CN103356610B - 四氢紫堇萨明在制备治疗老年性痴呆药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

四氢紫堇萨明（Tetrahydrocorysamine）是从中药延胡索分离得到的一种生物碱，延胡索具有活血、理气、止痛的功效，主要用于胸胁、脘腹疼痛，经闭痛经，产后瘀阻，跌扑肿痛。本发明公开了四氢紫堇萨明在制备治疗老年痴呆药物中的应用。

Description

四氢紫堇萨明在制备治疗老年性痴呆药物中的应用
技术领域
本发明涉及四氢紫堇萨明的一种新的用途，具体的，涉及四氢紫堇萨明在制备治疗老年痴呆药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease ，AD）又名老年性痴呆，是一种慢性神经退行性或脑血管损伤等引起脑实质损害、脑功能失调或缺失的老年病症。神经细胞受损与脑血管疾病发生发展密切相关【袁拯忠,朱陵群.栀子苷、黄芩苷和小檗碱对缺氧/复氧损伤时小鼠脑微血管内皮细胞粘附分子表达的影响[D].北京中医药大学硕士学位论文,2005.】。主要临床表现为记忆能力减退， 持续性认知能力下降以及运动障碍等，并伴随有一系列精神病症状。AD的3个神经病理学特征为：以β-淀粉样蛋白（Aβ）为沉积核心的老年斑，细胞内高度磷酸化的微管蛋白组成的神经元纤维缠结和前脑基底部胆碱能神经元的退化和丢失【Maccioni RB, Munoz JP, Barbeito L, et al.The Molecular Bases of Alzheimer’s Disease and Other Neurodegenerative Disorders [J] . Arch Med Res,2001,32 （5）:367-381.】。到目前为止，用于临床治疗AD的主要是乙酰胆碱酯酶抑制剂（AchEIs），它们通过抑制乙酰胆碱酯酶（AchE）的活性使突触间隙乙酰胆碱的作用延长，增强了脑内胆碱能神经的功能从而有效改善患者的认知能力【Trinh NH, Hoblyn MJ, Mhanty MP,et al . Efficacy of Cholinesterase inhibitors in the Treatment of Neuropsychiatric Symptoms and Functional Impairment in Alzheimer’s disease[J].JAMA,2003,289（2）:210-216.】。
在正常生理状态下，体内存在许多抗氧化酶如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、及水溶性或脂溶性抗氧化剂如谷胱甘肽、维生素E、雌激素，可以迅速清除自由基，使自由基的产生与清除处于动态平衡状态，而不致引起细胞损伤。许多研究表明，老年人和AD患者脑内的抗氧化物质减少，自由基增多【Elisabetta Baldi，Carlo Ambrogi Lorenzini，Corrado Bueherelli，Physiology Behavior，2003（78）:785-793.】。目前认为这是AD发病的一个重要诱因【Baddeley AD. Working memory.Seience，1992,255（5044）:556-559.】。
延胡索具有活血、理气、止痛的功效，主要用于胸胁、脘腹疼痛，经闭痛经，产后瘀阻，跌扑肿痛。四氢紫堇萨明（Tetrahydrocorysamine）是从中药延胡索分离的到的一种生物碱，结构式如下：
分子式：C20H19NO4，CAS登录号为：32043-26-8，四氢紫堇萨明除了可以在延胡索中分离得到以外，也有报道在苦地丁、峨眉紫堇等药物中分离得到。
延胡索总碱是从延胡索中提取得到的总生物碱，延胡索总生物碱能抵抗D-半乳糖所致小鼠的衰老【白雪，杨杰,等.延胡索总生物碱对D-半乳糖所致衰老模型小鼠相关指标的影响，贵州医药，2008,32（5）:399-401】，提示延胡索总碱可能具有对抗老年性痴呆的作用，但是延胡索总碱中包含有很多种生物碱，未见文献报道四氢紫堇萨明具有抗老年性痴呆的作用。
发明内容
本发明目的是提供四氢紫堇萨明在制备治疗老年性痴呆药物中的应用。
实验证实四氢紫堇萨明可有效抑制乙酰胆碱酯酶活性，使突触间隙乙酰胆碱的作用延长，增强了脑内胆碱能神经的功能从而有效改善老年性痴呆的认知能力。
此外，四氢紫堇萨明减少自由基氧化损伤，提高机体抗氧化能力，改善老年性痴呆的认知障碍。
