CN101087623A - 用于治疗变态反应和肿瘤细胞增殖的反义寡核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种的反义寡核苷酸。所述寡核苷酸针对编码受体的核酸序列,所述受体选自CCR3受体以及IL-3、IL-5和GM-CSF受体的共同亚基。
Description
发明领域
本发明涉及针对特异性细胞受体的、单独或组合的反义寡核苷酸的用途,以便抑制全身性炎症(包括与哮喘和变态反应相关的炎症)和嗜酸性粒细胞增多症。本发明还涉及反义寡核苷酸抑制肿瘤细胞增殖如癌症的用途。
发明背景
反义寡核苷酸是一类新的药物。一般来说,反义指小的合成寡核苷酸的用途,所述寡核苷酸与存在于人DNA或RNA中的寡核苷酸具有相同组成。反义寡核苷酸设计为它们所靶向基因的一部分的互补序列,以便能够附着于该序列并抑制基因表达。通过反义寡核苷酸与特异性信使RNA(mRNA)有义靶按照Watson-Crick碱基配对的杂交使基因表达受到抑制,在Watson-Crick碱基配对中,腺嘌呤和胸腺嘧啶(在mRNA中为尿嘧啶)或鸟嘌呤和胞嘧啶通过氢键键合相互作用。两种机制可解释这些作用,第一种机制是损害被靶向mRNA翻译的杂交,第二种机制是诱导降解mRNA的RNA酶H或类似酶。该策略的主要优势在于作用的特异性以及较少的副作用和毒性,尤其是在施用于作用位点时(局部治疗)。该治疗策略可潜在地应用于一般认为一种或几种基因的过表达引起疾病发生或迁延的任何疾病。因此,已有众多反义寡核苷酸用作癌症和病毒性疾病治疗剂的研究。
反义寡核苷酸可用于抑制白介素(IL)-6受体表达,由此抑制急性炎症介导物白介素-6对细胞的作用。已进行了几个研究来评价反义寡核苷酸是否可用于抑制涉及炎症(包括但不限于与哮喘相关的炎症和与特应性疾病和变态反应相关的炎症)的细胞或癌细胞上的其它受体。
哮喘是一种侵袭5-10%人群的疾病,在最近的25年中发病率已加倍。尤其在病毒感染气管(细支气管炎)后的婴儿、儿童和职业诱发性哮喘中注意到这种增加。变应原经常引发与哮喘相关的复发性呼吸问题,但哮喘的确切病因尚不知晓。然而,一般认为病毒之类的因子涉及存在于哮喘患者气管中的异常炎症的永续性,因此涉及病情的迁延。
为此,现时推荐的哮喘一线治疗是有效的抗炎药物,例如含皮质类固醇和抗白细胞三烯的药物。尽管该治疗在许多患者中有效,但一些患者对皮质类固醇有抗性。该药物还是具有长期副作用的有效免疫抑制剂,未表明其有效预防变态反应或哮喘。抗白细胞三烯在变态反应和哮喘中有一些作用,但不如皮质类固醇有效。
几种炎症介导物在哮喘患者气管中的炎症出现和永续性方面起作用。一些介导物或者通过嗜酸性粒细胞的趋化性(趋化因子:RANTES、嗜酸性粒细胞趋化因子1、2、3、MCP-3、4,它们主要通过称为CCR3的受体在哮喘性炎症中起作用)或者通过内皮细胞作用(IL-4、-13)吸引炎性细胞进入气管。其它介导物引起气管中炎性细胞的致敏和存活增加(IL-3、-4、-5、GM-CSF)。这些介导物因此或者由嗜酸性粒细胞的特异性趋化因子构成,或者由T辅助淋巴细胞2型表型的细胞因子(Th2:IL-3、-4、-5、-6、-9、-10、-13和GM-CSF)构成(John AE.和Lukacs NW.,2003 Sarcoidosis Vase Diffuse Lung Dis.,20:180-189;Blease等,2003,Expert Opin Emerg Drugs.8:71-81)。业已表明,当气管中的这些炎症介导物减少时,哮喘和全身性呼吸道炎症改善。
变态反应是一种对引起不需要的免疫应答的变应原的超敏反应。变态反应是一种极为普遍的疾病,例如侵袭约30%人群的特应性鼻炎和结膜炎。变态反应的特征在于异常的IgE产生和对变应原的炎症。在IgE和变应原存在的情况下,效应细胞如肥大细胞脱粒并释放炎性介导物,导致哮喘中可见的相同炎性细胞的募集。在变应性鼻炎(即枯草热)、变应性结膜炎、鼻息肉病、慢性窦炎和湿疹如特应性皮炎中,人们发现炎性介导物如同哮喘中存在的炎性介导物一样过量。IL-4和IL-13是生产IgE和诱导Th2表型细胞所必需的(BarnesPJ.,2003,Cytokine Growth Factor Rev.14:511-522;Schuh等,2003,Cytokine Growth Factor Rev.2003,14:503-510)。特应性疾病是通过接触变应原发生的变应疾病的总称,尤其是在具有易于对变应原敏化的遗传倾向性的个体中。具有这些诱病因素的个体容易对食源性抗原和吸入物出现异常免疫应答。变应疾病的一些具体实例为支气管哮喘、特应性皮炎、风疹、变应性鼻炎、变应性结膜炎和变应性胃肠炎。
肿瘤是一种不可控和进行性的异常组织生长。恶性肿瘤经常以癌症为特征。癌症在人类中是第二致死病因,是以永生化细胞的异常增殖为特征的100多种疾病的总称。涉及这些细胞的持久性和增加的机制之一是释放通过受体起作用并导致细胞增殖的生长因子。在这些生长因子中,已表明GM-CSF是几种肿瘤细胞的重要生长因子。最近,趋化因子受体CCR3被表征为由慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和毛细胞白血病(HCL)患者回收的恶性B淋巴细胞,(Trentin等,2004,Blood,104,502-508)。实际上,已发现表皮生长因子受体(EGFR)通过CCR-3趋化因子受体的反式激活作用是引起支气管上皮细胞中MAP激酶活化和细胞因子产生的关键途径(Adachi等,2004,Biochem.Biophys.Res.Commun.320,292-396)。通过阻断生长因子和/或趋化因子的受体来抑制癌细胞增殖可能在某些癌症的治疗中很重要。
嗜酸性粒细胞是一类白细胞。它们是具有核和胞质的粒性白细胞,所述核通常具有两个通过染色质细线连接的叶,所述胞质包含尺寸均一并可由曙红染色的成层(course)圆粒。嗜酸性粒细胞增多症的特征在于嗜酸性粒细胞的数量增加,经常与变态反应、哮喘和感染相关。
针对编码受体的特异性核酸序列的寡核苷酸用于抑制炎性反应的某些用途是已知的。Renzi的PCT申请号WO 99/66037描述了用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症的反义寡核苷酸。具体地说,Renzi的寡核苷酸针对的核酸序列编码CCR3受体、IL-4和IL-3受体的共同亚基或IL-3、IL-5和GM-CSF受体的共同亚基。其中还公开了一种鉴别为107A(5′-GGGTCTGCAGCGGGATGGT-3′)的反义寡核苷酸,其针对IL-3、IL-5和GM-CSF受体的共同β亚基。
对于潜在的临床用途,反义寡核苷酸应当表现出抗血清和细胞核酸酶降解的稳定性,显示出与血清和细胞蛋白的低非特异性结合,具有增强的靶mRNA序列识别,表现出细胞膜透过性,并在与互补mRNA复合时激发细胞核酸酶。文件已充分证明,含天然糖(D-核糖和D-2-脱氧核糖)和磷酸二酯(PO)键的寡核苷酸被血清和胞内核酸酶快速降解,这限制了其作为有效治疗剂的用途。业已描述了对寡核苷酸的化学策略性修饰,以便提升其作为治疗剂的稳定性和效力。主要的化学改变包括糖部分、碱基部分的修饰和/或核苷酸间磷酸二酯键的修饰或替代。迄今为止,最广泛研究的类似物是磷酸二酯主链中的其中一个非桥接氧原子被硫取代的硫代磷酸酯(PS)寡脱氧核苷酸(Eckstein F.,1985,Ann.Rev.Biochem.,54:367-402)。已开发出几种反义寡核苷酸生产方法,并用于体外和体内研究(Goodchild J.,2004,Curr.Opin.Mol.Ther.,2004,6:120-128;Urban E.和R.Noe CR.,2003,Farmaco.58:243-258)。
最近,Renzi等描述了2′,6′-二氨基嘌呤(DAP)及其类似物在抗炎组合物核分子中的用途(PCT申请号WO 03/004511 A2)。在该文献中还描述了相比于无DAP的寡核苷酸体内生理效力增加和毒性降低的核分子的制备。Renzi等进一步教导DAP置换具体用于制备针对肺部/呼吸系统疾病的寡核苷酸,所述疾病例如为囊性纤维化、哮喘、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病、嗜酸性粒细胞性支气管炎、变态反应、变应性鼻炎、肺纤维化、成人呼吸窘迫综合症、窦炎、呼吸道合胞体病毒或其它病毒性呼吸道感染以及癌症。
应当需要具有另外的反义寡核苷酸,其针对Th2细胞因子的至少一种特异性共同受体或介导物(其吸引响应Th2细胞因子的细胞)的受体,以便抑制在哮喘或变态反应中存在的炎性反应,以及抑制肿瘤细胞增殖。
还应当高度需要具有另外的反义寡核苷酸,其针对受体编码核酸序列,以便通过抑制这些受体使这些寡核苷酸可用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症。
发明概述
本发明提供反义寡核苷酸的用途,所述反义寡核苷酸针对细胞受体的至少一种共同亚基(例如IL-3、IL-5和GM-CSF受体的共同β亚基)或趋化因子受体CCR3,以便治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种。
在另一方面,本发明提供针对IL-3、IL-5和GM-CSF受体的共同β亚基的编码核酸序列的反义寡核苷酸,以便通过抑制这些受体使所述反义寡核苷酸可用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种。
本发明还提供针对趋化因子CCR3受体的编码核酸序列的反义寡核苷酸,以便通过抑制该受体使所述反义寡核苷酸可用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种。
本发明还提供治疗有效量的组合物,其包含至少一种针对IL-3、IL-5和GM-CSF受体的共同β亚基或CCR3受体的编码核酸序列的反义寡核苷酸,用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种。
本发明还提供治疗有效量的组合物,其包含两种各自针对IL-3、IL-5和GM-CSF受体的共同β亚基或CCR3受体的编码核酸序列的反义寡核苷酸,用于改善在治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种中的作用。
按照另一方面,本发明提供一种方法,用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、全身性炎症和癌症中的至少一种,所述方法包括给予一种或多种针对细胞受体的至少一种共同亚基(例如IL-3、IL-5和GM-CSF受体的共同β亚基)或CCR3受体的反义寡核苷酸。
本发明试图提供任何前述的反义寡核苷酸以及以已知方式修饰的化学修饰反义寡核苷酸,其在机体内具有改进的稳定性,同时表现出提升的有效性和降低的毒性。
按照本发明的另一方面,提供用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种的反义寡核苷酸。所述寡核苷酸针对编码受体的核酸序列,所述受体选自CCR3趋化因子受体以及IL-3、IL-5和GM-CSF受体的共同β亚基,具有选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的序列。
按照本发明的另一方面,提供至少一种寡核苷酸用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种的用途。优选地,使用含SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14两个序列的寡核苷酸。
按照本发明的另一方面,提供用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种的药物组合物,其包含至少一种寡核苷酸连同药物可接受的载体。优选地,所述至少一种寡核苷酸含SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14两者。
按照本发明的另一方面,提供所述药物组合物用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种的用途。
按照本发明的另一方面,提供一种治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种的方法,所述方法包括以下步骤:给予有效量的(i)至少一种寡核苷酸或(ii)含至少一种寡核苷酸连同药物可接受的载体的药物组合物。
本发明在此还涉及对反义寡核苷酸的修饰,所述修饰不显著地不利影响反义寡核苷酸降低靶蛋白活性或抑制靶蛋白表达的能力,但其可增强该能力。
附图简述
本发明优选实施方案的这些特征和其它特征在以下的详述中将变得更明显,在详述中参考附图,其中:
图1A显示了由猕猴IL-3、IL-5和GM-CSF受体基因共同β链的PCR扩增获得的3个克隆与人TOP004补体序列周围的对应人、黑猩猩、猪、大鼠和小鼠直系同源物的序列比对。
图1B显示了在克隆的猕猴、人、黑猩猩、猪、大鼠和小鼠共同β链DNA序列中TOP004补体节段周围的翻译区的预测氨基酸序列。
图2A显示了与未处理的细胞相比,通过改变猕猴PBMC中的TOP004浓度降低β链(βc)mRNA表达的情况。
图2B显示了与未处理的细胞相比,通过改变猕猴PBMC中的TOP005浓度降低CCR3 mRNA表达的情况。
图3A显示了与未处理的细胞相比,猕猴PBMC中的不同TOP004浓度降低β链(βc)细胞表面蛋白表达的情况。
图3B显示了与未处理的细胞相比,猕猴PBMC中的不同TOP005浓度降低CCR3细胞表面蛋白表达的情况。
图4A显示了与未处理的细胞相比,通过改变猕猴PBMC中的ASM8浓度降低β链(βc)mRNA表达的情况。
图4B显示了与未处理的细胞相比,通过改变猕猴PBMC中的ASM8浓度降低CCR3 mRNA表达的情况。
图5显示了寡核苷酸对HL60分化细胞中的CCR3 mRNA表达的作用。与对G3PDH表达无作用的对照和有义寡核苷酸相比时,针对CCR3的反义寡核苷酸A86显示出降低CCR3 mRNA表达。
图6显示了在寡核苷酸处理的HL-60 c1-15细胞中的钙动员测定。与对照和有义寡核苷酸处理的细胞相比,在A86处理细胞中响应于嗜酸性粒细胞趋化因子的动员下降。
图7显示了寡核苷酸作用于纯化人嗜酸性粒细胞对嗜酸性粒细胞趋化因子的趋化反应的情况。将A86处理的嗜酸性粒细胞的相对趋化反应与对照和有义寡核苷酸处理的细胞对比。
图8显示了响应于嗜酸性粒细胞趋化因子的寡核苷酸处理嗜酸性粒细胞中的钙动员测定。对比A86处理的嗜酸性粒细胞和对照或有义寡核苷酸处理的细胞中的钙动员。
图9显示了TOP005对CCR3的细胞表面表达的作用,以Eol-1和U937细胞中相对于对照的表达百分率来表示。
图10显示了TOP005对人PBMC中的mRNA表达的作用。显示G3PDH和CCR3表达的凝胶示于条图上。CCR3 mRNA表达对G3PDH的比率相对于对照标准化,示于底部。
