KR20140014179A - 키메라 벡본 및 2-아미노-2''-데옥시아데노신을 포함하는 올리고뉴클레오티드 저해제 - Google Patents

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로제인 세귄
니콜레이 페라리
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파맥시스 엘티디
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Abstract

본 발명은, 타겟 유전자를 겨냥하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 엄격 조건에서 상기 유전자를 코딩하는 핵산 서열의 적어도 일부분과 혼성화 가능하며, 상기 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드가 2-아미노-2'-데옥시아데노신 (DAP)이고, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드들 간의 결합들이 3개 이상의 교대 단편을 포함하며, 각각의 단편은 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 하나 이상의 포스포다이에스테르 결합으로 구성된 것을 특징으로 하는, 타겟 유전자를 겨냥하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

Description

키메라 벡본 및 2-아미노-2'-데옥시아데노신을 포함하는 올리고뉴클레오티드 저해제 {OLIGONUCLEOTIDE INHIBITORS WITH CHIMERIC BACKBONE AND 2-AMINO-2'-DEOXYADENOSINE}
본 출원은 2011년 2월 24일자 미국 가출원번호 제 61/446,144호에 대해 우선권을 주장한다.
본 발명은 염증 질환 및 호흡기 질환의 치료에 유용한 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포스포다이에스테라제 발현에 대한 올리고뉴클레오티드 저해제에 관한 것이다.
폐포(alveolar)와 기도의 상피는 산화적 스트레스, 패혈증, 내독소혈증 및 그외 치명적인 폐 질환에 대한 염증 및 대사 반응들을 조절하는데 중요한 역할을 수행하는 다이나믹한 장벽으로 인식된다. 호흡기 상피는 특히 상피-혈액 인터페이스에서 염증 증상/감염의 일차 타겟이며, 스스로 염증 세포를 동원하여 염증 매개인자들을 생산함으로써 염증 신호를 증폭할 수 있다.
만성 폐색성 폐 질환 (COPD)은 염증의 지속적인 상향 조절이 중요하게 작용하는 것으로 생각되는, 염증성 기도 및 폐포 질환의 일 예이다. COPD에서의 염증은 호중구, CD8+ 림프구 및 대식세포의 기도 침윤 증가를 특징으로 한다. 호중구와 대식세포는, 엘라스타제, 메탈로프로테아제 및 조직 염증과 손상을 촉진시키는 산소 라디칼 등의 다수의 매개 인자를 방출하는 능력으로 인해, COPD에서 기도 염증의 발병에 중요한 역할을 수행한다. 염증 세포를 기도로 유인하고, 이를 활성화하여, 기도에 존재하도록 유지시키는, 전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인들과 케모카인들의 방출이 증가함에 따라, COPD 환자의 기도에 염증 세포가 축적되는 것으로 보고된 바 있다. 또한, 체류하는 세포들은, 조직에 대해 부정적인 작용을 발휘하여 질병을 지속시키는 (메탈로프로테아제와 같은) 효소와 산소 라디칼을 방출한다. 대규모 전-염증성 사이토카인 및 케모카인 그룹이 COPD 환자의 폐에서 증가하는 것으로 밝혀지고 있다. 이러한 것들 중에서, 가장 중요한 역할은 종양 괴사 인자 α (TNF-α), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 인터루킨-8 (IL-8)에 의해 수행되는데, 이들은 COPD 환자의 기도에서 증가한다.
염증이 소정의 역할을 하는 것으로 보이는 호흡기 질환의 다른 예로는, 천식, 호산구성 기침, 기관지염, 낭성 섬유증, 폐 고혈압, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 급성 및 만성적인 폐 동종이식 거부 반응, 유육종증, 폐 섬유증, 비염 및 부비동염이 있다.
천식은 기도 염증, 가역적인 폐색증 및 기도 과민반응으로 정의된다. 이 질환의 경우, 관여하는 염증 세포가 주로 호산구, T 림프구 및 비만 세포이지만, 호중구와 대식세포도 중요할 수 있다. 대규모 사이토카인들과 케모카인 그룹이 기도에서 증가하여, 염증, 폐색 및 과민반응을 촉진함으로써 천식 질환의 병리학적 변화에 소정의 작용을 하는 것으로 밝혀지고 있다.
호산구성 기침은 기도 폐색 또는 과민반응을 보이지 않는 환자의 기도에서의 염증성 세포, 주로 호산구의 존재와 만성적인 기침을 특징으로 한다. 이 질환에서 몇가지 사이토카인과 케모카인들이 증가하지만, 이들은 대부분 호산구 특이적이다. 호산구는 기도에 동원되어 활성화되며, 잠재적으로 염증과 기침을 지속시키는 역할을 하는 효소와 산소 라디칼을 방출할 수 있다.
급성 기관지염은, 하기도의 감염이나, 예를 들어 오염원, 먼지, 가스 또는 화학제에 의한 자극 발생시 발병하는 급성 질환이다. 만성 기관지염은 연간 3개월 이상, 2년 이상 거의 매일 기침과 가래 발생으로 정의된다. 또한, 기도에 급성 또는 만성 기관지염이 발생한 동안에는, 광범위한 케모카인과 사이토카인 그룹을 가진 염증 세포, 대부분 호중구를 발견할 수 있다. 이들 매개인자는 질환 중에 발생하는 염증, 증상 및 점액 생산에 작용하는 것으로 생각된다.
폐 이식은 말기 폐암 환자들에서 시술된다. 신체의 염증 세포, 림프구가 공여 장기를 "자기"로 인지하지 않을 경우, 급성 및 보다 중요하게는 만성적인 동종이식 거부 반응이 발생한다. 염증 세포는 케모카인과 사이토카인에 의해 동원되어, 조직 파괴를 유발하는 거대 효소 그룹을 방출하며, 만성적인 거부 반응의 사례에서는 질환이 폐쇄성 세기관지염(bronchiolitis obliteran)으로 지칭된다.
유육종증은 만성적인 비-건락성 육아종 (chronic non-caseating granulomas)이 조직에 발생하는, 원인 불명의 질환이다. 가장 흔히 발병하는 장기는 폐이다. 폐의 기관지 폐포 세정액에서는 대부분 림프구, 대식세포, 때때로 호중구와 호산구의 증가가 확인된다. 또한, 이들 세포가 동원되어 사이토카인 및 케모카인에 의해 활성화되며, 질환의 병리학적 발생에 관여하는 것으로 생각된다.
폐 섬유증은 만성적인 호흡 부전을 야기하는 점진적이고 만성적인 섬유증 (흉터)으로 특정되는 폐 조직 질환이다. 폐 섬유증에는 여러가지 타입과 요인들이 존재하지만, 이들 모두 염증 세포의 유입과 존속, 활성화 및 폐 조직에 콜라겐이 축적된 섬유모세포의 증식을 특징으로 한다. 이러한 현상들은 폐 조직내 사이토카인과 케모카인의 방출과 관련있는 것으로 보인다.
급성 비염은, 코나 상기도의 감염, 또는 예를 들어 오염원, 먼지, 가스 또는 화학제에 의한 자극 현상이 발생하는 동안에 발병하는 급성 질환이다. 만성적인 비염은 장기간 계속되는 콧물, 코 막힘, 재채기 및 소양증의 존재로 정의된다. 또한, 광범위한 부류의 케모카인과 사이토카인을 가진 염증 세포들이 급성 또는 만성 비염이 발생된 동안에 상기도에서 발견될 수 있다. 이들 매개인자들은 이들 질환 중에 발생하는 염증, 증상 및 점액 생산에 작용하는 것으로 생각된다.
급성 부비동염은, 열을 수반하거나 수반하지 않는, 코 막힘, 콧물, 화농성 가래, 두통 또는 부비동 통증이 특징적인 부비동의 급성, 통상 감염성 질환이다. 만성 부비동염은 급성 부비동염의 증상들이 6개월 이상 지속되는 것으로 정의된다. 또한, 급성 또는 만성 부비동염이 발병되는 동안에는 상기도 및 부비동에서 광범위한 그룹의 케모카인과 사이토카인을 가진 염증성 세포들을 발견할 수 있다. 이들 매개인자들은 질환 중에 발생하는 염증, 증상 및 가래 생산에 작용하는 것으로 생각된다.
염증과 신생물 질환 간의 직접적인 연결을 시사하는 증거들이 증가하고 있다. 종양 미세환경은 여기에 유입되는 세포에 의해 형성되며, 이들의 기능은 국소 환경을 반영한다. 종양이 진행되는 동안에 종양 부위에서 이루어지는 연속적인 변화들은 만성 염증과 비슷하다. 이러한 만성적인 염증 반응은 종양에 의해 주로 주관되는 것으로 보이며, 종양 생존을 촉진시키는 것으로 보인다. 발생 중인 신생물에서 또는 그 주위에서 관찰되는 초기 지속되는 염증 반응들은, 조직 항상성 유지와 관련된 다양한 매개인자들, 예를 들어 가용성 성장 인자 및 생존 인자들, 매트릭스 리모델링 효소, 반응성 산소 종들 및 기타 생물활성 분자들을 제공함으로써, 종양 발생의 많은 측면들 (매트릭스 리모델링, 혈관신생, 악성 잠재력)을 조절한다는 것이 명확해지고 있다.
전술한 바와 같이, 이러한 염증성 호흡기 질환 또는 염증이 중요한 역할을 담당하는 질환들 모두, 정상 조직이 만성적으로 파괴 또는 파열되었을 때, 증상, 염증의 지속을 야기하는 효소 또는 산소 라디칼들을 방출하는 여러가지 염증 세포들을 동원하여 활성화하는 매개인자의 존재가 특징적이다.
광범위한 세포 집단에 의한 전-염증성 사이토카인과 케모카인의 방출을 감소시키면서 항-염증 매개인자 또는 효소의 방출에 대해서는 감소된 효과를 나타내는 치료학적 방법은, 염증성 호흡기 질환 또는 임의의 그외 전신성 염증 질환에 대한 현행 치료법 보다 유익할 수 있다.
사이클릭 뉴클레오티드인 cAMP와 cGMP는 신호전달 경로와 기전에 참여하는 도처에 존재하는 2차 메신저이다. cAMP와 cGMP는 둘다 아데닐릴 (아데닐레이트) 또는 구아닐릴 (구아닐레이트) 사이클라제의 촉매 활성에 의해 해당 트리포스페이트 (ATP 및 GTP)로부터 생성된다. cAMP/cGMP의 불활성화는, 사이클릭-뉴클레오티드-의존적인 포스포다이에스테라제 (PDE)에 의해 촉매되는 3'-포스포다이에스테르 결합의 가수분해에 의한 절단을 통해 달성되며, 이로써 대응되는 불활성 5'-모노포스페이트가 생성된다. 염증 반응과 이의 진행은 사이클릭 뉴클레오티드의 안정기 수준 조절에 정교하게 반응하는데, 이 경우 이러한 작용의 타겟 세포는 면역 세포를 벗어나 확대되어 기도 평활근 세포, 상피 세포, 내피 세포 및 뉴런 등의 보조 세포를 포괄하는 것으로 입증되고 있다. 사이클릭 뉴클레오티드인 PDE는, 11종 이상의 PDE 효소 패밀리로 이루어진, 증가 중인 거대 멀티유전자 패밀리이다. 따라서, 생체내 및 시험관내에서의 선택적인 및 비선택적인 PDE 유용성 프로파일은, 항우울제, 항증식제, 면역조절제, 자궁수축 억제제, 근육수축제/심박동제 및 세포보호제로서의 잠재적인 치료학적 유용성을 시사한다. PDE에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 ("AON")의 용도는 공동-출원한 WO 05/030787 및 WO 07/134451에 개시되어 있다.
잠재적인 임상적인 용도를 위해서는, 올리고뉴클레오티드는 혈청 및 세포성 뉴클레아제에 의한 분해에 안정적이어야 하며, 비-특이적인 혈청 및 세포 단백질에 대한 결합성이 낮아야 하며, 타겟 mRNA 서열에 대해 강화된 인지성을 나타내어야 하며, 세포막 투과성이어야 하며, 상보적인 mRNA와 복합체를 이루었을 때 세포성 뉴클레아제를 유도할 수 있어야 한다. 천연 당 (D-리보스 및 D-2-데옥시리보스)과 포스포다이에스테르 (PO) 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드들은 혈청 및 세포내 뉴클레아제들에 의해 신속하게 분해되어, 유효한 치료제로서의 유용성이 제한적이라는 것이 충분히 입증되었다. 이의 치료제로서의 안정성과 효과를 개선시키기 위한 올리고뉴클레오티드에 대한 전략적인 화학적 변형이 알려져 있다. 주된 화학적 변화로는 당 모이어티의 변형, 염기 모이어티의 변형, 및/또는 뉴클레오티드간 포스포다이에스테르 결합의 변형 또는 치환을 포함한다. 지금까지 가장 널리 연구된 유사체는, 포스포다이에스테르 벡본에서 비-브릿지 (non-bridging) 산소 원자들 중 하나가 황으로 치환된, 포스포로티오에이트 (PS) 올리고데옥시뉴클레오티드이다.
예를 들어, CpG-함유 올리고뉴클레오티드 등의 면역자극 서열에서 일부 PO 결합을 PS 결합으로 치환하면, 올리고뉴클레오티드의 안정성이 증가된 바 있다. 그러나, 일반적으로 CpG 모티프에는 PO 결합이 필요하며, 즉, 혼성 PO/PS 벡본이 CpG-함유 올리고뉴클레오티드의 최대 면역자극 활성에 필수적이다.
PO/PS 결합을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 FANA 변형이 도입된 예들이 있다. 그러나, 이러한 변형들은 본 출원인의 WO 09/137912에 기술된 바와 같이 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성을 낮출 수 있다.
올리고뉴클레오티드에 대한 그외 변형으로는 본 출원인의 WO 03/004511에 기술된 바와 같이, 2-아미노-2'-데옥시아데노신 (DAP)에 의한 아데노신 잔기 치환을 포함한다.
염증 및 호흡기 질환 치료에 사용하기 위해, PDE를 겨냥하는 올리고뉴클레오티드를 개선시키는 것이 바람직할 것이다.
일 측면은, 타겟 포스포다이에스테라제 (PDE)를 겨냥하는 올리고뉴클레오티드로서,
상기 올리고뉴클레오티드는 엄격 조건에서 PDE를 코딩하는 핵산 서열의 적어도 일부분과 혼성화할 수 있으며;
상기 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드가 2-아미노-2'-데옥시아데노신 (DAP)이고;
상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 간의 결합들이 3개 이상의 교대 단편 (alternating segment)을 포함하며, 각각의 단편은 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 하나 이상의 포스포다이에스테르 결합으로 구성된, 타겟 포스포다이에스테라제를 겨냥하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
다른 측면은, 본원에 기술된 하나의 올리고뉴클레오티드와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 측면은, 염증을 치료하기 위한 본원에 기술된 약학 조성물을 제공한다.
다른 측면은, 호흡기 질환을 치료하기 위한 본원에 기술된 약학 조성물을 제공한다.
다른 측면은, 본원에 기술된 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 호흡기 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 측면은, 호흡기 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 본원에 기술된 약학 조성물의 용도를 제공한다.
다른 측면은, 호흡기 질환을 치료하기 위한 본원에 기술된 약학 조성물의 용도를 제공한다.
