ES2304633T3 - Procedimiento para la preparacion de un farmaco especifico para celulas y/o tejidos y/o fases de enfermedad. - Google Patents
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Abstract
ADNzimas caracterizadas porque están compuestas por - un dominio catalítico con la secuencia de nucleótidos GGCTAGCTACAACGA o una secuencia modificada con efecto biológico comparable que corta al ARNm de GATA-3 en cada sitio de unión de purina-pirimidina, al que está unido, - un dominio de unión a sustrato derecho a continuación del extremo 3'' del dominio catalítico y - un dominio de unión a sustrato izquierdo a continuación del extremo 5'' del dominio catalítico, en las que los dos dominios de unión a sustrato son respectivamente complementarios a dos regiones del ARNm de GATA-3, de manera que se hibridan con el ARNm, - son activas in vivo y - contienen la secuencia hgd40 GTGGATGGA GGCTAGCTACAACGA GTCTTGGAG.
Description
Procedimiento para la preparación de un fármaco
específico para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de un fármaco específico para
células y/o tejidos y/o fases de enfermedad que es adecuado para el
tratamiento de inflamaciones crónicas.
Las inflamaciones crónicas representan una gran
problemática médica en aumento con gran impacto socioeconómico.
Entre éstas figuran especialmente los siguientes grupos de
enfermedades:
- Enfermedades autoinmunitarias y enfermedades
de tipo reumático (manifestaciones en, entre otros, piel, pulmón,
riñón, sistema vascular, sistema nervioso, tejido conjuntivo,
aparato locomotor, sistema endocrino)
- Reacciones alérgicas de tipo inmediato y
asma
- Enfermedades pulmonares obstructivas crónicas
(EPOC)
- Arteriosclerosis
- Psoriasis y eccema de contacto
- Reacciones de rechazo crónico después de
trasplante de órganos, de médula ósea
Muchas de estas enfermedades muestran en las
últimas décadas una prevalencia creciente no sólo en los países
industrializados, sino en parte mundialmente. Así, entretanto, en
Europa, América del Norte, Japón y Australia más del 20% de la
población padecen enfermedades alérgicas y asma. En la actualidad,
las enfermedades pulmonares obstructivas crónicas son la quinta
causa de muerte más frecuente mundialmente y representarán en el año
2020 según cálculos de la OMS la tercera causa de muerte más
frecuente. La arteriosclerosis con las comorbilidades infarto de
miocardio, ataque de apoplejía y enfermedad arterial oclusiva
periférica ocupan mundialmente una primera posición en la
estadística de morbilidad y mortalidad. La psoriasis y el eccema de
contacto son generalmente, junto con la neurodermitis, las
enfermedades inflamatorias crónicas más frecuentes de la piel.
Las regulaciones anómalas persistentes del
sistema inmunitario se producen debido a interacciones no
suficientemente entendidas hasta la fecha entre factores
medioambientales y una disposición genética. En este caso, para
estas diferentes enfermedades pueden fijarse los siguientes
principios comunes:
(A) Se produce el desarrollo de una respuesta
inmunitaria excesiva contra antígenos normalmente inofensivos para
los seres humanos. Estos antígenos pueden ser constituyentes del
medio ambiente (por ejemplo, alergenos, como polen, pelo de
animales, alimentos, ácaros, sustancias químicas como conservantes,
colorantes, productos de limpieza). En estos casos se desarrolla en
los pacientes una reacción alérgica. En el caso de, por ejemplo,
fumadores activos y pasivos se producen enfermedades pulmonares
obstructivas crónicas (EPOC). Sin embargo, por otro lado, el
sistema inmunitario también puede reaccionar contra componentes del
propio organismo que reconocen a éstos como extraños y ponen en
marcha una reacción inflamatoria en contra. En estos casos se
desarrolla una enfermedad autoinmunitaria. En todo caso se
reconocen por error antígenos no tóxicos inofensivos como extraños
o peligrosos y se pone en marcha una reacción inflamatoria
inadecuada.
(B) Las enfermedades pasan a fases entre las que
figuran la iniciación, progresión, por consiguiente el avance de la
reacción inflamatoria, y la destrucción y conversión asociadas a
ellas con pérdida de la funcionalidad de los órganos (denominada
remodelación).
(C) Las enfermedades muestran rasgos
característicos subfenotípicos específicos para los pacientes.
(D) En la iniciación, mantenimiento y los
procesos de destrucción y conversión participan persistentemente
componentes de la inmunidad congénita y adquirida. Bajo la
influencia de la inmunidad congénita (componentes importantes:
células presentadoras de antígeno con sus diversas poblaciones y el
sistema del complemento) se produce la activación y diferenciación
de las células del sistema inmunitario adaptativo (componentes
importantes: linfocitos T y B). A continuación, las células T
asumen funciones centrales mediante diferenciación en efectores
sumamente especializados. Con esto activan y adquieren determinados
mecanismos efectores, entre los que figuran especialmente las
siguientes funciones: producción de anticuerpos, control de la
funcionalidad de las células efectoras del sistema inmunitario
(como por ejemplo, granulocitos neutrófilos, basófilos,
eosinófilos), retroalimentación a las funciones del sistema
inmunitario congénito, influencia de la funcionalidad de las células
no hematopoyéticas, como por ejemplo epitelio, endotelio, tejido
conjuntivo, hueso y cartílago y sobre todo células neuronales. En
este caso se produce una interacción especial entre el sistema
inmunitario y nervioso a partir de la que se ha desarrollado el
concepto de interacción neuroinmunológica en inflamaciones
crónicas.
\newpage
Debido a la complejidad y las múltiples facetas
de los cuadros clínicos que van acompañados de las inflamaciones
crónicas, a un fármaco óptimo para el tratamiento de las
enfermedades debe exigírsele los siguientes requisitos:
(1) Las enfermedades se manifiestan en
(sub)-fenotipos específicos para los pacientes. Por
tanto, los fármacos deben presentar una alta especificidad clínica
o por pacientes.
(2) Las enfermedades pasan a estadios y fases.
Por tanto, los fármacos deben poseer una especificidad por estadios
y fases.
(3) Las enfermedades son reguladas por células
especializadas de manera diferente. Por tanto, los fármacos deben
provocar una intervención específica para la célula.
(4) Las enfermedades se manifiestan en
diferentes órganos y compartimentos. Por tanto, los fármacos deben
poseer una especificidad por un compartimento u órgano.
(5) Los fármacos deben ser adecuados durante una
terapia a largo plazo. Entonces, deben evitarse reacciones del
sistema inmunitario contra los fármacos.
(6) El perfil de efectos secundarios de los
fármacos debe estar en una relación aceptable en la relación médica
y ética con el grado de gravedad, pronóstico y transcurso de las
enfermedades.
Ninguna de las terapias establecidas actualmente
disponibles contra inflamaciones crónicas satisface de manera
óptima estos criterios. Del documento DE 695 11 245 T2 se conoce el
tratamiento con inmunoglobulina A y del documento DE 695 18 667 T2
la inhibición de la fosfolipasa A_{2} (PLA_{2}) y/o la
transacilasa independiente de la coenzima A
(CoA-IT). En el centro de interés de los conceptos
de terapia actualmente establecidos para esta enfermedad se
encuentra la terapia antiinflamatoria inespecífica, así como la
inmunosupresión. Así, muchas de las sustancias inespecíficas
utilizadas que actúan de forma antiinflamatoria, como ibuprofeno,
ácido acetilsalicílico y paracetamol, o no son suficientemente
eficaces o adolecen de una alta tasa de efectos secundarios no
deseados. Por el contrario, los esteroides tienen concretamente una
mayor potencia, pero por su parte adolecen de graves efectos
secundarios como hipertonía, diabetes y osteoporosis. Los
medicamentos inmunosupresores de ultimísima generación, como por
ejemplo, ciclosporina y tacrolimus, muestran hepatotoxicidad y
nefrotoxicidad.
