MX2007005083A - Oligonucleotidos antisentido para tratar alergias y proliferacion celular neoplastica. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan oligonucleotidos antisentido para tratar y/o prevenir por lo menos uno de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamacion general y cancer. Los oligonucleotidos estan dirigidos contra secuencias de acido nucleico que codifican un receptor seleccionado del grupo que consiste de un receptor CCR3 y una subunidad comun de receptores para IL-3, IL-5 y GM-CSF.

Description

OLIGON UCLEOT1 DOS ÁNT1SE NTIDO PARA TRATAR ALERGIA Y PROLIFERACIÓN C ELULAR NEOPLÁSTICA Cam po de la Invención La invención se refiere al uso de oligonucleótidos antisentido dirigidos contra los receptores celulares específicos, solos o en combinación, pa ra inhibir la inflamación general, incluyendo la inflamación asociada al asma y alergia, e hipereosinofilia. La invención también se refiere al uso de oligon ucleótidos antisentido para inhibir la proliferación celular neoplástica tal como cáncer. Antecedentes de la Invención Los oligonucleótidos antisentido son una nueva clase de productos farmacéuticos. En general , antisentido se refiere al uso de oljgon ucleótidos pequeños y sintéticos, con los mismos constituyentes que los encontrados en el ADN o ARN h umano. Los oligonucleótidos antisentido se diseñan como una secuencia complementaria de una parte de un gen , los cuales tienen el objetivo de poder adherirse a esta secuencia e inhibir la expresión del gen . La expresión del gen se inhibe a través de la hibridación de un oligonucleótido antisentido a un objetivo de sentido de ARN (ARNm) mensajero específico de acuerdo al apareamiento base Watson-Crick en el cual la adenósina y timidina (uracilo en ARNm) o guanosina y citidina interactúan a través de la unión de hidrógeno. Dos mecanismos se pueden considerar para estos efectos, el primero es la hibridación con la traducción deteriorada de ARNm especifico, el segundo es la inducción de RNase H o enzimas similares con la degradación de ARNm. Una ventaja importante de esta estrategia es la especificidad de la acción con el potencial para causar menos efectos secundarios y toxicidad, especialmente cuando se aplica al sitio de la acción (tratamiento tópico). Esta estrategia terapéutica se podría aplicar potencialmente a cualquier enfermedad donde se cree que una sobre-expresión de uno o varios genes causa la presencia o persistencia de la enfermedad. En consecuencia, se han hecho numerosos estudios de oligonucleótidos antisentido como agentes terapéuticos para el cáncer y enfermedades virales. Los oligonucleótidos antisentido se pueden utilizar para inhibir la expresión del receptor de interleucina (IL)-6, y así los efectos de la interleucina-6 mediadora de la inflamación aguda en las células. Pocos estudios se han conducido para determinar si los oligonucleótidos antisentidó se pueden utilizar para inhibir otros receptores en las células que están implicadas en la inflamación, incluyendo, pero sin limitarse a la inflamación asociada con el asma y a la inflamación asociada con enfermedades atópicas y alergia o en células cancerosas. El asma es una enfermedad que afecta del 5 al 10% de la población que ha doblado la prevalencia en los últimos 25 años. Este aumento se ha observado especialmente en infantes después de una infección viral de las vías aéreas (bronquiolitis) , en niños y en asma ocupacio nal inducido. Los problemas de respiración recurrentes asociados a asma son activados frecuentemente por alérgenos, pero aún no se conoce la causa exacta. Sin embargo, se cree que los agentes tales como los virus están implicados en la persistencia de la inflamación anormal que se encuentra en las vías aéreas de los pacientes con asma, y por consiguiente la persistencia de la enfermedad . Por esta razón las recome ndaciones actuales para la terapia de primera línea del asma son una medicación anti-inflamatoria potente tal como la que contiene corticoesteroides y anti-leucotrienos. Aunque esta terapia es efectiva en muchos pacientes, alg unos pacientes son resistentes a los corticoesteroides. Esta medicación también es un inmunosupresor potente con efectos secundarios a largo plazo y no se ha mostrado que sea efectivo en la prevención de la alergia o asma. Los anti-leucotrienos tienen un cierto efecto en la alergia y asma pero no son tan efectivos como los corticoesteroides. Varios mediadores de inflamación desempeñan un papel en la aparición y persistencia de la inflamación en las vías aéreas de los pacientes con asma . Algu nos mediadores atraen las células inflamatorias a las vías aéreas a través de la quimiotaxis de eosinófilos (quimiocinas: RANTES, eotaxinas 1 , 2 , 3, MCP-3, 4 que actúan sobre todo en la inflamación asmática a través de un receptor llamado CC R3) o a través de la activación celular endotelial (IL-4, -13). Otros mediadores causan la supervivencia principal e incrementada de las células inflamatorias en las vías aéreas (IL-3, -4, -5, GM-CSF). Estos mediadores consisten así de quimiocinas específicas para eosinófilos o citocinas del fenotipo del linfocito auxiliar T tipo 2 (Th2: IL-3, -4, -5, -6, -9, -10, -13 y GM-CSF), (John AE. y Lukacs NW, 2003 Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis., 20:180-189; Blease y col., 2003, Expert Opin Emerg Drugs. 8:71-81). Una mejora del asma e inflamación respiratoria general, se ha mostrado cuando hay una disminución de los mediadores de inflamación en las vías aéreas. La alergia es una hipersensibilidad a un alérgeno que causa una inmunorrespuesta indeseable. La alergia es una enfermedad que es extremadamente frecuente, por ejemplo la rinitis atópica y la conjuntivitis afectan aproximadamente el 30% de la población. La alergia está caracterizada por la producción anormal de IgE y por la inflamación a un alérgeno. En presencia de IgE y el alérgeno, las células efectoras, tal como mostacitos desgranulados y la liberación de mediadores de inflamación conducen a la selección de las mismas células inflamatorias que se encuentran en ef asma. En la rinitis alérgica (es decir fiebre del heno), conjuntivitis alérgica, poliposis nasal, sinusitis crónica y eczema, tal como dermatitis atópica, se encuentra el mismo exceso de mediadores de inflamación que el presente en el asma. I L-4 e I L-13 son necesarios para la producción de IgE y para la inducción de las células con un fenotipo Th2 (Barnes PJ., 2003, Cytokine Growth Factor Rev. 14:511-522; Schuh y col., 2003, Cytokine Growth Factor Rev. 2003, 14: 503-510). Enfermedades atópicas es un nombre genérico para las enfermedades alérgicas que son desarrolladas por la exposición a alérgenos, especialmente en individuos con una predisposición genética a ser sensibles fácilmente a los alérgenos. Los individuos que tienen estos factores de predisposición desarrollan fácilmente una inmunorrespuesta anormal a los antígenos e inhalantes alimenticios. Algunos ejemplos específicos de enfermedades alérgicas son el asma bronquial, dermatitis atópica, urticaria, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica y enterogastritis alérgica. Un neoplasma es un crecimiento anormal de tejido que es incontrolable y progresivo. Un neoplasma maligno se caracteriza frecuentemente porque es un cáncer. El cáncer es ia segunda causa principal de la muerte en humanos y es un término general para más de 100 enfermedades caracterizadas por la proliferación anormal de células inmortalizadas. Uno de los mecanismos que está implicado en la persistencia y aumento en las células es la liberación de factores de crecimiento que actúan a través de receptores y que conducen a la proliferación celular. Entre estos factores de crecimiento, se ha mostrado que GM-CSF es un factor de crecimiento importante para varias células tumorales. El receptor de quimiocina CCR3 fue caracterizado recientemente por la recuperación de linfocitos malignos B en pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en ingles) y con leucemia por tricoleucitos (HCL, por sus siglas en ingles), (Trentin y col., 2004, Blood, 104, 502-508). De hecho, se encontró que la transactivación del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR, por sus siglas en ingles) a través del receptor de quimiocina CCR-3, es una trayectoria crítica que provoca la activación de cinasa MAP y la producción de citocina en células epiteliales bronquiales (Adachi y col., 2004, Biochem. Biophys. Res. Commun. 320, 292-396). La inhibición de la proliferación de células cancerosas bloqueando los receptores para los factores de crecimiento y/o quimiocinas, puede ser importante en la terapia de ciertos cánceres. Los eosinófilos son un tipo de glóbulos blancos. Son leucocitos granulares con un núcleo que tiene generalmente dos lóbulos conectados por un filamento delgado de cromatina, y citoplasma que contiene por supuesto granulos redondos que son uniformes en tamaño y que se pueden manchar con eosina. La hipereosinofilia se caracteriza por un número aumentado de eosinófilos, se asocia frecuentemente con alergias, asmas e infecciones. Se conoce un cierto uso de oligonucleótidos dirigidos contra la codificación específica de secuencias de ácido nucleico de los receptores, para inhibir las reacciones inflamatorias. La Solicitud PCT No. WO 99/66037 de Renzi, describe los oligonucleótidos antisentido que se utilizan para tratar y/o prevenir el asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer.

Específicamente, los oligonucleótidos de Renzi se dirigen contra la codificación de las secuencias de ácido nucleico para un receptor CCR3, una sub-unidad común de los receptores IL-4 e IL-3, o una sub-únidad común de los receptores IL-3, IL-5 y GM-CSF. Entre otros, se describe en la presente un oligonucleótido antisentido identificado como 107A (5'- GGGTCTGCAGCGGGATGGT-3'), dirigido contra la sub-unidad común beta (ß) del receptor IL-3, IL-5 y GM-CSF. Para usos clínicos potenciales, los oligonucleótidos antisentido deben exhibir una estabilidad contra la degradación por suero y nucleasas celulares, mostrar una unión baja no específica al suero y proteínas celulares, exhibir reconocimiento mejorado de la secuencia de ARNm objetivo, demostrar una permeabilidad de la célula-membrana y nucleasas celulares producidas cuando se componen con ARNm complementario. Está bien documentado que los oligonucleótidos que contienen azúcares naturales (D-ribosa y D-2-deoxiribosa) y enlaces de fosfodiéster (PO) son degradados rápidamente por suero y nucleasas intracelulares, que limitan su utilidad como agentes terapéuticos efectivos. Las modificaciones estratégicas químicas se han descrito para los oligonucleótidos para mejorar su estabilidad y eficacia como agentes terapéuticos. Los cambios químicos principales incluyen, la modificación de la porción de azúcar, porción base, y/o la modificación o reemplazo del enlace de fosfodiéster del internucleótido. Hasta la fecha la mayoría de análogos estudiados ampliamente son los oligodeoxin ucleótidos de fosforotioato (PS) , en los cua les uno de los átomos de oxígeno no puenteados en la estructura del fosfodiéster se remplaza con un azufre (Eckstein F. , 1985 , Ann . Rev. Biochem. , 54: 367-402). Varias generaciones de oligonucleótido antisentido se han desarrollado y utilizado para estudios in vitro e in vivo (Goodchild J. , 2004, Curr. Opin. Mol. Ther. , 2004, 6: 120-128; Urban E. y R. Noe CR. , 2003 , Fármaco. 58:243-258) . Recientemente, Renzi y col. describieron el uso de 21,6'-diaminopurina (DAP) y análogos de la misma en moléculas nucleicas para composiciones anti-inflamatorias (Solicitud PCT No. WO 03/00451 1 A2) . También está descrita esta referencia la preparación de moléculas nucleicas que tienen una eficiencia fisiológica in vivo aumentada y una toxicidad red ucida con respecto a los oligonucleótidos sin DAP. Renzi y col. enseña adicionalmente que la substitución de DAP es particularmente útil en la preparación de oligonucleótidos dirigidos a enfermedades pu lmonares/respiratorias tal como fibrosis cistica, asma, bronquitis crón ica, enfermedad de pulmón obstructiva crónica, bronq uitis eosi nofílica , alergias , rin itis alérgica , fibrosis pulmonar, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, sinusitis, virus sincitial respiratorio u otra infección viral del tracto respiratorio y cáncer. Será conven iente tener otros oligon ucleótidos antisentido dirigidos contra por lo menos u n receptor común específico para citocinas Th2 o receptores para mediadores que atraen células que responden a los citocinas Th2, para inhibir la reacción inflamatoria que está presente en el asma o alergia y para inhibir la proliferación celular neoplástica. También será altamente deseable tener otros oligonucleótidos antisentido dirigidos contra la codificación de secuencias de ácido nucleico para receptores, a modo que inhibiendo los receptores los oligonucleótidos, se puedan utilizar en la terapia y/o prevención del asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona el uso de oligonucleótidos antisentido, dirigidos contra por lo menos una subunidad común de un receptor celular, tal como, por ejemplo, la subunidad beta común para los receptores IL-3, IL-5, y GM-CSF o para el receptor de quimiocina CCR3, para tratar y/o prevenir por lo menos una de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer. En otro aspecto, la presente invención proporciona oligonucleótidos antisentido dirigidos contra la codificación de la secuencia de ácido nucleico para la subunidad beta común de los receptores IL-3, IL-5 y GM-CSF tal que inhibiendo estos receptores se puedan utilizar en el tratamiento y/o prevención de por lo menos una de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer.

La presente invención también proporciona oligon ucleótidos antisentido dirigidos contra la codificación de la secuencia de ácido n ucleico para el receptor de qu imiocina CC R3s a m odo q ue inhibiendo este receptor se puedan utilizar en el tratamiento y/o prevención de por lo menos una de asma , alergia , hipereosinofilia, -inflamación general y cáncer. La presente invención también proporciona composiciones terapéuticamente efectivas que comprenden por lo menos un oligon ucleótido antisentido dirigido contra la codificación de secuencias de ácido nucleico para la subunidad beta común de los receptores I L-3 , I L-5 , y G M-CSF, o CCR3, para el tratamiento y/o prevención de por lo menos una de asma , alergia, hipereosinofilia , inflamación general y cáncer. La presente invención también proporciona composiciones terapéuticamente efectivas que comprenden dos oligonucleótidos antisentido , cada uno se dirige contra la codificación de secuencias de ácido nucleico para la subunidad beta común de los receptores I L-3 , I L-5 , y G M-CSF, o CCR3 , para un efecto mejorado en el tratamiento y/o prevención , de por lo menos una de asma , alergia, h ipereosinofilia , inflamación general y cáncer. De acuerdo a otro aspecto , la presente proporciona métodos para tratar y/o preven ir por lo menos una de asma, alergia , inflamación general y cáncer, q ue comprenden administrar uno o más oligonucleótidos antisentido dirigidos contra por lo menos una subunidad común de un receptor celular, tal como la subunidad beta común para los receptores IL-3, IL-5, y GM-CSF o CCR3. La presente invención pretende proporcionar los oligonucleótidos antisentido para cualquiera de los anteriores así como oligonucleótidos antisentido modificados químicamente, modificados de maneras conocidas que han mejorado la estabilidad en el cuerpo mientras que exhiben una efectividad mejorada y toxicidad más baja. De acuerdo a otro aspecto la presente invención proporciona un oligonucleótido antisentido para de tratar y/o prevenir por lo menos una de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer. El oligonucleótido se dirige contra la codificación de la secuencia de ácido nucleico para un receptor seleccionado del grupo que consiste de un receptor de quimiocina CCR3 y una subunidad beta común de los receptores IL-3, IL-5 y GM-CSF, y tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 1, SEC ID NO.13 y SEC ID NO. 14. De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de por lo menos un oligonucleótido para de tratar y/o prevenir por lo menos una de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer. Preferiblemente, se utilizan los oligonucleótidos que comprenden las secuencias SEC ID NO. 13 y SEC ID NO. 14. De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica para de tratar y/o prevenir por lo menos una de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer, que comprende por lo menos un oligonucleótido en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, por lo menos un oligonucleótido comprende la SEC ID NO. 13 y SEC ID NO. 14. De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona un uso de la composición farmacéutica, para tratar y/o prevenir por lo menos una de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer. De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona un método para de tratar y/o prevenir por lo menos una de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer, que comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de (i) por lo menos un oligonucleótido o (ii) la composición farmacéutica que comprende por lo menos un oligonucleótido en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable. La invención en la presente también se relaciona a las modificaciones dé oligonucléótidos antisentido que no afectan desfavorablemente de forma importante su capacidad de reducir la actividad o inhibir la expresión de una proteína objetivo, pero que pueden mejorar esta capacidad. Breve Descripción de los Dibujos Éstas y otras características de las modalidades preferidas de la invención serán más evidentes en la siguiente descripción detallada en la cual se hace referencia a los dibujos anexos en donde: La Figura 1 A muestra la alineación de la secuencia de tres clones obten idos de la amplificación de PCR de la cadena beta común del mono Cynomolgus para los genes del receptor IL-3, IL-5 y GM-CSF con los ortólogos de humano, chimpancé, cerdo, rata y ratón correspondientes que rodean la secuencia complementaria TOP004 humana. La fig ura 1 B muestra las secuencias de aminoácido previstas de la región trad ucida que rodea el segmento complementario TO P004 en las secuencias de ADN de cadena beta común de mono Cynomolg us , humano, chimpancé, cerdo, rata y ratón clonados. La figura 2A muestra la expresión de ARNm de cadena beta (ßc) red ucida variando las concentraciones de TOP004 en PBMC de mono Cynomolgus en comparación a las células sin tratar. La Figu ra 2b muestra la expresión reducida de ARN m de CCR3 variando las concentraciones de TOP005 en PBMC de mono Cynomolgus en comparación a las células sin tratar. La Figura 3A muestra la expresión reducida de la proteí.na de superficie celular de cadena beta (ßc) por concentraciones diferentes de TOP004 en PBMCs de mono Cynomolg us en comparación a las células sin tratar. La Figu ra 3B muestra la expresión reducida de la proteína de superficie celular de CCR3 por diferentes concentraciones de TO P005 en PBMCs de mono Cynomolgus en comparación a las células sin tratar.

La Figura 4A muestra la expresión reducida de ARNm de cadena beta (ßc) variando las concentraciones de ASM8 en PBMCs de mono Cynomolgus en comparación a las células sin tratar. La Figura 4B muestra la expresión reducida de ARNm de CCR3 variando las concentraciones de ASM8 en PBMCs de mono Cynomolgus en comparación a las células sin tratar. La Figura 5 muestra el efecto de oligonucleótidos en la expresión de ARNm de CCR3 en células HL60 diferenciadas. El oligonucleótido antisentido A86, dirigido contra CCR3, se muestra para disminuir la expresión de ARNm de CCR3 cuando se compara con los oligonucleótidos de control y sentido sin efectos sobre la expresión de G3PDH. La Figura 6 muestra un análisis de movilización de calcio en el cl-15 de células HL-60 tratadas con oligonucleótidos. La movilización disminuida en respuesta a la eotaxina en células A86 tratadas se compara con las células tratadas con oligonucleótidos de control y sentido. La Figura 7 muestra el efecto de oligonucleótidos en la respuesta quimiotáctica de eosinófilos humanos purificados a la eotaxina. La respuesta quimiotáctica relativa de eosinófilos A86 tratados se compara con las células tratadas de control y sentido.

