ES2320706T3 - Procedimiento para la produccion de un medicamento especifico para celulas y/o tejidos y/o fases de enfermedad. - Google Patents

Procedimiento para la produccion de un medicamento especifico para celulas y/o tejidos y/o fases de enfermedad. Download PDF

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Abstract

DNAzimas, caracterizadas porque ellas se componen de - un dominio catalítico con la secuencia de nucleótidos GGCTAGCTACAACGA o con una secuencia modificada que tiene un efecto biológico comparable, que corta al ARNm de T-bet en cada uno de los sitios de enlace de purina - pirimidina a los que está unido, - un dominio de fijación al substrato derecho, que sigue al extremo 3'' del dominio catalítico, y - un dominio de fijación al substrato izquierdo, que sigue al extremo 5'' del dominio catalítico, siendo los dos dominios de fijación al substrato en cada caso complementarios con dos regiones del ARNm de T-bet, de manera tal que ellos se hibridan con el ARNm, - son activas in vivo y - contienen la secuencia de td69 GGCAATGAA GGCTAGCTACAACGA TGGGTTTCT o de td70 TCACGGCAA GGCTAGCTACAACGA GAACTGGGT.

Description

Procedimiento para la producción de un medicamento específico para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad.
El presente invento se refiere a un procedimiento para la producción de un medicamento específico para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad, que es apropiado para el tratamiento de inflamaciones crónicas.
Antecedentes del invento
Las inflamaciones crónicas constituyen un círculo de problemas médicos cada vez más grande, con un alto impacto socioeconómico. Entre ellas se cuentan en particular los siguientes conjuntos de enfermedades:
-
enfermedades autoinmunitarias y enfermedades del círculo de formas reumáticas (manifestaciones, entre otros sitios, en la piel, los pulmones, los riñones, el sistema vascular, el sistema nervioso, el tejido conjuntivo, el aparato locomotor y el sistema endocrino)
-
reacciones alérgicas de tipo inmediato y asma
-
enfermedades pulmonares obstructivas crónicas (COPD)
-
arteriosclerosis
-
psoriasis y eccema por contacto
-
reacciones crónicas de rechazo después del trasplante de un órgano o de una médula ósea.
Muchas de estas enfermedades muestran en las últimas décadas una prevalencia creciente, no solamente en las naciones industriales, sino en parte por todo el mundo. Así, en Europa, América del Norte, Japón y Australia, entre tanto, más de un 20% de la población padece de enfermedades alérgicas y asma. Las enfermedades pulmonares obstructivas crónicas son en el momento actual causa de muerte más frecuente en quinto lugar por todo el mundo y según los cálculos de la WHO (Organización Mundial de la Salud) en el año 2020 constituirán la causa de muertes más frecuente en tercer lugar. La arteriosclerosis, con las enfermedades secuelas infarto cardiaco, ictus y enfermedad de obstrucción arterial periférica, ocupan en la estadística de morbidez y mortalidad por todo el mundo una posición dominante. La psoriasis y el eccema por contacto son, en general, conjuntamente con la neurodermitis, las enfermedades inflamatorias crónicas más frecuentes en la piel.
A causa de las interacciones, que hasta hoy en día se han entendido sólo insuficientemente, entre factores medioambientales y una disposición genética,se llega a regulaciones erróneas persistentes del sistema inmunitario. En este contexto se pueden establecer para estas diferentes enfermedades los siguientes principios comunes:
(A)
Se llega al desarrollo de una respuesta inmunitaria excesiva contra antígenos que normalmente son inocuos para los seres humanos. Estos antígenos pueden ser partes componentes del medio ambiente (p.ej. alergenos, tales como polen, pelos de animales, productos alimenticios, ácaros, sustancias químicas tales como sustancias conservantes, colorantes y agentes de limpieza). En estos casos se desarrolla en los pacientes una reacción alérgica. En el caso, p.ej., de fumadores activos y pasivos de cigarrillos se llega a enfermedades pulmonares obstructivas crónicas (COPD). Por otra parte, el sistema inmunitario, puede reaccionar, sin embargo, también contra ciertos componentes del propio organismo, reconocer a éstos como ajenos y poner en marcha una reacción inflamatoria contra ellos. En estos casos se desarrolla una enfermedad autoinmunitaria. En cualquier caso unos antígenos no tóxicos inocuos son reconocidos falsamente como ajenos o respectivamente peligrosos y se pone en marcha una desmesurada reacción inflamatoria.
(B)
Las enfermedades transcurren en fases, entre las que se cuentan la iniciación, la progresión, es decir el avance de la reacción inflamatoria, y la destrucción asociada con ello y la reconstrucción con pérdida de la funcionalidad del órgano (la denominada remodelación).
(C)
Las enfermedades muestran unas características de acentuamiento sub-fenotípicas, que son específicas para ciertos pacientes.
(D)
En los procesos de iniciación, mantenimiento y en los de destrucción y remodelación participan persistentemente ciertos componentes de la inmunidad congénita y adquirida. Bajo la influencia de la inmunidad congénita (componentes importantes: células que presentan antígenos con sus diversas poblaciones y el sistema de complemento) se llega a una activación y una diferenciación de las células del sistema inmunitario adaptable (componentes importantes: linfocitos T y B). Las células T toman a su cargo funciones primordiales en la evolución ulterior, al diferenciarse ellas en efectores altamente especializados. En este contexto ellas activan y adquieren determinados mecanismos de los efectores, entre los que se cuentan en particular las siguientes funciones: producción de anticuerpos, control de la funcionalidad de células efectoras del sistema inmunitario (tales como p.ej. granulocitos neutrófilos, basófilos y eosinófilos), retroacoplamiento a funciones del sistema inmunitario congénito, influjo sobre la funcionalidad de células no hematopoyéticas, tales como p.ej. las del epitelio, del endotelio, del tejido conjuntivo, de los huesos y de los cartílagos, y sobre todo células neuronales. En este contexto se llega a una interacción especial entre los sistemas inmunitario y nervioso, a partir de la cual se ha desarrollado el concepto de la interacción neuro-inmunológica en el caso de inflamaciones crónicas.
A causa de la complejidad y la multiplicidad de los cuadros patológicos, que acompañan a las inflamaciones crónicas, se deben establecer para un medicamento óptimo, destinado al tratamiento de las enfermedades, los siguientes requisitos:
(1)
Las enfermedades se manifiestan en (sub)-fenotipos que son específicos para ciertos pacientes. Por lo tanto, los medicamentos deben de presentar una alta especificidad para ciertos pacientes o respectivamente para ciertos casos.
(2)
Las enfermedades transcurren en estadios y fases. Los medicamentos deben de poseer, por lo tanto, una especificidad para ciertos estadios o respectivamente para ciertas fases.
(3)
Las enfermedades son reguladas por células diferentemente especializadas. Por lo tanto, los medicamentos deben de dar lugar a una intervención específica para ciertas células.
(4)
Las enfermedades se manifiestan en diferentes órganos y compartimientos. Por lo tanto, los medicamentos deben de poseer una especificidad para ciertos compartimientos o respectivamente para ciertos órganos.
(5)
Los medicamentos deben de ser apropiados para una terapia a largo plazo. Así, se deben de impedir reacciones del sistema inmunitario contra los medicamentos.
(6)
El perfil de efectos colaterales de los medicamentos debe de estar en una relación aceptable en los contextos medicinal y ético con el grado de gravedad, el pronóstico y la evolución de las enfermedades.
Ninguna de las terapias consagradas contra enfermedades crónicas, que hoy en día están disponibles, cumple de modo óptimo estos criterios. A partir del documento de patente alemana DE 695 11 245 T2 se conoce el tratamiento con una inmunoglobulina A y a partir del documento DE 695 18 667 T2 se conoce la inhibición de la fosfolipasa A_{2} (PLA_{2}) y/o de la transacilasa independiente de la coenzima A (CoA-IT). En el punto central de los conceptos terapéuticos hoy en día consagrados, se presentan para esta enfermedad la terapia anti-inflamatoria inespecífica, así como la supresión inmunitaria. Así, muchas de las sustancias que tienen un efecto anti-inflamatorio inespecífico, que se emplean, tales como ibuprofeno, ácido acetilsalicílico y paracetamol, o bien no son suficientemente eficaces o están vinculadas con una alta tasa de efectos colaterales indeseados. Los esteroides, por el contrario, tienen ciertamente una potencia más alta del efecto, pero ellos, por su parte, están vinculados con efectos colaterales graves, tales como hipertono, diabetes y osteoporosis. Los medicamentos supresores de inmunidad de la generación más reciente, tales como p.ej. la ciclosporina y el tacrolimus, muestran una toxicidad hepática y nefrológica.
