JP5314283B2 - アレルギーおよび新生物細胞増殖を治療するための、アンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents
アレルギーおよび新生物細胞増殖を治療するための、アンチセンスオリゴヌクレオチド Download PDFInfo
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Description
本発明は、一般的な炎症(喘息およびアレルギーと関連する炎症を含む)、および過好酸球増加症を阻害するため、特異的細胞受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを単独でまたは組み合わせて使用することに関する。本発明はまた、癌などの新生物細胞増殖を阻害するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することにも関する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬の新たなクラスである。一般的に、アンチセンスは、ヒトDNAまたはRNAにおいて見いだされた構成成分と同一の構成成分を有する小型の合成オリゴヌクレオチドを使用することに関するものである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的化する遺伝子の一部の配列に接着しそして遺伝子発現を阻害するため、標的化する遺伝子の一部の相補的な配列として設計される。遺伝子発現は、アデノシンとチミジン(mRNAではウラシル)またはグアノシンとシチジンが、水素結合を介して相互作用するWatson-Crick塩基対合に従って、特異的なメッセンジャーRNA(mRNA)センス標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを介して阻害される。2種類のメカニズムが、これらの作用に関与している可能性がある。第一は、標的化mRNAの翻訳を低下させるハイブリダイゼーション、そして第二はRNase HまたはmRNAの分解を伴う同様の酵素の誘導である。このストラテジーの主要な利点は、特に作用部位に対して適用される場合に(局所治療)、低い副作用や毒性の可能性しか伴わない、作用の特異性である。この治療ストラテジーは、1またはいくつかの遺伝子の過剰発現が、疾患の存在または残留を引き起こすと考えられているようないずれかの疾患に対して、将来的に実現可能性をもって適用することができる。結果的に、癌およびウィルス疾患に対する治療剤として、アンチセンスオリゴヌクレオチドの多数の研究が行われた。
本発明は、喘息、アレルギー、過好酸球増加症、一般的な炎症、および癌の少なくとも1つを治療しおよび/または予防するための、例えば、IL-3受容体、IL-5受容体、およびGM-CSF受容体についての共通βサブユニット、またはケモカイン受容体CCR3などの細胞受容体少なくとも1つの共通サブユニットに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの用途を提供する。
いくつかの炎症性メディエータ類は、喘息を伴う患者の気道において、炎症の出現および永続化に役割を果たしている。いくつかのメディエータ類は、好酸球の化学走性を介して気道中に炎症性細胞を誘引する。これらのケモカイン類の多くは、主として、CCR3受容体を介して、喘息性炎症またはアレルギー性炎症において作用する。IL-3、IL-5、およびGM-CSFなど、その他のメディエータ類は、気道または皮膚における炎症性細胞のプライミングを引き起こしたり、そして生存の亢進を引き起こす。気道中のこれらの炎症性メディエータ類が減少する場合、喘息の改善が示された。
図20〜図21において、ASM8オリゴヌクレオチド構成要素の濃度およびサルの血漿サンプル中でのそれらの一次代謝物(n-1)の濃度を測定した。動物を連続14日間吸入を介して治療した、非臨床的毒性試験の間にサンプルを採取した。
(a)疾患に対する素因を有する可能性があるが、それを有することは未だ診断されていない被検体において、疾患が生じないようにすること;
(b)疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻むこと;または
(c)疾患と取り除くこと、すなわち疾患の退行を引き起こすこと;
が含まれる。
本発明の製剤は、作用部位に対して直接的に投与することが好ましく、したがって経口、頬内、肺内、直腸、子宮内、腫瘍内、鼻内、くも膜下(intrathecal)、吸入、経皮、皮内、腔内(intracavitary)、イオントフォレーゼ、眼、膣、関節内、耳内(otical)、経粘膜、直腸、徐放性コーディング製剤、または徴用性コーディング製剤を含む(これらには限定されない)、局所的であることが好ましい。上記に関して何ら限定することなく、本発明の製剤は頭蓋内、筋肉内、皮下、血管内、腺内、器官内、リンパ内、腹腔内、静脈内、および移植可能なものであってもよい。製剤中で使用されるキャリアは、例えば、固体キャリアおよび/または液体キャリアであってもよい。
