JP2003189866A

JP2003189866A - 骨吸収抑制剤探索法

Info

Publication number: JP2003189866A
Application number: JP2001393788A
Authority: JP
Inventors: Naoya Fujita; 直也藤田; Atsushi Ishida; 敦士石田; Takashi Tsuruo; 鶴尾　　隆
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 2001-12-26
Filing date: 2001-12-26
Publication date: 2003-07-08

Abstract

(57)【要約】【課題】新規な抗骨吸収抑制物質のスクリーニング方法
を提供すること。【解決手段】下記［１］乃至［３］の工程を含むことか
らなる骨吸収抑制物質のスクリーニング方法：［１］被検化合物存在下又は非存在下において血管内皮
細胞を培養する工程；［２］被検化合物存在下において培養した血管内皮細胞
又は該化合物非存在下において培養した血管内皮細胞に
おける、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（receptor a
ctivator of NF-κB ligand：以下、「ＲＡＮＫＬ」と
いう。）遺伝子の活性化の程度を示す指標を測定する工
程；［３］被検化合物存在下において培養した血管内皮細胞
におけるＲＡＮＫＬ遺伝子の活性化の程度を示す指標の
測定値が、該化合物非存在下において培養した血管内皮
細胞における該測定値の２分の１以下である場合、該化
合物を陽性と判定する工程。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血管内皮細胞にお
けるＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（receptoractiva
tor of NF-κB ligand：以下、「ＲＡＮＫＬ」とい
う。）遺伝子の活性化の程度を指標とする骨吸収抑制物
質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法に使用
されるキット等に関する。

【０００２】

【従来の技術】骨微小環境における細胞間相互作用は、
骨リモデリングにおいて重要な役割を担っている。骨芽
細胞は細胞間相互作用により破骨細胞の増殖及び分化を
調節する可溶性因子の生産を通して骨リモデリングに関
与している（Manolagas SC, Jilka RL. (1995) N Engl
J Med 332,305-311）。現在までに、多くの可溶性の骨
作用因子が同定されているが、骨芽細胞と破骨細胞の相
互作用に関与する接着因子は明らかにされていない。最
近、破骨細胞分化因子（osteoclast differentiation f
actor：以下、「ＯＤＦ」という。）、別名ＲＡＮＫＬ
がクローニングされた（ Lacey DL, et al., (1998) Ce
ll 93,165-176.：Yasuda H, et al.,(1998) Proc Natl
Acad Sci USA 95,3597-3602.）。ＯＤＦ／ＲＡＮＫＬ
（以下、「ＲＡＮＫＬ」という。）は、マクロファージ
コロニー活性化因子（macrophage colony-stimulating
factor：以下、「Ｍ−ＣＳＦ」という。）存在下におい
て血液前駆体細胞が骨吸収作用を有する成熟多核性破骨
細胞へ完全に分化するために必須であり（ Arai F, et
al.,(1999) J Exp Med 190,1741-1754.：Filvaroff E,D
erynck R. (1998) Curr Biol 8, R679-R682.）、骨リモ
デリング又は過度な骨溶解の発生領域に存在する骨芽細
胞及び骨髄ストローマ細胞において高度に発現している
（Ikeda T, et al.,(2001) J Bone Miner Res 16,1416-
1425.）。ＲＡＮＫＬの発現は、副甲状腺ホルモン（par
athyroid hormone）、１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ３、インターロイキン−１１、プロスタグランジンＥ
₂のような骨作用性ホルモンやサイトカインにより、骨
芽細胞及び骨髄ストローマ細胞において促進される。Ｒ
ＡＮＫＬは、ＮＦ−κＢ活性化受容体（receptor activ
ator of NF-κB：以下、「ＲＡＮＫ」という。）とい
う、破骨細胞分化のある時期に破骨細胞上に出現する受
容体と相互作用し、細胞融合や骨吸収を促進する（Suda
T, et al.,(1999) Endocr Rev 20, 345-357.）。オス
テオプロテジェリン（osteoprotegerin：以下、「ＯＰ
Ｇ」という。）、別称破骨細胞形成抑制因子（osteocla
stogenesis inhibitory factor）は腫瘍壊死因子受容体
スーパーファミリーに属する可溶性因子で、多様な組織
で幅広く発現しており、ＲＡＮＫＬと結合してその作用
を中和する。すなわちＯＰＧは、in vivo及びin vitro
において、破骨細胞の分化、作用発現及び生存を抑制的
に調節する分泌性デコイ受容体として機能する（Simone
t WS, (1997) Cell 89,309-319.）。

【０００３】また、骨組織には相当量の血管が含まれ、
血管内皮細胞が骨溶解性疾患に影響を及ぼすことが組織
学的な観察より示唆されている（Collin-Osdoby P. (19
94)J Cell Biochem 55,304-309.）。例えば、骨転移巣
の大半は微小血管が豊富な成長軟骨層の近傍に見出され
る（Sasaki, et al., (1995) Cancer Res 55,3551-355
7.）。さらに、骨溶解性疾患はしばしば過剰な血管新生
を伴う（Dickson GR, et al.,(1990) Bone 11,205-21
0.：Dickson GR, et al.,(1987) Histochemistry87,569
-572.）。しかしながら、骨疾患に対する血管内皮細胞
の役割についてじゅうぶんな解明はなされていない。本
発明者らは、骨由来内皮細胞（bone-derived endotheli
al cells：以下、「ＢＤＥＣｓ」という。）の骨疾患に
おけ役割を研究するためＢＤＥＣｓ株を樹立し（Zhang
Y, et al.,(1998) Oncogene 16, 693-703.）、該株が、
インターロイキン−１１及びプロスタグランジンＥ₂を
生産することにより、骨代謝に重要な役割を果たすこと
を見出した（Zhang Y, et al.,(1998) Oncogene 16, 69
3-703.：Kage K, et al.,(1999) Biochem Biophys Res
Commun 254, 259-263.）。これらの知見は骨組織の内皮
細胞が破骨細胞形成に重要な役割を担っていることを示
すものである。

【０００４】骨マトリックスは成長因子の貯蔵庫として
働く。骨マトリックスに最も多量に保存する因子の一つ
であるトランスフォーミング成長因子β（transforming
growth factorβ：以下、「ＴＧＦβ」という。：Dela
ny AM, et al.,(eds) GrowthFactors and Cytokines in
Health and Disease, JAI Press, Greenwich, CT,vol
3 pp 127-155.）は、骨マトリックスが破壊される過程
で分泌され活性化されるので、分泌されたＴＧＦβは骨
微小環境内の細胞の活動に関与しているかもしれない。
ＴＧＦβは癌細胞によるＰＴＨ関連タンパク質の産生を
活性化することにより癌の増殖及び骨破壊を促進するこ
とが知られており（Thomas RJ, et al.,(1999) Endocri
nology 140, 4451-4458.）、分泌された活性型ＴＧＦβ
が内皮細胞の性質を変化させる可能性がある。しかしな
がら、骨組織中における内皮細胞の役割はじゅうぶんに
は解析されていない。