다른 측면은 서열번호 1-72 중 임의의 하나의 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
다른 측면은 서열번호 1-127 중 임의의 하나로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
도 1은 PDE7A mRNA 발현 감소에 대한 AON 서열의 효과를 예시한다. AON 서열들 TOP1766 (서열번호 30) - TOP1777 (서열번호 41)을 236 nM로 사용하여 24시간 동안 Flp-ln T-Rex 293 세포를 형질전환시키고, 공지된 PDE7A AON TOP1731 (서열번호 1)과 효과를 비교하였다. TOP1731s (서열번호 128)를 음성 대조군으로 사용하였다. PDE7A mRNA 발현 (평균 ± SEM)을 Quantigene 2.0 분석을 이용하여 정량하고, 대조군 유전자 β2M에 대하여 발현 수준을 정규화 (normalization)하였다. 비-형질전환 대조군 세포 (Ctrl NT, 점선) 대비, PDE7A mRNA의 평균 저해율을 20% 이상일 때 AON 처리군들에 대해 표시하였다. 대조군은 n=6이고, 형질전환 샘플은 n=3이다.
도 2는 AON 서열의 PDE4D 및 PDE4B mRNA 발현 감소 효과를 예시한다. Flp-ln T-Rex 293 세포를 TOP1572에 대한 AON 서열 (서열번호 42) 236 nM을 이용하여 24시간 형질전환하였다. TOP1572s (서열번호 131)를 음성 대조군으로 사용하였다. (A) PDE4D 및 (B) PDE4B mRNA 발현 (평균 ± SEM)을 Quantigene 2.0 분석을 이용하여 정량하고, 대조군 유전자 β2M에 대하여 발현 수준을 정규화하였다. 비-형질전환 대조군 세포 (Ctrl NT, 점선) 대비, PDE4D 및 PDE4B mRNA의 평균 저해율을 20% 이상일 때 AON 처리군들에 대해 표시하였다. 대조군은 n=6이고, 형질전환 샘플은 n=3이다.
도 3은 인간 AON 서열의 마우스 PDE mRNA 발현 감소 효과를 예시한다. NIH3T3 세포를 인간 PDE7A AON 서열들인 TOP1731 (서열번호 1), TOP1769 (서열번호 33), TOP1777 (서열번호 41) 및 PDE4B/4D 서열 TOP1572 (서열번호 42) 125 nM을 이용하여 24시간 형질전환하였다. 인간 AON의 효과를, 공지의 마우스 특이 PDE7A AON 서열 TOP2707-F3 (서열번호 134) 및 PDE4B/4D 특이 서열 TOP2804-F1 (서열번호) 또는 대조군 서열 TOP2707Mi2-F3 (서열번호 125) 및 TOP1572s (서열번호 131)의 효과와 비교하였다. Quantigene 2.0 분석을 이용하여, 뮤라인 (A) PDE7A, (B) PDE4D 또는 (C) PDE4B mRNA 발현 (평균 ± SEM)을 정량하고, β2M 수준에 대해 정규화하였다. 비-형질전환 대조군 세포 (Ctrl NT, 점선) 대비, PDE mRNA의 평균 저해율을 20% 이상일 때 표시하였다 (모든 처리군은 n=3, 대조군은 n=6).
도 4는 랫 PDE mRNA 발현 감소에 대한 인간 AON 서열들의 효과를 예시한다. L2 세포에, 24시간 동안, 250 nM의 PDE7A AON 서열들 TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86), TOP1769-P2M-7-DAP (서열번호 95), TOP1777-P2M-7-DAP (서열번호 101), 또는 500 nM의 PDE4B/4D AON 서열 TOP1572-P2M-7-DAP (서열번호 1 19)를 형질전환하였다. 인간 AON 서열들의 효과를 대조군 서열인 TOP1731s-P2M-7-DAP (서열번호 155) 및 TOP1572s-P2M-7-DAP (서열번호 156)와 비교하였다. Quantigene 2.0 분석을 이용하여, 랫 (A) PDE7A, (B) PDE4D 또는 (C) PDE4B mRNA 발현 (평균 ± SEM)을 정량하고, PPIB 수준에 대해 정규화하였다. 대조군 비-형질전환 세포에서의 유전자 발현 대비 PDE mRNA 평균 저해율 (Ctrl NT, 점선)이 20% 보다 높을 경우 표시하였다 (모든 처리군은 n=3, 대조군 NT는 n=6).
도 5는 원숭이 PDE mRNA 발현 감소에 대한 인간 AON 서열들의 효과를 예시한다. CYNOM-K1 세포에, 24시간 동안, 250 nM로 PDE7A AON 서열들인 TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86), TOP1769-P2M-7-DAP (서열번호 95), TOP1777-P2M-7-DAP (서열번호 101) 또는 PDE4B/4D 서열인 TOP1572 (서열번호 42), 또는 대조군 서열인 TOP1731s-P2M-7-DAP (서열번호 155)와 TOP1572s (서열번호 131)를 형질전환하였다. Quantigene 2.0 분석을 이용하여, 원숭이 (A) PDE7A, (B) PDE4D 또는 (C) PDE4B mRNA 발현 (평균 ± SEM)을 정량하고, PPIB 수준에 대하여 정규화하였다. 대조군 비-형질전환 세포에서의 유전자 발현 대비 PDE mRNA 평균 저해율 (Ctrl NT, 점선)이 20% 보다 높을 경우 표시하였다 (모든 처리군은 n=3, 대조군 NT는 n=6).
도 6은 타겟 mRNA 발현 감소에 대한 선택한 비변형 AON (PS-DNA) 및 DAP-함유 AON 서열들 간의 효과 비교를 예시한다. Flp-ln T-Rex 293 세포에, 24시간 동안, 118 nM로, TOP1731 (서열번호 1), TOP1731 -DAP (서열번호 74), 또는 263 nM로 TOP1572 (서열번호 42) 또는 TOP1572-DAP (서열번호 107)를 형질전환하였다. (A) PDE7A, (B) PDE4D 및 C) PDE4B mRNA 발현 (평균 ± SEM)을 Quantigene 2.0 분석으로 정량하고, 대조군 유전자인 β2M의 발현 수준에 대해 정규화하였다. 대조군 비-형질전환 세포에서의 유전자 발현 대비 PDE mRNA 평균 저해율 (Ctrl NT, 점선)을 AON 처리군들에 대해 표시하였다. 대조군 NT는 n=6, 형질전환 샘플들은 n=3임.
도 7은 타겟 mRNA 발현 감소에 대한 선택한 P2M-DAP AON 서열들 간의 효과 비교를 예시한다. Flp-ln T-REx 293 세포에, 24시간 동안, 236 nM로 PDE7A AON을 PS-DNA로서 또는 (A) TOP1731 (서열번호 1), (B) TOP1769 (서열번호 33) 또는 (C) TOP1777 (서열번호 41)인 다양한 P2M 또는 P2M-DAP 버전으로서 이용하여 형질전환하였다. PDE7A의 mRNA 발현 (평균 ± SEM)을 Quantigene 2.0 분석을 이용하여 정량하고, β2M 발현 수준에 대해 정규화하였다. 대조군 비-형질전환 세포에서의 유전자 수준 대비 PDE mRNA 평균 저해율 (Ctrl NT, 점선)이 20% 보다 높을 경우 표시하였다. 스튜던트 t-검정 분석, *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001. 모든 실험군은 n=3, 대조군 NT는 n=6임.
도 8은 타겟 mRNA 발현 감소에 대한 선택한 PS-DNA와 P2M-DAP-함유 AON 서열들 간의 효과 비교를 예시한다. Flp-ln T-REx 293 세포에, 24시간 동안, 15 내지 1200 nM로, (A) TOP1731 (서열번호 1), (B) TOP1769 (서열번호 33), (C) TOP1777 (서열번호 41) 또는 (D, E) TOP1572 (서열번호 42)를 PS-DNA 또는 P2M-7-DAP로서 각각 형질전환하였다. 서열 TOP1731s (서열번호 128)와 TOP1777s-P2M-7-DAP (서열번호 132)는 대조군으로 사용하였다. Quantigene 2.0 분석을 이용하여, 대조군 유전자 β2M의 발현을 기준으로 PDE mRNA 발현 (평균 ± SEM)을 정량하였다 (모든 실험군은 n=3, 대조군 NT는 n=6임). 비-선형 적합 (단일 위상 지수형 감소) 곡선을 GraphPad Prism 프로그램을 이용하여 구하였다. 패널 F는 용량-반응 곡선 하 면적 (AUC)을 나타내며, P2M-7-DAP-함유 AON 서열과 PS-DNA 간의 AUC 감소율을 비교한다.
도 9는 선택한 FANA-함유 AON과 P2M-DAP-함유 AON 간의 용량-반응 비교를 예시한다. Flp-ln T-REx 293 세포에, 24시간 동안, FANA-함유 또는 P2M-DAP-함유 TOP1572 (서열번호 42) 및 TOP1731 (서열번호 1) 중 어느 하나의 조합물을 6 내지 1260 nM로 형질전환하였다. (A) PDE7A, (B) PDE4D 및 (C) PDE4B mRNA 발현 (평균 ± SEM)을 Quantigene 2.0 분석으로 측정하고, 대조군 유전자 β2M의 발현에 대해 정규화하였다. 비-선형 적합 (단일 위상 지수형 감소) 곡선을 GraphPad Prism 프로그램을 이용하여 구하였다. 비-형질전환 세포에서의 유전자 수준 대비, 최대 농도에서의 PDE 저해율을 표시한다 (대조군 NT는 n=6, 형질전환 조건은 n=3).
도 10은 선택한 LNA-함유 AON과 P2M-DAP-함유 AON을 비교한 것이다. Flp-ln T-REx 293 세포에, 24시간 동안, 0, 238, 476 또는 713 nM로, P2M-DAP-함유 서열 (TOP1731 -P2M-7-DAP, 서열번호 86) 또는 LNA-함유 서열 (TOP1731 -LNA1 , 서열번호 93)을 형질전환하였다. 서열 TOP1777s-P2M-7-DAP (서열번호 132)는 대조군으로 사용하였다. PDE7A mRNA 발현 (평균 ± SEM)을 Quantigene 2.0 분석으로 측정하고, 대조군 유전자 β2M의 발현에 대해 정규화하였다. 대조군 NT는 n=6, 형질전환 조건은 n=3임.
도 11은 선택한 PDE4B/4D 및 PDE7A P2M-DAP-함유 AON 조합체들의 용량-반응 효과를 예시한다. Flp-ln T-REx-293 세포에, 6 내지 1260 nM로, 표시된 AON 조합체 또는 대조군 서열 TOP1777s-P2M-7-DAP (서열번호 132)를 형질전환하였다. (A) PDE7A, (B) PDE4D 및 (C) PDE4B mRNA 발현 (평균 ± SEM)을 Quantigene 2.0 분석으로 측정하고, 대조군 유전자 β2M의 발현에 대해 정규화하였다. 비-선형 적합 (시그모이드형 용량-반응/가변성 슬로프) 곡선을 형질전환 데이타 (Log(X))에 대해 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 작성하였다.
도 12는 선택한 PDE4B/4D 및 PDE7A AON의 마우스 폐 조직에서의 반감기를 나타낸다. 기관지내 에어로졸을 통해 투여한 후, 여러 시간대에 폐 조직 균질물에서 TOP1572-P2M-7-DAP (서열번호 119), TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86), TOP1769-P2M-7-DAP (서열번호 95) 및 TOP1777-P2M-7-DAP (서열번호 101)의 잔류량을 측정하였다. 각 데이타 점은 시간대별 마우스 5마리에 대한 평균 ± SD를 나타내며, 이는 0시간대에 설정한 100%를 기준으로 AON의 회수량 %로서 나타낸다. 비선형 회귀 곡선을 Graph Pad Prism으로 작성하고, 각 AON의 반감기를 단일 위상 지수형 감소 파라미터들을 이용하여 계산하였다.
도 13은 선택한 PDE4B/4D 및 PDE7A P2M-DAP-함유 AON 조합체들의 작용 지속 기간을 나타낸다. Flp-ln T-REx-293 세포를 378 nM로 표시한 AON 조합체들 (PDE4B/4D; TOP1572-P2M-7-DAP (서열번호 1 19), PDE7A; TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86), TOP1769-P2M-7-DAP (서열번호 95), TOP1777-P2M-7-DAP (서열번호 101)) 또는 대조군 서열 TOP1777s-P2M-7-DAP (서열번호 132)로 형질전환하였다. (A) PDE7A, (B) PDE4D 및 (C) PDE4B mRNA 발현 (평균 ± SEM)을 지정된 시간대에 Quantigene 2.0 분석으로 측정하고, 대조군 유전자 β2M의 발현에 대해 정규화하였다. 데이타는 값이 1.0으로 설정된 비-형질전환된 대조군 (Ctrl NT)을 이용하여 평균 ± SEM으로 로그-시간 스케일로 나타낸다. 페어드 t-검정을 사용하여 TOP1572-P2M-7-DAP+TOP1731-P2M-7-DAP 대비 통계학적 차이를 계산하였다 (*p<0.05, **p<0.01, n=3).
도 14는 일차 폐 상피 세포 (primary lung epithelial cell)에 대한 AON의 생물학적 효과를 나타낸다. 정상 인간 기관지 상피(NHBE) 세포에, PDE4B/4D- 및 PDE7A-특이적인 P2M-DAP 변형된 AON의 조합체 (250 nM 전체 AON) (TOP1572-P2M-7-DAP (서열번호 119), 도면의 "x" 축에 TOP1572로 표시됨), TOP1769-P2M-7-DAP (서열번호 95), 도면의 "x" 축에 TOP1769로 표시됨) 또는 대조군 서열 (TOP1777s-P2M-7-DAP (서열번호 132), 도면의 "x" 축에 TOP1777s로 표시됨)을 20시간 동안 형질전환하고, 케모카인 (MCP-1), 메탈로프로테아제 (MMP-2, MMP-12) 및 사이토카인 (GM-CSF, IL1-/β)의 유전자 발현과 단백질 분비를 유도하기 위해, 4시간 동안 사이토믹스 (TNF-α, IL-1 β 및 IFN-γ 각각 10 ng/mL)로 자극하였다. 롤리프람(rolipram) (36 μΜ)인 소분자 PDE4 저해제를 대조군으로 사용하였다. (A-G) 실시간 PCR을 이용하여, mRNA 발현 (평균 ± SEM)을 정량하고, 대조군 유전자 (β2M)의 발현에 대해 정규화하였다. 대조군 NT는 n=6, 형질전환 조건은 n=3이다. 자극시킨 비-형질전환 세포 (Ctrl NT, 점선) 대비 저해율을 나타낸다. Ctrl NS는 비-형질전환 및 비-자극시킨 세포이다. 스튜던트 t-검정을 이용하여 TOP1777s-P2M-7-DAP 대비 통계학적 차이를 계산하였다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, n=3).
도 15는 폐 상피 세포에 대한 AON의 생물학적 효과를 나타낸다. A549 세포에, 20시간 동안, PDE4B/4D- 및 PDE7A-특이적인 P2M-DAP 변형된 AON의 조합체 (236 nM 전체 AON) (PDE4B/4D; TOP1572 (서열번호 42), TOP 572-P2M-7-DAP (서열번호 119), PDE7A; TOP1731 (서열번호 1), TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86), TOP1769-P2M-7-DAP (서열번호 95) 또는 TOP1777-P2M-7-DAP (서열번호 101))를 형질전환하고, 케모카인 (IL-8 및 MCP-1)의 단백질 분비를 유도하기 위해 6시간 동안 IL-1β로 자극하였다. 소분자 PDE4 저해제인 롤리프람 (36 μΜ)을 대조군으로 사용하였다. 세포 상층액을 회수하고, ELISA로 (A) IL-8 및 (B) MCP-1의 수준 (평균 ± SEM)을 측정하였다. 대조군 NT는 n=6, 형질전환 조건은 n=3이다. 자극시킨 비-형질전환 세포 (Ctrl NT, 점선) 대비 저해율을 나타낸다. Ctrl NS는 비-형질전환 및 비-자극시킨 세포이다. 통계적 유의성은 ** (p<0.01)로 표시한다. 일원식 ANOVA 및 던네트 사후-검정 대 자극한 세포 (Ctrl NT).