为了实现本发明的目的，四氢紫堇萨明可制成适宜的药物剂型，优选的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂或注射剂。
为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。
为了证实四氢紫堇萨明的功效，发明人进行了如下实验：
实验一：四氢紫堇萨明对老年痴呆模型细胞存活率及AchE活性的影响。
一、实验材料
1.1供试品名称：四氢紫堇萨明，淡黄色颗粒，北京以岭医药研究院提供；延胡索总碱，黑色颗粒，北京以岭医药研究院提供。
1.2阳性对照药：石杉碱甲原粉：购自中国药品生物制品检定所，产品批号：100243-200401，分子量为242.32D；多奈哌齐盐酸盐：购自sigma公司，产品批号：061M4713V，分子量为433.97D。
1.3细胞株：PC-12，购自上海细胞生物学研究所。
二、实验方法：
2.1药物的配制：
2.1.1供试品的配制：
2.1.1.1四氢紫堇萨明：称取3000μg四氢紫堇萨明，加入1.0mL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制成3000μg/mL的母液，分装，-20℃冻存。使用前先用DMSO稀释成最终作用浓度的100倍，再加入无血清DMEM（Dulbecco's modification of Eagle's medium，DMEM）培养基稀释成相应浓度的工作液。
2.1.1.2延胡索总碱：称取3000μg延胡索总碱，加入1.0mLDMSO配制成3000μg/mL的母液，分装，-20℃冻存。使用前先用DMSO稀释成最终作用浓度的100倍，再加入无血清DMEM培养基稀释成相应浓度工作液。
2.1.1.3石杉碱甲：
称取10mg石杉碱甲原粉，加入10.32mLDMSO配制成4×10-3M母液，分装，-20℃冻存。使用前先用DMSO稀释成最终作用浓度的100倍，再加入无血清DMEM培养基稀释成相应浓度工作液。
2.1.1.4多奈哌齐盐酸盐：
称取10mg多奈哌齐盐酸盐，加入11.5mLDMSO配制成2×10-3M母液，分装，-20℃冻存。使用前先用DMSO稀释成最终作用浓度的100倍，再加入无血清DMEM培养基稀释成相应浓度工作液。
2.2 Aβ25-35的老化处理：
称取1mg Aβ25-35溶解在2mL的生理盐水中，配制成浓度为471.58μM的母液，置于37℃培养箱中老化5天，使其成为凝聚状态，-80℃贮存备用。使用前用无血清DMEM培养基稀释成相应浓度的工作液。
2.3酶提取液的配制：
取Triton X-100 0.5mL、EDTA 1.46mg，用PBS（0.1M，pH7.4）溶解并定容至100mL。
2.4细胞培养：
从液氮中迅速取出装有PC-12细胞的冻存管，立即放入37℃水浴中快速解冻约1min，75%酒精擦试冻存管后，移入超净工作台，700rpm离心3min，去除冻存液，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，吹打均匀后转入培养皿，置于37℃、5%CO2恒温细胞培养箱内培养。倒置显微镜下观察细胞生长融合至80%左右时，按1:2～1:3比例传代，取生长状态良好的细胞用于实验。
2.5四氢紫堇萨明对模型细胞存活率的影响
2.5.1实验分组与处理方法：
取对数生长期细胞，接种于96孔板中（细胞密度1.0×105个/mL），待细胞融合至80%时弃去旧培养基，将细胞分为以下几组（每组平行设置4个复孔）：
（1）空白对照组：用无血清的DMEM培养基培养。
（2）模型组：用无血清的DMEM培养基培养4h后弃去培养液，加入含30µM（终浓度）的Aβ25-35的无血清DMEM培养液孵育48h。
（3）溶剂对照组：加入含1%DMSO的无血清培养基培养4h后弃去培养液，再加入含1%DMSO（终浓度）与30µM（终浓度）的Aβ25-35无血清DMEM培养液孵育48h。
（4） 药物组：分别加入含相应药物（四氢紫堇萨明和延胡索总碱，两者的终浓度均设定为：30μg/mL、3μg/mL、0.3μg/mL、0.03μg/mL、0.003μg/mL。此浓度梯度以大量的前期预实验结果为依据而定）的无血清DMEM培养基，培养4h后弃去旧培养液，再分别加入含相同浓度药物与30µM 的Aβ25-35无血清DMEM培养液孵育48h。
（5） 阳性药对照组：分别加入含石杉碱甲（终浓度为10-5M）和多奈哌齐盐酸盐（终浓度为10-6M）的无血清培养基，分别培养4h后弃去旧培养液，再分别加入含相应浓度药物与30µM的Aβ25-35无血清DMEM培养液孵育48h。
