JP2014511181A - キメラ骨格および2−アミノ−2’−デオキシアデノシンを有するオリゴヌクレオチド阻害剤 - Google Patents
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Abstract
標的遺伝子に対するオリゴヌクレオチドであって、前記遺伝子をコードする核酸配列の少なくとも一部分と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドは2-アミノ-2’-デオキシアデノシン(DAP)であり、前記オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合は少なくとも3つの交互に存在するセグメントを含み、各セグメントが少なくとも1つのホスホロチオエート結合または少なくとも1つのホスホジエステル結合のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが提供される。
Description
[関連出願の相互参照]
本出願は、2011年2月24日に出願された米国仮特許出願第61/446,144号を基礎とする優先権を主張する。
本出願は、2011年2月24日に出願された米国仮特許出願第61/446,144号を基礎とする優先権を主張する。
本発明は、炎症および呼吸器疾患の治療において有用なオリゴヌクレオチドに関し、特に、ホスホジエステラーゼ発現のオリゴヌクレオチド阻害剤に関する。
肺胞および気道の上皮は、肺における酸化ストレス、敗血症、内毒血症、およびその他の重篤疾患に対する炎症性および代謝性応答の制御において重要な役割を果たす動的な障壁として認識されている。特に呼吸上皮は、上皮−血液インターフェースにおける炎症状態/感染の主要な標的であり、それ自体、炎症細胞を徴集し炎症メディエーターを産生することにより炎症シグナルを増幅する能力を有する。
慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、炎症性の気道および肺胞の疾患の一例であり、そこでは炎症の上方制御の持続が役割を果たすと考えられている。COPDにおける炎症は、好中球、CD8陽性リンパ球、およびマクロファージの気道への浸潤の増加により特徴付けられる。好中球およびマクロファージは、COPDにおける気道炎症の病変形成に重要な役割を果たすが、それは、これらが組織の炎症および損傷を促進するエラスターゼ、メタロプロテアーゼ、および酸素ラジカルを含む多くのメディエーターを放出する能力を有するからである。COPDを有する患者の気道における炎症細胞の蓄積は、炎症促進性サイトカインの放出の増加、および、炎症細胞を気道に誘引し、それらを活性化させ、それらの存在を維持させるケモカインの放出の増加により引き起こされることが示唆されている。そこに存在する細胞も、組織に対して負の影響を有し疾患を永続化させる酵素(例えばメタロプロテアーゼ)および酸素ラジカルを放出する。COPDを有する患者の肺内では、非常に多様な炎症促進性サイトカインおよびケモカインが増加していることが示されている。その中でも、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-アルファ)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、およびインターロイキン8(IL-8)は重要な役割を果たし、これらはCOPDの患者の気道において増加する。
炎症が役割を果たすと見られる呼吸器疾患のその他の例としては、喘息、好酸球性咳嗽、気管支炎、嚢胞性線維症、肺高血圧症、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、移植肺の急性および慢性拒絶反応、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、ならびに副鼻腔炎が挙げられる。
喘息は、気道炎症、可逆的閉塞、および気道過敏により定義される。この疾患において関与する炎症細胞は主に好酸球、Tリンパ球、およびマスト細胞であるが、好中球とマクロファージも重要であり得る。非常に多様なサイトカインおよにケモカインが気道において増加することが示されており、炎症、閉塞、および応答性亢進を促進させることによりこの疾患の病態生理において役割を果たす。
好酸球性咳嗽は、慢性的な咳、および、患者の気道において気道閉塞や応答性亢進の不在下で炎症細胞(大部分は好酸球)が存在することにより特徴付けられる。この疾患ではいくつかのサイトカインおよびケモカインが増加するが、これらはほとんどが好酸球誘導によるものである。好酸球は気道内に徴集されそこで活性化され、炎症の永続化および咳嗽に役割を果たす酵素および酸素ラジカルを放出する可能性を有する。
急性気管支炎は、下気道の感染または刺激事象(例えば汚染、粉塵、ガス、または化学物質によるもの)の際に発生する急性疾患である。慢性気管支炎は、2年間に渡って、1年のうち少なくとも3ヶ月間ほとんど毎日咳と痰が生じることにより定義される。急性または慢性気管支炎の際にも気道中に炎症細胞を見出すことができ、それはほとんどが好中球であって、広範なケモカインおよびサイトカインを伴う。これらのメディエーターは、これらの疾患において起こる炎症、症状、および粘液産生において役割を果たすと考えられている。
肺移植は末期肺疾患の患者において実施される。身体の炎症細胞であるリンパ球がドナー臓器を「自己」として認識しないときに、急性の、そしてより重要なことに慢性の、同種移植片拒絶が起こる。ケモカインおよびサイトカインにより炎症細胞が徴集されて非常に多様な酵素を放出するが、これは組織の破壊を、そして慢性拒絶の場合には閉塞性細気管支炎と呼ばれる疾患を導く。
サルコイドーシスは、組織内に慢性的な非乾酪性肉芽腫が起こる、原因不明の疾患である。最も一般的に罹患する臓器は肺である。肺の気管支肺胞洗浄検査では、ほとんどがリンパ球、マクロファージ、そして時として好中球および好酸球の増加が示される。これらの細胞もまたサイトカインおよびケモカインにより徴集され活性化され、この疾患の病変形成に関与すると考えられている。
肺線維症は、慢性呼吸障害につながる進行性かつ慢性の線維症(瘢痕)により特徴付けられる肺組織の疾患である。肺線維症には異なる種類および原因が存在するが、それらは全て、炎症細胞の流入ならびに肺組織におけるコラーゲン堆積を伴う線維芽細胞の持続、活性化および増殖により特徴付けられる。これらの事象は肺組織内におけるサイトカインおよびケモカインの放出と関係していると見られる。
急性鼻炎は、鼻または上気道の感染または刺激事象(例えば汚染、粉塵、ガス、または化学物質によるもの)の際に発生する急性疾患である。慢性鼻炎は、定常的な慢性の鼻汁、鼻閉、くしゃみ、およびそう痒症の存在により定義される。急性または慢性鼻炎の際にも、上気道中に、広範なケモカインおよびサイトカインを伴う炎症細胞を見出すことができる。これらのメディエーターは、これらの疾患において起こる炎症、症状、および粘液産生において役割を果たすと考えられている。
急性副鼻腔炎は、急性であり通常は感染性である副鼻腔の疾患であって、鼻閉、液体状で化膿性である痰、頭痛、または副鼻腔痛により特徴付けられ、発熱を伴う場合も伴わない場合もある。慢性副鼻腔炎は、急性副鼻腔炎の症状が6ヶ月より長く持続することにより定義される。急性または慢性副鼻腔炎の際にも、上気道中および副鼻腔中に、広範なケモカインおよびサイトカインを伴う炎症細胞を見出すことができる。これらのメディエーターは、これらの疾患において起こる炎症、症状、および粘液産生において役割を果たすと考えられている。
炎症と腫瘍性疾患との間に密接な関連があることを示唆する証拠が蓄積してきている。腫瘍微小環境はそこに入る細胞によって形成され、それら細胞の機能がその局所的条件を反映する。腫瘍の進行の際に腫瘍部位において起こる経時的変化は、慢性炎症と類似している。この慢性炎症性反応はその大部分が腫瘍によって統制されていると見られ、腫瘍の生存を促進させていると見られる。発達中の腫瘍の内部または周囲において観察される初期の持続性の炎症応答が、組織恒常性の維持に関係付けられる多様なメディエーター(例えば、可溶性の成長因子および生存因子、マトリックス再構築酵素、活性酸素種、およびその他の生理活性分子)を提供することにより、腫瘍発生の多くの側面(マトリックスの再構築、血管新生、悪性度)を制御することが明らかとなってきている。
上記で説明したように、これらの炎症性呼吸器疾患または炎症が重要な役割を果たす疾患はすべて、症状、炎症の持続、そして慢性の場合は正常組織の破壊または混乱を引き起こす酵素または酸素ラジカルを放出する様々な炎症細胞を徴集し活性化する、メディエーターの存在により特徴付けられる。
非常に多様な細胞により放出される炎症促進性サイトカインおよびケモカインを減少させ、その一方で抗炎症性のメディエーターまたは酵素の放出に対しては低作用である治療アプローチは、炎症性呼吸器疾患またはあらゆるその他の全身性炎症疾患のための現在の療法に比べて有利となり得る。
環状ヌクレオチドであるcAMPおよびcGMPは、シグナル伝達の経路および機序に関与する遍在的な二次メッセンジャーである。cAMPおよびcGMPはいずれも、対応する三リン酸エステル(ATPおよびGTP)から、アデニリル(アデニル酸)シクラーゼまたはグアニリル(グアニル酸)シクラーゼの触媒活性により形成される。cAMP/cGMPの不活性化は、環状ヌクレオチド依存性ホスホジエステラーゼ(PDE)により触媒される3’-リン酸ジエステル結合の加水切断により達成され、これにより対応する不活性5’-一リン酸エステルの形成が生じる。炎症応答およびその進行は、環状ヌクレオチドの定常状態レベルの調節にきわめて敏感であることが示されており、その作用を受ける標的細胞は、免疫細胞だけでなく、気道平滑筋、上皮および内皮細胞、ならびに神経細胞のような補助細胞までも含まれる。環状ヌクレオチドPDEは、拡充され続けている大きな多遺伝子ファミリーであり、少なくとも11個のPDE酵素ファミリーを含む。インビトロおよびインビボにおける選択的および非選択的PDE阻害剤のプロファイルは、従って、抗うつ薬、抗増殖薬、免疫調節薬、子宮収縮抑制薬、変力物質/変時薬、および細胞保護剤としての治療的有用性の可能性を示唆する。PDEに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(「AON」)の使用は、共有にかかるWO 05/030787およびWO 07/134451に記載されている。
臨床的使用の可能性のためには、オリゴヌクレオチドは、血清および細胞のヌクレアーゼによる分解に対する安定性を示し、血清および細胞のタンパク質に対する非特異的結合の低さを示し、標的mRNA配列の認識の強化を示し、細胞膜透過性を示し、相補的mRNAと複合体を形成する際に細胞性ヌクレアーゼを誘発するべきである。天然の糖(D-リボースおよびD-2-デオキシリボース)およびリン酸ジエステル(ホスホジエステル、PO)結合を含有するオリゴヌクレオチドは、血清および細胞内のヌクレアーゼにより迅速に分解されることが広く記述されており、このことによって、有効な治療剤としてのそれらの有用性は限定される。治療剤としての安定性および有効性を向上させるためのオリゴヌクレオチドの化学的戦略的修飾が記述されてきた。主な化学的改変としては、糖部分、塩基部分の修飾、および/またはヌクレオチド間ホスホジエステル結合の修飾もしくは置き換えが含まれていた。今日まで最も広く研究されてきた類似体はホスホロチオエート(PS)オリゴデオキシヌクレオチドであり、それは、ホスホジエステル骨格中の非架橋酸素原子の1つが硫黄で置き換えられたものである。
例えば、CpG含有オリゴヌクレオチドのような免疫賦活性配列中のいくつかのPO結合が、そのオリゴヌクレオチドの安定性を上昇させるためにPS結合に置き換えられてきた。しかしながら、CpGモチーフ内のPO結合は通常必要であり、従って、混合PO/PS骨格としてCpG含有オリゴヌクレオチドの免疫賦活性を最大限にすることが必要となる。
PO/PS結合およびFANA修飾の組み入れを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの例がある。しかしながら、そのような修飾は、共有にかかるWO09/137912に記載されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を低下させることがある。
オリゴヌクレオチドの他の修飾としては、共有にかかるWO 03/004511に記載されているように、アデノシン残基を2-アミノ-2’-デオキシアデノシン(DAP)で置き換えることが挙げられる。
炎症および呼吸器疾患の治療において使用するための、PDEに対する改善されたオリゴヌクレオチドを得ることが望ましいであろう。
一側面において、標的ホスホジエステラーゼ(PDE)に対するオリゴヌクレオチドが提供され、このオリゴヌクレオチドは、PDEをコードする核酸配列の少なくとも一部分とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、ここで、
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドは2-アミノ-2’-デオキシアデノシン(DAP)であり、