도 16은 시험관내 면역 반응에 대한 P2M-DAP 변형된 AON 대 P2M-DAP 비변형 AON (PS-DNA)의 효과를 비교하여 나타낸다. (A) 마우스 대식세포 (RAW 264.7) 또는 (B) 인간 PBMC를 다양한 농도의 AON (TOP1731 (서열번호 1) 또는 TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86))에 노출시켰다. 마우스 대식세포 (RAW 264.7) 역시 AON 서열 TOP062 (서열번호 ), 또는 (C) β-체인에 대한, TOP062-P2M-1 1-DAP (서열번호 ), TOP062-P2M- 2-DAP (서열번호 ), TOP057-P2M-4-DAP (서열번호 ) 및 TOP057-P2M-5-DAP (서열번호 ), 또는 (D) CCR3에 대한, AON TOP030 (서열번호 ) 또는 TOP030-P2M-15-DAP (서열번호 ), TOP031-P2M-1-DAP (서열번호 ) 및 TOP031-P2M-5-DAP (서열번호 ) 노출시켰다. 공지된 면역자극 서열인 CpG (서열번호 133)를 양성 대조군으로 사용하였고, 24시간 후에 TNF-α 및 IFN-α의 수준을 측정하였다 (n=3-5).
도 17은 장기간 투약한 후, 설치류 (마우스 또는 랫) 폐에서의 염증 반응에 대한 P2M-DAP 변형된 AON 대 P2M 비-변형된 AON (PS-DAP 또는 PS-DNA) 효과를 비교하여 나타낸다. (A) 랫에 선택한 AON들 (PS-DAP; TOP004 (서열번호 157), TOP005 (서열번호 158), PS-DNA; TOP006 (서열번호 159), TOP007 (서열번호 160))을 연속하여 14일간 지정된 용량으로 처리하고, 폐 조직에 대한 조직병리학적 분석으로 염증 반응을 평가하였다. 마우스에 선택한 AON들 (TOP1731 (서열번호 1) 또는 TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86))을 연속적으로 10일간 지정된 용량으로 처리하고, (B) 기관지폐포 세척물 (BAL) 및 (C) 폐 조직에 대한 조직병리학적 분석으로 염증 반응을 평가하였다.
도 18은 마우스에서 LPS-유발성 급성 폐 염증에 대한 P2M-DAP-변형된 PDE4B/4D 및 PDE7A AON에 의한 특이 저해 효과를 나타낸다. 마우스 (A) 또는 인간 (B) AON 조합체들 (PDE4B/4D; TOP2804-P2M-7-DAP (서열번호 138), TOP1572-P2M-7-DAP (서열번호 119), PDE7A; TOP2707-P2M-7-DAP (서열번호 136), TOP1777-P2M-7-DAP (서열번호 101)) 또는 대조군 서열 TOP1777s-P2M-7-DAP (서열번호 132), 또는 (C) 양성 대조군으로서 로플루밀라스트(roflumilast)로 사전-처리한, LPS-노출 마우스의 폐에서의 세포 유입 저해. BAL의 차별적인 세포 카운팅을 LPS에 노출한 지 3시간 후에 수행하였고, LPS-자극시킨 비히클 처리 동물과 비교함으로써 저해율을 정하였다. 나타낸 값들은 평균 ± SEM (n = 5-10)이며, 스튜던트 t-검정을 사용하여 PS로 자극한 비히클 처리 동물과 비교하여 통계학적 차이를 계산하였다 (*p<0.05, **p<0.01).
도 19는 흡연-유발성 폐 염증에 대한 PDE4B/4D와 7A P2M-DAP-변형된 AON들의 조합체 처리 효과를 나타낸다. 선택한 마우스 (A 및 D) 또는 인간 (B 및 E) AON 조합체들 (PDE4B/4D; TOP2804-P2M-7-DAP (서열번호 138), TOP1572-P2M-7-DAP (서열번호 1 19), PDE7A; TOP2707-P2M-7-DAP (서열번호 136), TOP1777-P2M-7-DAP (서열번호 101)) 또는 대조군 서열 TOP1777s-P2M-7-DAP (서열번호 132) 또는 (C 및 F) 양성 대조군으로서의 로플루밀라스트로 사전-처리한, 흡연-노출 마우스의 폐에서의 세포성 유입 저해. 흡연에 노출한 지 16-20시간째에 차별적인 BAL 카운팅을 수행하고, 흡연-노출된 비히클 처리 동물과 비교함으로써 저해율을 정하였다. 나타낸 값들은 평균 ± SEM이다.
도 20은 타겟 mRNA 및 단백질 발현 감소에 대한 선택한 DAP-함유 AON 및 P2M-DAP-함유 AON 서열들 간의 효과를 비교하여 나타낸다. (A 및 B) TF-1 세포에, 24시간 동안, TOP004 (서열번호 157) 및 TOP005 (서열번호 158), 또는 TOP062-P2M-12-DAP (서열번호 185) 및 TOP030-P2M-15-DAP (서열번호 170), 또는 TOP062-P2M-12-DAP (서열번호 185) 및 TOP031-P2M-1-DAP (서열번호 172) 중 어느 한가지 조합체를 1.34 μΜ로 형질전환하였다. Quantigene 2.0 분석을 이용하여, (A) CCR3 및 (B) β-체인 mRNA 발현을 정량하고, 비-형질전환 대조군 세포에서의 발현과 비교하여 저해율 %로 나타내었다. (C 및 D) TF-1 세포에, 24시간 동안, TOP004 (서열번호 157) 및 TOP005 (서열번호 158), 또는 TOP062-P2M-12-DAP (서열번호 185) 및 TOP030-P2M-15-DAP (서열번호 170), 또는 TOP062-P2M-12-DAP (서열번호 185) 및 TOP031-P2M-1-DAP (서열번호 172) 중 어느 하나의 조합체를 총 334 또는 668 nM로 형질전환하였다. 단백질 발현 수준을 형질전환 후 24시간째에 유세포 측정으로 측정하였다. 결과들은 평균 형광 세기 (MFI) ± SEM (n=3)로 나타내었다. 비-형질전환 대조군 (Ctrl NT) 세포 대비 저해율 %을 각 막대 상단에 나타내었다.
표에 대한 간단한 설명
표 1은 본 발명에 따른 인간 포스포다이에스테라제 (PDE) 이소형 7A에 대해 특이성을 가진 AON 서열들을 나타낸다.
표 2는 본 발명에 따른 인간 포스포다이에스테라제 (PDE) 이소형 4B 및 4D에 대해 특이성을 가진 AON 서열들을 나타낸다.
표 3은 여러가지 동물 종들 (마우스, 랫 및 원숭이) 유래의 서열들과 인간 AON 서열 간의 상동성을 나타낸다.
표 4는 본 발명에 따른 화학적 변형을 함유하는 인간 포스포다이에스테라제 (PDE) 이소형 4B, 4D 및 7A에 대해 특이성을 가진 AON 서열들을 나타낸다.
표 5는 본 발명에 따른 대조군으로서 사용되는 올리고뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
표 6은 본 발명에 따른 마우스 포스포다이에스테라제 (PDE) 이소형에 대해 특이성을 가진 AON 서열들을 나타낸다.
표 7은 시험관내 및 생체내 모델에서 타겟 유전자들과 염증 마커들을 정량하기 위해 사용한 실시간 PCR 프라이머들을 나타낸다.
표 8은 마우스의 폐에 AON 서열들을 투여한 후 기관지 폐포 세척물에서의 염증 세포의 유입과 조직병리학적 변화를 나타낸다.
표 9는 본 발명에 따른 생체내 독성 실험에 사용한 AON 서열들을 나타낸다.
표 10은 본 발명에 따른 화학적 변형을 함유하는 인간 β-체인 및 CCR3에 대한 특이성을 가진 AON 서열들을 나타낸다.
발현을 하향 조절하기 위한 포스포다이에스테라제 (PDE) 이소형에 대한 올리고뉴클레오티드들을 기술한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 혼성 포스포다이에스테르/포스포로티오에이트 벡본 (P2M)과 하나 이상의 2-아미노-2'-데옥시아데노신 (DAP) 뉴클레오티드를 가진다. P2M과 DAP 변형체들이 독성, 효과 또는 안정성 증가 및/또는 독성 감소에 의해, 항-PDE 올리고뉴클레오티드의 개선에 상승적인 작용을 나타낸다는 것을 놀랍게도 발견하게 되었다. 예를 들어, 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 예상치 못하게도 효능/독성 비율을 높게 나타낸다.
이에, 일 측면은, 타겟 포스포다이에스테라제 (PDE)를 겨냥하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 엄격 조건에서 PDE를 코딩하는 핵산 서열의 적어도 일부분과 혼성화할 수 있으며,
상기 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드가 2-아미노-2'-데옥시아데노신 (DAP)이고;
상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드들 간의 결합들이 3개 이상의 교대 단편을 포함하며, 각각의 단편은 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 하나 이상의 포스포다이에스테르 결합으로 구성된, 타겟 포스포다이에스테라제에 대한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
바람직하게는, 타겟 PDE는 PDE3A, PDE3B, PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE4D, PDE7A1, PDE7A2, PDE7A3 및 PDE7B로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 PDE7A, PDE4B 및 PDE4D이다.
일부 구현예들에서, 포스포로티오에이트 결합 : 포스포다이에스테르 결합의 비율은 30:70 - 70:30이고, 바람직하게는 40:60 - 60:40, 45:55 - 55:45 및 50:50이다.
일부 구현예들에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 타겟 PDE와의 상보성이 80% 이상, 바람직하게는 100%이다.
상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 효능/독성 비율이 0.25 보다 높다.
일부 구현예들에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 15-25개 길이이고, 바람직하게는 뉴클레오티드 18-22개 길이이다.
일 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1-72로 이루어진 군으로부터 선택되며, 하나 이상의 아데노신이 DAP로 치환된, 염기 서열을 가지며, 바람직하게는 서열번호 1, 33, 36, 41 및 42이다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 81, 86, 90, 92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 114, 119, 121, 123, 125 및 127 중 어느 하나를 포함하며, 바람직하게는 이로 구성된다.
다른 측면은, 본원에 기술된 하나의 올리고뉴클레오티드와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 본원에 기술된, 바람직하게는 PDE7A 및 PDE4B, 또는 PDE7A 및 PDE4D 각각을 겨냥하는 2 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, PDE4B 또는 PDE4D를 겨냥하는 올리고뉴클레오티드는 다른 것도 하향 조절한다.
다른 측면은 염증을 치료하기 위한 본원에 기술된 약학 조성물을 제공한다.
다른 측면은, 호흡기 질환, 바람직하게는 만성 폐색성 폐 질환, 천식, 호산구성 기침, 기관지염, 폐 동종이식의 만성 및 급성 거부 반응, 유육종증, 폐 섬유증, 비염, 부비동염, 바이러스 감염 또는 신생물 질환 중 하나 이상을 치료하기 위한 본원에 기술된 약학 조성물을 제공한다.
다른 측면은 본원에 기술된 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 호흡기 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 측면은 호흡기 질환의 치료용 약제의 제조에 있어서 본원에 기술된 약학 조성물의 용도를 제공한다.
다른 측면은 호흡기 질환을 치료하기 위한 본원에 기술된 약학 조성물의 용도를 제공한다.
다른 측면은 서열번호 1-72 중 임의의 하나의 염기 서열을 포함하며, 바람직하게는 하나 이상의 아데노신이 DAP로 치환된 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
다른 측면은 서열번호 1-127 중 임의의 하나로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
용어 "핵산" 및 "핵산 분자"는 본원에서 상호 호환적으로 뉴클레오티드, 즉, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 둘다로 구성된 분자를 지칭한다. 이 용어는 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드의 단량체 및 중합체를 포함하며, 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드는, 중합체의 경우, 5'에서 3'으로의 결합을 통해 서로 결합된다. 그러나, 결합은 예를 들어 5'에서 2'으로의 결합을 포함하는 핵산 등의, 핵산 합성 분야에 공지된 임의의 결합을 포함할 수 있다. 핵산 분자에 사용되는 뉴클레오티드는, 천연적으로 형성되는 염기 쌍들과 염기-쌍 관계를 형성할 수 있는, 천연적으로 형성된 유사체이거나, 또는 합성에 의해 제조되는 유사체일 수 있다.
"염기"는 천연적으로 발견되는 퓨린 및 피리미딘 염기들, 아데닌 (A), 티민 (T), 시토신 (C), 구아닌 (G) 및 우라실 (U) 중 임의의 하나를 포함하지만, 또한 이의 임의의 변형된 형태 또는 유사 형태를 포함한다. 염기-쌍 형성 관계를 형성할 수 있는 비-천연 염기의 예로는, 비제한적인 예로서, 아자 및 데아자 피리미딘 유사체, 아자 및 데아자 퓨린 유사체, 및 퓨린 및 피리미딘 고리의 고리 원자 및/또는 관능기들 중 하나 이상이 이종원자, 예컨대, 탄소, 불소, 질소, 산소, 황 등으로 치환되어진, 그외 헤테로사이클릭 염기 유사체를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 염기로는, 비제한적인 예로서, 이노신, 5-메틸시토신, 2-티오티민, 4-티오티민, 7-데아자아데닌, 9-데아자아데닌, 3-데아자아데닌, 7-데아자구아닌, 9-데아자구아닌, 6-티오구아닌, 이소구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 하이폭산틴 및 6-티오하이폭산틴을 포함한다. 또한, 염기는 5-플루오로시토신, 5-브로모시토신, 5-아이오도시토신, 이소시토신, N-메틸시토신, 5-아이오도우라실, 5-플루오로우라실, 4-티오우라실, 2-티오우라실, (E)-5-(2-브로모비닐)우라실, N6-메틸아데닌, 2-클로로아데닌, 2-플루오로아데닌, 2-클로로아데닌, N6-사이클로프로필-2,6-디아미노퓨린, 니코틴아미드, 2-아미노퓨린, 1,2,4-트리아졸-3-카르복스아미드를 포함할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
용어 "핵산 벡본" 또는 "뉴클레오티시드 간의 결합"은 본원에서 분자에서 뉴클레오티드를 연결하는 화학적 모이어티 구조를 지칭한다. 이는 뉴클레오티드들을 화학적으로 연결하는 임의의 수단 및 모든 수단으로부터 형성되는 구조를 포함할 수 있다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 본원에서 뉴클레오티드 약 2 내지 약 100개로 구성되는, 보다 바람직하게는 뉴클레오티드 2 내지 80개, 뉴클레오티드 4 내지 35개, 뉴클레오티드 10 내지 30개, 뉴클레오티드 15 내지 25개, 및 뉴클레오티드 18 내지 22개로 구성된 핵산 분자를 지칭한다.