【０００５】

【発明の解決しようとする課題】本発明者らは、ＢＤＥ
Ｃｓ株及びヒト臍帯静脈内皮細胞（human umbilical ve
in endothelial cell：以下、「ＨＵＶＥＣ」とい
う。）に対するＴＧＦβの作用を鋭意検討した結果、Ｔ
ＧＦβがそれらの細胞内におけるＲＡＮＫＬの発現を促
進すること、ＲＡＮＫＬの発現促進にはサイクリックＡ
ＭＰレシポンスエレメント結合タンパク質（cyclic AMP
response element binding protein：以下、「ＣＲＥ
Ｂ」という。）の活性化が関与していること、ＣＲＥＢ
の活性化にはｐ３８マイトジェン−アクチベイティッド
・プロテイン・キナーゼ（p38 mitogen-activated prot
ein kinase：以下、「ｐ３８ＭＡＰＫ」という。）等が
関与していることを見出し、血管内皮細胞の有するｐ３
８ＭＡＰＫ、ＰＫＡ、ＣＲＥＢ等が新規な骨吸収性疾患
の治療剤又は予防剤スクリーニングの標的分子となり得
ることを見出し、本発明を完成した。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）下記
［１］乃至［３］の工程を含むことからなる骨吸収抑制
物質のスクリーニング方法：［１］被検化合物存在下又は非存在下において血管内皮
細胞を培養する工程；［２］被検化合物存在下において培養した血管内皮細胞
又は該化合物非存在下において培養した血管内皮細胞に
おける、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（receptor a
ctivator of NF-κB ligand：以下、「ＲＡＮＫＬ」と
いう。）遺伝子の活性化の程度を示す指標を測定する工
程；［３］被検化合物存在下において培養した血管内皮細胞
におけるＲＡＮＫＬ遺伝子の活性化の程度を示す指標の
測定値が、該化合物非存在下において培養した血管内皮
細胞における該測定値の２分の１以下である場合、該化
合物を陽性と判定する工程、（２）下記［１］乃至
［３］の工程を含むことからなる骨吸収抑制物質のスク
リーニング方法：［１］被検化合物存在下又は非存在下において血管内皮
細胞を培養し、次いで該細胞にトランスフォーミング成
長因子β（transforming growth factorβ）を作用させ
る工程；［２］被検化合物存在下において培養した血管内皮細胞
又は該化合物非存在下において培養した血管内皮細胞に
おける、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（receptor a
ctivator of NF-κB ligand：以下、「ＲＡＮＫＬ」と
いう。）遺伝子の活性化の程度を示す指標を測定する工
程；［３］被検化合物存在下において培養した血管内皮細胞
におけるＲＡＮＫＬ遺伝子の活性化の程度を示す指標の
測定値が、該化合物非存在下において培養した血管内皮
細胞における該測定値の２分の１以下である場合、該化
合物を陽性と判定する工程、（３）血管内皮細胞が、ヒ
ト又はヒト以外の哺乳動物由来の血管内皮細胞若しくは
該細胞の不死化により確立された細胞株である、（１）
又は（２）に記載のスクリーニング方法、（４）遺伝子
の活性化の程度を示す指標が、下記［ｉ］乃至［ｘｉ］
からなる群より選択されるいずれか一つである、（１）
乃至（３）のいずれか一つに記載のスクリーニング方
法；［ｉ］ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（receptor act
ivator of NF-κB ligand：以下、「ＲＡＮＫＬ」とい
う。）遺伝子より転写されたメッセンジャーＲＮＡ又は
該メッセンジャーＲＮＡより翻訳されたＲＡＮＫＬタン
パク質の量；［ｉｉ］ＲＡＮＫＬ遺伝子プロモータの有する転写活性
の程度を示す指標；［ｉｉｉ］サイクリックＡＭＰレスポンスエレメント結
合タンパク質（cyclic AMP response element binding
protein：以下、「ＣＲＥＢ」という。）の活性化の程
度を示す指標；［ｉｖ］ＣＲＥＢ遺伝子より転写されたメッセンジャー
ＲＮＡ又は該メッセンジャーＲＮＡより翻訳されたＣＲ
ＥＢタンパク質の量；［ｖ］ＣＲＥＢ遺伝子プロモータの有する転写活性の程
度を示す指標；［ｖｉ］プロテインキナーゼＡ（protein kinase A：以
下、「ＰＫＡ」という。）の活性化の程度を示す指標；［ｖｉｉ］ＰＫＡ遺伝子より転写されたメッセンジャー
ＲＮＡ又は該メッセンジャーＲＮＡより翻訳されたＰＫ
Ａタンパク質の量；［ｖｉｉｉ］ＰＫＡ遺伝子プロモータの有する転写活性
の程度を示す指標；［ｉｘ］ｐ３８マイトジェン−アクチベイティッド・プ
ロテイン・キナーゼ（p38 mitogen-activated protein
kinase：以下、「ｐ３８ＭＡＰＫ」という。）の活性化
の程度を示す指標；［ｘ］ｐ３８ＭＡＰＫ遺伝子より転写されたメッセンジ
ャーＲＮＡ又は該メッセンジャーＲＮＡより翻訳された
ｐ３８ＭＡＰＫタンパク質の量；［ｘｉ］ｐ３８ＭＡＰＫ遺伝子プロモータの有する転写
活性の程度を示す指標、（５）血管内皮細胞、及び、Ｎ
Ｆ−κＢ活性化受容体リガンド（receptor activatorof
NF-κB ligand：以下、「ＲＡＮＫＬ」という。）遺伝
子の活性化の程度を示す指標の測定に使用される試薬を
含むことからなる、（１）乃至（４）のいずれか一つに
記載のスクリーニング方法に使用されるキット、及び、
（６）トランスフォーミング成長因子β（transforming
growth factorβ）を含む、（５）に記載のキット、に
関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明において、ＲＡＮＫＬ遺伝
子の活性化の程度を示す指標とは、ＲＡＮＫＬ遺伝子よ
り転写されたメッセンジャーＲＮＡの量、該ＲＮＡより
翻訳されたＲＡＮＫＬタンパク質の量、ＲＡＮＫＬ遺伝
子プロモータの有する転写活性の程度を示す指標、ＲＡ
ＮＫＬ遺伝子プロモータと結合する転写活性因子の活性
化の程度を示す指標、該転写因子遺伝子より転写された
メッセンジャーＲＮＡの量、該ＲＮＡより翻訳されたタ
ンパク質の量、該遺伝子プロモータの有する転写活性の
程度を示す指標、該転写調節因子を活性化する酵素タン
パク質の量、該酵素遺伝子より転写されたメッセンジャ
ーＲＮＡの量、該酵素遺伝子プロモータの有する転写活
性の程度を示す指標、該酵素活性の程度を示す指標、該
酵素の活性化の程度を示す指標、血管内皮細胞内におい
て生産されたＲＡＮＫＬの介在するシグナル伝達経路の
下流に存在する生化学的又は細胞生物学的な現象の程度
を示す指標等をいうが、これらに限定されるものではな
い。

【０００８】ＲＡＮＫＬ遺伝子プロモータと結合する転
写活性因子としては、ＣＲＥＢ等を例示することができ
る。転写調節因子がリン酸化により活性化される場合、
転写調節因子の活性化の程度とは該因子のリン酸化の程
度、該因子による標的遺伝子転写調節活性化の程度、該
因子の標的遺伝子転写調節領域への結合活性の程度等で
ある。ＣＲＥＢが結合する転写調節領域として、サイク
リックＡＭＰ応答エレメント（cyclic AMP response el
ement）、該エレメントを含むヌクレオチド等を例示す
ることができる。また、転写調節因子を活性化する酵素
としては、ＰＫＡ、ｐ３８ＭＡＰＫ等を例示することが
できる。該酵素がタンパク質リン酸化酵素である場合、
該酵素活性とは基質タンパク質をリン酸化する活性であ
る。該酵素がリン酸化により活性化される場合、該酵素
の活性化の程度とは該酵素タンパク質のリン酸化の程
度、該酵素による基質タンパク質リン酸化活性の程度等
である。ＰＫＡ又はｐ３８ＭＡＰＫの基質タンパク質と
して、ＣＲＥＢ等を例示することができる。さらに、血
管内皮細胞内において生産されたＲＡＮＫＬの介在する
シグナル伝達経路の下流に存在する生化学的又は細胞生
物学的な現象としては、ＲＡＮＫＬの受容体であるＯＰ
Ｇ又はＲＡＮＫを介した諸現象を例示することができ
る。

【０００９】本発明において、血管内皮細胞とは、ヒト
又はヒト以外の哺乳動物若しくは他の脊椎動物の血管内
皮に由来する細胞であれば特に限定されるものではな
く、正常な血管組織から分離された培養細胞（primary
culture）、該培養細胞の不死化により確立（establis
h）された細胞株、血管内皮細胞様の性質又は形質を有
するがん細胞等のいずれであってもよく、培養細胞とし
てＨＵＶＥＣ等を、細胞株としてマウス骨髄由来内皮細
胞株ＢＭ−３株（Zhang Y, et al.,(1998) Oncogene 1
6, 693-703.）等をそれぞれ例示することができる。

【００１０】本発明の提供するスクリーニング方法にお
ける、ＲＡＮＫＬ遺伝子の活性化の程度を示す指標の測
定には、メッセンジャーＲＮＡの量の測定、タンパク質
の量の測定、遺伝子プロモータの転写活性の測定、タン
パク質の活性の測定、タンパク質のリン酸化の程度の測
定等を適用することができる。

【００１１】メッセンジャーＲＮＡの量は、細胞より酸
−グアニジン−フェノール−クロロホルム法（Comczyns
ki p., et al., Anal.Biochem., 162, p156-159(198
7)）等の公知の方法により全ＲＮＡ又はメッセンジャー
ＲＮＡを得た後、逆転写ポリメラーゼ鎖伸長反応（reve
rse transcription - polymerase chain reaction：以
下、「ＲＴ−ＰＣＲ」という。）法、ノーザンブロット
法、ドットブロット法等の公知の方法により測定するこ
とができる。ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーは、ヒト
ＲＡＮＫＬ（GenBank Accession Number AF019047）、
マウスＲＡＮＫＬ（GenBank Accession Number AF01904
8）、マウスＥＰ４（GenBank Accession Number NM0089
65）、ヒトｐ３８ＭＡＰＫ（GenBank Accession Number
L35253）、ヒトＰＫＡ、、ヒトＣＲＥＢ（GenBank Acc
ession Number NM004379）等のヌクレオチド配列に基づ
いて設計され得るがそれらに限定されるものではない。