La Figura 8 muestra un análisis de movilización de calcio en eosinófilos tratados con oligonucleótidos en respuesta a la eotaxina. La movilización de calcio se compara en eosinófilos tratado con A86 y células tratadas con oligonucleótidos de control o sentido. La Figura 9 muestra el efecto de TOP005 en la expresión de superficie celular de CCR3 presentado como el porcentaje de la expresión contra controles en células Eol-1 y U937. La Figura 10 muestra el efecto de TOP005 en la expresión de ARNm en PBMC humano. Los geles que muestran la expresión de G3PDH y CCR3 se muestran en la gráfica de barras. La relación de la expresión de ARNm de CCR3 a G3PDH, normalizada para los controles se presenta en la parte inferior. La Figura 11A muestra la modulación de la expresión de ARNm de cadena beta (ßc) en células TF-1 tratadas con 107A usando RT-PCR para detectar la expresión de ARNm de cadena beta (ßc) o ARNm de G3PDH de control. Las Figuras 11B y 11C muestran el efecto del tratamiento con oligonucleótidos de sentido y con 107A én la expresión de la cadena beta en la superficie celular de las células TF-1, según lo determinado por el análisis de FACS. La Figura 11 D muestra el efecto de TOP004 en la expresión de la cadena beta común a los niveles de ARNm y proteína en células U937. La Figura 12 muestra la proliferación de células TF-1 tratadas con 107A en presencia de GM-CSF, IL-3, o IL-5. La Figura 13A muestra la modulación de la supervivencia del eosinófilo por 107A, determinada usando el análisis de exclusión con tinte azul Trypan. La Fig u ra 13B muestra la modulación de la supervivencia del eosinófilo por 1 07A según lo determinado por el análisis citométrico de flujo usando el protocolo Annexin-V-FITC y de yoduro de propidio. La figura 14 muestra el perfil de elusión de los productos individ uales de AS M8 (TO P004 y TOP005) usando la cromatografía de intercambio de aniones DEAE. La Fig ura 1 5 muestra el perfil de elusión para ASM8 después del tratamiento con CH3COO H durante 3 horas y sometido a lisis alcalina antes del fraccionamiento por la cromatografía de intercambio de aniones DEAE. La Figura 16 muestra el perfil de elusión para ASM8 después, del tratamiento con CH3COOH durante 6 horas y sometido a lisis alcalina antes del fraccionamiento por la cromatog rafía de intercambio de aniones DEAE. Las Figuras 17A1 , 1 7A2, 17B 1 y 17B2 muestran la estabilidad qu ímica de ASM8 después del almacenamiento bajo diferentes temperaturas y después de eluirse usando la cromatografía de intercambio de aniones D EAE. La Figura 1 8 muestra las curvas de fusión de TO P004 y TOP005 en IXPBS. La Fig u ra 1 9 m uestra un resumen termodinámico basado en los resu ltados de los ajustes de la curva de fusión de TO P004 y TOP0.05 en IXPBS.

Las Figuras 20A y 20B muestran las concentraciones de TOP004 y TOP005 y de sus metabolitos en el plasma de mono el día 1 después del tratamiento con una dosis alta de ASM8. Las Figuras 21A y 21B muestran las concentraciones de 5 TOP004 y TOP005 y de sus metabolitos en el plasma de mono el día 14 después del tratamiento con una dosis alta de ASM8. Descripción Detallada de la Invención Varios mediadores inflamatorios desempeñan un papel importante en la aparición y persistencia de la inflamación en las 10 vías aéreas de pacientes con asma. Algunos mediadores atraen las células inflamatorias en las vías aéreas a través de la quimiotaxis de eosinófilos. Muchas de estas quimiocinas actúan sobre todo n la inflamación asmática o. alérgica a través del receptor CCR3. Otros mediadores . causan la supervivencia -15. principal y aumentada de células inflamatorias en las vías aéreas o piel tal como IL-3, IL-5, y GM-CSF. Un mejoramiento en el asma se ha mostrado cuando hay una disminución de estos mediadores inflamatorios en las vías aéreas. Además, el cáncer, caracterizado por la proliferación 20 anormal de células inmortalizadas, puede deberse a la liberación de mediadores inflamatorios y/o factores de crecimiento que actúan a través de receptores y conducen a la proliferación celular. Entre éstos, se ha mostrado que GM-CSF es un factor de crecimiento importante para varias células tumorales. El receptor 25 de quimiocina CCR3 fue caracterizado por linfocitos B malignos recuperados de pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL) y con leucemia por tricoleucitos (HCL), (Trentin y col., 2004, Blood, 104, 502-508). De hecho, la transactivación de EGFR a través de CCR3 encontró una trayectoria crítica que provoca la activación de cinasa MAP y la producción de citocina en células epiteliales bronquiales (Adachi y col., 2004, Biochem. Res, Común. 320, 292-396). La inhibición de la proliferación y metástasis de células cancerosas bloqueando los receptores de los factores de crecimiento o el receptor de quimiocina CCR3, podría ser importante en la terapia de ciertos cánceres. En una modalidad de la invención, se proporciona un oligonucleót.id.o antisentido de novedad identificado como 828 (51-GTTACTACTTCCACCTGCCTG-3', (SEC ID NO.. 1)) y dirigido contra el receptor de quimiocina CCR3. Los ejemplos descritos ien la presente muestran que 828 es efectivo disminuyendo o bloqueando la expresión de ARNm de CCR3 en líneas celulares humanas. En otra modalidad de la invención, se proporcionan los oligonucleótidos antisentido de novedad TOP004 y TOP005 basados en 1O7A que se describió previamente y el anterior 828.

TOP004 (5'-GGGTCTGCXGCGGGXTGGT-3' (SEC ID NO. 13) donde X representa una modificación de DAP de un residuo de adenosina), como con 107A, es un 19-mer dirigido contra el ARNm de la cadena beta (ß) común de los receptores IL-3, IL-5, y GM-CSF. TOP005 (5'-GTTXCTXCTTCCXCCTGCCTG-3' (SEC ID NO . 14) , donde X representa una modificación de DAP de un resid uo de adenosina) , como con 828, es un 21 -mer dirigido contra el ARNm del receptor de quimiocina CCR3. Una composición que comprende TO P004 y TOP005 se identifica como parte de ASM8. Seg ún lo descrito en la presente, TO P004 y TOP005 poseen actividad en un sistema primate no humano, así se valida el uso del mono Cynomolgus para una evaluación segura. La Figura 1 muestra la secuencia del gen de cadena beta común del mono Cynomolgus . La secuencia de cadena beta del Cynomolgus complementaria a TOP 004 mostró una homología significativa. El grado muy alto dé identidad entre la. secuencia de cadena beta de mono y h umano sugiere una actividad funcional probable de TO P004 en el mono Cynomolgus. Sé muestra en- las figuras 2, 3, y 4, la efectividad de TOP004 y TOP005 en la expresión de bloqueo o disminución de la cadena beta común y CCR3 en células mononucleares sangu íneas periféricas del mono. Los resultados muestran que TOP004 y TO P005 dirigidos contra objetivos de gen h umano son efectivos en la reducción de la expresión de sus objetivos respectivos en las células mononucleares sanguíneas periféricas del mono Cynomolgus (PBMC, por sus sig las en ingles) . AS M8, que contiene TO P004 y TO P005 inhibió sig nificativamente la expresión cadena beta comú n y los receptores CCR3, a un mayor grado o al mismo grado en una concentración más baja . TOP004 y TOP005 juntos por lo tanto exhiben efectos sinérgicos en el bloqueo de la expresión de la cadena beta y de ARNm de CCR3. Además, en las tablas 7 y 8, las muestras traqueales, tomadas de los monos tratados con ASM8, se analizaron para el nivel de expresión de ARNm. La expresión de los genes objetivo se normalizó a los niveles del ARNm para los citocinas inflamatorias (IL-4 y de TNF-a). Incluso aproximadamente 24 horas después de la administración de ASM8, la expresión relativa de la subunidad-ßc y ARNm de CCR3 a ARNm de IL-4 fue disminuida en un 29% y 24%, respectivamente, y la expresión relativa de TNF-a fue disminuida en un 30% y 24%, respectivamente, en animales tratados con ASM8. En jas figuras .5-10, los nucleótidos antisentido, incluyendo A86 y TOP005, dirigidos contra ARNín de CCR3 fueron. probados para determinar la eficacia en células y líneas celulares humanas.

Cuando se determinó por transcripción inversa semi-cuantitativa -reacción en cadena de polimerasa ("RT-PCR"), los oligonucleótidos antisentido causaron la inhibición de la expresión de ARNm de CCR3. Además, usando análisis de FACS, se muestra que se inhibió la expresión de superficie celular de la proteína de CCR3 también mediante el tratamiento con oligonucleótidos antisentido. Por otra parte, la inhibición funcional de CCR.3 fue confirmada por la inhibición de la movilización de calcio (Ca++) en eosinófilos purificados después del estímulo con eotaxina. Además, los oligonucleótidos inhibieron la quimiotaxis de eosinófilos en un 55% en un análisis de quimiotaxis. En las Figuras 11-13, los antisentido 107A y TOP004 se utilizaron para tratar varias células. Las células TF-1 incubadas con 107A mostradas redujeron la expresión de ARNm de cadena beta. 107A también inhibió la proliferación de células TF-1 en la presencia de IL-3, IL-5, o GM-CSF. Además, 107A redujo, de una manera dependiente de la dosis, el efecto anti-apoptótico de IL-5 en eosinófilos. Las células U937 incubadas con TOP004 mostradas redujeron la expresión de la cadena beta común al nivel de ARNm y la proteína. Los antisentidos 107A y TOP004 fueron así altamente efectivos en el bloqueo dé la expresión de la proteína de ARNm de cadena beta, y funcion les bloqueando las respuestas celulares asociadas en cultivos celulares humanos. En las Figuras 14-17B2, la estabilidad de ASM8 es mostrada eluyendo la composición bajo condiciones variantes. ASM8 se eluyó usando el sistema fraccionamiento basado en la cromatografía líquida del alto rendimiento de intercambio de aniones DEAE (CLAR) para determinar la integridad ASM8 y sus productos de degradación después del almacenamiento a diferentes temperaturas. Los componentes de ASM8 no experimentaron ninguna degradación detectable cuando se almacenaron a -20°C, 4°C, 30°C, ó 40°C durante hasta 2 meses. En la Figuras 18-19, las curvas de fusión y los resúmenes termodinámicos proporcionados para ASM8 mostraron que los dos filamentos de oligonucleótidos no interactúan significativamente en la solución. En la Figuras 20-21, se midieron las concentraciones de los constituyentes del oiigonucleótfdo de ASM8 y sus metabolitos primarios (n-1) en muestras de plasma de mono. Las muestras se recolectaron durante un ensayo de toxicidad no clínico en el cual los animales fueron tratados durante 14 días consecutivos por inhalación. Así, por lo tanto se proporcionan los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra la subunidad beta común de los receptores 1L-3, IL-5 y GM-CSF, y.CCR3, y contra la codificación de ácidos nucleicos También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los oligonucleótidos con un portador farmacéuticamente aceptable. Se describen los usos de los oligonucleótidos y de los métodos que comprenden la administración de los oligonucleótidos para tratar y/o prevenir por lo menos una de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer. Los términos "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" según lo utilizado intercambiablemente en la presente, se refieren a una molécula compuesta de nucleótidos, es decir, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, o ambos. El término incluye monómeros y polímeros de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, con el ribonucleótido y/o desoxirribonucleótidos que se conectan juntos, en el caso de los polímeros, vía los enlaces 5' a 3'. Sin embargo , los enlaces pueden incluir cualq uiera de los enlaces conocidos en la técnica de la síntesis de ácido nucleico incluyendo , por ejemplo, los ácidos nucleicos que comprenden los enlaces 5' a 2'. Los nucleótidos usados en la molécula de ácido nucleico pueden encontrarse natu ralmente o pueden ser análogos producidos por síntesis que son capaces de formar relaciones, de pares de bases con pares de bases que se encuentran naturalmente. Los ejemplos de bases que no se encuentran naturalmente que son capaces de formar relaciones de pares de bases incluyen , pero no se limitan a , análogos de aza- y deaza-pirimidina, análogos de aza- y deaza-purina, y otros análogos heterocíclicos base, en donde uno o más de los átomos de carbono y nitrógeno de los anillos de purina y pirimidina se han sido sustituido por heteroátomos , por ejemplo , oxígeno, azufre, selenio, fósforo, y similares. El término "estructura de ácido n ucleico" seg ún lo utilizado en la presente se refiere a la estructu ra de los n ucleótidos de enlace de porción química en una molécula. Éste puede incluir estructuras formadas de cualq uiera y todos los medios de- los nucleótidos enlazados químicamente. U na estructura modificada segú n lo utilizado en la presente incluye modificaciones al enlace qu ímico entre los n ucleótidos, así como otras modificaciones que se pueden utilizar para mejorar la estabilidad y afinidad , tal como modificaciones a la estructura del azúcar. Por ejemplo se puede utilizar un [alfaj-anómero de desoxirribosa, donde la base se invierte con respecto al [betaj-a nómero natural. En una modalidad preferida, el 2'-OH del grupo azúcar se puede alterar a 2'-O-alquilo o 2'-O-alquilo-n (O-alquilo)-n , que proporciona resistencia a la deg radación sin comprende r la afin idad. El término "oligonucleótido" según lo utilizado en la presente se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nucleótidos, más preferiblemente de 1 a 80 nucleótidos, e incluso más preferiblemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 35 nucleótidos. Los compuestos de oligon ucleótidos antisentido de acuerdo a la presente invención también incluyen ARNspi (ARNs de poca interferencia) y CSIRs (complejos de silenciamiento ind ucido por ARN) que los contienen , los cuales resultan del proceso de iARN (interferencia de ARN). El proceso de interferencia de ARN (iARN) , que se ha descrito recientemente, se considera como una herramienta n ueva para la inhibición de la expresión del gen objetivo. Según lo ya conocido años atrás , la ÍARN se basa en un mecanismo antiguo de defensa anti-viral en eucariotas inferiores. Es inducida por el ARN de doble filamento y su proceso a 21 -23 nt de ARNs de poca interferencia (ARNspi), que causa la degradación de ARNm endógeno homólogo después de la hibridación al ARNm objetivo en una sola manera con filamentos con la asistencia del complejo CSI R. Los trabajos de la manera iARN todavía se deben aclarar completamente, pero ya sirven como un proceso de primera opción para generar fenotipos con pérdidas de función entre una amplia variedad de especies eucarióticas, tal como nematodos, moscas, plantas, hongos y mamíferos. Los compuestos de oligonucleótidos antisentido de acuerdo con la presente invención también incluyen ribozimas y secuencias de nucleótidos cortas, ARN o ADN con filamentos sencillos o dobles, que pueden incorporar modificaciones químicas según lo descrito anteriormente, son capaces de inhibir lá transcripción de-gen y/o traducción in vitro e in vivo. El término "oligonucleótido modificado" y "molécula modificada de ácido nucleico" incluye los compuestos de oligonucleótidos antisentido que se han modificado sin un efecto nocivo significativo a su actividad, por ejemplo, mediante la inserción o eliminación de una o más bases. En particular, la adición o eliminación de bases en los extremos terminales de los oligonucleótidos que exhiben una complementación del 100% al gen dirigidas en contra, generalmente se pueden hacer sin una pérdida significativa de la actividad inhibidora. Tales modificaciones se pueden hacer para aumentar actividad o proporcionar una estabilidad mejorada del oligonticleótido. Además, la sustitución de una o más bases en los presentes compuestos de oligonucleótidos antisentido también se puede hacer sin un efecto nocivo a la actividad, por ejemplo, la sustitución de purina con otra purina (adenina, g uanina) y pirimidina con pirimidina (citos'ma, timina, uracilo) . El oligon ucleótido modificado y la molécula modificada de ácido nucleico según lo utilizado en la presente también incluyen ácidos nucleicos, incluyendo los oligonucleótidos, con una o más modificaciones químicas al nivel molecular de las estructuras moleculares naturales de todas o cualquiera de las bases de ácido nucleico, porciones de azúcar, enlaces de fosfato de internucleósido, así corno moléculas q ue tienen agregados .sustituyentes , . tal como. diami nasJ colesterilo u otros grupos - lipofílicos , o una combinación de modificaciones en estos sitios.

