MX2011000227A - Composiciones y metodos para inhibir la expresion de genes del receptor de factor de crecimiento por transformacion-beta. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un ácido ribonucleico de doble hebra (ARNds) para inhibir la expresión de un gen del receptor de TGF-beta tipo I, que comprende una hebra de antisentido que tiene una secuencia de nucleátidos la cual tiene menos de 30 nucleótidos de largo y la cual es sustancialmente complementaria a por lo menos una parte de un gen del receptor de TGF-beta tipo I. La invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende las moléculas de ARNds o ácido nucleico o vectores que codifican para las mismas junto con un portador farmacéuticamente aceptable; métodos para tratar enfermedades causadas por la expresión de un gen del receptor de TGF-beta tipo I usando la composición farmacéutica; y métodos para inhibir la expresión de un gen del receptor de TGF-beta tipo I en una célula.

Description

POSICIONES Y METODOS PARA INHIBIR LA EXPRESION DE ECEPTOR DE FACTOR DE CRECIMIENTO POR TRANSFORMAC Descripción de la Invención Esta invención se refiere a ácidos ribonucl hebra (ARNds) , y a su uso para mediar la inter RN para inhibir la expresión de genes del rec eta, en particular en la inhibición de la expré tor de TGF-beta tipo I. Además, el uso de es tratar enfermedades/trastornos fibróticos, infla stornos proliferativos , tales como cánceres, es invención.

El factor de crecimiento por transformac beta; AfCS ID A00227I) es parte de la superfami de citocinas, la cual tiene más de 40 miembr o TGF-beta tiene al menos tres isoformas, in izan la liberación de TGF-beta activo del c ocurre comúnmente sobre la superficie de macró el complejo TGF-beta latente se une a CD36 por ligando, trombospondina-1 (TSP-1) . Los e matorios que activan macrófagos incremen ación de TGF-beta activo al promover la activ ina. Los macrófagos también pueden end ejos TGF-beta latentes unidos a IgG que son se élulas plasmáticas y luego liberar TGF-beta acti o extracelular .

Los receptores de TGF-beta tanto tipo I c fCS ID A002272/A002273) están implicados en la eñalización a TGF-beta. Ambas son proteínas de ral tipo I con un dominio de serina-treonin lásmico. Los receptores tipo II forman homodí cia de ligando y pueden auto-fosforilarse entre Además de la activación directa de los fac cripción Smad (descritos en detalle abajo) , a evidencia de que el receptor de TGF-beta puede ERK, JNK y p38 MAP cinasas por medio de cinasa as, RhoA y TGF-beta (TAK) . Otros reportes sugi receptores de TGF-beta pueden señalizar por med -cinasa y proteína fosfatasa 2A. Los mecanismos cuales los receptores de TGF-beta activan ización no Smad no son bien entendidos.

Principalmente, los receptores de lizan por medio de factores de transmisión citop tes llamados Smads. El término Smad se deriv es de las proteínas Drosophila Mad h viatura para "madres contra decapentaplég ínas Sma (abreviatura para "pequeño" ) de C. és de la unión a ligando, los 'receptores de a la transcripción génica al interactuar adores o co-represores de transcripción especí o. Los dominios de homología de Mad I (MH1) d y Smad4 se unen a elementos de unión a Smad 5' - .

La señalización del receptor TGF-beta es ivamente por el Smad inhibidor Smad7 { ejos de Smad7 y la Smurf2 E3 ligasa compiten unirse al receptor de TGF-beta y prom itinación y degradación del complejo del rec eta. La vía Ras/ERK atenúa también la señaliz eta al núcleo. La fosforilación de R-Smads e su acumulación nuclear.

TGF-beta tiene una amplia gama de act gicas, demasiado numerosas para listarlas, e el crecimiento en muchos tipos de células, o implicada en la formación de tejidos fibrótic ición de la unión de TGF-beta a receptores de ó ser capaz de aliviar fibrosis (Yata et al, He , 35:1022-1030) .

Las moléculas de AR de doble hebra . (AR ado que la expresión génica en un mecanismo r ente conservado conocido como interferencia ). O 99/32619 (Fire et al.) describe el us de por lo menos 25 nucleótidos de largo para in sión de un gen del receptor de TGF-beta en C. el En el hígado, una función principal de TGF- se produce normalmente por células estel quimáticas, es la de limitar el crecimiento rege epatocitos en respuesta a lesión al inhibir la DN e inducir apoptosis. . Existe un alto n cción de TGF-beta en el hígado de pacientes de c señalización de TGF-beta alternativas favo miento e invasión. Un inhibidor de receptor de sido usado en estudios preclinicos contra ica derivada de HCC.

A pesar de avances significativos en el y avances en el tratamiento de fibrosis y tr ferativos, tales como cánceres, sigue habi idad de un agente que pueda silenciar de tiva y efectiva los genes del receptor de TGF-be El uso de ARNi es una vía viable en el de ustancias terapéuticas activas para el tratami medades fibróticas, tales como, por ejemplo, ica y cirrosis, fibrosis renal, fibrosis de sis quística del páncreas y pulmones, fibr ción, fibrosis endomiocárdica, fibrosis ática del pulmón, fibrosis mediastinal, mileof La invención proporciona moléculas de ucleico de doble hebra (ARNds) , así como composi os para inhibir la expresión de un gen del rec eta, en particular la expresión de un gen del jF-beta I, en una célula, tejido o mamífero usa . La invención proporciona también composic os para tratar afecciones y enfermedades pat das por la expresión de un gen del receptor de T rticular el gen del receptor de TGF-beta I, tal ornos de fibrosis, inflamaciones y proliferativ ulas de ácido ribonucleico de doble hebra de la ción se caracterizan por su capacidad para in sión de un gen de receptor de TGF-beta I, en pa en del receptor de TGF-beta I de mamífero y h en al menos 80%. En una modalidad prefe ula de ácido ribonucleico de doble hebra de la i El ARNds de la invención comprende una hebr hebra antisentido) que tiene una región que tie nucleótidos de largo y sustancialmente compleme lo menos parte de un transcripto de AR m de un tor de TGF-beta tipo I. El uso de estas molé hace posible la degradación seleccionada de m RNm del receptor de TGF-beta tipo I, es deci , implicados en respuestas de fibrosis, en ev mación así como en trastornos proliferat eros, tales como cáncer por ejemplo cáncer de o ensayos a base de células y animales, los p tores han demostrado que dosis muy bajas de est n mediar de manera específica y eficiente ARN resultado en la inhibición significativa de la e el receptor de TGF-beta. De esta manera, los m siciones de la invención que comprenden estas m 117/118, 103/104, 31/32, 81/82, 99/100, 23/24 y 7/8. En el contexto de las moléculas íficas provistas en la presente, los p ificadores de números de secuencia están rela las secuencias de hebras de sentido y ant spondientes (5' a 3') como también se muestra s anexas e incluidas.

Asimismo las moléculas de ARNds modific istas en la presente y en particular se describ 3, que proporciona ejemplos ilustrativos culas de ARNds modificadas" de la presente in moléculas preferidas en este aspecto son, entr sentadas por SEQ ID NOs/pares: 151/152, 62, 231/232, 275/276, 253/254, 211/212, 182, 185/186, 209/210, 299/300, 295/296, 27 220. Las modificaciones ilustrativas d cular la expresión del gen del receptor de TGF-b mamífero o humano. La secuencia de codificación receptor de TGF-beta tipo I humano puede obte de datos relevantes, véase, por ejemplo Geneba 4612.2. Una secuencia de codificación que tambi secuencia de referencia en la presente para el tor de TGF-beta tipo I es provista en SEQ ID .

El ARNds comprende al menos dos secuencias ementarias unas con otras . El ARNds comprende u entido que comprende una primera secuencia y u entido puede comprender una segunda secuencia én la provisión de pares de ARNds específicos s I y III anexas. La hebra antisentido puede co secuencia de nucleótidos que sea sustanc ementaria a por lo menos parte de un ARN que c ótidos. Se prefieren más los tramos de dúplex d nucleótidos . El ARNds, después de hacer cont célula que expresa un receptor de TGF-beta, i sión de un gen del receptor de TGF-beta I in vit 80%.

Ensayos no limitativos que muestran cói ición in vitro puede ser probada se proporciona íos anexos, en los que la actividad de las molé /ARNds de esta invención y descritas en la pre en células HeLa, en particular en células células HeLa en cultivo se usaron p ificación del AR m del receptor de TGF-beta ti amificado en ARNm total aislado de células incub sayo de moléculas de ARNsi específicas del rec eta. Esta inhibición puede ser medida en parti . Ensayos correspondientes pueden ser esta xpresión del receptor de TGF-beta tipo I hasta aproximadamente 80%. De nuevo, se prop íos correspondientes en las tablas I y II, con sas tablas, la inhibición se ilustra por la can estante en las células evaluadas.

En una modalidad la hebra de sentido compr ncía que tiene una identidad de al menos 90% una porción de un ARNm que codifica para el rec eta tipo I. Esta secuencia se ubica en una r ementariedad de la hebra de sentido a la entido, de preferencia dentro de los nucleótidos mo 5' de la hebra de antisentido. En una m rida el ARNds se dirige particularmente al tor de TGF-beta tipo I humano, en otra modalida se dirige al gen del receptor de TGF-beta t (Mus usculus) y rata (.Rattus norvegicus) . uían INF-alfa y TNF-alfa in vitro.