Esta situación ha llevado a la búsqueda y al
ensayo clínico de una pluralidad de ultimísimas moléculas que deben
intervenir más específicamente en la regulación anómala inmunológica
y de biología celular. Entre éstas figuran citocinas, receptores de
citocinas y anticitocinas. Los problemas que están asociados a estas
ultimísimas utilizaciones terapéuticas incluyen falta de
especificidad por células y órganos, el desarrollo de reacciones
inmunitarias no deseadas contra estas moléculas, así como una falta
de eficacia en distintos fenotipos.
En los últimos tiempos se ha probado utilizar
una nueva clase de moléculas catalíticas, las denominadas
"ADNzimas" (Santoro, 1997), como agentes terapéuticos para la
inactivación de genes cuya expresión causa enfermedades. Las
ADNzimas son moléculas monocatenarias que fundamentalmente pueden
unirse a zonas complementarias de ARN e inactivar éstas mediante
escisión. No obstante, la utilización específica de las ADNzimas
como agentes terapéuticos presupone que los genes causantes de la
enfermedad y sus ARNm se conocen perfectamente. Hasta la fecha, esto
es sólo el caso de pocas enfermedades.
La ADNzima descrita en el documento WO
01/11023A1 se une a RelA (p65) mONA y con esto se dirige contra el
factor de transcripción NF-\kappaB, en el
documento WO 00/42173 se da a conocer una ADNzima que se une a ARNm
de EGR-1. El documento W099/50452 da a conocer una
ADNzima 10-23 que puede usarse en un procedimiento
diagnóstico para localizar mutaciones de ácidos nucleicos.
Ninguna de las moléculas antisentido y ADNzimas
actualmente conocidas puede usarse para la preparación de un
fármaco para el tratamiento de inflamaciones crónicas en
pacientes.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar fármacos específicos para células y/o tejidos y/o fases
de enfermedad, que llevan a la inactivación funcional de moléculas
de ácido ribonucleico de factores de transcripción y factores de
las rutas de transducción de señales, cuya expresión participa en la
aparición de reacciones inflamatorias crónicas y enfermedades
autoinmunitarias y son adecuados para el tratamiento de reacciones
inflamatorias crónicas y enfermedades autoinmunitarias,
eliminándose las desventajas expuestas en el estado de la
técnica.
Además, es objetivo de la invención proporcionar
un procedimiento para la preparación de fármacos específicos para
células y/o tejidos y/o fases de enfermedad, que identifique las
moléculas de ácido ribonucleico de factores de transcripción y de
factores de las rutas de transducción de señales, cuya expresión
participe en la aparición de reacciones inflamatorias crónicas y
enfermedades autoinmunitarias y las inactive funcionalmente en
células
diana.
diana.
\newpage
El objetivo se alcanza según la invención
mediante ADNzimas específicas según las reivindicaciones 1 a 5, un
procedimiento según la reivindicación 6 y un fármaco, así como su
uso según las reivindicaciones 7 a 9.
La ventaja de la invención consiste en una
inactivación funcional de las moléculas de ácido ribonucleico de
factores de transcripción y factores de las rutas de transducción de
señales para la diferenciación y/o expresión de citocinas que
participan en la aparición de reacciones inflamatorias crónicas y
enfermedades autoinmunitarias mediante ADNzimas y/o ARNip
específicos. Esta estrategia destaca, en comparación con los
enfoques convencionales, pero también de terapia génica, por la
mayor especificidad y selectividad para células y/o tejidos y/o
fases de enfermedad, alta estabilidad de las moléculas y una
antigenicidad insignificante. Se consiguen requisitos óptimos para
una terapia a largo plazo hecha a medida en pacientes con
enfermedades inflamatorias crónicas.
Otros detalles y preferencias de la presente
invención serán evidentes a partir de la siguiente figura y la
descripción. En este sentido muestra
La fig. 1: representación esquemática de la
transducción de señales en la diferenciación de células CD4^{+} a
células TH1 o TH2 (modificada según Ho I. C. y Glimcher L. H., Cell
2002; 109: pág. 109-pág. 120).
La fig. 2: secuencia de nucleótidos del dominio
catalítico de la ADNzima 10-23 y unión a un ARN
diana mediante el par de Watson-Crick. (R = A o G;
Y = U o C, N = A, G, U o G). La flecha muestra el sitio de escisión
en el ARNm diana.
La fig. 3: conjunto de moléculas de ácido
ribonucleico específico según la etapa b), en particular las
ADNzimas hgd1 a hgd70 contra GATA-3 y sus
secuencias de nucleótidos (A=adenina, G=guanina, C=citosina,
T=timina). Los nucleótidos escritos en mayúscula marcan un dominio
derecho e izquierdo de unión a sustrato, los nucleótidos escritos
en minúscula marcan el dominio catalítico central de la ADNzima
10-23.
La fig. 4: secuencias de nucleótidos del gen
GATA-3 humano en el alineamiento
secuencia 1: GATA-3 humano del
banco de datos nº: XM_043124,
secuencia 2: GATA-3 humano del
banco de datos nº: X58072,
secuencia 3: GATA-3 humano
(secuenciado a partir del plásmido pCR2.1).
Las bases divergentes están en cuadros grises,
las localizaciones de los cebadores para el clonado de
GATA-3 están subrayadas. La localización de la
ADNzima hgd40 está ilustrada en negrita, que al mismo tiempo está
en cuadros grises y subrayada.
(A=adenina, G=guanina, C=citosina, T=timina)
La fig. 4 A: secuencia de nucleótidos 3 del gen
GATA-3 humano de la figura 4 en la que están
marcados (en un cuadro en gris) respectivamente los pares de
nucleótidos GT y AT entre los que están más sitios de corte
de
ADNzimas.
ADNzimas.
La fig 5: la electroforesis en gel muestra la
escisión de un ARNm diana (en este caso ARNm de
GATA-3) con moléculas de ácido ribonucleico
específico según la etapa b), en este caso ADNzimas no modificadas
[hgd11 (carril 2), hgd13 (carril 4), hgd17 (carril 6), hgd40
(carril 8)] y ADNzimas modificadas [hgd11-M (carril
3), hgd13-M (carril 5), hgd17-M
(carril 7), hgd40-M (carril 9)]. M designa las
ADNzimas modificadas. Las ADNzimas no modificadas (0,25 \muM) o
modificadas (0,25 \muM) se incuban una hora a 37ºC con ARNm de
GATA-3 transcrito in vitro (0,025 \muM) en
un volumen de 10 \mul con la siguiente mezcla de reacción: Tris 50
mM a pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 10 mM. A continuación, los
productos se separan mediante electroforesis en gel. El carril 1
contiene como control ARNm sin adición de ADNzimas. El patrón de
longitud introducido conjuntamente (no representado) muestra
tamaños de banda de 1000 pb, 2000 pb y 3000 pb. Las flechas señalan
hacia S, la banda con el sustrato (en este caso ARNm de
GATA-3) y los productos de escisión P1 y P2.
