KR20060120048A - 세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이적 의약품의제조 방법 - Google Patents

세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이적 의약품의제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이적인 만성 염증 질환을 위한 의약품의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 질병, 세포 유형, 조직 및/또는 질병 단계 특이적 단백질 및 핵산을 그 변경된 발현 패턴에 맞게 식별하고 해당 핵산을 DNAzyme 또는 siRNA를 위한 공격 표적으로서 분석한다. 표적 서열에 결합하고 이를 분리하는 활성적 특이 DNAzyme 및 siRNA의 설계가 이루어지고, 이로써 만성 염증 질환 및 자가면역 질환에 대항하는 의약품이 제공된다.
리보핵산 분자, 전사인자, ＤＮＡｚｙｍｅ, ｓｉＲＮＡ, 표적 세포

Description

세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이적 의약품의 제조 방법{METHOD FOR THE PRODUCTION OF A CELL AND/OR TISSUE AND/OR DISEASE PHASE SPECIFIC MEDICAMENT}
본 발명은 세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이적인, 만성 염증 질환의 치료에 적합한 의약품의 제조 방법에 관한 것이다.
만성 염증은 심각한 사회 경제적 피해를 수반하는, 점차 증가하는 의학적 문제로 대두되고 있다. 여기에는 다음과 같은 질병군이 포함된다:
- 자가면역 질환 및 류마티스성 질환(피부, 폐, 신장, 혈관계, 신경계, 결합조직, 근골격계, 내분비계에서의 증상)
- 알러지성 즉시형 반응 및 천식
- 만성 폐쇄폐병(COPD)
- 동맥경화증
- 건선 및 접촉 습진
- 장기 및 골수 이식 후 만성적 거부 반응.
이런 질병들의 대부분은 산업국가에서 뿐만 아니라 세계 다른 국가에서도 최근 10년간 증가하는 발병률을 나타내고 있다. 유럽, 북미, 일본 및 호주에서는 현 재 인구의 20% 이상이 알러지성 질환 및 천식으로 고통받는 실정이다. 만성 폐쇄폐병은 현재 전 세계적으로 5번째 사망 원인이며, WHO의 통계에 따르면 2020년도에는 3번째 사망 원인이 될 것으로 전망된다. 심근경색증, 뇌졸중 및 폐색성 동맥질환과 같은 후유증을 동반하는 동맥경화증은 전 세계적으로 이환율 및 사망률 통계에서 높은 위치를 차지한다. 건선 및 접촉 습진은 신경피부염과 함께 가장 빈번한 만성 피부 염증 질환이다.
현재 유전적 소질과 환경 요인 사이에서의 불충분한 상호 작용으로 인해 면역계의 후속적 조절 장애가 발생한다. 이런 다양한 질환에 대해 아래와 같은 공통적 원칙이 확인되었다:
(A) 일반적으로 사람에게 무해한 항원에 대한 과도한 면역반응이 나타난다. 이런 항원은 환경의 구성 요인일 수 있다(예: 화분, 동물의 털, 음식, 진드기와 같은 알러지 항원, 보존제, 착색제, 세척제와 같은 화학적 물질). 이런 경우 환자에서 알러지 반응이 발생한다. 예를 들어 직접 및 간접 흡연의 경우에는 만성 폐쇄폐병(COPD)이 나타난다. 다른 한편으로 면역계는 자기 기관의 구성 성분에 대해서 반응하고, 외부 물질로 인식하며 이에 대항하여 염증 반응을 일으킬 수도 있다. 이런 경우에는 자가면역 질환이 발생한다. 어떤 경우에 있어서도 무해한, 비독성 항원이 왜곡되게도 외부 물질 또는 위험한 물질로 인식되고 과도한 염증 반응이 발생한다.
(B) 질병의 진행 단계는 초기, 염증 반응이 진행하는 진행기, 및 이로 인한 기관 기능의 상실을 수반하는 파괴 및 변형기(소위 재형성기)로 구분할 수 있다.
(C) 질병은 환자 특이적 표현형 발현 특성을 나타낸다.
(D) 초기, 유지기 및 파괴 및 재형성기에는 선천적 및 후천적으로 획득한 면역성 성분이 관여한다. 선천적 면역성(중요한 성분: 다양한 모집단을 갖는 항원전달 세포 및 보체 시스템)의 영향 하에서 적응 면역 시스템(중요한 성분: T 림프구 및 B 림프구)의 세포의 활성화 및 분화가 나타난다. T 세포는 매우 특화된 효과기를 분화시킴으로써 이후 경과에 있어 중심적인 기능을 수행한다. 이때 이 세포는 특정한 효과기 메카니즘을 활성화 및 증폭시키는데, 이런 메카니즘에는 아래의 기능이 포함된다: 항체의 생성, 면역시스템에서 효과기 세포(예: 향신경성, 호염기성, 호산성 과립구)의 기능성 점검, 후천성 면역 시스템의 기능에 대한 피드백, 예컨대 상피, 내피, 결합조직, 골 및 연골, 및 특히 신경세포와 같은 비조혈 세포의 기능성에 관여. 이때 면역 시스템과 신경 시스템 사이에서 특이한 상호작용이 발생하는데, 이런 상호작용에서 만성 염증 시 신경 면역학적 상호 작용의 컨셉이 개발된다.
만성 염증에 수반되는 질병의 종류의 다양성 및 질병의 복합성으로 인해, 이런 질병의 치료를 위한 의약품에는 다음과 같은 요건이 부과된다:
(1) 질병은 환자 특이적 표현형으로 분화된다. 따라서 의약품은 매우 특화된 환자 특이성 및 증례 특이성을 가져야 한다.
(2) 질병은 질환 단계 및 시기로 구분되어 진행한다. 따라서 의약품은 질환 단계 및 시기에 대한 특이성을 가져야 한다.
(3) 질병은 서로 다른 특화된 세포에 의해 조절된다. 따라서 의약품은 세포 특이적 개입 효과를 가져야 한다.
(4) 질병은 다양한 기관 및 부위에서 증상을 나타낸다. 따라서 의약품은 신체 부위 또는 기관 특이성을 가져야 한다.
(5) 의약품은 장기 치료에 적합해야 한다. 이로써 의약품에 대한 면역 시스템의 반응이 억제되어야 한다.
(6) 의약품의 부작용이 질병의 정도, 예후 및 질병의 진행에 대해 의학적 및 윤리적 측면에서 수용 가능한 정도의 비중을 차지해야 한다.
현재 제공되는 기존의 치료는 만성 염증 질환에 대해 이런 기준을 충분히 충족시키지 못한다. 독일 특허 DE 695 11 245 T2에는 면역 글로불린 A를 통한 치료가 공개되고 독일특허 DE 695 18 667 T2에는 포스포리파제 A2(PLA2) 및/또는 보조효소 A에 간섭받지 않는 트란스아실레이스(CoA-IT)가 공개되어 있다. 현재 확립된 주요 치료 컨셉에서는 이런 질병을 위해 비특이적 항염증 치료 및 면역억제 치료가 제공된다. 이부프로펜, 아세틸살리실산 및 파라 세타몰과 같은, 사용된 비특이적 항염증 물질의 대부분은 충분한 효능이 없거나 또는 높은 부작용 발생율을 갖는다. 이와 달리 스테로이드 제제는 더 강한 효능을 갖지만 과다근육긴장증, 당뇨병 및 골다공증과 같은 심각한 부작용을 수반한다. 사이클로스포린 및 타크로리무스와 같은 차세대 면역억제성 의약품은 간독성 및 콩팥독성을 나타낸다.
이러한 상황으로 인해, 면역학적 및 세포 생물학적 조절 장애에 특이적으로 투입될 수 있는, 다양한 새로운 분자에 대한 연구 및 임상 시험이 이루어졌다. 이런 분자로는 사이토카인, 사이토카인 수용체 및 항사이토카인을 들 수 있다. 이러 한 새로운 치료 수단과 관련된 문제점으로는 세포 및 기관에 대한 특이성 결여, 이런 분자에 대한 원치 않는 면역반응의 발생 및 다양한 표현형에서의 부족한 효과가 있다.
근래에는 그 발현으로 인해 질병이 발생하는 유전자를 비활성화시키기 위하여, 새로운 촉매성 분자인 소위 "DNAzyme"(산토로(Santoro), 1997)을 치료목적에 투입하려는 시도가 있었다. DNAzyme은 한 가닥 분자로서, 원칙적으로 RNA의 상보적 부위에 결합할 수 있고, 분리를 통해 이 부위를 비활성화시킨다. 하지만 치료 물질로서의 DNAzyme의 특이적 투입을 전제조건으로, 질병을 발생시키는 유전자 및 그 mRNA가 정확하게 밝혀져야 한다. 하지만 현재까지는 유전자가 정확하게 밝혀진 질병은 소수에 불과하다.
WO 01/11023A1에 공개된 DNAzyme은 RelA(p65) mRNA와 결합하고 이로써, 전사인자 NF-kB를 억제한다. WO 00/42173에서는 EGR-1 mRNA에 결합하는 DNAzyme이 공개되어 있다. WO99/50452에는 10-23 DNAzyme이 공개되어 있는데, 이 효소는 핵산 돌연변이를 찾기 위한 진단 방법에 사용될 수 있다.
지금까지 알려진 어떠한 센스 분자나 DNAzyme도 환자에 있어서, 만성 염증 치료를 위한 의약품 제조에 사용될 수 없었다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이적 의약품을 제공하는 것으로서, 이런 의약품은 그 발현이 만성 염증 반응 및 자가면역 반응의 발생에 관여하는 그러한 전사인자 및 신호 전달 경로 인자의 리보핵산 분자를 기능적으로 비활성화시키며 만성 염증 반응 및 자가면역 질환의 치료에 적합하고, 종래 기술에서 나타나는 전술한 단점은 제거된다.
또한 본 발명의 목적은, 세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이적 의약품 제조 방법을 제공하는 것으로서, 이런 의약품은 그 발현이 만성 염증 반응 및 자가 면역 반응의 발생에 관여하는 그러한 전사인자 및 신호 전달 경로 인자의 리보핵산 분자를 식별하고 표적 세포에서 이런 인자를 비활성화시킨다.
본 발명의 목적은, 청구항 1에 따른 방법 및 청구항 10 내지 15에 따른 특이 DNAzyme의 사용 하에서 청구항 16 내지 청구항 18에 따른 의약품을 통해 달성된다.
본 발명의 이점은, 특이 DNAzyme 및/또는 siRNA를 이용하여, 만성 염증 반응 및 자가면역 반응에 관련된 사이토카인의 발현 및/또는 분화를 위한 신호 전달 경로의 인자 및 전사인자의 리보핵산 분자를 기능적으로 비활성화시키는데 있다. 이런 전략은, 유전자 치료를 포함하는 종래 방식의 치료 방법에 비해 월등히 우수한 세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이성 및 선별성, 분자의 안정성 및 무시할 정도로 약한 항원성을 특징으로 한다. 만성 염증 질환 환자에서 맞춤형 장기 치료를 위한 최적의 조건이 제공된다.