图11A显示了调节107A处理的TF-1细胞中的β链(βc)mRNA表达,使用RT-PCR以检测β链(βc)mRNA表达或对照G3PDH mRNA表达。
图11B和11C显示了有义寡核苷酸和107A处理对TF-1细胞的细胞表面上β链表达的作用,其通过FACS分析测定。
图11D显示了TOP004在mRNA和蛋白水平上对U937细胞中的共同β链表达的作用。
图12显示了在GM-CSF、IL-3或IL-5存在下107A处理的TF-1细胞的增殖。
图13A显示了107A对嗜酸性粒细胞存活率的调节,其使用锥虫蓝染色排除测定来评价。
图13B显示了107A对嗜酸性粒细胞存活率的调节,其通过使用Annexin-V-FITC和碘化丙啶方案的流式细胞术分析来评价。
图14显示了使用DEAE阴离子交换层析的ASM8单个产物(TOP004和TOP005)的洗脱谱。
图15显示了用CH3COOH处理3小时并进行碱裂解后,通过DEAE阴离子交换层析分级分离后的ASM8洗脱谱。
图16显示了用CH3COOH处理6小时并进行碱裂解后,通过DEAE阴离子交换层析分级分离后的ASM8洗脱谱。
图17A1、17A2、17B1和17B2显示了在不同温度下储存并随后使用DEAE阴离子交换层析洗脱后,ASM8的化学稳定性。
图18显示了在1×PBS中TOP004和TOP005的解链曲线。
图19显示了基于1×PBS中TOP004和TOP005的解链曲线拟合结果的热力学总结。
图20A和20B显示了在用高剂量ASM8处理后1天,在猴血浆中的TOP004和TOP005及其代谢物的浓度。
图21A和21B显示了在用高剂量ASM8处理后14天,在猴血浆中的TOP004和TOP005及其代谢物的浓度。
发明详述
几种炎症介导物在哮喘患者气管中的炎症出现和永续性方面起作用。一些介导物通过嗜酸性粒细胞的趋化作用吸引炎性细胞进入气管。这些趋化因子中有许多主要通过CCR3受体在哮喘或变应性炎症中起作用。其它介导物在气管或皮肤中引起炎性细胞致敏和存活率增加,例如IL-3、IL-5和GM-CSF。业已表明,当气管中的这些炎症介导物减少时哮喘改善。
此外,释放通过受体起作用并导致细胞增殖的炎症介导物和/或生长因子,可引起特征为永生化细胞异常增殖的癌症。其中,已表明GM-CSF是几种肿瘤细胞的重要生长因子。趋化因子受体CCR3表征为由慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和毛细胞白血病(HCL)患者回收的恶性B淋巴细胞,(Trentin等,2004,Blood,104,502-508)。实际上,已发现EGFR通过CCR-3的反式激活作用是引起支气管上皮细胞中MAP激酶活化和细胞因子产生的关键途径(Adachi等,2004,Biochem.Biophys.Res.Commun.320,292-396)。通过阻断生长因子受体或趋化因子受体CCR3来抑制癌细胞的增殖和转移可能在某些癌症的治疗中很重要。
在本发明的一个实施方案中,提供一种鉴别为828(5′-GTTACTACTTCCACCTGCCTG-3′,(SEQ ID NO.1))并针对CCR3趋化因子受体的新反义寡核苷酸。本文公开的实例表明,828有效降低或阻断人细胞系中的CCR3 mRNA表达。
在本发明的另一个实施方案中,提供基于先前公开的107A和上述828的新反义寡核苷酸TOP004和TOP005。同107A一样,TOP004(5′-GGGTCTGCXGCGGGXTGGT-3′(SEQ ID NO.13),其中X代表腺苷残基的DAP修饰)是19聚体,针对IL-3、IL-5和GM-CSF受体的共同β链的 mRNA。同828一样,TOP005(5′-GTTXCTXCTTCCXCCTGCCTG-3′(SEQ ID NO.14),其中X代表腺苷残基的DAP修饰)是21聚体,针对趋化因子受体CCR3的mRNA。含TOP004和TOP005这二者的组合物被鉴别为ASM8的一部分。
如本文所公开的,TOP004和TOP005在非人灵长类动物系统中具有活性,因此验证猕猴对安全性评价的用途。图1显示了猕猴共同β链基因的测序。与TOP 004互补的猕猴β链序列显示出显著同源性。猕猴和人β链序列之间非常高度的同一性提示,TOP004在猕猴中可能有功能活性。TOP 004和TOP 005在猴外周血单核细胞中阻断或降低共同β链和CCR3表达的有效性示于图2、3和4。结果表明,针对人基因靶的TOP004和TOP005在猕猴外周血单核细胞(PBMC)中均有效降低其对应靶的表达。含TOP004和TOP005这二者的ASM8显著抑制共同β链表达和CCR3受体,在较低浓度时程度较高或者程度相同。因此,TOP004和TOP005一起在阻断β链和CCR3 mRNA表达方面表现出协同作用。而且,在表7和8中,分析取自ASM8处理猴的气管样品的mRNA表达水平。靶基因的表达对炎性细胞因子(IL-4和TNF-α)的mRNA水平标准化。在ASM8处理的动物中,即便在给予ASM8后约24小时,βc-亚基和CCR3 mRNA对IL-4 mRNA的相对表达分别下降达29%和24%,相对于TNF-α的表达分别下降达30%和24%。
在图5-10中,测试针对CCR3 mRNA的反义寡核苷酸(包括A86和TOP005)在人细胞和细胞系中的效力。当通过半定量逆转录-聚合酶链反应(“RT-PCR”)评价时,反义寡核苷酸引起CCR3 mRNA表达抑制。此外,使用FACS分析表明,CCR3蛋白的细胞表面表达同样受到反义寡核苷酸处理的抑制。而且,通过用嗜酸性粒细胞趋化因子刺激后抑制纯化的嗜酸性粒细胞中的钙(Ca++)动员,证实CCR3的功能性抑制。另外,在趋化性测定中,所述寡核苷酸抑制嗜酸性粒细胞趋化性达55%。
在图11-13中,107A和TOP004反义寡核苷酸用于处理各种细胞。与107A温育的TF-1细胞显示降低的β链mRNA表达。107A还在IL-3、IL-5或GM-CSF存在下抑制TF-1细胞增殖。而且,107A以剂量依赖性方式降低IL-5对嗜酸性粒细胞的抗凋亡作用。与TOP004温育的U937细胞在mRNA和蛋白水平上显示降低的共同β链表达。因此,反义107A和TOP004在阻断β链mRNA、蛋白表达方面高度有效,在阻断人细胞培养物中相关的细胞反应方面有功能。
在图14-17B2中,通过在改变的条件下洗脱组合物显示了ASM8的稳定性。使用基于DEAE阴离子交换高效液相层析(HPLC)的分级分离系统洗脱ASM8,以评价ASM8及其降解产物在不同温度储存后的完整性。ASM8组分在-20℃、4℃、30℃或40℃储存达2个月时不经历任何可检测的降解。
在图18-19中,所提供的ASM8的解链曲线和热力学总结表明,两条寡核苷酸链在溶液中不显著相互作用。
在图20-21中,检测ASM8寡核苷酸组分及其初级代谢物(n-1)在猴血浆样品中的浓度。在非临床毒性实验中收集样品,其中动物通过吸入处理连续14天。
因此提供针对IL-3、IL-5和GM-CSF的共同β亚基和CCR3受体并因此针对其编码核酸的反义寡核苷酸。还提供包含所述寡核苷酸和药物可接受载体的药物组合物。描述了所述寡核苷酸的用途和包含给予所述寡核苷酸的方法,用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种。
术语“核酸”和“核酸分子”在本文可互换使用,指由核苷酸(即核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或这两者)组成的分子。该术语包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的单体和多聚物,其中在多聚物情况下核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸经5′-3′键而连接在一起。但是,键可以包括核酸合成领域已知的任何键,包括例如含5′-2′键的核酸。用于核酸分子的核苷酸可以是天然的,或者可以是能与天然碱基对形成碱基配对关系的合成产生的类似物。能形成碱基配对关系的非天然碱基的实例包括但不限于氮杂和脱氮嘧啶类似物、氮杂和脱氮嘌呤类似物以及其它杂环碱基类似物,其中嘌呤和嘧啶环的一个或多个碳原子和氮原子已经被杂原子如氧、硫、硒、磷等取代。
本文所用术语“核酸主链”指连接分子中核苷酸的化学部分的结构。这可以包括由任何方式的化学连接核苷酸形成的结构。本文所用的修饰主链包括对核苷酸间化学键的修饰,以及可用于增强稳定性和亲合性的其它修饰,如对糖结构的修饰。例如可以使用脱氧核糖的[α]-异头物,其中碱基相对于天然[β]-异头物是反向的。在一个优选实施方案中,糖基的2′-OH可以改变成2′-O-烷基或2′-O-烷基-n(O-烷基),其提供了对降解的抗性而不影响亲合性。
本文使用的术语“寡核苷酸”指含约1到约100个核苷酸、更优选1到80个核苷酸,甚至更优选约4到约35个核苷酸的核酸分子。
本发明的反义寡核苷酸化合物还包括siRNA(小干扰RNA)和由于RNAi(RNA干扰)方法而含有它们的RISC(RNA诱导的沉默复合物)。RNA干扰(RNAi)方法最近已有描述,被认为是抑制靶基因表达的新工具。几年前就已经知晓,RNAi基于低等真核生物中的古老抗病毒防御机制。它由双链RNA诱导,双链RNA被加工成21-23 nt的小干扰RNA(siRNA),其在RISC复合物帮助下与单链形式靶mRNA杂交后引起同源的内源mRNA降解。RNAi的工作方式仍未完全阐明,但其已在广泛的真核生物物种如线虫、蝇、植物、真菌和哺乳动物中用作产生功能丧失表型的首选方法。
本发明的反义寡核苷酸化合物还包括核酶以及单链或双链的RNA或DNA的短核苷酸序列,其可以掺入如上所述的化学修饰,能体外和/或体内抑制基因转录和/或翻译。
术语“修饰的寡核苷酸”和“修饰的核酸分子”包括例如已通过插入或缺失1个或多个碱基而被修饰但对其活性没有显著不利作用的反义寡核苷酸化合物。具体地说,一般可在与它们针对的基因具有100%互补性的寡核苷酸末端实施碱基的加入或缺失,而不显著丧失抑制活性。可实施这样的修饰,以便增加寡核苷酸活性或提供增强的寡核苷酸稳定性。另外,还可在本发明的反义寡核苷酸化合物中实施1个或多个碱基的置换,而对活性没有不利作用,例如用另一个嘌呤(腺嘌呤、鸟嘌呤)置换嘌呤,以及用嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)置换嘧啶。本文使用的修饰的寡核苷酸和修饰的核酸分子还包括含寡核苷酸在内的核酸,其在所有或任意的核酸碱基、糖部分、核苷间磷酸键的天然分子结构的分子水平上具有一个或多个化学修饰,以及包括具有附加取代基(如二胺、胆甾基或其它亲脂性基团)的分子,或在这些位点的修饰的组合。核苷间磷酸酯键可以是磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲酯、乙酰胺酯、氨基甲酸酯、硫醚、桥联氨基磷酸酯(phosphoranidate)、桥联亚甲基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯、桥联硫代磷酸酯和/或砜核苷间键,或3′-3′、2′-5′或5′-5′键,以及这些相似键的组合(产生混合的主链修饰的寡核苷酸)。修饰可以在寡核苷酸分子的内部(单个的或重复的)或在末端,并且可以包括加到核苷间磷酸酯键的分子上,如胆甾基、在氨基之间具有不同数目碳残基的二胺化合物以及末端核糖、脱氧核糖和磷酸酯修饰,所述修饰切割或交联到相对链或缔合的酶或其它蛋白。亲电基团如核糖二醛可以与这种蛋白的赖氨酰残基的ε-氨基共价连接。亲核基团如束缚至寡聚物的n-乙基马来酰亚胺可共价连接到mRNA的5′端或另一个亲电位点。术语修饰的寡核苷酸还包括含有糖部分修饰的寡核苷酸,例如2′-取代的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体,任何它们通过5′-3′键连接在一起。修饰的寡核苷酸还可以由PNA或吗啉代修饰的主链组成,其中序列的靶特异性得以保持。术语修饰的寡核苷酸还包括如本文定义的寡核苷酸化合物,其形式不显著地不利影响反义寡核苷酸降低靶蛋白活性或抑制靶蛋白表达的能力,但其可增强该活性。
修饰的寡核苷酸还包括基于阿糖核苷酸或修饰的阿糖核苷酸残基或由其构建的寡核苷酸,包括但不限于基于β-阿拉伯呋喃糖及其类似物的反义寡核苷酸构建物。阿糖核苷酸是核糖核苷酸的立体异构体,差别仅在于糖环2′-位的构型。Damha等(1)的PCT申请号WO99/67378公开了阿糖核酸(ANA)寡聚物及其类似物,它们通过结合互补信使RNA提升了对基因表达的序列特异性抑制,该文献通过引用整体结合到本文中。Dahma等进一步教导了糖被修饰的寡核苷酸,其与其靶RNA序列形成双链体,产生RNA酶H的底物。具体地说,公开了包括β-D-阿糖核苷酸和2′-脱氧-2′-氟代-β-D-阿糖核苷的寡聚物。也是Dahma等(2)的PCT申请号WO 02/20773公开了用于以序列特异性方式抑制基因转录和表达的寡核苷酸嵌合体,该文献通过引用整体结合到本文中。具体地说,Dahma等(2)教导了由阿糖核苷酸构建的反义寡核苷酸,其位于一系列长度可变的脱氧核糖核苷酸残基的侧翼。如此构建的反义寡核苷酸用于杂交和诱导切割互补RNA。也是Dahma等(3)的PCT申请号WO 03/037909公开了具有内部无环连接残基的寡核苷酸,该文献通过引用整体结合到本文中。用无环连接基团制备的反义寡核苷酸用于阻止或削弱目标靶核酸如RNA的功能。也是Dahma等(4)的PCT申请号WO 03/064441公开了具有糖被修饰的核苷和2′-脱氧核苷的交替节段、并还具有糖被修饰的核苷酸和2′-脱氧核苷酸的交替节段的寡核苷酸,该文献通过引用整体结合到本文中。公开了具有这些交替节段的反义寡核苷酸,用于阻止或削弱目标靶核酸如RNA的功能。
术语“基本抗核酸酶的”指与天然或未修饰的核酸相比抗核酸酶降解的核酸。本发明的修饰核酸的核酸酶降解抗性是其未修饰对应物的至少1.25倍,更优选是其未修饰对应物抗性的至少2倍,甚至更优选是其未修饰对应物抗性的至少5倍,最优选是其未修饰对应物抗性的至少10倍。这种基本抗核酸酶的核酸包括但不限于具有修饰主链的核酸,所述修饰主链如硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、乙基磷酸三酯、2′-O-甲基硫代磷酸酯、2′-O-甲基-对-乙氧基核糖核苷酸、2′-O-烷基、2′-O-烷基-n(O-烷基)、3′-O-烷基、3′-O-烷基-n(O-烷基)、2′-氟、2′-脱氧-赤戊呋喃糖基、2′-O-甲基核糖核苷、氨基甲酸甲酯、碳酸甲酯、反向碱基(如反向T)或这些主链的嵌合形式。
本文使用的术语“CCR3受体和IL-3/IL-5/GM-CSF受体的共同β链的反义寡核苷酸”各自指分别靶向序列的寡核苷酸,所述序列影响CCR3趋化因子受体和IL-3/IL-5/GM-CSF受体的共同β链的表达和/或活性。这些寡核苷酸包括但不限于CCR3趋化因子受体和IL-3/IL-5/GM-CSF受体的共同β链、DNA编码序列、DNA启动子序列、DNA增强子序列、mRNA编码序列等。