아울러, 당해 기술 분야의 당업자는, 본 발명에 고려되는 실질적으로 유사한 핵산 서열들이, 본원에 예시된 서열 또는 본원에 기술된 뉴클레오티드 서열의 임의 일부분과 엄격 조건 (예, 0.5 x SSC, 0.1 % SDS, 60℃)에서 혼성할 수 있는 능력으로 정의되며, 본원에 기술된 핵산 서열들 중 임의의 것과 기능적으로 등가인 것으로 인식된다. 엄격 조건은, 매우 밀접한 유기체들로부터 유래된 기능성 효소를 복제하는 유전자들과 같이, 관련성이 먼 유기체들에서부터 매우 유사한 단편에 이르는 상동성 서열 등의, 적당히 비슷한 단편들을 스크리닝하도록 조정할 수 있다. 혼성화 후 세척이 엄격 조건을 결정한다. 바람직한 한가지 세트 조건은 15분간 실온에서 6 x SSC, 0.5% SDS로 세척하는 것으로 시작하여, 30분간 45℃에서 2 x SSC, 0.5% SDS로 세척한 다음, 30분간 50℃에서 0.2 x SSC, 0.5% SDS로 세척하는 일련의 세척 과정을 포함한다. 보다 바람직한 고도로 엄격한 조건 세트는, 마지막 단계에 0.2 x SSC, 0.5% SDS로 2번 30분 세척하는 온도를 60℃로 높이는 것 외에는, 상기와 동일한 세척을 사용하는, 보다 높은 온도를 이용하는 것이다. 다른 바람직한 매우 엄격한 조건 세트는 최종 2번의 세척을 65℃에서 0.1 x SSC, 0.1 % SDS를 이용하는 것이다.
용어 "치료", "치료하는", "치료법" 등은 일반적으로 바람직한 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미하기 위해 사용된다. 상기 효과는 질병 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 측면에서 예방학적일 수 있거나, 및/또는 질병에 대한 부분적인 또는 완전한 치유 및/또는 질병에 원인인 부작용의 완화 측면에서 치료학적일 수 있다. "치료"는 기존에 정의한 바와 같이 개체, 특히 인간에서의 모든 질환의 치료를 포괄하며, 하기를 포함한다:
(a) 질병 소양이 있을 수 있지만 아직 질병에 걸린 것으로 진단되지 않은 개체에서 질병 발생 예방;
(b) 질병의 저해, 즉 질병의 진행 저지; 또는
(c) 질병의 경감, 즉, 질병의 퇴행.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은, 담체, 부형제, 계면활성제 및 조성물에 대해 본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에 기술된 임의의 경로를 통한 투여에 독성이 아니거나 아니면 허용불가하지 않은, 환자 개체의 치료에 사용하는데 허용가능한 물질을 지칭한다.
본 발명의 제형은, 바람직하게는, 작용 부위로 직접 투여하며, 따라서 바람직하게는 비제한적인 예로서, 구강, 볼내, 폐내, 직장, 자궁내, 종양내, 코, 기관지내(intrathecal), 흡입성, 경피, 피내, 강내(intracavitary), 이온영동(iontophoretic), 눈, 질, 관절내, 귀, 경점막, 직장, 서방성 또는 장 코팅 제형들을 비롯하여, 국소이다. 전술한 임의의 것으로 제한되지 않으나, 본 발명의 제형은 또한 두개내, 근육내, 피하, 정맥내, 선내(glandular), 장기내, 림프계내, 복막내, 정맥내 및 이식형일 수 있다. 제형에 사용되는 담체는 예를 들어 고체 및/또는 액체 담체일 수 있다.
호흡기 질환 치료를 위해 투여하기 적합한 조성물/제형을 만들기 위해 본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물과 조합하기에 적합한 기타 담체에 대해서는 "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985를 참조할 수 있다.
선택적으로, 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드는 다양한 생릭학적 담체 분자와 함께 제형화될 수 있다. 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드는 또한 타겟 세포로의 유입력을 강화하는 분자와 함께 복합체를 형성할 수도 있다. 이러한 분자의 예로는, 탄수화물, 폴리아민, 아미노산, 펩타이드, 지질 및 세포 생육에 필수적인 분자가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 지질과 조될 수 있으며, 제조되는 올리고뉴클레오티드/지질 에멀젼 또는 리포좀 현탁물은 올리고뉴클레오티드의 생체내 반감기를 효과적으로 높일 수 있다.
본원에 제공되는 약학 조성물은 전술한 올리고뉴클레오티드 화합물과 한가지 이상의 약제학적으로 허용가능한 계면활성제를 포함할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 흡수를 강화하는데 적합한 계면활성제 또는 계면활성제 성분들은 미국 출원 공개번호 제 2003/0087845호에 이미 기술되어 있으며, 계면활성제와 관련한 내용은 본원에 포함된다. 상기 출원에서는, 적합한 계면활성제는 "합성 및 천연 뿐만 아니라 계면활성제 단백질 A, 계면활성제 단백질 B, 계면활성제 단백질 C, 계면활성제 단백질 D 및 계면활성제 단백질 E, 2-치환된 포스파티딜콜린 (디팔미토일 이외의 것), 디팔미토일포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티드산, 유비퀴논, 리소포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜콜린, 팔미토일-리소포스파티딜콜린, 데하이드로에피안드로스테론, 돌리콜, 설파티드산, 글리세롤-3-포스페이트, 디하이드록시아세톤 포스페이트, 글리세롤, 글리세로-3-포스포콜린, 디하이드록시아세톤, 팔미테이트, 시티딘 디포스페이트 (CDP) 디아실글리세롤, CDP 콜린, 콜린, 콜린 포스페이트의, 완전한 형태 또는 절단된 형태; 뿐만 아니라 계면활성제 성분들에 대한 천연 담체 비히클인 천연 및 인공 라멜라 바디들(lamelar body), 오메가-3 지방산, 폴리엔산, 폴리에노익산, 레시틴, 팔미틴산, 에틸렌 또는 프로필렌 옥사이드들의 비-이온성 블록 공중합체, 폴리옥시프로필렌, 단량체성 및 중합체성, 폴리옥시에틸렌, 단량체성 및 중합체성, 덱스트란 및/또는 아ㄹ카노일 측쇄를 가진 폴리(비닐아민), Brij 35TM, Triton X-100TM 및 합성 계면활성제 특히 ALEC TM, Exosurf TM, Survan TM 및 Atovaquone TM를 포함하는 것으로 기술되어 있다. 이들 계면활성제는 제형에서 복수 성분 계면활성제의 일부 또는 단독으로서 사용될 수 있거나, 또는 AON의 5' 및/또는 3' 말단에 공유적으로 결합된 부가물일 수 있다.
본 발명의 조성물의 올리고뉴클레오티드 성분은 리포좀 또는 미세결정 등의 지질 입자 또는 비히클내에 약학 제형 형태로 포함될 수 있다. 미국 특허 제 6,025,339호에 기술된 바와 같이, 상기 지질 입자는 올리고뉴클레오티드가 포함되는 한, 단층 또는 다층 등의 임의의 적합한 구조일 수 있다. N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸-암모늄에틸설페이트 또는 "DOTAP" 등의 양으로 하전된 지질이 특히 이러한 입자 및 비히클에 바람직하다. 이러한 지질 입자의 제조에 대해서는 잘 알려져 있다. 예를 들어, Janoff 등의 미국 특허 제 4,880,635호; Kurono 등의 제 4,906,477호; Wallach의 제 4,911,928호; Wallach의 제 4,917,951호; Allen 등의 제 4,920,016호; Wheatley 등의 제 4,921 ,757호 등을 참조한다.
본 발명의 조성물은, 예컨대 폐 등의 원하는 부위에 올리고뉴클레오티드 화합물을 전달하는 임의의 수단으로 투여할 수 있다. 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드 화합물들은 임의의 적정 수단에 의해 환자의 폐로 투여할 수 있지만, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 호흡가능한 입자로 구성된 에어로졸의 흡입을 통해 투여할 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드는 건조 분말 흡입기, 정량 흡입기(metered dose inhaler), 분무기, 소프트 미스트 흡입기로 투여하도록, 그리고 흡입 경로를 통해 폐에 올리고뉴클레오티드를 전달할 수 있는 임의의 기타 적합한 디바이스에 의해 투여하도록, 제형화할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 호흡가능한 크기의 입자, 예컨대 흡입시 코, 입 및 후두를 통해, 그리고 기관지와 폐의 폐포를 통해 통과할 만큼 충분히 작은 크기의 입자를 포함하는 제형으로서 호흡계로 투여할 수 있다. 일반적으로, 호흡가능한 입자는 크기가 약 0.5 미크론 - 10 미크론 범위이다. 에어로졸에 포함되는 호흡 불가한 크기의 입자는 목에 침착되어 삼켜지는 경향이 있으며, 따라서 에어로졸내 호흡 불가능한 입자의 양은 바람직하게는 최소화된다. 코 투여의 경우, 10-500 ㎛ 범위의 입자 크기가 비강내 체류를 보장하는데 바람직하다.
올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 고체 미립자 조성물은, 선택적으로, 에어로졸의 제형화를 용이하게 하도록 제공되는 분산제 뿐만 아니라 기타 치료 화합물을 포함할 수 있다. 적정 분산제는 락토스이며, 이는 안티센스 화합물과 임의의 적정 비율로, 예를 들어 1:1 중량비로 혼합할 수 있다.
에어로졸 제조를 위한 활성 화합물 (올리고뉴클레오티드 화합물(들))로 구성된 액체 약학 조성물들은 발열성 물질이 결핍된 멸균수 또는 포스페이트 완충화된 염수 등의 적정 비히클과 올리고뉴클레오티드 화합물을 조합함으로써, 제조할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 액체 입자 에어로졸제는 분무기를 이용하는 등의 임의의 적정 수단에 의해 제조할 수 있다. 분무기는 활성 성분 용액제 또는 현탁제를 좁은 벤투리관 오피스(venturi orifice)를 통한 압축 기체, 전형적으로 공기 또는 산소의 가속화를 이용하여 또는 초음파 교반을 이용함으로써 치료학적 에어로졸 미스트로 변형시키는 상업적으로 이용가능한 디바이스이다. 분무기에 사용하기 적합한 제형은 액체 담체에 활성 올리고뉴클레오티드 성분을 제형의 최대 40% w/w 함량으로, 바람직하게는 제형의 20% w/w 미만으로 포함한다. 상기 담체는 전형적으로 물 또는 바람직하게는 예를 들어 염화나트륨을 첨가하여 체액과 등장성으로 제조된 알코올 희석 수용액이다. 선택적인 첨가제로는, 제형이 멸균형으로 제조되지 않는다면, 보존제, 예를 들어 메틸 하이드록시벤조에이트, 항산화제, 항세균제, 향제, 휘발성 오일, 완충화제 및 유화제 및 기타 제형 계면활성제를 포함한다.
활성 올리고뉴클레오티드 화합물(들) 및 약제학적으로 허용가능한 계면활성제를 포함하는 고체 입자 에어로졸제는, 마찬가지로, 임의의 고체 미립자 약제 에어로졸 제조기를 이용하여 제조할 수 있다. 개체에게 고체 미립자 약제를 투여하기 위한 에어로졸 제조기는, 전술한 바와 같이, 호흡가능한 입자를 만들어내며, 약제를 미리 결정된 정량으로 포함하는 체적의 에어로졸을 인간 투여에 적합한 속도로 생성한다. 상기 활성 올리고뉴클레오티드 성분은 전형적으로 제형의 0.1 내지 100 w/w를 구성한다. 에어로졸 제조기의 예로 2번째 타입은 정량 흡입기를 포함한다. 정량 흡입기는 전형적으로 액화된 촉진제에 활성 성분의 현탁물 또는 용액 제형을 포함하는 가압식 에어로졸 디스펜서(aerosol dispenser)이다. 이들 장비는, 사용하는 동안에, 계량된 부피, 전형적으로 10 내지 150 ㎕를 전달하도록 고안된 밸브를 통해 제형을 공급하여, 활성 성분을 포함하는 미세 입자 스프레이를 생성한다. 적정 추진제로는 특정한 클로로플루오로카본 화합물, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 또는 하이드로플루오로알칸 및 이들의 혼합물을 포함한다. 제형은 부가적으로 한가지 이상의 공용매, 예를 들어, 에탄올, 유화제 및 올레산 또는 소르비탄 트리올리에이트 등의 그외 제형 계면활성제, 항산화제 및 적정 향제를 포함할 수 있다.
고체 입자 또는 액체 입자로 형성되든 상관없이, 에어로졸은, 약 1 - 150 L/분의 속도로 에어로졸 제조기에서 제조할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 범위를 한정하기 보다는 본 발명을 예시하기 위해 제공되는 실시예들을 참조함으로써 보다 쉽게 이해될 것이다.
실시예들
방법
세포 배양
A549 세포 (인간 폐 암종; ATCC; #CCL-185)는 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 햄의 F12 배지에서 배양하였다. Flp-ln T-Rex 293 세포 (인간 형질변형된 배아 신장; Invitrogen; #R780-07)는 10% FBS, 페니실린 100 U/mL 및 스트렙토마이신 100 ㎍/mL이 첨가된 DMEM에서 배양하였다. NHBE 일차 세포 (정상적인 인간 기관지 상피; Cederlane; #CC-2540)는 2 ml BPE, 0.5 mL 하이드로코르티손, 0.5 mL hEGF, 0.5 mL 에피네프린, 0.5 mL 트랜스페린, 0.5 mL 인슐린, 0.5 mL 레티노익산, 0.5 mL 트리아이도티로닌 (Cederlane, cat# CC-3170)이 첨가된 BEBM 배지 (500 mL)에서 배양하였다. CYNOM-K1 세포 (시노몰구스 원숭이 피부 배아; ECACC; #90071809)는 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 1 % 비-필수 아미노산, 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 EMEM (EBSS) 배지에서 배양하였다. L2 세포 (랫 폐 상피; ATCC; #CRL-149)는 10% FBS, 페니실린 100 U/mL 및 스트렙토마이신 100 ㎍/mL이 첨가된 F12K 배지에서 배양하였다. NIH3T3 세포 (마우스 섬유모세포; ATCC; #CRL-1658)는 10% BCS, 페니실린 100 U/mL 및 스트렙토마이신 100 ㎍/mL이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. RAW264.7 세포 (백혈병 단핵구 대식세포; ATCC; # TIB-71)는 10% FBS, 1 mM 소듐 피루베이트, 페니실린 100 U/mL 및 스트렙토마이신 100 ㎍/mL이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 인간 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)는 건강한 자원자들로부터 수득하였다. PBMC는 정상 공여자의 EDTA K3 혈액을 Ficoll-Hypaque 밀도 구배로 원심분리하여 수득하였다. PBMC는 48웰 플레이트 (현탁 세포용)에서 AIM-V 배양 배지 중에 0.2 x 106 세포/200 ㎕로 접종하였다. TF-1 세포 (적백혈병)는 2 mM L-글루타민, 10 mM HEPES, 4.5 g/L 글루코스, 1.5 g/L 소듐 바이카보네이트, 1 mM 소듐 피루베이트, 10% 비-불활성화된 FBS 및 2 ng/mL rhGM-CSF가 첨가된 RPMI-1640에서 유지시켰다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 (AON)의 제조
포스포로티오에이트-DNA (PS-DNA) AON (Sigma Genosys), 포스포로티오에이트-FANA (PS-FANA) AON (Topigen, Montreal 또는 UCDNA, Calgary), DAP, P2M 및 P2M-DAP AON (Biospring, Germany), 2'-OMe AON (Biospring, Germany) 또는 Lock 핵산 (LNA) AON (Exiqon, USA)을 멸균수에 재현탁하고, 생체내 실험을 위해 PBS에 희석하거나 또는 시험관내 형질전환을 위해 Opti-MEM에 희석하였다.
