ES2547229T3

ES2547229T3 - Inhibidores de cinasa y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2547229T3
Application number: ES08797416.8T
Authority: ES
Inventors: Alyssa Panitch; Brandon Seal; Brian Ward
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 2007-08-07
Filing date: 2008-08-07
Publication date: 2015-10-02
Anticipated expiration: 2028-08-07
Also published as: WO2009021137A3; JP2010535508A; WO2009021137A2; JP5703466B2; US20090149389A1; US20140342993A1; EP2185698A2; HK1144306A1; US8741849B2; EP2185698B1; EP2185698A4; DK2185698T3; US20130184221A9; US9447158B2

Abstract

Composicion inhibidora de cinasa que comprende un peptido inhibidor de cinasa para inhibir el crecimiento de un neoplasma, en la que el peptido inhibidor de cinasa es un peptido que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166]; WLRRIKAWLRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 113]; WLRRIKAWLRRALARQLGVA [SEQ ID NO: 177]; KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 173]; FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 163]; YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 106]; YARAAARQARAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 28]; YARAAARQARAKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 100]; y YARAAARQARAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 64].

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E08797416

14-09-2015

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de cinasa y usos de los mismos

Campo de la invención

La invención se refiere a biología celular, a usos de péptidos inhibidores de cinasa y ácidos nucleicos que codifican para los péptidos, y a usos terapéuticos de los mismos.

Antecedentes

Cinasas

Las cinasas son un grupo ubicuo de enzimas que catalizan la reacción de transferencia del grupo fosforilo desde un donador de fosfato (habitualmente ATP) hasta un sustrato receptor. Aunque todas las cinasas catalizan esencialmente la misma reacción de transferencia de fosforilo, presentan una diversidad notable en su especificidad de sustrato, estructura y rutas en las que participan. Una clasificación reciente de todas las secuencias de cinasas disponibles (aproximadamente 60.000 secuencias) indica que las cinasas pueden agruparse en 25 familias de proteínas homólogas. Estas familias de cinasas se reúnen en 12 grupos de plegamiento basados en la similitud del plegamiento estructural. 22 de las 25 familias (aproximadamente el 98,8% de todas las secuencias) pertenecen a 10 grupos de plegamiento para los que se conoce el plegamiento estructural. De las otras 3 familias, la polifosfato cinasa forma un grupo de plegamiento distinto; las 2 familias restantes son tanto cinasas integrales de membrana como comprenden el grupo de plegamiento final. Estos grupos de plegamiento no sólo incluyen algunos de los plegamientos de proteínas más ampliamente extendidos, tales como plegamiento de tipo Rossmann, plegamiento de tipo ferredoxina, plegamiento de tipo barriles TIM y plegamiento de tipo barril β antiparalelo, sino también todas las clases principales de estructuras de proteínas (todas las α, todas las β, α+β, α/β). Dentro de un grupo de plegamiento, el núcleo de dominio de unión a nucleótidos de cada familia tiene la misma arquitectura y la topología del núcleo de la proteína o bien es idéntica o bien está relacionada con permutación circular. No está implicada homología entre las familias dentro de un grupo de plegamiento.

Las cinasas del grupo I (23.124 secuencias) incorporan la proteína S/T-Y cinasa, proteína cinasa atípica, lípido cinasa y enzimas ATP-grasp y comprenden además la familia de proteína S/T-Y cinasa y proteína cinasa atípica

(22.074 secuencias). Estas cinasas incluyen: colina cinasa (EC 2.7.1.32); proteína cinasa (EC 2.7.137); fosforilasa cinasa (EC 2.7.1.38); homoserina cinasa (EC 2.7.1.39); I-fosfatidilinositol 4-cinasa (EC 2.7.1.67); estreptomicina 6cinasa (EC 2.7.1.72); etanolamina cinasa (EC 2.7.1.82); estreptomicina 3’-cinasa (EC 2.7.1.87); kanamicina cinasa (EC 2.7.1.95); 5-metiltiorribosa cinasa (EC 2.7.1.100); viomicina cinasa (EC 2.7.1.103); [hidroximetilglutaril-CoA reductasa (NADPH2)] cinasa (EC 2.7.1.109); proteína-tirosina cinasa (EC 2.7.1.112); [isocitrato deshidrogenasa (NADP+)] cinasa (EC 2.7.1.116); [cadena ligera de miosina] cinasa (EC 2.7.1.117); higromicina-B cinasa (EC 2.7.1.119); proteína dependiente de calcio/calmodulina cinasa (EC 2.7.1.123); rodopsina cinasa (EC 2.7.1.125); [receptor beta-adrenérgico] cinasa (EC 2.7.1.126); [cadena pesada de miosina] cinasa (EC 2.7.1.129); [proteína Tau] cinasa (EC 2.7.1.135); macrólido 2’-cinasa (EC 2.7.1.136); I-fosfatidilinositol 3-cinasa (EC 2.7.1.137); subunidad de [ARN-polimerasa] cinasa (EC 2.7.1.141); fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3-cinasa (EC 2.7.1.133); y fosfatidilinositol-4fosfato 3-cinasa (EC 2.7.1.154). El grupo I comprende además la familia de lípido cinasa (321 secuencias). Estas cinasas incluyen: I-fosfatidilinositol-4-fosfato 5-cinasa (EC 2.7.1.68); I-D-mioinositol-trifosfato 3-cinasa (EC 2.7.1.127); inositol-tetrakisfosfato 5-cinasa (EC 2.7.1.140); I-fosfatidilinositol-5-fosfato 4-cinasa (EC 2.7.1.149); Ifosfatidilinositol-3-fosfato 5-cinasa (EC 2.7.1.150); inositol-polifosfato multicinasa (EC 2.7.1.151); e inositolhexakisfosfato cinasa (EC 2.7.4.21). El grupo I comprende además las ATP-grasp cinasas (729 secuencias), que incluyen inositol-tetrakisfosfato I-cinasa (EC 2.7.1.134); piruvato, fosfato dicinasa (EC 2.7.9.1); y piruvato, agua dicinasa (EC 2.7.9.2).

Las cinasas del grupo II (17.071 secuencias) incorporan las cinasas de tipo Rossman. El grupo II comprende: (i) la familia de cinasas de bucle P (7.732 secuencias), que incluyen gluconocinasa (EC 2.7.1.12); fosforribulocinasa (EC 2.7.1.19); timidina cinasa (EC 2.7.1.21); ribosilnicotinamida cinasa (EC 2.7.1.22); desfosfo-CoA cinasa (EC 2.7.1.24); adenililsulfato cinasa (EC 2.7.1.25); pantotenato cinasa (EC 2.7.1.33); proteína cinasa (bacteriana) (EC 2.7.1.37); uridina cinasa (EC 2.7.1.48); shikimato cinasa (EC 2.7.1.71); desoxicitidina cinasa (EC 2.7.1.74); desoxiadenosina cinasa (EC 2.7.1.76); polinucleótido 5’-hidroxil-cinasa (EC 2.7.1.78); 6-fosfofructo-2-cinasa (EC 2.7.1.105); desoxiguanosina cinasa (EC 2.7.1.113); tetraacildisacárido 4’-cinasa (EC 2.7.1.130); desoxinucleósido cinasa (EC 2.7.1.145); adenosilcobinamida cinasa (EC 2.7.1.156); polifosfato cinasa (EC 2.7.4.1); fosfomevalonato cinasa (EC 2.7.4.2); adenilato cinasa (EC 2.7.4.3); nucleósido-fosfato cinasa (EC 2.7.4.4); guanilato cinasa (EC 2.7.4.8); timidilato cinasa (EC 2.7.4.9); nucleósido-trifosfato-adenilato cinasa (EC 2.7.4.10); (desoxi)nucleósido-fosfato cinasa (EC 2.7.4.13); citidilato cinasa (EC 2.7.4.14); y uridilato cinasa (EC 2.7.4.-); (ii) la familia de fosfoenolpiruvato carboxicinasa (815 secuencias), que incluye proteína cinasa (HPr cinasa/fosfatasa) (EC 2.7.1.37); fosfoenolpiruvato carboxicinasa (GTP) (EC 4.1.1.32); y fosfoenolpiruvato carboxicinasa (ATP) (EC 4.1.1.49); (iii) la familia de fosfoglicerato cinasa (1.351 secuencias), que incluye fosfoglicerato cinasa (EC 2.7.2.3) y fosfoglicerato cinasa (GTP) (EC 2.7.2.10); (iv) la familia de aspartocinasa (2.171 secuencias), que incluye carbamato cinasa (EC 2.7.2.2); aspartato cinasa (EC 2.7.2.4); acetilglutamato cinasa (EC 2.7.2.8 1); glutamato 5-cinasa (EC 2.7.2.1) y uridilato cinasa (EC 2.7.4.-); (v) la familia de cinasas de tipo fosfofructocinasa (1.998 secuencias), que incluye 6

15

25

35

45

55

E08797416

14-09-2015

fosfofrutocinasa (EC 2.7.1.1 1); NAD(+) cinasa (EC 2.7.1.23); I-fosfofructocinasa (EC 2.7.1.56); difosfato-fructosa-6fosfato I-fosfotransferasa (EC 2.7.1.90); esfinganina cinasa (EC 2.7.1.91); diacilglicerol cinasa (EC 2.7.1.107); y ceramida cinasa (EC 2.7.1.138); (vi) la familia de tipo ribocinasa (2.722 secuencias), que incluye glucocinasa (EC 2.7.1.2); cetohexocinasa (EC 2.7.13); fructocinasa (EC 2.7.1.4); 6-fosfofructocinasa (EC 2.7.1.11); ribocinasa (EC 2.7.1.15); adenosina cinasa (EC 2.7.1.20); piridoxal cinasa (EC 2.7.135); 2-deshidro-3-desoxigluconocinasa (EC 2.7.1.45); hidroximetilpirimidina cinasa (EC 2.7.1.49); hidroxietiltiazol cinasa (EC 2.7.1.50); I-fosfofructocinasa (EC 2.7.1.56); inosina cinasa (EC 2.7.1.73); 5-deshidro-2-desoxigluconocinasa (EC 2.7.1.92); tagatosa-6-fosfato cinasa (EC 2.7.1.144); fosfofructocinasa dependiente de ADP (EC 2.7.1.146); glucocinasa dependiente de ADP (EC 2.7.1.147); y fosfometilpirimidina cinasa (EC 2.7.4.7); (vii) la familia de tiamina pirofosfocinasa (175 secuencias), que incluye tiamina pirofosfocinasa (EC 2.7.6.2); y (viii) la familia de glicerato cinasa (107 secuencias), que incluye glicerato cinasa ( (EC 2.7.1.31).

Las cinasas del grupo III (10.973 secuencias) comprenden (i) las cinasas de plegamiento de tipo ferredoxina; (ii) la familia de nucleósido-difosfato cinasa (923 secuencias), que incluye nucleósido-difosfato cinasa (EC 2.7.4.6); (iii) la familia de HPPK cinasa (609 secuencias), que incluye 2-amino-4-hidroxi-6-hidroximetildihidropteridina pirofosfocinasa (EC 2.7.6.3); (iv) la familia de guanido cinasa (324 secuencias), que incluye guanidoacetato cinasa (EC 2.7.3.1); creatina cinasa (EC 2.7.3.2); arginina cinasa (EC 2.7.3.3); y lombricina cinasa (EC 2.7.3.5); (v) la familia de histidina cinasa (9.117 secuencias), que incluye proteína cinasa (histidina cinasa) (EC 2.7.1.37); [piruvato deshidrogenasa(lipoamida)] cinasa (EC 2.7.1.99); y [3-metil-2-oxibutanoato deshidrogenasa(lipoamida)] cinasa (EC 2.7.1.115).

Las cinasas del grupo IV (2.768 secuencias) incorporan cinasas de tipo H, que incluyen hexocinasa (EC 2.7.1.1); glucocinasa (EC 2.7.1.2); fructocinasa (EC 2.7.1.4); ramnulocinasa (EC 2.7.1.5); manocinasa (EC 2.7.1.7); gluconocinasa (EC 2.7.1.12); L-ribulocinasa (EC 2.7.1.16); xilulocinasa (EC 2.7.1.17); eritritol cinasa (EC 2.7.1.27); glicerol cinasa (EC 2.7.1.30); pantotenato cinasa (EC 2.7.1.33); D-ribulocinasa (EC 2.7.1.47); L-fucolocinasa (EC 2.7.1.51); L-xilulocinasa (EC 2.7.1.53); alosa cinasa (EC 2.7.1.55); 2-deshidro-3-desoxigalactonocinasa (EC 2.7.1.58); N-acetilglucosamina cinasa (EC 2.7.1.59); N-acilmanosamina cinasa (EC 2.7.1.60); polifosfato-glucosa fosfotransferasa (EC 2.7.1.63); beta-glucósido cinasa (EC 2.7.1.85); acetato cinasa (EC 2.7.2.1); butirato cinasa (EC 2.7.2.7); ácido graso de cadena ramificada cinasa (EC 2.7.2.14); y propionato cinasa (EC 2.7.2.-).

Las cinasas del grupo V (1.119 secuencias) incorporan cinasas de tipo barril TIM β/α, que incluyen piruvato cinasa (EC 2.7.1.40).

Las cinasas del grupo VI (885 secuencias) incorporan GHMP cinasas. Estas enzimas incluyen galactocinasa (EC 2.7.1.6); mevalonato cinasa (EC 2.7.1.36); homoserina cinasa (EC 2.7.1.39); L-arabinocinasa (EC 2.7.1.46); fucocinasa (EC 2.7.1.52); shikimato cinasa (EC 2.7.1.71); 4-(citidina 5’-difosfo)-2-C-metil-D-eritriol cinasa (EC 2.7.1.148); y fosfomevalonato cinasa (EC 2.7.4.2).

Las cinasas del grupo VII (1.843 secuencias) incorporan cinasas de tipo AIR sintetasa, que incluyen tiamina-fosfato cinasa (EC 2.7.4.16) y seleniuro, agua dicinasa (EC 2.7.9.3).

Las cinasas del grupo VIII (565 secuencias) incorporan riboflavina cinasas (565 secuencias), que incluyen riboflavina cinasa (EC 2.7.1.26).

Las cinasas del grupo IX (197 secuencias) incorporan dihidroxiacetona cinasas, que incluyen glicerona cinasa (EC 2.7.1.29).

Las cinasas del grupo X (148 secuencias) incorporan supuestas glicerato cinasas, que incluyen glicerato cinasa (EC 2.7.1.31).

Las cinasas del grupo XI (446 secuencias) incorporan polifosfato cinasas, que incluyen polifosfato cinasas (EC 2.7.4.1).

Las cinasas del grupo XII (263 secuencias) incorporan cinasas integrales de membrana. El grupo XII comprende la familia de dolicol cinasa, que incluyen dolicol cinasas (EC 2.7.1.108); y la familia de undecaprenol cinasa, que incluyen undecaprenol cinasas (EC 2.7.1.66).

Las cinasas, que están entre las enzimas mejor estudiadas a nivel estructural, bioquímico y celular, desempeñan papeles indispensables en numerosas rutas metabólicas y de señalización celulares. Aunque todas las cinasas usan el mismo donador de fosfato (en la mayoría de los casos, ATP) y parecen catalizar aparentemente la misma reacción de transferencia de fosforilo, presentan diversidad notable en sus plegamientos estructurales y mecanismos de reconocimiento de sustrato. Esto se debe probablemente en gran medida a la naturaleza extraordinariamente diversa de las estructuras y propiedades de sus sustratos.

Rutas de transducción de señales

La familia AGC de proteína cinasas, que comprende isoformas de proteína cinasa B (PKB, también conocida como Akt), cinasa p70 ribosómica S6 (S6K), proteína cinasa inducida por suero y glucocorticoides (SGK) e isoformas

15

25

35

45

55

E08797416

14-09-2015

atípicas de proteína cinasa C (PKC), se activa en el plazo de minutos de la estimulación inducida por factores de crecimiento o insulina de fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3-cinasa). Una vez activada, PKB/Akt se fosforila y modula la función de varias proteínas reguladoras importantes, dando como resultado la inhibición de la apoptosis, la formación de división celular y la estimulación de la captación y el almacenamiento de glucosa. La serina/treonina cinasa Akt (proteína cinasa B) es una enzima crítica en rutas de transducción de señales implicadas en la proliferación celular, apoptosis, angiogénesis y diabetes. Se conocen tres isoformas de Akt (α, β, γ o Akt 1, 2, 3) en mamíferos. Estas isoformas presentan un alto grado de homología pero difieren ligeramente en la ubicación de sus sitios de fosforilación reguladores. Las enzimas Akt están compuestas por tres regiones funcionalmente distintas: 1) un dominio de homología a pleckstrina (PH) N-terminal; 2) un dominio catalítico central; y 3) un motivo hidrófobo C-terminal. El dominio PH en la región N-terminal de Akt proporciona un módulo de unión a lípidos para dirigir la Akt a PIP2 (fosfatidilinositol bisfosfato o los productos obtenidos mediante la escisión de PIP3) y PIP3 (fosfatidilinositol(3,4,5)-trifosfato, el producto de la actividad de la fosfoinosítido 3-cinasa de clase I sobre el fosfatidilinositol(4,5)-bisfosfato), interacciona con 3’-fosfoinosítidos y ayuda a reclutar Akt en la membrana plasmática.

En células no estimuladas, Akt se fosforila de manera constitutiva en Ser124, en la región entre los dominios PH y catalítico, y en Thr450, en la región C-terminal (en Aktα). La activación de Akt implica la unión de factores de crecimiento a una tirosina cinasa receptora y la activación de PI 3-K (PI 3-K fosforila PIP2 unido a la membrana para generar PIP3). La unión de PIP3 al dominio PH ancla la Akt a la membrana plasmática y permite su fosforilación y activación mediante PDK1 (isozima piruvato deshidrogenasa cinasa 1). Akt se activa completamente tras su fosforilación en dos residuos reguladores, un residuo de treonina en el dominio cinasa y un residuo de serina en el motivo hidrófobo. Estos motivos están conservados estructural y funcionalmente dentro de la familia de AGC cinasa. Se requiere la fosforilación en Thr308 y Ser473 para la activación de Aktα. La fosforilación en Thr309 y Ser474 activa Aktβ. La fosforilación en Thr305 activa Aktγ. La activación de Akt requiere la fosforilación de un residuo de treonina en el dominio cinasa, catalizada por PDK1. Esto produce un cambio conformacional inducido por carga y permite la unión al sustrato y una velocidad de catálisis aumentada. La fosforilación en el residuo de serina, principalmente mediante el complejo mTOR/rictor (mTORC2), aumenta la actividad de Akt aproximadamente en 10 veces. Estudios indican que ADN-PK y PKCbII fosforilan el residuo de serina en la subunidad reguladora. El motivo hidrófobo de Akt, sin fosforilación de treonina, es más susceptible a la acción de fosfatasas; sin embargo, la enzima doblemente fosforilada y completamente activa es estable, permitiendo su ubicación en el núcleo y otros sitios. La actividad de Akt se regula negativamente por PTEN (gen homólogo de fosfatasa y tensina cuyo producto actúa como fosfatasa para desfosforilar fosfatidilinositol(3,4,5)-trifosfato) y SHIP (inositol fosfatasa que contiene SH2, INPP5D).

