CN102949722A - 基于p38抑制剂和细胞生长因子的新颖药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于p38MAP激酶抑制剂在和细胞生长因子的新颖药物组合物，其制法及其用于治疗辐射、化学毒物诱导骨髓抑制疾病中的用途。通过现代药理学实验证明，小鼠在受照后注射p38抑制剂与G-CSF，可对化学毒物、辐射诱导的骨髓抑制具有一定的缓解作用，提示该药物组合物可用于治疗化学毒物、辐射诱导骨髓的损伤。对于放疗患者，进行p38抑制剂与细胞因子联合治疗，有利于保护骨髓细胞功能，缓解骨髓长期抑制。

Description

基于p38抑制剂和细胞生长因子的新颖药物组合物

技术领域

本发明涉及基于细胞生长因子及p38激酶抑制剂的新颖药物组合物，其制法及其用于防治辐射、化学毒物诱导骨髓抑制疾病中的用途。

背景技术

P38丝裂原活化激酶(P38MAPK，p38)通路是一种应激反应通路，它可被不同的外部与细胞内刺激所激活，这些压力包括渗透压，热休克，不同毒素，UV，辐射，活性氧，细胞因子，端粒缺失，DNA损伤等。P38MAPK的激活与级联反应p38MAPK的激酶反应信息传递为：细胞受到刺激后，通过某种中间环节使MAPKKK活化，其转而激活MAPKK，后者通过双位点磷酸化调控p38MAPK的活性。

如同其它丝裂原活化激酶，p38 MAPK通路可被MAPK激酶激酶类所激活，其中最主要的两种为MKK3和MKK6。此外MKK4在一些细胞中对p38的激活也有一些辅助作用。P38MAPK可被细胞外多种刺激激活，主要原因在于其上游MKK3可被多种刺激激活。研究发现，TAK1，ASK1/MAPKKK5，DLK/MUK/ZPK和MEKK4等均能激活MKK3。此外，Rho家族的Rac1和Cdc42等也能激活p38MAPK上游通路。

p38 MAPK通路激活后，其下游靶点也分布广泛，有转录因子如p53，ATF1/2/6，MEF2A/C，SAP1，STAT1，Gadd153，Max等，还有蛋白激酶MSK1，MSK2，MNK1，MNK2，MK2，MK3和MK5等。p38MAPK通路对其下游的激活，会引发细胞产生炎症或免疫反应，或者导致细胞周期停滞，衰老，凋亡等。近年，Reinhardt等人发现除经典的ATM/Chk2及ATR/Chk1通路外，p38MAPK/MK2复合体也是ATM/ATR下游因子，并与Chk1，Chk2平行作用于检验点。

在造血系统中，p38MAPK通路在多个发育过程中占据重要地位。如p38α(-/-)缺陷型小鼠会在胚胎期E10.5-E12.5间死亡。在造血细胞中，p38MAPK通路可被各类细胞因子如造血因子EPO，骨髓抑制因子IFN-α，IFN-β，TGF-β和TNF-α等激活。通过对红细胞分化过程中p38四种亚型的mRNA表达分析，发现p38α和p38γ mRNA在造血祖细胞早期及红细胞晚期均表达，而p38δmRNA仅在红细胞分化后期有表达。与之相反的是p38β在造血祖细胞早期很少表达，在红细胞晚期不表达。这说明p38MAPK通路参与红细胞生成调节。抑制p38MAPK通路能加强中性白细胞发育，但持续性激活p38MAPK通路会彻底抑制中性白细胞分化。这说明p38MAPK通路还参与了髓系祖细胞分化与扩增的调节。

近年来随着研究的深入，逐步发现p38MAPK在造血干/祖细胞衰老和凋亡中具有重要作用。研究发现抑制p38 MAPK通路可能治疗多发性骨髓瘤。而利用Atm缺陷小鼠发现小鼠HSC积聚的活性氧会导致造血干细胞过度增殖分化最终衰竭，其中p38MAPK通路被激活。随后进一步研究发现，在活性氧诱导衰老的造血干细胞中，p38，p16，p19表达升高。对造血干细胞加入BSO(Buthionine sulfoximine)、NAC(N-acetyl-L-cysteine)或者p38MAPK抑制剂(SB203580)均能降低ROS诱导的p16和p19表达，并且使造血干细胞功能有所恢复。而在ROS较低的造血干细胞中，其功能较强，并且p16基本未表达，p38表达较低。这些研究均提示p38MAPK通路可作为治疗靶点。

粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)是一种促进造血细胞增殖的多肽因子，通过与靶细胞表面受体结合发挥其生物学效应。G-CSF作用于中性细胞的前体细胞，促进其分化、增殖并促进骨髓中成熟的中性粒细胞释放，增强中性粒细胞的功能。G-CSF除了能够提高中性粒细胞的水平外，还能增强外周血中性粒细胞的吞噬、杀伤及趋化功能，从而减少感染的发生率。但有实验证实，G-CSF可能导致造血干细胞功能衰竭，这严重限制了G-CSF的临床应用。