本発明のさらなる側面において、アレルギー、喘息、鼻炎および炎症性疾患に関連する症状を治療するために治療的に有効な医薬的に許容可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物をその中に含有する包装材料が含まれる製品が提供される。一態様において、組成物は、CCR3ケモカイン受容体またはIL-3/IL-5/GM-CSF-受容体の共通β鎖遺伝子を阻害するために効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を含み、前記オリゴヌクレオチド化合物は、その遺伝子に少なくとも50%相補的である。別の側面において、組成物は、少なくとも2つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を含み、それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、CCR3ケモカイン受容体遺伝子およびIL-3/IL-5/GM-CSF-受容体の共通β鎖遺伝子を下方制御することができ、それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が実際にはそのままではそのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が対する遺伝子を下方制御するために効果的ではない濃度で存在し、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の組合せが、アンチセンスオリゴヌクレオチドが対する少なくとも1つ遺伝子を下方制御するために有効である。
材料
以下の材料および試薬を実験のために使用した:RPMI 1640(Wisent, cat# 10040 CV);FBS(ウシ胎児血清、Wisent, cat#80150);ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO, cat#15140-122);HEPES(Wisent, cat#26060CI);L-グルタミン(Gibco, cat#25030-081);ピルビン酸ナトリウム(Wisent, cat#25000-Ci);滅菌PBS(GIBCO, cat#25030-081);Hanks平衡化塩類溶液(HBSS, cellgro,cat#2O021-cv);RT-PCR用のSuperscriptファーストストランドSynthesis Systemキット(Invitrogen, cat# 11904-018);dNTPs(Invitrogen, cat# 10297-018;オリゴ(dT)12-18(Invitrogen, cat# 11904-018);Qiagen RNAeasy Mini Kit(Qiagen, cat#74106);Qiagenゲル抽出キット(Qiagen, ca.t#28704);Qiagen PCR抽出キット(Qiagen, cat#28104);β-メルカプトエタノール(Sigma, cat#M- 6250);99%エタノール(Commercial alcohols Inc., Brampton, Ontario, Canada);QiaVac 24 Manifold(Qiagen, cat#19403);Disposable Vacconnectors(Qiagen, cat#19407);DNase Iキット(Fermentas;cat.#ENO521);RiboGreen Quantification Reagent(Invitrogen-Molecular probes, cat#R-11490);Taq PCRコアキット(Qiagen, cat#201223)、Hema-3染色セット(Fisher scientific Co. cat#122-911, lot#999901);Alamar Blue(Biosource cat#DAL1100);ヒトCCR3プライマー対(R & D systems, cat# RDP-209-025);ヒトGAPE5Hプライマー対(R&D systems, cat# RDP-39-025);Ficoll(Amersham Biosciences;cat#: 17-1440- 03);抗-CD 16(好酸球精製キット, Miltenyi Biotec, Auburn, CA, cat# 130-045- 701);rhエオタキシン(Biosource, cat# PMC1434);化学走性チャンバーおよびメンブレン(NeuroProbe, Nucleopore-Neuroprobe, Cabin John, MD);ヒト血清アルブミン(SIGMA;cat.#A9511);抗ヒトIL-3/IL-5/GM-CSF受容体β鎖(マウスモノクローナルIgG2b;Santa Cruz Biotechnology, cat.#sc-457);抗-マウスIgG2b(ヤギモノクローナル, Alexa Fluor 488, Molecular Probes, cat#A-21141);抗-ヒトCCR3抗体(ラットモノクローナル, IgG2a, R&D, cat.# MAB 155);抗-ラットIgG(ヤギモノクローナル, Alexa Fluor 633, Molecular Probes, cat.# A-21094);rhGM-CSF(R & D systems, cat#215-GM-005);rhIL-3(R & D systems, cat#203-IL-010);rhIL-5(R & D systems, cat#205-IL-005)、rhIL-2(R&D systems, cat#202-IL-010);TOP 004-(n-1)(Biosource, 3'末端の1ヌクレオチド欠損を有するオリゴヌクレオチド);TOP 005-(n-1)(Biosource, 3'末端の1ヌクレオチド欠損を有するオリゴヌクレオチド);TOP 004-TP(Biosource, 鋳型プローブ);TOP 004-(n-1-TP-T)(Biosource Biosource , 鋳型プローブ);LP(Biosource, Ligation Probe);TOP 005-TP(Biosource);TOP 004-(n-1-LP-A, Biosource);Reacti-Bind