实验结束后，各组弃去旧培养基，加入含有CCK-8的无血清DMEM培养基（CCK-8溶液:无血清DMEM培养基=1:10），37℃孵育2h，酶标仪450nm处检测吸光度。实验操作严格按照CCK-8试剂检测说明书进行。
2.6四氢紫堇萨明对模型细胞AchE活性的影响：
2.6.1实验分组与处理方法：
取对数生长期细胞，接种于6cm细胞培养皿中（细胞密度1.0×105个/mL），待细胞融合至80%时弃去旧培养基，将细胞分为以下几组（每组平行设置3个复皿）：
（1）空白对照组：用无血清的DMEM培养基培养。
（2）模型组：用无血清的DMEM培养基培养4h后弃去培养液，再加入含30µM的Aβ25-35的无血清DMEM培养液孵育48h。
（3）溶剂对照组：加入含1%DMSO的无血清DMEM培养基培养4h后弃去培养液，再加入含1%DMSO与30µM 的Aβ25-35 无血清DMEM培养液孵育48h。
（4）药物组：加入含相应药物（四氢紫堇萨明：0.3μg/mL（此浓度依据四氢紫堇萨明对细胞生存活性的作用选定）、延胡索总碱：0.3μg/mL）的无血清DMEM培养基培养4h后弃去旧培养液，再加入含相应浓度药物与30µM的Aβ25-35无血清DMEM培养液孵育48h。
（5）阳性药对照组（石杉碱甲和多奈哌齐）：分别加入含10-5M（终浓度）石杉碱甲和10-6M（终浓度）多奈哌齐盐酸盐的无血清DMEM培养基，培养4h后弃去旧培养液，再分别加入含相应浓度药物与30µM的Aβ25-35无血清DMEM培养液孵育48h。
实验结束后，各组弃去旧培养基，用细胞刮收集细胞，BCA法测定蛋白浓度，AchE活性测定试剂盒测定AchE活性，实验操作严格按照试剂说明书进行。
三、数据处理
利用下列公式计算各孔细胞存活率。
各组实验数据（其中AchE的活性变化以相对于空白对照组的倍数表示）用均数±标准差表示，采用Origin8.0软件进行绘图。
四、实验结果
4.1四氢紫堇萨明对AD细胞模型存活率的影响（图1，表1）。
实验结果显示：与空白对照组比较，模型组细胞的存活率显著降低（P＜0.05），随着药物浓度的增加，细胞存活率随之升高，当浓度达到0.3μg/mL时存活率最高（P＜0.05，P＜0.01），之后随着药物浓度的增加存活率降低；并且四氢紫堇萨明组的存活率始终高于延胡索总碱组。因此，选取0.3μg/mL作为下一步实验用浓度。
表1各组细胞存活率变化的比较
组别 四氢紫堇萨明 延胡索总碱
空白对照组 100.02±7.91 100.01±7.22
模型组 75.88±3.22* 74.18±3.01*
溶剂对照组 76.26±9.64 76.16±9.54
0.003μg/mL 96.70±1.49 85.10±1.09
0.03μg/mL 102.12±13.35△ 83.02±10.30
0.3μg/mL 110.17±2.975△△ 90.07±0.17
3μg/mL 104.95±5.435△ 80.15±0.73
30μg/mL 94.70±2.96 78.90±4.26
石杉碱甲组 98.84±8.89 88.94±1.81
多奈哌齐组 95.28±3.22 94.20±0.92
注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△ P＜0.05，△△ P＜0.01。
4.2四氢紫堇萨明对各组细胞AchE活性的影响（图2，表2）。
与空白对照组比较，加入Aβ25-35后，模型组细胞中AchE活性显著升高（P＜0.01），可达空白对照组的1.37倍；与模型组比较，溶剂对照组细胞中AchE活性基本没有变化；四氢紫堇萨明组AchE活性显著减低（P＜0.01），并且细胞形态和数量都有明显改善；延胡索总碱组、石杉碱甲组和多奈哌齐组的AchE活性亦降低，但均不如四氢紫堇萨明组。
表2 各组AchE活性的变化
组别 AchE活性
空白对照组 1.00±0.15
模型组 1.37±0.36**
溶剂对照组 1.29±0.10
四氢紫堇萨明组 0.93±0.27△△
延胡索总碱组 1.17±0.21
石杉碱甲组 1.33±0.43
多奈哌齐组 1.03±0.14
注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△ P＜0.01。
五、结论：
综合分析认为，四氢紫堇萨明在浓度0.3μg/mL处对Aβ25-35所致的PC-12细胞损伤有明显的改善作用，可以显著提高模型细胞的存活率，降低模型细胞AchE的活性，且效果明显优于延胡索总碱及阳性药石杉碱甲和多奈哌齐。