La fig. 6: inmunotransferencia con la reacción
de moléculas de ácido ribonucleico específico en células. Se
transfectan células Jurkat E6.1 mediante lipofección con moléculas
de ácido ribonucleico específico, en este caso ADNzimas
[hgd11-M (carril 4), hgd13-M (carril
5), hgd17-M (carril 6), hgd40-M
(carril 7)], como controles se utilizan células no tratadas (carril
1), células sólo tratadas con medio de transfección (carril 2) o
células tratadas con ADNzimas (hgd11-M) sin medio de
transfección (carril 3). Después de 48 h de incubación, las
proteínas solubilizadas se separan mediante SDS-PAGE
y GATA-3 (A) se detecta mediante inmunotransferencia
con anticuerpos específicos (el carril 4 contiene células con
hgd11-M, el carril 5 contiene células con
hgd13-M, el carril 6 contiene células con
hgd17-M, el carril 7 contiene células con
hgd40-M). Para el control a las mismas cantidades
de proteína por carril, en la misma membrana de transferencia se
realiza una inmunotinción con \beta-actina (B).
El patrón de longitud introducido conjuntamente (no representado)
muestra tamaños de banda de 63,8 kDa, 49,5 kDa y
37,4 kDa.
37,4 kDa.
\newpage
La figura 1 muestra en una representación
esquemática modificada según Ho I.C. y Glimcher L.H. (Cell 2002;
109: pág. 109-pág. 120) las relaciones de la
transducción de señales en la diferenciación de células CD4^{+} a
células TH1 o TH2. La estimulación mediante el receptor de células T
por el complejo péptido-MHC correspondiente induce
la expansión clonal y la diferenciación programada de linfocitos T
CD4^{+} a células T cooperadoras (TH) 1 o TH2. La distinción de
estos dos subtipos tiene lugar debido a su perfil de citocinas. Las
células TH1 producen interferón-\gamma
(INF\gamma), interleucina 2 (IL-2) y factor
\beta de necrosis tumoral, mientras que las células TH2 secretan
IL-4, IL-5, IL-9 y
IL-13. Las infecciones bacterianas y virales inducen
una respuesta inmunitaria que es dominada por células TH1. Por otra
parte, las células TH2 regulan la producción de IgE contra
parásitos. En este sentido, entre las células TH1 y TH2 existe un
equilibrio. La destrucción de este equilibrio causa enfermedades;
así, una respuesta excesiva de células TH1 está asociada con
enfermedades autoinmunitarias, mientras que las enfermedades
alérgicas se basan en una respuesta reforzada de células TH2.
Se sabe que las citocinas TH1 participan en la
patogénesis de enfermedades autoinmunitarias, como por ejemplo
uveitis autoinmune, encefalomielitis alérgica experimental, diabetes
mellitus tipo 1 o enfermedad de Crohn, mientras que las citocinas
TH2 (IL A, IL-5, IL-13 o
IL-9) participan en la aparición de enfermedades
respiratorias inflamatorias crónicas, como por ejemplo eosinofilia
de las vías respiratorias, hipersecrección mucosa e hiperreactividad
de las vías respiratorias. La base de estas enfermedades son
modificaciones patofisiológicas durante la producción de citocinas
características mediante células TH específicas para antígeno. Así,
los ratones transgénicos, que en los epitelios de las vías
respiratorias sobreexpresan de manera constitutiva las citocinas TH2
IL-4, IL-5, IL-13 o
IL-9, muestran reacciones inflamatorias alérgicas
típicas. Las subpoblaciones de células TH2 en el pulmón y las vías
respiratorias provocan en las células TH2 en el modelo animal los
síntomas característicos del asma
bronquial.
bronquial.
Se encontró de manera sorprendente que para el
tratamiento específico para células y/o tejidos de inflamaciones
crónicas y/o enfermedades autoinmunitarias son idealmente adecuados
factores de transcripción y factores de las rutas de transducción
de señales para la diferenciación y/o expresión de citocinas que
participan en la aparición de reacciones inflamatorias crónicas y
enfermedades autoinmunitarias, como por ejemplo: el factor de
transcripción específico para células TH1 T-bet y el
factor de transcripción específico para células TH2
GATA-3.
El factor de transcripción específico para
células TH2 GATA-3 es sobre todo responsable de la
diferenciación de células T CD4^{+} indiferenciadas a células
TH2.
En este sentido, la diferenciación de células
TH2 se controla principalmente mediante dos rutas de transducción
de señales, la ruta del receptor de células T (RCT) y la ruta del
receptor de IL-4. Las señales transmitidas por RCT
activan tanto los factores de transcripción específicos para células
TH2 c-Maf y GATA-3 como los factores
de transcripción NFAT y AP-1. La activación del
receptor de IL-4 lleva a la unión de STAT6 al
dominio citoplasmático del receptor de IL-4, donde
es fosforilado por las cinasas Jak1 y Jak3. Por su parte, la
fosforilación lleva a la dimerización y translocación de STAT6 en
el núcleo, en el que STAT6 activa la transcripción de
GATA-3 y otros
genes.
genes.
GATA-3 es un factor de
transcripción de tipo dedo de cinc que según el "análisis de
diferencia representacional" (ADR) y estudios de la regulación
transcripcional de IL-5 se expresa exclusivamente en
células TH2 maduras, no en TH1.
Otros factores de transcripción que desempeñan
una función en la diferenciación a células TH1 o TH2 y participan
en la aparición de reacciones inflamatorias crónicas y enfermedades
autoinmunitarias presentan una expresión que se diferencia en una
célula diana en comparación con la expresión de una célula de
control y según la invención también se utilizan para el diseño de
ADNzimas y/o ARNip específicos para la utilización terapéutica en
enfermedades inflamatorias crónicas:
\bullet STAT4, STAT5a y STAT1 (signal
transducer and activator of transcription, transductor de señales y
activador de la transcripción)
\bullet c-Rel
\bullet CREB2 (cAMP response
element-binding protein 2, proteína de unión 2
del elemento de respuesta del AMPc)
\bullet ATF-2,
ATF-2
\bullet Hlx
\bullet IRF-1 (interferon
regulatory factor-1, factor 1 regulador del
interferón)
\bullet c-Maf
\bullet NFAT (Nuclear factor of
activated T cells, factor nuclear de células T
activadas)
\bullet NIP45 (NF-AT
interacting protein 45, proteína 45 que interacciona
con NF-AT)
\bullet AP1 (Activator Protein
1, proteína 1 activadora)
\bullet Mel-18
\bullet SKAT-2 (SCAN
box, KRAB domain associated with a Th2
phenotype, dominio KRAB de la caja SCAN asociado con un fenotipo
Th2)
\bullet CTLA-4
(Cytolytic T
lymphocyte-associated antigen
4, antígeno 4 asociado al linfocito T citotóxico)
Otros factores de las rutas de transducción de
señales que son responsables de la diferenciación y/o expresión de
citocinas y participan en la aparición de reacciones inflamatorias
crónicas y enfermedades autoinmunitarias presentan una expresión
que se diferencia en una célula diana en comparación con la
expresión de una célula de control y según la invención también se
utilizan para el diseño de ADNzimas y/o ARNip específicos para la
utilización terapéutica en enfermedades inflamatorias crónicas:
\bullet Cinasa Src
\bullet Cinasa Tec
- Rlk (Txk en seres humanos)
- Itk
- Tec
\bullet RIBP (proteína de unión a Rlk/Itk)
\bullet PLC\gamma (fosfolipasa
C\gamma1)
\bullet Cinasa MAP (proteína cinasa activada
por mitógeno)
- ERK
- JNK
- P38
\bullet MKK (cinasa cinasa MAP)
- MKK1
- MKK2
- MKK3
- MKK4
- MKK6
- MKK7
\bullet Rac2
\bullet GADD45 (gen 45 de detención del
crecimiento y daño del ADN)
- GADD45\beta
- GADD45\gamma
\bullet SOCS (supresores de la señalización de
citocinas)
- CIS (proteína SH2 inducida por citocinas)
- SOCS1
- SOCS2
- SOCS3
\bullet JAK (cinasa Janus)
- JAK1
- JAK3
\bullet NIP45 (proteína que interacciona con
NF-AT)
Según la invención se proporciona un fármaco
específico para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad que es
adecuado para el tratamiento de inflamaciones crónicas.