NeutrAvidin-コート化高結合能力プレート(Pierce, cat # 15508);T4 DNAリガーゼ5 U/mL(Roche, cat # 799 009);抗-DIG-AP抗体(Roche, cat# 1093274);PBS 中SuperBlock Blocking Buffer(Pierce, cat # 37515);メチルウンベリフェリル(umbellyferyl)リン酸アルカリホスファターゼ基質(Molecular Probes, cat # M-6491);サルASM8含有血漿サンプル;MW96 Plate Washer(Beckman Coulter);96-well大容量ポリプロピレンプレート(Nunc);マイクロピペッター(Eppendorf Research Brand);Black opaque 96-wellプレート(Costar, cat# 3915)。
オリゴヌクレオチドを、Gene Assembler-PlusTM(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)を用いて合成し、ホスホロチオエート化し、そしてHPLCにより精製した。図5〜7に示した実験で使用したTOP 005は、cGMPオリゴヌクレオチドを用いて行った。アンチセンス配列および同定は、表1に記載する。
以下の細胞株を使用した:TF-1(ヒト赤白血病細胞株、ATCC#CRL-2003);EOL-1(ヒト急性脊髄性“好酸球性”白血病細胞株;DSMZ#ACC386)およびU937(ヒト組織球性リンパ腫細胞株;ATCC#CRL-1593.2)。EOL-1およびU937を、2 mMのL-グルタミン;1.5 g/L重炭酸ナトリウム;4.5 g/Lグルコース;10 mM Hepes;1 mMピルビン酸ナトリウム;10%FBS、ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100μg/mLを含むRPMI 1640中で培養した。rhGM-CSFを2 ng/mLで添加した以外は、同一の培地を、TF-1の培養のためにも使用した。
HL-60クローン15を、Tiffanyら(1998, J. Immunol 160:1385-1392)に記載されるように、好酸球に分化させた。簡単に述べると、骨髄球細胞細胞株HL-60を、10%加熱非働化FBSおよび25 mM N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-ヒドロキシプロパンスルホン酸](Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)、pH 7.6を添加したL-グルタミンを含むRPMI 1640中で、37℃、5%CO2で維持した。細胞を、それらを0.5μMの酪酸(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)で少なくとも5日間処理することにより、好酸球様表現型へと分化することを誘導した。FACS解析を使用して、細胞分化後に、IL-3/EL-5/GM-CSF受容体の共通β鎖の存在を評価した。
細胞生存率は、Alamar Blue試験を製造者が示唆するように使用して、体系的にアッセイを行った。EOL-1;TF-1;HL-60またはU937細胞を、遠心処理(5分間、1500 RPM、室温)により回収し、3×HBSSで洗浄し、そして血清を含まないRPMI培地中に1×106細胞/mlで再懸濁した。1×106細胞を滅菌チューブ中で5分間、正確なアンチセンス濃度(0〜20μMのあいだ)を用いて、インキュベートした。次に、各反応物を、12ウェルプレート中に移し、そして37℃、5%CO2にて、mRNA定量のために5時間、またはタンパク質解析のために12時間、インキュベートした。RPMI/FBS 20%を、最終濃度10%FBSとなるように添加し、そして細胞を37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。細胞を遠心処理(5分間、1500 RPM、室温)により回収し、そして1×Hanks平衡塩類溶液(HBSS)で洗浄した。対照実験が含まれ、それはアンチセンスの非存在下、またはミスマッチオリゴヌクレオチドの存在下で、細胞処置から構成された。
顆粒球画分を、Ficoll-Hypaque密度勾配(1.077 g/mL、350 gで30分間)を介して全血液を遠心分離し、バッフィーコート層を得ることにより得た。ヒト好酸球を、抗-CD 16コート化免疫磁性マイクロビーズを用いて、4℃にて、Miltenyi Biotec(Auburn, CA)の磁気細胞ソーティングシステムを使用して、陰性選択によりさらに精製した。ギムザ染色により推定した好酸球集団の精製度は、典型的には92%〜100%であった。
カニクイザル由来の新鮮な血液を、ITR Laboratories Canada Inc.から得た。PBMCは、正常ドナー由来のEDTA K3血液をFicoll-Hypaque密度勾配遠心分離することにより単離した。PBMCを、12ウェルプレート中に、10%加熱非働化FBS、ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100μg/mLを添加したRPMI 1640細胞培養液中、2×106細胞/mL/ウェルでプレーティングした。細胞生存率を、Alamar Blueを使用して評価し、そして典型的には85%〜95%であった。