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合は少なくとも3つの交互に存在するセグメントを含み、各セグメントは、少なくとも1つのホスホロチオエート結合からなるか、または少なくとも1つのホスホジエステル結合からなるかのいずれかである。
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドは2-アミノ-2’-デオキシアデノシン(DAP)であり、
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合は少なくとも3つの交互に存在するセグメントを含み、各セグメントは、少なくとも1つのホスホロチオエート結合からなるか、または少なくとも1つのホスホジエステル結合からなるかのいずれかである。
さらなる一側面において、1つの本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む薬学組成物が提供される。
さらなる一側面において、炎症の治療のための本明細書に記載される薬学組成物が提供される。
さらなる一側面において、呼吸器疾患の治療のための本明細書に記載される薬学組成物が提供される。
さらなる一側面において、本明細書に記載される薬学組成物を投与することを含む、対象における呼吸器疾患を治療する方法が提供される。
さらなる一側面において、呼吸器疾患の治療用の医薬の調製における本明細書に記載される薬学組成物の使用が提供される。
さらなる一側面において、呼吸器疾患の治療のための本明細書に記載される薬学組成物の使用が提供される。
さらなる一側面において、配列番号1〜72のいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが提供される。
さらなる一側面において、配列番号1〜127のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが提供される。
[表の簡単な説明]
[表1]表1は、本発明によるヒトのホスホジエステラーゼ(PDE)アイソフォーム7Aに特異的なAONの配列を表示する。
[表2]表2は、本発明によるヒトのホスホジエステラーゼ(PDE)アイソフォーム4Bおよび4Dに特異的なAONの配列を表示する。
[表3]表3は、ヒトAON配列と、異なる動物種(マウス、ラット、およびサル)由来の配列との間の相同性を示す。
[表4]表4は、本発明による、ヒトのホスホジエステラーゼ(PDE)アイソフォーム4B、4D、および7Aに特異的な、修飾化学を含むAONの配列を表示する。
[表5]表5は、本発明に従って対照として用いられるオリゴヌクレオチドの配列を表示する。
[表6]表6は、本発明によるマウスのホスホジエステラーゼ(PDE)アイソフォームに特異的なAONの配列を表示する。
[表7]表7は、インビトロおよびインビボのモデルにおいて標的遺伝子および炎症マーカーを定量化するために使用されるリアルタイムPCRプライマーを記述する。
[表8]表8は、マウスの肺にAON配列を投与した後の、気管支肺胞洗浄検査における炎症細胞流入および組織病理学的変化を記述する。
[表9]表9は、本発明に従ってインビボ毒性試験において使用されるAON配列を表示する。
[表10]表10は、本発明による、ヒトのβ鎖およびCCR3に特異的な、修飾化学を含むAONの配列を表示する。
[表1]表1は、本発明によるヒトのホスホジエステラーゼ(PDE)アイソフォーム7Aに特異的なAONの配列を表示する。
[表2]表2は、本発明によるヒトのホスホジエステラーゼ(PDE)アイソフォーム4Bおよび4Dに特異的なAONの配列を表示する。
[表3]表3は、ヒトAON配列と、異なる動物種(マウス、ラット、およびサル)由来の配列との間の相同性を示す。
[表4]表4は、本発明による、ヒトのホスホジエステラーゼ(PDE)アイソフォーム4B、4D、および7Aに特異的な、修飾化学を含むAONの配列を表示する。
[表5]表5は、本発明に従って対照として用いられるオリゴヌクレオチドの配列を表示する。
[表6]表6は、本発明によるマウスのホスホジエステラーゼ(PDE)アイソフォームに特異的なAONの配列を表示する。
[表7]表7は、インビトロおよびインビボのモデルにおいて標的遺伝子および炎症マーカーを定量化するために使用されるリアルタイムPCRプライマーを記述する。
[表8]表8は、マウスの肺にAON配列を投与した後の、気管支肺胞洗浄検査における炎症細胞流入および組織病理学的変化を記述する。
[表9]表9は、本発明に従ってインビボ毒性試験において使用されるAON配列を表示する。
[表10]表10は、本発明による、ヒトのβ鎖およびCCR3に特異的な、修飾化学を含むAONの配列を表示する。
[詳細な説明]
本明細書では、ホスホジエステラーゼ(PDE)のアイソフォームの発現を下方制御するためにそれらアイソフォームへと向けられた、オリゴヌクレオチドが記述される。これらのオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル/ホスホロチオエートの混合骨格(P2M)、および少なくとも1つの2-アミノ-2’-デオキシアデノシン(DAP)ヌクレオチドを有する。P2MとDAPの修飾は、作用強度、有効性、もしくは安定性を増加させ、および/または毒性を減少させることにより、抗PDEオリゴヌクレオチドを改善させることにおいて相乗効果を示すことが予期せず発見された。例えば本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、予想外に高い有効性/毒性比を示す。
本明細書では、ホスホジエステラーゼ(PDE)のアイソフォームの発現を下方制御するためにそれらアイソフォームへと向けられた、オリゴヌクレオチドが記述される。これらのオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル/ホスホロチオエートの混合骨格(P2M)、および少なくとも1つの2-アミノ-2’-デオキシアデノシン(DAP)ヌクレオチドを有する。P2MとDAPの修飾は、作用強度、有効性、もしくは安定性を増加させ、および/または毒性を減少させることにより、抗PDEオリゴヌクレオチドを改善させることにおいて相乗効果を示すことが予期せず発見された。例えば本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、予想外に高い有効性/毒性比を示す。
従って、一側面において、標的ホスホジエステラーゼ(PDE)に対するオリゴヌクレオチドが提供され、このオリゴヌクレオチドは、PDEをコードする核酸配列の少なくとも一部にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、ここで、
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドは2-アミノ-2’-デオキシアデノシン(DAP)であり、
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合は少なくとも3つの交互に存在するセグメントを含み、各セグメントが少なくとも1つのホスホロチオエート結合または少なくとも1つのホスホジエステル結合のいずれかからなる。
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドは2-アミノ-2’-デオキシアデノシン(DAP)であり、
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合は少なくとも3つの交互に存在するセグメントを含み、各セグメントが少なくとも1つのホスホロチオエート結合または少なくとも1つのホスホジエステル結合のいずれかからなる。
好ましくは、標的PDEは、PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A1、PDE7A2、PDE7A3、およびPDE7Bからなる群から選択され、好ましくはPDE7A、PDE4B、およびPDE4Dからなる群から選択される。
いくつかの実施態様において、ホスホロチオエート結合対ホスホジエステル結合の比は30:70〜70:30であり、好ましくは40:60〜60:40、45:55〜55:45、50:50である。
いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは標的PDEに対して少なくとも80%相補的であり、好ましくは100%相補的である。
オリゴヌクレオチドは好ましくは0.25より高い有効性/毒性比を示す。
いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、15〜25ヌクレオチドの長さであり、好ましくは18〜22ヌクレオチドの長さである。
一実施態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号1〜72からなる群から選択される塩基配列を有し、ここで、少なくとも1つのアデノシンはDAPにより置き換えられ、そして好ましくは配列番号1、33、36、41、および42である。
好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号81、86、90、92、95、97、99、101、103、105、114、119、121、123、125、および127のいずれか1つを含み、好ましくはこれらの配列番号のいずれか1つからなる。
さらなる一側面において、1つの本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドと薬学的に許容される担体とを含む薬学組成物が提供される。一実施態様において、薬学組成物は、好ましくはそれぞれPDE7AとPDE4B、またはPDE7AとPDE4Dに対する、少なくとも2つの本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施態様において、PDE4BまたはPDE4Dに対するオリゴヌクレオチドは、もう一方も下方制御する。
さらなる一側面において、本明細書に記載される薬学組成物は炎症の治療用に提供される。
さらなる一側面において、本明細書に記載される薬学組成物は、呼吸器疾患、好ましくは慢性閉塞性肺疾患、喘息、好酸球性咳嗽、気管支炎、移植肺の急性および慢性拒絶反応、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、副鼻腔炎、ウイルス感染症、または腫瘍性疾患のうちの少なくとも1つの治療用に提供される。
さらなる一側面において、本明細書に記載される薬学組成物を投与することを含む、対象における呼吸器疾患を治療する方法が提供される。
さらなる一側面において、呼吸器疾患の治療用の医薬の調製における、本明細書に記載される薬学組成物の使用が提供される。
さらなる一側面において、呼吸器疾患の治療のための本明細書に記載される薬学組成物の使用が提供される。
さらなる一側面において、配列番号1〜72のいずれか1つの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが提供され、ここで、好ましくは少なくとも1つのアデノシンがDAPで置き換えられている。
さらなる一側面において、配列番号1〜127のいずれか1つからなるオリゴヌクレオチドが提供される。
「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその両方から構成される分子を表す。この用語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのモノマーおよびポリマーを含み、ポリマーの場合は、5’から3’への結合を介してリボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドが互いに連結されている。しかしながら、結合は核酸合成技術において知られるあらゆる結合を含むことができ、例えば5’から2’への結合を含む核酸が含まれる。核酸分子において使用されるヌクレオチドは天然のものであってもいいし、あるいは、天然の塩基対とともに塩基対関係を形成することができる合成の類似体であってもよい。
「塩基」は、自然界に見出されるプリンおよびピリミジン塩基、すなわちアデニン(A)、チミン(T)、シトシン(C)、グアニン(G)、およびウラシル(U)のいずれかを含むだけでなく、それらのあらゆる修飾形態または類似形態をも含む。塩基対関係を形成することができる非天然塩基の例としては、アザおよびデアザピリミジン類似体、アザおよびデアザプリン類似体、ならびにその他の複素環式塩基類似体(そこでは、プリン環およびピリミジン環の1つ以上の環原子および/または官能基がヘテロ原子、例えば炭素、フッ素、窒素、酸素、硫黄等により置換されている)が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、そのような塩基としては、イノシン、5-メチルシトシン、2-チオチミン、4-チオチミン、7-デアザアデニン、9-デアザアデニン、3-デアザアデニン、7-デアザグアニン、9-デアザグアニン、6-チオグアニン、イソグアニン、2,6-ジアミノプリン、ヒポキサンチン、および、6-チオヒポキサンチンが含まれるが、これらに限定されない。塩基としてはまた、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、5-ヨードシトシン、イソシトシン、N4-メチルシトシン、5-ヨードウラシル、5-フルオロウラシル、4-チオウラシル、2-チオウラシル、(E)-5-(2-ブロモビニル)ウラシル、N6-メチルアデニン、2-クロロアデニン、2-フルオロアデニン、2-クロロアデニン、N6-シクロプロピル-2,6-ジアミノプリン、ニコチンアミド、2-アミノプリン、1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミドが含まれ得るが、これらに限定されない。