实验二：四氢紫堇萨明对SAMP8快速老化型AD模型小鼠的作用
一、实验材料
1.1供试品名称：四氢紫堇萨明，淡黄色颗粒，分子量337.3692D，北京以岭医药研究院提供。
1.2石杉碱甲：哈伯因（石杉碱甲片）主要成份：石杉碱甲（C15H18N2O），河南太龙药业股份有限公司豫中制药厂，规格：50μg*24片/盒，批号：100303。对痴呆患者和脑器质性病变引起的记忆障碍均有明显改善作用。口服，每次2-4片，一日2次，日用量不超过9片。
1.3延胡索总碱：黑色颗粒，北京以岭医药研究院提供，实验剂量为200mg/kg体重。
1.4 实验动物：动物种系：SAMP8小鼠（快速老化型AD模型小鼠）和SAMR1小鼠（野生型正常小鼠）；动物级别：SPF级；动物性别和数量：雄性，SAMP8小鼠120只，SAMR1小鼠20只；动物体重：27-36g；动物来源：购于北京大学医学部实验动物科学部，合格证号：0116778；
二、实验方法
分组与给药剂量
实验分为正常组（SAMR1小鼠）、模型组（SAMP8小鼠）、四氢紫堇萨明大剂量组（0.3mg/kg·day）、四氢紫堇萨明中剂量组（0.2mg/kg·day）、四氢紫堇萨明小剂量组（0.1mg/kg·day）、石杉碱甲组、延胡索总碱组。溶媒均为0.5%羧甲基纤维素钠。表3。
表3 实验分组和给药剂量
组　别 动物数量（只） 剂量（mg/kg.d）
正常组 20 ——
模型组 20 ——
四氢紫堇萨明小剂量组 20 0.10
四氢紫堇萨明中剂量组 20 0.20
四氢紫堇萨明大剂量组 20 0.30
石杉碱甲组 20 0.15
延胡索总碱组 20 200
给药方法
灌胃给药。每天上午8～9点按体重给药，每天一次，连续10周，正常组和模型组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠灌胃。
实验方法
给药28d后，各组进行行为学检测，以评价四氢紫堇萨明对AD模型小鼠学习记忆能力的影响；实验结束时，10%水合氯醛麻醉，颈总动脉取血，分离血清，并迅速取脑，预冷生理盐水冲洗清除血迹，取血清与脑进行生化指标检测。
各组小鼠学习记忆认知功能检测
采用Morris水迷宫，其测试系统主要由圆形水池，可移动透明平台和自动记录系统三部分组成。水池直径90cm，高50cm，池壁由不锈钢板组成，池内水深30cm。平台直径9cm，高28cm。自动记录系统包括摄像机、监视器和计算机。摄像机安装在水池上方约2m处，并与监视器和计算机相连接。小鼠在水池中的全部活动情况可在监视屏中看到，利用计算机软件对其活动进行全程跟踪，并显示整个活动轨迹。当设定的时间已到或动物爬上平台，计算机停止跟踪并记录下小鼠的游泳轨迹，在水池中所游路程，找到平台所需时间（潜伏期），寻找平台采用的策略以及朝向错误角度等，并以此表示小鼠的空间学习记忆能力。实验宜在暗室内进行，水池放在房间的中央，四周（距水池lm处）各安置一25w的日光灯照明，池壁上随意悬挂两个物体作为近距离视觉暗示，并有多种远距离视觉暗示。实验过程中要保持实验室各种条件恒定不变。实验前用无毒黑色染发剂在小鼠头部做标记，以便摄像跟踪其游行轨迹。预先在水池里注入含1000g奶粉的水溶液，使池水成不透明的乳白色，再注入清水使水面高出平台2cm，水温控制在25℃左右。实验室温度保持在24～25℃，水池四周存在丰富的空间参照物（门、灯、桌椅、摄像头及实验者等），且位置保持不变，以供小鼠定位平台。
隐蔽平台实验实验研究：实验前1d，让动物在不设平台的水池中自由游泳90s，上午、下午各一次，使其熟悉迷宫环境。实验时平台位置固定不变，置于东北象限中央，平台中点离池壁22.5cm。在平台对侧选两个与之距离相等的点作为入水点，训练时将动物面朝池壁轻轻放入水中，记录小鼠从入水至找到平台时游泳路线的长度及找到平台的时间（逃避潜伏期），然后让小鼠在平台上停留10s。如果90s内找不到平台，潜伏期记为90s，并将小鼠置于平台上休息10s。训练结束后，将小鼠置于笼中，并注意保暖、用吹风机烘干鼠毛。
各组小鼠血液中MDA含量及SOD、CAT活性的检测
实验操作严格按照试剂盒说明书进行。
各组小鼠脑组织中MDA含量及SOD、CAT、ChAT、AchE活性的检测
小鼠断头取脑后，切取大脑中后部含海马区0.1~0.2g，冰冻备用；加入预冷的生理盐水（组织质量(g)/生理盐水体积(mL)＝1:9）；匀浆机匀浆后，3000rpm离心10min，取上清备用。实验操作严格按照试剂盒说明书进行。
数据处理