Las moléculas de ARNds de la invención pued endidas de nucleótidos de origen natural o pued endidas de al menos un nucleótido modificado, ucleótido modificado en 2/-0-metilo/ un nucleó ende un grupo 5 ' -fosforotioato y un nucleótido ado a un derivado de colesterilo o un g cilamida de ácido dodecanoico. Los nuc icados 2' pueden tener una ventaja adicional os factores inmunoestimuladores o citocin midos cuando las moléculas de ARNds de la inve en in vivo, por ejemplo en un escenario médic nativa y no limitación, el nucleótido modifica cionarse del grupo de: un nucleótido modificado i-2 ' -fluoro, un nucleótido modificado con 2' -de ótido cerrado, un nucleótido abásico, nu idinas de la hebra de antisentido son nuc icados con 2' -desoxi-2' -fluoro. En una m rida uno de los dos nucleótidos de . desoxitim ntran en el 3' de ambas hebras de la molécula d tra modalidad al menos uno de estos nucleót itimidina en el extremo 3' de las hebras de la RNds comprenden un grupo 5 ' -fosforotioato . idad todas las citocinas seguidas por adenina, uracilos seguidos ya sea por adenina, guanina o a hebra de sentido son nucleótidos modificados c o, y todas las citocinas y uracilos seguidos por a hebra de antisentido son nucleótidos modific -metilo. En la tabla 3 anexa se proporcionan m N de doble hebra modificadas e ilustrativas.

El ARNds de la invención puede comprende o más salientes de nucleótidos de una sola hebr endidas de una primera secuencia del ARNds ciona del grupo que consista en las secuen do de la tabla 1 ó 3 y la segunda secue ciona del grupo¦ que consiste en las secuen entido de la tabla 1 ó 3. Pares preferidos de é ncías se proporcionan en las tablas dentro / intervalo .

De preferencia, el ARNds compren nucleótidos, en donde un oligonucleótido (sen ito por la tabla 1 y el segundo oligonu sentido) es descrito por la tabla 1 o en nucleótido modificado (sentido) es descrito por el segundo oligonucleótido (antisentido) es ito en la tabla 3. Ambas tablas proporcionan valo individual secuencias de hebras de se entido particularmente útiles, ambas provi mplificadas .

La invención proporciona también célu enden al menos una de las moléculas de ARNd ción. La célula es de preferencia una cé ero, tal como una célula humana. Además, os y/u organismos , no humanos que compren ulas de ARNds definidas en la presente endidos en esta invención, con lo cual el orga o es particularmente útil para propósi tigación o como herramienta de investigaci lo también durante pruebas de fármacos .

La invención se refiere también a compo céuticas que comprenden las moléculas de ARNds ción. Estas composiciones farmacéutic cularmente útiles en la inhibición de la expresi el receptor de TGF-beta tipo I en una célula, u siciones farmacéuticas para tratar enfermedades la expresión de un gen del receptor de TGF- cular un gen del receptor de TGF-beta tipo I..

Además, la invención se refiere a un mét ir la expresión de un gen del receptor de TGF icular un gen del receptor de TGF-beta tipo I de mano, en una célula, tejido u organismo, que c iguientes etapas: (a) introducir en la célula, tejido u orga ribonucleico de doble hebra (ARNds) como el def esente; (b) mantener la célula, tejido u o cido en la etapa (a) durante un tiempo suficie er la degradación del transcripto de ARNm de un tor de TGF-beta tipo I, inhibiendo así la expr n del receptor de TGF-beta tipo I en una célula nucleico que codifica para una hebra de sentido de antisentido comprendida en la molécula ucleico de doble hebra como la, definida en la p >tra modalidad, la invención proporciona vecto ir la expresión de un gen del receptor de TGF élula, en particular gen del receptor de TGF-bet omprende una secuencia reguladora enlazada opera secuencia de nucleótidos que codifica para al m de una de las moléculas de ARNds de la invenció ula de ácido nucleico de la invención o vect comprendida en una célula, un tejido o un orga o. Este organismo no humano puede ser un génico y no humano. Las células, los tejidos transgénicos no humanos de esta invención pu s como herramientas de investigación. Sin emba ias o tejidos también se pueden usar en inte ncia reguladora, una secuencia que codifique una "hebra de sentido" del ARNds de la invenci una "hebra de antisentido" del ARNds. Tam m la que la célula reclamada comprenda dos res que comprendan, aparte de las se adoras, las secuencias definidas en la prese ican al menos para una hebra de una de las molé de la invención.

La invención proporciona ácido ribonucl hebra (ARNds) , así como composiciones y méto ir la expresión de un gen del receptor de TGF-b una célula o mamífero usando el ARNds. La i rciona también composiciones y métodos para ciones patológicas y enfermedades en un das por la expresión de un gen del receptor de I usando ARNds. ARNds dirige la degradación es moléculas de ARNds relevantes. Además, para ulas de ARNds particularmente preferidas (secue do y antisentido proporcionadas) se prop etros adecuados biológica y clínicamente rel e tablas 2 y 4 anexas .

La tabla 1 se refiere también a m ridas que se usarán como ARNds de acuerdo c ción. Se prefieren particularmente las moléc identificadas como las provistas en la h rvalos 1 a 10) y en la hilera II (intervalos 1 mbargo, también la hilera III (intervalos 32 a 5 a IV (hilera 59 a 75) comprenden moléculas s de acuerdo con esta invención. Como es eviden ior, las moléculas de ARNds preferidas parcia stas en los pares de sentido y antisentido defin D NOS: ¾, 117/118, 103/104, 31/32, 81/82, 99/100 tor de TGF-beta tipo I humano como el provisto e 326 anexo (y también en Genebank/EMBL M_004612 s están comprendidos en regiones de los nucleót 0 y 1500 a 1600, muy preferiblemente en los nuc 20 y 1520 a 1580 o más preferiblemente en las s nucleótidos 298-332 y 1522 a 1569 de SEQ ID , que representan el gen del receptor de TGF-bet I o .

Las tablas 3 y 4 proporcionan también molé /ARNds adicionales útiles en el contexto ción, con lo cual la tabla 4 proporciona terísticas sorprendentes biológicas y/o clín antes de las moléculas de AR si/moléculas d icadas vde esta invención como las mostradas en Moléculas modificadas particularmente útiles co ecuencias (hebra de sentido y hebra de antisenti secuencias provistas en SEQ ID NOS: 151/152, 62, 231/232, 275/276, 253/254, 211/212, 82, 185/186, 209/210, 299/300, 295/296, 279/ 20.

Definiciones Por conveniencia, el significado de nos y frases usadas en la descripción, eje ndicaciones anexas, 'es provisto a continuaci e una discrepancia aparente entre el* uso de un tras partes de esta descripción y su definición ta sección, la definición en esta sección preval "G" , "C" , "A" , HU" y T" o T" respect uno generalmente indica un nucleótido que na, citosina, adenina, uracilo y desoxitimidina , respectivamente. Sin embargo, el nucleótido" o "nucleótido" también se puede refe mente, este tramo saliente comprende el núcle itimidina, en la mayoría de las modalidad itimidinas en el extremo 3'. Estas salie ibir n e ilustrarán abajo.

El término "receptor de TGF-beta" o ."rec r de crecimiento por transformación beta" segú presente, se refiere en particular al receptor tipo I (cinasa tipo receptor de TGF-beta I, rec ina A tipo II) y el término se refiere spondiente , AR m codificado, proteína/pol icado así como fragmentos funcionales de los ragmentos como los provistos en la presente se r otros, a los "puntos calientes" definidos nte de grupos en la secuencia objetivo contra lo I dirigidas las moléculas de AR ds definidas nte. Estos fragmentos son, entre otros, los nuc anscrito de ARN de un gen de receptor de TGF-bet omprende estas mutaciones/alteraciones .

Según se usa en la presente, "secuencia o efiere a una porción contigua de la secue ótidos de una molécula de ARNm formada dur cripción de un gen del receptor de TGF-beta yendo ARNm que es un producto de procesamiento d oducto de transcripción primario.

Según se usa en la presente, el término "h ende una secuencia" se refiere a un oligonucleó ende una cadena de nucleótidos que se describe ncía referida usando la nomenclatura de nu dar. Sin embargo, como se detalla en la presen a que comprende una secuencia" también puede co icaciones, tales como nucleótidos modificados.

Según se usa en la presente, y a menos das completamente de, pares de bases no de Wats pares de bases formados a partir de nucleót ales y modificados, siempre y cuando los requer iores con respecto a su capacidad para hibri fechos.

Las secuencias mencionadas como "compl ementarias" comprenden apareo de base nucleótido o polinucleótido que comprende la ncia de nucleótidos al oligonucleótido o polinu comprende la segunda secuencia de nucleótidos tud completa de la primera y segunda secuen ótidos .

