CN107429250A - 用于调节tmprss6表达的化合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开用于调节TMPRSS6和调节有需要的个体中的铁积聚疾病、病症和/或病状的组合物和化合物，所述组合物和化合物包含修饰的寡核苷酸。通过施用靶向TMPRSS6的反义化合物，可治疗、改善、延迟或预防个体中的铁积聚疾病，如红细胞增多症、血色素沉着症或β‑地中海贫血。

Description

用于调节TMPRSS6表达的化合物和方法
序列表
本申请连同序列表一起以电子格式提交。序列表作为在2016年3月23日创建的名称为BIOL0271WOSEQ_ST25.txt的文件提供，所述文件的大小为148kb。电子格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明提供为了减少动物中的铁积聚的目的，用于调节TMPRSS6表达的方法、化合物和组合物。
发明背景
由于铁吸收和排泄的人体生理学的能力有限，所以人体铁平衡的维持是脆弱的(Finch,C.A.和Huebers,H.N.Engl.J.Med.1982.306:1520-1528)。铁缺乏是一种广泛病症，并且是由其中膳食铁摄入不满足身体需求的任何病状产生。通常，病理性失血导致负铁平衡。铁超负荷也是常见的病状，并且可能由遗传学原因引起，例如铁代谢的不同基因的突变(Camaschella,C.Blood.2005.106:3710-3717)。肝肽激素铁调素在身体铁代谢中起关键作用，因为它控制铁吸收和再循环(Ganz,T.Am.Soc.Hematol.Educ.Program 2006.507:29-35；Kemna,E.H.等人,Clin.Chem.2007.53:620-628)。包括HFE(血色素沉着症蛋白)(Ahmad,K.A.等人,Blood Cells Mol Dis.2002.29:361)、转铁蛋白受体2(Kawabata,H.等人,Blood2005.105:376)和血幼素(Papanikolaou,G.等人,Nat.Genet.2004.36:77)在内的几种蛋白质也调控身体的铁水平。
跨膜蛋白酶丝氨酸6(TMPRSS6)是II型跨膜丝氨酸蛋白酶并且主要在肝中表达(Velasco,G.等人,J.Biol.Chem.2002.277:37637-37646)。TMPRSS6中的突变一直牵涉于缺铁性贫血中(Finberg,K.E.等人,Nat.Genet.2008.40:569-571)，其中发现铁调素水平异常升高。对患有小红细胞性贫血的人群体的研究发现TMPRSS6基因中的功能丧失性突变导致铁调素的过度产生，这进而导致有缺陷的铁吸收和利用(Melis,M.A.等人,Hematologica2008.93:1473-1479)。TMPRSS6参与由铁缺乏触发的跨膜信号传导途径并且抑制Hamp活化(编码铁调素的基因)的不同途径(Du,X.等人,Science 2008.320:1088-1092)。HFE-/-小鼠中TMPRSS6的杂合性缺失降低全身铁超负荷，而HFE-/-小鼠中TMPRSS6的纯合性缺失引起全身铁缺乏和铁调素的肝表达升高(Finberg,K.E.等人,Blood 2011.117:4590-4599)。
铁超负荷病症的一个实例是血色素沉着症。血色素沉着症(例如1型血色素沉着症或遗传性血色素沉着症)是导致胃肠道对膳食铁过量肠吸收的病症(Allen,K.J.等人,N.Engl.J.Med.2008.358:221-230)。这导致全身铁贮量的病理性增加。过量铁在组织和器官，特别是肝、肾上腺、心脏、皮肤、性腺、关节和胰腺中积聚，并且破坏其正常功能。二次并发症，如肝硬化(Ramm,G.A.和Ruddell,R.G.Semin.Liver Dis.2010.30:271-287)、多关节病(Carroll,G.J.等人,Arthritis Rheum.2011.63:286-294)、肾上腺功能不全、心力衰竭和糖尿病(Huang,J.等人,Diabetes 2011.60:80-87)是常见的。铁超负荷病症的另一个实例是β-地中海贫血，其中患者可能发展由用于治疗β-地中海贫血的红细胞生成或输血无效引起的铁超负荷。
迄今为止，用于治疗铁超负荷病症的治疗策略一直受到限制。已经提出或开发了诸如siRNA和反义寡核苷酸的核酸抑制剂，但是直接靶向TMPRSS6的化合物(PCT公布WO2014/076195、WO2012/135246、WO2014/190157、WO2005/0032733、WO 2013/070786和WO2013/173635；美国专利号8,090,542；Schmidt等人Blood.2013,121(7):1200-8)没有一种已被批准用于治疗铁超负荷病症。因此，对于用于抑制TMPRSS6的高度有效和耐受的化合物存在尚未满足的需求。本文公开的本发明涉及发现TMPRSS6表达的新颖高效抑制剂及其在治疗中的用途。
本申请中引用的所有文献或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍及论文)关于本文所论述的文献部分明确地以引用的方式特此并入以及以引用的方式特此整体并入。
发明概述
本文提供用于调节动物中的TMPRSS6 mRNA和/或蛋白质的水平的组合物、化合物和方法。本文提供用于降低TMPRSS6水平的组合物、化合物和方法。
本文公开的某些实施方案提供包含靶向编码TMPRSS6的核酸序列的修饰的寡核苷酸的化合物。在某些实施方案中，所述化合物靶向如在SEQ ID NO:1-6中的任一个的核碱基序列中所示的TMPRSS6序列。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰的寡核苷酸的化合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含核碱基序列，所述核碱基序列包含与SEQ ID NO:1的核碱基3162至3184的等长部分互补的至少8个连续核碱基的部分，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰的寡核苷酸的化合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成且具有包含SEQ ID NO:23、36、37、63、77的核碱基序列中的任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列。
本文公开的某些实施方案提供包含具有下式的修饰的寡核苷酸的化合物：
本文公开的某些实施方案提供包含具有下式的修饰的寡核苷酸的化合物：
发明详述
应理解，以上概述和以下详述二者都仅为示例性和解释性的，并且不限制要求保护的本发明。在本文中，除非另外确切说明，否则单数的使用包括复数。如本文所使用，除非另外说明，否则“或”的使用是指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。此外，除非另外明确陈述，否则如“要素”或“组分”的术语涵盖包含一个单元的要素和组分与包含一个以上亚单元的要素和组分两者。
本文所用的章节标题仅出于组织目的，并且不应解释为限制所述主题。本申请中引用的所有文献或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍及论文)关于本文所论述的文献部分明确地以引用方式特此并入以及以引用方式特此整体并入。
定义
除非提供具体定义，否则关于本文所述的分析化学、合成有机化学和医学和药物化学所用的命名以及本文所述的分析化学、合成有机化学和医学和药物化学的工序和技术为本领域中熟知且常用的。标准技术可用于化学合成和化学分析。在允许的情况下，贯穿本文的公开内容所提及的所有专利、申请、公布的申请及其他公布、可经由数据库(如美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI))获得的GENBANK登录号及相关序列信息及其他数据关于本文所论述的文献部分以引用的方式并入本文以及以引用的方式整体并入本文。
除非另外指出，否则以下术语具有以下含义：
“2'-O-甲氧基乙基”(又为2’-MOE和2’-O(CH2)2-OCH3)是指呋喃糖基环的2'位的O-甲氧基-乙基修饰。2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是修饰的糖。
“2’-O-甲氧基乙基核苷酸”是指包含2’-O-甲氧基乙基修饰的糖部分的核苷酸。
“5-甲基胞嘧啶”是指使用连接至5’位置的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。
“约”是指在值的±10％以内。例如，如果陈述“标志物可增加约50％”，则意味着标志物可增加45％-55％之间。
“活性药剂”或“药剂”是指当施用给个体时药物组合物中提供治疗益处的一种或多种物质。例如，在某些实施方案中，靶向TMPRSS6的反义寡核苷酸为活性药剂。
“活性靶区域”或“靶区域”是指一种或多种活性反义化合物所靶向的区域。
“活性反应化合物”是指降低靶核酸水平或蛋白质水平的反义化合物。
“伴随施用”是指在相同时间以任何方式共同施用两种药剂，其中两种药剂的药理作用均在患者中显现。伴随施用不要求以单一的药物组合物、以相同剂型或通过相同的施用途径来施用两种药剂。这两种药剂的作用本身不需要同时显现出来。这些作用仅需要一段时间重叠并且不需要共延。
“施用”是指向个体提供药剂，且包括但不限于由医学专业人员施用及自行施用。
“药剂”是指在施用给动物时可提供治疗益处的活性物质。“第一药剂”是指本文提供的治疗性化合物。例如，第一药剂是靶向TMPRSS6的反义寡核苷酸。“第二药剂”是指本文所述的第二治疗性化合物。例如，第二药剂可以是靶向TMPRSS6或非TMPRSS6靶标的第二反义寡核苷酸。或者，第二药剂可以是除反义寡核苷酸以外的化合物。
“改善(Amelioration)”或“改善(ameliorate)”是指相关疾病、病症和/或病状的至少一种指标、标志物、体征或症状的减轻。在某些实施方案中，改善包括延缓或减缓病状、病症和/或疾病的一个或多个指标的进展。指标的严重性可通过本领域的技术人员已知的主观或客观度量来确定。
“贫血”是以血液中红血细胞(红细胞)低于正常数量为特征的疾病，通常通过血红蛋白的量的降低来测量。贫血的原因可包括慢性炎症、慢性肾病、肾透析治疗、遗传(遗传性)病症、慢性感染、急性感染、癌症和癌症治疗。这些疾病、病症和/或病状中改变的铁稳态和/或红细胞生成还可导致减少的红细胞产生。贫血的临床体征包括低血清铁(血铁过少)、低血红蛋白水平、低血细胞比容水平、红血细胞减少、网织红细胞减少、可溶性转铁蛋白受体增加和铁限制性红细胞生成。贫血的实例包括地中海贫血(即α-地中海贫血、β-地中海贫血(轻型、中间型和重型)和δ-地中海贫血)、镰状细胞性贫血、再生障碍性贫血、范可尼贫血(Fanconi anemia)、戴-布二氏贫血(Diamond Blackfan anemia)、舒-戴二氏综合征(Shwachman Diamond syndrome)、红细胞膜障碍、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏、遗传性出血性毛细血管扩张症、溶血性贫血、慢性病性贫血等。
“动物”是指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、狗、猫、猪，以及非人灵长类，包括但不限于猴和黑猩猩。
“抗体”是指特征在于与抗原以某种方式特异性反应的分子，其中抗体与抗原各自利用另一者来定义。抗体可指完全抗体分子或其任何片段或区域，如重链、轻链、Fab区和Fc区。
“反义活性”是指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测或可测量的活性。在某些实施方案中，反义活性为靶核酸或由此靶核酸所编码的蛋白质的量或表达的减少。
“反义化合物”是指能够经历通过氢键合与靶核酸进行杂交的低聚化合物。
“反义抑制”是指与在不存在与靶核酸互补的反义化合物的情况下的靶核酸水平或靶蛋白质水平相比，在存在反义化合物的情况下靶核酸水平或靶蛋白质水平的降低。
“反义寡核苷酸”是指具有允许与靶核酸的对应区域或片段杂交的核碱基序列的单链寡核苷酸。
“双环糖”是指通过两个非孪位环原子桥接而修饰的呋喃糖基环。双环糖是修饰的糖。
“双环核酸”或“BNA”是指其中核苷或核苷酸的呋喃糖部分包括连接呋喃糖环上的两个碳原子的桥联从而形成双环系统的核苷或核苷酸。
“输血”是指将血液制品静脉内注射到人体血液循环中的过程。输血用于各种医学疾病、病症和/或病状中以取代丢失的血液组分。
“帽结构”或“端帽部分”是指已在反义化合物的任一末端并入的化学修饰。
“cEt”或“限制性乙基”是指包含连接4'-碳与2'-碳的桥的双环糖部分，其中所述桥具有下式：4’-CH(CH3)-O-2’。
“限制性乙基核苷”(又为cEt核苷)是指包含含有4’-CH(CH3)-O-2’桥的双环糖部分的核苷。
“化学上不同的区域”是指以某种方式化学上不同于同一反义化合物的另一区域的反义化合物的区域。例如，具有2’-O-甲氧基乙基核苷酸的区域化学上不同于具有无2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸的区域。
“嵌合反义化合物”是指具有至少两个化学上不同的区域的反义化合物。
“共同施用”是指向个体施用两种或更多种药剂。两种或更多种药剂可在单一药物组合物中，或可在分开的药物组合物中。两种或更多种药剂中的每一种可通过相同或不同的施用途经进行施用。共同施用包括伴随、并行或相继施用。
“互补性”是指第一核酸与第二核酸的核碱基之间配对的能力。在某些实施方案中，第一核酸是反义化合物且第二核酸是靶核酸。
“连续核碱基”是指彼此紧邻的核碱基。
“脱氧核糖核苷酸”是指在核苷酸的糖部分的2’位具有氢的核苷酸。脱氧核糖核苷酸可用多种取代基中的任一种进行修饰。
“稀释剂”是指组合物中缺乏药理活性但在药学上是必需的或期望的成分。例如，所注射组合物中的稀释剂可以是液体，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
“剂量单位”是指所提供的药剂的形式，例如丸剂、片剂或本领域中已知的其他剂量单位。在某些实施方案中，剂量单位为含有冻干反义寡核苷酸的小瓶。在某些实施方案中，剂量单位为含有重构反义寡核苷酸的小瓶。
“剂量”是指在单个施用中或在指定时间内提供的指定量的药剂。在某些实施方案中，剂量可在一个、两个或多个大丸剂、片剂或注射剂中施用。例如，在某些实施方案中，当期望皮下施用时，所需剂量需要不易由单次注射调节的体积，因此，两个或多个注射可用于实现所需剂量。在某些实施方案中，药剂通过在延长的时段内或连续地输注来施用。剂量可被规定为每小时、每天、每周或每月药剂的量。
“有效量”或“治疗有效量”是指足以在需要活性药剂的个体中实现所需生理学结果的药剂的量。有效量可在个体间变化，取决于待治疗个体的健康和身体条件、待治疗个体的分类群、组合物的制剂、个体的医疗条件的评价以及其他相关因素。
“完全互补”或“100％互补”是指第一核酸的核碱基序列的每个核碱基在第二核酸的第二核碱基序列中具有互补核碱基。在某些实施方案中，第一核酸是反义化合物且第二核酸是靶核酸。
“缺口聚物(Gapmer)”是指其中具有多个支持RNA酶H裂解的核苷的内部区域位于具有一个或多个核苷的外部区域之间的嵌合反义化合物，其中包含内部区域的核苷化学上不同于包含外部区域的核苷。内部区域可被称为“缺口区段”，且外部区域可被称为“翼区段”。
“缺口加宽的”是指具有定位于具有一个至六个核苷的5’和3’翼区段之间且与所述5’和3’翼区段紧邻的12个或多个连续2’-脱氧核苷的缺口区段的嵌合反义化合物。
“血色素沉着症”是一种铁代谢病症，其导致从胃肠道吸收过量铁，从而导致过量铁积聚和沉积在身体的各种组织中。原发性或遗传性经典血色素沉着症是由(例如HFE基因中的)遗传突变引起的。患有这种疾病的受试者具有过量的铁，其被吸收在胃肠道中并积累在身体组织中，特别是肝中。继发性或获得性血色素沉着症可由频繁输血、铁补充剂的高口服或胃肠外摄入或其他疾病的继发作用引起。
“血细胞生成”是指源于造血干细胞的血液细胞组分的形成。这些干细胞驻留在骨髓的髓质中，并且具有产生所有不同成熟血细胞类型的独特能力。
“溶血”是指红细胞或红血细胞的破裂以及其内容物释放到周围流体中。动物中的溶血可由于大量医疗条件，包括细菌感染、寄生虫感染、自身免疫性病症和遗传病症而发生。
“铁调素”是指响应于炎症或血液中的铁水平上升而由肝细胞产生的mRNA以及由所述mRNA编码的蛋白质。铁调素的主要作用是通过促进这些血液铁水平的降低来调控血液铁水平。铁调素表达在急性和慢性炎症的情况下增加，从而导致用于红细胞生成的铁利用率降低。“铁调素”还称为铁调素抗微生物肽；HAMP；HAMP1；HEPC；HFE2；LEAP-1；LEAP1；和肝表达的抗微生物肽。
“遗传性贫血”是指由遗传性病状引起的贫血，其导致身体中的红血细胞比正常人更快死亡，从肺部输送氧至身体的不同部位无效，或根本不产生。实例包括但不限于镰状细胞性贫血、地中海贫血、范可尼贫血、戴-布二氏贫血、舒-戴二氏综合征、红细胞膜障碍、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏，或遗传性出血性毛细血管扩张症。
“HFE”是指人血色素沉着症基因或蛋白质。
“HFE基因突变”是指HFE基因中的突变，其可能导致遗传性血色素沉着症。
“杂交”是指互补核酸分子的退火。在某些实施方案中，互补核酸分子包括反义化合物和靶核酸。
“鉴定处于患有与铁过量积聚相关的疾病、病症和/或病状的风险的动物”是指鉴定已被诊断为患有与铁过量积聚相关的疾病、病症和/或病状的动物或鉴定易发展与铁过量积聚相关的疾病、病症和/或病状的动物。例如，如果动物具有血色素沉着症家族史，则所述动物可能易发展与铁过量积聚相关的疾病、病症和/或病状。这种鉴定可通过包括评估动物的医疗史和标准临床测试或评定的任何方法来实现。
“紧邻”是指在紧邻的要素之间没有插入要素。
“个体”或“受试者”或“动物”是指对于治疗或疗法所选择的人或非人动物。
“抑制表达或活性”是指RNA或蛋白质的表达或活性的降低或阻断并且不一定表示表达或活性的完全消除。
“核苷间键联”是指核苷之间的化学键。
“静脉内施用”是指进入静脉中的施用。
“铁积聚”或“铁超负荷”指示由任何原因引起的铁在体内的积聚和沉积。最常见的原因是遗传性原因、输血铁超负荷，其可由重复输血或过量膳食铁摄入所致。
“铁补充剂”是指出于治疗患者的铁缺乏的医疗原因而开处方的补充剂。铁可通过口服途径补充或胃肠外给予。
“连接的核苷”是指键合在一起的相邻核苷。
“标志物”或“生物标志物”是充当健康或生理学相关评定的指标的任何可测量和可量化的生物学参数。例如，转铁蛋白饱和度百分比的增加、铁水平的升高或铁调素水平的降低可被认为是铁超负荷疾病、病症和/或病状的标志。
“MCH”是指“平均红细胞血红蛋白”或“平均细胞血红蛋白”，其是表示血液样品中每个红血细胞的血红蛋白(Hb)的平均质量的值。
“MCV”是指“平均红细胞体积”或“平均细胞体积”，其是表示平均红血细胞大小的值。“
“错配”或“非互补核碱基”或“MM”是指当第一核酸的核碱基不能与第二或靶核酸的对应核碱基配对的情况。
“修饰的核苷间键联”是指来自天然存在的核苷间键(即磷酸二酯核苷间键)的取代或任何变化。
“修饰的核碱基”是指不是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷或尿嘧啶的任何核碱基。例如，修饰的核碱基可以是5-甲基胞嘧啶。“未修饰的核碱基”是指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。
“修饰的核苷”是指独立地具有修饰的糖部分和/或修饰的核碱基的核苷。
“修饰的核苷酸”是指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷间键联和/或修饰的核碱基的核苷酸。
“修饰的寡核苷酸”是指包含修饰的核苷间键联、修饰的糖和/或修饰的核碱基的寡核苷酸。
“修饰的糖”是指来自天然糖的取代或改变。例如，修饰的糖可以是2’-MOE。
“调节”是指改变或调整细胞、组织、器官或生物体的特征。例如，调节TMPRSS6水平可是指增加或降低细胞、组织、器官或生物体中的TMPRSS6 mRNA和/或TMPRSS6蛋白质的水平。“调节剂”实现细胞、组织、器官或生物体的改变。例如，TMPRSS6反义寡核苷酸可以是增加或减少细胞、组织、器官或生物体中的TMPRSS6 mRNA或TMPRSS6蛋白质的量的调节剂。
“单体”是指低聚物的单个单元。单体包括但不限于天然存在或修饰的核苷及核苷酸。
“基序”是指反义化合物中化学上不同的区域的模式(pattern)。
“突变”是指核酸序列中的变化。突变可以各种方式引起，所述方式包括但不限于辐射、病毒、转座子和致突变化学品，以及在减数分裂、DNA复制、RNA转录和转录后加工过程中发生的错误。突变可导致序列中的若干不同变化；它们可没有作用、改变基因的产物或阻止基因正常或完全地发挥作用。例如，HFE突变可导致基因产物的不正常功能，从而导致肠中的过量铁吸收。
“骨髓增生异常综合征”是指一组不同的血液学医学疾病、病症和/或病状，其涉及骨髓类血细胞的无效产生。该综合征由骨髓中干细胞的病症引起。在骨髓增生异常综合征中，血细胞生成无效，并且血细胞的数量和质量不可逆地下降，从而进一步损害血液产生。因此，患有骨髓增生异常综合征的患者发展严重贫血并且需要频繁输血。
“天然存在的核苷间键联”是指3'至5'磷酸二酯键联。
“天然糖部分”是指DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)发现的糖。
“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)和微RNA(miRNA)。
“核碱基”是指能够与另一核酸的碱基配对的杂环部分。
“核碱基序列”是指不依赖于任何糖、键联或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。
“核苷”是指连接至糖的核碱基。
“核苷模拟物”包括用于在低聚化合物的一个或多个位置处置换糖或糖和碱基且不一定置换键联的那些结构，例如像具有吗啉代、环己烯基、环己基、四氢吡喃基、双环或三环糖模拟物(例如非呋喃糖糖单位)的核苷模拟物。
“核苷酸”是指具有共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。
“核苷酸模拟物”包括用于在低聚化合物的一个或多个位置处置换核苷和键联的那些结构，例如像肽核酸或吗啉代类(由-N(H)-C(＝O)-O-或其他非磷酸二酯键连接的N-吗啉基)。
“低聚化合物”或“低聚物”是指包含两个或多个子结构(单体)且能够与核酸分子的区域杂交的多聚结构。在某些实施方案中，低聚化合物为寡核苷。在某些实施方案中，低聚化合物为寡核苷酸。在某些实施方案中，低聚化合物为反义化合物。在某些实施方案中，低聚化合物为反义寡核苷酸。在某些实施方案中，低聚化合物为嵌合寡核苷酸。
“寡核苷酸”是指连接的核苷的聚合物，其中每个可以彼此独立地经修饰或未经修饰。
“胃肠外施用”是指通过注射或输注来施用。胃肠外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。施用可以是连续的，或长期的，或短期的或间歇的。
“肽”是指通过由酰胺键连接至少两个氨基酸而形成的分子。肽是指多肽和蛋白质。
“转铁蛋白的饱和度百分比”是指血清铁与总铁结合能力的比值乘以100。关于可用以结合铁的转铁蛋白分子，该数值告诉临床医生实际结合了多少血清铁。
“药物组合物”是指适于向个体施用的物质的混合物。例如，药物组合物可包含一种或多种活性药剂和无菌水溶液。
“药学上可接受的载体”是指不干扰寡核苷酸的结构的介质或稀释剂。某些所述载体使得药物组合物能够配制成例如由受试者经口摄取的片剂、丸剂、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、浆料、混悬液及锭剂。例如，药学上可接受的载体可以是无菌水溶液，如PBS。
“药学上可接受的衍生物”涵盖本文所述的化合物的药学上可接受的盐、缀合物、前药或异构体。
“药学上可接受的盐”是指反义化合物的生理上和药学上可接受的盐，即保留了母体寡核苷酸的所需生物活性并且不赋予其不希望的毒理学效应的盐。
“硫代磷酸酯键联”是指核苷之间的键联，其中磷酸二酯键通过用硫原子置换非桥联氧原子之一而被修饰。硫代磷酸酯键联为修饰的核苷间键联。
“红细胞增多症”是指在指定体积中由于红血细胞数量增加(绝对红细胞增多症)或血浆体积减小(相对红细胞增多症)所致的红血细胞(RBC)增加的病状。血容量与红血细胞比例可被测量为血细胞比容(Hct)水平。RBC的比例增加可使血液粘稠，这可导致通过循环系统的较慢血液流动以及血凝块的潜在形成。较慢血液流动可使输送至细胞、组织和/或器官的氧气减少，从而导致诸如心绞痛或心力衰竭的疾病、病症或病状。在循环系统中形成血凝块可导致细胞、组织和/或器官损伤，从而导致诸如心肌梗塞或中风的疾病、病症或病状。红细胞增多症的治疗包括静脉切开术或减少RBC产生的药物(例如，INF-α、羟基脲、阿那格雷)。红细胞增多症的实例包括但不限于真性红细胞增多症(PCV)、真性红细胞增多(PRV)和红细胞增多症。在某些情况下，红细胞增多症可进展成受试者的红细胞白血病。
“部分”是指核酸的限定数目的连续(即连接的)核碱基。在某些实施方案中，部分是靶核酸的限定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，部分是反义化合物的限定数目的连续核碱基。
“预防”是指延迟或阻止疾病、病症或病状的发作、发展或进展达数分钟到无限期的时间段。预防还是指降低发展疾病、病症或病状的风险。
“前药”是指以非活性形式制备且在体内或其细胞内通过内源酶或其他化学物质或条件的作用转化成活性形式的治疗剂。
“副作用”是指可归因于治疗的非所需作用的生理应答。在某些实施方案中，副作用包括注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常、肌病和不适。例如，血清中的转氨酶水平升高可指示肝中毒或肝功能异常。
“单链寡核苷酸”是指未与互补链杂交的寡核苷酸。
“可特异性杂交”是指反义化合物与靶核酸之间具有足够的互补度以在需要特异性结合的条件下，即在体内测定及治疗性治疗的状况下于生理条件下诱导所需作用，而对非靶核酸展现极小的影响或无影响。
“皮下施用”是指刚好在皮肤下方的施用。
“靶向”或“靶向的”是指将与靶核酸特异性杂交并诱导所需效应的反义化合物的设计和选择的过程。
“靶核酸”、“靶RNA”和“靶RNA转录物”均是指能够由反义化合物靶向的核酸。
“靶区段”是指反义化合物所靶向的靶核酸的核苷酸的序列。“5’靶位点”是指靶区段的最5’核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段的最3’核苷酸。
“地中海贫血”是指由导致红血细胞的破坏或降解的异常血红蛋白分子形成引起的贫血亚组(例如，α-地中海贫血、β-地中海贫血、δ-地中海贫血、非输血依赖性地中海贫血(NTDT))。地中海贫血的并发症包括过量铁(即由地中海贫血本身或用于治疗地中海贫血的频繁输血造成的血液中的铁超负荷)、感染风险增加、骨畸形、脾脏增大(脾肿大)、生长速率减慢和心脏问题(例如，充血性心力衰竭和心律不齐)。
“治疗有效量”是指向动物提供治疗益处的药剂的量。
“TMPRSS6”(还称为“蛋白裂解酶-2”)是指TMPRSS6的任何核酸或蛋白质。
“TMPRSS6核酸”是指编码TMPRSS6的任何核酸。例如，在某些实施方案中，TMPRSS6核酸包括编码TMPRSS6的DNA序列，从编码TMPRSS6的DNA(包括含有内含子和外显子的基因组DNA转录的RNA序列，以及编码TMPRSS6的mRNA序列。“TMPRSS6 mRNA”是指编码TMPRSS6蛋白的mRNA。
“TMPRSS6特异性抑制剂”是指能够在分子水平上特异性地抑制TMPRSS6基因、TMPRSS6RNA和/或TMPRSS6蛋白的表达的任何试剂。例如，TMPRSS6特异性抑制剂包括核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小分子和其他能够抑制TMPRSS6的水平的试剂。在某些实施方案中，通过特异性地调节TMPRSS6，TMPRSS6特异性抑制剂可影响铁积聚途径的组分。
“治疗”是指向动物施用药物组合物以便实现动物的疾病、病症或病状的改变或改善。在某些实施方案中，可向动物施用一种或多种药物组合物。
“未修饰的核苷酸”是指由天然存在的核碱基、糖部分和核苷间键联组成的核苷酸。在某些实施方案中，未修饰的核苷酸为RNA核苷酸(即，β-D-核糖核苷酸)或DNA核苷酸(即，β-D-脱氧核糖核苷酸)。
某些实施方案
在本文公开的某些实施方案中，TMPRSS6具有如在以下中列出的序列：GenBank登录号NM_153609.2(作为SEQ ID NO:1并入本文)；从16850000至16897000截短的GENBANK登录号NT_011520.12的补体(作为SEQ ID NO:2并入本文)；GENBANK登录号CR456446.1(作为SEQ ID NO:3并入本文)；GENBANK登录号BC039082.1(作为SEQ ID NO:4并入本文)；GENBANK登录号AY358398.1(作为SEQ ID NO:5并入本文)；以及GENBANK登录号DB081153.1(作为SEQID NO:6并入本文)。
本文公开的某些实施方案提供包含靶向编码TMPRSS6的核酸序列的修饰的寡核苷酸的化合物。在某些实施方案中，所述化合物靶向如在SEQ ID NO:1-6中的任一个的核碱基序列中所示的TMPRSS6序列。
本文公开的某些实施方案提供一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含与SEQ IDNO:1-6的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
本文公开的某些实施方案提供一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含与SEQ IDNO:1的核碱基3162至3184的等长部分互补的至少8个连续核碱基的部分，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。
本文公开的某些实施方案提供一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含与SEQ IDNO:1的核碱基1286至1305的等长部分互补的至少8个连续核碱基的部分，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。
本文公开的某些实施方案提供一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含与SEQ IDNO:1的核碱基3162至3184的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的部分，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。
本文公开的某些实施方案提供一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含与SEQ IDNO:1的核碱基1286至1305的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的部分，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。
本文公开的某些实施方案提供一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ IDNO:7-85的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
本文公开的某些实施方案提供一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ IDNO:23、36、37、63、77的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
本文公开的某些实施方案提供一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ IDNO:36的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
本文公开的某些实施方案提供一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ IDNO:77的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1-6中的任一个的等长部分至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸包含与SEQID NO:1-6中的任一个的等长部分100％互补的核碱基序列。
在某些实施方案中，所述化合物包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由8至80个、20至80个、10至50个、20至35个、10至30个、12至30个、15至30个、16至30个、20至30个、20至29个、20至28个、20至27个、20至26个、20至25个、20至24个、20至23个、20至22个、20至21个、15至25个、16至25个、15至24个、16至24个、17至24个、18至24个、19至24个、19至22个、16至21个、18至21个或16至20个连接的核碱基组成。在某些实施方案中，所述化合物包含由16个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，所述化合物包含由20个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸。
在某些实施方案中，所述化合物包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个或80个连接的核碱基长度，或处于由任何两个上述值所界定的范围组成。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸是单链的。
