CN102089429A - 用于抑制TGF-β受体基因表达的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于抑制I型TGF-β受体基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其包含反义链，所述反义链具有长度小于30个核苷酸并且与I型TGF-β受体基因的至少一部分实质性互补的核苷酸序列。本发明还涉及药物组合物，其包含所述dsRNA或编码它们的核酸分子或载体以及可药用载体；使用所述药物组合物治疗I型TGF-β受体基因的表达导致的疾病的方法；以及抑制I型TGF-β受体基因在细胞中表达的方法。

Description

用于抑制TGF-β受体基因表达的组合物和方法
本发明涉及双链核糖核酸(dsRNAs)及其介导DNA干扰以抑制TGF-β受体基因表达的用途，特别是抑制I型TGF-β受体表达的用途。此外，所述dsRNA用于治疗纤维化性疾病/病症、炎症和增殖性疾病(例如癌症)的用途也是本发明的一部分。 
转化生长因子-β(TGF-β；AfCS ID A002271)是细胞因子的TGF-β超家族的一部分，其具有超过40个成员。TGF-β本身具有至少三种同种型，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。每种是同源二聚体，虽然在TGF-β同种型和TGF-β超家族的其它成员之间也可形成异源二聚体。TGF-β由很多细胞类型分泌，包括与两种其它多肽(潜在TGF-β结合蛋白(LTBP)和潜在相关肽(LAP))复合的潜在形式的巨噬细胞。血清蛋白酶，例如纤溶酶，催化活性TGF-β从复合体中释放。这通常发生于巨噬细胞表面，其中潜在TGF-β复合体通过其配体(血小板反应蛋白-1(TSP-1))与CD36结合。活化巨噬细胞的炎性刺激通过促进纤溶酶的活化，增强了活性TGF-β的释放。巨噬细胞还可内吞浆细胞分泌的结合IgG的潜在TGF-β复合体，由此将活性TGF-β释放进细胞外液体中。 
I型和II型TGF-β受体(AfCS ID A002272/A002273)均涉及对TGF-β的信号应答。两种均为具有胞质丝氨酸-苏氨酸激酶结构域的I型整合膜蛋白。II型受体在不存在配体时形成同源二聚体，并且可互相自身磷酸化。II型受体可独立于I型受体结合TGF-β，它们是配体特异性的主要决定子。I型受体也可无需配体形成同源二聚体，但是在不存在II型受体时它们不能与配体高效结合。存在配体时，I型和II型受体形成高亲合性(avidity)受体复合体。然后II型受体磷酸化I型受体，致使它们活化。 
除了对Smad转录因子的直接活化(下文详述)之外，还有一些证据表 明，TGF-β受体可通过Ras、RhoA和TGF-β活化激酶(TAK)来活化ERK、JNK和p38MAP激酶。其它报道表明，TGF-β受体可通过PI 3-激酶和蛋白磷酸酶2A产生信号。TGF-β受体活化非Smad信号途径的机制尚不清楚。 
基本上，TGF-β受体通过被称为Smads的潜在胞质转录因子传递信号。术语Smad源于同源果蝇(Drosophila)Mad蛋白(“mothers againstdecapentaplegic”的缩写)和秀丽隐杆线虫(C.elegans)Sma蛋白(“small”的缩写)的名称。结合配体后，磷酸化的I型TGF-β受体结合被受体调节的Smads(R-Smads)——Smad1、2、3、5和8，并对它们磷酸化。R-Smads和TGF-β受体复合体的结合由被称为SARA的含FYVE结构域的适体蛋白协助，并且可在受体已经内化进内体之后发生。一旦被磷酸化，R-Smads从受体复合体上解离，形成同源三聚体并且与Smad4(共同介体Smad(Co-Smad))结合。R-Smad/Smad4复合体转位进细胞核，并且通过与组织特异性转录辅激活物或辅阻遏物相互作用来调控基因转录。Smad4和R-Smads的Mad同源性1(MH1)结构域结合5′-AGACC-3′Smad结合元件(SBE)。 
TGF-β受体信号转导受Smad7抑制性Smad(I-Smad)的负调控。Smad7和Smurf2E3连接酶的复合体与SARA竞争结合TGF-β受体，并促进TGF-β受体复合体的泛素化和降解。Ras/ERK途径还削弱TGF-β向细胞核的信号转导。ERK对R-Smads的磷酸化阻止了它们的核积累。 
TGF-β有广泛的生物活性，因其太多在此不予赘述。虽然其抑制了很多细胞类型的生长，但是其也可诱导细胞增殖和活化。近来已表明，对TGF-β受体信号转导的抑制可阻止大鼠颈动脉损伤模型中狭窄(stenosis)的形成(Fu et al.，Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology 2008，28：665)。此外，II型TGF-β受体的增加的表达看起来在糖尿病性大血管病的发展中具有重要作用(Hosomi et al.，Atherosclerosis.2002，162：69-76)。TGF-β已被一般性地涉及纤维化性组织的形成中，对TGF-β与TGF-β受体的结合的抑制已显示能减轻纤维化(Yata et al，Hepatology 2003， 35：1022-1030)。 
双链RNA分子(dsRNA)已显示能以被称为RNA干扰(RNAi)的高度保守的调控机制来阻断基因表达。WO 99/32619(Fire et al.)公开了使用长度为至少25个核苷酸的dsRNA来抑制TGF-β受体基因在秀丽隐杆线虫中的表达。 
在肝中，正常情况下由非实质星状细胞产生的TGF-β的主要功能是通过抑制DNA合成和诱导凋亡来限制肝细胞应答于损伤的再生性生长。在可能是由于慢性肝炎导致的肝细胞癌(HCC)患者的肝中存在高水平的TGF-β产生。TGF-β的水平与HCC进程良好相关。但是，在HCC细胞中TGF-β-受体II被下调，使得它们对TGF-β诱导的生长抑制不敏感。因此，目前假设TGF-β在HCC中的功能是：其通过抑制免疫系统帮助HCC细胞逃避免疫细胞攻击。HCC细胞能够使用利于生长和侵入的替代性TGF-β信号途径。TGF-β-受体I抑制剂已被用于针对源于HCC的肝纤维化的临床前研究。 
虽然在RNAi的领域取得了显著进展以及在纤维化和增殖性病症(例如癌症)的治疗方面也取得了进展，但是人们仍需要能选择性并且高效沉默TGF-β受体基因的试剂。 
在对用于治疗纤维化疾病的治疗活性物质的开发中，使用RNAi是可行途径，所述疾病例如肝纤维化和肝硬化、肾纤维化、脾纤维化、胰和肺的囊性纤维化、注射性纤维化、心内膜心肌纤维化、肺的特发性肺纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、肾源性系统纤维化、弥漫性实质性肺病、输精管切除术后疼痛综合征和类风湿性关节炎。或者，TGF-β受体表达的抑制剂，特别是用本发明的dsRNA分子对TGF-β受体I的表达的抑制剂，可用于治疗癌症，例如肝癌，以及例如HCC。 
本发明提供了双链核糖核酸分子(dsRNAs)以及使用此类dsRNA抑制TGF-β受体基因在细胞、组织或哺乳动物中表达、特别是抑制TGF-β受体I基因的表达的组合物和方法。本发明还提供了用于治疗TGF-β受体基因 (特别是TGF-β受体I基因)表达导致的病理性状况和疾病(例如在纤维化、炎症中以及在增殖性病症中)的组合物和方法。本发明的双链核糖核酸分子特征在于其在体外将TGF-β受体I基因(特别是哺乳动物和人TGF-β受体I基因)的表达抑制至少80％的能力。在一种优选的实施方式中，本发明的双链核糖核酸分子包含有义链和反义链，反义链至少部分与有义链互补，其中有义链包含具有与编码TGF-β受体的mRNA的至少一部分至少90％同一性的序列，其中所述序列(i)位于所述有义链与所述反义链的互补性区域；并且(ii)其中所述序列长度少于30个核苷酸。 
本发明的dsRNA包含具有下述区域的RNA链(反义链)，所述区域少于30个核苷酸长，并且与I型TGF-β受体基因的mRNA转录物的至少部分实质性互补。使用这些dsRNAs使得I型TGF-β受体(其牵涉到哺乳动物中的纤维化应答、炎性事件以及增殖性病症等等，例如癌症，例如肝癌)的mRNAs得以靶向降解。使用基于细胞的测定法以及动物测定法，本发明的发明人已证实：非常低剂量的这些dsRNA可特异性并高效介导RNAi，导致对所述TGF-β受体基因的表达的显著抑制。因此，本发明的包含这些dsRNAs的方法和组合物可用于治疗其中出现不期望的I型TGF-β受体表达的病症。此类病症包括纤维化性病症、炎症以及增殖性病症，例如癌症/肿瘤。 
本发明上下文中提供了相应的dsRNA分子，下文表1和表3中，以及优选地所附的SEQ ID NOs/对：1/2、117/118、103/104、31/32、81/82、99/100、23/24、13/14、29/30和7/8等等中，提供了最优选的dsDNA分子。在本文提供的特定dsRNA分子的上下文中，SEQ ID NOs对涉及还在本文所附且包括的表中示出的相应有义和反义链序列(5’至3’)。 
此外，本文提供了经修饰的dsRNA分子，特别地，其还公开于表3中，其中提供了对本发明的此类“经修饰的dsRNA分子”的阐释性例子。在该方面，优选的分子包括SEQ ID NOs/对：151/152、249/250、261/262、231/232、275/276、253/254、211/212、265/266、181/182、185/186、209/210、299/300、295/296、279/280和219/220所示的等等。本发明的dsRNAs的 这些组分的阐述性修饰在本文中作为修饰的例子提供。此外，本发明还包含这些dsRNAs(及其组分)的其它修饰，这也作为本发明的一种实施方式。相应的例子提供于本发明的更详细描述中。 
在一种实施方式中，本发明提供了用于抑制TGF-β受体基因表达(特别是哺乳动物或人I型TGF-β受体基因的表达)的双链核糖核酸(dsRNA)分子。人I型TGF-β受体基因的编码序列可从相关数据库获得，见例如Genebank/EMBL.NM_004612.2。还在本文中用作为I型TGF-β受体基因的参考序列的一条编码序列被提供于所附的SEQ ID NO.326中。 
dsRNA包含互相互补的至少两条序列。dsRNA包含含有第一序列的有义链和可含有第二序列的反义链，还见所附的表1和3中提供的特定dsRNA对。反义链可包含与编码所述TGF-β受体的mRNA的至少部分实质性互补的核苷酸序列，互补性区域最优选长度小于30个核苷酸。此外，优选地，本文所述的本发明dsRNA分子的长度(双链体长度)在大约16至30个核苷酸的范围内，特别地，在大约18至28个核苷酸的范围内。在本发明的上下文中，特别有用的是大约19、20、21、22、23或24个核苷酸的双链体长度。最优选的是19、21或23个核苷酸的双链体片断。DsRNA与表达TGF-β受体的细胞接触时，将体外TGF-β受体I基因的表达抑制至少80％。 
所附的实施例中提供了如何测试此类体外抑制的非限制性测定法，其中本发明及本文所述的的siRNAs/dsRNAs的活性在HeLa，特别是HeLaS3细胞中被测试。这些培养中的HeLa细胞被用于对I型TGFβ-受体mRNA加以定量，这通过从用TGFβ受体特异性siRNAs测定法培养的细胞分离的总mRNA中支化DNA来实现。特别地，可体外测量这种抑制。相应测定法易于由本领域技术人员建立，本文也有所提供。如例如本文所附实施例或提供的表中所述，最优选地，本发明的dsRNAs在30nM的浓度下对人I型TGF-β受体的体外表达抑制至少大约80％。本发明的具体的dsRNA分子甚至在更低的浓度下(例如300pM)对I型TGF-β受体的体外表达抑制至少大约80％。再次，表1和2中提供了相应的例子，在所述表中，通过 被评估的细胞中剩余的RNA的量阐明了抑制。 
在一种实施方式中，有义链包含具有与编码I型TGF-β受体的mRNA的至少部分至少90％同一性的序列。所述序列位于有义链与反义链的互补性区中，优选地，位于反义链5’末端的第2-7个核苷酸内。在一种优选的实施方式中，dsRNA特别地靶向人I型TGF-β受体基因，在另一实施方式中，dsRNA靶向小鼠(Mus musculus)和大鼠(Rattus norvegicus)I型TGF-β受体基因。 
在一种实施方式中，本发明的dsRNA分子包含有义和反义链，其中，两条链均具有至少5小时的半寿期。在一种优选的实施方式中，本发明的dsRNA包含有义和反义链，其中两条链在人血清中均具有至少5小时的半寿期。 
在另一实施方式中，本发明的dsRNa分子是非免疫刺激性的，例如，不体外刺激INF-α和TNF-α。 