本发明人在实验中首次发现：p38MAP激酶抑制剂及联合细胞生长因子在防治骨髓抑制中具有明显的治疗作用。特别是防治辐射诱导骨髓抑制更加明显，基于上述的发现经过进一步实验完成本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题是寻找能够有效保护各种因素诱导骨髓细胞和功能的损伤得到防护和治疗的药物。

因此，本发明的目的在于提供p38MAP激酶抑制剂联合细胞生长因子在制备预防或治疗辐射、化学毒物诱导骨髓抑制药物中的应用，降低化疗所带来的毒副作用。

附图说明

图1p38抑制剂联合G-CSF对辐射暴露小鼠骨髓细胞CAFC能力的影响。小鼠照射剂量为4Gy。照射后分别给予生理盐水、SB(15mg/kg，隔日给药，5次)、G-CSF(1ug/次，2次/日，连续6次)，SB+G-CSF，腹腔注射，每处理组5只。照射10天后，取骨髓细胞，进行CAFC能力检测。结果表明SB及联合用药组在第四周对小鼠的CAFC能力有显著保护作用。

图2p38抑制剂联合G-CSF对辐射暴露小鼠存活率的影响(7.2Gy)。雄性C57小鼠75只，分为5组，照射后分别给予生理盐水、SB(15mg/kg，隔日给药，5次)、G-CSF(1ug/次，2次/日，连续6次)，SB+G-CSF，腹腔注射，每处理组15只，观察30天，小鼠存活率得到显著提高。

具体实施方式

一种p38MAP激酶抑制剂联合细胞生长因子在制备预防辐射、化学毒物诱导骨髓抑制药物中的应用。所述的辐射诱导骨髓损伤，包括：接受放射治疗的肿瘤患者、辐射暴露的工作人员、意外辐射性同位素暴露的人员。

另一个优选的实施方式是：p38MAP激酶抑制剂联合细胞生长因子在制备治疗化学毒物诱导的骨髓型死亡药物中的应用。其中所述化学毒物诱导的骨髓抑制，包括：接受化学治疗的肿瘤患者、抑制骨髓的化学毒物接触的工作人员及意外暴露的人员。

本发明所述的骨髓抑制(骨髓抑制性死亡)，包括外周血白细胞下降、骨髓增生不良或再生障碍性贫血。

本发明对辐射诱导骨髓抑制的实验内容主要包括以下几个方面：

1.p38MAP激酶抑制剂联合G-CSF可显著提高全身照射的小鼠生存率

2.p38MAP激酶抑制剂联合G-CSF对接收全身照射的小鼠骨髓细胞功能损伤有保护作用

下面通过药效学实验进一步说明p38抑制剂联合G-CSF在预防或治疗辐射、化学毒物诱导骨髓抑制作用的药理实验情况。

1、骨髓单个核细胞分离

无菌取小鼠股骨，含2％FCS的Hanks液冲洗骨髓，Ficoll分离，制备单个核细胞悬液，洗涤，计数调整所需的细胞浓度后待用。

2、饲养层细胞的培养

无菌取小鼠骨髓细胞，计数后调整到一定浓度，加于96孔板，每孔200ul，放于33度二氧化碳培养箱中培养，每周换液一次。一周后照射15Gy，再培养一周后种入细胞。

3、CAFC能力测定

无菌取小鼠骨髓细胞，计数后用IMDM培养基调整到一定浓度，取部分装于14ml的falcon管。对照组需细胞3.0375×106个细胞，照射组上调三倍，共需细胞9.1125×106个细胞。对照组配置浓度为40.5×104/ml的细胞悬液7.5ml，照射组配置浓度为12.15×105/ml的细胞悬液7.5ml。充分混匀(来回吹打十次)后吸取2.5ml加入下一含有5mlIMDM培养基的falcon管中，吹打十次混匀后，再次稀释。每个照射剂量梯度稀释五次。

取饲养层细胞培养板，吸取190ul培养基，按照浓度从低到高，每种浓度加20孔，每孔加200ul，种板。连续观察5周，细胞数≥5为阳性集落，最后用相关软件进行计算。

4、集落形成(克隆)能力测定

分装甲基纤维素培养基，-20℃保存。用前置于2-8℃冰箱内或室温下解冻；分离小鼠骨髓细胞，胎盘蓝染色计数细胞调整细胞浓度加入M3534，振荡器充分混匀，静置待气泡消失，用3ml注射器连接16#平头注射器针头，加入24孔板放入湿盒，置入37℃，5％CO2培养箱中培养14天。