Los enlaces de . fosfato de internucleósido pueden ser fosfodiéster, fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, fosforanidato puenteado, f.osfonato de metileno puenteado, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, enlaces de internucleótido de fosforotioato y/o sulfona puenteados, o en laces 3'-3', 2'-5' ó 5'-5\ y las combinaciones de tales enlaces similares (para producir oligon ucleótidos modificados de estructura mezclada). Las modificaciones pueden ser internas (sencillas o repetidas) o en los extremos de la molécula del oligonucleótido y pueden incluir adiciones a la molécula de los enlaces de fosfato de intern ucleósido, tal como colesterilo, compuestos de diamina con números variantes de resid uos de carbono entre los g rupos amino y modificaciones terminales de ribosa, desoxirribosa y fosfato que dividen o reticulan a las cadenas opuestas o a las enzimas asociadas u otras proteínas. Los grupos electrofílicos tal como ribosa-dialdehído pueden enlazarse covalentemente a un grupo amino epsilon del residuo lisilo de tal proteína. Un grupo nucleofílico tal como n-etilmaleimida unido a un oligómero, puede unirse covalentemente al extremo 5' de un ARNm o a otro sitio electrofílico. El término oligonu.cleótidos modificados también incluye oligonucleótidos que comprenden modificaciones a las porciones de azúcar tal como ribonucleótidos sustituidos, con 2', o monómero de desoxirribonucleótido, cualquiera de los .cuales están conectados juntos vía los enlaces 5' a 3'. Los oligonucleótidos modificados también pueden estar compuestos por estructuras modificadas de PNA o morfolino donde se mantiene la especificidad del objetivo de la secuencia. El término oligonucleótidos modificados también incluye compuestos de oligonucleótido, según lo definido en la presente, de una forma que ño afecta significativamente de manera dañina su actividad para reducir la actividad o inhibir la expresión de una proteína objetivo, pero que puede mejorar esta actividad. Los oligonucleótidos modificados también incluyen los oligonucleótidos que se basan en o se construyen a partir de arabinonucleótidos o residuos modificados de arabinonucleótidos, incluyendo pero sin limitarse a, constructos de oligonucleótidos antisentido basados en beta-arabinofuranosa y sus análogos. Los aribonucleósidos son estereoisómeros de ribonucleósidos, que se diferencian solamente en la co nfiguración en la posición 2' del anillo de azúcar. La Solicitud P CT No. WO 99/67378 de Damha y col. (1 ), q ue se incorpora por referencia en la presente en su totalidad , describe los oligómeros de ácido arabinonucleico (ANA) y sus análogos para una inhibición mejorada específica de secuencia de la expresión de gen vía la asociación- al ARN mensajero complementario. Dahma y col. además enseña los oiigon ucleótidos . modificados con azúcar q ue forman un d úplex con su secuencia de ARN objetivo dando por resultado" un sustrato para RNaseH. Específicamente, se describen los oligómeros que comprenden beta-D-arabinonucleótidos y 2'-desoxi-2'-fluoro-beta-D-arabinon ucleósidos. La Solicitud PCT No . WO 02/20773 también de Dahm a y col. (2) , q ue se incorpora en su totalidad por referencia en este medio, describe oligon ucleótidos quiméricos usados para inhibir la transcripción de gen y la expresión en una secuencia de manera específica. Específicamente, Dahma y col . (2) enseña los oligonucleótidos antisenti.do construidos a partir de arabinonucleótidos que flanq uean una serie de residuos de n ucleótido de deoxiribosa de longitud variable. Se utilizan los oligon ucleótidos antisentido construido así para hibridizar e inducir la división de ARN complementario. La Solicitud PCT No. WO 03/037909 también de Dahma y col. (3) , que se incorpora en su totalidad por la referencia en este medio, describe oligonucleótidos que tienen un resid uo en lazador acíclico intern o . Los ol igon ucleótidos antisentido preparados con un enlazador acíclico se utilizan para prevenir o reducir la función de un ácido nucleico objetivo del interés tal como ARN. La Solicitud PCT No. WO 03/064441 también de Dahma y col. (4), que se incorpora en su totalidad por 5 la referencia en este medio, describe los oligonucleótidos que tienen segmentos alternantes de nucleósidos modificados con azúcar y 2'-desoxinucleósidos y también, segmentos alternantes de nucleótidos modificados con azúcar yJ2'-desoxinucleótidos.

. Los . oligonucleótidos antisentido que tienen estos segmentos ?'o alternantes se describen para utilizarse para prevenir o reducir la función de un ácido nucleico objetivo de interés tal como ARN. El término "resistente sustancialmente a la nucleasa" se refiere a los ácidos nucleicos que son resistentes a la degradación por nucleasa, en comparación a los ácidos nucleicos 15 que se encuentran naturalmente o sin modificar. Los ácidos nucleicos modificados de la invención son por lo menos 1.25 veces más resistentes a la degradación por nucleasa que su contraparte sin modificar, más preferiblemente por lo menos 2 veces más resistente, incluso más preferiblemente por lo menos 5 20 veces más resistente, y muy preferiblemente por lo menos 10 veces más resistentes que su contraparte sin modificar. Tales ácidos nucleicos resistentes a la nucleasa incluyen sustancialmente, pero no se limitan a, ácidos nucleicos con estructuras modificadas tal como fosforotioatos, metilfosfonatos, 25 etilfosfotriésteres, 2'-0-metilfosforotioatos, ribonucleótidos de 2'- O-metil-p-etoxi, 2'-O-alq?ilos, 2'-O-alquilo-n(O-alquilo), 3'-O-alquilos, 3'-O-aIquilo-n(O-alquiIo), 2'-fluoros, 2'-deoxi-eritropentofuranosilos, ribonucleósidos de 2'-O-metiIo, carbamatos de metilo, carbonatos de metilo, bases invertidas (por ejemplo, T's invertidas), o versiones quiméricas de estas estructuras. Los términos "CCR3 y cadena beta común de los receptores IL-3/IL-5/GM-CSF, y oligonucleótidos antisentido'J según lo utilizado en la presente cada uno se refiere a un oligónucleótido dirigido, respectivamente, a las secuencias que afectan la expresión y/o actividad del receptor de quimiocina CCR3 y de la cadena beta común para los receptores IL-3/IL-5/GM-CSF. Éstos incluyen, pero no se limitan a, el receptor de quimiocina CCR3 y la cadena beta común para los receptores IL-3/IL-5/GM-CSF, secuencias de codificación de ADN, secuencias del promotor de ADN, secuencias potenciadoras de ADN, secuencias de codificación de ARNm, y similares. Según lo discutido anteriormente, una modalidad de la presente invención proporciona oligonucleótidos antisentido dirigidos a las secuencias que afectan la expresión y/o actividad del receptor de quimiocina CCR3 y de la cadena beta común para los receptores IL-3/IL-5/GM-CSF. En una modalidad el oiigonucleótido antisentido puede comprender fragmentos o variantes de estas secuencias, como será entendido por un experto en la técnica, que puede alterar la composición y/o longitud del oligonucleótido, pero mantiene o aumenta la actividad del oligonucleótido para disminuir-regular la expresión del gen. En otra modalidad, la presente invención proporciona las combinaciones de por lo menos dos oligonucleótidos antisentido de las secuencias identificadas como la SEC ID NO. 1, SEC ID NO. 13 y SEQ ID NO. 14. Los términos "tratamiento", "tratar", "terapia" y similares se utilizan en la' présente generalmente para dar a entender la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para una enfermedad y/o aliviar un efecto nocivo atribuible a la enfermedad. "Tratamiento" según lo utilizado en la presente cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un sujeto según lo definido previamente, particularmente un humano, e incluye: (a) prevenir que una enfermedad se presente en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que todavía no se ha diagnosticado con ella; (b) inhibir una enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar una enfermedad, es decir, causar el retroceso de la enfermedad. El término "farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en la presente con respecto a los portadores, tensioactivos y composiciones, se refiere a las sustancias que son aceptables para el uso en el tratamiento de un paciente objeto, que no es tóxico o de otra manera inaceptable para la administración por cualquiera de las rutas, descritas en la presente. La invención está, dirigida generalmente hacia el tratamiento de sujetos mediante la administración : de cantidades terapéuticamente efectivas de compuestos de oligonucleótidos antisentido de acuerdo a la presente invención, incluyendo ARNpi, ribozimas, secuencias cortas de nucleótidos como ARN y/o ADN que ¡ncluyen filamentos sencillos o dobles trenzados, que pueden ser complementarios a un ácido nucleico objetivo, o se pueden modificar opcionalmente según lo descrito anteriormente, un oligonucleótido de ARN que tiene por lo menos una porción del oligonucleótido de ARN capaz de hibridizarse con ARN para formar un dúplex de oligonucleótido-ARN, o un oligonucleótido quimérico, que disminuirá/regulará o inhibirá la expresión de un gen endógeno in vivo. Por cantidad "terapéuticamente efectiva" se entiende una cantidad de un compuesto de oligonucleótidos antisentido no tóxica pero suficiente para proporcionar el efecto terapéutico deseado. En el presente caso, la dosis del compuesto de oligonucleótidos antisentido es efectiva para aliviar, mejorar, o prevenir los síntomas de la condición o enfermedad que está siendo tratada, por ejemplo una enfermedad asociada a una alergia, asma, enfermedad inflamatoria tal como enfermedad respiratoria inflamatoria. El término "alergia" según lo utilizado en la presente, describe cualquier inmunorrespuesta indeseable del cuerpo a una sustancia a la cual se ha vuelto hipersensible. Las formulaciones de la presente invención se administran de preferencia directamente al sitio de acción y son así preferiblemente formulaciones tópicas, incluyendo pero sin limitarse a, orales, intrabucales, intrapulmonares, rectales, intrauterinas, intratumorales, nasales, intratecales, inhalables, transdermales, ¡ntradérmicas, intracavitarias, iontoforéticas, oculares, vaginales, intraarticulares, oticales, transmucosales, rectales, de liberación retardada o con recubrimiento entérico. Sin limitarse a cualquiera de las anteriores, las formulaciones de la presente invención pueden también ser intracraneales, intramusculares, subcutáneas, intravasculares, intraglandulares, intraorgánicas, intralinfáticas, intraperitoneales, intravenosas, e implantables. Los portadores usados en las formulaciones pueden ser, por ejemplo, portadores sólidos y/o líquidos. Se puede hacer referencia a "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa, 1985, para otros portadores que serán adecuados para la combinación con los presentes compuestos de oligonucleótidos para hacer que las composiciones/formulaciones sean adecuadas para la administración para tratar la enfermedad respiratoria.

Opcionalmente, los oligonucleótidos ahora descritos se pueden formular con una variedad de moléculas de portador fisiológico. Los oligonucleótidos actualmente descritos también pueden estar compuestos por moléculas que mejoran su capacidad .para incorporar las células objetivo. Los ejemplos de tales moléculas incluyen, pero no, se limitan a, carbohidratos, poliaminas, aminoácidos, péptidos, lípidos, y moléculas vitales para el crecimiento celular. Por ejemplo, los oligonucleótidos se pueden combinar con un lípido, la emulsión resultante de oligonucleótido/lípido, o la suspensión liposómica pueden, entre otras cosas, aumentar efectivamente la vida promedio in vivo del oligonucleótido. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente pueden comprender los compuestos de oligonucleótidos antisentido descritos anteriormente y uno o más tensioactivos farmacéuticamente aceptables. Se han descrito previamente los componentes de tensioactivos o tensioactivo adecuados para mejorar la absorción de oligonucleótidos antisentido de la invención en la Publicación de Solicitud Norteamericana No. 2003/0087845, cuyos contenidos se incorporan en la presente con respecto a los tensioactivos. La Solicitud indica que los tensioactivos adecuados "...incluyen formas sintéticas y naturales así como por completas y truncadas de proteína A de tensioactivo, proteína B de tensioactivo, proteína C de tensioactivo, proteína D de tensioactivo y proteína E de tensioactivo, fosfatidilcolina di-saturada (distinta de dipalmitoilo), dipalmitoilfosfatidilcolina, fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidiletan olamina, fosfatidilserina; ácido fosfatíd ico, ubiquinonas , lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilcolina, -- palmitoil-lisofosfatidilcólina, dehidroepiandrosterona, dolicoles, ácido sulfatídico, glicerol-3-fosfato, fosfato de dihidroxiacetona, glicerol, glicero-3-fosfocolina, dihidroxiacetona, palmitato, de citidina difosfato diacilglicerol (CDP) , colina de CDP, colina, fosfato de colina; así como cuerpos lamelares naturales y artificiales que son los veh ículos natu rales del portador para los componentes de tensioactivo, ácidos grasos de omega-3, ácido poliénico, ácido polienóico , lecitina, ácido palm itínico, copolímeros de bloq ue no iónicos de óxidos de etileno o propileno, del polioxipropileno, monomérico y polimérico, políoxietileno, monomérico y polimérico, poli(vinilamina) con cadenas laterales de dextrano y/o alcanoilo, Brij 35™ , Tritón X-100™ y tensioactivos sintéticos ALEC™ , Exosurf™ , Survan™ y Atovaquone™ , entre otros. Estos tensioactivos se pueden utilizar solos o como parte de un tensioactivo de componente mú ltiple en una formulación , o como adiciones unidas covalentemente a los extremos 5' y/o 3' de los oligonucleótidos antisentido". El componente antisentido de las presentes composiciones puede estar contenido en una formulación farmacéutica dentro de una partícula o ampolla de lípido, tal como liposoma o un microcristal. Según lo descrito en la Patente Norteamericana No. 6, 025,339, las partícu las de l ípidos pueden ser de cualquier estructu ra adecuada, tal como u nilamelar o plurilamelar, siempre y cuando el oligonucleótido antisentido esté contenido en las mismas. Los lípidos cargados positivamente tal como N-[1 -(2 ,3-dioleoiloxi)propil]-N , N , N-trimetil-amoniometilsuifato, o "DOTAP" son particularmente preferidos para tales partículas y ampollas. Es bien conocida la preparació n de tales partículas de l ípidos. Ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,880,635 de Janoff y col. ; 4,906,477 de Kurono y col. ; 4,91 1 ,928 de Wallach ; 4,91 7,951 de Wallach ; 4,920,016 de Alien y col. ; 4,921 ,757 a Wheatley y col. ; etc. La composición de la invención se puede administrar por cualquier medio que transporte el compuesto de oligonucleótido antisentido al sitio deseado, tal como por ejemplo, el pulmón.

Los compuestos antisentido descritos en la presente se pueden administrar a los pulmones de un paciente por cualqu ier medio adecuado , pero se administran preferiblemente mediante inhalación de un aerosol compuesto por partículas respirables que comprenden el compuesto antisentido. La composición de la presente invención se puede administrar en el sistema respi ratorio como u na form ulación que incluye partículas de tamaño respirable, por ejemplo las partículas de un tamaño suficientemente pequeño para pasar a través de la nariz, boca y laringe d u rante la inhalación , y a través de los bronquios y alvéolos de los pulmones. En general, las partículas respirables oscilan de aproximadamente 0.5 a 10 micrones de tamaño. Las partículas de tamaño no respirable que se incluyen en. ehaerosol tienden a depositarse en la garganta y ser tragadas, y la cantidad de partículas no respirables en el aerosol así preferiblemente sé minimiza. Para la administración nasal, se prefiere un tamaño de partícula en el intervalo de 10-500 micro-M (micrómetros) para asegurar la retención en la cavidad nasal. Las composiciones farmacéuticas líquidas del compuesto activo (compuestos de oligonucleótidos antisentido) para producir un aerosol se pueden preparar combinando el compuesto antisentido con un vehículo adecuado, tal como pirogen estéril libre de agua o solución salina amortiguada con fosfato. Una composición con partículas sólidas que comprende el compuesto antisentido puede contener opcionalmente un dispersor que sirve para facilitar la formación de un aerosol así como otros compuestos terapéuticos. Un dispersor adecuado es la lactosa, que se puede mezclar con el compuesto antisentido a cualquier relación adecuada, por ejemplo, una relación de 1 a 1 en peso. Las composiciones antisentido se pueden administrar en una cantidad efectiva anti-broncoconstricción, anti-alergias y/o anti-inflamatoria, cuya cantidad depende del grado de la enfermedad que es tratada, la condición del paciente objeto, formulación particular, ruta de administración, duración de la administración al sujeto, etc. En general, son deseables las concentraciones intracelulares del oligonucleótido de 0.05 a 50 microM, o más particularmente 0.2 a 5 microM. Para la administración a un paciente mamífero tal como un humano, se utiliza comúnmente una dosificación de aproximadamente 0.001, 0.01, 0.1, ó 1 mg/Kg hasta aproximadamente 50, ó 100 mg/Kg o más. Sin embargo, también se contemplan otras dosis.

Dependiendo de la solubilidad del compuesto activo en cualquier formulación particular, la dosis diaria se puede dividir entre una o varias administraciones de dosis unitaria. Los aerosoles de partículas líquidas que comprenden el compuesto antisentido se pueden producir por cualquier medio adecuado, por ejemplo con un nebulizador. Los nebulizadores son los dispositivos disponibles comercialmente que transforman las soluciones o suspensiones deí ingrediente activo en una vaporización de aerosol terapéutica por medio de la aceleración de un gas comprimido, comúnmente aire u oxígeno, a través de un orificio inyector estrecho o por medio de agitación ultrasónica. Las formulaciones adecuadas para el uso en nebulizadores comprenden el ingrediente activo de oligonucleótidos antisentido en un portador líquido en una cantidad de hasta 40% p/p, preferiblemente de menos de 20% p/p de la formulación. El portador es comúnmente agua o una solución alcohólica acuosa diluida, preferiblemente hecha isotónica con fluidos corporales por la adición de, por ejemplo, cloruro de sodio. Los aditivos opcionales incluyen conservadores si la formulación no está preparada estéril, por ejemplo, hidroxibenzoato de metilo, antioxicfantes, anti-bacterianos, saborizantes, aceites volátiles, amortiguadores y emulsificadores y otros tensioactivos de la formulación. Los aerosoles de las partículas sólidas que comprenden los compuestos activos de oligonucleótidos y un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, se pueden producir asimismo con cualquier generador de medicamento en forma de aerosol con partículas sólidas. Los generadores de aerosol para la administración de medicamentos con partículas sólidas a un sujeto produce partículas que son respirables, según lo explicado anteriormente, y generan un volumen de aerosol que contiene una dosis medida predeterminada de un medicamento a una velocidad adecuada para la administración humana. El ingrediente activo de oligonucleótidos comprende comúnmente de 0.1 a 100 p/p de la formulación. Un segundo tipo de generador de aerosol ilustrativo comprende un inhalador de dosis medida. Los inhaladores de dosis medida son distribuidores de aerosol presurizados, que comúnmente contienen una formulación en forma de suspensión o solución del ingrediente activo en un propulsor licuado. Durante el uso, estos dispositivos descargan la formulación a través de una válvula adaptada para liberar un volumen medido, comúnmente de 10 a 150 microL, para producir un spray con partículas finas q ue contiene el ing rediente activo. Los propulsores adecuados incluyen ciertos compuestos de clorofluorocarbono, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o hidrofluoroalcanos y mezclas de los mismos. La formulación puede contener adicionalmente uno o más co-solventes, por ejemplo, etanol, emulsificadores y otros tensioactivos de la formulación, tal como ácido oleico o trioleato de sorbitan , antioxidante y agentes saborizantes adecuados. El aerosol , así formado de partículas sólidas o líquidas, puede ser producido por el generador de aerosol a u na velocidad de aproximadamente 1 a 150 litros por min uto. En un aspecto adicional de la presente invención , se proporciona un artículo de fabricación que incluye el material de empaquetado, cuyo contenido es una composición oligon ucleótidos antisentido farmacéuticamente aceptable que es terapéuticamente efectiva para tratar las condiciones asociadas a la alergia, asma, rin itis y enfermedad inflamatoria. En una modalidad , la composición comprende un compuesto de oligo n ucleótid os antisentid o q ue sea efectiva para in h ib ir u n gen del receptor de q u imioci na CCR3 o de la cadena beta comú n para los receptores IL-3/I L-5/GM-CSF, el compuesto de oligon ucleótidos es por lo menos 50% complementario al gene. En otro aspecto, la composición comprende por lo menos 2 compuestos de oligonucleótidos antisentido, cada compuesto de oligonucleótidos antisentido es capaz de dismin uir/regular el gen del receptor de quimiocina CCR3 y de la cadena beta com ún para los ' receptores I L-3/I L-5/GM-CSF, cada compuesto de oligon ucleótidos antisentido está presente a una concentración en la cual el compuesto de oligon ucleótidos antisentido es prácticamente inefectivo por sí solo para dismin uir/regular el gen dirigido en contra, la combinación de los compuestos de oligonucleótidos antisentido es efectiva para dismin uir/reg ular por lo menos uno de los genes contra los que están dirigido los oiigonucleótidos antisentido. En una modalidad, el material de empaq uetado del artículo comprende u na etiqueta que indica que la composición se puede utilizar para tratar la enfermedad respiratoria inflamatoria y adicionalmente puede incluir una indicación de que la enfermedad es una de alergia, rinitis y asma . En otra modalidad, el material de empaquetado del artículo comprende una etiqueta que ind ique que la composición se puede utilizar para tratar la enfermedad respiratoria inflamatoria, y adicionalmente puede incluir un a indicación de que la enfermedad es una de alergia, asma, hipereosinofilia, bronquitis , rinitis o sinusitis. Para los propósitos de la presente invención, el material de empaquetado puede ser cualquier material adecuado para empaquetar una composición que contiene nucleótidos de acuerdo a la presente invención , incluyendo una botella u otro recipiente (plástico o de cristal), cartón, tubo, u otra envoltura protectora.