所有数据用均数±标准差（±s）表示。采用SPSS统计软件包，首先进行正态性检验，符合正态分布的数据，均数比较用单因素方差分析，若方差齐，则采用两两比较采用最小显著差法进行分析，若方差不齐则采用Dunnett’s T3检验行两两比较；如不符合正态分布，则用非参数检验Kruskal—Wallis进行统计分析，以P<0.05为有统计学意义。
三、实验结果
3.1各组小鼠不同时间点潜伏期的变化（表4，图3）。
表4 各组小鼠不同时间点潜伏期的变化（潜伏期：s）
组 别 1d 2d 3d 4d 5d 6d
正常组 44.16±21.67 46.19±24.26 39.56±24.27 23.19±12.16 36.06±19.38 35.17±19.86
模型组 80.62±12.21 △ 86.77±11.75 △△ 74.99±23.00 △△ 74.37±19.00 △△ 77.96±20.82 △△ 64.71±15.36 △△
四氢紫堇萨明低剂量组 69.31±19.4 49.09±25.25** 47.03±22.76** 34.62±24.45** 42.79±22.67** 32.99±22.48**
四氢紫堇萨明中剂量组 65.03±15.24 65.49±18.29** 46.3±21.56** 39.30±16.02** 36.06±24.49** 36.93±15.43**
四氢紫堇萨明高剂量组 55.87±17.06 60.09±17.54** 48.76±18.82** 42.39±20.37** 44.05±23.78** 40.72±25.50*
石杉碱甲组 59.54±24.01 50.67±24.76** 33.87±21.84** 47.40±19.30** 45.88±19.81** 39.78±17.7**
延胡索总碱组 69.34±14.11 66.17±18.16** 53.81±20.12** 49.12±17.43** 48.76±17.97** 48.48±20.17*
注：与正常组比较 △ P<0.05，△△ P<0.01；与模型组比较 * P<0.05，**P<0.01
由表4、图3可见，与正常组比较，从第1d起，模型组潜伏期明显延长（P<0.05或P<0.01）；随着学习时间延长，各组动物潜伏期逐渐缩短，模型组潜伏期缩短趋势最缓；与模型组比较，从第二天起，各用药组潜伏期均显著缩短：且均有统计学差异（P<0.05或P<0.01）。
3.2各组小鼠不同时间点总路程的变化（表5，图4）。
表5 各组小鼠不同时间点总路程的变化（总路程：cm）
组别 1d 2d 3d 4d 5d 6d
正常组 955.0±64.5 931.5±65.9 953.2±78.5 619.7±57.4 882±59.2 854.5±67.8
模型组 1576.3±50.9 △ 1391.8±62.9 1395.9±48.3 △ 1546.0±61.9 △△ 1672.3±61.1 △△ 1583.6±62.8 △△
四氢紫堇萨明低剂量组 1565.4±62.3 1108.5±68.4 1232.7±77.9 913.8±71.4** 1098.9±60.7** 967.7±69.1**
四氢紫堇萨明中剂量组 1376.2±59.5 1387.2±60.5 1112.5±61.7* 1123.2±80.5* 934.3±65.5** 987.6±83.6*
四氢紫堇萨明高剂量组 1268.3±71.5 1328.0±61.1 1095.2±72.2 1118.5±72.0* 1011.6±75.6** 1007.1±91.8
石杉碱甲组 1214.8±80.5 1107.1±82.4 878.7±60.5* 1240.5±73.0 1209.0±91.7 664.0±53.7**
延胡索总碱组 1559.34±14.02 1386.17±18.20 1253.81±17.02 1200.12±14.13* 1148.76±18.97* 1001.48±15.07*
注：与正常组比较 △ P<0.05，△△ P<0.01；与模型组比较 * P<0.05，**P<0.01
由表5、图4可见，与模型组比较，随学习时间延长各用药组小鼠的总路程均呈现出不同程度的缩短趋势。其中，实验第3d，四氢紫堇萨明中剂量组，石杉碱甲组总路程较模型组明显缩短（P<0.05）；第4、5d四氢紫堇萨明大、中、小剂量组、延胡索总碱组较模型组总路程均显著缩短（P<0.05或P<0.01）；第6d，四氢紫堇萨明中剂量组、四氢紫堇萨明小剂量组、石杉碱甲组、延胡索总碱组总路程较模型组明显缩短（P<0.05或P<0.01）。
3.3各组小鼠不同时间点总时间的变化（表6，图5）。