【００１２】タンパク質の量は、細胞よりタンパク質画
分を得、ドデシル硫酸ナトリウム存在下又は非存在下に
おける電気泳動に供した後、クマシー・ブリリアント・
ブリー染色、銀染色、該タンパク質に結合する抗体を用
いた免疫染色等により測定することができる。また、電
気泳動に供するタンパク質画分は、予め所望のタンパク
質と結合する抗体で免疫沈降しておくことが好ましい。

【００１３】遺伝子プロモータの転写活性は、当該プロ
モータ配列の下流にルシフェラーゼ、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ等の公知のリポーター
遺伝子を連結した組換えベクターを作成し、血管内皮細
胞を該ベクターで形質転換することにより得られる細胞
にリポーター遺伝子の翻訳産物の基質を作用させること
により、分光光学的又は放射化学的手法を用いて測定す
ることができる。遺伝子プロモータ領域は、ヒトＲＡＮ
ＫＬ（GenBank Accession Number AF019047）、マウス
ＲＡＮＫＬ（GenBank Accession Number AF019048）、
マウスＥＰ４（GenBank Accession Number NM00896
5）、ヒトｐ３８ＭＡＰＫ（GenBank Accession Number
L35253）、ヒトＰＫＡ、、ヒトＣＲＥＢ（GenBank Acce
ssion NumberNM004379）等のヌクレオチド配列等に基づ
いてヒト又はヒト以外の哺乳動物のゲノムＤＮＡライブ
ラリーより公知の方法によりクローニングすることがで
きる。

【００１４】タンパク質のリン酸化の程度は、細胞より
タンパク質画分を得、ドデシル硫酸ナトリウム存在下又
は非存在下における電気泳動に供した後、リン酸化され
た該タンパク質に選択的に結合する抗体を用いて免疫染
色することにより測定する。また、電気泳動に供するタ
ンパク質画分は、予め所望のタンパク質と結合する抗体
で免疫沈降しておくことが好ましい。

【００１５】本発明の提供するスクリーニングにおい
て、タンパク質の免疫染色又は免疫沈降に使用する抗体
は、抗血清、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗
体のいずれであってもよく、それらは公知の方法を用い
て取得することができる。例えば、ヒトＲＡＮＫＬ（Ge
nBank Accession Number AF019047）、マウスＲＡＮＫ
Ｌ（GenBank Accession Number AF019048）、マウスＥ
Ｐ４（GenBank AccessionNumber NM008965）、ヒトｐ３
８ＭＡＰＫ（GenBank Accession Number L35253）、ヒ
トＰＫＡ、、ヒトＣＲＥＢ（GenBank Accession Number
NM004379）等のタンパク質を、細胞を用いて発現さ
せ、必要に応じて精製単離し、得られたタンパク質で別
種の哺乳動物を免疫し、採血した後血清を回収し、必要
に応じ、該抗体を精製し、モノクローナル抗体産生細胞
（ハイブリドーマ）を取得し、該細胞の生産するモノク
ローナル抗体を取得することが可能である。また、リン
酸化されたタンパク質で哺乳動物を免疫することによ
り、同様に、抗（リン酸化）ｐ３８ＭＡＰＫ抗体、抗
（リン酸化）ＰＫＡ抗体、抗（リン酸化）ＣＲＥＢ抗体
等を取得することができる。そのような抗体として、抗
マウスＲＡＮＫＬ抗体（ＩＭＧＥＮＥＸ社製）、抗ヒト
ＲＡＮＫＬ抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ社製）、抗ｐ３
８ＭＡＰＫ抗体、抗（リン酸化）ｐ３８ＭＡＰＫ抗体
（以上、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ社製）、抗ＣＲＥＢ抗体、抗（リン酸化）ＣＲＥ
Ｂ抗体（以上、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ社製）等の市販の抗体を例示することがで
きる。

【００１６】本発明のスクリーニング方法においては、
ＲＡＮＫＬ遺伝子の活性化の程度を示す指標は、血管内
皮細胞においてＲＡＮＫＬ遺伝子を活性化する因子によ
り、血管内皮細胞を刺激した後に測定することが好まし
い。そのような因子としてＴＧＦβ等を例示することが
できる。

【００１７】本発明のスクリーニング方法においては、
血管内皮細胞に対する被検化合物の接触は、該細胞の培
養からＲＡＮＫＬ遺伝子の活性化の程度を示す指標の測
定に至る過程のいずれの時期であってもよく、好適には
該指標の測定の前である。血管内皮細胞をＴＧＦβで刺
激する場合、被検化合物の接触はＴＧＦβ刺激と同時又
はその前に行うことが好ましい。

【００１８】本発明のスクリーニング方法において陽性
と判定される被検化合物は、該化合物存在下において培
養した血管内皮細胞におけるＲＡＮＫＬ遺伝子の活性化
の程度を示す指標の測定値（以下、「被検群の値」とい
う。）が、該化合物非存在下において培養した血管内皮
細胞における該測定値（以下、「対照群」という。）よ
り小さく、好適には被検群の値が対照群の値の２分の１
以下であり、より好適には被検群の値が対照群の値の５
分の１以下であり、最適には被検群の値が対照群の値の
１０分の１以下である。

【００１９】本発明の提供するスクリーニング方法にお
いて陽性と判定される物質（以下、「骨吸収抑制物質」
という）も本発明に包含される。本発明の骨吸収抑制物
質には、ＲＡＮＫＬ遺伝子発現抑制剤、ＰＫＡ阻害剤、
ＰＫＡ遺伝子発現抑制剤、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ｐ３
８ＭＡＰＫ遺伝子発現抑制剤、ＰＫＡリン酸化阻害剤、
ｐ３８ＭＡＰＫリン酸化阻害剤、ＣＲＥＢ阻害剤、ＣＲ
ＥＢ遺伝子発現抑制剤、ＣＲＥＢリン酸化阻害剤等とし
て公知のものが全て含まれる。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤と
しては、ＳＢ２０３５８０、ＰＤ１６９３１６、ＳＢ２
０２１９０、ＳＢ２２００２５（以上、Calbiochem社
製）、抗ｐ３８ＭＡＰＫ活性中和抗体、抗（リン酸化）
ｐ３８ＭＡＰＫ活性中和抗体、ｐ３８ＭＡＰＫのドミナ
ント・ネガティブ変異体等を例示することができる。Ｐ
ＫＡ阻害剤としては、ＫＴ５７２０、Ｋ−２５２ａ、Ｋ
−２５２ｂ、Ｋ−２５２ｃ（以上、Calbiochem社製）、
抗ＰＫＡ活性中和抗体、抗（リン酸化）ＰＫＡ活性中和
抗体、ＰＫＡのドミナント・ネガティブ変異体等を例示
することができる。ＣＲＥＢ阻害剤としては、抗ＣＲＥ
Ｂ活性中和抗体、抗（リン酸化）ＣＲＥＢ活性中和抗
体、ＣＲＥＢのドミナント・ネガティブ変異体等を例示
することができる。

【００２０】本発明の骨吸収抑制物質は、ヒト又はヒト
以外の哺乳動物若しくは他の脊椎動物における各種骨吸
収性疾患の予防又は治療等の医薬用途に好適に使用する
ことができる。該物質の適応は、骨吸収が関与する疾患
であれば特に限定されるものではないが、例えば、一次
性骨粗鬆症（老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症及び特発
性若年性骨粗鬆症）、内分泌骨粗鬆症（甲状腺機能亢進
症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群及び末端肥
大症）、性機能低下に伴う骨粗鬆症（下垂体機能低下
症、Ｋｌｉｎｅｆｅｌｔｅｒ症候群及びＴｕｒｎｅｒ症
候群）、遺伝性及び先天性形態の骨粗鬆症（骨形成不
全、ホモシスチン尿症、メンケス症及びライリー−デイ
症候群）、重力負荷軽減又は四肢の固定や不動化による
骨減少症、パジェット病、骨髄炎、骨喪失による感染性
病巣、固形腫瘍（乳癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌等）に
起因する高カルシウム血症、血液学的悪性疾患（多発性
骨髄腫、リンパ腫及び白血病）、特発性高カルシウム血
症、甲状腺機能亢進症又は腎臓機能不全に伴う高カルシ
ウム血症、ステロイド投与に起因する骨減少症、他の薬
物（メトトレキセート及びシクロスポリンＡ等の免疫抑
制剤、ヘパリン及び抗てんかん薬）投与に起因する骨減
少症、腎臓機能不全に伴う骨減少症、外科手術、消化器
疾患（小腸障害、大腸障害、慢性肝炎、胃切除、原発性
胆汁性肝硬変及び肝硬変）に伴う骨減少症、慢性関節リ
ウマチ等の各種リウマチによる骨減少症、慢性関節リウ
マチ等の各種リウマチによる骨破壊及び関節破壊、ムチ
ランス型リウマチ、変形性関節症、歯周骨喪失、癌の骨
転移（骨溶解性転移）、外傷性負傷、ゴシェ病、鎌状赤
血球貧血、全身性紅性狼創若しくは非外傷性負傷に伴う
骨壊死又は骨細胞死、腎性骨異栄養症等の骨異栄養症、
低アルカリフォスファターゼ血症、糖尿病に伴う骨減少
症、栄養障害又は摂食障害に伴う骨減少症、その他の骨
減少症等を挙げることができる。