Como será apreciado, el empaquetado puede variar con la naturaleza de la composición de oligonucleótidos, por ejemplo, una formulación líquida se puede empaquetar de manera diferente que una formulación en forma de aerosol. La presente invención será entendida más fácilmente refiriéndose a los ejemplos que se dan para ilustrar la siguiente invención en lugar de limitar su alcance. Con respecto a estos ejemplos, los siguientes son métodos y materiales que ya se utilizaron.

Ejemplos Materiales y Métodos Materiales Los siguientes materiales y reactivo se utilizaron para los experimentos: RPMI 1640 (Wisent, cat# 10040 CV); FBS (Fetal Bovine Serum, Wisent, cat#80150); Penicilina-Estreptomicina (GIBCO, cat#15140-122); HEPES (Wisent, cat#26060CI); L-glutamina (Gibco, cat#25030-081); Piruvato de Sodio (Wisent, cat#25000-C¡); PBS Estéril (GIBCO, cat#25030-081); Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, cellgro,cat#2O021-cv); Superscript First-Strand Synthesis System para el kit de RT-PCR (Invitrogen, cat#11904-018); dNTPs (Invitrogen, cat#10297-018; oligo (dT)12. 18(lnv¡trogen, cat#11904-018); Qiagen RNAeasy Mini Kit (Qiagen, cat#74106); kit de extracción de gel Qiagen (Qiagen, cat#28704); kit de extracción de PCR Qiagen (Qiagen, cat#28104); ß-Mercaptoetanol (Sigma, cat#M-6250); 99% de Etanol (Commercial alcohols Inc., Brampton, Ontario, Canadá); QiaVac 24 Manifold (Qiagen, cat#19403);- Disposable Vacconnectors (Qiagen, cat#19407); kit DNase I (Fermentas; cat.#ENO521); RiboGreen Quantification Reagent (Invitrogen-IMolecular probes, cat#R-11490); kit de núcleo de PCR Taq (Qiagen, cat#201223), conjunto de teñido Hema-3 (Fisher scientific Co. cat#122-911, lot#999901); Alamar Blue (Biosource cat#DAL1100); par de cebadores de CCR3 humano (R&D systems, cat# RDP-209-025); par de cebadores de GAPE5H humano (R&D systems, cat# RDP-39-025); Ficoll (Amersham Biosciences; cat#: 17-1440-03); anti-CD 16 (kit de purificación de eosinófilos, Miltenyi Biotec, Auburn, CA, cat#130-045- 701); rhEotaxin (Biosource, cat# PMC1434); cámara y membranas de quimiotaxis (NeuroProbe, Nucleopore- Neuroprobe, Cabin John, MD); albúmina de suero humana (SIGMA; cat.#A9511); cadena beta de los receptores IL-3/IL-5/GM-CSF de anti-humano (lgG2b monoclonal de ratón; Santa Cruz Biotechnology, cat#sc-457); lgG2b de Anti-ratón (monoclonal de cabra, Alexa Fluor 488, Molecular Probes, cat#A-21141); anticuerpo de CCR3 anti-humano (monoclonal de ratón, lgG2a, R&D, cat.# MAB 155); IgG anti-rata (monoclonal de cabra, Alexa Fluor 633, Molecular Probes, cat.# A-21094); rhGM-CSF (R&D systems, cat#215-GM-005); rhlL-3 (R&D systems, cat#203-IL-010); rhlL-5 (R&D systems, cat#205-IL-005), rhlL-2 (R&D systems, cat#202-IL-010); TOP004-(n-1) (Biosource, Oligonucleótida con un nucleótido menos en el extremo 31); TOP005-(n-1) (Biosource, Oligonucleótidoos con un" nucleótido menos en el extremo 3 OP004-TP (Biosource, Témplate Probé); TOP 004-(n-1-TP-T) (Biosource Biosource , témplate Probé); LP (Biosource, Ligation Probé); TOP005-TP (Biosource); TOP004-(n-l-LP-A, Biosource); placas de capacidad alta de unión recubiertas con neutravidina Reacti-Bind (Pierce, cat#15508); T4 DNA Ligase 5U/mL (Roche, cat#799 009); anticuerpo Anti-DIG-AP (Roche, cat# 1093274); SuperBlock Blocking Buffer in PBS (Pierce, cat#37515); sustrato de metilumbelliferil fosfrato alcalino fosfato (Molecular Probes, cat#M-649.1 ); muestras de plasma de monos que contienen ASM8; MW96 Píate Washer (Beckman Coulter); placa de polipropileno de gran capacidad con 96 pozos (Nunc); Micropipettors de Eppendorf Research Brand; placas con 96 pozos de color negro opaco (Costar, cat# 3915).

Síntesis Antisentido e Identificación de Secuencia Los oligonucleótidos se sintetizaron con un gen Assembler-Plus™ (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, E.E.U.U.), fosforotiolaron y purificaron por CLAR. Los TOP005 usado en los experimentos ilustrados en las Figuras 5-7 se realizó con oligonucleótidos de GMPc. Las secuencias e identificaciones antisentido se describen en la tabla 1.

Tabla 1 Células y Cultivo Celular Se utilizaron las siguientes líneas celulares: TF-1 (línea celular de eritroleucemia humana, ATCC#CRL-2003); EOL-I (línea celular de leucemia "Eosinofílica" mieloide aguda humana; DSMZ#ACC386) y U937 (línea celular de linfoma histiocítica humana; ATCC#CRL-1593.2). EOL-1 y U937, se cultivaron en RPMI 1640 con 2 mM de L-glutamina; 1.5 g/l de bicarbonato de sodio; 4.5 g/l de glucosa; 10 mM de Hepes; 1 mM de piruvato de sodio; 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 microg/ml de estreptomicina. El mismo medio se utilizó para el cultivo de TF-1, excepto que se agregó 2 ng/ml de rhGM-CSF. Cultivo Celular del Clon 15 de HL-60 y Diferenciación El clon 15 de HL-60 se diferenció a Eosinófilos según lo descrito por Tiffany y col., 1998, J. Immunol 160:1385-1392.

Brevemente, HL-60 de la línea celular promielocítica se mantuvo en RPMI 1640 con L-glutamina complementada con 10% de FBS inactivado por calor y 25 mM de N-[2-hidroxiethil]piperaz¡na-N'-[ácido 2-hidroxipropansulfónico (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), pH 7.6, a 37°C y 5% de C02. Se indücieron las células para diferenciar al fenotipo similar al eosinófilo, tratándolas con 0.5 microM de ácido butírico (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) durante por lo menos 5 días. El análisis de FACS se utilizó para determinar la presencia de la cadena beta común para los receptores de IL-3/EL-5/GM-CSF, después de la diferenciación de las células. Viabilidad Celular y Tratamiento Antisentido La viabilidad celular fue analizada sistemáticamente usando la prueba de Alamar Azul siguiendo el procedimiento del fabricante. Las células EOL-1; TF-1; HL-60 o U937 fueron cosechadas por centrifugación (5 minutos, 1500 RPM, a temperatura ambiente), se lavaron con 3 x HBSS y suspendieron nuevamente en 1x106 células/ml en un medio de RPMI sin suero. 1x106 de células fueron incubadas, por triplicados, durante 5 minutos con una concentración exacta antisentido (entre 0 y 20 microM) en un microtubo estéril. Cada reacción entonces se transfirió en placas de 12 pozos e incubó a 37°C, 5% de CO2 durante 5 horas para la cuantificación de ARNm o 12 horas para el análisis de la proteína. Se agregó 20% de RPMI/FBS a una concentración final de 10% de FBS y las células se incubaron a 37°C, 5% CO2 du rante la noche. Se cosecharon las células por centrifugación (5 min utos, 1500 RPM , a temperatu ra ambiente) y se lavaron con 1 x de H BSS . Los experimentos de control fueron incluidos y consistieron tratam ientos celulares en ausencia de antisentido o en presencia de oligonucleótidos desiguales. Purificación de Eosinófilos Humanos La fracción de granulositos fue obtenida por centrifugación de sang re completa a través de gradientes de Ficoll-Hypaque (1 .077 g/ml en 350 g durante 30 minutos) para obtener la capa de leucocitos. Los eosinófilos humanos fueron purificados adicionalmente por la selección negativa con mocrogránulos inmunomagnéticos recubiertos con anti-CD 16 a 4°C usando el sistema magnético de clasificación celular de Miltenyi Biotec (Auburn, CA) . La pureza de las poblaciones de eosinófilos , estimada por el teñido con Giemsa, fue comúnmente del 92%- 100% . Purificación del PBMC de Humano y Mono Cynomolgus La sangre fresca de monos Cynomolgus fue obtenida de ITR Laboratories Canadá I nc. Se aislaron PBMCs por centrifugación de gradiente de densidad Ficoll-Hipaq ue de sangre con K3 EDTA de donantes normales. Las PBM Cs se colocaron en placas a 2x106 células/ml/pozo en placas de 12 pozos en un medio de cultivo celular de RPM I 1640 complementado con 10% de FBS inactivado con calor, 100 U/ml de pen icilina, 1 00 microg/ml de estr ptomicina. La viabilidad celular célula fue determinada usando Alamar Azul y fue comúnmente 85%-95%. Transfectación de PBMC y Eosinófilos Humanos Las PBMCs humanas fueron cosechadas por centrifugación (5 minutos, 1500 RPM, a temperatura ambiente), se lavaron con 3 x HBSS y suspendieron nuevamente en 2xl06 células/ml en suero de 5% de medio de RPMI que contiene 10 microg/ml dé PHA. 2x106 células fueron incubadas, por triplicados, durante 5 minutos con una concentración antisentido exacta (entre 0 y 20 microM) en un microtubo estéril. Después se trasfirió cada reacción en placas de 12 pozos e incubó a 37°C, 5% de CO2 durante la noche para la cuantificación de ARNm o 48 horas, o menos cuando se indicó, para el análisis de la proteína. Las células se cosecharon por centrifugación (5 minutos, 1500 RPM, a temperatura ambiente) y lavaron con 1x de HBSS. Los experimentos de control fueron incluidos y consistieron de tratamientos celulares en ausencia de antisentido o en presencia de oligonucleótidos desiguales. Los eosinófilos humanos purificados durante la noche se cosecharon por centrifugación (5 minutos, 1500 RPM, a temperatura ambiente), se lavaron con 3 x HBSS y suspendieron nuevamente en 2.5xl06 células/ml en suero de 10% de medio de RPMI que contiene 2 nanog/ml de rhGM-CSF o rhlL-5. Al siguiente día, las células se lavaron dos veces con HBSS y suspendieron nuevamente en 2.5x106 células/ml en suero de 5% de medio de RPMI y se incubaron, por triplicados, durante 5 min utos con una concentración an.tisentido exacta (entre 0 y 20 microM) en un microtubo estéril. Después se trasfirió cada reacción en placas de 12 pozos e incubó a 37°C , d urante la noche 5% de CO2 para la cuantific.ación de ARN m o 48 horas, o menos cuando se indicó, para el análisis de la proteína. Las células se cosecharon por centrifugación (5 minutos, 1500 RPM , a temperatura ambiente) y lavaron con 1.x de HBSS. Los experimentos de control se incluyeron y consistieron de tratamientos celulares en ausencia de antisentido o en presencia de oligonucleótidos desiguales. Transfectación de PBMC de Mono Las PBM Cs de mono Cynomolg us se cosecharon por centrifugación (5 minutos, 1500 RPM , a temperatura ambiente), se lavaron con 3 x HBSS y suspendieron nuevamente en 2x106 células/ml en suero de 5% de medio de RPM I y 10 microg/ml de PHA (o 10 nanog/ml de rh l L-2, cuando se indicó) . 2x1 06 células se incubaron , por triplicados, durante 5 min utos con una concentración antisentido exacta (entre 0 y 20 microM) en un microtubo estéril. Después se trasfirió cada reacción en placas de 12 pozos e incubó a 37°C , 5% de CO2 durante la noche para la cuantificación de ARNm o 48 horas, o menos cuando se indicó, para el análisis de la proteína. Las células se cosecharon por centrifugación (5 minutos, 1500 RPM , a temperatura ambiente) y lavaron con 1 x de H BSS. Los experimentos de control se incluyeron y consistieron de tratamientos celu lares en ausencia de antisentido o en presencia de oligonucleótidos desiguales. Análisis Citométrico de Flujo Las células se contaron y suspendieron nuevamente en 1x106 células por ml. Las células se centrifugaron en 400 x g durante 3 min. a 20-25°C, y los supernadantes se desecharon.

Después, el granulo celular se suspendió nuevamente en 50 microL de amortiguador de FACS (1x de PBS, pH 7.2-7.4; 0.5% de albúminas humanas; 2.5% de suero humano) e se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Sin desechar el supernadante, se agregó el anticuerpo primario directamente al tubo y se mezcló.

Se incubó a 4°C protegido contra la luz durante 1 h, (el anticuerpo CCR-3 anti-humano se utilizó a 1 microg por 0.5x106 células. La cadena beta común anti-humano se utilizó a 2 microg por 0.5x106 células). Se lavaron con 2 ml de amortiguador de FACS, centrifugaron en 400 x g durante 3 minutos y se desechó el supernadante. Para los controles de isotipo, se suspendió nuevamente el granulo celular con 300 microL de FACSFix (1x de PBS, pH 7.2-7.4; 4% de paraformaldehído), se mantuvo a 4°C protegido contra luz. Para el etiquetado de CCR3 y de ia cadena beta común, el granulo celular se suspendió nuevamente con 50 microL de amortiguador de FACS y se agregó el anticuerpo secundario, (se utilizó Fluor 633 Alexa de lgG2a anti-rata en 1 microg por 0.5x106 células. Se utilizó Fluor 488 Alexa de lgG2b anti-ratón en 2 microg por 0.5x106 células). Se incubó a 4°C protegido contra la luz durante 1 h. Se lavó con 2 ml de amortiguador de FACS, centrifugó en 400 x g durante 3 minutos y se desechó el supernadante. Se prepararon las células etiquetadas con 300 microL de FACSFix, mantuvieron a 4°C protegidas contra la luz. Los datos se analizaron en un BD Biosciences FACS Calibur y se procesaron con el programa Cell Quest. Análisis de Movilización de Calcio Los eosinófilos se suspendieron nuevamente en 1 x 107 células/ml en RPMI 1640 que contiene 10% de FBS y se cargaron mediante la incubación con Fura-2 AM 5 M (Molecular Probes, Eugene, OR, E.E.U.U.) a temperatura ambiente durante 30 minutos en oscuridad. Las células (1 x 106 células/ml) se lavaron tres veces y suspendieron nuevamente en amortiguador de salino (138 mM de NaCI, 6 mM de KCl, 1 mM de CaCI2, 10 mM de Hepes, 5 mM de glucosa, y 1% de BSA, pH 7.4). Después cada 2 ml de la suspensión celular se transfirieron a un recipiente de cuarzo, que se colocó en un espectrofotómetro de luminescencia LS50B (Perkin-Elmer, Beaconsfield, Reino Unido). La movilización de Ca2+ de las células se midió registrando el cociente la relación de fluorescencia emitida a 510 nm después de la excitación secuencial a 340 y 380 nm en respuesta a la quimiocina. Análisis de Quimiotaxis La quimiotaxis in vitro se determinó en cámaras de 48 pozos (NeuroProbe, Cabin John, MD) usando membranas de policarbonato libres de polivinilpirrolidona con poros de 5 mm (Nucleopore-Neuroprobe). Los eosinófilos tratados con control o antisentido se suspendieron en 1 x 10d células/ml en un medio de RPMI 1640 que contiene 0.25% de BSA. Los pozos superior e inferior contuvieron 50 microL y 31 microL dé la suspensión celular, respectivamente, con la última suspensión complementada con una concentración óptima de eotaxina (80 nanog/ml). Después de 1 hora de incubación a 37°C en 5% de CO2, se contaron las células que migraron presentes en el pozo inferior. La migración espontánea se determinó en ausencia de eotaxina y factorizó en resultados.