El fármaco ataca preferiblemente en los puntos
de intervención de la compleja cascada de las regulaciones anómalas
inmunológicas y de biología celular en la que se basan las
reacciones inflamatorias crónicas y las enfermedades
autoinmunitarias. Se prefieren especialmente estos puntos de
intervención de la regulación de la diferenciación de los factores
de transcripción partícipes, como por ejemplo el factor de
transcripción específico para células TH2 GATA-3.
El efecto terapéutico conseguido consiste en una inactivación
funcional de moléculas de ARNm mediante ADNzimas y/o ARNip
específicos. Esta estrategia ofrece una serie de ventajas en
comparación con los enfoques convencionales, pero también de terapia
génica: mayor especificidad y selectividad, alta estabilidad de las
moléculas y una antigenicidad insignificante. Se consiguen
requisitos óptimos para una terapia a largo plazo hecha a medida en
pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas.
Según la invención se proporciona un
procedimiento para la preparación de un fármaco específico para
células y/o tejidos y/o fases de enfermedad que comprende las
siguientes etapas:
a) Identificación de moléculas de ácido
ribonucleico cuya expresión se diferencia en una célula diana en
comparación con la expresión de una célula de control
b) Diseño de moléculas de ácido ribonucleico
específico que se unen a las moléculas de ácido ribonucleico de la
etapa a) y las inactivan funcionalmente
c) Introducción de las moléculas de ácido
ribonucleico específico de la etapa b) en células diana
d) Formulación de las moléculas de ácido
ribonucleico específico de la etapa b) y/o de una célula diana de
la etapa c) en un fármaco
El término "específico para células y/o
tejidos y/o fases de enfermedad" significa en el sentido de la
presente invención que el fármaco preparado mediante el
procedimiento según la invención sólo es esencialmente eficaz en un
tipo determinado de células (célula diana) y/o en determinados
tejidos u órganos y/o en determinadas fases de la enfermedad y
posee una influencia insignificante en otras células (células de
control), tejido u órganos. Preferiblemente, el fármaco es eficaz
en al menos 2/3 de las células diana. Más preferido en al menos el
80% y lo más preferido en al menos el 98% de las células diana. Se
prefiere además que el fármaco sea eficaz en como máximo el 10% de
las células de control, más preferido en como máximo el 5% y lo más
preferido en < 1% de las células de
control.
control.
El término "identificación de moléculas de
ácido ribonucleico cuya expresión se diferencia en una célula diana
en comparación con la expresión de una célula de control"
comprende en la presente invención los siguientes puntos:
i) Células diana son células en tejidos y
órganos que, de manera conocida, llevan a la aparición de una
enfermedad, contribuyen a ella o la refuerzan, que fomentan los
procesos que mantienen la enfermedad, contribuyen a ellos o los
refuerzan, o que llevan a las consecuencias a largo plazo de una
enfermedad, contribuyen o las refuerzan. Entre éstas figuran, por
ejemplo, células que presentan determinados factores de
transcripción, que segregan hormonas específicas, citocinas y
factores de crecimiento, o células con receptores de superficie
típicos.
ii) Las células diana pueden aislarse, por
ejemplo, mediante tecnologías que se basan en la unión a anticuerpos
específicos. En este caso se usan perlas magnéticas que pueden
obtenerse de las empresas Miltenyi (Macs-System),
Dynal (DynaBeads) o BD-Bioscience (iMAG).
Alternativamente, esto tiene lugar mediante una purificación de
células mediante anticuerpos marcados con fluorescencia en
citómetros, por ejemplo, de la empresa Cytomation (MOFLO) o
BD-Bioscience (FACS-Vantage). La
pureza de las células diana es preferiblemente de al menos el 80%,
más preferido de al menos el 95% y lo más preferido de al menos el
99%.
iii) Los procedimientos para el aislamiento de
ARN se describen, por ejemplo, en Sambrook y Russell, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor
Laboratory (2001), Nueva York y Ausubel y col., Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998), Nueva York.
Además, para el experto medio en la materia es posible usar kits
comercialmente disponibles (Silika-Technologie), por
ejemplo, el kit RNeasy de la empresa Qiagen, para el aislamiento de
ARN. Además, se prefiere purificar directamente ARNm de las células
diana mediante el uso de kits comerciales, por ejemplo, de las
empresas Qiagen (kit Oligotex mRNA), Promega (polyATract mRNA
Isolation System) o Miltenyi (mRNA direct).
iv) La identificación de ARNm que son
diferencialmente distintos, es decir, ARNm cuya expresión en la
célula diana es alta en comparación con la célula de control, tiene
lugar, por ejemplo, con matrices génicas que pueden adquirirse
comercialmente (por ejemplo, MWG, CLONTECH)] o con un procedimiento
de hibridación en filtro (por ejemplo Unigene) según indicaciones
del fabricante. Alternativamente, los ARNm diferenciales se preparan
mediante hibridación sustractiva de ADNc que se forman previamente
a partir de ARNm mediante reacción de TI. Entre los procedimientos
conocidos para el experto figuran, por ejemplo, el procedimiento de
SSH (empresa Clontech) o el procedimiento de ADR. A una forma de
aplicación también preferida pertenece la combinación de tecnología
de matrices e hibridación sustractiva. La identificación de los
genes diferencialmente expresados tiene lugar con la utilización de
la tecnología de matrices con ayuda de programas que pueden
obtenerse comercialmente, por ejemplo, con el programa Vector
Xpression de la empresa InforMax. En la utilización de hibridación
sustractiva, después del aislamiento de los genes diferencialmente
expresados mediante procedimientos habituales usuales para el
experto como clonación y posterior secuenciación (véase, por
ejemplo, Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory (2001), Nueva York
y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons (1998), Nueva York) tiene lugar un alineamiento de
secuencias en un banco de datos, como por ejemplo
Gene-Bank (www.ncbi.nlm.nih.gov).
La expresión en la célula diana se diferencia en
comparación con la expresión en una célula de control. En una forma
de realización del procedimiento según la invención, la expresión en
la célula diana es alta en comparación con la expresión en una
célula de control, preferiblemente al menos un factor de 1,5. En una
forma de realización especialmente preferida, la expresión en la
célula diana es alta en comparación con la expresión en una célula
de control al menos un factor de 5, y en una forma de realización
muy preferida, la expresión sólo en la célula diana, pero no en la
célula de control, es detectable.
El término "diseño de moléculas de ácido
ribonucleico que se unen a moléculas de ácido ribonucleico de la
etapa a) y las inactivan funcionalmente" comprende en el sentido
de la presente invención el uso de enzimas de ADN inactivadoras de
ARN (ADNzimas) y/o ARN interferente pequeño (ARNip) que inactivan
funcionalmente las moléculas de ácido ribonucleico.
El término ADNzimas comprende en este sentido
según la invención moléculas de ADN que reconocen específicamente y
escinden la secuencia diana del ácido nucleico, tanto ADN como
ARN.