在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，所述修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，至少一个修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，每个修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸包含至少一个包含修饰的糖的核苷。在某些实施方案中，至少一个修饰的糖包含双环糖。在某些实施方案中，至少一个修饰的糖包含2’-O-甲氧基乙基、受限的乙基、3’-氟-HNA或4’-(CH2)n-O-2’桥，其中n是1或2。
在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸包含至少一个包含修饰的核碱基的核苷。在某些实施方案中，修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸包含缀合物基团。在某些实施方案中，所述缀合物是碳水化合物部分。在某些实施方案中，所述缀合物是GalNAc部分。在某些实施方案中，GalNAc是5'-三己基氨基-(THA)-C6GalNAc3。在某些实施方案中，所述缀合物具有式
在某些实施方案中，所述化合物包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且靶向SEQ ID NO:1的区域3162至3184的等长部分或与SEQ IDNO:1的区域3162至3184的等长部分互补，其中所述修饰的寡核苷酸包含：(a)由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由连接的核苷组成的5’翼区段；以及(c)由连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于紧邻且介于5’翼区段与3’翼区段之间，并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸还包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸还包含GalNAc缀合物。在某些实施方案中，所述缀合物是5'-三己基氨基-(THA)-C6 GalNAc3缀合物。
在某些实施方案中，所述化合物包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且靶向SEQ ID NO:1的区域1286至1305的等长部分或与SEQ IDNO:1的区域1286至1305的等长部分互补，其中所述修饰的寡核苷酸包含：(a)由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由连接的核苷组成的5’翼区段；以及(c)由连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于紧邻且介于5’翼区段与3’翼区段之间，并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸还包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸还包含GalNAc缀合物。在某些实施方案中，所述缀合物是5'-三己基氨基-(THA)-C6 GalNAc3缀合物。
在某些实施方案中，所述化合物包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成并且靶向SEQ ID NO:1的区域3162至3181的等长部分或与SEQ ID NO:1的区域3162至3181的等长部分互补，其中所述修饰的寡核苷酸包含：(a)由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由5个连接的核苷组成的5’翼区段；以及(c)由5个连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于紧邻且介于5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中至少一个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸还包含GalNAc缀合物。在某些实施方案中，所述缀合物是5'-三己基氨基-(THA)-C6GalNAc3缀合物。
在某些实施方案中，所述化合物包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成并且靶向SEQ ID NO:1的区域3169至3184的等长部分或与SEQ ID NO:1的区域3169至3184的等长部分互补，其中所述修饰的寡核苷酸包含：(a)由9个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由3个连接的核苷组成的5’翼区段；以及(c)由4个连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于紧邻且介于5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖，其中每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸还包含GalNAc缀合物。在某些实施方案中，所述缀合物是5'-三己基氨基-(THA)-C6GalNAc3缀合物。
在某些实施方案中，所述化合物包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:36的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰的寡核苷酸包含：(a)由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由5个连接的核苷组成的5’翼区段；以及(c)由5个连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于紧邻且介于5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中至少一个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸还包含GalNAc缀合物。在某些实施方案中，所述缀合物是5'-三己基氨基-(THA)-C6GalNAc3缀合物。
在某些实施方案中，所述化合物包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:77的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰的寡核苷酸包含：(a)由9个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由3个连接的核苷组成的5’翼区段；以及(c)由4个连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于紧邻且介于5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖，其中每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸还包含GalNAc缀合物。在某些实施方案中，所述缀合物是5'-三己基氨基-(THA)-C6GalNAc3缀合物。
本文公开的某些实施方案提供一种化合物，其包含根据下式的修饰的寡核苷酸：mCes Teo Teo Teo Aeo Tds Tds mCds mCds Ads Ads Ads Gds Gds Gds mCeo Aeo GesmCes Te(SEQ ID NO:36)；其中，A是腺嘌呤，mC是5-甲基胞嘧啶，G是鸟嘌呤，T是胸腺嘧啶，e是2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，d是2’-脱氧核苷，并且s是硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸还包含GalNAc缀合物。在某些实施方案中，所述缀合物是5'-三己基氨基-(THA)-C6GalNAc3缀合物。
本文公开的某些实施方案提供包含具有下式的修饰的寡核苷酸的化合物：
本文公开的某些实施方案提供一种化合物，其包含根据下式的修饰的寡核苷酸：mCks Aes Gks mCds Tds Tds Tds Ads Tds Tds mCds mCds Aes Aes Aks Gk(SEQ ID NO:77)；其中，A是腺嘌呤，mC是5-甲基胞嘧啶，G是鸟嘌呤，T是胸腺嘧啶，e是2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，d是2’-脱氧核苷，s是硫代磷酸酯核苷间键联，并且k是cEt。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸还包含GalNAc缀合物。在某些实施方案中，所述缀合物是5'-三己基氨基-(THA)-C6 GalNAc3缀合物。
本文公开的某些实施方案提供包含具有下式的修饰的寡核苷酸的化合物：
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物包含修饰的寡核苷酸的盐。
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物还包含药学上可接受的载体或稀释剂。
在某些实施方案中，动物是人。
某些实施方案提供包含如本文所述的修饰的寡核苷酸的组合物或化合物，其中粘度水平小于40cP。在某些实施方案中，所述组合物具有小于15cP的粘度水平。在某些实施方案中，所述组合物具有小于12cP的粘度水平。在某些实施方案中，所述组合物具有小于10cP的粘度水平。
本文公开的某些实施方案提供包含靶向TMPRSS6的修饰的寡核苷酸的化合物和组合物，其用于减少细胞、组织、器官或动物中的TMPRSS6。
本文公开的某些实施方案提供包含靶向TMPRSS6的修饰的寡核苷酸的化合物和组合物，其用于降低细胞、组织、器官或动物中的铁水平。在某些实施方案中，所述化合物和组合物降低血清铁水平。在某些实施方案中，所述化合物和组合物降低肝铁水平。在某些实施方案中，所述化合物和组合物降低铁吸收。在某些实施方案中，所述化合物和组合物降低铁超负荷或积聚。在某些实施方案中，降低铁超负荷/积聚改善、治疗、预防或延迟与铁超负荷相关的疾病、病症或病状。
本文公开的某些实施方案提供包含靶向TMPRSS6的修饰的寡核苷酸的化合物和组合物，其用于提高动物中的铁调素水平，如mRNA或蛋白质表达水平。
本文公开的某些实施方案提供包含靶向TMPRSS6的修饰的寡核苷酸的化合物和组合物，其用于降低动物中的转铁蛋白饱和度百分比。在某些实施方案中，降低转铁蛋白饱和度导致用于红细胞生成的铁供应的降低。在某些实施方案中，红细胞生成的减少可治疗、预防动物中的红细胞增多症或其症状，延迟动物中的红细胞增多症或其症状的发作，改善和/或减轻动物中的红细胞增多症或其症状。在某些实施方案中，红细胞增多症是真性红细胞增多症。在某些实施方案中，用靶向TMPRSS6的修饰的寡核苷酸治疗预防或延迟红细胞增多症进展成红细胞白血病。
本文公开的某些实施方案提供用于减少动物中的铁积聚的化合物和组合物，所述化合物和组合物包含靶向TMPRSS6的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，包含靶向TMPRSS6的修饰的寡核苷酸的化合物和组合物用于治疗、预防与动物中的铁过量积聚相关的疾病、病症和/或病状或其症状，减缓所述疾病、病症和/或病状或其症状的进展，延迟所述疾病、病症和/或病状或其症状的发作，改善和/或减轻所述疾病、病症和/或病状或其症状。
在某些实施方案中，铁积聚是动物中的疾病、病症或病状的结果或原因。在某些实施方案中，所述疾病、病症或病状是无效红细胞生成、红细胞增多症、血色素沉着症或贫血。在某些实施方案中，血色素沉着症是遗传性血色素沉着症。在某些实施方案中，贫血是遗传性贫血、骨髓增生异常综合征或严重慢性溶血。在某些实施方案中，遗传性贫血是镰状细胞性贫血、地中海贫血、范可尼贫血、戴-布二氏贫血、舒-戴二氏综合征、红细胞膜障碍、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏，或遗传性出血性毛细血管扩张症。在某些实施方案中，地中海贫血是β-地中海贫血。在某些实施方案中，β-地中海贫血是重型β-地中海贫血、中间型β-地中海贫血或轻型β-地中海贫血。在某些实施方案中，所述疾病、病症或病状与HFE基因中的突变相关。在其他实施方案中，所述疾病与血幼素基因中的突变相关。在其他实施方案中，所述疾病与铁调素基因中的突变相关。
在某些实施方案中，铁积聚是用于治疗动物中的疾病、病症或病状的疗法的结果。在某些实施方案中，所述疗法是静脉切开术或输血疗法。在某些实施方案中，所述疾病、病症和/或病状可以是由于多次输血所致。在某些实施方案中，多次输血可导致红细胞增多症。在某些实施方案中，多次输血与患有贫血的动物相关。需要多次输血的贫血实例是遗传性贫血、骨髓增生异常综合征和严重慢性溶血。
在某些实施方案中，所述疾病、病症和/或病状与过量胃肠外铁补充剂摄入或过量膳食铁摄入相关。
在某些实施方案中，提供包含靶向TMPRSS6的修饰的寡核苷酸的化合物和组合物，其用于疗法中。在某些实施方案中，所述包含靶向TMPRSS6的修饰的寡核苷酸的化合物和组合物以治疗有效量施用至动物。
在某些实施方案中，提供包含靶向TMPRSS6的修饰的寡核苷酸的化合物和组合物，其用于制备药物。在某些实施方案中，所述药物用于治疗、预防与动物中的铁过量积聚相关的疾病、病症和/或病状或其症状，减缓所述疾病、病症和/或病状或其症状的进展，延迟所述疾病、病症和/或病状或其症状的发作，和/或减轻所述疾病、病症和/或病状或其症状。
在某些实施方案中，所述包含靶向TMPRSS6的修饰的寡核苷酸的组合物或化合物与一种或多种第二药剂共同施用。在某些实施方案中，第二药剂是铁螯合剂或铁调素激动剂。在其他实施方案中，铁螯合剂包括FBS0701(FerroKin)、地拉罗司(Exjade)、除铁灵(Desferal)或去铁酮(Deferiprone)(DFP)。在某些实施方案中，第二药剂是第二反义化合物。在其他实施方案中，第二反义化合物靶向TMPRSS6。在其他实施方案中，第二反义化合物靶向非TMPRSS6化合物。在其他实施方案中，所述包含靶向TMPRSS6的修饰的寡核苷酸的组合物或化合物在静脉切开术或输血疗法之前、期间或之后施用。
反义化合物
低聚化合物包括但不限于寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义化合物、反义寡核苷酸和siRNA。低聚化合物可以是靶核酸的“反义序列”，意味着其能够与靶核酸经由氢键合进行杂交。
在某些实施方案中，反义化合物具有在按5'至3'方向书写时包含其所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列的核碱基序列。在某些这类实施方案中，反义寡核苷酸具有在按5'至3'方向书写时包含其所靶向的靶核酸的靶段的反向互补序列的核碱基序列。
在某些实施方案中，靶向TMPRSS6核酸的反义化合物的长度为10至30个核苷酸。换句话说，反义化合物为10至30个连接的核碱基。在其他实施方案中，反义化合物包含由8至80个、10至80个、12至50个、15至30个、18至24个、19至22个或20个连接的核碱基组成的修饰的寡核苷酸。在某些这类实施方案中，反义化合物包含由8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个或80个连接的核碱基长度，或处于由任何两个上述值所界定的范围组成的修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，反义化合物为反义寡核苷酸。
在某些实施方案中，反义化合物包括缩短或截短的修饰的寡核苷酸。缩短或截短的修饰的寡核苷酸可从5’端(5'截短)、中心部分或可替代地3’端(3'截短)缺失单个核苷。缩短或截短的寡核苷酸可从5'端缺失两个或多个核苷、从中心部分缺失两个或多个核苷，或可替代地可从3'端缺失两个或多个核苷。或者，缺失的核苷可散布于整个修饰的寡核苷酸中，例如在从5'端缺失一个或多个核苷、从中心部分缺失一个或多个核苷和/或从3'端缺失一个或多个核苷的反义化合物中。
当单一额外核苷存在于延长的寡核苷酸中时，额外核苷可位于寡核苷酸的5'端、3'端或中心部分。当存在两个或多个额外核苷时，所添加的核苷可彼此邻近，例如在寡核苷酸的5'端(5'添加)、3'端(3'添加)中心部分添加有两个核苷的寡核苷酸中。或者，所添加的核苷可散布于整个反义化合物中，例如在5'端添加有一个或多个核苷、3'端添加有一个或多个核苷和/或中心部分添加有一个或多个核苷的寡核苷酸中。
有可能增加或减少反义化合物(如反义寡核苷酸)的长度和/或引入错配碱基而不消除活性。例如，在Woolf等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7305-7309,1992)中，测试长度为13-25个核碱基的一系列反义寡核苷酸在卵母细胞注射模型中诱导靶RNA裂解的能力。长度为25个核碱基且在接近反义寡核苷酸的末端处具有8或11个错配碱基的反义寡核苷酸能够导引靶mRNA进行特异性裂解，但程度低于不含错配的反义寡核苷酸。同样，靶标特异性裂解可使用具有13个核碱基的反义寡核苷酸(包括具有1或3个错配者)达成。
Gautschi等人(J.Natl.Cancer Inst.93:463-471,March 2001)表明与bcl-2mRNA具有100％互补性且与bcl-xL mRNA具有3个错配的寡核苷酸在体外及体内减少bcl-2及bcl-xL两者的表达的能力。此外，这种寡核苷酸展现有效的体内抗肿瘤活性。
Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)分别测试一系列具有14个核碱基的串联反义寡核苷酸以及包含所述串联反义寡核苷酸中的两个或三个的序列的具有28个及42个核碱基的反义寡核苷酸在家兔网织红细胞测定中阻止人DHFR转译的能力。3个具有14个核碱基的反义寡核苷酸各自能够单独抑制转译，但程度相较于具有28个或42个核碱基的反义寡核苷酸而言更适中。
某些反义化合物基序和机制
在某些实施方案中，反义化合物具有排列成一定型态或基序的化学上修饰的亚单位，以赋予反义化合物以诸如抑制活性增强、对靶核酸的结合亲和力增强或对由体内核酸酶引起的降解具抗性的性质。
嵌合反义化合物通常含有至少一个修饰的以赋予增强的核酸酶降解抗性、增加的细胞吸收、增强的对靶核酸的结合亲和力和/或增强的抑制活性的区。嵌合反义化合物的第二区可赋予另一个所需的性质，例如用作细胞核酸内切酶RNA酶H的底物，所述酶裂解RNA:DNA双螺旋体的RNA链。
反义活性可以从涉及反义化合物(例如，寡核苷酸)与靶核酸的杂交的任何机制获得，其中杂交最终产生生物作用。在某些实施方案中，调节靶核酸的量和/或活性。在某些实施方案中，减少靶核酸的量和/或活性。在某些实施方案中，反义化合物与靶核酸的杂交最终导致靶核酸降解。在某些实施方案中，反义化合物与靶核酸的杂交未导致靶核酸降解。在某些实施方案中，反义化合物与靶核酸杂交的出现(占位)导致反义活性的调节。在某些实施方案中，具有特定化学基序或化学修饰的模式的反义化合物特别适合采用一种或多种机制。在某些实施方案中，反义化合物通过一种以上的机制和/或通过从未被阐述的机制起作用。因此，本文所述的反义化合物不限于特定机制。
反义机制包括但不限于RNA酶H介导的反义；RNAi机制，其利用RISC途径并且包括但不限于siRNA、ssRNA和微RNA机制；以及占位型机制。某些反义化合物可通过一种以上的此机制和/或通过另外的机制起作用。
RNA酶H介导的反义
在某些实施方案中，反义活性通过RNA酶H导致靶RNA的至少部分地裂解。RNA酶H为裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。本领域已知“DNA样”的单链反义化合物在哺乳动物细胞中引发RNA酶H活性。因此，包含DNA或DNA状核苷的至少一部分的反义化合物可激活RNA酶H，导致靶核酸的裂解。在某些实施方案中，利用RNA酶H的反义化合物包含一种或多种修饰核苷。在某些实施方案中，此类反义化合物包含至少一个1-8修饰核苷的嵌段。在某些实施方案中，修饰核苷不支持RNA酶H活性。在某些实施方案中，此类反义化合物为如本文所述的缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口包含DNA核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口包含DNA样核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口包含DNA核苷和DNA样核苷。
具有缺口聚物基序的某些反义化合物被认为是嵌合反义化合物。在缺口聚物中，具有多个支持RNA酶H裂解的核苷酸的内部区位于具有多个在化学上与内部区的核苷不同的核苷酸的外部区之间。在具有缺口聚物基序的反义寡核苷酸的状况下，缺口区段一般用作核酸内切酶裂解的底物，而翼区段包含修饰的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的区由构成每个相异区的糖部分的类型来区分。用于区分缺口聚物的每个区的糖部分的类型在一些实施方案中可包括β-D-核糖核苷、β-D-脱氧核糖核苷、2'-修饰的核苷(此2'-修饰的核苷可尤其包括2'-MOE和2’-O-CH3)，以及双环糖修饰的核苷(此双环糖修饰的核苷可包括具有限制性乙基的核苷)。在某些实施方案中，翼中的核苷可包括若干修饰的糖部分，包括例如2'-MOE和双环糖部分，如限制性乙基(cEt)或LNA。在某些实施方案中，翼可包括若干修饰的和未修饰的糖部分。在某些实施方案中，翼可包括2'-MOE核苷、双环糖部分(如限制性乙基核苷或LNA核苷)及2'-脱氧核苷的各种组合。
每个相异区可包含均一糖部分、变体或交替的糖部分。翼-缺口-翼基序常被描述为“X-Y-Z”，其中“X”表示5'翼的长度，“Y”表示缺口的长度，且“Z”表示3'翼的长度。“X”及“Z”可包含均一、变体或交替的糖部分。在某些实施方案中，“X”和“Y”可包含一个或多个2'-脱氧核苷。“Y”可包含2’-脱氧核苷。本文所用的描述为“X-Y-Z”的缺口聚物具有一定构型以使缺口位于紧邻5'翼及3'翼中的每一个。因此，在5'翼与缺口之间，或缺口与3'翼之间不存在介入的核苷酸。本文所述的任何反义化合物均可具有缺口聚物基序。在某些实施方案中，“X”与“Z”相同；在其他实施方案中，它们不同。在某些实施方案中，“Y”为8至15个核苷。X、Y或Z可为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个或超过30个核苷中的任一个。
在某些实施方案中，靶向TMPRSS6核酸的反义化合物具有其中缺口由6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个连接的核苷组成的缺口聚物基序。
在某些实施方案中，反义寡核苷酸具有由如下的式A描述的糖基序：(J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z
其中：
每个A独立地为2'-取代的核苷；
每个B独立地为双环核苷；
每个J独立地为2'-取代的核苷或2'-脱氧核苷；
每个D为2'-脱氧核苷；
m为0-4；n为0-2；p为0-2；r为0-2；t为0-2；v为0-2；w为0-4；x为0-2；y为0-2；z为0-4；g为6-14；
其限制条件为：
m、n及r中的至少一个不为0；
w和y中的至少一个不为0；
m、n、p、r及t的总和为2至5；并且
v、w、x、y及z的总和为2至5。
RNAi化合物
在某些实施方案中，反义化合物干扰RNA化合物(RNAi)，所述RNA化合物包括双链RNA化合物(也称为短干扰RNA或siRNA)和单链RNAi化合物(或ssRNA)。此化合物至少部分地通过RISC途径起作用以降解和/或螯合靶核酸(因此包括微RNA/微RNA模拟化合物)。在某些实施方案中，反义化合物包含使其特别适合于此机制的修饰。
i:ssRNA化合物
在某些实施方案中，包括特别适合用作单链RNAi化合物(ssRNA)的那些的反义化合物包含修饰的5’末端。在某些实施方案中，5’末端包含修饰的磷酸酯部分。在某些实施方案中，此修饰的磷酸酯是稳定的(例如，与未修饰的5’磷酸酯相比，对降解/裂解有抗性)。在某些实施方案中，此5’末端核苷使5’磷酸酯部分保持稳定。某些修饰的5’末端核苷可见于本领域，例如WO2011/139702中。
在某些实施方案中，ssRNA化合物的5’核苷具有式IIc：
其中：
T1为任选保护的磷部分；
T2为连接式IIc的化合物与低聚化合物的核苷间连接基团；
A具有下式的一个：
Q1和Q2各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或N(R3)(R4)；
Q3为O、S、N(R5)或C(R6)(R7)；
各R3、R4、R5、R6和R7独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基或C1-C6烷氧基；
M3为O、S、NR14、C(R15)(R16)、C(R15)(R16)C(R17)(R18)、C(R15)＝C(R17)、OC(R15)(R16)或OC(R15)(Bx2)；
R14为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
R15、R16、R17和R18各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
Bx1为杂环碱基部分；
或如果Bx2存在，则Bx2为杂环碱基部分且Bx1为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
J4、J5、J6和J7各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
或J4与J5或J7中的一个形成桥，其中所述桥包含1至3个选自以下的连接的双基：O、S、NR19、C(R20)(R21)、C(R20)＝C(R21)、C[＝C(R20)(R21)]和C(＝O)，且J5、J6和J7中的其他两个各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
各R19、R20和R21独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
G为H、OH、卤素或O-[C(R8)(R9)]n-[(C＝O)m-X1]j-Z；
各R8和R9独立地为H、卤素、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
X1为O、S或N(E1)；
Z为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或N(E2)(E3)；
E1、E2和E3各自独立地为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
n为1至约6；
m为0或1；
j为0或1；
每个取代基包含一个或多个任选受保护的取代基，所述取代基独立地选自卤素、OJ1、N(J1)(J2)、＝NJ1、SJ1、N3、CN、OC(＝X2)J1、OC(＝X2)N(J1)(J2)以及C(＝X2)N(J1)(J2)；
X2为O、S或NJ3；
各J1、J2和J3独立的为H或C1-C6烷基；
当j为1时，则Z不为卤素或N(E2)(E3)；以及
其中所述低聚化合物包含8至40个单体亚单位并且与靶核酸的至少一部分是可杂交的。
在某些实施方案中，M3为O、CH＝CH、OCH2或OC(H)(Bx2)。在某些实施方案中，M3为O。
在某些实施方案中，J4、J5、J6和J7各自为H。在某些实施方案中，J4与J5或J7中的一者形成桥。
在某些实施方案中，A具有下式的一个：
其中：
Q1和Q2各自独立的为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或取代的C1-C6烷氧基。在某些实施方案中，Q1和Q2各自为H。在某些实施方案中，Q1和Q2各自独立地为H或卤素。在某些实施方案中，Q1和Q2为H，并且Q1和Q2中的另一者为F、CH3或OCH3。
在某些实施方案中，T1具有下式：
其中：
Ra和Rc各自独立地为保护的羟基、保护的巯基、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、保护的氨基或取代的氨基；以及
Rb为O或S。在某些实施方案中，Rb为O且Ra和Rc各自独立地为OCH3、OCH2CH3或CH(CH3)2。
在某些实施方案中，G为卤素、OCH3、OCH2F、OCHF2、OCF3、OCH2CH3、O(CH2)2F、OCH2CHF2、OCH2CF3、OCH2-CH＝CH2、O(CH2)2-OCH3、O(CH2)2-SCH3、O(CH2)2-OCF3、O(CH2)3-N(R10)(R11)、O(CH2)2-ON(R10)(R11)、O(CH2)2-O(CH2)2-N(R10)(R11)、OCH2C(＝O)-N(R10)(R11)、OCH2C(＝O)-N(R12)-(CH2)2-N(R10)(R11)或O(CH2)2-N(R12)-C(＝NR13)[N(R10)(R11)]，其中R10、R11、R12和R13各自独立地为H或C1-C6烷基。在某些实施方案中，G为卤素、OCH3、OCF3、OCH2CH3、OCH2CF3、OCH2-CH＝CH2、O(CH2)2-OCH3、O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2、OCH2C(＝O)-N(H)CH3、OCH2C(＝O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2或OCH2-N(H)-C(＝NH)NH2。在某些实施方案中，G为F、OCH3或O(CH2)2-OCH3。在某些实施方案中，G为O(CH2)2-OCH3。
在某些实施方案中，5’末端核苷具有式IIe：
在某些实施方案中，反义化合物(包括特别适合于ssRNA的那些)包含以限定的模式或糖修饰基序沿着寡核苷酸或其区布置的一种或多种类型的修饰的糖部分和/或天然存在的糖部分。所述基序可包括本文讨论的任何糖修饰和/或其他已知的糖修饰。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有均匀糖修饰的区或者由具有均匀糖修饰的区组成。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均包含相同的RNA样糖修饰。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为2’-F核苷。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为2’-OMe核苷。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为2’-MOE核苷。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为cEt核苷。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为LNA核苷。在某些实施方案中，统一区构成了寡核苷酸的全部或基本上全部。在某些实施方案中，所述区构成了全部寡核苷酸，除1-4个末端核苷之外。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含重复糖修饰的一个或多个区，其中所述核苷在具有第一类型的糖修饰的核苷与具有第二类型的糖修饰的核苷之间交替。在某些实施方案中，两种类型的核苷均为RNA样核苷。在某些实施方案中，交替核苷选自2’-OMe、2’-F、2’-MOE、LNA以及cEt。在某些实施方案中，交替修饰为2’-F和2’-OMe。此类区可以是连续的或可以夹杂不同修饰的核苷或缀合核苷。
在某些实施方案中，交替修饰的交替区各自由单个核苷组成(即模式为(AB)xAy，其中A为具有第一类型的糖修饰的核苷并且B为具有第二类型的糖修饰的核苷；x为1-20并且y为0或1)。在某些实施方案中，交替基序中的一个或多个交替区包括不只一种类型的单个核苷。例如，寡核苷酸可包括以下核苷基序中的任一个的一个或多个区：
AABBAA、
ABBABB、
AABAAB、
ABBABAABB、
ABABAA、
AABABAB、
ABABAA、
ABBAABBABABAA、
BABBAABBABABAA或
ABABBAABBABABAA；
其中，A为第一类型的核苷并且B为第二类型的核苷。在某些实施方案中，A和B各自选自2’-F、2’-OMe、BNA以及MOE。
在某些实施方案中，具有此交替基序的寡核苷酸还包含修饰的5’末端核苷，诸如式IIc或IIe的那些。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含具2-2-3基序的区。此类区包含以下基序：
-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3-
其中：A为第一类型的修饰核苷；
B和C为具有与A不同修饰的核苷，然而，B和C两者彼此可具有相同或不同的修饰；
x和y为1至15。
在某些实施方案中，A为2'-OMe修饰核苷。在某些实施方案中，B和C两者均为2’-F修饰核苷。在某些实施方案中，A为2'-OMe修饰核苷并且B和C两者均为2’-F修饰核苷。
在某些实施方案中，寡核苷酸具有以下糖基序：
5’-(Q)-(AB)xAy-(D)z
其中：
Q为包含稳定的磷酸酯部分的核苷。在某些实施方案中，Q为具有式IIc或IIe的核苷；