세포에 AON 형질전환
A549 세포는 항생제 없이 10% 혈청이 첨가된 HAM-F12 배지에 0.25 X 106 세포/mL (200 ㎕/웰, 48-웰 플레이트)로 접종한 다음, AON/리포펙타민 복합체 (비율, 1 ㎍ AON: 1 ㎕ 리포펙타민 2000)를 이용한 형질전환 전에, 37℃에서 밤새 배양하였다. Flp-ln T-Rex 293 세포는 항생제 없이 10% 혈청이 첨가된 DMEM 배지에 0.9 X 106 세포/mL (200 ㎕/웰, 48-웰 플레이트)로 접종한 다음, 전술한 바와 같이 형질전환 수행 전에 37℃에서 밤새 배양하였다. NHBE 세포는 항생제 없이 BEBM 완전 배지에 0.5 X 106 세포/mL (200 ㎕/웰, 48-웰 플레이트)로 접종한 다음, 전술한 바와 같이 형질전환 수행 전에 24시간 동안 배양하였다. L2 세포는 항생제 없이 10% 혈청이 첨가된 F12K 배지에 1.75 X 106 세포/mL (400 ㎕/웰, 24-웰 플레이트)로 접종한 다음, 전술한 바와 같이 형질전환 수행 전에 37℃에서 밤새 배양하였다. CYNOM-K1 세포는 항생제 없이 10% 혈청이 첨가된 EMEM 배지에 0.25 X 106 세포/mL (200 ㎕/웰, 48-웰 플레이트)로 접종한 다음, AON/리포펙타민 복합체 (비율, 1 ㎍ AON: 2 ㎕ 리포펙타민 2000)을 이용하여 형질전환 수행 전에 37℃에서 밤새 배양하였다. NIH 3T3 세포는 항생제 없이 10% 혈청이 첨가된 DMEM 배지에 0.25 X 106 세포/mL (200 ㎕/웰, 48-웰 플레이트)로 접종한 다음, AON/리포펙타민 복합체 (비율, 1 ㎍ AON: 3 ㎕ 리포펙타민 2000)을 이용하여 형질전환 수행 전에 37℃에서 밤새 배양하였다. 형질전환 전날, TF-1 세포를 다음날 0.6 - 0.8 x 106 세포/mL의 밀도가 되도록 희석하였다. 형질전환 당일에, 세포를 항생제 없이 배양 배지 400 ㎕에 밀도 0.5x106 세포/웰로 12웰 플레이트에 접종한 다음, AON과 리포펙타민 2000 형질전환 시약을 핵산 1 ㎍ : 지질 1 ㎕의 비율로 혼합하여 형질전환하였다. 이 복합체를 20분간 인큐베이션한 다음, 세포에 처리하여 37℃ 5% C02에서 24시간 처리하였다.
RNA 추출
RNA를 퀴아젠 사의 QiaVac 24 매니폴드를 이용하여 RNAeasy 미니 키트 프로토콜에 따라 세포 펠렛으로부터 추출하고, 퀴아젠 사의 절차에 따라 DNase를 처리하였다. RNA를 제조사 (Invitrogen)의 프로토콜에 따라 RiboGreen 시약을 이용하여 정량하였다.
역전사 (RT)
RT-PCR 키트 (Invitrogen)의 슈퍼스크립트 제1 가닥 합성 시스템을 이용하여, 총 반응 부피 20 ㎕로, 제1 가닥 cDNA 제조를 수행하였다. RNA 1 ㎍을 5분간 65℃에서 각 dNTP 0.5 mM, 올리고 (dT)18 0.5 ㎍, 2 pmol의 PDE4B 유전자 특이 역방향 프라이머 (5'- tctttgtctccctgctgga-3')와 함께 먼저 변성시키고, 적어도 1분간 얼음에서 냉각시켰다. 혼합물을 2분간 42℃에서 인큐베이션하고, 1X 제1 가닥 완충액, 10 mM DTT 및 40 유닛의 Superscript II RT가 포함된 2차 프리-믹스를 첨가하였다. 반응물을 10분간 42℃에서, 1시간 동안 50℃에서 인큐베이션하고, 15분간 70℃로 가열하여 불활성화하였다.
실시간 PCR
PCR 반응 혼합물은, 각 PCR 프라이머 0.4 mM 및 LC FastStart DNA Master SYBR Green 1 PLUS 4 ㎕가 존재하는 총 부피 20 ㎕에서, cDNA 반응물 3 ㎍로 수행하였다. 단계 1 (변성): 95℃, 10분 (속도 20°C/초); 단계 2 (사이클 x 40): 95℃, (속도 20℃/초); 57℃ 또는 59℃, 5초 (속도 20℃/초) 72℃, 10초 (속도 20℃/초); 단계 3 (용융 곡선): 95℃ (속도 20℃/초); 70℃, 30초 (속도 20℃/초); 95℃, 0초 (속도 0.1℃/초); 단계 4 (냉각): 40℃, 30초 (속도 20℃/초).
각 유전자에 사용되는 PCR 프라이머 서열들은 도 6에 나타낸다. PCR 산물들의 정량은 RelQuant 프로그램 (Roche)을 이용하여 수행하였다.
Quantigene 분석
세포를 회수하여, Quantigene® 2.0 키트 (Affymetrix)의 1X 라이시스 혼합물 중에서 30분간 55℃에서 라이시스하였다. 세포 라이세이트를 특이 프로브 세트의 존재 하에 Quantigene® 2.0 포착 플레이트에서 55℃에서 밤새 혼성화하고, mRNA 신호를 (55℃에서) 증폭 및 (50℃에서) 검출하였다. mRNA 발현을 Luminoskan을 이용하여 발광 신호를 선형적으로 정량하였다.
단백질 정량
β-체인 또는 CCR3 단백질 측정을 위해, 형질전환하고 24시간 후 TF-1을 회수하여, PBS로 2번 세척한 다음, 4℃에서 1시간 동안 에오탁신-바이오틴 또는 IL-3-바이오틴과 함께 인큐베이션하였다. 그 후, 아비딘-FITC를 첨가하고, 세포를 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2번 헹구고, 유세포 측정 분석을 수행하기 전에 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다.
시험관내 기능성 분석
형질전환 기간 종료시에, NHBE 세포를 10 ng/mL 사이토믹스(cytomix) (TNF-α + IL-1β + IFN-γ)를 사용하여 4시간 자극하였다. A549 세포는 형질전환 기간 종료시에 10 ng/mL IL-1β를 사용하여 6시간 동안 자극하였다. 염증 마커들의 mRNA 발현을 실시간 PCR로 분석하였다. 단백질 분비는 멀티플렉스 ELISA (SearchLight service, Aushon)에 의해 세포 상층액에서 측정하였고, 알라마르블루 (alamarBlue) 분석으로 측정한 세포 생존성에 대해 정규화하였다.
시험관내 면역자극 분석
RAW264.7 세포는 24웰 플레이트에 항생제 없이 완전 배지에 0.13 X 106 세포/mL로 접종하여, AON 서열 또는 대조군 CpG 면역자극 서열의 존재 하에 24시간 동안 인큐베이션하였다. PBMC는 48웰 플레이트에 항생제 없이 AIM-V 배지에 1 X 106 세포/mL로 접종하고, 전술한 바와 같이 처리하였다. 처리 후, 배양 상층액을 수집하고, 제조사의 지시에 따라 ELISA로 단백질 함량을 분석하였다.
마우스 폐에서의 반감기 결정
CD-1 수컷 마우스 (25-30 g, Charles River)를, 처리를 시작하기 약 1주일 전에, 동물 사육소 (Mispro, Montreal, Canada)에서 적응시켰다. 마우스를 이소플루란 (또는 케타민/자일라진, t = 0h 시간대)으로 마취시키고, 삽관하였다. AON 에어로졸 (0.2 mg/kg)을 마이크로스프레어 (Penn-Century)를 이용하여 기도에 투여하였다. AON 전달 직후 (시간 = 0h) 또는 전달 후 다양한 시간대 (시간 = 2 h, 8 h, 16 h, 24 h, 48 h, 72 h 및 144 h)에, 마우스를 케타민/자일라진을 이용하여 희생시켰다. 폐를 적출하여, 액체 질소에 급속 동결시킨 다음, 조직 호모게네이트를 제작할 때까지 -80℃에 보관하였다. 폐 조직은 라이시스 완충액에서 호모게나이징하고, 원심분리한 다음 수득항 상층액을 급속 냉동시켰다. 혼성화-효소-연결된-면역흡착-분석 (H-ELISA) 방법을 사용하여, 특이 프로브 세트들을 이용히여 각 AON의 정량화를 수행하였다. 매트릭스로서 마우스 폐 조직 호모게네이트를 이용하여 표준 곡선을 각 AON에 대해 구하였다.
설치류의 폐 염증 모델
모든 동물 실험들에서, 실험에 사용한 마우스 (수컷 C57BI/6, Charles Rivers Laboratory) 하우징과 케어는 캐나다 의회의 동물 케어 (CCAC) 가이드라인에 준하여 미스프로 바이오텍의 동물 케어 및 사용 위원회로부터 승인받은 프로토콜에 따라 제공하였다. 1-5일 및 8-12일째에, 마우스 그룹들을 이소플루란으로 마취시키고, 삽관하였다. 비히클 (내독소-결핍 PBS) 또는 AON 에어로졸을 마이크로스프레어 (Penn-Century)를 이용하여 기도에 투여하였다. 기관지폐포 세척 (BAL)을 마지막 처리한 지 24시간 후에 수행하고, 표준 형태 척도를 이용하여 적어도 세포 300개에서 차별적인 세포 카운트를 구하였다. 폐 조직을 회수하여 포르말린에 고정한 다음, 파라핀 단편을 준비하였다. 조직병리학적 평가를 헤마톡실린 & 에오신 염색 슬라이드에 대해 수행하였다.
랫 실험은 GLP 규약에 준하여 캐나다 ITR 레보레이토리스 (Baie d'Urfe, QC)에서 수행하였다. 간략하게는, 스프라그-다울리 랫 수컷 및 암컷에 비히클 또는 5 mg/kg의 TOP004/TOP005 또는 TOP006/TOP007 (염수 중의 1 :1 w/w 비율)을 흡입 노출 시스템을 이용한 에어로졸제로서 14일 연속 용량으로 투여하였다. 동물은 식품 섭취에 대한 영양 평가 등의 임상적인 증상들을 매일 1-2회 조사하고, 매주 체중을 측정하였다. 심전도 (ECG) 활성을 기록하고, 눈 검사를 실험 전과 14일째에 동물에서 수행하였다.
최종 투여 후 1일째에 (15일), 랫 (8/성별/그룹)을 안락사시켰다. 종료 절차에는 전신 검시, 수집 및 조직 약 40종의 보존, 모든 주요 장기들의 무게 측정을 포함시켰다. 모든 동물에서 호흡관 조직 (비강, 비인두, 후두, 인두, 기도, 기관지, 기관분기부와 기관지 림프절을 비롯한 폐)을 광 현미경으로 검경하였고, 모든 수집한 조직들은 모든 고용량군과 대조군 동물들에서 조사하였다.
리포폴리사카라이드 (LPS)-유발성 폐 염증에 대한 마우스 모델
1일째에, 마우스 그룹을 이소플루란으로 마취시키고, 삽관하였다. 비히클 에어로졸 (내독소-결핍 PBS), AON 에어로졸 또는 대조군 에어로졸을 마이크로스프레이어 (Penn-Century)를 이용하여 기도에 투여하였다. 1일째에, 다른 그룹의 마우스에는 비히클 (0.5% 메틸셀룰로스) 또는 로플루밀라스트 (Rasayan)를 위관 영양법으로 처리하였다. 약물 처리 1시간 후에, 플렉시글라스 챔버 안에서 마우스를 염수 또는 LPS (0.04 mg/mL)에 15분간 노출시켰다. 노출 후 3시간째에 BAL을 수행하고, 표준 형태 척도를 이용하여 적어도 세포 300개에서 차별적인 세포 카운트를 결정하였다.
담배 흡연-유발성 폐 염증에 대한 마우스 모델
1일, 3일, 6일 및 8일째에 또는 6일 및 8일째에, 마우스 그룹들을 케타민과 자일라진 (60 mg/kg 및 12 mg/kg, i.p.)으로 마취하고, 삽관하였다. 비히클 에어로졸 (내독소-결핍 PBS), AON 에어로졸 또는 대조군 에어로졸을 마이크로스프레이어 (Penn-Century)를 이용하여 기도에 투여하였다. 6-9일째에, 다른 그룹의 마우스는 비히클 (0.5% 메틸셀룰로스) 또는 로플루밀라스트 (Rasayan)를 위관 영양법으로 처리하였다. 6 - 9일째에, (약물 처리 3시간 후에), 마우스의 코만 1일 당 2개의 2R4f 레퍼런스 담배 (University of Kentucky) 연기에 노출시켰다. 담배 연기는 코만 노출하는 시스템 (Proto-Werx)을 이용하여 분당 1 puff (20 ml)의 속도로 마우스에 전달하였다. BAL을 마지막 담배 연기에 노출시킨 후 18-24시간째에 수행하고, 표준 형태 척도를 이용하여 적어도 세포 300개에서 차별적인 세포 카운트를 결정하였다.
실시예 1 : 인간 PDE7A에 대한 AON의 효과
포스포다이에스테라제 (PDE) 이소형 7A을 겨냥하는 AON 서열들을 표 1에 나타낸다. Flp-ln T-Rex 293 세포주에 지정된 AON 서열을 형질전환한 후 유전자 발현 감소를 나타낸, 몇몇 선택한 포스포로티오에이트 (PS) AON 서열 (PS-DNA)의 효과를 도 1에 나타낸다. PDE7A mRNA 수준을 감소시키는 효과를 대조군 센스 서열 TOP1731s (서열번호 128)의 효과와 비교함으로써, 선택한 AON 서열의 특이성을 평가하였다. 표 1에 열거된 AON 비교 활성은 비-형질전환 대조군 (Ctrl NT)에 상대적인 PDE7A mRNA의 평균 저해율로서 표시된다.
실시예 2: 인간 PDE4D 및 PDE4B에 대한 AON의 효과
PDE 이소형들 4D 및 4B를 겨냥하는 AON 서열들을 표 2에 나타낸다. Flp-ln T-Rex 293 세포주에 지정된 AON 서열을 형질전환한 후 유전자 발현 감소를 나타낸, 몇몇 선택한 PS-DNA AON 서열의 효과를 도 2에 나타낸다. PDE4D (도 2A) 및 PDE4B (도 2B) mRNA 수준을 감소시키는 효과를 대조군 센스 서열 TOP1572s (서열번호 131)의 효과와 비교함으로써, 선택한 AON 서열의 특이성을 평가하였다. 표 2에 열거한 AON 비교 활성은 비-형질전환 대조군 (Ctrl NT)에 상대적인 PDE7A mRNA의 평균 저해율로서 표시된다.