El modelo "10-23"
representa un modelo de ADNzimas general. Las ADNzimas del modelo
10-23 - también denominadas "ADNzimas
10-23" - poseen un dominio catalítico de 15
ácidos desoxirribonucleicos que está flanqueado por dos dominios de
unión a sustrato. La longitud de los dominios de unión a sustrato es
variable, son o de longitud igual o diferente. En una realización
preferida, la longitud de los dominios de unión a sustrato asciende
a entre 6 y 14 nucleótidos.
En una realización especialmente preferida, los
dominios de unión a sustrato son completamente complementarios a la
región que flanquea el sitio de escisión. Sin embargo, para unirse
al ARN diana y escindirlo, las ADNzimas no deben ser necesariamente
completamente complementarias. Las investigaciones in vitro
muestran que las ADNzimas del tipo 10-23 escinden
el ARNm diana de secuencias sucesivas de
purina-pirimidina.
Para usar las ADNzimas en el tratamiento de
enfermedades se prefiere que las ADNzimas estén tan bien
estabilizadas en el cuerpo (en la sangre, en el medio intracelular,
etc.) como sea posible contra la degradación. Una realización
preferida es la introducción de una inversión 3'-3'
en uno o varios extremos de la ADNzima. El término inversión
3'-3' designa un enlace fosfato covalente entre los
carbonos de 3' del nucleótido del extremo y del nucleótido
contiguo. Este tipo de enlace está en oposición al enlace fosfato
normal entre los carbonos de 3' y 5' de nucleótidos sucesivos. En
consecuencia, se prefiere que el nucleótido en el extremo 3' del
dominio de unión a sustrato contiguo al extremo 3' del dominio
catalítico esté al revés. Adicionalmente a las inversiones, las
ADNzimas pueden contener nucleótidos o compuestos de nucleótidos
modificados. Los nucleótidos modificados contienen, por ejemplo,
compuestos de N3'-P5'-fosforamidato,
sustituciones de 2'-O-metilo y
compuestos de ácido nucleico de péptido. Su preparación es usual
para el experto.
Aunque los potenciales sitios de corte de
ADNzimas aparecen de forma ubicua, éstos están frecuentemente
bloqueados por la estructura secundaria del ARN y con ello son
inaccesibles para las ADNzimas. Por tanto, de un conjunto de
ADNzimas se seleccionan aquellas cuyos sitios de corte estén
libremente accesibles. Estas ADNzimas seleccionadas son activas,
escinden el ARNm diana y con ello lo inactivan funcionalmente. La
eficacia de la escisión del ARNm por las ADNzimas individuales se
muestra o mediante pruebas individuales de cada ADNzima o mediante
pruebas acopladas de varias ADNzimas en "múltiples ensayos"
(descritos, por ejemplo, en Cairns y col.,
1999).
1999).
El término ARNip comprende según la invención
moléculas de ARN bicatenario de 21-23 bases de
longitud que llevan a una degradación específica del ARNm diana
complementario tanto in vitro como in vivo. El
experto sabe mediante la bibliografía (por ejemplo,
http://www.mpibpc.gwdg.de/abteilungen/100/105/index.html) preparar
moléculas de ARNip partiendo de la secuencia de ARNm diana.
La probabilidad de que entre tres moléculas de
ARNip seleccionadas se encuentre al menos una sumamente activa
(inhibición del ARN diana de al menos el 80%) se indica en la
bibliografía con al menos el 70%. De un conjunto de moléculas de
ARNip se seleccionan aquellas que llevan a una degeneración
específica del ARNm diana complementario tanto in vitro como
in vivo.
El término "introducción de las moléculas de
ácido ribonucleico específico de la etapa b) en células diana"
comprende en el sentido de la presente invención la transfección de
vectores, especialmente plásmidos, cósmidos, virus o bacteriófagos,
que contienen las moléculas de ácido ribonucleico específico
anteriormente descritas según la invención, en las células diana.
Preferiblemente son adecuados los vectores para la transformación
de células animales y humanas y permiten la integración de las
moléculas de ácido ribonucleico según la invención. Los
procedimientos para la transfección, como por ejemplo lipofección
mediante DMRIE-C de la empresa Invitrogen, son
conocidos para el experto de la bibliografía. En principio, para
esto también son adecuados vectores liposomales. Las moléculas
diana son factores de transcripción, células que segregan hormonas,
citocinas y factores de crecimiento, pero también células que en la
superficie llevan los receptores expresados.
Como células de control en el sentido de la
invención se recurre a células sanas de tejido diana, células del
mismo tipo de otros compartimentos del mismo paciente o también de
individuos sanos.
El cultivo de la célula diana tiene lugar en
medios nutrientes que están adaptados correspondientemente a las
necesidades de la célula diana según valor de pH, temperatura,
concentración de sales, antibióticos, vitaminas, oligoelementos y
aireación.
El término paciente se refiere igualmente a
seres humanos y vertebrados. Con esto, el fármaco puede usarse en
la medicina humana y veterinaria.
El término "formulación de las moléculas de
ácido ribonucleico específico de la etapa b) o de una célula diana
de la etapa c) en un fármaco" comprende composiciones
farmacéuticamente aceptables que contienen modificaciones y
"profármacos", siempre y cuando según juicio médico fidedigno
no desencadenen toxicidad excesiva, irritaciones o reacciones
alérgicas en el paciente. El término "profármaco" se refiere a
compuestos que se transforman para mejorar la absorción, como por
ejemplo mediante hidrólisis en la sangre.
Preferiblemente, la formulación hace posible que
las moléculas de ácido ribonucleico específico se administren al
paciente en forma de una composición farmacéuticamente aceptable o
bien por vía oral, rectal, parenteral, intravenosa, intramuscular o
subcutánea, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal,
intratecal, intravascular, local (polvo, pomada o gotas) o bien en
forma de aerosol.
Las formas farmacéuticas para la administración
local del fármaco de esta invención incluyen pomadas, polvos,
aerosoles o agentes para inhalación. El componente activo se mezcla
en condiciones estériles con un vehículo fisiológicamente aceptable
y posibles conservantes, tampones o propelentes, dependiendo de la
necesidad.
El médico práctico determina el tipo de
dosificación correspondientemente a los factores clínicos. El
experto sabe que el tipo de dosificación depende de distintos
factores como, por ejemplo, tamaño corporal, peso, superficie
corporal, edad, sexo o la salud general del paciente, pero también
del agente que especialmente va a administrarse, la duración y el
tipo de administración y de otros medicamentos que posiblemente se
administran en paralelo.
El fármaco preparado con el procedimiento según
la invención presenta una alta especificidad por pacientes,
enfermedades, estadios o fases. Produce una intervención específica
para células y es específico para compartimentos y órganos. No
aparece ninguna reacción o sólo muy pocas reacciones del sistema
inmunitario contra el fármaco y el perfil de efectos secundarios
está en una relación aceptable con el grado de gravedad, pronóstico
y transcurso de la enfermedad.
El fármaco puede usarse para la terapia contra
grupos completos de enfermedades que van acompañados de
inflamaciones crónicas como, por ejemplo, enfermedades
autoinmunitarias, enfermedades de tipo reumático (manifestaciones
en, entre otros, piel, pulmón, riñón, sistema vascular, sistema
nervioso, tejido conjuntivo, aparato locomotor, sistema endocrino),
reacciones alérgicas de tipo inmediato y asma, enfermedades
pulmonares obstructivas crónicas (EPOC), arteriosclerosis,
psoriasis y eccema de contacto, así como contra reacciones de
rechazo crónico después de trasplante de órganos y de médula
ósea.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
i) Como células diana se usan las células
CD4^{+} indiferenciadas responsables de la aparición de reacciones
inflamatorias crónicas.
ii) Las células diana CD4^{+} se aíslan
mediante perlas magnéticas (empresa Miltenyi
(Macs-System), Dynal (DynaBeads) o
BD-Bioscience (iMAG), alternativamente mediante
anticuerpos marcados con fluorescencia en citómetros, por ejemplo
de las empresas Cytomation (MOFLO) o BD-Bioscience
(FACS-Vantage).
iii) El aislamiento de ARN tiene lugar según
procedimientos habituales, véase Sambrook y Russell, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor
Laboratory (2001), Nueva York y Ausubel y col., Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998), Nueva York.