A为第一类型的修饰核苷；
B为第二类型的修饰核苷；
D为包含与其邻近的核苷不同的修饰的经修饰核苷。因此，如果y为0，那么D与B必须是不同修饰的并且如果y为1，那么D与A必须是不同修饰的。在某些实施方案中，D不同于A和B两者。
X为5-15；
Y为0或1；
Z为0-4。
在某些实施方案中，寡核苷酸具有以下糖基序：
5’-(Q)-(A)x-(D)z
其中：
Q为包含稳定的磷酸酯部分的核苷。在某些实施方案中，Q为具有式IIc或IIe的核苷；
A为第一类型的修饰核苷；
D为包含不同于A的修饰的修饰核苷。
X为11-30；
Z为0-4。
在某些实施方案中，以上基序中的A、B、C以及D选自：2’-OMe、2’-F、2’-MOE、LNA以及cEt。在某些实施方案中，D表示末端核苷。在某些实施方案中，此类末端核苷不被设计来与靶核酸杂交(尽管一个或多个可能偶然杂交)。在某些实施方案中，每个D核苷的核碱基为腺嘌呤，与靶核酸的相应位置处的核碱基的同一性无关。在某些实施方案中，每个D核苷的核碱基为胸腺嘧啶。
在某些实施方案中，包括特别适合用作ssRNA的那些的反义化合物包含以限定的模式或修饰的核苷间键联基序沿着寡核苷酸或其区布置的修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有交替的核苷间键联基序的区。在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有统一修饰的核苷间键联的区。在某些所述实施方案中，寡核苷酸包含通过硫代磷酸酯核苷间键联统一连接的区。在某些实施方案中，寡核苷酸通过硫代磷酸酯核苷间键联统一连接。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯并且至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少6个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少8个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少10个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少6个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少8个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少10个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少12个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端的3个核苷内。
具有本文所述的各种糖基序中的任一个的寡核苷酸可以具有任何键联基序。例如，包括但不限于以上所述的那些的寡核苷酸可以具有选自非限制性下表的键联基序：
5’最末端键联 中心区 3’区
PS 交替PO/PS 6PS
PS 交替PO/PS 7PS
PS 交替PO/PS 8PS
ii.siRNA化合物
在某些实施方案中，反义化合物为双链RNAi化合物(siRNA)。在此类实施方案中，一条或两条链可以包含针对ssRNA的以上所述的任何修饰基序。在某些实施方案中，ssRNA化合物可以是未修饰的RNA。在某些实施方案中，siRNA化合物可以包含未修饰的RNA核苷，但是是修饰的核苷间键联。
若干实施方案涉及双链组合物，其中每条链包含由一个或多个修饰或未修饰的核苷的位置限定的基序。在某些实施方案中，提供包含完全或至少部分杂交以形成双链体的第一和第二低聚化合物并且还包含与核酸目标互补并且杂交的区的组合物。此组合物包含第一低聚化合物(其为与核酸目标具有完全或部分互补性的反义链)和第二低聚化合物(其为与第一低聚化合物的一个或多个区具有互补性并且形成至少一个双链体区的有义链)是合适的。
若干实施方案的所述组合物通过与核酸目标杂交调节基因表达，从而导致正常功能的损失。在一些实施方案中，靶核酸是TMPRSS6。在某些实施方案中，通过用本发明的组合物形成的活化的RISC复合物促进靶向TMPRSS6的降解。
若干实施方案涉及双链组合物，其中所述链中的一条用于例如影响相反的链优选装载入(或裂解)RISC复合物中。所述组合物用于靶向所选择的核酸分子并且调节一个或多个基因的表达。在一个实施方案中，本发明的组合物与靶RNA的一部分杂交，导致靶RNA的正常功能的损失。
若干实施方案涉及双链组合物，其中两条链均包括半修饰基序、完全修饰的基序、定位修饰的基序或交替基序。本发明的组合物的每条链可被修饰以在例如siRNA途径中充当特定的角色。使用每条链中的不同基序或每条链中具有不同化学修饰的相同基序使得靶向RISC复合物的反义链，同时抑制有义链的并入。在该模型中，每条链可以独立地被修饰以使得增强其特定的作用。反义链可以在5'末端进行修饰以增强在RISC的一个区的作用，而3'末端可以进行不同修饰以增强在RISC的不同区域的作用。
双链寡核苷酸分子可以是包含自身互补的有义和反义区的双链多核苷酸分子，其中反义区包含与靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区具有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列。双链寡核苷酸分子可以由两个单独的寡核苷酸组装，其中一条链是有义链并且另一条链是反义链，其中反义链和有义链是自身互补的(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；诸如其中反义链和有义链形成双链体或双链结构，例如其中双链区为约15至约30，例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对；反义链包括与靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义链包含与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列(例如，双链寡核苷酸分子的约15至约25个或多个核苷酸与靶核酸或其一部分互补)。或者，双链寡核苷酸由单一寡核苷酸组装，其中siRNA的自身互补的有义和反义区借助于基于核酸或不基于核酸的接头连接。
双链寡核苷酸可以是具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，其具有自身互补的有义和反义区，其中反义区包含与单独的靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区具有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列。双链寡核苷酸可以是具有两个或多个环结构以及茎的环形单链多核苷酸，所述主干包含自身互补的有义和反义区，其中反义区包括与靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区具有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列，并且其中环形多核苷酸可以在体内或体外处理产生能够介导RNAi的活性siRNA分子。
在某些实施方案中，双链寡核苷酸包含分开的有义和反义序列或区，其中有义和反义区通过如本领域已知的核苷酸或非核苷酸接头分子共价连接，或者可替代地通过离子相互作用、氢键合、范德华相互作用、疏水性相互作用和/或堆积相互作用非共价连接。在某些实施方案中，双链寡核苷酸包含与靶基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一个实施方案中，双链寡核苷酸以引起靶基因表达抑制的方式来与靶基因的核苷酸序列相互作用。
如本文所用，双链寡核苷酸无需限于仅含有RNA的那些分子，而是进一步涵盖化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在某些实施方案中，短干扰核酸分子缺乏含有2'-羟基(2'-OH)的核苷酸。在某些实施方案中，短干扰核酸任选地不包括任何核糖核苷酸(例如，具有2'-OH基团的核苷酸)。然而，不要求分子内存在核糖核苷酸来支持RNAi的这类双链寡核苷酸可以具有连接的一个或多个接头或其他连接或缔合的基团、部分或含有一个或多个具有2'-OH基团的核苷酸的链。任选地，双链寡核苷酸可以在约5％、10％、20％、30％、40％或50％的核苷酸位置上包括核糖核苷酸。如本文所用，术语siRNA是指等同于用来描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其他术语，例如，短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)以及其他。此外，如本文所用，术语RNAi是指等同于用来描述序列特异性RNA干扰，诸如转录后基因沉默、转录抑制或表观遗传的其他术语。例如，双链寡核苷酸可以以转录后水平和转录前水平二者用于表观遗传学沉默基因。在非限制性实例中，通过本发明的siRNA分子表观遗传学调节基因表达可以由染色质结构的siRNA介导的修饰或甲基化模式以改变基因表达导致(参见例如，Verdel等,2004,Science,303,672-676；Pal-Bhadra等,2004,Science,303,669-672；Allshire,2002,Science,297,1818-1819；Volpe等,2002,Science,297,1833-1837；Jenuwein,2002,Science,297,2215-2218以及Hall等,2002,Science,297,2232-2237)。
可以设想本文提供的若干实施方案的化合物和组合物可以通过dsRNA介导的基因沉默或RNAi机制靶向TMPRSS6，包括例如“发夹”或茎-环双链RNA效应分子，其中具有自身互补序列的单个RNA链能够形成双链构型或包含两个单独的RNA链的双链体dsRNA效应分子。在各种实施方案中，dsRNA完全由核糖核苷酸组成或由核糖核苷酸和脱氧核苷酸的混合物(诸如例如通过2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的美国序列号60/130,377所公开的RNA/DNA杂合体)组成。dsRNA或dsRNA效应分子可以是具有自身互补性的区的单个分子使得分子的一个区段中的核苷酸与分子的另一个区段中的核苷酸进行碱基配对。在各种实施方案中，由单个分子组成的dsRNA完全由核糖核苷酸组成或包括与脱氧核糖核苷酸的区互补的核糖核苷酸的区。或者，dsRNA可以包括具有彼此互补的区的两个不同的链。
在各种实施方案中，两条链完全由核糖核苷酸组成，一条链完全由核糖核苷酸组成并且一条链完全由脱氧核糖核苷酸组成，或者一条或两条链含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。在某些实施方案中，互补的区彼此或与靶核酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、98％或100％互补性。在某些实施方案中，以双链构型存在的dsRNA的区包括至少19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、50、75、100、200、500、1000、2000或5000个核苷酸或者包括所有的cDNA中或由dsRNA表示的其他靶核酸序列中的核苷酸。在一些实施方案中，dsRNA不含有任何单链区诸如单链区末端或者dsRNA为发夹。在其他实施方案中，dsRNA具有一个或多个单链区或突出端。在某些实施方案中，RNA/DNA杂合体包括为反义链或区的DNA链或区(例如，与靶核酸具有至少70、80、90、95、98或100％互补性)以及为有义链或区的RNA链或区(例如，与靶核酸具有至少70、80、90、95、98或100％互补性)，并且反之亦然。
在各种实施方案中，RNA/DNA杂合体是使用酶法或化学合成方法诸如本文所述的那些或在2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的美国序列号60/130,377中所述的那些在体外制成的。在其他实施方案中，体外所合成的DNA链在其转化进入细胞之前、之后或同时与体内或体外所制成的RNA链复合。在其他实施方案中，dsRNA为含有有义和反义区的单环核酸，或者dsRNA包括环状核酸和第二个环状核酸或线性核酸(参见，例如2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的美国序列号60/130,377)。示例性环状核酸包括套索结构，其中核苷酸的游离5'磷酰基以环回方式连接到另一个核苷酸的2'羟基。
在其他实施方案中，dsRNA包括其中糖的2'位含有卤素(诸如氟基)或者含有烷氧基(诸如甲氧基)的一个或多个修饰的核苷酸，其相比于其中相应的2'位含有氢或羟基的相应的dsRNA增加了体外或体内dsRNA的半衰期。在其他实施方案中，dsRNA包括相邻核苷酸之间的一个或多个键而非自然存在的磷酸二酯键联。此类键联的实例包括磷酰胺、硫代磷酸酯以及二硫代磷酸酯键联。dsRNA还可以是如美国专利号6,673,661中所教导的化学修饰的核酸分子。在其他实施方案中，dsRNA含有一个或两个加帽链，如例如由2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的美国序列号60/130,377所公开的。
在其他实施方案中，dsRNA可以是任何WO 00/63364中所公开的至少部分dsRNA分子，以及任何美国临时申请60/399,998以及美国临时申请60/419,532和PCT/US2003/033466中所述的dsRNA分子，所述申请的教义以引用的方式并入本文。任何dsRNA可使用本文所述的方法或标准方法诸如WO 00/63364中所述的那些在体外或体内进行表达。
占位
在某些实施方案中，预期反义化合物或靶核酸不通过RNA酶H导致裂解或者通过RISC途径导致裂解或螯合。在某些此类实施方案中，反义活性可以由占位产生，其中杂交反义化合物的存在破坏了靶核酸的活性。在某些此类实施方案中，反义化合物可以是统一修饰的或者可以包含修饰的混合和/或包含修饰的和未修饰的核苷酸。
靶核酸、靶区域和核苷酸序列
编码TMPRSS6的核苷酸序列包括但不限于以下：GENBANK登录号NM_153609.2(作为SEQ ID NO:1并入本文)，从16850000至16897000截短的GENBANK登录号NT_011520.12的补体(作为SEQ ID NO:2并入本文)，GENBANK登录号CR456446.1(作为SEQ ID NO:3并入本文)，GENBANK登录号BC039082.1(作为SEQ ID NO:4并入本文)，GENBANK登录号AY358398.1(作为SEQ ID NO:5并入本文)，或GENBANK登录号DB081153.1(作为SEQ ID NO:6并入本文)。在某些实施方案中，本文所述的反义化合物靶向编码TMPRSS6的核酸序列。在某些实施方案中，本文所述的反义化合物靶向SEQ ID NO:1-6中的任一个的序列。
应了解，本文中所含的实例中的各SEQ ID NO中所列的序列与糖部分、核苷间键联或核碱基的任何修饰无关。因而，由SEQ ID NO定义的反义化合物可独立地包含糖部分、核苷间键联或核碱基的一个或多个修饰。由Isis编号(Isis No)描述的反义化合物指示核酸碱基序列与基序的组合。
在某些实施方案中，靶区域为靶核酸的结构明确的区。例如，靶区域可包含3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子接合部、编码区、翻译起始区、翻译终止区，或其他所定义的核酸区域。关于TMPRSS6的结构上定义的区域可通过登录号从序列数据库如NCBI获得并且所述信息以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，靶区域可涵盖从靶区域内一个靶区段的5’靶位点到所述靶区域内另一靶区段的3’靶位点的序列。
在某些实施方案中，“靶区段”是核酸内的靶区域的较小分部分。例如，靶区段可以是一种或多种反义化合物所靶向的靶核酸的核苷酸的序列。“5’靶位点”是指靶区段的最5’核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段的最3’核苷酸。
靶向包括确定至少一个与反义化合物杂交，从而出现所需作用的靶区段。在某些实施方案中，所需作用为mRNA靶核酸水平降低。在某些实施方案中，所需作用为由靶核酸编码的蛋白质水平的降低或与靶核酸有关的表型改变。
靶区域可含有一个或多个靶区段。靶区域内的多个靶区段可重叠。或者，它们可不相重叠。在某些实施方案中，靶区域内的靶区段相隔至多约300个核苷酸。在某些实施方案中，靶区域内的靶区段相隔靶核酸上一定数目的核苷酸，所述数目为、为约、为至多、为至多约250个、200个、150个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、20个或10个核苷酸，或为由前述任何两个值所界定的范围。在某些实施方案中，靶区域内的靶区段相隔靶核酸上的至多或至多约5个核苷酸。在某些实施方案中，靶区段为连续的。涵盖由具有为本文所列的5'靶位点或3'靶位点中的任一个的起始核酸的范围所界定的靶区。
适合的靶区段可见于5'UTR、编码区、3'UTR、内含子、外显子或外显子/内含子接合点内。含有起始密码子或终止密码子的靶区段也为适合的靶区段。适合的靶区段可尤其排除某一结构明确的区，诸如起始密码子或终止密码子。
确定适合的靶区段可包括将靶核酸的序列与整个基因组中的其他序列相比较。举例来说，可使用BLAST算法来鉴别不同核酸当中具相似性的区域。这个比较可预防选择可能以非特异性方式与除所选靶核酸以外的序列(即非靶或脱靶序列)杂交的反义化合物序列。
反义化合物在活性靶区内的活性(例如如由靶核酸水平的降低百分比所定义)可能不同。在某些实施方案中，TMPRSS6 mRNA水平的降低指示对TMPRSS6表达的抑制。TMPRSS6蛋白质水平的降低还指示靶TMPRSS6表达的抑制。此外，表型改变指示对TMPRSS6表达的抑制。例如，铁调素表达水平的提高可指示TMPRSS6表达的抑制。在另一个实例中，组织中铁积聚的减少可指示TMPRSS6表达的抑制。在另一个实例中，转铁蛋白的饱和度百分比的增加可指示TMPRSS6表达的抑制。
杂交
在一些实施方案中，在本文公开的反义化合物与TMPRSS6核酸之间进行杂交。杂交的最常见机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键键结(例如沃森-克里克、霍氏或反霍氏氢键键结)。
杂交可在不同条件下进行。严格条件具序列依赖性且由待杂交的核酸分子的性质和组成决定。
确定序列是否特异性杂交至靶核酸的方法是本领域中熟知的(Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,2001)。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物可与TMPRSS6核酸特异性杂交。
互补性
当反义化合物中足够数目的核碱基可与靶核酸中的相应核碱基进行氢键合，从而出现所需作用(例如对靶核酸(诸如TMPRSS6核酸)的反义抑制)时，反义化合物与靶核酸彼此互补。
可容忍反义化合物与TMPRSS6核酸之间的非互补性核碱基，前提是所述反义化合物仍能够与TMPRSS6核酸特异性杂交。此外，反义化合物可在TMPRSS6核酸的一个或多个区段上杂交，以使得介入或相邻区段不参与杂交事件(例如环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与TMPRSS6核酸、靶区、靶区段或其指定部分为或为至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。反义化合物与靶核酸的互补性百分比可使用常规方法测定。举例来说，反义化合物中反义化合物的20个核碱基中有18个核碱基与靶区互补且因此特异性杂交将表示90％互补性。在这个实例中，其余非互补核碱基可与互补核碱基丛集或交替并且不需要彼此相邻或与互补核碱基相邻。因此，长18个核碱基并且具有4(四)个非互补核碱基且所述非互补核碱基侧接有两个与靶核酸完全互补的区的反义化合物将与靶核酸具有77.8％总体互补性且因此将处于本发明的范围内。
反义化合物与靶核酸的区域的互补性百分比可常规地使用本领域中已知的BLAST程序(基本局部比对搜寻工具)和PowerBLAST程序来测定(Altschul等人，J.Mol.Biol.,1990,215,403 410；Zhang和Madden，Genome Res.,1997,7,649 656)。同源性、序列同一性或互补性的百分比可通过例如使用Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482 489)的算法的Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)使用默认设置来测定。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与靶核酸或其指定部分完全互补(即100％互补)。例如，反义化合物可与TMPRSS6核酸或其靶区域或靶区段或靶序列完全互补。本文所用的“完全互补”是指反义化合物的每个核碱基皆能够与靶核酸的相应核碱基进行准确碱基配对。举例来说，具有20个核碱基的反义化合物与长度为400个核碱基的靶序列完全互补，只要靶核酸中有具有20个核碱基的相应部分与反义化合物完全互补即可。完全互补还可参考第一和/或第二核酸的指定部分来使用。举例来说，具有30个核碱基的反义化合物中的20个核碱基的部分可与长度为400个核碱基的靶序列“完全互补”。具有30个核碱基的寡核苷酸中的20个核碱基的部分在靶序列具有含20个核碱基且每个核碱基与反义化合物中的所述20个核碱基的部分互补的相应部分的情况下与靶序列完全互补。同时，整个具有30个核碱基的反义化合物与靶序列可能完全互补或可能不是完全互补，这取决于反义化合物的其余10个核碱基是否也与靶序列互补。
非互补核碱基的位置可处于反义化合物的5'端或3'端处。或者，一个或多个非互补核碱基可处于反义化合物的内部位置处。当存在两个或多个非互补核碱基时，它们可为连续(即连接的)或不连续的。在一个实施方案中，非互补核碱基位于缺口聚物反义寡核苷酸的翼段中。
在某些实施方案中，长度为或为达12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基的反义化合物相对于靶核酸(诸如TMPRSS6核酸)或其指定部分包含至多4个、至多3个、至多2个或至多1个非互补核碱基。
在某些实施方案中，长度为或为达12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核碱基的反义化合物相对于靶核酸(诸如TMPRSS6核酸)或其指定部分包含至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个非互补核碱基。
本文提供的反义化合物还包括与靶核酸的一部分互补的反义化合物。本文所用的“部分”是指靶核酸的区或段内确定数目的连续(即连接的)核碱基。“部分”还可指反义化合物中确定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少8个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少12个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少15个核碱基的部分互补。还涵盖与靶区段中具有至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或多个(或由这些值中的任何两个所界定的范围)核碱基的部分互补的反义化合物。
同一性
本文提供的反义化合物还可与特定核苷酸序列SEQ ID NO或由特定Isis编号表示的化合物或其部分具有确定的同一性百分比。如本文所用，如果反义化合物具有相同的核碱基配对能力，那么其与本文公开的序列同一。举例来说，在所公开的DNA序列中含有尿嘧啶代替胸苷的RNA将被视作与DNA序列同一，因为尿嘧啶和胸苷皆与腺嘌呤配对。还涵盖本文所述的反义化合物的缩短及延长型式以及相对于本文提供的反义化合物具有不一致碱基的化合物。不一致碱基可彼此相邻或散布于整个反义化合物中。反义化合物的同一性百分比是根据相对于与其比较的序列具有同一碱基配对的碱基的数目来计算的。
在某些实施方案中，反义化合物或其部分与本文公开的一种或多种反义化合物或SEQ ID NO或其部分具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
修饰
核苷为碱基-糖组合。核苷的核碱基(又称为碱基)部分通常为杂环碱基部分。核苷酸为还包括共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。对于包括呋喃戊糖基糖的那些核苷，磷酸酯基可连接至糖的2'、3'或5'羟基部分。寡核苷酸是经由相邻核苷彼此共价键联形成线性聚合寡核苷酸而形成的。在寡核苷酸结构内，磷酸酯基通常被视作形成寡核苷酸的核苷间键联。
反义化合物的修饰涵盖核苷间键联、糖部分或核碱基的取代或改变。修饰的反义化合物常因具有如以下的所需性质而优于原生形式：细胞吸收增强、对核酸靶标的亲和力增强、在核酸酶存在下的稳定性增强或抑制活性增强。
化学上修饰的核苷还可用于增强缩短或截短型反义寡核苷酸对其靶核酸的结合亲和力。因此，常可以具有所述化学上修饰的核苷的较短反义化合物获得类似结果。
修饰的核苷间键联
RNA和DNA的天然存在的核苷间键联为3'至5'磷酸二酯键联。相较于具有天然存在的核苷间键联的反义化合物，具有一个或多个修饰的(即非天然存在)的核苷间键联的反义化合物常会因具有所需性质(如细胞吸收增强、对靶核酸的亲和力增强及在核酸酶存在下的稳定性增强)而被优先选择。
具有修饰的核苷间键联的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键联以及不具磷原子的核苷间键联。代表性含磷的核苷间键联包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯及硫代磷酸酯。制备含磷键及不含磷键的方法为熟知的。
在某些实施方案中，靶向TMPRSS6核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联中的至少一个为硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，反义化合物的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
修饰的糖部分
本发明的反义化合物可任选含有其中糖基已被修饰的一个或多个核苷。所述糖修饰的核苷可赋予反义化合物以增强的核酸酶稳定性、增强的结合亲和力或某种其他有利生物性质。在某些实施方案中，核苷包含化学上修饰的呋喃核糖环部分。化学上修饰的呋喃核糖环的实例包括不限于添加取代基(包括5'及2'取代基)；非偕位环原子桥连形成双环核酸(BNA)；核糖基环氧原子用S、N(R)或C(R1)(R2)(R、R1和R2各自独立地为H、C1-C12烷基或保护基)置换；及其组合。化学上修饰的糖的实例包括2'-F-5'-甲基取代的核苷(关于其他所公开的5',2'-双取代的核苷，参见08年8月21日公开的PCT国际申请WO 2008/101157)或核糖基环氧原子被S置换且2'位上被进一步取代(参见2005年6月16日公开的公开美国专利申请US2005-0130923)；或者BNA的5'-取代(参见07年11月22日公开的PCT国际申请WO 2007/134181，其中LNA被例如5'-甲基或5'-乙烯基取代)。
具有修饰的糖部分的核苷的实例包括不限于包含5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)、4'-S、2'-F、2'-OCH3、2’-OCH2CH3、2’-OCH2CH2F和2'-O(CH2)2OCH3取代基的核苷。2’位置处的取代基还可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、巯基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、OCH2F、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)和O-CH2-C(＝O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)，其中Rl、Rm和Rn各自独立地为H或取代的或未取代的C1-C10烷基。
本文所用的“双环核苷”是指包含双环糖部分的修饰的核苷。双环核酸(BNA)的实例包括不限于在4'与2'核糖基环原子之间包含桥的核苷。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物包含一个或多个BNA核苷，其中桥包含下式中的一个：4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(cEt)和4'-C-H(CH2OCH3)-O-2'(以及其类似物，参见2008年7月15日颁发的美国专利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(以及其类似物，参见2009年1月8日公布的以WO 2009/006478公布的PCT/US2008/068922)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(以及其类似物，参见2008年12月11日公布的以WO/2008/150729公布的PCT/US2008/064591)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见2004年9月2日公布的已公布的美国专利申请US2004-0171570)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R为H、C1-C12烷基或保护基(参见2008年9月23日颁发的美国专利7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见Zhou等人，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4'-CH2-C(＝CH2)-2'(以及其类似物，参见2008年12月8日公布的以WO 2008/154401公布的PCT/US2008/066154)。
其他双环核苷已经在公开的文献中进行了报道(参见例如：Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Frieden等人,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372；Elayadi等人,Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等人,Chem.Biol.,2001,8,1-7；Orum等人,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Singh等人,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；美国专利号：7,399,845；7,053,207；7,034,133；6,794,499；6,770,748；6,670,461；6,525,191；6,268,490；美国专利公布号：US2008-0039618；US2007-0287831；US2004-0171570；美国专利申请序列号：12/129,154；61/099,844；61/097,787；61/086,231；61/056,564；61/026,998；61/026,995；60/989,574；国际申请WO 2007/134181；WO2005/021570；WO 2004/106356；WO 99/14226；以及PCT国际申请号：PCT/US2008/068922；PCT/US2008/066154；和PCT/US2008/064591)。上述各双环核苷可被制备而具有一种或多种立体化学糖构型，包括例如α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(参见1999年3月25日公开为WO99/14226的PCT国际申请PCT/DK98/00393)。
本文所用的“单环核苷”是指包含不为双环糖部分的修饰的糖部分的核苷。在某些实施方案中，核苷的糖部分或糖部分类似物可在任何位置上被修饰或取代。
本文所用的“4'-2'双环核苷”或“4'至2'双环核苷”是指包含含连接2'碳原子与4'碳原子的桥基的呋喃糖环的双环核苷。
在某些实施方案中，BNA核苷的双环糖部分包括但不限于在呋喃戊糖基糖部分的4'与2'碳原子之间具有至少一个桥的化合物，所述桥包括但不限于包含1个或1至4个独立地选自以下的连接基团的桥：-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-以及-N(Ra)-；其中：x是0、1或2；n是1、2、3或4；每个Ra和Rb独立地为H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚磺酰基(S(＝O)-J1)；以及
各J1和J2独立地为H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基团。