如上所述,本发明的一个实施方案提供靶向序列的反义寡核苷酸,该序列影响CCR3趋化因子受体和IL-3/IL-5/GM-CSF受体的共同β链的表达和/或活性。在一个实施方案中,所述反义寡核苷酸可包含这些序列的片段或变体,本领域技术人员会理解,所述片段或变体可改变寡核苷酸组成和/或长度,但保持或增加寡核苷酸下调基因表达的活性。在另一个实施方案中,本发明提供至少两个反义寡核苷酸的组合,所述两个反义寡核苷酸来自鉴别为SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14的序列。
本文所用术语“处理”、“治疗”、“疗法”等一般表示获得期望的药理和/或生理作用。这种作用可以是预防性的,即完全或部分预防疾病或其症状,和/或可以是治疗性的,即部分或完全治愈疾病和/或减轻疾病引起的不利作用。本文所用“处理”涵盖对如先前定义的对象中疾病的任何处理,所述对象尤其是人,包括:
(a)预防对象发生疾病,所述对象可能容易发生该疾病但仍未诊断为具有该疾病;
(b)抑制疾病,即停止其发展;或
(c)缓解疾病,即引起疾病消退。
术语“药物可接受的”在本文中用于载体、表面活性剂和组合物时表示可接受用于治疗患者对象的物质,所述物质无毒或对于通过本文所述任何途径给予来说不是不可接受的。
本发明一般涉及通过给予治疗有效量的本发明反义寡核苷酸化合物而治疗对象,所述化合物包括siRNA、核酶、单链或双链的短核苷酸序列,包括可与靶核酸互补或可任选地如上所述修饰的RNA和/或DNA;具有所述RNA寡核苷酸的至少一部分的RNA寡核苷酸,所述RNA寡核苷酸能与RNA杂交形成寡核苷酸-RNA双链体;或嵌合寡核苷酸,它们将下调或抑制内源性基因体内表达。
所述“治疗有效”量指无毒性但足以提供期望治疗效果的反义寡核苷酸化合物的量。在此情况下,该剂量的反义寡核苷酸化合物有效缓解、改善、或预防待治疗病症或疾病(如与变态反应、哮喘、炎性疾病如炎性呼吸道疾病相关的疾病)的症状。
本文使用的术语“变态反应”描述了机体对物质的任何不期望的免疫应答,机体对所述物质已变成超敏性的。
本发明的制剂优选直接给予作用部位,因此优选是局部制剂,包括但不限于口服、颊内、肺内、直肠、子宫内、肿瘤内、经鼻、鞘内、可吸入、透皮、皮内、腔内、离子导入、经眼、阴道、关节内、经耳、经粘膜、直肠、缓释或肠溶包衣制剂。不限于任何前述制剂,本发明的制剂还可为颅内、肌内、皮下、血管内、腺体内、器官内、淋巴内、腹膜内、静脉内和可植入制剂。用于制剂的载体可以是例如固体和/或液体载体。
对于应适于与本发明的寡核苷酸化合物组合,以使组合物/制剂适于给予来治疗呼吸系统疾病的其它载体,可以参考“Remington′sPharmaceutical Sciences”,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985。
任选地,当前描述的寡核苷酸可与各种生理载体分子配制。当前描述的寡核苷酸还可与增强其进入靶细胞的能力的分子复合。这种分子的实例包括但不限于糖、聚胺、氨基酸、肽、脂质和对细胞生长不可或缺的分子。例如,寡核苷酸可与脂质组合,产生的寡核苷酸/脂质乳浊液或脂质体悬浮液尤其可有效增加寡核苷酸的体内半寿期。
本文提供的药物组合物可包含上述反义寡核苷酸化合物和一种或多种药物可接受的表面活性剂。增强本发明的反义寡核苷酸吸收的适宜表面活性剂或表面活性剂成分先前已描述于美国申请公开第2003/0087845号,该申请中关于表面活性剂的内容结合到本文中。该申请提出,合适的表面活性剂“...包括合成和天然以及全长和截短形式的表面活性蛋白A、表面活性蛋白B、表面活性蛋白C、表面活性蛋白D、表面活性蛋白E、二饱和磷脂酰胆碱(除了二棕榈酰以外)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、泛醌、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、棕榈酰溶血磷脂酰胆碱、脱氢表雄酮、多萜醇、硫苷脂酸(sulfatidic acid)、甘油-3-磷酸、磷酸二羟基丙酮、甘油、甘油-3-磷酸胆碱、二羟基丙酮、棕榈酸、胞嘧啶二磷酸(CDP)二酰基甘油、CDP胆碱、胆碱、磷酸胆碱;以及天然和人工片状体,它们是以下表面活性剂成分的天然载体溶媒:ω-3脂肪酸、多烯酸(polyenicacid)、多烯酸(polyenoic acid)、卵磷脂、棕榈酸、环氧乙烷或环氧丙烷的非离子性嵌段共聚物、单体和多聚体形式的聚氧丙烯、单体和多聚体形式的聚氧乙烯、具有右旋糖酐和/或烷酰基侧链的聚(乙烯胺)、Brij35TM、Triton X-100TM和合成表面活性剂ALECTM、ExosurfTM、SurvanTM和AtovaquoneTM等。这些表面活性剂可作为制剂中的单一表面活性剂或多组分表面活性剂的一部分使用,或作为对反义寡核苷酸的5′和/或3′末端的共价结合添加物使用。”
本发明组合物的反义组分可包含在脂质颗粒或囊泡(如脂质体或微晶)中的药用制剂中。如美国专利6,025,339所述,脂质颗粒可以是任何合适的结构,如单层或多层,只要所述反义寡核苷酸包含于其中。带正电的脂质如乙基硫酸N-[1-(2,3-二油酰氧)丙基]-N,N,N-三甲基铵或“DOTAP”,对于这样的颗粒和囊泡是特别优选的。这种脂质颗粒的制备是公知的。参见例如Janoff等的美国专利第4,880,635号、Kurono等的4,906,477号、Wallach的4,911,928号、Wallach的4,917,951号、Allen等的4,920,016号、Wheatley等的4,921,757号;等等。
本发明的组合物可以用运输反义寡核苷酸化合物到期望部位如肺的任意方式给予。本文公开的反义化合物可通过任何合适的方式给予患者的肺,但优选通过气溶胶吸入给予,所述气溶胶由包含反义化合物的可呼吸颗粒组成。
本发明的组合物可以作为包含可呼吸大小的颗粒的制剂给予呼吸系统,例如颗粒大小小到足以在吸入时通过鼻、口和咽喉并穿过肺的支气管和肺泡。一般来说,可呼吸颗粒大小范围在约0.5到10微米之间。包含在气溶胶中的不可呼吸大小的颗粒倾向于沉积在咽喉并被吞咽,因此气溶胶中不可呼吸颗粒的量优选最少化。对于经鼻给予,优选10-500微米(μM)范围的颗粒大小,以确保保留在鼻腔中。
可以通过将反义化合物与合适的溶媒如无菌无热源水或磷酸缓冲盐水混合,制备用于产生气溶胶的活性化合物(反义寡核苷酸化合物)的液体药物组合物。
含反义化合物的固体颗粒组合物可以任选含有用于辅助形成气溶胶的分散剂以及其它治疗性化合物。合适的分散剂是乳糖,它可以与反义化合物以任意合适的比例混合,如1∶1的重量比。
反义组合物可以抗支气管收缩、抗变态反应和/或抗炎有效量给予,该量取决于待治疗疾病的程度、患者对象的身体状况、具体制剂、给药途径、向对象给药的时间安排等。一般来说,期望寡核苷酸细胞内浓度是0.05-50μM,或更具体的0.2-5μM。对于向哺乳动物患者如人给药,一般使用约0.001、0.01、0.1或1mg/Kg直至约50或100mg/Kg或更多的剂量。但是,也考虑了其它剂量。根据活性化合物在任何具体制剂中的溶解性,每日剂量可以分成一个或几个单位剂量给予。
含反义化合物的液体颗粒的气溶胶可通过任意合适的手段产生,如用喷雾器。喷雾器是通过使压缩气体(通常是空气或氧气)加速通过狭窄的文丘里喷嘴或者经超声搅动的方式,将活性成分的溶液或悬液转化成治疗性气溶胶雾的商品装置。用于喷雾器的合适制剂包含在液体载体中的活性反义寡核苷酸成分,其量可达制剂的40%(重量/重量),优选少于制剂的20%(重量/重量)。载体一般是水或稀的醇水溶液,优选通过加入例如氯化钠而与体液等渗。任选的添加剂包括防腐剂如羟基苯甲酸甲酯(如果制剂不是无菌制备的话)、抗氧化剂、抗细菌剂、调味剂、挥发性油、缓冲剂和乳化剂以及其它的制剂表面活性剂。
包含活性寡核苷酸化合物和药物可接受表面活性剂的固体颗粒气溶胶同样可用任何固体颗粒药物气溶胶发生器产生。用于向对象给予固体颗粒药物的气溶胶发生器产生可呼吸的颗粒(如上所释),并以适于人给药的速率产生一定体积的气溶胶,其中含预定计量的药物剂量。活性寡核苷酸成分一般占制剂的0.1-100重量/重量。第二类示例性气溶胶发生器包括计量剂量吸入器。计量剂量吸入器是加压气溶胶分散器,一般含有活性成分在液化推进剂中的悬液或溶液制剂。使用时这些装置通过适用于递送计量体积(一般为10-150μL)的阀门释放制剂,以产生含活性成分的细颗粒喷雾。合适的推进剂包括某些氯氟碳化合物,例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或氢氟烷及其混合物。制剂还可以含有一种或多种助溶剂(如乙醇)、乳化剂和其它制剂表面活性剂(如油酸或失水山梨醇三油酸酯)、抗氧化剂和合适的调味剂。
无论是由固体还是液体颗粒形成的气溶胶,都可通过气溶胶发生器以约1-150升/分钟的速率产生。
在本发明的再一方面,提供一种制品,它包括包装材料,包装材料内含有药物可接受的反义寡核苷酸组合物,该组合物治疗学有效地治疗与变态反应、哮喘、鼻炎和炎症疾病相关的病症。在一个实施方案中,组合物包含可有效抑制CCR3趋化因子受体基因或IL-3/IL-5/GM-CSF受体的共同β链基因的反义寡核苷酸化合物,所述寡核苷酸化合物与该基因至少50%互补。在另一方面,组合物包含至少两种反义寡核苷酸化合物,反义寡核苷酸化合物各自能下调CCR3趋化因子受体和IL-3/IL-5/GM-CSF受体基因的共同β链,每种反义寡核苷酸化合物的存在浓度使得反义寡核苷酸化合物单独使用时实际上不能有效下调所针对基因,而反义寡核苷酸化合物的组合有效下调反义寡核苷酸所针对基因中的至少一种。
在一个实施方案中,制品的包装材料包含标签,它指示组合物可用于治疗炎症呼吸系统疾病,并可另外包括所述疾病是变态反应、鼻炎和哮喘之一的说明。
在另一个实施方案中,制品的包装材料包含标签,它指示组合物可用于治疗炎性呼吸系统疾病,并可另外包括所述疾病是变态反应、哮喘、嗜酸性粒细胞增多症、支气管炎、鼻炎或窦炎之一的说明。
对于本发明目的,包装材料可以是包装本发明的含核苷酸组合物的任何适宜材料,包括瓶或其它容器(塑料或玻璃)、纸盒、管或其它保护性包装材料。人们将会意识到,包装可以根据寡核苷酸组合物的性质而变化,例如液体制剂可以不同于气溶胶制剂的形式包装。
参考实施例将更容易理解本发明,给出这些实施例是为了阐述以下的本发明,而不是限制其范围。就这些实施例而言,使用以下的方法和材料。
实施例
材料和方法
材料
实验使用以下的材料和试剂:RPMI 1640(Wisent,目录号10040CV);FBS(胎牛血清,Wisent,目录号80150);青霉素-链霉素(GIBCO,目录号15140-122);HEPES(Wisent,目录号26060CI);L-谷氨酰胺(Gibco,目录号25030-081);丙酮酸钠(Wisent,目录号25000-Ci);无菌PBS(GIBCO,目录号25030-081);Hanks平衡盐溶液(HBSS,cellgro,目录号20021-cv);RT-PCR试剂盒的Superscript首链合成系统(Invitrogen,目录号11904-018);dNTP(Invitrogen,目录号10297-018;oligo(dT)12-18(Invitrogen,目录号11904-018);Qiagen RNAeasy Mini Kit(Qiagen,目录号74106);Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen,目录号28704);Qiagen PCR提取试剂盒(Qiagen,目录号28104);β-巯基乙醇(Sigma,目录号M-6250);99%乙醇(Commercial alcohols Inc.,Brampton,Ontario,Canada);QiaVac 24 Manifold(Qiagen,目录号19403);一次性Vacconnectors(Qiagen,目录号19407);DNase I试剂盒(Fermentas;目录号ENO521);RiboGreen定量试剂(Invitrogen-IMolecular probes,目录号R-11490);Taq PCR核心试剂盒(Qiagen,目录号201223);Hema-3染色套装(Fisher scientific Co.目录号122-911,批号999901);Alamar Blue(Biosource,目录号DAL1100);人CCR3引物对(R&D systems,目录号RDP-209-025);人GAPE5H引物对(R&Dsystems,目录号RDP-39-025);Ficoll(Amersham Biosciences;目录号:17-1440-03);抗-CD16(嗜酸性粒细胞纯化试剂盒,Miltenyi Biotec,Auburn,CA,目录号130-045-701);rhEotaxin(Biosource,目录号PMC1434);趋化室和膜(NeuroProbe,Nucleopore-Neuroprobe,CabinJohn,MD);人血清白蛋白(SIGMA;目录号);抗人IL-3/IL-5/GM-CSF受体β链(小鼠单克隆IgG2b;Santa Cruz Biotechnology,目录号sc-457);抗小鼠IgG2b(山羊单克隆,Alexa Fluor 488,Molecular Probes,目录号A-21141);抗人CCR3抗体(大鼠单克隆,IgG2a,R&D,目录号MAB 155);抗大鼠IgG(山羊单克隆,Alexa Fluor 633,Molecular Probes,目录号A-21094);rhGM-CSF(R&D systems,目录号215-GM-005);rhIL-3(R&D systems,目录号203-IL-010);rhIL-5(R&D systems,目录号205-IL-005);rhIL-2(R&D systems,目录号202-IL-010);TOP004-(n-1)(Biosource,在3′末端少一个核苷酸的寡核苷酸);TOP005-(n-1)(Biosource,在3′末端少一个核苷酸的寡核苷酸);TOP004-TP(Biosource,模板探针);TOP004-(n-1-TP-T)(BiosourceBiosource,模板探针);LP(Biosource,连接探针);TOP005-TP(Biosource);TOP004-(n-1-LP-A,Biosource);Reacti-Bind中性抗生物素蛋白包被的高结合量平板(Pierce,目录号15508);T4 DNA连接酶5 U/mL(Roche,目录号799 009);抗DIG-AP抗体(Roche,目录号1093274);SuperBlock Blocking Buffer in PBS(Pierce,目录号37515);磷酸甲基伞形酯(methylumbellyferyl phosphate)碱性磷酸酶底物(Molecular Probes,目录号M-6491);含ASM8的猴血浆样品;MW96板清洗器(Beckman Coulter);96-孔大容量聚丙烯板(Nunc);EppendorfResearch Brand的微量移液器;黑色不透明96-孔板(Costar,目录号3915)。