Akt facilita la supervivencia celular mediada por factores de crecimiento y bloquea la muerte celular apoptótica desactivando (a través de fosforilación) factores pro-apoptóticos tales como Bad, caspasa-9 y factores de

Ser136

transcripción Forkhead (AFX, Daf-16, FKHR). La fosforilación de Bad en promueve su asociación con proteínas 14-3-3 en el citosol; esto evita que Bad se ubique en la mitocondria para inducir apoptosis. Akt promueve la supervivencia celular inactivando la caspasa-9 a través de fosforilación en Ser196. De manera similar, Akt activada fosforila miembros de la familia Forkhead, dando como resultado su secuestro en el citoplasma. En ausencia de factores de supervivencia y actividad de Akt, los miembros de la familia Forkhead se translocan al núcleo, en el que inician un programa de expresión génica (por ejemplo, FasL) que promueve la muerte celular. Akt también fosforila y activa IKKα (una subunidad del complejo 1κB alfa cinasa que tiene un papel importante en la activación del factor nuclear -κB (NF-κB), un regulador clave de la proliferación celular normal y tumoral, la apoptosis y la respuesta a quimioterapia) en Thr23. La IKKα activada, a su vez, fosforila IκB, dirigiéndola para la ubiquitinación y la degradación proteosómica. Esto conduce a la activación y la translocación nuclear de NF-κB, y a la transcripción de genes prosupervivencia dependientes de NF-κB que incluyen inhibidores de caspasa y Bcl-xL.

Akt también fosforila y inactiva GSK-3 (glucógeno sintasa cinasa-3), permitiendo que continúe la activación de glucógeno sintasa. GSK-3 fosforila la ciclina D (un regulador de la transición de fase G1 a S), dirigiendo la ciclina D para proteólisis. Por tanto, la inactivación de GSK-3 puede promover la regulación por incremento de ciclina D y potenciar el ciclo celular.

Estudios indican que Akt fosforila Chk1 (una cinasa efectora de daño en el ADN) en Ser280 evitando de ese modo que las proteína cinasas humanas ATM (ataxia telangiectasia mutada) y ATR (ataxia telangiectasia y Rad3 relacionadas) activen Chk1 a través de fosforilación en Ser345. Esto puede ser de importancia terapéutica, ya que la inhibición de Chk1 potencia la sensibilización de tumores a los agentes quimioterápicos.

Ser353

Akt fosforila Cdc25B en , dando como resultado su acumulación citoplasmática. Cdc25B experimenta activación durante la fase S y desempeña un papel en la activación de la cinasa mitótica Cdk1/ciclina B en el citoplasma. Esta reubicación de Cdc25B al citoplasma permite que Akt to regule la función de Cdc25B y participe en el control de la entrada de células en mitosis.

La regulación de Akt por varios oncogenes anteriores y genes de supresión de tumores influye en la progresión del cáncer. Las líneas celulares de cáncer de mama expresan Aktα en diversos grados. El inhibidor de Akt, 2-(R)-2-Ometil-3-O-octadecilcarbonato de 1L-6-hidroximetilquiro-inositol, reduce la supervivencia de células de mieloma múltiple resistentes a fármacos y sensibles a fármacos. Akt también desempeña un papel crítico en tumorigénesis.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E08797416

14-09-2015

Akt se activa cuando los supresores de tumores, tales como el inhibidor del ciclo celular p27 y PTEN, pierden sus funciones. Akt confiere la importancia nuclear de p27 mediante la fosforilación de p27 en Thr157 . La ubicación errónea citoplasmática de p27 se ha asociado fuertemente con pérdida de diferenciación y malos desenlaces en el cáncer de mama. También se ha informado que Akt se asocia físicamente con p21 endógeno (un inhibidor del ciclo celular). La fosforilación de p21 en Thr145 por Akt produce la ubicación de p21 en el citoplasma y la posterior degradación.

Akt y p53 (también conocida como proteína 53 o proteína tumoral 53, un factor de transcripción que regula el ciclo celular) desempeñan papeles opuestos en las rutas de señalización que determinan la supervivencia celular. En condiciones en las que el efecto apoptótico de p53 es dominante, la destrucción de Akt desempeña un papel en la aceleración del proceso apoptótico. En células propensas a apoptosis, la señalización dependiente de p53 permite la regulación por disminución de Akt, lo que predispone a las células a la apoptosis rápida en respuesta a señales de estrés. En determinadas circunstancias, la activación de Akt puede superar los efectos de p53 que promueven la muerte y puede rescatar a las células de la apoptosis. Estudios indican que Akt puede fosforilar Mdm2 (una proteína codificada por un oncogén que modula la actividad supresora de tumores de p53) en Ser166 y Ser188 y promueve la translocación de Mdm2 al núcleo en el que Mdm2 desestabiliza p53 y potencia su degradación a través de la ruta proteasómica.

Inhibición de cinasa

Las proteína cinasas eucariotas constituyen una de las superfamilias más grandes de proteínas homólogas que están relacionadas entre sí en virtud de sus dominios catalíticos. Las proteínas cinasas más relacionadas son específicas para o bien la fosforilación de serina/treonina o bien la fosforilación de tirosina. Se considera que la estimulación de proteína cinasas es uno de los mecanismos de activación más comunes de estas enzimas en los sistemas de transducción de señales y por tanto desempeña un papel integral en la respuesta celular a estímulos extracelulares. Se conocen muchos sustratos que experimentan fosforilación mediante múltiples proteína cinasas. Se ha publicado una cantidad considerable de información sobre la secuencia primaria de los dominios catalíticos de diversas proteína cinasas. Estas secuencias comparten un gran número de residuos implicados en la unión a ATP, catálisis y mantenimiento de la integridad estructural. La mayoría de las proteína cinasas poseen un dominio catalítico de 30-32 kDa bien conservado. Estudios han intentado identificar y utilizar elementos reguladores de proteína cinasas. Estos elementos reguladores incluyen anticuerpos, péptidos bloqueantes e inhibidores.

Inhibidores

Los inhibidores enzimáticos son moléculas que se unen a enzimas disminuyendo de ese modo la actividad enzimática. La unión de un inhibidor puede detener la entrada del sustrato en el sitio activo de la enzima y/u obstaculizar que la enzima catalice su reacción. La unión del inhibidor es o bien reversible o bien irreversible. Los inhibidores irreversibles reaccionan habitualmente con la enzima y la cambian químicamente, por ejemplo, modificando residuos de aminoácido clave necesarios para la actividad enzimática. En cambio, los inhibidores reversibles se unen no covalentemente y producen diferentes tipos de inhibición dependiendo de si estos inhibidores se unen a la enzima, al complejo enzima-sustrato, o a ambos.

A menudo se evalúan inhibidores enzimáticos por su especificidad y potencia. El término “especificidad” tal como se usa en el presente documento se refiere a la unión selectiva o influencia de una sustancia sobre otra. El término “potencia” tal como se usa en el presente documento se refiere a la eficacia, efectividad, fuerza o, normalmente, la constante de disociación, que indica la concentración necesaria para inhibir una enzima.

Se han estudiado inhibidores de proteína cinasas para su uso como herramientas en la regulación de la actividad de proteína cinasas. Se han estudiado inhibidores para su uso con, por ejemplo, cinasa dependiente de ciclina (Cdk), MAP cinasa, serina/treonina cinasa, proteína tirosina cinasa de la familia Src, tirosina cinasa, calmodulina (CaM) cinasa, caseína cinasa, cinasa de punto de control (Chkl), GSK-3, JNK, MEK, cadena ligera de miosina cinasa (MLCK), proteína cinasa A, Akt (proteína cinasa B), proteína cinasa C, proteína cinasa G, proteína tirosina cinasa, Raf cinasa y Rho cinasa.

Anticuerpos

Los anticuerpos (o “inmunoglobulinas”) son proteínas gamma-globulinas producidas por linfocitos B del sistema inmunitario en respuesta a un antígeno usado por el organismo para identificar y neutralizar objetos extraños que tienen ese antígeno. En su forma nativa, normalmente están compuestos por unidades estructurales básicas, cada una con dos cadenas pesadas (H) grandes y dos cadenas ligeras (L) pequeñas, para formar, por ejemplo, monómeros con una unidad, dímeros con dos unidades o pentámeros con cinco unidades. Hay varios tipos diferentes de cadenas pesadas de anticuerpo y varios tipos diferentes de anticuerpos, que se agrupan en diferentes isotipos basándose en qué cadena pesada tienen. Se conocen cinco isotipos de anticuerpo diferentes en mamíferos, que desempeñan diferentes papeles y ayudan a dirigir la respuesta inmunitaria apropiada para cada tipo diferente de objeto extraño que encuentran. La especificidad y afinidad de unión de un anticuerpo vienen dictados por los tres bucles polivariables de la cadena VL y los tres bucles hipervariables de la cadena VH ubicados en cada brazo de ese anticuerpo. Las variaciones en las longitudes y secuencias de estos bucles definen el sitio de combinación del

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E08797416

14-09-2015

anticuerpo (ACS). Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” incluye, a modo de ejemplo, tanto anticuerpos que se producen de manera natural como que no se producen de manera natural. Específicamente, el término “anticuerpo” incluye anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales, y fragmentos de los mismos. Además, el término “anticuerpo” incluye anticuerpos quiméricos y anticuerpos completamente sintéticos, y fragmentos de los mismos. Los términos “epítopo” y “determinante antigénico” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse al sitio en una molécula que reconoce un ACS y al que se une/asocia ese mismo anticuerpo. Un epítopo puede ser un sitio de unión a antígeno/determinante antigénico en un péptido inhibidor de cinasa. El epítopo puede estar relacionado con la secuencia primaria, secundaria o terciaria.

Se ha estudiado la especificad de las interacciones entre determinados anticuerpos y proteína cinasas para su uso en la regulación de la actividad de proteína cinasas. Se han aislado anticuerpos para su uso con, por ejemplo, rutas de MAP, proteína cinasa A, proteína cinasa B, proteína cinasa G, serina/treonina cinasas, glucógeno-sintasa cinasa3 (GSK-3), rutas de proteína activada por estrés (SAP) cinasa, y tirosina cinasas. Adicionalmente, se han aislado anticuerpos para su uso con inhibidores de proteína cinasa y sustratos de proteína cinasa.

Péptidos bloqueantes

Un péptido es un compuesto químico que está compuesto por una cadena de dos o más aminoácidos; el grupo carboxilo de un aminoácido se une al grupo amino de un aminoácido adyacente para formar un enlace peptídico. El término “polipéptido” se usa en el presente documento en su sentido más amplio para referirse a una secuencia de subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácido o peptidomiméticos, en la que las subunidades se unen mediante enlaces peptídicos. Los péptidos o polipéptidos pueden sintetizarse químicamente o expresarse de manera recombinante. Se han usado péptidos en el estudio de la estructura y función de proteínas. Pueden usarse péptidos sintéticos como sondas para observar dónde se producen interacciones proteína-péptido. Pueden usarse péptidos inhibidores en investigación clínica para examinar los efectos de los péptidos sobre la inhibición de proteína cinasas, proteínas de cáncer y otros trastornos.

Se ha estudiado el uso de varios péptidos bloqueantes. Por ejemplo, la cinasa regulada por señales extracelulares (ERK), una proteína cinasa MAPK (lo que significa cualquiera de un grupo de proteína serina/treonina cinasas que responden a estímulos extracelulares (antígenos) y regulan diversas actividades celulares), es esencial para la proliferación y diferenciación celulares. La activación de MAPK requiere un mecanismo de cascada por el que se fosforila MAPK por una MAPKK (MEK) anterior que entonces, a su vez, se fosforila mediante una tercera cinasa MAPKKK (MEKK). Este péptido inhibidor funciona como señuelo de MEK mediante la unión a ERK. Contiene los 13 aminoácidos amino-terminales (GMPKKKPTPIQLN) [SEQ ID NO: 149] de MEK1 y se une a ERK. Esto bloquea la activación de ERK mediante MEK ya que ERK no puede interaccionar con MEK. El péptido inhibidor de ERK también contiene una secuencia de transducción de proteínas (PTD) (DRQIKIWFQNRRMKWKK) [SEQ ID NO: 150] derivada de Antennapedia que hace que el péptido sea permeable en la célula.

Otros péptidos bloqueantes incluyen el péptido inhibidor relacionado con autocamtida-2 (AIP). Este péptido sintético es un inhibidor potente y altamente específico de la proteína cinasa II dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKII). AIP es un análogo no fosforilable de autocamtida-2, un sustrato péptidico altamente selectivo para CaMKII. AIP inhibe CaMKII con una CI50 de 100 nM (CI50 es una concentración del inhibidor requerida para obtener una inhibición del 50%). La inhibición de AIP es no competitiva con respecto a sintida-2 (sustrato peptídico de CaMKII) y ATP, pero es competitiva con respecto a autocamtida-2. La inhibición no resulta afectada por la presencia o ausencia de Ca2+/calmodulina. La actividad de CaMKII se inhibe completamente por AIP 1 µM; PKA, PKC y CaMKIV no resultan afectadas. La secuencia de aminoácidos de AIP es: KKALRRQEAVDAL (Lys-Lys-Ala-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Val-Asp-Ala-Leu) [SEQ ID NO: 151].

Otros péptidos bloqueantes incluyen el péptido inhibidor de cinasa 5 dependiente de ciclina (Cdk5) (CIP). Cdk5 fosforila tau en fosfo-epítopos específicos de la enfermedad de Alzheimer (AD) cuando se asocia con el componente regulador p25. p25 es un activador truncado del heterodímero Cdk-p25 (una proteína asociada a microtúbulos), que se produce a partir del activador fisiológico de Cdk5, p35, tras la exposición a péptidos amiloides-beta (Aβ, una proteína implicada en la AD). Tras infecciones neuronales con CIP, los CIP inhiben selectivamente la actividad de p25/Cdk5 y suprimen la fosforilación aberrante de tau en neuronas corticales. Los motivos para la especificidad demostrada por CIP no se comprenden completamente.

Se han estudiado péptidos bloqueantes adicionales para ERK2, ERK3, p38/HOG1, proteína cinasa C, caseína cinasa II, Ca2+/calmodulina cinasa IV, caseína cinasa II, Cdk4, Cdk5, ADN-PK, PAK3, PI-3 cinasa, PI-5 cinasa, PSTAIRE, cinasa S6 ribosómica, GSK-4, GCK, SAPK, SEK1 y FAK.

Dominios de transducción de proteínas

Las nuevas tecnologías de administración de fármacos ocupan un lugar importante en los tratamientos ya que permiten que los fármacos sean más eficaces. La administración de fármacos todavía se considera insuficiente en relación con el descubrimiento de fármacos, teniendo más del 95% de todos los nuevos agentes terapéuticos potenciales mala farmacocinética. El mayor impedimento para la liberación citosólica de moléculas terapéuticas es la barrera de membrana de las células diana. Los dominios de transducción de proteínas (PTD), también denominados

15

25

35

45

55

E08797416

14-09-2015

péptidos troyanos, las secuencias de translocación de membrana o proteínas permeables en células, son una clase de péptidos que generalmente pueden penetrar en la membrana plasmática de células de mamífero. Los PTD tienen generalmente 10-16 aminoácidos de longitud y puede agruparse según su composición, por ejemplo péptidos ricos en arginina y/o lisina. Los PTD también pueden usarse para ayudar a que inhibidores de cinasa HSP27 novedosos penetren en las membranas celulares (véase, por ejemplo, el documento PCT/US2007-16246, presentado el 16 de julio de 2007, titulado “Polipeptic Inhibitors of HSP27 and Uses Thereof”, que se incorpora como referencia en el presente documento en su totalidad). Los PTD pueden transportar compuestos de muchos tipos y pesos moleculares a través de células de mamífero. Estos compuestos incluyen moléculas efectoras, tales como proteínas, ADN, péptidos conjugados, oligonucleótidos y pequeñas partículas tales como liposomas. Cuando los PTD se unen

o se fusionan químicamente a otras proteínas, estas proteínas de fusión todavía pueden penetrar en la membrana plasmática y entrar en las células. Aunque se desconoce el mecanismo exacto de esta transducción, no se cree que la internalización de estas proteínas esté mediada por receptor o por transportador. El uso de PTD que pueden transportar moléculas efectoras al interior de las células se ha vuelto cada vez más atractivo en el diseño de fármacos ya que promueven la captación celular de moléculas de carga. Estos péptidos que penetran en las células, clasificados generalmente como anfipáticos o catiónicos dependiendo de su secuencia, proporcionan una tecnología de administración no invasiva para macromoléculas.

Proteínas que contienen PTD virales

Las primeras proteínas que se describió que tenían propiedades de transducción fueron de origen viral. Estas proteínas todavía son los modelos más comúnmente aceptados para la acción de PTD. El transactivator de transcripción del VIH-1 (TAT) y la proteína VP 22 del VHS-1 son las proteínas virales que contienen PTD mejor caracterizadas.

TAT (producto génico transactivador del VIH-1) es un polipéptido de 86 aminoácidos que actúa como factor de transcripción poderoso del genoma de VIH-1 integrado. TAT estimula la replicación viral en células infectadas de manera latente. Las propiedades de translocación de la proteína TAT le permiten activar células infectadas de manera quiescente y pueden estar implicadas en la sensibilización de células no infectadas para la posterior infección regulando muchos genes celulares, incluyendo citocinas. El PTD mínimo de TAT es la secuencia de proteína de 9 aminoácidos RKKRRQRRR (TAT49-57) [SEQ ID NO: 152]. Estudios que utilizaban un fragmento más largo de TAT demostraron transducción satisfactoria de proteínas de fusión de hasta 120 kDa. Se ha demostrado que la adición de múltiples PTD de TAT y derivados sintéticos de TAT media en la translocación a la membrana. Se han usado proteínas de fusión que contienen PTD de TAT como restos terapéuticos en experimentos que implicaban cáncer, para transportar una proteína de muerte al interior de las células, y en modelos de enfermedad de trastornos neurodegenerativos.

VP22 es la proteína de tegumento del VHS-1, una parte estructural del virión de VHS. VP22 puede realizar translocación independiente de receptor y se acumula en el núcleo. Esta propiedad de VP22 clasifica a la proteína como un péptido que contiene PTD. Las proteínas de fusión que comprenden VP22 de longitud completa se han translocado eficazmente a través de la membrana plasmática.

Homeoproteínas con propiedades de translocación intercelular

Las homeoproteínas son factores de transcripción de transactivación, altamente conservados implicados en procesos morfológicos. Se unen al ADN a través de una secuencia específica de 60 aminoácidos. El homeodominio de unión a ADN es la secuencia más altamente conservada de la homeoproteína. Varias homeoproteínas presentan actividad de tipo PTD; pueden realizar translocación eficaz a través de membranas celulares de una manera independiente de energía e independiente de endocitosis sin especificidad del tipo celular.

La proteína Antennapedia (Antp) es un factor de transactivación que puede realizar translocación a través de membranas celulares; la secuencia mínima de translocación es un péptido de 16 aminoácidos que corresponde a la tercera hélice del homeodominio de la proteína. La internalización de esta hélice se produce a 4ºC, lo que sugiere que este proceso no es dependiente de endocitosis. Péptidos de hasta 100 aminoácidos producidos como proteínas de fusión con AntpHD penetran en las membranas celulares.

Otros homeodominios que pueden realizar translocación incluyen el homeodominio Fushi tarazu (Ftz) y Engrailed (En). Puesto que la tercera hélice de todos los homeodominios está altamente conservad, es probable que otros homeodominios puedan poseer características similares.

PTD sintéticos

Se han sintetizado varios péptidos PTD. Muchos de estos péptidos sintéticos se basan en péptidos existentes y bien documentados, mientras que otros se seleccionan por sus residuos básicos y/o carga positiva, que se cree que son cruciales para la función de PTD. Estos péptidos sintéticos incluyen: PTD-4 (YARAAARQARA) [SEQ ID NO: 153]; PTD-5 (RRQRRTSKLMKR) [SEQ ID NO: 154]; MST-1 (AAVLLPVLLAAR) [SEQ ID NO: 155]; L-R9 (RRRRRRRRR) [SEQ ID NO: 156]; y Péptido 2 (SGWFRRWKK) [SEQ ID NO: 157].