본 발명의 다른 세부 사항 및 이점들은 하기 도면 및 설명을 통해 기술된다. 도면은 다음과 같다.
도 1은 CD4+ 세포에서부터 TH1 또는 TH2 세포로의 분화 시의 신호 전달 경로를 개략적으로 도시한 도면이다(Ho I.C. 및 Glimcher L.H.에 따라 변형됨, Cell 2002; 109; P109-P120).
도 2는 10-23 DNAzyme의 촉매 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 왓슨-크릭 결합을 통한 표적 RNA에의 결합을 나타낸다(R=A 또는 G; Y=U 또는 C, N=A, G, U 또는 G). 화살표는 표적 mRNA에서의 분리위치를 표시한다.
도 3은 단계 b)에 따른 리보핵산 분자, 특히 GATA-3 및 그 뉴클레오티드 서열에 대한 DNAzyme hgd 1 내지 hgd 70에 대한 풀을 나타낸다(A=아데닌, G-=구아닌, C=시토신, T=티민). 대문자로 표기된 뉴클레오티드는 우측 및 좌측 기질 결합 영역, 소문자로 표기된 뉴클레오티드는 10-23 DNAzyme의 중앙 촉매성 영역을 나타낸다.
도 4-1 내지 4-3은 배열된 인간 GATA-3-유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열 1:데이터 뱅크 번호 XM_043124에서 발췌한 인간 GATA-3. 서열 2:데이터 뱅크 번호 X58072에서 발췌한 인간 GATA-3. 서열 3: 인간 GATA-3(플라즈미드 pCR2.1에서 염기서열분석). 분기되는 염기는 회색 배경으로 표시되고, GATA-3의 복제를 위한 시발체 위치는 밑줄로 표시된다. DNAzyme hgd40의 위치는 굵은 문자로 표시되고, 동시에 밑줄로 강조된다(A= 아데닌, G=구아닌, C=시토신, T=티민).
도 4A는 도 4-1 내지 4-3에 따른 인간 GATA-3 유전자의 뉴클레오티드 서열 3으로서 여기에서는 (회색 배경으로) 각각 뉴클레오티드 쌍 GT 또는 AT가 표시되며, 이들 사이에는 다른 DNAzyme 접촉면이 존재한다.
도 5는 겔 전기영동의 결과로서, 이 전기영동 그림은 단계 b)에 따른 특이 리보핵산 분자, 즉 여기에서는 변형되지 않은 DNAzyme[hgd11(트레이스 2), hgd13(트레이스 4), hgd17(트레이스 6), hgd40(트레이스 8)] 및 변형된 DNAzyme[hgd11-M(트레이스 3), hgd13-M(트레이스 5), hgd17-M(트레이스 7), hgd40(트레이스 9)]을 통한 표적 mRNA(여기에서는 GATA-3 mRNA)의 분리를 나타낸다. M은 변형된 DNAzyme을 나타낸다. 변형되지 않은 DNAzyme(0.25μM) 또는 변형된 DNAzyme(0.25㎛)이 37℃에서 시험관 내에서 전사된 GATA-3 mRNA(0.025μM)와 하기의 반응 조성을 갖는 10㎕의 체적에서 배양되었다: 50mM Tris pH 7.4, 150mM NaCl, 10mM MgCl2. 그 다음 산물이 전기영동법에 따라 분리되었다. 트레이스 1은 대조군으로서 DNAzyme이 첨가되지 않은 mRNA를 포함한다. 동봉된 사이즈 표준(size standard)(표시되지 않음)은 1000bp, 2000bp 및 3000bp의 밴드 치수를 나타낸다. 화살표는 S, 기질(여기에서는 GATA-3-mRNA)이 포함된 밴드 및 분리산물 P1 및 P2를 지시한다.
도 6은 세포에서 특이 리보핵산 분자의 반응을 포함하는 면역 블롯을 나타낸다. Jurkat E6.1 세포는 리포펙션(lipofection)을 통해 특이 리보핵산 분자, 여기에서는 DNAzyme[hgd11-M(트레이스 4), hgd13-M(트레이스 5), hgd17-M(트레이스 6), hgd40-M(트레이스 7)]와 함께 핵내주입되었다. 대조군으로서는 처리되지 않은 세포(트레이스 1), 단지 핵내주입 매질만(트레이스 2), 또는 핵내주입 매 질(transfection medium)이 포함되지 않은 DNAzyme(hgd11-M)으로 처리된 세포가 사용되었다. 48시간 배양 후에 용해화된 단백질을 SDS-PAGE를 이용해 분리하고 특이 항체를 통한 면역 블롯으로 GATA-3(A)를 검출했다(트레이스 3은 hgd11-M을 갖는 세포를 포함하고, 트레이스 5는 hgd13-M을 갖는 세포를 포함하며, 트레이스 6은 hgd17-M을 갖는 세포를 포함하고, 트레이스 7은 hgd40-M을 갖는 세포를 포함한다). 각 트레이스에 동일한 양의 단백질이 투입되었음을 입증하기 위해, 동일한 블롯막에서 베타 액틴(B)을 이용한 면역 착색이 이루어진다. 동봉된 사이즈 표준(도시되지 않음)은 63.8kDa, 49.5kDa 및 37.4kDa의 밴드 치수를 나타낸다.
도 7은 단계 b)에 따른 특이 리보핵산 분자, 특히 T-bet 및 그 뉴클레오티드 서열에 대한 DNAzyme td 1 내지 td70의 풀을 나타낸다(A=아데닌, G=구아닌, C=시토신, T=티민).
도 8-1 내지 8-2는 배열된 인간 T-bet-유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열 1: 데이터 뱅크 번호 NM_013351에서 발췌한 인간 T-bet. 서열 2: 인간 T-bet(pBluescript-SK에서 염기서열분석). 분기되는 염기는 회색 배경으로 표시되고, T-bet의 복제를 위한 시발체 위치는 밑줄로 표시된다. 라이트사이클러(LightCycler)에서의 상대적 양의 측정을 위한 위치는 네모칸으로 표시되었다. DNAzyme td54 및 td69의 위치는 회색 배경과 밑줄로 표시되었으며 td70은 여기에 추가적으로 굵은 문자로 강조되었다(A=아데닌, G=구아닌, C=시토신, T=티민).
도 8A는 도 8-1 내지 8-2에 따른 인간 T-bet-유전자의 뉴클레오티드 서열 1로서 여기에는 회색 배경으로 각 뉴클레오티드 쌍 GT 또는 AT가 표시되면, 이들 사 이에는 다른 DNAzyme 접촉면이 존재한다.
또 9는 겔 전기영동의 결과로서, 이 전기영동 그림은 단계 b)에 따른 특이 리보핵산 분자, 즉 여기에서는 변형된 DNAzyme[td54M(트레이스 3), td69M(트레이스 4), td70M(트레이스 5)]을 통한 표적-mRNA(여기에서는 T-bet mRNA)의 분리를 나타낸다. 변형된 DNAzyme(0.25μM)이 37℃에서 시험관 내에서 전사된 T-bet mRNA(0.025μM)와 하기의 반응 조성을 갖는 10㎕의 체적에서 배양되었다: 50mM Tris pH 7.4, 150mM NaCl, 10mM MgCl2. 그 다음 산물이 전기영동법에 따라 분리되었다. 트레이스 M은 동봉된 사이즈 표준(size standard) 3000염기 및 2000염기를 포함하며, 트레이스 2는 대조군으로서 DNAzyme이 첨가되지 않은 mRNA를 포함한다. 화살표 A는 기질(여기에서는 T-bet-mRNA)이 포함된 밴드, 화살표 B는 가장 큰 분리 산물을 나타낸다. 제2 분리산물은 더 작고, 이 그림에 더 이상 표시되지 않는다.
도 10은 DNAzyme td54(A), td69(B) 및 td70(C)로 처리된 세포에서 T-bet 및 GAPDH-mRNA의 양을 라이트사이클러로 나타낸 그래프이다. Jurkat E6.1 세포는 2회에 걸쳐 24시간의 간격으로 T-bet 특이 DNAzyme td54(A), td69(B) 및 td70(C) 또는 대조군(도시되지 않음)으로서의 논센스 DNAzyme을 통해 핵내주입되었다. 그 다음 RNA를 정제하고, 역전사를 실시한 후 얻은 DNA를 라이트사이클러에 투입했다. 내부 표준으로서 GAPDH(쇄선 곡선)이 사용된다. 그래프에는 T-bet 특이 DNAzyme 또는 논센스 DNAzyme으로 처리된 세포에서 각각 4회에 걸친 측정이 나타나 있다. 실선은 T-bet 특이 DNAzyme으로 처리된 세포가 있는 T-bet의 양을 나타내고, 점선은 논센 스 DNAzyme으로 처리된 세포가 있는 T-bet의 양을 나타낸다.
도 11은 Jurkat E6.1 세포에서의 T-bet mRNA의 상대적 양을 나타내는 그래프이다. Jurkat E6.1 세포는 T-bet 특이 DNAzyme td54, td69 및 td70을 통해 2회에 걸쳐 핵내주입되고 48시간 후에 RNA가 분리된다. 역전사 후에 라이트사이클러를 통해 mRNA의 양이 측정된다. 대조군으로서 논센스 DNAzyme이 사용된다. T-bet 및 GAPDH-mRNA의 상대적인 양의 측정은 지침[User Bulletin #2(ABI Prism 7700 Sequence detection System User Bulletin #2(2001) Relative quantification of gene expression, http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf에 설명됨]에 따라 실시된다. 이때 논센스 DNAzyme을 통한 대조 시험의 T-bet mRNA의 양은 100%로 설정된다.
상세한 설명
도 1은 Ho I.C. 및 Glimcher L.H.(Cell 2002; 109; P109-P120)에 따라 변형된 개략적 도시에서 CD4+ 세포에서부터 TH1 또는 TH2 세포로의 분화 시 신호 전달의 상호관계를 나타낸다. 상응하는 펩티드 MHC 복합체에 의한 T 세포 수용체를 통한 시뮬레이션은 CD4+ 림프구에서 T 보조세포 (TH)1 또는 TH2로의 순차적 분화 및 클론확장을 유도한다. 양측 아형의 구분은 그 사이토카인 프로파일을 근거로 이루어진다. TH1 세포는 인터페론-γ(INFγ), 인터루킨 2(IL-2) 및 종양괴사인자-β를 생산하고, 반면 TH2 세포는 IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13을 분비한다. 박테리아 및 바이러스 감염은 TH1 세포에 의해 주로 일어나는 면역반응을 유도한다. 다른 한편으로 TH2 세포는 기생충에 대항하여 IgE 생산을 조절한다. 이때 TH1 세포와 TH2 세포 사이에는 평형이 유지된다. 이런 평형의 파괴는 질병을 유발하며, 이로써 TH1의 과도한 면역반응은 자가면역 질환을 발생시키고, 반면 알러지성 질환은 강화된 TH2 세포반응에 기인한다.