ヒトPBMCを、遠心処理(5分間、1500 RPM、室温)により回収し、3×HBSSで洗浄し、そして10μg/mLのPHAを含有する5%血清を含むRPMI培地中に2×106細胞/mLで再懸濁した。2×106細胞を、滅菌チューブ中で5分間、正確なアンチセンス濃度(0〜20μMのあいだ)で、3重にしてインキュベートした。次いで、各反応物を12ウェルプレートに移し、そして37℃、5%CO2で、mRNA定量のためには一晩、またはタンパク質解析のためには48時間または言及される場合にはそれよりも短い時間、インキュベートした。細胞を遠心処理(5分間、1500 RPM、室温)により回収し、そして1×HBSSで洗浄した。対照実験が含まれ、それはアンチセンスの非存在下、またはミスマッチオリゴヌクレオチドの存在下で、細胞処置から構成された。
カニクイザルPBMCを、遠心処理(5分間、1500 RPM、室温)により回収し、3×HBSSで洗浄し、そして2 ng/mLのrhGM-CSFまたはrhIL-5を含有する10%血清を含むRPMI培地中に2.5×106細胞/mLで再懸濁した。5%血清および10μg/mL PHA(または言及された場合には10 ng/mL rhIL-2)を含むRPMI培地中に、2×106細胞/mLで再懸濁した。
細胞を計数し、そして1×106細胞/mLで再懸濁した。細胞を、400×gで3分間、20〜25℃で遠心処理し、そして上清を廃棄した。その後、細胞ペレットを50μLのFACSバッファー(1×PBS、pH 7.2〜7.4;0.5%ヒトアルブミン;2.5%ヒト血清)中に再懸濁し、そして37℃で30分間インキュベートした。上清を廃棄することなく、一次抗体をチューブおよび混合物に対して直接添加する。光から保護して、4℃で1時間、インキュベートする(抗ヒトCCR-3抗体を1μg/0.5×106細胞で使用した。抗ヒト共通β鎖を2μg/0.5×106細胞出使用した)。2 mLのFACSバッファーで洗浄し、400×gで3分間遠心処理し、そして上清を廃棄する。イソ型対照として、300μLのFACS Fix(1×PBS、pH 7.2〜7.4;4%パラホルムアルデヒド)出細胞ペレットを再懸濁し、光から保護して、4℃で維持した。
好酸球を10%FBSを含有するRPMI 1640中1×107細胞/mLで再懸濁し、そして5 M Fura-2 AM(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)と共に、室温にて30分間、暗所でインキュベートすることにより、負荷した。細胞(1×106細胞/mL)を3回洗浄し、そして塩類溶液バッファー(138 mM NaCl、6 mM KCl、1 mM CaCl2、10 mM Hepes、5 mMグルコース、および1%BSA、pH 7.4)に再懸濁させた。次に、各2 mLの細胞懸濁液を水晶キュベットに移し、それをルミネッセンス分光光度計LS50B(Perkin-Elmer, Beaconsfield, UK)中に静置した。ケモカインに反応して、340 nmおよび380 nmでの連続的励起の後に510 nmで放出される蛍光を記録することにより、細胞Ca2+移動度を測定した。
5 mm孔を有するポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートメンブレン(Nucleopore-Neuroprobe)を使用して、In vitro化学走性を、48-ウェルチャンバー(NeuroProbe, Cabin John, MD)中で評価した。対照好酸球またはアンチセンス処理した好酸球を、0.25%BSAを含有するRPMI 1640培地中で1×106細胞/mLを懸濁した。上部ウェルおよび下部ウェルには、50μLおよび31μLの細胞懸濁液がそれぞれ含有され、後者の懸濁液には最適濃度のエオタキシン(80 ng/mL)が添加された。37℃、5%CO2中での1時間のインキュベーションの後、下部ウェル中に存在する遊走細胞を計数した。自発的遊走を、エオタキシンの非存在下にて測定し、そして結果に含まれる。
このプロトコルは、ITR Laboratories Canada Inc.のAnimal Care Committee(ACC)によるレビューを受け、そして評価された。Canadian Council on Animal Careにより発行された現在の“Guide to the Care and Use of Experimental Animals”、およびNIHが発行する“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”に概説される原則に従って、すべての動物を飼育した。
(2):ビヒクル対照動物を質量の観点では高用量群について精製した物と同等と考えられるエアロゾル濃度でビヒクル溶液から生成したエアロゾルに対して曝露した。
(3):標的用量およびエアロゾル濃度は、試験物質の絶対的純度に基づき、それは投与溶液製剤化プロセスにおいて純度についての適切な補正因子を使用することにより得られた。
(4):曝露期間中の得られた用量レベルは、以下の式を使用して推定された:
DL= E0×RMV×T/BW
式中、
DL = 得られた用量レベル(mg/kg/日);
Ec = 動物に対して送達される実際の濃度(mg/L空気);
RMV = 毎分量(mL/分)、Bideら(2000, J. App. Toxicol., 20, 273-290)の式、詳細には:RMV(L) = 0.499×W(kg)0.809の式にしたがって推定されたもの;
T = 時間、日曝露の期間(分);
BW = 曝露期間中の平均体重(kg)。
死亡率、臨床検査、体重、食物消費、心電図記録、検眼鏡検査(ophtalmoscopy)、臨床病理、血漿レベル測定、過敏性試験、を含むIn-life観察を、すべての動物に対して行った。
半定量的RT-PCRを使用して、ASM8投与後24時間後の高用量処置カニクイザルから得た気管サンプル上で、共通β鎖mRNA発現およびCCR3 mRNA発現に対していずれかのASM8阻害作用が存在するかどうかを、調べた。