PTD humanos

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E08797416

14-09-2015

Los PTD humanos pueden evitar problemas de inmunogenicidad potencial cuando se usan como agentes terapéuticos tras la introducción en un paciente humano. Los péptidos con secuencias de PTD incluyen: Hoxa-5, Hox-A4, Hox-B5, Hox-B6, Hox-B7, HOX-D3, GAX, MOX-2 y FtzPTD, compartiendo todos ellos la secuencia encontrada en PTD de Antp (RQIKIWFQNRRMKWKK) [SEQ ID NO: 158]. Otros PTD incluyen Islet-1, interleucina1β, factor de necrosis tumoral y la secuencia hidrófoba del péptido señal de FGF de Kaposi (K-FGF o FGF-4) que puede realizar translocación independiente de energía, receptor y endocitosis. Los PTD no confirmados incluyen miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF).

En la actualidad, es posible producir una molécula de proteína dada mediante tecnología de ADN recombinante para aplicaciones terapéuticas in vivo. Aunque se han diseñado satisfactoriamente pequeñas moléculas o péptidos que pueden atravesar las membranas celulares para administrar proteínas pequeñas o moderadamente grandes, sigue siendo un reto la administración de proteínas recombinantes a dianas deseadas in vivo. Pese a los desarrollos en el área de los péptidos de transducción de proteínas, los métodos de administración clásicos de genes que codifican para proteínas a través de vectores de virus adenoasociados, adenovirus, lentivirus, herpes virus y vectores de expresión de plásmidos siguen siendo la elección preferida para la expresión de proteínas.

Se considera que la expresión génica mediada por vectores virales es el enfoque más eficaz y fiable para expresar proteínas funcionales de novo en tipos de células mitóticamente activas o bloqueadas tras la mitosis debido a sus capacidades naturales para administrar los genes específicos a células permisivas. Sin embargo, invariablemente se requieren vectores virales en dosis grandes para lograr niveles de expresión terapéuticos de las proteínas deseadas y pueden integrarse con el material de cromatina del huésped. Puesto que estas propiedades pueden tener consecuencias indeseables para los sistemas genéticos del huésped, la seguridad sigue siendo una preocupación grave para su aplicación clínica final.

Aunque un enfoque alternativo, es decir, producir proteínas recombinantes de manera exógena y luego administrarlas sistémicamente o mediante inyecciones localizadas en los órganos diana, parece tener un perfil de seguridad mejor, es necesario refinar la administración y biodisponibilidad de las proteínas recombinantes al interior de células o tejidos.

Varios estudios han demostrado el potencial de PTD en el descubrimiento de fármacos y la transducción de proteínas de hasta 120 kDa al interior de diferentes células. La inyección de proteínas de fusión in vivo de manera sistémica ha demostrado la eficacia del PTD en la administración de proteínas. Pese a las aplicaciones satisfactorias, todavía quedan por resolver cuestiones sobre la potencia de la transducción de proteínas mediada por PTD. Además, han fracasado algunos estudios sobre la transducción de proteínas de fusión mediada por PTD in vitro/in vivo y que intentan inducir una respuesta inmunitaria. Además, la expresión intracelular de proteínas de fusión u otras proteínas no secretoras por PTD puede no lograr la misma biodistribución que la de la proteína recombinante. Además, la entrada de PTD a través de la barrera hematoencefálica sigue siendo difícil de lograr.

Se ha intentado la administración de un conjunto diverso de cargas que oscilan entre pequeñas moléculas y cargas particuladas usando diferentes tipos de péptidos que penetran en las células in vitro e in vivo. Sin embargo, el mecanismo de internalización de estos péptidos es una cuestión sin resolver hasta la fecha, con cambios notables en vista de la participación de un proceso dependiente de energía que implica endocitosis como ruta de internalización. Una mejora en la eficacia de los PTD aumentaría significativamente la biodisponibilidad y disminuiría las dosis requeridas de agentes terapéuticos existentes y novedosos.

La presente invención proporciona péptidos con dominio de transducción que son útiles para la inhibición de cinasas. La presente invención proporciona además una clase de péptidos que incluyen determinados dominios de transducción que son útiles como inhibidores de la actividad cinasa. La presente invención proporciona además péptidos con dominio de transducción que son útiles como agentes terapéuticos para una variedad de trastornos hiperplásicos y neoplásicos. La presente invención proporciona además péptidos con dominio de transducción que son útiles como sustancias que producen muerte celular.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones de inhibición de cinasa y usos de las mismas y proporciona péptidos de inhibición de cinasa aislados y usos de los mismos para inhibir hiperplasia, para inhibir el crecimiento de neoplasmas y para inducir muerte celular programada en una población celular, tal como se define en las reivindicaciones.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición inhibidora de cinasa que comprende una cantidad inhibidora de un péptido inhibidor de cinasa; en la que el péptido inhibidor de cinasa es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en HRRIKAWLKKILALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166]; WLRRIKAWLRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 113]; WLRRIKAWLRRALARQLGVA [SEQ ID NO: 177]; KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 173]; FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 163]; YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 106]; YARAAARQARAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 28]; YARAAARQARAKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 100]; y YARAAARQARAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 64]. Según otra realización, la secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa es HRRIKAWLKKILALARQLGVAA [SEQ ID

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E08797416

14-09-2015

NO: 166]. Según otra realización, la secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa es WLRRIKAWLRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 113]. Según otra realización, la secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa es WLRRIKAWLRRALARQLGVA [SEQ ID NO: 177]. Según otra realización de este tipo, la secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa es KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 173]. Según otra realización de este tipo, la secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa es FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 163].

Según otra realización de este tipo, el péptido inhibidor de cinasa tiene la secuencia de aminoácidos KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 173].

Según otra realización de este tipo, la secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa es FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 163].

Según otra realización de este tipo, la secuencia de aminoácidos es YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 106].

Según otra realización de este tipo, la secuencia de aminoácidos es YARAAARQARAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 28].

Según otra realización de este tipo, la secuencia de aminoácidos es YARAAARQARAKALNRQLVAA [SEQ ID NO: 100].

Según otra realización de este tipo la secuencia de aminoácidos es YARAAARQARAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 64].

Según otra realización, la enzima cinasa es una enzima cinasa seleccionada del grupo que consiste en: Ab 1, Akt/PKB, AMPK, Arg, Ask, Aurora-A, Axl, Blk, Bmx, Brk, BTK, CaMKI, CaMKIδ, CaMKIIβ, CaMKIIγ, CaMKI1β, caseína cinasa, Cdk, CDK9/ciclina, Ckly1, CKly2, CKly3, Ck1δ, CK2α, CK2, CHK, CDK1/ciclinaB, CHK1, mutantes de CHK2 , CK1δ, CK2, c-Kit, CLK2, CLK3, Cott, Csk, DAPK1, DCAMKL2, DDR, DYRK2, EGFR, Ephs, EphA2, FAK, Fer, Fes/Fps, FGFR, FGFR1, Fgr, Fit, Flt3, Flt4, Fms/CSF-I R, Fyn, GRK5, GRK6, GRK7, GSK, CSK3, Hck, HER/ErbB, HIPK1, HIPK2, HIPK3, IGF-1, ICF IR, IKK, insulina R, IRAK, IRAK1, IRK4, JAK, JAK1, JAK2, JAK3, JNK/SAPK, KDR, Lck, LIMK, LIMK1, LOK, Lyn, MAPK, MAPK1, MAPKAP cinasa, MEK, MEK1, MELK, Met, Mer, MINK, MKK, MLCK, MLK1, MRCKa, MSK1, MST, MST3, NEK, NEK3, NEK9, PDGFR, PDGFRα, PDGFRβ, PDK, PhKγ2, PI 3-cinasa, PIM, Pim-1, Pim-2, Pim-3, PKC, PKCβ1, PKCδ, PKD2, PKR, PKA, PKBβ, PKCβI, PKCδ, PKG1, PKG1α, PKG1β, PKR, PLK, PRAK, PTK5, Pyk, Raf, Ret, RIPK2, ROK/ROCK, ROCK-I, Ron, Ros, Rse, Rsk4, Rsk/MAPKAP cinasa, S6 cinasa, Rsk2, SAPK2a, SGK, c-Src, Src(1-530), Src, Syk, TAK1, TAO1, TAO2, TBK, Tie2/TEK, TLK2, Trk, TSSK2, TrkA, Txk, ULK3, Ulk2, VRK2, WEE, Yes, ZAP-70 y ZIPK. Según una realización de este tipo, la enzima cinasa se selecciona del grupo que consiste en una ROCK cinasa, una Src cinasa, una PKC cinasa y una Trk cinasa. Según algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa es una ROCK cinasa. Según algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa es una Src cinasa. Según algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa es una PKC cinasa. Según algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa es una Trk cinasa.

En otro aspecto, la presente invención proporciona la composición inhibidora de cinasa tal como se definió anteriormente para su uso en un método para tratar un neoplasma seleccionado del grupo que consiste en un papiloma, un adenoma, una mola hidatidiforme, un fibroma, un condroma, un osteoma, un leiomioma, un rabdomioma, un lipoma, un hemangioma, un linfangioma, una policitemia vera, una mononucleosis infecciosa, un glioma “benigno”, un meningioma, un ganglioneuroma, un neurilemoma, un neurofibroma, un nevo pigmentado (lunar), un feocromocitoma, un tumor carcinoide, un teratoma, un carcinoma, un adenocarcinoma, un carcinoma de células basales, un coriocarcinoma, un fibrosarcoma, un condrosarcoma, un osteosarcoma, un leiomiosarcoma, un rabdomiosarcoma, un liposarcoma, un hemangiosarcoma, un linfangiosarcoma, una leucemia mielocítica, una leucemia eritrocítica, una leucemia linfocítica, un mieloma múltiple, una leucemia monocítica, un sarcoma de Ewing, un linfoma maligno no Hodgkin, un meduloblastoma, un oligodendroglioma, un sarcoma neurilémico, melanoma maligno, timoma, un glioblastoma multiforme, un astrocitoma, un ependimoma, un sarcoma meníngeo, un neuroblastoma (schwannoma), un neurofibrosarcoma, un feocromocitoma maligno, un retinoblastoma, un tumor carcinoide, un nefroblastoma (tumor de Wilms), un teratocarcinoma y un carcinoma embrionario con coriocarcinoma.

Breve descripción de las la figuras

La figura 1 muestra células MCF-7 tratadas con diferentes dosis de cuatro péptidos KIP. El péptido 1 es HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166], el péptido 2 es WLRRIKAHRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 167], el péptido 3 es WLRRIKAWLRR [SEQ ID NO: 168] y el péptido 4 es WLRRIKAWLRRALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 169]. Para todos los péptidos, la concentración CI50 estaba por debajo de 15 µM.

La figura 2 muestra células MDA 231 tratadas con diferentes dosis de cuatro péptidos KIP. El péptido 1 es HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166], el péptido 2 es WLRRIKAHRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 167], el péptido 3 es WLRRIKAWLRR [SEQ ID NO: 168] y el péptido 4 es WLRRIKAWLRRALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 169]. Para todos los péptidos, la concentración CI50 estaba por debajo de 20 µM.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E08797416

14-09-2015

La figura 3 muestra células SF539 tratadas con diferentes dosis de cuatro péptidos KIP. El péptido 1 es HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166], el péptido 2 es WLRRIKAHRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 167], el péptido 3 es WLRRIKAWLRR [SEQ ID NO: 168] y el péptido 4 es WLRRIKAWLRRALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 169]. Para todos los péptidos, la concentración CI50 estaba por debajo de 27 µM.

La figura 4 muestra células HT29 tratadas con diferentes dosis de cuatro péptidos KIP. El péptido 1 es HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166], el péptido 2 es WLRRIKAHRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 167], el péptido 3 es WLRRIKAWLRR [SEQ ID NO: 168] y el péptido 4 es WLRRIKAWLRRALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 169]. Para todos los péptidos, la concentración CI50 estaba por debajo de 27 µM.

La figura 5 muestra células Paca 2 tratadas con diferentes dosis de cuatro péptidos KIP. El péptido 1 es HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166], el péptido 2 es WLRRIKAHRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 167], el péptido 3 es WLRRIKAWLRR [SEQ ID NO: 168] y el péptido 4 es WLRRIKAWLRRALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 169]. Para todos los péptidos, la concentración CI50 estaba por debajo de 43 µM.

La figura 6 muestra células PC3 tratadas con diferentes dosis de cuatro péptidos KIP. El péptido 1 es HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166], el péptido 2 es WLRRIKAHRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 167], el péptido 3 es WLRRIKAWLRR [SEQ ID NO: 168] y el péptido 4 es WLRRIKAWLRRALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 169]. Para todos los péptidos, la concentración CI50 estaba por debajo de 36 µM.

La figura 7 muestra células A549 tratadas con diferentes dosis de cuatro péptidos KIP. El péptido 1 es HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166], el péptido 2 es WLRRIKAHRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 167], el péptido 3 es WLRRIKAWLRR [SEQ ID NO: 168] y el péptido 4 es WLRRIKAWLRRALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 169]. Para todos los péptidos, la concentración CI50 estaba por debajo de 35 µM.

La figura 8 muestra que los péptidos KIP inducen apoptosis en una línea celular de cáncer. Se trataron células MCF7 durante 24 horas con 3 µM (paneles superiores) o 10 µM (paneles inferiores) de péptido KIP HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166]. Se tiñeron las células con colorante Hoescht (paneles A y D; azul), anticuerpo anti-anexina V (paneles B y E; verde) y yoduro de propidio (paneles C y F; rojo). Para ambas concentraciones sometidas a prueba, la tinción con anexina V fue mucho más intensa que la tinción con yoduro de propidio, lo que indica que los péptidos KIP pueden inducir apoptosis en una línea celular de cáncer.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona composiciones de inhibición de cinasa terapéuticas y usos de las mismas.

Los términos “administrar” o “administración” tal como se usan en el presente documento se usan de manera intercambiable e incluyen administración in vivo, así como administración directamente a tejido ex vivo. Generalmente, las composiciones pueden administrarse de manera sistémica, o bien por vía oral, bucal, parenteral, tópica, mediante inhalación o insuflación (es decir, a través de la boca o a través de la nariz), o bien por vía rectal en formulaciones de dosificación unitaria que contienen los portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables, no tóxicos, convencionales según se desee, o pueden administrarse de manera local por medios tales como, pero sin limitarse a, inyección, implantación, injerto, aplicación tópica o por vía parenteral. El término “parenteral” tal como se usa en el presente documento se refiere a la introducción en el organismo a modo de una inyección (es decir, administración mediante inyección), incluyendo, por ejemplo, inyección por vía subcutánea (es decir, una inyección por debajo de la piel), por vía intramuscular (es decir, una inyección en un músculo), por vía intravenosa (es decir, una inyección en una vena), por vía intratecal (es decir, una inyección en el espacio alrededor de la médula espinal o bajo la membrana aracnoides del cerebro), intraesternal o técnicas de infusión. Una composición administrada por vía parenteral se suministra usando una aguja, por ejemplo, una aguja quirúrgica. El término “aguja quirúrgica” tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier aguja adaptada para el suministro de composiciones fluidas (es decir, que pueden fluir) en una estructura anatómica seleccionada. Las preparaciones inyectables, tales como suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, pueden formularse según la técnica conocida usando agentes de dispersión o humectación y agentes de suspensión adecuados.

La administración adicional puede realizarse, por ejemplo, por vía intravenosa, pericárdica, oral, a través de implante, por vía transmucosa, transdérmica, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intratecal, intralinfática, intralesional o epidural. La administración puede realizarse, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces y/o a lo largo de uno o más periodos prolongados. El término “administración tópica” y “aplicación por vía tópica” tal como se usa en el presente documento se usan de manera intercambiable para referirse al suministro de un péptido, el ácido nucleico, o un vector que comprende el péptido o el ácido nucleico sobre una o más superficies de un tejido o célula, incluyendo superficies epiteliales.

Sin embargo, la administración tópica, a diferencia de la administración transdérmica, proporciona generalmente un efecto local más que sistémico. Los términos “administración tópica” y “administración transdérmica” tal como se usan en el presente documento, a menos que se establezca o implique otra cosa, se usan de manera intercambiable.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E08797416

14-09-2015

El término “asociar” o “asociados” tal como se usa en el presente documento se refiere a unir, conectar o combinar con, de manera o bien directa, indirecta, activa, inactiva, inerte, no inerte, completa o bien incompleta.

Las abreviaturas usadas el presente documento para aminoácidos son las abreviaturas que se usan convencionalmente: A=Ala=Alanina; R=Arg=Arginina; N=Asn=Asparagina; D=Asp=Ácido aspártico; C=Cys=Cisteína; Q=Gln=Glutamina; E=Glu=Ácido glutámico; G=Gly=Glicina; H=His=Histidina; I=Ile=Isoleucina; L=Leu=Leucina; K=Lys=Lisina; M=Met=Metionina; F=Phe=Fenilanina; P=Pro=Prolina; S=Ser=Serina; T=Thr=Treonina; W=Trp=Triptófano; Y=Tyr=Tirosina; V=Val=Valina. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos L o D. Un aminoácido puede reemplazarse por un aminoácido sintético que se altera para aumentar la semivida del péptido o para aumentar la potencia del péptido, o para aumentar la biodisponibilidad del péptido.

El término “poner en contacto” tal como se usa en el presente documento se refiere a llevar o colocar en contacto, estar en o entrar en contacto. El término “contacto” tal como se usa en el presente documento se refiere a un estado

o condición de tocarse o de estar en proximidad inmediata o local. La puesta en contacto de una composición con un destino diana, tal como, pero sin limitarse a, un órgano, tejido, célula o tumor, puede producirse mediante cualquier medio de administración conocido por el experto en la técnica.

Existen métodos para la transducción y la transfección de ácidos nucleicos al interior de células. Los términos “transducción”, o “transducir” tal como se usan en el presente documento se usan de manera intercambiable para referirse al proceso de atravesar membranas biológicas. El paso a través de membranas biológicas puede ser de una célula a otra, del entrono extracelular al entorno intracelular, o a través de una membrana celular o membrana nuclear. Los materiales que pueden experimentar transducción incluyen, pero no se limitan a, proteínas, proteínas de fusión, péptidos, polipéptidos, aminoácidos, ADN viral y ADN bacteriano.

El término “secuencia reguladora” (también denominada “región reguladora” o “elemento regulador”) se refiere a un promotor, potenciador u otro segmento ADN al que se unen proteínas reguladoras, tales como factores de transcripción, preferentemente para controlar la expresión génica y por tanto la expresión de proteínas.

El término “elemento regulador controlable” tal como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de ácido nucleico que pueden efectuar la expresión de los ácidos nucleicos, o el producto de péptido o proteína de los mismos. Los elementos reguladores controlables pueden unirse operativamente a los ácidos nucleicos, péptidos o proteínas de la presente invención. No es necesario que los elementos reguladores controlables, tales como, pero sin limitarse a, secuencias de control, sean contiguos a los ácidos nucleicos, péptidos o proteínas cuya expresión controlan siempre que funcionen para dirigir la expresión de los mismos. Por tanto, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias intermedias no traducidas aunque transcritas entre una secuencia promotora y un ácido nucleico de la presente invención y la secuencia promotora todavía puede considerare “operativamente unida” a la secuencia codificante. Otras secuencias de control de este tipo incluyen, pero no se limitan a, señales de poliadenilación, señales de terminación y señales de unión a ribosoma.

El término “hibridación” se refiere a la unión de dos moléculas de ácido nucleico monocatenarias entre sí a través de apareamiento de bases. Los nucleótidos se unirán a su complemento en condiciones normales, por lo que se unirán (o aparearán) entre sí fácilmente dos hebras perfectamente complementarias. Sin embargo, debido a las diferentes geometrías moleculares de los nucleótidos, una única inconsistencia entre las dos hebras hará que la unión entre ellas sea más desfavorable energéticamente. Los efectos de la incompatibilidad de bases pueden medirse cuantificando la velocidad a la que se aparean dos hebras, esto puede proporcionar información sobre la similitud en la secuencia de bases entre las dos hebras que están apareándose.