【００２１】また、本発明の骨吸収抑制物質の投与形態
は特に限定されるものではなく、製剤、年齢、性別、疾
患の種類、疾患の進行の程度等に応じて適宜選択され得
る。例えば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、
液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等は経口投与
され得る。注射剤は単独で若しくはグルコース、アミノ
酸等の補液との混合液として、又はポリオキシエチレン
ソルビタン脂肪酸エステル類等と混和したエマルジョン
として、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与
及び／又は腹腔内投与され得る。坐剤は直腸内投与され
得る。

【００２２】これらの各種製剤は、主薬に加え、賦形
剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、矯味矯臭剤、コ
ーティング剤等、当該分野で公知の補助剤を用いて製造
することができる。

【００２３】錠剤の成形に際しては、担体として当該分
野で公知のもの、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウ
ム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリ
ン、結晶セルロース、珪酸等の賦形剤、水、エタノー
ル、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉
液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラ
ック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニル
ピロリドン等の結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウ
ム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸
カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エス
テル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグ
リセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、
カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第四級アン
モニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進
剤、グリセリン、澱粉等の保湿剤、澱粉、乳糖、カオリ
ン、ベントナイト、コロイド状珪酸等の吸着剤、精製タ
ルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコー
ル等の滑沢剤等を使用することができる。錠剤の場合、
必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣
錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング
錠、二重錠、多重錠等とすることができる。

【００２４】丸剤の成形に際しては、担体として当該分
野で公知のもの、例えば、グルコース、乳糖、澱粉、カ
カオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、ア
ラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等
の結合剤、ラミナラン、寒天等の崩壊剤を使用すること
ができる。

【００２５】坐剤の成形に際しては、担体として当該分
野で公知のもの、例えば、ポリエチレングリコール、カ
カオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル
類、ゼラチン、半合成グリセライド等を使用することが
できる。

【００２６】注射剤が液剤、乳剤又は懸濁剤である場
合、滅菌され且つ血液と等張であることが好ましく、こ
れら液剤、乳剤及び懸濁剤の成形に際しては、希釈剤と
して当該分野で公知のもの、例えば、水、エチルアルコ
ール、プロピレングリコール、エポキシ化イソステアリ
ルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコー
ル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等
を使用することができる。注射剤を血液と等張にするた
めに充分な量の食塩、グルコース、グリセリン等を含有
せしめてもよく、通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤
糖を含有せしめてもよい。

【００２７】これらの各種製剤には、必要に応じ、着色
剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、他の薬剤等を含有
せしめてもよい。

【００２８】これらの各種製剤中に含まれる、本発明の
骨吸収抑制物質の量は、剤形、投与方法等に依存する
が、通常１乃至７０重量％であり、好ましくは１乃至３
０重量％である。

【００２９】、本発明の骨吸収抑制物質の投与量は、該
物質の構造や物理化学的諸性質、疾患の種類、疾患の進
行度、年齢、体重、投与方法、剤形等に依存するが特に
限定されるものではない。

【００３０】本発明の骨吸収抑制物質を含有する医薬の
投与回数は、剤形、疾患の種類、疾患の程度、体重等に
依存するが、特に限定されるものではない。

【００３１】また、本発明の骨吸収抑制物質が、抗ｐ３
８ＭＡＰＫ抗体、抗ＰＫＡ抗体、抗ＣＲＥＢ抗体等のタ
ンパク質又はそれらをコードしたヌクレオチドである場
合、医薬としてヒト又はヒト以外の哺乳動物へ投与され
得るのに加え、それらを標的の罹患組織又は罹患細胞へ
局所的に導入する方法によりヒト又はヒト以外の哺乳動
物へ適用することができる。そのような抗体を動物に投
与する場合にはその動物体内において免疫源性又は抗原
性を発現しないように当該抗体を予め加工することが好
ましい。ヒトへ投与する場合には予め該抗体をヒト化す
ることが好ましい。

【００３２】さらに、本発明のスクリーニング方法に使
用されるキットも、本発明に包含される。そのようなキ
ットは、血管内皮細胞、ＲＡＮＫＬ遺伝子の活性化の程
度を示す指標の測定に使用される試薬等を含み、好適に
はＴＧＦβも含む。以下に実施例を挙げて本発明をより
詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されない。

【００３３】

【実施例】実施例１．細胞株の培養ゼラチンでコートしたシャーレにマウス骨髄由来内皮細
胞株ＢＭ−３株（Zhang Y, et al.,(1998) Oncogene 1
6, 693-703.）を接種し、２ｍＭ濃度のＬ−グルタミン
酸（Ｇｉｂｃｏ社製）、１００μｇ／ｍｌ濃度のカナマ
イシン（明治製菓（株）製）及び１０％の加熱失活させ
たウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を添加したダルベッ
コ改変イーグル培地（：以下、「ＤＭＥＭ培地」とい
う。：ニッスイ製薬（株）製）を分注し、５％二酸化炭
素−９５％空気で通気しながら３７℃にて保温した。

【００３４】同様に、マウス骨髄ストローマ細胞株ＳＴ
２（理化学研究所）を接種し、２ｍＭ濃度のＬ−グルタ
ミン酸（Ｇｉｂｃｏ社製）、１００μｇ／ｍｌ濃度のカ
ナマイシン（明治製菓（株）製）及び１０％の加熱失活
させたウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を添加したＲＭ
ＰＩ１６４０培地（ニッスイ製薬（株）製）を、分注
し、５％二酸化炭素−９５％空気で通気しながら３７℃
にて保温した。

【００３５】同様に、ゼラチンでコートしたシャーレに
ＨＵＶＥＣ（三光純薬（株）製）を接種し、２ｍＭ濃度
のＬ−グルタミン酸（Ｇｉｂｃｏ社製）、１００μｇ／
ｍｌ濃度のカナマイシン（明治製菓（株）製）及び１０
％の加熱失活させたウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を
添加したＲＭＰＩ１６４０培地（ニッスイ製薬（株）
製）を、分注し、５％二酸化炭素−９５％空気で通気し
ながら３７℃にて保温した。実施例２．骨関連因子の発現解析１）ＲＴ−ＰＣＲによる解析方法実施例１にて得られた細胞に０、０．１、１又は１０ｎ
ｇ／ｍｌ濃度のＴＧＦβを３７℃にて３時間作用させた
後、酸−グアニジン−フェノール−クロロホルム法（Co
mczynski P., et al., Anal.Biochem., 162, p156-159
(1987)）により全ＲＮＡ１μｇ及びモロニーマウス白血
病ウイルスの逆転写酵素（Applied Biosystems）５０Ｕ
ｎｉｔ（単位）を用いてｃＤＮＡ第一鎖を調製した。得
られたｃＤＮＡ第一鎖を鋳型に、表１に配列を記載した
組み合わせのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、
ポリメラーゼ鎖伸長反応（：以下、「ＰＣＲ」とい
う。）を行い、所望の転写産物を増幅した。

【００３６】表１に記載のオリゴヌクレオチドの配列
は、ヒトＲＡＮＫＬ（GenBank Accession Number AF019
047）、マウスＲＡＮＫＬ（GenBank Accession Number
AF019048）、ヒトＯＰＧ（GenBank Accession Number U
94332）、ヒトβアクチン（GenBank Accession Number
NM001101）、マウスＧ３ＤＰＨ（GenBank Accession Nu
mber M32599）又はマウスＥＰ４（GenBank Accession N
umber NM008965）のヌクレオチド配列に基づいて設計さ
れた。