本发明的dsRNA分子可包含天然存在的核苷酸或可包含至少一个经修饰的核苷酸，例如，2’-O-甲基修饰的核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基团的核苷酸、与胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸基酰胺基团相连的末端核苷酸。2’修饰的核苷酸可具有额外的优点：当本发明的dsRNA分子体内使用时，例如在医药背景中，某些免疫刺激性因子或细胞因子被抑制。或者，并且非限制性地，经修饰的核苷酸可选自2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯(phosphoramidate)和包含非天然碱基的核苷酸构成的组。在一种优选的实施方式中，dsRNA分子包含下述经修饰的核苷酸中的至少一种：2’-O-甲基修饰的核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基团的核苷酸和脱氧胸苷。在另一优选的实施方式中，有义链的所有嘧啶是2’-O-甲基修饰的核苷酸，反义链的所有嘧啶是2’-脱氧-2-’-氟修饰的核苷酸。在一种优选的实施方式中，在dsRNA分子的两条链的3’端发现两个脱氧胸苷核苷酸之一。在另一实施方式中，dsRNA分子的两条链的3’末端的这些脱氧胸苷核苷酸中的至少一个包含5’-硫代磷酸酯基团。 在另一实施方式中，在有义链中，腺嘌呤之前的所有胞嘧啶以及腺嘌呤、鸟嘌呤或尿嘧啶之前的所有尿嘧啶是2’-O-甲基修饰的核苷酸，反义链中腺嘌呤之前的所有胞嘧啶和尿嘧啶是2’-O-甲基修饰的核苷酸。在所附的表3中，提供了阐述性的、经修饰的双链RNA分子。 
本发明的dsRNA还可包含一个或多个单链核苷酸突出端。还如上文所描述的，这些突出端可特别位于每条链的3’末端，并且可包含一个、两个、三个、四个或五个额外的核苷酸。还如所附实施例中阐述的，没有额外的核苷酸、有一个或两个额外的核苷酸的突出端是特别感兴趣的。在一些实施方式中，额外的核苷酸是“T”，优选是两个“T”，即，在每条链的3’末端上具有“TT”的突出端。 
本发明的dsRNA分子可包含选自表1或3的有义序列构成的组的dsRNA第一链，以及选自表1或3的反义序列构成的组的dsRNA第二链。这两条序列的优选的对提供于表中一行/排内。 
优选地，dsRNA包含两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸(有义)由表1所示，第二寡核苷酸(反义)由表1所示，或者其中，一个经修饰的寡核苷酸(有义)由表3所示，第二寡核苷酸(反义)也由表3所示。两张表在每列中均提供了特别有用的有义和反义链序列，均以5’至3’方向提供，每列中的这些序列是用于本发明的各dsRNAs的优选序列。 
因此，本发明的dsRNA的第一序列可选自表1(或3)的有义序列构成的组，第二序列可选自表1(或3)的反义序列构成的组，其中表3提供了示例性的2’-O-甲基修饰的序列。 
本发明还提供了包含本发明的至少一种dsRNAs的细胞。所述细胞优选是哺乳动物细胞，例如人细胞。此外，本发明还包含含有本文定义的dsRNA分子的组织和/或非人生物，其中，所述非人生物对于研究目的或者作为研究工具来说特别有用，例如用于药物测试中。 
本发明还涉及包含本发明的发明性dsRNAs的药物组合物。这些药物组合物特别用于抑制I型TGF-β受体基因在细胞、组织或生物中的表达。包含本发明的一种或多种dsRNA的药物组合物还可包含(a)可药用载体、 稀释剂和/或赋形剂。因此，本发明的某些方面提供了包含本发明的dsRNA(任选与可药用载体一起)的药物组合物、使用所述组合物抑制I型TGF-β受体基因表达的方法以及使用所述药物组合物治疗TGF-β受体基因，特别是I型TGF-β受体基因的表达导致的疾病的方法。 
此外，本发明涉及抑制TGF-β受体基因(特别是哺乳动物或人I型TGF-β受体基因)在细胞、组织或生物中表达的方法，所述方法包括下述步骤： 
(a)向细胞、组织或生物中引入本文定义的双链核糖核酸(dsRNA)； 
(b)将步骤(a)中产生的所述细胞、组织或生物保持足够的时间，以获得I型TGF-β受体基因的mRNA转录物的降解，由此抑制I型TGF-β受体基因在给定细胞中的表达。 
在另一实施方式中，本发明提供了治疗、预防或管理纤维化性病症/疾病、炎症或增殖性病症的方法，所述方法包括向需要此类治疗、预防或管理的受试者施用治疗或预防有效量的一种或多种本发明的dsRNAs。优选地，所述受试者是哺乳动物，最优选是人类患者。 
本发明还提供了核酸序列，其编码本文定义的双链核糖核酸分子中包含的有义链和/或反义链。在另一实施方式中，本发明提供了抑制TGF-β受体基因，特别是包含与编码本发明dsRNA之一的至少一条链的核苷酸序列有效连接的调控序列的I型TGF-β受体基因在细胞中表达的载体。此类本发明的核酸分子或载体可包含在细胞、组织或非人生物中。此类非人生物可以是转基因的非人动物。本发明的细胞、组织以及非人转基因生物可用作为研究工具。此外，细胞和组织还可用于医学介入以及用作为药物。 
在另一实施方式中，本发明提供了包含用于抑制TGF-β受体基因(特别是I型TGF-β受体基因)在细胞中表达的载体的细胞。所述载体包含与编码本发明的dsRNA之一的至少一条链的核苷酸序列有效连接的调控序列。此外，优选地，所述载体除了包含所述调控序列之外，还包含编码本发明dsRNA的至少一条“有义链”和所述dsRNA的至少一条“反义链”的序列。本发明还设想要求保护的细胞包含两个或多个下述载体，所述载体除 了包含所述调控序列之外，还包含编码本发明的dsRNA之一的至少一条链的本文定义的序列。 
本发明提供了双链核糖核酸(dsRNA)以及使用所述dsRNA抑制I型TGF-β受体基因在细胞或哺乳动物中表达的组合物和方法。本发明还提供了使用所述dsRNA在哺乳动物中治疗I型TGF-β受体基因表达导致的病理性状况和疾病的组合物和方法。dsRNA通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。该过程在多种不同的生物(包括哺乳动物和其它脊椎动物)中发生。 
本发明中选择的dsRNA分子提供于表1和3中，其中表1定义了TGF-β受体(I型)基因(也由Genebank/EMBL.NM_004612.2示出)中的靶位点以及相关dsRNA的有义和反义链。此外，还针对某些特别优选的dsRNA(提供的有义和反义序列)，提供了生物和临床相关的有利参数；见附表2和4。 
表1还涉及根据本发明用作为dsRNA的优选分子。特别优选的是第一层(1至10排)和第二层(11至31排)提供的鉴定的dsRNA。但是，第三层(32至58排)和第四层(第59至75排)也包含可用于本发明的dsRNA分子。如上文明显所示地，部分优选的dsRNA分子被提供于SEQ ID NOs：1/2、117/118、103/104、31/32、81/82、99/100、23/24、13/14、29/30和/或7/8定义的有义和反义对中。表2提供了表I所示的本发明的特定dsRNA分子的某些生物和临床特征。 
在本发明的上下文中，我们惊奇地发现，可用于抑制(人)I型TGF-β受体基因表达的一些特别优选的dsRNAs在I型TGF-β受体基因的相应mRNA的特定区域聚簇。关于所附SEQ 1D NO.326中(以及还在Genebank/EMBL NM_004612.2中)提供的人I型TGF-β受体基因，所述簇包含在所附SEQ 1D NO.326(代表人I型TGF-β受体基因)的第250至350位以及1500至1600位核苷酸的区域中，更优选地，第220-320位以及1520至1580位核苷酸，或者更优选地，第298-332以及1522至1569位核苷酸的区域中。 
表3和4还提供了可用于本发明上下文中的其它siRNA分子/dsRNA，其中表4提供了表3所示的本发明的经修饰的siRNA分子/dsRNA分子的某些生物和/或临床相关的令人惊奇的特征。特别有用的、经修饰的分子包含第一层(1至15排)和第二层(16至42排)中提供的序列(有义和反义链)。此外，第三层(43至75排)中定义的dsRNA/siRNAs包含可用于本发明上下文中的有用的dsRNA分子，只要能实现对I型TGF-β受体基因表达的抑制(所述抑制在体外测量，并且抑制了大约至少80％)即可。在经修饰的dsRNA/siRNAs的上下文中，优选的是SEQ ID NOs：151/152、249/250、261/262、231/232、275/276、253/254、211/212、265/266、181/182、185/186、209/210、299/300、295/296、279/280和/或219/220中提供的序列。 
定义 
为方便起见，本说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语和短语的含义被提供于下文中。如果本说明书其它部分的术语使用与本章节所提供的其定义明显不同，以本章节的定义为准。 
“G”、“C”、“A”、“U”和“T”或“dT”每个分别一般性地代表分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶和脱氧胸苷作为碱基的核苷酸。但是，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可表示经修饰的核苷酸(如下文所详细描述的)或者备选替换部分。包含此类替换部分的序列也是本发明的实施方式。如下文所详细描述的，本文所述的dsRNA分子还包含“突出端”，即，不直接参与本文定义的“有义链”和“反义链”的对的正常形成的RNA双螺旋结构的未配对的突出核苷酸。通常，此类突出序列包含脱氧胸苷核苷酸，在大多数实施方式中，是3’末端的2-脱氧胸苷。此类突出端将在下文中描述和阐述。 
术语“TGF-β受体”或“转化生长因子β因子”在本文中特别表示I型TGF-β受体(TGF-β受体I，II型激活蛋白A受体样激酶)，所述术语涉及相应的基因、编码的mRNA、编码的蛋白/多肽以及它们的功能性片段。本文提供的片段涉及本文定义的dsRNA分子所针对的靶序列中簇的本文定 义的“热点”等等。此类片段包括所附SEQ ID NO.326的第250至350位和第1500至1600位核苷酸等等。术语“I型TGF-β受体基因/序列”不仅涉及野生型序列，还涉及所述基因/序列中可能包含的突变和改变。因此，本发明不限于本文提供的特定的dsRNA分子。本发明还涉及包含下述反义链的dsRNA分子，所述反义链与包含此类突变/改变的I型TGF-β受体基因的RNA转录物的相应核苷酸序列至少85％互补。 
在本文中使用时，“靶序列”指I型TGF-β受体转录期间形成的mRNA分子(包括是对一级转录产物进行RNA加工的产物的mRNA)的核苷酸序列的连续部分。 
在本文中使用时，术语“包含序列的链”指这样的寡核苷酸，其包含使用标准核苷酸命名法的所述序列所示的核苷酸的链。但是，如本文中详细描述地，此类“包含序列的链”也可包含修饰，例如经修饰的核苷酸。 
在本文中使用时，除非另有指明，在用于描述相对于第二核苷酸序列的第一核苷酸序列时，术语“互补”指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下杂交并形成双链体结构的能力。在本文中使用时，“互补”序列还可包括从非天然和经修饰的核苷酸形成的碱基对和/或非Watson-Crick碱基对，或者完全由它们形成，只要它们杂交能力方面的上述要求能够满足即可。 
被称为“完全互补”的序列包含：包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的全长上的碱基配对。 
但是，在本文中当第一序列被称为相对第二序列“实质性互补”时，两条序列可以是完全互补的，或者它们在杂交时可形成一处或多处但优选不超过13处错配碱基对。 
术语“互补”、“完全互补”和“实质性互补”在本文中可根据dsRNA的有义链和反义链之间或者dsRNA的反义链和靶序列之间的碱基匹配来使用，这将可从它们使用的上下文来理解。 
术语“双链RNA”、“dsRNA分子”或“dsRNA”在本文中使用时表示下 述核糖核酸分子或核糖核酸分子复合体，它们具有包含两条反平行并且实质性互补的核酸链的双链体结构。形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或者它们可以是不同的RNA分子。当两条链是一个较大分子的部分并且由此通过形成双链体结构的一条链的3’末端和另一条链的5’末端之间的未间断核苷酸链相连时，连接用的RNA链被称为“发夹环”。当两条链并非通过形成双链体结构的一条链的3’末端和另一条链的5’末端之间的未间断核苷酸链共价相连时，连接的结构被称为“接头”。RNA链可具有相同或不同数量的核苷酸。除了双链体结构之外，dsRNA可包含一条或多条核苷酸突出端。所述“突出端”中的核苷酸可包含0至5个核苷酸，其中“0”表示没有额外的形成“突出端”的核苷酸，而“5”表示在dsRNA双链体的各链上有5个另外的核苷酸。这些任选的“突出端”位于各链的3’末端。如下文所详细描述地，在本发明的范畴内，仅在两条链之一包含“突出端”的dsRNA分子也可能是有用的，甚至是有利的。“突出端”优选包含0至2个核苷酸。最优选地，在dsRNA的两条链的3’末端均有2个“dT”(脱氧胸苷)核苷酸。此外，2个“U”(尿嘧啶)核苷酸可作为dsRNA的两条链的3’末端的突出端。因此，“核苷酸突出端”指：当dsRNA的一条链的3’末端从另一条链的5’末端延伸出去或者反过来时，从dsRNA的双链体结构伸出的未成对的一个或多个核苷酸。例如，反义链包含23个核苷酸，有义链包含21个核苷酸，就在反义链的3’末端形成了2个核苷酸的突出端。优选地，该2个核苷酸的突出端与靶基因的mRNA完全互补。“平的”或“平末端”表示在dsRNA的该末端没有未成对的核苷酸，即，没有核苷酸突出端。“平末端”dsRNA是在其全长上均为双链的dsRNA，即，在分子的任一末端都没有核苷酸突出端。 