El término “aislado” se refiere a material, tal como un ácido nucleico, un péptido, o una proteína, que está: (1) sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interaccionan con el mismo tal como se encuentra en su entorno que se produce de manera natural. Los términos “sustancial o esencialmente libre” se usan para referirse a un material, que está libre en al menos el 80% de componentes que normalmente acompañan o interaccionan con el mismo tal como se encuentra en el entorno que se produce de manera natural. El material aislado comprende opcionalmente material no encontrado con el material en su entorno natural; o (2) si el material están en su entorno natural, el material se ha alterado de manera sintética (no natural) mediante la intervención humana deliberada para dar una composición y/o se ha colocado en una ubicación en la célula (por ejemplo, genoma u orgánulo subcelular) no nativa para el material encontrado en ese entorno. La alteración para dar el material sintético puede realizarse sobre el material dentro de, o extraído, de su estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico que se produce de manera natural se convierte en un ácido nucleico aislado si se altera o si se transcribe a partir de ADN que se ha alterado, por medio de la intervención humana realizada dentro de la célula a partir de la cual se origina. Véanse, por ejemplo, Compounds and Methods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiec, patente estadounidense n.º 5.565.350; In vivo Homologous Sequence Targeting in Eukaryotic Cells; Zarling et al., documento PCT/US93/03868. Asimismo, un ácido nucleico que se produce de manera natural (por ejemplo, un promotor) se aísla si se introduce por medios que no se producen de manera natural en un locus del genoma no nativo a ese ácido nucleico. Los ácidos nucleicos que se “aíslan” tal como se define en el presente documento también se denominan ácidos nucleicos “heterólogos”.

El término “efecto terapéutico” tal como se usa en el presente documento se refiere a una consecuencia de

15

25

35

45

55

E08797416

14-09-2015

tratamiento, cuyos resultados se consideran deseables y beneficiosos. Un efecto terapéutico puede incluir, directa o indirectamente, la detención, reducción o eliminación de una manifestación de enfermedad. Un efecto terapéutico también puede incluir, directa o indirectamente, la detención, reducción o eliminación de la progresión de una manifestación de enfermedad. El término “cantidad terapéuticamente eficaz” o una “cantidad eficaz” de uno o más de los agentes activos de la presente invención es una cantidad que es suficiente para proporcionar un efecto terapéutico. Generalmente, una cantidad eficaz de los agentes activos que puede emplearse oscila entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Sin embargo, los niveles de dosificación se basan en una variedad de factores, incluyendo el tipo de lesión, la edad, el peso, el sexo, el estado médico del paciente, la gravedad del estado, la vía de administración y el agente activo particular empleado. Por tanto, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero puede determinarse de manera rutinaria por un médico usando métodos convencionales.

El término “agente terapéutico” tal como se usa en el presente documento se refiere a un fármaco, molécula, ácido nucleico, proteína, composición u otra sustancia que proporciona un efecto terapéutico. El término “agente activo” tal como se usa en el presente documento se refiere al ingrediente, componente o constituyente de las composiciones de la presente invención responsables del efecto terapéutico deseado. Los términos “agente terapéutico” y “agente activo” se usan de manera intercambiable en el presente documento.

El término “componente terapéutico” tal como se usa en el presente documento se refiere a una dosificación terapéuticamente eficaz (es decir, dosis y frecuencia de administración) que elimina, reduce o previene la progresión de una manifestación de enfermedad particular en un porcentaje de una población. Un ejemplo de un componente terapéutico usado comúnmente es la DE50 que describe la dosis en una dosificación particular que es terapéuticamente eficaz para una manifestación de enfermedad particular en el 50% de una población.

El término “fármaco” tal como se usa en el presente documento se refiere a un agente terapéutico o cualquier sustancia, distinta de alimento, usada en la prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o cura de una enfermedad.

El término “reducir” o “reducción” tal como se usa en el presente documento se refiere a limitar la aparición del trastorno en individuos en riesgo de desarrollar el trastorno.

El término “modular” tal como se usa en el presente documento significa regular, alterar, adaptar o ajustar a una determinada medida o proporción.

Los términos “inhibiendo”, “inhibir” o “inhibición” tal como se usan en el presente documento se usan para referirse a reducir la cantidad o velocidad de un proceso, detener el proceso en su totalidad, o disminuir, limitar o bloquear la acción o función del mismo. La inhibición puede incluir una reducción o disminución de la cantidad, velocidad, función de acción, o proceso en al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98% o al menos el 99% en comparación con una sustancia de referencia, en la que la sustancia de referencia es una sustancia que no se inhibe.

El término “cinasa” tal como se usa en el presente documento se refiere a un tipo de enzima que transfiere grupos fosfato desde moléculas donadoras de alta energía hasta sustratos o moléculas diana específicas. Los grupos donadores de alta energía pueden incluir, pero no se limitan a, ATP.

El término “péptido inhibidor de cinasa” (o “KIP”) tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos de KIP. Una secuencia de aminoácidos de KIP dentro de un péptido o peptidomimético transmite al péptido o peptidomimético determinadas capacidades de inhibición de cinasa. KIP1, KIP2 y KIP3 son clases de secuencias de aminoácidos de KIP.

El término “peptidomimético” tal como se usa en el presente documento se refiere a una cadena de tipo proteína pequeña diseñada para imitar a un péptido. Un peptidomimético surge normalmente a partir de la modificación de un péptido existente con el fin de alterar las propiedades de la molécula.

El término “sustrato de cinasa” tal como se usa en el presente documento se refiere a un sustrato que puede fosforilarse mediante una cinasa.

El término “actividad cinasa” tal como se usa en el presente documento se refiere a fosforilación mediada por cinasa de un sustrato de cinasa.

El término “célula de mamífero” tal como se usa en el presente documento se refiere a una célula derivada de un animal de la clase Mammalia. Tal como se usa en el presente documento, las células de mamífero pueden incluir células normales, anómalas y transformadas. Los ejemplos de células de mamífero utilizadas dentro de la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, neuronas, células epiteliales, células musculares, células sanguíneas, células inmunitarias, células madre, osteocitos, células endoteliales y blastocitos.

El término “ácido nucleico” se refiere a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma o bien mono o

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E08797416

14-09-2015

bien bicatenaria, y a menos que se limite de otro modo, engloba análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales porque se hibridan con ácidos nucleicos monocatenarios de manera similar a nucleótidos que se producen de manera natural (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos).

El término “operativamente unido” se refiere a una unión funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en la que la secuencia promotora inicia y media en la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, operativamente unido significa que las secuencias de ácido nucleico que se unen son contiguas, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, son contiguas y están en el mismo marco de lectura.

El término “polinucleótido” se refiere a una desoxirribopolinucleótido, ribopolinucleótido, o análogos de los mismos que tienen la naturaleza esencial de un ribonucleótido natural porque se hibridan, en condiciones de hibridación rigurosas, sustancialmente con la misma secuencia de nucleótidos que nucleótidos que se producen de manera natural y/o permiten la traducción en el/los mismo(s) aminoácido(s) que el/los nucleótido(s) que se produce(n) de manera natural. Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen regulador o estructural nativo o heterólogo. A menos que se indique otra cosa, el término incluye referencia a la secuencia especificada así como a la secuencia complementaria de la misma. Por tanto, los ADN o RNA con estructuras principales modificadas por motivos de estabilidad o por otros motivos son “polinucleótidos” tal como se prevé el término en el presente documento. Además, los ADN o RNA que comprenden bases inusuales, tales como inosina,

o bases modificadas, tales como tritiladas, por citar sólo dos ejemplos, son polinucleótidos tal como se usa el término en el presente documento. Se apreciará que se han realizado una gran variedad de modificaciones al ADN y ARN que sirven para muchos fines útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término polinucleótido tal como se emplea en el presente documento abarca tales formas de polinucleótidos modificados química, enzimática o metabólicamente de polinucleótidos, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo entre otras cosas, células simples y complejas.

El término “péptido” tal como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido, proteína o peptidomimético. Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácido es un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente que se produce de manera natural, así como polímeros de aminoácido que se producen de manera natural. La naturaleza esencial de tales análogos de aminoácidos que se producen de manera natural es que, cuando se incorporan en una proteína, esa proteína es reactiva específicamente con anticuerpos producidos para la propia proteína pero que consisten en su totalidad en aminoácidos que se producen de manera natural. Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” también incluyen modificaciones incluyendo, pero sin limitarse a, glicosilación, unión de lípidos, sulfatación, gammacarboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación. Se apreciará, tal como se conoce bien y tal como se ha indicado anteriormente, que los polipéptidos pueden no ser completamente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de ubiquitinación, y pueden ser circulares, con o sin ramificación, generalmente como resultado de acontecimientos tras la traducción, incluyendo acontecimientos de procesamiento naturales y acontecimientos provocados por la manipulación humana que no se producen de manera natural. También pueden sintetizarse polipéptidos circulares, ramificados y circulares ramificados mediante un proceso natural distinto de traducción y mediante métodos completamente sintéticos.

El término “ácido nucleico” se refiere a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma o bien mono o bien bicatenaria y, a menos que se limite de otro modo, engloba análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales porque se hibridan con ácidos nucleicos monocatenarios de manera similar a los nucleótidos que se producen de manera natural (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos).

El término “nucleótido” se refiere a un compuesto químico que consiste en una base hetrocíclica, un azúcar y uno o más grupos fosfato. En los nucleótidos más comunes, la base es un derivado de purina o pirimidina, y el azúcar es la pentosa desoxirribosa o ribosa. Los nucleótidos son los monómeros de ácidos nucleicos, con tres o más uniones entre sí con el fin de formar un ácido nucleico. Los nucleótidos son las unidades estructurales de ARN, ADN y varios cofactores incluyendo, pero sin limitarse a, CoA, FAD, DMN, NAD y NADP. Las purinas incluyen adenina (A) y guanina (G); las pirimidinas incluyen citosina (C), timina (T) y uracilo (U).

El término “reducir” o “reducción” tal como se usa en el presente documento se refiere a una disminución en tamaño

o a la ralentización del crecimiento o la velocidad proliferativa de una célula de un neoplasma o hiperplasia.

El término “‘neoplasia” tal como se usa en el presente documento se refiere a la proliferación anómala de células que da como resultado un neoplasma. El término “neoplasma” tal como se usa en el presente documento se refiere a una masa anómala de tejido, cuyo crecimiento supera y no está coordinado con el de los tejidos normales, y persiste de la misma manera excesiva tras el cese del estímulo que provocó el cambio. Un neoplasma puede ser benigno, potencialmente maligno o maligno. Los neoplasmas benignos incluyen fibroides uterinos y nevos melanocíticos (lunares cutáneos). Estos neoplasmas no se transforman en cáncer. Los neoplasmas potencialmente malignos incluyen carcinoma in situ. Estos neoplasmas no invaden ni destruyen, pero con tiempo suficiente, se transformarán en un cáncer. Los neoplasmas malignos se denominan comúnmente cáncer. Estos neoplasmas invaden y destruyen el tejido circundante, pueden formar metástasis y finalmente matan al sujeto.

15

25

35

45

E08797416

14-09-2015

El término “hiperplasia” tal como se usa en el presente documento es un término general que se refiere a la proliferación de células dentro de un órgano o tejido más allá de la observada habitualmente por ejemplo en células que se dividen constantemente. La hiperplasia puede dar como resultado el agrandamiento macroscópico de un órgano, la formación de un tumor benigno, o puede ser visible sólo bajo un microscopio. Se considera que la hiperplasia es una respuesta fisiológica a un estímulo específico, y las células de un crecimiento hiperplásico siguen sometiéndose a mecanismos de control reguladores normales. La hiperplasia puede producirse en o sobre un sujeto. La hiperplasia puede deberse a varias causas, incluyendo demanda aumentada, respuesta inflamatoria crónica, disfunciones hormonales o compensación por daño o enfermedad en otra parte. La hiperplasia puede ser inocua y producirse en un tejido particular. La hiperplasia también puede inducirse artificialmente. La hiperplasia también puede producirse de manera anómala y estar asociada con una variedad de enfermedades clínicas. La hiperplasia incluye, pero no se limita a, una hiperplasia de la neoíntima de una arteria; cicatrices queloides o cicatrices hiperplásicas; adhesiones quirúrgicas; hiperplasia inducida quirúrgicamente; hiperplasia suprarrenal congénita; hiperplasia del endometrio; hiperplasia prostática benigna; hiperplasia de la mama; hiperplasia epitelial focal; hiperplasia sebácea; hiperplasia hepática compensatoria y estados hiperplásicos semejantes.

El término “sujeto” o “individuo” o “paciente” se usan de manera intercambiable para referirse a un miembro de una especie animal de origen mamífero, incluyendo pero sin limitarse a, un ratón, una rata, un gato, una cabra, una oveja, caballo, hámster, hurón, cerdo, un perro, una cobaya, un conejo y un primate, tal como, por ejemplo, un mono, simio o ser humano.

El término “tratar” o “tratamiento” tal como se usa en el presente documento se refiere a llevar a cabo uno o más de lo siguiente: (a) reducir la gravedad de un trastorno; (b) limitar el desarrollo de síntomas característicos de un trastorno que está tratándose; (c) limitar el empeoramiento de síntomas característicos de un trastorno que está tratándose; (d) limitar la reaparición de un trastorno en pacientes que tuvieron previamente el trastorno; y (e) limitar la reaparición de síntomas en pacientes que anteriormente eran sintomáticos para el trastorno. El término “enfermedad” o “trastorno” tal como se usa en el presente documento se refiere a una alteración de la salud o un estado de funcionamiento anómalo. El término “síndrome” tal como se usa en el presente documento se refiere a un patrón de síntomas indicativos de alguna enfermedad o estado. El término “lesión” tal como se usa en el presente documento se refiere un daño o perjuicio en una estructura o función del organismo producido por una fuerza o agente externo, que puede ser físico o químico. El término “estado” tal como se usa en el presente documento se refiere a una variedad de estados de salud y pretende incluir trastornos o enfermedades producidas por cualquier mecanismo subyacente o trastorno, lesión, y la estimulación de tejidos y órganos sanos. Los trastornos pueden incluir, por ejemplo, pero sin limitarse a, neoplasia o hiperplasia.

COMPOSICIONES: Péptidos de inhibición de cinasa (KIP)

Según un aspecto, la presente invención proporciona una composición inhibidora de cinasa, comprendiendo la composición un péptido inhibidor de cinasa tal como se define en las reivindicaciones, en la que el péptido inhibidor de cinasa inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa.

Según una realización, el péptido inhibidor de cinasa es un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina. En algunas realizaciones de este tipo, la secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa es HRRIKAWLKKILALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166]. En algunas realizaciones de este tipo, la secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa es WLRRIKAWLRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 113]. En algunas realizaciones de este tipo, la secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa es WLRRIKAWLRRALARQLGVA [SEQ ID NO: 177].

En algunas realizaciones de este tipo, la secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa es KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 173]. En algunas realizaciones de este tipo, la secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa es FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 163].

Según algunas realizaciones de este tipo, la secuencia de aminoácidos es YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 106].

Según otra realización de este tipo, la secuencia de aminoácidos es YARAAARQARAKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 100].

Según otra realización de este tipo, la secuencia de aminoácidos es YARAAARQARAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 64].

También se describen los péptidos de inhibición de cinasa de la tabla 1.

Tabla 1. Secuencias de aminoácidos de KIP adicionales

imagen1

E08797416

14-09-2015 E08797416

Secuencia de aminoácidos: [SEQ ID NO:]

1: (R)4-9 [SEQ ID NO: 1]

2: GRKKRRQRRRPPQ [SEQ ID NO: 2]

3: AYARAAARQARA [SEQ ID NO: 3]

4: DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE [SEQ ID NO: 4]

5: GWTLNSAGILLGLINLKALAALAKKIL [SEQ ID NO: 5]

6: PLSSIFSRIGDP [SEQ ID NO: 6]

7: AAVALLPAVLLALLAP [SEQ ID NO: 7]

8: AAVLLPVLLAAP [SEQ ID NO: 8]

9: VTVLALGALAGVGVG [SEQ ID NO: 9]

10: GALFLGWLGAAGSTMGAWSQP [SEQ ID NO: 10]

11: GWTLNSAGILLGLINLKALAALAKKIL [SEQ ID NO: 11]

12: KLALKLALKALKAALKLA [SEQ ID NO: 12]

13: KETWWETWWTEWSQPKKKRKV [SEQ ID NO: 13]

14: KAFAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 14]

15: KAFAKLAARLYRAA [SEQ ID NO: 15]

16: AAFAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 16]

17: KAFAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 17]

18: KAFAKLAARLYRKAGC [SEQ ID NO: 18]

19: KAFAKLAARLYRAAGC [SEQ ID NO: 19]

20: AAFAKLAARLYRKAGC [SEQ ID NO: 20]

21: KAFAKLAARLYRKAGC [SEQ ID NO: 21]

22: KAFAKLAAQLYRKAGC [SEQ ID NO: 22]

23: AGGGGYGRKKRRQRRR [SEQ ID NO: 23]

24: (WLRRIKA)1-3 [SEQ ID NO: 176]

25: YGRKKRRQRRR [SEQ ID NO: 24]

26: YARAAARQARA [SEQ ID NO: 25]

27: RQRRKKRG [SEQ ID NO: 26]

28: GRKKRRQR [SEQ ID NO: 27]

29: YARAAARQARAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 28]

30: YGRKKRRQRRRKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 29]

31: GRKKRRQRKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 30]

32: RQRRKKRGKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 31]

33: WLRRIKAWLRRIKAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 32]

34: WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 33]

35: YARAAARQARAKKKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 34]

36: YGRKKRRQRRRKKKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 33]

37: RQRRKKRGKKKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 36]

38: GRKKRRQRKKKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 37]

39: WLRRIKAWLRRIKAKKKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 38]

40: WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAKKKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 39]

41: YARAAARQARAKKKALNRGLGVA [SEQ ID NO: 40]

42: YGRKKRRQRRRKKKALNRGLGVA [SEQ ID NO: 41]

43: RQRRKKRGKKKALNRGLGVA [SEQ ID NO: 42]

44: GRKKRRQRKKKALNRGLGVA [SEQ ID NO: 43]

45: WLRRIKAWLRRIKAKKKALNRGLGVA [SEQ ID NO: 44]

46: WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAKKKALNRGLGVA [SEQ ID NO: 45]

47: YARAAARQARAKKKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 46]

48: YGRKKRRQRRRKKKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 47]

49: RQRRKKRGKKKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 48]

50: GRKKRRQRKKKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 49]

51: WLRRIKAWLRRIKAKKKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 50]

52: WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAKKKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 51]

53: YARAAARQARAKKKALARQLGVA [SEQ ID NO: 52]

54: YGRKKRRQRRRKKKALARQLGVA [SEQ ID NO: 53]

55: RQRRKKRGKKKALARQLGVA [SEQ ID NO: 54]

56: GRKKRRQRKKKALARQLGVA [SEQ ID NO: 55]

57: WLRRIKAWLRRIKAKKKALARQLGVA [SEQ ID NO: 56]

58: WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAKKKALARQLGVA [SEQ ID NO: 57]

59: YARAAARQARAKALNRGLGVA [SEQ ID NO: 58]

60: YGRKKRRQRRRKALNRGLGVA [SEQ ID NO: 39]

61: RQRRKKRGKALNRGLGVA [SEQ ID NO: 60]

62: GRKKRRQRKALNRGLGVA [SEQ ID NO: 61]