投与前Day 1およびDay 14、投与後0.5、1、3、6および24時間に、サル血液サンプル(それぞれ約1 mL)を、それぞれの動物から回収した。血液サンプルを4℃で遠心処理して血漿を作成し、そして血漿を分離し、そしてハイブリダイゼーション/ライゲーションELISA定量アッセイを使用して、TOP 004およびTOP 005(および近接n-1代謝物)濃度の測定値について解析するまで、ドライアイス上で冷凍した。
テンプレートプローブ溶液(0.05μMテンプレートプローブ、60 mM Na2HPO4、pH 7.4、0.9 M NaCl、0.24%Tween-20;10×ライゲーションバッファー(0.8248 M Tris-Cl pH 7.5、0.0828 M MgCl2、1.93%DTT;ATP 100 mM溶液(水中で調製し、そしてNaOHを用いてpH 7±0.5に調整);ライゲーションプローブ溶液(1×ライゲーションバッファー中、0.067μMのオリゴ、0.025 Units/mL T4 DNAリガーゼ、0.05 mM ATP;洗浄バッファー(25 mM Tris-Cl、pH 7.2、0.15 M NaCl、0.1%Tween)。
サル気管を、ポリトロンPT 1200(Brinkmann Instruments)を使用してホモジナイズし、そして全RNAをQiagen RNAeasyミニキット(Qiagen, Mississauga ON, Canada)をして、次いでDNase I消化を行って、抽出した。全RNAをRibogreen Fluorescent Assay(Invitrogen Corporation, Burlington ON, Canada)を使用して定量した。SuperscriptTMII RTキット(Invitrogen Corporation, Burlington ON, Canada)を使用したファーストストランドcDNA合成を使用して、1〜2μgのRNAからcDNAを調製した。
RNAを、Qiagen RNAeasyミニキットプロトコルに従って、Qiagenから入手したQiaVac 24マニホルドを使用して細胞ペレットから抽出し、そしてRNAをFermentas法に従ってDNase-Iで処理した。mRNAをRiboGreen試薬を使用して、製造者のプロトコルに従って定量した。そうでない場合には、RNAを分光光度計を使用して定量した。ファーストストランドcDNAの調製を、20μLの全反応容量中、Invitrogenから入手したRT-PCRキット用のSuperscriptファーストストランド合成システムを使用して行った。簡単に説明すると、1〜2.5μgのRNAを、はじめに、0.5 mMの各dNTP、0.5μgのオリゴ(dT)12-18とともに65℃で5分間変性させ、そして少なくとも1分間氷上で冷却した。混合物を42℃で2分間インキュベートし、そして1×ファーストストランドバッファーを含有する第二のプレミックス、10 mM DTT、40 unitのRNaseOUTおよび40 unitのSuperscript II RTを添加した。反応物を42℃で10分間、50℃で1時間、インキュベートし、そして70℃で15分間加熱することにより不活性化した。PCRを、全反応容量50μL中1×PCRバッファー(10×:Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、15 mM MgCl2;pH8.7)、0.2 mMの各dNTP、8.5 pmolの各PCRプライマー、および2.5 unitのTaq DNA Polymerase中で、最適化された量のcDNA(CCR3については100〜250 ng、そしてG3PDHについては1〜10 ng)により行った。混合物を、94℃で5分間加熱し、その後それぞれインキュベーションを、94℃で1分間、60℃で45 秒間、そして72℃で45秒間からなるサイクルを30〜35サイクル行った。追加的な伸長は、72℃で10分間行った。PCR生成物は、エチジウムブロマイドの存在下で、1.5%アガロースゲル電気泳動により解析した。PCR生成物の定量を、Total Labソフトウェア(Rolling Ballを用いてバックグラウンド削除;Ultra Lum Inc., Model UC4800)を使用して行った。PCRプライマーは:ヒトCCR3プライマー対(R&D systems, cat# RDP-209-025);ヒトGAPDHプライマー対(R&D systems, cat# RDP-39-025)および表4に示されるプライマーである。対照実験が、系統的に含められ、そしてPCRまたは非RT-RNAから構成された。
解析前にTOP 004およびTOP 005の分解を誘導するため(無傷分子由来の分解生成物の融解を確実にするため)、以下の処理を行った:
*脱プリン化:ASM8を、30%CH3COOH中に最終濃度0.5 mg/mLで再懸濁し、そして3、4、または6時間室温でインキュベートした。5容量の水を添加することにより反応を停止し、そして混合物をSpeed-Vacでの凍結乾燥まで-20℃に置き、酢酸を除去した。
TOP 004およびTOP 005のHPLC分画
ASM8を秤量し、PBS中に0.5mg/mLの濃度で可溶化した(0.25 mg/mL TOP 004および0.25 mg/mL TOP 005)。HPLC購買パラメータは、表5に示す。
オリゴヌクレオチド保存
PBS中ASM8の一部(0.5 mg/mL)を、-20℃、4℃、30℃、および40℃で2ヶ月間インキュベートした。第4週および第8週に、ASM8のHPLCプロファイルを得た。対照条件を、なんらかの保存時間の前に、ASM8のHPLCプロファイルとして定義した。(すなわち、時点0)。HPLC システムは、Watersから入手したBreezeTM(V 3.30)ソフトウェアにより、駆動した。