术语“反义链”指dsRNA的链，其包括与靶序列实质性互补的区域。在本文中使用时，术语“互补性区域”指反义链上与序列(例如靶序列)实质性互补的区域。当互补性区域与靶序列并不完全互补时，在反义链5’末端的第2-7个核苷酸之外的错配是最可容忍的。 
术语“有义链”在本文中使用时指这样的dsRNA链，所述链包括与反 义链的区域实质性互补的区域。“实质性互补”指有义和反义链中重叠的核苷酸中至少85％是互补的。 
在提到dsRNA时，“引入细胞”表示促进摄入或吸收进细胞，如本领域技术人员所理解的。吸收或摄入dsRNA可通过独立进行的扩散或主动的细胞过程来进行，或可通过辅助试剂或装置来进行。该术语的含义不限于体外细胞；dsRNA也可被“引入细胞”，其中细胞是活生物的一部分。在这种情况下，引入细胞将包括递送进生物。例如，对于体内递送而言，可将dsRNA注射进组织位点或者全身性施用。例如，本发明的dsRNA分子可被施用至需要医学介入的受试者。此类施用可包括将本发明的dsRNA、载体或细胞注射进所述受试者的患病侧，例如，注射进肝组织/细胞或注射进癌组织/细胞，例如肝癌组织。但是，也设想在患病组织的邻近区域注射。体外引入细胞包括本领域已知的方法，例如电穿孔或脂转染。 
在指I型TGF-β受体基因时，术语“沉默”、“抑制......的表达”和“击倒”在本文中表示：I型TGF-β受体基因的表达至少部分被抑制，这是通过从I型TGF-β受体基因转录的mRNA的量降低表现的，所述mRNA可分离自第一细胞或细胞组(I型TGF-β受体基因在其中转录，并且经过处理，使得I型TGF-β受体基因的表达被抑制)，所述抑制是较之第二细胞或细胞组(与第一细胞或细胞组基本相同，但是没有经过那样的处理(对照细胞))而言的。抑制程度通常表示为： 
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或者，抑制程度可表示为与I型TGF-β受体基因转录功能相关的参数的降低，所述参数是例如细胞分泌的I型TGF-β受体基因编码的蛋白的量或者展现某种表型的细胞的数量。 
如本文提供的所附实施例和所附表中阐述的，在体外测定中，即，在体外，本发明的dsRNA分子可将人I型TGF-β受体基因的表达抑制至少大约70％，优选至少80％，最优选至少90％。术语“体外”用于本文中时包括但不限于细胞培养测定法。在另一实施方式中，本发明的dsRNA分 子能将小鼠或大鼠I型TGF-β受体基因的表达抑制至少大约70％，优选至少80％，最优选至少90％。本领域技术人员可容易地确定此类抑制率以及相关效果，特别是考虑到本文所提供的测定。如本文所示，当使用大约30nM的所述dsRNA/siRNA的单剂量浓度时，本发明的最优选的dsRNAs能将人I型TGF-β受体基因的表达体外抑制至少大约80％。本发明还包括在大约300pm的单剂量浓度下能抑制人I型TGF-β受体基因的表达的dsRNA/siRNA。此外，本文还提供了本发明范畴内的相应工作实施例，它们也显示于所附的表中。提供了特别优选的dsRNAs，例如，所附表I的第一层中，特别是1至31排，尤其是1至10排(其中提供的有义链和反义链序列为5’至3’的方向)。 
术语“非靶(off target)”在本文中使用时表示提供计算机方法基于序列互补性预测能与描述的dsRNA杂交的转录组的所有非靶标的mRNAs。本发明的dsRNA优选特异性抑制I型TGF-β受体基因的表达，即，不抑制任何非靶的表达。 
例如，所附表1和3中(其中提供的有义链和反义链序列为5’至3’的方向)提供了特别优选的dsRNAs。 
术语“半寿期”在本文中使用时是化合物或分子稳定性的量度，可通过本领域技术人员已知的方法来对其加以评估(尤其是考虑到本文提供的测定法)。 
术语“非免疫刺激性”在本文中使用时表示不存在本发明的dsRNA分子对免疫应答的任何诱导。测定免疫应答的方法是本领域技术人员公知的，例如，通过评估细胞因子的释放，如实施例章节所描述的。 
术语“治疗”在本发明上下文中表示缓解或减轻与I型TGF-β受体基因表达相关的病症，例如，纤维化性病症、炎症或癌症，例如肝癌。在本发明的上下文中，其涉及下文中提到的任何其它状况(并非纤维化、炎症或癌症)时，术语“治疗”表示缓解或减轻与此类状况相关的至少一种症状，或减慢或逆转此类状况的进程。 
在本文中使用时，短语“治疗有效量”和“预防有效量”指对纤维化或纤 维化的明显症状的治疗、预防或管理提供治疗益处。治疗有效的特定量可由普通医疗人员容易地确定，其可根据本领域已知的多种因素变动，例如，纤维化、炎症或癌症的种类、患者病史和年龄、待治疗的疾病的阶段以及其它药剂(例如抗炎药、抗纤维化剂或抗癌/抗肿瘤剂)的施用。 
在本文中使用时，“药物组合物”包含药理学有效量的dsRNA和可药用载体。但是，这种“药物组合物”还可包含本文所述的载体，其中载体包含与编码本发明的发明性dsRNAs/siRNAs中包含的有义或反义链中至少一条链的核苷酸序列有效连接的调控序列。此外，表达或包含本文定义的dsRNAs/siRNAs的细胞、组织或经分离的器官可用作为“药物组合物”，例如，在包含移植方法的医学介入中。在本文中使用时，“药理学有效量”、“治疗有效量”或简单的“有效量”指有效产生想要的药理学、治疗或预防结果的RNA的量。例如，如果当与疾病或病症相关的可测量参数至少降低25％时给定的临床治疗被认为有效，那么用于治疗该疾病或病症的药物的治疗有效量是必须实现该参数的至少25％的降低的量。 
术语“可药用载体”指用于施用治疗剂的载体。此类载体包括但不限于：盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。该术语特别地排除细胞培养基。对于口服施用的药物而言，可药用载体包括但不限于可药用赋形剂，例如，惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、增甜剂、调味剂、着色剂和防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖，玉米淀粉和海藻酸是合适的崩解剂。粘合剂可包括淀粉和明胶，而润滑剂(如果存在的话)将通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要的话，片剂可包衣有单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯等材料，以延迟在胃肠道中的吸收。但是，本发明特别设想：用于本发明范畴内的可药用载体允许全身性施用本发明的dsRNAs、载体或细胞。虽然本发明包括经肠施用，但是肠胃外施用以及经皮或经粘膜(例如吹入、含服、阴道、肛门)施用以及吸入药物也是向需要医学介入的患者施用本发明化合物的可行方法。当利用肠胃外施用时，这可包括将本发明的化合物直接注射进患病组织或者至少邻近区域。但是，本发明化合物的静脉内、动脉内、皮下、肌 内、腹膜内、皮内、鞘内和其它施用也是本领域技术人员(例如主治医师)已知的。 
本发明特别设想：可药用载体允许全身性施用本发明的dsRNAs、载体或细胞。虽然本发明设想经肠施用，但是肠胃外施用以及经皮或经粘膜(例如吹入、含服、阴道、肛门)施用以及吸入药物也是向需要医学介入的患者施用本发明化合物的可行方法。当利用肠胃外施用时，这可包括将本发明的化合物直接注射进患病组织或者至少邻近区域。但是，本发明化合物的静脉内、动脉内、皮下、肌内、腹膜内、皮内、鞘内和其它施用也是本领域技术人员(例如主治医师)已知的。 
对于肌内、皮下和静脉内使用而言，本发明的药物组合物通常以被缓冲至合适的pH和等渗性的无菌水性溶液或悬浮液的形式提供。在一种优选的实施方式中，载体排他性地由水性缓冲液组成。在本文上下文中，“排他性”表示不存在可能影响或介导dsRNA被摄入进表达I型TGF-β受体基因的细胞的辅助试剂或者包封物质。根据本发明的水性悬浮液可包括悬浮剂，例如纤维素衍生物、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和黄蓍树胶，以及润湿剂，例如卵磷脂。用于水性悬浮液的合适防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。根据本发明有用的药物组合物还包括经包封的制剂，以保护dsRNA避免从体内快速清除，例如控释制剂，包括植入体和微包封递送系统。可使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法将是本领域技术人员显而易见的。脂质体悬浮液也可用作为可药用载体。可按照本领域技术人员已知的方法来制备它们。 
在本文中使用时，“经转化的细胞”是已引入了至少一个载体的细胞，可从所述载体表达dsRNA分子或此类dsRNA分子的至少一条链。此类载体优选是包含下述调控序列的载体，所述调控序列与编码本发明dsRNAs中包含的有义链或反义链中至少一条的核苷酸序列有效连接。 
可合理预测：包含表1和表3的序列之一并且减去一个或两个末端的数个核苷酸的较短的dsRNAs具有与上文所述的dsRNAs相似的效果。如 上文所指出的，在本发明的大多数实施方式中，本文提供的dsRNA分子包含大约16至大约30个核苷酸的双链体长度(即，没有“突出端”)。特别有用的dsRNA双链体长度为大约19至大约25个核苷酸。最优选的是长度为19个核苷酸的双链体结构。在本发明的dsRNA分子中，反义链至少部分与有义链互补。 
本发明的dsRNA可含有与靶序列的一处或多处错配。在一种优选的实施方式中，本发明的dsRNA含有不超过13处错配。如果dsRNA的反义链含有与靶序列的错配，优选地，错配区域不位于反义链5’末端的第2-7个核苷酸内。在另一实施方式中，优选地，错配区域不位于反义链5’末端的第2-9个核苷酸内。考虑具有错配的dsRNAs抑制TGF-β受体基因表达的效果是重要的，尤其是如果TGF-β受体基因(特别是I型TGF-β受体基因)中特定的互补性区域已知在种群中具有多态性序列变化时。 
如上文所提到的，dsRNA的至少一个末端/链可具有1至5个(优选1或2个)核苷酸的单链核苷酸突出端。具有至少一个核苷酸突出端的dsRNAs比其平末端对应物具有意想不到的优良抑制性质。此外，本发明发明人发现，仅一个核苷酸突出端的存在加强了dsRNA的干扰活性，并且不会影响其总体稳定性。具有仅一个突出端的dsRNA已被证实为在体内以及在多种细胞、细胞培养基、血液和血清中特别稳定和有效。优选地，单链突出端位于反义链的3’末端，或者，位于有义链的3’末端。dsRNA还可具有平末端，优选位于反义链的5’末端。优选地，dsRNA的反义链具有位于3’末端的核苷酸突出端，并且5’末端是平的。在另一实施方式中，突出端中核苷酸的一个或多个被核苷硫代磷酸酯替换。 
本发明的dsRNA还可经化学修饰，以增强稳定性。可通过本领域中已良好建立的方法来合成和/或修饰本发明的核酸，例如″Current protocolsin nucleic acid chemistry″，Beaucage，S.L.et al.(Edrs.)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY，USA中描述的，其通过引用并入本文。化学修饰可包括但不限于2’修饰，引入非天然碱基，与配体共价连接以及用硫代磷酸酯连接替换磷酸酯连接。在该实施方式中，双链体结构的完整性被至少一 个以及优选至少两个化学连接加强。化学连接可通过多种公知技术中的任何技术来实现，例如通过引入共价键、离子键或氢键；疏水相互作用、范德华或堆叠相互作用；通过金属-离子配位作用或者通过使用嘌呤类似物来实现。优选地，可用于修饰dsRNA的化学基团包括但不限于：亚甲基蓝；双功能基团，优选地，双-(2-氯乙基)胺；N-乙酰基-N′-(对乙醛酰苯甲酰基)胱胺；4-硫脲嘧啶和补骨脂素。在一种优选的实施方式中，接头是六甘醇接头。在这种情况下，通过固相合成生产dsRNA，按照标准方法(例如Williams，D.J.，and K.B.Hall，Biochem.(1996)35：14665-14670)加入六甘醇接头。在一种特别的实施方式中，反义链的5’末端和有义链的3’末端经由六甘醇接头化学连接。在另一实施方式中，dsRNA的至少一个核苷酸包含硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯基团。dsRNA末端的化学键优选通过三螺旋键形成。表3和4提供了本发明的经修饰的RNAi试剂。 