Esta situación ha conducido a la búsqueda y a la prueba clínica de un gran número de más nuevas moléculas, que deben de intervenir más específicamente en las regulaciones erróneas inmunológicas y biológicas celulares. Entre ellas se cuentan las citocinas, los receptores de citocinas y las anti-citocinas. Los problemas, que están vinculados con estos más recientes enfoques terapéuticos, incluyen una defectuosa especificidad para ciertas células y ciertos órganos, el desarrollo de indeseadas reacciones inmunitarias contra estas moléculas, así como una defectuosa actividad en el caso de diferentes fenotipos.
En los últimos tiempos se está intentando emplear una nueva clase de moléculas catalíticas, las denominadas "DNAzimas" (Santoro, 1997) como agentes terapéuticos para la desactivación de unos genes, cuya expresión provoca enfermedades. Las DNAzimas son unas moléculas monocatenarias, que en principio se pueden fijar a zonas complementarias de los ARN y desactivan a éstas por disociación. El empleo específico de DNAzimas como agentes terapéuticos presupone, no obstante, que han de ser conocidos con mucha exactitud los genes causantes de las enfermedades y sus ARNm (mensajeros). Esto hasta ahora ocurre solamente en los casos de unas pocas enfermedades.
La DNAzima descrita en el documento de solicitud de patente internacional WO 01/11023A1 fija al mONA de RelA (p65) y por consiguiente está dirigida contra el factor de transcripción NF-\kappaB, y en el documento WO 00/42173 se divulga una DNAzima que fija al ARNm de EGR-1. El documento WO 99/50452 divulga una DNAzima 10-23 que se puede utilizar en un procedimiento de diagnóstico para el descubrimiento de mutaciones de ácidos nucleicos.
Ninguna de las moléculas antisentido y de las DNAzimas, que se conocen hasta el momento actual, se puede utilizar para la producción de un medicamento destinado al tratamiento de inflamaciones crónicas en pacientes.
Misión del invento
Es misión del presente invento poner a disposición unos medicamentos que sean específicos para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad, los cuales conduzcan a la desactivación funcional de moléculas de ácidos ribonucleicos de factores de transcripción y de factores de las rutas de transducción de señales, cuya expresión participa en la generación de reacciones inflamatorias crónicas y de enfermedades autoinmunitarias, y que sean apropiados para el tratamiento de reacciones inflamatorias crónicas y de enfermedades autoinmunitarias, habiendo sido eliminadas las desventajas expuestas en el estado de la técnica.
Además de esto es una misión del invento poner a disposición un procedimiento para la producción de medicamentos que sean específicos para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad, que identifique a moléculas de ácidos ribonucleicos de factores de transcripción y de factores de las rutas de transducción de señales, cuya expresión participa en la generación de reacciones inflamatorias crónicas y enfermedades autoinmunitarias, y las desactive funcionalmente en células dianas.
El problema planteado por esta misión se resuelve conforme al invento mediante unas DNAzimas específicas de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, y un medicamento, así como su utilización de acuerdo con las reivindicaciones 7 a 9.
La ventaja del invento consiste en una desactivación funcional de moléculas de ácidos ribonucleicos de factores de transcripción y de factores de las rutas de transducción de señales para la diferenciación y/o la expresión de citocinas, que participan en la generación de las reacciones inflamatorias crónicas y de las enfermedades autoinmunitarias mediante específicas/os DNAzimas y/o siRNA. Esta estrategia se distingue con respecto a los enfoques convencionales, pero también con respecto a los enfoques terapéuticos génicos, por unas elevadísimas especificidades y selectividades para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad, por una alta estabilidad de las moléculas y por una antigenicidad despreciable. Se proporcionan las premisas óptimas para una terapia a largo plazo desarrollada a medida en los casos de pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas.
Otros detalles y otras ventajas preferentes del presente invento son observables a partir de las siguientes Figuras y de la memoria descriptiva. En ellas, muestran
La Fig. 1: Una representación esquemática de la transducción de señales en el caso de la diferenciación de células CD4^{+} para dar una célula TH1 o respectivamente TH2 (modificada de acuerdo con Ho I.C. y Glimcher L.H., Cell 2002; 109: S109-S120).
La Fig. 2: La secuencia de nucleótidos del dominio catalítico de la DNAzima 10-23 y la fijación a un ARN diana mediante un apareamiento según Watson-Crick (R = A o G; Y = U o C, N = A, G, U o G). La flecha indica el sitio de disociación en el ARNm diana.
La Fig. 3: Una agrupación (pool) de moléculas de ácidos ribonucleicos específicos según la etapa b), en particular de las DNAzimas td 1 hasta td 70 contra T-bet y sus secuencias de ácidos nucleicos (A = adenina, G = guanina, C = citosina, T = timina).
La Fig. 4: Las secuencias de nucleótidos de genes T-bet humanos en la alineación
Secuencia 1:
T-bet humano procedente del banco de datos Nº.: NM_013351.
Secuencia 2:
T-bet humano (secuenciado a partir de SK de pBluescript).
Las bases divergentes están provistas de un fondo gris. Las localizaciones de cebadores para la clonación de T-bet están subrayadas. Las localizaciones de cebadores para la cuantificación relativa en el LightCycler están contorneadas. La localización de las DNAzimas td54 y td69 está al mismo tiempo provista de un fondo gris y subrayada, además la td70 está resaltada en letras escritas en negrita (A = adenina, G = guanina, C = citosina, T= timina).
La Fig. 4A: La secuencia de nucleótidos 1 del gen T-bet de la Figura 4, en ella están dibujados como provistos de un fondo gris en cada caso los pares de nucleótidos GT y AT, entre los cuales se encuentran unos sitios adicionales de corte con DNAzimas.
La Fig. 5: Una electroforesis en gel muestra la disociación de un ARNm diana (aquí un ARNm de T-bet) con moléculas de ácidos ribonucleicos específicos según la etapa b), aquí DNAzimas modificadas [(td54m (pista 3), td69m (pista 4) y td70rn (pista 5)]. Las DNAzimas modificadas (0,25 \muM) se incuban durante 30 min a 37ºC con un ARNm de T-bet (0,025 \muM) transcrito in vitro, en un volumen de 10 \mul con la siguiente composición de reacción: 50 mM de Tris de pH 7,4, 150 mM de NaCl, 10 mM de MgCl_{2}. A continuación, los productos se separan mediante una electroforesis en gel. La pista M contiene un patrón de longitudes de 3.000 bases y 2.000 bases llevado a cabo conjuntamente, la pista 2 contiene como testigo un ARNm sin la adición de una DNAzima. La flecha A apunta hacia la banda con un substrato (aquí un ARNm de T-bet). La flecha B apunta hacía el producto de disociación de mayor tamaño. El segundo producto de disociación es más pequeño y ya no se presenta en esta reproducción.
La Fig. 6: Cualificación de las cantidades de los ARNm de T-bet y de GAPDH en el LightCycler (Ciclador luminoso), a partir de células tratadas con las DNAzimas td54 (A), td69 (B) y td70 (C). Unas células Jurkat E6.1 se transfectan dos veces con un intervalo de 24 h, o bien con las DNAzimas td54 (A), td69 (B) y td70 (C) que son específicas para T-bet o con una DNAzima sin sentido como testigo (no representada). A continuación se purifica el ARN, se lleva a cabo una transcripción inversa y el ADN obtenido se introduce en el LightCycler. Como patrón interno sirve la GAPDH (curvas de trazos). Se muestran en cada caso determinaciones cuádruples (en 4 veces) de células tratadas con DNAzimas específicas para T-bet o con la DNAzima sin sentido. Las curvas de línea continua muestran la cantidad de T-bet en las células tratadas con DNAzimas específicas para T-bet, y las líneas de puntos muestran la cantidad de T-bet en las células tratadas con una DNAzima sin sentido.