【００３７】

【表１】（Ｉ）センスプライマー配列 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 配列表の配列番号分子センスプライマーのヌクレオチド配列 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 配列番号１ヒトRANKL 5'-TGGATCACAGCACATCAGAGCAG-3' 配列番号２マウスRANKL 5'-CAGATTTGCAGGACTCGAC-3' 配列番号３ヒトOPG 5'-GGGGACCACAATGAACAAGTTG-3' 配列番号４ヒトβ-actin 5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3' 配列番号５マウスG3PDH 5'-TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3' 配列番号６マウスEP4 5'-CCGCAGAGCAATGTAGACCAG-3' ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― （ＩＩ）アンチセンスプライマー配列 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 配列表の配列番号分子アンチセンスプライマーのヌクレオチド ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 配列番号７ヒトRANKL 5'-TGGGGCTCAATCTATATCTCGAAC-3' 配列番号８マウスRANKL 5'-AGCAGGGAAGGGTTGGACA-3' 配列番号９ヒトOPG 5'-AGCTTGCACCACTCCAAATCC-3' 配列番号１０ヒトβ-actin 5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3' 配列番号１１マウスG3PDH 5'-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3' 配列番号１２マウスEP4 5'-AGCCATCAGTCTCTTCCCACG-3' ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― ＢＭ−３細胞及びＨＵＶＥＣにおけるＲＡＮＫＬの発現
を、本実施例１）に記載の方法により測定した。その結
果を図１及び２に示す。

【００３８】図１及び２に示す通り、ＴＧＦβは、これ
らの血管内皮細胞におけるＲＡＮＫＬの転写を濃度依存
性又は経時的に促進した。２）ＲＡＮＫＬタンパク質のウェスタンブロットによる
解析実施例１にて得られた細胞に０、０．１、１又は１０ｎ
ｇ／ｍｌ濃度のＴＧＦβを３７℃にて３時間作用させた
後、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０及びドデシル硫酸ナトリ
ウムを含有する緩衝液を添加し、該細胞を溶解（lysi
s）させた。得られた細胞溶解物（lysate）２５μｇを
４乃至１０％の濃度勾配を作製したアクリルアミドゲル
上のウェルへ供与し、電気泳動を行った。電気泳動後、
ゲル中のＤＮＡをニトロセルロース膜へ転写させ、該ニ
トロセルロース膜をブロッキング操作に供してから、抗
体と反応させた。使用した抗体は、抗マウスＲＡＮＫＬ
抗体（ＩＭＧＥＮＥＸ社製）、又は、抗ヒトＲＡＮＫＬ
抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ社製）である。

【００３９】反応後、ペルオキシダーゼ（peroxidase）
でコンジュゲート（conjugate）した二次抗体をニトロ
セルロース膜に反応させ、次いで蛍光混合液（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社製）で処理した。

【００４０】結果を図３及び４に示す。

【００４１】図３及び４に示す通り、ＴＧＦβは、血管
内皮細胞におけるＲＡＮＫＬタンパク質の生産を濃度依
存性に促進した。実施例３．ＰＧＥ₂濃度の測定実施例１記載の方法に準じ、ゼラチンでコートした６穴
シャーレを用いてＢＭ−３細胞株をコンフルエントにな
るまで培養した後、細胞をフォスフェート・バッファー
・セイライン（phosphate buffer saline：以下、「Ｐ
ＢＳ」という。）で洗浄してから、血清を含有しないＤ
ＭＥＭ培地を添加し３７℃で２４時間保温し、次いでＴ
ＧＦβを添加した。３７℃にて３時間保温した後、上清
を回収して０．２２μｍのフィルターを用いてろ過し、
得られたろ液を−８０℃で保存した。

【００４２】Ｃａｙｍａｎ社のキット（Prostagrandin
E₂ EIA Kit-Monoclonal）に含まれる実験仕様書に基づ
き、酵素免疫アッセイ法により各ろ液のＰＧＥ₂濃度を
測定した。

【００４３】その結果、１０ｎＭ以下の濃度のＰＧＥ₂
は、ＲＡＮＫＬの発現を促進しなかった。実施例４．プロモータ活性の測定実施例１記載の方法に準じ、ゼラチンでコートした６穴
シャーレを用いてＢＭ−３細胞株をコンフルエント時細
胞数の５０乃至８０％になるまで培養した。同様に、実
施例１記載の方法に準じ、ゼラチンでコートした６穴シ
ャーレを用いてＳＴ２細胞株を培養した。

【００４４】Ｐｒｏｍｅｇａ社のキット（Luciferase A
ssay System）に含まれる実験仕様書に基づき、マウス
ＲＡＮＫＬ遺伝子の転写開始点よりそこから５’−側に
数えて１００６番目のヌクレオチド（−１００５から＋
１まで：Kitazawa R, et al.,(1999) Biochim Biophys
Acta 1445,134-141.）を含む、ルシフェラーゼ（licufe
rase）リポーターベクターｐＧＬ３−１００５１μｇ
を、Ｆｕｇｅｎｅ６（Roche Molecular Biochemicals社
製）３μｇを用いて該細胞へ導入した。３７℃で４時間
保温した後、血清を含有しない培地に交換して３７℃に
て１２時間保温した。次いで、０、０．１、１又は１０
ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＧＦβを培地に添加して３７℃で３
時間保温した。保温後細胞を溶解（lysis）することに
より得られた溶解液（lysate）につき、ＭｉｃｒｏＬｕ
ｍａｔＬＢ９６Ｐｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Bertho
ld社製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。ＢＣ
Ａｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ
社製）を用いて各溶解液のタンパク質濃度を測定し、ル
シフェラーゼ活性の測定値を校正した。

【００４５】その結果を図５に示す。

【００４６】図５に示す通り、ＴＧＦβは、ＢＭ−３細
胞においてＲＡＮＫＬ遺伝子プロモータを濃度依存性に
活性化した。実施例５．ＴＧＦβの作用に対する各種化合物の影響実施例１で得られたＢＭ−３細胞を、血清を含まないＤ
ＭＥＭ培地で３７℃にて２４時間培養した後、１０又は
３０μＭ濃度のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０
（Calbiochem社製：Matsumoto, M., et al., J. Biol.
Chem., 275, p31155-31161(2000)）、１０μＭ濃度のプ
ロテインキナーゼＡ阻害剤ＫＴ５７２０（Calbiochem社
製：Tintut,Y., et al., Circulation, 102, p2636-264
2(2000)）、又は、５０μＭ濃度のＭＡＰキナーゼ阻害
剤ＰＤ９８０５９（New EnglandBiolabs社製：Son, M.
S. et al., Cancer Res., 61, p8322-8330(2001)）で１
時間処理した後、２．５ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＧＦβ添加
又は無添加の、血清を含まないＤＭＥＭ培地で３７℃に
て３時間保温した。次いで細胞を回収し、実施例２に記
載の方法に準じてＲＴ−ＰＣＲ法によりＲＡＮＫＬの転
写を測定した。その結果を図６に示す。

【００４７】図６に示す通り、ＳＢ２０５８８０及びＫ
Ｔ５７２０はＴＧＦβによるＲＡＮＫＬの転写促進を阻
害したが、ＰＤ９８０５９は該転写促進を阻害しなかっ
た。実施例６．転写調節タンパク質を用いたＲＡＮＫＬ発現
調節機構の解析１）組換えベクターの構築野生型ヒトＣＲＥＢｃＤＮＡ（以下、「ＷＴ−ＣＲＥ
Ｂ」という。）又はそのドミナント・ネガティブ変異体
（以下、「ＤＮ−ＣＲＥＢ１３３」という。）をｐＣＭ
Ｖベクターへ導入することにより得られる組換えベクタ
ーはＣＬＯＮＴＨＥＣＨ社より購入した。ＤＮ−ＣＲＥ
Ｂ１３３は、ＷＴ−ＣＲＥＢの１３３番目のアミノ酸を
セリンからアラニンへ置換するべくヌクレオチド配列を
変換した変異体である。２）トランスフェクションＦｕｇｅｎｅ６（Roche Molecular Biochemicals社製）
を用いて、１．５×１０⁵／ｍｌ濃度になるよう調製し
た、実施例１で得られた細胞に、本実施例１）で得られ
た組換えベクターＤＮＡ１μｇをトランスフェクショ
ンした。対照として、挿入断片を含まないベクターｐｃ
ＤＮＡ３を、同様にトランスフェクションした。顕微鏡
を用いて観察したところ、トランスフェクション効率は
５０％以上であった。３）ＷＴ−ＣＥＲＢ及びＤＮ−ＣＲＥＢの効果（その
１）２）で得られた、ＷＴ−ＣＲＥＢ又はＤＮ−ＣＲＥＢを
過剰発現するＢＭ−３細胞を、血清を含まないＤＭＥＭ
培地で３７℃にて２４時間培養した後、細胞を回収し、
実施例２の１）に記載の方法に準じてＲＴ−ＰＣＲ法に
よりＲＡＮＫＬの転写を測定した。その結果を図７に示
す。