反义寡核苷酸合成和序列鉴别
用Gene Assembler-PlusTM(Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ,USA)合成寡核苷酸,硫代磷酸酯化,并通过HPLC纯化。TOP005用于图5-7中阐述的实验,所述实验用cGMP寡核苷酸实施。反义序列和鉴别描述于表1。
表1
反义编号 | 反义序列5′-3′ | GeneBank登录号和/或SEQ ID NO. |
828 | 5-GTTACTACTTCCACCTGCCTG-3 | AF224496-SEQ ID NO.1 |
773 | 5-TGGAAAAGCGACACCTACCTG-3 | AF247360-SEQ ID NO.2 |
786 | 5-CCCTTTTCCTGGAAAAGCGACA-3 | AF247360-SEQ ID NO.3 |
788 | 5-CTCCCTTTTCCTGGAAAAGCG-3 | AF247360-SEQ ID NO.4 |
793 | 5-TCCACCTCCCTTTTCCTGGA-3 | AF247361-SEQ ID NO.5 |
807 | 5-CCTCCTTGTTCCACCTCCCTT-3 | AF247362-SEQ ID NO.6 |
RZ1 | 5-ACCCATTGGCATTGCTCATTT-3 | AF247360-SEQ ID NO.7 |
RZ2 | 5-TCCTTGCAATTAGTGCTGCTT-3 | AF247361-SEQ ID NO.8 |
RZ3 | 5-TCGTGCAGTTCTTCTTTTTCA-3 | AF247362-SEQ ID NO.9 |
RZ4 | 5-CAGACTAGCTTCTCAGTTTTG-3 | AF247363-SEQ ID NO.10 |
RZ5 | 5-TGCTAATTTAGTGAAGTCCTT-3 | AF247364-SEQ ID NO.11 |
RZ6 | 5-CTTCTCCCTGAAAATCTCTTCT-3 | AF224495-SEQ ID NO.12 |
107A | 5-GGGTCTGCAGCGGGATGGT-3 | NM_000398-1 |
A86 | 5-CTGGGCCATCAGTGCTCTG-3 | NM_178329-SEQ ID NO.29 |
*top004 | 5-GGGTCTGCXGCGGGXTGGT-3 | NM_000395-1-SEQ ID NO.13 |
*top005 | 5-GTTXCTXCTTCCXCCTGCCTG-3 | AF224496-SEQ ID NO.14 |
*:X= | X代表腺苷残基的DAP修饰 |
细胞和细胞培养
使用以下的细胞系:TF-1(人红白血病细胞系,ATCC#CRL-2003);EOL-1(人急性骨髓“嗜酸性”白血病细胞系;DSMZ#ACC386)和U937(人组织细胞淋巴瘤细胞系;ATCC#CRL-1593.2)。EOL-1和U937在具有2mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mM Hepes、1mM丙酮酸钠、10%FBS、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL的RPMI 1640中培养。TF-1培养使用相同培养基,只是以2ng/mL加入rhGM-CSF。
HL-60克隆15细胞培养和分化
如Tiffany等,1998,J.Immunol 160:1385-1392所述,将HL-60克隆15分化为嗜酸性粒细胞。简单地讲,早幼粒细胞细胞系HL-60于37℃和5%CO2中保持在具有L-谷氨酰胺、补加10%热失活FBS和25mM N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-羟基丙磺酸](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)的RPMI 1640,pH 7.6中。通过用0.5μM丁酸(SigmaChemical Co.,St.Louis,MO)处理细胞至少5天,诱导细胞分化为嗜酸性粒细胞样表型。在细胞分化后使用FACS分析评价IL-3/IL-5/GM-CSF受体的共同β链的存在情况。
细胞生存和反义处理
使用Alamar Blue测试按照生产商的方法系统地测定细胞生存。通过离心(5分钟、1500RPM,室温)收集EOL-1、TF-1、HL-60或U937细胞,用3×HBSS清洗,以1×106细胞/mL重悬浮在无血清的RPMI培养基中。一式三份将1×106细胞与精确浓度的反义物(0-20μM)在无菌细管中温育5分钟。然后将各个反应物转移到12孔平板中,于37℃、5%CO2中温育5小时,用于mRNA定量,或温育12小时,用于蛋白分析。加入RPMI/FBS 20%至10%FBS的终浓度,细胞于37℃、5%CO2中温育过夜。离心(5分钟、1500RPM,室温)收集细胞,用1×HBSS清洗。纳入对照实验,其由没有反义寡核苷酸或存在错配寡核苷酸的细胞处理组成。
人嗜酸性粒细胞的纯化
通过Ficoll-Hypaque梯度(1.077g/mL,350g,30分钟)离心全血,获得棕黄层,由此获得粒细胞分离级分。用抗CD16包被的免疫磁性微珠于4℃使用磁性细胞分拣系统Miltenyi Biotec(Auburn,CA)通过负选择进一步纯化人嗜酸性粒细胞。通过Giemsa染色估计嗜酸性粒细胞群的纯度一般为92%-100%。
人和猕猴PBMC的纯化
猕猴的新鲜血得自ITR Laboratories Canada Inc。通过对正常供体的EDTA K3血液进行Ficoll-Hypaque密度梯度离心,分离PBMC。将PBMC以2×106细胞/mL/孔接种在12孔平板中的RPMI 1640细胞培养基中,所述培养基补加10%热失活FBS、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL。细胞生存使用Alamar Blue评价,一般为85%-95%。
人PBMC和嗜酸性粒细胞转染
通过离心(5分钟、1500RPM,室温)收集人PBMC,用3×HBSS清洗,以2×106细胞/mL重悬浮在含10μg/mL PHA的RPMI培养基5%血清中。以一式三份将2×106细胞与精确浓度的反义物(0-20μM)在无菌细管中温育5分钟。然后将各个反应物转移到12孔平板中,于37℃、5%CO2中温育过夜,用于mRNA定量,或温育48小时或48小时以下(在指明时),用于蛋白分析。通过离心(5分钟、1500RPM,室温)收集细胞,用1×HBSS清洗。纳入对照实验,其由在没有反义寡核苷酸或存在错配寡核苷酸的细胞处理组成。
通过离心(5分钟、1500RPM,室温)收集纯化的人嗜酸性粒细胞,用3×HBSS清洗,以2.5×106细胞/mL重悬浮在2ng/mL rhGM-CSF或rhIL-5的RPMI培养基10%血清中过夜。第二天,用HBSS清洗细胞两次,以2.5×106细胞/mL重悬浮在RPMI培养基5%血清中,一式三份与精确浓度的反义物(0-20μM)在无菌细管中温育5分钟。然后将各个反应物转移到12孔平板中,于37℃、5%CO2中温育过夜,用于mRNA定量,或温育48小时或48小时以下(在指明时),用于蛋白分析。通过离心(5分钟、1500RPM,室温)收集细胞,用1×HBSS清洗。纳入对照实验,其由在没有反义寡核苷酸或存在错配寡核苷酸的细胞处理组成。
猴PBMC转染
通过离心(5分钟、1500RPM,室温)收集猕猴PBMC,用3×HBSS清洗,以2×106细胞/mL重悬浮在RPMI培养基5%血清和10μg/mLPHA(或10ng/mL rhIL-2,在指明时)中。以一式三份将2×106细胞与精确浓度的反义物(0-20μM)在无菌细管中温育5分钟。然后将各个反应物转移到12孔平板中,于37℃、5%CO2中温育过夜,用于mRNA定量,或温育48小时或48小时以下(在指明时),用于蛋白分析。通过离心(5分钟、1500RPM,室温)收集细胞,用1×HBSS清洗。纳入对照实验,其由在没有反义寡核苷酸或存在错配寡核苷酸的细胞处理组成。
流式细胞术分析
计数细胞,并以1×106细胞/mL重悬浮。于20-25℃以400×g离心细胞3分钟,废弃上清液。此后,将细胞沉淀重悬浮在50μL FACS缓冲液(1×PBS,pH7.2-7.4;0.5%人白蛋白;2.5%人血清)中,37℃温育30分钟。不废弃上清液,将一抗直接加入管中并混合。于4℃避光温育1小时,(抗人CCR-3抗体以1μg/0.5×106细胞使用。抗人共同β链以2μg/0.5×106细胞使用)。用2mL FACS缓冲液清洗,以400×g离心3分钟,废弃上清液。对于同种型对照,用300μL FACSFix(1×PBS,pH 7.2-7.4;4%多聚甲醛)重悬浮细胞沉淀,于4℃避光保持。
为标记CCR3和共同β链,用50μL FACS缓冲液重悬浮细胞沉淀,并加入二抗,(抗大鼠IgG2a Alexa Fluor 633以1μg/0.5×106细胞使用。抗小鼠IgG2b Alexa Fluor 488以2μg/0.5×106细胞使用)。4℃避光温育1小时。用2mL FACS缓冲液清洗,以400×g离心3分钟,并废弃上清液。用300μL FACSFix固定标记细胞,于4℃避光保持。数据在BD biosciences FACS calibur中分析,用Cell Quest程序处理。
钙动员测定
嗜酸性粒细胞以1×107细胞/mL重悬浮在含10%FBS的RPMI1640中,通过与5M Fura-2AM(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)于室温在黑暗中温育30分钟而负载。细胞(1×106细胞/mL)清洗3次,重悬浮在盐水缓冲液(138mM NaCl、6mM KCl、1mM CaCl2、10mMHepes、5mM葡萄糖和1%BSA,pH 7.4)中。然后将各2mL的细胞悬浮液转移至石英比色皿,将石英比色皿置于发光分光光度计LS50B(Perkin-Elmer,Beaconsfield,UK)中。通过记录在趋化因子作用下于340和380nm顺序激发后于510nm发射的荧光比率,检测细胞的Ca2+动员。
趋化性测定
使用具有5mm孔的无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜(Nucleopore-Neuroprobe),在48孔(NeuroProbe,Cabin John,MD)室中评价体外趋化性。对照或反义物处理的嗜酸性粒细胞以1×106细胞/mL悬浮在含0.25%BSA的RPMI 1640培养基中。上层孔和下层孔分别含50μL和31μL细胞悬浮液,后一悬浮液补加优化浓度的嗜酸性粒细胞趋化因子(80ng/mL)。在于37℃、5%CO2中温育1小时后,记数存在于下层孔中的迁移细胞。在没有嗜酸性粒细胞趋化因子的情况下测定自发迁移,并计算入结果中。
猴反义物处理和毒性研究
该方法由ITR Laboratories Canada Inc.的动物关怀委员会(ACC)回顾和评价。所有动物都按照Canadian Council on Animal Care出版的现行“Guide to the Care and Use of Experimental Animals”和NIH出版物“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”概述的原则照料。
在连续14天内通过每日一次吸入接触,给予由两种寡核苷酸(TOP 004和TOP 005)的1∶1混合物组成的ASM8,在此期间研究所述ASM8的毒性,以表征其单个寡核苷酸组分的毒代动力学模式。还评价14天恢复期后ASM8的任何作用的可逆性。还评价14天吸入接触ASM8后的任何系统性超敏状况(可通过皮内注射(ID)检测)。
溶媒对照制品是USP注射级0.9%氯化钠溶液,按原样使用。通过混合TOP 004和TOP 005与USP注射级0.9%氯化钠溶液,以获得1∶1混合物,制备用于气溶胶化的测试制品(ASM8)的液体制剂。目标剂量的溶液浓度基于纯寡核苷酸。因此,将根据纯度调整的校正系数应用于测试制品组分的称重和分配。对于TOP 004,校正系数是1.15,对于TOP 005,校正系数是1.24。在14天接触期开始前,称出每个每日接触所需要的各相应寡核苷酸的量,混合(以粉末形式)在设计用于每日接触的小瓶中,于-80℃冷冻储存。在每日接触时,由冷冻储存中取出正确的小瓶,将内容物溶解在盐水溶媒中,通过无菌0.2μm滤器过滤,制剂仅用于当天的接触。
每组的动物数目和处理陈述于以下的表2和3:
表2
组别 | 处理 | 动物数目 | |||
极期 | 恢复期 | ||||
雄性 | 雌性 | 雄性 | 雌性 | ||
1 | 溶媒对照 | 3 | 3 | 1 | 1 |
2 | ASM8低剂量 | 3 | 3 | - | - |
3 | ASM8中剂量 | 3 | 3 | - | - |
4 | ASM8高剂量 | 3 | 3 | 1 | 1 |
体重范围 在第1天处理时为2-4kg
年龄范围 在第1天处理时为青年
表3
ASM8接触浓度和剂量水平(4)
组别 | 处理 | ASM8的剂量(mg/kg/天),(1) | ASM8的气溶胶浓度(mg/L),(3) |
1 | 溶媒对照,(2) | 0 | 0 |
2 | ASM8低剂量 | 0.05 | 0.00795 |
3 | ASM8中剂量 | 0.25 | 0.0397 |
4 | ASM8高剂量 | 2.5 | 0.3976 |
(1):基于估计的2.5kg体重。
(2):溶媒对照动物接触由溶媒溶液产生的气溶胶,其气溶胶浓度就质量而言一般被认为等于高剂量组产生的气溶胶浓度。
(3):目标剂量和气溶胶浓度基于测试制品的绝对纯度,该绝对纯度通过在剂量溶液配制过程中使用纯度的合适校正系数获得。
(4):使用下式:DL=Ec×RMV×T/BW估测接触期当中获得的剂量水平,其中
DL=获得的剂量水平(mg/kg/天)
Ec=传递给动物的实际浓度(mg/L空气)
RMV=按照Bide等,2000,J.App.Toxicol.,20,273-290的公式估测的分钟体积(mL/min),该公式详细为:RMV(L)=0.499×W(kg)0.809
T=时间,每日接触的持续时间(分钟)
BW=接触期当中的平均体重(kg)
假定此估测的所获剂量100%沉积在呼吸道中。
对所有动物进行生命观测,包括死亡率、临床检查、体重、食物消耗、心电图、检眼镜检查、临床病理、血浆水平测定、超敏检验。
在处理期结束时,麻醉动物,并进行解剖病理学检验、验尸、器官重量检验、组织病理学检验。
在给予ASM8后24小时,使用半定量RT-PCR检测对高剂量处理猕猴气管样品的共同β链和CCR3 mRNA表达是否存在任何的ASM8抑制作用。
用于猴血浆中的寡核苷酸检测的HL-ELISA
在给药前的第1天和第14天、给药后的0.5、1、3、6和24小时由各只动物收集猴血样(各约1mL)。血样于4℃离心,以产生血浆,分离血浆,在干冰上冷冻,直至使用杂交/连接ELISA定量测定对TOP004和TOP005(以及近似的n-1-代谢物)浓度进行测定分析。