TH1 사이토카인이 예를 들어 자가 면역성 포도막염, 실험적 알러지성 뇌척수염, 당뇨병 제1형 및 크론병과 같은 자가면역 질환의 발병기전에 관련이 있고, 반면 TH2 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-13 또는 IL-19)은 예를 들어 기도 호산구 증가증, 점액과다분비증, 기도 반응항진과 같은 만성적 기도 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이런 질환의 근본은 해당 사이토카인의 생산 중에 항원 특이 TH 세포에 의한 병리생리학적 변화이다. TH2 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-13 또는 IL-19가 체질적으로 과다 발현된, 유전자 삽입 쥐는 전형적인 알러지성 염증반응을 나타낸다. 폐와 기도에 있는 TH2 세포 부분모집단(subpopulation)은 동물 모형의 TH2 세포에서 기관지천식의 특징적 증상을 초래한다.
놀랍게도, 만성 염증 및/또는 자가 면역 질환에 대한 세포 및/또는 조직 특이적 치료에서 만성 염증 반응 및 자가면역 질환에 관련이 있는 사이토카인의 발현 및/또는 분화에 관련된 인자 및 전사인자, 예를 들어 TH1 세포 특이적 전사인자 T-bet 및 TH2 세포 특이적 전사인자 GATA-3이 이상적으로 적합하다는 것이 발견되었다.
TH1 세포 특이적 전사인자 T-bet는 특히 신생 CD+ T 세포에서 TH1 세포로의 분화에 관여한다. 그 발현은 T 세포 수용체(TZR)의 신호 전달 경로 및 INFγ 수용체/STAT1에 의해 조절된다. T-bet는 내재성 INFγ 유전자를 전이 활성화시키고 INFγ 생산을 유도한다. 또한 T-bet는 IL-12Rβ2 사슬의 단백질 발현의 조절을 유도하고 개별적 INFγ 대립 유전자의 염색질 재형성을 유발한다. T-bet의 생체 내 기능은 형질전환 쥐(Knock-Out mouse)를 통해 확인되었다(T-bet-/-). T-bet 결손 쥐가 정상적인 림프구 발달을 갖지만, 항 CD3/CD28 뿐 아니라 PMA/로노마이신(lonomycin)을 통한 시뮬레이션에서도 이런 쥐의 CD4+ 세포가 INFγ를 생산하지 않는다. T-bet 결손 쥐는 큰리슈만편모충(L. major) 감염에 면역 반응을 나타내지 않으며, TH2 사이토카인의 양이 증가한다.
염증성 피부 질환의 발생 시 점막 T 세포에 있는 T-bet의 기능은 잘 알려져 있다. 동물 모형에서의 시험에서는 재구축된 SCID(Severe Combined Immuno-deficincy, 중증 합병성 면역결핍증), 쥐에서 실시한 T-bet에서 CD4+ CD26L+ T 세포로의 레트로바이러스성 형질도입 후에 대장염이 악화되는 것으로 나타나고, 그 반대로 T-bet 결손 T 세포로부터의 형질도입 시 대장염 유도를 발생시키지 않는다.
전사인자 T-bet은 특이적으로 TH1 세포의 발달을 유도하며 이 세포에서의 INFγ 생산을 조절한다. T-bet의 억제를 통해 TH1 세포와 TH2 세포 사이에서의 평형이 TH2 세포 방향으로 이동한다.
TH2 세포 특이성 전사인자 GATA-3은 특히 신생 CD4+ T 세포에서 TH2 세포로 의 분화에 관여한다.
이때 TH2 세포분화는 주로 두 개의 신호 전달 경로를 통해 T 세포 수용체(TZR) 경로 및 IL-4 수용체 경로를 조절한다. TZR에서부터 전달된 신호는 TH2 특이성 전사인자 c-Maf 및 GATA-3 뿐 아니라 전사인자 NFAT 및 AP-1도 활성화시킨다. IL-4 수용체의 활성화는 IL-4 수용체의 세포질 영역으로의 STAT6의 결합을 유발시키는데, 이 세포질 영역에서 이 수용체는 Jak1 활성효소 및 Jak3 활성효소에 의해 인산화된다. 인산화는 핵으로의 STAT6의 전위 및 이합체화를 발생시키는데, 여기에서 STAT6이 GATA-3 및 다른 유전자의 전사를 활성화시킨다.
GATA-3은 아연 손가락(zinc finger) 전사인자로서, 이 전사인자는 "화상적 차이 분석법(RDA, representational difference analysis)" 및 IL-5의 전사 조절에 대한 연구에 따르면 TH1 세포가 아닌 오로지 성숙한 TH2 세포에서만 발현된다. TH1 세포 또는 TH2 세포의 분화에 영향을 미치고 만성 염증 반응 및 자가 면역 질환에 관여하는 다른 전사인자는, 대조 세포의 발현에 비해 표적 세포에서 차이를 나타내는 발현을 가지며 마찬가지로 본 발명에서는 만성 염증성 질환의 치료 목적을 위한 특이 DNAzyme 및/또는 siRNA의 설계에 사용된다:
·STAT4, STAT5a 및 STAT1(신호 변환기 및 전사 활성자(signal transducer and activator of transcription))
·c-Rel
·CREB2(cAMP 반응 요소-결합 단백질 2(cAMP response element-binding protein 2))
·ATF-2, ATF-2
·Hlx
·IRF-1(인터페론 조절 인자-1(interferon regulatory factor-1))
·c-Maf
·NFAT(활성화된 T 세포의 핵 인자(Nuclear factor of activated T cells))
·NIP45(NF-AT 상호작용 단백질(NF-AT interacting protein 45))
·AP1(활성인자 단백질 1(Activator Protein 1))
·Mel-18
·SKAT-2(스캔박스, Th2 표현형과 결합한 KRAB 도메인(SCAN box, KRAB domain associated with a Th2 phenotype))
·CTLA-4(세포용해 T 림프구-결합 항원 4(Cytolytic T lymphocyte-associated antigen 4))
사이토카인의 분화 및/또는 발현에 관여하고, 만성 염증 반응 및 자가면역 질환에 관련이 있는 다른 신호 전달 경로 인자는, 대조 세포의 발현에 비해 표적 세포에서 차이를 나타내는 발현을 가지며, 마찬가지로 본 발명에서는 만성 염증성 질환의 치료 목적을 위한 특이 DNAzyme 및/또는 siRNA의 설계에 사용된다:
·Src 키나아제(kinase)
·Tec 키나아제
Rlk(인체 내 Txk)
ItK
Tec
·RIBP(Rlk/Itk-결합 단백질)
·PLCy(포스포리파아제 Cy1)
·MAP 키나아제(Mitogen-activated protein kinase)
ERK
JNK
P38
·MKK(MAP kinase kinase)
MKK1
MKK2
MKK3
MKK4
MKK6
MKK7
·Rac2
·GADD45(생장억제 및 DNA 손상 유전자 45(Growth arrest and DNA damage gene 45))
GADD45β
GADD45γ
·SOCS(사이토카인 신호표시 억제자(Suppressor of cytokine signalling)
CIS(사이토카인-유발 SH2 단백질(Cytokine-induced SH2 protein))
SOCS1
SOCS2
SOCS3
·JAK(야누스 키나아제(Janus kinase))
JAK1
JAK3
·NIP45(NF-AT 상호작용 단백질(NF-AT interacting protein))
본 발명에서는 만성 염증의 치료에 적합한, 세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이적 의약품이 제공된다.
바람직하게도, 이 의약품은 만성 염증 반응 및 자가면역 질환에 관련이 있는 면역학적 및 세포생물학적 조절 장애의 복합적 경로에 대한 개입점을 공격한다. 특히 바람직하게도 이 개입점은, 예를 들어 TH2 세포 특이적 전사인자 GATA-3 또는 TH1 세포 특이적 전사인자 T-bet와 같은 관련 전사인자의 분화를 조절하는 개입점이다. 달성된 치료 효과는 특이 DNAzyme 및/또는 siRNA를 통한 mRNA 분자의 기능적 비활성화에 있다. 이런 전략은 종래 방식의 치료 및 유전자 치료 방식에 비해서도 하기와 같은 다양한 이점을 제공한다: 최고의 특이성 및 선택성, 분자의 높은 안정성 및 매우 약한 항원성. 만성 염증 질환 환자에게 맞춤형 장기 치료를 제공하기 위한 최적의 전제 조건이 수립되었다.
본 발명에서는 하기와 같은 단계를 포함하는 세포 및/또는 조직 및/또는 질 환 단계 특이적 의약품의 제조 방법이 제공된다:
a) 발현이 대조 세포의 발현에 비해 표적 세포에서 차이를 나타내는 리보 핵산 분자의 식별 단계,
b) 단계 a)에서 리보핵산 분자에 결합하고 이 분자를 기능적으로 비활성화시키는 특이 리보핵산 분자의 설계 단계,
c) 단계 b)의 특이 리보핵산 분자의 표적 세포로의 주입단계,
d) 단계 b)의 특이 리보핵산 분자 및/또는 단계 c)의 표적 세포의 의약품 제형화 단계.
본 발명에서 "세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이적"이란 개념은, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 의약품이 특정한 유형의 세포(표적 세포) 및/또는 특정한 조직 또는 기관 및/또는 특정한 질환 단계에만 주로 작용하고, 다른 세포(대조 세포), 조직 또는 기관에는 거의 무시할 정도의 영향을 미친다는 것을 의미한다. 바람직하게도, 이 의약품은 표적 세포의 적어도 2/3에 작용한다. 더욱 바람직하게는 표적 세포의 적어도 80% 및 가장 바람직하게는 표적 세포의 적어도 98%에 작용한다. 또한 이 의약품이 대조 세포의 최고 10%, 더욱 바람직하게는 대조 세포의 최고 5% 및 가장 바람직하게는 대조 세포의 1% 미만에 작용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "발현이 대조 세포의 발현에 비해 표적 세포에서 차이를 나타내는 리보핵산 분자의 식별"이라는 개념은 하기의 내용을 포함한다:
i) 표적 세포는 조직 및 기관의 세포로서, 이런 세포는 알려진 바와 같이 발 병을 초래하고, 이에 기여하거나 이를 강화시키며, 이런 세포는 질병을 유지시키는 과정을 지속시키며, 이에 기여하거나 또는 이를 강화시키고 또는 이런 세포는 질병의 후유증을 초래하고, 이에 기여하거나 이를 강화시킨다. 예를 들어 이런 세포로는, 특이 전사인자를 갖는 세포, 특이 호르몬, 사이토카인 및 성장인자를 분비하는 세포 또는 전형적인 표면 수용체를 갖는 세포를 들 수 있다.