Sin embargo, cuando se hace referencia ra secuencia como "sustancialmente complementa cto a una segunda secuencia en la presente, ncías pueden ser completamente complementarias, El término "ARN de doble hebra" , "molé " o "ARNds" , según se usan en la presente, se re olécula de ácido ribonucleico, o complejo de m cido ribonucleico, que tiene una estructura dú ende dos hebras de ácido nucleico sustane ementarias y anti -paralelas . Las dos hebras qu ctura de dúplex pueden ser diferentes porcione ula de ARN más grande, o pueden ser moléculas adas . Cuando las dos hebras son parte de una grande, y por lo tanto están conectadas por un errumpida de nucleótidos entre el extremo 3' y el extremo 5' de la otra hebra respectiva q structura de dúplex, la cadena de ARN conec ida como una "asa de pasador" . Cuando las do conectadas covalentemente por medios que no a ininterrumpida de nucleótidos entre el extre ótidos adicionales en las hebras individuales de RNds. Estas "salientes" opcionales se ubica mo 3' de las hebras individuales. Como se d , también las moléculas de ARNds que comprenden ente" en una de las dos hebras pueden ser so adecuadas en el contexto de esta invenci ente" comprende de preferencia entre 0 y 2 nucl referiblemente dos nucleótidos T" (desoxitimi ntran en el extremo 3' de ambas hebras del smo, 2 nucleótidos "U" (uracilo) se pueden u ntes en el extremo 3' de ambas hebras del AR cuencia, una "saliente de nucleótidos" se re ótido o nucleótidos no apareados que sobresale ctura de dúplex de un ARNds cuando un extremo 3 del ARNds se extiende más allá del extremo 5 hebra, o viceversa. Por ejemplo la hebra ant ótidos en cada extremo de la molécula .

El término "hebra de antisentido" se refie de un ARNds que incluye una región ncialmente complementaria a una secuencia o se usa en la presente, el término "re ementariedad" se refiere a la región en la entido que es sustancialmente complementaria ncía, por ejemplo, una secuencia objetivo. C n de complementariedad no es compl ementaría de la secuencia objetivo, las no coinc rincipalmente toleradas fuera de los nucleótidos mo 5' de la hebra de antisentido.

El término "hebra de sentido" , según se u nte, se refiere a la hebra de un ARNds que inc n que es sustancialmente complementaria a una r ebra de antisentido. "Sustancialmente complem gnificado de este término no está limitado a cé ; un ARNds también puede ser "introducido a" , en donde la célula sea parte de un organis al caso, la introducción en la célula incl istro al organismo. Por ejemplo, para sumin ARNds puede ser inyectado en un sitio ti istrarse sistémicamente . Es, por ejemplo, con las moléculas de ARNds de esta invención istrarse a un sujeto que requiera de inte a. Esta administración puede comprender la i ARNds, el vector o una célula de esta invenció enfermo del sujeto, por ejemplo en tejido icas o en tejidos/células cancerosas, tales com áncer hepático. Sin embargo, también la inye na proximidad del tejido enfermo es contempla ducción in vitro en una célula incluye métodos c tor de TGF-beta tipo I sea transcrito y el cual sido tratado de tal manera que se inhiba la e en del receptor de TGF-beta tipo I, en compara segunda célula o grupo de células sustanc icas al primer grupo de células o célula pero q haya sido tratado de esta manera (células de c ado de inhibición normalmente se expresa en térm (ARNm en células de control) - (ARNm en células tratadas) # j (ARNm en células de control) Como alternativa, el grado de inhibició en términos de una reducción del parámetro onalmente ligado a la transcripción del gen del GF-beta tipo I, por ejemplo, la cantidad de icada por un gen del receptor de TGF-beta tipo I tado por una célula, o el número de célu nten cierto fenotipo. ción son capaces de inhibir la expresión de un tor de TGF-beta tipo I de ratón o rata en al me referencia en al menos 80%, muy preferiblement 90%. La persona capacitada en la técnic mente determinar este índice de inhibición y ionados, en particular en vista de los rcionados en la presente. Según se document nte, las moléculas de ARNds más preferidas nte invención son capaces de inhibir la expré del receptor de TGF-beta tipo I humano en a imadamente 80% in vi tro cuando una concentració dosis de aproximadamente 30 nm del ARNds/A ada. Se abarcan también las moléculas de ARN on capaces de inhibir la expresión de receptor humano tipo I a una sola concentración de imadamente 300 pM. Nuevamente, los ejemplos de transcriptoma que se predice mediante métodos i ibridan a las moléculas de AR ds descritas con mplementariedad de secuencia. Las moléculas de resente invención de preferencia inhiben específ xpresión del gen del receptor de TGF-beta tip , no inhiben la expresión de ningún fuera de obj Las moléculas de ARNds particularmente pr provistas, por ejemplo en las tablas 1 y 3 ane ncías de hebra de sentido y hebra de ant stas ahí en orientación 5' a 3').

El término "vida media" según se usa en la a medida de la estabilidad de un compuesto o mo uede evaluar mediante métodos conocidos por una itada en la técnica, especialmente en vista os provistos en la presente.

El término "no inmunoestimulador" según s del receptor de TGF-beta tipo I, tales como tr ticos, inflamaciones o c nceres, tales como ico. En el contexto de la presente invención a que se refiera a cualquiera de las demás af itas en la presente abajo (que no sea f macion y cáncer) , los términos "tratar" , "tratam ares significan aliviar o liberar al menos un ado con esta afección, o hacer más lento o inv esión de esa afección.

Según se usa en la presente, las frases " éuticamente efectiva" y "cantidad profiláct iva" se refieren a una cantidad que proporc icio terapéutico en el tratamiento, prevención brosis o un síntoma manifiesto de fibrosis. La ífica que es terapéuticamente efectiva minarse fácilmente por un practicante médico or able . Sin embargo, esta "composición farma én puede comprender los vectores descritos nte que comprenden una secuencia regladora blemente a una secuencia de nucleótidos que al menos una hebra de una hebra de sentido o u tisentido comprendida en las moléculas de ARNds/ vención. Se contempla también que células, t os aislados que expresen o comprendan las molé /ARNsi definidas en la presente se pueden us osiciones farmacéuticas", por ejemplo en interv as que comprendan enfoques de trasplante . Segú la presente, "cantidad farmacológicamente ef idad terapéuticamente efectiva" o simplemente u iva" se refiere a la cantidad de un ARN efect cir el resultado farmacológico, terapéutico o pr do. Por ejemplo, si se considera un tratamiento ados a, solución salina, solución salina de pH r osa, agua, glicerol, etanol y combinaciones S. El término excluye específicamente medio de élulas. Para fármacos administrados oralmen dores farmacéuticamente aceptables incluyen, limitados a excipientes farmacéuticamente ac como diluyentes inertes, agentes desinte es aglutinantes, agentes lubricantes, orantes, agentes saborizantes , agentes color rvadores . Los diluyentes inertes adecuados nato de sodio y calcio, fosfato de sodio y sa, mientras que el almidón de maíz y ácido algí ados como agentes 1 desintegrantes. Los inantes pueden incluir almidón y gelatina, a e lubricante, si está presente, generalmen rato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si S dérmica o transmucosal (por ejemplo, insuflación al, anal) así como inhalación del fármaco s les para administrar a un paciente que vención médica los compuestos de esta invención, plea administración parenteral, ésta puede compr ción directa de los compuestos de esta invenci o enfermo o al menos en cercana proximidad go, también las administraciones intravenosa, ial, subcutánea, intramuscular, intraper dérmica, intratecal y otras de los compuestos ción están dentro de la capacidad del técni ío el médico que atienda.

Se contempla en particular que el céuticamente aceptable permite la admini mica de las moléculas de ARNds, vectores o cé invención. En tanto que también la admini r 37 venosa, intra-arterial , subcutánea, intram peritoneal, intradérmica, intratecal y otras estos de esta invención están dentro de la capac co, por ejemplo el médico que atienda.

Para uso intramuscular, subcutáneo e intr composiciones farmacéuticas de la invención gene provistas en soluciones o suspensiones iles, reguladas hasta un pH adecuado e isotonici odalidad preferida, el portador consiste exclus un regulador de pH acuoso. En este c usivamente" significa que ningún agente aux ncia encapsuladora están presentes los cuales ar o mediar la absorción de ARNds en las cél sen un gen del receptor de TGF-beta tipo nsiones acuosas de acuerdo con la invención ir agentes de suspensión tales como deriv gradables y biocompatibles pueden ser usados, ta to de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poligl eno, poliortoésteres, y ácido polil ctico. Los la preparación de estas formulaciones serán a aquellos expertos en la técnica. Pueden usarse nsiones liposómicas como portadores farmacéut ables . Estas se pueden preparar de acuerdo con idos por los expertos en la técnica.

Según se usa en la presente, una formada" es una célula en la cual por lo menos u do introducido del cual una molécula de ARNds o hebra de esta molécula de ARNds puede ser ex vector es de preferencia un vector que compr ncia reguladora enlazada operablemente a una s cleótidos que codifica para al menos una de una do o una hebra de antisentido comprendida imadamente 16 a alrededor de 30 nucleótidos. Lo plex de ARNds particularmente útiles son alreded roximadamente 25 nucleótidos. Se prefieren cturas de dúplex con una longitud de 19 nucleóti moléculas de ARNds de la invención, la h entido es por lo menos parcialmente complementa de sentido.