通过连续稀释猴血浆样品制备寡核苷酸的标准曲线溶液。通常标准曲线的工作范围是125nM至0.007629nM。适当稀释血浆样品,用于检测标准曲线的线性范围,制备一个以上稀释度用于精确检测。
将各个标准品或血浆样品等份(200μL)分在96孔聚丙烯板中,其中将200μL适宜的模板探针溶液加至200μL血浆样品中,37℃温育60分钟。以一式两份将150μL转移至NeutrAvidin包被的板,于37℃温育30分钟。使用板清洗器用清洗缓冲液清洗该板4次(每次200μL)。加入150μL连接探针溶液,之后于室温温育120分钟。在温育后,使用板清洗器用清洗缓冲液度清洗样品2次(每次200μL),之后使用板清洗器用ddH2O清洗3次(200μL)。加入150μL 1∶2000抗DIG-AP稀释液(在Super block,Peirce中),之后于室温温育30分钟。使用板清洗器用清洗缓冲液清洗样品4次(200μL)。然后加入150μL10μM MUP试剂,接着室温温育60分钟。读取355ex/485em的荧光。
用于HL-ELISA的溶液:
模板探针溶液(0.05μM模板探针、60mM Na2HPO4 pH 7.4、0.9MNaCl、0.24%Tween-20);10×连接缓冲液(0.8248M Tris-Cl pH 7.5,0.0828 M MgCl2、1.93%DTT);ATP 100mM溶液(在水中制备,用NaOH调节至pH 7±0.5);连接探针溶液(在1×连接缓冲液中的0.067μM寡核苷酸、0.025单位/mL T4 DNA连接酶、0.05mM ATP);清洗缓冲液(25mM Tris-Cl pH 7.2、0.15M NaCl、0.1%Tween)。
猴气管匀浆和RNA提取
使用Polytron PT 1200(Brinkmann Instruments)匀浆猴气管,使用Qiagen RNAeasy小型试剂盒(Qiagen,Mississauga ON,Canada)提取总RNA,接着进行DNA酶I消化。使用Ribogreen荧光测定(InvitrogenCorporation,Burlington ON,Canada)定量总RNA。使用SuperscriptTM IIRT试剂盒(Invitrogen Corporation,Burlington ON,Canada),使用首链cDNA合成由1-2μg RNA制备cDNA。
RNA提取、逆转录和聚合酶链反应
按照Qiagen RNAeasy小型试剂盒方法,使用Qiagen的QiaVac 24歧管由细胞沉淀提取RNA,按照Fermentas方法用DNA酶I处理RNA。使用RiboGreen试剂按照生产商的方法定量RNA。或者,使用分光光度计定量RNA。使用Invitrogen的RT-PCR试剂盒的Superscript首链合成系统以20μL总反应体积进行首链cDNA制备。简单地讲,首先于65℃使1-2.5μgRNA和0.5mM的每种dNTP、0.5μg oligo(dT)12-18变性5分钟,于冰上冷冻至少1分钟。混合物42℃温育2分钟,加入第二种预混合物,其含有1×首链缓冲液、10mMDTT、40单位RNaseOUT和40单位Superscript II RT。反应物于42℃温育10分钟,于50℃温育1小时,通过于70℃加热15分钟失活。用在1×PCR缓冲液(10×:Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、15mM MgCl2;pH 8.7)中的优化量cDNA(对于CCR3为100-250ng,对于G3PDH为1-10ng)、0.2mM每种dNTP、8.5pmol每种PCR引物和2.5单位Taq DNA聚合酶以总反应体积50μL进行PCR。将混合物于94℃加热5分钟,接着进行30-35个循环,每个循环包括:94℃温育1分钟、60℃温育45秒以及72℃温育45秒。补充延伸于72℃进行10分钟。在溴化乙锭存在下通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。使用Total Lab软件(背景扣除采用滚球法;Ultra Lum Inc.,Model UC4800)进行PCR产物的定量。PCR引物是:人CCR3引物对(R&D systems,目录号RDP-209-025);人GAPDH引物对(R&D systems,目录号RDP-39-025)和示于表4的引物。系统性地纳入对照实验,其由对非RT-RNA进行的PCR组成。
表4.
引物标识 | 引物序列:5′-3′ | SEQ ID NO. |
huBcATG.for | 5-ATGGTGCTGGCCCAGGG-3 | 15 |
huBcATGl.for | 5-CCAGGGAGATGGTGCTGG-3 | 16 |
huBc6.rev | 5-CCGCTTGTAGACCACCTCAAC-3 | 17 |
huBc7.rev | 5-CCTTGGCTGAACAGAGACGATG-3 | 18 |
mkCCR3.for | 5-TGCTCTGTGAAAAAGCCGATG-3 | 19 |
mkCCR3-2.rev | 5-ACCAAAAGTGACAGTCCTGGC-3 | 20 |
huBc4.for | 5-AAGTCAGGGTTTGAGGGCTATG-3 | 21 |
huBc4.rev | 5-CAAGGGGGCAGAGACAGGTAG-3 | 22 |
G3pdh.for | 5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 | 23 |
G3pdh.rev | 5-TCCACCACCCCTGTTGCTGTA-3 | 24 |
寡核苷酸化学降解
为在分析前诱导TOP 004和TOP 005降解(以便确保分辨完整分子和降解产物),进行以下处理:
*脱嘌呤:将ASM8以0.5mg/mL终浓度重悬浮在30%CH3COOH中,于室温温育3、4或6小时。通过加入5体积水终止反应,将混合物置于-20℃,然后在Speed-Vac中冻干,以去除乙酸。
*切割:将脱嘌呤的寡核苷酸重悬浮在0.2M NaOH(0.5mg/mL)中,于50℃温育1小时,储存在-20℃或通过HPLC分析。
TOP004和TOP005的HPLC分级分离
称重ASM8,以0.5mg/mL的浓度(0.25mg/mL TOP004和0.25mg/mL TOP005)溶解在PBS中,HPLC梯度参数示于下表5。
表5.HPLC梯度参数:
时间(分钟) | 流速(ml/分钟) | %缓冲液A | %缓冲液B |
0 | 1 | 100 | 0 |
5 | 1 | 100 | 0 |
10 | 1 | 93 | 7 |
100 | 1 | 65 | 35 |
102 | 1 | 20 | 80 |
122 | 1 | 20 | 80 |
124 | 1 | 100 | 0 |
144 | 1 | 100 | 0 |
146 | 0.1 | 100 | 0 |
用联结Waters 2487 Dualλ吸光度检测器并配有在线脱气器、烘箱和1500系列手动注射器Reodyne 7725i的Waters 1500系列二元HPLC泵进行HPLC分离。寡核苷酸混合物在Waters Protein Pak DEAE5PW阴离子交换柱(0.5cm×75cm)上分级分离,保持在60℃,通过260nm的UV吸收检测。寡核苷酸混合物(体积=25μL)在水中上柱(缓冲液A:水(MilliQ级)),通过逐渐增加缓冲液B(1M LiClO4,(0.22μm过滤))的比例使液相的离子强度增加,由固相(柱)洗脱寡核苷酸,由此进行洗脱。
在测定条件下,62.5μg的TOP 004或TOP 005中的任一个于260nm产生的可检测变化都>0.15吸光度单位(AU)。
寡核苷酸储存
将等份的ASM8(0.5mg/mL)的PBS溶液于-20℃、4℃、30℃和40℃温育2个月。在第4周和第8周时建立ASM8的HPLC谱。对照条件定义为任意储存时间前(即时间0)的ASM8 HPLC谱。HPLC系统由Waters的BreezeTM(V 3.30)软件驱动。
寡核苷酸解链曲线和热力学总结表
TOP 004和TOP 005以在1×PBS(以及其它缓冲系统)中的等摩尔浓度混合。总寡核苷酸浓度在约1.2-8.7mM的范围内。使用带有Tm附件的Beckman DU640分光光度计进行标准UV热变性法。在10-90℃的每个温度检测260nm的吸光度变化。使用MELTWINTM 3.5软件拟合解链曲线,以测定热力学参数。产生解链曲线和热力学总表的屏幕图像。
实施例1
针对CCR3受体的反义寡核苷酸的效力
分析几种针对CCR3趋化因子受体的反义寡核苷酸抑制受体mRNA表达和抑制受体功能的能力。在Eol-1和U937细胞系中进行CCR3反义初级筛选。这些细胞在上述正常细胞培养条件下表达CCR3mRNA。表6显示了针对人CCR3趋化因子受体的反义寡核苷酸。
参看表6,针对CCR3受体的反义寡核苷酸828(828:5′-GTTACTACTTCCACCTGCCTG-3′SEQ ID NO.1)有效抑制受体的mRNA表达,如表6中所示。
寡核苷酸828针对CCR3基因,在外显子1末端后的48个碱基处开始,21个碱基长。对828进行BLAST检索,除了针对CCR3受体以外,下一个最接近的同源性报告为低于72%的同源性。对获得两个互补序列的完全结合来说,这被看作是无意义的同源性。使用错配寡核苷酸(SEQ ID NO.32)评价828的特异性。错配对CCR3mRNA或在这些实验中用作内标的看家基因G3PDH没有作用。因此,反义寡核苷酸828是特异性的。
表6
反义标识 | 反义序列:5′-3′ | CCR3mRNA抑制的百分率 |
773 | 5-TGGAAAAGCGACACCTACCTG-3 | 73% |
828 | 5-GTTACTACTTCCACCTGCCTG-3 | 71% |
786 | 5-CCCTTTTTCCTGGAAAAGCGACA-3 | 45% |
788 | 5-CTCCCTTTTCCTGGAAAAGCG-3 | 37% |
793 | 5-TCCACCTCCCTTTTCCTTGGA-3 | 35% |
807 | 5-CCTCCTTGTTCCACCTCCCTT-3 | 31% |
实施例2
两个DAP取代的寡核苷酸在猴外周血单核细胞(PBMC)中的效力
如上所述,通过用DAP置换腺苷修饰反义寡核苷酸107A和828,以分别产生反义寡核苷酸TOP004和TOP005。同107A一样,TOP004(5′-GGGTCTGCXGCGGGXTGGT-3′(SEQ ID NO.13),其中X代表腺苷残基的DAP修饰)是19聚体,针对IL-3、IL-5和GM-CSF受体的共同β链。同828一样,TOP005(5′-GTTXCTXCTTCCXCCTGCCTG-3′(SEQ ID NO.14))是21聚体,针对趋化因子受体CCR3。
测试TOP004和TOP005这二者单独的和组合的效力。ASM8是部分含TOP004和TOP005这二者的组合物。在猴外周血单核细胞(PBMC)中进行效力研究,以验证该物种研究由ASM8药理学活性产生的毒性作用潜力的用途。
为使ASM8在猕猴中有效,其与其靶序列必须存在足够的同源性。猕猴β链序列不能由公开的数据库获得,因此克隆并测序包含TOP004序列区的节段。但是,可在相关的体外系统中直接评价灵长类物种间的TOP004活性。具体地说,外周血单核细胞(PBMC)制备物是测试TOP004功能性的合适系统,因为在大部分单核白细胞亚群(T和B细胞、单核细胞和巨噬细胞)上发现了共同β链。
仅可获得猕猴CCR3受体编码区的序列信息;在公开的数据库中不能获得TOP005结合区的序列信息。TOP005靶序列在人基因外显子1末端后的48个碱基处开始;此内含子跨越超过20kbp,使其克隆和测序变得很冗长。文献中的报告已表明,内含子序列中的某些节段在人和猴之间是保守的(Rahman等,2004.Genomics.8376-84)。进化研究也表明,在分类群(人、鲸和海豹)间存在同源内含子序列的节段,发现这些节段更经常地邻近内含子-外显子接合处(HareMP和Palumbi SR.,2003 Mol Biol Evol.20,969-978.)。在PBMC制备物中测试TOP005在猴中的功能性,其中在T和B细胞亚群上存在CCR3受体表达。
猕猴共同β链的测序
人、黑猩猩、猪、小鼠和大鼠的IL3/IL-5/GM-CSF受体基因的共同β链的分析揭示,在脊椎动物间有高度的基因序列相似性。设计用于克隆PCR的引物序列。引物序列来源于在人、黑猩猩、猪、小鼠和大鼠中高度保守的核苷酸序列,它们在共同β链基因的TOP004寡核苷酸区周围。表2显示了不同的引物。这些引物用于扩增猕猴PBMC cDNA的特异性产物。获得几种PCR产物,这取决于使用的引物组。使用嵌套PCR循环评价获得产物的特异性。克隆并测序阳性扩增子。
图1A显示了得自猕猴TOP004区的PCR扩增的3个克隆(分别为SEQ ID NO.25、26和27)的序列,其与人序列(SEQ ID NO.28)和黑猩猩(SEQ ID NO.33)、猪(SEQ ID NO.34)、大鼠(SEQ ID NO.35)和小鼠(SEQ ID NO.36)核苷酸序列中的相应区比对。非同源核苷酸用小写字母显示,而保守区用大写字母表示。TOP004区标下划线。与TOP004区互补的猕猴β链序列在全部3个测序克隆中都显示出显著同源性(19个碱基中有18个相同)。在第6位发现差异(由TOP 004的5′末端开始),其中“A”和“G”同时存在(“A”是预期碱基)。图1B显示了由克隆的猕猴(SEQ ID NO.37)和人(SEQ ID NO.38)、黑猩猩(emb.AADA01213660)(SEQ ID NO.39)、猪(U94688.1)(SEQ IDNO.40)、小鼠(NM_007780.1)(SEQ ID NO.41)和大鼠(NM_133555.1)(SEQ ID NO.42)的已知核苷酸序列预测的蛋白序列的比对。在第6位(由TOP 004的5′末端开始,其中“A”和“G”同时存在)存在的核苷酸差异对应于公开数据库中可获得的蛋白序列的共同β链中的谷氨酰胺(Q)或赖氨酸(K)密码子的第二个碱基。图1B中提供的数据表明,高度进化物种在TOP004互补区中含有谷氨酰胺残基(在人、黑猩猩、猪中的箭头)。谷氨酰胺由两个密码子CAA或CAG编码。在低等物种(小鼠和大鼠)中,谷氨酰胺被赖氨酸残基取代。赖氨酸由两个密码子AAA或AAG编码。在任一种情况下,第2位的腺苷都是保守的。因此,腺苷残基是有功能的猴序列的可能候选物,因为其存在于其它高等脊椎动物中。但是,不能排除GM-CSFβ链多态性。Freeburn等公开了β链受体的胞质内区中的几个突变,其可能是易感白血病的原因,(Freeburn等,1997,Exp.Hematol.,25:306-311)。图1A中给出的测序数据表明,鸟苷残基可存在于第6位,第6位由标下划线的TOP004序列的5′末端开始。在此情况下,密码子将为CGG,蛋白序列将在该位置包含精氨酸(R)残基。该位置的碱性碱基(H、K或R)使人联想到低等脊椎动物,不可能是灵长类动物的情况。