【００４８】図７に示す通り、ＷＴ−ＣＲＥＢの過剰発
現はＲＡＮＫＬの転写を促進したが、ＤＮ−ＣＲＥＢの
過剰発現は該転写を促進せずむしろ転写を抑制した。４）ＷＴ−ＣＥＲＢ及びＤＮ−ＣＲＥＢの効果（その
２）２）で得られた、ＷＴ−ＣＲＥＢ又はＤＮ−ＣＲＥＢを
過剰発現するＢＭ−３細胞を、血清を含まないＤＭＥＭ
培地で３７℃にて２４時間培養した後、細胞を回収し、
実施例２の２）に記載の方法に準じて、該細胞の溶解液
のウェスタンブロット解析を行った。使用した抗体は、
抗ＣＲＥＢ抗体、又は、抗（リン酸化）ＣＲＥＢ抗体
（以上、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ社製）である。その結果を図８に示す。

【００４９】図８に示す通り、ＷＴ−ＣＲＥＢの過剰発
現はリン酸化ＣＲＥＢタンパク質を増加させたが、ＤＮ
−ＣＲＥＢの過剰発現は該タンパク質を増加させなかっ
た。実施例７．ＴＧＦβの作用機序におけるｐ３８ＭＡＰＫ
の役割の解析１）キナーゼリン酸化に対するＴＧＦβの効果実施例２の２）に記載の方法に準じ、ＢＭ−３細胞に
０、１又は１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＧＦβを作用させ、
次いでウェスタンブロット解析を行った。使用した抗体
は、抗ｐ３８ＭＡＰＫ抗体、抗（リン酸化）ｐ３８ＭＡ
ＰＫ抗体（以上、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ社製）、又は、抗（活性型）ＭＡＰＫ／
ＥＲＫ抗体（ｐＴＥｐＹ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）であ
る。その結果を図９に示す。

【００５０】図９に示す通り、ＴＧＦβはｐ３８ＭＡＰ
Ｋのリン酸化を濃度依存性に促進したが、ＭＡＰＫ／Ｅ
ＲＫの活性化は促進しなかった。２）ＲＡＮＫＬ発現に対するｐ３８ＭＡＰＫ過剰発現の
効果Ｃ７細胞より実施例２に記載の方法に準じてｍＲＮＡを
調製し、次いでそれを鋳型とし、且つ、配列表の配列番
号１又は２で示されるオリゴヌクレオチドをプライマー
としてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られたＲＴ−ＰＣＲ産
物をｐＣＲＩＩ（Invitrogen社製）に挿入することによ
り、ヒトｐ３８ＭＡＰＫをクローン化した。得られた組
換えベクターの挿入配列上に存在する配列表の配列番号
３で示されるヌクレオチド配列を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎ
ｇｅｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓｋｉｔ（STRATAGENE社製）を用いて配列表の配
列番号４で示されるヌクレオチド配列へ変換した。次い
で、反応物に制限酵素ＥｃｏＲＩを添加し、得られたＥ
ｃｏＲ１−ＥｃｏＲ１断片を、ＦＬＡＧエピトープを含
むベクターｐｃ５ＦＬＡＧのＥｃｏＲＩ部位へ挿入し
た。 5'-AGATGTCGCAGGAGAGGCCCACG-3'（配列表の配列番号１
３） 5'-CTCAGGACTCCATTTCTTCTTGGTCAAGGGGTGG-3'（配列表の
配列番号１４） 5'-GAATTC-3'（配列表の配列番号１５） 5'-GAGTTC-3'（配列表の配列番号１６）得られた組換えベクターＤＮＡを用いて、実施例６の
２）に記載の方法に準じてトランスフェクションを行
い、本実施例の１）に記載の方法に準じてＲＡＮＫＬの
転写を測定した。

【００５１】その結果を図１０に示す。

【００５２】図１０に示す通り、ｐ３８ＭＡＰＫの過剰
発現はＲＡＮＫＬの発現を促進した。３）ＣＲＥＢリン酸化に対するｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の
効果実施例５に記載の方法に準じ、ＴＧＦβ存在下又は非存
在下、且つ、３０μＭ濃度のＳＢ２０３５８０（New En
gland Biolbas社製）又は５０μＭ濃度のＰＤ９８０５
９（Calbiochem社製）の存在下又は非存在下における、
ＣＲＥＢリン酸化の程度を測定した。ウェスタンブロッ
トに使用した抗体は、抗ＣＲＥＢ抗体、又は、抗（リン
酸化）ＣＲＥＢ抗体（以上、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉ
ｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）である。その結果を
図１１に示す。