14-09-2015

Secuencia de aminoácidos: [SEQ ID NO:]

63: WLRRIKAWLRRIKAKALNRGLGVA [SEQ ID NO: 62]

64: WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAKALNRGLGVA [SEQ ID NO: 63]

65: YARAAARQARAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 64]

66: YGRKKRRQRRRKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 65]

67: RQRRKKRGKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 66]

68: GRKKRRQRKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 67]

69: WLRRIKAWLRRIKAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 68]

70: WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 69]

71: YARAAARQARAKALARQLGVA [SEQ ID NO: 70]

72: YGRKKRRQRRRKALARQLGVA [SEQ ID NO: 71]

73: RQRRKKRGKALARQLGVA [SEQ ID NO: 72]

74: GRKKRRQRKALARQLGVA [SEQ ID NO: 73]

75: WLRRIKAWLRRIKAKALARQLGVA [SEQ ID NO: 74]

76: WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAKALARQLGVA [SEQ ID NO: 75]

77: YARAAARQARAKKKALNRGLGVAA [SEQ ID NO: 76]

78: YGRKKRRQRRRKKKALNRGLGVAA [SEQ ID NO: 77]

79: RQRRKKRGKKKALNRGLGVAA [SEQ ID NO: 78]

80: GRKKRRQRKKKALNRGLGVAA [SEQ ID NO: 79]

81: WLRRIKAWLRRIKAKKKALNRGLGVAA [SEQ ID NO: 80]

82: WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAKKKALNRGLGVAA [SEQ ID NO: 81]

83: YARAAARQARAKKKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 82]

84: YGRKKRRQRRRKKKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 83]

85: RQRRKKRGKKKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 84]

86: GRKKRRQRKKKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 85]

87: WLRRIKAWLRRIKAKKKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 86]

88: WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAKKKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 87]

89: YARAAARQARAKKKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 88]

90: YGRKKRRQRRRKKKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 89]

91: RQRRKKRGKKKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 90]

92: GRKKRRQRKKKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 91]

93: WLRRIKAWLRRIKAKKKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 92]

94: WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAKKKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 93]

95: YARAAARQARAKALNRGLGVAA [SEQ ID NO: 94]

96: YGRKKRRQRRRKALNRGLGVAA [SEQ ID NO: 95]

97: RQRRKKRGKALNRGLGVAA [SEQ ID NO: 96]

98: GRKKRRQRKALNRGLGVAA [SEQ ID NO: 97]

99: WLRRIKAWLRRIKAKALNRGLGVAA [SEQ ID NO: 98]

100: WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAKALNRGLGVAA [SEQ ID NO: 99]

101: YARAAARQARAKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 100]

102: YGRKKRRQRRRKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 101]

103: RQRRKKRGKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 102]

104: GRKKRRQRKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 103]

105: WLRRIKAWLRRIKAKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 104]

106: WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 105]

107: YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 106]

108: YGRKKRRQRRRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 107]

109: RQRRKKRGKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 108]

110: GRKKRRQRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 109]

111: WLRRIKAWLRRIKAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 110]

112: WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 111]

113: WLRRIKAWLRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 113]

114: WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 142]

115: FAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 160]

116: FAKLAARLYRKAGC [SEQ ID NO: 161]

117: FAKLAARLYRKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 162]

118: FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 163]

119: FAKLAARLYRKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 164]

120: FAKLAARLYRKALARQLGVA [SEQ ID NO: 165]

121: HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166]

122: WLRRIKAHRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 167]

123: WLRRIKAWLRR [SEQ ID NO: 168]

124: WLRRIKAWLRRALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 169]

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

E08797416

14-09-2015

Secuencia de aminoácidos: [SEQ ID NO:]

125: YARAAARQARAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 147]

126: YARAAARQARALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 170]

127: YARAAARQARALARQLGVAA [SEQ ID NO: 171]

128: KAFAKLAARLYRKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 172]

129: KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 173]

130: KAFAKLAARLYRKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 174]

131: KAFAKLAARLYRKALARQLGVA [SEQ ID NO: 175]

132: WLRRIKAWLRRALARQLGVA [SEQ ID NO: 177]

Los siguientes términos se usan en el presente documento para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) “secuencia de referencia”, (b) “intervalo de comparación”, (c) “identidad de secuencia”, (d) “porcentaje de identidad de secuencia” y (e) “identidad sustancial”.

El término “secuencia de referencia” se refiere a una secuencia usada como base para comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como segmento de una secuencia génica o ADNc de longitud completa, o la secuencia génica o ADNc completo.

El término “intervalo de comparación” se refiere a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótido, en el que la secuencia de polinucleótido puede compararse con una secuencia de referencia y en el que la parte de la secuencia de polinucleótido en el intervalo de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, el intervalo de comparación tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos contiguos, y opcionalmente puede tener una longitud de al menos 30 nucleótidos contiguos, una longitud de al menos 40 nucleótidos contiguos, una longitud de al menos 50 nucleótidos contiguos, una longitud de al menos 100 nucleótidos contiguos, ser más largo. Los expertos en la técnica entienden que para evitar una alta similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de huecos en la secuencia de polinucleótido, normalmente se introduce una penalización de hueco y se resta del número de coincidencias.

Se conocen bien en la técnica métodos de alineación de secuencias para comparación. La alineación de secuencias óptima para comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol.

48:443 (1970); mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 (1988); mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos, incluyendo, pero sin limitarse a: CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, Calif.; GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., EE.UU; el programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins y Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16:10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8:155-65 (1992), y Pearson, et al., Methods in Molecular Biology 24:307-331 (1994). La familia de programas BLAST, que pueden usarse para búsquedas de similitud en bases de datos, incluye: BLASTN para secuencias de consulta de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de nucleótidos; BLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de proteínas; BLASTP para secuencias de consulta de proteínas contra secuencias de bases de datos de proteínas; TBLASTN para secuencias de consulta de proteínas contra secuencias de bases de datos de nucleótidos; y TBLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de nucleótidos. Véase, Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1995).

A menos que se indique otra cosa, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en el presente documento se refieren al valor obtenido usando el paquete de programas BLAST 2.0 usando parámetros por defecto. Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). El software para realizar análisis de BLAST está públicamente disponible, por ejemplo, a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.hcbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que o bien coinciden

o bien satisfacen alguna puntuación T umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina el umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al., citado anteriormente). Estos resultados positivos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contienen. Los resultados positivos de palabra se extienden entonces en ambos sentidos a lo largo de cada secuencia todo lo que pueda aumentarse la alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre>0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siembre<0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los resultados positivos de palabra en cada sentido se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa disminuye en la cantidad X con respecto a su valor máximo logrado; la puntuación acumulativa se vuelve cero o menor, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo de BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos)

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E08797416

14-09-2015

usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, punto de corte de 100, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo de BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo de BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con la que se produciría una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos por casualidad. Las búsquedas en BLAST suponen que las proteínas pueden modelarse como secuencias al azar. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencias no al azar que pueden ser extensiones homopoliméricas, repeticiones de periodo coro o regiones enriquecidas en uno o más aminoácidos. Tales regiones de baja complejidad pueden alinearse entre proteínas no relacionadas aunque otras regiones de la proteína sean completamente distintas. Pueden emplearse varios programas de filtro de baja complejidad para reducir tales alineaciones de baja complejidad. Por ejemplo, pueden emplearse los filtros de baja complejidad SEG (Wooten y Federhen, Comput. Chem., 17:149-163 (1993)) y XNU (Claverie y States, Comput. Chem., 17:191-201 (1993)) solos o en combinación.

Tal como se usa en el presente documento, “identidad de secuencia” o “identidad” en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para correspondencia máxima a lo largo de un intervalo de comparación especificado. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de residuo que no son idénticas a menudo difieren en sustituciones de aminoácido conservativas, es decir, cuando los residuos de aminoácido se sustituyen por otros residuos de aminoácido con propiedades químicas similares (por ejemplo carga o hidrofobia) y por tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse de manera ascendente para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren en tales sustituciones conservativas tienen “similitud de secuencia” o “similitud”. Los expertos en la técnica conocen bien medios para obtener este ajuste. Normalmente esto implica puntuar una sustitución conservativa como coincidencia errónea parcial en lugar de completa, aumentando de ese modo el porcentaje de identidad de secuencia. Por tanto, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le da una puntuación de 1 y a una sustitución no conservativa se le da una puntuación de cero, a una sustitución conservativa se le da una puntuación entre cero y 1. La puntuación de sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, según el algoritmo de Meyers y Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4:11-17 (1988) por ejemplo, tal como se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif., EE.UU.).

Tal como se usa en el presente documento, “porcentaje de identidad de secuencia” significa el valor determinado comparando dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de un intervalo de comparación, en el que la parte de la secuencia de polinucleótido en el intervalo de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) as en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número posiciones en las que se producen bases de ácido nucleico o residuos de aminoácido idénticos en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en el intervalo de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia.

El término “identidad sustancial” de secuencias de polinucleótido significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70%, una identidad de secuencia de al menos el 80%, una identidad de secuencia de al menos el 90% y una identidad de secuencia de al menos el 95%, en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineación descritos usando parámetros convencionales. Un experto reconocerá que estos valores pueden ajustarse de manera apropiada para determinar identidades correspondientes de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, la colocación del marco de lectura y similares. Identidad sustancial de secuencias de aminoácidos para estos fines normalmente significa identidad de secuencia de al menos el 60%, o al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, o al menos el 95%. Otra indicación de que secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es si dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas. Sin embargo, los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones rigurosas todavía son sustancialmente idénticos si los polipéptidos para los que codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede producirse, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la degeneración de codones máxima permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que el polipéptido para el que codifica el primer ácido nucleico presenta reacción cruzada inmunológicamente con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico.

El término “identidad sustancial” en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a una secuencia de referencia, una identidad de secuencia de al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o el 95% con respecto a la secuencia de referencia a lo largo del intervalo de comparación especificado. Opcionalmente, la alineación óptima se realiza usando el algoritmo de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970). Una indicación de que dos

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E08797416

14-09-2015

secuencias peptídicas son sustancialmente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos producidos contra el segundo péptido. Por tanto, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren sólo en una sustitución conservativa. Los péptidos que son “sustancialmente similares” comparten secuencias tal como se observó anteriormente excepto en aquellas posiciones de residuos que no son idénticas que pueden diferir en cambios de aminoácidos conservativos.

También se describe un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 85% con respecto a KIP1, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa. El ácido nucleico aislado codifica para un polipéptido con una identidad de secuencia de aminoácidos del 100% con respecto a KIP1, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa. En algunas realizaciones de este tipo, la secuencia de KIP1 está operativamente unida a un elemento regulador controlable.

También se describe un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 85% con respecto a KIP2, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa. El ácido nucleico aislado codifica para un polipéptido con una identidad de secuencia de aminoácidos del 100% con respecto a KIP2, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa. La secuencia de KIP2 está operativamente unida a un elemento regulador controlable.

Se describe adicionalmente un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 85% con respecto a KIP3, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa. El ácido nucleico aislado codifica para un polipéptido con una identidad de secuencia de aminoácidos del 100% con respecto a KIP3, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa. La secuencia de KIP3 está operativamente unida a un elemento regulador controlable

También se describe un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 85% con respecto a KIP4, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa. El ácido nucleico aislado codifica para un polipéptido con una identidad de secuencia de aminoácidos del 100% con respecto a KIP4, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa. La secuencia de KIP4 está operativamente unida a un elemento regulador controlable.

Se describe adicionalmente un ácido nucleico aislado que se hibrida específicamente con ARNm que codifica para un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de KIP1 o KIP2. El término “se hibrida específicamente” tal como se usa en el presente documento se refiere al proceso por el que un ácido nucleico forma pares de bases de manera distintiva o definitiva con regiones complementarias de al menos una cadena de ADN que no estaba apareada originalmente con el ácido nucleico. Por ejemplo, un ácido nucleico que puede unirse o hibridarse con al menos una parte de un ARNm de una célula que codifica para un péptido que comprende una secuencia de KIP puede considerarse un ácido nucleico que se hibrida específicamente. Un ácido nucleico que se hibrida selectivamente experimenta hibridación, en condiciones de hibridación rigurosa, de la secuencia de ácido nucleico con una secuencia diana de ácido nucleico especificada en un grado detectablemente mayor (por ejemplo, al menos 2 veces con respecto al nivel inicial) que su hibridación con secuencias de ácido nucleico no diana y con la exclusión sustancial de ácidos nucleicos no diana. Las secuencias que se hibridan selectivamente normalmente tienen una identidad de secuencia de aproximadamente al menos el 80%, una identidad de secuencia de al menos el 90% o una identidad de secuencia de al menos el 100% (es decir, son complementarias) entre sí.

Los métodos de extracción de ARN se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en J. Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), vol. 1, capítulo 7, “Extraction, Purification, and Analysis of Messenger RNA from Eukaryotic Cells”, incorporado en el presente documento como referencia. Otros métodos de aislamiento y extracción también se conocen bien, por ejemplo en F. Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, 2007. Normalmente, el aislamiento se realiza en presencia de agentes caotrópicos, tales como cloruro de guanidinio o tiocianato de guanidinio, aunque pueden usarse alternativamente otros detergentes y agentes de extracción. Normalmente, el ARNm se aísla a partir del ARN extraído total mediante cromatografía sobre oligo(dT)-celulosa u otros medios cromatográficos que tienen capacidad para unirse a la parte en 3’-poliadenilada de las moléculas de ARNm. Alternativamente, pero menos preferiblemente, puede usarse el ARN total. Sin embargo, generalmente se prefiere aislar poli(A)+ARN de fuentes de mamífero.

También se describe un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos de un péptido KIP.

Métodos de inhibición de la actividad cinasa

Se describe adicionalmente un método para inhibir la actividad cinasa de una enzima cinasa, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una composición inhibidora de cinasa, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un péptido inhibidor de cinasa; (b) poner en contacto la composición inhibidora de cinasa con una enzima cinasa de manera que el péptido inhibidor de cinasa se asocia con la enzima cinasa; y (c) reducir la actividad cinasa de la enzima cinasa.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E08797416

14-09-2015

También se describe un método para inhibir la actividad cinasa de una enzima cinasa, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una composición inhibidora de cinasa, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un péptido inhibidor de cinasa, en el que el péptido inhibidor de cinasa comprende además un péptido KIP1; (b) poner en contacto la composición inhibidora de cinasa con una enzima cinasa de manera que el péptido inhibidor de cinasa se asocia con la enzima cinasa; y (c) reducir la actividad cinasa de la enzima cinasa.

Se describe adicionalmente un método para inhibir la actividad cinasa de una enzima cinasa, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una composición inhibidora de cinasa, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un péptido inhibidor de cinasa, en el que el péptido inhibidor de cinasa comprende además un péptido KIP2; (b) poner en contacto la composición inhibidora de cinasa con una enzima cinasa de manera que el péptido inhibidor de cinasa se asocia con la enzima cinasa; y (c) reducir la actividad cinasa de la enzima cinasa.

También se describe un método para inhibir la actividad cinasa de una enzima cinasa, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una composición inhibidora de cinasa, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un péptido inhibidor de cinasa, en el que el péptido inhibidor de cinasa comprende además un péptido KIP3; (b) poner en contacto la composición inhibidora de cinasa con una enzima cinasa de manera que el péptido inhibidor de cinasa se asocia con la enzima cinasa; y (c) reducir la actividad cinasa de la enzima cinasa.

También se describe un método para disminuir la velocidad enzimática de una reacción de cinasa, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una composición inhibidora de cinasa, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un péptido inhibidor de cinasa, en el que el péptido inhibidor de cinasa comprende un péptido KIP1, (b) poner en contacto la composición inhibidora de cinasa con una enzima cinasa de manera que el péptido inhibidor de cinasa se asocia con la enzima cinasa; y (c) disminuir la velocidad enzimática de la enzima cinasa. En algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa está en una célula procariota. En algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa está en una célula eucariota. En algunas realizaciones de este tipo, el péptido inhibidor de cinasa está operativamente unido a un elemento regulador controlable.

Se describe adicionalmente un método para disminuir la velocidad enzimática de una reacción de cinasa, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una composición inhibidora de cinasa, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un péptido inhibidor de cinasa, en el que el péptido inhibidor de cinasa comprende un péptido KIP2, (b) poner en contacto la composición inhibidora de cinasa con la enzima cinasa de manera que el péptido inhibidor de cinasa se asocia con la enzima cinasa; y (c) disminuir la velocidad enzimática de la enzima cinasa. En algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa está en una célula procariota. En algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa está en una célula eucariota. En algunas realizaciones de este tipo, el péptido inhibidor de cinasa está operativamente unido a un elemento regulador controlable.

Según otra realización, la enzima cinasa es una serina cinasa. Según otra realización, la enzima cinasa es una treonina cinasa. Según otra realización, la enzima cinasa es una tirosina cinasa. Según otra realización, la enzima cinasa es una tirosina cinasa receptora. Según otra realización, la enzima cinasa es una serina/treonina cinasa.

Según otra realización, la enzima cinasa es una enzima cinasa seleccionada del grupo que consiste en: Ab 1, Akt/PKB, AMPK, Arg, Ask, Aurora-A, Axl, Blk, Bmx, Brk, BTK, CaMKI, CaMKIδ, CaMKIIβ, CaMKIIγ, CaMKIIβ, caseína cinasa, Cdk, CDK9/ciclina, Ckly1, CKly2, CKly3, Ck1δ, CK2α, CK2, CHK, CDK1/ciclina B, CHK1, mutantes de CHK2, CK1δ, CK2, c-Kit, CLK2, CLK3, Cott, Csk, MAPK1, DCAMKL2, DDR, DYRK2, EGFR, Ephs, EphA2, FAK, Fer, Fes/Fps, FGFR, FGFRI, Fgr, Fit, Flt3, Flt4, Fms/CSF-1 R, Fyn, GRK5, GRK6, GRK7, GSK, CSK3, Hck, HER/ErbB, HIPK1, HIPK2, HIPK3, IGF-1, ICF IR, IKK, insulina R, IRAK, IRAK1, IRAK4, JAK, JAK1, JAK2, JAK3, JNK/SAPK, KDR, Lck, LIMK, LIMK1, LOK, Lyn, MAPK, MAPK1, MAPKAP cinasa, MEK, MEK1, MELK, Met, Mer, MINK, MKK, MLCK, MLK1, MRCKa, MSK1, MST, MST3, NEK, NEK3, NEK9, PDGFR, PDGFRα, PDGFRβ, PDK, PhKγ2, PI 3cinasa, PIM, Pim-1, Pim-2, Pim-3, PKC, PKCβ1, PKC8, PKD2, PKR, PKA, PKBβ, PKCβI, PKCδ, PKG1, PKG1α, PKG1β, PKR, PLK, PRAK, PTK5, Pyk, Raf, Rct, RIPK2, ROK/ROCK, ROCK-I, Ron, Ros, Rse, Rsk4, Rsk/MAPKAP cinasa, S6 cinasa, Rsk2, SAPK2a, SGK, c-Src, Src(1-530), Src, Syk, TAK1, TAO1, TAO2, TBK, Tie2/TEK, TLK2, Trk, TSSK2, TrkA, Txk, ULK3, Ulk2, VRK2, WEE, Yes, ZAP-70 y ZIPK.

En algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa se selecciona del grupo que consiste en una ROCK cinasa, una Src cinasa, una PKC cinasa y una Trk cinasa. En algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa es una ROCK cinasa. En algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa es ROCK-1. En algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa es una Src cinasa. En algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa es SRrc(1-530). En algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa es una PKC cinasa. En algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa es PKCβ1 o PKCδ. En algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa es una Trk cinasa. En algunas realizaciones de este tipo, la enzima cinasa es TrkA.