尽管有这种差异,但猴和人β链序列之间非常高度的同一性提示,TOP004在猕猴中有功能。
TOP004和TOP005在猕猴PBMC中的效力
在猕猴PBMC中分别单独地测试TOP004和TOP005选择性降低β链和CCR3表达的能力。将纯化的猴PBMC与不同浓度的TOP004和TOP005温育。
参看图2A和2B,条图A和条图B中给出了对由猴获得的10个以上血样进行的实验结果。条图显示用TOP004(A)和TOP005(B)降低猴PBMC中的β链和CCR3 mRNA表达。抑制是TOP004和TOP005特异性的,不是因为RNA降解或细胞存活丧失,以内标为证(对应于G3PDH mRNA的451-bp产物和细胞存活检验)。根据RT-PCR检测,TOP004特异性地降低初级猴PBMC中的共同β链表达(图2A)。10-15μM浓度获得最大效力,其中大部分观察到>50%的抑制。TOP004对猴β链的抑制证实了在人和猴β链mRNA序列之间显示出非常高度的同一性的测序数据(图1A)。同样,根据RT-PCR检测,TOP005转染入猴PBMC中降低了CCR3 mRNA的表达(图2B)。TOP005对CCR3 mRNA表达的最大抑制在低于β链所用浓度(10-15μM)的反义寡核苷酸浓度(0.05-2.5μM)获得。
据RT-PCR检测,mRNA表达抑制还在蛋白水平上得到流式细胞术(FACS)的确证。在不同浓度的TOP004或TOP005存在下,猴PBMC在生长培养基中温育36小时。如上所述进行流式细胞术定量。参看图3A和3B,条图显示了分别在TOP004和TOP005存在下猕猴PBMC中的β链和CCR3细胞表面表达。所述图表明,在用TOP004或TOP005处理后,观察到在7.5μM和0.5μM时表达β链和CCR3的细胞百分率分别获得30%以上的下降。
还测试了以1∶1比率组合(ASM8)的TOP004和TOP005在猕猴PBMC中分别选择性降低β链和CCR3表达的能力。猴PBMC在不同浓度的ASM8存在下温育过夜,然后通过RT-PCR评价β链和CCR3的表达。参看图4A和4B,显示了5个以上得自猴的血液的条图,代表在ASM8存在下猕猴PBMC中的β链和CCR3表达。在2.5-5μM的ASM8浓度范围观察到显著的β链抑制(图4A),这低于单独的TOP004获得最大抑制的最佳浓度范围(10-15μM(图2A))。这些结果表明,相比于单独的TOP004,TOP004和TOP005反义寡核苷酸的组合在阻断β链表达方面提供了增强效力和ASM8的协同作用。同样,根据RT-PCR的检测,将ASM8转染入猴PBMC中降低了CCR3 mRNA表达(图4B)。TOP005对CCR3 mRNA表达的最大抑制在低于β链所用浓度(2.5-5μM)的反义寡核苷酸浓度(0.05-5μM)获得。ASM8对CCR3抑制的作用明显不是浓度依赖性的,该结果可能反映出对CCR3来说获得最大抑制(稳定值)的浓度低于β链所用浓度。
总之,猕猴共同β链测序表明了非常高度的同一性(含TOP004序列的19个碱基中的至少18个碱基相同)。预期与人基因的此高度同源性足以使TOP004与猴β链mRNA杂交,以诱导反义活性,由此降低其表达。
将TOP004转染入纯化的猕猴PBMC中,以评价其下调猴β链表达的能力。TOP004有效降低β链mRNA表达,据RT-PCR检测达30-70%。
同样,将TOP005转染入猕猴PBMC中,通过半定量RT-PCR测定CCR3表达水平。结果表明,TOP005以30%-85%的范围内下调猕猴CCR3表达。
同样,根据流式细胞仪检测,在猴PMBC中TOP004或TOP005的转染于0.5μM(>30%)时诱导β链或CCR3阳性的细胞数特异性降低。
还将ASM8转染入纯化的猴PBMC中,以评价组合处理(TOP004和TOP005)下调猴β链和CCR3 mRNA表达的效力。在这些条件下,根据RT-PCR检测,在低至0.1-0.5μM的ASM8浓度时,ASM8显著降低β链和CCR3的表达。这也提示,猕猴是在其中检验由于ASM8药理学活性引起的潜在毒性作用的适宜物种。
实施例3
针对CCR3的反义寡核苷酸在人细胞和细胞系中的作用
实施进一步的实验,以评价A86和TOP005在HL-60分化的嗜酸性粒细胞样细胞(Lee Tiffany等,J.Immunol 1998,160:1385-92)、U937和Eol-1细胞以及外周血单核细胞(PBMC)中抑制CCR3 mRNA表达的能力。还研究了A86和TOP005在HL-60细胞和纯化的人外周血嗜酸性粒细胞这二者中抑制嗜酸性粒细胞迁移和钙动员的能力。A86是反义寡核苷酸(5′CTG GGC CAT CAG TGC TCT G3′(SEQID NO.29),对应于CCR3编码区(外显子7)的87-105核苷酸序列。如早前所论述,TOP005是828,但全部3个腺苷都被2,6-二氨基嘌呤取代(5′GTT XCT XCT TCC XCC TGC CTG 3′(SEQ ID NO.14))。828互补序列在外显子1末端后的48个碱基处开始,21个碱基长。互补有义寡核苷酸(5′CAG AGC ACT GAT GGC CCA G3′(SEQ IDNO.30))和错配寡核苷酸(5′CGT GGC ACT CAG TGT CCT G3′(SEQID NO.31))用作A86的对照。错配寡核苷酸(5′CCT TTG ACC TGCCAA TGC TCT 3′(SEQ ID NO.32))用作828/TOP005的对照。
A86反义寡核苷酸在HL-60克隆15来源的嗜酸性粒细胞中对CCR3mRNA表达的作用
已知丁酸处理可诱导HL-60细胞的克隆15变体分化为具有外周血嗜酸性粒细胞的多种特征的细胞(Lee Tiffany等,J.Immunol 1998,160:1385-92)。使用相同的分化方法,我们证实CCR3 mRNA在分化的HL-60细胞中的表达。然后进行RT-PCR,以检验合成寡核苷酸在分化为嗜酸性粒细胞的HL-60细胞中调节CCR3受体编码mRNA表达的能力。在用10μM A86处理细胞后,使用内标G3PDH通过半定量PCR评价CCR3 mRNA。总RNA分离自如上所述新鲜收集的细胞。参看图5,显示了针对CCR3的反义寡核苷酸在HL60分化细胞中对CCR3 mRNA表达的作用。与有义寡核苷酸和错配寡核苷酸相反,反义寡核苷酸显著抑制CCR3 mRNA表达。在有义寡核苷酸和错配寡核苷酸处理的细胞中CCR3 mRNA表达明显不同于在未处理细胞中获得的CCR3 mRNA表达。而且,所有寡核苷酸在所使用的浓度都不影响G3PDH mRNA表达。因此,在此实验中使用的反义寡核苷酸A86能够特异性地抑制CCR3 mRNA的表达。
A86对CCR3蛋白细胞表面表达的作用
进一步研究了CCR3 mRNA降低是否能反映出CCR3细胞表面蛋白密度的降低。就此而言,进行流式细胞术分析来评价用寡核苷酸处理后HL-60衍生的嗜酸性粒细胞上的CCR3受体表达。在丁酸处理后,表达CCR3受体的HL-60衍生的嗜酸性粒细胞的百分率为40%。当用有义和错配寡核苷酸(10μM)处理时,阳性细胞的百分率稍微且不显著地下降;阳性细胞的百分率分别为35%和38%。但是,在A86处理细胞上的CCR3受体密度显著降低(阳性细胞为26%,相比之下在未处理细胞中为40%)。10μM的A86能够降低CCR3细胞表面表达达65%。较高浓度的A86的作用更显著。具体地说,使用20和30μM的A86,结果表明CCR3细胞表面表达分别降低达75%和85%。CCR3的反义寡核苷酸A86能够以剂量依赖性方式抑制CCR3细胞表面表达。
A86对HL-60细胞中嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的钙动员的作用
当趋化因子刺激表达其特异性受体的白细胞时,通常观察到快速的瞬时钙流动。这种钙动员可通过Fura-2AM载荷细胞实时跟踪,是受体活化的便利检测方法。趋化因子嗜酸性粒细胞趋化因子是CCR3受体的特异性配体,在连接至受体时诱导快速钙流动和白细胞趋化性。参看图6,显示了A86对CCR3活化的作用。与对照和有义寡核苷酸相比,A86处理细胞中响应于嗜酸性粒细胞趋化因子的钙动员下降。以10μM浓度的A86寡核苷酸处理细胞。用有义寡核苷酸处理的细胞能够响应于嗜酸性粒细胞趋化因子,未处理的细胞也是如此。在这些情况下,嗜酸性粒细胞趋化因子诱导胞内Ca++浓度增加。但是,在A86处理的细胞中,嗜酸性粒细胞趋化因子诱导少得多的Ca++动员。本文给出的结果表明,A86在HL-60细胞系中有效干扰CCR3受体活化。
用反义寡核苷酸处理纯化的人嗜酸性粒细胞抑制纯化的人嗜酸性粒细胞对嗜酸性粒细胞趋化因子的响应
参看图7,显示了反义寡核苷酸对纯化的人嗜酸性粒细胞对嗜酸性粒细胞趋化因子的趋化反应的作用。将纯化的人嗜酸性粒细胞与10μM浓度的反义寡核苷酸(方块)或有义寡核苷酸(圆形)在补加5%FCS和IL-5(1.5ng/mL)的RPMI 1640中温育过夜。对照细胞(三角形)在无ODNS的相同条件下温育。数据来自代表3个样本的单个实验,以每5个高倍视野中三份平行迁移细胞测定的迁移细胞平均数±SD给出。针对CCR3的反义寡核苷酸抑制嗜酸性粒细胞迁移,当嗜酸性粒细胞趋化因子浓度增加时这种抑制更显著。在80ng/mL嗜酸性粒细胞趋化因子时,嗜酸性粒细胞迁移降低达55.6%。
图8显示了反义寡核苷酸处理的嗜酸性粒细胞中的钙动员。当用A86(10μM)处理嗜酸性粒细胞时,与对照和有义寡核苷酸相比,嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的Ca++动员也被抑制。
本文给出的结果表明,A86通过下调CCR3受体有效干扰嗜酸性粒细胞对嗜酸性粒细胞趋化因子的趋化性。
TOP005的效力
使用TOP005进行相似的实验。选择TOP005是因为828的效力、表明828与已知基因没有同源性的该序列BLAST评价结果、828与TOP004没有杂交(以DNA软件进行的实验)及其长度(当混合在一起并通过阴离子交换HPLC分离时允许由TOP004分化)。
图9表明了TOP005对CCR3的细胞表面表达的作用。在Eol-1和U937细胞中评价TOP005的效力。在用TOP005处理后36小时通过流式细胞术评价CCR3表达。结果以Eol-1和U937细胞中相对于对照的表达百分率表示。图9中的条图表明,TOP005抑制U937和Eol-1细胞表面上的CCR3蛋白表达。
图10A和10B显示了TOP005对人外周血单核细胞(PBMC)中的CCR3 mRNA表达的作用。人PBMC或者是新鲜分离的,或者在人IL-2中培养(10ng/mL,24小时)。然后使它们接触TOP005,培养18小时。在图10A中,显示G3PDH和CCR3表达的凝胶示于顶部。CCR3mRNA表达对G3PDHL的比率相对于对照标准化,示于底部。参看图10B,条图表明,TOP005在低至1μM浓度的剂量有效降低PBMCCCR3 mRNA表达。
因此,反义寡核苷酸A86和TOP005可在Eol-1细胞(人嗜酸性粒细胞细胞系)、分化为嗜酸性粒细胞的HL-60细胞和U937细胞中抑制CCR3 mRNA表达。用这些寡核苷酸抑制CCR3还降低HL-60分化细胞和人嗜酸性粒细胞这二者中的钙动员,以及降低嗜酸性粒细胞对嗜酸性粒细胞趋化因子的趋化性。对应的有义寡核苷酸和错配寡核苷酸均不能影响对嗜酸性粒细胞趋化因子的响应。
实施例4
TOP004降低IL-3、IL-5和GM-CSF受体的共同β链亚基表达以及
人细胞系中的相关细胞应答的效力
进行进一步的实验,以检验107A和TOP004对IL-3、IL-5和GM-CSF受体的共同β链亚基表达的作用。
TF-1和U937细胞中的β链mRNA表达的调节
参看图11A、11B和11C,显示了TF-1细胞中的β链mRNA表达的调节。TF-1细胞用107A反义寡核苷酸处理12小时。参看图11A,进行RT-PCR来检测TF-1细胞中的β链mRNA和G3PDH mRNA表达。细胞如下处理:泳道1:对照未处理的;泳道2:有义寡核苷酸(10μM);泳道3:107A(10μM);泳道4,错配寡核苷酸(10μM)。在非饱和条件下使用半定量RT-PCR评价β链和G3PDH(用作对照)mRNA的表达。用107A(10μM)处理几乎完全抑制TF-1(图11A)和U937处理细胞(数据未显示)中的β链表达。107A的抑制是特异性的,不是由于RNA降解或细胞存活丧失,以内标为证(对应于G3PDH mRNA的450-bp产物)(图11A)。相反,在未处理的对照细胞或有义或错配寡核苷酸处理的细胞中,β链mRNA表达不受抑制(图11A)。因此,107A活性对于抑制β链mRNA的表达是特异性和有效的。
参看图11B和11C,显示了有义寡核苷酸和107A处理对TF-1细胞的细胞表面上的β链表达的作用,如FACS分析测定。图11B显示了未处理对照(PC)对有义寡核苷酸处理的(S-ODN),在这里NC代表阴性对照。图11C显示了107A(以5、10和20μM的变化浓度)处理36小时的细胞中的细胞表面表达。反义寡核苷酸抑制细胞β链蛋白表达的能力在107A处理细胞表面上产生对应较低密度的β链亚基。使用针对GM-CSF/IL-3/IL-5受体的共同β链蛋白的单克隆抗体(MAb),与FACS分析一起检测TF-1细胞上的β链蛋白的细胞表面表达。未处理的TF-1细胞的β链表达水平非常高,不受有义寡核苷酸处理影响。但是,增加107A浓度(5、10和20μM)以剂量依赖性方式显著降低β链表达水平(在FACS分析中测试阳性的细胞百分率由69.9%降低至27.8%)。
图11D显示了TOP004处理后在U937细胞中共同β链表达的抑制。U937细胞在渐增浓度的TOP004(0.01、0.1、1和10μM)存在下在无血清培养基中温育12小时(之后进行RT-PCR)和48小时(之后进行FACS分析)。共同β链mRNA或蛋白抑制的百分率通过与获自未处理细胞的值进行对比来确定。实验平行进行3次,数据表示为平均值±SE。图11D中给出的结果表明,TOP004反义寡核苷酸含DAP残基并与107A反义寡核苷酸同源,在mRNA和蛋白水平上有效抑制共同β链。而且,发现少量的TOP004(例如1μM)足以敲减β链mRNA以及对应的蛋白。因此,该数据有利于DAP化学物质的效力及其在如上所述的药理学组合物中的用途。
细胞存活和功能研究
参看图12,显示了在GM-CSF、IL-3或IL-5存在下用107A反义寡核苷酸处理的TF-1细胞的增殖情况。细胞与107A(10μM)在含1ng/mL GM-CSF或3ng/mL IL-3或3ng/mL IL-5的无血清培养基中温育5小时。2天后终止温育,通过Alamar Blue测定(n=3)检测细胞增殖。结果表示为吸光度(570-595)的平均值±SD。
TF-1细胞需要细胞因子GM-CSF、IL-3或IL-5来增殖,对这些细胞因子的生物反应涉及β链信号转导途径。预期抑制β链蛋白的细胞表面表达抑制TF-1细胞增殖,即便在这些细胞因子存在的情况下。107A(10μM)在IL-3、IL-5或GM-CSF存在下引起TF-1细胞的生长抑制。这些结果表明,107A对β链细胞表面蛋白表达的抑制有效抑制对全部3种细胞因子的细胞生物反应。