【００５３】図１１に示す通り、ＳＢ２０３５８０はＴ
ＧＦβによるＣＲＥＢリン酸化の促進を抑制したが、Ｐ
Ｄ９８０５９は該リン酸化の促進を抑制しなかった。実施例８．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（その
１）［１］実施例１に記載の方法に準じ、血管内皮細胞であ
るＢＭ−３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合
物存在下又は非存在下において３７℃にて１時間保温す
る。次いで１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを
添加して３７℃にて３時間処理する。［２］［１］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、ｐ３８ＭＡＰＫ活性を測定す
る。［３］［２］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例９．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（その
２）［１］実施例１に記載の方法に準じ、血管内皮細胞であ
るＢＭ−３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合
物存在下又は非存在下において３７℃にて１時間保温す
る。次いで１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを
添加して３７℃にて３時間処理する。［２］［１］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の１）に記載の方法
に準じ、全ＲＮＡを調製してＲＴ−ＰＣＲを行うことに
よりｐ３８ＭＡＰＫ遺伝子の転写産物の量を測定する。［３］［２］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例１０．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の３）［１］実施例１に記載の方法に準じ、血管内皮細胞であ
るＢＭ−３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合
物存在下又は非存在下において３７℃にて１時間保温す
る。次いで１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを
添加して３７℃にて３時間処理する。［２］［１］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の２）に記載の方法
に準じ、抗ｐ３８ＭＡＰＫ抗体を用いたウェスタンブロ
ットを行うことによりｐ３８ＭＡＰＫタンパク質の量を
測定する。［３］［２］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例１１．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の４）［１］実施例４に記載の方法に準じ、ｐ３８ＭＡＰＫ遺
伝子上流に存在するプロモータ配列とルシフェラーゼ遺
伝子配列を連結することにより得られるリポーターアッ
セイ用組換えベクターを構築する。［２］実施例１に記載の方法に準じ、予め［１］で得ら
れた組換えベクターをトランスフェクションしたＢＭ−
３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合物存在下
又は非存在下において３７℃にて１時間保温する。次い
で１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを添加して
３７℃にて３時間処理する。［３］［２］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の２）に記載の方法
に準じ、実施例４に記載の方法に準じて該プロモータの
有する転写活性を測定する。［４］［３］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例１２．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の５）［１］実施例１に記載の方法に準じ、血管内皮細胞であ
るＢＭ−３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合
物存在下又は非存在下において３７℃にて１時間保温す
る。次いで１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを
添加し３７℃にて３時間処理する。［２］［１］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の２）に記載の方法
に準じ、抗（リン酸化）ｐ３８ＭＡＰＫ抗体を用いたウ
ェスタンブロットを行うことによりリン酸化ｐ３８ＭＡ
ＰＫタンパク質の量を測定する。［３］［２］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値より２倍以上大き
い場合、該化合物を陽性と判定する。実施例１３．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の６）［１］実施例１に記載の方法に準じ、血管内皮細胞であ
るＢＭ−３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合
物存在下又は非存在下において３７℃にて１時間保温す
る。次いで１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを
添加して３７℃にて３時間処理する。［２］［１］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、ＰＫＡ活性を測定する。［３］［２］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値が２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例１４．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の７）［１］実施例１に記載の方法に準じ、血管内皮細胞であ
るＢＭ−３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合
物存在下又は非存在下において３７℃にて１時間保温し
た。次いで１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを
添加して３７℃にて３時間処理する。［２］［１］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の１）に記載の方法
に準じ、全ＲＮＡを調製してＲＴ−ＰＣＲを行うことに
よりＰＫＡ遺伝子の転写産物の量を測定する。［３］［２］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例１５．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の８）［１］実施例１に記載の方法に準じ、血管内皮細胞であ
るＢＭ−３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合
物存在下又は非存在下において３７℃にて１時間保温す
る。次いで１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを
添加して３７℃にて３時間処理する。［２］［１］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の２）に記載の方法
に準じ、抗ＰＫＡ抗体を用いたウェスタンブロットを行
うことによりＰＫＡタンパク質の量を測定する。［３］［２］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例１６．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の９）［１］実施例４に記載の方法に準じ、ＰＫＡ遺伝子上流
に存在するプロモータ配列とルシフェラーゼ遺伝子配列
を連結することにより得られるリポーターアッセイ用組
換えベクターを構築する。［２］実施例１に記載の方法に準じ、予め［１］で得ら
れた組換えベクターをトランスフェクションしたＢＭ−
３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合物存在下
又は非存在下において３７℃にて１時間保温する。次い
で１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを添加して
３７℃にて３時間処理する。［３］［２］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の２）に記載の方法
に準じ、実施例４に記載の方法に準じて該プロモータの
有する転写活性を測定する。［４］［３］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例１７．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の１０）［１］実施例１に記載の方法に準じ、血管内皮細胞であ
るＢＭ−３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合
物存在下又は非存在下において３７℃にて１時間保温す
る。次いで１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを
添加して３７℃にて３時間処理する。［２］［１］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の２）に記載の方法
に準じ、抗（リン酸化）ＰＫＡ抗体を用いたウェスタン
ブロットを行うことによりリン酸化ＰＫＡタンパク質の
量を測定する。［３］［２］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例１８．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の１１）［１］実施例１に記載の方法に準じ、血管内皮細胞であ
るＢＭ−３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合
物存在下又は非存在下において３７℃にて１時間保温す
る。次いで１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを
添加して３７℃にて３時間処理する。［２］［１］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の１）に記載の方法
に準じ、全ＲＮＡを調製してＲＴ−ＰＣＲを行うことに
よりＲＡＮＫＬ遺伝子の転写産物の量を測定する。［３］［２］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例１９．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の１２）［１］実施例１に記載の方法に準じ、血管内皮細胞であ
るＢＭ−３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合
物存在下又は非存在下において３７℃にて１時間保温す
る。。次いで１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβ
を添加して３７℃にて３時間処理する。［２］［１］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の２）に記載の方法
に準じ、抗ＲＡＮＫＬ抗体を用いたウェスタンブロット
を行うことによりＲＡＮＫＬタンパク質の量を測定す
る。［３］［２］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例２０．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の１３）［１］実施例４に記載の方法に準じ、ＲＡＮＫＬ遺伝子
のプロモータ配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子配列を
連結することにより得られるリポーターアッセイ用組換
えベクターを構築する。［２］実施例１に記載の方法に準じ、予め［１］で得ら
れた組換えベクターをトランスフェクションしたＢＭ−
３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合物存在下
又は非存在下において３７℃にて１時間保温する。次い
で１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを添加して
３７℃にて３時間処理する。［３］［２］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の２）に記載の方法
に準じ、実施例４に記載の方法に準じて該プロモータの
有する転写活性を測定する。［４］［３］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例２１．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の１４）［１］実施例１に記載の方法に準じ、血管内皮細胞であ
るＢＭ−３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合
物存在下又は非存在下において３７℃にて１時間保温す
る。次いで１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを
添加して３７℃にて３時間処理する。［２］［１］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、ＣＲＥＢ活性を測定する。［３］［２］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例２２．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の１５）［１］実施例１に記載の方法に準じ、血管内皮細胞であ
るＢＭ−３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合
物存在下又は非存在下において３７℃にて１時間保温す
る。次いで１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを
添加して３７℃にて３時間処理する。［２］［１］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の１）に記載の方法
に準じ、全ＲＮＡを調製してＲＴ−ＰＣＲを行うことに
よりＣＲＥＢ遺伝子の転写産物の量を測定する。［３］［２］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例２３．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の１６）［１］実施例１に記載の方法に準じ、血管内皮細胞であ
るＢＭ−３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合
物存在下又は非存在下において３７℃にて１時間保温す
る。次いで１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを
添加して３７℃にて３時間処理する。［２］［１］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の２）に記載の方法
に準じ、抗ＣＲＥＢ抗体を用いたウェスタンブロットを
行うことによりＣＲＥＢタンパク質の量を測定する。［３］［２］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例２４．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の１７）［１］実施例４に記載の方法に準じ、ＣＲＥＢ遺伝子上
流に存在するプロモータ配列とルシフェラーゼ遺伝子配
列を連結することにより得られるリポーターアッセイ用
組換えベクターを構築する。［２］実施例１に記載の方法に準じ、予め［１］で得ら
れた組換えベクターをトランスフェクションしたＢＭ−
３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合物存在下
又は非存在下において３７℃にて１時間保温する。次い
で１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを添加して
３７℃にて３時間処理する。［３］［２］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の２）に記載の方法
に準じ、実施例４に記載の方法に準じて該プロモータの
有する転写活性を測定する。［４］［３］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値の２分の１以下で
ある場合、該化合物を陽性と判定する。実施例２５．骨吸収抑制物質のスクリーニング方法（そ
の１８）［１］実施例１に記載の方法に準じ、血管内皮細胞であ
るＢＭ−３株又はＨＵＶＥＣを培養し、次いで被検化合
物存在下又は非存在下において３７℃にて１時間保温す
る。次いで１０ｎｇ／ｍｌ濃度となるようにＴＧＦβを
添加し３７℃にて３時間処理する。［２］［１］で得られた細胞を超音波破砕することによ
り溶解液（lysate）を得、実施例２の２）に記載の方法
に準じ、抗（リン酸化）ＣＲＥＢ抗体を用いたウェスタ
ンブロットを行うことによりリン酸化ＣＲＥＢタンパク
質の量を測定する。［３］［２］における該化合物存在下における測定値
が、該化合物非存在下における測定値より２倍以上大き
い場合、該化合物を陽性と判定する。

【００５４】

【発明の効果】本発明は血管内皮細胞におけるｐ３８Ｍ
ＡＰＫ、ＰＫＡ又はＣＲＥＢの活性、ＲＡＮＫＬの発現
量等を測定する工程を含む、新規な骨吸収抑剤のスクリ
ーニング方法等を提供する。本発明の提供するスクリー
ニング方法は骨吸収抑制物質のスクリーニング等に有用
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＢＭ−３細胞をＴＧＦβで処理した際の、ＲＡ
ＮＫＬ遺伝子の濃度依存性の転写誘導を示す。対照のＧ
３ＰＤＨは転写誘導を受けなかった。

【図２】ＨＵＶＥＣを１ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＧＦβで処
理した際の、ＲＡＮＫＬ遺伝子の経時的な転写誘導を示
す。対照のβ-actinは転写誘導を受けなかった。

【図３】ＢＭ−３細胞をＴＧＦβで処理した際の、ＲＡ
ＮＫＬタンパク質の濃度依存性の発現誘導を示す。

【図４】ＨＵＶＥＣをＴＧＦβで処理した際の、ＲＡＮ
ＫＬタンパク質の濃度依存性の発現誘導を示す。

【図５】ＢＭ−３細胞をＴＧＦβで処理した際の、ＲＡ
ＮＫＬ遺伝子プロモータ活性の濃度依存性の活性化を示
す。当該活性はルシフェラーゼ遺伝子を用いリポーター
遺伝子アッセイ法により測定された。

【図６】ＢＭ−３細胞をＴＧＦβで処理した際の、ＲＡ
ＮＫＬ遺伝子の濃度依存性の転写誘導に対する、ｐ３８
ＭＡＰＫ阻害剤のＳＢ２０３５８０、ＰＫＡ阻害剤のＫ
Ｔ５７２０又はＭＡＰＫ阻害剤であるＰＤ９８０５９添
加の影響を示す。対照のＧ３ＰＤＨの転写はＴＧＦβ及
び各種阻害剤の影響を受けなかった。

【図７】ＢＭ−３細胞へＣＲＥＢ遺伝子又はそのドミナ
ント・ネガティブ変異体遺伝子を導入した際のＲＡＮＫ
Ｌ遺伝子の転写を示す。対照としてｐＣＭＶベクター
（ｍｏｃｋ）をトランスフェクションした。

【図８】ＢＭ−３細胞へＣＲＥＢ遺伝子又はそのドミナ
ント・ネガティブ変異体遺伝子を導入した際のＣＲＥＢ
タンパク質のリン酸化を示す。対照としてｐＣＭＶベク
ター（ｍｏｃｋ）をトランスフェクションした。

【図９】ＢＭ−３細胞をＴＧＦβで処理した際の、リン
酸化ｐ３８ＭＡＰＫの濃度依存性の増加を示す。対照の
ｐ３８ＭＡＰＫ及び活性型ＭＡＰＫは濃度依存性に増加
しなかった。

【図１０】ＢＭ−３細胞へｐ３８ＭＡＰＫ遺伝子を導入
した際のＲＡＮＫＬ遺伝子の転写誘導を示す。対照とし
てｐｃ５ＦＬＡＧベクター（ｍｏｃｋ）をトランスフェ
クションした。

【図１１】ＢＭ−３細胞をＴＧＦβで処理した際のＣＲ
ＥＢのリン酸化に対するｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤のＳＢ２
０３５８０又はＭＡＰＫ阻害剤であるＰＤ９８０５９添
加の影響を示す。対照群にはジメチルスルフォキシド
（ＤＭＳＯ）を添加した。