실시예 3: 종간 PDE mRNA 수준 감소에 대한 AON의 효과
인간 PDE 유전자를 타겟팅하는 몇몇 AON 선택 서열들을, 다른 종들의 PDE 유전자 서열, 특히 마우스, 랫 및 원숭이 서열들과의 상동성을 최대화하도록 설계하였다. 표 3은 이들 다른 종들 간에 선택한 AON 서열들의 서열 상동성과 미스매치 수를 나타낸다. 도 3은 마우스 세포주인 NIH 3T3에 24시간 형질전환한 후, 몇몇 선택한 AON (PDE7A; TOP1731 (서열번호 1), TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86), TOP1769 (서열번호 33), TOP1769-P2M-7-DAP (서열번호 95), TOP1777 (서열번호 41), TOP1777-P2M-7-DAP (서열번호 101), TOP2707-F3 (서열번호 134); PDE4B/4D, TOP1572 (서열번호 42), TOP1572-P2M-7-DAP (서열번호 119), TOP2804-F1 (서열번호 137))에 의한, PDE7A (도 3A), PDE4D (도 3B) 및 PDE4B (도 3C) mRNA 수준의 특이적인 감소를 보여준다. 상기 AON 선택 서열들의 저해 활성은 또한 L2 세포의 경우 랫 PDE mRNA (도 4A-C), 그리고 CYNO-K1 세포의 경우 원숭이 PDE mRNA (도 5A-C)에서 관찰되었다.
실시예 4: 타겟 mRNA 낫다운에 대한 효과 증가가 확인된 P 2 M 변형 및 DAP 변형을 이용한 AON
본 실시예는, P2M 변형 및 DAP 변형을 AON의 화학구조에 병합하였을 때, 다양한 mRNA 타겟에 대한 특이적인 AON의 효과 강화에 관한 것이다. 표 4a-4d 및 10a-10b는 DAP 잔기 및 P2M 연결로 변형된 AON 조성을 나타낸다.
선택한 PS AON 서열의 아데노신 염기들을 모두 2-아미노-2'-데옥시아데노신 염기 (PS-DAP)로 치환하고, 24시간 형질전환한 Flp-ln T-Rex 293 세포에서, 타겟 mRNA의 발현 감소 효과에 대해, 비변형 PS-DNA AON 서열과 효과를 비교하였다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, DAP 변형은, 비변형 버전과 비교하여, PDE7A 감소에 대해 TOP1731 (PS-DNA; TOP 731 (서열번호 1), PS-DAP; TOP 731-DAP (서열번호 74))의 효과 증가를 제공하지 않거나 (도 6A), 또는 PDE4D (도 6B) 및 PDE4B (도 6C) 감소에 대해 TOP1572 (PS-DNA; TOP1572 (서열번호 42), PS-DAP; TOP1572-DAP (서열번호 107))의 효과 증가를 제공하지 않았다.
도 7에서, Flp-ln T-Rex 293 세포에, 24시간 동안, 236 nM의 PDE7A-특이적인 AON (A) TOP1731 (서열번호 1), (B) TOP1769 (서열번호 33) 또는 (C) TOP1777 (서열번호 41)을 포스포로티오에이트 조성 (PS-DNA)으로 또는 P2M 연결 변형을 포함하는 AON (P2M; TOP1731-P2M-7 (서열번호 85), TOP1731 -P2M-9 (서열번호 89), TOP1731-P2M-10 (서열번호 91), TOP1769-P2M-7 (서열번호 94), TOP1769-P2M-9 (서열번호 96), TOP1769-P2M-10 (서열번호 98), TOP1777-P2M-7 (서열번호 100), TOP1777-P2M-9 (서열번호 102), TOP1777-P2M-10 (서열번호 104))을 도 7에 제시된 설명에 기술된 바와 같이 형질전환하였다. P2M 연결을 가진 TOP1731, TOP1769 또는 TOP1777의 변형체 서열 (TOP1731-P2M-7 (서열번호 85) TOP1769-P2M-7 (서열번호 94) TOP1777-P2M-7 (서열번호 100))은 타겟 유전자의 발현을 저해하는 AON 효과를 강화하였으며, AON 활성에 대한 이러한 변형의 이점을 명확하게 나타내었다 (도 7A-C).
P2M 연결 변형을 포함하는 AON 서열에 DAP 염기 변형을 적용하였다. 도 7은, DAP 염기가 타겟 유전자 발현을 저해하는 P2M 변형된 AON 서열 (TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86), TOP1769-P2M-7-DAP (서열번호 95), TOP1777-P2M-7-DAP (서열번호 101))의 효과를 더욱 강화한다는 것을 나타내는 것으로, AON 활성에 대한 DAP 변형과 P2M 연결 변형의 상승적인 효과가 명확하게 확인된다 (도 7A-C).
도 8에서, Flp-ln T-Rex 293 세포에, 24시간 동안, 15 내지 1200 nM 범위에서 농도를 증가시키면서, PDE7A-특이적인 AON (A) TOP1731 (서열번호 1), (B) TOP1769 (서열번호 33) 또는 (C) TOP1777 (서열번호 41) 또는 PDE4B/4D-특이적인 AON (D-E) TOP1572 (서열번호 42)를 포스포로티오에이트 조성 (PS-DNA)으로서, 또는 DAP 염기와 P2M 결합 변형을 포함하는 형태로서 (P2M-DAP; TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86), TOP1769-P2M-7-DAP (서열번호 95), TOP1777-P2M-7-DAP (서열번호 101), TOP1572-P2M-7-DAP (서열번호 119)), 도 8에 제공된 설명에 기술된 바와 같이, 형질전환하였다. 도 8의 결과는, DAP 염기 변형과 P2M 연결 변형이, PS-DNA와 비교하여, AON 서열들의 활성을 강화할 뿐만 아니라 이러한 변형들이 AON 서열이 도달할 수 있는 최대 타겟 mRNA 저해 활성을 놀랍게도 증가시킴을 보여준다 (도 8A-F). 활성 증가는, 포스포로태오에이트/포스포다이에스테르 비율이 낮을수록 전통적으로 안정성이 감소한다고 생각되기 때문에, 놀랍운 일이다 (실제, P2M-7-DAP는 PS-DNA에 비해 반감기가 짧음, 아래 실시예 5 참조). 아울러, 최대 타겟 mRNA 저해에 대한 유익한 증가는, 안정성 변화가 활성에 영향을 줄 가능성이 있었지만 최대 저해에는 그렇지 않았기 때문에 특히 놀라운 일이었다. 실시예 4에서 전술한 바와 같이, PS-DNA를 DAP로만 변형시키는 경우 저해에는 별다른 효과가 없었다.
도 9 및 10은, AON 활성을 개선시키기 위해 사용된 다른 변형들을 DAP 염기 및 P2M 연결 변형과 비교하여 나타낸다. 도 9에서, Flp-ln T-Rex 293 세포에, 24시간 동안, 6 - 1260 nM의 범위에서 농도를 증가시키면서, PDE4B/4D AON 서열의 FANA-함유 버전 또는 P2M-DAP-함유 버전 (TOP1572-P2M-7-DAP (서열번호 1 19); TOP1572-F2 (서열번호 106))과 PDE7A AON 서열 (TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86); TOP1731-F3 (서열번호 73))의 조합을 형질전환하였다. 비변형 PS-DNA AON 서열을 이용한 비교 분석에서 관찰되는 바와 마찬가지로, 결과들은, P2M-DAP 변형이 FANA-함유 AON 서열과 비교하여 최대 타겟 mRNA 저해성이 보다 우수하다는 것을 보여준다 (도 9A-C).
도 10에서, Flp-ln T-Rex 293 세포에, 24시간 동안, PDE7A AON 서열의 LNA(locked nucleic acid)-함유 버전 또는 P2M-DAP-함유 버전 (TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86); TOP1731-LNA1 (서열번호 93))을, 최대 713 nM로 농도를 증가시키면서 형질전환하였다. LNA AON은, mRNA 발현을 저해하는데 가장 강력한 것으로 입증되었으며, 가장 기대되는 화학적 변형인 것으로 확인된 바 있다 (Kurreck J 2003, Eur. J. Biochem, 270:1628-1644; Jepsen and Wengel 2004, Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 7:188-194). 도 10의 결과는, DAP 염기 변형과 P2M 연결 변형이 LNA에 비해 AON 서열의 활성을 강화함을 나타낸다.
도 11에서, Flp-ln T-Rex 293 세포에, 24시간 동안, PDE4B/4D와 PDE7A P2M-7-DAP-함유 AON 서열들의 조합 (PDE4B/4D: TOP1572-P2M-7-DAP (서열번호 1 19); PDE7A: TOP1731 -P2M-7-DAP (서열번호 86); TOP1769-P2M-7-DAP (서열번호 95), TOP1777-P2M-7-DAP (서열번호 101) 또는 대조군 서열 TOP1777s-P2M-7-DAP (서열번호 132)를 최대 1260 nM으로 농도를 증가시키면서 형질전환하였다. 도 10의 결과는, PDE4B/4D와 PDE7A의 모든 조합이 강력한 타겟 mRNA 낫다운을 제공함을 나타낸다.
도 20에서, TF-1 세포에, 24시간 동안, β-체인과 CCR3 PS-DAP의 조합 (TOP004 (서열번호 157) 및 TOP005 (서열번호 158)) 또는 P2M-DAP-함유 AON (β-체인: TOP062-P2M-12-DAP (서열번호 185); CCR3: TOP031-P2M-1-DAP (서열번호 172); TOP030-P2M-15-DAP (서열번호 170))를, 농도를 최대 1.34 μΜ로 증가시키면서 형질전환하였다. 도 20의 결과는, P2M-DAP-함유 AON 서열들의 모든 조합이 보다 강력한 타겟 mRNA 및 단백질 낫다운을 제공함을 나타낸다.
실시예 5: P 2 M-DAP로 변형된 AON은 연장된 작용 기간을 나타낸다
본 실시예는 P2M-DAP-함유 AON 서열들의 효과 연장에 관한 것이다. P2M 변형은 PS 결합율이 낮아, 뉴클레오시다제 분해에 대한 내성이 거의 없어지므로, AON 안정성을 낮출 것으로 예상되며, 이로써 생체내 및 시험관내 활성은 단축될 것이다. P2M-DAP-함유 AON 서열들의 반감기를 폐 조직에서 평가하였다. P2M-DAP-함유 AON 서열들을 마우스에 기관지내 에어로졸을 통해 투여하고, 투여 후 여러 시간대에 AON 함량을 측정하였다. 도 12는, P2M-DAP-함유 AON 서열들의 조직 반감기가 5 시간 보다 짧다는 것을 보여준다. P2M-DAP-함유 AON 서열들의 짧은 반감기는, 비변형 PS-DNA AON 서열에서 측정되는 반감기와 대조된다. TOP1731 (서열번호 1) 및 TOP1572 (서열번호 42)의 폐 조직 반감기는 각각 22시간 및 26시간이다. DAP-염기 변형만 추가된 AON 서열 TOP1731-DAP (서열번호 74) 및 TOP1572-DAP (서열번호 107)는 비변형 PS-DNA 서열과 유사한 수준의 반감기를 가진다.
도 13에서, Flp-ln T-Rex 293 세포에, 24시간 동안, PDE4B/4D- 및 PDE7A-특이적인 AON들의 조합을 378 nM (전체 AON)로 형질전환하고, 시간 경과에 따라 타겟 유전자의 발현을 서열들 (PDE4B/4D; TOP1572-P2M-7-DAP (서열번호 1 19), PDE7A; TOP1731 -P2MP2M-7-DAP (서열번호 86), TOP1769-P2M-7-DAP (서열번호 95), TOP1777-P2M-7-DAP (서열번호 101)) 또는 대조군 서열 (TOP1777s-P2M-7-DAP (서열번호 132)에서 분석하였다.
놀랍게도, 비교적 짧은 반감기에도 불구하고, DAP 염기와 P2M 연결이 변형된 AON 서열들이 시험관내에서 최대 72시간의 지속적인 저해 활성을 나타내었다 (도 13A-C).
실시예 6: 세포의 생물학적 기능에 대한, P 2 M-DAP 화학적 변형이 추가된 AON의 효과
본 실시예는 여러가지 세포 타입의 생물학적 기능, 특히 사이토카인 및 케모카인의 분비에 대한, P2M-DAP-함유 AON의 효과에 관한 것이다. 사이토카인과 케모카인은 세포 활성화 및 동원의 중요한 매개인자이지만, 메탈로프로테아제 (MMP)는 조직 리모델링의 중요한 조절인자이다. 폐 상피 세포는 호중구 및 단핵구/대식세포 등의 면역 세포의 동원을 유도하는 케모카인, 사이토카인 및 메탈로프로테아제의 분비를 통해 염증성 호흡기 질환의 병리생리학에 역할을 할 수 있다. 인터루킨-8 (IL-8/CXCL8) 및 단핵구 주화성 단백질-1 (MCP-1/CCL2) 수준은 COPD 환자들에서 증가된다 (Szilasi M et al. Pathology Oncology Research. 2006, 12:52-60). IL-8과 MCP-1의 수준은 각각 호중구와 대식세포 동원에 관여할 수 있다. 마찬가지로, MMP는 COPD의 병인에 기여할 수 있다 (Baraldo et al., Chest 2007, 132:1733-40). MMP-2와 MMP-12의 발현은 COPD 환자들에서 증가한다.
도 14에서, 정상적인 인간 기관지 상피 (NHBE) 세포를 PDE4B/4D- 및 PDE7A-특이적인 AON 서열의 조합 (TOP1572-P2M-7-DAP (서열번호 119), TOP1769-P2M-7-DAP (서열번호 95)) 또는 대조군 서열 (TOP1777s-P2M-7-DAP (서열번호 132)) 총 250 nM로 20시간 형질전환한 다음, 4시간 동안 10 ng/mL 사이토믹스 (TNF-α + ΙL-1β + IFN-γ)로 자극하였다. 그 결과, (D) MCP-1 , (E) MMP-2, (F) MMP-12 및 (G) IL-1 β의 유전자 발현이 NHBE 세포의 자극 후 증가되었다. P2M-DAP 변형된 PDE4B/4D- 및 PDE7A-특이적인 AON 서열들의 조합 (TOP1572-P2M-7-DAP (서열번호 119), TOP1769-P2M-7-DAP (서열번호 95))이 타겟 유전자 발현을 제한할 수 있었으며 (도 14A-C), 유전자 발현의 유도를 차단할 수 있었다 (도 14D-G). MCP-1, MMP-2, MMP-12 및 IL-1β의 발현에 대한 AON의 활성은, 사용된 롤리프람의 농도가 AON 보다 >2-log 많다는 것을 고려한다면, 소분자 PDE4 저해제인 롤리프람의 활성 보다 현저하게 높은 것이다.
도 15에서, 폐 상피 A549 세포를 PDE4B/4D- 및 PDE7A-특이적인 AON 서열들의 조합 (PDE4B/4D; TOP1572 (서열번호 42), TOP1572-P2M-7-DAP (서열번호 119), PDE7A; TOP1731 (서열번호 1), TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86), TOP1769-P2M-7-DAP (서열번호 95), TOP1777-P2M-7-DAP (서열번호 101)) 총 238 nM로 20시간 동안 형질전환한 다음, 6시간 동안 IL-1β로 자극하여, IL-8/CXCL-8 및 MCP-1 /CCL2의 단백질 분비를 유도하였다. AON의 DAP 염기 변형과 P2M 연결 변형은 전-염증성 사이토카인인 IL-8/CXCL-8과 MCP-1/CCL2의 분비를 제한하는 AON의 활성을, 비변형된 (PS-DNA) AON에 비해, 강화하였다.