El ARNds de la invención puede contener u incidencias con la secuencia objetivo. En una m rida, el ARNds de la invención contiene no más idencias. Si la hebra de antisentido del ARNds oincidencias con una secuencia objetivo, es pr el área de no coincidencia no se ubique dentro ótidos 2-7 del extremo 5' de la hebra de anti otra modalidad es preferible que un área idencia no se ubique dentro de los nucleótidos RNds puede tener una saliente de nucleotido de de 1 a 5; de preferencia 1 ó nucleótidos ulas de ARNds que tienen al menos una sali ótido tienen propiedades inhibitorias inesper iores que sus contrapartes de - extremos ra s, los presentes inventores han descubierto ncía de sólo una saliente de nucleotido refu idad de interferencia del ARNds , sin afe ilidad general. ARNds que tiene sólo una sal do ser particularmente estable y efectivo in v en una variedad de células, medios de cul as, sangre y suero. De preferencia, la salient hebra se ubica en el extremo 3' -terminal de la entido o, como alternativa, en el extremo 3'-ter bra de sentido. El ARNds también puede tener un ado, de preferencia ubicado en el extremo 5' de como aquellos descritos en "Current proto ic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs & Sons, Inc., Nueva York, NY, E.U.A., la pora en la presente a manera de referencia icaciones químicas pueden incluir, pero n adas a modificaciones 2' , introducción de b ales, fijación covalente a un ligando y reem es de fosfato con enlaces de tiofosfato. idad, la integridad de la estructura de dú zada por al menos uno, y de preferencia dos, cos. El enlace químico se puede lograr uiera de una variedad de técnicas bien conoci ío al introducir enlaces covalentes, iónico geno; interacciones hidrófobas, interacciones de o de apilado; por medio de coordinación d ieos o a través del uso de análogos de puri em. (1996) 35:14665-14670). En una m icular, el extremo 5' de la hebra de antisenti emo 3' de la hebra de sentido se enlazan químicam nlazador de hexa-etilenglicol . En otra modal s un nucleótido del ARNds comprende grupos fosfo sforoditioato . El enlace químico en los extr s se forma de preferencia por enlaces de triple tablas 3 y 4 proporcionan ejemplos de agentes ficados de la invención.

En ciertas modalidades, un enlace químico r por medio de uno o varios grupos de unión, s grupos de unión son de preferencia cadenas fosfinicooxi-1, 3-propandiol) - y/o polietilenglic S modalidades, un enlace químico también puede edio de análogos de purina introducidos en la es doble hebra en lugar de purinas . En mod eñir o inhibir la activación de enzimas celula lo ciertas nucleasas. Las técnicas para in ación de enzimas celulares se conocen en la yendo, pero no limitadas a, modificaciones 2 ficaciones de azúcar 2'-amino, modificaciones d modificaciones 2'-F, modificaciones de azú ilo, modificaciones de estructura de base no ficaciones morfolino, modificaciones 2'-0-m ramidato (véase, por ejemplo, Wagner, Wat. Med 16-8) . De esta manera, por lo menos un g xilo de los nucleótidos en un ARNds es reempla rupo químico, de preferencia por un grupo 2'-am etilo. Asimismo, al menos un nucleótido p ficado para formar un nucleótido cerrado, eótido cerrado contiene un puente de metileno que ' -oxígeno de ribosa con el 4' -carbono de ribo después de su administración, por ejem ación de citocinas que es de preferencia su modificaciones químicas y estructurales se co écnica y son, entre otras, ilustradas en Nawro nt Topics in Med Chem, 6, 913-925.

Conjugar un ligando a un ARNds puede increm ción celular así como dirigirlo a un tejido par iertos casos, un ligando hidrófobo es conjugado facilitar la permeacion directa de la membrana alternativa, el ligando conjugado al ARNds rato para endocitosis mediada por receptor. ues han sido usados para facilitar la permeacion ligonucleótidos antisentido. Por ejemplo, coles conjugado a varios oligonucleótidos antisenti resultado compuestos que son sustancialmente más omparación con sus análogos no conjugados. to. La fijación de ácido fólico al extremo 3 nucleótido se traduce en absorción celular incr oligonucleótido (Li, S.; Deshmukh, H. M . ; H . Res. 1998, 15, 1540) . Otros ligandos que gados a oligonucleótidos incluyen polietileng s de carbohidratos, agentes de entrelaz gados de porfirina y péptidos de suministro .

En ciertos casos, la conjugación de un ónico a oligonucleótidos comúnmente se tra stencia mejorada a nucleasas. Ejemplos represe ligandos catiónicos son propilamon tilpropilamonio . De manera interesante, se rep oligonucleótidos de antisentido conservaban idad de unión a AR m cuando el ligando catió erso a lo largo del nucleótido. Véase M. sense & Nucleic Acid Orug Development 2002, 1 ión de enlace unida a los mismos. Los método ción facilitan la síntesis de AR ds conjugado a ante el uso de, en algunas modalidades pre eros de núcleosidos que hayan sido co adamente con ligandos y que puedan además ser f aterial de soporte sólido. Estos conjugados de eósido, fijados opcionalmente a un material de o, se preparan de acuerdo con algunas mo eridas de soporte sólido, se preparan de acu as modalidades preferidas de los métodos de la i medio de la reacción de un ligando de unión ccionado con una porción de enlace ubicada en la e un nucleósido u oligonucleótido . En ciertos c s que porte un ligando aralquilo fijado al términ s es preparado al fijar primero covalentemente u onstrucción monomérico a un soporte de vidrio écnica bien conocida de síntesis en fase sólida, conoce usar técnicas similares para prepara onucleótidos, tales como los fosforotioatos y ilados .

Las enseñanzas con respecto a la sínt onucleótidos modificados particulares pueden enc as siguientes patentes de E.U.A. No. 5,218,105, igonucleótidos conjugados a poliamina; patentes d 5,541,307, dirigida a oligonucleótidos que cturas de base modificadas; patente de E.U 1,302, dirigida a procesos para preparar oligonuc tienen enlaces de fósforo quirales; patente de E. 9,082, dirigida a ácidos nucleicos péptidos; pa . No. .5,554,746, dirigida a oligonucleótidos qu ucturas de base de ß-lactama; patente de E. 1,902 dirigida a métodos y materiales para la sín nopurina; patente de E.U.A. No. 5,587,469, di onucleótidos que tienen purinas N-2 sustituidas; .U.A. No. 5,587,470, dirigida a oligonucleót en 3-desazapurinas; patente de E.U.A. No. 5, S dirigidas a análogos de 4'-desmetil n ugados; patente de E.U.A. No. 5,610,289, di ogos de oligonucleótido modificados en la estru patente de E.U.A. No. 6,262,241 dirigida s, métodos para sintetizar 2 ' -fluoro-oligonucleót En el ARNds conj gado a ligando y nuc zados específicos de secuencia que portan molé ndo de la invención, los oligonucleót onucleósidos pueden ser ensamblados en un sinteti adecuado utilizando precursores de nucleó eósidos estándares, o precursores de conjug eótidos o nucleósidos que ya porten la porción d onucleótidos que portan una variedad de molécul esteroides, vitaminas, lípidos y moléculas rep sido descritos previamente (véase Manoharan citud de PCT O 93/07883) . En una modalidad p oligonucleótidos o nucleósidos enlazados de la i sintetizan por un sintetizador automático oramiditas derivadas de conjugados ligando-n ás de fosforamiditas disponibles comercialmente.

La incorporación de un grupo 2'-0-metil o, 2 ' -O-propilo, 2'-0-alilo, 2 ' -O-aminoalquilo xi-2 ' -fluoro en nucleósidos de un oligon iere propiedades de hibridación increment onucleótido. Además, los oligonucleótidos que c ucturas de base de fosforotioato tienen estábi easas incrementada. De esta manera, los nuc ionalizados y enlazados de la invención ados de éster activos se conocen bien por los a técnica. Esteres activos representativos es de N-hidrosuccinimida, ásteres tetrafluorofe es pentafluorofenólicos y ésteres pentaclorofe eacción del grupo amino y el éster activo pr nucleótido en el cual el ligando seleccionado e posición 5' a través de un grupo de enlace. en el extremo 5' se puede preparar utiliz ivo C6 modificador de 5' -amino. En una m rida, las moléculas de ligando pueden ser conj nucleótidos en la posición 5' mediante el uso ramidita de ligando-nucleósido en donde el lig ado al grupo 5'-hidroxi directa o indirectam de un enlazador. Estas fosforamiditas de ósido se usan típicamente en el final dimiento de síntesis automático para proporc nucleótidos conjugados a ligando de la i yen, pero no están limitados a, 2 ' -aminoalcoxi- ósidos, 2' -6-aminoalquilamino-5' -ODMT-nucleósido alcoxi-2' -desoxi-nucleósidos , 5' -6-aminoa gido-nucleósidos , 3 ' -6-aminoalcoxi-5 ' -ODMT-nucle inoalquilamino-5 ' -ODMT-nucleósidos que pued gidos en la porción de núcleo base de la molécu os para la síntesis de estos precursores de nuc gidos y enlazados a amino se conocen por aqu cidad ordinaria en la técnica.

En muchos casos, se usan grupos protectores eparación de los compuestos de la invención. en la presente, el término "protegido" signific ion indicada tiene un grupo protector anexo en l algunas modalidades preferidas de la invenci estos contienen uno o más grupos protectores . hesis, capítulo 2, 2 a edición, John Wiley & Son , 1991, y Oligonucleotides and Analogues A oach, Ekstein, F. Ed. , IRL Press, N.Y., 1991.