嗜酸性粒细胞表达GM-CSF、IL-3和IL-5受体,在炎症和变态反应中起关键作用。嗜酸性粒细胞需要GM-CSF、IL-3以及尤其是IL-5用于其分化、活化和存活(Oddera等,1998,Lung.176:237-247;Ohnishi等,1993,J.Allergy Clin.Immunol.,92:607-615)。研究了靶向β链mRNA的反义寡核苷酸抑制响应IL-5的嗜酸性粒细胞存活的能力。参看图13A和13B,显示了107A对嗜酸性粒细胞存活的调节。
参看图13A,将纯化的人嗜酸性粒细胞在补加5%FBS和1.5ng/mL IL-5的RPMI培养基中与指定浓度(10、15和20μM)的107A温育过夜。使用锥虫蓝染色排除测定评价嗜酸性粒细胞存活。结果是3个实验的平均结果。用指定浓度的107A处理以剂量依赖性方式显著降低嗜酸性粒细胞存活达对照水平的35%±12%(10μM)、43%±2%(15μM)和54%±7%(20μM)(p<0.01)。嗜酸性粒细胞存活未受到作为对照的20μM浓度有义寡核苷酸处理的影响。因此,即便在含特异性细胞因子IL-5的培养基存在下,靶向β链的107A也抑制嗜酸性粒细胞存活。
参看图13B,在有或没有107A(15μM)的情况下,将纯化的人嗜酸性粒细胞在补加5%FBS和2ng/mL IL-5的RPMI培养基中温育48小时。如材料和方法中所述,使用Annexin-V-FITC和碘化丙锭方法通过流式细胞术分析评价嗜酸性粒细胞存活。
当用107A处理嗜酸性粒细胞时,其存活降低达64%,41%归因于凋亡。相反,在未处理细胞和用有义寡核苷酸处理的细胞中,死亡细胞的百分率较低。
因此,根据RT-PCR和FACS的检测,107A反义寡核苷酸在mRNA和蛋白水平上特异性抑制TF-1细胞和初级嗜酸性粒细胞中的共同β链表达。在使用的实验条件下,在20μM浓度观察到对测试的细胞系统获得最大效力。在107A存在时,TF-1细胞的增殖下降,无论是IL-3、IL-5还是GM-CSF用作营养因子。此结果表明了107A反义寡核苷酸对β链的特异性和效力。
在IL-5存在下嗜酸性粒细胞存活受到107A抑制,似乎凋亡是这种抑制作用的结果。嗜酸性粒细胞在变应性炎症中起关键作用,需要GM-CSF、IL-3和IL-5用于其分化、活化和存活(Adachi等,1995,Am.J.Respir.Grit.Care Med.151:618-623和Oddera等,1998,Lung.176:237-247)。在哮喘中,嗜酸性粒细胞累积和存活被认为是炎症和上皮组织损伤的重要引发因素,因为它们释放毒性产物,包括嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(Walsh等,1997,Clin.Exp.Allergy 27:482-487)。
实施例5
气管样品中的ASM8靶基因的mRNA分析
进行进一步的实验来分析猕猴气管样品中ASM8针对的靶基因(β链亚基和CCR3)的mRNA水平。在第15天(最后1剂后1天),在处死第1组(对照)和第4组(高剂量组;目标剂量水平2.5mg/kg/天)的全部极期动物后,立即收集气管样品,并在液氮中快速冷冻。通过RT-PCR分析冷冻的气管样品的靶mRNA水平。
使用经验证的半定量RT-PCR法测定猴气管样品的目标基因表达水平(βc-亚基和CCR3)。对对照和高剂量ASM8处理动物的气管提取物进行βc-亚基和CCR3-特异性PCR扩增(表7)。
表7.RT-PCR样品分析结果
光密度分析法 | |||||
剂量=0mg/kg bw/天 | |||||
动物 | 性别 | βc-亚基 | CCR3 | IL-4 | TNF-α |
1002A | 雄性 | 21787 | 28776.5 | 15312.6 | 91432.5 |
1003A | 雄性 | 25339 | 19986.9 | 11093.0 | 99032.7 |
1004C | 雄性 | 27568 | 27600.6 | 13218.8 | 77107.2 |
1101A | 雄性 | 21599 | 22619.4 | 12450.4 | 95441.5 |
1501A | 雌性 | 5452 | 5053.0 | 18074.5 | 80778.5 |
1502A | 雌性 | 14920 | 19799.4 | 15252.2 | 86741.0 |
1503B | 雌性 | 9691 | 15004.8 | 15200.0 | 90229.0 |
1504C | 雌性 | 22800 | 52842.7 | 9001.6 | 102726.5 |
平均值 | 20529 | 26661 | 13700 | 90436 | |
剂量=5mg/kg bw/天 | |||||
4002B | 雄性 | 22073 | 22778.3 | 11034.0 | 71911.0 |
4003B | 雄性 | 12652 | 9109.4 | 5887.0 | 86317.4 |
4101A | 雄性 | 21154 | 11365.8 | 15361.0 | 86526.0 |
4501A | 雌性 | 14755 | 2227.0 | 173.5 | 57996.7 |
4502B | 雌性 | 7604 | 21286.0 | 14463.4 | 98144.3 |
4503B | 雌性 | 3505 | 29105.0 | 16711.0 | 103532.5 |
平均值 | 13624 | 18729 | 12691 | 84071 |
备注:阴影值代表未纳入平均值计算的逸出值。
尽管甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)通常在RT-PCR反应分析中用作内标,但观测肺和气管的温和细胞浸润物(其通常与其它反义寡核苷酸一起在沉积部位被观测到)。因此,由于细胞浸润物有助于βc-亚基和CCR3的检测水平(即表达βc-亚基和CCR3的免疫细胞),所以G3PDH不被认为是在此情况下用作内标的最合适基因。代之以将靶基因的表达对炎性细胞因子即IL-4和TNF-α的mRNA水平标准化。结果表明,在ASM8处理的动物中(表8),即便在给予ASM8后约24小时,βc-亚基和CCR3 mRNA对IL-4 mRNA的相对表达分别降低达29%和24%,相对于TNF-α的表达分别降低达30%和24%。
表8 抑制表 | ||||
比率 | ||||
βc-亚基/IL-4 | CCR3/IL-4 | βc-亚基/TNF-α | CCR3/TNF-α | |
对照 | 1.50 | 1.95 | 0.23 | 0.29 |
处理的 | 1.07 | 1.48 | 0.16 | 0.22 |
抑制 | 28.7% | 24.1% | 30.4% | 24.1% |
因此,尽管猴气管组织复杂以及ASM8给药至获得组织样品过去了24小时,但相对于炎性细胞因子IL-4和TNF-α,ASM8处理显著抑制βc-亚基和CCR3 mRNA的表达。
实施例6
ASM8的储存稳定性
进行稳定性测试,以评价在不同储存温度下ASM8(TOP004和TOP005)的寡核苷酸组分的完整性。该信息对确定ASM8的最优储存、复测和储存期条件很重要。
毛细管凝胶电泳(CGE)和高效(压)液相层析(HPLC)已广泛用于反义寡核苷酸的化学分析。由于ASM8有两种寡核苷酸组成,所以测试系统必须提供足够分开的两种单独的反义分子。因此,将描述以下内容:1)基于阴离子交换层析的方法以分离ASM8组分(TOP004和TOP005)及其降解产物,和2)储存温度对ASM8组分稳定性的作用(图14-16)。
对ASM8称重,并以0.5mg/mL浓度溶解在PBS中(0.25mg/mLTOP004和0.25mg/mL TOP005)。[TOP004的纯度因子是1.15(即1.15g粉末含1g活性分子);TOP005的纯度因子是1.24即1.24g粉末含1g活性分子)。]
为在分析前诱导TOP004和TOP005降解(以便确保分辨出完整分子的降解产物),进行以下处理:
·
脱嘌呤:将ASM8以0.5mg/mL终浓度重悬浮在30%CH3COOH中,于室温温育3、4或6小时。通过加入5体积水终止反应,将混合物置于-20℃,然后在Speed-Vac中冻干,以去除乙酸。
·
切割:将脱嘌呤的寡核苷酸重悬浮在0.2M NaOH(0.5mg/mL)中,于50℃温育1小时,储存在-20℃或通过HPLC分析。
将等份的ASM8(0.5mg/mL)的PBS溶液于-20℃、4℃、30℃和40℃温育2个月。在第4周和第8周时建立ASM8的HPLC谱。对照条件定义为任意储存时间前(即时间0)的ASM8 HPLC谱。HPLC系统由Waters的Breeze(V 3.30)软件驱动(图17A1、17A2、17B1和17B2)。
用联结Waters 2487 Dualλ吸光度检测器并配有在线脱气器、烘箱和1500系列手动注射器Reodyne 7725i的Waters 1500系列二元HPLC泵进行HPLC分离。
寡核苷酸混合物在Waters Protein Pak DEAE 5PW阴离子交换柱(0.5cm×75cm)上分级分离,保持在60℃,通过260nm的UV吸收检测。寡核苷酸混合物(体积=25μL)在水(缓冲液A)中上柱,通过逐渐增加缓冲液B(1M LiClO4)的比例使液相(表9)的离子强度增加,由固相(柱)洗脱寡核苷酸,由此进行洗脱。
在测定条件下,62.5μg的TOP004或TOP005中的任一个于260nm产生的可检测变化都>0.15吸光度单位(AU)。
表9 分离ASM8和降解物的HPLC梯度 | |||
时间(分钟) | 流速(ml/分钟) | 缓冲液A(%) | 缓冲液B(%) |
0 | 1 | 100 | 0 |
5 | 1 | 100 | 0 |
10 | 1 | 93 | 7 |
100 | 1 | 65 | 35 |
102 | 1 | 20 | 80 |
122 | 1 | 20 | 80 |
124 | 1 | 100 | 0 |
144 | 1 | 100 | 0 |
146 | 0.1 | 100 | 0 |
图14中的层析图显示了在DEAE阴离子交换层析中ASM8(TOP004和TOP005)的单个产物的洗脱谱。25μL体积的新鲜制备的ASM8(0.5mg/mL)在DEAE阴离子交换柱上分级分离。在上述梯度条件下,TOP004洗脱早于TOP005;这与TOP004比TOP005少两个核苷酸并具有较少的带负电残基相一致。TOP004寡核苷酸在81.3分钟洗脱下来,占260nm吸收的总材料的48.0%。TOP005在86.8分钟洗脱下来,占260nm吸收的总材料的49.3%。
为了证实TOP004、TOP005和ASM8降解产物之间足够分离,进行ASM8的两步化学降解。切割步骤保持不变,但脱嘌呤步骤的温育期进行3-6小时。参看图15,ASM8(0.5mg/mL)用CH3COOH处理3小时,进行碱裂解(如上所述),然后通过DEAE阴离子交换层析分级分离。TOP004寡核苷酸在81.5分钟洗脱下来,占260nm吸收的总材料的32.4%。TOP005产物在86.9分钟洗脱下来,占总材料的28.0%。较小峰代表ASM8的降解产物。参看图16,ASM8(0.5mg/mL)用CH3COOH处理6小时,如上所述进行碱裂解,然后通过DEAE阴离子交换层析分级分离。在260nm检测下,TOP004寡核苷酸在82.2分钟洗脱下来,TOP005在86.7分钟洗脱下来。通过增加脱嘌呤时间,TOP004的比例降低至20.6%,TOP005的比例降低至14.5%。在这些实验条件下TOP005的降解程度似乎稍高。如图15和16中的层析图可见,增加脱嘌呤时间增加了ASM8的降解。
参看图17A1、17A2、17B1和17B2,评价不同储存温度下ASM8的化学稳定性。ASM8(0.5mg/mL的PBS溶液)于-20℃、4℃、30℃或40℃温育4周(图17A1和17A2)和8周(图17B1和17B2),并通过DEAE阴离子交换层析分析。在该实验中测试的各种储存温度不影响ASM8组分的洗脱谱。在ASM8储存长达2个月的任一个温度都未观察到ASM8的显著降解。
上文业已描述了ASM8的基于DEAE阴离子交换HPLC的分离方法。因为该产物的性质,优选ASM8组分(TOP004和TOP005寡核苷酸)的足够分离。在所述梯度条件下,TOP004的保留时间比TOP005的保留时间早5分钟,两个峰几乎没有重叠。
该方法还能够检测ASM8的降解产物。可通过此HPLC法评价在不同温度、湿度和光照条件下的ASM8的化学稳定性。
ASM8在PBS中的制剂是化学稳定的,在一系列温度下储存达2个月后通过HPLC法未检测到显著的降解产物。
实施例7
ASM8的热力学评价
进行进一步的实验,以确保在使用热力学评价时两条寡核苷酸链TOP004和TOP005在溶液中不相互作用。
TOP 004和TOP 005以在1×PBS(以及其它缓冲系统)中以等摩尔浓度混合。总寡核苷酸浓度在约1.2-8.7μM的范围内。使用带有Tm附件的Beckman DU640分光光度计进行标准UV热变性法。在10-90℃的每个温度检测260 nm的吸光度变化。使用MELTWINTM 3.5软件拟合解链曲线,以测定热力学参数。产生解链曲线和热力学总结表的屏幕图像。
参看图18,显示了在1×PBS中的TOP004和TOP005的解链曲线。图19是基于TOP004和TOP005在1×PBS中的解链曲线拟合结果的热力学总结。结果表明,在温度增加时,寡核苷酸组合/条件没有一个在解链谱中产生显著跃迁(吸光度的突升)。这表明,测试的寡核苷酸混合物在测试缓冲条件下不形成显著的二级结构相互作用。
实施例8
ASM8在猕猴中的毒性
该实施例显示了由TOP004和TOP005的1∶1混合物组成的ASM8的毒性。还显示了在连续14天内通过每日一次吸入接触给予猕猴时,其各个寡核苷酸组分的毒代动力学模式。此外,14天吸入接触ASM8未激发可通过皮内注射(ID)检测的系统性超敏状况。
表10.估计达到的剂量
剂量组/处理 | 估计达到的剂量(mg/kg/天) | ||
雄性 | 雌性 | 混合 | |
1:溶媒对照 | 0 | 0 | 0 |
2:ASM8低剂量 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
3:ASM8中剂量 | 0.22 | 0.23 | 0.22 |
4:ASM8高剂量 | 2.4 | 2.5 | 2.5 |
表11.总体接触的气溶胶浓度
剂量组/处理 | 平均值(μg/L) | S.D.(μg/L) | C.V.(%) |
1:溶媒对照 | 0 | - | - |
2:ASM8低剂量 | 7.4 | 0.89 | 12.1 |
3:ASM8中剂量 | 34.6 | 5.68 | 16.4 |
4:ASM8高剂量 | 380.4 | 68.43 | 18.0 |