TOP 004およびTOP 005を、1×PBS中(並びにその他のバッファー系中)等モル濃度で混合した。全オリゴヌクレオチド濃度は、約1.2〜8.7 mMの範囲であった。Tmアクセサリを付属したBeckman DU640分光光度計を使用して、標準UV熱変性法を行った。吸光度の変化を、10〜90℃の各温度で、260 nmで検出した。融解曲線を、MELTWIN 3.5TMソフトウェアを使用して適合させ、熱力学的パラメータを決定した。融解曲線のスクリーン画像および熱力学的概要表を生成した。
CCR3ケモカイン受容体に対するいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド受容体のmRNA発現を阻害し、そしてその受容体の機能を阻害するそれらの能力について解析した。CCR3アンチセンス一次スクリーニングを、Eol-1およびU937細胞株において行った。これらの細胞は、上述した正常細胞培養条件下で、CCR3 mRNAを発現する。表6は、ヒトCCR3ケモカイン受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを示す。
上述したように、アンチセンスオリゴヌクレオチド107Aおよび828を、アデノシンをDAPで置換することにより修飾して、アンチセンスオリゴヌクレオチドTOP 004およびTOP 005をそれぞれ生成した。TOP 004(5'-GGGTCTGCXGCGGGXTGGT-3'(SEQ ID NO. 13)〔ここで、Xはアデノシン残基のDAP修飾を示す〕は、107Aと同様に、19-merのIL-3受容体、IL-5受容体、およびGM-CSF受容体の共通β鎖に対するものである。TOP 005(5'-GTTXCTXCTTCCXCCTGCCTG-3'(SEQ ID NO. 14))は、828と同様に、21-merのケモカイン受容体CCR3に対するものである。
ヒト、チンパンジー、ブタ、マウス、およびラット由来IL-3/IL-5/GM-CSF受容体遺伝子についての共通β鎖の解析から、脊椎動物間で高い程度の遺伝子配列同一性が示された。クローニングPCRのためのプライマー配列を設計した。プライマー配列は、ヒト、チンパンジー、ブタ、マウスおよびラットにおいて非常に保存されたヌクレオチド配列に由来し、共通β鎖遺伝子のTOP 004オリゴヌクレオチド領域を取り囲む。表2は、異なるプライマーを示す。これらのプライマーを使用して、カニクイザルPBMC cDNAから特異的な生成物を増幅した。使用したプライマーのセットに依存して、いくつかのPCR生成物を得た。ネスト化PCRラウンドを使用して、得られた生成物の特異性を評価した。陽性のアンプリコンを、クローニングしてそして配列決定した。
カニクイザルPBMCにおけるTOP 004およびTOP 005の効率
TOP 004およびTOP 005を、それぞれβ鎖の発現およびCCR3の発現を選択的に減少させる能力について、カニクイザルPBMC中で個別に試験した。精製サルPBMCを、異なる濃度のTOP 004およびTOP 005と共にインキュベートした。
A86およびTOP 005がHL-60分化好酸球様細胞中(Lee Tiffany et al, J. Immunol 1998, 160:1385-92)、U937およびEol-1細胞中、ならびに末梢血単核細胞(PBMC)中でのCCR3 mRNA発現を阻害する能力を評価するため、さらなる実験を行った。A86およびTOP 005が、HL-60細胞およびヒト精製末梢血好酸球の両方において、好酸球細胞遊走およびカルシウム移動を阻害する能力を研究した。A86は、CCR3のコード領域(エクソン7)の87〜105番ヌクレオチド配列に対応する、アンチセンスオリゴヌクレオチドである(5' CTG GGC CAT CAG TGC TCT G 3'(SEQ ID NO. 29))。前でも検討したように、TOP 005は、3つのアデノシンすべてが2,6-ジアミノプリンに置換された828である(5'GTT XCT XCT TCC XCC TGC CTG 3'(SEQ ID NO. 14))。828の相補的配列配列は、エクソン1の末端の48塩基後から開始し、そして21塩基の長さである。A86についての対照として、相補的なセンスオリゴヌクレオチド(5' CAG AGC ACT GAT GGC CCA G 3'(SEQ ID NO. 30))およびミスマッチ(5' CGT GGC ACT CAG TGT CCT G 3'(SEQ ID NO. 31))を使用した。828/TOP 005のための対照として、ミスマッチ(5' CCT TTG ACC TGC CAA TGC TCT 3'(SEQ ID NO. 32))を使用した。
HL-60細胞のクローン15変異体は、酪酸処理により誘導して、末梢血好酸球の多数の特性を有する細胞に分化させることができることが知られている(Lee Tiffany et al, J. Immunol 1998, 160:1385-92)。Using 同一の分化プロトコルを使用して、我々は、分化HL-60細胞におけるCCR3 mRNAの発現を確認した。次いで、RT-PCRを行って、合成オリゴヌクレオチドが、好酸球に分化したHL-60細胞中で、CCR3受容体をコードするmRNAの発現を調節する能力を調べた。10μMのA86を用いた細胞処置ののち、CCR3 mRNAを、内部対照G3PDHを使用した半定量的PCRにより評価した。全RNAを、上述したように、新たに採取した細胞から単離した。図5を参照することにより、CCR3に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、HL60分化細胞におけるCCR3 mRNA発現に対する作用が示される。センスオリゴヌクレオチドおよびミスマッチオリゴヌクレオチドとは対照的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、CCR3 mRNAの発現を顕著に阻害する。センスオリゴヌクレオチドおよびミスマッチオリゴヌクレオチドで処置した細胞中でのCCR3 mRNAの発現は、非処置細胞において得られた発現と顕著には異なっていなかった。さらに、使用された濃度で、すべてのオリゴヌクレオチドは、G3PDH mRNA発現に影響を与えなかった。したがって、本実施例において使用されたアンチセンスオリゴヌクレオチドA86は、CCR3 mRNA発現を特異的に阻害することができる。