在某些实施方式中，可通过一个或多个键合基团来形成化学键，其中此类键合基团优选是聚-(氧磷酸亚氧基-1，3-丙二醇)-和/或聚乙二醇链。在其它一些实施方式中，还可通过引入双链结构以代替嘌呤的嘌呤类似物，来形成化学键。在还有一些实施方式中，可通过引入双链结构的氮杂苯单元来形成化学键。在另一些实施方式中，可通过引入双链结构代替核苷酸的支化核苷酸类似物来形成化学键。在某些实施方式中，可通过紫外光来诱导化学键。 
在另一实施方式中，两条单链之一或两者的核苷酸可经修饰，以预防或抑制细胞的酶(例如某些核酸酶)的活化。用于抑制细胞酶的活化的技术是本领域已知的，其包括但不限于：2’-氨基修饰、2’-氨基糖修饰、2’-F糖修饰、2’-F修饰、2’-烷基糖修饰、不带电荷的主链修饰、吗啉代修饰、2’-O-甲基修饰和氨基磷酸酯(phosphoramidate)(见例如Wagner，Nat.Med.(1995)1：1116-8)。因此，dsRNA上核苷酸的至少一个2’-羟基被化学基团替换，优选被2’-氨基或2’-甲基替换。此外，可对至少一个核苷酸加以修饰，以形成锁定核苷酸。此类锁定核苷酸含有亚甲基桥，其连接核糖的2’-氧和核糖的4’-碳。向寡核苷酸中引入锁定核苷酸能改善对互补序列的亲和性，并 且能将解链温度增加数度。 
对本文提供的dsRNA分子的修饰可正面影响它们的体内及体外稳定性，还可改进它们向(患病)靶侧的递送。此外，此类结构和化学修饰可正面影响施用时针对dsRNA分子的生理反应，例如，细胞因子释放(其优选被抑制)。此类化学和结构修饰是本领域已知的，例如阐述于Nawrot(2006)Current Topics in Med Chem，6，913-925中。 
将配体与dsRNA缀合可增强其细胞吸收以及向特定组织的靶向。在某些情况下，将疏水配体与dsRNA缀合，以促进直接透过细胞膜。或者，与dsRNA缀合的配体是受体介导的内吞的底物。这些方法已被用于协助反义寡核苷酸的细胞透过。例如，已将胆固醇与多种反义寡核苷酸缀合，导致产生较之其未经缀合的类似物而言活性高得多的化合物。见M.Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002，12，103。已与寡核苷酸缀合的其它亲脂性化合物包括1-芘丁酸、1，3-双-O-(十六烷基)甘油和薄荷醇。用于受体介导的内吞的配体的一个例子是叶酸。叶酸通过叶酸-受体介导的内吞进入细胞。具有叶酸的dsRNA化合物将通过叶酸-受体介导的内吞有效转运进细胞。将叶酸与寡核苷酸的3’末端连结导致细胞对寡核苷酸的摄入增加(Li，S.；Deshmukh，H.M.；Huang，L.Pharm.Res.1998，15，1540)。已被与寡核苷酸缀合的其它配体包括聚乙二醇、碳水化合物簇、交联剂、卟啉缀合物和递送肽。 
在某些实施方式中，将阳离子配体与寡核苷酸缀合通常导致增加的对核酸酶的抗性。阳离子配体的代表性例子是丙基铵和二甲基丙基铵。有意思的是，有报道称，当阳离子配体在寡核苷酸中到处分散时，反义寡核苷酸保持其与mRNA的高结合亲和性。见Manoharan Antisense & NucleicAcid Drug Development 2002，12，103及其中的参考文献。 
可使用具有悬垂(pendant)的反应官能性的dsRNA(例如源于将连接分子连接到dsRNA上的)，来合成本发明的配体缀合的dsRNA。该反应性的寡核苷酸可与可商业获得的配体、具有多种保护基团任一种的合成配体或者具有与其相连的连接部分的配体直接反应。本发明的方法促进配体缀合 的dsRNA的合成，在一些优选的实施方式中，这通过使用已与配体适当缀合并且还可连接到固体支持体材料上的核苷单体来实现。按照本发明的方法的一些优选实施方式，通过选用的血清结合配体与位于核苷或寡核苷酸的5’位置上的连接部分的反应，来制备此类配体-核苷缀合物(任选地与固体支持材料相连接)。在某些情况下，通过下述方法来制备具有与dsRNA的3’末端相连接的芳烷基配体的dsRNA：首先，将单体结构单元与受控的有孔玻璃支持物通过长链氨基烷基共价连接。然后，通过标准固相合成技术，将核苷酸键合到固体支持物上结合的单体结构单元上。单体结构单元可以是核苷或与固相合成相容的其它有机化合物。 
可通过公知的固相合成技术，方便且常规地制造用于本发明缀合物中的dsRNA。使用类似技术来制备其它寡核苷酸(例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物)也是已知的。 
关于合成经特定修饰的寡核苷酸的教导可在下述美国专利中找到：美国专利号5,218,105，涉及多胺缀合的寡核苷酸；美国专利号5,541,307，涉及具有经修饰的主链的寡核苷酸；美国专利号5,521,302，涉及制备具有手性磷连接的寡核苷酸的方法；美国专利号5,539,082，涉及肽核酸；美国专利号5,554,746，涉及具有β-内酰胺主链的寡核苷酸；美国专利号5,571,902，涉及用于合成寡核苷酸的材料和方法；美国专利号5,578,718，涉及具有烷硫基基团的核苷，其中此类基团可用作为与核苷多个位置中任何位置处连接的其它部分的接头；美国专利号5,587,361，涉及具有高手性纯度的硫代磷酸酯连接的寡核苷酸；美国专利号5,506,351，涉及制备2′-O-烷基鸟苷和相关化合物(包括2，6-二氨基嘌呤化合物)的方法；美国专利号5,587,469，涉及具有N-2取代的嘌呤的寡核苷酸；美国专利号5,587,470，涉及具有3-脱氮杂嘌呤的寡核苷酸；美国专利号5,608,046，均涉及缀合的4’-去甲基核苷类似物；美国专利号5,610,289，涉及主链经修饰的寡核苷酸类似物；美国专利号6,262,241，涉及合成2’-氟-寡核苷酸的方法等。 
在本发明的与配体缀合的dsRNA和具有配体分子的序列特异性相连的核苷中，可利用标准核苷酸或核苷前体，或已经具有连接部分的核苷酸 或核苷缀合物前体、已经具有配体分子的配体-核苷酸或核苷-缀合物前体，或具有非核苷配体的结构单元，在合适的DNA合成仪上装配寡核苷酸和寡核苷。 
当使用已经具有连接部分的核苷酸-缀合物前体时，典型地完成对序列特异性相连的核苷的合成，然后将配体分子与连接部分反应，以形成与配体缀合的寡核苷酸。之前已描述过具有多种分子(例如类固醇、维生素、脂类和报道分子)的寡核苷酸缀合物(见Manoharan et al.，PCT申请WO93/07883)。在一种优选的实施方式中，除了使用可商业获得的氨基磷酸酯之外，还使用源于配体-核苷缀合物的氨基磷酸酯，通过自动合成仪合成本发明的寡核苷酸或相连的核苷。 
将2′-O-甲基、2′-O-乙基、2′-O-丙基、2′-O-烯丙基、2′-O-氨基烷基或2′-脱氧-2′-氟基团掺入寡核苷酸的核苷中，向寡核苷酸赋予了增强的杂交性质。此外，含有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸具有增强的核酸酶稳定性。因此，本发明的官能化的相连的核苷可被扩大，以包括硫代磷酸酯主链或2′-O-甲基、2′-O-乙基、2′-O-丙基、2′-O-氨基烷基、2′-O-烯丙基或2′-脱氧-2′-氟基团中的任一种或两种。 
在一些优选的实施方式中，使用DNA合成仪来制备本发明的在5’末端具有氨基的官能化核苷序列，然后将其与选用的配体的活性酯衍生物反应。活性酯衍生物是本领域技术人员公知的。代表性的活性酯包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、四氟代酚酯、五氟代酚酯和五氯代酚酯。氨基和活性酯的反应产生了这样的寡核苷酸，其中选用的配体通过连接基团连接到5’位上。5’末端的氨基可利用5’氨基修饰剂C6试剂来制备。在一种优选的实施方式中，可使用配体-核苷氨基磷酸酯(其中配体与5’羟基直接相连或者通过接头间接相连)将配体分子与寡核苷酸在5’位缀合。此类配体-核苷氨基磷酸酯典型地用于自动合成步骤末尾，以提供在5’末端具有配体的配体缀合的寡核苷酸。 
在本发明方法的一种优选的实施方式中，对配体缀合寡核苷酸的制备从选择合适的前体分子(在其上构建配体分子)开始。典型地，前体是通常 使用的核苷的经适当保护的衍生物。例如，用于合成本发明的配体缀合寡核苷酸的合成前体包括但不限于：2′-氨基烷氧基-5′-ODMT-核苷、′-6-氨基烷基氨基-5′-ODMT-核苷、′-6-氨基烷氧基-2′-脱氧-核苷、′-6-氨基烷氧基-2-保护的核苷、′-6-氨基烷氧基-5′-ODMT-核苷和3′-氨基烷基氨基-5′-ODMT-核苷，其可在分子的核碱基部分被保护。用于合成此类氨基连接的被保护的核苷前体的方法是本领域普通技术人员已知的。 
在很多情况下，在制备本发明的化合物期间，使用保护基团。在本文中使用时，术语“保护”表示指出的部分具有附到其上的保护基团。在本发明的一些优选的实施方式中，化合物含有一个或多个保护基团。在本发明的方法中可利用多种保护基团。通常，保护基团使得化学官能度对特定反应条件呈现惰性，并且可在不实质损伤分子其余部分的情况下将其附到分子中此类官能度上以及从分子中此类官能度上移除。 
代表性的羟基保护基团以及其它代表性保护基团被公开于Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synth esis，Chapter 2，2d ed.，JohnWiley & Sons，New York，1991和Oligonucleotides And Analogues APractical Approach，Ekstein，F.Ed.，IRL Press，N.Y，1991中。 
使用碱处理来选择性去除对酸性处理稳定的氨基保护基团，它们可用于产生对于取代来说可选择性利用的反应性氨基。此类基团的例子是Fmoc(E.Atherton and R.C.Sheppard in The Peptides，S.Udenfriend，J.Meienhofer，Eds.，Academic Press，Orlando，1987，volume 9，p.1)和多种被取代的氨基甲酸磺酰基乙酯，例如Nsc基团(Samukov et al.，TetrahedronLett.，1994，35：7821)。 
其它氨基保护基团包括但不限于：氨基甲酸酯保护基团，例如，2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基(Teoc)、1-甲基-1-(4-二苯基)乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁氧基羰基(BOC)、烯丙氧基羰基(Alloc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)和苄氧羰基(Cbz)；酰胺保护基团，例如，甲酰基、乙酰基、三卤代乙酰基、苯甲酰基和硝基苯基乙酰基；氨磺酰保护基团，例如2-硝基苯磺酰基；以及亚胺和环状亚胺保护基团，例如，苯二甲酰亚氨基(phthalimido)和二硫 杂琥珀酰基(dithiasuccinoyl)。这些氨基保护基团的等同物也被包括在本发明的化合物和方法内。 
很多固体支持物可商业获得，本领域普通技术人员可容易地选择将用于固相合成步骤中的固体支持物。在某些实施方式中，使用通用支持物。通用支持物允许制备具有位于寡核苷酸的3’末端的不常见或经修饰的核苷酸的寡核苷酸。关于通用支持物的进一步细节，参见Scott et al.，Innovationsan d Perspectives in solid-phase Synthesis，3rd International Symposium，1994，Ed.Roger Epton，Mayflower Worldwide，115-124。此外，已有报道，当寡核苷酸通过syn-1，2-乙酰氧磷酸酯基团(更易于经历碱性水解)键合到固体支持物上时，可在更温和的反应条件下，将寡核苷酸从通用支持物上切割下来。见Guzaev，A.I.；Manoharan，M.J.Am.Chem.Soc.2003，125，2380。 
核苷通过含磷或不含磷的共价核苷间连接相连。就鉴定的目的而言，此类缀合的核苷可被表征为具有配体的核苷或者配体-核苷缀合物。较之未经缀合的相似dsRNA化合物而言，具有与其序列内核苷缀合的芳烷基配体的相连的核苷将展示出增强的dsRNA活性。 
本发明与芳烷基-配体缀合的寡核苷酸还包括寡核苷酸和相连的核苷的缀合物，其中配体直接连接到核苷或核苷酸上，而不经接头基团作为中介。配体可优选通过连接基团连接在配体的羧基、氨基或氧代基团上。典型的连接基团可以是酯、酰胺或氨基甲酸酯基团。 
用于本发明的配体缀合寡核苷酸的优选经修饰的寡核苷酸的特定例子包括含有经修饰的主链或非天然核苷间连接的寡核苷酸。如本文所定义的，具有经修饰的主链或核苷间连接的寡核苷酸包括主链中保留了磷原子的那些和主链中不具有磷原子的那些。就本发明的目的而言，其糖间主链中不具有磷原子的经修饰的寡核苷酸也被认为是寡核苷。 