【配列表フリーテキスト】

配列番号１：ヒトＲＡＮＫＬ増幅用センス・プライマー配列番号２：マウスＲＡＮＫＬ増幅用センス・プライマ
ー配列番号３：ヒトＯＰＧ増幅用センス・プライマー配列番号４：ヒトβアクチン増幅用センス・プライマー配列番号５：マウスＧ３ＰＤＨ増幅用センス・プライマ
ー配列番号６：マウスＥＰ４増幅用センス・プライマー配列番号７：ヒトＲＡＮＫＬ増幅用アンチセンス・プラ
イマー配列番号８：マウスＲＡＮＫＬ増幅用アンチセンス・プ
ライマー配列番号９：ヒトＯＰＧ増幅用アンチセンス・プライマ
ー配列番号１０：ヒトβアクチン増幅用アンチセンス・プ
ライマー配列番号１１：マウスＧ３ＰＤＨアンチセンス・プライ
マー配列番号１２：マウスＥＰ４アンチセンス・プライマー配列番号１３：ヒトｐ３８ＭＡＰＫ増幅用プライマー
（１）配列番号１４：ヒトｐ３８ＭＡＰＫ増幅用プライマー
（２）配列番号１５：制限酵素ＥｃｏＲ１で認識される配列配列番号１６：制限酵素ＥｃｏＲ１では認識されない変
異配列

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SANKYO CO., LTD <110> TSURUO,TAKASHI <120> METHODS FOR IDENTIFING SUBSTANCES WHICH SUPPRESS THE EXPRESSION OF RANKL IN VASCULAR ENDOTHELIAL CELLS. <130> 2001220KW <140> <141> <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A sense primer for amplifing a DNA encoding human RANKL. <400> 1 TGGATCACAG CACATCAGAG CAG 23 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A sense primer for amplifying a DNA encoding mouse RANKL. <400> 2 CAGATTTGCA GGACTCGAC 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A sense primer for amplifying a DNA encoding human OPG. <400> 3 GGGGACCACA ATGAACAAGT TG 22 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A sense primer for amplifying a DNA encoding human beta actin. <400> 4 TGACGGGGTC ACCCACACTG TGCCCATCTA 30 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A sense primer for amplifying a DNA encoding mouse G3PDH. <400> 5 TGAAGGTCGG TGTGAACGGA TTTGGC 26 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A sense primer for amplifying a DNA encoding mouse EP4. <400> 6 CCGCAGAGCA ATGTAGACCA G 21 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:An antisense primer for amplify ing a DNA encoding human RANKL. <400> 7 TGGGGCTCAA TCTATATCTC GAAC 24 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:An antisense primer for amplify ing a DNA encoding mouse RANKL. <400> 8 AGCAGGGAAG GGTTGGACA 19 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:An antisense primer for amplify ing a DNA encoding human OPG. <400> 9 AGCTTGCACC ACTCCAAATC C 21 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:An antisense primer for amplify ing a DNA encoding human beta actin. <400> 10 CTAGAAGCAT TTGCGGTGGA CGATGGAGGG 30 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:An antisense primer for amplify ing a DNA encoding mouse G3PDH. <400> 11 CATGTAGGCC ATGAGGTCCA CCAC 24 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:An antisense primer for amplify ing a DNA encoding mouse EP4. <400> 12 AGCCATCAGT CTCTTCCCAC G 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A primer for amplifying a DNA e ncoding human p38MAPK (1). <400> 13 AGATGTCGCA GGAGAGGCCC ACG 23 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A primer for amplifying a DNA e ncoding human p38MAPK (2). <400> 14 CTCAGGACTC CATTTCTTCT TGGTCAAGGG GTGG 34 <210> 15 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A sequence recognized by a rest riction enzyme EcoR1. <400> 15 GAATTC 6 <210> 16 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A mutated sequence which cannot be recognized by a restriction enzyme EcoR1. <400> 16 GAGTTC 6

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/53 Ａ６１Ｋ 45/00 // Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 19/08 Ａ６１Ｐ 19/08 19/10 19/10 Ｃ１２Ｒ 1:91 (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:91） (72)発明者鶴尾隆東京都世田谷区宮坂３−36−６Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB03 4B024 AA11 CA12 FA02 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ36 QQ53 QR16 QR36 QR62 QR77 QS34 4C084 AA17 MA35 MA52 MA55 MA66 NA14 ZA961 ZA971 ZC781

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記［１］乃至［３］の工程を含むことか
らなる骨吸収抑制物質のスクリーニング方法：［１］被検化合物存在下又は非存在下において血管内皮
細胞を培養する工程；［２］被検化合物存在下において培養した血管内皮細胞
又は該化合物非存在下において培養した血管内皮細胞に
おける、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（receptor a
ctivator of NF-κB ligand：以下、「ＲＡＮＫＬ」と
いう。）遺伝子の活性化の程度を示す指標を測定する工
程；［３］被検化合物存在下において培養した血管内皮細胞
におけるＲＡＮＫＬ遺伝子の活性化の程度を示す指標の
測定値が、該化合物非存在下において培養した血管内皮
細胞における該測定値の２分の１以下である場合、該化
合物を陽性と判定する工程。
【請求項２】下記［１］乃至［３］の工程を含むことか
らなる骨吸収抑制物質のスクリーニング方法：［１］被検化合物存在下又は非存在下において血管内皮
細胞を培養し、次いで該細胞にトランスフォーミング成
長因子β（transforming growth factorβ）を作用させ
る工程；［２］被検化合物存在下において培養した血管内皮細胞
又は該化合物非存在下において培養した血管内皮細胞に
おける、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（receptor a
ctivator of NF-κB ligand：以下、「ＲＡＮＫＬ」と
いう。）遺伝子の活性化の程度を示す指標を測定する工
程；［３］被検化合物存在下において培養した血管内皮細胞
におけるＲＡＮＫＬ遺伝子の活性化の程度を示す指標の
測定値が、該化合物非存在下において培養した血管内皮
細胞における該測定値の２分の１以下である場合、該化
合物を陽性と判定する工程。
【請求項３】血管内皮細胞が、ヒト又はヒト以外の哺乳
動物由来の血管内皮細胞若しくは該細胞の不死化により
確立された細胞株である、請求項１又は２に記載のスク
リーニング方法。
【請求項４】遺伝子の活性化の程度を示す指標が、下記
［ｉ］乃至［ｘｉ］からなる群より選択されるいずれか
一つである、請求項１乃至３のいずれか一つに記載のス
クリーニング方法；［ｉ］ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（receptor act
ivator of NF-κB ligand：以下、「ＲＡＮＫＬ」とい
う。）遺伝子より転写されたメッセンジャーＲＮＡ又は
該メッセンジャーＲＮＡより翻訳されたＲＡＮＫＬタン
パク質の量；［ｉｉ］ＲＡＮＫＬ遺伝子プロモータの有する転写活性
の程度を示す指標；［ｉｉｉ］サイクリックＡＭＰレスポンスエレメント結
合タンパク質（cyclic AMP response element binding
protein：以下、「ＣＲＥＢ」という。）の活性化の程
度を示す指標；［ｉｖ］ＣＲＥＢ遺伝子より転写されたメッセンジャー
ＲＮＡ又は該メッセンジャーＲＮＡより翻訳されたＣＲ
ＥＢタンパク質の量；［ｖ］ＣＲＥＢ遺伝子プロモータの有する転写活性の程
度を示す指標；［ｖｉ］プロテインキナーゼＡ（protein kinase A：以
下、「ＰＫＡ」という。）の活性化の程度を示す指標；［ｖｉｉ］ＰＫＡ遺伝子より転写されたメッセンジャー
ＲＮＡ又は該メッセンジャーＲＮＡより翻訳されたＰＫ
Ａタンパク質の量；［ｖｉｉｉ］ＰＫＡ遺伝子プロモータの有する転写活性
の程度を示す指標；［ｉｘ］ｐ３８マイトジェン−アクチベイティッド・プ
ロテイン・キナーゼ（p38 mitogen-activated protein
kinase：以下、「ｐ３８ＭＡＰＫ」という。）の活性化
の程度を示す指標；［ｘ］ｐ３８ＭＡＰＫ遺伝子より転写されたメッセンジ
ャーＲＮＡ又は該メッセンジャーＲＮＡより翻訳された
ｐ３８ＭＡＰＫタンパク質の量；［ｘｉ］ｐ３８ＭＡＰＫ遺伝子プロモータの有する転写
活性の程度を示す指標。
【請求項５】血管内皮細胞、及び、ＮＦ−κＢ活性化受
容体リガンド（receptor activatorof NF-κB ligand：
以下、「ＲＡＮＫＬ」という。）遺伝子の活性化の程度
を示す指標の測定に使用される試薬を含むことからな
る、請求項１乃至４のいずれか一つに記載のスクリーニ
ング方法に使用されるキット。
【請求項６】トランスフォーミング成長因子β（transf
orming growth factorβ）を含む、請求項５に記載のキ
ット。