Estudios de Tratamiento y Toxicidad de Antisentido de Mono Este protocolo fue revisado y certificado por el Animal Care Comité (ACC) de ITR Laboratories Canadá Inc. Todos los animales fueron cuidados de acuerdo con los principios especificados en la actual "Guide to the Care and Use of Experimental Animáis" según lo publicado por el Canadian Council on Animal Care y la "Guide for the Care and Use of Laboratory AnimalsJ una publicación de NIH. La toxicidad de ASM8, que consistió de una mezcla d 1:1 de dos oiigonucleótidos (TOP004 y TOP005) fue investigada para caracterizar el perfil toxicocinético de sus componentes de oligonucleótidos individuales, cuando se administró por exposición a inhalación una vez diariamente durante 14 días consecutivos. También se determinó la capacidad de retroceso de cualquier efecto de ASM 8 después de un período de recuperación de 14 días. También se determinó cualquier condición de hipersensibilidad sistémica después de 14 días de exposición a la inhalación de ASM8 (detectable por inyección intradérmica (ID, por sus siglas en ingles)). El artículo de control de vehículo fue 0.9% de solución de cloruro de sodio para la inyección USP, y se utilizó según lo recibido. Se prepararon las formulaciones líquidas del artículo de prueba (ASM8) para la formación de aerosol mezclando TOP004 y TOP005 con 0.9% de solución de cloruro de sodio para la inyección, USP, para obtener una mezcla 1 : 1. Las concentraciones de la solución de dosis objetivo se basaron en el oligonucleótido puro. Por lo tanto, un factor de corrección para ajustar la pureza se aplicó para pesar y distribuir los componentes del artículo de prueba. Los factores de corrección son 1 .15 para TOP004 y 1.24 para TOP005. Antes del inicio del período de exposición de 14 días, las cantidades de cada oligonucleótido respectivo requeridas para cada exposición diaria se pesaron, combinándose (como polvos) en frascos designados para cada día de exposición, y almacenándose congelados a -80°C. En cada día de exposición el frasco correcto se retiró del alrñacenamiento frigorífico, el contenido se disolvió en el vehículo de solución salina, se filtró a través de un filtro estéril de 0.2 µm y la formulación se utilizó para la exposición de solamente ese día. El número de animales por grupo y los tratamientos se establecen en las tablas 2 y 3 siguientes: Tabla 2. intervalo de peso corporal 2-4 kg el día 1 de tratamiento Intervalo dé edad Adultos jóvenes el día 1 de tratamiento Tabla 3. Concentraciones de exposición a ASM8 y niveles de dosis (4) (1 ) : Basada en un peso corporal estimado de 2.5 kg . (2) : Los animales de control de vehículo fueron expuestos a un aerosol generado a partir de la solución de veh ículo a una concentración de aerosol que se considera que es equivalente en términos de masa a la generada para el grupo de dosis alta. (3) : La dosis objetivo y las concentraciones del aerosol se basaron en la pureza absoluta de los artículos de prueba, q ue fueron obtenidos utilizando los factores de corrección apropiados para la pureza en el proceso de la formulación de solución de dosis. (4) : Se estimaron los niveles de dosis alcanzados durante el período de exposición usando la siguiente fórmula: DL = Ec x RMV x T/BW, en donde, DL = niveles de dosis alca nzados (mg/kg/día) Ec = concentración actual suministrada a los animales (mg/l de aire) RMV = volumen por min uto (ml/min) estimado de acuerdo a la fórmula de Bidé y col. , 2000, J. App. Toxicol . , 20, 273-290. seg ún lo detallado: RMV (L) = 0.499 x W(TCg)0-809 T = tiempo, duración de la exposición diaria (minutos) BW = peso corporal promedio (kg) durante el período de exposición . Esta estimación de la dosis alcanzada asumió una deposición del 100% dentro del tracto respiratorio. Se realizaron en todos los animales las observaciones en vida que incluyen mortalidad , exámenes cl ínicos, peso corporal, consumo alimenticio, electrocardiografía, optalmoscopia, patología clínica, determinaciones del nivel de plasma, prueba de hipersensibilidad. Durante la finalización del período de tratamiento , los animales se eutanizaron y se sometieron a pruebas de patología anatómicas, necroscopia, pesos del órgano, histopatología. RT-PCR semi-cuantitativa se utilizó para medir si había cualquier efecto inh ibidor de ASM8 en la cadena beta común y en la expresión de ARNm de CCR3 en muestras traqueales de los monos Cynomolgus tratados co n la dosis alta 24 horas después de la administración de ASM8. HL-ELISA para las Medicion es de Oligonucleótidos en el Plasma del Mono Las muestras de sangre de los monos (aproximadamente 1 mi cada una) se recolectaron de cada animal los d ías 1 y 14 antes de la dosis, 0.5, 1 , 3, 6 y 24 horas después de la dosis. Las muestras de sangre se centrifugaron a 4°C para generar el plasma, y éste se separó y congeló en el hielo seco hasta analizarse para la determinación de las concentraciones de TOP004 y TOP005 (y metabolitos n- próximos) usando el análisis de cuantificación ELI SA de hibridización/ligadura. La solución de curva está ndar para los oligon ucleótidos se preparó mediante dilusiones seriales para las muestras de plasma del mono. El intervalo de trabajo de la curva estándar común es de 125 n M a 0.007629 n M . Las muestras de plasma se diluyeron apropiadamente para la medición en la porción lineal de la curva estándar, haciendo más de una dilusión para u na medición exacta. Cada muestra estándar o de plasma se sometió a alícuotas (200 microL) en una placa de polipropileno de 96 pozos en la cual se agregaron 200 microL de la solución de sonda patrón apropiada a 200 microL de la m uestra de plasma y se incubaron a 37°C durante 60 minutos. 150 microL se transfirieron a una placa recubierta con NeutrAvidin por duplicado y se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Se lavó 4 veces con amortiguador de lavado usando el lavador de placa (200 microL cada vez). Se agregaron 150 microL de la solución de sonda de ligadura seguida por la incubación a temperatura ambiente durante 120 minutos.

Después de la incubación, la muestra se lavó 2 veces con, amortiguador de lavado usando el lavador de placa (200 microL cada vez) seguida después se lavo 3 veces con ddH2O usando el lavador de placa (200 microL). Se agregaron 150 microL de dilusión de 1:2000 (en Super block, Peirce) de anti-DIG-AP seguidos por la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. La muestra se lavó 4 veces con amortiguador de lavado usando el lavador de placa (200 microL). Después se agregaron 150 microL de 10 microM de reactivo MUP seguido por la incubación a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se leyó la fluorescencia a 355ex/485em. Soluciones usadas en HL-ELISA: Solución de Sonda Patrón (0.05 microM de sonda patrón, 60 mM de Na2HPO4, pH 7.4, 0.9M de NaCl, 0.24% de Tween-20; 10x de amortiguador de ligadura (0.8248M de Tris-Cl, pH 7.5, 0.0828M de MgC12, 1.93% de DTT; Solución de 100 mM de ATP (preparar en agua y ajustar a pH 7 ± 0.5 con NaOH); Solución de Sonda Patrón de Ligadura (0.067 microM de oligo en 1x de amortiguador de ligadura, 0.025 Unidades/ml ligasa de ADN T4, 0.05 mM de ATP; Amortiguador de Lavado (25 mM de Tris-Cl, pH 7.2, 0.15M de NaCI, 0.1% de tween). Homogenización de la Tráquea de Mono y Extracción de ARN La tráquea del mono se homogenizó usando un polit.ron PT 1200 (Brinkmann Instruments) y el ARN total se extrajo usando el mini kit de Qiagen ARNeasy (Qiagen, Mississauga ON, Canadá) seguido por la digestión de DNasa-l. El ARN total se cuantificó usando el Análisis Fluorescente de Ribogreen (Invitrogen Corporation, Burlington ON, Canadá). ADNc se preparó de 1-2 microg de ARN usando el kit First-Strand cDNA Synthesis Using Superscript™ II RT (Invitrogen Corporation, Burlington ON, Canadá). Extracción de ARN, Transcripción Inversa y Reacción en Cadena de Polimerasa El ARN se extrajo de granulos celulares de acuerdo al protocolo del mini kit Qiagen ARNeasy usando el distribuidor QiaVac 24 de Qiagen y el ARN se trató con DNasa-I de acuerdo a los procedimientos de Fermentas. El ARN se cuantificó usando el reactivo de RiboGreen de acuerdo al protocolo del fabricante. De lo contrario, el ARN se cuantificó usando un espectrofotómetro. La preparación de ADNc del primer filamento se realizó usando el Superscript First-Strand Synthesis System para el kit de RT-PCR de Invitrogen, en un volumen total de reacción de 20 microL. Brevemente, 1-2.5 microg de ARN primero se desnaturalizaron a 65°C durante 5 minutos, con 0.5 mM de cada dNTPs, 0.5 microg de oligo (dT)12-i8 y se enfriaron en hielo durante por lo menos 1 minuto. La mezcla se incubó a 42°C durante 2 minutos y se agregó una segunda premezcla que contiene 1x de First-Strand Buffer, 10 mM de DTT, 40 unidades de RNaseOUT y 40 unidades de Superscript RT II. Las reacciones se incubaron a 42°C durante 10 minutos, a 50°C durante 1 hora y se inactivaron con calor a 70°C durante 15 minutos. La PCR se realizó con una cantidad optimizada de ADNc (100-250 nanog para CCR3 y 1-10 nanog para G3PDH) en 1x de amortiguador de PCR (10x: Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, 15 mM DE MgCI2; pH 8.7) en un volumen total de reacción de 50 microL, 0.2 mM de cada dNTPs, 8.5 pmol de cada cebador de PCR y 2.5 unidades de polimerasa de ADN Taq. La mezcla se calentó a 94°C durante 5 minutos, seguido por 30-35 ciclos, cada uno consistió de una incubación durante 1 minuto a 94°C, 45 segundos a 60°C y 45 segundos a 72°C. La prolongación complementaria se realizó a 72°C durante 10 minutos. Los productos de PCR se analizaron mediante 1.5% de electroforesis de gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. La cuantificación de los productos de PCR se realizó usando el software Total Lab (extracción en segundo plano con Rolling Ball; Ultra Lum Inc., Modelo UC4800). Los cabadores de PCR fueron: Par de cebadores de CCR3 humano (R&D systems, cat# RDP-209-025); Par de cebadres de GAPDH humano (R&D systems, cat# RDP-39-025) y los cebadores mostrados en la tabla 4. Los experimentos de control de PCR se incluyeron sistemáticamente y consistieron de RT-ARN.

Tabla 4.

Degradación Química de Oligonucleótidos Pava inducir la degradación de TOP004 y TOP005 antes del análisis (para asegurar la resolución de los productos de degradación a partir de las moléculas intactas) , se realizaron los siguientes tratamientos: *Depuración : ASM8 se suspendió nuevamente en 30% de CH3COO H a una concentración final de 0.5 mg/ml, e incubó durante 3, 4, ó 6 horas a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de 5 volúmenes de agua y la mezcla se colocó a -20° antes de la liofilización en u n Speed-VAC para eliminar el ácido acético.

*División: Los oligonucleótidos depurados se suspendieron nuevamente en 0.2 M de NaOH (0.5 mg/ml) , se incubaron a 50°C durante 1 hora, y almacenaron a -2O°C o se analizaron por CLAR. Fraccionamiento por CLAR de TOP004 y TOP005 Se pesó ASM8, y solubilizó en PBS a una concentración de 0.5 mg/ml (0.25 mg/ml de TO P004 y 0.25 mg/ml de TOP005). Los parámetros del gradiente de CLAR se m uestran a continuación en la tabla 5. Tabla 5. Parámetros del gradiente de CLAR.

La separación por CLAR se realizó con una bomba para CLAR Waters 1 500 Series Binary acoplada a un detector absorbencia Waters 2487 ? Dual y equipado con un desgasificador en línea, horno, y un inyector man ual serie 1500, Reodyne 7725L La mezcla de oligonucleótidos se fraccionó en una columna de intercambio de aniones Waters Protein Pak DEAE 5PW (0.5 cm X 75 cm), se mantuvo a 60°C, y se detectó por absorción UV a 260 nm. La mezcla de oligonucleótidos (volumen = 25 microL) se cargó á la columna en agua (amortiguador A: agua (grado MilliQ)) y se realizó la elución progresivamente aumentando la proporción de amortiguador B (1 M de LiCIO , (0.22 micrómetros filtrados)), dando por resultado en un aumento de la fuerza iónica de la fase líquida, que eluyó el oligonucleótido de la fase sólida (columna). Bajo las condiciones de análisis, 62.5 microg de TOP004 o TOP005 produjeron un cambio que se pudo medir de > 0.15 unidades de absorbencia (AU) a 260 nm. Almacenamiento de Oligonucleótidos Las alícuotas de ASM8 (0.5 mg/ml) en PBS se incubaron a -20°C, 4°C, 30°C, y 40°C durante 2 meses. En las semanas 4, y 8, se estableció ei perfil de CLAR para ASM8'. La condición de control fue definida como el perfil de CLAR para ASM8 antes de cualquier tiempo de almacenamiento (es decir, en el tiempo cero). El sistema de CLAR fue conducido por el software Breeze™ (V 3.30) de Waters. Curvas de Fusión de Oligonucleótidos y Tablas de Resumen Termodinámico Se mezclaron TOP004 y TOP005 a concentraciones equimolares en 1 x PBS (así como en otros sistemas de amortiguador). La concentración total de oligonucleótidos osciló de aproximadamente 1.2 a 8.7 mM. Los métodos de termo-desnaturalización UV estándares se condujeron usando un espectrofotómetro Beckman DU640 con un accesorio Tm. El cambio en la absorbencia se detectó a 260 nm a cada grado de 10 a 90°C. Las curvas de fusión se ajustaron usando el software MELTWIN™ 3.5 para determinar los parámetros termodinámicos. Se produjeron las imágenes de pantalla de las curvas fusión y tablas de resumen termodinámico. Ejemplo 1 Eficacia de los Oliqonucleótidos Antisentido Dirigidos al Receptor CCR3 Varios oligonucleótidos antisentido dirigidos al receptor de quimiocina CCR3 se analizaron para determinar su capacidad de inhibir la expresión de ARNm del receptor e de inhibir la función del receptor. El análisis primario del antisentido de CCR3 se realizó en líneas celulares EoI-1 y U937. Estas células expresan ARNm de CCR3 bajo las condiciones normales de cultivo celular descritas anteriormente. La tabla 6 muestra los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra el receptor CCR3 humano de quimiocina. Refiriéndose a la tabla 6, el oligonucleótido antisentido 828 dirigió contra el receptor CCR3 (828: 5'- GTTACTACTTCCACCTGCCTG-3' SEC ID NO. 1) es efectivo al inhibir la expresión de ARNm del receptor según lo mostrado en la tabla 6.

El oligon ucleótido 828 se dirige contra el gen de CCR3 y comienza 48 bases después del extremo del exón 1 y es de 21 bases de largo. Las búsquedas BLAST se realizaron en 828 y, distintos al receptor CCR3, la siguiente homología más cercana se reporta en menos del 72% de homolog ía. Ésta se considera que es una homología insignificante para obtener la asociación completa de dos secuencias complementarias. La especificidad de 828 se determinó usando un oligonucleótido desigual (SEC ID NO . 32). El desigual no tuvo n ingún efecto en ARNm de CCR3 o en el gen de mantenimiento G3PDH utilizado como control interno en estos experimentos. El oligon ucleótido antisentido 828 es por lo tanto específico. Tabla 6.