下文描述了特定的寡核苷酸化学修饰。并不必须将给定化合物的所有位置均一地修饰。相反，在单个dsRNA化合物或者甚至在其单个核苷酸中可掺入超过一处修饰。 
优选的经修饰的核苷连接或主链包括，例如：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′连接的硼烷磷酸酯(boranophosphates)、它们的2′-5′连接的类似物以及具有反向极性的那些(其中，核苷单元的邻近对3′-5′与5′-3′相连或2′-5′与5′-2′相连)。本发明还包括多种盐、混合盐和游离酸形式。 
与制备上述含磷原子连接相关的代表性美国专利包括但不限于，美国专利号4,469,863、5,023,243、5,264,423、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233和5,466,677，它们每份都通过引用并入本文。 
其中不包括磷原子的优选的经修饰的核苷间连接或主链(即，寡核苷)具有通过短链烷基或环烷基糖间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基糖间连接或一个或多个短链杂原子或杂环糖间连接形成的主链。它们包括具有吗啉代连接(部分从核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；formacetyl和thioformacetyl主链；亚甲基formacetyl和thioformacetyl主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和氨磺酰主链；酰胺主链的那些以及具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其它主链。 
与制备上述寡核苷相关的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506、5,214,134、5,216,141、5,264,562、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,602,240和5,663,312，它们每份都通过引用并入本文。 
在其它一些优选的寡核苷酸模拟物中，核苷单元的糖和核苷间连接，即，主链，被新的基团替换。核碱基单元被保持与合适的核酸靶化合物杂交。已显示具有优秀杂交性质的一种此类寡核苷酸、寡核苷酸模拟物被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链被含酰胺主链(特别是氨基乙基甘氨酸主链)替换。核碱基被保留，并且与主链的酰胺部分的原子直接或间接结合。关于PNA化合物的教导可在例如美国专利号 5,539,082中找到。 
本发明的一些优选实施方式利用具有硫代磷酸酯连接的寡核苷酸和具有杂原子主链，以及特别地，上文引用的美国专利号5,489,677的--CH2--NH--O--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[已知为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--O--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯主链被表示为--O--P--O--CH2--]和上文引用的美国专利号5,602,240的酰胺主链的寡核苷酸。具有上文引用的美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构的寡核苷酸也是优选的。 
用于本发明的配体缀合的寡核苷酸中的寡核苷酸可额外或备选包含核碱基(本领域中通常简单称为“碱基”)修饰或取代。在本文中使用时，“未经修饰的”或“天然”核碱基包括：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括其它合成的和天然核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代，特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤以及3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。 
其它核碱基包括美国专利号3,687,808中公开的那些，ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering，pages 858-859，Kroschwitz，J.I.，ed.John Wiley & Sons，1990中公开的那些，Englisch etal.，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613中公开的那些以及Sanghvi，Y.S.，Chapter 15，Antisense Research and Applications，pages289-302，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，ed.，CRC Press，1993中公开的那些。 这些核碱基的某些特别可用于增加本发明寡核苷酸的结合亲和性。它们包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示能将核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Id.，276-278页)，其是目前优选的碱基取代，尤其当与2’-甲氧基乙基糖修饰组合时。 
与上述经修饰的核碱基以及其它经修饰的核碱基中的某些的制备相关的代表性美国专利包括但不限于上文提到的美国专利号3,687,808以及U.S.Pat.Nos 5,134,066、5,459,255、5,552,540、5,594,121和5,596,091，它们全都通过引用并入本文。 
在某些实施方式中，用于本发明的配体缀合的寡核苷酸的寡核苷酸可额外或备选包含一个或多个经取代的糖部分。优选的寡核苷酸包含位于2’-位的下述之一：OH；F；O-、S-或N-烷基，O-、S-或N-烯基或O、S-或N-炔基，其中烷基、烯基和炔基可以是经取代的或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。特别优选的是O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是1至大约10。其它优选的寡核苷酸包含位于2’-位的下述之一：C1至C10低级烷基，经取代的低级烷基，烷芳基，芳烷基，O-烷芳基或O-芳烷基，SH，SCH3，OCN，Cl，Br，CN，CF3，OCF3，SOCH3，SO2 CH3，ONO2，NO2，N3，NH2，杂环烷基，杂环烷芳基，氨基烷基氨基，聚烷基氨基，经取代的甲硅烷基，RNA切割基团(cleaving group)，报道基团，嵌入剂，改善寡核苷酸药代动力学性质的基团或者改善寡核苷酸药效学性质的基团以及具有类似性质的其它取代基。优选的修饰包括2′-甲氧基乙氧基[2′-O--CH2CH2OCH3，也被称为′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE]，即，烷氧基烷氧基。另外优选的修饰包括2′-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也被称为2′-DMAOE，如1998年1月30提交的美国专利号6,127,533中描述的，其内容通过引用并入本文。 
其它优选修饰包括2′-甲氧基(2′-O--CH3)、2′-氨基丙氧基 (2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。类似修饰还可在寡核苷酸的其它位置处产生，特别是在3’末端核苷酸上的糖的3’位或者在2’-5’连接的寡核苷酸中。 
在本文中使用时，术语“糖取代基”或“2’-取代基”包括与有或没有氧原子的呋喃核糖基部分的2’-位相连接的基团。糖取代基包括但不限于：氟、O-烷基、O-烷基氨基、O-烷基烷氧基、受保护的O-烷基氨基、O-烷基氨基烷基、O-烷基咪唑和式(O-烷基)m的聚醚，其中m是1至大约10。这些聚醚中优选的是线性和环状的聚乙二醇(PEGs)和含PEG的基团，例如冠醚等，它们由Delgardo et.al.(Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems 1992，9：249)公开，该文献通过引用整体并入本文。其它糖修饰由Cook(Anti-fibrosis Drug Design，1991，6：585-607)公开。氟、O-烷基、O-烷基氨基、O-烷基咪唑、O-烷基氨基烷基和烷基氨基取代被描述于名称为“Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucleotide(s)with 2′and 5′Substitutions”的美国专利6,166,197中，其整体通过引用并入本文。 
适合本发明的其它糖取代基包括2′-SR和2′-NR2基，其中每个R独立地是氢、保护基团或者经取代或未经取代的烷基、烯基或炔基。2′-SR核苷被公开于美国专利号5,670,633中，其整体通过引用并入本文。2′-SR单体合成子的掺入由Hamm et al.(J.Org.Chem.，1997，62：3415-3420)公开。2′-NR核苷由Goettingen，M.，J.Org.Chem.，1996，61，6273-6281和Polushin et al.，Tetrahedron Lett.，1996，37，3227-3230公开。适合本发明的其它代表性的2’-取代基包括具有式I或II之一的那些： 
Figure BDA0000043649990000271
其中，E是C1-C10烷基、N(Q3)(Q4)或N＝C(Q3)(Q4)；每个Q3和Q4 独立地是H、C1-C10烷基、二烷基氨基烷基、氮保护基团、束缚或非束缚的缀合物基团、固相支持体的接头；或者Q3和Q4一起形成氮保护基团或环结构，其任选包括选自N和O的至少一个另外的杂原子； 
q1是1至10的整数； 
q2是1至10的整数； 
q3是0或1； 
q4是0、1或2； 
每个Z1、Z2和Z3独立地是C4-C7环烷基、C5-C14芳基或C3-C15杂环基，其中所述杂环基中的杂原子选自氧、氮和硫； 
Z4是OM1、SM1或N(M1)2；每个M1独立地是H、C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C(＝NH)N(H)M2、C(＝O)N(H)M2或OC(＝O)N(H)M2；M2是H或C1-C8烷基；以及 
Z5是C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C6-C14芳基、N(Q3)(Q4)、OQ3、卤代、SQ3或CN。 
式I的代表性的2’-O-糖取代基被公开于标题为“Capped 2′-OxyethoxyOligonucleotides”的美国专利号6,172,209中，其整体通过引用并入本文。式II的代表性的环状2’-O-糖取代基被公开于标题为“RNA Targeted2′-Modified Oligonucleotides that are Conformationally Preorganized”的美国专利6,271,358中，其整体通过引用并入本文。 
在核糖基环上具有O-取代的糖也适合本发明。环O的代表性取代包括但不限于S、CH2、CHF和CF2。 
寡核苷酸还可具有糖模拟物，例如环丁基部分，代替戊呋喃基糖。与此类经修饰的糖的制备相关的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,359,044、5,466,786、5,519,134、5,591,722、5,597,909、5,646,265和5,700,920，其全部通过引用并入本文。 