Fig. 7: Diagrama de la cuantificación relativa de un ARNm de T-bet en células Jurkat E6.1.
Unas células Jurkat E6.1 se transfectan dos veces con las DNAzimas específicas para T-bet td54, td69 y td70, y se aísla el ARN después de 48 h. Después de una transcripción inversa, la cantidad de ARNm se determina mediante el LightCycler. Como testigo sirve una DNAzima sin sentido. La cuantificación relativa de los ARNm del T-bet y de GAPDH se efectúa de acuerdo con las instrucciones [descritas en el User Bulletin #2 [Boletín del usuario nº 2] (ABI Prism 7700 Sequence detection System User [Sistema de detección de secuencias] Bulletin #2 (2001). Cuantificación relativa de la expresión de genes.
Http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf)]
En este caso la cantidad de ARNm de T-bet procedente del experimento testigo con una DNAzima sin sentido, se equipara a 100%.
La Figura 1 muestra en una representación esquemática modificada según Ho I.C. y Glimcher L.H.-(Cell 2002; 109: S109-S120) las conexiones de la transducción de señales en el caso de la diferenciación de células CD4^{+} para dar una célula TH1 o respectivamente TH2. La estimulación a través del receptor de células T mediante el correspondiente complejo de péptido y MHC, induce la expansión clonal y la diferenciación programada de linfocitos T CD4^{+} para dar células cooperantes T [del inglés T Helper (TH)] TH1 o TH2. La diferenciación de estos dos subtipos se efectúa basándose en sus perfiles de citocinas. Las células TH1 producen interferón \gamma (INF\gamma), interleucina 2 (IL-2) y el factor \beta de necrosis de tumores, mientras que, por el contrario, las células TH2 segregan IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13. Unas infecciones bacterianas y víricas inducen una respuesta inmunitaria, que es dominada por células TH1. Por el otro lado, las células TH2 regulan la producción de IgE contra parásitos. En este caso existe un equilibrio entre células TH1 y TH2. La destrucción de este equilibrio provoca enfermedades, así, una respuesta excesiva de células TH1 está asociada con enfermedades autoinmunitarias, mientras que para las enfermedades alérgicas se presenta como fundamento una respuesta aumentada de células TH2.
Es conocido que las citocinas de TH1 están implicadas en la patogénesis de enfermedades autoinmunitarias tales como p.ej. uveítis autoinmunitarias, encefalomielitis alérgica experimental, diabetes mellitus del tipo 1 o la enfermedad de Crohn, mientras que las citocinas de TH2 (IL A, IL-5, IL-13 o respectivamente IL-9) participan en la generación de enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias, tales como p.ej. eosinofilia de las vias respiratorias, hipersecreción de mucosidad e hiperreactividad de las vías respiratorias. El fundamento de estas enfermedades son unas alteraciones patofisiológicas durante la producción de citocinas características mediante células TH que son específicas para antígenos. Así, unos ratones transgénicos, que sobreexpresan constitutivamente en los epitelios de las vías respiratorias las citocinas de TH2 IL-4, IL-5, IL-13 o respectivamente IL-9, muestran unas reacciones inflamatorias alérgicas típicas. Unas subpoblaciones de células TH2 en los pulmones y en las vías respiratorias provocan en células TH2, en un modelo con animales, los síntomas característicos del asma bronquial.
De modo sorprendente se encontró que para el tratamiento específico para células y/o tejidos de inflamaciones crónicas y/o de enfermedades autoinmunitarias, son apropiados de una manera ideal unos factores de transcripción y unos factores de las rutas de transducción de señales para la diferenciación y/o la expresión de citocinas, que participan en la generación de las reacciones inflamatorias crónicas y de enfermedades autoinmunitarias, tales como p.ej. el factor de transcripción T-bet, que es específico para células TH1, y el factor de transcripción GATA-3, que es específico para células TH2.
El factor de transcripción T-bet, que es específico para células TH1, es responsable sobre todo de la diferenciación de células T CD^{+} naives (ingenuas) para dar células TH1. Su expresión es controlada a través de las rutas de transducción de señales del receptor de células T (TZR) y a través del complejo de receptor de INF\gamma/STAT1. El T-bet transactiva al gen endógeno de INF\gamma e induce la producción de INF\gamma. Además de esto, él induce la regulación en sentido ascendente de la expresión de proteínas de cadenas de IL-12R\beta2 y conduce a la remodelación con cromatina de alelos individuales de INF\gamma. La función in vivo del T-bet es confirmada en ratones Knock-Out (es decir desactivados para expresión) (T-bet^{-/-}). Aún cuando los ratones deficientes en T-bet presentan un desarrollo normal de linfocitos, las células T CD4^{+} procedentes de estos ratones no producen nada de INF\gamma, ni sobre la estimulación con anti-CD3/CD28 ni con PMA/ionomicina. Los ratones deficientes en T-bet no muestran ninguna respuesta inmunitaria contra una infección causada por L. major, y la cantidad de citocinas de TH2 es aumentada. Se conoce la función de un T-bet en células T mucosales en el caso de la generación de enfermedades intestinales inflamatorias. Unas investigaciones en un modelo con animales muestran un empeoramiento de la colitis en ratones con SCID (acrónimo de Severe Combined Immunodeficiency = inmunodeficiencia combinada grave) reconstituidos después de una transducción retrovírica de T-bet en células T CD4^{+}CD26L^{+}, a la inversa la transferencia de células T deficientes en T-bet no conduce a ninguna inducción de colitis.
El factor de transcripción T-bet induce específicamente el desarrollo de células TH1 y controla la producción de INF\gamma en estas células. Mediante la inhibición del T-bet, el equilibrio entre células TH1 y TH2 se desplaza en favor de las células TH2.
Otros factores de transcripción, que desempeñan un cierto cometido en la diferenciación para dar células TH1 o respectivamente TH2 y que participan en la generación de las reacciones inflamatorias crónicas y de las enfermedades autoinmunitarias, presentan una expresión en una célula diana que se diferencia en comparación con la expresión de una célula testigo, y se emplean conforme al invento asimismo para el diseño de específicas/os DNAzimas y/o siRNA para el empleo terapéutico en el caso de enfermedades inflamatorias crónicas:
\bullet
STAT4, STAT5a und STAT1 (acrónimo de signal transducer and activator of transcription = transductor de señales y activador de la transcripción)
\bullet
c-Rel
\bullet
CREB2 (acrónimo de cAMP response element-binding protein 2 = proteína 2 que se fija a elementos de respuesta a cAMP)
\bullet
ATF-2, ATF-2
\bullet
Hlx
\bullet
IRF-1 (acrónimo de interferon regulatory factor-1 = factor 1 regulador de interferón)
\bullet
c-Maf
\bullet
NFAT (acrónimo de Nuclear factor of activated T cells = factor nuclear de células T activadas)
\bullet
NIP45 (acrónimo de NF-AT interacting protein 45 = proteína interactiva con NFAT 45)
\bullet
AP1 (acrónimo de Activator Protein 1 = proteína activadora 1)
\bullet
Mel-18
\bullet
SKAT-2 (acrónimo de SCAN box, KRAB domain associated with a Th2 phenotype = caja SCAN, dominio KRAB asociado con un fenotipo de Th2))
\bullet
CTLA-4 (acrónimo de Cytolytic T lymphocyte-associated antigen 4 = antígeno 4 asociado con linfocitos T citolíticos).
Otros factores de las rutas de transducción de señales, que son responsables de la diferenciación y/o expresión de citocinas, y que participan en la generación de las reacciones inflamatorias crónicas y de las enfermedades autoinmunitarias, presentan una expresión en una célula diana que se diferencia en comparación con la expresión de una célula testigo, y se emplean conforme al invento asimismo para el diseño de específicas/os DNAzimas y/o siRNA para el empleo terapéutico en el caso de enfermedades inflamatorias crónicas.