「核酸骨格」または「ヌクレオシド間結合」という用語は、本明細書で使用される場合、分子内でヌクレオチドを連結する化学部分の構造を表す。これには、ヌクレオチドを化学的に連結するあらゆる全ての手段により形成される構造が含まれ得る。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、約2〜約100ヌクレオチドの核酸分子を表し、2~80ヌクレオチド、4〜35ヌクレオチド、10〜30ヌクレオチド、15〜25ヌクレオチド、そして18〜22ヌクレオチドという順番で好適度が上昇する。
さらに、本発明に包含される実質的に同様の核酸配列は、本明細書に例示される配列、または、本明細書に開示されるヌクレオチド配列および本明細書に開示される核酸配列のいずれかと機能的に同等であるもののいずれかの一部分と、ストリンジェントな条件下(例えば0.5 x SSC、0.1 % SDS、60℃)でハイブリダイズすることができる能力によっても定義されることを当業者は認識する。ストリンジェンシー条件は、適度な類似性を有する断片(例えば遠い類縁関係にある生物からの相同的配列)から、高度な類似性を有する断片(例えば緊密な類縁関係にある生物の機能的酵素の複製である遺伝子)までをスクリーニングするために、調節することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄はストリンジェンシー条件を決定する。1組の好ましい条件は、室温で15分間の6 x SSC、0.5% SDSで洗浄を始めて、45℃で30分間の2 x SSC、0.5% SDSで洗浄を繰り返し、50℃で30分間の0.2 x SSC、0.5% SDSで洗浄を2回繰り返すという一連の洗浄を含む。高度にストリンジェントな条件のより好ましい組は、より高い温度の使用を含み、それは最後の2つの30分間、0.2 x SSC、0.5% SDSの洗浄の温度を60℃に上げる以外は上記と同じ洗浄である。非常に高いストリンジェンシーの条件のもう1つの好ましい組は、最後の2つの洗浄を0.1 x SSC、0.1% SDSで65℃にて行うものである。
「治療」、「治療すること」、「療法」等の用語は、本明細書では、所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを一般的に意味するために使用される。その効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に防止するという点で予防的なものであり得、ならびに/または、疾患の部分的なもしくは完全な治癒および/もしくは疾患に起因する有害作用の寛解という点で治療的なものであり得る。「治療」は、本明細書で使用される場合、前に定義されたように対象(特にヒト)の疾患のあらゆる治療を包含し、
(a)疾患の素因を有し得るがまだその疾患を有するとは診断されていない対象において、その疾患の発生を防止すること;
(b)疾患を阻止すること、すなわちその発達を抑止すること;または
(c)疾患を軽減させること、すなわち疾患の退縮を引き起こすこと
を含む。
(a)疾患の素因を有し得るがまだその疾患を有するとは診断されていない対象において、その疾患の発生を防止すること;
(b)疾患を阻止すること、すなわちその発達を抑止すること;または
(c)疾患を軽減させること、すなわち疾患の退縮を引き起こすこと
を含む。
「薬学的に許容される」という用語は、担体、賦形剤、界面活性剤、および組成物との関係で本明細書で使用される場合、対象患者の治療における使用を許容することができる物質であって、毒性であったり本明細書に記載されるいずれかの経路による投与にとって許容不可能であったりしないものを表す。
本発明の製剤は好ましくは作用部位に直接投与され、すなわち、好ましくは局所的なものであり、経口、頬内、肺内、経直腸、子宮内、腫瘍内、経鼻、髄腔内、吸入用、経皮、皮内、腔内、イオン注入用、経眼、経腟、関節腔内、オティカル(otical)、経粘膜、経直腸、徐放、または腸溶コーティング製剤を含み得るが、これらに限定されない。上記のいずれかを限定することなく、本発明の製剤は、頭蓋内、筋肉内、皮下、血管内、腺内、臓器内、リンパ管内、腹腔内、静脈内、および植え込み式でもあり得る。製剤において使用される担体は、例えば、固形状および/または液状担体であり得る。
呼吸器疾患を治療するための投与に適した組成物/製剤を得るために本オリゴヌクレオチド化合物と組み合わせることに適した他の担体については、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 17th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985を参照することができる。
任意で、本明細書に記述されるオリゴヌクレオチドは、様々な生理的担体分子とともに製剤し得る。本明細書に記述されるオリゴヌクレオチドはまた、標的細胞に入る能力を増強する分子と複合体を形成させてもよい。そのような分子の例としては、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、ペプチド、脂質、および細胞増殖にとって重要な分子が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドを脂質と組み合わせることができ、結果として得られるオリゴヌクレオチド/脂質エマルションまたはリポソーム懸濁物は、特にオリゴヌクレオチドのインビボ半減期を効果的に増加させ得る。
本明細書で提供される薬学組成物は、上記で説明したオリゴヌクレオチド化合物および1つ以上の薬学的に許容される界面活性剤を含み得る。適切な界面活性剤、または本発明のオリゴヌクレオチドの取込みを強化するための界面活性剤成分は、以前に米国出願公開公報第2003/0087845号において記述されており、この公報の内容は界面活性剤に関して本明細書に組み入れられる。この出願は、適切な界面活性剤には「合成および天然の、そして全長および切断形態のサーファクタント・タンパク質A、サーファクタントタンパク質B、サーファクタントタンパク質C、サーファクタントタンパク質D、およびサーファクタントタンパク質E、二飽和ホスファチジルコリン(ジパルミトイル以外)、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン;ホスファチジン酸、ユビキノン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、パルミトイル-リゾホスファチジルコリン、デヒドロエピアンドロステロン、ドリコール、スルファチジン酸(sulfatidic acid)、グリセロール-3-リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール、グリセロ-3-ホスホコリン、ジヒドロキシアセトン、パルミチン酸、シチジン二リン酸(CDP)ジアシルグリセロール、CDPコリン、コリン、コリンリン酸;さらには天然および合成のラメラ体(界面活性剤構成成分の天然の運搬媒体である)、オメガ3脂肪酸、ポリエン酸(polyenic acid)、ポリエン酸(polyenoic acid)、レシチン、パルミチン酸、エチレンもしくはプロピレンオキシドの非イオン性ブロック共重合、ポリオキシプロピレンのモノマーおよびポリマー、ポリオキシエチレンのモノマーおよびポリマー、デキストランおよび/もしくはアルカノイル側鎖を有するポリ(ビニルアミン)、Brij 35(登録商標)、Triton X-100(登録商標)、ならびに合成界面活性剤であるALEC(登録商標)、エキソサーフ(登録商標)、サーヴァン(登録商標)、およびアトバクオン(登録商標)等が含まれる、と述べている。これらの界面活性剤は製剤中において、単一成分界面活性剤もしくは複数成分界面活性剤の一部として、
または、AONの5’および/もしくは3’末端への共有結合付加物として使用され得る。
または、AONの5’および/もしくは3’末端への共有結合付加物として使用され得る。
本組成物のオリゴヌクレオチド成分は、脂質の粒子またはベシクル、例えばリポソームまたは微結晶内において薬学製剤に含有され得る。米国特許第6,025,339号に記載されているように、脂質粒子は、オリゴヌクレオチドが含有されさえすれば、単層または複数層など、いかなる適切な構造であってもよい。N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル-アンモニウムエチルスルフェートあるいは「DOTAP」のような正に荷電した脂質は、そのような粒子およびベシクルのために特に好ましい。そのような脂質粒子を調製することはよく知られている。例えばJanoffらの米国特許第4,880,635号、Kuronoらの米国特許第4,906,477号、Wallachの米国特許第4,911 ,928号、Wallachの米国特許第4,917,951号、Allenらの米国特許第4,920,016号、Wheatleyらの米国特許第4,921 ,757号等を参照されたい。
本発明の組成物は、オリゴヌクレオチド化合物を所望の部位(例えば肺)へ輸送するあらゆる手段により投与することができる。本明細書で開示されるオリゴヌクレオチド化合物は、あらゆる適切な手段によって患者の肺に投与され得るが、好ましくは、オリゴヌクレオチド化合物を含む呼吸可能粒子から構成されるエアロゾルの吸入により投与される。
オリゴヌクレオチドは、ドライパウダー吸入器、定量式吸入器、噴霧吸入器、ソフトミスト吸入器、および、吸入ルートで肺にオリゴヌクレオチドを送達する能力を有するその他の適切な装置において投与されるように製剤され得る。
本発明の組成物は、呼吸可能なサイズの粒子、例えば吸入された際に鼻、口、喉頭を通過し肺の気管支および肺胞を通過するために十分に小さいサイズである粒子を含む製剤として、呼吸器系に投与され得る。一般的に、呼吸可能な粒子は約0.5〜10ミクロンの範囲のサイズである。エアロゾルに含まれる呼吸不可能なサイズの粒子は、咽頭中に沈着して嚥下される傾向にあり、従ってエアロゾル中の呼吸不可能な粒子の量は好ましくは最小限にする。経鼻投与のためには、鼻腔内に維持されること確実にするために、10〜500μΜの範囲の粒子サイズが好ましい。
オリゴヌクレオチド化合物を含む固体粒子組成物は、エアロゾルの形成を促進することに役立つ分散剤およびその他の治療化合物を任意で含み得る。1つの適切な分散剤はラクトースであり、これはあらゆる適切な比率(例えば重量にして1対1の比率)でアンチセンス化合物と混合することができる。
エアロゾルを産生するための、活性化合物(1つまたは複数のオリゴヌクレオチド化合物)の液体薬学組成物は、オリゴヌクレオチド化合物を適切な媒体(例えば発熱物質非含有滅菌水またはリン酸緩衝食塩水)と組み合わせることにより調製することができる。
オリゴヌクレオチド化合物を含有する液体粒子のエアロゾルは、あらゆる適切な手段により産生することができ、例えば噴霧器を用いて産生することができる。噴霧器は、圧縮されたガス(通常は空気もしくは酸素)を狭いベンチュリ開口部を通して加速させること、または超音波撹拌のいずれかによって、活性成分の溶液または懸濁液を治療用エアロゾル噴霧に変換する、市販されている装置である。噴霧器における使用のための適切な製剤は、液状担体中に活性オリゴヌクレオチド成分を、最大で組成物の40% w/wの量で、好ましくは組成物の20% w/w未満の量で含む。担体は通常は水または希釈アルコール水溶液であり、好ましくは、例えば塩化ナトリウムの添加により体液と等張にされる。任意添加物としては、製剤が無菌状態で調製されない場合には例えばヒドロキシ安息香酸メチルのような保存剤、抗酸化剤、抗細菌剤、香料、揮発油、緩衝剤、および乳化剤、ならびにその他の製剤用界面活性剤が挙げられる。
1つまたは複数の活性オリゴヌクレオチド化合物および薬学的に許容される界面活性剤を含む固体粒子のエアロゾルは、同様に、あらゆる固体粒子薬物エアロゾル発生装置を用いて産生し得る。対象に固体粒子薬物を投与するためのエアロゾル発生装置は、上記で説明したような呼吸可能な粒子を産生し、事前に定められた定投与量の薬物を含む一定体積のエアロゾルを、ヒトへの投与に適した速度で産生する。活性オリゴヌクレオチド成分は通常は製剤の0.1〜100 w/wを構成する。例示的なエアロゾル発生装置の第2の種類は、定量吸入器を含む。定量吸入器は、加圧エアロゾルディスペンサーであり、通常は液状化された噴霧剤中に活性成分の懸濁液製剤または溶液製剤を含む。使用にあたりこれらの装置は、計量された体積(通常は10〜150μL)を送達するように調節された弁を通して製剤を放出し、活性成分を含む微細粒子の噴霧を産生する。適切な噴霧剤としては、ある種のクロロフルオロカーボン化合物、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、またはヒドロフルオロアルカン、およびこれらの混合物が挙げられる。製剤は、1つ以上の共溶媒(例えばエタノール)、乳化剤およびその他の製剤用界面活性剤(例えばオレイン酸またはトリオレイン酸ソルビタン)、抗酸化剤、ならびに適切な香味料を追加的に含み得る。