附表6 各组小鼠不同时间点总时间的变化（总时间：s）
组别 1d 2d 3d 4d 5d 6d
正常组 46.65±20.11 50.53±22.84 42.35±22.16 25.50±23.46 40.15±15.85 38.50±18.72
模型组 84.70±15.33 △ 87.37±12.47 △△ 75.68±21.32 △△ 72.25±17.34 △△ 84.37±15.58 △△ 67.02±21.90 △△
四氢紫堇萨明低剂量组 70.44±25.59 53.26±23.12** 52.16±21.06** 38.94±22.13** 48.11±25.00** 37.32±16.16**
四氢紫堇萨明中剂量组 67.24±28.21* 66.65±23.24** 51.30±18.10** 44.00±21.75** 41.25±22.64** 39.13±25.87**
四氢紫堇萨明高剂量组 58.74±30.22** 61.68±21.41** 51.49±20.91** 46.54±10.38** 44.54±22.72** 42.05±23.73*
石杉碱甲组 62.15±36.35* 54.55±23.00** 37.05±18.35** 50.15±18.91** 48.35±22.63** 33.65±15.07**
延胡索总碱组 79.34±20.01 66.97±11.06** 63.81±14.02* 59.12±20.13* 68.46±14.57* 58.28±19.87*
注：与正常组比较 △ P<0.05，△△ P<0.01；与模型组比较 * P<0.05，**P<0.01
由表6、图5可见，与正常组比较，从第1d起，模型组总时间明显延长（P<0.01）；与模型组比较，随着用药时间的延长，除四氢紫堇萨明小剂量组和延胡索总碱组外，其余用药组总时间均显著缩短（P<0.05或P<0.01）。
3.4各组小鼠不同时间点上台前路程的变化（表7，图6）。
表7 各组小鼠不同时间点上台前路程的变化（上台前路程：cm）
组别 1d 2d 3d 4d 5d 6d
正常组 919.5±62.6 909.7±66.5 937.4±75.2 795.2±57.3 848.6±57.7 881.1±65.8
模型组 1567.7±52.7 △ 1387.0±63.4 1355.2±42.5 △ 1534.4±61.9 △△ 1584.0±61.5 △△ 1469.3±63.7 △
四氢紫堇萨明低剂量组 1551.9±65.6 1075.2±61.2 1213.1±75.9 869.2±73.6** 1051.8±66.9** 852.4±65.1**
四氢紫堇萨明中剂量组 1350.3±62.1 1365.5±62.2 957.5±61.8* 979.5±81.2* 904.7±75.0** 915.9±84.3*
四氢紫堇萨明高剂量组 1218.5±71.0 1312.1±65.1 1005.7±71.0 1021.1±70.9* 957.8±78.5** 1015.9±92.0
石杉碱甲组 1228.0±82.6 1024.7±51.0 972.8±70.1* 1212.6±71.2 1167.8±60.1 734.9±51.2**
延胡索总碱组 1559.04±18.51 1366.07±11.46 1353.11±21.02 1249.12±14.53 1148.76±12.27 956.18±22.20*
注：与正常组比较 △ P<0.05，△△ P<0.01；与模型组比较 * P<0.05，**P<0.01
由表7、图6可见，实验期间各组动物上台前路程与总路程变化规律相同，其中，模型组没有明显变化，其他各组随学习时间延长总路程均呈现出不同程度缩短趋势。从第1d起，正常组较模型组总路程明显缩短（P<0.05）；第3d，四氢紫堇萨明中剂量组、石杉碱甲组较模型组总路程明显缩短（P<0.05）；第4、5d四氢紫堇萨明大、中、小剂量组较模型组总路程缩短，有统计学差异（P<0.05或P<0.01），第6d，各用药组总路程均缩短，其中四氢紫堇萨明中、四氢紫堇萨明小剂量组、石杉碱甲组、延胡索总碱组较模型组明显缩短，具有统计学差异（P<0.05或P<0.01）。
3.5各组小鼠不同时间点上台前速度的变化（表8，图7）。
表8各组小鼠不同时间点上台前速度的变化（上台前速度：cm/s）
组别 1d 2d 3d 4d 5d 6d
正常组 22.85±2.54 22.84±10.14 25.39±7.59 27.59±8.05 25.51±6.12 27.42±8.47