\bullet
Src kinase = cinasa de Src
\bullet
Tec kinase = cinasa de Tec
Rlk (Txk en seres humanos)
Itk
Tec
\bullet
RIBP (acrónimo de Rlk/Itk-binding protein = proteína que se fija a Rlk/Itk)
\bullet
PLC\gamma (acrónimo de phospholipase C\gamma1)
\bullet
MAP (acrónimo de Mitogen-activated protein kinase = cinasa de la proteína activada por mitógenos)
ERK
JNK
P38
\bullet
MKK (acrónimo de MAP kinase kinase = cinasa de cinasa de MAP)
MKK1
MKK2
MKK3
MKK4
MKK6
MKK7
\bullet
Rac2
\bullet
GADD45 (acrónimo de Growth arrest and DNA damage gene 45 = gen 45 de detención del crecimiento y de daño para el ADN)
GADD45\beta
GADD45\gamma
\bullet
SOCS (acrónimo de Suppressors of cytokine signalling = supresores de la señalización de citocinas)
\bullet
CIS (acrónimo de Cytokine-induced SH2 protein = proteína SH2 inducida por citocinas)
SOCS1
SOCS2
SOCS3
\bullet
JAK (acrónimo de Janus kinase cinasa de Janus)
JAK1
JAK3
\bullet
NIP45 (acrónimo de NF-AT interacting protein = proteína 45 que interactúa con el NFAT)
Conforme al invento se pone a disposición un medicamento que es específico para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad, el cual es apropiado para el tratamiento de enfermedades crónicas.
El medicamento interviene preferentemente en los puntos de intervención de la cascada compleja de las regulaciones erróneas inmunológicas y biológicas celulares que se presentan como fundamento de las reacciones inflamatorias crónicas y de las enfermedades autoinmunitarias. De manera especialmente preferida, éstos son unos puntos de intervención de la regulación de la diferenciación de los factores de transcripción participantes, tales como por ejemplo el factor de transcripción T-bet, que es específico para células TH1. El efecto terapéutico conseguido consiste en una desactivación funcional de moléculas de ARNm mediante específicas/os DNAzimas y/o siRNA. Esta estrategia ofrece una serie de ventajas frente a enfoques convencionales, pero también terapéuticos génicos: unas elevadísimas especificidades y selectividades, una alta estabilidad de las moléculas y una antigenicidad despreciable. Se proporcionan las premisas óptimas para una terapia a largo plazo ajustada a medida en el caso de pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas.
Conforme al invento se pone a disposición un procedimiento para la producción de un medicamento específico para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad, que comprende las siguientes etapas:
a)
La identificación de moléculas de ácidos ribonucleicos, cuya expresión en una célula diana se diferencia en comparación con la expresión en una célula testigo
b)
El diseño de moléculas de ácidos ribonucleicos específicos, que se fijan a moléculas de ácidos ribonucleicos procedentes de la etapa a) y las desactivan funcionalmente
c)
La incorporación de las moléculas de ácidos ribonucleicos específicos, procedentes de la etapa b), en células dianas
d)
La formulación de las moléculas de ácidos ribonucleicos específicos procedentes de la etapa b) y/o de una célula diana procedente de la etapa c), en un medicamento.
El concepto de "específico para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad" significa, en el sentido del presente invento, el hecho de que el medicamento, producido mediante el procedimiento conforme al invento, es eficaz en lo esencial solamente en el caso de un determinado tipo de células (células dianas) y/o en determinados tejidos u órganos y/o en determinadas fases de la enfermedad, y posee una influencia despreciable sobre otras células (células testigos), otros tejidos u otros órganos. De manera preferida, el medicamento es eficaz en el caso de por lo menos 2/3 de las células dianas. De manera más grandemente preferida es eficaz en por lo menos un 80% y de una manera sumamente preferida en por lo menos un 98% de las células dianas. Además, se prefiere que el medicamento sea eficaz en el caso de a lo sumo 10% de las células testigos, de manera más grandemente preferida en el caso de a lo sumo 5% y de una manera sumamente preferida en el caso de < 1% de las células testigos.
El concepto de "identificación de moléculas de ácidos ribonucleicos, cuya expresión en una célula diana se diferencia en comparación con la expresión en una célula testigo" comprende en el presente invento los siguientes puntos:
i)
Las células dianas son células presentes en tejidos y órganos que, tal como es conocido, conducen a la generación de una enfermedad, contribuyen a ella o refuerzan a ésta, que mantienen procesos que conservan la enfermedad, contribuyen a ellos o refuerzan a éstos, o respectivamente que conducen a secuelas tardías de una enfermedad, contribuyen a ellas o las refuerzan. Entre éstas se cuentan por ejemplo unas células, que tienen determinados factores de transcripción, segregan hormonas, citocinas y factores de crecimiento específicas/os, o unas células con receptores superficiales típicos.
ii)
Las células dianas pueden ser aisladas por ejemplo mediante unas tecnologías, que se basan en la fijación de anticuerpos específicos. Aquí se utilizan unas perlas magnéticas (en inglés magnetic beads) obtenibles de la entidad Miltenyi (Macs-System), Dynal (DynaBeads) o BD-Bioscience (iMAG). Alternativamente, esto se efectúa a través de una purificación de las células mediante anticuerpos marcados por fluorescencia en dispositivos clasificadores de células, por ejemplo de la entidad Cytomation (MOFLO) o BD-Bioscience (FACSVantage). La pureza de las células dianas está situada de manera preferida en por lo menos un 80%, de manera más grandemente preferida en por lo menos un 95% y de manera sumamente preferida en por lo menos un 99%.
iii)
Unos procedimientos para el aislamientos de los ARN se describen p.ej. en las citas de Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio], 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory (2001), Nueva York, y de Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos actuales en biología molecular], John Wiley & Sons (1998), Nueva York. Además es posible para un experto con conocimientos medios utilizar para el aislamiento de los ARN unos estuches disponibles comercialmente (de la tecnología de la sílice) p.ej. el RNeasy Kit de la entidad Qiagen. Además se prefiere purificar directamente un ARNm procedente de las células diana mediante la utilización de estuches comerciales, por ejemplo de las entidades Qiagen (Oligotex mRNA Kit), Promega (PolyATract mRNA Isolation System = sistema de aislamiento de ARNm poliAtract) o Miltenyi (mRNAdirect).
iv)
La identificación de los ARNm's que son distintos diferencialmente, es decir los ARNm's cuya expresión en las células diana ha aumentado en comparación con la célula testigo, se efectúa por ejemplo con chips génicos adquiridos comercialmente (p.ej. MWG, de CLONTECH)] o con un procedimiento de hibridación en filtros (p.ej. de Unigene) de acuerdo con los datos de los fabricantes. Alternativamente se producen ARNm's diferenciales mediante una hibridación substractiva de los ADNc (ADN cromosomales) que han resultado previamente a partir de los ARNm mediante una reacción con RT (acrónimo de Reverse Transcriptase = transcriptasa inversa). Entre estos procedimientos conocidos para un experto en la especialidad se cuentan por ejemplo el método SSH (de la entidad Clontech) o el método RDA. A una forma de utilización asimismo preferida pertenece la combinación de una tecnología de chips y de una hibridación substractiva. La identificación de los genes expresados diferencialmente se efectúa mediando empleo de la tecnología de los chips con ayuda de programas obtenibles comercialmente, p.ej. con el programa Vector Xpression de la entidad InforMax. En el caso del empleo de una hibridación substractiva, después del aislamiento de los genes expresados diferencialmente con ayuda de procedimientos habituales, que son usuales para un experto en la especialidad, tales como clonación y subsiguiente secuenciación (véanse p.ej. las citas de Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory (2001), Nueva York, y de Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998), Nueva York), se efectúa una compensación de secuencias en un banco de datos tal como p.ej. el banco de genes (www.ncbi.nlm.nih.gov).