Los grupos protectores amino estables a tr ácido se retiran selectivamente con tratamiento usan para hacer grupos amino reactivos selec onibles para sustitución. Ejemplos de estos g oc (E. Atherton and R. C. Sheppard in The Pept friend, J. Meienhofer, Eds., Academic Press, volumen 9, pag. 1) y varios carbamatos de sulf plificados por el grupo Nsc (Samukov et al., Te . 1994, 35:7821.

Los grupos protectores amino adicionales no están limitados a, grupos protectores c S como 2-trimetilsililetoxicarbonilo (Teoc) , 1 ifenilil) etoxicarbonilo (Bpoc) , t-butoxicarbonil rcialmente y alguien de capacidad ordinaria en la e seleccionar fácilmente un soporte sólido que las etapas de síntesis en fase sólida. En lidades, se usa un soporte universal. Un ersal permite la preparación de oligonucleót e nucléotidos inusuales o modificados ubicado ino 3' del oligonucleótido . Para detalles adi ca de soportes universales véase Scott vations and Perspectives in solid-phase Synthe rnational Symposium, 1994, Ed. Roger Epton, dwide, 115-124] . Adem s, se ha reportado onucleótido puede ser cortado del soporte univer iciones de reacción más suaves cuando el oligon unido al soporte sólido por medio de un grupo oxifosfato el cual sufra más fácilmente h ca. Véase Guzaev, A. I.; Manoharan, M. J\ Am, C re con compuestos de ARNds y similares que gados .

Los oligonucleótidos conujugados a ar do de la invención incluyen también conjug nucleótidos y nucleósidos enlazados en los do está fijado directamente al nucleósido o nu la intermediación de un grupo enlazador. El ser de preferencia fijado, por medio de g e, en un grupo carboxilo, amino u oxo de ligan s . enlazadores típicos pueden ser grupos éster, mato .

Ejemplos específicos de oligonuc icados que se prefieren y contemplados para u oligonucleótidos conjugados a ligando de la i yen oligonucleótidos que contienen estructuras icadas o enlaces entre nucleósidos no naturale ífieos se describen a continuación. No es neces las posiciones en un compuesto dado se mo rmemente. De manera inversa, más de una modi incorporarse en un compuesto ARNds individual o solo nucleótido del mismo.

Los enlaces entre nucleósidos modificados eren o estructuras de base incluyen, por rotioatos, fosforotioatos quirales, fosforodi triésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfon o y otros de alquilo incluyendo 3 ' -alquilenfosf natos quirales, fosfinatos, fosforamiditas in inofosforamidato y aminoalquilfosfora fosforamidatos , tionoalquilfos alquilfosfotriésteres y boranofosfatos que es 3' -5' normales, análogos 2 ' -5' enlazados de íos que tengan polaridad invertida en donde l era de referencia.

Los enlaces o estructuras de base entre nuc icados que se prefieren que no incluyen un ro en los mismos (es decir, oligonucleósidos) cturas de base que son formadas por enlace res de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, azúcares de alquilo o cicloalquilo o un het , o uno o más enlaces entre azúcares heteroat ocíclicos de cadena corta. Esos incluyen aque n enlaces morfolino (formados en parte a part ión de azúcar de un nucleósido) estructuras de ano; estructuras de base de sulfuro, sulf na; estructuras de base de formacetilo y tioform ucturas de base de metilenformacetilo y tiofor cturas de base que contienen alquenos; estruc de sulfamato; estructuras de base de metile En otros miméticos de oligonucleótidos eren, tanto en enlace de azúcar como e ósidos, es decir, la estructura de base, de las ucleósido son reemplazados con grupos nuevos des de nucleobase se conservan para hibridació esto objetivo de ácido nucleico adecuado. Uno nucleótidos , un mimético de oligonucleótido, ado tener propiedades de hibridación excelen ido como un ácido nucleico péptido {PNA, por su nglés) . En compuestos PNA, la estructura de r de un oligonucleótido es reemplazada ctura de base que contiene amida, en particu ctura de base de aminoetilglicina . Las nucleo rvan y se unen directa o indirectamente a átom ión amida de la estructura de base. La ense estos PNA puede encontrarse por ejemplo en la pa tente de E.U.A. No. 5,489,677 referenciada arrib cturas de base de amida de la patente de E. ,240 mencionada arriba. Se prefieren tamb nucleótidos que tienen estructuras de base morf tente de E.U.A. No. 5,034,506 indicada arriba.

Los oligonucleótidos empleados e nucleótidos conjugados a ligando de la invenció ender además o como alternativa modificac tuciones en nucleobase (conocidas comúnmente ca simplemerite como "base"). Según se usa nte, las nucleobases "no modificadas" o "na yen las bases de purina adenina (A) y guanina (G de pirimidina timina (T) , citosina (C) y urac nucleobases modificadas incluyen otras ncu ticas y naturales, tales como 5-metilcitosina { roximetil citosina, xantina, hipoxantin guanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina aadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina.

Las nucleobases adicionales incluyen itas en la patente de E.U.A. No. 3,687,808, itas en Concise Encyclopedia Of Polymer Sci eering, páginas 858^859, Kroschwitz, J. I., Se Sons, 1990, aquellas descritas por Englisch andte Chemie, International Edition, 1991, 30 ias descritas por Sanghvi, Y. S., capítulo 15, rch and Application , páginas 289-302, Crooke, u, B., ed., CRC Press, 1993. Ciertas d obases son particularmente útiles para increm dad de unión de los oligonucleótidos de la i incluyen pirimidinas 5-sustituidas , 6-azapirim as N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluy propiladenina, 5 -propiniluracilo y 5-propinilc yen, pero no están limitadas a, las anter onadas patentes de E.U.A. No. 3,687,808, así tes de E.U.A. Nos. 5,134,066; 5,459,255; 5, ,121 y 5,596,091 todas las cuales se incorpor nte a manera de referencia.

En ciertas modalidades, los oligonuc ados en los oligonucleótidos conjugados a ligan eion pueden comprender además o como alternati porciones de azúcar' sustituidas. Los oligonuc ridos comprenden una de la siguiente en la posi ; O-, S-, o N-alquilo, O-, S-, 6 N-alquenilo, u uinilo, en donde el alquilo, alquenilo y a n ser alquilo de Ci a Ci0 o alquenilo y alquinil sustituidos o no sustituidos. . Se p icularmente O [ (CH2) ¿O] mCH3 , 0(CH2)nOCH3, 0( )nCH3, 0(CH2)nONH2 y O (CH2) nON [ (CH2) nCH3) ] 2 , en don para mejorar las propiedades farmacodinámica nucleótido, y otros sustituyentes que tengan pro lares. Una modificación que se prefiere inc ietoxi [2 ' -0-CH2CH2OCH3 , también conocida como ietilo) o 2'-M0E], es decir, un grupo alcoxialco ficación preferida adicional incluye ilaminooxietoxi, es decir, un grupo 0(CH2)2 ién conocida como 2'-DMA0E, como la descrit te de E.U.A. No. 6,127,533, presentada el 30 de , cuyos contenidos se incorporan a manera de refe Otras modificaciones preferidas incluyen 2 -CH3), 2 ' -aminopropoxi (2 ' -OCH2CH2CH2NH2) y 2'-flu Las modificaciones similares también pueden ha S posiciones en el oligonucleótido, particularmen ción 3' del azúcar en el nucleótido del extremo ligonucleótidos 2' -5' enlazados. eren los polietilenglicoles lineales y cíclicos s que contienen (PEG) , tales como éteres de c otros, aquellos que se describen por Delgard tical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Syste ) , la cual se incorpora en la presente a m encia en su totalidad. Modificaciones de onales se describen por Cook {Anti-fibrosis Drug , 6:585-607)'. Sustitución fluoro, 0-alqu lamino, O-alquil imidazol, O-alquilaminoal lamino se describe en la patente de E.U.A. 6, ada "Compuestos Oligoméricos que Tienen Nucleó idina con Sustituciones 2' y 5'", incorporad nte a manera de referencia en su totalidad.

Grupos sustituyentes de azúcar adiciona n ser adecuados para la invención incluyen grup -NR2/ en donde cada R es, independientemente, hi sentativos adicionales que son adecuados ción incluyen aquellos que tienen una de las fór en donde E es alquilo de C1-C10, N(Q3) (Q4) o N=C Q3 y Q4 es, independientemente, H, alquilo d uilaminoalquilo, un grupo protector nitrógeno, gado encadenado o no encadenado, un enlazad te sólido o Q3 y Q4 juntos, formar un grupo p geno o una estructura de anillo que nalmente al menos un heteroátomo adicional sele Z4 es OMi, SMi o N(Mi)2; cada endientemente, H, alquilo de Ci-C8, haloalquilo )N(H) 2, C(=0)N(H)M2 u OC ( =0) N (H) M2 ; M2 es H o al ; y Z5 es alquilo de Ci-Ci0, haloalquilo de nilo de C2-Ci0, alqunilo de C2-Ci0, arilo de (Q4), OQ3, halo, SQ3 o CN.