ii) 표적 세포는 예를 들어 특이 항체의 결합을 원리로 하는 기술을 통해 분리할 수 있다. 분리에는 미테니(Mitenyi(Macs-System)), 다이날(Dynal(DynaBeads)) 또는 BD-바이오사이언스(BD-Bioscience(iMAG))의 자성 구슬(magnetic beads)이 사용된다. 대안적으로 이런 분리는 예를 들어 사이토메이션(Cytomation(MOFLO)) 또는 BD-바이오사이언스(FACS-Vantage) 사의 세포 분별기에서 형광 표시 항체를 이용한 세포 분리를 통해 이루어진다. 표적 세포의 순도는 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 99%이다.
iii) RNA의 분리 방법은, 예를 들어 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제3판, Cold Spring Harbor Laboratory(2001), New York] 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1998), New York]에 설명되어 있다. 또한 일반적 전문가라면 예를 들어 퀴아겐(Qiagen) 사에서 제공하는 RNeasy 킷과 같은 일반 시판되는 킷(실리카 기술)을 RNA 분리에 사용할 수 있다. 또한 예를 들어 퀴아겐(올리고텍스(Oligotex) mRNA 킷), 프로메가(Promega)(PolyATract mRNA Isolation System) 또는 밀테니(Miltenyi)(mRNAdirect)와 같은 일반 시판 킷을 사용해 표적 세포에서 직접 mRNA 를 분리하는 것도 바람직하다.
iv) 발현의 차이를 갖는 mRNA, 즉 표적 세포에서의 그 발현이 대조 세포에 비해 증가된 mRNA의 식별은 예를 들어 일반 시판형 유전자칩(예: MWG, CLON-TECH) 또는 필터 유전자 교잡법(예: Unigene)을 통해 제조사의 지침에 따라 이루어진다. 대안적 방법으로서 사전에 RT 반응을 통해 mRNA에서 발생된 cDNA의 차등적 유전자 교잡(subtractive hybridization)을 통해 mRNA에서 발생된 cDNA의 차등적 유전자 교잡(subtractive hygridization)을 통해 차등 발현된 mRNA를 얻을 수 있다. 전문가들에게 알려진 이런 방법으로는 SSH 방법(클론테크(Clontech) 사) 또는 RDA 방법이 있다. 또한 이런 선호되는 사용 형태에는 칩 테크닉과 차등적 유전자 교잡이 조합된 방법이 포함된다. 차등 발현된 유전자의 식별은 예를 들어 인포맥스(InfoMax) 사의 벡터 익스프레션(Vector Xpression) 프로그램과 같은 일반 시판 프로그램이 적용되는 칩 테크닉을 사용하여 실시할 수 있다. 차등적 유전자 교잡(subtractive hybridization) 방법의 적용 시에는 유전자 복제와 이어지는 염기서열분석과 같은, 일반적으로 전문가들에게 알려진 방법(예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제3판, Cold Spring Harbor Laboratory(2001), New York] 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1998), New York]를 참조)에 따라 차등 발현된 유전자를 분리한 후에 예를 들어 진-뱅크(Gene-Bank)(www.ncbi.nlm.nih.gov)와 같은 데이터 뱅크에서 서열 배열이 이루어진다.
표적 세포의 발현은 대조 세포에 비해 상이하다. 본 발명에 따른 방법의 어 느 한 실시 형태에서는 대조 세포에서의 발현에 비해 표적 세포에서의 발현이 바람직하게는 적어도 1.5배 증가된다. 더욱 바람직한 실시 형태에서는 대조 세포에서의 발현에 비해 표적 세포에서의 발현이 적어도 5배 증가하며, 가장 바람직한 실시 형태에서는 표적 세포에서만 발명이 나타나고 대조 세포에서는 발현이 나타나지 않는다.
본 발명에서 "a)에서 리보핵산 분자에 결합하고 이 분자를 기능적으로 비활성화시키는 특이 리보핵산 분자의 설계"라는 개념은 리보핵산 분자를 기능적으로 비활성화시키는 소간섭 RNA(Small-Interfering-RNA, siRNA) 및/또는 RNA-비활성화성-DNA-효소(DNAzyme)의 사용을 포함한다.
여기에서 DNAzyme 개념은 핵산, 즉 DNA 뿐 아니라 RNA의 표적 서열을 특이적으로 인식하고 분리시키는 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함한다.
일반적인 DNAzyme 모형은 "10-23-모형"이다. "10-23-DNAzyme"이라고도 하는 10-23-모형의 DNAzyme은, 두 개의 기질 결합 영역에 의해 측면에서 연결되는 15개의 디옥시리보핵산을 갖는다. 기질 결합 영역의 길이는 가변적으로서, 동일한 길이 또는 상이한 길이를 갖는다. 바람직한 실시에서는 기질 결합 영역의 길이가 6 내지 14 뉴클레오티드 사이이다. 더욱 바람직한 실시에서는 기질 결합 영역이 분리 위치를 감싸는 구역에 대해 상보적이다. 하지만 표적 RNA를 결합하고 이 RNA를 분리시키기 위해, DNAzyme이 반드시 완전히 상보적일 필요는 없다. 시험관 내 검사에서는, 10-23 타입의 DNAzyme이 퓨린-피리미딘 서열에서 표적 mRNA를 분리하는 것으로 밝혀졌다.
질병 치료에 DNAzyme을 사용하기 위해, 바람직하게도 DNAzyme이 생체 내 분해(혈액 내에서, 세포 내 환경에서 등)에 대항하여 안정화되었다. 바람직한 실시는 DNAzyme의 하나 또는 복수의 말단에서 3'-3'-역전의 도입이다. 3'-3'-역전의 개념은 말단 뉴클레오티드와 인접한 뉴클레오티드의 3'-탄소 사이에서의 인산염 공유결합을 의미한다. 이런 유형의 결합은 보통의 인산염 결합과는 달리 연속되는 뉴클레오티드의 3'탄소와 5'탄소 사이에서 결합이 이루어진다. 이에 상응하게, 뉴클레오티드가 촉매제 영역의 3'-말단에 접하는 기질 결합 영역의 3'-말단에서 역전된다. 역전에 추가적으로 DNAzyme이 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 화합물을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드는 예를 들어 N3'-P5'-포스포라미데이트 화합물, 2'-O-메틸-치환 화합물 및 펩티드 핵산 화합물을 포함한다. 당업자에게는 그 제조 방법이 알려져 있다.
잠재적 DNAzyme 접촉면이 동시 편재성(ubiquitous)으로 존재하지만, 이는 대개 RNA의 이차 구조에 의해 차단되고 이로써 DNAzyme에 접근되지 않는다. 따라서 DNAzyme의 풀(pool)에서, 그 접촉면으로의 자유로운 접근이 가능한 효소만 선별된다. 이 선별된 DNAzyme은 활성이며, 표적 mRNA를 분리시키고 이로써 표적 mRNA를 기능적으로 비활성화시킨다. 개별 DNAzyme에 의한 mRNA 분리의 효과는 각 DNAzyme의 개별 테스트 또는 "멀티플렉스-분석(Multiplex-Assays)"(예를 들어, 문헌[Cairns et at.(1999)에 설명됨])에서 연결 테스트를 통해 나타난다.
siRNA 개념은 시험관 내(in vitro) 뿐 아니라 생체 내(in vivo)에서도 상보적 표적 mRNA의 특이 분해를 유도하는 21-23 염기 길이의 본 발명에 따른 두 가락 RNA 분자를 포함한다. 표적 mRNA 서열에서 siRNA 분자를 획득하는 것은 당업자에게는 문헌을 통해 이미 알려져 있다(예: http://www.mpibpc.gwdg.de.abteilungen/100/105/index.html). 문헌에 따르면 선택된 3 개의 siRNA 분자들 중에서 적어도 하나의 고활성 분자(적어도 80%의 표적 RNA 억제)가 존재할 확률은 적어도 70%이다. siRNA 분자 풀에서, 시험관 내에서 뿐만 아니라 생체 내에서도 상보적 표적 mRNA의 특이 분해를 유도하는 분자가 선별된다.
본 발명에서 "단계 b)에서 표적 세포로의 특이 리보핵산 분자의 주입"이라는 개념은 전술한 본 발명에 따른 특이성 리보핵산 분자를 포함하는 특히 플라즈미드, 코스미드, 바이러스 또는 박테리오파지 같은 매개체의 표적 세포로의 핵내주입을 포함한다. 바람직하게도 핵내주입을 위한 매개체가 동물세포와 인간세포에 적합하며, 본 발명에 따른 리보핵산 분자의 통합을 허용한다. 예를 들어 인비트로젠(Invitrogen) 사의 DMRIE-C를 통한 리포펙션(lipofection)과 같은 핵내주입 방법은 당업자에게 알려져 있다. 원칙적으로 여기에는 리포좀 매개체도 적합하다. 표적 분자는 전사인자로서 호르몬, 사이토카인 및 성장인자를 분비하는 세포 및 발현된 수용체의 표면에서 지지되는 세포이다.
본 발명에서 대조 세포로는 표적 조직의 정상 세포, 동일한 환자의 다른 구역에서 온 동종 세포 또는 건강한 개체에서 온 동종세포를 들 수 있다.
표적 세포의 배양은, pH-값, 온도, 염도, 항생제, 비타민, 미량원소 및 통풍에 대한 표적 세포의 요구에 상응하게 조정된 배지에서 이루어진다.
환자의 개념은 인간과 척추동물에 대해 동일하게 적용된다. 이로써 이 의약 품은 인의학 및 수의학 분야에도 사용할 수 있다.
"단계 b)의 특이 리보핵산 분자 또는 단계 c)의 표적 세포의 의약품 제형화"라는 개념은 변형 및 "전구약물을 포함하는 제약학적으로 수용 가능한 조성을 포함하는데, 단 이런 조성이 신뢰성 있는 의학적 평가에 따라 환자에게서 과도한 독성, 자극 또는 알러지 반응을 유발시키지 않는다는 것을 전제로 한다. 용어 "전구약물"은 수용의 개선을 위해, 예를 들어 혈액에서 가수분해를 통해 변환된 화합물과 관련이 있다.
바람직하게도 제형화는, 제약학적으로 수용 가능한 조성의 형태로 경구, 직장, 비경구, 정맥 내, 근육 내 또는 피하, 수조 내 주입, 질 내, 복막 내, 경막 내, 혈관 내, 국소투여(분말, 연고 또는 점적약제) 또는 스프레이 형태로 환자에게 특이 리보핵산 분자의 투여를 가능하게 한다.
본 발명에 따른 의약품의 국부적 투여를 위한 제형에는 연고, 분말, 스프레이 또는 흡입제가 포함된다. 활성 성분은 멸균 조건 하에서 필요에 따라 생리학적으로 수용 가능한 부형제 및 보존제, 완충제 또는 분사제와 함께 혼합된다.