La expresión en la célula diana se diferencia en comparación con la expresión en una célula testigo. En una forma de realización del procedimiento conforme al invento, la expresión en la célula diana ha aumentado en comparación con la expresión en una célula testigo, de manera preferida por lo menos en un factor de 1,5. En una forma de realización especialmente preferida, la expresión en la célula diana en comparación con la expresión en una célula testigo ha aumentado en por lo menos un factor de 5, y en una forma de realización preferida en la mayor parte de los casos, la expresión es detectable solamente en la célula diana, pero no en la célula testigo.
El concepto de "diseño de moléculas de ácidos ribonucleicos, que se fijan a moléculas de ácidos ribonucleicos procedentes de la etapa a) y las desactivan funcionalmente" comprende, en el sentido del presente invento, la utilización de enzimas de ADN (DNAzimas) que desactivan a los ARN, y/o de ARN interferidores pequeños (siRNA de small interfering RNA), que desactivan funcionalmente a moléculas de ácidos ribonucleicos.
El concepto de DNAzimas comprende en este caso, conforme al invento, unas moléculas de ADN, que reconocen específicamente y disocian a la secuencia diana del ácido nucleico, tanto de un ADN como también de un ARN.
Un modelo general de DNAzimas lo constituye el modelo "10-23". Las DNAzimas del modelo 10-23 - también designadas como "DNAzimas 10-23" - poseen un dominio 25 catalítico de 15 ácidos desoxirribonucleicos, que es flanqueado por dos dominios de fijación a substratos. La longitud de los dominios de fijación a substratos es variable, ellos son o bien iguales o de diferente longitud. En una forma de realización preferida, la longitud de los dominios de fijación a substratos está situada entre 6 y 14 nucleótidos.
En una forma de realización especialmente preferida, los dominios de fijación a substratos son totalmente complementarios con respecto a la región, que flanquea al sitio de disociación. Con el fin de fijar a los ARN dianas y disociarlos, la DNAzima, sin embargo, no debe ser indispensablemente complementaria por completo. Unas investigaciones in vitro muestran que las DNAzimas del tipo 10-23 disocian al ARNm diana en secuencias con la sucesión de purina - pirimidina.
Con el fin de utilizar las DNAzimas en el tratamiento de enfermedades, se prefiere que las DNAzimas sean estabilizadas lo mejor que sea posible contra la degradación en el cuerpo (en la sangre, en el medio intracelular, etc). Una forma de realización preferida es la introducción de una inversión 3'-3' junto a uno o varios extremos de la DNAzima. El concepto de la inversión 3'-3' designa a un enlace covalente de fosfato entre los carbonos 3' del nucleótido terminal y del nucleótido colindante. Este tipo de enlace está en contraposición con el enlace normal de fosfato entre los carbonos 3' y 5' de nucleótidos que se suceden unos a otros. De modo correspondiente, se prefiere que el nucleótido situado junto al extremo 3' sea inverso con respecto del dominio de fijación al substrato que colinda con el extremo 3' del dominio catalítico. Adicionalmente a las inversiones, las DNAzimas pueden contener nucleótidos o compuestos de nucleótidos modificados. Los nucleótidos modificados contienen p.ej. compuestos de N3'-P5'-fosforamidato, sustituciones con 2'-O-metilo y compuestos de péptidos y ácidos nucleicos. Sun preparación es habitual para un experto en la especialidad.
Aunque los sitios potenciales de corte con DNAzimas se presentan ubicuamente, éstos con frecuencia están bloqueados por medio de la estructura secundaria de los ARN y por consiguiente son inaccesibles para la DNAzimas. Por lo tanto, a partir de una agrupación (pool) de DNAzimas se seleccionan las que son libremente accesibles a sus sitios de corte. Estas DNAzimas seleccionadas son activas, disocian al ARNm diana y lo desactivan por consiguiente funcionalmente. La eficiencia de la disociación de los ARNm mediante las DNAzimas individuales es mostrada o bien mediante ensayo individual de cada una de las DNAzimas o mediante ensayo acoplado de varias DNAzimas en "ensayos Multiplex" (descritos p.ej. en la cita de Cairns y colaboradores, 1999).
El concepto de siRNA comprende unas moléculas de ARN bicatenarias con una longitud de 21-23 bases, que conducen a una degradación específica de los ARNm's dianas complementarios tanto in vitro como también in vivo. Es conocido para un experto en la especialidad con ayuda de la bibliografía (p.ej. http://www.mpibpc.gwdg.de/abteilungen/
100/105/index.html), producir moléculas de siRNA, partiendo de la secuencia del ARNm diana.
La probabilidad de que entre tres moléculas de siRNA seleccionadas se encuentre por lo menos una que sea muy activa (inhibición del ARN diana en por lo menos un 80%) se indica en la bibliografía con un valor de por lo menos 70%. Si a partir de una agrupación de moléculas de siRNA se seleccionan las que conducen a una degeneración específica del ARNm diana complementario tanto in vitro como también in vivo.
El concepto de "incorporación de las moléculas de ácidos ribonucleicos específicos procedentes de la etapa b) en células dianas" comprende en el sentido del presente invento la transfección de vectores, en particular de plásmidos, cósmidos, virus o bacteriófagos, que contienen las moléculas de ácidos ribonucleicos específicas conformes al invento, que más arriba se han descrito, en las células diana. De manera preferida, los vectores son apropiados para la transformación de células animales y humanas y permiten la integración de las moléculas de ácidos ribonucleicos conformes al invento. Unos procedimientos para la transfección, tales como p.ej. la lipofección mediante el DMRIE-C de la entidad Invitrogen, son conocidos para un experto en la especialidad a partir de la bibliografía. Fundamentalmente son apropiados para ello también unos vectores liposomales. Las moléculas dianas son factores de transcripción, células que segregan hormonas, citocinas y factores del crecimiento, pero también células que llevan sobre la superficie los receptores expresados.
Como células testigos en el sentido del invento se hace uso de células sanas del tejido diana, células de igual tipo procedentes de otros compartimientos del mismo paciente o también procedentes de individuos sanos.
La cultivación de la célula diana se efectúa en unos medios nutritivos, que están adaptados de manera correspondiente a las necesidades de la célula diana según el valor del pH, la temperatura, la concentración de sales, antibióticos, vitaminas, elementos trazas y aireación.
El concepto de paciente se refiere de igual manera a seres humanos y animales vertebrados. Por consiguiente, el medicamento se puede utilizar en las medicinas humana y veterinaria.
El concepto de "formulación de las moléculas de ácidos ribonucleicos específicos procedentes de la etapa b) o de una célula diana procedente de la etapa c) en un medicamento" comprende unas composiciones que son farmacéuticamente aceptables, las cuales contienen modificaciones y profármacos (en inglés "prodrugs"), siempre y cuando que ellas no provoquen, después de una valoración médica confiable, ninguna toxicidad excesiva, ni irritaciones ni tampoco reacciones alérgicas en un paciente. El término "profármaco" se refiere a compuestos que son transformados para el mejoramiento de la ingestión, tal como por ejemplo mediante hidrólisis en la sangre.
De manera preferida, la formulación hace posible que las moléculas de ácidos ribonucleicos específicos sean administradas a los pacientes en forma de una composición farmacéuticamente aceptable, o bien por vía oral, rectal, parenteral, intravenosa, intramuscular o subcutánea, o intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, intratecal, intravascular, local (polvos para espolvorear, pomadas o gotas) o en una forma para atomización (en inglés "spray").
Las formas de dosificación para la administración local del medicamento de este invento incluyen pomadas, polvos para espolvorear, formulaciones de atomización o agentes de inhalación. El componente activo se mezcla en condiciones estériles con una sustancia de vehículo fisiológicamente aceptable y con posibles agentes conservantes, tampones o agentes de expansión, según sean las necesidades.
El tipo de la dosificación es determinado por el médico que realiza el tratamiento, de un modo correspondiente a los factores clínicos. Es conocido para un experto en la especialidad que el tipo de la dosificación es dependiente de diferentes factores, tales como p.ej. el tamaño corporal, el peso, la superficie corporal, la edad, el sexo, o la salud general del paciente, pero también del agente que se ha de administrar especialmente, de la duración y del tipo de la administración y de otros medicamentos que se administren posiblemente de modo paralelo.