从培养第5天开始在倒置显微镜下进行观察。低倍观察集落形成情况，细胞数≥30为阳性集落，集落形成率以每10⁵个细胞形成的集落数表示。

5、全身照射小鼠生存率测定全身照射后，定期称重，每日观察小鼠死亡情况。

二、实验结果与讨论

1、p38抑制剂联合G-CSF对辐射暴露小鼠骨髓细胞及外周血白细胞计数的影响

小鼠按照射剂量分为2、4、6Gy三组，25只/组。照射后分别给予生理盐水、SB(15mg/kg，隔日给药，5次)、G-CSF(1ug/次，2次/日，连续6次)，SB+G-CSF，腹腔注射，每处理组5只。照射10天后，取骨髓细胞及外周血。结果发现如表1和2所示，不同照射剂量对小鼠骨髓及外周血计数均有抑制作用，而p38抑制剂联合G-CSF在6Gy照射后对小鼠骨髓与外周血白细胞有明显的保护作用，与照射组相比，P＜0.05.

表1p38抑制剂联合G-CSF对受照小鼠外周血的影响

表2p38抑制剂联合G-CSF对受照小鼠骨髓的影响

2.p38抑制剂联合G-CSF对辐射暴露小鼠骨髓细胞CAFC能力的影响

小鼠照射剂量为4Gy。照射后分别给予生理盐水、SB(15mg/kg，隔日给药，5次)、G-CSF(1ug/次，2次/日，连续6次)，SB+G-CSF，腹腔注射，每处理组5只。照射10天后，取骨髓细胞，进行CAFC能力检测。结果如图1所示，发现SB及联合用药组在第四周对小鼠的CAFC能力有显著的保护作用。

3、p38抑制剂联合G-CSF对辐射暴露小鼠骨髓细胞集落形成率的影响

小鼠按照射剂量分为2、4、6Gy三组，25只/组。照射后分别给予生理盐水、SB(15mg/kg，隔日给药，5次)、G-CSF(1ug/次，2次/日，连续6次)，SB+G-CSF，腹腔注射，每处理组5只。照射10天后，取骨髓细胞，接种，进行粒单系集落形成试验(colony-formingunit-granulocyte-macrophage，CFU-GM)。结果发现，不同照射剂量对小鼠CFU-GM具有明显的抑制作用，而p38抑制剂联合G-CSF具有明显的保护作用，与对照组相比，P＜0.01。

表3  p38抑制剂联合G-CSF对受照小鼠单侧股骨CFU-GM的影响

4.p38抑制剂联合G-CSF对辐射暴露小鼠存活率的影响

雄性C57小鼠75只，分为5组，照射后分别给予生理盐水、SB(15mg/kg，隔日给药，5次)、G-CSF(1ug/次，2次/日，连续6次)，SB+G-CSF，腹腔注射，每处理组15只，观察30天，小鼠存活率得到显著提高，结果见图2。

根据体内实验结果发现，p38抑制剂联合G-CSF对辐射诱导的骨髓细胞功能损伤具有一定的保护作用。

本发明所具有的积极效果在于：

1、P38MAP激酶抑制剂尚未用于治疗骨髓细胞功能损伤。

2、尽管G-CSF已经广泛应用于临床，但有一定局限性，其与P38MAP激酶抑制剂的联合治疗作用在一定程度上可扩大其应用范围。

Claims (10)

1.一种药物组合物，其特征在于其中包含一或多种细胞生长因子(A)与一或多种p38激酶抑制剂(B)组合，其可任选以其对应异构体、对应异构体的混合物形式或其消旋物形式，可任选以其溶剂合物或水合物形式，及可任选并用药学上可接受的赋形剂。

2.p38激酶抑制剂联合细胞生长因子制备防治辐射、化学毒物诱导骨髓抑制药物中的应用。

3.在权利要求1和2所述的应用，其特征在于p38激酶抑制剂联合细胞生长因子在制备预防辐射诱导骨髓损伤药物中的应用。

4.权利要求1和2所述的应用，其特征在于p38激酶抑制剂联合细胞生长因子在制备治疗化学毒物诱导的骨髓抑制性死亡药物中的应用。

5.权利要求1和2所述的应用，其中所述辐射诱导的骨髓抑制，包括接受放射治疗的肿瘤患者、辐射暴露的工作人员、意外辐射性同位素暴露的人员。

6.权利要求1和2所述的应用，其中所述化学毒物诱导的骨髓抑制，包括接受化学治疗的肿瘤患者、抑制骨髓的化学毒物接触的工作人员及意外暴露的人员。

7.权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于所述的骨髓抑制，包括外周血白细胞下降、骨髓增生不良或再生障碍性贫血。

8.根据权利要求1-7中任一项的药物组合物，其特征在于A与B的重量范围为1∶2000至20∶1，优选为1∶800至10∶1。

9.根据权利要求1-8中任一项的药物组合物，其特征在于单一给药剂量相当于活性物质A与B组合的剂量为约20至10000微克，优选为100至5000微克。

10.根据权利要求1-9中任一项的药物组合物，其特征在于其是以适合注射用的制剂形式存在的。

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