용량의 유형은 담당 의사에 의해 임상적 요인에 상응하게 결정된다. 용량의 유형이 예를 들어 환자의 키, 체중, 체표면적, 연령, 성별 또는 일반적인 건강 상태와 같은 복수의 요인에 따라 결정되며 또한 투여하는 수단, 투여 기간 및 유형, 경우에 따라 병행하여 투여되는 다른 의약품에 따라 결정된다는 것은 전문가들에게 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 의약품은 환자, 질환, 시기 또는 단계에 대 한 강한 특이성을 갖는다. 이 의약품은 세포 특이적으로 작용하며 구역 및 기관에 대해 특이성을 갖는다. 이 의약품에 대한 면역 시스템의 반응이 발생하지 않거나 또는 단지 매우 약한 반응이 발생하며, 부작용은 질병의 정도, 예후 및 진행에 대해 수용 가능한 정도로 나타난다.
이 의약품은 예를 들어 자가면역 질환, 류마티스성 질환(피부, 폐, 신장, 결합조직, 혈관계, 신경계, 근골격계, 내분비계에서의 증상), 알러지성 즉시형 반응 및 천식, 만성 폐쇄폐병(COPD), 동맥경화증, 건선 및 접촉 습진과 같은 만성 염증을 수반하는 모든 질병군 및 장기 및 골수 이식 후 만성적 거부 반응을 치료하는데 사용할 수 있다.
실시예 1: GATA -3
a) 발현이 대조 세포의 발현에 비해 표적 세포에서 차이를 나타내는 리보핵산 분자의 식별
i) 표적 세포로는 만성 염증 반응의 발생과 관련이 있는 신생 CD4+ 세포를 사용했다.
ii) CD4+ 세포는 [밀테니(Miltenyi, Macs-System), 다이날(Dynal,DnyaBeads) 또는 BD-바이오사이언스(iMAG) 사의] 자성 구슬(magnetic beads)을 통해 분리하며, 대안적으로 예를 들어 사이토메이션(MOFLO) 또는 BD-바이오사이언스(FACS-Vantage) 사의 세포 분별기에서 형광 표시 항체를 통해 분리했다.
iii) RNA의 분리는 표준 방법에 의해 수행했다. 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제3판, Cold Spring Harbor Laboratory(2001), New York] 참조.
대안적으로 퀴아젠(Qiagen) 사에서 제공하는 RNeasy 킷(kit)을 사용하거나 또는 퀴아젠 사의 올리고텍스(Oligotex) mRNA 킷을 이용해 제조사의 지침에 따라 CD4+ 세포에서 mRNA를 직접 분리했다.
iv) 발현의 차이를 갖는 mRNA, 즉 표적 세포에서의 그 발현이 대조 세포에 비해 증가된 mRNA의 식별은 유전자칩(예, MWG, 클론테크)을 통해 수행했으며, 차등 발현된 유전자의 식별은 인포맥스(InfoMax) 사의 벡터 익스프레션(Vector Xpression) 프로그램을 통해 수행했다.
또는 필터 유전자 교잡법(예: Unigene)을 통해 제조사의 지침에 따라 수행했다. 차등 발현된 유전자의 분리 후에는 이어서 복제, 염기서열분석(표준 규정에 따라 실시했고,(참조: 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제3판, Cold Spring Harbor Laboratory(2001)]) 유전자 데이터 뱅크(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 서열 배열을 수행했다. GATA-3의 발현은 대조 세포(예: Th0 세포)에서의 발현에 비해 차이가 났다.
b) 단계 a에서 리보핵산 분자에 결합하고 이 분자를 기능적으로 비활성화시키는 특이 리보핵산 분자의 설계
도 3은 GATA-3 mRNA에 대한 특이 DNAzyme에서 본 발명에 따른 풀 hgd 1 내지 hgd 70을 나타낸다. DNAzyme은 33 뉴클레오티드의 총 길이를 가지며, 중앙의 촉매 영역의 15개의 뉴클레오티드(소문자로 표기)는 (도 2의) 알려진 10-23 DNAzyme의 촉매 영역에 해당한다. 이 촉매 영역은 각각 9개의 뉴클레오티드로 이루어진 두 개의 우측 및 좌측 기질 결합 영역(대문자 표기)에 의해 측면으로 연결된다. 우측 및 좌측 기질 결합 영역의 뉴클레오티드 서열은 서로 상이하며 DNAzyme hdg 1 내지 hgd 70에서 변하므로, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 결합을 통해 GATA-3 mRNA로의 서로 다른 특이적 결합이 이루어진다.
도 2는 N으로 표시된 임의의 표적 RNA로의 10-23 DNAzyme의 결합에 관한 모형을 나타내는데, 여기에서 화살표는 표적 mRNA에서의 분리 위치를 지시한다.
DNAzyme은 모든 퓨린-피리미딘 서열에서 표적 mRNA를 분리시킬 수 있지만, 문헌에 따르면 퓨린-우라실 결합이 퓨린-시토신 결합보다 더욱 효과적으로 분리되는 것으로 알려져 있다. 따라서 바람직하게는, 퓨린-시토신 결합을 분리하는 DNAzyme이 설계된다.
도 2에 도시한 모형은 그 작용기전에 따라 GATA-3 mRNA에서 DNAzyme hdg 1 내지 hgd 70의 결합으로 적용될 수 있다.
DNAzyme hgd 1 내지 hgd 70은 시험관 내 시험에서는 변형되지 않은 상태로 사용되며 세포 배양 시험에서는 변형하여 사용했다(유로젠텍(Eurogentec) 사에서 구입가능).
안정화 및 보호를 위한 변형으로서 하기의 것을 사용했다:
1) 3'-말단에 안정화된 역전 티민
2) FACS 분석을 통해 세포의 핵내주입 효과를 평가하기 위한 5'-말단의 FAM 마킹.
시험관 내에서 DNAzyme을 시험하기 위해, 시험관 내 전사를 통해 제조된 GATA-3 mRNA가 필요했다. 각 단계는 하기와 같았다:
-QIAamp-RNA-Blood-Mini-Kit(퀴아젠(Qiagen), 독일)을 이용해 제조사의 지시에 따라 인간 EDTA 온혈액에서 RNA 분리
-시발체를 이용한 역전사:
상류 시발체 GGCGCCGTCTTGATACTTT
하류 시발체 CCGAAAATTGAGAGAGAAGGAA, 여기에서 길이가 2731 뉴클레오티드인 PCR 산물(JumpStart Accu Taq DNA Polymerase, 시그마(Sigma) 사)을 적용했다.
PCR 조건: 초기 변성 (96℃, 30초) 40 사이클로 증폭(94℃, 15초; 48℃, 30초; 68℃, 3분), 최종 확장(68℃, 3분).
PCR 산물은 표준 방법을 통해 플라즈미드 pCR2.1(시험관 내 유전자)로 복제되고 점검을 위해 염기서열분석을 수행했다. GATA-3 mRNA의 제조는 제조사(Ambion)의 지침에 따라 시험관 내 전사를 통해 제한효소 Spe I로 분리함으로써 GAT-3에 포함된 플라즈미드 pCR2.1을 선형화한 후에 수행했다. GATA-3 mRNA는 총 2876 뉴클레오티드 길이로 존재했다.
도 4-1 내지 4-3은 데이터 뱅크[PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide)]에서 발췌한 인간 GATA-3 유전자의 알려진 뉴클레오티드 서열을 나타내는데, 여기에서 분기되는 염기는 회색 배경으로 표시했다. 서열1: 데이터 뱅크 번호 XM_043124에서 발췌한 인간 GATA-3, 서열 2: 인간 GATA-3(플라즈미드 pCR2.1에서 분리).
GATA-3 mRNA 서열들은 3'-비해독 말단 또는 5'-비해독 말단의 길이에 있어서 구별된다. mRNA의 정확한 전체 서열을 얻기 위해, 항목 번호 XM_043124 및 X58072의 mRNA 서열을 시발체 선별에 사용했다. GATA-3의 복제를 위한 시발체 위치는 도 4-1 내지 4-3에서 밑줄로 강조했다. 또한 도 4-1 내지 4-3은 플라즈미드 pCR2.1에서 서열 분석이 이루어진 뉴클레오티드 서열(서열 3)을 포함하는 데이터 뱅크(서열 1 및 서열 2)에서 발췌한 GATA-3의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다. 여기에서는 서열이 완전히 동일하지 않고 각 염기가 상이하다는 것을 알 수 있다. 본 발명에서 도 4-1 내지 4-3의 GATA-3의 핵산 서열 3은 GATA-3 mRNA에 대항하는 DNAzyme의 설계를 위한 기초를 형성한다.
도 4A는 도 4-1 내지 4-3에 인간 GATA-3 유전자의 서열 3에 대한 뉴클레오티드 서열을 나타내며 회색 배경으로 표시한 부분은 각각 두 개의 뉴클레오티드 GT 또는 AT를 나타내며, 이들 사이에는 DNAzyme을 위한 다른 잠재적 접촉면이 존재한다.
DNAzyme(hgd1-hgd70)을 이용한 GATA-3 mRNA의 시험관 내 분리 시험은 아래의 반응 조성을 갖는 10㎕의 체적에서 실시했다: 50mM Tris pH7.4, 150mM NaCl, 10mM MgCl2, 0.25μM DNAzyme 및 시험관 내에서 전사된 0.025μM GATA-3 mRNA(DNAzyme에 대한 기질의 비 1:10). 반응물은 37℃에서 각각의 지정된 시간으로 배양했다. 포름 아마이드 및 EDTA 함유성 RNA-샘플-적재-버퍼(시그마 사)를 첨가함으로써 반응이 정지시켰다. 변성된 시편은 1.3%의 TAE 한천겔에서 분리하고 UV투과조명기에서 분석했다.
도 5는 한천겔 전기영도의 결과로서 변형되지 않은 DNAzyme[hgd 11(트레이스 2), hgd 13(트레이스 4), hgd 17(트레이스 6), hgd 40(트레이스 8)] 및 변형된 DNAzyme[hgd 11-M(트레이스 3), hgd 13-M(트레이스 5), hgd 17-M(트레이스 7), hgd 40-M(트레이스 9)]을 통한 GATA-3 표적 mRNA의 분리를 나타낸다. 트레이스 1은 대조군으로서 DNAzyme이 첨가되지 않은 mRNA를 포함했다. 변형된 DNAzyme은 추가적으로 M으로 표시했다. 동봉된 사이즈 표준(size standard)(표지되지 않음)은 1000bP, 2000bp 및 3000bp의 밴드 치수를 나타낸다. 화살표는 S, 기질(여기에서는 GATA-3-mRNA)이 포함된 밴드 및 분리산물 P1 및 P2를 지시한다.
모든 70개의 DNAzyme 사이의 비교에서는 hgd11, hgd13, hgd17 및 hgd40이 특히 활성이며, 변형이 DNAzyme hgd11, hgd13 및 hgd17의 효과를 저하시키지는 않지만 DNAzyme hgd40의 효과는 저하시키는 것을 알 수 있었다.