エアロゾルは、固体粒子または液体粒子のいずれから形成されるかに関わらず、1分間あたり約1〜150リットルの速度でエアロゾル発生装置により産生され得る。
本発明は、実施例を参照することによってより容易に理解されるが、実施例は以下の発明を説明するために提供されるのであって、その範囲を限定するものではない。
[方法]
細胞培養
A549細胞(ヒト肺癌腫;ATCC;#CCL-185)は、10% FBS、100 U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンを含むハムF12培地中で培養した。Flp-In T-Rex 293細胞(ヒト形質転換胚性腎細胞;インビトロジェン社;#R780-07)は、10% FBS、ペニシリン100 U/mL、およびストレプトマイシン100μg/mLを含むDMEM中で培養した。NHBE初代細胞(正常ヒト気管支上皮;シーダーレーン社;#CC-2540)は、2 ml BPE、0.5 mLヒドロコルチゾン、0.5 mL hEGF、0.5 mLエピネフリン、0.5 mLトランスフェリン、0.5 mLインスリン、0.5 mLレチノイン酸、0.5 mLトリヨードチロニンで補足されたBEBM培地(500 mL)(シーダーレーン社、カタログ# CC-3170)中で培養した。CYNOM-K1細胞(カニクイザル皮膚胚性;ECACC;#90071809)は、10% FBS、2 mM L-グルタミン、1% 非必須アミノ酸、100 U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンを含むEMEM(EBSS)培地中で培養した。L2細胞(ラット肺上皮;ATCC;#CRL-149)は、10% FBS、ペニシリン100 U/mL、およびストレプトマイシン100μg/mLを含むF12K培地中で培養した。NIH3T3細胞(マウス線維芽細胞;ATCC;#CRL-1658)は、10% BCS、ペニシリン100 U/mL、およびストレプトマイシン100μg/mLを含むDMEM培地中で培養した。RAW264.7細胞(白血病単球マクロファージ;ATCC;# TIB-71)は、10% FBS、1 mMピルビン酸ナトリウム、ペニシリン100 U/mL、およびストレプトマイシン100μg/mLを含むDMEM培地中で培養した。ヒト末梢血単核球(PBMC)は健常なボランティアから得た。PBMCは、正常なドナー由来のEDTA K3血液のフィコール・ハイパック密度勾配遠心分離により単離した。PBMCは、48ウェル・プレートにおいてAIM-V培地中で0.2×106細胞/200μLにて蒔いた(浮遊細胞について)。TF-1細胞(赤白血病)は、2 mM L-グルタミン、10 mM HEPES、4.5g/Lグルコース、1.5 g/L炭酸水素ナトリウム、1 mMピルビン酸ナトリウム、10% 非不活性化FBS、および2 ng/mL rhGM-CSFで補足されたRPMI-1640中で維持した。
細胞培養
A549細胞(ヒト肺癌腫;ATCC;#CCL-185)は、10% FBS、100 U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンを含むハムF12培地中で培養した。Flp-In T-Rex 293細胞(ヒト形質転換胚性腎細胞;インビトロジェン社;#R780-07)は、10% FBS、ペニシリン100 U/mL、およびストレプトマイシン100μg/mLを含むDMEM中で培養した。NHBE初代細胞(正常ヒト気管支上皮;シーダーレーン社;#CC-2540)は、2 ml BPE、0.5 mLヒドロコルチゾン、0.5 mL hEGF、0.5 mLエピネフリン、0.5 mLトランスフェリン、0.5 mLインスリン、0.5 mLレチノイン酸、0.5 mLトリヨードチロニンで補足されたBEBM培地(500 mL)(シーダーレーン社、カタログ# CC-3170)中で培養した。CYNOM-K1細胞(カニクイザル皮膚胚性;ECACC;#90071809)は、10% FBS、2 mM L-グルタミン、1% 非必須アミノ酸、100 U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンを含むEMEM(EBSS)培地中で培養した。L2細胞(ラット肺上皮;ATCC;#CRL-149)は、10% FBS、ペニシリン100 U/mL、およびストレプトマイシン100μg/mLを含むF12K培地中で培養した。NIH3T3細胞(マウス線維芽細胞;ATCC;#CRL-1658)は、10% BCS、ペニシリン100 U/mL、およびストレプトマイシン100μg/mLを含むDMEM培地中で培養した。RAW264.7細胞(白血病単球マクロファージ;ATCC;# TIB-71)は、10% FBS、1 mMピルビン酸ナトリウム、ペニシリン100 U/mL、およびストレプトマイシン100μg/mLを含むDMEM培地中で培養した。ヒト末梢血単核球(PBMC)は健常なボランティアから得た。PBMCは、正常なドナー由来のEDTA K3血液のフィコール・ハイパック密度勾配遠心分離により単離した。PBMCは、48ウェル・プレートにおいてAIM-V培地中で0.2×106細胞/200μLにて蒔いた(浮遊細胞について)。TF-1細胞(赤白血病)は、2 mM L-グルタミン、10 mM HEPES、4.5g/Lグルコース、1.5 g/L炭酸水素ナトリウム、1 mMピルビン酸ナトリウム、10% 非不活性化FBS、および2 ng/mL rhGM-CSFで補足されたRPMI-1640中で維持した。
アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)の調製
ホスホロチオエートDNA(PS-DNA)AON(シグマ社ジェノシス)、ホスホロチオエートFANA(PS-FANA)AON(トピジェン社、モントリオールまたはUCDNA、カルガリー)、DAP、P2M、およびP2M-DAPのAON(バイオスプリング社、ドイツ)、2’-OMe AON(バイオスプリング社、ドイツ)、またはロック核酸(LNA)AON(エクシコン社、米国)は、滅菌水に再懸濁し、インビトロ・トランスフェクションのためにOpti-MEM中に希釈するか、またはインビボ実験のためにPBS中に希釈した。
ホスホロチオエートDNA(PS-DNA)AON(シグマ社ジェノシス)、ホスホロチオエートFANA(PS-FANA)AON(トピジェン社、モントリオールまたはUCDNA、カルガリー)、DAP、P2M、およびP2M-DAPのAON(バイオスプリング社、ドイツ)、2’-OMe AON(バイオスプリング社、ドイツ)、またはロック核酸(LNA)AON(エクシコン社、米国)は、滅菌水に再懸濁し、インビトロ・トランスフェクションのためにOpti-MEM中に希釈するか、またはインビボ実験のためにPBS中に希釈した。
細胞のAONトランスフェクション
A549細胞は、10%血清で補足され抗生物質を含まないHAM-F12培地中で0.25×106細胞/mL(48ウェルプレート中でウェルあたり200μL)にて播種し、それから37℃で一晩インキュベートした後に、AON/リポフェクタミン複合体(1μg AON:1μL リポフェクタミン2000の比率)でトランスフェクトした。Flp-In T-Rex 293細胞は、10%血清で補足され抗生物質を含まないDMEM培地中で0.9×106細胞/mL(48ウェルプレート中でウェルあたり200μL)にて播種し、それから37℃で一晩インキュベートした後に、上記のようにトランスフェクトした。NHBE細胞は、抗生物質を含まないBEBM完全培地中で0.5×106細胞/mL(48ウェルプレート中でウェルあたり200μL)にて24時間播種した後に、上記のようにトランスフェクトした。L2細胞は、10%血清で補足され抗生物質を含まないF12K培地中で1.75×106細胞/mL(24ウェルプレート中でウェルあたり400μL)にて播種し、それから37℃で一晩インキュベートした後に、上記のようにトランスフェクトした。CYNOM-K1細胞は、10%血清で補足され抗生物質を含まないEMEM培地中で0.25×106細胞/mL(48ウェルプレート中でウェルあたり200μL)にて播種し、それから37℃で一晩インキュベートした後に、AON/リポフェクタミン複合体(1μg AON:2μL リポフェクタミン2000の比率)でトランスフェクトした。
A549細胞は、10%血清で補足され抗生物質を含まないHAM-F12培地中で0.25×106細胞/mL(48ウェルプレート中でウェルあたり200μL)にて播種し、それから37℃で一晩インキュベートした後に、AON/リポフェクタミン複合体(1μg AON:1μL リポフェクタミン2000の比率)でトランスフェクトした。Flp-In T-Rex 293細胞は、10%血清で補足され抗生物質を含まないDMEM培地中で0.9×106細胞/mL(48ウェルプレート中でウェルあたり200μL)にて播種し、それから37℃で一晩インキュベートした後に、上記のようにトランスフェクトした。NHBE細胞は、抗生物質を含まないBEBM完全培地中で0.5×106細胞/mL(48ウェルプレート中でウェルあたり200μL)にて24時間播種した後に、上記のようにトランスフェクトした。L2細胞は、10%血清で補足され抗生物質を含まないF12K培地中で1.75×106細胞/mL(24ウェルプレート中でウェルあたり400μL)にて播種し、それから37℃で一晩インキュベートした後に、上記のようにトランスフェクトした。CYNOM-K1細胞は、10%血清で補足され抗生物質を含まないEMEM培地中で0.25×106細胞/mL(48ウェルプレート中でウェルあたり200μL)にて播種し、それから37℃で一晩インキュベートした後に、AON/リポフェクタミン複合体(1μg AON:2μL リポフェクタミン2000の比率)でトランスフェクトした。
NIH 3T3細胞は、10%血清で補足され抗生物質を含まないDMEM培地中で0.25×106細胞/mL(48ウェルプレート中でウェルあたり200μL)にて播種し、それから37℃で一晩インキュベートした後に、AON/リポフェクタミン複合体(1μg AON:3μL リポフェクタミン2000の比率)でトランスフェクトした。TF-1細胞は、トランスフェクションの前日に、その翌日に0.6〜0.8×106細胞/mLの密度に達するように希釈した。トランスフェクションの当日、12ウェル・プレートにおいて、抗生物質を含まない400μLの培地中で0.5×106細胞/ウェルの密度で細胞を播種し、それから、1μg核酸:1μl脂質の比率に従ってリポフェクタミン2000トランスフェクション試薬と混合されたAONを用いて、トランスフェクションを行なった。この複合体を20分間インキュベートしてから細胞に加え、37℃、5% CO2にて24時間処理した。
RNA抽出
RNAは、キアゲン社のQia Vac 24マニフォールドを用いてRNAeasyミニキット・プロトコールに従って細胞ペレットから抽出し、キアゲン社の手順に従ってDNaseで処理した。リボグリーン試薬を用いて製造会社(インビトロジェン)のプロトコールに従ってRNAを定量化した。
RNAは、キアゲン社のQia Vac 24マニフォールドを用いてRNAeasyミニキット・プロトコールに従って細胞ペレットから抽出し、キアゲン社の手順に従ってDNaseで処理した。リボグリーン試薬を用いて製造会社(インビトロジェン)のプロトコールに従ってRNAを定量化した。
逆転写(RT)
第一鎖cDNAの調製は、RT-PCRキット(インビトロジェン社)用のスーパースクリプト第一鎖合成システムを使用して、20μLの総反応体積にて行った。1μgのRNAを、0.5 mMの各dNTP、0.5μgのオリゴ(dT)18、2 pmolのPDE4B遺伝子特異的リバースプライマー(5’-tctttgtctccctgctgga-3’)とともに65℃で5分間まず変性させ、氷上で少なくとも1分間冷却した。この混合物を42℃で2分間インキュベートし、1×第一鎖バッファー、10 mM DTT、および40ユニットのスーパースクリプトII RTを含む第2の事前混合物を添加した。反応は、42℃で10分間、50℃で1時間インキュベートし、70℃で15分間加熱することにより不活性化した。
第一鎖cDNAの調製は、RT-PCRキット(インビトロジェン社)用のスーパースクリプト第一鎖合成システムを使用して、20μLの総反応体積にて行った。1μgのRNAを、0.5 mMの各dNTP、0.5μgのオリゴ(dT)18、2 pmolのPDE4B遺伝子特異的リバースプライマー(5’-tctttgtctccctgctgga-3’)とともに65℃で5分間まず変性させ、氷上で少なくとも1分間冷却した。この混合物を42℃で2分間インキュベートし、1×第一鎖バッファー、10 mM DTT、および40ユニットのスーパースクリプトII RTを含む第2の事前混合物を添加した。反応は、42℃で10分間、50℃で1時間インキュベートし、70℃で15分間加熱することにより不活性化した。
リアルタイムPCR
PCR反応混合物は、3μLのcDNA反応物を用いて、0.4 mMの各PCRプライマーおよび4μLのLCファストスタートDNAマスターSYBRグリーン1プラスの存在下で20μLの総体積にて実施した。ステップ1(変性):95℃、10分(勾配20℃/秒);ステップ2(サイクル×40):95℃、(勾配20℃/秒);57℃または59℃、5秒(勾配20℃/秒)72℃、10秒(勾配20℃/秒);ステップ3(融解曲線):95℃、(勾配20℃/秒);70℃、30秒(勾配20℃/秒);95℃、0秒(勾配0,1℃/秒);ステップ4(冷却):40℃、30秒(勾配20℃/秒)