模型组 18.56±5.85 17.71±6.59 △△ 19.16±7.19 △ 21.38±6.83 △ 21.84±6.69 24.18±4.88
四氢紫堇萨明低剂量组 23.15±4.29* 25.11±12.58** 27.13±6.40** 26.58±4.57* 26.54±4.52** 28.04±5.55**
四氢紫堇萨明中剂量组 21.65±3.73 22.78±6.13** 25.39±6.56* 25.90±8.40* 24.12±5.21 28.61±6.53*
四氢紫堇萨明高剂量组 24.11±6.23* 22.24±3.67** 25.26±8.64* 29.61±10.28* 24.52±4.74 26.82±3.26
石杉碱甲组 22.90±6.12 21.64±6.42** 29.57±9.86** 26.75±11.34* 25.24±3.22* 30.37±7.49**
延胡索总碱组 22.34±10.01 20.17±11.46* 23.81±10.22* 25.12±17.03* 24.76±14.27 25.48±15.07
注：与正常组比较 △ P<0.05，△△ P<0.01；与模型组比较 * P<0.05，**P<0.01
由表8、图7可见，实验期间各组动物上台速度逐渐变快：从第2天起，模型组与正常组相比上台速度明显加快（P<0.01或P<0.05），第5、6d与正常组已没有统计学差异（P>0.05）；随着学习时间延长，各组动物上台速度逐渐变快；各治疗组与模型组相比上台速度均有不同程度的加快；第2、3、4d四氢紫堇萨明大、中、小剂量组和延胡索总碱组上台速度，第5d，四氢紫堇萨明小剂量组上台速度，第6d，四氢紫堇萨明中、小剂量组上台速度与模型组相比统计学差异显著（P<0.05或P<0.01）。石杉碱甲组上台速度2~6d与模型组相比均有统计学差异（P<0.05或P<0.01）。
3.6各组小鼠脑组织MDA含量、SOD及CAT活性的变化（表9，图8）。
表9 各组小鼠脑组织MDA含量、SOD及CAT活性的变化
组别 SOD （ U/mg prot ） MDA （ nmol /mg prot ） CAT （ U/mg prot ）
正常组 165.281±17.45 2.451±0.731 3.84±1.22
模型组 94.73±32.41 △△ 4.818±0838 △△ 2.42±1.11 △△
四氢紫堇萨明低剂量组 166.99±31.37** 2.675±0.567** 4.64±1.37**
四氢紫堇萨明中剂量组 143.30±20.58** 3.489±0.486** 3.457±1.41
四氢紫堇萨明高剂量组 142.96±18.12** 3.250±0.647** 5.15±1.18**
石杉碱甲组 144.81±20.73* 3.278±0.346* 4.815±1.24**
延胡索总碱组 134.01±21.15* 3.578±0.157* 3.115±1.18
注：与正常组比较△ P<0.05，△△ P<0.01；与模型组比较 * P<0.05，**P<0.01
由附表9、图8可见，与正常组比较，模型组SOD活性、CAT活性明显降低， MDA含量显著增多，均具有统计学差异（P<0.05或P<0.01）；与模型组比较，四氢紫堇萨明中剂组和延胡索总碱组CAT酶活性有所升高，但无统计学差异，其余用药组中的各项指标均有明显恢复正常的趋势，且具有显著统计学差异（P<0.05或P<0.01）。
3.7各组小鼠脑组织AchE, ChAT的变化（表10，图9）。
表10 各组小鼠脑组织AchE,ChAT的变化
组别 AchE （ U/mg prot ） ChAT （ U/g ）
正常组 0.168±0.014 170±0.038
模型组 0.405±0.057 △△ 45±0.107 △△
四氢紫堇萨明低剂量组 0.253±0.031** 143±0.036**
四氢紫堇萨明中剂量组 0.239±0.042** 148±0.051**
四氢紫堇萨明高剂量组 0.184±0.024** 164±0.052**
石杉碱甲组 0.207±0.017** 147±0.043**
延胡索总碱组 0.287±0.127* 127±0.253**
注：与正常组比较△ P<0.05，△△ P<0.01；与模型组比较 * P<0.05，**P<0.01