Ejemplo 2 Eficacia de Dos Ol igonucleótidos Sustituidos con DAP en las Células Monon ucleares de Sangre Periféricas del Mono (PBMCs) Según lo discutido anteriormente, los oligonucleótidos antisentido 1 07A y 828 fueron modificados sustituyendo la adenosina con DAP para producir los oligonucleótidos antisentido TOP005 y TOP004 respectivamente. TOPO04 (5*- GGGTCTGCXGCGGGXTGGT-3' (SEC I D NO . 13), donde X representa una mod ificación de DAP de un residuo de adenosina) , mientras que con 107A, es 1 9-mer dirigido a la cadena beta com ún de los receptores I L-3 , I L-5, y GM-CSF. TOP005 (5'- GTTXCTXCTTCCXCCTGCCTG- 3' (SEC I D N O. 14)) , mientras que con 828 , es 21 -mer dirigido contra el receptor de quimiocina CCR3. Las eficacias de TOP004 y TOP005 se probaron por separado y en combinación . ASM8 es una composición que comprende, en parte, TOP004 y TOP005. Los estudios de eficacia se realizaron en las células monon ucleares de la sangre periféricas del mono (PBMCs) , para validar el uso de esta especie para explorar el potencial de los efectos tóxicos que se presentan a partir de la actividad farmacológica de AS M8. Para que ASM8 sea efectivo en el mono Cynomolgus, debe existir una homología suficiente a sus secuencias objetivo. La secuencia de cadena beta de Cynomolgus no está disponible en las bases de datos públicas y así se clonó y secuenció el segmento que comprende la región de la secuencia de TOP004. Sin embargo , la actividad de TO P004 a través de las especies de primates se puede determinar directamente en un sistema in vitro relevante. Específicamente, una preparación de células mononucleares de la sangre periféricas (P BMC) es un sistema adecuado para probar la funcionalidad de TO P004, puesto q ue la cadena beta común se encuentra en la mayoría de las sub-poblaciones mononucleares de leucocitos (células T y B, monocitos, y macrófagos). La información de la secuencia para el receptor CCR3 del mono Cynomolgus está disponible solamente para la región de codificación; no hay disponible información de la secuencia para la región de unión de TOP005 en las bases de datos públicas. La secuencia objetivo de TOP005 inicia 48 bases después del extremo del exón 1 del gen humano; este intrón abarca más de 20 pares de kilobases, haciendo que su clonación y secuanciación sean monótonas. Los reportes en la literatura han mostrado que algunos segmentos de las secuencias del intrón están conservados entre el humano y mono (Rahman y col., 2004. Genomics. 8376-84). Los estudios evolutivos también muestran que los segmentos de secuencias intrónicas homologas se encuentran a través de taxones (humano, ballena y foca), y que estos segmentos se encuentran más frecuentemente cerca de las uniones del intrón-exón (Haré MP y Palumbi SR., 2003 Mol. Biol Evol. 20, 969-978). La funcionalidad de TOP005 en monos se probó en una preparación de PBMC en la cual la expresión del receptor CCR3 se encontró en los subconjuntos de células T y B. Secuenciación de la Cadena ß Común del Mono Cynomolgus El análisis de la cadena beta común para los genes del receptor IL3/IL-5/GM-CSF de humano, chimpancé, cerdo, ratón y rata, reveló un alto grado de semejanza de la secuencia de gen entre vertebrados. Se designaron las Secuencias de cebadores para PCR de clonación . Las secuencias de cebadores se derivaron de secuencias alta mente de nucleótidos altamente conservadas en h umanos, chimpancés, cerdos, ratones y ratas, q ue rodean la región de olig onucleótido TOP004 del gen de cadena beta común . La tabla 2 muestra los diferentes cebadores. Estos cebadores se utilizaron para amplificar los productos específicos del ADNc de PBMC de Cynomolgus. Se obtuvieron varios productos de PCR, dependiendo del conju nto de cebadores usado. Una ronda de PCR integrada se utilizó para determinar la especificidad de los prod uctos obtenidos. Los amplicones positivos se clonaron y secuenciaron. La Figura 1 A muestra las secuencias de tres clones (SEC ID NOS. 25, 26 y 27 respectivamente) obtenida de la amplificación de PCR de la región de TOP004 de Cynomolgus alineada a la secuencia humana (SEC ID NO . 28) y a la región correspondiente en las secuencias de nucleótidos de chimpancé (SEC ID NO . 33) , cerdo (SEC I D NO. 34), rata (SEC I D NO. 35) y ratón (SEC I D NO . 36) . Los nucleótidos no homólogos se muestran con letras min úsculas mientras q ue las regiones conservadas se muestran en letras mayúsculas. La región de TOP004 se encuentra subrayada. La secuencia de la cadena beta de Cynomolgus complementaria a la región de TOP004 mostró que la homología sig nificativa (18 de 1 9 bases de identidad) en todos los tres clones secuenciados. La diferencia se encontró en la posición 6 (iniciando desde el extremo 5' de TOP 004), donde se encuentran una "A" y una "G" ("A" es la base prevista). La Figura 1B muestra la alineación de las secuencias de proteína prevista del Cynomolgus clonado (SEC ID NO. 37) y las secuencias de nucleótidos conocidas del humano (SEC ID NO. 38), chimpancé (emb. AADA01213660) (SEC ID NO. 39); cerdo (U94688.1) (SEC ID NO. 40); ratón (NM_007780.1) (SEC ID NO. 41) y rata (NM_133555.1) (SEC ID NO. 42). La discrepancia de nucleótidos encontrada en la posición 6 (iniciando desde el extremo 5' de TOP004, donde se encuentran una "A" y una "G") corresponde a la segunda base del codón de glutamina (Q) ó lisina (k) en la cadena beta común de las secuencias de proteína disponibles en el banco de datos público. Los datos presentados en la figura 1B muestran que las especies altamente desarrolladas contienen un residuo de glutamina (flecha en humano, chimpancé, cerdo), en la región complementaria de TOP004. La glutamina se codificada por 2 codones, CAA ó CAG. En una especie inferior (ratón y rata), la glutamina está sustituida por un residuo de lisina. La Usina está codificada por 2 codones, AAA ó AAG. En cualquier caso, se conserva una adenosina en la segunda posición. Como tal, el residuo de adenosina es un candidato probable para que la secuencia del mono sea tan funcional que esté en otros vertebrados superiores. Sin embargo, los polimorfismos de la cadena beta de GM-CSF, no se pueden eliminar. Preeburn y col. describe varias mutaciones en la región intra-citoplásmica del receptor de la cadena beta, que se podría considerar para la susceptibilidad a la leucemia, (Freeburn y col., 1997, Exp. Hematol., 25:306-311). Los datos de secuenciación presentados en la Figura 1A muestran que un residuo de guanosina puede encontrarse en la posición 6 que inicia desde 5' de la secuencia subrayada de TOP004. En este caso, el codón será CGG y la secuencia de proteína contendrá un residuo de arginina (R) en esa posición. Una base básica (H, K ó R) en esa posición es reminiscente de vertebrados inferiores y es improbable en el caso de los primates. A pesar de esta discrepancia, el grado muy alto de identidad entre la secuencia de cadena beta de humano y mono sugiere la funcionalidad de TOP004 en el mono Cynomolgus. Eficacia de TOP004 y TOP005 en PBMCs de Mono Cynomolgus Se probaron TOP004 y TOP005 individualmente en PBMCs de mono Cynomolgus para su capacidad de disminuir selectivamente la expresión de la cadena beta y CCR3, respectivamente. Las PBMCs purificadas de mono se incubaron con diversas concentraciones de TOP004 y TOP005. Refiriéndose a las Figuras 2A y 2B, los resultados de experimentos realizados en más de 10 muestras de sangre obtenidas de monos, se presentan en la gráfica de barras A y en la gráfica de barras B. Las gráficas de barras muestran la expresión reducida de la cadena beta y de ARNm de CCR3 con TOP004 (A) y TOP005 (B) en PBMC de mono. La inhibición fue específica para TOP004 y TOP005 y no se debió a ia degradación de ARN o a la pérdida de viabilidad celular, según lo evidenciado por el control interno (producto de 451-bp que corresponde a la prueba de ARNm de G3PDH y de viabilidad celular). TOP004 redujo específicamente la expresión de la cadena ß común en PBMCs primarias de mono según lo medido por RT-PCR (Figura 2A). La eficacia máxima se obtuvo con concentraciones de 10 a 15 microM, en donde >50% de inhibición se observó principalmente. La inhibición de la cadena beta de mono mediante TOP004, confirmó los datos de secuenciación entre (Figura 1A) que mostraron un grado muy alto de identidad entre las secuencias de ARNm de cadena beta de humano y mono. Similarmente, la transfección de TOP005 en PBMCs de mono disminuyó la expresión de ARNm de CCR3, según lo medido por RT-PCR (Figura 2B). La inhibición máxima para la expresión de ARNm de CCR3 mediante TOP005, se obtuvo a concentraciones de oligonucleótidos antisentido más bajas (0.05 a 2.5 microM) que para la cadena ß (10 a 15 microM). La inhibición de la expresión de ARNm, según lo medido por RT-PCR también fue corroborada al nivel de proteína mediante la citometría de flujo (FACS). Las PBMCs de mono se incubaron durante 36 horas en un medio de crecimiento en presencia de varias concentraciones de TOP004 ó TOP005. Se hizo la cuantificación de la citometría de flujo según lo descrito anteriormente. Refiriéndose a las Figuras 3A y 3B, las gráficas de barras muestran la expresión de la superficie celular de la cadena beta y CCR3 en presencia de TOP004 y TOP005 respectivamente en PBMCs de mono Cynomolgus. Las gráficas muestran que, después del tratamiento con TOP004 ó TOP005, se observo una reducción en el porcentaje de células que expresan la cadena beta y CCR3 de más del 30% que fue obtenida a 7.5 microM y 0.5 microM, respectivamente. TOP004 y TOP005 también se probaron en combinación, a una relación de 1:1 (ASM8), en PBMCs de mono Cynomolgus para su capacidad de disminuir selectivamente la expresión de la cadena beta y CCR3, respectivamente. Las PBMCs de mono se incubaron durante la noche en presencia de varias concentraciones de ASM8, antes de la expresión de la cadena beta y CCR3 se determinaron por RT-PCR. Refiriéndose a las Figuras 4A y 4B, se muestran las gráficas de barras que representan la expresión de la cadena beta y de ARNm de CCR3 en presencia de ASM8 en PBMCs de mono Cynomolgus para máe de cinco (5) muestras de sangre obtenidas de monos. La inhibición significativa de la cadena beta fue observada con concentraciones de ASM8 que oscilan de 2.5 a 5 microM (Figura 4A), la cual es ¡nferior que el intervalo de concentración óptimo que da la inhibición máxima de TOP004 solo (entre 10 y 15 microM (Figura 2A)). Estos resultados muestran que la combinación de los antisentidos TOP004 y TOP005 proporciona una potencia mejorada y una sinergia de ASM8 al bloquear la expresión de la cadena beta, en comparación a TOP004 solo. Similarmente, la transfección de ASM8 en PBMCs de mono, dismin uyó la expresión de ARN m de CCR3, seg ún lo medido por RT-PCR (Figura 4B). La inhibición máxima para la expresión de ARNm de CCR3 por TOP005 se obtuvo a una concentración de oligon ucleótidos antisentido más baja (0.05 a 5 microM) que para la cadena beta (2.5 a 5 micro M). El efecto de ASM8 sobre la inhibición de CCR3 no fue claramente dependiente de la concentración , este resultado puede reflejar que la inhibición máxima (meseta) se obtiene a una concentración más baja para CCR3 que para la cadena beta. En resumen , la secuenciación de la cadena beta común de Cynomolgus indicó un grado muy alto de identidad (por lo menos 18 fuera de las 1 9 bases q ue comprende la secuencia de TO P004) . Se esperó que este alto grado de homolog ía con el gen humano permita la hibridación suficiente de TOP004 a ARNm de cadena beta del mono para ind ucir la actividad antisentido , y por lo tanto disminuir su expresión. TOP004 se transfectó en PBMCs purificadas de Cynomolgus para evaluar su capacidad para disminuir/regular la expresión de la cadena ß del mono. TOP004 dismin uyó efectivamente la expresión de ARNm de cadena ß, medida por RT-PCR, en 30 a 70%). Similarmente, TOP005 se transfectó en PBMCs de mono Cynomolg us y el nivel de la expresión de CCR3 se determinó por RT-PCR semi-cuantitativa. Los resultados demostraron que TOP005 diminuye-regula la expresión de CCR3 de Cynomolg us en un intervalo que varía entre 30% y 85% . De la misma manera, la transfección de TOP004 ó TOP005 en PM BCs de mono , indujo una reducción específica a 0.5 microM (>30%) en el número de células positivas para la cadena beta o CCR3 , medida por la citometría de flujo . ASM8 también se transfectó en PBMCs purificadas de mono para evaluar la eficacia del tratamiento combinado (TO P004 y TO P005) para disminuir/regular la expresión de la cadena beta y ARNm de CCR3 de mono. En estas condiciones , ASM8 redujo significativamente la expresión de la cadena beta y CCR3 , medida por RT-PCR , a una concentración de ASM8 de hasta 0.1 a 0.5 microM . Esto también sugiere que el mono Cynomolgus es una especie apropiada en la cual examinar los efectos tóxicos potenciales debidos a la actividad farmacológica de ASM8. Ejem plo 3 Efecto de los Oligonucleótidos Antisentido Di rigidos Contra CCR3 en Cél ulas Humanas y Líneas Cel ulares Otros experimentos se realizaron para determinar la capacidad de A86 y TOP005 para inhibir la expresión de ARNm de CCR3 en H L-60 diferenciada de las células similares a los eosinófilos (Lee Tiffany y col. J . Immunol 1 998, 1 60: 1 385-92) , las células U937 y Eol-1 así como en las células monon ucleares de sangre periféricas (PBMC) . También se investigó la capacidad de A86 y TOP005 para inhibir la migración celular de eosinófilos y la movilización de calcio en las células HL-60 y eosinófilos de sangre periféricos purificados humanos. A86 es un oligonucleótido antisentido (5' CTG GGC CAT CAG TGC TCT G 3' (SEC ID NO. 29) que corresponde a la secuencia de nucleótidos 87-105 de la región de codificación (exón 7) de CCR3. Según lo discutido anteriormente, TOP0O5 es 828 pero con las tres adenosinas remplazadas por 2,6-diaminopurina (5'GTT XCT XCT TCC XCC TGC CTG 3' (SEC ID NO: 14)). La secuencia complementaria 828 comienza 48 bases después del extremo del exón 1 y es de 21 bases de largo. Como controles para A86, se utilizaron un oligonucleótido de sentido complementario (5' CAG AGC ACT GAT GGC CCA G 3' (SEC ID NO. 30)) y un desigual (5' CGT GGC ACT CAG TGT CCT G 3' (SEC ID NO. 31)). Como control para 828/TOP005, se usa un desigual (5' CCT TTG ACC TGC CAA TGC TCT 3' (SEC ID NO. 32)). Efecto de Oligonucleótidos Antisentido A86 en la Expresión de ARNm de CCR3 en Eosinófilos Derivados del Clon 15 de HL-60 Se conoce que la variante del clon 15 de células HL-60 se puede inducir por el tratamiento con ácido butírico para diferenciarse en las células que tienen muchas características de los eosinófilos de sangre periféricos (Lee Tiffany y col., J. Immunol 1998, 160:1385-92). Usando el mismo protocolo de diferenciación, confirmamos la expresión de ARNm de CCR3 en células HL-60 diferenciadas. La RT-PCR entonces se realizó para examinar las capacidades de los oligonucleótidos sintéticos para modular la expresión de la codificación de ARNm para el receptor CCR3 en las células HL-60 diferenciadas en eosinófilos. Después del tratamiento de las células con 10 microM de A86, se - determinó el ARNm de CCR3 por PCR semi-cuantitativa usando como control interno G3PDH. El ARN total fue aislado de las células cosechadas recientemente según lo descrito anteriormente. Refiriéndose a la figura 5, se muestra el efecto de los oligonucleótidos antisentido contra CCR3 sobre la expresión de ARNm de CCR3 en células distinguidas HL60. En contraste para detectar los oligonucleótidos, y oligonucleótidos desiguales, los oligonucleótidos antisentido inhiben notablemente la expresión de ARNm de CCR3. La expresión de ARNm de CCR3 en las células tratadas con los oligonucleótidos de sentido y los oligonucleótidos desiguales no fue significativamente diferente de la obtenida en células no tratadas. Por otra parte, todos los oligonucleótidos a la concentración usada no afectaron la expresión de G3PDH de ARNm. El oligonucleótido antisentido A86 de usado en este experimento puede por lo tanto inhibir específicamente la expresión de ARNm de CCR3. Efecto de A86 Sobre la Expresión de Superficie Celular de la Proteína de CCR3 Se investigó adicionalmente si la disminución de ARNm para CCR3 podría reflejar la densidad de la proteína de superficie celular de CCR3. A este respecto, se realizó el análisis citométrico de flujo para determinar la expresión del receptor CCR3 en los eosinófilos derivados de HL-60 después del tratamiento con oligonucleótidos. Después del tratamiento con ácido butírico, el porcentaje de receptor CCR3 de expresión en eosinófilos derivados de HL-60 fue de 40%. Cuando se trató con oligonucleótidos de sentido y desiguales (10 microM), el porcentaje de células positivas disminuyó levemente y no significativamente; el porcentaje de células positivas fue de 35% y 38% respectivamente. Sin embargo, la densidad del receptor CCR3 en las células tratadas con A86 fue de reducido significativamente (26% de células positivas contra 40% en células no tratadas). A86 en 10 microM es capaz de reducir la expresión de superficie celular de CCR3 en un 65%. El efecto de A86 fue más significativo a concentraciones más altas.