在某些实施方案中，双环糖部分的桥为-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或–C(RaRb)-O-N(R)-。在某些实施方案中，桥为4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'和4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中每个R独立地为H、保护基团或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，双环核苷进一步由异构构型定义。例如，包含4'-(CH2)-O-2'桥的核苷可呈α-L构型或呈β-D构型。α-L-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA先前已并入展示反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等人,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。
在某些实施方案中，双环核苷包括具有4'至2'桥的那些，其中此类桥包括但不限于α-L-4'-(CH2)-O-2'、β-D-4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'、4'-CH2-N(R)-O-2'、4'-CH(CH3)-O-2'、4'-CH2-S-2'、4'-CH2-N(R)-2'、4'-CH2-CH(CH3)-2'以及4'-(CH2)3-2'，其中R为H、保护基团或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
-Qa-Qb-Qc-为-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-或-N(Rc)-O-CH2；
Rc为C1-C12烷基或氨基保护基团；以及
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接。
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Za为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、巯基或取代的巯基。
在一个实施方案中，每个取代的基团独立地被独立地选自以下的取代基单取代或多取代：卤素、氧代、羟基、OJc、NJcJd、SJc、N3、OC(＝X)Jc、以及NJeC(＝X)NJcJd，其中每个Jc、Jd和Je独立地为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基且X为O或NJc。
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Zb为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基或取代的酰基(C(＝O)-)。
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Rd为C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
各qa、qb、qc和qd独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-C6氨基烷基或取代的C1-C6氨基烷基；
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
qa、qb、qe和qf各自独立地为氢、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；
或qe和qf一起为＝C(qg)(qh)；
qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基；
已描述了具有4'-CH2-O-2'桥的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶双环核苷的合成和制备连同其低聚化以及核酸识别性质(Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。双环核苷的合成还已描述于WO 98/39352和WO 99/14226中。
还已制备具有4'至2'桥连基团诸如4'-CH2-O-2'和4'-CH2-S-2'的各种双环核苷的类似物(Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。包含双环核苷作为核酸聚合酶的底物的寡脱氧核糖核苷酸双螺旋体的制备也已有所描述(Wengel等人,WO 99/14226)。此外，2'-氨基-BNA(一种新颖的构形受限的高亲和力寡核苷酸类似物)的合成在本领域中已有所描述(Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。另外，2'-氨基-BNA和2'-甲基氨基-BNA已被制备且它们与互补的RNA及DNA链的双螺旋体的热稳定性先前已有所报道。
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
各qi、qj、qk和ql独立地为H、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；以及
qi和qj或ql和qk一起为＝C(qg)(qh)，其中qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基。
一种具有4'-(CH2)3-2'桥和烯基类似物桥4'-CH＝CH-CH2-2'的碳环双环核苷已有所描述(Freier等人,Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443和Albaek等人,J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。碳环双环核苷的合成和制备连同其低聚化和生物化学研究也已有所描述(Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
在某些实施例中，双环核苷包括但不限于如下所描绘的(A)α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(B)β-D-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(C)亚乙基氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA；(D)氨基氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA；(E)氧基氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA；(F)甲基(亚甲基氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA(又称为约束的乙基或cEt)；(G)亚甲基硫代(4’-CH2-S-2’)BNA；(H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA；(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA；(J)亚丙基碳环(4’-(CH2)3-2’)BNA以及(K)乙烯基BNA。
其中Bx为碱基部分且R独立地为H、保护基团、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基。
如本文所用，“修饰的四氢吡喃核苷”或“修饰的THP核苷”是指具有取代普通核苷中的呋喃戊糖基残基的6元四氢吡喃“糖”的核苷并且也可以称为糖替代物。修饰的THP核苷包括但不限于在本领域中称为己糖醇核酸(HNA)、anitol核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA)(参见Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-854)或具有如下所示的四氢吡喃环系统的氟HNA(F-HNA)。
在某些实施方案中，选择具有下式的糖替代物：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地为将四氢吡喃核苷类似物连接至低聚化合物的核苷间连接基团，或者T3和T4中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接至低聚化合物或寡核苷酸的核苷间连接基团，且T3和T4中的另一个为H、羟基保护基团、连接的缀合物基团或5'或3'-端基；
q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；以及
R1和R2中的一个为氢且另一个选自卤素、取代或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1,N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中X为O、S或NJ1，且J1、J2和J3各自独立地为H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少一个不为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少一个为甲基。在某些实施方案中，提供THP核苷，其中R1和R2中的一个为F。在某些实施方案中，R1为氟且R2为H；R1为甲氧基并且R2为H，以及R1为甲氧基乙氧基并且R2为H。
在某些实施方案中，糖替代物包含具有多于5个原子和多于一个杂原子的环。例如包含吗啉代糖部分的核苷以及它们在低聚化合物中的用途已有所报道(参见例如：Braasch等人,Biochemistry,2002,41,4503-4510；和美国专利5,698,685；5,166,315；5,185,444以及5,034,506)。如在此所使用，术语“吗啉代”是指具有以下式的糖替代物：
在某些实施方案中，可例如通过添加或改变来自以上吗啉代结构的各种取代基来修饰吗啉代。所述糖替代物在本文中称为“修饰的吗啉代”。
还提供了修饰的组合，不限于如2'-F-5'-甲基取代的核苷(对于其他公开的5',2'-双取代核苷，参见8/21/08公布的PCT国际申请WO 2008/101157)和用S替代核糖基环氧原子以及在2'-位上的进一步取代(参见2005年6月16日公布的已公布的美国专利申请US2005-0130923)或替代地双环核酸的5'-取代(参见11/22/07公布的PCT国际申请WO2007/134181，其中4'-CH2-O-2'双环核苷在5'位上被5'-甲基或5'-乙烯基进一步取代)。碳环双环核苷的合成和制备连同其低聚和生物化学研究也已有所描述(参见，例如，Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个修饰的环己烯基核苷，其为用六元环己烯基替代天然存在的核苷中的呋喃戊糖基残基的核苷。修饰的环己烯基核苷包括但不限于本领域中描述的那些(参见例如共同拥有的已公布的2010年4月10日公布的PCT申请WO 2010/036696；Robeyns等人,J.Am.Chem.Soc.,2008,130(6),1979-1984；Horváth等人,Tetrahedron Letters,2007,48,3621-3623；Nauwelaerts等人,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(30),9340-9348；Gu等人,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2005,24(5-7),993-998；Nauwelaerts等人,Nucleic Acids Research,2005,33(8),2452-2463；Robeyns等人,Acta Crystallographica,Section F:Structural Biology and CrystallizationCommunications,2005,F61(6),585-586；Gu等人,Tetrahedron,2004,60(9),2111-2123；Gu等人,Oligonucleotides,2003,13(6),479-489；Wang等人,J.Org.Chem.,2003,68,4499-4505；Verbeure等人,Nucleic Acids Research,2001,29(24),4941-4947；Wang等人,J.Org.Chem.,2001,66,8478-82；Wang等人,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2001,20(4-7),785-788；Wang等人,J.Am.Chem.,2000,122,8595-8602；已公布的PCT申请WO06/047842；以及已公布的PCT申请WO 01/049687；其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。某些修饰的环己烯基核苷具有式X。
其中独立地对于所述至少一种式X的环己烯基核苷类似物中的每一个：
Bx为杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地为将环己烯基核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团，或者T3和T4中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团且T3和T4中的另一个为H、羟基保护基、连接的缀合物基团或5'或3'-端基；以及
q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8以及q9各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或其他糖取代基团。
许多其他单环、双环和三环的环系统为本领域中已知的并且适合作为可用来修饰用于并入本文所提供的低聚化合物中的核苷的糖替代物(参见，例如，综述文章：Leumann,Christian J.Bioorg.&Med.Chem.,2002,10,841-854)。可对所述环系统进行各种其他的取代以进一步增强活性。
如本文所用，“2’-修饰的糖”是指在2’位上修饰的呋喃糖基糖。在某些实施方案中，所述修饰包括选自以下的取代基：包括但不限于卤基、取代和未取代的烷氧基、取代和未取代的硫烷基、取代和未取代的氨基烷基、取代和未取代的烷基、取代和未取代的烯丙基以及取代和未取代的炔基。在某些实施方案中，2’修饰选自包括但不限于以下的取代基：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nF、O(CH2)nONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3、以及O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。其他2'取代基还可选自：C1-C12烷基、取代的烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、F、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷氨基、聚烷氨基、取代的硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、改进药物动力学性质的基团，或改进反义化合物的药效学性质的基团，以及其他具有类似性质的取代基。在某些实施方案中，修饰的核苷包含2'-MOE侧链(Baker等人,J.Biol.Chem.,1997,272,11944-12000)。所述2'-MOE取代已被描述为相较于未修饰的核苷及其他修饰的核苷(如2'-O-甲基、O-丙基及O-氨基丙基)具有改善的结合亲和力。具有2'-MOE取代基的寡核苷酸还已展示为基因表达的反义抑制剂且具有有希望用于体内使用的特征(Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504；Altmann等人,Chimia,1996,50,168-176；Altmann等人,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637；以及Altmann等人,Nucleosides Nucleotides,1997,16,917-926)。
本文所用的“2'-修饰的核苷”或“2'-取代的核苷”是指包含在2'位上包含除H或OH以外的取代基的糖的核苷。2'-修饰的核苷包括但不限于具有诸如以下的非桥连2'取代基的核苷：烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中Rm和Rn各自独立地为H或取代或未取代的C1-C10烷基。2'-修饰的核苷可进一步例如在糖的其他位置上和/或在核碱基上包含其他修饰。
本文所用的“2’-F”是指包括在糖环的2'位上包含氟基的糖的核苷。
本文所用的“2’-OMe”或“2’-OCH3”、“2’-O-甲基”或“2’-甲氧基”各自是指包含在糖环的2'位上包含-OCH3基团的糖的核苷。
本文所用的“MOE”或“2’-MOE”或“2’-OCH2CH2OCH3”或“2’-O-甲氧基乙基”各自是指包含在糖环的2'位上包含-OCH2CH2OCH3基团的糖的核苷。
用于制备修饰的糖的方法为本领域技术人员所熟知。教导此类修饰的糖的制备的一些代表性美国专利包括但不限于U.S.：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,670,633；5,700,920；5,792,847和6,600,032，以及2005年6月2日提交且2005年12月22日公布为WO 2005/121371的国际申请PCT/US2005/019219，并且其各自以引用的方式整体并入本文。
本文所用的“寡核苷酸”是指包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方案中，多个核苷中的一或多个是修饰的。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。
在具有修饰的糖部分的核苷酸中，核碱基部分(天然、修饰的或其组合)被维持以便与适当核酸目标杂交。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的糖部分为2'-MOE。在某些实施方案中，2'-MOE修饰的核苷酸排列于缺口聚物基序中。在某些实施方案中，修饰的糖部分是具有(4’-CH(CH3)-O-2’)桥接基团的双环核苷。在某些实施方案中，(4’-CH(CH3)-O-2’)修饰的核苷布置在整个缺口聚物基序的翼中。
修饰的核碱基
核碱基(或碱基)修饰或取代与天然存在的或合成的未修饰核碱基在结构上不同，但在功能上是可以互换的。天然和修饰的核碱基能够参与氢键合。这样的核碱基修饰可赋予反义化合物以核酸酶稳定性、结合亲和力或某种其他有益的生物学特性。修饰的核碱基包括合成的和天然的核碱基，诸如，例如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)。某些核碱基取代，包括5-甲基胞嘧啶取代，对于增加反义化合物的靶核酸结合亲和力是特别有用的。例如，5-甲基胞嘧啶取代已显示出增加核酸双链体稳定性0.6℃-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,第276-278页)。
额外未修饰的核碱基包括但不限于5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-位取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基尤其是5-溴基、5-三氟甲基和其他5-位取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
杂环碱基部分还可包括嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环类取代的碱基部分，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。尤其可用于提高反义化合物的结合亲和性的核碱基包括5-位上被取代的嘧啶、6-氮嘧啶和N-2、N-6和O-6位上被取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
在某些实施方案中，靶向TMPRSS6核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施方案中，靶向TMPRSS6核酸的缺口加宽的反义寡核苷酸包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基中的至少一个是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
用于配制药物组合物的组合物和方法
反义化合物可与药学上可接受的活性或惰性物质混合以制备药物组合物或制剂。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或所施用的剂量。
靶向TMPRSS6核酸的反义化合物可通过将反义化合物与适合的药学上可接受的稀释剂或载体组合而用于药物组合物中。药学上可接受的稀释剂包括水，例如注射用水(WFI)。药学上可接受的稀释剂包括盐水，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)。水或盐水是适用于以胃肠外方式递送的组合物中的稀释剂。因此，在一个实施方案中，在本文所述的方法中使用包含靶向TMPRSS6核酸的反义化合物及药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施方案中，药学上可接受的稀释剂是水或盐水。在某些实施方案中，反义化合物为反义寡核苷酸。
包含反义化合物的药物组合物涵盖在动物(包括人)施用时能够提供(直接或间接)其生物活性代谢物或残余物的任何药学上可接受的盐、酯或所述酯的盐，或任何其他寡核苷酸。因此，例如，本文的公开内容还涉及反义化合物的药学上可接受的盐、前药、所述前药的药学上可接受的盐以及其他生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。
本文所述的化合物的“药学上可接受的盐”可通过本领域中熟知的方法制备。关于药学上可接受的盐的综述，参见Stahl和Wermuth,Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection and Use(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)。反义寡核苷酸的钠盐是有用的并且对于人类的治疗性施用是广泛接受的。因此，在一个实施方案中，本文所述的化合物是呈钠盐的形式。
前药可包括在反义化合物的一端或两端上并入可由体内内源性核酸酶裂解而形成活性反义化合物的额外核苷。
给药
在某些实施方案中，药物组合物根据给药方案(例如，剂量、施用频率和持续时间)来施用，其中所述给药方案可经选择以实现期望的效果。所需作用可以是例如如降低TMPRSS6或预防、减少、改善与TMPRSS6相关的疾病或、病症或病状或减缓其进展。
在某些实施方案中，将给药方案的变量调整以产生受试者中的药物组合物的所需浓度。关于剂量方案所用的“药物组合物的浓度”可以涉及药物组合物的化合物、寡核苷酸或活性成分。例如，在某些实施方案中，剂量和剂量频率被调整以提供足以达到所期望效果的量的药物组合物的组织浓度或血浆浓度。
剂量取决于所欲治疗的疾病病况的严重性和反应性，其中治疗过程持续若干天至若干个月，或者直至实现治愈或达成疾病病况的减少。剂量也依赖于药物效力和代谢。在某些实施方案中，剂量是每kg体重0.01μg至100mg，或在0.001mg至1000mg的剂量范围内，并且可以每日、每周、每两周、每月、每季度、每半年或每年给予一次或多次，或甚至每2至20年给予一次。成功治疗后，可能需要对患者进行维持疗法以预防疾病病况复发，其中寡核苷酸以维持剂量施用，所述维持剂量在每千克体重0.01μg至100mg范围内，每天一次或多次至每20年一次或在0.001mg至1000mg给药的范围内。
施用
取决于希望局部或全身性治疗并且取决于有待治疗的区域，可以将本发明的化合物或药物组合物按许多方式施用。施用可以是吸入(即，肺部)、肠内(即肠道)、胃肠外或局部。
在某些实施方案中，如本文所述的化合物和组合物以胃肠外方式施用。胃肠外施用包括但不限于静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、眼内、肌内、颅内、鞘内、髓内、心室内或肿瘤内注射或输注。胃肠外施用还包括鼻内施用。
在某些实施方案中，胃肠外施用是通过输注。输注可以是长期的或连续的或短期的或间歇的。在某些实施方案中，输注的药物试剂是用泵递送的。
在某些实施方案中，胃肠外施用是通过注射。注射可用注射器或泵递送。在某些实施方案中，注射是快速浓注。在某些实施方案中，注射被直接施用至组织或器官。
在某些实施方案中，用于胃肠外施用的制剂可包括无菌水溶液，所述无菌水溶液还可含有缓冲剂、稀释剂和其他合适添加剂，如但不限于渗透促进剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
在某些实施方案中，肠内施用如本文所述的化合物和组合物。肠道施用包括但不限于口服、经粘膜、肠或直肠(例如，栓剂、灌肠剂)。在某些实施方案中，用于肠内施用所述化合物或组合物的制剂可包括但不限于药物载体、赋形剂、粉末或颗粒、微粒、纳米颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或小片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可为需要的。在某些实施方案中，肠内制剂是本文提供的化合物与一种或多种渗透促进剂、表面活性剂和螯合剂结合施用的那些。
在某些实施方案中，施用包括肺部施用。在某些实施方案中，肺部施用包括通过吸入将雾化寡核苷酸递送至受试者的肺部。在受试者吸入雾化寡核苷酸之后，寡核苷酸分布至正常和发炎肺组织的细胞，包括肺泡巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、上皮细胞、血管内皮细胞和细支气管上皮细胞。用于递送包含修饰的寡核苷酸的药物组合物的合适装置包括但不限于标准雾化器装置。另外合适的装置包括干粉吸入器或计量剂量吸入器。
在某些实施方案中，施用药物组合物以实现局部暴露而非全身暴露。例如，肺部施用将药物组合物以最小的全身暴露递送至肺部。
缀合的反义化合物
在某些实施方案中，通过共价连接一个或多个缀合物基团来修饰如本文提供的寡核苷酸或低聚化合物。通常，缀合物基团改变所连接的寡核苷酸或低聚化合物的一种或多种性质，包括但不限于药效学、药代动力学、稳定性、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和清除率。如本文所使用，“缀合物基团”是指包含连接至寡核苷酸或低聚化合物的原子基团的基团。通常，缀合物基团改变它们所连接的化合物的一种或多种性质，包括但不限于药效学、药代动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除性质。缀合物基团通常用于化学领域，并且可包括将缀合物基团共价连接至寡核苷酸或低聚化合物的缀合物接头。在某些实施方案中，缀合物基团包括将缀合物基团共价连接至寡核苷酸或低聚化合物的可裂解部分。在某些实施方案中，缀合物基团包括缀合物接头和可裂解部分，以将缀合物基团共价连接至寡核苷酸或低聚化合物。在某些实施方案中，缀合物基团具有以下通式：
其中n是1至约3，当n是1时m是0，或当n是2或3时m是1，j是1或0，k是1或0，并且j和k的总和是至少1。
在某些实施方案中，n是1，j是1且k是0。在某些实施方案中，n是1，j是0且k是1。在某些实施方案中，n是1，j是1且k是1。在某些实施方案中，n是2，j是1且k是0。在某些实施方案中，n是2，j是0且k是1。在某些实施方案中，n是2，j是1且k是1。在某些实施方案中，n是3，j是1且k是0。在某些实施方案中，n是3，j是0且k是1。在某些实施方案中，n是3，j是1且k是1。
缀合物基团在本文中示为基团，提供用于形成至低聚化合物如寡核苷酸的共价连接的键。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点是在3'-末端核苷或修饰的核苷处。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点是3’末端核苷或修饰的核苷的3'-羟基的3'-氧原子。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点是在5'-末端核苷或修饰的核苷处。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点是5’末端核苷或修饰的核苷的5'-羟基的5'-氧原子。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点是在核苷、修饰的核苷或核苷间键联上的任何反应性位点处。
如本文所用，“可裂解部分”和“可裂解键”是指能够在某些生理条件下分裂或裂解的可裂解键或原子基团。在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解键。在某些实施方案中，可裂解部分包含可裂解键。在某些实施方案中，可裂解部分是原子基团。在某些实施方案中，可裂解部分在细胞或亚细胞区室(如溶酶体)内部选择性地裂解。在某些实施方案中，可裂解部分通过内源性酶如核酸酶选择性地裂解。在某些实施方案中，可裂解部分包含具有一个、两个、三个、四个或多于四个可裂解键的原子基团。
在某些实施方案中，缀合物基团包含可裂解部分。在某些此类实施方案中，可裂解部分将低聚化合物共价连接至缀合物接头。在某些此类实施方案中，可裂解部分将低聚化合物共价连接至细胞靶向部分。
在某些实施方案中，可裂解键选自以下：酰胺、聚酰胺、酯、醚、磷酸二酯的一个或两个酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、二硫化物或肽。在某些实施方案中，可裂解键是磷酸二酯的酯中的一种。在某些实施方案中，可裂解键是磷酸二酯的一种或两种酯。在某些实施方案中，可裂解部分是低聚化合物与缀合物基团的其余部分之间的磷酸二酯键联。在某些实施方案中，可裂解部分包含位于低聚化合物与缀合物基团的其余部分之间的磷酸二酯键联。在某些实施方案中，可裂解部分包含磷酸酯或磷酸二酯。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至缀合物接头。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯键联连接至缀合物接头。在某些实施方案中，缀合物基团不包括可裂解部分。
在某些实施方案中，可裂解部分是可裂解核苷或修饰的核苷。在某些实施方案中，核苷或修饰的核苷包含选自以下的任选保护的杂环碱基：嘌呤、取代的嘌呤、嘧啶或取代的嘧啶。在某些实施方案中，可裂解部分是选自以下的核苷：尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、4-N-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-N-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、6-N-苯甲酰基腺嘌呤、鸟嘌呤以及2-N-异丁酰基鸟嘌呤。
在某些实施方案中，可裂解部分是2'-脱氧核苷，所述2'-脱氧核苷通过磷酸二酯键联连接至低聚化合物的3'或5'末端核苷并且通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联共价连接至缀合物基团的其余部分。在某些实施方案中，可裂解部分是2'-脱氧腺苷，所述2'-脱氧腺苷通过磷酸二酯键联连接至低聚化合物的3'或5'末端核苷并且通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联共价连接至缀合物基团的其余部分。在某些实施方案中，可裂解部分是2'-脱氧腺苷，所述2'-脱氧腺苷通过磷酸二酯键联连接至3’末端核苷或修饰的核苷的3'-羟基的3'-氧原子。在某些实施方案中，可裂解部分是2'-脱氧腺苷，所述2'-脱氧腺苷通过磷酸二酯键联连接至5’末端核苷或修饰的核苷的5'-羟基的5'-氧原子。在某些实施方案中，可裂解部分连接至低聚化合物的核苷或修饰的核苷的2'位置。
如本文所用，在缀合物基团背景下的“缀合物接头”是指包含任何原子或原子基团的缀合物基团的一部分，其将细胞靶向部分直接或通过可裂解部分共价连接至低聚化合物。在某些实施方案中，缀合物接头包含选自以下的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚(-S-)和羟基氨基(-O-N(H)-)。在某些实施方案中，缀合物基团包含选自以下的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，缀合物接头包含选自烷基和酰胺基团的基团。在某些实施方案中，缀合物接头包含选自烷基和醚基团的基团。在某些实施方案中，缀合物接头包含至少一个磷连接基团。在某些实施方案中，缀合物接头包含至少一个磷酸二酯基团。在某些实施方案中，缀合物接头包含至少一个中性连接基团。
在某些实施方案中，缀合物接头共价连接至低聚化合物。在某些实施方案中，缀合物接头共价连接至低聚化合物和支链基团。在某些实施方案中，缀合物接头共价连接至低聚化合物和束缚配体。在某些实施方案中，缀合物接头共价连接至可裂解部分。在某些实施方案中，缀合物接头共价连接至可裂解部分和支链基团。在某些实施方案中，缀合物接头共价连接至可裂解部分和束缚配体。在某些实施方案中，缀合物接头包含一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团不包含缀合物接头。