由表10、图9可见，与正常组比较，模型组AchE活性明显升高（P<0.01），而ChAT活性则显著降低（P<0.01）；与模型组比较，四氢紫堇萨明各个剂量组、石杉碱甲组和延胡索总碱组AchE酶活性明显降低，而ChAT酶活性则明显升高（P<0.01）。
3.8各组小鼠血清中MDA含量、SOD与CAT活性的变化（表11，图10）。
表11 各组小鼠血清中MDA含量、SOD与CAT活性的变化
组别 SOD （ U/mL ） MDA （ nmol/mL ） CAT （ U/mL ）
正常组 141.1±3.01 6.74±1.73 6.89±1.50
模型组 102.36±6.53 △△ 17.34±3.17 △△ 3.68±1.42 △△
四氢紫堇萨明低剂量组 126.12±5.83** 7.72±2.54** 7.14±1.15**
四氢紫堇萨明中剂量组 131.14±3.11** 9.51±0.65** 7.53±1.78**
四氢紫堇萨明高剂量组 135.02±5.27** 8.11±2.41** 9.08±1.50**
石杉碱甲组 130.26±3.99** 10.50±0.94** 9.88±2.41**
延胡索总碱组 120.26±3.10* 12.43±0.42** 5.88±1.75*
注：与正常组比较△ P<0.05，△△ P<0.01；与模型组比较 * P<0.05，**P<0.01
由表11、图10可见，与正常组比较，模型组中SOD与CAT的活性明显降低（P<0.01）；而MDA含量则显著升高（P<0.01），与模型组比较，各用药组SOD活性、CAT活性均明显增高，而MDA含量则显著降低（P<0.05，P<0.01）。
四、结论
本研究结果显示：1. 四氢紫堇萨可明显缩短SAMP8快速老化型AD模型小鼠水迷宫隐蔽平台潜伏期、总时间、总路程及上台前路程，加快上台前速度。2. 四氢紫堇萨明可以提高该模型小鼠脑组织及血清中SOD、CAT活性，降低MDA水平，进而提高AD模型小鼠机体抗氧化损伤能力。3. 四氢紫堇萨明能显著降低该模型小鼠脑组织中AchE的活性，同时提高ChAT酶活性，进而改善胆碱能神经系统的功能。提示四氢紫堇萨明对SAMP8快速老化型AD模型小鼠记忆和认知功能具有明显的保护作用，且效果均优于延胡索总碱及石杉碱甲。这可能与四氢紫堇萨明能够减少自由基氧化损伤，进而提高机体抗氧化能力，改善胆碱能系统的作用有关。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进行进一步的说明，但本发明并不受限于此。
实施例1：四氢紫堇萨明片剂制备
称取0.1g四氢紫堇萨明原料，加入微晶纤维素30g，乳糖170g，充分混匀，加入5%聚维酮K30水溶液30mL，再加水10mL，充分搅拌，混合均匀，用24目筛制粒，70℃烘干，整粒，加入1%硬脂酸镁，混匀，压片，制成1000片片剂。
实施例2：四氢紫堇萨明胶囊剂制备
称取0.1g四氢紫堇萨明原料，加入微晶纤维素20g，加入交联聚维酮10g，乳糖220g，充分混匀，加入5%聚维酮K30水溶液30mL，再加水15mL，充分搅拌，混合均匀，用24目筛制粒，70℃烘干，整粒，加入1%硬脂酸镁，混匀，装入胶囊得1000粒胶囊。
实施例3：四氢紫堇萨明滴丸剂制备
称取100g聚乙醇6000，70℃水浴熔化，加入0.1g四氢紫堇萨明原料，边加边搅拌，加完充分搅拌，滴制成丸，制成3000粒滴丸。
实施例4：四氢紫堇萨明颗粒剂制备
称取0.1g四氢紫堇萨明原料，加入蔗糖500g，糊精2500g，充分混匀，加水180mL，充分搅拌，混合均匀，用24目筛制粒，70℃烘干，整粒，分装成500袋。
实施例5：四氢紫堇萨明喷雾剂制备
称取0.1g四氢紫堇萨明原料与1g苯甲酸钠，加入10mL乙醇溶解，再加水稀释至1000mL，充分搅拌均匀，分装到10瓶喷雾瓶。
实施例6：注射液的制备
称取0.1g四氢紫堇萨明原料，加入注射用水充分溶解，调节PH值至7.4，0.2μm微孔滤膜滤过，封装至1000支安瓿。

Claims (3)

1.四氢紫堇萨明做为唯一活性成分在制备治疗老年性痴呆药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于四氢紫堇萨明在制备抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物中的应用。
3.根据权利要求1-2任一项所述的应用，其特征在于所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂或注射剂。
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