Específicamente, 20 y 30 microM de A86 se utilizaron y los resultados mostraron que la expresión de superficie celular de CCR3 fue disminuida en un 75% y 85% respectivamente. A86, un oligonucleótido antisentido para CCR3, es capaz de inhibir la expresión de superficie celular de CCR3 de una manera dependiente de la dosis. Efecto de A86 en la Movilización de Calcio Inducida por Eotaxina en Células HL-60 Un flujo transitorio rápido de calcio se observa comúnmente cuando los leucocitos son estimulados por quimiocinas para que expresen un receptor específico. Esta movilización de calcio se puede seguir en tiempo real mediante células cargadas con Fura-2AM y es una medida conveniente de la activación del receptor. La eotaxina de quimiocina es un ligando específico para el receptor CCR3 e induce una afluencia de calcio rápida y los leucocitos de quimiotaxis durante la ligadura al receptor. Refiriéndose a la figura 6, se muestra el efecto de A86 sobre la activación de CCR3. La movilización de calcio en respuesta a la eotaxina se disminuyó en las células tratadas con A86 en comparación a los oligonucleótidos de control y sentido. Las células se trataron con el oligonucleótido A86 a una concentración de 10 microM. Las células tratadas con oligonucleótidos sentido podrían responder a la eotaxin mientras que ias células no tratadas no lo harían. En estas condiciones, la eotaxina induce un aumento en la concentración intracelular de Ca++. Sin embargo, en las células tratadas con A86, la eotaxina indujo mucha menos movilización de Ca+J Los resultados presentaron en la presente mostraron que A86 fue efectivo interfiriendo con la activación del receptor CCR3 en la línea celular HL-60. Tratamiento de Eosinófilos Humanos Purificados con Oligonucleótidos Antisentido que Inhiben su Respuesta a Eotaxina Refiriéndose a la Figura 7, se muestra el efecto de los oligonucleótidos antisentido sobre la respuesta quimiotáctica de eosinófilos humanos purificados a la eotaxina. Los eosinófilos humanos purificados se incubaron durante la noche con oligonucleótidos antisentido (cuadrados) o oligonucleótidos de sentido (círculos) a una concentración de 10 microM, en RPMI 1640 complementado con 5% de FCS e IL-5 (1.5 ng/ml). Las células de control (triángulos) se incubaron en las mismas condiciones sin ODNS. Los datos son de un solo experimento representativo de tres y se presentan como el número promedio de células que migraron ± SD de las determinaciones triplicadas de células que migraron por 5 campos de alta potencia. La migración de eosinófilos se inhibió mediante oligonucleótidos antisentido contra CCR3 y esta inhibición fue más significativa cuando se aumento la concentración de eotaxina. En 80 ng/ml de eotaxina, la migración de eosinófilos se disminuyó en un 55.6%. La Figura 8 muestra la movilización de calcio en eosinófilos tratados con oligonucleótidos antisentido. Cuando las células de eosinófilos se tratan con A86 (10 microM), la movilización de Ca++ inducida por eotaxina también se inhibió al compararse con los oligonucleótidos de control y sentido. Los resultados presentados en la presente muestran que A86 fue potente interfiriendo con la quimiotaxis de eosinófilos a eotaxina, reduciendo/regulando el receptor CCR3. Eficacia de TOP005 Los experimentos similares se realizaron usando TOP005. Se eligió TOP005 debido a la eficacia de 828, los resultados de la evaluación BLAST de la secuencia mostraron que 828 no tuvo ninguna homología al gen conocido, la carencia de hibridación de 828 con TOP004 (experimentos re.alizados en el software de ADN) y su longitud (permite la diferenciación de TOP004 cuando se mezcló junto y separado por CLAR de intercambio de aniones). La Figura 9 muestra el efecto de TOP005 sobre la expresión de superficie celular de CCR3. La eficacia de TOP005 se determinó en las células Eol-1 y U937. La expresión de CCR3 se determinó mediante la citométria de flujo 36 horas después del tratamiento con TOP005. Los resultados se presentan como el porcentaje de expresión contra los controles en las células Eol-1 y U937. Las gráficas de barras en la Figura 9 muestran que TOP005 inhibió la expresión de la proteína de CCR3 en la superficie de las células U937 y Eol-1. Las figuras 10A y 10B muestran el efecto de TOP005 sobre la expresión de ARNm de CCR3 en las células mononucleares de sangre periféricas humana (PBMC). Las PBMCs humanas se aislaron o cultivaron recientemente en ¡nterleucina-2 humana (10 nanog/ml durante 24 horas). Después se expusieron a TOP005 y cultivaron durante 18 horas. En la Figura 10A, los geles que muestran la expresión de G3PDH y CCR3 se muestran en la parte superior. La relación de la expresión de ARNm de CCR3 a G3PDHL, normalizada para los controles se presenta en la parte inferior. Refiriéndose a la figura 10B, la gráfica de barras muestra que TOP005 es efectivo disminuyendo la expresión de ARNm de CCR3 en PBMC a dosis tan bajas como 1 microM . Los oligon ucleótidos antisentido A86 y TOP005 por lo tanto pueden inhibir la expresión de ARNm de CCR3 en las células Eol-1 (una línea celular eosinofílica humana) , células HL-60 diferenciadas en eosinófilos y células U937. La inhibición de CCR3 con estos oligonucleótidos también dismin uyó la movilización de calcio en células H L-60 diferenciadas y eosinófilos h umanos, así como dismin uyó la quimiotaxis de eosinófilos a eotaxina. Ni los oligonucleótidos sentido correspondientes ni los oligon ucleótidos desiguales afectaron la respuesta a eotaxina. Ejemplo 4 Eficacia de TOP004 en la Reducción de la Expresión de la Subunidad de Cadena ß Común de los Receptores IL-3, IL-5 y GM-CSF y Respuestas Celulares Asociadas en Líneas Celulares H umanas Otros experimentos se realizaron para probar el efecto de 107A y TOP004 sobre la expresión de la subunidad de cadena beta común de los receptores I L-3, I L-5 y GM-CSF. Modulación de la Expresión de ARNm de Cadena Beta en Células TF-1 y U937 Refiriéndose a las Figuras 1 1A, 1 1 B y 1 1 C se muestra la modulación de la expresión de ARNm de cadena beta en las células TF-1 . Se trataron las células TF-1 con antisentido 107A durante 12 horas . Refiriéndose a la Figura 1 1 A, se realizó la RT- PCR para detectar la expresión de ARNm de cadena beta y ARNm de G3PDH en células TF-1. Las células se trataron como sigue: línea 1, control sin tratar; línea 2, oligonucleótido de sentido (10 microM); línea 3, 107A (10 microM); línea 4, oligonucleótido desigual (10 microM). Se usó RT-PCR semi-cuantitativa en condiciones no saturadas para determinar la expresión de la cadena beta y ARNm de G3PDH (que se usó como control). El tratamiento con 107A (10 microM) inhibió casi completamente la expresión de la cadena beta en células tratadas TF-1 (Figura 11A) y U937 (datos no mostrados). La inhibición fue específica para 107A y no se debió a la degradación de ARN o a la pérdida de viabilidad celular, según lo evidenciado por el control interno (producto 450-bp que corresponde a ARNm de G3PDH) (Figura 11 A). En contraste, la expresión de ARNm de cadena beta no fue inhibida en células de control sin tratar o en células tratadas con oligonucleótidos de sentido o desiguales (Figura 11 A). Así, la actividad de 107A fue específica y efectiva inhibiendo la expresión de ARNm de cadena beta. Refiriéndose a las Figuras 11B y 11C, se muestra el efecto del oligonucleótido de sentido y del tratamiento con 107A sobre la expresión de la cadena beta en la superficie celular de las células TF-1, según lo determinado por el análisis de FACS. La Figura 11B muestra los controles sin tratar (PC) contra oligonucleótidos de sentido tratados (S-ODN) y donde NC representa un control negativo. La Figura HC muestra la expresión de superficie celular en células tratadas con 107A (a concentraciones variantes de 5, 10, y 20 microM) durante 36 horas. La capacidad de los oligonucleótidos antisentido para inhibir la expresión de la proteína de cadena beta celular dio lugar a una densidad más baja correspondiente de la subunidad de cadena beta en la superficie de las células tratadas con 107A. Se utilizó un anticuerpo monoclonal (MAb) contra la proteína de cadena beta común de los receptores GM-CSF/IL-3/IL-5, junto con el análisis de FACS, para medir la expresión de superficie celular de la proteína de cadena beta en las células TF-1. El nivel de expresión de la cadena beta mediante células TF-1 sin tratar fue muy alto y no fue afectado por el tratamiento de oligonucleótidos de sentido. Sin embargo, las concentraciones de aumento de 107A (5, 10, y 20 microM) redujeron significativamente el nivel de la expresión de cadena beta de una manera dependiente de la dosis (el porcentaje de células probadas positivo en el análisis de FACS disminuyó de 69.9% a 27.8%). La figura 11D muestra la inhibición de la expresión de la cadena beta común en las células U937 después del tratamiento con TOP004. Las células U937 se incubaron en presencia de concentraciones increméntales de TOP004 (0.01, 0.1, 1 y 10 microM) durante 12 horas en un medio libre de suero antes de RT-PCR y antes de 48 horas del análisis de FACS. El porcentaje de inhibiciones de ARNm de cadena beta común o proteína, se determinó comparando los valores obtenidos a las células sin tratar. El experimento se realizó por triplicado y los datos representan un promedio +/- SE. Los resultados presentados en la Figura 11D, demuestran que el antiaentido TOP004, que es DAP que contiene los residuos homólogos al antisentido 107A, es eficaz inhibiendo la cadena beta común a niveles de ARNm y proteína. Por otra parte, se encontró que cantidades pequeñas de TOP004 (por ejemplo, 1 microM) fueron suficientes para bloquear ARNm de cadena beta así como la .proteína correspondiente. Así, estos datos favorecen la eficacia de la química de DAP y su uso en las composiciones farmacológicas según lo descrito anteriormente. Estudios Funcionales y de Supervivencia Celular Refiriéndose a la Figura 12, se muestra la proliferación de células TF-1 tratadas con antisentido 107A en presencia de GM-CSF, 1L-3 o IL-5. Las células se incubaron con 107A (10 microM) durante 5 horas en medio libre de suero; que contiene 1 ng/ml de GM-CSF o 3 ng/ml de IL-3 ó 3 ng/ml de IL-5. Se completó la incubación después de 2 días, y la proliferación celular fue medida por el análisis de alamar azul (n=3). Los resultados se expresaron como el promedio de absorbencia (570-595) ± SD. Las células TF-1 requieren citocinas GM-CSF, IL-3, o IL-5 para proliferar, y la respuesta biológica a estas citocinas involucra la cadena beta que señala la trayectoria. Se esperaba que la inhibición de la expresión de superficie celular de la proteína de cadena beta inhibiera la proliferación de células TF-1 , incluso en presencia de éstas citocinas. 107A (10 microM) causó la inhibición^del crecimiento de las células TF-1 en presencia de I L-3, I L-5, o G M-CSF. Estos resultados demuestran que la inhibición de la expresión de la proteína de superficie cel ular de cadena beta mediante 107A, inhibió efectivamente las respuestas biológicas celulares de las tres citocinas. Los eosinófilos expresan los receptores GM-CS F, I L-3 e I L-5 y desempeña un papel esencial en la inflamación y alergia. Los eosinófilos req uieren GM-CSF, I L-3, y particularmente I L-5 para su diferenciación , activación , y supervivencia (Oddera y col. , 1998 , Lung. 176: 237-247; Ohnishi y col. , 1993, J . Allergy Clin. Immunol. , 92: 607-615). Se investigó la capacidad del oligon ucleótido antisentido que identifica ARNm de cadena beta para inhibir la supervivencia de eosinófilos en respuesta a I L-5.

Refiriéndose a la Figura 13A y 1 3B , se mostró la modulación de la supervivencia eosinófilo mediante 107A. Refiriéndose a la Figura 1 3A, los eosinófilos humanos purificados se incubaron con 1 07A a concentraciones indicadas (10, 15 , y 20 microM) en un medio de RPMI complementado con 5% de FBS y 1 .5 ng/ml de IL-5 durante la noche. La viabilidad de eosinófilos se determinó usando el análisis de exclusión con tinte azu l tripán . Los resultados son los resultados promedios de tres experimentos. El tratamiento con 107A a las concentraciones ind icadas redujo sign ificativamente la supervivencia de eosinófilos en una manera dependiente de la dosis, a 35% ± 12% (10 microM), 43% ± 2% (15 microM), y 54% ± 7% (20 microM) de los niveles de control (p<0.01). La supervivencia de eosinófilos no fue afectada significativamente por el tratamiento con el oligonucleótido de sentido, como un control, a una concentración de 20 microM. Así, 107A que identifica la cadena beta, inhibió la supervivencia de eosinófilos incluso en presencia de un medio de cultivo que contiene la citocina específica IL-5. Refiriéndose a la Figura 13B, los eosinófilos humanos purificados se incubaron durante 48 horas en RPMI complementado con 5% de FBS y 2 ng/ml de IL-5 en presencia o ausencia de 107A (15 microM). La viabilidad de eosinófilos se determinó mediante el análisis citométrico de flujo usando el protocolo de Annexin- V-FITC y yoduro de propidio según lo descrito en el material y métodos. Cuando los eosinófilos se trataron con 107A, su viabilidad fue disminuida en un 64%, 41% debido a la apoptosis. En contraste, en células no tratadas y células tratadas con el oligonucleótido de sentido, fue ¡nferior el porcentaje de células muertas. Así, el antisentido 107A inhibe específicamente la expresión de la cadena beta común en células TF-1 y eosinófilos primarios al nivel de ARNm y proteína según lo medido por RT-PCR y FACS. La eficacia máxima obtenida en sistema celular probado, bajo condiciones experimentales usadas, se observó a una concentración de 20 microM. En presencia de 107A, se redujo la proliferación de células TF-1, si se usaron IL-3, IL-5, o GM-CSF como un factor trófico. Este resultado muestra la especificidad y eficacia del antisentido 107A para la cadena beta. La supervivencia de eosinófilos se inhibió mediante 107A en presencia de IL-5 y pareció que la apoptosis es una consecuencia de este efecto inhibidor. Los eosinófiios desempeñan un papel esencial en la inflamación alérgica y requieren GM-CSF, IL-3, e IL-5 para su diferenciación, activación, y supervivencia (Adachi y col., 1995, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 151: 618-623 y Oddera y col., 1998, Lung. 176: 237-247). En el asma, la acumulación y supervivencia de eosinófilos se piensan que son contribuyentes importantes para la inflamación y para el daño de tejido epitelial debido a que liberan productos tóxicos, que incluyen la proteína catiónica de eosinófilos (Walsh y col., 1997, Clin Exp. Allergy 27: 482-487). Ejemplo 5 Análisis de ARNm para Genes Objetivo de ASM8 en Muestras Traquéales Otros experimentos se condujeron para analizar las muestras traqueales en monos Cynomolgus para los niveles de ARNm de los genes objetivo a los cuales se dirige en contra ASM8 (subunidad de cadena beta y CCR3). El día 15 (un día después de la última dosis), las muestras traqueales se recolectan inmediatamente después del sacrificio de todos los an imales de la fase principal en los grupos 1 (control) y 4 (g rupo de dosis alta; nivel de dosi s objetivo de 2.5 mg/kg/día) y congelado rápidamente en n itrógeno líquido. Las muestras traqueales congeladas se analizaron para los niveles objetivo de ARNm medianíe RT-PCR. Se determinaron los nivel es de expresión del gen objetivo (subunidad ßc y CCR3) para las muestras traqueales del mono usando un método validado de RT-PCR semi-cuantitativa. Las amplificaciones de PCR específicas de la subunidad ßc y CCR3 se llevaron a cabo en los extractos traqueales para los animales de control y dosis alta tratados con ASM8 (tabla 7). Tabla 7. Resultados del Análisis de la Muestra por RT-PCR Nota: los valores sombreados representan valores atípicos que no fueron incluidos en el cálculo de valores promedio. Aunque la deshidrogen asa de gliceraldeh ído-3-fosfato (G3PDH) se utiliza comúnmente como un control interno en los análisis de las reacciones de RT-PCR, se observó un infiltrado celular moderado de los pulmones y tráquea (como se observó comúnmente con otros oligonucleótidos antisentido en los sitios de deposición). Así, mientras el infiltrado celular contribuyó a los niveles medidos de la subunidad ßc y CCR3 (es decir, las células inmunes expresan la subunidad ßc y CCR3), no se consideró que G3PDH fuera un gen más apropiado para utilizarse como el control interno en este caso. En cambio, la expresión de los genes objetivo se normalizó a los niveles de ARNm para los citocinas inflamatorias; es decir, de IL-4 y TNF-a. Los resultados mostraron que incluso aproximadamente 24 horas después de la administración de ASM8, la expresión relativa de la subunidad ßc y de ARNm de CCR3 a ARNm de IL-4 se disminuyó en un 29% y 24%, respectivamente, y la expresión relativa para TNF-a se disminuyó en un 30% y 24%, respectivamente, en los animales tratados con ASM8 (Tabla 8).

El tratamiento con ASM8 así, inhibe significativamente la expresión de la subunidad ßc y ARNm de CCR3 en relación a las citocinas inflamatorias IL-4 y TNF-a, a pesar de la complejidad del tejido traqueal del mono y de las 24 horas que transcurrieron entre la dosificación de ASM8 y la obtención de ias muestras de tejido. Ejemplo 6 Estabilidad en Almacenamiento de ASM8 La prueba de estabilidad se condujo para evaluar la integridad de los constituyentes de oligonucleótidos de ASM8 (TOP004 y TOP005) bajo diferentes temperaturas de almacenamiento. Esta información es importante para definir las condiciones óptimas de almacenamiento, repetición de la prueba, y duración en almacenamiento de ASM8. La electroforesis de gel capilar (CGE, por sus siglas en ingles) y la cromatografía líquida (presión) de alto rendimiento (CLAR) se han utilizado ampliamente para el análisis químico del de los oligonucleótidos antisentido. Mientras que ASM8 está compuesto por dos oligonucleótidos, el sistema de prueba debe proporcionar la separación adecuada de las dos moléculas individuales de antisentido. Así, lo siguiente será descrito: 1) un método basado en la cromatografía de intercambio de aniones para separar los componentes de ASM8 (TOP004 y TOP005) y sus productos de degradación, y 2) el efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la estabilidad de los constituyentes de ASM8 (Figuras 14-16). Se pesó ASM8 y solubilizó en PBS a una concentración de 0.5 mg/m1 (0.25 mg/ml de TOPO04 y 0.25 mg/ml de TOP005). [El factor de pureza para TOP004, fue de 1.15 (es decir, 1.15 g de polvo contiene 1 g de moléculas activas); el factor de pureza para TOP005, fue de 1.24 (es decir, 1.24 g de polvo contiene 1 g de moléculas activas)]. Para inducir la degradación de TOP004 y TOP005 antes del análisis (para asegurar la resolución de los productos de degradación a partir de las moléculas intactas), se realizaron los siguientes tratamientos: • Depuración: ASM8 se suspendió nuevamente en 30% de CH3COOH a una concentración final de 0.5 mg/ml, e incubó durante 3, 4, ó 6 horas a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de 5 volúmenes de agua y la mezcla se colocó a -20° antes de la liofilización en un Spedd-Vac para eliminar el ácido acético. • División: Los oligonucleótidos depurados se suspendieron nuevamente en 0.2 M de NaOH (0.5 mg/ml), incubaron a 50°C durante 1 hora, y almacenaron a -20°C o analizaron por CLAR. Las alícuotas de ASM8 (0.5 mg/ml) en PBS se incubaron a -20°C, 4°C, 30°C, y 40°C durante 2 meses. En las semanas 4, y 8, se estableció el perfil de CLAR de ASM8. La condición de control se definió como el perfil de CLAR de ASM8 antes de cualquier periodo de almacenamiento (es decir, al tiempo cero). El sistema de CLAR fue conducido por el software Breeze (V 3.30) de Waters (Figuras 17A1, 17A2, 17B1 y 17B2). La separación por CLAR se realizó con una bomba CLAR Waters 1500 Series Binary acoplada a un detector de absorbencia Waters 2487 Dual ? y equipada con desgasificador en línea, horno, y un inyector manual serie 1500, Reodyne 7725i. La mezcla de oligonucleótidos se fraccionó en una columna de intercambio de aniones Waters Protein Pak DEAE 5PW (0.5 cm X 7.5 cm), se mantuvo a 60°C, y detectó por absorción UV a 260 nm. La mezcla de oligonucleótidos (volumen = 25 microL) se cargó en la columna en agua (amortiguador A) y se realizó la elusíón aumentando progresivamente la proporción del amortiguador B (1 M de LiCIO ), dando por resultado un aumento de fuerza iónica de la fase líquida (Tabla 9), que eluyó el oligonucleótido de la fase sólida (columna). Bajo condiciones de análisis, 62.5 microgramos de TOP004 o TOP005 produjeron un cambio que se pudo medir como >0.15 unidades de absorbencia (AU) a 260 nm.

El cromatógrama en la Figura 14 muestra el perfil de elusión de los productos individuales de ASM8 (TOP004 y TOP005) bajo la cromatografía de intercambio de aniones de DEAE. Un volumen de 25 microL de ASM8 preparado recientemente (0.5 mg/ml) se fraccionó en la columna de intercambio de aniones de DEAE. Bajo las condicio nes del gradiente descritas anteriormente, TOP004 se antes que TO P005; esto es consistente con TOP004 que es 2 nucleótid os más corto que TO P005 y tiene pocos residuos cargados negativamente. El oligonucleótido TOP004 eluído en 81 .3 minutos y representó 48.0% del total de absorción de material a 260 nm . TOP005 elu ído en 86.8 min utos y representó el 49.3% del total de absorción de material a 260 nm. Para confirmar la separación adecuada entre TO.P004, TOP005, y los productos de deg radación de ASM8, se realizó una degradación química de dos etapas de ASM8. La etapa de división se mantuvo constante pero el período de incubación para la etapa de depuración se realizó durante 3 a 6 horas. Refiriéndose a la Figura 15, AS M8 (0.5 mg/ml) se trató con CH3COOH durante 3 horas y se sometió a lisis alcalina (según lo descrito anteriormente) antes del fraccionamiento por cromatografía de intercambio de aniones de DEAE. El oligonucleótido TOP004 eluído en 81 .5 minutos y representó el 32.4% del total de absorbencia de material a 260. El producto de TO P005 eiu ído en 86.9 minutos y represento el 28.0% del total de absorbencia de material. Los picos menores representan los productos de degradación de ASM8. Refiriéndose a la Figura 16, ASM8 (0.5 mg/ml) se trató con CH3COOH durante 6 horas y se sometió a lisis alcalina según lo descrito anteriormente antes del fraccionamiento por cromatografía de intercambio de aniones de DEAE. Bajo detección a 260 nm, el oligonucleótido TOP004 eluído en 82.2 minutos y TOP005 eluído en 86.7 minutos.

Aumentando el tiempo de depuración, la proporción de TOP004 disminuyó un 20.6% y TOP005 un 14.5%. El grado de degradación de TOP005 pareció ser levemente mayor bajo estas condiciones experimentales. Según lo observado en los cromatógramas en las Figuras 15 y 16, aumentando el tiempo de depuración se aumentó la degradación de ASM8. Refiriéndose a las figuras 17A1, 17A2, 17B1 y 17B2, se evaluó la estabilidad química de ASM8 bajo diferentes temperaturas de almacenamiento. ASM8 (0.5 mg/ml en PBS) se incubó a -20°C, 4°C, 30°C, ó 40°C durante 4 semanas (Figura 17A1 y 17A2) y 8 semanas (Figura 17B1 y 17B2) y se analizó por cromatografía de intercambio de aniones de DEAE. Varias • temperaturas de almacenamiento probadas en este experimento no afectaron el perfil de elusión de los componentes de ASM8. No se observó ninguna degradación significativa de ASM8 a cualquiera de las temperaturas a las cuales ASM8 se almacenó durante hasta 2 meses. Se ha descrito anteriormente un método de separación basado en CLAR de intercambio de aniones de DEAE para ASM8. Debido a la naturaleza de este producto, se prefiere la separación adecuada de los componentes de ASM8 (los oligonucleótidos TOP004 y TOP005). Bajo las condiciones de gradiente descritas, el tiempo de retención de TOP004 fue de más de 5 minutos antes que el tiempo de retención de TOP005, con un traslapo muy pequeño de dos picos.. El método también es capaz de detectar los productos de degradación de ASM8. Se puede determinar la estabilidad química de ASM8 bajo diferentes condiciones de temperatura, humedad, y luz por este método de CLAR. La formulación de ASM8 en PBS fue estable químicamente, y no se detectó ningún producto de degradación significativo por el procedimiento de CLAR después del almacenamiento bajo un intervalo de temperaturas durante hasta 2 meses. Ejemplo 7 Evaluación Termodinámica de ASM8 Otros experimentos se condujeron para asegurar que los dos filamentos de oligonucleótidos, TOP004 y TOP005, no interactuaran en la solución usando evaluaciones termodinámicas.