如本文所用，“支链基团”是指具有能够形成与两个或多个束缚配体和缀合物基团的其余部分的共价键链的至少3个位置的原子基团。通常，支链基团通过缀合物接头和/或可裂解部分提供多个用于将束缚配体连接至低聚化合物的反应性位点。在某些实施方案中，支链基团包括选自以下的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟基氨基。在某些实施方案中，支链基团包含支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟基氨基。在某些此类实施方案中，支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺和醚基团。在某些此类实施方案中，支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、氨基和醚基团。在某些此类实施方案中，支链脂肪族基团包含选自烷基和醚基团的基团。在某些实施方案中，支链基团包含单环系统或多环系统。
在某些实施方案中，支链基团共价连接至缀合物接头。在某些实施方案中，支链基团共价连接至可裂解部分。在某些实施方案中，支链基团共价连接至缀合物接头和每个束缚配体。在某些实施方案中，支链基团包含一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团不包括支链基团。
在某些实施方案中，如本文提供的缀合物基团包括具有至少一个束缚配体的细胞靶向部分。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含共价连接至支链基团的两个束缚配体。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含共价连接至支链基团的三个束缚配体。
如本文所用，“系链”是指将配体连接至缀合物基团的其余部分的原子基团。在某些实施方案中，每个系链是包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、取代的烷基、醚、硫醚、二硫化物、氨基、氧代、酰胺、磷酸二酯和聚乙二醇基团。在某些实施方案中，每个系链是包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、醚、硫醚、二硫化物、氨基、氧代、酰胺和聚乙二醇基团。在某些实施方案中，每个系链是包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、取代的烷基、磷酸二酯、醚和氨基、氧代、酰胺基团。在某些实施方案中，每个系链是包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、醚和氨基、氧代、酰胺基团。在某些实施方案中，每个系链是包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、氨基和氧代基团。在某些实施方案中，每个系链是包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基和氧代基团。在某些实施方案中，每个系链是包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基和磷酸二酯。在某些实施方案中，每个系链包含至少一个磷连接基团或中性连接基团。
在某些实施方案中，系链包含一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，每个束缚配体连接至支链基团。在某些实施方案中，每个束缚配体通过酰胺基团连接至支链基团。在某些实施方案中，每个束缚配体通过醚基团连接至支链基团。在某些实施方案中，每个束缚配体通过磷连接基团或中性连接基团连接至支链基团。在某些实施方案中，每个束缚配体通过磷酸二酯基团连接至支链基团。在某些实施方案中，每个系链通过酰胺或醚基团连接至配体。在某些实施方案中，每个系链通过醚基团连接至配体。
在某些实施方案中，每个系链在配体与支链基团之间包含约8至约20个原子的链长。在某些实施方案中，每个系链在配体与支链基团之间包含约10至约18个原子的链长。在某些实施方案中，每个系链包含约13个原子的链长。
在某些实施方案中，本公开提供配体，其中每个配体通过系链共价连接至缀合物基团的其余部分。在某些实施方案中，每个配体经过选择以对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲合力。在某些实施方案中，选择对哺乳动物肝脏细胞表面上的至少一种类型的受体具有亲合力的配体。在某些实施方案中，选择对肝去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)具有亲合力的配体。在某些实施方案中，每个配体是碳水化合物。在某些实施方案中，每个配体独立地选自半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、甘露糖、葡萄糖、葡糖胺以及岩藻糖。在某些实施方案中，每个配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。在某些实施方案中，靶向部分包含1至3个配体。在某些实施方案中，靶向部分包含3个配体。在某些实施方案中，靶向部分包含2个配体。在某些实施方案中，靶向部分包含1个配体。在某些实施方案中，靶向部分包含3个N-乙酰基半乳糖胺配体。在某些实施方案中，靶向部分包含2个N-乙酰基半乳糖胺配体。在某些实施方案中，靶向部分包含1个N-乙酰基半乳糖胺配体。
在某些实施方案中，每个配体是碳水化合物、碳水化合物衍生物、改性的碳水化合物、多价碳水化合物聚簇、多糖、修饰的多糖或多糖衍生物。在某些实施方案中，每个配体是氨基糖或硫代糖。例如，氨基糖可选自任何数目的本领域中已知的化合物，例如葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-乙酰胺基-2-脱氧-D-吡喃半乳糖(GalNAc)、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖(β-胞壁酸)、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖和N-磺基-D-葡糖胺以及N-乙醇酰基-α-神经氨酸。例如，硫代糖可选自由以下组成的组：5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖以及3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯。
在某些实施方案中，如本文提供的缀合物基团包含碳水化合物聚簇。如本文所用，“碳水化合物聚簇”是指其中两个或多个碳水化合物残基通过系链基团连接至支链基团的缀合物基团的一部分。(关于碳水化合物缀合物聚簇的实例，参见例如Maier等人,“Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a MultivalentCarbohydrate Cluster for Cellular Targeting,”Bioconjugate Chemistry,2003,(14):18-29，其以引用的方式整体并入本文；或Rensen等人,“Design and Synthesis ofNovel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting ofLipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor,”J.Med.Chem.2004,(47):5798-5808)。
如本文所使用，“修饰的碳水化合物”是指相对于天然存在的碳水化合物具有一个或多个化学修饰的任何碳水化合物。
如本文所使用，“碳水化合物衍生物”是指可使用碳水化合物作为起始材料或中间体合成的任何化合物。
如本文所使用，“碳水化合物”是指天然存在的碳水化合物、修饰的碳水化合物或碳水化合物衍生物。
在某些实施方案中，提供缀合物基团，其中所述细胞靶向部分具有式：
在某些实施方案中，提供缀合物基团，其中所述细胞靶向部分具有式：
在某些实施方案中，提供缀合物基团，其中所述细胞靶向部分具有式：
在某些实施方案中，缀合物基团具有式：
教导某些上述缀合物基团、缀合低聚化合物如包含缀合物基团的反义化合物、系链、缀合物接头、支链基团、配体、可裂解部分以及其他修饰的制备的代表性美国专利、美国专利申请公布和国际专利申请公布包括但不限于US 5,994,517、US 6,300,319、US 6,660,720、US 6,906,182、US 7,262,177、US 7,491,805、US 8,106,022、US 7,723,509、US 2006/0148740、US 2011/0123520、WO 2013/033230和WO 2012/037254，其各自均以引用的方式整体并入本文。
教导某些上述缀合物基团、缀合低聚化合物如包含缀合物基团的反义化合物、系链、缀合物接头、支链基团、配体、可裂解部分以及其他修饰的制备的代表性公布包括但不限于BIESSEN等人,"The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactosidewith High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor:a PotentCholesterol Lowering Agent"J.Med.Chem.(1995)38:1846-1852；BIESSEN等人,"Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the HepaticAsialoglycoprotein Receptor"J.Med.Chem.(1995)38:1538-1546；LEE等人,"New andmore efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor ofmammalian hepatocytes"Bioorganic&Medicinal Chemistry(2011)19:2494-2500；RENSEN等人,"Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing ofLigands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and inVivo"J.Biol.Chem.(2001)276(40):37577-37584；RENSEN等人,"Design and Synthesisof Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting ofLipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor"J.Med.Chem.(2004)47:5798-5808；SLIEDREGT等人,"Design and Synthesis of Novel Amphiphilic DendriticGalactosides for Selective Targeting of Liposomes to the HepaticAsialoglycoprotein Receptor"J.Med.Chem.(1999)42:609-618；以及Valentijn等人,“Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides with highaffinity for the Asialoglycoprotein Receptor”Tetrahedron,1997,53(2),759-770，其各自以引用的方式整体并入本文。
在某些实施方案中，缀合物基团包括但不限于嵌入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫代胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素和染料。某些缀合物基团先前已经得到描述，例如：胆固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556)、胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.,1994,4,1053-1060)、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306-309；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765-2770)、硫代胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.AcidsRes.,1992,20,533-538)、脂肪族链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.,1991,10,1111-1118；Kabanov等人，FEBS Lett.,1990,259,327-330；Svinarchuk等人，Biochimie,1993,75,49-54)、磷脂例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)或金刚烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)，或十八胺或己基氨基-羰基-氧胆固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937)。
在某些实施方案中，缀合物基团包含活性药物，例如阿司匹林、华法林(warfarin)、苯基丁氮酮、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹酰基肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、氟灭酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂吲哚美辛、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺药、抗糖尿病剂、抗菌剂或抗生素。
缀合物接头的一些非限制性实例包括吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)和6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其他缀合物接头包括但不限于取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10烯基或取代或未取代的C2-C10炔基，其中优选取代基的非限制性列表包括羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
缀合物基团可连接至寡核苷酸的任一端或两端(末端缀合物基团)和/或任何内部位置。
在某些实施方案中，缀合物基团处于低聚化合物的寡核苷酸的3’-末端。在某些实施方案中，缀合物基团靠近3’-末端。在某些实施方案中，缀合物连接在低聚化合物的3’末端处，但位于一个或多个端基核苷之前。在某些实施方案中，缀合物基团位于端基内。
细胞培养和反义化合物处理
可在多种细胞类型中体外测试反义化合物对TMPRSS6核酸或蛋白质的水平、活性或表达的作用。用于所述分析的细胞类型可获自商业供货商(例如American Type CultureCollection,Manassas,VA；Zen-Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC；CloneticsCorporation,Walkersville,MD)且根据供货商的说明书使用商购的试剂(例如，Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)培养细胞。例示性细胞类型包括但不限于HepG2细胞、Hep3B细胞、Huh7(肝细胞癌)细胞、原代肝细胞、A549细胞、GM04281成纤维细胞和LLC-MK2细胞。
体外测试反义寡核苷酸
本文描述用反义寡核苷酸处理细胞的方法，所述方法可被适当修改以用于用其他反义化合物进行的处理。
通常，可当细胞在培养中达到约60-80％汇合度时，用反义寡核苷酸处理细胞。
一种通常用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括阳离子型脂质转染试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)。可将反义寡核苷酸与在1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达成反义寡核苷酸的所需最终浓度及可在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL范围内的浓度。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括LIPOFECTAMINE(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将反义寡核苷酸与LIPOFECTAMINE在1血清减少型培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达成反义寡核苷酸的所需浓度及可在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL范围内的浓度。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将反义寡核苷酸与在1血清减少型培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达成反义寡核苷酸的所需浓度及可在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL范围内的浓度。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括OligofectamineTM(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)。反义寡核苷酸与OligofectamineTM在Opti-MEMTM-1血清减少型培养基(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)中混合以达成寡核苷酸的所需浓度，其中OligofectamineTM与寡核苷酸的比率为每100nM约0.2至0.8μL。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括FuGENE 6(RocheDiagnostics Corp.,Indianapolis,IN)。反义低聚化合物与FuGENE 6在1mL无血清的RPMI中混合以达成寡核苷酸的所需浓度，其中FuGENE 6与低聚化合物的比率是每100nM为1至4μL的FuGENE 6。
用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的另一种技术包括电穿孔(Sambrook和Russell，Molecular Cloning.A Laboratory Manual.第3版Cold Spring Harborlaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York.2001)。
通过常规方法用反义寡核苷酸处理细胞。可在反义寡核苷酸处理后16-24小时收获细胞，此时通过本领域中已知及本文所述的方法测量靶核酸的RNA或蛋白质水平(Sambrook和Russell，Molecular Cloning.A Laboratory Manual.第3版Cold SpringHarbor laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York.2001)。一般来说，当在多次重复实验中进行处理时，数据呈现为重复处理的平均值。
所用的反义寡核苷酸浓度在细胞系之间有所不同。确定用于特定细胞系的最佳反义寡核苷酸浓度的方法在本领域中为熟知的(Sambrook和Russell，Molecular Cloning.ALaboratory Manual.第3版.Cold Spring Harbor laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York.2001)。当用脂质转染剂(Lipofectin)或细胞转染剂(Cytofectin)转染时，通常使用浓度在1nM至300nM范围内的反义寡核苷酸。当使用电穿孔进行转染时，使用625nM至20,000nM范围内的较高浓度的反义寡核苷酸。
RNA分离
可对总细胞RNA或聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离的方法是本领域中熟知的(Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,2001)。RNA是使用本领域中熟知的方法，例如使用试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)，根据制造商推荐的方案来制备。
分析对目标水平或表达的抑制
TMPRSS6核酸水平或表达的抑制可以本领域中已知的多种方式来测定(Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,2001)。举例来说，靶核酸水平可通过例如RNA印迹分析、竞争性聚合酶链反应(PCR)或定量实时PCR来定量。可对总细胞RNA或聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法在本领域中是熟知的。RNA印迹分析在本领域中也是常规的。定量实时PCR可以使用可从PE-Applied Biosystems,Foster City,CA商购，并根据制造商说明书来使用的市售ABI7600、7700或7900序列检测系统来方便地完成。
对目标RNA水平的定量实时PCR分析
可通过定量实时PCR，使用ABI7600、7700或7900序列检测系统(PE-Applied Biosystems,Foster City,CA)根据制造商说明书来对靶RNA水平进行定量。定量实时PCR的方法在本领域中为熟知的。
在实时PCR之前，使分离的RNA经历逆转录酶(RT)反应，产生互补的DNA(cDNA)，其接着用作实时PCR扩增的底物。在同一样品孔中依序进行RT和实时PCR反应。RT和实时PCR试剂可获自Invitrogen(Carlsbad,CA)。RT实时PCR反应通过本领域技术人员熟知的方法进行。
通过实时PCR获得的基因(或RNA)目标量是使用表达恒定的基因(如亲环素A(cyclophilin A))的表达水平或通过使用(Invitrogen,Inc.Carlsbad,CA)定量总RNA来标准化。亲环素A表达是通过实时PCR，通过与目标同时操作、复合操作或分开操作来定量。总RNA是使用RNA定量试剂(Invitrogen,Inc.Eugene,OR)来定量。通过定量RNA的方法是教导于Jones,L.J.等人,(AnalyticalBiochemistry,1998,265,368-374)中。使用4000仪器(PE AppliedBiosystems)来测量荧光。
探针和引物被设计来与TMPRSS6核酸杂交。用于设计实时PCR探针及引物的方法在本领域中为熟知的，且可包括使用软件，如PRIMER软件(AppliedBiosystems,Foster City,CA)。
分析蛋白质水平
对TMPRSS6核酸的反义抑制可通过测量TMPRSS6蛋白质水平来评估。TMPRSS6的蛋白质水平可以本领域中熟知的多种方式来评价或定量，如免疫沉淀法、蛋白质印迹分析(免疫印迹法)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量蛋白质测定、蛋白质活性测定(例如卡斯蛋白酶活性测定)、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光活化细胞分选法(FACS)(Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,2001)。针对目标的抗体可被识别且获自多种来源，如MSRS抗体目录(Aerie Corporation,Birmingham,MI)，或可经由本领域中熟知的常规单克隆或多克隆抗体生成方法来制备。
体内测试反义化合物
在动物体内测试反义化合物(例如，反义寡核苷酸)以评估它们抑制TMPRSS6表达和产生表型改变(如，减少的体内铁积聚)的能力。可在正常动物或实验疾病模型中进行测试。为了向动物施用，在药学上可接受的稀释剂(如无菌注射用水或磷酸盐缓冲盐水)中配制反义寡核苷酸。施用包括胃肠外施用途径，诸如腹膜内、静脉内和皮下。反义寡核苷酸剂量和施用频率的计算取决于许多因素，如施用途径和动物体重。在一个实施方案中，在用反义寡核苷酸处理一段时间后，自肝组织分离RNA且测量TMPRSS6核酸表达的变化。还可测量TMPRSS6蛋白质水平的变化。TMPRSS6表达的变化可通过测定动物中存在的铁调素表达水平、铁血浆水平和转铁蛋白的饱和度百分比来测量。
某些适应症
提供用于治疗个体的组合物、化合物和方法，所述方法包括向所述个体施用本文描述的一种或多种组合物或化合物。在某些实施方案中，提供用于降低个体中的TMPRSS6表达的组合物、化合物和方法。在某些实施方案中，提供用于通过向个体施用治疗有效量的包含靶向TMPRSS6核酸的反义寡核苷酸的组合物或化合物来治疗个体的组合物、化合物和方法。在某些实施方案中，靶向TMPRSS6的反义化合物降低TMPRSS6。在某些实施方案中，需要TMRPSS6降低的个体患有铁积聚疾病、病症或病状，或处于铁积聚疾病、病症或病状的风险中。在某些实施方案中，本文提供本文所述的组合物、化合物和方法，其用于降低个体中的铁水平。
在某些实施方案中，铁积聚是用于治疗个体中的疾病、病症或病状的疗法的结果。在某些实施方案中，所述疗法是输血疗法。在某些实施方案中，多次输血可导致红细胞增多症。在其他实施方案中，多次输血与患有贫血的动物相关。需要多次输血的贫血实例是遗传性贫血、骨髓增生异常综合征和严重慢性溶血。遗传学贫血的实例包括但不限于镰状细胞性贫血、地中海贫血、范可尼贫血、戴-布二氏贫血、舒-戴二氏综合征、红细胞膜障碍、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏，或遗传性出血性毛细血管扩张症。在某些实施方案中，地中海贫血是β-地中海贫血。在某些实施方案中，β-地中海贫血是HbE/β-地中海贫血、重型β-地中海贫血、中间型β-地中海贫血或轻型β-地中海贫血。
在某些实施方案中，铁积聚由于个体中的疾病、病症或病状所致。在某些实施方案中，所述疾病、病症或病状是遗传性血色素沉着症或地中海贫血。在某些实施方案中，地中海贫血是非输血依赖性地中海贫血(NTDT)或β-地中海贫血。在某些实施方案中，β-地中海贫血是HbE/β-地中海贫血、重型β-地中海贫血、中间型β-地中海贫血或轻型β-地中海贫血。
在某些实施方案中，所述疾病、病症和/或病状与过量胃肠外铁补充剂摄入或过量膳食铁摄入相关。
本文提供用于提高铁调素水平(如mRNA或蛋白质表达水平)的组合物、化合物和方法。在某些实施方案中，提供如本文所述的靶向TMPRSS6的反义化合物，其用于提高铁调素水平，如mRNA或蛋白质表达水平。
本文提供用于降低动物中的转铁蛋白饱和度百分比的组合物、化合物和方法。在某些实施方案中，提供如本文所述的靶向TMPRSS6的反义化合物，其用于降低动物中的转铁蛋白饱和度百分比。在某些实施方案中，降低转铁蛋白饱和度导致用于红细胞生成的铁供应的降低。在某些实施方案中，红细胞生成的减少可治疗、预防动物中的红细胞增多症或其症状，延迟动物中的红细胞增多症或其症状的发作，改善和/或减轻动物中的红细胞增多症或其症状。在某些实施方案中，提供如本文所述的靶向TMPRSS6的反义化合物，其用于治疗、预防动物中的红细胞增多症或其症状，延迟红细胞增多症或其症状的发作，改善和/或减轻红细胞增多症或其症状。在某些实施方案中，红细胞增多症是真性红细胞增多症。在某些实施方案中，用靶向TMPRSS6的反义化合物治疗预防或延迟红细胞增多症进展成红细胞白血病。
在某些实施方案中，在个体中施用治疗有效量的靶向TMPRSS6核酸的反义化合物伴随监测TMPRSS6水平，以确定个体对所述反义化合物的反应。在某些实施方案中，在个体中施用治疗有效量的靶向TMPRSS6核酸的反义化合物伴随监测个体中的铁调素水平。在某些实施方案中，在个体中施用治疗有效量的靶向TMPRSS6核酸的反义化合物伴随监测个体中的铁水平。在某些实施方案中，在个体中施用治疗有效量的靶向TMPRSS6核酸的反义化合物伴随评估个体中的转铁蛋白饱和度百分比。个体对施用反义化合物的反应可由医师用于确定治疗性干预的量及持续时间。
本文提供包含靶向TMPRSS6的反义化合物的药物组合物，其用于制备用于治疗患有或易患铁积聚疾病、病症或病状的患者的药物。
在某些实施方案中，本文所述的方法包括施用包含修饰的寡核苷酸的反义化合物，所述修饰的寡核苷酸具有与TMPRSS6核酸互补的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续的核碱基部分。
某些组合疗法
在某些实施方案中，包含本文提供的组合物或化合物的第一药剂与一种或多种第二药剂共同施用。在某些实施方案中，此类第二药剂被设计来治疗与本文所述的第一药剂相同的铁积聚疾病、病症或病状。在某些实施方案中，此类第二药剂被设计来治疗与本文所述的第一药剂不同的疾病、病症或病状。在某些实施方案中，此类第二药剂被设计来治疗如本文所述的一种或多种组合物或化合物的不期望的副作用。在某些实施方案中，此类第一药剂被设计来治疗第二药剂的不期望的副作用。在某些实施方案中，第二药剂与第一药剂共同施用以治疗第一药剂的不期望的作用。在某些实施方案中，第二药剂与第一药剂共同施用以产生组合效果。在某些实施方案中，第二药剂与第一药剂共同施用以产生协同效果。在某些实施方案中，与在药剂作为独立疗法施用时达到治疗或预防效果所需要的剂量相比，第一药剂和第二药剂的共同施用允许使用较低剂量。在某些实施方案中，共同施用的第二药剂的剂量与在单独施用第二药剂时将施用的剂量相同。在某些实施方案中，共同施用的第二药剂的剂量比在单独施用第二药剂时将施用的剂量低。在某些实施方案中，共同施用的第二药剂的剂量比在单独施用第二药剂时将施用的剂量高。
在某些实施方案中，第一药剂和一种或多种第二药剂在相同时间施用。在某些实施方案中，第一药剂和一种或多种第二药剂在不同时间施用。在某些实施方案中，第二药剂在施用第一药剂之前施用。在某些实施方案中，第二药剂在施用第一药剂之后施用。在某些实施方案中，第一药剂和一种或多种第二药剂一起制备于单一药物制剂中。在某些实施方案中，第一药剂和一种或多种第二药剂分开制备。
在某些实施方案中，第二药剂包括但不限于核酸化合物。此类核酸化合物可包括siRNA、核酶或靶向TMPRSS6或另一靶标的反义化合物。
在某些实施方案中，第二药剂包括但不限于非反义化合物，如铁螯合剂、转铁蛋白、骨形态发生蛋白6(BMP6)、铁调素激动剂、干细胞、靶向TMPRSS6的抗体或胎儿血红蛋白(HbF)升高剂。在其他实施方案中，铁螯合剂选自但不限于FBS0701(FerroKin)、地拉罗司、除铁灵和去铁酮。在某些实施方案中，HBF升高剂包括5-羟基脲、短链脂肪酸(SCFA)衍生物(例如，HQK1001)、DNA甲基转移酶抑制剂(例如，地西他滨)或组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(例如Zolina、帕比司他(Panobinostat))。
在某些实施方案中，第二药剂包括但不限于静脉切开术或输血疗法。在某些实施方案中，第一药剂与静脉切开术或输血疗法同时施用。在某些实施方案中，第一药剂在静脉切开术或输血疗法之前施用。在某些实施方案中，第一药剂在静脉切开术或输血疗法之后施用。在某些实施方案中，施用本文提供的组合物或化合物降低个体中静脉切开术或输血的频率。在某些实施方案中，施用本文提供的组合物或化合物提高个体中静脉切开术或输血的频率。在某些实施方案中，施用本文提供的组合物或化合物减少静脉切开术或输血所需的时间长度。
某些化合物
在本文的实施例中证明具有增强其作为人的治疗性治疗的有益性质的优选反义化合物。为了简洁起见，仅描述了有助于选择优选反义化合物的研究。以下提供所述实施例的非详尽总结以便于参考。
设计了具有MOE缺口聚物基序或含有靶向人TMPRSS6的基序的cEt的约2200种反义化合物，并且在Hep3B细胞中筛选在向细胞施用单个剂量之后其对人TMPRSS6 mRNA的影响。实施例1显示被选择用于进一步研究的超过100种有效反义化合物的代表性单剂量筛选数据。
在体外用单剂量测试的大约2200种反义化合物中，选择约100种反义化合物用于在剂量依赖性抑制研究中进行测试，以确定其在Hep3B细胞中的半最大抑制浓度(IC50)(实施例2)。
基于其在剂量反应和/或单剂量研究中的效力进一步选择了约77种反义化合物，以在CD-1小鼠中研究来确定所述反义化合物在小鼠中的耐受性(例如，血浆化学标志物、体重和器官重量)(实施例3-4)。
在CD-1小鼠中针对耐受性测试的大约77种反义化合物中，选择了约48种反义化合物用于在Sprague-Dawley大鼠中研究来确定大鼠的耐受性(实施例5)。
基于大鼠耐受性研究，选择了约32种反义化合物用于人TMPRSS6转基因(huTMPRSS6 tg)小鼠中的体内效力测试(实施例6)。
评估在小鼠研究中鉴别为有效和可耐受的反义化合物与恒河猴TMPRSS6基因序列的交叉反应性(实施例7)。虽然本文所述研究中的反义化合物在食蟹猴中进行了测试(实施例11)，但食蟹猴TMPRSS6序列不可用于与反义化合物的序列进行比较，因此将反义化合物的序列与密切相关的恒河猴的序列进行比较。发现约七种反义化合物与恒河猴TMPRSS6基因序列没有错配。