还可在寡核苷酸的其它位置上进行额外的修饰，特别是在3’末端核苷酸上的糖的3’位。例如，对本发明的配体缀合寡核苷酸的一种额外修饰涉及向寡核苷酸上化学连接一个或多个额外的非配体部分或缀合物，它们能 增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄入。此类部分包括但不限于脂类部分，例如，胆固醇部分(Letsinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553)，胆酸(Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，4，1053)，硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306；Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765)，硫代胆固醇(Oberhauser et al.，Nucl.Acids Res.，1992，20，533)，脂肪链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.，EMBO J.，1991，10，111；Kabanov et al.，FEBS Lett.，1990，259，327；Svinarchuk et al.，Biochimie，1993，75，49)，磷脂，例如，1，2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸二-十六烷基-rac-甘油酯或三乙基铵(Manoharan et al.，TetrahedronLett.，1995，36，3651；Shea et al.，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777)，聚胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.，Nucleosides & Nucleotides，1995，14，969)或金刚烷乙酸(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651)，棕榈酰部分(Mishra et al.，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229)或十八胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923)。 
本发明还包括利用对寡核苷酸内的特定位置而言基本上手性纯的寡核苷酸的组合物。基本上手性纯的寡核苷酸的例子包括但不限于：具有至少75％Sp或Rp的硫代磷酸酯连接的那些(Cook et al.，美国专利号5,587,361)和具有基本上手性纯(Sp或Rp)的烷基膦酸酯、氨基磷酸酯或磷酸三酯连接的那些(Cook，美国专利号5,212,295和5,521,302)。 
在某些情况下，可通过非配体基团来修饰寡核苷酸。多种非配体分子已与寡核苷酸缀合，以增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄入，用于进行此类缀合的方法是科学文献中可获得的。此类非配体部分包括脂类部分，例如胆固醇(Letsinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86：6553)，胆酸(Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，4：1053)，硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660：306；Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3：2765)，硫代胆 固醇(Oberhauser et al.，Nucl.Acids Res.，1992，20：533)，脂肪族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.，EMBO J.，1991，10：111；Kabanov et al.，FEBS Lett.，1990，259：327；Svinarchuk et al.，Biochimie，1993，75：49)，磷脂，例如，1，2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸二-十六烷基-rac-甘油酯或三乙基铵(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651；Shea et al.，Nucl.Acids Res.，1990，18：3777)，聚胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.，Nucleosides & Nucleotides，1995，14：969)或金刚烷乙酸(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651)，棕榈酰部分(Mishra et al.，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264：229)或十八胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277：923)。典型的缀合方案包括合成在序列的一个或多个位置具有氨基接头的寡核苷酸。然后使用合适的偶联或活化试剂，将氨基与被缀合的分子反应。缀合反应可与仍与固相支持体结合的寡核苷酸进行或切割寡核苷酸之后在溶液相中进行。通过HPLC纯化寡核苷酸缀合物通常提供了纯的缀合物。使用胆固醇缀合物是特别优选的，因为此类部分可增加向肝(因子V蛋白产生的位点)中组织的靶向。 
或者，被缀合的分子可转化进结构单元，例如，亚磷酰胺，这通过分子中存在的醇基团或通过连接具有可被磷酸化的醇基团的接头来实现。 
重要地，这些方法中的每种可用于合成配体缀合的寡核苷酸。连接有氨基的寡核苷酸可通过使用偶联试剂与配体直接偶联，或活化配体作为NHS或五氟酚酯之后偶联。可通过将氨基己醇接头连接到羧基之一接着对末端醇官能度进行亚磷酰化来合成配体亚磷酰胺。还可利用其它接头，例如，半胱胺，用于与合成的寡核苷酸上存在的氯乙酰基接头缀合。 
本发明的主要要点之一是提供了包含本发明的dsRNA分子的药物组合物。此类药物组合物还可包含此类dsRNA分子的各链或下述载体，所述载体包含与核苷酸序列有效连接的调控序列，所述核苷酸序列编码本发明的dsRNA分子中包含的有义链或反义链中的至少一条。此外，表达或包含本文定义的dsRNA分子的细胞和组织也可用作药物组合物。此类细 胞或组织特别可用于移植方法。这些方法还可包括异种移植。 
在一种实施方式中，本发明提供了包含本文所述的dsRNA和可药用载体的药物组合物。包含dsRNA的药物组合物可用于治疗与I型TGF-β受体基因的表达或活性相关的疾病或病症，例如纤维化性病症、癌症或炎症。 
本发明的药物组合物以足以抑制I型TGF-β受体基因表达的剂量施用。本发明的发明人已经发现，包含本发明的dsRNA的组合物因为具有提高的效率，故而可以以低剂量施用。每天每千克接受者体重5mg dsRNA的最大剂量就足以抑制或完全抑制I型TGF-β受体基因的表达。 
通常，dsRNA的合适剂量将在每天每千克接受者体重0.01至5.0毫克的范围内，优选在每天每千克体重0.1至200微克的范围内，更优选在每天每千克体重0.1至100微克的范围内，进一步更优选在每天每千克体重1.0至50微克的范围内，最优选在每天每千克体重1.0至25微克的范围内。药物组合物可一天施用一次，或者dsRNA可在全天中以合适的间隔作为两次、三次、四次、五次、六次或更多亚剂量施用，或者甚至使用连续输注来施用。在这种情况下，每份亚剂量中含有的dsRNA可相应较小，以获得总的日剂量。剂量单位还可混合，用于在数日内递送，例如，使用常规持续释放制剂，其在数日内提供dsRNA的持续释放。持续释放制剂是本领域公知的。在该实施方式中，剂量单位含有相应的多份每日剂量。 
技术人员知道，某些因素可影响到有效治疗受试者所需的剂量和时机，它们包括但不限于疾病或病症的严重程度、以前的治疗、受试者的一般性健康情况和/或年龄以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的组合物治疗受试者可包括单次治疗或系列治疗。可使用常规方法或基于使用合适动物模型的体内测试，来评估本发明所包括的各dsRNA的有效剂量和体内半寿期。 
小鼠遗传学上的进展已产生了大量的小鼠模型，用于研究多种人类疾病，例如纤维化、癌症或炎症。此类模型用于体内测试dsRNA，以及用于测定治疗有效剂量。 
本发明包括的药物组合物可通过本领域已知的任何手段施用，它们包括但不限于经口或肠胃外途径，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、经皮、气道(气溶胶)、直肠、阴道和局部(包括含服和舌下)施用。在一些优选的实施方式中，药物组合物静脉内施用。 
对于肌内、皮下和静脉内使用而言，本发明的药物组合物将通常以缓冲至合适pH和等渗性的无菌水性溶液或悬浮液提供。合适的水性载体包括林格液和等渗氯化钠。在一种优选的实施方式中，载体排他性地由水性缓冲液构成。在本文上下文中，“排他性”表示不存在可能影响或介导dsRNA被摄入进表达TGF-β受体基因的细胞的辅助试剂或者包封物质。此类物质包括，例如，微团结构，例如脂质体或衣壳，如下文所述。虽然需要显微注射、脂转染、病毒、类病毒、衣壳、capsoid或其它辅助试剂来将dsRNA引入细胞培养物，但令人惊奇地，这些方法和试剂并不是dsRNA体内摄入所必需的。根据本发明的水性悬浮液可包括悬浮剂，例如纤维素衍生物、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和黄蓍树胶，以及润湿剂，例如卵磷脂。用于水性悬浮液的合适防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。 
根据本发明有用的药物组合物还包括经包封的制剂，以保护dsRNA避免从体内快速清除，例如控释制剂，包括植入体和微包封递送系统。可使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法将是本领域技术人员显而易见的。材料可从Alza Corporation and NovaPharmaceuticals，Inc.商业获得。脂质体悬浮液(包括靶向受感染细胞的脂质体，具有针对病毒抗原的单克隆抗体)也可用作为可药用载体。可按照本领域技术人员已知的方法来制备它们，例如美国专利号4,522,811；PCT公开WO 91/06309和欧洲专利公开EP-A-43075中描述的，它们通过引用并入本文。 
本发明还提供了含有本发明的RNAi试剂的装置，例如与血液接触的装置。与血液接触的装置的例子包括血管植入物、支架、矫形假体、心脏假 体和体外循环系统。 
可通过标准药物流程，在细胞培养物或实验动物中测定此类化合物的毒性和治疗效果，例如，用于测定LD50(群体50％致死的剂量)和ED50(对群体50％治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比例是治疗指数，其可表示为比例LD50/ED50。展示出高治疗指数的化合物是优选的。 
从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。本发明的组合物的剂量优选在包括ED50但极少毒性或没有毒性的循环浓度的范围内。该剂量可在该范围内变化，这取决于利用的剂量形式和使用的施用途径。对于用于本发明的方法的任何化合物而言，最初可从细胞培养物测定法来估计治疗有效剂量。可在动物模型中配制剂量，以获得该化合物的循环血浆浓度范围，或者如果合适的话，靶序列的多肽产物的循环血浆范围(例如，实现降低的多肽浓度)，其包括细胞培养物中测定的IC50(即实现对症状的最大抑制的一半时的测试化合物浓度)。此类信息可用于更精确地测定人中的有用剂量。可例如通过高效液相色谱来测量血浆中的水平。 
除了它们各自或多次施用(如上文讨论的)之外，本发明的dsRNAs还可与能有效治疗纤维化、炎症或增殖性病症(例如癌症，特别是肝癌)的其它已知试剂组合施用。在任何情况中，施用的医师可基于使用本领域已知或本文描述的对疗效的标准测量观察到的结果，来调节dsRNA施用的量和时机。 
本发明的RNAi试剂还可与合适的抗血小板试剂共同施用，所述试剂包括但不限于：纤维蛋白原受体拮抗剂(例如，用于治疗或预防不稳定型绞痛或用于预防血管成形术后的再阻塞和再狭窄)，抗凝血剂(例如阿司匹林)，溶栓剂，例如纤溶酶原活化剂或链激酶，以在对多种血管病的治疗中获得协同效果，或者降脂剂，包括抗高胆固醇血剂(例如HMG CoA还原酶抑制剂，例如洛伐他汀和辛伐他汀，HMG CoA合酶抑制剂等等)，以治疗或预防动脉粥样硬化。例如，遭遇冠心病的患者和要进行血管成形术的患者将从血纤蛋白原受体拮抗剂和本发明RNAi试剂的共同施用中得到益处。 
在一种实施方式中，本发明提供了治疗具有TGF-β受体基因(特别是I型TGF-β受体基因)的表达介导的病理性状况的受试者的方法。此类状况包括下述病症，例如纤维化性病症、不希望的炎症事件或者增殖性病症。在这种实施方式中，dsRNA作为治疗剂发挥作用，以控制TGF-β受体蛋白的表达。所述方法包括向患者(例如人)施用本发明的药物组合物，使得TGF-β受体基因的表达，特别是I型TGF-β受体基因的表达被沉默。因为其高特异性，本发明的dsRNA特异性靶向I型TGF-β受体基因的mRNAs。 