Los grupos sustituyentes 2'- sentativos de la fórmula I se describen en la pa . No. 6,172,209, titulada "Oligonucleótidos Bl os Extremos con 2 ' -Oxietoxi" , incorporada en la anera de referencia en su totalidad. Los ituyentes 2'-0-azúcar cíclicos representativos la II se describen en la patente de E.U 1,358, titulada "Oligonucleótidos 2 ' -Mod ccionados por ARN que son Preorganiza sentativas que se refieren a la preparación res modificados incluyen, pero no están limi tes de E.U.A. Nos. 5,359,044; 5,466,786; 5, ,722; 5,597,909; 5,646,265 y 5,700,920, todas la corporan en la presente a manera de referencia.

Modificaciones adicionales también pueden ras posiciones en el oligonucleótido, particula ión 3' del azúcar en el nucleótido 3' -termina lo, una modificación adicional de los oligonuc gados a ligando de la invención incluye camente al oligonucleótido una o más porc gados no de ligando adicionales que increme idad, distribución celular o absorción celu nucleótido . Estas porciones incluyen pero adas a porciones lípidas, tales como una terol (Letsinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci . ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1, 2-di-0-he: licero-3 -H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan hedron Lett. , 1995, 36, 3651; Shea et al., uc , 1990, 18, 3777), una cadena de poli tilenglicol (Manoharan et al.,' Nucleos otídes, 1995, 14, 969), o ácido adamantano < haran et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 36 on palmitilo (Mishra et al., Biochin. Biophy , 1264, 229), o una porción octadecilamina o hex nil-oxicolesterol (Crooke et al., J\ Phar ac , 1996, 277, 923) .

La invención incluye también composicio an oligonucleótidos que son puros de ncialmente quiral con respecto a posiciones part o de los oligonucleótidos. Ejemplos de oligonuc son puros de manera sustancialmente quiral incluy nucleótidos para incrementar así la ac ibución celular o absorción celular del oligonuc s procedimientos para llevar a cabo estas conju disponibles en la literatura científica, ones que no son ligando han incluido porci os, tales como colesterol (Letsinger et al., Pro * Sci. E.U.A., 1989, 86:6553), ácido cólico (Mano Bioorg. Med. Chem. Lett . , 1994, 4, 1053), un ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., A . Scí. , 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioo . Let., 1993, 3, 2765), un tiocolesterol (Oberh Nucí. Acids Res., 1992, 20, 533), una cadena al ejemplo, residuos dodecanodiol o undecilo aras et al., EMBO J. , 1991, 10, lll;Kavanov et a ., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochini 49) , un fosfolípido, por ejemplo, di-hexade J. Pharmacol. Exp. Ther. , 1996, 277, 923) colos de conjugación típicos incluyen la sín nucleótidos que portan un aminoenlazador en un iones de la secuencia. El grupo amino es lue ionar con la molécula que está siendo conjugad ivos de acoplamiento o activación adecuado ión de conjugación se puede llevar a cabo ya se nucleótido aún unido al soporte sólido o des del oligonucleótido en fase de solución icación del conjugado de oligonucleótido media ípicamente el conjugado puro. El uso de conj terol es particularmente 1 preferido toda vez on puede incrementar la dirección a tejidos o, un sitio de producción de proteína de factor Como alternativa, la molécula que s gando puede convertirse en un bloque de const do como un NHS o éster pentafluorofenolato ramiditas de ligando pueden ser sintetizadas med ión de un enlazador de aminohexanol a uno de lo xilo seguida por la fosfitilación dé la funciona ol terminal. Otros enlazadores, tales como cis én se pueden utilizar para su conjugación a un e oroacetilo presente en un oligonucleótido sintet Una de las metas principales de la ción es la provisión de composiciones farmacéut endan las moléculas de AR ds de esta invenció sición farmacéutica también puede comprender iduales de esta molécula ARNds o (a) vecto endan una secuencia reguladora enlazada operabl secuencia de nucleotidos que codifique para al m de sentido o una hebra de antisentido compre moléculas ARNds de esta invención. Asimismo c es útil para tratar una enfermedad o trastorno la expresión o actividad de un gen del receptor tipo I, tales como trastornos fibróticos, c maciones .

Las composiciones farmacéuticas de la inve istran en dosis suficientes para inhibir la expr en del receptor de TGF-beta tipo I. Los p tores han encontrado que, gracias a su ada, las composiciones que comprenden el ARNd ción pueden ser administradas a bajas dosis. U a de 5 mg de ARNds por kilogramo de peso corp tor al día es suficiente para inhibir o etamente la expresión de un gen del receptor de I.

En general, una dosis adecuada de ARNds e scala de 0.01 a 5.0 miligramos por kilogramo istrado como dos, tres, cuatro, cinco, seis o a intervalos adecuados a lo largo del d a o o infusión continua. En ese caso, el ARNds cont sub-dosis debe ser correspondientemente más pequ r así la dosis diaria total. La unidad de dosi én puede ser mezclada para suministrarse durant por ejemplo, usando una formulación de li ngada convencional que proporcione la li ngada del ARNds durante un periodo de varios dí laciones de liberación prolongadas se conocen bi ea. En esta modalidad, la unidad de dosi ene un múltiplo correspondiente de la dosis diar El experto en la técnica apreciará que res pueden influenciar la dosificación y sincro ridas para tratar de manera efectiva un yendo pero no limitado a la severidad de la enfe Los avances en la genética ele ratones han úmero de modelos de ratón para el estudio d medades humanas, tales como fibrosis, c mación. Estos modelos se usan para pruebas in , así como para determinar una dosis terapéut iva.

Las composiciones farmacéuticas abarcadas ción pueden ser administradas por cualquie ido en la técnica incluyendo pero no limitado s o parenterales , incluyendo la admini venosa, intramuscular, intraperitoneal, sub dérmica, vía aérea (aerosol) , rectal, vaginal uyendo bucal y sublingual) . En modalidades pre composiciones farmacéuticas se adm venosamente .

Para uso intramuscular, subcutáneo e intr Nds en las células que expresen un gen del rec eta. Estas sustancias incluyen, por cturas micelares, tales como liposomas o cápsid escribe abajo. Aunque la microinyección, lipo , viroides, c psides, capsoides u otros iares se requieren para introducir ARNds en cu as, sorprendentemente estos métodos y agentes arios para la absorción de ARNds in vivo nsiones acuosas de acuerdo con la invención ir agentes de suspensión tales como deriv osa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona canto, y un agente humectante tal como leciti rvadores adecuados para suspensiones acuosas inc xibenzoato de etilo y n-propilo.

Las composiciones farmacéuticas útiles de la invención incluyen también formulaciones enca n obtener comercialmente dé Alza Corporation aceuticals , Inc. Las suspensiones lip uyendo liposomas dirigidos a células infecta uerpos monoclonales contra antígenos virales) ta n usar como portadores farmacéuticamente ace se pueden preparar de acuerdo con métodos conoc íos expertos en la técnica, por ejemplo, ibe en la patente de E.U.A. No. 4,522,811; pub CT WO 91/06309; y publicación de patente Europ , las cuales se incorporan a manera de referenc nte .

La presente invención proporciona sitivos que contienen los agentes de ARNi de la ción, tales como dispositivos que entran en cont angre. Ejemplos de dispositivos que entran en sangre incluyen injertos vasculares, stents, e terapéutico y se puede expresar como la ED50. Los compuestos que exhiben altos éuticos se prefieren.

Los datos obtenidos de ensayos de cult as y estudios en animales pueden usarse lación de una gama de dosis para usarse en huma de composiciones de la invención está de pre o de un intervalo de concentraciones circula yen la ED50 con muy poca o ninguna toxicidad. variar dentro de esta escala dependiendo de la icación empleada y la ruta de administración ut cualquier compuesto usado en el método de la i dosis terapéuticamente efectiva puede e almente a partir de ensayos en el cultivo de osis puede formularse en modelos de animales par escala de concentración plasmática circula Además de su administración individualment pluralidad, como se describió arriba, las molé de la invención pueden ser administradas en com otros agentes conocidos efectivos en el tratam sis, inflamación o trastornos proliferativos , ta r, en particular cáncer hepático. En cualquier o que administre puede ajustar 1 la cant onización de administración de ARNds sobre la tados observados usando medidas de eficacia es idas en la técnica o descritas en la presente.

Los agentes de ARNi de la presente i én pueden ser co-administrados con agente etarios adecuados, incluyendo, pero no limit onistas de receptor de , fibrinógeno (por ejemp r o prevenir angina inestable o para prev usión después de angioplastia y rest os a procedimientos de angioplastia, se benefici co-administración de antagonistas de rece nogeno y de los presentes agentes de ARNi .

En una modalidad, la invención proporc o para tratar un sujeto que tenga una ógica mediada por la expresión de un gen del rec eta, en particular el gen del receptor de TGF-b Estas afecciones comprenden trastornos tal ornos fibróticos, eventos de inflamación o tr ferativos no deseados. En esta modalidad, como un agente terapéutico para controlar la e na proteína del receptor de TGF-beta. El ende administrar una composición farmacéutic ción al paciente (por ejemplo, humano) , de ta la expresión de un gen del receptor de TGF- cular el gen del receptor de TGF-beta tipo lo, fibrosis hepática y cirrosis, fibrosis sis del bazo, fibrosis quística del páncreas y p sis por inyección, fibrosis endomiocárdiaca, nar idiopática del pulmón, fibrosis medi fibrosis, fibrosis retroperitoneal , fibrosis esiva, fibrosis sistémica nefrogénica, enferm n parenquimática difusa, síndrome de dolo tomía y artritis reumatoide. Como alternat idor de la expresión del receptor de TGF-bet ción, y específicamente de la expresión del rec eta 1, puede usarse en el tratamiento de cán ío, cáncer de hígado, y, por ejemplo, c ocelular HCC. No obstante, también cán ornos proliferativos adicionales, pueden ser los medios y métodos provistos en la presente, tornos proliferativos no comprenden solamente miento de fibrosis, de eventos de inflama dos y/o de crecimiento celular no deseado.