실시예 8: P 2 M-DAP 변형된 AON들에 대한 시험관내 및 생체내 반응
본 실시예는 마우스에 장기간 투약한 후 시험관내 뿐만 아니라 생체내에서 P2M-DAP 변형된 AON의 상대적인 면역 및 염증 반응의 감소에 관한 것이다. 도 16 (A, B, C 및 D)은 비변형 PS-DNA 서열 TOP1731 (서열번호 1), TOP062 (서열번호 179) 및 TOP030 (서열번호 161), 또는 P2M-DAP-변형된 서열들인 TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86), TOP062-P2M-11-DAP (서열번호 184), TOP062-P2M-12-DAP (서열번호 185), TOP057-P2M-4-DAP (서열번호 193), TOP057-P2M-5-DAP (서열번호 194), TOP030-P2M-15-DAP (서열번호 170), TOP031-P2M-1-DAP (서열번호 172) 또는 TOP031-P2M-5-DAP (서열번호 176) 중 어느 하나에 24시간 노출하였을 때, 마우스 대식세포 (RAW 264.7 세포) 및 인간 PBMC의 시험관내 반응을 나타낸 것이다. 공지된 면역자극 서열 (CpG (서열번호 133))을 양성 대조군으로 사용하였다. 그 결과, PS-DNA 서열이 각각 RAW 264.7 및 PBMC에서 TNF-α 및 IFN-α의 용량-의존적인 분비를 유도하지만, P2M-DAP 변형을 병합하면 이러한 면역자극 효과가 완전히 없어지는 것으로 나타났다. 이러한 결과는, 본 실험에 양성 대조군으로 사용된 CpG 서열 (서열번호 133) 등의, 공지된 면역자극 서열들의 보다 광범위한 활성이 혼성 PS/PO 결합의 존재에 의존적인 것으로 알려져 있다는 점을 고려하면, 놀라운 일이다 (Krieg A. 2002 Annu. Rev. Immunol, 20:709-760).
비변형된 PS-DNA와 DAP-변형된 AON 서열의 반응을 또한 랫에 14일 연속 용량 5 mg/kg을 흡입시켜 투여한 후 생체내에서 평가하였다 (염수를 대조군으로 사용함). 폐 조직의 조직병리학적 분석을 마지막 AON 처리 24시간 후에 수행하였다. 도 17A는 비변형된 또는 DAP-변형된 AON 선택 서열을 처리한 후 동물에서 관찰된 조직병리학적 변화를 보여준다. 그 결과, 비변형된 또는 DAP-변형된 AON 서열로 처리된 동물들은, AON의 허용성에 대해 DAP 염기 변형 단독이 유익하지 않다는 점을 명확하게 보여주는, 비교가능한 타입의 검출 결과들, 검출 결과들의 발생율 및 검출 결과의 중증성을 나타내었다.
마우스에 2.5 mg/kg으로 10회 기관지내 투여시, P2M-DAP-변형된 AON 서열에 대한 반응을 조사하였다 (PBS를 대조군으로 사용함). 기관지폐포 세척액 (BAL)의 차별적인 세포 카운트와 폐 조직의 조직병리학적 분석을, AON을 마지막 처리 후 14시간 후에 수행하였다. 표 8은 선택한 P2M-DAP AON 서열과 비변형된 AON 서열 (PS-DNA)의, BAL내 염증 세포의 유입과 조직병리학적 평과 결과를 요약하여 나타낸다. 도 17B에서 알 수 있는 바와 같이, 그 결과, P2M-DAP-변형된 AON (TOP1731-P2M-7-DAP (서열번호 86))가, 비변형 PS-DNA 서열 TOP1731 (서열번호 1)에 비해, 대식세포, 림프구 및 호중구 감소로 확인되는, 총 세포의 유입 저하를 나타내었다. 또한, P2M-DAP-변형된 AON로 처리된 마우스는 폐 조직에서의 검출율이 낮았으며, 이들 동물에서 관찰되는 결과는 비변형된 PS-DNA AON (도 17C)에 비해 낮은 수준의 중증도 결과 (1 등급은 최소 중증도이고, 4 등급은 중증 중등도임)였으며, 이는 AON의 허용성에 대한 DAP 염기 변형과 P2M 연결 변형의 유용성을 명확하게 보여준다.
또한, 표 8은 선택한 P2M-DAP-함유 AON 서열에 대해 계산한 효능/독성 효익 비율 (efficacy/toxicity benefit ratio)을 요약 개시한다. 이 비율은 AON의 활성 (효능 지수 또는 본 실시예에서와 같이 주어진 농도에서 달성되는 최대 타겟 낫다운임) 대 이의 상대적인 독성 (본원에서는 폐 독성 지수 또는 모들 결과들과 이의 중증도 등급의 합임)을 고려한다. 표 8의 결과는, 비변형된 AON 서열 (PS-DNA)이 비율 값이 매우 낮고, P2M-DAP-함유 AON 서열이 비율 값이 더 높다 (>0.25)는 것을 보여준다.
실시예 9: LPS-유도성 마우스 기도 염증 모델에서의 P 2 M-DAP-변형된 AON의 효과
본 실시예는 급성 폐 염증에 대한 생체내 마우스 모델에서, AON 화합물에 P2M-DAP 변형을 병합할 경우, PDE4B/4D 및 PDE7A에 대한 AON의 타겟팅 효과에 관한 것이다. 표 4c, 4d 및 6은 인간 또는 마우스 PDE4B/4D 및 PDE7A를 타겟팅하며 P2M-DAP로 변형된 AON 서열들의 조성을 나타낸다.
PDE4B/4D 및 PDE7A를 타겟팅하는 P2M-DAP-변형된 AON 서열들의 활성을, LPS-유발성 급성 폐 염증 마우스 생체내 모델에서 확인하였다. 이 염증 모델에서는, 마우스를 LPS에 노출시켜, 동물의 폐에 현저한 호중구의 유입을 발생시켰다 (도 18). 호중구는 COPD 등의 다수의 염증성 질환들에서 염증 반응의 근간이 되는 주요 세포이다. LPS에 노출시키기 전에, 마우스에 PDE4B/4D를 타겟팅하는 한가지 변형된 AON (TOP572-P2M-7-DAP (서열번호, ) 또는 TOP2804-P2M-7-DAP (서열번호 138))과 PDE7A를 타겟팅하는 한가지 변형된 AON (TOP1777-P2M-7-DAP (서열번호 101) 또는 TOP2707-P2M-7-DAP (서열번호 136))의 (1 :1 w/w 비율의) 조합물을 처리하였을 때, LPS-유발성 호중구 유입이 현저하게 감소되는 것으로 관찰되었다 (도 18A-B). 그러나, LPS에 노출시킨 마우스에 대조군 서열 (TOP1777s-P2M-7-DAP (서열번호 132))을 처리한 경우, 폐내 호중구 유입은 감소되지 않았다 (도 18A). LPS에 노출시켰지만 PDE4의 소분자 저해제인 로플루밀라스트를 처리하지 않은 마우스의 경우, AON으로 수득되는 수준과 상응하는 수준으로 호중구의 유입을 낮추는데에는 용량 100 mg/kg이 요구되었다 (도 18C).
실시예 10: 담배 흡연-유발성 기도 염증 마우스 모델에서의 P 2 M-DAP-변형된 AON의 효과
본 실시예는, 담배 흡연-유발성 폐 염증의 생체내 마우스 모델에서 AON의 화합물에 P2M-DAP 변형을 도입하였을 때, PDE4B/4D 및 PDE7A를 타겟팅하는 AON의 효과에 관한 것이다. 표 4c, 4d 및 6은 인간 또는 마우스 PDE4B/4D 및 PDE7A를 타겟팅하며 P2M-DAP로 변형된 AON 서열들의 조성을 나타낸다.
PDE4B/4D 및 PDE7A를 타겟팅하는 P2M-DAP-변형된 AON 서열들의 활성을, 담배 흡연-유발성 폐 염증 마우스 생체내 모델에서 확인하였다. 이 염증 모델에서, 마우스를 4일간 연속하여 담배 흡연에 노출시켜, 동물의 폐에 현저한 호중구의 유입을 발생시켰다 (도 19). 흡연 노출하기 2일 전에, 마우스에 PDE4B/4D를 타겟팅하는 한가지 P2M-DAP-변형된 AON (TOP572-P2M-7-DAP (서열번호 ))과 PDE7A를 타겟팅하는 한가지 P2M-DAP-변형된 AON (서열번호 101)의 (1 :1 w/w 비율의) 조합물을 처리하였을 때, 호중구의 총 유입 (도 19A 및 B)과 호중구 % (도 19D 및 E)의 감소가 관찰되었다. 담배 흡연에 노출시켰지만 PDE4의 소분자 저해제인 로플루밀라스트를 처리하지 않은 마우스의 경우, 호중구 총 유입을 낮추는데에는 용량 5 mg/kg이 요구되었지만 (도 19C), 호중구 %에는 효과가 없었다 (도 19F).
P2M-DAP-변형된 AON 서열들은, 매일 투여한 로플루밀라스트에 비해, 2일마다 투여하였기 때문에, 이의 장기 작용 특성이 재입증되었다.
본 발명의 바람직한 구현예들이 본원에 기술되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 사상 또는 첨부된 청구항의 범위로부터 이탈되지 않으면서 본 발명에 대한 변형을 가할 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 인용된 모든 참조문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
Figure pct00001
a PDE7A1 mRNA 서열 (accession # NM_002603)에서의 타겟 부위
b "Flp-ln T-Rex 293 세포에서 PDE7A mRNA 발현율 (260 nM)
Figure pct00002
a PDE4B1 (accession # NM_001037341) 또는 PDE4D1 (accession # NM_001104631) mRNA 서열에서의 타겟 부위
b "Flp-ln T-Rex 293 세포에서 PDE4B 또는 PDE4D mRNA 발현율 (260 nM)
Figure pct00003
* 동물 종들과의 미스매치(들)는 굵은 글씨의 밑줄 친 문자임
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
a AON 서열에서의 포스포로티오에이트 결합 %
c 236nM PS-DNA를 처리한 Flp-ln T-Rex 293 세포에서의 PDE mRNA 저해 대비 차이 %
Figure pct00008
Figure pct00009
a AON 서열에서의 포스포로티오에이트 결합 %
Figure pct00010
Figure pct00011
a AON 서열에서의 포스포로티오에이트 결합 %
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
BAL: 수치는 평균 (±SEM)로 나타냄
LUNG: 수치는 결과를 보인 동물의 수/총 동물 수로 나타냄
A: 2가지 타겟 (PDE4B 및 PDE4D)에 대한 평균 효과
* 폐 독성 지수 = ∑(검출% * 중증도 등급)
TOP1572를 예로 들면:
폐 독성 지수 = (0.25*1 +0.25*2+0.5*3) + (0.25*2+0.25*3+0.5*4) = 5.5
**효능 지수 = 시험관내 최대 타겟 낫다운%
*** 효능/독성 비율 = 효능 지수/폐 독성 지수
Figure pct00015
a AON 서열에서의 포스포로티오에이트 결합 %
Figure pct00016
Figure pct00017
a AON 서열에서의 포스포로티오에이트 결합 %
Figure pct00018
Figure pct00019
a AON 서열에서의 포스포로티오에이트 결합 %
Figure pct00020
SEQUENCE LISTING <110> Pharmaxis Ltd. <120> Oligonucleotide Inhibitors with Chimeric Backbone and 2-Amino-2'-Deoxyadenosine <130> 55565523-7PCT <140> PCT/CA2012/000169 <141> 2012-02-23 <150> US 61/446,144 <151> 2011-02-24 <160> 196 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tcatgagtgg cagctgcaat t 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cagtctgatc agaactgtc 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 catctcctag catacgaatg 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ggctccttac acgtacatc 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gacagacact tcaatttcag 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gctggaaact tagtagcct 19 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gtgaagatct aagatatc 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tgaaaccgca gtaccacga 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 aggttaagct tactagact 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tggaagtact caattaatc 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ctacgaagtt tcatcatatc 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ggactgcgtt atggtaagg 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 catggcctga gtaacatcc 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 cagaattggc aagcttagg 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 atgatccaga tcatgagtg 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gttgccaagt aatggttag 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 cagtactgag gtattcttg 19 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 cactgcagat ctccagtg 18 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gaataagcct gattctctc 19 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gagcacctat ctgtgtctcc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gtggctagta tcagagcacc 20 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gactgatgtc tgtggctag 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gtgtctggtg tcttctagg 19 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 ccacgtccga catgggttac 20 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 tctatatctc cttgatgga 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 tagattcagt gtgacgatc 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 accaatctgg atgttggca 19 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 ctggatgatc cagatcatg 19 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 ggcttgtcca ttataatc 18 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 acatctccta gcatacgaat 20 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 aaggttaagc ttactagact a 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 gtgcatggcc tgagtaacat c 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <400> 33 acagtgcatg gcctgagtaa c 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 cagaattggc aagcttaggt t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 tggcaagctt aggttccttt a 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 tgatccagat catgagtggc 20 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 taaagttgcc aagtaatggt t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 actgaggtat tcttgtataa a 21 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 gcagatctcc agtggtgatt 20 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 catacacttg gcttgtccat t 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <400> 41 taagtaacag tgcatggcct g 21 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <400> 42 ggttgctcag ntctgcaca 19 <210> 43 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (2)..(12) <223> Nucleotides 2 and 12 are inosine <400> 43 ancatccttt tnaact 16 <210> 44 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Nucleotide 3 is inosine <400> 44 agnccccatt tgttca 16 <210> 45 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (6)..(12) <223> Nucleotides 6 and 12 are inosine <400> 45 gccacntcag cntggta 17 <210> 46 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (9)..(12) <223> Nucleotides 9 and 12 are inosine <400> 46 accatgtcna tnaccat 17 <210> 47 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (5)..(11) <223> Nucleotides 5 and 11 are inosine <400> 47 tcatntgttt ngacat 16 <210> 48 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3)..(6) <223> Nucleotides 3 and 6 are inosine <400> 48 ganctngtca ctttctt 17 <210> 49 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Nucleotide 15 is inosine <400> 49 gcacagtgca ccatntt 17 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (7)..(10) <223> Nucleotides 7 and 10 are inosine <400> 50 gctcagntcn gcacagtg 18 <210> 51 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (9)..(15) <223> Nucleotides 9 and 15 are inosine <400> 51 tcacacatng ggctnat 17 <210> 52 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3)..(12) <223> Nucleotides 3 and 12 are inosine <400> 52 ttntcacaca tngggct 17 <210> 53 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Nucleotide 7 is inosine <400> 53 gccattntcc acatcaa 17 <210> 54 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> Nucleotides 8 and 9 are inosine <400> 54 ggatccanng gactccg 17 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (7)..(16) <223> Nucleotides 7 and 16 are inosine <400> 55 gtcatantcg ctgtcngatc 20 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (7)..(13) <223> Nucleotides 7 and 13 are inosine <400> 56 gacctgngca aanggagt 18 <210> 57 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Nucleotide 15 is inosine <400> 57 gccatctcac tgacnga 17 <210> 58 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (6)..(15) <223> Nucleotides 6 and 15 are inosine <400> 58 cttttnaact tgttnga 17 <210> 59 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (9)..(12) <223> Nucleotides 9 and 12 are inosine <400> 59 tctaagaang tntttga 17 <210> 60 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (6)..(15) <223> Nucleotides 6 and 15 are inosine <400> 60 tgcttntcta agaangt 17 <210> 61 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (7)..(10) <223> Nucleotides 7 and 10 are inosine <400> 61 ttcagtnttn actccaa 17 <210> 62 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> Nucleotides 9 and 11 are inosine <400> 62 tggtcttcna nagtcat 17 <210> 63 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Nucleotide 15 is inosine <400> 63 atctccaaat ctgtnaa 17 <210> 64 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Nucleotide 3 is inosine <400> 64 agnatctcca aatctgt 17 <210> 65 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (9)..(12) <223> Nucleotides 9 and 12 are inosine <400> 65 ggatgatcna cntcatg 17 <210> 66 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3)..(15) <223> Nucleotides 3 and 15 are inosine <400> 66 acnccaggat gatcnac 17 <210> 67 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (9)..(12) <223> Nucleotides 9 and 12 are inosine <400> 67 gcaagttcng antttgt 17 <210> 68 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (4)..(7) <223> Nucleotides 4 and 7 are inosine <400> 68 cttngtnggg ttgctcag 18 <210> 69 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (9)..(15) <223> Nucleotides 9 and 15 are inosine <400> 69 tcacacatng ggctnat 17 <210> 70 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (6)..(12) <223> Nucleotides 6 and 12 are inosine <400> 70 ggatgnacaa tntagtc 17 <210> 71 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Nucleotide 3 is inosine <400> 71 gangccatct cactgac 17 <210> 72 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> Nucleotides 13 and 15 are inosine <400> 72 gtaatggtct tcnanag 17 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Nucleotides are FANA <220> <221> misc_feature <222> (18)..(21) <223> Nucleotides are FANA <400> 73 tcatgagtgg cagctgcaat t 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides3, 6, 12, 18-19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 74 tcntgngtgg cngctgcnnt t 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 tcatgagtgg cagctgcaat t 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides3, 6, 12, 18-19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 76 tcntgngtgg cngctgcnnt t 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Nucleotides are 2'-OMe-RNA <220> <221> misc_feature <222> (17)..(21) <223> Nucleotides are 2'-OMe-RNA <400> 77 tcatgagtgg cagctgcaat t 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 78 tcatgagtgg cagctgcaat t 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (15)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 79 tcatgagtgg cagctgcaat t 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (16)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 80 tcatgagtgg cagctgcaat t 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 6, 12, 18-19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 81 tcntgngtgg cngctgcnnt t 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (18)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 82 tcatgagtgg cagctgcaat t 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (8)..(13) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 83 tcatgagtgg cagctgcaat t 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(12) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 84 tcatgagtgg cagctgcaat t 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 85 tcatgagtgg cagctgcaat t 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 3, 6, 12, 18-19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 86 tcntgngtgg cngctgcnnt t 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (18)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 87 tcatgagtgg cagctgcaat t 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 3, 6, 12, 18-19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 88 tcntgngtgg cngctgcnnt t 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 89 tcatgagtgg cagctgcaat t 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 3, 6, 12, 18-19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 90 tcntgngtgg cngctgcnnt t 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 91 tcatgagtgg cagctgcaat t 21 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 3, 6, 12, 18-19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 92 tcntgngtgg cngctgcnnt t 21 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Nucleotides 1 to 5 are LNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(20) <223> Nucleotides 16 to 20 are LNA <400> 93 tcatggtggc agctgcaatt 20 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 94 acagtgcatg gcctgagtaa c 21 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 1, 3, 8, 16, 19-20 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 95 ncngtgcntg gcctgngtnn c 21 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 96 acagtgcatg gcctgagtaa c 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 1, 3, 8, 16, 19-20 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 97 ncngtgcntg gcctgngtnn c 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 98 acagtgcatg gcctgagtaa c 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 1, 3, 8, 16, 19-20 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 99 ncngtgcntg gcctgngtnn c 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 100 taagtaacag tgcatggcct g 21 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 3, 6, 7, 9, 14 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 101 tnngtnncng tgcntggcct g 21 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 102 taagtaacag tgcatggcct g 21 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 3, 6, 7, 9, 14 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 103 tnngtnncng tgcntggcct g 21 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 104 taagtaacag tgcatggcct g 21 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 3, 6, 7, 9, 14 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 105 tnngtnncng tgcntggcct g 21 <210> 106 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Nucleotides are FANA <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (15)..