基于小鼠效力和耐受性研究的结果以及与恒河猴序列的同源性，选择了来自先前研究的七种反义化合物(585774、585683、585775、630718、647477、647449、647420)的序列用于进一步化学修饰以使它们更有效地降低TMPRSS6水平。基于七种原始反义化合物设计了八种具有GalNAc缀合物的新反义化合物(702843、705051、705052、705053、706940、706941、706942、706943)(实施例7)。
八种GalNAc缀合的反义化合物在小鼠中进行了测试：对于在CD-1小鼠中的耐受性(例如，测量了体重、器官重量、肝代谢标志物(例如，ALT、AST和胆红素)、肾代谢标志物(例如，BUN和肌酸酐)、组织学、血液学参数(例如，血细胞计数和血细胞比容)等(实施例8)；以及对于在人TMPRSS6转基因小鼠中的效力(实施例9)。
还评估了八种GalNAc缀合的反义化合物的粘度，并且发现八种中的七种具有有利的粘度水平，而发现一种具有边界可接受的粘度水平(实施例10)。
基于在小鼠和体外粘度研究中观察的有利概况，进一步测试了八种GalNAc缀合的反义化合物在降低TMPRSS6中的效力、耐受性以及其在食蟹猴中的铁参数(例如，铁调素水平、血清铁和转铁蛋白饱和度)的影响(实施例11)。通常发现八种GalNAc缀合的反义化合物在食蟹猴中是有效的和可耐受的。发现反义化合物705051、702843、706942和706943在降低TMRPSS6、血清铁和转铁蛋白饱和度方面特别有效。
因此，本文提供具有任何一种或多种有利于其用作治疗剂的特征的反义化合物。在某些实施方案中，本文提供包含如本文所述的修饰的寡核苷酸的反义化合物，所述修饰的寡核苷酸靶向或与选自SEQ ID NO:1-6中任一项的核苷酸的区域特异性地杂交。
在某些实施方案中，如本文所述的某些反义化合物由于其在抑制TMPRSS6表达中的效力而是有效的。在某些实施方案中，所述化合物或组合物将TMPRSS6抑制至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
在某些实施方案中，如本文所述的某些反义化合物由于当在人细胞(例如在Hep3B细胞系)中测试时(如实施例2中所描述)小于20μM、小于10μM、小于8μM、小于5μM、小于2μM、小于1μM、小于0.9μM、小于0.8μM、小于0.7μM、小于0.6μM或小于0.5μM的体外IC50而是有效的。
在某些实施方案中，如本文所述的某些反义化合物由于在体内≤5mpk/wk、≤4mpk/wk、≤3mpk/wk、≤2mpk/wk或≤1mpk/wk的中值有效剂量(ED50)而是有效的。在某些实施方案中，具有ED50≤1mpk/wk的优选反义化合物包括如实施例8中所述的反义化合物702843、706940、706942和706943。
在某些实施方案中，如本文所述的某些反义化合物由于具有小于40cP、小于35cP、小于30cP、小于25cP、小于20cP、小于15cP或小于10cP的粘度而是有效的，如在实施例9中所描述。具有大于40cP的粘度的寡核苷酸将具有低于最佳粘度。
在某些实施方案中，如本文所述的某些反义化合物是高度耐受的，如实施例中所述的体内耐受性测量值所证明。在某些实施方案中，如本文所述的某些反义化合物是高度耐受的，如通过在盐水处理的动物上ALT和/或AST值不超过3倍、2倍或1.5倍的增加所证明。
在某些实施方案中，如本文所述的某些反义化合物由于具有以下中的一个或多个而是有效的：抑制效力大于50％、ED50≤1mpk/wk、粘度小于40cP以及在转基因小鼠中ALT和/或AST的不超过3倍增加。
在某些实施方案中，ISIS 702843(SEQ ID NO:36)是优选的。发现这种化合物在TMPRSS6转基因小鼠中是有效的抑制剂，并且在CD-1小鼠中是非常耐受的反义化合物。在小鼠中，与盐水处理的动物相比，它具有ALT和/或AST水平的不到3倍增加。在huTMPRSS6转基因小鼠中，它具有约33cP的可接受粘度和ED50≤1mpk/wk。此外，在猴中，它是在抑制TMPRSS6方面最有效的化合物之一。
在某些实施方案中，ISIS 705051(SEQ ID NO:36)是优选的。发现这种化合物在TMPRSS6转基因小鼠中是有效的抑制剂，并且在CD-1小鼠中是非常耐受的反义化合物。在小鼠中，与盐水处理的动物相比，它具有ALT和/或AST水平的不到3倍增加。在huTMPRSS6转基因小鼠中，它具有约23cP的可接受粘度和ED50≤3mpk/wk。此外，在猴中，它是在抑制TMPRSS6方面最有效的化合物之一。
在某些实施方案中，ISIS 706942(SEQ ID NO:77)是优选的。发现这种化合物在TMPRSS6转基因小鼠中是有效的抑制剂，并且在CD-1小鼠中是非常耐受的反义化合物。在小鼠中，与盐水处理的动物相比，它具有ALT和/或AST水平的不到3倍增加。在huTMPRSS6转基因小鼠中，它具有约20cP的可接受粘度和ED50≤1mpk/wk。此外，在猴中，它是在抑制TMPRSS6方面最有效的化合物之一。
在某些实施方案中，ISIS 706943(SEQ ID NO:77)是优选的。发现这种化合物在TMPRSS6转基因小鼠中是有效的抑制剂，并且在CD-1小鼠中是非常耐受的反义化合物。在huTMPRSS6转基因小鼠中，与盐水处理的动物相比，它具有ALT和/或AST水平的不到3倍增加。在huTMPRSS6转基因小鼠中，它具有约19cP的可接受粘度和ED50≤1mpk/wk。此外，在猴中，它是在抑制TMPRSS6方面最有效的化合物之一。
实施例
非限制性公开且以引用方式并入
虽然已根据某些实施方案具体描述了本文所述的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用以说明本文所述的化合物并且不意图限制所述化合物。本申请中所述的各参考文献以引用的方式整体并入本文。
实施例1：靶向人II型跨膜丝氨酸蛋白酶6(TMPRSS6)的反义寡核苷酸
大约2200种新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5 MOE缺口聚物或含cET缺口聚物。
5-10-5 MOE缺口聚物被设计为20个核苷长度的寡核苷酸，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联是硫代磷酸酯(P＝S)键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
含cET缺口聚物被设计为具有变化的脱氧、MOE和(S)-cEt缺口聚物基序。脱氧、MOE和(S)-cEt寡核苷酸的长度是16个核苷，其中核苷具有MOE糖修饰、(S)-cEt糖修饰或脱氧核糖。表3中的‘化学’列描述各寡核苷酸的糖修饰。‘k’指示(S)-cEt糖修饰；‘d’指示脱氧核糖；并且‘e’指示MOE修饰。除非另外说明，否则每个缺口聚物整个的核苷间键联是硫代磷酸酯(P＝S)键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1(GENBANK登录号NM_153609.2)的人TMPRSS6 mRNA或在本文中指定为SEQ IDNO:2(从核苷酸16850000至16897000截短的GENBANK登录号NT_011520.12补体)的人TMPRSS6基因组序列。在以下表中，‘n/a’表示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向所述特定基因序列。
测试了2200种嵌合反义寡核苷酸在体外对TMRPSS6 mRNA的单剂量影响。在具有类似培养条件的一系列实验中至少一次测试反义寡核苷酸。
在所测试的2200种中约110种有效反义寡核苷酸的代表性结果呈现于以下所示的表1-3中。选择这些有效的反义寡核苷酸用于如下所述的进一步研究。
表1显示由5-10-5MOE缺口聚物对TMPRSS6 mRNA的抑制百分比。使用电穿孔以4,500nM反义寡核苷酸转染密度为每孔约20,000个细胞的培养的Hep3B细胞。在大约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量TMPRSS6 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3840(正向序列CAAAGCCCAGAAGATGCTCAA，在本文中指定为SEQ ID NO:92；反向序列GGAATAGACGGAGCTGGAGTTG，在本文中指定为SEQ ID NO:93；探针序列ACCAGCACCCGCCTGGGAACTT，在本文中指定为SEQ ID NO:94)来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调整TMPRSS6 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的TMPRSS6的抑制百分比。
表1
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对TMPRSS6 mRNA的抑制
表2显示由另外的5-10-5MOE缺口聚物对TMPRSS6 mRNA的抑制百分比。使用电穿孔以5,000nM反义寡核苷酸转染密度为每孔约20,000个细胞的培养的Hep3B细胞。在大约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量TMPRSS6 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3840来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调整TMPRSS6 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的TMPRSS6的抑制百分比。
表2
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对TMPRSS6 mRNA的抑制
表3示出来自一系列实验的由含cEt缺口聚物对TMPRSS6 mRNA的抑制百分比。使用电穿孔以2,000nM反义寡核苷酸转染密度为每孔约20,000个细胞的培养的Hep3B细胞。在大约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量TMPRSS6 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3840来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调整TMPRSS6 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的TMPRSS6的抑制百分比。
表3
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的含cEt缺口聚物对TMPRSS6 mRNA的抑制
实施例2：靶向人TMPRSS6的反义寡核苷酸在Hep3B细胞中的剂量反应
在体外抑制人TMPRSS6 mRNA的研究中，还在Hep3B细胞中以不同剂量测试了约100种反义寡核苷酸，其选自在实施例1中描述的单剂量实验中测试的约2200种反义寡核苷酸。
对于以下表4中的实验，将细胞以12,000个细胞/孔的密度涂铺并且使用电穿孔，以0.15μM、0.44μM、1.33μM、4.00μM和12.00μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在大约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量TMPRSS6 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3840来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调整TMPRSS6mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的TMPRSS6的抑制百分比。“0”表示反义寡核苷酸不降低TMPRSS6 mRNA水平。
还呈现了各寡核苷酸的半最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，TMPRSS6 mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表4
使用5-10-5MOE缺口聚物的剂量反应测定
对于以下表5中的实验，将细胞以5,000个细胞/孔的密度涂铺并且使用电穿孔，以0.19μM、0.56μM、1.67μM和5.0μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在大约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量TMPRSS6 mRNA水平。再次使用人引物探针集RTS3840来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调整TMPRSS6mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的TMPRSS6的抑制百分比。
还呈现了各寡核苷酸的半最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，TMPRSS6 mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表5
使用含cEt的寡核苷酸的剂量反应测定
对于以下表6中的实验，将细胞以20,000个细胞/孔的密度涂铺并且使用电穿孔，以0.22μM、0.67μM、2.00μM和6.0μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在大约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量TMPRSS6 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3840来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调整TMPRSS6 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的TMPRSS6的抑制百分比。
还呈现了各寡核苷酸的半最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，TMPRSS6 mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表6
使用含cEt的寡核苷酸的剂量反应测定
实施例3：靶向人TMPRSS6的5-10-5 MOE缺口聚物在CD1小鼠中的耐受性
小鼠(Charles River,MA)是经常被用于安全性和功效测试的多用途小鼠模型。将小鼠用选自上述表的约26种ISIS 5-10-5 MOE缺口聚物反义寡核苷酸处理，并且评价各种血浆化学标志物水平的变化。
处理
每周两次向六周龄雄性CD1小鼠的组皮下注射50mg/kg的ISIS寡核苷酸(100mg/kg/周剂量)，持续6周。每周两次向一组雄性CD1小鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为了评价ISIS寡核苷酸对肝和肾功能的作用，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量了转氨酶(ALT和AST)、总胆红素(Tbil)、白蛋白(Alb)、肌酸酐(Creat)和BUN的血浆水平。结果呈现于表7中。引起超出反义寡核苷酸的预期范围的肝或肾功能标志物的任一种的水平变化的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表7
在第六周时CD1小鼠中的血浆化学标志物
体重及器官重量
在实验开始时测量所有组小鼠的体重，并且每周测量直到研究结束。在研究结束时还测量了肝、脾和肾重量，并且相对于在基线的PBS对照组，体重和器官重量的变化呈现于表8中。引起超出反义寡核苷酸的预期范围之外的器官重量的任何变化的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表8
在第六周时CD1小鼠的体重和相对器官重量(克)
从这些耐受性研究，观察到大多数5-10-5MOE缺口聚物反义寡核苷酸在给药6周后耐受性良好。
实施例4：靶向人TMPRSS6的含cEt寡核苷酸在CD1小鼠中的耐受性
小鼠(Charles River,MA)是经常被用于安全性和功效测试的多用途小鼠模型。将小鼠用选自上述表的约51种含cEt反义寡核苷酸处理，并且评价各种血浆化学标志物水平的变化。
处理
每周两次向5至6周龄雄性CD1小鼠的组(每个治疗组n＝4)皮下注射25mg/kg的ISIS寡核苷酸(50mg/kg/周剂量)，持续6周。每周两次向一组雄性CD1小鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。收集肝、肾和脾用于组织学，并且收集血浆以测量某些血浆化学标志物的水平。
将寡核苷酸分成具有相同条件的两个测试组，并且结果呈现于以下表中。
血浆化学标志物
为了评价ISIS寡核苷酸对肝和肾功能的作用，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量了转氨酶、胆红素、白蛋白、肌酸酐和BUN的血浆水平。结果呈现于表9-10中。引起超出反义寡核苷酸的预期范围的肝或肾功能标志物的任一种的水平变化的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表9
在第六周时CD1小鼠中的血浆化学标志物
表10
在第六周时CD1小鼠中的血浆化学标志物
体重及器官重量
在实验开始时测量所有组小鼠的体重，并且每周测量直到研究结束。在研究结束时还测量了肝、脾和肾重量，并且相对于在基线的PBS对照组，体重和器官重量的变化呈现于表11-12中。引起超出反义寡核苷酸的预期范围之外的器官重量的任何变化的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表11
在第六周时CD1小鼠的体重和相对器官重量(克)
表12
在第六周时CD1小鼠的体重和相对器官重量(克)
实施例5：靶向人TMPRSS6的寡核苷酸在Sprague-Dawley大鼠中的耐受性
Sprague-Dawley大鼠是用于安全性和功效评价的多用途模型。将大鼠用来自以上实施例中描述的研究的被发现在小鼠中体外有效和耐受的约48种反义寡核苷酸处理，并且评价各种血浆化学标志物水平的变化。
处理
将雄性Sprague-Dawley大鼠(约8周龄)维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Purina正常大鼠食物饲料5001。每周一次向各自4只Sprague-Dawley大鼠的组皮下注射100mg/kg的MOE缺口聚物或50mg/kg的含cEt反义寡核苷酸，持续6周。在最终剂量后1至2天，测定尿蛋白/肌酸酐(P/C)比率，并且在最后一次剂量后3天抽取血液用于以下所述的血液学评估。在最后一次剂量三天后，使大鼠安乐死并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为了评价ISIS寡核苷酸对肝和肾功能的作用，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量了转氨酶(丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(Tbil)、白蛋白(Alb)、肌酸酐(Creat)和BUN的血浆水平。结果呈现于表13中。引起超出反义寡核苷酸的预期范围的肝或肾功能标志物的任一种的水平变化的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表13
Sprague-Dawley大鼠中的血浆化学标志物
表14
Sprague-Dawley大鼠的尿中的P/C比率
血液学测定
从含有K2-EDTA的管中的每个可用研究动物收集大约1.3mL血液的血液样品，并且送至IDEXX Laboratories,Inc.(Fremont,CA)用于红血细胞计数(RBC)计数和白血细胞计数(WBC)计数、个别白血细胞计数(如单核细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞的白血细胞计数)以及血小板计数、总血红蛋白含量和血细胞比容(HCT)的测量和分析。结果呈现于表15中。引起超出反义寡核苷酸的预期范围的血液学标志物的任一种的水平变化的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表15
Sprague-Dawley大鼠中的血液学标志物
体重及器官重量
在实验开始时测量所有组大鼠的体重，并且每周测量直到研究结束。在研究结束时还测量了肝、脾和肾重量，并且相对于在基线的PBS对照组，体重和器官重量的变化呈现于表16中。引起超出反义寡核苷酸的预期范围之外的器官重量的任何变化的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表16
在第六周时Sprague-Dawley大鼠的体重和相对器官重量(克)
实施例6：TMPRSS6在转基因小鼠模型中的反义抑制作用
进一步评价了在上述大鼠研究中发现可耐受的约32种反义寡核苷酸在具有人TMPRSS6转基因的小鼠(“huTMPRSS6”或“Tg”小鼠)中降低人TMPRSS6 mRNA转录物的能力。
处理
向8至16周龄的雄性和雌性huTMPRSS6转基因小鼠皮下注射在两周的时间段内施用的5个剂量的6mg/kg/剂量的靶向TMPRSS6的ISIS反义寡核苷酸(总计30mg/kg)，或皮下注射PBS作为对照。每个处理组由4只动物组成。在施用最后一次剂量四十八小时后，从每只小鼠中抽血并且将小鼠杀死并收集组织。
RNA分析
在研究结束时，从肝中提取RNA以用于肝TMPRSS6 mRNA表达的实时PCR分析。结果在表17中呈现为相对于PBS处理的动物的抑制百分比。使用人引物探针集RTS4586(正向序列TGATAACAGCTGCCCACTG，在本文中指定为SEQ ID NO:86；反向序列TCACCTTGAAGGACACCTCT，在本文中指定为SEQ ID NO:87；探针序列AGTTCTGCCACACCTTGCCCA，在本文中指定为SEQ IDNO:88)来测量mRNA水平。将mRNA水平用亲环素A(一种管家基因)的水平标准化，所述水平使用引物探针集mCYCLO_24(正向序列TCGCCGCTTGCTGCA，在本文中指定为SEQ ID NO:89；反向序列ATCGGCCGTGATGTCGA，在本文中指定为SEQ ID NO:90；探针序列CCATGGTCAACCCCACCGTGTTC，在本文中指定为SEQ ID NO:91)测定。
表17
标准化至PBS表达的TMPRSS6 mRNA在转基因小鼠肝中的抑制％
ISIS No 抑制％
585626 57
585653 74
585683 81
585698 59
585698 59
585774 69
585775 81
591514 73
615899 88
615900 88
615903 97
630716 82
630718 99
630722 92
630794 71
630800 81
630948 65
630950 81
630957 70
647384 66
647393 95
647395 100
647419 99
647420 96
647446 84
647447 89
647448 96
647449 88
647475 84
647476 84
647477 96
647478 91
647506 91
实施例7：缀合至靶向TMPRSS6的GalNAc3的反义化合物
选择在上述实施例中发现有效和可耐受的靶向TMPRSS6的选定反义寡核苷酸的序列作为亲本序列来设计靶向人TMPRSS6的新的GalNAc3缀合的反义化合物。
如以下表18中所总结，在此实施例中描述的新设计的反义化合物各自具有5'-三己基氨基-(THA)-C6GalNAc3端帽。ISIS 702843是具有带有5'-三己基氨基-(THA)-C6GalNAc3端帽的混合(硫代磷酸酯和磷酸二酯)主链(“MBB”)的5-10-5MOE缺口聚物。ISIS705051、705052和705053是具有带有5'-三己基氨基-(THA)-C6GalNAc3端帽的硫代磷酸酯主链的5-10-5MOE缺口聚物。ISIS 706940是具有所有硫代磷酸酯核苷间键联和5'-三己基氨基-(THA)-C6GalNAc3端帽的3-10-3cEt缺口聚物；ISIS 706941、706942和706943是具有带有5'-三己基氨基-(THA)-C6GalNAc3端帽的硫代磷酸酯主链的脱氧、MOE和含(S)-cEt缺口聚物。
表18
靶向TMPRSS6 mRNA的八种未缀合的反义化合物和相应的GalNAc3缀合物反义化合物
表18中描述的所有寡核苷酸序列都与人和恒河猴序列互补。在进行本文所述的研究时，针对TMPRSS6的食蟹猴基因组序列在National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)数据库中是不可用的；因此，不能确认靶向人TMPRSS6的反义寡核苷酸与食蟹猴基因序列的交叉反应性。取而代之，将反义寡核苷酸的序列与恒河猴序列针对同源性进行比较。预期与恒河猴序列具有同源性的ISIS寡核苷酸也与食蟹猴序列完全交叉反应。
选择用于GalNAc缀合的反义寡核苷酸与恒河猴基因组序列(从核苷酸380000至422000截短的GENBANK登录号NW_001095180.1的补体，在本文中指定为SEQ ID NO:95)完全互补。恒河猴序列的每个寡核苷酸的起始位点和终止位点呈现于表19中，而人序列的每个寡核苷酸的起始位点和终止位点呈现于表20中。“起始位点”表示恒河猴或人序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。
表19
与恒河猴TMPRSS6基因组序列(SEQ ID NO:95)互补的ASO
表20
由GalNAc3修饰的反义寡核苷酸靶向的TMPRSS6 mRNA(SEQ ID NO:1)和/或基因组(SEQ ID NO:2)序列上的位点
实施例8：靶向人TMPRSS6的GalNAc3修饰的反义寡核苷酸在CD-1小鼠中的耐受性
用以上表18中描述的ISIS GalNAc3修饰的反义寡核苷酸处理小鼠(Charles River,MA)，并且评价各种血浆化学标志物水平的变化。
处理
每周两次向6周龄雄性CD1小鼠的组(每个治疗组n＝4)皮下注射40mg/kg的ISISMOE缺口聚物GalNAc3修饰的反义寡核苷酸(80mg/kg/周剂量)或20mg/kg的以上表14中所述的ISIS含(S)-cEt缺口聚物GalNAc3修饰的反义寡核苷酸(40mg/kg/周剂量)持续6周。每周两次向一组雄性CD1小鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。收集肝、肾、脾、心脏和肺用于组织学，并且收集血浆以测量某些血浆化学标志物的水平。
血浆化学标志物
为了评价ISIS GalNAc3修饰的寡核苷酸对肝和肾功能的作用，使用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量了转氨酶、胆红素、白蛋白、肌酸酐和BUN的血浆水平。结果呈现于表21中。引起超出反义寡核苷酸的预期范围的肝或肾功能标志物的任一种的水平变化的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表21
在第六周时CD1小鼠中的血浆化学标志物
体重及器官重量
在实验开始时测量所有组小鼠的体重，并且每周测量直到研究结束。在研究结束时还测量了肝、肾和脾重量，并且相对于在基线的PBS对照组，体重和器官重量的变化呈现于表22中。引起超出反义寡核苷酸的预期范围之外的器官重量的任何变化的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表22
在第六周时CD1小鼠的体重和相对器官重量的变化(克)
血液学
为了评价CD1小鼠中的ISIS GalNAc3修饰的反义寡核苷酸对血液学参数的任何影响，从含有K2-EDTA的管中的每个可用研究动物收集大约1.3mL血液的血液样品。使用ADVIA120血细胞分析仪(Bayer,USA)分析样品的红血细胞(RBC)计数、白血细胞(WBC)计数、个别白血细胞计数(诸如单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的计数)以及血小板计数、血红蛋白含量和血细胞比容。数据呈现于表23中。
所述数据示出寡核苷酸不会引起超出在此剂量下的寡核苷酸的预期范围之外的血液学参数的显著变化。通常，ISIS GalNAc缀合的反义寡核苷酸在小鼠的血液学参数方面是良好耐受的。
表23
CD1小鼠中的血细胞计数
进行来自CD-1小鼠的肝、脾、肾脏、心脏和肺中的GalNAc缀合的TMPRSS6反义化合物的组织学评估。总体而言，尽管在肝中以比未缀合的寡核苷酸具有多大约8倍活性的剂量给予GalNAc3缀合的反义寡核苷酸，但它们是用于抑制TMPRSS6的良好耐受的和有用的化合物，并且是用于治疗铁积聚疾病、病症或病状的重要候选物。
实施例9：靶向TMPRSS6的反义寡核苷酸在huTMPRSS6转基因小鼠中的剂量反应
测试了八种靶向TMPRSS6的ISIS GalNAc3修饰的反义寡核苷酸(ISIS No.702843、705051、705052、705053、706940、706941、706942和706943)以及两种母体化合物(ISIS585774和ISIS 630718)，并且在剂量-反应研究中评价了其在huTMPRSS6转基因小鼠中抑制人TMPRSS6 mRNA表达的能力。
处理
将huTMPRSS6Tg小鼠维持在12小时亮/暗循环中，并且随意喂食正常小鼠食物。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在缓冲盐水(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)，并通过0.2微米过滤器过滤灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中用于注射。
将大约3.5至4.5个月龄的雄性和雌性huTMPRSS6小鼠分成44组，每组4只小鼠(在每个组中2只雄性和2只雌性)。小鼠接受皮下注射ISIS寡核苷酸，每周两次，持续三周。一组小鼠接受每周两次皮下注射PBS，持续三周。在施用最后一次剂量四十八小时后，从每只小鼠中抽血并且将小鼠杀死并收集组织。
RNA分析
在处理期结束时，从转基因小鼠的肝中提取总RNA以用于人TMPRSS6 mRNA表达的定量实时PCR分析和测量。将TMPRSS6mRNA水平用亲环素A(一种管家基因)的水平标准化，亲环素A的水平根据标准方案使用mCYCLO_24引物探针集测定。以下结果作为标准化至PBS处理的对照的每个处理组的TMPRSS6 mRNA水平的平均百分比呈现在表24中并且表示为“％PBS”。100以上的值被简单记为“100”。负值被简单地记为“0”。
使用人引物探针集RTS4586(正向序列TGATAACAGCTGCCCACTG，在本文中指定为SEQID NO:86；反向序列TCACCTTGAAGGACACCTCT，在本文中指定为SEQ ID NO:87；探针序列AGTTCTGCCACACCTTGCCCA，在本文中指定为SEQ ID NO:88)来测量mRNA水平。
表24
在Tg小鼠中对靶向TMPRSS6的8种ISIS GalNAc3缀合的化合物和两种未缀合的化合物的反应
血浆化学标志物
为了评价ISIS寡核苷酸对肝和肾功能的作用，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量了转氨酶、胆红素和BUN的血清水平并且呈现于以下表25中。引起超出反义寡核苷酸的预期范围的肝或肾功能标志物的任一种的水平变化的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表25
靶向TMPRSS6的八种ISIS GalNAc3修饰的ASO和两种未缀合的化合物在转基因小鼠中的血清化学
所有GalNAc缀合的ASO都是良好耐受的，器官和体重以及血清转氨酶水平均无明显变化。
计算了每种ASO的半最大有效剂量(ED50)并且呈现于以下表26中。
表26
靶向TMPRSS6的八种ISIS GalNAc3修饰的ASO和两种未缀合的化合物的效力
ED50计算表明，GalNAc缀合的ASO比未缀合的ASO效力高大约10倍。ISIS 702843是最有效的GalNAc缀合的5-10-5MOE缺口聚物化合物。
实施例10：靶向TMPRSS6的反义寡核苷酸的粘度评估
测量了反义寡核苷酸的粘度，目的是筛选出粘度大于40cP的反义寡核苷酸。粘度大于40cP的寡核苷酸对于施用至受试者将不是最佳的。
将ISIS寡核苷酸(32-35mg)称量到玻璃小瓶中，添加120μL的水，并通过在50℃下加热小瓶将反义寡核苷酸溶解于溶液中。将预加热的样品的一部分(75μL)移液至微量粘度计(Cambridge)。微量粘度计的温度设定为25℃并且测量样品的粘度。将预加热的样品的另一部分(20μL)移液到10mL的水中，以在85℃下在260nM下UV读取(Cary UV instrument)。结果呈现于表27中，并且表明大多数GalNAc反义寡核苷酸溶液在上述标准下其粘度是最佳的。反义寡核苷酸706941是唯一具有高于40cP的粘度水平的所测试的反义寡核苷酸。
表27
GalNAc-缀合的ASO的粘度数据