本发明的化合物特别可用于抗凝血剂治疗或预防适应的那些状况，包括下述这些。 
本发明的化合物可用于治疗或预防纤维化性疾病，例如，肝纤维化和肝硬化、肾纤维化、脾纤维化、胰和肺的囊性纤维化、注射纤维化、心内膜心肌纤维化、肺的特发性肺纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、肾源性系统纤维化、弥漫性实质性肺病、输精管切除术后疼痛综合征和类风湿性关节炎。或者，本发明的TGF-β受体(特别是TGF-β受体I)表达抑制剂可用于治疗癌症，例如肝癌，以及例如肝细胞癌HCC。此外，其它一些癌症或增殖性病症也可用本文提供的手段和方法来治疗。此类增殖性病症不仅包括原发性癌症/肿瘤，也包括继发性肿瘤(即，由于转移事件发展出的肿瘤)。在本发明的一些特别优选的实施方式中，待用本发明的化合物治疗的肿瘤/癌症是脑、乳腺、肺、前列腺或肝癌。 
本发明因此提供了将要施用给人(特别是通过静脉内施用)的抗TGF-β受体dsRNA用于治疗纤维化、不希望的炎症事件和/或不想要的细胞生长的用途。 
本发明所包括的药物组合物可通过本领域已知的任何手段施用，包括但不限于口服或肠胃外途径，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、经皮、气道(气溶胶)、鼻内、直肠、阴道和局部(包括含服和舌下)施用以及硬膜外施用。在一些优选的实施方式中，药物组合物通过输注或注射静脉内施用。 
在另一方面，本发明提供了抑制I型TGF-β受体基因在哺乳动物中表 达的方法。所述方法包括向哺乳动物施用本发明的组合物，使得靶TGF-β受体基因的表达被沉默。因为其高特异性，本发明的dsRNAs特异性靶向靶TGF-β受体基因的RNAs(最初的或经加工的)。使用本发明的dsRNAs来抑制这些I型TGF-β受体基因表达的组合物和方法可按照本文其它地方所述来进行。 
在本发明的另一方面，调节TGF-β受体基因表达活性的TGF-β受体特异性dsRNA分子是从插入进DNA或RNA载体的转录单元表达的。这些转基因可作为线性构建体、环状质粒或病毒载体引入，它们可被掺入，并作为整合进宿主基因组的转基因被遗传。还可构建转基因，以允许其作为染色体外质粒遗传。 
可通过两个不同表达载体上的启动子来转录dsRNA的各链，并将其共转染进靶细胞。或者，通过位于相同表达质粒上的启动子来转录dsRNA的各链。在一种优选的实施方式中，dsRNA作为连有接头多核苷酸序列的反向重复序列表达，使得dsRNA具有茎环结构。 
重组dsRNA表达载体优选是DNA质粒或病毒载体。表达dsRNA的病毒载体的构建可基于但不限于：腺伴随病毒；腺病毒或甲病毒以及本领域其它已知的。逆转录病毒已被用于将多种基因体外和/或体内引入很多不同的细胞类型，包括上皮细胞。能转导并表达插入细胞基因组的基因的重组逆转录病毒载体可这样生产：将重组逆转录病毒基因组转染进合适的包装细胞系，例如PA317和Psi-CRIP。重组腺病毒载体可被用于感染易感宿主(例如大鼠、仓鼠、狗和黑猩猩)中的多种细胞和组织，它们还具有不需要具有有丝分裂活性的细胞用于感染的优点。 
在本发明的DNA质粒或病毒载体中驱动dsRNA表达的启动子可以是真核RNA聚合酶I(例如核糖体RNA启动子)、RNA聚合酶II(例如CMV早期启动子或肌动蛋白启动子或U1snRNA启动子)，或者优选地，RNA聚合酶III启动子(例如U6snRNA或7SK RNA启动子)，或原核启动子，例如T7启动子，只要表达质粒还编码从T7启动子转录所需的T7RNA聚合酶即可。启动子还可指导转基因表达进胰脏(见例如the insulin regulatory sequence for pancreas(Bucchini et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2511-2515))。 
此外，可例如通过使用可诱导的调控序列和表达系统(例如，对某些生理调控因素(例如循环葡萄糖水平或激素)敏感的调控序列)，来精确调控转基因的表达。此类适用于控制细胞或哺乳动物中转基因表达的可诱导的表达系统包括：通过蜕皮激素，通过雌激素、孕酮、四环素、二聚化的化学诱导剂以及异丙基-β-D1-硫代吡喃半乳糖苷(EPTG)进行调控。本领域技术人员将能基于dsRNA转基因的预期用途来选择合适的调控/启动子序列。 
优选地，能表达dsRNA分子的重组载体按照下文所述被递送并且持续存在于靶细胞中。或者，可使用病毒载体，提供dsRNA分子的瞬时表达。此类载体可按照需要重复施用。一旦表达，dsRNAs与靶RNA结合，并调节其功能或表达。dsRNA表达载体的递送可以是全身性的，例如通过静脉内或肌内施用，通过施用给从患者外植的靶细胞接着再重新引入到患者中，或者通过允许引入期待的靶细胞的任何其它手段来实现。 
DsRNA表达DNA质粒典型地作为与阳离子脂类载体(例如Oligofectamine)或基于非阳离子脂类的载体(例如Transit-TKOTM)的复合体转染进靶细胞。本发明还包括多种脂转染，用于dsRNA介导的击倒，在一周或更长时间内靶向单个TGF-β受体基因或多个TGF-β受体基因的不同区域。可使用多种已知方法来监测本发明载体向宿主细胞的成功引入。例如，可使用报道子，例如荧光标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)来信号转导瞬时转染。可使用向经转染细胞提供对特定环境因素(例如抗生素和药物)的抗性(例如潮霉素B抗性)的标记，来确保离体细胞的稳定转染。 
在一种实施方式中，该方法包括施用包含dsRNA的组合物，其中所述dsRNA包含与将被治疗的哺乳动物的I型TGF-β受体基因的RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。如上文所指出的，包含编码本文定义的dsRNA分子的至少一条链的核酸分子的载体和细胞也可用作为药物组合物，并且因此也可用于本文公开的治疗需要医学介入的受试者的方法中。当被治疗的生物/受试者是哺乳动物，例如是人时，组合物可以通过本领域 已知的任何手段施用，包括但不限于口服或肠胃外途径，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、经皮、气道(气溶胶)、鼻内、直肠、阴道和局部(包括含服和舌下)施用。在一些优选的实施方式中，药物组合物通过静脉内输注或注射施用。上文已经以非限制性方式提供了其它的施用手段。还要注意，与药物组合物和相应的治疗(人)受试者的方法相关的这些实施方式还涉及基因治疗方法等方法。本文提供的I型TGF-β受体特异性dsRNA分子或编码这些本发明dsRNA分子的各链的核酸分子还可插入载体，并作为基因治疗载体用于人类患者。基因治疗载体可通过例如静脉内注射、局部施用(见美国专利5,328,470)或通过立体定向注射(见例如Chen et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057)递送给受试者。基因治疗载体的药物制剂可包括处于可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或者可包含缓释基质，其中包埋基因递送载体。或者，当可从重组细胞完整产生完整的基因递送载体(例如逆转录病毒载体)时，药物制剂可包括产生基因递送系统的一种或多种细胞。 
此外，为了引入dsRNA分子，已提供了手段和方法。例如，通过经糖基化和经叶酸修饰的分子的靶向递送，包括使用具有配体(例如半乳糖和乳糖)的聚合物载体或者将叶酸连接到多种大分子上，允许待递送的分子与叶酸受体结合。通过不是抗体的肽和蛋白的靶向递送是已知的，例如，包括：经RGD修饰的纳米颗粒体内递送siRNA，或多组分(非病毒)递送系统(包括短的环糊精，金刚烷-PEG)。此外，使用抗体或抗体片段的靶向递送，包括抗体的(单价)Fab-片段(或此类抗体的其它片段)或单链抗体也是本发明所设想的。用于靶定向递送的注射方法包括水力静脉内注射。此外，dsRNA的胆固醇缀合物可用于靶向递送，其中与亲脂性基团的缀合增强了细胞摄入，改进了寡核苷酸的药代动力学和组织生物分布。此外，阳离子递送系统也是已知的，其中具有净正(阳离子)电荷的合成载体协助与聚阴离子核酸形成复合体，并与带负电荷的细胞膜相互作用。此类阳离子递送系统还包含阳离子脂质体递送系统、阳离子聚合物和肽递送系统。用于dsRNA/siRNA的细胞摄入的其它递送系统是适体-ds/siRNA。此外，基因 治疗方法也可用于递送本发明的dsRNA分子或编码它们的核酸分子。此类系统包含使用非病原性病毒、经修饰的病毒载体以及使用纳米颗粒或脂质体进行递送。用于细胞摄入dsRNA的其它递送方法是体外的，例如离体处理细胞、器官或组织。这些技术的一些被描述和概括于出版物中，例如Akhtar(2007)，Journal of Clinical Investigation 117，3623-3632，Nguyenet al.(2008)，Current Opinion in Moleculare Therapeutics 10，158-167，Zamboni(2005)，Clin Cancer Res 11，8230-8234或Ikeda et al.(2006)，Pharmaceutical Research 23，1631-1640。 
除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文所述相似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明，但下文中描述了合适的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用整体并入本文。有矛盾时，以本申请文件(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅为阐明性的而非限制性的。 
下述非限制性实施例将阐述上文提供的本发明的实施方式和项目。 
附表的描述 
表1-靶向人TGF-β受体I基因的dsRNA。“mRNA中的位置”栏里第一个数字对应23mer序列的开始。所述栏中以灰色标记或粗体的数表示热点(灰色＝热点1；粗体＝热点2)。对所有序列而言，双链体的长度均为19个核苷酸。 
表2-对靶向人TGF-β受体I的dsRNA的分析：HeLaS3细胞中针对单剂量的活性测试和剂量应答、特异性、稳定性和细胞因子诱导。IC50：50％抑制浓度。t1/2：实施例中定义的链的半寿期，PBMC：人外周血单核细胞。 
表3-包含核苷酸修饰的靶向人TGF-β受体I基因的dsRNA。“mRNA中的位置”栏中灰色标记或粗体的数表示热点(灰色＝热点1；粗体＝热点2)。大写的字母代表RNA核苷酸，小写字母“c”、“g”、“a”和“u”代表2’O-甲基修饰的核苷酸，“s”代表硫代磷酸酯。 
表4-对包含核苷酸修饰的靶向人TGF-β受体I的dsRNA的表征：HeLaS3细胞中针对单剂量的活性测试和剂量应答、特异性、稳定性和细胞因子诱导。IC50：50％抑制浓度。t1/2：实施例中定义的链的半寿期，PBMC：人外周血单核细胞。 
表5-用于测定人TGF-β受体I的bDNA探针的序列；LE＝标记延伸子，CE＝捕获延伸子，BL＝封闭探针。 
表6-用于测定人GAPDH的bDNA探针的序列；LE＝标记延伸子，CE＝捕获延伸子，BL＝封闭探针。 
实施例
TGF-β受体基因的基因巡查
进行siRNA设计以鉴定靶向人TGF-β受体I的siRNAs。首先，通过计算机分析，检查人TGF-β受体I的已知mRNA序列(NM_004612.2，L11695.1)，以鉴定出19个核苷酸的同源序列，产生在这些序列之间具有交叉反应性的RNAi试剂。 
在对RNAi试剂的鉴定中，使用fastA算法，选择限于与人RefSeq数据库(版本24)中任何其它序列具有至少2处错配的19mer序列，我们假设所述数据库代表了详尽的人转录组。 
由此鉴定出的序列形成了合成表1和表3中RNAi试剂的基础。 
dsRNA合成
试剂来源
试剂的来源本文中并没有特别给出，此类试剂可从任何分子生物学试剂供应商以应用于分子生物学的质量/纯度标准获得。 
siRNA合成
使用Expedite 8909合成仪(Applied Biosystems，Applera DeutschlandGmbH，Darmstadt，Germany)和受控孔玻璃(CPG， 
Figure BDA0000043649990000391
Proligo Biochemie GmbH，Hamburg，Germany)作为固相支持体，通过固相合成，以1μmole的规模生产单链RNAs。分别利用相应的亚磷酰胺和2’-O-甲基亚磷酰胺(Proligo Biochemie GmbH，Hamburg，Germany)，通过固相合成，产生RNA和含有2’-O-甲基核苷酸的RNA。使用标准核苷亚磷酰胺化学，例如Current protocols in nucleic acid chemistry，Beaucage，S.L.et al.(Edrs.)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY，USA中描述的，将这些结构单元掺入到寡核糖核苷酸链的序列中选择的位置上。通过用Beaucage试剂(Chruachem Ltd，Glasgow，UK)在乙腈(1％)中的溶液代替碘氧化剂溶液，引入硫代磷酸酯连接。其它辅助试剂从Mallinckrodt Baker(Griesheim，Germany)获得。 