(19) <223> Nucleotides are FANA <400> 106 ggttgctcag ntctgcaca 19 <210> 107 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 9, 17, 19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 107 ggttgctcng ntctgcncn 19 <210> 108 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <400> 108 ggttgctcag ntctgcaca 19 <210> 109 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 9, 17, 19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 109 ggttgctcng ntctgcncn 19 <210> 110 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Nucleotides are 2'-OMe-RNA <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (15)..(19) <223> Nucleotides are 2'-OMe-RNA <400> 110 ggttgctcag ntctgcaca 19 <210> 111 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 111 ggttgctcag ntctgcaca 19 <210> 112 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 112 ggttgctcag ntctgcaca 19 <210> 113 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (15)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 113 ggttgctcag ntctgcaca 19 <210> 114 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 9, 17, 19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (15)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 114 ggttgctcng ntctgcncn 19 <210> 115 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 115 ggttgctcag ntctgcaca 19 <210> 116 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (8)..(12) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 116 ggttgctcag ntctgcaca 19 <210> 117 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 117 ggttgctcag ntctgcaca 19 <210> 118 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 118 ggttgctcag ntctgcaca 19 <210> 119 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 9, 17, 19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 119 ggttgctcng ntctgcncn 19 <210> 120 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 120 ggttgctcag ntctgcaca 19 <210> 121 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 9, 17, 19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 121 ggttgctcng ntctgcncn 19 <210> 122 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 122 ggttgctcag ntctgcaca 19 <210> 123 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 9, 17, 19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 123 ggttgctcng ntctgcncn 19 <210> 124 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (8)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> 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<222> (11)..(12) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 126 ggttgctcag ntctgcaca 19 <210> 127 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 9, 17, 19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 127 ggttgctcng ntctgcncn 19 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> 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next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 132 nttcnttgtc ncgtnccggn c 21 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (15)..(19) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 133 gggggacgat cgtcgggggg 20 <210> 134 <211> 17 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Nucleotides are FANA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(17) <223> Nucleotides are FANA <400> 134 tccagatcgt gagtggc 17 <210> 135 <211> 17 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Nucleotides are FANA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(17) <223> Nucleotides are FANA <400> 135 tgctcaacgt ctgaggg 17 <210> 136 <211> 17 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 4, 6, 12 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 136 tccngntcgt gngtggc 17 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Nucleotides are FANA <220> <221> misc_feature <222> (17)..(20) <223> Nucleotides are FANA <400> 137 ggttgctcag gtctgcacag 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 9, 17, 19 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(19) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 138 ggttgctcng gtctgcncng 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 tcaggccatg cactgttact 20 <210> 140 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 140 cctgattctc tcaataagcc c 21 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 141 tggcagacct gaagacaatg 20 <210> 142 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 142 aaattcctcc atgatgcgg 19 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens 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DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 1, 4, 8, 15, 20, 21 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 155 ngtnctcncc gtcgncgttn n 21 <210> 156 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 3, 4, 7, 12, 14 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Nucleotide 11 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 156 ccnncgngtc nngncgtgt 19 <210> 157 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 9, 15 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 157 gggtctgcng cgggntggt 19 <210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 4, 7, 13 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 158 gttnctnctt ccncctgcct g 21 <210> 159 <211> 18 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <400> 159 tggcacttta ggtggctg 18 <210> 160 <211> 18 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <400> 160 actcatattc atagggtg 18 <210> 161 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <400> 161 cacctctgtc accagcatg 19 <210> 162 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 11, 14, 17 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 162 cncctctgtc nccngcntg 19 <210> 163 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 11, 14, 17 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 163 cncctctgtc nccngcntg 19 <210> 164 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 11, 14, 17 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 164 cncctctgtc nccngcntg 19 <210> 165 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 11, 14, 17 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 165 cncctctgtc nccngcntg 19 <210> 166 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 11, 14, 17 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 166 cncctctgtc nccngcntg 19 <210> 167 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 11, 14, 17 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (8)..(10) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(15) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 167 cncctctgtc nccngcntg 19 <210> 168 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 11, 14, 17 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(8) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 168 cncctctgtc nccngcntg 19 <210> 169 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 11, 14, 17 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 169 cncctctgtc nccngcntg 19 <210> 170 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 11, 14, 17 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 170 cncctctgtc nccngcntg 19 <210> 171 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 11, 14, 17 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(12) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 171 cncctctgtc nccngcntg 19 <210> 172 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <400> 172 gtacttccgg aacctctctc c 21 <210> 173 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 3, 11, 12 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 173 gtncttccgg nncctctctc c 21 <210> 174 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 3, 11, 12 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 174 gtncttccgg nncctctctc c 21 <210> 175 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 3, 11, 12 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(15) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 175 gtncttccgg nncctctctc c 21 <210> 176 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 3, 11, 12 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 176 gtncttccgg nncctctctc c 21 <210> 177 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 3, 11, 12 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(9) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(16) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 177 gtncttccgg nncctctctc c 21 <210> 178 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 3, 11, 12 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(20) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 178 gtncttccgg nncctctctc c 21 <210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <400> 179 ctctccactt ccacggcctg 20 <210> 180 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 7, 13 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(19) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 180 ctctccnctt ccncggcctg 20 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 7, 13 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 181 ctctccnctt ccncggcctg 20 <210> 182 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 7, 13 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(19) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 182 ctctccnctt ccncggcctg 20 <210> 183 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 7, 13 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 183 ctctccnctt ccncggcctg 20 <210> 184 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 7, 13 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(19) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 184 ctctccnctt ccncggcctg 20 <210> 185 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 7, 13 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(8) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(19) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 185 ctctccnctt ccncggcctg 20 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 7, 13 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(19) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 186 ctctccnctt ccncggcctg 20 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 7, 13 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(19) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 187 ctctccnctt ccncggcctg 20 <210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 7, 13 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(13) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(19) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 188 ctctccnctt ccncggcctg 20 <210> 189 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> All linkages are phosphorothioate <400> 189 gaccgagctg gccacctcc 19 <210> 190 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 6, 14 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 190 gnccgngctg gccncctcc 19 <210> 191 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 6, 14 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 191 gnccgngctg gccncctcc 19 <210> 192 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 6, 14 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(13) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 192 gnccgngctg gccncctcc 19 <210> 193 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 6, 14 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (5)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 193 gnccgngctg gccncctcc 19 <210> 194 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 6, 14 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(8) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(14) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 194 gnccgngctg gccncctcc 19 <210> 195 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 6, 14 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (13)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 195 gnccgngctg gccncctcc 19 <210> 196 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Nucleotides 2, 6, 14 are 2-amino-2'deoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (12)..(18) <223> Linkage to next nucleotide is phosphorothioate <400> 196 gnccgngctg gccncctcc 19

Claims (40)

  1. 타겟 유전자를 겨냥하는 올리고뉴클레오티드로서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 엄격 조건에서 상기 유전자를 코딩하는 핵산 서열의 적어도 일부분과 혼성화 가능하며,
    상기 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드가 2-아미노-2'-데옥시아데노신 (DAP)이고,
    상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드들 간의 결합들이 3개 이상의 교대 단편 (alternating segment)을 포함하며, 각각의 단편은 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 하나 이상의 포스포다이에스테르 결합으로 구성된 것을 특징으로 하는, 타겟 유전자를 겨냥하는 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 타겟 유전자가 IL-3, IL-5 및 GM-CSF의 공통 β 서브유닛(common beta subunit)인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 타겟 유전자가 CCR3 케모카인 수용체인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 타겟 유전자가 타겟 포스포다이에스테라제 (PED)인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 타겟 PDE가 PDE3A, PDE3B, PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE4D, PDE7A1, PDE7A2, PDE7A3 및 PDE7B로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 타겟 PDE가 PDE7A인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  7. 제5항에 있어서, 상기 타겟 PDE가 PDE4B인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  8. 제5항에 있어서, 상기 타겟 PDE가 PDE4D인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 포스포로티오에이트 : 포스포다이에스테르 결합의 비율이 30:70 내지 70:30인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  10. 제9항에 있어서, 포스포로티오에이트 : 포스포다이에스테르 결합의 비율이 40:60 내지 60:40인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서, 포스포로티오에이트 : 포스포다이에스테르 결합의 비율이 45:55 내지 55:45인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 포스포로티오에이트 : 포스포다이에스테르 결합의 비율이 약 50:50인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 상기 타겟 유전자에 대해 80% 이상 상보적인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 상기 타겟 유전자에 대해 100% 상보적인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서, 상기 효능/독성의 비가 0.25 보다 높은 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이가 뉴클레오티드 15 내지 25개인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이가 뉴클레오티드 18 내지 22개인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  18. 제4항에 있어서, 서열번호 1 - 72, 바람직하게는 서열번호 1, 4, 8, 33, 36, 41 및 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기 서열을 가지며, 상기 서열에서 하나 이상의 아데노신이 DAP로 치환된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  19. 제18항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1, 33, 41 및 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  20. 제4항에 있어서, 서열번호 81, 86, 90, 92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 114, 119, 121, 123, 125 및 127, 바람직하게는 서열번호 86, 95, 101 및 119 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  21. 제20항에 있어서, 서열번호 81, 86, 90, 92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 114, 119, 121, 123, 125 및 127, 바람직하게는 서열번호 86, 95, 101 및 119 중 어느 하나로 구성되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  22. 제2항에 있어서, 서열번호 179 - 189로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기 서열을 가지며, 상기 서열에서 하나 이상의 아데노신이 DAP로 치환된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  23. 제22항에 있어서, 서열번호 180 - 188 및 190 - 197 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  24. 제3항에 있어서, 서열번호 161 - 171로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기 서열을 가지며, 상기 서열에서 하나 이상의 아데노신이 DAP로 치환된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  25. 제24항에 있어서, 서열번호 162 - 170 및 172 - 178 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한항에 따른 올리고뉴클레오티드와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 제1항 내지 제25항 중 어느 한항에 따른 올리고뉴클레오티드 2개 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 2개 이상의 올리고뉴클레오티드가 각각 PDE7A와 PDE4B를 겨냥하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 상기 2개 이상의 올리고뉴클레오티드가 각각 PDE7A와 PDE4D를 겨냥하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 PDE4B 또는 PDE4D를 겨냥하는 올리고뉴클레오티드가 다른 것을 하향 조절하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  31. 제27항에 있어서, 상기 2개 이상의 올리고뉴클레오티드가 IL-3, IL-5 및 GM-CSF의 공통 β 서브유닛과 CCR3 케모카인 수용체를 각각 겨냥하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한항에 있어서, 염증 치료용인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  33. 제26항 내지 제31항 중 어느 한항에 있어서, 호흡기 질환의 치료용인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 만성 폐색성 폐 질환, 천식, 호산구성 기침, 기관지염, 폐 동종이식의 급성 및 만성 거부 반응, 유육종증, 폐 섬유증, 비염, 부비동염, 바이러스 감염 또는 신생물 질환 중 한가지 이상의 치료용인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  35. 제26항 내지 제31항 중 어느 한항에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 호흡기 질환을 치료하는 방법.
  36. 호흡기 질환 치료용 약제의 제조에 있어서의, 제26항 내지 제31항 중 어느 한항에 따른 약학 조성물의 용도.
  37. 호흡기 질환을 치료하기 위한, 제26항 내지 제31항 중 어느 한항에 따른 약학 조성물의 용도.
  38. 서열번호 1-72, 161, 171, 179 및 189, 바람직하게는 서열번호 1, 4, 8, 33, 36, 41, 42, 161, 171, 179 및 189 중 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  39. 제38항에 있어서, 하나 이상의 아데노신이 DAP로 치환된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  40. 서열번호 1 - 127 및 161 - 197 중 어느 하나로 구성된 올리고뉴클레오티드.
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