PCR反応混合物は、3μLのcDNA反応物を用いて、0.4 mMの各PCRプライマーおよび4μLのLCファストスタートDNAマスターSYBRグリーン1プラスの存在下で20μLの総体積にて実施した。ステップ1(変性):95℃、10分(勾配20℃/秒);ステップ2(サイクル×40):95℃、(勾配20℃/秒);57℃または59℃、5秒(勾配20℃/秒)72℃、10秒(勾配20℃/秒);ステップ3(融解曲線):95℃、(勾配20℃/秒);70℃、30秒(勾配20℃/秒);95℃、0秒(勾配0,1℃/秒);ステップ4(冷却):40℃、30秒(勾配20℃/秒)
各遺伝子について用いられたPCRプライマー配列は表6に記載する。PCR産物の定量化はレルクォントプログラム(ロシュ社)を使用して行った。
クォンティジーン・アッセイ
細胞を回収し、クォンティジーン(登録商標)2.0キット(アフィメトリックス社)の1×溶解混合液中において55℃で30分間溶解した。細胞溶解物を、クォンティジーン(登録商標)2.0捕捉プレート中において、特異的プローブセットの存在下で55℃で一晩ハイブリダイズさせ、mRNAシグナルを増幅し(55℃にて)、検出した(50℃にて)。mRNA発現は、ルミノスキャンを使用して発光シグナルにより線形的に定量化した。
細胞を回収し、クォンティジーン(登録商標)2.0キット(アフィメトリックス社)の1×溶解混合液中において55℃で30分間溶解した。細胞溶解物を、クォンティジーン(登録商標)2.0捕捉プレート中において、特異的プローブセットの存在下で55℃で一晩ハイブリダイズさせ、mRNAシグナルを増幅し(55℃にて)、検出した(50℃にて)。mRNA発現は、ルミノスキャンを使用して発光シグナルにより線形的に定量化した。
タンパク質定量化
β鎖またはCCR3タンパク質の測定のために、TF-1をトランスフェクションの24時間後に回収し、PBSで2回洗浄し、エオタキシン-ビオチンまたはIL-3-ビオチンとともに4℃で1時間インキュベートした。それからアビジン-FITCを加え、細胞を4℃で30分間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド中で固定した後にフローサイトメトリー解析を行った。
β鎖またはCCR3タンパク質の測定のために、TF-1をトランスフェクションの24時間後に回収し、PBSで2回洗浄し、エオタキシン-ビオチンまたはIL-3-ビオチンとともに4℃で1時間インキュベートした。それからアビジン-FITCを加え、細胞を4℃で30分間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド中で固定した後にフローサイトメトリー解析を行った。
インビトロ機能アッセイ
NHBE細胞は、トランスフェクション時間の最後に10 ng/mLのサイトミックス(TNF-α+IL-1β+IFN-γ)で4時間刺激した。A549細胞は、トランスフェクション時間の最後に10 ng/mLのIL-1βで6時間刺激した。炎症マーカーのmRNA発現はリアルタイムPCRにより解析した。タンパク質分泌は、マルチプレックスELISA(サーチライト・サービス、オーション社)により細胞上清中において測定し、アラマーブルー・アッセイにより測定される細胞生存率で標準化した。
NHBE細胞は、トランスフェクション時間の最後に10 ng/mLのサイトミックス(TNF-α+IL-1β+IFN-γ)で4時間刺激した。A549細胞は、トランスフェクション時間の最後に10 ng/mLのIL-1βで6時間刺激した。炎症マーカーのmRNA発現はリアルタイムPCRにより解析した。タンパク質分泌は、マルチプレックスELISA(サーチライト・サービス、オーション社)により細胞上清中において測定し、アラマーブルー・アッセイにより測定される細胞生存率で標準化した。
インビトロ免疫刺激アッセイ
RAW264.7細胞は、24ウェル・プレートにおいて、抗生物質を含まない完全培地中で0.13×106細胞/mLにて播種し、AON配列または対照CpG免疫賦活性配列の存在下で24時間インキュベートした。PBMCは、48ウェル・プレートにおいて、抗生物質を含まないAIM-V培地中で1×106細胞/mLにて播種し、上記と同様に処理した。処理後、培養上清を回収し、製造会社の説明書に従ってELISAによってタンパク質含量をアッセイした。
RAW264.7細胞は、24ウェル・プレートにおいて、抗生物質を含まない完全培地中で0.13×106細胞/mLにて播種し、AON配列または対照CpG免疫賦活性配列の存在下で24時間インキュベートした。PBMCは、48ウェル・プレートにおいて、抗生物質を含まないAIM-V培地中で1×106細胞/mLにて播種し、上記と同様に処理した。処理後、培養上清を回収し、製造会社の説明書に従ってELISAによってタンパク質含量をアッセイした。
マウス肺における半減期の決定
CD-1オスマウス(25〜30 g、チャールス・リバー社)は、処置開始の約1週間前に動物施設(ミスプロ社、モントリオール、カナダ)に順化させた。マウスはイソフルラン(またはt=0 hの時点におけるケタミン/キシラジン)で麻酔し、挿管した。マイクロ噴霧器(ペンセンチュリー社)を使用してAONのエアロゾル(0.2 mg/kg)を気管に投与した。AONの送達の直後(時間=0 h)、または送達後の様々な時点において(時間=2 h、8 h、16 h、24 h、48 h、72 h、および144 h)、ケタミン/キシラジンを使用してマウスを犠牲にした。肺を摘出して、液体窒素中で急速凍結して、組織ホモジネートを調製するときまで-80℃にて保存した。肺組織は溶解バッファー中でホモジェナイズし、遠心分離し、得られた上清を急速凍結した。ハイブリダイゼーション酵素結合免疫吸着アッセイ(H-ELISA)法を使用して、特異的プローブセットを用いた各AONの定量化を実施した。マウス肺組織ホモジネートをマトリックスとして使用して各AONについて標準曲線を調製した。
CD-1オスマウス(25〜30 g、チャールス・リバー社)は、処置開始の約1週間前に動物施設(ミスプロ社、モントリオール、カナダ)に順化させた。マウスはイソフルラン(またはt=0 hの時点におけるケタミン/キシラジン)で麻酔し、挿管した。マイクロ噴霧器(ペンセンチュリー社)を使用してAONのエアロゾル(0.2 mg/kg)を気管に投与した。AONの送達の直後(時間=0 h)、または送達後の様々な時点において(時間=2 h、8 h、16 h、24 h、48 h、72 h、および144 h)、ケタミン/キシラジンを使用してマウスを犠牲にした。肺を摘出して、液体窒素中で急速凍結して、組織ホモジネートを調製するときまで-80℃にて保存した。肺組織は溶解バッファー中でホモジェナイズし、遠心分離し、得られた上清を急速凍結した。ハイブリダイゼーション酵素結合免疫吸着アッセイ(H-ELISA)法を使用して、特異的プローブセットを用いた各AONの定量化を実施した。マウス肺組織ホモジネートをマトリックスとして使用して各AONについて標準曲線を調製した。
肺炎症のげっ歯類モデル
すべての動物実験について、本研究で使用されたマウス(オスC57BI/6、チャールス・リバー・ラボラトリー社)の収容設備および飼育は、カナダ国動物管理評議会(CCAC)ガイドラインに適合した、ミスプロバイオテクの施設動物管理・使用委員会により承認されたプロトコールに従って提供された。第1〜5日目および第8〜12日目に、マウスのいくつかの群をイソフルランで麻酔し、挿管した。マイクロ噴霧器(ペンセンチュリー社)を使用して、媒体(エンドトキシン非含有PBS)またはAONのエアロゾルを気管に投与した。最後の処置の24時間後に気管支肺胞洗浄検査(BAL)を実施し、標準的な形態学的判断基準を用いて少なくとも300個の細胞について差次的細胞計数を決定した。肺組織を回収し、ホルマリンで固定し、パラフィン切片を調製した。ヘマトキシリンとエオシンで染色したスライドについて組織病理学的な評価を行なった。
すべての動物実験について、本研究で使用されたマウス(オスC57BI/6、チャールス・リバー・ラボラトリー社)の収容設備および飼育は、カナダ国動物管理評議会(CCAC)ガイドラインに適合した、ミスプロバイオテクの施設動物管理・使用委員会により承認されたプロトコールに従って提供された。第1〜5日目および第8〜12日目に、マウスのいくつかの群をイソフルランで麻酔し、挿管した。マイクロ噴霧器(ペンセンチュリー社)を使用して、媒体(エンドトキシン非含有PBS)またはAONのエアロゾルを気管に投与した。最後の処置の24時間後に気管支肺胞洗浄検査(BAL)を実施し、標準的な形態学的判断基準を用いて少なくとも300個の細胞について差次的細胞計数を決定した。肺組織を回収し、ホルマリンで固定し、パラフィン切片を調製した。ヘマトキシリンとエオシンで染色したスライドについて組織病理学的な評価を行なった。
ラット実験は、ITRラボラトリーズ・カナダ(ベ・デュルフェ、ケベック)において、GLP規則を遵守して実施した。手短に述べると、オスとメスのスプラーグ・ドーリー・ラットに、媒体または5 mg/kgのTOP004/TOP005もしくはTOP006/TOP007(食塩水中1:1 w/wの比率)の14回の連続的な投与量を、吸入曝露システムを使用してエアロゾルとして日毎に投与した。動物は、食物摂取の質的評価を含む臨床的症状について毎日1〜2回検査し、体重を週毎に測定した。実験前および第14日目の動物について、心電図(ECG)活性を記録し、眼科的検査を行なった。
最後の投与の1日後(第15日目)、ラット(8匹/性別/群)を安楽死させた。最終手順には、完全な死体解剖肉眼検査、40ほどの組織の回収および保存、ならびに全ての主要臓器の重量の測定が含まれた。全ての動物からの気道組織(鼻腔、鼻咽頭、喉頭、咽頭、気管、気管支、気管分岐部を含む肺、および気管支リンパ節)を光学顕微鏡で検査し、全ての高投与量群および対照群の動物については全ての回収された組織を検査した。
リポ多糖(LPS)誘発性肺炎症のマウスモデル
第1日目に、いくつかの群のマウスをイソフルランで麻酔し、挿管した。マイクロ噴霧器(ペンセンチュリー社)を使用して、媒体(エンドトキシン非含有PBS)、AON、または対照のエアロゾルを気管に投与した。第1日目に、他の群のマウスを媒体(0.5%メチルセルロース)またはロフルミラスト(ラサヤン社)を用いた強制栄養により処置した。薬剤処置の1時間後、プレキシガラスのチャンバー内でマウスを食塩水またはLPS(0.04 mg/mL)に15分間晒した。負荷の3時間後にBALを実施し、標準的な形態学的判断基準を用いて少なくとも300個の細胞について差次的細胞計数を決定した。
第1日目に、いくつかの群のマウスをイソフルランで麻酔し、挿管した。マイクロ噴霧器(ペンセンチュリー社)を使用して、媒体(エンドトキシン非含有PBS)、AON、または対照のエアロゾルを気管に投与した。第1日目に、他の群のマウスを媒体(0.5%メチルセルロース)またはロフルミラスト(ラサヤン社)を用いた強制栄養により処置した。薬剤処置の1時間後、プレキシガラスのチャンバー内でマウスを食塩水またはLPS(0.04 mg/mL)に15分間晒した。負荷の3時間後にBALを実施し、標準的な形態学的判断基準を用いて少なくとも300個の細胞について差次的細胞計数を決定した。
タバコ煙誘発性肺炎症のマウスモデル
第1日目、3日目、6日目、および8日目において、または第6日目および8日目だけにおいて、いくつかの群のマウスをケタミンおよびキシラジン(60 mg/kgおよび12 mg/kg、i.p.)で麻酔し、挿管した。マイクロ噴霧器(ペンセンチュリー社)を使用して、媒体(エンドトキシン非含有PBS)、AON、または対照のエアロゾルを気管に投与した。第6〜9日目において、他の群のマウスを媒体(0.5%メチルセルロース)またはロフルミラスト(ラサヤン社)を用いた強制栄養により処置した。第6〜9日目において(薬剤処置の3時間後)、1日あたり2本の2R4f基準タバコ(ケンタッキー大学)の煙にマウスを鼻だけ晒した。タバコの煙は、鼻だけ曝露システム(プロトワークス社)を使用して、1分間あたりひと吹き(20 ml)の速度でマウスに送達した。最後の煙曝露の18〜24時間後にBALを実施し、標準的な形態学的判断基準を用いて少なくとも300個の細胞について差次的細胞計数を決定した。
第1日目、3日目、6日目、および8日目において、または第6日目および8日目だけにおいて、いくつかの群のマウスをケタミンおよびキシラジン(60 mg/kgおよび12 mg/kg、i.p.)で麻酔し、挿管した。マイクロ噴霧器(ペンセンチュリー社)を使用して、媒体(エンドトキシン非含有PBS)、AON、または対照のエアロゾルを気管に投与した。第6〜9日目において、他の群のマウスを媒体(0.5%メチルセルロース)またはロフルミラスト(ラサヤン社)を用いた強制栄養により処置した。第6〜9日目において(薬剤処置の3時間後)、1日あたり2本の2R4f基準タバコ(ケンタッキー大学)の煙にマウスを鼻だけ晒した。タバコの煙は、鼻だけ曝露システム(プロトワークス社)を使用して、1分間あたりひと吹き(20 ml)の速度でマウスに送達した。最後の煙曝露の18〜24時間後にBALを実施し、標準的な形態学的判断基準を用いて少なくとも300個の細胞について差次的細胞計数を決定した。