Las composiciones farmacéuticas abarcadas ción pueden ser administradas mediante cualqui ido en la técnica incluyendo, pero no limitado o parenteral, incluyendo administración intr muscular, intraperitoneal , subcutánea, transdérm (aerosol) , nasal, rectal, vaginal y tópica (in y sublingual), y administración epidural idades preferidas, las composiciones farmacéu istran intravenosamente por infusión o inyección En otro aspecto m s, la invención propor o para inhibir la expresión de un gen del rec eta tipo I en un mamífero. El método c istrar una composición de la invención al mam anera que la expresión del gen del receptor de íficas del receptor de TGF-beta que modulan la a a expresión del gen del receptor de TGF-b sadas a partir de unidades de transcripción in ectores de ADN o AR . Estos transgenes pue ducidos como una construcción lineal, un lar o un vector viral, los cuales se pueden inco ar como un transgén integrado en el gen rión. El transgén también puede construir tirle ser heredado como un plásmido extracromoso Las hebras individuales de un ARNds pue critas por promotores en dos vectores de e ados y co- transíectarse en una célula objetivo nativa cada hebra individual del ARNds pu crita por promotores ambos de los cuales se ub ismo plásmido de expresión. En una modalidad pr INds es expresado como una repetición invertida u yendo células epiteliales, in vi tro y/o in v res retrovirales recombinantes capaces de tran sar genes insertados en el genoma de una célul producidos al transfectar el genoma re binante en líneas de células de empaque adecuad PA317 y Psi-CRIP. Los vectores aden nbinantes pueden ser usados para infectar un dad de células y tejidos en anfitriones susc ejemplo, rata, hámster, perro y chimpancé) , én la ventaja de no requerir de células mitót as para infección.

El promotor que conduce la expresión de en un plásmido de ADN o vector viral de la i ser una ARN polimerasa I eucariótica (por tor de ARN ribosómico) , ARN polimerasa II (por tor temprano de CMV o promotor de actina o pro Además, la expresión del transgén puede r forma precisa, por ejemplo, usando una s adora inducible y sistemas de expresión tales ncía reguladora que sea sensible a ciertos reg lógicos, por ejemplo, niveles de glucosa circul nas. Estos sistemas de expresión inducibles, a el control de la expresión transgénica en célu eros incluyen regulación por ecdisoma, por est sterona, tetraciclina, inductores químic ización e isopropil-beta-Dl -tiogalacteopi ) . Una persona capacitada en la técnica sería cionar la secuencia reguladora/promotora adec en el uso deseado del transgén de ARNds.

De preferencia, los vectores recombinantes xpresar moléculas de ARNds son suministrados ibe a continuación, y persisten en células o nte, o mediante cualquier otro medio que pe ducción en una célula objetivo deseada.

Plásmidos de ADN de expresión de AR fectados típicamente de células objetivo ejo con portadores de lípidos catiónicos (por fectamine) o portadores a base de lípidos no ca ejemplo, Transit-TKO™) . Varias afecciones de supresiones mediadas por ARNds que se di entes regiones de un solo gen del receptor de TG íos genes del receptor de TGF-beta A durante un a semana o más se contemplan también por la in ntroducción exitosa de los vectores de la inve as hospederas puede monitorearse usando varios ides . Por ejemplo, la transfección transitor señalizada con un reportero, tal como un escente, tal como proteína fluorescente verde (G receptor de TGF-beta tipo I del mamífero q do. Como se indicó arriba, también vectores y omprenden moléculas de ácido nucleico que codifi ños una hebra de las moléculas de ARNds definid nte se puede usar como composiciones farmacé , por lo tanto, emplearse también en los itos en la presente para tratar un sujeto que tervención médica. Cuando el organismo/sujeto do es un mamífero tal como un humano, la compos administrar mediante cualquier medio conocid ea incluyendo, pero no limitado a rutas teral, incluyendo administración intr muscular, intracraneal, subcutánea, transdérmi (aerosol) , nasal, rectal, vaginal y tópica (in y sublingual) . En modalidades preferid siciones se administran mediante infusión o i ulas de ARNds de la invención también pue tadas en vectores y usarse como vectores de a para pacientes humanos. Los vectores de a pueden ser suministrados a un sujeto media ío, inyección intravenosa, administración loca te de E.U.A. No. 5,328,470) o por i eotáctica (véase, por ejemplo, Chen et al. (199 Acad. Sci. E.U.A. 91:3054-3057). La pre céutica del vector de terapia génica puede in r de terapia génica en un diluyente aceptable, ender una matriz de liberación lenta en la c stado el vehículo de suministro génico. nativa, cuando el vector de suministro génico producirse intacto a partir de células recomb ejemplo, vectores retrovirales , la pre céutica puede incluir una o más células que prod ínas que no son anticuerpos, por ejemplo, in articulas modificadas con RGD para suministrar o sistemas de suministro de varios compone es) incluyendo ciclodextrinas cortas, adamant bstante, también se contempla el suministro o anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, in entos Fab (monovalentes) de un anticuerpo { entos de este anticuerpo) o anticuerpos de idual. Los enfoques de inyección para su ido a objetivo comprenden, entre otros, i venosa hidrodinámica. Asimismo, conjuga sterol de ARNds se pueden usar para suministro d lo cual la conjugación o grupos lipófilos incre ción celular y mejore la farmacociné istribución tisular de los oligonucleótidos . Ta en sistemas de suministro catiónicos, con ulas de ARNds de la invención o moléculas ico que codifique para las mismas. Estos enden el uso de virus no patógenos, vectores icados, así como suministros con nanopartí omas. Otros métodos de suministro para la a ar de ARNds son tratamientos extracorpóreos, por mientos ex vivo de células, órganos o tejidos, estas tecnologías se describen y se res caciones, tales como Akhtar (2007) , Journal of tigation 117, 3623-3632, Nguyen et al. (2008), on in Moleculare Therapeutics 10, 158-167, ), Clin Cáncer Res 11, 8230-8234 o Ikeda et al. aceutical Research 23, 1631-1640.

A menos que se defina lo contrario, to nos técnicos y científicos usados en la present ismo significado que el entendido comúnmente por iciones, prevalecerán. Además, los materiales, emplos son ilustrativos únicamente y no se int limitativos.

Las modalidades provistas arriba y los elem resente invención se ilustran ahora con los si íos no limitativos.

Descripción de tablas anexas; Tabla 1 - ARNds que se dirige al gen del F-beta tipo I humano. El primer número en la ción en ARNm" corresponde al inicio de la secu eros . Los números en la columna marcada en tas indican un punto caliente (gris = punto cal tas = punto caliente 2) . La longitud del dúplex las secuencias de 19 nucleótidos.

Tabla 2 - Caracterización de moléculas de A irigen al receptor de TGF-beta humano 1: Pru egritas = punto caliente 2) . Las letras en ma sentan nucleótidos de ARN, las letras en minúscu "a" y wu" representan nucleótidos 2'- icados, "s" representa fosforotioato .

Tabla 4 - Caracterización de moléculas de A irigen al receptor de TGF-beta humano I que co icaciones de nucleótidos: Pruebas de actividad dosis y respuesta a dosis en células ificidad, estabilidad de inducción de citocinas. ntración inhibitoria al 50%. t ½: Vida media como se define en los ejemplos, PBMC: ucleares de sangre periférica humana.

Tabla 5 - Secuencias de , sondas de ADNb minación del receptor de TGF-beta I humano sor de etiqueta, CE = extensor de captura, BL = eo .

I 95.1) fueron examinadas mediante análisis de com identificar las secuencias homologas de 19 nuc produjeran agentes de ARNi que reaccionaran d da entre estas secuencias.

Para identificar los agentes de ARNi, la s imitó a secuencias de 19 meros que tenían al me idencias con cualquier otra secuencia en la RefSeq humana (edición 24) , la cual s senta el transcriptoma humano comprehensivo, u itmo fastA.

Las secuencias identificadas de esta ron la base para la síntesis de los agentes de bla 1 y tabla 3.

Síntesis de AKNds Fuente de reactivos Cuando la fuente de un reactivo no se controlado (CPG, 500Á, Proligo Biochemie GmbH, H nía) como soporte sólido. ARN y ARN que ótidos de 2'-0-metilo fueron generados mediante ase sólida empleando las fosforamiditas correspo '-0-metil fosforamiditas, respectivamente emie GmbH, Hamburg, Alemania) . Estos blo rucción se incorporaron en sitios seleccionado a secuencia de la cadena de oligorribonucleótido ea de fosforamidita nucleósida estándar tal ita en Current protocols in nucleic acid ch age, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc , ¾ Y, E.U.A. Los enlaces de fosforotioato ducidos mediante reemplazo de la solución oxi con una solución de reactivo de Beaucage (Chruac ow, Reino Unido) en acetonitrilo (1%) . R iares adicionales se obtuvieron de Mallinckro ezclar una solución equimolar de hebras complem gulador de pH de fijación (20 mM de fosfato de s 100 mM de cloruro de sodio) , se calentaron en un a 85-90°C durante 3 minutos y se enfriaron a tem nte durante un periodo de 3-4 horas. La solució a se almacenó a -20 °C hasta usarse.