Alternativamente se usa un kit RNeasy de la
empresa Qiagen, o tiene lugar el aislamiento directo de ARNm de
células diana CD4^{+} con el kit Oligotex mRNA de la empresa
Qiagen según indicaciones del fabricante.
iv) La identificación de ARNm que son
diferencialmente distintos, es decir, ARNm cuya expresión en la
célula diana es alta en comparación con la célula de control, tiene
lugar mediante matrices génicas (por ejemplo, MWG, CLONTECH)] y la
identificación de los genes diferencialmente expresados mediante el
programa Vector Xpression de la empresa
Infor-Max.
Procedimientos de hibridación en filtro (por
ejemplo Unigene) según indicaciones del fabricante. El aislamiento
de los genes diferencialmente expresados incluye la clonación,
secuenciación (según instrucciones habituales, véase, por ejemplo,
Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª
edición, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) y el alineamiento de
secuencias en el banco de datos de genes (www.ncbi.nlm.nih.gov).
La expresión de GATA-3 se
diferencia en la célula diana (célula TH2) en comparación con la
expresión en una célula de control (por ejemplo, célula Th0).
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 3 muestra el conjunto según la
invención hgd1 a hgd70 de ADNzimas específicas contra ARNm de
GATA-3. Las ADNzimas presentan una longitud total
de 33 nucleótidos, en las que el dominio catalítico central se
corresponde con 15 nucleótidos (en letras minúsculas) del dominio
catalítico de la ADNzima 10-23 conocida (figura 2).
Este dominio catalítico se flanquea por dos dominios de unión a
sustrato derecho e izquierdo compuestos respectivamente por 9
nucleótidos (en letras mayúsculas). La secuencia de nucleótidos del
dominio de unión a sustrato derecho e izquierdo es diferente y
varía en las ADNzimas hgd1 a hgd70, de manera que tiene lugar una
unión diferentemente específica mediante el par de
Watson-Crick del ARNm de GATA-3.
La figura 2 muestra el modelo general para la
unión de la ADNzima 10-23 a un ARN diana cualquiera
marcado con N en el que la flecha señala hacia el sitio de escisión
en el ARNm diana.
Las ADNzimas pueden escindir el ARNm diana
concretamente en cualquier secuencia de
purina-pirimidina, pero de la bibliografía se
conoce que los enlaces purina-uracilo se escinden
más eficazmente que los enlaces purina-citosina.
Por esto se construyen preferiblemente ADNzimas que se escinden en
los enlaces purina-uracilo.
El modelo mostrado en la figura 2 puede
transferirse en su modo de funcionamiento al enlace de las ADNzimas
hgd1 a hgd70 de ARNm de GATA-3.
Las ADNzimas hgd1 a hgd70 se utilizan sin
modificar para ensayos in vitro, para ensayos en cultivo
celular provistas de modificaciones (pueden adquirirse
comercialmente de la empresa Eurogentec).
Como modificaciones para la estabilización y
protección se utilizan:
1) Una timidina inversa estabilizadora en el
extremo 3'
2) Una marca de FAM en el extremo 5' para
evaluar la eficacia de transfección de las células mediante análisis
de FACS.
Para probar las ADNzimas in vitro se
necesita ARNm de GATA-3 que se prepare mediante
transcripción in vitro. Las etapas individuales son del
siguiente modo:
- Aislamiento de ARN a partir de sangre completa
humana con EDTA mediante
QlAamp-RNA-Blood-Mini-Kit
(Qiagen, Alemania) según indicaciones del fabricante
- Transcripción inversa con los cebadores:
Cebador directo GGCGCCGTCTTGATACTTT
Cebador inverso CCGAAAATTGAGAGAGAAGGAA, en la
que se amplifica un producto de PCR con una longitud de 2731
nucleótidos (JumpStart Accu Taq DNA Polymerase, Sigma).
Condiciones de PCR: desnaturalización inicial
(96ºC, 30 s), amplificación con 40 ciclos (94ºC, 15 s; 48ºC, 30 s;
68ºC, 3 min.), extensión final (68ºC, 30 min).
El producto de PCR se clona mediante
procedimientos habituales en el plásmido pCR2.1 (Invitrogen) y se
secuencia para comprobación. La preparación de ARNm de
GATA-3 tiene lugar después de la linealización del
plásmido pCR2.1 que contiene GATA-3 mediante
escisión con la enzima de restricción Spe 1 mediante transcripción
in vitro según indicaciones del fabricante (Ambion). El ARNm
de GATA-3 está presente con una longitud total de
2876 nucleótidos.
La figura 4 muestra las secuencias de
nucleótidos conocidas de los genes de GATA-3 humanos
de las entradas del banco de datos [PubMed
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide)], en
las que las bases divergentes están en un cuadro gris. Secuencia 1:
GATA-3 humano del banco de datos nº: XM_043124,
secuencia 2: GATA-3 humano del banco de datos nº:
X58072, secuencia 3: GATA-3 humano (aislado a partir
del plásmido
pCR2.1).
pCR2.1).
Las secuencias de ARNm de GATA-3
se diferencian entre sí en lo referente a la longitud de los
extremos sin traducir 3' o sin traducir 5'. Para obtener la
secuencia completa exacta del ARNm, para la selección de cebadores
se usan las secuencias de ARNm de nº de entrada: XM_043124 y X58072.
Las localizaciones de los cebadores para la clonación de
GATA-3 están subrayadas en la figura 4. La figura 4
muestra además un alineamiento de la secuencia de ácidos nucleicos
de GATA-3 de la base de datos (secuencia 1 y 2) con
la secuencia de nucleótidos (secuencia 3) secuenciada a partir del
plásmido pCR2.1. En este sentido se muestra que las secuencias no
son completamente idénticas, sino que bases aisladas son
diferentes. La secuencia de ácidos nucleicos 3 de
GATA-3 de la figura 4 forma según la invención la
base para la construcción de ADNzimas contra ARNm de
GATA-3.
GATA-3.
La figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos
de la secuencia 3 del gen de GATA-3 humano de la
figura 4 y en ella marcada como relleno gris respectivamente dos
nucleótidos GT o AT, entre los cuales se encuentran otros sitios de
corte potenciales para las ADNzimas.