[実施例1:ヒトPDE7Aに対するAONの有効性]
ホスホジエステラーゼ(PDE)アイソフォーム7Aに対するAONの配列を表1に示す。いくつかの選ばれたホスホロチオエート(PS)AON配列(PS-DNA)の効力が図1において実証されており、この図は、Flp-In T-Rex 293細胞株において、示されているAON配列のトランスフェクション後に遺伝子発現が減少したことを示している。これらの選ばれたAON配列の特異性は、それらがPDE7A mRNAレベルを減少させる効力を、対照センス配列TOP1731s(配列番号128)の効果と比較することにより評価した。表1に列挙するAON比較活性は、未トランスフェクション対照(Ctrl NT)に対する相対的なPDE7A mRNAの平均パーセンテージ阻害として表している。
ホスホジエステラーゼ(PDE)アイソフォーム7Aに対するAONの配列を表1に示す。いくつかの選ばれたホスホロチオエート(PS)AON配列(PS-DNA)の効力が図1において実証されており、この図は、Flp-In T-Rex 293細胞株において、示されているAON配列のトランスフェクション後に遺伝子発現が減少したことを示している。これらの選ばれたAON配列の特異性は、それらがPDE7A mRNAレベルを減少させる効力を、対照センス配列TOP1731s(配列番号128)の効果と比較することにより評価した。表1に列挙するAON比較活性は、未トランスフェクション対照(Ctrl NT)に対する相対的なPDE7A mRNAの平均パーセンテージ阻害として表している。
[実施例2:ヒトPDE4DおよびPDE4Bに対するAONの有効性]
PDEのアイソフォーム4Dおよび4Bに対するAONの配列を表2に示す。いくつかの選ばれたPS-DNA AON配列の効力が図2において実証されており、この図は、Flp-In T-Rex 293細胞株において、示されているAON配列のトランスフェクション後に遺伝子発現が減少したことを示している。これらの選ばれたAON配列の特異性は、それらがPDE4D(図2A)およびPDE4B(図2B)のmRNAレベルを減少させる効力を、対照センス配列TOP1572s(配列番号131)の効果と比較することにより評価した。表2に列挙するAON比較活性は、未トランスフェクション対照に対する相対的なPDE4DおよびPDE4BのmRNAの平均パーセンテージ阻害として表している。
PDEのアイソフォーム4Dおよび4Bに対するAONの配列を表2に示す。いくつかの選ばれたPS-DNA AON配列の効力が図2において実証されており、この図は、Flp-In T-Rex 293細胞株において、示されているAON配列のトランスフェクション後に遺伝子発現が減少したことを示している。これらの選ばれたAON配列の特異性は、それらがPDE4D(図2A)およびPDE4B(図2B)のmRNAレベルを減少させる効力を、対照センス配列TOP1572s(配列番号131)の効果と比較することにより評価した。表2に列挙するAON比較活性は、未トランスフェクション対照に対する相対的なPDE4DおよびPDE4BのmRNAの平均パーセンテージ阻害として表している。
[実施例3:ヒトAON配列が異なる種でPDE mRNAレベルを減少させる効力]
ヒトPDE遺伝子を標的とするいくつかの選ばれたAON配列は、他の種由来のPDE遺伝子配列、具体的にはマウス、ラット、およびサルの配列との相同性が最大限になるように設計された。表3は、選ばれたAON配列の、これら異なる種間の配列相同性およびミスマッチ数を記述している。図3は、マウス細胞株であるNIH 3T3における、24時間のトランスフェクション後の、いくつかの選ばれたAON(PDE7A;TOP1731(配列番号1)、TOP1731-P2M-7-DAP(配列番号86)、TOP1769(配列番号33)、TOP1769-P2M-7-DAP(配列番号95)、TOP1777(配列番号41)、TOP1777-P2M-7-DAP(配列番号101)、TOP2707-F3(配列番号134);PDE4B/4D、TOP1572(配列番号42)、TOP1572-P2M-7-DAP(配列番号119)、TOP2804-F1(配列番号137))によるPDE7A(図3A)、PDE4D(図3B)、およびPDE4B(図3C)のmRNAレベルの特異的減少を示す。選ばれたAON配列の阻害活性は、L2細胞におけるラットPDE mRNAに対して(図4A〜C)、およびCYNOM-K1細胞におけるサルPDE mRNAに対して(図5A〜C)も観察された。
ヒトPDE遺伝子を標的とするいくつかの選ばれたAON配列は、他の種由来のPDE遺伝子配列、具体的にはマウス、ラット、およびサルの配列との相同性が最大限になるように設計された。表3は、選ばれたAON配列の、これら異なる種間の配列相同性およびミスマッチ数を記述している。図3は、マウス細胞株であるNIH 3T3における、24時間のトランスフェクション後の、いくつかの選ばれたAON(PDE7A;TOP1731(配列番号1)、TOP1731-P2M-7-DAP(配列番号86)、TOP1769(配列番号33)、TOP1769-P2M-7-DAP(配列番号95)、TOP1777(配列番号41)、TOP1777-P2M-7-DAP(配列番号101)、TOP2707-F3(配列番号134);PDE4B/4D、TOP1572(配列番号42)、TOP1572-P2M-7-DAP(配列番号119)、TOP2804-F1(配列番号137))によるPDE7A(図3A)、PDE4D(図3B)、およびPDE4B(図3C)のmRNAレベルの特異的減少を示す。選ばれたAON配列の阻害活性は、L2細胞におけるラットPDE mRNAに対して(図4A〜C)、およびCYNOM-K1細胞におけるサルPDE mRNAに対して(図5A〜C)も観察された。
[実施例4:P2M修飾とDAP修飾の両方を有するAONは標的mRNAノックダウンの効力の増加を示した]
この実施例は、AONの化学にP2M修飾およびDAP修飾を組み入れた場合における、様々なmRNA標的に対する特異的AONの効力の増強に関する。表4a〜4dおよび10a〜10bは、DAP残基およびP2M結合により修飾されたAONの組成を記述する。
この実施例は、AONの化学にP2M修飾およびDAP修飾を組み入れた場合における、様々なmRNA標的に対する特異的AONの効力の増強に関する。表4a〜4dおよび10a〜10bは、DAP残基およびP2M結合により修飾されたAONの組成を記述する。
選ばれたPS AON配列の全てのアデノシン塩基を2-アミノ-2’-デオキシアデノシン塩基に置き換え(PS-DAP)、24時間トランスフェクトされたFlp-In T-Rex 293細胞において標的mRNA発現を減少させる効力について、未修飾PS-DNA AON配列と比較した。図6に示すように、DAP修飾は、未修飾のバージョンと比較して、TOP1731(PS-DNA;TOP 1731(配列番号1)、PS-DAP;TOP 1731-DAP(配列番号74))がPDE7Aを減少させる効力(図6A)、またはTOP1572(PS-DNA;TOP1572(配列番号42)、PS-DAP;TOP1572-DAP(配列番号107))がPDE4D(図6B)およびPDE4B (図6C)を減少させる効力を上昇させなかった。
図7では、図面の説明に示されているように、PDE7A特異的AONである TOP1731(配列番号1)(A)、TOP1769(配列番号33)(B)、またはTOP1777(配列番号41)(C)の、ホスホロチオエート組成物の形態(PS-DNA)またはP2M結合修飾を含む形態(P2M;TOP1731-P2M-7(配列番号85)、TOP1731-P2M-9(配列番号89)、TOP1731-P2M-10(配列番号91)、TOP1769-P2M-7(配列番号94)、TOP1769-P2M-9(配列番号96)、TOP1769-P2M-10(配列番号98)、TOP1777-P2M-7(配列番号100)、TOP1777-P2M-9(配列番号102)、TOP1777-P2M-10(配列番号104))のいずれかを、236 nM で用いて、Flp-In T-Rex 293細胞を24時間トランスフェクトした。P2M結合によるTOP1731、TOP1769、またはTOP1777配列の修飾(TOP1731-P2M-7(配列番号85)、TOP1769-P2M-7(配列番号94)、TOP1777-P2M-7(配列番号100))は、標的遺伝子発現を阻害するAONの効力を増強し、AON活性にとってこの修飾が有利であることが明確に示された(図7A〜C)。
DAP塩基修飾を、P2M結合修飾を含むAON配列に組み入れた。図7は、標的遺伝子発現を阻害するP2M修飾AON配列の効力がDAP塩基によりさらに増強されたことを示しており(TOP1731-P2M-7-DAP(配列番号86)、TOP1769-P2M-7-DAP(配列番号95)、TOP1777-P2M-7-DAP(配列番号101))、AON活性についてDAP修飾とP2M結合修飾との間の相乗効果を明確に示している(図7A〜C)。
図8では、図面の説明に示されているように、PDE7A特異的AONであるTOP1731(配列番号1)(A)、TOP1769(配列番号33)(B)、もしくはTOP1777(配列番号41)(C)、またはPDE4B/4D特異的AONであるTOP1572(配列番号42)(D〜E)の、ホスホロチオエート組成物の形態(PS-DNA)またはDAP 塩基とP2M結合修飾とを含む形態(P2M-DAP;TOP1731-P2M-7-DAP(配列番号86)、TOP1769-P2M-7-DAP(配列番号95)、TOP1777-P2M-7-DAP(配列番号101)、TOP1572-P2M-7-DAP(配列番号119))のいずれかを、15〜1200 nMの範囲で漸増させた濃度で用いて、Flp-In T-Rex 293細胞を24時間トランスフェクトした。図8の結果は、DAP塩基とP2M結合修飾が、PS-DNAと比較してAON配列の活性を増強させることを示すだけでなく、これらの修飾が、驚くべきことに、AON配列の達成し得る最大標的mRNA阻害を上昇させることを示している(図8 A〜F)。より低いホスホロチオエート/ホスホジエステル比は安定性を減少させると従来は考えられていたので(事実、P2M-7-DAPはPS-DNAと比べて確かに短い半減期を有する。下記実施例5を参照のこと。)、活性の増加は予期せぬものである。さらに、安定性の変化は活性に影響し得るとしても最大阻害には影響しないと考えられるので、最大標的mRNA阻害の有利な上昇は特に予期せぬものであった。実施例4で上述したように、PS-DNAをDAP単独で修飾しても阻害に対してほとんど効果がなかった。
図9および10は、DAP塩基およびP2M結合の修飾の活性を、AONの活性を向上させるために使用される他の修飾と比較している。図9では、FANA含有バージョンまたはP2M-DAP含有バージョンのいずれかのPDE4B/4D AON配列(TOP1572-P2M-7-DAP(配列番号119);TOP1572-F2(配列番号106))およびPDE7A AON配列(TOP1731-P2M-7-DAP(配列番号86);TOP1731-F3(配列番号73))の組合せを、6〜1260 nMの範囲で漸増させた濃度で用いて、Flp-In T-Rex 293細胞を24時間トランスフェクトした。未修飾PS-DNA AON配列を用いた比較解析で観察されたのと同様に、P2M-DAP修飾はFANA含有AON配列と比べてより高い最大標的mRNA阻害を有することが結果に示されている(図9A〜C)。
図10では、ロックド核酸(LNA)含有バージョンまたはP2M-DAP含有バージョンのPDE7A AON配列(TOP1731-P2M-7-DAP(配列番号86);TOP1731-LNA1(配列番号93))を、最大713 nMまで漸増させた濃度で用いて、Flp-In T-Rex 293細胞を24時間トランスフェクトした。LNA AONはmRNA発現を阻害する能力が非常に強いことが示されており、最も有望な化学修飾であるとして記述されてきた(Kurreck J 2003, Eur. J. Biochem, 270:1628-1644;Jepsen and Wengel 2004, Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 7:188-194)。図10における結果は、DAP塩基およびP2M結合の修飾がAON配列の活性を増強することをLNAと比較して示している。
図11では、PDE4B/4DおよびPDE7AのP2M-7-DAP含有AON(PDE4B/4D:TOP1572-P2M-7-DAP(配列番号119);PDE7A:TOP1731-P2M-7-DAP(配列番号86);TOP1769-P2M-7-DAP(配列番号95)、TOP1777-P2M-7-DAP(配列番号101))の組合せまたは対照配列TOP1777s-P2M-7-DAP(配列番号132)を、最大1260 nMまで漸増させた濃度で用いて、Flp-In T-Rex 293細胞を24時間トランスフェクトした。図10における結果は、PDE4B/4DおよびPDE7AのAON配列の組合せが強力な標的mRNAノックダウンを提供することを示している。