实施例11：在食蟹猴中通过包含GalNAc3缀合物的靶向TMPRSS6的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在进行此研究时，针对TMPRSS6的食蟹猴基因组序列在National Center forBiotechnology Information(NCBI)数据库中是不可用的；因此，不能确认靶向人TMPRSS6的反义寡核苷酸与食蟹猴基因序列的交叉反应性。取而代之，如以上实施例6中所描述将反义寡核苷酸的序列与恒河猴序列针对同源性进行比较。预期与恒河猴序列具有同源性的ISIS寡核苷酸也与食蟹猴序列完全交叉反应。
选择用于在食蟹猴中测试的十种人TMPRSS6反义寡核苷酸与如在以上实施例6中所述的恒河猴基因组序列(SEQ ID NO:95)具有0个错配。
研究设计
在雄性食蟹猴中的TMPRSS6 mRNA的反义抑制的13周研究中评价了十种反义寡核苷酸的功效和耐受性，以及其在肝和肾中的药代动力学概况。通过皮下施用靶向TMPRSS6的8种ISIS GalNAc3修饰的ASO和两种未缀合的母体反义寡核苷酸处理猴，如表28中所示。
表28
在食蟹猴研究中比较的ASO
组 ISIS# 剂量
1 PBS对照 n/a
2 585774 25mpk
3 705051 30mpk
4 705052 30mpk
5 705053 30mpk
6 702843 30mpk
7 705051 5mpk
8 702843 5mpk
9 630718 23mpk
10 706940 30mpk
11 706941 30mpk
12 706942 30mpk
13 706943 30mpk
14 706940 5mpk
评估了GalNAc缀合的ASO的高剂量(30mpk)组的毒性。将GalNAc缀合的ASO的低剂量(5mpk)组与相应的未缀合的亲本序列进行比较以评估活性。第2、3、6、7和8组是相同的序列，并且混合主链(MBB)化合物ISIS No.702843在低剂量和高剂量下进行测试，以及与完全硫代磷酸酯化合物ISIS No.705051(也在低剂量和高剂量下测试)进行比较。第9、10、11和14组是相同的序列，并且ISIS No.706940在低剂量和高剂量下进行测试。
处理
在研究之前，将猴保持隔离，在此期间，每天观察动物的一般健康状况。猴年龄为2至4岁，体重为2至4kg。将56只雄性食蟹猴随机分为14个处理组，每组4只猴。使用不锈钢给药针头和适当尺寸的注射器将猴各自每隔一天皮下注射持续第一周，且然后每周一次持续11周，共计15个剂量的ISIS寡核苷酸或PBS。尾部放血在第一次施用前1周进行，然后在第9、16、30、44、58、72和86天再次进行。
在研究期期间，每天两次观察猴的生病或不适的迹象。在与实验负责人协商后，由兽医用得到批准的止痛剂或缓解疼痛的试剂处理经历因治疗、损伤或生病所引起的超过瞬时或轻微的疼痛或不适的任何动物。鉴定出任何处于不良健康状况或处于可能的濒死状况的动物以供进一步监测以及可能的安乐死。动物的计划安乐死在第86天进行。实施例中所述的实验方案由Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)批准。
在第一剂量之前和之后的不同时间点，针对临床病理学终点(血液学、临床化学、凝血、补体Bb和C3、细胞因子和趋化因子分析)进行抽血，并且还测量了尿化学。在基线和实验期结束时，测量了某些药理学终点，如肝TMPRSS6 mRNA表达、血清铁调素(IntrinsicLifeSciences,San Diego,CA)、血清铁和血清转铁蛋白饱和度。在研究结束时，测量身体和器官重量、组织的组织病理学以及肝和肾的PK分析。没有观察到体重、细胞因子或白蛋白水平的显著变化。
TMPRSS6 RNA分析
在研究结束时，从肝中提取RNA以用于使用各种引物探针集进行TMPRSS6的mRNA表达的测量的实时PCR分析。使用引物探针集RTS3840的代表性数据呈现于以下表中。表29中的结果被呈现为用亲环素(mCYCLO_24引物探针集)标准化的相对于盐水对照的TMPRSS6mRNA的抑制百分比。
表29
在12周ASO施用后，猴肝TMPRSS6 mRNA的降低
ISIS No.705051、702843、706942和706943非常有效，在给药13周后在30mpk下展示≥89％的靶标降低。
铁调素分析
在以下表30中所示的时间点测量血清铁调素水平。结果被呈现为盐水对照百分比。“第-7天”表示在施用第一剂量之前一周。
表30
猴血清铁调素水平
该表显示，在研究过程中血清铁调素水平升高。
血清铁和转铁蛋白饱和度分析
来自14个治疗组中的每一个的四名受试者的平均值呈现于以下表31中。如表31中所示，与对照相比，血清铁水平和转铁蛋白饱和度(“Tf sat”)在处理组中在第86天降低。
表31
在第86天的猴血清铁和转铁蛋白饱和度水平
序列表
<110> IONIS制药公司
<120> 用于调节TMPRSS6表达的化合物和方法
<130> BIOL0271WO
<150> 62/142,986
<151> 2015-04-03
<160> 95
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3212
<212> DNA
<213> 智人()
<400> 1
cttgagccag acccagtcca gctctggtgc ctgccctctg gtgcgagctg acctgagatg 60
cacttccctc ctctgtgagc tgtctcggca cccacttgca gtcactgccg cctgatgttg 120
ttactcttcc actccaaaag gatgcccgtg gccgaggccc cccaggtggc tggcgggcag 180
ggggacggag gtgatggcga ggaagcggag ccggagggga tgttcaaggc ctgtgaggac 240
tccaagagaa aagcccgggg ctacctccgc ctggtgcccc tgtttgtgct gctggccctg 300
ctcgtgctgg cttcggcggg ggtgctactc tggtatttcc tagggtacaa ggcggaggtg 360
atggtcagcc aggtgtactc aggcagtctg cgtgtactca atcgccactt ctcccaggat 420
cttacccgcc gggaatctag tgccttccgc agtgaaaccg ccaaagccca gaagatgctc 480
aaggagctca tcaccagcac ccgcctggga acttactaca actccagctc cgtctattcc 540
tttggggagg gacccctcac ctgcttcttc tggttcattc tccaaatccc cgagcaccgc 600
cggctgatgc tgagccccga ggtggtgcag gcactgctgg tggaggagct gctgtccaca 660
gtcaacagct cggctgccgt cccctacagg gccgagtacg aagtggaccc cgagggccta 720
gtgatcctgg aagccagtgt gaaagacata gctgcattga attccacgct gggttgttac 780
cgctacagct acgtgggcca gggccaggtc ctccggctga aggggcctga ccacctggcc 840
tccagctgcc tgtggcacct gcagggcccc aaggacctca tgctcaaact ccggctggag 900
tggacgctgg cagagtgccg ggaccgactg gccatgtatg acgtggccgg gcccctggag 960
aagaggctca tcacctcggt gtacggctgc agccgccagg agcccgtggt ggaggttctg 1020
gcgtcggggg ccatcatggc ggtcgtctgg aagaagggcc tgcacagcta ctacgacccc 1080
ttcgtgctct ccgtgcagcc ggtggtcttc caggcctgtg aagtgaacct gacgctggac 1140
aacaggctcg actcccaggg cgtcctcagc accccgtact tccccagcta ctactcgccc 1200
caaacccact gctcctggca cctcacggtg ccctctctgg actacggctt ggccctctgg 1260
tttgatgcct atgcactgag gaggcagaag tatgatttgc cgtgcaccca gggccagtgg 1320
acgatccaga acaggaggct gtgtggcttg cgcatcctgc agccctacgc cgagaggatc 1380
cccgtggtgg ccacggccgg gatcaccatc aacttcacct cccagatctc cctcaccggg 1440
cccggtgtgc gggtgcacta tggcttgtac aaccagtcgg acccctgccc tggagagttc 1500
ctctgttctg tgaatggact ctgtgtccct gcctgtgatg gggtcaagga ctgccccaac 1560
ggcctggatg agagaaactg cgtttgcaga gccacattcc agtgcaaaga ggacagcaca 1620
tgcatctcac tgcccaaggt ctgtgatggg cagcctgatt gtctcaacgg cagcgacgaa 1680
gagcagtgcc aggaaggggt gccatgtggg acattcacct tccagtgtga ggaccggagc 1740
tgcgtgaaga agcccaaccc gcagtgtgat gggcggcccg actgcaggga cggctcggat 1800
gaggagcact gtgactgtgg cctccagggc ccctccagcc gcattgttgg tggagctgtg 1860
tcctccgagg gtgagtggcc atggcaggcc agcctccagg ttcggggtcg acacatctgt 1920
gggggggccc tcatcgctga ccgctgggtg ataacagctg cccactgctt ccaggaggac 1980
agcatggcct ccacggtgct gtggaccgtg ttcctgggca aggtgtggca gaactcgcgc 2040
tggcctggag aggtgtcctt caaggtgagc cgcctgctcc tgcacccgta ccacgaagag 2100
gacagccatg actacgacgt ggcgctgctg cagctcgacc acccggtggt gcgctcggcc 2160
gccgtgcgcc ccgtctgcct gcccgcgcgc tcccacttct tcgagcccgg cctgcactgc 2220
tggattacgg gctggggcgc cttgcgcgag ggcggcccca tcagcaacgc tctgcagaaa 2280
gtggatgtgc agttgatccc acaggacctg tgcagcgagg tctatcgcta ccaggtgacg 2340
ccacgcatgc tgtgtgccgg ctaccgcaag ggcaagaagg atgcctgtca gggtgactca 2400
ggtggtccgc tggtgtgcaa ggcactcagt ggccgctggt tcctggcggg gctggtcagc 2460
tggggcctgg gctgtggccg gcctaactac ttcggcgtct acacccgcat cacaggtgtg 2520
atcagctgga tccagcaagt ggtgacctga ggaactgccc ccctgcaaag cagggcccac 2580
ctcctggact cagagagccc agggcaactg ccaagcaggg ggacaagtat tctggcgggg 2640
ggtgggggag agagcaggcc ctgtggtggc aggaggtggc atcttgtctc gtccctgatg 2700
tctgctccag tgatggcagg aggatggaga agtgccagca gctgggggtc aagacgtccc 2760
ctgaggaccc aggcccacac ccagcccttc tgcctcccaa ttctctctcc tccgtcccct 2820
tcctccactg ctgcctaatg caaggcagtg gctcagcagc aagaatgctg gttctacatc 2880
ccgaggagtg tctgaggtgc gccccactct gtacagaggc tgtttgggca gccttgcctc 2940
cagagagcag attccagctt cggaagcccc tggtctaact tgggatctgg gaatggaagg 3000
tgctcccatc ggaggggacc ctcagagccc tggagactgc caggtgggcc tgctgccact 3060
gtaagccaaa aggtggggaa gtcctgactc cagggtcctt gccccacccc tgcctgccac 3120
ctgggccctc acagcccaga ccctcactgg gaggtgagct cagctgccct ttggaataaa 3180
gctgcctgat caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 3212
<210> 2
<211> 47001
<212> DNA
<213> 智人()
<400> 2
tgggtggaat cacttgaggt caggagttcg agaccagcct ggctaacatg gtgaaacccc 60
atctcttcta aaattatgaa aattagccgg gcatggtggt gggcgctgta atcccagcta 120
cctgggaggc tgaggcagga gaattgcttg aacccgggag gcggaggttg cagtgagccg 180
aaatcacacc actgcactct agcctgggtg acggagtgag actccatctt aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaagaacga ggtaggaatt caaataattc ccagctaaac agaaaatagc 300
atcaaacccc acccctgcct cccctttctc ctctccagtc cccagagtat atgggcccag 360
cctccttttc tctctctcag gccagcagct cctttagtct cgcctgtcca ggtaagcacc 420
tggactcacc cttgtgagcc cctgcactca cctgcaccgg cctctgcaca gtccccagtc 480
cttggctgtc cctacctcat gctctcgggg accaggggct gtaaccaggc aggcatgtca 540
ccaggcaacg ggcctcgggg gagagctcag atctcccgca cctgcctgcc agcctctggg 600
gtgcccatgc gggggtgggg gaagatgggg cggggcaggc actgccttct cctacctcct 660
gcctgtttac ctgtacttag tcacagtgct gtccaggacc cagcaggagg agttccatgg 720
agcctgaggc cacaggccac aggggacaag ggccagacac cctggtcatg gctctaggcc 780
attgatccag cctgggctgg ctgggtgggg gtggggaggc cttggcctgg acaaacagag 840
gctcctgagg cctgtgtgca ggcccggcac ctatctgccg ctcccaaagg taagcggggg 900
cctccaggac aggggaccgg gatctataaa tgacctagtg acagtgtcca ccctaagagc 960
tgggcctggc tccctgcagc ctgagccacc taccctgctc cgaggccagg cctgcagggc 1020
ctcatcggcc agagggtgat cagtgagcag aaggtgaggg gcccacagag ctggggaggg 1080
gagggaccac gcagggtgac accaggtgtg tggacaggca cagcatcagt gctgggtggt 1140
tggtggcctg ggattcaggt ggcagggaca ggaggaaggg agaggccacc ctacccctgc 1200
ctcgcaggac tggacatgct gccccctcca cacccggtac cccacctggg ccttctggtg 1260
taggagacag gcccggagcc ccacattgca cctatgtact gacttaagcc caggaccctg 1320
ggctcacagg ctcagagttg gcatgtatgt gtatgtgtgt tcgtgtgtgt gtctgtgtag 1380
gaagggcgtg catctatgaa tttttgtgtc atgaatagat gtgcgtatat ccctccgcgt 1440
gtctccatct gtgtacatct gtgggtctgt gagtgtgttt atatgtgtgg aagggacccc 1500
cacccagtcc cccacactct caggactcta gggcctaatg gtttcactga aagatgcccc 1560
tatggcccta gcccagagtc cctgctctgc tctgctctgc cctggctgag ggacctcggg 1620
taagtcatgt tacctctctc tacctcagtt tccccagcca ttaaatagag tcagcaaagt 1680
aggcacccca ggctgttgga ggctgcagtg gagtttgcag cactgcccag cacagggctg 1740
gcacatggta ggagttcata cgcagtggtt gaatccggat ctgcattgct gggggagtcg 1800
cggccccgcc ccaaggagct cagcctccag caggcagacc cgagaccctc caatggccag 1860
aagggcagga gggagtgagg agcaggtgcc agggtggggt ccatggtgct cagagctggg 1920
ggactgcttc aggcccctgt ggcaattgga gcacagtccc cgcttccagg agttcaatgt 1980
gaggggcaaa gagagagtgc ccacaggtaa gctgcacatc gcgaggggca gccgcccctt 2040
ctagggcact ctgggagagc tgcgaagagg tgaggtctga actgaggtga caggggctgc 2100
ataagagctg gccaggttgg gaggtggggg cccaggcaga aggaagagtg tggggacgcc 2160
tggccgtgaa caagcactga cagggctcaa ggtccacgag ggctcttggt gccggctggc 2220
tgctcttaat ccataaatgt ttgctaccat cccattgtta aaatttctca ccaatggaag 2280
tccagtgtcc ttggggtgcg acggggaaaa gagagggtgg gaaaaaagga ggcaggagaa 2340
gttggccagg ccacatatgc acacagcacc ttggacttct gtagggagga aggagctggg 2400
accttgtcat tcattcattt aacaattact gagtgtccgc tgagtaccag actctgctct 2460
catgcagctt acagacaggg aggaggcaga taaatgacat atttgcatat caggcaattt 2520
aggcctctgt aattgctata aagaaaaatg caggagagac gggagtgccc agggaaggcc 2580
tctctggaga ggtgacatct gaccctttgg aggaggtaaa ggagggagcc acgaggccag 2640
cagaaaggaa aacatcccag gcccagcaag gagcaaacct cccattcagc aaagaggaca 2700
ggaaaactga gaccctgggt ctttagggac tgtgttctag gtggatggaa gccgtgcgag 2760
gcttgtgggc agggcacatg gtgacaacac gcagtggcca ttgtgtgaga actcactggg 2820
taggggggtg ggtgattggc tattgcagga gtcgaggtga cagatgacgg tggcctggat 2880
gatggtggga gtcatggggg gccaagaagg ggctggcttt ggggggcatt tggaaggtag 2940
ggccacaggc ttttccaaag gtgctggacc ctgggaatgg gggagccgtt gtattataag 3000
atagtaaaga caagagtggc accgtcatct tcacaactgt ccactgcccc tcctcctgct 3060
gggcaggaaa cccaagagga tgggaatgag gtctcttaga gtcaccatgt gccaccctgt 3120
cgccaccaca gagcctggca ccaagcaggt gctagacaaa gatagggtga ctgagcattg 3180
aacctgggac cccacaggcc cacaccattg tccatgcccc agtgccaggc ctcacaagtc 3240
ctccttcctg gaggcagcaa gatagaaagc cctgtaccag gggcctagag acttggcagt 3300
ttcattcact cattctttct gatccttcac tcatgtgacg ggctgtgcgg cgttccatgg 3360
ggaaccccag aggtgagcaa gatgctggcc ctgcctgttc tgtaggggac agaggcaaga 3420
cccaaagcca aggcatattc ttgatctgat caagggctgc ccaggggagg gggcagctta 3480
actagccagg ggcccagaac ccagtgcctg gcaggtcgcc tggtaagagt tccccacagt 3540
ccaggcaggg ggactcagct gcacaaaggc agggtctcgt gggcctgggg caccatgtgc 3600
atgatggaag ttatagccac gaggagggtg gacagcagcc tggccatgga gggtcttgga 3660
tgtcgcagca aggggtttgg atgataagtg gctgggagct gtgaaaggat cctgagcagg 3720
tgagcgattg agctggggag ggaggatgcg ctggaagacg caatggaggc aggggaccta 3780
gtgaggaggc cgccccaggg gtttgggtgg gaagttatga tgagcccggg ggaattaatt 3840
tcccactact gccatttgga ccatggcttg ggtttttaca gagggtgtcc tgaaaatgag 3900
cctctctgtg ctgctcaaag tcctcccaga tggatgcgag gggcatttag agggaggcaa 3960
aatctgcata gagaaggacg cctggcttgg aggatgagag gggaggggag gcccaccaag 4020
caccccacca tgagctgccc ctcttcgggc ttcctctaat ggacccacga cctgctccga 4080
gcctcagttt ccctctcttt acactgatta tctgagaggt agtagggctc agtgatcagg 4140
gcgtcactct gaagtcaatc tgcttgactt tgcagcctgg ctgtgctgct gaccagctgt 4200
gtgaccttag ccaagctgct caacctctct gtgccttgac tctcccatct gtaaagtagg 4260
agtgatcaga gtacctgtcc ccacaggatc tgtgtaaggc ttacatgaga aagtgcacat 4320
aaagcaacag agacaattga aataaatgtc acctgttacc acctctatgc ccccgagtcc 4380
ccatggctct atgactcatc ccaaaatagc tcctttgtga tccagactca agagtaaaac 4440
agggccaggt atggtggctc acatctgtaa tctcaacact tcaggaggcc aaggtgaggg 4500
gatcgcttga ggccaggtgt ttgagacctg gtctctacaa aaaataaaac tataaaatta 4560
gccaggtgtg ctggtgcacc tgtagtccca gctacttggg aggctgaggt gggaggatca 4620
ctcgaaccca ggagttggag gctggggtga gctatgatcg tgctaccata ctccagcctg 4680
ggtgacagag tgagatcctg tcccttaaac aaaaggggtg cgacgggaat atggtgtcct 4740
cctctggcag agggagggga cgagggactg aaagaagggc aaggagccaa cccatcacct 4800
gggatcttcc caatccagca aaccttctca gattttgagg acagccacct cagtcagagg 4860
tggccagccc aggacagaca ggcagctctg cgctggggac tcaaacctgc catgtggcct 4920
catgcaagag tctcagcacc ctgttactgg tctgtttctt gcctgtttct cactagggat 4980
gctgtgaaca tttgaggaag tgggcggggc tgtcccaccc gttgccggac gtttaccatt 5040
taccattccc tggccttggc cccataaaag ccagtagggc ccactccaca tgcaggaatg 5100
tcctagctta gttgtggagg gggatgtcat gcccagtgag ggtcccctgc agtccctccc 5160
ttccttgtat ctgatggggg ccgctcaaca gagtcactgt ggcttgacac caaagaccct 5220
tagctgggaa cgatgccaag gggagctgga gggagccagg aagctgggag aagggccagg 5280
gcccttcaca tccacctggg aggactttga gcattactaa agagccccgt ttttggaaac 5340
ccgctgtgta aaatcccaag atacagccca aaggaagccc cgcctgcatc tggggtgcat 5400
tttatttatt tttttatgtt tttttttttc tcaagcagag tcttgctctg tcacccaggc 5460
tggagtacaa tggcatgatc tcagctcact gcaacctccc ctgaccaggt tcaagtgatt 5520
ctcctgcctc agcctcccga gtagctggga ttacaggtgc ccaccaccac agccggctaa 5580
tttttgtatt tttcatagtg acagggtttc accatattgg ccaggctgat ctcgaactcc 5640
tgacctcagg tgatccactc acctcagcct cccaaagtgt tgggattaca ggcgtgagcc 5700
acggcacccg gccctggggt gcattttaaa gctacacggt atttatggat atagtaagag 5760
gagatgaact tcgcagtagt ctggagcctt tgctctcccg gtgggtgggt caaaggcttt 5820
ctctgtactg tggggaaacc tgcgtcaaag gccaaataca ttgggatgtt tgcttgaaag 5880
ggtctcaaaa tagagttgga accctggagc gtggagaggg gcgacattca gttgctattt 5940
aatcatgatt tgttaattaa cagctcattt atgggaggca tcttagattc gtggaaaaag 6000
cagggagtca gacatctaga ctcaacctcc acttccctgc tgtgtgatct tgggcaagcg 6060
gcttagcctc tctgggcttc agggtttttt taatctgtaa aatgcgtctg ggagtgaatg 6120
tcaggtattc aaatcacact gggaaaatgg ggctaggaaa agccctagac tgagttagtg 6180
ctagaacact ctgggtctca gtttccttat ctgttcaatg ggtgcagaac tggaggttta 6240
agtgagataa agcaggtgaa gtacccacgt ggtgtgggct ggaggaagaa aacatgggac 6300
aatggttcca catccctggg tgacctgaaa attaagtgtg agatgtctca tgagggcacg 6360
aaatgaatat tagtttttgt tcccttcctc tgccacaaga ctttgagagc agaaaggtga 6420
gagagacggt actctgtgaa ggaaggcagg tccccggccc agcgcagtgc cagctcaggg 6480
gattctgggg cgggggctaa gtgcatggac tgtgtgggcg tggtgggaag ctccgtgaac 6540
cagaaccagg agcaagaaac agcattcctt gcgtggacgg gaaatgaggg caagaggtca 6600
gatgtctaca gaagtctgca ccccatgtac ttcagttctg tctgtgggtg cagcctctag 6660
ggaggtgggt gtttaggtac tgagacctcc gtctgtcctc tgaccatagg gaagccagtg 6720
ggaagcaaag gtggggttct tgagccagac ccagtccagc tctggtgcct gccctctggt 6780
gcgagctgac ctgagatgca cttccctcct ctgtgagctg tctcggcacc cacttgcagt 6840
cactgccgcc tgatgttgtt actcttccac tccaaaaggc agggaagtcc tgcttccgtg 6900
ccccaccggt gctcagcaga ggctcccttg caaatgcgag gctgtttcca actttggtct 6960
gtttccctgg caggatgccc gtggccgagg ccccccaggt ggctggcggg cagggggacg 7020
gaggtgatgg cgaggaagcg gagccggagg ggatgttcaa ggcctgtgag gactccaaga 7080
gaaaagcccg gggctacctc cgcctggtgc ccctgtttgt gctgctggcc ctgctcgtgc 7140
tggcttcggc gggggtgcta ctctggtatt tcctaggtaa cgttgtggga ccgcctggga 7200
gaggcacctg gggaggactt ggggtgactg tagcaggcac agcaggacag gactgggttc 7260
caggctcagc cgtgcttagc atattgctgt gtgaccttgg gcaagtcact tctgttctct 7320
gggtctccct ccctgtcctt ccagctggag atgctgtcag accctggctc caggtcctat 7380
ggctcgggtc tgcttcctgc ttgggcaaag tgccccaaag ctccccacca ggtggggaaa 7440
gtgggccctc ctagcaccca gttcttgtga gccagccagc ccacagagca taaacatcgc 7500