CCR3に対するmRNAの減少を、CCR3細胞表面タンパク質密度の減少を反映するかどうかを、さらに研究した。この側面において、フローサイトメトリー解析を行って、オリゴヌクレオチドでの処置後の、HL-60由来好酸球上でのCCR3受容体の発現を評価した。酪酸処置の後、CCR3受容体を発現するHL-60由来好酸球の割合は、40%であった。センスオリゴヌクレオチドおよびミスマッチオリゴヌクレオチド(10μM)で処置された場合、陽性細胞の割合は、わずかに、そして顕著で半句、減少した;陽性細胞の割合は、それぞれ、35%および38%であった。しかしながら、A86で処置した細胞上でのCCR3受容体の密度は、顕著に減少した(26%の陽性細胞対非処置細胞の40%)。10μMでのA86は、CCR3細胞表面発現を65%減少させることができる。A86の作用は、より高濃度の場合により顕著であった。具体的には、20および30μMのA86を使用して、そして結果から、CCR3細胞表面発現がそれぞれ75%および85%減少したことが示される。CCR3に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるA86は、濃度依存的にCCR3細胞表面発現を阻害することができる。
カルシウムの迅速な一過性流入は、白血球が特異的受容体を発現するケモカイン類により白血球を刺激する場合に一般的に観察される。このカルシウム移動は、Fura-2AM負荷細胞によりリアルタイムに追跡することができ、そして受容体活性化の簡便な目安である。ケモカインエオタキシンは、CCR3受容体に対する特異的リガンドであり、そして迅速なカルシウム流入および受容体に対する結合に際して、白血球化学走性を誘導する。図6を参照すると、A86のCCR3活性化に対する作用が示される。エオタキシンに応答したカルシウム移動は、対照オリゴヌクレオチドおよびセンスオリゴヌクレオチドと比較した場合、A86処置細胞において減少した。細胞を、10μMの濃度のA86オリゴヌクレオチドで処置した。センスオリゴヌクレオチドで処置した細胞は、非処置細胞が反応したと同様に、エオタキシンに対して反応することができた。これらの条件下で、エオタキシンは、Ca++の細胞内濃度の増加を誘導する。しかしながら、A86処置した細胞において、エオタキシンは、非常にわずかなCa++移動しか誘導しない。ここで示されたこの結果は、A86がHL-60細胞株におけるCCR3受容体活性化を妨害する際に有効であることを示す。
図7を参照することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、エオタキシンに対する精製ヒト好酸球の化学走性反応に対する作用が示される。精製ヒト好酸球を、5%FCSおよびIL-5(1.5 ng/mL)を添加したRPMI 1640中10μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド(四角)またはセンスオリゴヌクレオチド(丸)と共に、一晩インキュベートした。対照細胞(三角)を、ODNSを含まない同一条件下で、インキュベートした。データは、3回の実験を代表する1回の実験に由来する者であり、そして5つの高倍率視野あたりの遊走性細胞の3回の測定の、遊走細胞平均数±SDとして示される。好酸球遊走を、CCR3に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害し、そしてこの阻害はエオタキシン濃度を上昇させた場合により顕著であった。80 ng/mLのエオタキシンで、好酸球遊走を55.6%減少させた。
TOP 005の効率
同様の実験をTOP 005を使用して行った。828の効率性、828が既知の遺伝子と何の相同性も有さないことを示す配列のBLAST評価から得た結果、828はTOP 004とのハイブリダイゼーションを行わないこと(DNAソフトウェアで行った実験)、およびその長さ(一緒に混合しそしてアニオン交換HPLCにより分離した場合、TOP 004からの分化を可能にする)のため、TOP 005を選択した。
107AおよびTOP 004の、IL-3受容体、IL-5受容体、およびGM-CSF受容体の共通β鎖サブユニットの発現に対する作用を試験するため、さらなる実験を行った。