El medicamento producido con el procedimiento conforme al invento, tiene una alta especificidad para pacientes, enfermedades, estadios o respectivamente fases. Él produce una intervención específica para ciertas células y es específico para ciertos compartimientos y órganos. No resulta ninguna reacción, o resultan solo muy pequeñas reacciones, del sistema inmunitario contra el medicamento, y el perfil de efectos colaterales está en una relación aceptable con el grado de gravedad, el pronóstico y la evolución de la enfermedad.
El medicamento se puede administrar para la terapia contra todos los conjuntos de enfermedades que van acompañadas por inflamaciones crónicas, tales como p.ej. enfermedades autoinmunitarias, enfermedades del círculo de formas reumáticas (manifestaciones, entre otros sitios, en la piel, los pulmones, los riñones, el sistema vascular, el sistema nervioso, el tejido conjuntivo, el aparato locomotor y el sistema endocrino), reacciones alérgicas de tipo inmediato y asma, enfermedades pulmonares obstructivas crónicas (COPD), arteriosclerosis, psoriasis y un eccema por contacto, así como contra reacciones crónicas de rechazo después del trasplante de un órgano y de una médula ósea.
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Ejemplo a) Identificación de moléculas de ácidos ribonucleicos, cuya expresión en una célula diana se diferencia en comparación con la expresión en una célula testigo
i) Como células dianas se utilizan las células CD4^{+} naives (ingenuas) que son responsables de la generación de reacciones inflamatorias crónicas.
ii) Las células dianas CD4^{+} se aíslan sobre perlas magnéticas (de las entidades Miltenyi (sistema Macs-System), Dynal (DynaBeads) o BDBioscience (iMAG), alternativamente mediante anticuerpos marcados por fluorescencia en dispositivos clasificadores de células, por ejemplo de las entidades Cytomation (MOFLO) o BD-Bioscience (FACS-Vantage).
iii) El aislamiento de los ARN se efectúa de acuerdo con un método clásico, véanse Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory (2001), Nueva York y Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998), Nueva York.
Alternativamente, se utiliza un estuche RNeasy Kit de la entidad Qiagen, o se efectúa un aislamiento directo del ARNm a partir de células diana CD4^{+} con el estuche de ARNm Oligotex mRNA Kit de las entidades Qia-20 gen, de acuerdo con los datos del fabricante.
iv) La identificación de los ARNm's, que son distintos diferencialmente, es decir los ARNm's cuya expresión en la célula diana ha aumentado en comparación con la célula testigo, se efectúa mediante chips génicos (p.ej. MWG, CLONTECH), y la identificación de los genes expresados diferencialmente se efectúa mediante un programa Vector Xpression de la entidad Infor-Max.
Los procedimientos de hibridación en filtros (p.ej. de Unigene) se efectúan de acuerdo con los datos del fabricante. Al aislamiento de los genes expresados diferencialmente le siguen una clonación, una secuenciación (de acuerdo con prescripciones clásicas, véase p.ej. Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory (2001), y la compensación de secuencias en el banco de datos de genes (www.ncbi.nlm.nih.gov).
La expresión de T-bet en la célula diana (célula Th1) se diferencia en comparación con la expresión en una célula testigo (por ejemplo una célula Th0).
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b) Diseño de moléculas de ácidos ribonucleicos específicos, que se fijan a moléculas de ácidos ribonucleicos procedentes de la etapa a) y las desactivan funcionalmente
La Figura 3 muestra la agrupación de las td1 - td78, conforme al invento, de DNAzimas específicas contra un ARNm de T-bet. La DNAzimas tienen una longitud total de 33 nucleótidos, correspondiendo el dominio catalítico central a base de 15 nucleótidos (en letras minúsculas) al dominio catalítico de la conocida DNAzima 10-23 (Figura 2). Este dominio catalítico es flanqueado por dos dominios de fijación de fijación al substrato, derecho e izquierdo, que se componen en cada caso de 9 nucleótidos (en letras mayúsculas). La secuencia de nucleótidos de los dominios de fijación al substrato, derecho e izquierdo, es diferente y varía en los casos de las DNAzimas td1 hasta td78, de manera tal que se efectúa una fijación diversamente específica mediante un apareamiento según Watson-Crick al ARNm de T-bet.
La Figura 2 muestra el modelo general para la fijación de la DNAzima 10-23 a un ARN diana arbitrario marcado en N, apuntando la flecha hacia el sitio de disociación en el ARNm diana.
Puesto que a partir de la bibliografía es conocido que las DNAzimas disocian más efectivamente al ARNm diana con enlaces de purina - uracilo que a los enlaces de purina - citosina, se construyen preferiblemente 5 DNAzimas que disocian enlaces de purina - uracilo.
El modelo mostrado en la Figura 2 puede ser transferido en su modo de funcionamiento a la fijación de las DNAzimas td1 hasta td78 a un ARNm de T-bet.
Las DNAzimas td1 hasta td78 se emplean en estado sin modificar para ensayos in vitro, para ensayos en un cultivo celular provisto de modificaciones (adquirido comercialmente de la entidad Eurogentec).
Como modificaciones para la estabilización y la protección se emplean:
1)
Una timidina inversa estabilizadora situada en el extremo 3'
2)
una marcación con FAM en el extremo 5' para la valoración de la eficiencia de transcripción de las células mediante un análisis por FACS.
Para la representación de las propiedades de disociación de las DNAzimas y la desactivación funcional de los ARNm diana de los ARNm de T-bet se efectúa una transcripción in vitro de los ARNm de T-bet procedentes de EDTA - sangre entera humana mediante un mini-estuche QlAamp-RNA-Blood-Mini-Kit (de Qiagen, Alemania) de acuerdo con los datos del fabricante.
La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos de un T-bet humano, como se puede deducir de los registros en los bancos de datos [PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi? db = nucleótidos)] Nº: NM_013351, secuencia 1.
La transcripción inversa se efectúa
con el cebador de avance CGGCCCGCTGGA-GAGGAAGC y
con el cebador inverso CACACACCCACACACAACC de acuerdo con una prescripción patrón (ThermoScript de Invitrogen), siendo amplificado un producto de PCR [de Polymerase Chain Reaction = reacción en cadena de la polimerasa] con una longitud de 2.450 nucleótidos. Este producto de PCR es clonado mediante procedimientos clásicos en el plásmido pBluescript-SK (de Stratagene) y es secuenciado para la comprobación.
La Figura 4 muestra una comparación de la secuencia de T-bet Nº: NM_013351 (Secuencia 1) y de la secuencia secuenciada (Secuencia 2). En este caso se muestra que ambas secuencias no son totalmente idénticas, sino que se han intercambiado bases individuales. La Secuencia 2 de ácido nucleico del T-bet procedente de la Figura 4 forma en este invento el fundamento para la construcción de DNAzimas contra un ARNm de T-bet.
La Figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos de la Secuencia 1 del gen de T-bet humano procedente de la Figura 4 y allí están dibujados como provistos de fondo gris en cada caso dos nucleótidos GT o respectivamente AT, entre los cuales están situados otros sitios potenciales de corte con DNAzimas.
La producción de un ARNm de T-bet se efectúa después de una linealización del plásmido pBluescript-SK que contiene T-bet, por disociación con la enzima de restricción Xba I (de Fermentas) y mediante una transcripción in vitro de acuerdo con los datos del fabricante (Ambion). El ARNm de T-bet se presenta con una longitud de 2.550 nucleótidos en total.
Los experimentos de disociación in vitro de los ARNm de T-bet con las DNAzimas (td1 hasta td78) se llevan a cabo en un volumen de 10 \mul con la siguiente composición de reacción: 50 mM de Tris de pH 7,4, 150 mM de NaCl, 10 mM de MgCl_{2}, 0,25 \muM de DNAzimas y 0,025 \muM de ARNm de GATA-3 transcritos in vitro (en una relación del substrato a la DNAzima de 1:10). Las tandas de reacción se incuban a 37ºC para las células indicadas en cada caso. Por medio de la adición de un tampón de carga de muestras de ARN (RNA-Sample-Loading-Buffer) (de Sigma) que contiene formamida y EDTA, se detiene la reacción. Las muestras desnaturalizadas son separadas en geles de TAE-agarosa al 1,3% y son analizadas en un aparato transiluminador con UV.