进行死亡率、临床征兆、体重、食物消耗、心电图、检眼镜检查和临床病理学的全面评价。在接触的第1天和最后1天以及恢复期结束时得到系列血样,在完结时收集组织,用于测定个体寡核苷酸含量。另外,在第25天时,对设计用于恢复期的动物皮内注射(ID)给予ASM8,以评价潜在的系统性超敏性。所有动物都在接触14天后(第15天)或14天恢复期后(第29天)实施安乐死,进行全尸检,并由每只动物收集一套完整组织。组织病理学评价由高剂量和对照组动物的全部组织以及低剂量组和恢复动物的呼吸道组织的显微镜检查组成。
ASM8制剂易于气溶胶化,产生的接触气溶胶始终稳定并可呼吸,组间质量中位直径(MMAD)和几何标准偏差(GSD)值分别在1.7-1.8μm和2.12-2.22之间。对于组2-4,获得的估计达到剂量分别接近0.05、0.22和2.5mg/kg/天的目标,表7-8。
没有死亡,猴对剂量良好耐受。对体重、食物消耗、心电图、检眼镜检查或临床病理学和超敏测试没有影响,揭示ASM8给药无作用。在尸检后,器官重量检测未产生毒性证据。所有器官的外观检查揭示,在ASM8处理动物中只是肾脏有灰白变色。但是,由于没有已证实的微观变化、临床病理学观察结果或器官重量变化以及在恢复14天后未观察到变色的事实,所以认为该观察结果的生物学和毒物学意义不明确。
TOP004和TOP005的血浆水平以及其近似的(n-1)代谢物在血浆中非常低,低和中剂量组在定量限度以下。对于高剂量组(2.5mg/kg/天),TOP004和TOP005浓度通常在给药后0.5小时的最早取样时间或1小时时间点时最大。在大部分给药后时间点,TOP004的平均浓度类似于TOP005的浓度,图20A和图20B。
如图21A和图21B所示,重复地每日给予达14天,血浆中的任一种寡核苷酸组分(或其n-1代谢物)都没有累积。血浆浓度没有一致性差异。循环寡核苷酸的显著性百分率以TOP004和TOP005这二者的近似n-1代谢物给出,尽管所述百分率往往稍低于TOP004。对于两种寡核苷酸及其n-1代谢物,在24小时收集期内明显由血室(血浆)中清除出去。在终末期处死时(最后1剂ASM8吸入后1天),在高剂量动物气管中检测到可感知量的ASM8的完整寡核苷酸组分(TOP004和TOP005)。在14天恢复期结束时(第29天),TOP004及其n-1代谢物的水平相对于第15天时已消除,经检测稍微高于测定的检测限度。相反,在恢复期处死时间点时TOP005或其代谢物不可定量。这些结果提示,TOP004具有高于TOP005的组织稳定性。
在除呼吸道以外的任何器官中都未观察到处理相关的微观变化。按照4点评分,呼吸道中观察到的所有变化都被评为最低(最小)。对肺观察到的变化包括:以0.22或2.5mg/kg/天给药的动物中的泡沫状肺泡巨噬细胞、2.5mg/kg/天给药的动物中的肺泡内粒细胞炎症、2.5mg/kg/天给药的2只动物中的灶性出血和1只动物中的病灶性细支气管组织转化;对鼻腔观察到的变化包括:2.5mg/kg/天给药的6只动物中有2只的鼻中隔扁平上皮出现病灶性侵蚀,伴有急性炎症,并在1只猴中出现炎症渗出液;对支气管淋巴结观察到的变化包括:2.5mg/kg/天给药的动物中有泡沫状巨噬细胞。在中和高剂量动物中观察到的变化的严重性较小,在肺实质中不伴有局部损伤或细胞浸润的证据。炎症细胞稀少,仅在少量ASM8高剂量动物中观察到,变化的分布与测试物的吸入相一致。灶性出血非常小,被解读成可能是偶然的。因此,报告的变化一般与和吸入测试物的吞噬作用和清除相关的正常肺部机制相一致。撤消处理14天导致持续存在若干泡沫状肺泡巨噬细胞,在两只ASM高剂量动物中有1只无炎症。此观察结果与病灶的逐渐退化相一致,表明肺实质没有进行性或迁延性变化。
在14天恢复期后没有处理作用于鼻组织的证据。关于高剂量动物中的支气管淋巴结观察结果,髓窦中的泡沫状巨噬细胞与通过由肺进行淋巴引流清除测试材料相一致。没有实质损伤的证据,淋巴结似乎未处于活性状态中。
总之,以达2.5mg/kg/天的估计达到剂量连续14天吸入ASM8被良好耐受,对体重、食物消耗、心电图、检眼镜检查或临床病理学参数没有影响,超敏测试揭示ASM8给药无作用。大部分最小组织形态学变化有许多在肺(0.22和2.5mg/kg/天)以及鼻腔和支气管淋巴结(2.5mg/kg/天)中观察到。这些变化在恢复14天后严重性下降或消失。
尽管本文已描述了本发明的优选实施方案,但本领域技术人员会理解,可对这些实施方案进行改变,而不背离本发明的精神或所附权利要求书的范围。
序列表
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<120>用于治疗变态反应和肿瘤细胞增殖的反义寡核苷酸
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<213>智人(Homo sapiens)
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<210>2
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<213>黑猩猩
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Leu Ser Glu Thr Ile Pro Leu Gln Thr Leu Arg Cys
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<213>猪
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<212>PRT
<213>小鼠
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<213>大鼠
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Claims (68)
1.一种用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种的反义寡核苷酸,所述寡核苷酸针对编码蛋白的核酸序列,所述蛋白选自CCR3趋化因子受体和IL-3、IL-5与GM-CSF受体的共同β亚基,以及能够接触IL-3、IL-5和GM-CSF受体的共同β亚基的其它蛋白,其中所述寡核苷酸是以下中的一种:(i)选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的序列,和(ii)选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的序列的修饰寡核苷酸。
2.权利要求1的反义寡核苷酸,其中所述寡核苷酸具有包含SEQID NO.1的序列。
3.权利要求1的反义寡核苷酸,其中所述寡核苷酸具有包含SEQID NO.13的序列。
4.权利要求1的反义寡核苷酸,其中所述寡核苷酸具有包含SEQID NO.14的序列。
5.权利要求1的反义寡核苷酸,其中所述反义寡核苷酸用于治疗和/或预防哮喘。
6.权利要求1的反义寡核苷酸,其中所述反义寡核苷酸用于治疗和/或预防变态反应。
7.权利要求1的反义寡核苷酸,其中所述反义寡核苷酸用于治疗和/或预防嗜酸性粒细胞增多症。
8.权利要求1的反义寡核苷酸,其中所述反义寡核苷酸用于治疗和/或预防全身性炎症。
9.权利要求1的反义寡核苷酸,其中所述反义寡核苷酸用于治疗和/或预防癌症。
10.权利要求1的反义寡核苷酸,其中所述癌症是白血病。
11.权利要求1定义的至少一种反义寡核苷酸的用途,所述反义寡核苷酸用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种。
12.权利要求11的用途,其中所述至少一种反义寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.1的序列。
13.权利要求11的用途,其中所述至少一种反义寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.13的序列。
14.权利要求11的用途,其中所述至少一种反义寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.14的序列。
15.权利要求11的用途,其中所述至少一种反义寡核苷酸为至少两种反义寡核苷酸,它们分别具有包含SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14的序列。
16.权利要求11的用途,其中所述至少一种寡核苷酸用于治疗和/或预防哮喘。
17.权利要求11的用途,其中所述至少一种寡核苷酸用于治疗和/或预防变态反应。
18.权利要求11的用途,其中所述至少一种寡核苷酸用于治疗和/或预防嗜酸性粒细胞增多症。
19.权利要求11的用途,其中所述至少一种寡核苷酸用于治疗和/或预防全身性炎症。
20.权利要求11的用途,其中所述至少一种寡核苷酸用于治疗和/或预防癌症。
21.权利要求11的用途,其中所述癌症是白血病。
22.一种用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种的药物组合物,所述组合物包含至少一种权利要求1定义的反义寡核苷酸以及药物可接受的载体。
23.权利要求22的药物组合物,其中所述至少一种反义寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.1的序列。
24.权利要求22的药物组合物,其中所述至少一种反义寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.13的序列。
25.权利要求22的药物组合物,其中所述至少一种反义寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.14的序列。
26.权利要求22的药物组合物,其中所述至少一种反义寡核苷酸为至少两种反义寡核苷酸,它们分别具有包含SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的序列。
27.权利要求22-26中任一项的药物组合物,其中所述药物组合物是局部药物组合物。
28.权利要求22的药物组合物,其中所述药物组合物用于治疗和/或预防哮喘。
29.权利要求22的药物组合物,其中所述药物组合物用于治疗和/或预防变态反应。
30.权利要求22的药物组合物,其中所述药物组合物用于治疗和/或预防嗜酸性粒细胞增多症。
31.权利要求22的药物组合物,其中所述药物组合物用于治疗和/或预防全身性炎症。
32.权利要求22的药物组合物,其中所述药物组合物用于治疗和/或预防癌症。
33.权利要求22的药物组合物,其中所述癌症是白血病。
34.权利要求22-27中任一项的药物组合物的用途,所述药物组合物用于治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种。
35.权利要求34的用途,其中所述药物组合物用于治疗和/或预防哮喘。
36.权利要求34的用途,其中所述药物组合物用于治疗和/或预防变态反应。
37.权利要求34的用途,其中所述药物组合物用于治疗和/或预防嗜酸性粒细胞增多症。
38.权利要求34的用途,其中所述药物组合物用于治疗和/或预防全身性炎症。
39.权利要求34的用途,其中所述药物组合物用于治疗和/或预防癌症。
40.权利要求34的用途,其中所述癌症是白血病。
41.一种治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种的方法,所述方法包含给予有效量的至少一种权利要求1定义的反义寡核苷酸的步骤。
42.权利要求41的方法,其中所述至少一种反义寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.1的序列。
43.权利要求41的方法,其中所述至少一种反义寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.13的序列。
44.权利要求41的方法,其中所述至少一种反义寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.14的序列。
45.权利要求41的方法,其中所述至少一种反义寡核苷酸为至少两种反义寡核苷酸,它们分别具有包含SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14的序列。
46.权利要求41的方法,其中所述方法用于治疗和/或预防哮喘。
47.权利要求41的方法,其中所述方法用于治疗和/或预防变态反应。
48.权利要求41的方法,其中所述方法用于治疗和/或预防嗜酸性粒细胞增多症。
49.权利要求41的方法,其中所述方法用于治疗和/或预防全身性炎症。
50.权利要求41的方法,其中所述方法用于治疗和/或预防癌症。
51.权利要求41的方法,其中所述癌症是白血病。
52.一种治疗和/或预防哮喘、变态反应、嗜酸性粒细胞增多症、全身性炎症和癌症中的至少一种的方法,所述方法包含给予有效量的权利要求22-27中任一项定义的药物组合物的步骤。
53.权利要求52的方法,其中所述方法用于治疗和/或预防哮喘。
54.权利要求52的方法,其中所述方法用于治疗和/或预防变态反应。
55.权利要求52的方法,其中所述方法用于治疗和/或预防嗜酸性粒细胞增多症。
56.权利要求52的方法,其中所述方法用于治疗和/或预防全身性炎症。
57.权利要求52的方法,其中所述方法用于治疗和/或预防癌症。
58.权利要求52的方法,其中所述癌症是白血病。
59.权利要求1的至少一种反义寡核苷酸用于生产药物的用途,所述药物用于治疗哮喘。
60.权利要求1的至少一种反义寡核苷酸用于生产药物的用途,所述药物用于治疗变态反应。
61.权利要求1的至少一种反义寡核苷酸用于生产药物的用途,所述药物用于治疗嗜酸性粒细胞增多症。
62.权利要求1的至少一种反义寡核苷酸用于生产药物的用途,所述药物用于治疗全身性炎症。
63.权利要求1的至少一种反义寡核苷酸用于生产药物的用途,所述药物用于治疗癌症。
64.权利要求1的至少一种反义寡核苷酸用于生产药物的用途,所述药物用于治疗白血病。
65.权利要求59-64中任一项的用途,其中所述至少一种寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.1的序列。
66.权利要求59-64中任一项的用途,其中所述至少一种寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.13的序列。
67.权利要求59-64中任一项的用途,其中所述至少一种寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.14的序列。
68.权利要求59-64中任一项的用途,其中所述至少一种寡核苷酸为至少两种寡核苷酸,它们分别具有包含SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14的序列。
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