Los experimentos de escisión in vitro de
ARNm de GATA-3 con las ADNzimas
(hgd1-hgd70) se realizan en un volumen de 10 \mul
de la siguiente mezcla de reacción: Tris 50 mM a pH 7,4, NaCl 150
mM, MgCl_{2} 10 mM, ADNzima 0,25 \muM y ARNm de
GATA-3 transcrito in vitro 0,025 \muM (en
una relación sustrato a ADNzima de 1:10). Las reacciones se incuban
a 37ºC durante los tiempos respectivamente indicados. La reacción se
detiene mediante la adición de tampón de carga de muestra de ARN
que contiene formamida y EDTA (Sigma). Las muestras
desnaturalizadas se separan en geles de TAE al 1,3%-agarosa y se
analizan en el transiluminador de UV. La figura 5 muestra como
resultado de la electroforesis en gel la escisión del ARNm diana de
GATA-3 con ADNzima no modificada [hgd11 (carril 2),
hgd13 (carril 4), hgd17 (carril 6), hgd40 (carril 8)] y ADNzimas
modificadas [hgd11-M (carril 3),
hgd13-M (carril 5), hgd17-M (carril
7), hgd40-M (carril 9)]. El carril 1 contiene como
control ARNm sin adición de ADNzima. Las ADNzimas modificadas están
marcadas con una M adicional. Un patrón de longitud introducido
conjuntamente (no representado) muestra tamaños de banda de 1000 pb,
2000 pb y 3000 pb. Las flechan señalan hacia S, la banda con el
sustrato (en este caso ARNm de GATA-3) y los
productos de escisión P1 y
P2.
P2.
La comparación entre las 70 ADNzimas muestra que
hgd11, hgd13, hgd17 y hgd40 son especialmente activas, las
modificaciones reducen la eficacia de las ADNzimas hgd11, hgd13 y
hgd17, pero no la eficacia de la ADNzima hgd40.
La siguiente tabla muestra la clasificación de
las ADNzimas hgd1 a hgd70 contra ARNm de GATA-3 en 4
grupos. Esta clasificación en grupos tiene lugar debido a las
pruebas de actividad in vitro de las ADNzimas realizadas
contra ARNm de GATA-3. Grupo 1: actividad de
escisión alta, grupo 2: actividad de escisión media, grupo 3:
actividad de escisión débil, grupo 4: ninguna actividad de
escisión.
\vskip1.000000\baselineskip
Las ADNzimas todavía activas hgd11, hgd13, hgd17
y hgd40 se usan con y sin las modificaciones descritas en células
diana.
Para esto se cultivan células Jurkat E6.1
células (células de leucemia aguda humana de células T) en medio
RPMI con 100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina y SBF
al 10% a 37ºC en atmósfera humedecida con 5% de CO_{2}. Las
transfecciones se realizan en placas de 6 pocillos. Para esto,
2x10^{6} células Jurkat E6.1 se transfieren a medio de cultivo
celular Opti-MEM-I (Invitrogen) y se
transfectan mediante DMRIE-C (Invitrogen) con las
ADNzimas modificadas (0,3 \muM) (según indicaciones del fabricante
de la empresa Invitrogen). Después de 10 horas de incubación en una
estufa de incubación bajo las condiciones anteriores se añade medio
RPMI (con los aditivos anteriormente indicados) y la incubación
continua durante otras 14 horas. Las células se lavan con medio
Opti-MEM y a continuación se transfectan de nuevo
según el protocolo anteriormente descrito. Después de cada
transfección se valora la eficacia de la transfección mediante
análisis de FACS.
A continuación se comprueba la actividad de las
ADNzimas mediante detección de la cantidad de proteína de
GATA-3 en transferencia de Western (véase la figura
6).
Para los análisis de transferencia de Western,
las proteínas citoplasmáticas y las proteínas del núcleo se separan
procesan mediante un kit de extracción de proteínas según
indicaciones del fabricante (Pierce). La concentración de proteína
se determina con el kit BCA (Pierce). La separación de
respectivamente 30 \mug de proteína tiene lugar mediante
electroforesis en gel desnaturalizante en geles de SDS al
10%-poliacrilamidas. Las proteínas se transfieren a continuación
según procedimientos habituales a membranas de nitrocelulosa. Las
membranas se bloquean con leche desnatada en polvo al 5% en PBS (con
Tween 20 al 0,01%) y a continuación con anticuerpos de ratón
anti-GATA-3 (Santa Cruz) (1:500) y
posteriormente se incuban con anticuerpos de ratón
anti-conejo acoplados a HRP (BD Biosciences)
(1:2000) durante respectivamente una hora a temperatura ambiente.
Las proteínas se visualizan mediante quimioluminiscencia. Mediante
la detección en paralelo de beta-actina en las
transferencias se controlan las variaciones en la cantidad aplicada
de proteína. Para esto se detecta primero GATA-3 en
la membrana de nitrocelulosa. A continuación se deja la misma
membrana durante la noche en una cámara húmeda. Después de 2
lavados con PBS tiene lugar la detección de
\beta-actina mediante inmunotinción con
anticuerpos específicos (anticuerpos de ratón
anti-beta-actina humana
(Sigma)).
La figura 6 muestra el resultado de la
inmunotransferencia con el resultado de la actividad de las ADNzimas
en células. Las células Jurkat E6.1 se transfectan mediante
lipofección con ADNzimas (carril 4=hgd11-M, carril
5=hgd13-M, carril 6=hgd17-M, carril
7=hgd40-M). Como controles se utilizan células no
tratadas (carril 1), solamente tratadas con medio de transfección
(carril 2) o con ADNzimas sin medio de transfección (carril 3).
Después de 48 h de incubación, las proteínas solubilizadas se
separan mediante SDS-PAGE y GATA-3
(A) se detecta mediante inmunotransferencia con anticuerpos
específicos. Para confirmar que en cada carril se utiliza la misma
cantidad de proteína, en la misma membrana de transferencia tiene
lugar una inmunotinción con \beta-actina (B). Un
patrón de longitud introducido conjuntamente (no representado)
muestra bandas de proteína del tamaño 63,8 kDa, 49,5 kDa y 37,4
kDa.
Se muestra que las ADNzimas hgd11, hgd13 y hgd17
no son activas in vivo, mientras que la ADNzima hgd40
también inhibe la expresión de GATA-3 in
vivo. Por tanto, la inhibición específica de la expresión de
GATA-3 in vivo por la ADNzima hgd40
representa una herramienta terapéutica eficaz para el tratamiento
de enfermedades inflamatorias crónicas.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de distintas ADNzimas con dominio de
unión a sustrato específico para GATA-3 muestra que
la ADNzima hgd40 inhibe específicamente la expresión de
GATA-3 in vivo y es adecuada como ácido
ribonucleico específico para la preparación de un fármaco
específico para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad. Además,
hgd40 (5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG) o las
células transfectadas con hgd40 se proveen en una composición
farmacéutica de un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo
liposomas o polímeros biodegradables. Alternativamente a las
ADNzimas, para la inhibición específica de la expresión de
GATA-3 y para la preparación de un fármaco
específico para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad se
propone la utilización de ARNip. Preferiblemente se utiliza ARNip
para la inhibición de GATA-3 de ratón y humano. La
preparación de ARNip es conocida para el experto y se describe en
la bibliografía.
\newpage
A continuación se presentan ejemplos de
secuencias de ARNip:
Para el experto es evidente que con el
conocimiento de la presente invención también pueden prepararse
fácilmente ADNzimas o ARNip específicos como fármacos para
enfermedades inflamatorias crónicas y enfermedades autoinmunitarias
que están dirigidos contra otros factores de transcripción que
desempeñan una función en la diferenciación a células TH1 o TH2,
por ejemplo STAT4, STAT5a, STAT1, c-Rel, CREB2,
ATF-2, ATF-2, Hlx,
IRF-1, c-Maf, NFAT, NIP45, AP1,
Mel-18, SKAT-2,
CTLA-4 o que están dirigidos contra otros factores
de las rutas de transducción de señales para la diferenciación y/o
expresión de citocinas, por ejemplo cinasa Src, cinasa Tec, Rlk (Txk
en seres humanos), Itk, Tec, RIBP, PLC\gamma, cinasa MAP, ERK,
JNK, P38, MKK, MKK1, MKK2, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, Rac2, GADD45,
GADD45\beta, GADD45\gamma, SOCS, CIS, SOCS1, SOCS2, SOCS3, JAK,
JAK1, JAK3, NIP45.