También se describe un método de inhibición de la traducción de ARNm de una molécula de ARNmKIP, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una composición inhibidora de cinasa, en el que la

15

25

35

45

55

E08797416

14-09-2015

composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 100% con respecto a KIP1, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa; (b) poner en contacto la composición inhibidora de cinasa de la etapa (a) con una molécula de ARNmKIP de manera que el ácido nucleico aislado se hibrida con el ARNmKIP; y (c) inhibir la traducción del ARNm de la molécula de ARNmKIP. Tal como se usa en el presente documento, el término “ARNmKIP” se refiere a una molécula de ARNm que tras la traducción del ARNm, produce una molécula de KIP. En algunas realizaciones de este tipo, la traducción del ARNm de la molécula de ARNmKIP produce una molécula de KIP1. En algunas realizaciones de este tipo, la molécula de ARNmKIP comprende una secuencia de KIP operativamente unida a un elemento regulador controlable. En algunas realizaciones de este tipo, en la etapa (a) el ácido nucleico aislado codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 85% con respecto a un péptido KIP1.

Se describe adicionalmente un método de inhibición de la traducción de ARNm de una molécula de ARNmKIP, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una composición inhibidora de cinasa, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 100% con respecto a un péptido KIP2, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa; (b) poner en contacto la composición inhibidora de cinasa de la etapa (a) con una molécula de ARNmKIP de manera que el ácido nucleico aislado se hibrida con el ARNmKIP; y (c) inhibir la traducción del ARNm de la molécula de ARNmKIP. En algunas realizaciones de este tipo, la traducción del ARNm de la molécula de ARNmKIP produce una molécula de KIP2. En algunas realizaciones de este tipo, la molécula de ARNmKIP comprende una secuencia de KIP operativamente unida a un elemento regulador controlable. En algunas realizaciones de este tipo, en la etapa (a) el ácido nucleico aislado codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% con respecto a un péptido KIP2.

También se describe un método de inhibición de una función de inhibición de cinasa de un péptido KIP1, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una composición inhibidora de cinasa, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo específico frente a un epítopo de una secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa, en el que la secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa es una secuencia de aminoácidos del péptido KIP1; (b) poner en contacto la composición inhibidora de cinasa de la etapa (a) con un péptido KIP1 de manera que el anticuerpo se asocia con el péptido KIP1; y (c) inhibir la función de inhibición de cinasa del péptido inhibidor de cinasa.

Se describe adicionalmente un método de inhibición de la función de inhibición de cinasa de un péptido KIP2, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una composición inhibidora de cinasa, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo específico frente a un epítopo de una secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa, en el que el secuencia de aminoácidos del péptido inhibidor de cinasa es una secuencia de aminoácidos del péptido KIP2; (b) poner en contacto la composición inhibidora de cinasa de la etapa (a) con un péptido KIP2 de manera que el anticuerpo se asocia con el péptido KIP2; y (c) inhibir la función de inhibición de cinasa del péptido inhibidor de cinasa.

Inhibición de trastornos

También se describe un método para inhibir la hiperplasia de una población celular, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inhibidora de cinasa a un sujeto que la necesita, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 100% con respecto a un péptido KIP, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa; (b) poner en contacto la composición inhibidora de cinasa de la etapa (a) con al menos una célula hiperplásica de manera que el ácido nucleico aislado se asocia con la al menos una célula hiperplásica; y (c) inhibir la hiperplasia. En otra realización, el ácido nucleico aislado de la etapa (a) comprende además un elemento regulador controlable.

Se describe adicionalmente un método para inhibir la hiperplasia de una población celular, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inhibidora de cinasa a un sujeto que la necesita, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un péptido inhibidor de cinasa, en la que el péptido inhibidor de cinasa comprende un péptido KIP, (b) poner en contacto la composición inhibidora de cinasa con al menos una célula hiperplásica de manera que el péptido inhibidor de cinasa se asocia con la al menos una célula hiperplásica; y (c) inhibir la hiperplasia. En algunas realizaciones de este tipo, el péptido inhibidor de cinasa de la etapa (a) está operativamente unido a un elemento regulador controlable.

El término “crecimiento” tal como se usa en el presente documento se refiere a un proceso de hacer más grandes, más largas o más numerosas, o un amento en tamaño, número o volumen de las células en una población celular.

También se describe un método para inhibir el crecimiento de un neoplasma, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inhibidora de cinasa a un sujeto que la necesita, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 100% con

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E08797416

14-09-2015

respecto a un péptido KIP, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa; (b) poner en contacto el neoplasma con la composición inhibidora de cinasa de la etapa (a) de manera que el ácido nucleico aislado se asocia con el neoplasma; y (c) inhibir el crecimiento del neoplasma. En otra realización, el ácido nucleico aislado de la etapa (a) comprende además un elemento regulador controlable.

Se describe adicionalmente un método para inhibir el crecimiento de un neoplasma, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inhibidora de cinasa a un sujeto que la necesita, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un péptido inhibidor de cinasa, en el que el péptido inhibidor de cinasa comprende un péptido KIP, (b) poner en contacto el neoplasma con la composición inhibidora de cinasa de manera que el péptido inhibidor de cinasa se asocia con el neoplasma; y (c) inhibir el crecimiento del neoplasma. En algunas realizaciones de este tipo, el péptido inhibidor de cinasa de la etapa (a) está operativamente unido a un elemento regulador controlable.

Según otra realización, el neoplasma es un tumor benigno. Según otra realización, el neoplasma es un tumor maligno.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona la composición inhibidora de cinasa tal como se definió anteriormente para su uso en un método de tratamiento de un neoplasma seleccionado del grupo que consiste en un papiloma, un adenoma, una mola hidatidiforme, un fibroma, un condroma, un osteoma, un leiomioma, un rabdomioma, un lipoma, un hemangioma, un linfangioma, una policitemia vera, una mononucleosis infecciosa, un glioma “benigno”, un meningioma, un ganglioneuroma, un neurilemoma, un neurofibroma, un nevo pigmentado (lunar), un feocromocitoma, un tumor carcinoide, un teratoma, un carcinoma, un adenocarcinoma, un carcinoma de células basales, un coriocarcinoma, un fibrosarcoma, un condrosarcoma, un osteosarcoma, un leiomiosarcoma, un rabdomiosarcoma, un liposarcoma, un hemangiosarcoma, un linfangiosarcoma, una leucemia mielocítica, una leucemia eritrocítica, una leucemia linfocítica, un mieloma múltiple, una leucemia monocítica, un sarcoma de Ewing, un linfoma maligno no Hodgkin, un meduloblastoma, un oligodendroglioma, un sarcoma neurilémico, melanoma maligno, timoma, un glioblastoma multiforme, un astrocitoma, un ependimoma, un sarcoma meníngeo, un neuroblastoma (schwannoma), un neurofibrosarcoma, un feocromocitoma maligno, un retinoblastoma, un tumor carcinoide, un nefroblastoma (tumor de Wilms), un teratocarcinoma y un carcinoma embrionario con coriocarcinoma.

El ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 100% con respecto a un péptido KIP, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa, puede administrarse de manera local o sistémica.

Se describen adicionalmente experimentos en modelos animales de enfermedad humana que se usarán para determinar el efecto de los polipéptidos de la presente invención. Estos modelos animales se han usado por otros investigadores, y se aceptan generalmente como tales. Los resultados terapéuticos obtenidos con este modelo pueden extrapolarse por tanto a métodos de tratamiento de sujetos humanos.

Modelo de hiperplasia

Puede evaluarse un péptido KIP para determinar su capacidad para reducir la hiperplasia usando un modelo porcino de reestenosis coronaria tal como describen Heldman et al. (A.W. Heldman, L. Cheng, G.M. Jenkins, etc., 2001, “Paclitaxel Stent Coating Inhibits Neointimal Hyperplasia at 4 Weeks in a Porcine Model of Coronary Restenosis,” Circulation, 103: 2289-2295). Las endoprótesis se recubren sumergiendo la endoprótesis en una disolución que contiene un péptido KIP y secando el disolvente. Las endoprótesis recubiertas se montan en catéteres de balón y se esterilizan usando gas de óxido de etileno. Se tratan previamente cerdos enanos NIH machos y hembras que pesan de 35 a 45 kg con aspirina (325 mg) y diltiazem (180 mg) el día antes de la implantación de la endoprótesis. Tras sedar los animales con ketamina (20 mg/kg i.m.) y acetilpromazina (0,22 mg/kg i.m.) y administrar a los animales pentobarbital sódico (4 mg/kg i.v.) para facilitar la colocación en decúbito supino y la intubación endotraqueal, se inserta una cubierta arterial en la arteria carótida derecha según una técnica quirúrgica estéril. Tras la administración de heparina (5000 U), puede colocarse la endoprótesis en la arteria coronaria descendente anterior izquierda a través de un catéter guía y desplegarse usando insuflaciones de balón. Se realizan angiogramas a lo largo del periodo de recuperación y experimental. El grado de hiperplasia puede evaluarse, entre otros métodos, usando preparación histológica y análisis histomorfométrico.

Modelo de neoplasma

Puede evaluarse un péptido KIP para determinar la capacidad de un péptido KIP para inhibir o disminuir el crecimiento de un neoplasma usando un modelo de tumor de ratón scid, tal como describen Becker et al. (J.C. Becker, N. Varki, S.D. Gillies, K. Furukawa, y R.A. Reisfeld, 1996, “Long-lived and Transferable Tumor Immunity in Mice after Targeted Interleukin-2 Therapy,” J. Clin. Invest., 98(12): 2801-2804). Pueden inducirse tumores subcutáneos mediante la inyección subcutánea de 5 x 106 células tumorales (tal como la línea celular de melanoma murino B16 o la línea celular B78-D14) suspendidas en un tampón isotópico, tal como RPMI 1640. En el plazo de 14 días, deben estar presentes tumores con un volumen de aproximadamente 40 µl. Puede inyectarse el péptido KIP directamente en la masa tumoral, administrado en el momento de la inducción del tumor a través de inyección, o suministrado a través de un vehículo o un dispositivo. Los tumores subcutáneos pueden evaluarse, entre otros

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E08797416

14-09-2015

métodos, a través de histología, inmunohistoquímica o técnicas de obtención de imágenes para evaluar la eficacia del péptido KIP en la inhibición, ralentización, disminución o modificación del crecimiento o el tamaño del neoplasma.

Muerte celular

El término “muerte celular programada” (o “PCD”) tal como se usa en el presente documento se refiere la muerte de una célula de cualquier forma, mediada por un programa intracelular. A diferencia de la necrosis (una forma de muerte celular que resulta de lesión tisular aguda y que provoca una respuesta inflamatoria), la PCD es un proceso regulado que generalmente confiere ventajas durante el ciclo de vida de un organismo. Se conocen dos tipos de PCD: muerte celular por apoptosis (tipo I) y autofágica (tipo II). Otras vías de muerte celular incluyen la muerte celular programada no apoptótica (también denominada PCD independiente de caspasa o PCD de tipo necrosis), anoikis (una forma de apoptosis inducida por células dependientes de anclaje que se desprenden de la matriz extracelular circundante), cornificación, excitotoxicdad y degeneración de Wallerain (degeneración axonal).

El término “apoptosis” tal como se usa en el presente documento se refiere a una serie de acontecimientos bioquímicos que conducen a cambios morfológicos incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, formación de burbujas, cambios en la membrana celular, tales como pérdida de unión y asimetría de membrana, encogimiento celular, fragmentación nuclear, condensación de cromatina y fragmentación del ADN cromosómico. El proceso de apoptosis está controlado por una variedad diversa de señales celulares extracelulares e intracelulares. Tales señales extracelulares pueden incluir, por ejemplo, pero no se limitan a, toxinas, hormonas, factores de crecimiento, óxido nítrico o citocinas, y por tanto deben o bien atravesar la membrana plasmática o bien transducir la célula para efectuar una respuesta. El término “señalización apoptótica intracelular” tal como se usa en el presente documento se refiere a una respuesta iniciada por una célula en respuesta al estrés. En última instancia puede dar como resultado el suicidio celular. La unión de receptores nucleares mediante factores, tales como, glucocorticoides, calor, radiación, privación de nutrientes, infección viral e hipoxia puede conducir a la liberación de señales apoptóticas intracelulares por una célula dañada.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona la composición inhibidora de cinasa tal como se definió anteriormente, en la que la composición induce muerte celular programada de al menos una célula en la población celular. En algunas realizaciones de este tipo, la célula es una célula procariota. En algunas realizaciones de este tipo, la célula es una célula eucariota. En algunas realizaciones de este tipo, la célula es una célula de mamífero. En algunas realizaciones de este tipo, la célula de mamífero se selecciona del grupo que consiste en una neurona, una célula epitelial, una célula muscular, una célula sanguínea, una célula inmunitaria, una célula madre, un osteocito o una célula endotelial. En algunas realizaciones de este tipo, la muerte celular programada es apoptosis.

También se describe un método para inducir muerte celular programada en una población celular, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inhibidora de cinasa, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 100% con respecto a un péptido KIP, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa; (b) poner en contacto al menos una célula en la población celular con la composición inhibidora de cinasa de la etapa (a) de manera que el ácido nucleico aislado se asocia con la al menos una célula; y (c) inducir muerte celular programada de la al menos una célula en la población celular. En algunas realizaciones de este tipo, el ácido nucleico aislado de la etapa (a) comprende además un elemento regulador controlable. En algunas realizaciones de este tipo, la célula es una célula procariota. En algunas realizaciones de este tipo, la célula es una célula de mamífero. En algunas realizaciones de este tipo, la célula de mamífero se selecciona del grupo que consiste en una neurona, una célula epitelial, una célula muscular, una célula sanguínea, una célula inmunitaria, una célula madre, un osteocito o una célula endotelial. En algunas realizaciones de este tipo, la célula es una célula eucariota. En algunas realizaciones de este tipo, la muerte celular programada es apoptosis.

El término “enfermedad progresiva” tal como se usa en el presente documento implica que el/los tratamiento(s) administrados anteriormente no son/eran eficaces y que pueden ser necesarios otros tratamientos para controlar la enfermedad. El término “enfermedad estable” tal como se usa en el presente documento se refiere a ausencia de disminución significativa en el tamaño o el número de lesiones en el organismo, e implica que probablemente será(n) necesario(s) tratamiento(s) adicional(es) para intentar una cura. El término “respuesta parcial” tal como se usa en el presente documento se refiere a una reducción de enfermedad en aproximadamente el 30% o más identificada en examen clínico, rayos X, exploraciones o pruebas para biomarcadores. El término “respuesta completa” tal como se usa en el presente documento se refiere a ausencia de enfermedad residual que puede identificarse en examen clínico, mediante rayos X, o en pruebas para biomarcadores de la enfermedad; la cura no está implícita.

Se describe adicionalmente un método para inhibir la progresión de una población celular en proliferación, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inhibidora de cinasa, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un péptido inhibidor de cinasa; (b) poner en contacto al menos una célula en la población celular en proliferación con la composición inhibidora de cinasa de manera que el péptido inhibidor de cinasa se asocia con la al menos una célula en proliferación; y (c) inhibir la proliferación mediante la al menos una célula. En algunas realizaciones de este tipo, el péptido inhibidor de cinasa está operativamente unido a un elemento regulador controlable. En algunas

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E08797416

14-09-2015

realizaciones de este tipo, la célula es una célula procariota. En algunas realizaciones de este tipo, la célula es una célula eucariota.

Según una realización, la presente invención proporciona un método para inhibir la progresión de una población celular en proliferación, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inhibidora de cinasa, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un péptido inhibidor de cinasa, en el que el péptido inhibidor de cinasa comprende un péptido KIP, (b) poner en contacto al menos una célula en la población celular en proliferación con la composición inhibidora de cinasa de manera que el péptido inhibidor de cinasa se asocia con al menos una célula en proliferación; y (c) inhibir la proliferación mediante la al menos una célula. En algunas realizaciones de este tipo, la célula es una célula procariota. En algunas realizaciones de este tipo, la célula es una célula eucariota.

También se describe un método para inhibir la progresión de una población celular en proliferación, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inhibidora de cinasa, en el que la composición inhibidora de cinasa comprende una cantidad inhibidora de un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 100% con respecto a un péptido KIP, en el que el polipéptido inhibe la actividad cinasa de una enzima cinasa; (b) poner en contacto al menos una célula en la población celular en proliferación con la composición inhibidora de cinasa de la etapa (a) de manera que el ácido nucleico aislado se asocia con al menos una célula en proliferación; y (c) inhibir la proliferación de la al menos una célula. En otra realización, el ácido nucleico aislado de la etapa (a) comprende además un elemento regulador controlable. En algunas realizaciones de este tipo, la célula es una célula procariota. En algunas realizaciones de este tipo, la célula es una célula eucariota.

Según otra realización, la composición inhibidora de cinasa, que es deseable suministrar localmente, puede formularse para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de dosis múltiples, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en una forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos

o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosas contienen sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas. Alternativamente, los compuestos activos pueden estar en forma en polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril, antes de su uso.

Las composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones de inhibición de cinasa) también pueden comprender portadores o excipientes sólidos o en fase de gel adecuados. Los ejemplos de tales portadores o excipientes incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.

Las formas de preparación farmacéutica sólidas o líquidas adecuadas están, por ejemplo, microencapsuladas, y si resulta apropiado, con uno o más excipientes, en cocleatos, recubiertas sobre partículas de oro microscópicas, contenidas en liposomas, microgránulos para implantación en el tejido, o secadas sobre un objeto que va a frotarse en el tejido. Tales composiciones farmacéuticas también pueden estar en forma de gránulos, perlas, polvos, comprimidos, comprimidos recubiertos, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, gotas o preparaciones con liberación prolongada de compuestos activos, en cuya preparación se usan habitualmente excipientes y aditivos y/o agentes auxiliares tales como disgregantes, aglutinantes, agentes de recubrimiento, agentes de hinchado, lubricantes o solubilizantes, tal como se describió anteriormente. Las composiciones farmacéuticas son adecuadas para su uso en una variedad de sistemas de administración de fármacos. Para una breve revisión de métodos para la administración de fármacos, véase Langer 1990 Science 249, 1527-1533, que se incorpora en el presente documento como referencia.

La composición inhibidora de cinasa, y opcionalmente otros compuestos terapéuticos, puede administrarse tal cual (en estado puro) o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero sales no farmacéuticamente aceptables pueden usarse de manera conveniente para preparar sales farmacéuticamente aceptable de las mismas. Tales sales incluyen, pero no se limitan a, las preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-toluenosulfónico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftaleno-2-sulfónico y bencenosulfónico. Además, tales sales pueden prepararse como sales alcalinotérreas o de metal alcalino, tales como sales de sodio, potasio o calcio del grupo ácido carboxílico. Por “sal farmacéuticamente aceptable” quiere decirse aquellas sales que, dentro del alcance de criterio médico razonable, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y otros animales inferiores sin un exceso de toxicidad,

15

25

35

45

55

E08797416

14-09-2015

irritación, respuesta alérgica y similares y son proporcionales con una razón de riesgo/beneficio razonable. En la técnica se conocen bien sales farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, P. H. Stahl, et al. describen sales farmacéuticamente aceptables en detalle en “Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use” (Wiley VCH, Zúrich, Suiza: 2002). Las sales pueden prepararse in situ durante el aislamiento y la purificación finales de los compuestos descritos dentro de la presente invención o por separado haciendo reaccionar una función de base libre con un ácido orgánico adecuado. Sales de adición de ácido representativas incluyen, pero no se limitan a, acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, canforato, canforsufonato, digluconato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato (isetionato), lactato, maleato, metanosulfonato, nicotinato, 2-naftalenosulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, fosfato, glutamato, bicarbonato, p-toluenosulfonato y undecanoato. Además, los grupos que contienen nitrógeno básico pueden cuaternizarse con agentes tales como haluros de alquilo inferior tales como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; sulfatos de dialquilo tales como sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo; haluros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo; haluros de arilalquilo tales como bromuros de bencilo y fenetilo y otros. De este modo se obtienen productos solubles o dispersables en agua o aceite. Ejemplos de ácidos que pueden emplearse para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico y ácidos orgánicos tales como ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico y ácido cítrico. Pueden prepararse sales de adición de base in situ durante el aislamiento y la purificación finales de compuestos descritos en la invención haciendo reaccionar un resto que contiene ácido carboxílico con una base adecuada tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable o con amoniaco o una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, cationes basados en metales alcalinos o metales alcalinotérreos tales como sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio y similares y cationes de amina y amoniaco cuaternario no tóxicos incluyendo amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, dietilamina, etilamina y similares. Otras aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de base incluyen etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperidina, piperazina y similares. También pueden obtenerse sales farmacéuticamente aceptables usando procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica, por ejemplo haciendo reaccionar un compuesto suficientemente básico tal como una amina con un ácido adecuado para proporcionar un anión fisiológicamente aceptable. También pueden prepararse sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio, potasio o litio) o metales alcalinotérreos (por ejemplo calcio o magnesio) de ácidos carboxílicos.

Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de poner en asociación una composición inhibidora de cinasa, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma (“compuesto activo”) con el portador que constituye uno o más agentes auxiliares. En general, las formulaciones se preparan poniendo de manera uniforme e íntima en asociación el agente activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos, o ambos, y después, si es necesario, conformando el producto para dar la formulación deseada.

El agente farmacéutico o un éster, sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo puede mezclarse con otros materiales activos que no alteran la acción deseada, o con materiales que suplementan la acción deseada. Las disoluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica, subcutánea, intratecal o tópica pueden incluir, pero no se limitan a, por ejemplo, los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parental puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis compuestos por vidrio o plástico. Para la administración intravenosa, portadores particulares son solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Las composiciones farmacéuticas para inyección parenteral comprenden disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones estériles, acuosas o no acuosas, farmacéuticamente aceptables, y polvos estériles para su reconstitución en disoluciones o dispersiones estériles inyectables. Ejemplos de portadores, diluyentes, disolventes o vehículos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol y similares), mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes incluyendo agentes conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos puede garantizarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede provocarse mediante el uso de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E08797416

14-09-2015

La suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión, tales como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar, goma tragacanto y mezclas de los mismos.

Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la razón de fármaco con respecto a polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la tasa de liberación de fármaco. Tales formulaciones de acción prolongada pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poliortoésteres y polianhídridos. Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejidos corporales.

Las formulaciones localmente inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro que retiene bacterias o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril justo antes de su uso. Pueden formularse preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, según las técnica conocida usando agentes de suspensión y agentes dispersantes o humectantes adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una disolución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico, aceptable por vía parenteral tal como una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, solución de Ringer, disolución de cloruro de sodio isotónica y de la U.S.P. Además, convencionalmente se emplean aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Con este fin, puede emplearse cualquier aceite fijo insípido incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, se usan ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de productos inyectables.

Las formulaciones para la administración parenteral (incluyendo, pero sin limitarse a, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intratecal e intraarticular) incluyen disoluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos, que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas, que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo ampollas selladas y viales, y pueden almacenarse en un estado secado por congelación (liofilizado) que sólo requiere la adición del portador líquido estéril, por ejemplo, solución salina, agua para inyección, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse disoluciones y suspensiones para inyección extemporáneas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles de la clase descrita anteriormente.

Otro método de formulación de las composiciones descritas en el presente documento implica conjugar los compuestos descritos en el presente documento con un polímero que potencia la solubilidad acuosa. Ejemplos de polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol, poli-(ácido d-glutámico), poli-(ácido l-glutámico), poli-(ácido l-glutámico), poli-(ácido d-aspártico), poli-(ácido l-aspártico), poli-(ácido l-aspártico) y copolímeros de los mismos. Pueden usarse poli(ácidos glutámicos) que tienen pesos moleculares de entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 100.000, con pesos moleculares de entre aproximadamente 20.000 y aproximadamente 80.000 y también pueden usarse con pesos moleculares de entre aproximadamente 30.000 y aproximadamente 60.000. El polímero se conjuga a través de una unión éster con uno o más hidroxilos de una epotilona de la invención usando un protocolo esencialmente tal como se describe en la patente estadounidense n.º 5.977.163 que se incorpora en el presente documento como referencia. Los sitios de conjugación particulares incluyen el hidroxilo del carbono 21 en el caso de derivados 21-hidroxilo de la presente invención. Otros sitios de conjugación incluyen el, pero no se limitan al, hidroxilo del carbono 3 y/o hidroxilo del carbono 7.

Los agentes tamponantes adecuados incluyen: ácido acético y una sal (al 1-2% p/v); ácido cítrico y una sal (al 1-3% p/v); ácido bórico y una sal (al 0,5-2,5% p/v); y ácido fosfórico y una sal (al 0,8-2% p/v). Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio (al 0,003-0,03% p/v); clorobutanol (al 0,3-0,9% p/v); parabenos (al 0,01-0,25% p/v) y timerosal (al 0,004-0,02% p/v).

En algunas realizaciones, la composición inhibidora de cinasa es una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente invención contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inhibidora de cinasa y opcionalmente otros agentes terapéuticos incluidos en un portador farmacéuticamente aceptable. El término “portador farmacéuticamente aceptable” tal como se usa en el presente documento se refiere a una o más sustancias de carga, diluyentes o encapsulantes compatibles, sólidas o líquidas, que son adecuadas para la administración a un ser humano u otro animal vertebrado. El término “portador” tal como se usa en el presente documento se refiere a un componente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el componente activo para facilitar la aplicación. El componente activo puede ser una composición inhibidora de cinasa. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también pueden combinarse de tal manera que no haya interacción que altere sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.

El/los agente(s) terapéutico(s), incluyendo la composición inhibidora de cinasa, puede(n) proporcionarse en partículas. El término “partículas” tal como se usa en el presente documento se refiere a nano o micropartículas (o en algunos casos más grandes) que pueden contener, en su totalidad o en parte, la composición inhibidora de

15

25

35

45

55

E08797416

14-09-2015

cinasa. Las partículas pueden contener el/los agente(s) terapéutico(s) en un núcleo rodeado por un recubrimiento. El/los agente(s) terapéutico(s) también puede(n) dispersarse a través de las partículas. El/los agente(s) terapéutico(s) también puede(n) adsorberse sobre al menos una superficie de las partículas. Las partículas pueden tener cinética de liberación de cualquier orden, incluyendo liberación de orden cero, liberación de primer orden, liberación de segundo orden, liberación retardada, liberación sostenida, liberación inmediata, etc., y cualquier combinación de las mismas. La partícula puede incluir, además del/de los agente(s) terapéutico(s), cualquiera de los materiales usados de manera rutinaria en la técnica de la farmacia y la medicina, incluyendo, pero sin limitarse a, material erosionable, no erosionable, biodegradable o no biodegradable o combinaciones de los mismos. Las partículas pueden ser microcápsulas que contienen la composición inhibidora de cinasa en una disolución o en un estado semisólido. Las partículas pueden tener prácticamente cualquier forma.

Pueden usarse materiales poliméricos tanto no biodegradables como biodegradables en la fabricación de partículas para suministrar el/los agente(s) terapéutico(s). Tales polímeros pueden ser polímeros naturales o sintéticos. El polímero se selecciona basándose en el periodo de tiempo a lo largo del cual se desea la liberación. Polímeros bioadhesivos de interés particular incluyen hidrogeles bioerosionables tal como los descritos por Sawhney et al en Macromolecules (1993) 26, 581-587, cuyas enseñanzas se incorporan en el presente documento. Estos incluyen poli(ácidos hialurónicos), caseína, gelatina, glutina, polianhídridos, poli(ácido acrílico), alginato, quitosano, poli(metacrilatos de metilo), poli(metacrilatos de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo) y poli(acrilato de octadecilo).

El/los agente(s) terapéutico(s) puede(n) estar contenido(s) en sistemas de liberación controlada. Con el fin de prolongar el efecto de un fármaco, con frecuencia es deseable ralentizar la absorción del fármaco a partir de una inyección subcutánea, intratecal o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con poca solubilidad en agua. La tasa de absorción del fármaco depende entonces de su tasa de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de cristal y la forma cristalina. Se pretende que el término “liberación controlada” se refiera a cualquier formulación que contiene fármaco en la que se controlan la manera y el perfil de liberación de fármaco a partir de la formulación. Esto se refiere a formulaciones de liberación inmediata así como no inmediata, incluyendo las formulaciones de liberación no inmediata, pero sin limitarse a, formulaciones de liberación sostenida y de liberación retardada. El término “liberación sostenida” (también denominado “liberación prolongada”) se usa en el presente documento en su sentido convencional para referirse a una formulación de fármaco que proporciona una liberación gradual de un fármaco a lo largo de un periodo de tiempo prolongado, y que preferiblemente, aunque no necesariamente, da como resultado niveles en sangre sustancialmente constantes de un fármaco a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. Alternativamente, la absorción retardada de un fármaco administrado por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo aceitoso. El término “liberación retardada” se usa en el presente documento en su sentido convencional para referirse a una formulación de fármaco en la que hay un retardo en el tiempo entre la administración de la formulación y la liberación del fármaco a partir de la misma. La “liberación retardada” puede implicar o no una liberación gradual de fármaco a lo largo de un periodo de tiempo prolongado, y por tanto puede ser

o no una “liberación sostenida”.

El uso de un implante de liberación sostenida a largo plazo puede ser particularmente adecuado para el tratamiento de estados crónicos. El término liberación “a largo plazo”, tal como se usa en el presente documento, significa que el implante se construye y dispone para suministrar niveles terapéuticos del componente activo durante al menos 7 días, y preferiblemente de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 días. Los expertos habituales en la técnica conocen bien los implantes de liberación sostenida a largo plazo e incluyen algunos de los sistemas de liberación descritos anteriormente.

También se describe un dispositivo biomédico que comprende al menos un péptido inhibidor de cinasa aislado que comprende una secuencia según la fórmula IV, en el que el uno o más péptidos de inhibición de cinasa aislados se disponen sobre o en el dispositivo. En algunas realizaciones de este tipo, el al menos un péptido inhibidor de cinasa es al menos un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en HRRIKAWLKKILALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166]; WLRRIKAWLRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 113]; y WLRRIKAWLRRALARQLGVA [SEQ ID NO: 177]. En algunas realizaciones de este tipo, el dispositivo biomédico comprende al menos un péptido inhibidor de cinasa aislado que comprende una secuencia según la fórmula V, en el que el uno o más péptidos de inhibición de cinasa aislados se disponen sobre o en el dispositivo. En algunas realizaciones de este tipo, el dispositivo biomédico comprende al menos un péptido inhibidor de cinasa aislado que comprende una secuencia según la fórmula VI, en el que el uno o más péptidos de inhibición de cinasa aislados se disponen sobre o en el dispositivo. En algunas realizaciones de este tipo, el péptido inhibidor de cinasa es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 173]; FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 163]; y WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 142].

Se describen métodos generales de genética molecular e ingeniería genética útiles en la presente invención en las ediciones actuales de Molecular Cloning A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), “Guide to Protein Purification” en Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer, ed.,

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E08797416

14-09-2015

(1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2ª ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. Nueva York, NY), y Gene Transfer and Expression Protocols, págs. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.). Reactivos, vectores de clonación y kits para la manipulación genética están disponibles de proveedores comerciales tales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, ClonTech y Sigma-Aldrich Co.

Cuando se proporciona un valor de intervalos, se entiende que cada valor intermedio, hasta la decena de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior y el límite inferior de ese intervalo y cualquier otro valor mencionado o intermedio en ese intervalo mencionado, queda abarcado por la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños que pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños también quedan abarcados por la invención, con sujeción a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo mencionado. Cuando el intervalo mencionado incluye uno o ambos de los límites, también se incluyen en la invención intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o pruebas de la presente invención también puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas en el presente documento se incorporan en el presente documento como referencia para dar a conocer y describir los métodos y/o materiales en relación con los cuales se mencionan las publicaciones.

Debe observarse que, tal como se usan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado.

Las publicaciones dadas a conocer en el presente documento se proporcionan únicamente por su divulgación previa a la fecha de presentación de la presente invención. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder a tal publicación debido a invención previa. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden diferir de las fechas de publicación reales que puede ser necesario confirmar de manera independiente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos habituales en la técnica una completa divulgación y descripción de cómo preparar y usar la presente invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni se pretende que manifiesten que los siguientes experimentos son todos o los únicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos por garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero debe contarse con algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio en peso, la temperatura es en grados centígrados y la presión es la presión atmosférica

o está próxima a esta.

Ejemplo 1. Comparación de la eficacia de un inhibidor peptídico de MAPKAP cinasa II (MK2) solo o unido covalentemente al dominio de transducción WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 134].

Usando el ensayo de lisato Omnia™ para el kit de MAPKAP-K2 (Invitrogen, Carlsbad, CA), se determinó la velocidad de reacción para MK2 en presencia y ausencia de cada uno de los péptidos indicados en la tabla 2. En resumen, se evaluaron concentraciones de péptido inhibidor a 12,5 µmol, 25 µmol, 50 µmol y 100 µmol. El kit contiene un tampón de reacción propio al que se le añade lo siguiente (se dan las concentraciones finales): ATP 1 mM, DTT 0,2 mM, sustrato peptídico modificado por Sox MAPKAP-K2 10 µM, 5 ng de MK2, y el inhibidor peptídico de interés (volumen final de 50 µl). Se realizaron las reacciones en los pocillos de una placa de 96 pocillos de poca unión a proteína proporcionada con el kit, y se tomaron lecturas de fluorescencia a 485 nm cada 30 segundos durante 20 minutos en un espectrofotómetro M5 de Molecular Devices. Se usó un péptido que tenía la secuencia KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 124] como referencia porque es un inhibidor conocido basándose en el trabajo de Hayess y Benndorf (Katrin Hayess y Rainer Benndorf, 1997, “Effect of protein kinase inhibitors on activity of mammalian small heat-shock protein (HSP25) kinase”, Biochemical Pharmacology, 53(9): 1239-1247).

En la tabla 3 se muestran las velocidades de reacción para una concentración de inhibidor de MK2 de 100 µM; las velocidades de reacción relativas entre péptidos fueron similares a concentraciones inferiores y superiores (datos no mostrados). Los resultados de este estudio muestran que varios de los péptidos de inhibición de cinasa según la presente invención pudieron inhibir la actividad de MK2. Los resultados proporcionan adicionalmente información en cuanto a los aminoácidos que son los más cruciales para la función del inhibidor de MK2. Obsérvese que la unión covalente del péptido inhibidor de MK2 al dominio de transducción WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 134] aumenta sustancialmente la función de inhibidor de MK2.

Tabla 2: Evaluación de la secuencia de inhibidor de MK2 de cada aminoácido

E08797416

14-09-2015

[SEQ ID NO:]

Controles

KALNRQLGVA*: [SEQ ID NO:114]

KKKALNRQLGVAA#: [SEQ ID NO: 115]

(WLRRIKA)2LNRQLGVAA: [SEQ ID NO: 178]

Barrido con alanina

KALNROLGVAA: [SEQ ID NO: 116]

KAANRQLGVAA: [SEQ ID NO: 117]

KALARQLGVAA: [SEQ ID NO: 118]

KALNAQLGVAA: [SEQ ID NO: 119]

KALNRALGVAA: [SEQ ID NO: 120]

KALNRQAGVAA: [SEQ ID NO: 121]

KALNRQLAVAA: [SEQ ID NO: 122]

KALNRQLGAAA: [SEQ ID NO: 123]

Barrido con d-aminoácido

KdALNRQLGVAA: [SEQ ID NO: 179]

KAdLNRQLGVAA: [SEQ ID NO: 180]

KALdNRQLGVAA: [SEQ ID NO: 181]

KALNdRQLGVAA: [SEQ ID NO: 182]

Controles

KALNRdQLGVAA: [SEQ ID NO: 183]

KALNRQdLGdVAA: [SEQ ID NO: 184]

KALNRQLGdVAA: [SEQ ID NO: 185]

*= Control para determinar el requisito de la A final; # =Control para determinar la importancia de K iniciales Tabla 3. Velocidades de reacción para variantes de inhibidor de MK2 (n=3)

Secuencia de péptido variante inhibidor de MK2: % de la velocidad de reacción de KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 124] a una concentración de inhibidor de 100 µM (+/-EEM de la secuencia de péptido*)

WLKKIKAWLKKIKALNRQLGVVA [SEQ ID NO: 159]: -32% (+/-6%)

KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 124]: 100% (+/-3%)

KALNRQLGVA [SEQ ID NO: 125]: 100% (+/-3%)

KAANRQLGVAA [SEQ ID NO: 126]: 152% (+/-3%)

KALARQLGVAA [SEQ ID NO: 127]: 39% (+/-1%)

KALNAQLGVAA [SEQ ID NO: 128]: 358% (+/-8%)

KALNRALGVAA [SEQ ID NO: 129]: 338% (+/-15%)

KALNRQAGVAA [SEQ ID NO: 130]: 118% (+/-4%)

KALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 131]: 72% (+/-3%)

KALNRQLGAAA [SEQ ID NO: 132]: 373% (+/-13%)

KAdLNRQLGVAA [SEQ ID NO:: 146% (+/-4%)

KALdNRQLGVAA: 95% (+/-6%)

KALNdRQLGVAA: 306% (+/-4%)

KALNRdQLGVAA: 276% (+/-3%)

KALNRQdLGVAA: 357% (+/-10%)

KALNRQLGdVAA: 260% (+/-14%)

KKKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 133]: 91% (+/-4%)

*EEM = Error estándar de la media para tres valores

Ejemplo 2. Velocidades de reacción de dominio de transducción

Se comparó la actividad de inhibición de MK2 del dominio de transducción WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 134] con la actividad de inhibición de MK2 de otros dominios de transducción conocidos: YARAAARQARA [SEQ ID NO: 135] y YGRKKKRRQRRR [SEQ ID NO: 136]. Se sometieron a prueba los dominios de transducción para determinar la actividad de MK2 usando las mismas condiciones de ensayo que en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la tabla 4.

Tabla 4. Velocidades de reacción para dominios de transducción diferentes (n = 3)

Secuencia de péptido: [SEQ ID NO:] % de la velocidad de reacción de KKKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 115] a una concentración de inhibidor de 100 µM (+/-EEM*)

WLRRIKA: 137 394% (+/-5%)

5

10

15

20

25

30

E08797416

14-09-2015

WLRRIKAWLRRIKA: 134 19% (+/-2%)

YARAAARQARA: 135 274% (+/-9%)

YGRKKRRQRRR: 136 158% (+/-11%)

*EEM = Error estándar de la media para tres valores

Estos resultados indican diferencias sustanciales en el efecto de varios dominios de transducción sobre la inhibición de MK2 y que los dominios de transducción son útiles para inhibir la actividad de cinasas, tales como MK2. El monómero WLRRIKA [SEQ ID NO: 137] tenía el mismo nivel de inhibición que el control no inhibidor (datos no mostrados); sin embargo, el dímero de dominio de transducción WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 134] inhibió MK2 significativamente más que KKKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 115]. YARAAARQARA [SEQ ID NO: 135] y YGRKKRRQRRR [SEQ ID NO: 136] también inhiben MK2 pero no tanto como WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 134].