図11A、図11Bおよび図11Cを参照すると、TF-1細胞におけるβ鎖mRNA発現の修飾が示される。TF-1細胞を、107Aアンチセンスで12時間処置した。図11Aを参照すると、RT-PCRを行って、TF-1細胞におけるβ鎖mRNA発現およびG3PDH mRNA発現を検出した。細胞を以下の通り処置した:レーン1、対照非処置;レーン2、センスオリゴヌクレオチド(10μM);レーン3、107A(10μM);レーン4、ミスマッチオリゴヌクレオチド(10μM)。非飽和性条件下での半定量的RT-PCRを使用して、β鎖mRNAおよびG3PDH(対照として使用)mRNAの発現を評価した。107A(10μM)での処置は、ほぼ完全にTF-1細胞中(図11A)およびU937処置細胞中(データは示さず)において、β鎖発現を阻害した。阻害は、107Aに特異的であり、そして内部対照(G3PDH mRNAに対応する450-bp生成物)により示されるように、RNA分解や細胞生存率の喪失によるものではなかった(図11A)。対照的に、β鎖mRNA発現は、非処置対照細胞中またはセンスオリゴヌクレオチドまたはミスマッチオリゴヌクレオチドで処置した細胞中においては阻害されなかった(図11A)。このように、107Aの活性は、β鎖mRNAの発現を阻害する際に特異的かつ効果的であった。
図12を参照することにより、GM-CSF、IL-3またはIL-5の存在下にて、107Aアンチセンスで処置されたTF-1細胞の増殖が示される。細胞を、107A(10μM)と共に5時間、1 ng/mL GM-CSFまたは3 ng/mL IL-3または3 ng/mL IL-5を含有する血清不含培地中でインキュベートした。インキュベーションを2日後に終了し、そして細胞増殖をalamar blueアッセイにより測定した(n=3)。結果を、吸光度(570-595)の平均±SDとして表す。
ASM8が標的とする標的遺伝子(β鎖サブユニットおよびCCR3)に対するmRNAレベルについて、カニクイザルにおける気管サンプルを解析するため、さらなる実験を行った。Day 15(最終投与後1日後)に、グループ1(対照)およびグループ4(高用量群;2.5 mg/kg/dayの標的用量レベル)のすべての主相の動物を犠死させてすぐに気管サンプルを回収し、そして液体窒素中で急速に凍結した。凍結気管サンプルを、RT-PCRにより標的mRNAレベルについて解析した。
安定性試験を、様々な保存温度下でのASM8のオリゴヌクレオチド構成成分(TOP 004およびTOP 005)の完全性を評価するために行った。この情報は、ASM8についての最適な保存、再試験、および貯蔵寿命条件を定義するために重要である。
・脱プリン化:ASM8を、0.5 mg/mLの最終濃度で30%CH3COOH中に再懸濁し、そして3、4、または6時間、室温でインキュベートした。5容量の水を添加することにより反応を停止し、そして混合物をSpeed-Vac中での凍結乾燥まで-20℃におき、酢酸を除去した。
・切断:脱プリン化オリゴヌクレオチドを、0.2 M NaOH(0.5 mg/mL)中に再懸濁し、50℃で1時間インキュベートし、そして-20℃で保存するか、またはHPLCにより解析した。
HPLC分離を、Waters 2487 Dual λ Absorbance検出器に連結そしてインライン脱気装置、オーブン、および1500シリーズマニュアルインジェクター、Reodyne 7725iを備えた、Waters 1500 Series Binary HPLCポンプを用いて行った。
PBS中でのASM8の製剤は、化学的に安定であり、そして最大2ヶ月間の温度の範囲のもとで保存した後、HPLC法によって顕著な分解生成物は検出されなかった。
2種のオリゴヌクレオチド鎖、TOP 004およびTOP 005、が、熱力学的評価を使用して、溶液中で相互作用しないかを確認するため、さらなる実験を行った。
本実施例は、TOP 004およびTOP 005の1:1混合物からなるASM8の毒性を示す。1日1回14日連続でカニクイザルに対して吸入曝露により投与した場合のその個別のオリゴヌクレオチド構成成分の毒物動態プロファイルもまた、示される。さらに、ASM8に対する14日の吸入曝露は、皮内注射(ID)により検出可能な全身性の過敏性症状を発生しなかった。
ASM8の製剤は、容易にエアロゾル化され、そして一貫して安定でありそして呼吸に適した、1.7〜1.8μmの集団間質量中央径(inter-group mass median diameter;MMAD)および2.12〜2.22の幾何学的標準偏差(GSD)値を有する、曝露用エアロゾルを生成した。結果として推定された達成用量は、グループ2〜グループ4のそれぞれについて、0.05、0.22および2.5 mg/kg/dayで、標的に近接していた。表7〜8。
Claims (7)
- SEQ ID NO. 13の配列およびSEQ ID NO. 14の配列をそれぞれ含む配列を有する少なくとも2つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、医薬的に許容可能なキャリアと組み合わせて含む、喘息、アレルギー、過好酸球増加症、または一般的な炎症を治療および/または予防する際に使用するための、医薬組成物。
- 2つのオリゴヌクレオチドが、それぞれSEQ ID NO. 13の配列およびSEQ ID NO. 14の配列からなる、請求項1に記載の医薬組成物。
- 局所用である、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 喘息の治療の際に使用するための、請求項1〜3のいずれかに記載の医薬組成物。
- 喘息、アレルギー、過好酸球増加症、または一般的な炎症を治療および/または予防する際に使用するための医薬の製造における、SEQ ID NO. 13の配列およびSEQ ID NO. 14の配列をそれぞれ含む配列を有する2つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
- 2つのオリゴヌクレオチドが、それぞれSEQ ID NO. 13およびSEQ ID NO. 14からなる配列を有する、請求項5に記載の使用。
- 医薬が喘息の治療のためのものである、請求項5または6に記載の使用。
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