하기의 표에서는 GATA-3 mRNA에 대해 DNAzyme hgd1 내지 hgd70을 4개의 그룹으로 분류했다. 이런 그룹 분류는 실시한 GATA-3 mRNA에 대한 DNAzyme의 시험관 내 활성도 시험을 근거로 수행했다. 그룹 1: 강한 분리 활성도, 그룹 2: 중간 분리 활성도, 그룹 3: 약한 분리 활성도, 그룹 4: 분리 활성도 측정 안됨.
Figure 112006029305504-PCT00001
c) 단계 b)에서 표적 세포로의 특이 리보핵산 분자의 주입
강한 활성의 DNAzyme hgd11, hgd13, hgd17 및 hgd40을 전술한 변형 없이 및 변형과 함께 표적 세포에 사용했다.
이를 위해 Jurkat E6.1 세포(human acute T cell leukemia Cells)를 100U/ml 페닐실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신 및 10% FKS가 포함된 RPMI 배지에서 37℃ 온도로 습윤한 5% CO2 대기 중에 배양했다. 핵내주입은 6-파형판에서 실시했다. 이를 위해 2×106 Jurkat E6.1 세포를 Opti-MEM-I 세포용 배지(인비트로젠(Invitrogen) 사)에 옮기고 DMRIE-C(인비트로젠 사)를 이용해 변형된 DNAzyme(0.3μM)으로 핵내주입을 실시했다(인비트론 사의 제조사 지침에 따라). 전술한 조건 하에서 10시간 동안 배양기에서 배양한 후에 RPMI 배지(전술한 첨가물이 포함됨)를 여기에 첨가하고 이후 14시간 동안 배양을 계속했다. 세포는 Opti-MEM 배지에서 성장했으며, 그 후에 다시 전술한 프로토콜에 따라 핵내주입을 수행했다. 핵내주입을 한 후에 매번 FACS 분석을 통해 핵내주입 효율을 평가했다.
그 다음 GATA-3 단백질 양의 증명을 통해 웨스턴블롯에서 DNAzyme의 활성도를 검사했다(도 6 참조).
웨스턴블롯 분석을 위해 제조사(피어스(Pierce) 사)의 지침에 따라 단백질 추출 킷(Protein-Extraction-Kit)을 이용해 세포질 단백질 및 핵 단백질을 분리 및 처리했다. 단백질 농도는 BCA-킷(피어스 사)을 통해 측정했다. 각각 30㎍의 단백질 분리는 변성된 겔 전기영동법을 통해 10%의 SDS 폴리아크릴아미드겔에서 수행했다. 그 다음, 단백질은 표준 방법에 따라 니트로셀룰로스막에 블롯팅했다. 이 막은 5%의 탈지분유를 통해 PBS(0.01% Tween 20 포함)에서 차단했고 그 다음 mouse-anti-GATA-3 항체(산타 크루즈(Santa Cruz) 사)(1:500)와 함께, 그리고 이어서 HRP-결합된 mouse-anti-rabbit-항체(BD 바이사이언스 사)(1:2000)와 함께 각각 1시간 동안 상온에서 배양했다. 단백질은 화학적 형광물질을 통해 가시화시켰다. 블롯 상에서 베타 액틴의 병렬 증명을 통해 단백질 도포량에서 변이를 점검했다. 이를 위해 니트로셀룰로스막에서 우선 GATA-3를 검출했다. 그 다음 동일한 막을 습윤 챔버에서 하룻밤 동안 두었다. PBS를 통한 2회에 걸친 정화 후에 특이 항체를 통한 면역 착색을 이용해 베타 액틴의 증명을 수행했다[mouse-anti-Human 베타 액틴 항체(시그마 사)].
도 6은 세포에서의 DNAzyme의 활성도와 함께 면역 블롯의 결과를 나타낸다. Jurkat E6.1 세포는 리포펙션을 통해 DNAzyme(트레이스 4=hgd11-M, 트레이스 5=hgd13-M, 트레이스 6=hgd17-M, 트레이스 7=hgd40-M)와 함께 핵내주입되었다. 대조군으로서는 처리되지 않은 세포(트레이스 1), 단지 핵내주입 매질만(트레이스 2), 또는 핵내주입 매질(transfection medium)이 포함되지 않은 DNAzyme(트레이스 3)으로 처리된 세포를 사용했다. 48시간의 배양 후에 용해화된 단백질을 SDS-PAGE를 이용해 분리하고 특이 항체를 통한 면역 블롯으로 GATA-3(A)을 검출했다. 각 트레이스에 동일한 양의 단백질이 투입되었음을 입증하기 위해, 동일한 블롯막에서 베타 액틴(B)을 이용한 면역 착색을 수행했다. 동봉된 사이즈 표준(도시되지 않음)은 크기 63.8kDa, 49.5kDa 및 37.4kDa의 단백질 밴드를 나타냈다.
DNAzyme hgd11, hgd13 및 hgd17이 생체 내에서 활성이 아님이 밝혀졌고, 이에 반해 DNAzyme hgd40이 생체 내에서도 GATA-3 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 DNAzyme hgd40을 통한 생체 내에서의 GATA-3 발현의 특이 억제는 만성 염증 질환의 치료를 위한 효과적인 치료 도구를 의미한다.
d) 단계 b)의 특이 리보핵산 분자 및/또는 단계 c)의 표적 세포의 의약품 제형화
GATA-3에 대한 특이 기질 결합 영역을 갖는 다양한 DNAzyme의 분석에서, DNAzyme hgd40이 생체 내에서 GATA-3발현을 특이적으로 억제하며 세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이적 의약품의 제조를 위한 특이 리보핵산으로서 적합하다는 것이 밝혀졌다. 이를 위해 hgd40(5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG) 또는 hgd40으로 핵내주입된 세포에 제약학적 조성으로, 제약학적으로 수용할 수 있는 리포좀 또는 생물분해가 가능한 폴리머와 같은 운반체를 제공했다.
DNAzyme에 대안적으로 GATA-3 발현의 특이 억제 및 세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이적 의약품의 제조를 위해 siRNA의 사용을 제안했다. 바람직하게 도 siRNA가 쥐와 인간 GATA-3의 억제를 위해 사용된다. siRNA의 제조는 당업자들 사이에 일반적으로 알려져 있으며 문헌에 기술되어 있다. siRNA 서열에 대한 예시는 아래에 기술하였다:
Figure 112006029305504-PCT00002
실시예 2: T-Bet에 대한 DNAzyme
a) 발현이 대조 세포의 발현이 대조 세포의 발현에 비해 표적 세포에서 차이를 나타내는 리보핵산 분자의 식별
식별은 상기한 방법으로 수행했다.
표적 세포(Th1 세포)에서의 T-bet의 발현은 대조 세포(Th0 세포)에서의 발현에 비해 상이했다.
b) 단계 a)에서 리보핵산 분자에 결합하고 이 분자를 기능적으로 비활성화시키는 특이 리보핵산 분자의 설계
T-bet의 분리를 위한 접촉면의 식별은 GATA-3에 대해 설명한 바와 같이 동일하게 수행했다.
도 7은 T-bet mRNA에 대한 특이 DNAzyme에서 본 발명에 따른 풀 hgd1 내지 hgd78을 나타낸다. DNAzyme은 33 뉴클레오티드의 총 길이를 가지며, 중앙의 촉매 영역의 15개의 뉴클레오티드(소문자로 표기)는 (도 2)의 알려진 10-23 DNAzyme의 촉매 영역에 해당한다. 이 촉매 영역은 각각 9개의 뉴클레오티드로 이루어진 두 개의 우측 및 좌측 기질 결합 영역(대문자 표기)에 의해 측면으로 연결된다. 우측 및 좌측 기질 결합 영역의 뉴클레이티드 서열은 서로 상이하며 DNAzyme hdg1 내지 hgd78에서 변하므로, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 결합을 통해 T-bet mRNA로의 서로 다른 특이적 결합이 이루어진다.
문헌에 따르면 DNAzyme이 퓨린-시토신 결합에서보다 퓨린-우라실 결합에서 더 효과적으로 표적 mRNA를 분리하는 것으로 알려져 있으므로, 바람직하게도 퓨린-우라실 결합을 분리하는 DNAzyme이 설계했다.
도 2에 도시한 모형은 그 작용기전에 따라 T-bet mRNA에서 DNAzyme hgd11 내지 hgd78의 결합으로 적용될 수 있다.
DNAzyme의 분리 특성 및 T-bet mRNA의 표적 mRNA에 대한 기능적 비활성화를 설명하기 위해, QIAamp-RNA-Blood-Mini-Kit(퀴아젠 사, 독일)을 이용해 제조사 지시에 따라 인간 EDTA 온혈액에서 T-bet mRNA의 시험관 내 전사를 수행했다.
도 8-1 내지 8-2는 데이터 뱅크[PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide)]의 번 호 NM_013351, 서열 1에서 발췌한 인간 T-bet의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
역전사는 상류 시발체 CGGCCCGCTGGAGAGGAAGC 및 하류 시발체 CACACACCCACACACAACC를 통해 표준 규정(인비트로젠 사의 ThermoScript)으로 수행했으며, 여기에서 길이가 2450 뉴클레오티드인 PCR 산물을 적용했다. 이 PCR 산물은 표준 방법에 따라 플라즈미드 ρBluescript-SK(스트라타진(Stratagene) 사)로 복제했고 점검을 위해 염기서열분석을 수행했다.
도 8-1 내지 8-2는 T-bet(No.: NM_013351)(서열 1)의 핵산 서열 및 염기서열이 분석된 서열(서열2)에 대한 비교를 나타낸다. 여기에서는 서열이 완전히 동일하지 않고 개별 염기가 뒤바뀌었음을 알 수 있다. 본 발명에서 도 8-1 내지 8-2의 T-bet의 핵산 서열 2는 T-bet 유전자의 서열 1에 대한 뉴클레오티드 서열을 나타내며 회색 배경으로 표시한 부분은 각각 두 개의 뉴클레오티드 GT 또는 AT를 나타내며, 이들 사이에는 DNAzyme을 위한 다른 잠재적 접촉면이 존재한다.
T-bet mRNA의 제조는 제조사(앰비온 사)의 지침에 따라 시험관 내 전사를 통해 제한효소 Xba I(퍼만타스(Fermantas) 사)로 분리함으로써 T-bet에 포함된 플라즈미드 ρBluescript-SK를 선형화한 후에 수행했다. T-bet mRNA는 총 2550 뉴클레오티드 길이로 존재했다.
DNAzyme(hgd1-hgd78)을 이용한 T-bet mRNA의 시험관 내 분리 시험은 GATA-3을 통한 시험에서 명시한 것과 동일한 방법으로 진행했다.