Ejemplo 3. Péptidos inhibidores de MK2 con dominios de transducción

Se sintetizó un conjunto de péptidos inhibidores de MK2 que tenían dominios de transducción (véase la tabla 5). Las variantes incluían péptidos con el dominio de transducción WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 134] y asparagina sustituida por alanina, glicina sustituida por alanina, o ambas sustituciones de alanina en el dominio terapéutico. También se prepararon los mismos péptidos con el dominio de transducción YARAAARQARA [SEQ ID NO: 135]. Se compararon las velocidades de reacción de estas variantes con la velocidad de reacción de un blanco sin inhibidor añadido. En la tabla 6 se muestran los resultados. Los datos en la tabla 6 muestran una sinergia entre el dominio de transducción y el dominio terapéutico en la inhibición de MK2. Dado que el dominio de transducción WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 134] es un inhibidor de MK2 mucho más fuerte que el dominio de transducción YARAAARQARA [SEQ ID NO: 135], los péptidos con un dominio de transducción WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 134] son inhibidores de MK2 mucho más fuertes a una concentración dada que los péptidos con el dominio de transducción YARAAARQARA [SEQ ID NO: 135].

Tabla 5: Dominios terapéuticos optimizados propuestos con dos dominios de transducción diferentes

Péptidos con dominio de transducción WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 134]: SEQ ID NO: Péptidos con dominio de transducción YARAAARQARA [SEQ ID NO: 135] SEQ ID NO:

WLRRIKAWLRRIKALARQLAVA WLRRIKAWLRRIKALARQLGVA WLRRIKAWLRRIKALARQLAVA WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVA WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA: 138 139 140 141 142 YARAAARQARAKALARQLAVA YARAAARQARAKALARQLGVA YARAAARQARAKALNRQLAVA YARAAARQARAKALNRQLGVA YARAAARQARAKALNRQLGVAA 143 144 145 146 147

Tabla 6: Velocidades de reacción para péptidos optimizados seleccionados (n=3)

Secuencia de péptido: SEQ ID NO % de la velocidad de reacción de blanco a una concentración de inhibidor de secuencia de péptido de 6,25 pN (+/-EEM*)

WLRRIKAWLRRIKALARQLAVA: 138 3,3% (+/-0,4%)

WLRRIKAWLRRIKALARQLGVA: 139 3,9% (+/-0,8%)

WLRRIKAWLRRIKALNRQLAVA: 140 -2,1% (+/-0,5%)

WLRRIKAWLRRIKKKALARQLAVA: 148 1,0% (+/-0,4%)

YARAAARQARAKALARQLGVA: 143 28,9% (+/-0,8%)

YARAAARQARAKKKALARQLAVA: 112 22,4% (+/-0,5%)

Sin inhibidor añadido: - 100% (+/-2%)

*EEM = Error estándar de la media de tres valores

Ejemplo 4 -Ensayos de determinación de perfil de cinasas

Se usaron los péptidos KIP, WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 142], KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 173] y FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 163], para determinar el perfil de una variedad de cinasas diferentes. Se usaron los servicios de ensayo de determinación de perfil de cinasas proporcionados por Upstate, una parte de Millipore Corporation (Billerica, MA), para realizar los perfiles de cinasas. Los ensayos de determinación de perfil de cinasas, que son radiométricos, se basan en medir la cantidad de transferencia radiactiva desde un ATP (γ-33P-ATP) hasta un péptido sustrato usando concentraciones conocidas de enzima cinasa, inhibidor, ATP y tampón en puntos de tiempo y a temperaturas definidos. Hay detalles disponibles sobre las condiciones de reacción para cada cinasa en http://www.millipore.com/drugdiscovery/dd3/KinaseProfiler. Por ejemplo, se sometió a prueba la inhibición de ROCK-1(h) usando un tampón que contenía MOPS 20 mM, EDTA 1 mM, Brij-35 al 0,01%,

E08797416

14-09-2015

glicerol al 5%, β-mercaptoetanol al 0,1%, BSA 1 mg/ml. Se incubó ROCK-1(h) (5-10 mU) con MOPS 8 mM, pH 7,0, 33P-

EDTA 0,2 mM, 30 µM del péptido KEAKEKRQEQIAKRRRLSSLRASTSKSGGSQK, acetato de Mg 10 mM y γ-ATP (actividad específica de aproximadamente 500 cpm/pmol, concentración según se requería) en un volumen de reacción final de 25 µl. Se inició la reacción mediante la adición de la mezcla de MgATP en ausencia y en presencia

5 de compuestos inhibidores. Tras la incubación durante 40 minutos a temperatura ambiente, se detuvo la reacción mediante la adición de 5 µl de una disolución de ácido fosfórico al 3%. Entonces se aplicaron 10 µl de la mezcla de reacción sobre un filtro P30. Se lavó el filtro tres veces durante 5 minutos en ácido fosfórico 75 mM, una vez en metanol, se secó y se contó mediante recuento por centelleo. Cuando la cinasa no se inhibe, la cinasa fosforila un sustrato cargado positivamente con ATP radiactivo, que entonces se une a una membrana de filtro cargada

10 negativamente. Las cuentas de centelleo (radiactividad) se correlacionan directamente con la actividad cinasa. Se llevó a cabo el ensayo a una concentración de ATP dentro del intervalo de 15 micromolar de la Km para cada cinasa individual. Todos los datos de perfiles inferiores a 100 indican inhibición de cinasa mientras que los datos superiores a 100 indican estimulación de cinasa.

Los resultados del ensayo de determinación de perfil de cinasas se muestran en la tabla 7 para

15 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 142]; en la tabla 8 para KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 173]; y en la tabla 9 para FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 163]. Los resultados muestran que los péptidos KIP son útiles en la regulación de la función cinasa. Más específicamente, estos datos muestran que los péptidos WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 142], KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 173], y FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 163] inhiben varias cinasas, muchas de las cuales se sabe que son

20 mediadores importantes de hiperplasia y cáncer.

Tabla 7. Resultados del ensayo de determinación de perfil de cinasas usando el péptido de prueba WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 142].

Cinasa: Perfil 1 a 30 µm Cinasa Perfil 1 a 30 µm Cinasa Perfil 1 a 30 µm

Abl (h): 24 GSK3β (h) 129 PKB β (h) 18

AMPK (r): 36 IGF-IR (h) 227 PKC β I (h) 8

Aurora-A (h): 46 IRAK4 (h) 12 PKCδ (h) 11

BTK (h): 5 JAK3 (h) 85 PKG1α (h) 16

CaMKI (h): 9 KDR (t1) 27 PKG1β (h) 15

CDKI/ciclina B (h): 17 Lck (h) 130 Ret (h) 117

CHK1 (h): 31 L1MK1 (h) 89 ROCK-1 (h) 0

CKIB (h): 52 MAPKI (h) 121 Rsk2 (h) 14

CK2 (h): 114 MEKI (h) 14 SAPK2 a (h) 61

cKit (h): 23 Met (h) 30 Src (1-530) (h) 6

DYRK2 (h): 93 MLCK (h) 4 Syk (h) 19

EGFR (h): 10 PDGFRβ (h) 42 Tie2 (h) 17

EphA2 (h): 38 PhKγ2 (h) 15 TrkA (h) 6

FGFR1 (h): 27 Pim-1 (h) 5

Flt3 (h): 38 PKA (h) 80

Tabla 8. Resultados del ensayo de determinación de perfil de cinasas usando el péptido de prueba KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 173]

Cinasa: Perfil 1 a 100 µm Cinasa Perfil 1 a 100 µm Cinasa Perfil 1 a 100 µm

Abl (h): 55 IRAK4 (h) 16 Pim-1 (h) 1

AMPK (r): 118 JAK3 (h) 91 PKA (h) 103

ASK1 (h): 48 JNK1α1 (h) 92 PKB β (h) 28

Aurora-A (h): 60 KDR (t1) 56 PKC β 1 (h) 23

BTK (h): 16 Lck (h) 847 PKCδ (h) 24

CaMKI (h): 0 L1MK1 (h) 93 PKG1α (h) 25

CDKI/ciclina B (h): 55 MAPKI (h) 108 PKG1β (h) 24

CHK1 (h): 68 MAPKAP-K2 (h) 8 PRAK 148

CKIB (h): 97 MAPKAP-K3 (h) 17 Ret (h) 117

CK2 (h): 79 MEKI (h) 66 ROCK-1 (h) 29

cKit (h): 31 Met (h) 22 Rsk2 (h) 6

DYRK2 (h): -10 MKK4 (m) 114 SAPK2 a (h) 59

EGFR (h): 16 MKK6 (h) 48 Src (1-530) (h) 3

EphA2 (h): 22 MLCK (h) 2 Syk (h) 4

FGFR1 (h): 35 MSK1 (h) 13 Tie2 (h) 8

Flt3 (h): 20 MSK2 (h) 30 TrkA (h) 16

E08797416

14-09-2015

GSK3β (h): 184 PDGFRβ (h) 66

IGF-IR (h): 76 PhKγ2 (h) 27

Tabla 9. Resultados del ensayo de determinación de perfil de cinasas usando el péptido de prueba FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 163].

Abl (h): 41 IRAK4 (h) 13 Pim-1 (h) 1

AMPK (r): 101 JAK3 (h) 102 PKA (h) 76

ASK1 (h): 53 JNK1α1 (h) 91 PKB β (h) 16

Aurora-A (h): 65 KDR (t1) 78 PKC β1 (h) 73

BTK (h): 19 Lck (h) 493 PKCδ (h) 40

CaMKI (h): 0 L1MK1 (h) 92 PKG1α (h) 12

CDKI/ciclina B (h): 36 MAPKI (h) 104 PKG1β (h) 15

CHK1 (h): 54 MAPKAP-K2 (h) 5 PRAK 131

CKIB (h): 99 MAPKAP-K3 (h) 10 Ret (h) 89

CK2 (h): 80 MEKI (h) 68 ROCK-1 (h) 25

cKit (h): 42 Met (h) 17 Rsk2 (h) -1

DYRK2 (h): -11 MKK4 (m) 90 SAPK2 a (h) 30

EGFR (h): 18 MKK6 (h) 42 Src (1-530) (h) 5

EphA2 (h): 32 MLCK (h) 1 Syk (h) 38

FGFR1 (h): 22 MSK1 (h) 11 Tie2 (h) 0

Flt3 (h): 14 MSK2 (h) 24 TrkA (h) 17

GSK3β (h): 188 PDGFRβ (h) 92

IGF-IR (h): 69 PhKγ2 (h) 20

Ejemplo 5. Pruebas de toxicidad de péptidos KIP sobre múltiples líneas celulares de cáncer.

Se evaluó el efecto de seis concentraciones de cuatro péptidos KIP sobre siete líneas celulares de cáncer. En la tabla 10 se indican los péptidos KIP usados en estos experimentos. Tabla 10: Péptidos KIP sometidos a prueba sobre líneas celulares de cáncer

Número de péptido: Estructura primaria de péptido SEQ ID NO:

1: HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA 166

2: WLRRIKAHRRIKALARQLGVAA 167

3: WLRRIKAWLRR 168

4: WLRRIKAWLRRALNRQLGVAA 169

Las siete líneas celulares fueron: células de cáncer de mama MCF-7 dependientes de estrógenos, células de cáncer de mama MDA 231 no dependientes de estrógenos, células de cáncer del sistema nervioso central SF 539, células de cáncer colon HT29, células de cáncer de páncreas Paca 2, células de cáncer de próstata PC3 y células de 10 cáncer de pulmón A549. Para cada línea celular, se tripsinizaron células en crecimiento exponencial y se sembraron en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. Se mantuvieron las células en una incubadora humidificada, con CO2 al 5%, a 37ºC durante 24 horas. Al día siguiente, se añadieron medios recientes junto con 1 µl de una disolución madre de péptido para dar concentraciones de péptido finales de 0,3 µM, 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM y 100 µM (n=4). Se sometió a prueba doxorubicina como control positivo. Tras incubar las células durante 72 horas, a cada pocillo se 15 le añadieron 20 µl de disolución al 0,5% de MTT {bromuro de 3-(4,5-dimetildiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio}. Entonces se incubaron las placas durante 4 horas adicionales, momento en el cual se midió la absorbancia a 570 nm para cada pocillo usando un lector de microplacas. Se trazó la absorbancia como función de la concentración de péptido, y se calcularon los valores de CI50 para cada péptido para cada línea celular. En las figuras 1-7 se presentan los resultados de este experimento. En la tabla 11 se presentan los valores de CI50 calculados. Para todas

20 las líneas celulares, los valores de CI50 para cada uno de los cuatro péptidos eran inferiores a 50 µM. Estos resultados indican que los péptidos KIP son antiproliferativos/citotóxicos frente a diversas líneas celulares de cáncer diferentes de una manera dependiente de la dosis.

Tabla 11: CI50 para péptidos KIP sometidos a prueba sobre líneas celulares de cáncer

CI50 de línea celular (µM)

Péptido: MCF-7 MDA231 SF539 HT29 Paca 2 A549 PC3

Péptido 1: 1,6 9,3 4,3 6,7 9,0 8,7 6,0

Péptido 2: 7,8 19,9 26,0 26,4 19,5 31,9 28,9

E08797416

14-09-2015

CI50 de línea celular (µM)

Péptido: MCF-7 MDA231 SF539 HT29 Paca 2 A549 PC3

Péptido 3: 13,5 17,4 22,0 20,7 42,5 34,3 35,5

Péptido 4: 4,4 12,0 10,0 11,8 11,2 12,5 23,7

Ejemplo 6. Evaluación de la apoptosis en células de cáncer de mama MCF-7 usando un péptido KIP

Se sembraron células de cáncer de mama MCF-7 en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos y se mantuvieron durante 24 horas en una incubadora humidificada, con CO2 al 5%, a 37ºC. Al día siguiente, se añadieron medios recientes junto con 1 µl de una disolución madre de péptido KIP, HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA

5 [SEQ ID NO: 166], para dar una concentración final de 3 µM o 10 µM (n=4). Tras incubar las células durante 24 horas, se trataron las células con colorante Hoescht para la tinción nuclear, yoduro de propidio para la tinción de ADN de células necróticas, y anexina V para visualizar células apoptóticas.

Tal como se observa en la figura 8, las células de cáncer de mama MCF-7 tienen un alto grado de tinción con anexina V en comparación con la tinción con yoduro de propidio para ambas concentraciones de péptido KIP. Estos

10 resultados indican que los péptidos KIP pueden inducir apoptosis en una línea celular de cáncer.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición inhibidora de cinasa que comprende un péptido inhibidor de cinasa para inhibir el crecimiento de un neoplasma, en la que el péptido inhibidor de cinasa es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

5 HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166];

WLRRIKAWLRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 113];

WLRRIKAWLRRALARQLGVA [SEQ ID NO: 177];

KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 173];

FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 163];

10 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 106];

YARAAARQARAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 28];

YARAAARQARAKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 100]; y

YARAAARQARAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 64].
2. Composición inhibidora de cinasa según la reivindicación 1, en la que el péptido inhibidor de cinasa para

15 inhibir el crecimiento de un neoplasma es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 166].
3. Composición inhibidora de cinasa según la reivindicación 1, en la que el péptido inhibidor de cinasa para inhibir el crecimiento de un neoplasma es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos WLRRIKAWLRRIKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 113].

20 4. Composición inhibidora de cinasa según la reivindicación 1, en la que el péptido inhibidor de cinasa para inhibir el crecimiento de un neoplasma es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos WLRRIKAWLRRALARQLGVA [SEQ ID NO: 177].
5. Composición inhibidora de cinasa según la reivindicación 1, para su uso en un método de tratamiento de un neoplasma seleccionado del grupo que consiste en un papiloma, un adenoma, una mola hidatidiforme, un 25 fibroma, un condroma, un osteoma, un leiomioma, un rabdomioma, un lipoma, un hemangioma, un linfangioma, una policitemia vera, una mononucleosis infecciosa, un glioma “benigno”, un meningioma, un ganglioneuroma, un neurilemoma, un neurofibroma, un nevo pigmentado (lunar), un feocromocitoma, un tumor carcinoide, un teratoma, un carcinoma, un adenocarcinoma, un carcinoma de células basales, un coriocarcinoma, un fibrosarcoma, un condrosarcoma, un osteosarcoma, un leiomiosarcoma, un 30 rabdomiosarcoma, un liposarcoma, un hemangiosarcoma, un linfangiosarcoma, una leucemia mielocítica, una leucemia eritrocítica, una leucemia linfocítica, un mieloma múltiple, una leucemia monocítica, un sarcoma de Ewing, un linfoma maligno no Hodgkin, un meduloblastoma, un oligodendroglioma, un sarcoma neurilémico, melanoma maligno, timoma, un glioblastoma multiforme, un astrocitoma, un ependimoma, un sarcoma meníngeo, un neuroblastoma (schwannoma), un neurofibrosarcoma, un feocromocitoma maligno,

35 un retinoblastoma, un tumor carcinoide, un nefroblastoma (tumor de Wilms), un teratocarcinoma y un carcinoma embrionario con coriocarcinoma.
6. Uso de la composición inhibidora de cinasa según la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para tratar un neoplasma seleccionado del grupo que consiste en un papiloma, un adenoma, una mola hidatidiforme, un fibroma, un condroma, un osteoma, un leiomioma, un rabdomioma, un lipoma, un

40 hemangioma, un linfangioma, una policitemia vera, una mononucleosis infecciosa, un glioma “benigno”, un meningioma, un ganglioneuroma, un neurilemoma, un neurofibroma, un nevo pigmentado (lunar), un feocromocitoma, un tumor carcinoide, un teratoma, un carcinoma, un adenocarcinoma, un carcinoma de células basales, un coriocarcinoma, un fibrosarcoma, un condrosarcoma, un osteosarcoma, un leiomiosarcoma, un rabdomiosarcoma, un liposarcoma, un hemangiosarcoma, un linfangiosarcoma, una

45 leucemia mielocítica, una leucemia eritrocítica, una leucemia linfocítica, un mieloma múltiple, una leucemia monocítica, un sarcoma de Ewing, un linfoma maligno no Hodgkin, un meduloblastoma, un oligodendroglioma, un sarcoma neurilémico, melanoma maligno, timoma, un glioblastoma multiforme, un astrocitoma, un ependimoma, un sarcoma meníngeo, un neuroblastoma (schwannoma), un neurofibrosarcoma, un feocromocitoma maligno, un retinoblastoma, un tumor carcinoide, un nefroblastoma

50 (tumor de Wilms), un teratocarcinoma y un carcinoma embrionario con coriocarcinoma.
7. Composición inhibidora de cinasa según la reivindicación 1, en la que el péptido inhibidor de cinasa es un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina.

34
8.

Composición inhibidora de cinasa según la reivindicación 1, en la que la composición induce muerte celular programada de al menos una célula en una población celular.
9.

Composición inhibidora de cinasa según la reivindicación 1, en la que la composición inhibe la hiperplasia de al menos una célula hiperplásica en una población celular.

5 10. Composición inhibidora de cinasa según la reivindicación 1, en la que el péptido inhibidor de cinasa para inhibir el crecimiento de un neoplasma es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 173].
11. Composición inhibidora de cinasa según la reivindicación 1, en la que el péptido inhibidor de cinasa para

inhibir el crecimiento de un neoplasma es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos 10 FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 163].
12.

Composición inhibidora de cinasa según la reivindicación 1, en la que el péptido inhibidor de cinasa para inhibir el crecimiento de un neoplasma es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 106].
13.

Composición inhibidora de cinasa según la reivindicación 1, en la que el péptido inhibidor de cinasa para

15 inhibir el crecimiento de un neoplasma es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos YARAAARQARAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 28].
14. Composición inhibidora de cinasa según la reivindicación 1, en la que el péptido inhibidor de cinasa para inhibir el crecimiento de un neoplasma es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos YARAAARQARAKALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 100].

20 15. Composición inhibidora de cinasa según la reivindicación 1, en la que el péptido inhibidor de cinasa para inhibir el crecimiento de un neoplasma es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos YARAAARQARAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 64].

35