図20では、β鎖およびCCR3の組合せのPS-DAP(TOP004(配列番号157)およびTOP005(配列番号158))またはP2M-DAP含有AON(β鎖:TOP062-P2M-12-DAP(配列番号185);CCR3:TOP031-P2M-1-DAP(配列番号172);TOP030-P2M-15-DAP(配列番号170))を、最大1.34μΜまで漸増させた濃度で用いて、TF-1細胞を24時間トランスフェクトした。図20における結果は、全ての組合せのP2M-DAP含有AON配列が、標的mRNAおよびタンパク質のより強力なノックダウンを提供することを示している。
[実施例5:P2M-DAPで修飾されたAONは延長された作用持続時間を有する]
この実施例は、P2M-DAP含有AONの延長された有効性に関する。P2M修飾は、PS結合の含量が低くなっていることから、ヌクレオシダーゼ消化に対する耐性が低下してAONの安定性を低下させると予測され、その場合インビトロおよびインビボにおけるAONの活性が短期化すると考えられる。P2M-DAP含有AONの半減期を肺組織において評価した。P2M-DAP含有AONを気管内エアロゾルを介してマウスに投与し、投与後の異なる時点においてAON含量を測定した。図12は、P2M-DAP含有AONの組織半減期は5時間より短いことを示している。P2M-DAP含有AONのこの短い半減期は、未修飾PS-DNA AON配列について測定された半減期と対照的である。TOP1731(配列番号1)およびTOP1572(配列番号42)の肺組織半減期はそれぞれ22時間および26時間である。DAP塩基修飾のみを有するAON配列TOP1731-DAP(配列番号74)およびTOP1572-DAP(配列番号107)は未修飾PS-DNA配列に匹敵する半減期を有する。
この実施例は、P2M-DAP含有AONの延長された有効性に関する。P2M修飾は、PS結合の含量が低くなっていることから、ヌクレオシダーゼ消化に対する耐性が低下してAONの安定性を低下させると予測され、その場合インビトロおよびインビボにおけるAONの活性が短期化すると考えられる。P2M-DAP含有AONの半減期を肺組織において評価した。P2M-DAP含有AONを気管内エアロゾルを介してマウスに投与し、投与後の異なる時点においてAON含量を測定した。図12は、P2M-DAP含有AONの組織半減期は5時間より短いことを示している。P2M-DAP含有AONのこの短い半減期は、未修飾PS-DNA AON配列について測定された半減期と対照的である。TOP1731(配列番号1)およびTOP1572(配列番号42)の肺組織半減期はそれぞれ22時間および26時間である。DAP塩基修飾のみを有するAON配列TOP1731-DAP(配列番号74)およびTOP1572-DAP(配列番号107)は未修飾PS-DNA配列に匹敵する半減期を有する。
図13では、PDE4B/4DおよびPDE7Aに特異的なAONの組合せを378 nM(総AON)で用いて、Flp-In T-Rex 293細胞を24時間トランスフェクトし、時間経過とともに標的遺伝子発現を評価した(PDE4B/4D;TOP1572-P2M-7-DAP(配列番号119)、PDE7A;TOP1731 -P2M-7-DAP(配列番号86)、TOP1769-P2M-7-DAP(配列番号95)、TOP1777-P2M-7-DAP(配列番号101)または対照配列TOP1777s-P2M-7-DAP(配列番号132))。
驚くべきことに、比較的短い半減期にもかかわらず、DAP塩基とP2M結合とによるAON 配列の修飾は、インビトロで72時間にもおよんで阻害活性を持続させた(図13A〜C)。
[実施例6:P2M-DAP化学により修飾されたAONの、細胞の生物学的機能に対する作用]
この実施例は、異なる細胞型の生物学的機能、特にサイトカインおよびケモカインの分泌に対するP2M-DAP含有AONの有効性に関する。サイトカインおよびケモカインは細胞の活性化および徴集の重要な媒介因子であり、一方でメタロプロテアーゼ(MMP)は組織再構築の重要な修飾因子である。肺上皮細胞は、免疫細胞(例えば好中球および単球/マクロファージ)の徴集を導くケモカイン、サイトカイン、およびメタロプロテアーゼの分泌を通して、炎症性呼吸器疾患の病態生理において役割を果たし得る。インターロイキン8(IL-8/CXCL8)および単球走化性タンパク質-1(MCP-1/CCL2)のレベルはCOPD患者において上昇する(Szilasi M et al. Pathology Oncology Research. 2006, 12:52-60)。IL-8およびMCP-1のレベルは、それぞれ好中球およびマクロファージの徴集に関与し得る。同様にMMPも、COPDの病変形成に寄与し得る(Baraldo et al., Chest 2007, 132:1733-40)。MMP-2およびMMP-12の発現はCOPD患者において上昇する。
この実施例は、異なる細胞型の生物学的機能、特にサイトカインおよびケモカインの分泌に対するP2M-DAP含有AONの有効性に関する。サイトカインおよびケモカインは細胞の活性化および徴集の重要な媒介因子であり、一方でメタロプロテアーゼ(MMP)は組織再構築の重要な修飾因子である。肺上皮細胞は、免疫細胞(例えば好中球および単球/マクロファージ)の徴集を導くケモカイン、サイトカイン、およびメタロプロテアーゼの分泌を通して、炎症性呼吸器疾患の病態生理において役割を果たし得る。インターロイキン8(IL-8/CXCL8)および単球走化性タンパク質-1(MCP-1/CCL2)のレベルはCOPD患者において上昇する(Szilasi M et al. Pathology Oncology Research. 2006, 12:52-60)。IL-8およびMCP-1のレベルは、それぞれ好中球およびマクロファージの徴集に関与し得る。同様にMMPも、COPDの病変形成に寄与し得る(Baraldo et al., Chest 2007, 132:1733-40)。MMP-2およびMMP-12の発現はCOPD患者において上昇する。
図14では、PDE4B/4DおよびPDE7Aに特異的なAON配列の組合せ(TOP1572-P2M-7-DAP (配列番号119)、TOP1769-P2M-7-DAP(配列番号95))または対照配列(TOP1777s-P2M-7-DAP(配列番号132)を総量250 nMで用いて、正常ヒト気管支上皮(NHBE)細胞を20時間トランスフェクトし、それからこの細胞を10 ng/mLのサイトミックス(TNF-α+IL-1β+IFN-γ)で4時間刺激した。結果は、NHBE細胞の刺激後、MCP-1(D)、MMP-2(E)、MMP-12(F)、およびIL-1β(G)の遺伝子発現が増加していることを示している。P2M-DAP修飾されたPDE4B/4DおよびPDE7A特異的AON配列の組合せ(TOP1572-P2M-7-DAP(配列番号119)、TOP1769-P2M-7-DAP(配列番号95))は、対応する標的遺伝子の発現を制限し(図14 A〜C)、遺伝子発現の誘導を遮断することができる(図14 D〜G)。使用されたロリプラムの濃度はAONの濃度よりも>2-log高かったことを考慮すると、MCP-1、MMP-2、MMP-12、およびIL-1βの発現についてのAONの活性は、小分子PDE4阻害剤であるロリプラムの活性よりも著しく高い。
図15では、PDE4B/4DおよびPDE7Aに特異的なAON配列の組合せ(PDE4B/4D;TOP1572 (配列番号42)、TOP1572-P2M-7-DAP(配列番号119)、PDE7A;TOP1731(配列番号1)、TOP1731-P2M-7-DAP(配列番号86)、TOP1769-P2M-7-DAP(配列番号95)、TOP1777-P2M-7-DAP(配列番号101))を総量238 nMで用いて、肺上皮A549細胞を20時間トランスフェクトし、この細胞をIL-1βで6時間刺激してIL-8/CXCL-8およびMCP-1/CCL2のタンパク質分泌を誘導した。AONのDAP塩基およびP2M結合による修飾は、未修飾(PS-DNA)AONと比較して、炎症促進性ケモカインIL-8/CXCL-8およびMCP-1/CCL2の分泌を制限するAONの活性を増強させた。
[実施例8:P2M-DAP修飾AONに対するインビトロおよびインビボの応答]
この実施例は、P2M-DAP修飾AONの、インビトロにおける、およびマウスへの長期投与後のインビボにおける、免疫および炎症応答の相対的な減少に関する。図16(A、B、C、およびD)は、未修飾PS-DNA配列TOP1731(配列番号1)、TOP062(配列番号179)、およびTOP030 (配列番号161)、またはP2M-DAP修飾AON配列TOP1731-P2M-7-DAP(配列番号86)、TOP062-P2M-11 -DAP(配列番号184)、TOP062-P2M-12-DAP(配列番号185)、TOP057-P2M-4-DAP(配列番号193)、TOP057-P2M-5-DAP(配列番号194)、TOP030-P2M-15-DAP(配列番号170)、TOP031-P2M-1-DAP(配列番号172)、もしくはTOP031-P2M-5-DAP(配列番号176)のいずれかに24時間晒した場合におけるマウスマクロファージ(RAW 264.7細胞)およびヒトPBMCのインビトロ応答を示す。既知の免疫賦活性配列(CpG(配列番号133))を陽性対照として使用した。結果は、PS-DNA配列がRAW 264.7およびPBMCにおいてそれぞれTNF-αおよびIFN-αの用量依存的分泌を誘発した一方で、P2M-DAP修飾の導入はこの免疫賦活性作用を完全に抑止したことを示している。本研究で陽性対照として用いられたCpG配列(配列番号133)のような既知の免疫賦活性配列のより広範な活性は、混合PS/PO結合の存在に依存することが知られているため(Krieg A. 2002 Annu. Rev. Immunol, 20:709-760)、この結果は予測せぬものであった。
この実施例は、P2M-DAP修飾AONの、インビトロにおける、およびマウスへの長期投与後のインビボにおける、免疫および炎症応答の相対的な減少に関する。図16(A、B、C、およびD)は、未修飾PS-DNA配列TOP1731(配列番号1)、TOP062(配列番号179)、およびTOP030 (配列番号161)、またはP2M-DAP修飾AON配列TOP1731-P2M-7-DAP(配列番号86)、TOP062-P2M-11 -DAP(配列番号184)、TOP062-P2M-12-DAP(配列番号185)、TOP057-P2M-4-DAP(配列番号193)、TOP057-P2M-5-DAP(配列番号194)、TOP030-P2M-15-DAP(配列番号170)、TOP031-P2M-1-DAP(配列番号172)、もしくはTOP031-P2M-5-DAP(配列番号176)のいずれかに24時間晒した場合におけるマウスマクロファージ(RAW 264.7細胞)およびヒトPBMCのインビトロ応答を示す。既知の免疫賦活性配列(CpG(配列番号133))を陽性対照として使用した。結果は、PS-DNA配列がRAW 264.7およびPBMCにおいてそれぞれTNF-αおよびIFN-αの用量依存的分泌を誘発した一方で、P2M-DAP修飾の導入はこの免疫賦活性作用を完全に抑止したことを示している。本研究で陽性対照として用いられたCpG配列(配列番号133)のような既知の免疫賦活性配列のより広範な活性は、混合PS/PO結合の存在に依存することが知られているため(Krieg A. 2002 Annu. Rev. Immunol, 20:709-760)、この結果は予測せぬものであった。
未修飾PS-DNAおよびDAP修飾AON配列の応答は、ラットに5 mg/kgの投与量を14回連続的に吸入させることにより投与した後に、インビボでも評価した(食塩水を対照として使用した)。最後のAON処置の24時間後、肺組織の組織病理を評価した。図17Aは、選ばれた未修飾またはDAP修飾AON配列を用いた処置後の動物において観察された組織病理学的変化を示す。結果は、未修飾またはDAP修飾AON配列により処置された動物は、同様の種類、頻度、および重症度の所見を有していたことを示しており、AONの忍容性にとってDAP塩基修飾単独では有益性がないことが明確に示されている。
マウスに10回の2.5 mg/kgの投与量を気管内投与した場合のP2M-DAP修飾AON配列の応答(PBSを対照として使用した)。最後のAON処置の24時間後、気管支肺胞洗浄検査(BAL)の差次的細胞計数および肺組織の組織病理を評価した。表8は、選ばれたP2M-DAPおよび未修飾AON配列(PS-DNA)について、BALにおける炎症細胞の流入および組織病理学的評価を要約する。図17Bに見られるように、P2M-DAP修飾AON(TOP1731-P2M-7-DAP(配列番号86)の投与を受けた動物は、未修飾PS-DNA配列TOP1731(配列番号1)と比較して、総細胞流入が低下(マクロファージ、リンパ球、および好中球の減少により表される)していたことが結果において示された。P2M-DAP修飾AONにより処置されたマウスはまた、未修飾PS-DNA AONと比較して、より低い肺組織所見の頻度を有しており、且つこれらの動物において観察された所見はより重症度が低く(グレード1は最小の重症度を反映し、グレード4は重度の重症度を反映する)(図17C)、AONの忍容性にとってDAP塩基およびP2M結合の修飾が有益であることが明確に示されている。