도 9는 한천겔 전기영동의 결과로서 변형된 DNAzyme[td54-M(트레이스 3), td69-M(트레이스 4), td70-M(트레이스 5)]을 통한 T-bet 표적 mRNA의 분리를 나타 낸다. 트레이스 2는 대조군으로서 DNAzyme이 첨가되지 않은 T-bet 표적 mRNA를 포함했다. 동봉된 사이즈 표준(size standard)(트레이스 M)은 2000bP 및 3000bp의 밴드 치수를 나타낸다. 화살표는 A, 기질(여기에서는 T-bet mRNA)이 포함된 밴드 및 분리 산물의 B를 지시한다(다른 산물은 이 그림에 표시되지 않는다).
모든 78개의 DNAzyme 사이 비교에서는, td54, td69 및 td70이 특히 활성이며, 변형이 DNAzyme의 효과를 저하시키지는 않는 것을 알 수 있었다.
아래의 표에서는 T-bet 3 mRNA에 대해 DNAzyme td1 내지 td78을 4개의 그룹으로 분류했다. 이런 그룹 분류는 실시한 T-bet mRNA에 대한 DNAzyme의 시험관 내 활성도 시험을 근거로 수행했다. 그룹 1: 강한 분리 활성도, 그룹 2: 중간 분리 활성도, 그룹 3: 약한 분리 활성도, 그룹 4: 분리 활성도 측정 안됨.
Figure 112006029305504-PCT00003
c) 단계 b)에서 표적 세포로의 특이 리보핵산 분자의 주입
DNAzyme td54, td69 및 td70은 전술한 변형 없이 및 변형과 함께 표적 세포에 사용했다. Jurkat E6.1 세포에 대한 전사는 실시예 GATA-3에서 설명한 내용과 동일하게 수행했다.
Jurkat E6.1 세포의 전사 후에 시험관 내에서의 DNAzyme의 효과에 대한 진술 을 위해, GAPDH-mRNA 발현에 대해 상대적인 T-bet mRNA의 양을 실시간-PCR(라이트사이클러(LightCycler), 로슈(Roche) 사)를 통해 양적으로 측정했다.
라이트사이클러 분석을 위해 RNeasy Mini 킷(퀴아젠, 독일)을 이용해 Jurkat E6.1 세포를 정제하고 그 다음 광도측정으로 정상화했다. 제조사의 지침에 따라 수퍼스크립트(SuperScript II)(깁코(Gibco) 사)로 역전사한 후에, 라이트사이클러에서 T-bet 및 GAPDH-mRNA의 양적 분석을 수행했다. PCR의 총 체적은 20㎕였고, 여기에는 1㎕ DNA, 각 1㎕(0.5㎕)의 센스 및 안티센스 시발체, 및 10㎕ QunatiTect-SYBR-Freen-PCR-Mater-Mix(퀴아젠, 독일)가 함유되어 있었다. T-bet를 위해 사용된 PCR 시발체: 센스 5'-CCCACCATGTCCTACTACCG-3'; 안티센스 5'-GCAATCTCAGTCCACACCAA-3'. GAPDH를 위한 PCR 시발체: 센스 5'-TCTTCTTTTGCGTCGCCAG-3' 및 안티센스 5'-AGCCCCAGCCTTCTCCA-3'. PCR 조건: 변성 (15분, 95℃), 증폭(15초 95℃, 25초 59℃, 25초 72℃, 50 사이클) 그 다음 최종 확장 2분 72℃.
그 다음, 용융곡선이 하기와 같이 작성되었다: 0초 95℃, 15초 60℃, 그 후에 온도를 0.2℃ 간격으로 증가시켜 97℃까지 높였고, 동시에 연속적으로 형광물질을 측정했다. 모든 PCR 산물이 고유의 용융 온도를 가지므로, 이 용융곡선은 내부적인 대조를 위한 것이었다.
SYBR-Green은 두 가닥 DNA에 결합하는 형광염료이다(QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix로 구입 가능). 확장 중에 DNA가 복제되면 SYBR-Green이 여기에 결합하고 결합에 따라 형광신호를 발생시키는데, 이 신호는 라이트사이클러에 의해 각 확장의 말단에서 검출된다. 출발 물질의 양이 많을수록, 형광물질의 현저한 증가가 더 조기에 검출된다. 라이트사이클러 소프트웨어는 수집된 형광물질 강도를 각 사이클에 대해 그래픽으로 표시한다.
도 10은 DNAzyme td54m, td69m 및 td70m으로 Jurkat E6.1 세포를 처리한 후에 논센스-DNAzyme에 대해 비교한 T-bet 및 GAPDH-mRNA 라이트사이클러 증폭곡선을 나타낸다.
형광물질이 최초로 배경 형광물질에 대해 현저하게 구분되는 PCR 사이클로 정의되는 각 "교차점(Crossing Point(Ct))"은 라이트사이클러 소프트웨어의 핏 포인트(Fit-Point) 방식에 따라 수동으로 결정했다. 논센스 DNAzyme과 비교한 DNAzyme으로 처리된 세포에서의 T-bet 및 GAPDH-mRNA의 상대적인 양의 측정은 사용자 게시판 #2[ABI Prism 7700 Sequence detection System User Bulletin #2 (2001) Relative quantification of gene expression http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf]에 설명된 지침에 따라 실시했다. 이때 대조 시험의 T-bet mRNA의 양은 100%로 설정했다. 상대적 양을 측정한 데이터는 도 11에 그래프로 도시했다.
논센스 DNAzyme 처리에 비해, td69m-DNAzyme이 81.3%의 억제를 발생시키고 td70m-DNAzyme이 81.0%의 억제를 발생시키는 것으로 나타났으며, td45m-DNAzyme은 T-bet mRNA에 대한 억제 효과가 없는 것으로 밝혀졌다.
이것은 td54m-DNAzyme이 생체 내에서는 활성이 아니며, 이와 달리 td69m 및 td70m-DNAzyme은 세포 환경에서도 T-bet의 mRNA를 비활성화시키는 것을 의미한다. DNAzyme td69m 및 td70m에 의한 생체 내에서의 T-bet mRNA의 특이적 감소는 만성 염증 질환의 치료를 위한 효과적인 치료 도구를 의미한다.
d) 단계 b)의 특이 리보핵산 분자 및/또는 단계 c)의 표적 세포의 의약품 제형화
T-bet에 대한 특이 기질 결합 영역을 갖는 다양한 DNAzyme의 분석에서, DNAzyme td69 및 td70이 생체 내에서 T-bet 발현을 특이적으로 억제하며 세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이적 의약품의 제조를 위한 특이 리보핵산으로서 적합하다는 것이 밝혀졌다.
이를 위해 td69(GGCAATGAAggctagctacaacgaTGGGTTTCT) 또는 td70(TCACGGCAAggctagctacaacgaGAACTGGGT) 또는 td69m 또는 td70m으로 핵내주입된 세포에 제약학적 조성으로 제약학적으로 수용할 수 있는 리포좀 또는 생물 분해가 가능한 폴리머와 같은 운반체를 제공했다.
DNAzyme에 대안적으로 T-bet 발현의 특이 억제 및 세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이적 의약품의 제조를 위해 siRNA의 사용을 제안하였다.
바람직하게도 siRNA가 인간 T-bet의 억제를 위해 사용된다. siRNA의 제조는 전문가들 사이에 일반적으로 알려져 있으며 문헌에 기술되어 있다. siRNA 서열에 대한 예시는 아래에 기술했다:
Figure 112006029305504-PCT00004
전문가들은, 본 발명의 지식을 통해 또한 약한 특이성의 DNAzyme 또는 siRNA도 만성 염증 질환 및 자가면역 질환을 위한 의약품으로서 제조할 수 있다는 것을 쉽게 이해하는데, 이런 의약품은 예를 들어 STAT4, STAT5a, STAT1, c-Rel, CREB2, ATF-2, ATF-2, HIx, IRF-1, c-Maf, NFAT, NIP45, AP1, Mel-18, SKAT-2, CTLA-4와 같이 TH1 세포 또는 TH2 세포로의 분화에 영향을 미치는 다른 전사인자를 억제하며, 또는 예를 들어 Src 키나아제, Tec 키나아제, Rlk(인체의 Txk), Itk Tec, RIBP, PLCγ, MAP 키나아제, ERK, JNK, P38, MKK, MKK1, MKK2, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, Rac2, GADD45, GADD45β, GADD45γ, SOCS, CIS, SOCS1, SOCS2, SOCS3, JAK, JAK1, JAK3, NIP45와 같이 사이토카인의 분화 및/또는 발현을 위한 신호 전달 경로에 영향을 미치는 다른 인자를 억제한다.
이런 단백질은 대조 세포의 발현에 비해 표적 세포에서 증가된 발현을 갖는다.