TOP004 y TOP005 se mezclaron a concentraciones equimolar'es en 1 x PBS (así como en otros sistemas de amortiguador). La concentración total de oligonucleótidos osciló de aproximadamente 1.2 a 8.7 microM. Los métodos de termo-desnaturalización UV estándares se condujeron usando un espectrofotómetro Beckman DU640 con un accesorio Tm. El cambio en la absorbencia se detectó a 260 nm en cada grado de 10 a 90°C. Las curvas de fusión se ajustaron usando el software MELTWIN 3.5™ para determinar los parámetros termodinámicos. Se produjeron las imágenes en pantalla de las curvas de fusión y de tablas se resumen termodinámico. Refiriéndose a la Figura 18, se muestran las curvas de fusión para TOP004 y TOP005 en 1 x PBS. La Figura 19 es un resumen termodinámico basado en los resultados de los ajustes de la curva de fusión para TOP004 y TOP005 en 1 x PBS. Los resultados demostraron que ninguna de las combinaciones/condiciones de los oligonucleótidos produjo una transición significativa (salto en la absorbencia) en el perfil de fusión durante el aumento en la temperatura. Esto indicó que las mezclas de oligonucleótidos probadas no forman interacciones de estructura secundarias significativas a las condiciones probadas de amortiguador. Ejemplo 8 Toxicidad de ASM8 en el Mono Cynomolgus Este ejemplo muestra la toxicidad de ASM8, que consiste en una mezcla 1:1 de TOP004 y TOP005. También se muestra el perfil toxicocinético de sus componentes de oligonucleótidos individuales, cuando se administran por exposición a inhalación una vez diariamente durante 14 días consecutivos a los monos Cynomolgus. Además, 14 días de exposición a la inhalación de ASM8 no provocaron una condición hipersensibilidad sistémica detectable mediante la inyección intradérmica (ID).

Tabla 1 0. Dosificación Lograda Estimada Tabla 1 1 . Concentraciones en aerosol de Exposición Total Se realizaron las valoraciones completas de la mortalidad, signos clínicos, pesos corporales, consumo alimenticio, electrocardiografía, optalmoscopia y patolog ía clínica. Las muestras de sangre seriales se obtuvieron en los primeros y últimos días de exposición y en el final del período de recuperación y se recolectaron los tejidos en la finalización , para determinar el contenido individual de oligonucleótidos. Adicionalmente, el día 25 , se les dio a los animales designados para la fase de recuperación una inyección intradérmica (ID) de ASM8 para determinar la hipersensibilidad sistémica potencial. Todos los animales se eutanizaron después de 14 días (d ía 15) de exposición o después de un periodo de recuperación de 14 días (día 29) y se sometieron a una autopsia completa con recolección de un conjunto completo de tejidos de cada animal. La evaluación histopatológica consistió en el examen microscópico de todos los tejidos de los animales en los grupos de dosis alta y de control, y los tejidos del tracto respiratorio en los grupos de dosis inferior y en los animales en recuperación. La formulación de ASM8 se convirtió en aerosol fácilmente y produjo aerosoles de exposición que fueron constantemente estables y respirables, con un diámetro mediano de masa del inter-grupo (MMAD) y los valores de desviación geométrica estándar (GSD, por sus siglas en ingles) entre 1.7-1.8 micrómetros y 2.12-2.22, respectivamente. Las dosis alcanzadas estimadas resultantes estuvieron cerca del objetivo a 0.05, 0.22 y 2.5 mg/kg/día para los grupos 2-4, respectivamente, Tabla 7-8. No hubo muertes, y los monos toleraron bien las dosificaciones. No hubo efectos sobre el peso corporal, consumo alimenticio, electrocardiografía, optalmoscopia o parámetros de patología clínica y la prueba de hipersensibilidad no reveló ningún efecto de la administración de ASM8. Después de la autopsia, las mediciones del peso del órgano no produjeron ninguna evidencia de toxicidad. Las investigaciones macroscópicas de todos los órganos revelaron solamente una descoloración pálida de los ríñones en animales tratados con ASM8. Sin embargo, debido a la ausencia de alteraciones microscópicas confirmativas, hallazgos de la patología clínica o cambios en el peso del órgano, y al hecho de que la descoloración no fue considerada después de 14 días de recuperación, éste hallazgo fue considerado de un importancia biológica y toxicológica equivoca. Los niveles de plasma de TOP004 y TOP005, así como sus metabolitos (n-1) próximos, fueron muy bajos en el plasma, con los grupos de dosis baja y media por debajo del límite de cuantificacíón. Para el grupo de dosis alta (2.5 mg/kg/día), las concentraciones de TOP004 y TOP005 fueron comúnmente mayores en el tiempo de muestreo anterior de 0.5 horas después de la dosis, o en el punto del tiempo de 1 hora. En la mayoría de los puntos de tiempo después de la dosis, la concentración promedio de TOP004 fue similar a la de TOP005, Figura 20A y Figura 20B. No hubo ninguna acumulación de ningún componente de oligonucleótidos (o sus metabolitos n-1) en el plasma con la administración diaria repetida durante 14 días según lo mostrado en la Figura 21A y Figura 21B. No hubo ninguna diferencia de género constante en las concentraciones de plasma. Un porcentaje significativo de oligonucleótidos de circulación se presentó como el metabolito n-1 próximo para TOP004 y TOP005, aunque el porcentaje tendió a ser ligeramente inferior para TOP004. Para ambos ollgonucleótidos y sus metabolitos n-1, la eliminación del compartimiento de sangre (plasma) fue evidente durante el período de recolección de 24 horas. En el sacrificio terminal (un día después de la última inhalación de la dosis de ASM8), las cantidades apreciables de los componentes de oligonucleótidos intactos de ASM8 (TOP004 y TOP005) se detectaron en la tráquea de los animales de dosis alta. Al final del período de recuperación de 14 días (día 29), habían disminuido los niveles de TOP004 y de su metabolito n-1, en relación al día 15 y fueron medidos ligeramente por encima del límite de detección del análisis. En contraste, no fue cuantificable ningún TOP005 o ni su metabolito en el punto de tiempo del sacrificio de recuperación. Estos resultados sugieren que TOP004 tiene mayor estabilidad tisular que TOP005. Los cambios microscópicos relacionados al tratamiento no se observaron en ningún órgano excepto en el tracto respiratorio. Todos los cambios observados en la tracto respiratorio se evaluaron en una escala de 4 puntos que es la más baja (mínima). Los cambios que se observaron se incluyeron para los pulmones: macrófagos alveolares espumosos en los animales dosificados a 0.22 ó 2.5 mg/kg/día, inflamación granulocítica intra-alveolar a 2.5 mg/kg/día, hemorragia focal en dos animales y metaplasia bronquial focal en un animal dosificado a 2.5 mg/kg/día; para la cavidad nasal: erosión focal del epitelio escamoso del tabique nasal en 2/6 animales dosificados a 2.5 mg/kg/día, acompañada por inflamación aguda y un exudado inflamatorio en un mono; y para los nodos linfáticos bronquiales: macrófagos espumosos en animales dosificados a 2.5 mg/kg/día.

La gravedad de los cambios observados en los pulmones de los animales de dosis media y alta fue menor y no fue acompañada por evidencia de daño local o infiltración celular en la parenquima pulmonar. Las células inflamatorias fueron escasas y solo se observaron en un n úmero pequeño de animales de dosis alto de ASM8 y de la distribución de los cambios fue consistente con ia inhalación del material de prueba. Las hemorragias focales fueron muy pequeñas e interpretadas como que son probablemente fortuitas . Los cambios descritos son así generalmente consistentes con los mecanismos pulmonares normales asociados con la fagocitosis y eliminación de un material de prueba inhalado. El retiro del tratamiento durante 14 d ías dio lugar a la presencia continua de algunos macrófagos alveolares espumosos sin inflamación en uno de los dos animales de dosis alta de ASM8. Esta observación es consistente con el retroceso gradual de las lesiones e indica que no hubo alteración progresiva o persistente a la parenquima pulmonar. No hubo evidencia de un efecto del tratamiento en tejidos nasales después del período de recuperación de 14 d ías. Con respecto a los hallazgos de los nodos linfáticos bronq uiales en animales de dosis alta, los macrófagos espumosos en los senos medulares son consistentes con la eliminación del material de prueba mediante el drenado linfático del pulmón . No h ubo evidencia de daño parenquimal, y los nodos linfáticos no parecieron estar en una condición reactiva.

En conclusión , fue bien tolerada la inhalación de ASM8 durante 14 días consecutivos a dosis alcanzadas estimadas de hasta 2.5 mg/kg/día y no produjo ningún efecto sobre los pesos corporales, consumo alimentici o, electrocardiografía, pesos del órgano , optalmoscopia o parámetros de patología clínica, y la prueba de hipersensibilidad n o reveló ningún efecto de la administración de ASM8. Un número de alteraciones histomorfológicas muy mínimas se observó en los pulmones (0.22 y 2.5 mg/kg/día) , así como en la cavidad nasal y en los nodos linfáticos bronquiales (2.5 mg/kg/día) . Estos cambios fueron red ucidos en cuanto a gravedad d estuvieron ausentes después de 14 días de recuperación. Au nque las modalidades preferidas de la invención se han descrito en la presente, será entendido por el experto en la técnica que se pueden hacer variaciones a la misma sin apartarse del espíritu de la invención o del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (68)

REIVINDICACIONES

1. Un. oligonucleótido antisentido para tratar y/o prevenir por lo menos uno de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer, el oligonucleótido está dirigido contra la codificación de la secuencia de ácido nucleico de una proteína seleccionada del grupo que consiste de un receptor de quimiocina CCR3 y una sub-unidad beta común de los receptores IL-3, IL-5 y GM-CSF y otras proteínas capaces de entrar en contacto con la sub-unidad beta común de los receptores de IL-3, IL-5 y GM-CSF, en donde el oligonucleótido es uno de (i) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO. 1, SEC ID NO. 13 y SEC ID NO. 14 y (ii) un oligonucleótido modificado de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO. 1, SEC ID NO. 13 y SEC ID NO.14.

2. El oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido tiene una secuencia que comprende la SEC ID NO. 1.

3. El oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido tiene una secuencia que comprende la SEC ID NO. 13.

4. El oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido tiene una secuencia que comprende la SEC ID NO. 14.

5. El oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido antisentido es para tratar y/o prevenir el asma.

6. El oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido antisentido es para tratar y/o prevenir la alergia.

7. El oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido antisentido es para tratar y/o prevenir la hipereosinofilia.

8. El oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido antisentido es para tratar y/o prevenir la inflamación general.

9. El oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido antisentido es para tratar y/o prevenir el cáncer.

10. El oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el cáncer es leucemia.

11. Uso de por lo menos un oligonucleótido antisentido de acuerdo a lo definido en la reivindicación 1 para tratar y/o prevenir por lo menos una de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer.

12. El uso de acuerdo a la reivindicación 11, en donde por lo menos un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia que comprende la SEC ID NO. 1. 13. El uso de acuerdo a la reivindicación 11, en donde por lo menos un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia que comprende la SEC ID NO.

13. 14. El uso de acuerdo a la reivindicación 11, en donde por lo menos un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia que comprende la SEC ID NO.

14.

15. El uso de acuerdo a la reivindicación 11, en donde por lo menos un oligonucleótido antisentido es por lo menos dos oligonucleótidos antisentido que tienen secuencias que comprenden la SEC ID NO. 13 y SEC ID NO. 14, respectivamente.

16. El uso de acuerdo a la reivindicación 11, en donde por lo menos un oligonucleótido se utiliza para tratar y/o prevenir el asma.

17. El uso de. acuerdo a la reivindicación 11, en donde por lo menos un oligonucleótido se utiliza para tratar y/o prevenir la alergia.

18. El uso de acuerdo a la reivindicación 11, en donde por lo menos un oligonucleótido se utiliza para tratar y/o prevenir la hipereosinofilia.

19. El uso de acuerdo a la reivindicación 11 , en donde por lo menos un oligonucleótido se utiliza para tratar y/o prevenir la inflamación general.

20. El uso de acuerdo a la reivindicación 11, en donde por lo menos un oligonucleótido se utiliza para tratar y/o prevenir el cáncer.

21. El uso de acuerdo a la reivindicación 11, en donde el cáncer es leucemia.

22. Una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir por lo menos una de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer, que comprende por lo menos un oligonucleótido antisentido de acuerdo a lo definido en la reivindicación 1, en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable.

23. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 22, en donde por lo menos un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia que comprende la SEC ID NO. 1.

24. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 22, en donde por lo menos un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia que comprende la SEC ID NO. 13.

25. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 22, en donde por lo menos un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia que comprende la SEC ID NO. 14.

26. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 22, en donde por lo menos un antisentido es por lo menos dos oligonucleótidos antisentido que tienen las secuencias que comprenden la SEC ID NO. 13 y SEC ID NO. 14, respectivamente.

27. La composición farmacéutica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 22-26, en donde la composición farmacéutica es tópica.

28. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 22, en donde la composición farmacéutica es para tratar y/o prevenir el asma.

29. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 22, en donde la composición farmacéutica es para tratar y/o prevenir la alergia.

30. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 22, en donde la composición farmacéutica es para tratar y/o prevenir la hipereosinofilia.

31. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 22, en donde la composición farmacéutica es para tratar y/o prevenir la inflamación general.

32. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 22, en donde la composición farmacéutica es para tratar y/o prevenir el cáncer.

33. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 22, en donde el cáncer es leucemia.

34. Uso de la composición farmacéutica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 22-27 para tratar y/o prevenir por lo menos una de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer.

35. El uso de acuerdo a la reivindicación 34, en donde la composición farmacéutica se utiliza para tratar y/o prevenir el asma.

36. El uso de acuerdo a la reivindicación 34, en donde la composición farmacéutica se utiliza para tratar y/o prevenir la alergia.

37. El uso de acuerdo a la reivindicación 34, en donde la composición farmacéutica se utiliza para tratar y/o prevenir la hipereosinofilia.

38. El uso de acuerdo a la reivindicación 34, en donde la composición farmacéutica se utiliza para tratar y/o prevenir la inflamación general.

39. El uso de acuerdo a la reivindicación 34, en donde la composición farmacéutica se utiliza para tratar y/o prevenir el cáncer.

40. El uso de acuerdo a la reivindicación 34, en donde el cáncer es leucemia.

41. Un método para tratar y/o prevenir por lo menos una de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer, que comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de por lo menos un oligonucleótido antisentido de acuerdo a lo definido en la reivindicación 1.

42. El método de acuerdo a la reivindicación 41, en donde por lo menos un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia que comprende la SEC ID NO. 1.

43. El método de acuerdo a la reivindicación 41, en donde por lo menos un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia que comprende la SEC ID NO. 13.

44. El método de acuerdo a la reivindicación 41, en donde por lo menos un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia que comprende la SEC ID NO. 14.

45. El método de acuerdo a la reivindicación 41, en donde por lo menos un oligonucleótido es por lo menos dos oligonucleótidos antisentido que tienen la secuencias que comprenden la SEC ID NO. 13 y SEC ID NO. 14, respectivamente.

46. El método de acuerdo a la reivindicación 41, el cual es para tratar y/o prevenir el asma.

47. El método de acuerdo a la reivindicación 41, el cual es para tratar y/o prevenir la alergia.

48. El método de acuerdo a la reivindicación 41, el cual es para tratar y/o prevenir la hipereosinofilia.

49. El método de acuerdo a la reivindicación 41, el cual es para tratar y/o prevenir la inflamación general.

50. El método de acuerdo a la reivindicación 41, el cual es para tratar y/o prevenir el cáncer.

51. El método de acuerdo a la reivindicación 41, en donde el cáncer es leucemia.

52. Un método para tratar y/o prevenir por lo menos una de asma, alergia, hipereosinofilia, inflamación general y cáncer, que comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de acuerdo a lo definido en cualquiera de las reivindicaciones 22-27.

53. El método de acuerdo a la reivindicación 52, el cual es para tratar y/o prevenir el asma.

54. El método de acuerdo a la reivindicación 52, el cual es para tratar y/o prevenir la alergia.

55. El método de acuerdo a la reivindicación 52, el cual es para tratar y/o prevenir la hipereosinofilia.

56. El método de acuerdo a la reivindicación 52, el cual es para tratar y/o prevenir la inflamación general.

57. El método de acuerdo a la reivindicación 52, el cual es para tratar y/o prevenir el cáncer.

58. El método de acuerdo a la reivindicación 52, en donde el cáncer es leucemia.

59. Uso de por lo -menos un oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1 para la producción de un medicamento para el uso en el tratamiento del asma.

60. Uso de por lo menos un oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1 para la producción de un medicamento para el uso en el tratamiento de la alergia.

61. Uso de por lo menos un oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1 para la producción de un medicamento para el uso en el tratamiento de la hipereosinofilia.

62. Uso de por lo menos un oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1 para la producción de un medicamento para el uso en el tratamiento de la inflamación general.

63. Uso de por lo menos un oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1 para la producción de un medicamento para el uso en el tratamiento del cáncer.

64. Uso de por lo menos un oligonucleótido antisentido de acuerdo a la reivindicación 1 para la producción de un medicamento para el uso en el tratamiento de la leucemia.

65. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 59-64, en donde por lo menos un oligonucleótido tiene una secuencia que comprende la SEC ID NO. 1 .

66. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 59-64, en donde por lo menos un oligonucleótido tiene una secuencia que comprende la SEC I D NO. 13.

67. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 59-64, en donde por lo menos un oligonucleótido tiene una secuencia que comprende la SEC I D NO. 14.

68. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 59-64, en donde por lo menos un oligonucleótido es por lo menos dos oligonucleótidos que tienen las secuencias que comprenden la SEC I D NO. 13 y SEC ID NO. 14, respectivamente.