通过阴离子交换HPLC对粗制的寡核糖核苷酸进行的去保护和纯化按照已建立的流程来进行。使用分光光度计(DU 640B，Beckman CoulterGmbH，Unterschleiβheim，Germany)，在260nm的波长下，通过各RNA溶液的UV吸收，来测定产率和浓度。通过将等摩尔互补链溶液在退火缓冲液(20mM磷酸钠，pH 6.8；100mM氯化钠)中混合来产生双链RNA，在85-90℃的水浴中加热3分钟，在3-4小时内冷却至室温。将退火的RNA溶液贮藏于-20℃直到使用。 
活性测试
在HeLaS3细胞中测定上文提到的siRNAs的活性。 
培养物中的HeLa细胞被用于对I型TGFβ受体mRNA加以定量，这通过从用TGFβ受体特异性siRNAs测定温育的细胞分离的总mRNA中的支化DNA来实现。 
从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(Rockville，Md.，cat.No.CCL-2.2)获得HeLaS3细胞，将其培养于补充以含有10％胎牛血清(FCS)(Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.S0115)、青霉素100U/ml、链霉素100mg/ml(Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.A2213)的Ham’s F12(Biochrom AG，Berlin，Germany， cat.No.FG 0815)中，培养在5％CO2气氛下、潮湿培养箱(HeraeusHERAcell，Kendro Laboratory Products，Langenselbold，Germany)中。细胞接种和siRNA转染同时进行。为用siRNA进行转染，将HeLaS3细胞以1.5x104个细胞/孔的密度接种于96孔板中。用lipofectamine 2000(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，Germany，cat.No.11668-019)，按照厂商所述，进行siRNA的转染。在第一单剂量实验中，siRNA以30nM的浓度被转染。在第二单剂量实验中，在300pM再次分析最具活性的siRNA。来自300pM的单剂量筛选的对TGFβ受体最有效的siRNAs通过剂量反应曲线再次表征。为绘制剂量反应曲线，像上文所述的单剂量筛选那样进行转染，但是使用下述siRNA浓度(nM)：24、6、1.5、0.375、0.0938、0.0234、0.0059、0.0015、0.0004和0.0001nM。转染后，细胞在37℃和5％CO2下于潮湿培养箱(Heraeus GmbH，Hanau，Germany)中培养24小时。为测量TGFβ-受体mRNA，收获细胞，在53℃按照QuantiGene Screen AssayKit(Cat-No：QG0004，Panomics，Inc.，Fremont，USA)厂商推荐的流程进行裂解，用于对mRNA进行bDNA定量。之后，将50μl裂解物与对人TGFβ-受体和人GAPDH特异的探针组(探针组序列见附表5和6)一起孵育，并按照QuantiGene的厂商方案进行处理。在Victor2-Light(Perkin Elmer，Wiesbaden，Germany)中测量作为RLU(相对光单位)的化学发光，针对每个孔，将用人TGFβ-受体探针组获得的值对各个人GAPDH值归一化。不相关的对照siRNAs被用作阴性对照。 
siRNAs稳定性
在体外测定中，使用人或小鼠血清，通过测量每条单链的半寿期，来测定siRNA的稳定性。 
测量针对每个时间点以一式三份进行，其中使用与30μl人或小鼠血清(Sigma Aldrich)混合的3μl 50μM siRNA样品。将混合物在37℃孵育0分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时、24小时或48小时。作为非特异性降解的对照，将siRNA与30μl 1x PBS pH 6.8孵育48小时。通过加入4μl 蛋白酶K(20mg/ml)、25μl蛋白酶K缓冲液和33μl Millipore水，在65℃下20分钟终止反应。之后将样品以3000rpm旋转过滤通过0.2μm 96孔过滤板20分钟，用50μl Millipore水洗涤两次，再次旋转过滤。 
为分离单链并分析剩下的全长产物(FLP)，将样品在变性条件下运行通过离子交换Dionex Summit HPLC，其中使用洗脱剂A：10％ACN中的20mM Na3PO4(pH＝11)和洗脱剂B(洗脱剂A中的1M NaBr)。应用下述梯度： 
对于每次注射而言，通过Dionex Chromeleon 6.60HPLC软件自动对色谱图积分，如果需要的话，进行人工调整。所有峰面积都相对内标(IS)峰校正，并归一化至t＝0分钟时的温育。针对每条单链并且一式三份分别计算峰下面积和得到的剩余FLP。通过一式三份的平均时间点[h]来定义链的半寿期(t1/2)，此时FLP的一半被降解。 
细胞因子诱导
通过在体外PBMC测定中测量INF-a和TNF-a的释放，来测定siRNAs的潜在细胞因子诱导。 
通过Ficoll离心，在转染当天，从两名供体的暗黄覆盖层分离人外周血单核细胞(PBMC)。使用Gene Porter 2(GP2)或DOTAP，用siRNA(终浓度为Opti-MEM中130nM)在37℃对细胞进行一式四份的转染。已知 诱导INF-a和TNF-a的siRNA序列被用于测定，以及CpG寡核苷酸以500nM的浓度用作为阳性对照。 
通过夹层ELISA，在合并的一式四份的上清液中测量INF-a和TNF-a，每种测量两次。诱导程度相对于阳性对照表示为分数，最大为5分。 
siRNAs的特异性
通过计算机预测其非靶潜力，来测定siRNA的特异性。非靶潜力相对于最相关的非靶基因来测量，其表示为数字的特异性分数。最相关的非靶基因基于错配数量和siRNA反义链的分布来鉴定。为了测定所有可能的非靶基因，使用fastA算法，针对与反义序列具有最高互补性的可能的靶区域，检索所有人转录物(RefSeq数据库，版本24)。 
为鉴定最低特异性分数表征的最相关的非靶基因，通过perl脚本进一步分析fastA输出文件。高特异性分数被定义为最有利的，至少3分被定为特异性的。 
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Claims (20)

1.双链核糖核酸分子，所述分子能够在体外将人I型TGF-β受体基因的表达抑制至少80％。
2.权利要求1的双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子包含有义链和反义链，所述反义链至少部分与所述有义链互补，其中所述有义链包含具有与编码TGF-β受体的mRNA的至少一部分至少90％同一性的序列，其中所述序列(i)位于所述有义链与所述反义链的互补性区域；并且(ii)其中所述序列长度少于30个核苷酸。
3.权利要求1或2的双链核糖核酸分子，其中所述有义链选自由SEQID Nos：1、117、103、31、81、99、23、13、29和7中所示的核酸序列组成的组，并且所述反义链选自由SEQ ID Nos：2、118、104、32、82、100、24、14、30和8所示的核酸序列组成的组，或者其中所述双链核糖核酸分子包含选自由SEQ ID NOs：1/2、117/118、103/104、31/32、81/82、99/100、23/24、13/14、29/30和7/8组成的组的序列对。
4.权利要求1-3中任意一项的双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子包含至少一个经修饰的核苷酸。
5.权利要求4的双链核糖核酸分子，其中所述经修饰的核苷酸选自由2’-O-甲基修饰的核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基团的核苷酸、和与胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸基酰胺基团相连的末端核苷酸、2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸组成的组。
6.权利要求4或5的双链核糖核酸分子，其中所述有义链选自由SEQID Nos：151、249、261、231、275、253、211、265、181、185、209、299、295、279和219所示的核酸序列组成的组，并且所述反义链选自由SEQ IDNos：152、250、262、232、276、254、212、266、182、186、210、300、296、280和220所示的核酸序列组成的组，或者其中所述双链核糖核酸分子包含选自由SEQ ID NOs：151/152、249/250、261/262、231/232、275/276、253/254、211/212、265/266、181/182、185/186、209/210、299/300、295/296、279/280和219/220组成的组的序列对。
7.编码权利要求1-6中任意一项定义的双链核糖核酸分子中包含的有义链和/或反义链的核酸序列。
8.载体，其包含与编码权利要求1-6中任意一项定义的双链核糖核酸分子中包含的有义链或反义链中至少一条的核苷酸序列有效连接的调控序列，或包含权利要求7的核酸序列。
9.细胞、组织或非人生物，其包含权利要求1-6中任意一项定义的双链核糖核酸分子、权利要求7的核酸分子或权利要求8的载体。
10.药物组合物，其包含权利要求1-6中任意一项定义的双链核糖核酸分子、权利要求7的核酸分子、权利要求8的载体或权利要求9的细胞或组织。
11.权利要求10的药物组合物，还包含可药用载体、稳定剂和/或稀释剂。
12.抑制TGF-β受体基因在细胞、组织或生物中表达的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)向所述细胞、组织或生物中引入权利要求1-6中任意一项定义的双链核糖核酸分子、权利要求7的核酸分子、权利要求8的载体；以及
(b)将在步骤(a)中产生的所述细胞、组织或生物保持足以获得TGF-β受体基因的mRNA转录物降解的时间，由此抑制TGF-β受体基因在所述细胞中的表达。
13.治疗、预防或管理纤维化疾病、炎症事件或增殖性疾病的方法，所述方法包括向需要此类治疗、预防或管理的受试者施用治疗或预防有效量的权利要求1-6中任意一项定义的双链核糖核酸分子、权利要求7的核酸分子、权利要求8的载体和/或权利要求10或11定义的药物组合物。
14.权利要求13的方法，其中所述受试者是人。
15.权利要求1-6中任意一项定义的双链核糖核酸分子、权利要求7的核酸分子、权利要求8的载体和/或权利要求10或11定义的药物组合物，用于治疗纤维化疾病、炎症事件或增殖性疾病。
16.权利要求1-6中任意一项定义的双链核糖核酸分子、权利要求7的核酸分子、权利要求8的载体和/或权利要求9的细胞或组织用于制备用于治疗纤维化疾病、炎症事件或增殖性疾病的药物组合物的用途。
17.权利要求12至14中任意一项的方法、权利要求15的双链核糖核酸分子、权利要求15的细胞、权利要求10的药物组合物或权利要求16的用途，其中所述纤维化疾病选自由肝纤维化、肝硬化、肾纤维化、脾纤维化、胰和肺的囊性纤维化、注射性纤维化、心内膜心肌纤维化、肺的特发性肺纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、肾源性系统纤维化、弥漫性实质性肺病、输精管切除术后疼痛综合征和类风湿性关节炎组成的组。
18.权利要求12至14中任意一项的方法、权利要求15的双链核糖核酸分子、权利要求9的细胞、权利要求10的药物组合物或权利要求16的用途，其中所述增殖性疾病是癌性疾病。
19.权利要求18的方法、双链核糖核酸分子、细胞、药物组合物或用途，其中所述癌性疾病选自由肝癌、脑癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌组成的组。
20.权利要求19的方法、双链核糖核酸分子、细胞、药物组合物或用途，其中所述肝癌选自由肝细胞癌(HCC)、肝母细胞瘤、混合型肝癌、源于间质组织的癌、肝肉瘤或胆管癌组成的组。
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