<110> Philipps-Universitat Marburg <120> Method for producing a cell and/or tissue and/or disease phase specific medicament <130> T46P5WO <160> 153 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(33) <223> hgd1 DNAzyme against GATA-3mRNA <400> 1 tcggtcagag gctagctaca acgatgcgtt gct 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(33) <223> hdg2 DNAzyme against GATA-3mRNA <400> 2 ggcgtacgag gctagctaca acgactgctc ggt 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(33) <223> hgd3 DNAzyme against GATA-3mRNA <400> 3 ggcggcgtag gctagctaca acgagacctg ctc 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(33) <223> hgd4 DNAzyme against GATA-3mRNA <400> 4 ctcgggtcag gctagctaca acgactgggt agc 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(33) <223> hgd5 DNAzyme against GATA-3mRNA <400> 5 tcctctgcag gctagctaca acgacggggt cct 33 <210> 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ctgactatga agaaggaagg catccagacc agaaaccgaa aaatgtctag 1260 caaatccaaa aagtgcaaaa aagtgcatga ctcactggag gacttcccca agaacagctc 1320 gtttaacccg gccgccctct ccagacacat gtcctccctg agccacatct cgcccttcag 1380 ccactccagc cacatgctga ccacgcccac gccgatgcac ccgccatcca gcctgtcctt 1440 tggaccacac cacccctcca gcatggtcac cgccatgggt tagagccctg ctcgatgctc 1500 acagggcccc cagcgagagt ccctgcagtc cctttcgact tgcatttttg caggagcagt 1560 atcatgaagc ctaaacgcga tggatatatg tttttgaagg cagaaagcaa aattatgttt 1620 gccactttgc aaaggagctc actgtggtgt ctgtgttcca accactgaat ctggacccca 1680 tctgtgaata agccattctg actcatatcc cctatttaac agggtctcta gtgctgtgaa 1740 aaaaaaaaat cctgaacatt gcatataact tatattgtaa gaaatactgt acaatgactt 1800 tattgcatct gggtagctgt aaggcatgaa ggatgccaag aagtttaagg aatatgggag 1860 aaatagtgtg gaaattaaga agaaactagg tctgatattc aaatggacaa actgccagtt 1920 ttgtttcctt tcactggcca cagttgtttg atgcattaaa agaaaataaa aaaaagaaaa 1980 aagagaaaag aaaaaaaaag aaaaaagttg taggcgaatc atttgttcaa agctgttggc 2040 cctctgcaaa ggaaatacca gttctgggca atcagtgtta ccgttcacca gttgccattg 2100 agggtttcag agagcctttt tctaggccta catgctttgt gaacaagtcc ctgtaattgt 2160 tgtttgtatg tataattcaa agcaccaaaa taagaaaaga tgtagattta tttcatcata 2220 ttatacagac cgaactgttg tataaattta tttactgcta gtcttaagaa ctgctttctt 2280 tcgtttgttt gtttcaatat tttccttctc tctcaatttt cggttgaata aactagatta 2340 cattcagttg gcaaaaaaaa aaaaa 2365 <210> 153 <211> 2728 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (57) <220> <221> mutation <222> (59) <220> <221> mutation <222> (69) <220> <221> mutation <222> (909)..(927) <400> 153 ggcgccgtct tgatactttc agaaagaatg cattccctgt aaaaaaaaaa aaaaaaaaat 60 actgagagag ggagagagag agaagaagag agagagacgg agggagagcg agacagagcg 120 agcaacgcaa tctgaccgag caggtcgtac gccgccgcct cctcctcctc tctgctcttc 180 gctacccagg tgacccgagg agggactccg cctccgagcg gctgaggacc ccggtgcaga 240 ggagcctggc tcgcagaatt gcagagtcgt cgcccctttt tacaacctgg tcccgtttta 300 ttctgccata cccagttttt ggatttttgt cttccccttc ttctctttgc taaacgaccc 360 ctccaagata atttttaaaa aaccttctcc tttgctcacc tttgcttccc agccttccca 420 tccccccacc gaaagcaaat cattcaacga cccccgaccc tccgacggca ggagcccccc 480 gacctcccag gcggaccgcc ctccctcccc gcgcgcgggt tccgggcccg gcgagagggc 540 gcgagcacag ccgaggccat ggaggtgacg gcggaccagc cgcgctgggt gagccaccac 600 caccccgccg tgctcaacgg gcagcacccg gacacgcacc acccgggcct cagccactcc 660 tacatggacg cggcgcagta cccgctgccg gaggaggtgg atgtgctttt taacatcgac 720 ggtcaaggca accacgtccc gccctactac ggaaactcgg tcagggccac ggtgcagagg 780 taccctccga cccaccacgg gagccaggtg tgccgcccgc ctctgcttca tggatccctc 840 cctggctgga cggcggcaaa gccctgggca gccaccacac cgcctccccc tggaatctca 900 gccccttctc caagacgtcc atccaccacg gctccccggg gcccctctcc gtctaccccc 960 cggcctcgtc ctcctccttg tcggggggcc acgccagccc gcacctcttc accttcccgc 1020 ccaccccgcc gaaggacgtc tccccggacc catcgctgtc caccccaggc tcggccggct 1080 cggcccggca ggacgagaaa gagtgcctca agtaccaggt gcccctgccc gacagcatga 1140 agctggagtc gtcccactcc cgtggcagca tgaccgccct gggtggagcc tcctcgtcga 1200 cccaccaccc catcaccacc tacccgccct acgtgcccga gtacagctcc ggactcttcc 1260 cccccagcag cctgctgggc ggctccccca ccggcttcgg atgcaagtcc aggcccaagg 1320 cccggtccag cacagaaggc agggagtgtg tgaactgtgg ggcaacctcg accccactgt 1380 ggcggcgaga tggcacggga cactacctgt gcaacgcctg cgggctctat cacaaaatga 1440 acggacagaa ccggcccctc attaagccca agcgaaggct gtctgcagcc aggagagcag 1500 ggacgtcctg tgcgaactgt cagaccacca caaccacact ctggaggagg aatgccaatg 1560 gggaccctgt ctgcaatgcc tgtgggctct actacaagct tcacaatatt aacagacccc 1620 tgactatgaa gaaggaaggc atccagacca gaaaccgaaa aatgtctagc aaatccaaaa 1680 agtgcaaaaa agtgcatgac tcactggagg acttccccaa gaacagctcg tttaacccgg 1740 ccgccctctc cagacacatg tcctccctga gccacatctc gcccttcagc caccccagcc 1800 acatgctgac cacgcccacg ccgatgcacc cgccatccag cctgtccttt ggaccacacc 1860 acccctccag catggtcacc gccatgggtt agagccctgc tgatgctcac agggccccca 1920 gcgagagtcc ctgcagtccc tttcgacttg catttttgca ggagcagtat catgaagcct 1980 aaacgcgatg gatatatgtt tttgaaggca gaaagcaaaa ttatgcttgc cactttgcaa 2040 aggagctcac tgtggtgtct gtgttccaac cactgaatct ggaccccatc tgtgaataag 2100 ccattctgac tcatatcccc tatttaacag ggtctctagt gctgtgaaaa aaaaaaatgc 2160 tgaacattgc atataactta tattgtaaga aatactgtac aatgacttta ttgcatctgg 2220 gtagctgtaa ggcatgaagg atgccaagaa gtttaaggaa tatgggagaa atagtgtgga 2280 aattaagaag aaactaggtc tgatattcaa atggacaaac tgccagtttt gtttcctttc 2340 actggccaca gttgtttgat gcattaaaag aaaataaaaa aaagaaaaag agaaaagaaa 2400 aaaaaagaaa aaagttgtag gcgaatcatt tgttcaaagc tgttggcctc tgcaaaggaa 2460 ataccagttc gggcaatcag tgttaccgtt caccagttgc cattgagggt ttcagagagc 2520 ctttttctag gcctacatgc tttgtgaaca agtccctgta attgttgttt gtatgtataa 2580 ttcaaagcac caaaataaga aaagatgtag atttatttca tcatattata cagaccgaac 2640 tgttgtataa atttatttac tgctagtctt aagaactgct ttctttcgtt tgtttgtttc 2700 aatattttcc ttctctctca attttcgg 2728

Claims (18)

  1. a) 발현이 대조 세포의 발현에 비해 표적 세포에서 차이를 나타내는 리보 핵산 분자의 식별 단계;
    b) 단계 a)에서 리보핵산 분자에 결합하고 이 분자를 기능적으로 비활성화시키는 특이 리보핵산 분자의 설계 단계;
    c) 단계 b)의 특이 리보핵산 분자의 표적 세포로의 주입 단계;
    d) 단계 b)의 특이 리보핵산 분자 및/또는 단계 c)의 표적 세포의 의약품 제형화 단계를 포함하는 세포 및/또는 조직 및/또는 질환 단계 특이적 의약품의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적 세포는 전사인자를 갖는 세포 및/또는 호르몬 및/또는 사이토카인 및/또는 성장인자를 분비하는 세포 및/또는 전형적인 표면 수용체를 갖는 세포인 것이 특징인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 대조 세포는 표적 조직의 정상 세포 또는 동일한 환자의 다른 구역 유래의 온 동종 세포인 것이 특징인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 리보핵산 분자가 대조 세포의 발현에 비하여 표적 세포에서의 발현을 증가시키기 위해 분리되는 것이 특징인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 대조 세포의 발현에 비해 표적 세포에서 발현이 증가된 상기 리보핵산 분자는 STAT4, STAT5a, STAT1, c-Rel, CREB2, ATF-2, ATF-2, HIx, IRF-1, c-Maf, NFAT, NIP45, AP1, Mel-18, SKAT-2, CTLA-4, Src 키나아제, Tec 키나아제, Rlk(인체의 Txk), Itk, Tec, RIBP, PLCγ, MAP 키나아제, ERK, JNK, P38, MKK, MKK1, MKK2, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, Rac2, GADD45, GADD45β, GADD45γ, SOCS, CIS, SOCS1, SOCS2, SOCS3, JAK, JAK1, JAK3, NIP45 mRNA에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 대조 세포의 발현에 비하여 표적 세포에서 발현이 증가된 상기 리보핵산 분자는 GATA-3 mRNA인 것이 특징인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 대조 세포의 발현에 비하여 표적 세포에서 발현이 증가된 상기 리보핵산 분자는 T-bet mRNA인 것이 특징인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 특이 리보핵산 분자가 GATA-3 mRNA에 결합하여 이를 기능적으로 비활성화시키는 것이 RNA-비활성화성-DNA-효소(DNAzyme) 또는 소간섭-RNA(siRNA)인 것이 특징인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 특이 리보핵산 분자인 T-bet mRNA에 결합하여 이를 기능적 으로 비활성화시키는 것이 RNA-비활성화성-DNA-효소(DNAzyme) 또는 소간섭-RNA(siRNA)인 것이 특징인 방법.
  10. - 뉴클레오티드 서열 GGCTAGCTACAACGA가 결합된 모든 퓨린-피리미딘 접촉면에서 mRNA를 절단하는, 상기 서열을 포함하는 촉매성 영역,
    - 촉매성 영역의 3'-말단에 연결되는 우측 기질 결합 영역 및
    - 촉매성 영역의 5'-말단에 연결되는 좌측 기질 결합영역을 포함하며, 이러한 양측 기질 결합 영역이 두 개의 GATA-3 mRNA 구역에 대해 각각 상보적이며 따라서 이 영역이 mRNA와 교잡되는 것이 특징인, GATA-3 mRNA 분리에 특이적인 DNAzyme.
  11. 제10항에 있어서, 서열 hgd 40 GTGGATGGA GGCTAGCTACAA CGAGTCTTGGAG를 갖는 것을 특징으로 하는 DNAzyme.
  12. - 뉴클레오티드 서열 GGCTAGCTACAACGA가 결합된 모든 퓨린-피리미딘 접촉면에서 mRNA를 절단하는, 상기 서열을 포함하는 촉매성 영역,
    - 촉매성 영역의 3'-말단에 연결되는 우측 기질 결합 영역 및
    - 촉매성 영역의 5'-말단에 연결되는 좌측 기질 결합영역을 포함하며, 이러한 양측 기질 결합 영역이 두 개의 T-bet mRNA 구역에 대해 각각 상보적이며 따라서 이 영역이 mRNA와 교잡되는 것이 특징인, T-bet mRNA 분리에 특이적인 DNAzyme.
  13. 제12항에 있어서, 서열 td69 GGCAATGAA GGCTAGCTACAACGA TGGGTTTCT 또는 td70 TCACGGCAA GGCTAGCTACAACGA GAACTGGGT를 갖는 것이 특징인 DNAzyme.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 서열을 갖는 것이 특징인 DNAzyme.
  15. 제14항에 있어서, 상기 변형이 3'-말단에 역전된 티민 및/또는 5'-말단에 FAM 마킹을 갖는 것이 특징인 DNAzyme.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 DNAzyme 및 제약학적으로 수용가능한 운반체를 함유하는 의약품.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제약학적으로 수용 가능한 운반체는 리포좀 및 생물 분해가 가능한 폴리머의 그룹 유래인 것이 특징인 의약품.
  18. 제16항 또는 17항에 기재된 DNAzyme 함유 의약품을 만성 염증 반응 및 자가면역 질환의 치료에 이용하는 방법.
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