表8はまた、選ばれたP2M-DAP含有AON配列について計算された有効性/毒性便益比を要約している。この比率は、AONの活性(有効性指数、あるいはこの例では、所与の濃度において得られた最大標的ノックダウンを表す)に対するその相対的毒性(ここでは肺毒性指数、あるいは全ての所見およびそれらの重症度グレードの合計を表す)を考慮に入れたものである。表8における結果は、未修飾AON配列(PS-DNA)については非常に低い比率の値を、P2M-DAP含有AON配列についてはより高い比率の値(>0.25)を示している。
[実施例9:LPS誘発性気道炎症のマウスモデルにおけるP2M-DAP修飾AONの有効性]
この実施例は、マウスの急性肺炎症のインビボモデルにおいて、AONの化学にP2M-DAP修飾を組み入れた場合におけるPDE4B/4DおよびPDE7Aを標的とするAONの有効性に関する。表4c、4d、および6は、ヒトまたはマウスのPDE4B/4DおよびPDE7Aを標的とするAONの組成ならびにP2M-DAPによる修飾を記述している。
この実施例は、マウスの急性肺炎症のインビボモデルにおいて、AONの化学にP2M-DAP修飾を組み入れた場合におけるPDE4B/4DおよびPDE7Aを標的とするAONの有効性に関する。表4c、4d、および6は、ヒトまたはマウスのPDE4B/4DおよびPDE7Aを標的とするAONの組成ならびにP2M-DAPによる修飾を記述している。
PDE4B/4DおよびPDE7Aを標的とするP2M-DAP修飾AONの活性が、マウスのLPS誘発性急性肺炎症モデルのインビボモデルにおいて実証された。この炎症モデルでは、マウスをLPSに晒し、これらの動物の肺における好中球の著しい流入を引き起こす(図18)。好中球は、例えばCOPDの場合のように、多くの炎症疾患における炎症応答の基礎をなす、鍵となる細胞である。LPS曝露の前に、PDE4B/4Dを標的とする1つの修飾AON(TOP572-P2M-7-DAP(配列番号)またはTOP2804-P2M-7-DAP(配列番号138))とPDE7Aを標的とする1つの修飾AON(TOP1777-P2M-7-DAP(配列番号101)またはTOP2707-P2M-7-DAP(配列番号136))との組合せ(比率1:1 w/w)でマウスを処置した場合には、LPS誘発性好中球流入の著しい減少が観察された(図18 A〜B)。しかしながら、LPS曝露マウスを対照配列(TOP1777s-P2M-7-DAP(配列番号132))で処置した場合には、肺への好中球流入は減少しなかった(図18A)。LPSに晒されたがロフルミラスト(PDE4の小分子阻害剤)で処置されたマウスでは、AONによって得られたのと同等のレベルで好中球流入を減少させるために、100 mg/kgの投与量が必要とされた(図18C)。
[実施例10:タバコ煙誘発性気道炎症のマウスモデルにおけるP2M-DAP修飾AONの有効性]
この実施例は、マウスのタバコ煙誘発性肺炎症のインビボモデルにおいて、AONの化学にP2M-DAP修飾を組み入れた場合における、PDE4B/4DおよびPDE7Aを標的とするAONの有効性に関する。表4c、4d、および6は、ヒトまたはマウスのPDE4B/4DおよびPDE7Aを標的とするAONの組成ならびにP2M-DAPによる修飾を記述している。
この実施例は、マウスのタバコ煙誘発性肺炎症のインビボモデルにおいて、AONの化学にP2M-DAP修飾を組み入れた場合における、PDE4B/4DおよびPDE7Aを標的とするAONの有効性に関する。表4c、4d、および6は、ヒトまたはマウスのPDE4B/4DおよびPDE7Aを標的とするAONの組成ならびにP2M-DAPによる修飾を記述している。
PDE4B/4DおよびPDE7Aを標的とするP2M-DAP修飾AONの活性は、マウスのタバコ煙誘発性肺炎症モデルのインビボモデルにおいても実証された。この炎症モデルでは、マウスを連続4日間タバコの煙に晒し、動物の肺における好中球の著しい流入を引き起こす(図19)。煙への曝露の前に、PDE4B/4Dを標的とする1つのP2M-DAP修飾AON(TOP572-P2M-7-DAP(配列番号))とPDE7Aを標的とする1つのP2M-DAP修飾AON(TOP1777-P2M-7-DAP(配列番号101))との組合せ(比率1:1 w/w)で1日おきにマウスを処置した場合には、好中球流入の総数(図19AおよびB)およびパーセンテージ(図19DおよびE)の減少が観察された。タバコの煙に晒されたがロフルミラスト(PDE4の小分子阻害剤)で処置されたマウスでは、好中球流入の総数を減少させるために5 mg/kgの投与量が必要とされたが(図19C)、好中球のパーセンテージについての効果は無かった(図19F)。
P2M-DAP修飾AONは2日に1回投与されたのに対しロフルミラストは毎日投与されたことから、ここでもP2M-DAP修飾AONの長期作用特性が実証された。
本明細書では本発明の好ましい実施態様を説明したが、本発明の趣旨または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく変化を施すことができることは当業者に理解されるであろう。本明細書で引用する全ての参考文献は引用により組み入れられる。
Claims (40)
- 標的遺伝子に対するオリゴヌクレオチドであって、前記遺伝子をコードする核酸配列の少なくとも一部分と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、ここで、
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドは2-アミノ-2’-デオキシアデノシン(DAP)であり、
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合は少なくとも3つの交互に存在するセグメントを含み、各セグメントが少なくとも1つのホスホロチオエート結合または少なくとも1つのホスホジエステル結合のいずれかからなる
オリゴヌクレオチド。 - 前記標的遺伝子が、IL-3、IL-5、およびGM-CSFの共通ベータ・サブユニットである、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記標的遺伝子がCCR3ケモカイン受容体である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記標的遺伝子が標的ホスホジエステラーゼ(PDE)である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記標的PDEが、PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A1、PDE7A2、PDE7A3、およびPDE7Bからなる群から選択される、請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記標的PDEがPDE7Aである、請求項5に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記標的PDEがPDE4Bである、請求項5に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記標的PDEがPDE4Dである、請求項5に記載のオリゴヌクレオチド。
- ホスホロチオエート結合対ホスホジエステル結合の比が30:70〜70:30である、請求項1〜8のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- ホスホロチオエート結合対ホスホジエステル結合の比が40:60〜60:40である、請求項9に記載のオリゴヌクレオチド。
- ホスホロチオエート結合対ホスホジエステル結合の比が45:55〜55:45である、請求項10に記載のオリゴヌクレオチド。
- ホスホロチオエート結合対ホスホジエステル結合の比が約50:50である、請求項11に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記標的遺伝子に対して少なくとも80%相補的である、請求項1〜12のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記標的遺伝子に対して100%相補的である、請求項13に記載のオリゴヌクレオチド。
- 有効性/毒性比が0.25より高い、請求項1〜14のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- 長さが15〜25ヌクレオチドである、請求項1〜14のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- 長さが18〜22ヌクレオチドである、請求項16に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号1〜72、好ましくは配列番号1、4、8、33、36、41、および42からなる群から選択される塩基配列を有し、少なくとも1つのアデノシンがDAPで置き換えられている、請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号1、33、41、および42からなる群から選択される塩基配列を有する、請求項18に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号81、86、90、92、95、97、99、101、103、105、114、119、121、123、125、および127、好ましくは配列番号86、95、101、および119のいずれか1つを含む、請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号81、86、90、92、95、97、99、101、103、105、114、119、121、123、125、および127、好ましくは配列番号86、95、101、および119のいずれか1つからなる、請求項20に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号179および189からなる群から選択される塩基配列を有し、少なくとも1つのアデノシンがDAPで置き換えられている、請求項2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号180〜188および190〜197のいずれか1つを含む、請求項22に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号161および171からなる群から選択される塩基配列を有し、少なくとも1つのアデノシンがDAPで置き換えられている、請求項3に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号162〜170および172〜178のいずれか1つを含む、請求項24に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜25のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、および薬学的に許容される担体を含む、薬学組成物。
- 少なくとも2つの、請求項1〜25のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含む、請求項17に記載の薬学組成物。
- 前記少なくとも2つのオリゴヌクレオチドは、それぞれPDE7AおよびPDE4Bに対するものである、請求項27に記載の薬学組成物。
- 前記少なくとも2つのオリゴヌクレオチドは、それぞれPDE7AおよびPDE4Dに対するものである、請求項27に記載の薬学組成物。
- 前記PDE4BまたはPDE4Dに対するオリゴヌクレオチドは、もう一方も下方制御する、請求項28または29に記載の薬学組成物。
- 前記少なくとも2つのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、IL-3、IL-5、およびGM-CSFの共通ベータ・サブユニット、ならびにCCR3ケモカイン受容体に対するものである、請求項27に記載の薬学組成物。
- 炎症の治療用の、請求項26〜31のいずれかに記載の薬学組成物。
- 呼吸器疾患の治療用の、請求項26〜31のいずれかに記載の薬学組成物。
- 慢性閉塞性肺疾患、喘息、好酸球性咳嗽、気管支炎、移植肺の急性および慢性拒絶反応、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、副鼻腔炎、ウイルス感染症、または腫瘍性疾患のうちの少なくとも1つの治療用の、請求項33に記載の薬学組成物。
- 請求項26〜31のいずれかに記載の薬学組成物を投与することを含む、対象における呼吸器疾患を治療する方法。
- 呼吸器疾患の治療用の医薬の調製における、請求項26〜31のいずれかに記載の薬学組成物の使用。
- 呼吸器疾患の治療のための、請求項26〜31のいずれかに記載の薬学組成物の使用。
- 配列番号1〜72、161、171、179、および189、好ましくは配列番号1、4、8、33、36、41、42、161、171、179、および189のいずれか1つの塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも1つのアデノシンがDAPで置き換えられている、請求項38に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号1〜127および161〜197のいずれか1つからなるオリゴヌクレオチド。
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