La Figura 5 muestra como resultado de la electroforesis en gel la disociación de los ARNm diana de T-bet con DNAzimas modificadas [td54-M (pista 3), td69-M (pista 4), td70-M (pista 5)]. La pista 2 contiene como testigo un ARNm diana de T-bet sin la adición de una ADNzima. Un patrón de longitudes llevado a cabo conjuntamente (pista M) muestra unos tamaños de las bandas de 2.000 pb (pares de bases) y 3.000 pb (pares de bases). Las flechas apuntan hacia A, la banda con el substrato (aquí un ARNm de T-bet) y hacia B, uno de los dos productos de disociación (el otro producto de disociación no puede verse en esta Figura).
La comparación entre la totalidad de las 78 DNAzimas muestra que son especialmente activas las td54, td69 y td70 y que las modificaciones no disminuyen la efectividad de las DNAzimas.
La siguiente Tabla muestra la clasificación en 4 grupos de las DNAzimas td 1 hasta td 78 frente a 3 ARNm de T-bet. Esta clasificación en grupos se efectúa basándose en ensayos de actividad in vitro de las DNAzimas contra los ARNm de T-bet, que se llevaron a cabo. Grupo 1: alta actividad de disociación, Grupo 2: actividad intermedia de disociación, Grupo 3: débil actividad de disociación y Grupo 4: ninguna actividad medible de disociación.
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1 
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c) Incorporación de las moléculas de ácidos ribonucleicos específicos procedentes de la etapa b) en células dianas
Las DNAzimas td54, td69 y td70 son utilizadas en células dianas con y sin las modificaciones descritas.
Para esto, unas células Jurkat E6.1 (células de leucemia celular T aguda humana) se cultivan en un medio RPMI con 100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina y 10% de FKS a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% humedecida. Las transfecciones se llevan a cabo en placas de 6 pocillos. Para esto, 2x10^{6} células Jurkat E6.1 se transfieren a un medio de cultivo de células Opti-MEM-I (de Invitrogen) y se transfectan mediante DMRIE-C (de Invitrogen) con las DNAzimas modificadas (0,3 \muM) (de acuerdo con los datos del fabricante, la entidad Invitrogen). Después de una incubación durante 10 horas en un armario de fertilización en las condiciones anteriores, se añade a esto un medio RPMI (con las adiciones arriba indicadas) y se prosigue la incubación durante 14 horas más. Las células se lavan con un medio Opti-MEM y a continuación se transfectan de nuevo de acuerdo con el protocolo arriba descrito. Después de cada transfección, la eficiencia de transfección es valorada mediante un análisis FACS (de citometría de flujo).
Después de la transfección de células Jurkat E6.1, se determina cuantitativamente la cantidad de ARNm de T-bet con relación a una expresión de ARNm de GAPDH mediante una PCR en tiempo real (en el LightCycler, de Roche) con el fin de obtener informaciones acerca de la efectividad in vitro de las DNAzimas.
Para los análisis en el LightCycler, el ARN procedente de las células Jurkat E6.1 se purifica mediante un estuche RNeasy Mini Kit (de Qiagen, Alemania) y seguidamente se normaliza fotométricamente. Después de una transcripción inversa con SuperScript II (de Gibco) de acuerdo con los datos del fabricante, sigue el análisis cuantitativo de los ARNm de T-bet y de GAPDH en el LightCycler. El volumen total para la PCR es de 20 \mul, allí están contenidos 1 \mul de un ADN, en cada caso 1 \mul (0,5 \muM) de cebadores del mismo sentido y antisentido, así como 10 \mul de una mezcla QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (de Qiagen, Alemania).
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Los cebadores de PCR utilizados para T-bet son:
del mismo sentido 5'-CCCACCATGTCCTACTACCG-3'
antisentido 5'-GCAATCTCAGTCCACACCAA-3'.
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Los cebadores de PCR para GAPDH son:
del mismo sentido 5'-TCTTCTTTTGCGTCGCCAG-3'
y antisentido 5'-AGCCCCAGCCTTCTCCA-3'.
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Las condiciones de PCR son: desnaturalización (15 min a 95ºC), amplificación (15 s a 95ºC, 25 s a 59ºC, 25 s a 72ºC de 50 ciclos) y luego una extensión final (del inglés Final Extention) 2 min a 72ºC. La subsiguiente curva de fusión es generada de la siguiente manera: 0 s a 95ºC, 15 s a 60ºC y luego la temperatura se aumenta en escalones de 0,2ºC hasta llegar a 97ºC, al mismo tiempo se mide de una manera continua la fluorescencia. La curva de fusión sirve para el testigo interno, puesto que todos los productos de PCR tienen una temperatura específica de
fusión.
El verde SYBR Green es un colorante fluorescente (contenido en la QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix), que se fija a un ADN bicatenario. Cuando durante la extensión se ha duplicado el ADN, el SYBR Green se fija a él y genera una señal de fluorescencia dependiente de la fijación, que es detectada por el LightCycler al final de cada extensión. Cuanto más alta sea la cantidad de material de partida, tanto más tempranamente es detectada la elevación significativa de la fluorescencia. El Software del LightCycler representa gráficamente las intensidades de fluorescencia reunidas contra los ciclos.
En la Fig. 6 se representan unas curvas de amplificación en LightCycler de los ARNm de T-bet y de GAPDH después del tratamiento de células Jurkat E6.1 con las DNAzimas td54m, td69m y td70m, en comparación con las tratadas con una DNAzima sin sentido.
El respectivo "punto de cruce" (Ct), definido como el ciclo de PCR, en el cual la fluorescencia se diferencia por primera vez significativamente con respecto de la fluorescencia de fondo, es determinado manualmente con el método de puntos de ajuste Fit-Point del software del LightCycler. La cuantificación relativa de los ARNm de T-bet y de GAPDH en células tratadas con DNAzimas, en comparación con células tratadas con una DNAzima sin sentido, es llevada a cabo de acuerdo con las instrucciones descritas en el boletín del usuario #2 (ABI Prism 7700 Sequence detection System User Bulletin #2 (2001) Relative quantification of gene expression http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/ 04303859.pdQf). En este caso la cantidad de ARNm de T-bet procedente del ensayo testigo se equipara a 100%. Los datos de la cuantificación relativa se representan gráficamente en la Fig. 7.
En comparación con el tratamiento con una DNAzima sin sentido se muestra que la DNAzima td69m conduce a una supresión de 81,3% y la DNAzima td70m conduce a una supresión de 81,0%, al contrario de lo cual la DNAzima td54m no tiene ningún efecto supresor sobre un ARNm de T-bet.
Esto significa que la DNAzima td54m no es activa in vivo, al contrario de lo cual las DNAzimas td69m y td70m también desactivan en el medio celular a los ARNm de T-bet. La reducción específica de los ARnm de T-bet in vivo mediante las DNAzimas td69m y td70m constituye por consiguiente una herramienta terapéutica efectiva para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas.
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d) Formulación del ácido ribonucleico específico procedente de la etapa b) y/o de una célula diana procedente de la etapa c) en un medicamento
El análisis de diferentes DNAzimas con un dominio de fijación al substrato que es específico para T-bet, muestra que las DNAzimas td69 y td70 inhiben específicamente in vivo la expresión de T-bet y son apropiadas como ácidos ribonucleicos específicos para la producción de un medicamento que es específico para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad.
Para esto, la td69 (GGCAATGAAggctagctacaacga TGGGTTTCT) o la td70 (TCACGGCAAggctagctacaacga-GAACTGGGT) o células transfectadas con td69m o respectivamente td70m, son provistas, en una composición farmacéutica, de un soporte o vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo liposomas o polímeros biodegradables.
Alternativamente a las DNAzimas, para la inhibición específica de la expresión de T-bet y para la producción de un medicamento específico para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad, se propone el empleo de un siRNA.