Estas proteínas presentan una expresión que es
alta en una célula diana en comparación con la expresión de una
célula de control.
<110> Universidad Philipps de Marburgo
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la preparación de
un fármaco específico para células y/o tejidos y/o fases de
enfermedad
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 04802618.1 - 2403
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/DE2004002197
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
01-10-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 10346487.5
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
02-10-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd1 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcggtcagag gctagctaca acgatgcgtt gct
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hdg2 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgtacgag gctagctaca acgactgctc ggt
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd3 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcggcgtag gctagctaca acgagacctg ctc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd4 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgggtcag gctagctaca acgactgggt agc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd5 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctctgcag gctagctaca acgacggggt cct
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd6 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactctgcaag gctagctaca acgatctgcg agc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd7 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcgacgag gctagctaca acgatctgca att
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd8 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggggcgag gctagctaca acgagactct gca
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd9 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaacgggag gctagctaca acgacaggtt gta
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd10 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaataaaag gctagctaca acgagggacc agg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd11 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggcagaag gctagctaca acgaaaaacg gga
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd12 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaactgggtag gctagctaca acgaggcaga ata
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd13 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatccaaaaag gctagctaca acgatgggta tgg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd14 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggggaagag gctagctaca acgaaaaaat cca
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd15 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttaaaaag gctagctaca acgatatctt gga
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd16 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggggggag gctagctaca acgagggaag gct
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd17 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttgaatgag gctagctaca acgattgctt tcg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd18 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgttgaag gctagctaca acgagatttg ctt
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd19 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcccggaag gctagctaca acgaccgcgc gcg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd20 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcacctccag gctagctaca acgaggcctc ggc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd21 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgccgtcag gctagctaca acgactccat ggc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd22 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtggctcag gctagctaca acgaccagcg cgg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd23 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgttgagcag gctagctaca acgaggcggg gtg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd24 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgcgtccag gctagctaca acgagtagga gtg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd25 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcgggtag gctagctaca acgatgcgcc gcg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd26 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcacatccag gctagctaca acgactcctc cgg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd27 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaagcacag gctagctaca acgaccacct cct
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd28 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaaaaagcag gctagctaca acgaatccac ctc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd29 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccgtcgag gctagctaca acgagttaaa aag
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd30 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgccttgag gctagctaca acgacgtcga tgt
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd31 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggcgggag gctagctaca acgagtggtt gcc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd32 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggccctgag gctagctaca acgacgagtt tcc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd33 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacctctgcag gctagctaca acgacgtggc cct
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd34 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggagggtag gctagctaca acgactctgc acc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd35 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcggcacag gctagctaca acgactggct ccc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd36 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggcggcag gctagctaca acgaacctgg ctc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd37 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggatccag gctagctaca acgagaagca gag
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd38 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtagggag gctagctaca acgaccatga agc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd39 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggctgagag gctagctaca acgatccagg ggg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd40 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggatggag gctagctaca acgagtcttg gag
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd41 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtggtggag gctagctaca acgaggacgt ctt
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd42 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggggtagag gctagctaca acgaggagag ggg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd43 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaggaggag gctagctaca acgagaggcc ggg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd44 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccccccgag gctagctaca acgaaaggag gag
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd45 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggggagag gctagctaca acgagtcctt cgg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd46 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggacagcgag gctagctaca acgagggtcc ggg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd47 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggggtggag gctagctaca acgaagcgat ggg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd48 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgaggcag gctagctaca acgatctttc tcg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd49 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacctggtag gctagctaca acgattgagg cac
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd50 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaggggcag gctagctaca acgactggta ctt
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd51 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagcttcag gctagctaca acgagctgtc ggg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd52 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgggacgag gctagctaca acgatccagc ttc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd53 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagtgggag gctagctaca acgagactcc agc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd54 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgctgccag gctagctaca acgagggagt ggg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd55 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcggtcag gctagctaca acgagctgcc acg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd56 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggctccag gctagctaca acgaccaggg cgg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd57 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgggtcgag gctagctaca acgagaggag gct
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd58 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtggtgag gctagctaca acgaggggtg gtg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd59 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactcgggcag gctagctaca acgagtaggg cgg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd60 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagctgtag gctagctaca acgatcgggc acg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd61 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggacttgcag gctagctaca acgaccgaag ccg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd62 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcctggag gctagctaca acgattgcat ccg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd63 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgctggag gctagctaca acgacgggcc ttg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd64 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttcacacag gctagctaca acgatccctg cct
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd65 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagttcacag gctagctaca acgaactccc tgc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd66 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacagttcag gctagctaca acgaacactc cct
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd67 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttgccccag gctagctaca acgaagttca cac
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd68 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgccgccag gctagctaca acgaagtggg gtc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd69 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccgtgccag gctagctaca acgactcgcc gcc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADNzima hgd70 contra ARNm de
GATA-3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgttgcag gctagctaca acgaaggtag tgt
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2399
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2365
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (57)..(57)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (59)..(59)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (69)..(69)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sitio de unión de hgd40
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (909)..(927)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. ADNzimas caracterizadas porque están
compuestas por
- un dominio catalítico con la secuencia de
nucleótidos GGCTAGCTACAACGA o una secuencia modificada con efecto
biológico comparable que corta al ARNm de GATA-3 en
cada sitio de unión de purina-pirimidina, al que
está unido,
- un dominio de unión a sustrato derecho a
continuación del extremo 3' del dominio catalítico y
- un dominio de unión a sustrato izquierdo a
continuación del extremo 5' del dominio catalítico, en las que los
dos dominios de unión a sustrato son respectivamente complementarios
a dos regiones del ARNm de GATA-3, de manera que se
hibridan con el ARNm,
- son activas in vivo y
- contienen la secuencia hgd40 GTGGATGGA
GGCTAGCTACAACGA GTCTTGGAG.
2. ADNzimas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque cortan con el dominio catalítico el
ARNm de GATA-3 en un sitio de unión de
purina-uracilo.
3. ADNzimas según las reivindicaciones 1 y 2,
caracterizadas porque están estabilizadas contra la
degradación en el organismo mediante la introducción de una
inversión 3'-3'.
4. ADNzimas según las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizadas porque están estabilizadas contra la
degradación en el organismo mediante la introducción de nucleótidos
o compuestos de nucleótidos modificados.
5. ADNzimas según las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizadas porque como modificación presentan una
timidina inversa en el extremo 3' y/o una marca de FAM en el
extremo 5'.
6. Procedimiento para la preparación de un
fármaco para el tratamiento de inflamaciones crónicas,
caracterizado porque
- se determinan células diana en las que la
expresión de ARNm de GATA-3 es mayor que en células
corporales sanas,
- se desarrolla una ADNzima eficaz in
vivo según la reivindicación 1 que se une al ARNm de
GATA-3 y lo inactiva funcionalmente,
- la ADNzima eficaz in vivo se introduce
en las células diana y
- se formulan fármacos que contienen la ADNzima
eficaz in vivo.
7. Fármaco que contiene una ADNzima según las
reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
8. Uso de una ADNzima según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de un fármaco para el
tratamiento de inflamaciones crónicas.
9. Uso de una ADNzima según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de un fármaco para la
inhibición específica de la expresión de GATA-3 en
células diana de pacientes que padecen inflamaciones crónicas.
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