Pruebas de actividad La actividad de las moléculas de ARNsi a se probó en células HeLaS3.

Células HeLa en cultivo se usaron ificación del ARNm del receptor de TGF-beta ti de ADN ramificado en ARNm total aislado de adas con ensayo de moléculas ARNsi específi tor de TGF-beta.

Células HeLaS3 fueron obtenidas de la C icana de Tipos de Cultivos (Rockville, Md. , cat . transfección con ARNsi, las células HeLaS3 radas a una densidad de 1.5xl04 células/poc as de 96 pocilios. . La transfección del A ó a cabo con Lipofectamine 2000 (Invitroge sruhe, Alemania, cat. No. 11668-019) c ribe por el fabricante. En un primer expe una sola dosis, moléculas de ARNsi sfectadas a una concentración de 30 nM . ndo experimento de una sola dosis las moléc i más activas se volvieron a analizar a moléculas de ARNsi más efectivas contra el r GF-beta provenientes del primer análisis de pM se caracterizaron más mediante cu uesta a dosis. Para las curvas de resp S, se llevaron a cabo transíecciones al ig el análisis de una sola dosis anterior, p mics, Inc., Fremont, E.U.A.) para la cuantif de ARNm . Posteriormente, 50 µ? de los on incubados con conjuntos de sondas espe receptor de TGF-beta humano y GAPDH uencia de sub-sondas, véanse las tablas as) y se procesaron de acuerdo con el protoc icante para QuantiGene. La quimiolumini sce O en un Vic tor2 - Light (Perkin Elmer, Wie ania) como RLUs (unidades de luz relativas res obtenidos con el conjunto de sond ptor de TGF-beta humano se normalizaron res GAPDH humanos respectivos para cada p eulas de ARNsi de control no relacionadas se un control negativo.

Estabilidad de las moléculas de ARNsi Se determinó la estabilidad de las mo el control para degradación inespecífica A bó con 30 µ? lx PBS pH 6.8 durante 48 hora ciones se detuvieron mediante la adición de einasa K (20 mg/ml) , 25 µ? de regulador d einasa y 33 µ? de agua Millipore dur tos a 65°C. Las muestras fueron rifugadas y filtradas a través de una p ro de 96 pocilios de 0.2 µ? a 3000 rpm dur tos, se lavaron con 50 µ? de agua Millip s y se filtraron por centrifugación de nuevo Para la separación de las hebras indi análisis de producto de longitud completa ) , las muestras se ejecutaron a través de u ex Summit de intercambio iónico bajo condici aturalización usando como eluyente A 20 4 en 10% de ACN pH = 11 y para el eluyente sario. Todas las áreas pico se corrigieron ndar interno (IS) y se normalizaron a la inc 0 minutos. El área bajo el pico y FLP r itante se calcularon para cada hebra indiv licada por separado. La vida media (tM) a se definió por el punto de tiempo prome triplicados a los cuales la mitad del adad .

Inducción de citocinas La inducción de citocinas potenc culas de ARNsi se determinó al medir la lib NF-a y TNF-a en un ensayo de PBMC in vitro.

Células mononuc leares de sangre per C) humanas fueron aisladas de sangre d ocitaria de dos donadores mediante centrif 11 el día de la transíecc ion . Las células ción a controles positivos como puntuación o de 5.

Especificidad de las moléculas de ARNsi La especificidad de las moléculas de A rminó mediante predicción in silico de su po a de objetivo.

El potencial fuera de dirección se m ción con el gen fuera de objetivo más rele expresó por una puntuación de especi rica. El gen fuera de objetivo más relev tificó con base en un número de no coincide ribución a la hebra de antisentido del ARNsi rminar todos los genes fuera de o ciales, todos los transcriptos humanos ( S RefSeq, edición 24), fueron escrutado ones objetivo potenciales con complementarie (O 00 O O o O 00 Se hace constar que con relación a esta f método conocido por la solicitante para llev ica la citada invención, es el que resulta cia nte descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ante ma como propiedad lo contenido en las si ndicaciones : . 1. Una molécula de ácido ribonucleico d , caracterizada porque es capaz de inhibir la e gen del receptor de TGF-beta tipo I humano in nos 80%. 2. La molécula de ácido ribonucleico de dob nformidad con la reivindicación 1, caracterizad ende una hebra de sentido y una hebra de antisen de antisentido es al menos parcialmente complei . hebra de sentido, con lo cual la hebra de ende una secuencia, la cual tiene una identida 90% con por lo menos una porción de un A ica para un receptor de TGF-beta, en donde la s ecuencias de ácido nucleico ilustradas en SEQ ID 104, 32, 82, 100, 24, 14, 30 y 8 o en donde la eido ribonucleico de doble hebra comprende los ncías seleccionados del grupo que consiste en 1/2, 117/118, 103/104, 31/32, 81/82, 99/100, , 29/30 y 7/8. 4. La molécula de ácido ribonucleico de dob nformidad con cualquiera de las reivindicacione terizada porque comprende al menos un nu icado . 5. La molécula de ácido ribonucleico de dob onformidad con la reivindicación 4, caracterizad cleótido modificado se selecciona del grupo que n nucleótido 2'-0-metil modificado, un nucleó ende un grupo 5 ' -fosforotioato y un nucleótido ado a un derivado de colesterilo o g ste en las secuencias de ácido nucleico ilust D Nos: 151, 249, 261, 231, 275, 253, 211, 265, 1 299, 295, 279 y 219 y la hebra de antise ciona del grupo que consiste en las secuencias ico ilustradas en SEQ ID Nos: 152, 250, 262, 2 212, 266, 182, 186, 210, 300, 296, 280 y 220, o olécula de ácido ribonucleico de doble hebra c ares de secuencias seleccionados del grupo que EQ ID Nos: 151/152, 249/250, 261/262, 231/232, 54, 211/212, 265/266, 181/182, 185/186, 00, 295/296, 279/280 y 219/220. 7. Una secuencia de ácido nucleico carac e codifica para una hebra de sentido y/o una entido comprendida en la molécula de ácido ribo doble hebra de conformidad con cualquiera ndicaciones 1 a 6. terizado porque comprende la molécula de ácido doble hebra de conformidad con cualquiera ndicaciones 1 a 6, la molécula de ácido nuc rmidad con la reivindicación 7 o el ve rmidad con la reivindicación 8. 10. Una composición farmacéutica carac e comprende la molécula de ácido ribonucleico de conformidad con cualquiera de las reivindica la molécula de ácido nucleico de conformidad ndicación 7, el vector de conformidad ndicación 8, o la célula o tejido de conformida ndicación 9. 11. La composición farmacéutica de conform eivindicación 10, caracterizada porque comprend ortador, estabilizador y/o diluyente farmacéut able . (b) mantener la célula, tejido u o cido en la etapa (a) durante un tiempo suficie er la degradación del transcripto de ARNm de un tor de TGF-beta, inhibiendo así la expresión d eceptor de TGF-beta en la célula. 13. Un método para tratar, prevenir o man medad fibrótica, un evento de inflamación medad proliferativa, caracterizado porque c istrar a un sujeto que requiera de este trat neion o manejo, una cantidad terapéu lácticamente efectiva de la molécula de ucleico de doble hebra de conformidad con cualqu reivindicaciones 1 a 6, la molécula de ácido nuc rmidad con la reivindicación 7, el vector de con la reivindicación 8 y/o la composición farmacé rmidad con las reivindicaciones 10 u 11. tica, un evento de inflamación o una en ferativa . 16. Uso de la molécula de ácido ribonuc hebra de conformidad con cualquiera ndicaciones 1 a 6, la molécula de ácido nuc rmidad con la reivindicación 7, el vector de con a reivindicación 8 y/o la célula o tejido de con a reivindicación 9, en la preparación de una com céutica para el tratamiento de una enfermedad fi ento de inflamación o una enfermedad proliferati 17. El método de conformidad con cualquier ndicaciones 12 a 14, la molécula de ácido ribo oble hebra de conformidad con la reivindicació a de conformidad con la reivindicación sición farmacéutica de conformidad con la reivin i el uso de conformidad con la reivindicac toide . 18. El método de conformidad con cualquier ndicaciones 12 a 14, la molécula de ácido ribo oble hebra de conformidad con la reivindicació a de conformidad con la reivindicación 9, la com céutica de conformidad con la reivindicación 10 onformidad con la reivindicación 16, caract e la enfermedad proliferativa es una en rosa. 19. El método, la molécula de ácido ribonuc hebra, la célula, la composición farmacéutica onformidad con la reivindicación 18, caract e la enfermedad cancerosa se selecciona del g ste en. cáncer de hígado, cáncer de cerebro, c , cáncer de pulmón y cáncer de próstata. 20. El método, la molécula de ácido ribonuc