\newpage
Preferiblemente, se trata de un siRNA para la inhibición de T-bet humano. La producción del siRNA es conocida para un experto en la especialidad y se describe en la bibliografía. Un ejemplo de secuencias de siRNA:
2
Es observable para un experto en la especialidad, que con el conocimiento del presente invento se pueden producir también DNAzimas o respectivamente siRNAs ligeramente específicas/os como medicamentos en los casos de enfermedades inflamatorias crónicas y de enfermedades autoinmunitarias, que están dirigidas contra otros factores de transcripción, que desempeñan un cierto cometido en el caso de la diferenciación para dar células TH1 o respectivamente TH2, por ejemplo STAT4, STAT5a, STAT1, c-Rel, CREB2, ATF-2, ATF-2, Hlx, IRF-1, c-Maf, NFAT, NIP45, AP1, Mel-18, SKAT-2, CTLA-4, o que están dirigidos contra otros factores de las rutas de transducción de señales para la diferenciación y/o expresión de citocinas, por ejemplo cinasa de Src, cinasa de Tec, Rlk (Txk en un ser humano), Itk, Tec, RIBP, PLC\gamma, cinasa de MAP, ERK, JNK, P38, MKK, MKK1, MKK2, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, Rac2, GADD45, GADD45\beta, GADD45y, SOCS, CIS, SOCS1, SOCS2, SOCS3, JAK, JAK1, JAK3, NIP45.
Estas proteínas presentan una expresión en una célula diana que ha aumentado en comparación con la expresión de una célula testigo.
<110> Philipps-Universität (Universidad Phillips) Marburg
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<120> Procedimiento para la producción de un medicamento específico para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad
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<130> desconocido
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/DE2004/002197
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<141> 2004-10-01
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 10346487.5
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<151> 2003-10-02
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<160> 80
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<170> PatentIn Versión 3.3
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<210> 1
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> DNAzima td1 contra ARNm de T-bet
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<222> (1)..(33)
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<400> 1
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100 
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<210> 2
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> DNAzima td2 contra ARNm de T-bet
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<222> (1)..(33)
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<400> 2
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101 
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<210> 3
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> DNAzima td3 contra ARNm de T-bet
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<222> (1)..(33)
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<400> 3
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102 
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<210> 4
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> DNAzima td4 contra ARNm de T-bet
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<222> (1)..(33)
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<400> 4
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103 
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<210> 5
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> DNAzima td5 contra ARNm de T-bet
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<222> (1)..(33)
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<400> 5
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104 
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<210> 6
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> DNAzima td6 contra ARNm de T-bet
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<222> (1)..(33)
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<400> 6
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105 
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<210> 7
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> DNAzima td7 contra ARNm de T-bet
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<222> (1)..(33)
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<400> 7
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106 
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<210> 8
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> DNAzima td8 contra ARNm de T-bet
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<222> (1)..(33)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
107 
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<210> 9
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> DNAzima td9 contra ARNm de T-bet
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<222> (1)..(33)
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<400> 9
\hskip1cm
108 
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<210> 10
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> DNAzima td10 contra ARNm de T-bet
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<222> (1)..(33)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
109 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> DNAzima td11 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
110 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> DNAzima td12 contra ARNm de T-bet
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<222> (1)..(33)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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111 
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<210> 13
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td13 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
112 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td14 contra ARNm de T-bet
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<222> (1)..(33)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
113 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td15 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
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114 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> DNAzima td16 contra ARNm de T-bet
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<222> (1)..(33)
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<400> 16
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115 
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<210> 17
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> DNAzima td17 contra ARNm de T-bet
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<222> (1)..(33)
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<400> 17
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116 
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<210> 18
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td18 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
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<400> 18
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117 
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<210> 19
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> DNAzima td19 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
118 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td20 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
119 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td21 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
120 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td22 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
121 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td23 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm
122 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td24 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
123 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td25 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm
124 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td26 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
125 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td27 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm
126 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td28 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
127 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td29 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm
128 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td30 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
129 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td31 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm
130 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td32 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
131 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td33 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
132 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td34 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm
133 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td35 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm
134 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td36 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm
135 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td37 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm
136 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td38 DNAzyme against, T-bet mRNA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm
137 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td39 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm
138 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td40 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1cm
139 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td41 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1cm
140 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td42 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm
141 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td43 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm
142 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td44 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
143 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td45 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
144 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td46 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
145 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td47 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm
146 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td48 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
147 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td49 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm
148 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td50 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip1cm
149 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td51 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip1cm
150 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td52 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\hskip1cm
151 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td53 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\hskip1cm
152 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td54 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\hskip1cm
153 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td55 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\hskip1cm
154 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td56 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\hskip1cm
155 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td57 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip1cm
156 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td58 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
157 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td59 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
158 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td60 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
159 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td61 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
160 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td62 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
161 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td63 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
162 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td64 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
163 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td65 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
164 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td66 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
165 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td67 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
166 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td68 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
167 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td69 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\hskip1cm
168 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td70 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\hskip1cm
169 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td71 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\hskip1cm
170 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td72 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\hskip1cm
171 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td73 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
172 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td74 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
173 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td75 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
174 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td76 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
175 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td77 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
176 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td78 contra ARNm de T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
177 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2588
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> td54 sitio de fijación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (952)..(970)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> td69 sitio de fijación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1096)..(1114)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> td70 sitio de fijación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1100)..(1118)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2450
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (134)..(134)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (310)..(310)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> td54 sitio de fijación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (952)..(970)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> td69 sitio de fijación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1096)..(1114)
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<220>
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<221> td70 sitio de fijación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1100)..(1118)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1399)..(1399)
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1556)..(1556)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
5

Claims (9)

1. DNAzimas, caracterizadas porque ellas se componen de
- un dominio catalítico con la secuencia de nucleótidos GGCTAGCTACAACGA o con una secuencia modificada que tiene un efecto biológico comparable, que corta al ARNm de T-bet en cada uno de los sitios de enlace de purina - pirimidina a los que está unido,
- un dominio de fijación al substrato derecho, que sigue al extremo 3' del dominio catalítico, y
- un dominio de fijación al substrato izquierdo, que sigue al extremo 5' del dominio catalítico, siendo los dos dominios de fijación al substrato en cada caso complementarios con dos regiones del ARNm de T-bet, de manera tal que ellos se hibridan con el ARNm,
- son activas in vivo y
- contienen la secuencia de td69 GGCAATGAA GGCTAGCTACAACGA TGGGTTTCT o de td70 TCACGGCAA GGCTAGCTACAACGA GAACTGGGT.
2. DNAzimas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizadas porque ellas cortan el dominio catalítico del ARNm de T-bet junto a un sitio de enlace de purina - uracilo.
3. DNAzimas de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadas porque ellas han sido estabilizadas contra la descomposición en el organismo mediante la introducción de una inversión 3-3'.
4. DNAzimas de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizadas porque ellas han sido estabilizadas contra la descomposición en el organismo mediante la introducción de nucleótidos o compuestos de nucleótidos modificados.
5. DNAzimas de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadas porque ellas tienen como modificación una timidina inversa junto al extremo 3' y/o una marcación con FAM junto al extremo 5'.
6. Procedimiento para la producción de un medicamento destinado al tratamiento de inflamaciones crónicas, caracterizado porque
- se determinan unas células dianas, en las cuales la expresión de un ARNm de T-bet es más alta que que en células corporales sanas,
- se desarrollan unas DNAzimas eficaces in vivo de acuerdo con la reivindicación 1, las cuales se fijan a un ARNm de T-bet y lo desactivan funcionalmente,
- las DNAzimas eficaces in vivo se introducen en células dianas y
- se formulan unos medicamentos que contienen las DNAzimas eficaces in vivo.
7. Medicamentos que contienen una DNAzima de acuerdo con las reivindicaciones 2 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. Utilización de una DNAzima de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, para la producción de un medicamento destinado al tratamiento de inflamaciones crónicas.
9. Utilización de una DNAzima de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, para la producción de un medicamento destinado a la inhibición específica de la expresión de T-bet en células dianas de pacientes para el tratamiento de inflamaciones crónicas.
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