cttcccttgc ctgcagtcct cctgggttgc ccctgaggct tggagccaac ccagccctaa 7560
agaaggaggc ccagaggcac caatggtacc tggtaccaat tagtgcctct gctcacttga 7620
gcctagccta ggttctcctc taggctgggg accacagctc tatcccctct gggtctccag 7680
ggtccagcat gaatggggga cggagcaggc agctggagag cagccagcct tggggccctc 7740
tgccatgtcc ttaattatgg ctggcccctc cctgatgtca cagccctcag tcagtcccct 7800
ggtgcccggg gagcaattgg cctgtgctct gggcccattc atccaggcct ccgttcattc 7860
attcatggaa taaatgctct tgagcatcta ttatctttct ctaagattga tggagtctct 7920
cctcttcctt ctgcctttga cagtgggaag taatggagaa accaaatcgg actgtgcctc 7980
tacactgtac actgtagaag gcccattcat ttgttcattt actcagtgcc aagcacctcc 8040
tgtgtgccag gttctgggga tagcccctgt ccttgtgatt tagccaaggc atcagacctg 8100
acatttacgc taaagcatag catgtgatgg gacagaggaa gctgagggct gggaagccac 8160
aggagggaca acccagatgc ctgcgtgatc agaagcatcc cattaaacat cctgcaaagg 8220
atagctagtg ctcttactgg ctgaatctcc tggtggaatt ccaggcctgt tgaaagcaac 8280
ctggggacca actttgtagc agtggagaga aatccatgta ggcctagatc caaggggtca 8340
gggttgggag tgtctggaac cagcatctgg gagtgacact attgggaacc ccaggtctga 8400
cacgggcctg cttgcaatga cttatagtga ttctacccag agttgagcaa cgcaggcagt 8460
agacgccatg tgcatttcac caccagcagg aagccagtgc cccagatagc acagggctgt 8520
gggggcctcc tcaggtagcg ggctaattag tctacagggt aaaccacggg gcactgggct 8580
ggagggccag gaactcacct gccaattatt tctctttgca gaggagttta attccccctg 8640
attatgctcc tggggtaaat caccccccac cccaggagag gtgctccatg gggctgagga 8700
cccaaggggt gagtgctccc aagcctctgc tgggggaagc caactccccc acagagggat 8760
taagggttga aggaggcact ttgggagctg tttgaaagac tcctcccgcc ttgaccaggc 8820
tgtgctcctg ggactgggcg ctgggcaagg aagtggatca gagacacgcc ctgccctgtc 8880
tggaagagga ggtgcacaag tgaccagtga cactggagca ggacaggccc caagcgagga 8940
ggacagcctg gcccgaggag agggtgtggc tggcttccta aggatggtag caggaccctt 9000
aataccacca accatatttc ctgggtcctt tccctttcct gctctcccag gcaagagttt 9060
tatgtgttct caagccccca gcacccgcct gcccctgtct cctgcttcag tgagaaaaca 9120
aaacagctta gaagagaagc cccatatatg ttggcccacc tgccctccca gctgcatcac 9180
gtgcactcct cctgggaccc cgatcccgcc ccctctgccc acacaatggc ccagcaccag 9240
caaggatgcc ctctctcccc cagtgtccct tggggtgcct cccccatttc tctgctcctt 9300
gaaagagctg tcagtccaca cacccagtct ctctgtgccc tttccaacct ggctccctct 9360
gccccccaac tccaatggcc attgtcaagc tcgccaacat cccaggttgc taaatccaat 9420
gtccacttct cagtcatcat tgcacttgac ccgggggctc acccccacct ccagaagccc 9480
tttcctccct agactttggg ccgccaccgg gtcctttccg ctcagcaggt tgctttttct 9540
gtgtccctgc tgatgggtgg ggcctctcct ttctctctcc acccgcttct ttcgtgatct 9600
catctgctac ccttagcttc aagtgccctt tataccctga taacacccac atttgcattt 9660
ctagcctggg cctctccctt gagcttgtct ctagagctgc ccctgctctt cctcttaatg 9720
tctaaggagc atctcggacc ctatgctttc agaccatgag gtctctgcat aatttccccc 9780
agacctgtac ctccaacatc ccagtccaag accacttctt tctggcacct tccccttact 9840
cctttctttc ttttccaccc agccccactt tgccagcaaa cctggtcatc tctaactcca 9900
aaacacatca aaagcagctg acgccaatca cttcccaccc tctcctctgc cacagctggg 9960
gccaggctct gtccccctgg acatctctcc cctggagccc tgcaggcgtg tcctcgatgc 10020
tctccctgcc tctgccctgc ctccttagag cctttctcaa cagcagaggg accatttgat 10080
aaagcaaacg aaatcctcta acttcgctgc ttaaaacctc gcttggggcc aggcgcgtgg 10140
ctcacgcccg taatcccagc actttgggag gccgaggcag atggatcacc tgaggtcagg 10200
agttcgagac cagcctgacc aatatgcaga aaccctgtct ctactaaaaa tacaaaatta 10260
accgggcgtg gtggtgcatg cctgtaatcc cagctacttg cgaggctgag gcaggagaat 10320
cgcttgaacc cgggaggcag aggttgtggt gagcggagat tgagccattg cactccaagc 10380
taggcaacaa gagcgaaact ctgtctcaaa aacaaaacaa aacaaaaaca aaaagaaaac 10440
aaaaaaacca cctcccattc ctcccatctt acccagggtg aaagcccgag tcctcccagg 10500
cctggaaagc cctacccagc ctctcccctt ccccatctca taccctcctg ctgtcctgtt 10560
gctcactctt tgctgctcct gaaacacacc aggcctttgc acttgcccct gcctgggaca 10620
ttctttccac agatgtacat caccttcttc cctgacctcc atatcgcagc ccgtcccatg 10680
ccctgattcc caccgcactg accacctcta acctgttata cacgatgtgt ggtttaccgt 10740
ctgattcctt gctagtctac aagctattaa gggcagtttt ttcttgatag ttctgtccgt 10800
tgttttgctc atatagtccc aagtactttg gctcagttcc tacacatagc aggctctcaa 10860
gaggtattta ctgagtaaat ggataggggt gtaaaccagg gctgtgagtc taccctcttc 10920
acttcagcca aaatagcctt tgcaaaacag aagtctgatg acatcattcc tgattttaaa 10980
cttttcatgg ttacccttgt tcatcgggta aagacccaat gggccctgcc ctgcggaggc 11040
cccagctcct tgccgcccct ccccatctct gactgctcca gccaaacagg ctttcagccc 11100
gggtcctcac catggtcccc gtgctaccgg ccccgtgccc catgctgctc cctctgctgg 11160
aaggtacttc cctccctctt ctcttaccaa tttacagttt ccccatccct acatctcagc 11220
tggagggtca ctccactctg gcccaggctg agtgtcctcg tcacatcccc tcaacagcac 11280
catgtggcac tgctccctga tggcactgcc cacagacaga tgccacatgc tgtgtggttg 11340
ccagagccac gcctttctta cccaccactg tcagcttcac aaggggaggc acatctgtct 11400
tggttaactg gcgtacccca tgtagtaggt ggttagcaca cactgtggga tccctgggtg 11460
acctcacgag tggaaggatg cctagtggtg ctgacccatg accttggcct cctgggccta 11520
tgtggatttc ctggccttca tgtcattggt gtcctggact ggtcactgtg tcagcctctc 11580
cctgggaacc tgtaggacac catccatctg ggagcctttc acctccctgg taccttgcag 11640
ccagtttgtc atccaataaa ctttagatga ccatgatgac aatgggagtg acaaagatga 11700
tgatgatgac attgatggtg ccatggagac ccaagacact gaggctgagc tgagggtgtg 11760
ggtggcagga gaaggcatgg aagagacagg agactttccc acctgcttcc tccactaacc 11820
ctgctggttc cttcctgggc agggtacaag gcggaggtga tggtcagcca ggtgtactca 11880
ggcagtctgc gtgtactcaa tcgccacttc tcccaggatc ttacccgccg ggaatctagt 11940
gccttccgca gtgaaaccgc caaagcccag aagatggtag gaaaggatct gggggatgag 12000
agggagggaa tatgggggtg aaaagagagg ggtggggtct gatcacatgg agccagttgg 12060
tcaacccatc tggagcattc acagggacca cagccctgct ccaggcacca tggaagcaga 12120
tgaggttgag ggtcatggga aagttagtgg atgtttgggt caatagcact cggattagat 12180
cctgatcatg cctcttacca ggggtggagc atgaccttgg gaaaggtccc acagtgcagc 12240
tgacactatt gagggcccgc tcctgcccct ccgttacagg acggtggccc gctcctcccc 12300
ctccgttaca ggacggtggc ccgctcctcc ccctccgtta caggacggtg gccgctcctg 12360
cccctccgtt acaggacggt ggccgctcct gcccctccgt tacaggacgg tggcccgctc 12420
ctccccctcc gttacaggac ggtggccctc tcctccccct ccgttacagg acggtggccc 12480
tctcctcccc ctccgtaaca ggacggtggc cctctcctcc ccctccgtta caggacggtg 12540
gcccgctctt ccccctccgt tacaggacgg tggccgctcc tgcccctccg ttacaggacg 12600
gtggcccact cctgcccctc cgttacagga cagtggccgc tcctgcccct ccgttacagg 12660
acggtggccc gctcctgccc ctctgttaca agacggtggc ccgctcctgc ccctccgtta 12720
caggacggtg gccactcctg cccctctgtt acaggatggt ggctcactgc acggaggctg 12780
gtctactgcc tgccactctc aggctgcagg accactgccc agcaaggcag gccagaagtg 12840
ccggggagtt attcccagga gcaaccctga accatgagcg ctggagtggg tggatcaata 12900
ccgcagcttc tttggccctg gcagggggaa tagttcacag aatgttccag gctgtctccc 12960
agagatgccc tattcggctg agctcagatg ctctcagctc tacactgcgc attcatggcc 13020
ctgtgttggt tgcccacttt ccagtctctc cctcccaact actgtttccc agaatcacct 13080
ccaaataaac cacttgcccc accttgtcaa tggagggtct gcttctgagg gacccagcct 13140
gaggctgccc gtttcctcct ccatgaggta ggggtgataa caacaggacc cggctgcaga 13200
tttgttgtgg gttgcagtga agttgagata acacgaacac tattcccacg ctgcgcaaat 13260
gcttaagagc ctgtaatcct gccagcagcg ctgtagttgg agatgcgcaa aaactaccca 13320
tcagagctgc tggcttgtcc caggccatgg gaggaggtgc agaggggacc caggagccga 13380
gtggggtttc tcagagttga ggagtgactt ttggcaaggg gcagaggggt catcagcagt 13440
gcaggtggag gtgagagtcg ggtgtagtgg aaacagaaag aaggggatgg ggtgtgagat 13500
tcatgcatgc cccggcccgg ccactcagca ctgtgtgacc gtgatcaagc ctgtccacct 13560
tggagaatca tgcatggagc ggggctgcca gtaggagcaa agggcacctc caggtaggaa 13620
gtgggcctgt ctgccctgca gagggtccca ggggctgttg tcttcccttc tcacagctca 13680
aggagctcat caccagcacc cgcctgggaa cttactacaa ctccagctcc gtctattcct 13740
ttgggtgagt tgtccttgcc cctgaccagc tcctgcaaga agctgagatt caaagaatgg 13800
gaggggcctc tgtaggcttc tgatgcaatg ccttcatgtt tcaaatgggg aaactaaggc 13860
atagagaggg aacttggctt cctgcatgtc accctccctt cactgggctc atctgtagaa 13920
tggaaacatg ggtgtgatag gtttgcacca gacaatgact gtgatggctg atcaagggcc 13980
tgacaccatc aggcgaggcg atgttggagg ggcatggggt taaaagcatt ggctccaggg 14040
cccgactgcc ccgtccacat ctggttctgc tacttgcggc atagtttatg agacacaagt 14100
tcacctctca tgcctcagtt ttctcattcg taaaataagg attatgagag cgcctccttc 14160
agaggtcgct aggaggcttc tgcgtgaaga cggacagcaa tggctgaggt gcggaaagtg 14220
ctcgatgtgc atgagcaggg gtggagctgg ggccagacct cagaatcctt ccctggcctc 14280
tctcacttct gcctgcctta gggagggacc cctcacctgc ttcttctggt tcattctcca 14340
aatccccgag caccgccggc tgatgctgag ccccgaggtg gtgcaggcac tgctggtgga 14400
ggagctgctg tccacagtca acagctcggc tgccgtcccc tacagggccg agtacgaagt 14460
ggaccccgag ggcctagtga tcctgggtca gtactgcgag tggaaacgtg gggttggcct 14520
catgaggttg ggggaaacaa gctgtggtgt ggcccgggga ggctgcctgc caggcctggg 14580
gtgctgtcag ggtgggcccc ccaggagagc cccccaggtg aggtagcagt gccattgcat 14640
tcaaggagcc aggaaagaag ggtgggatgg gggcatttag ggtaaatctc agacaaggct 14700
ggctccaagg gtctcctcta attttatttt cattgtattt tcttttcttt tttttttttt 14760
ttgttcttgt ttatttgttt gttcatttcc ttttatcaga agccagtgtg aaagacatag 14820
ctgcattgaa ttccacgctg ggtacgctat ttttttttcc cctccccatt ttccttttga 14880
gttggcattt gtcttgactt tgttgtgtat cagggggaca catggcttct gttgtgtgtg 14940
cagggagccc tggccaagag tcacccaggg gatgccatgg tggactcagc gatgtgtccc 15000
aagcaagtct tggagcctgt agggggagag gaggtggcga cgtgcatgcg tgtatttgtg 15060
tgtgtcttgt agacgggtgt gcatgcgttc ctgtgtgggt gtgaggatga gtcaggttta 15120
gtggtccacg aacgtgactc tcctctatca ttcacttcaa cctgcccaca agctagtttc 15180
cactgatggt agaaaatcat cttgccaatt cacggtttgt cagtcacgtt ggttttaaaa 15240
cttggtcttt tggaggtagc ggtgccattg cattcaagaa cgctccttcc ctcttttcct 15300
ttccttccca gtcaggctca tcagccctcc ctccctacct ggtgccgtat tgctagagtc 15360
accttgcatt tctccaagcg gacccacaat ctttcagctg accagcacag tcaccacgct 15420
gcacaaggca ggaggtgctg tccaagttgt agtttgtgtg agttgtgcag tgcaccaact 15480
ggctgctgga ctctatggcc cctaaattct cagattcctc ccacactatc tagtgttgtc 15540
acccagagcc aaggtggggg tgagcgtctc aaccccttct cagggaggga ggcagagttt 15600
aaatccttgt tatacctttc cttaccttcc cgtcttccca tcctgctggt caaatgcttg 15660
cttctttgtt ggatggaggt gatgaggtca aagtacagtt ttcaaagagg tgaaatcatg 15720
attctcatac aaagatagag tgaccatgtg tcaaatattt atttggctga ttaatggggg 15780
aacgagtaga atggtaaaga atgcaagaaa ctgatctatt tgtctatcta tctatctatc 15840
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cctaccaggc aagaaaactc aaacctttgg agttgtcttt tctagtgaat taaaatcatt 16140
gacagcttat tacagtcttc tgaaagttaa catctacctc tacagagtct gaggttgata 16200
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagaa agaaagaaag gaaaggaaaa ggtcctatgg 17040
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ctgtgccatg atccttacac atagtgagtg cctagcactt acacgctagc cattattgtt 21600
atcattatat atgctctaac tgggactggg ccgcaaaagg cattgagtgc caggagccat 21660
ttggactttg atatttggta agtggggagc tattgaaagt tcttgagcac agaagtaggg 21720
ctttagggca taagatatgg agtggagtac agaagtgatc aggatcagag ggcaggtggt 21780
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cagcctcctg agtaactggg attacaggca tgtgccacca cacccagcta attttgtatt 43080
tttagtacag acagggtttc tccatgttgg tcaagctggt ctcaaactct tgacctcagg 43140
tgttccgtcc gcctcagcct cccaaagtgc tgggattaca ggcatgagcc accgtgcccg 43200
gccctccaca tgggctttgg tcgggggctg tcaccatgaa ccccacagag aaagagctag 43260
aataaagtga cagggaggca gaggggcagg tgcgacccta gcaggggtaa gggtgggcag 43320
agcaggagag aagtaggctc ctgagatgca aagggaataa tgttagggag aatagagaac 43380
aggggctcca ggctcctgag atctcacttc tgcccttgac cacggacagg ccccatcagc 43440
aacgctctgc agaaagtgga tgtgcagttg atcccacagg acctgtgcag cgaggtctat 43500
cgctaccagg tgacgccacg catgctgtgt gccggctacc gcaagggcaa gaaggatgcc 43560
tgtcaggtga gtcccccggg catgggaggg agagaggagg gagaaaggat gctgcccaca 43620
tcaccagggt ctggcccttt gctcacatca gcctgctgaa gcctcccatc ctcccagcaa 43680
ggtggtgatg gccaccccta ctttacagaa gaggagactg gggcttagaa aggttgagga 43740
gcttgcccaa ggttgcagag ccacagatca gaagagatgc tgtgatgggc aggtgttagg 43800
ctcaaaccca gttctgctcc ttgcccacca caaggcacta ggcccagggt cccacagtga 43860
ggtggatgca tggaagaaga aaggggtgtc agccacagaa gggaggcgga ggcagagtgg 43920
gggcgtgggg acacagccac agttccagga ggtcccaggc tggctggagg ccggggaggg 43980
ctggcttggg ctctctccat ttagcaggcg aggggaaagc agagctttaa gactgaacgt 44040
gactctggca cccagtcaat tcccaacagt caggacttaa tccctatggc tcttcacctg 44100
gaaaaggggg tgcccttacc ctgcttcagt cctttctcct ttcccccttt cagggtgact 44160
caggtggtcc gctggtgtgc aaggcactca gtggccgctg gttcctggcg gggctggtca 44220
gctggggcct gggctgtggc cggcctaact acttcggcgt ctacacccgc atcacaggtg 44280
tgatcagctg gatccagcaa gtggtgacct gaggaactgc ccccctgcaa agcagggccc 44340
acctcctgga ctcagagagc ccagggcaac tgccaagcag ggggacaagt attctggcgg 44400
ggggtggggg agagagcagg ccctgtggtg gcaggaggtg gcatcttgtc tcgtccctga 44460
tgtctgctcc agtgatggca ggaggatgga gaagtgccag cagctggggg tcaagacgtc 44520
ccctgaggac ccaggcccac acccagccct tctgcctccc aattctctct cctccgtccc 44580
cttcctccac tgctgcctaa tgcaaggcag tggctcagca gcaagaatgc tggttctaca 44640
tcccgaggag tgtctgaggt gcgccccact ctgtacagag gctgtttggg cagccttgcc 44700
tccagagagc agattccagc ttcggaagcc cctggtctaa cttgggatct gggaatggaa 44760
ggtgctccca tcggagggga ccctcagagc cctggagact gccaggtggg cctgctgcca 44820
ctgtaagcca aaaggtgggg aagtcctgac tccagggtcc ttgccccacc cctgcctgcc 44880
acctgggccc tcacagccca gaccctcact gggaggtgag ctcagctgcc ctttggaata 44940
aagctgcctg atccaagccc cgctgctgga gtttgaatgg gacccaggca ccagcctcat 45000
gcccttgact ggagcagccc ctgcttcctg ctcagcctgt ttgacaagtg tccagaaggc 45060
caaggtgggc tcagtggcag tgggcgtggc cactgagggc tggggcctgc agggcagctg 45120
cccaggtccc agaagaaatg ccaggaaggc aatcatttgg ggaccctcag gtcagaggga 45180
tgtgaggagc aatcgtctcc ttttggaacc ttaggaggaa actgaggctc agagaggcgg 45240
ttaagacatc ctcatagtgg cactgggggt taggagtgga ggtggcatag actcctgtct 45300
cccagctccc tgtctgccaa ggccccgtcc agtgcgacac tcccttcctt tgcattcttt 45360
gagccactga ataaagcctt gggctccaac catgtgccag cactatgctg gggccacagg 45420
ggtgaaggac ctggctcctg accccaggag cagtggggat gatccagtgg gaaggggccg 45480
gaggggagcg tggactgggc aagtcaaggc aagctgcctg gaggctgtga gacttgagct 45540
ggggttcaga ggtggtccag gtgggaatat ccgggaagga tattccaggc agggaagagc 45600
acgtgcaaag gcacagtccc ggaagaatga ggcacgctag gacccagcaa gccgagtgag 45660
tgttagaaca gagctcgaga ggatgactca agaattcaga ggggcgaact gaggcgggat 45720
agcagagcct ggggttgagc caaggatttg atcttgaaag ctctggggag ccacggtggg 45780
ctctatagca taggagtgac atgagaggat tcacattttg gaaccagcct tggcaccagt 45840
gtgcagggag cggcaggcag ggaggctggt taggaggcca ccgcaggatt ccaggatgga 45900
gaggatgggc cgggactgag cagcgccatg ggatggactg gaggatgatt ttagacccct 45960
gggggcagtt gtgatggagg cagggggctc gctggaggtg agggtggacg gtcaagtgtg 46020
gacaactctt tctagacgcc taactgggag cggaagggag agagggagct tcagaggggc 46080
cccagactga agaggggttt ttccaacatg ggcgctgctg ccaggtctgt gggtgaatga 46140
ggcagaaggg gaaccaggga cggggagcac ccacctgggt cctgccagga cgagccggag 46200
cagctgggtg ggcagggagc gtctccagag caggtgggca gaacacatgc agaatacctt 46260
gggtgatctg gaatcaccct gggccctacc tcagtcttca tcggaatcct ggagggcggg 46320
ggacgtgtca tctgttctcc taacaagcct cctggtgact cttttgcaag gatagttgga 46380
ccctaaaaat gagtccagct ttggagtgga gtgtcctcag gggaagtggc gaggccctcc 46440
aggcttgagc tggcaagagg gtgcccccgc cccagcctgt ggaaggcctg cgccttaggg 46500
gctcactgcc cggcaggatt tcctcgagca gcggggagga ctgaggagtt gaaggaactg 46560
gccagggtgg gtggagggtc tggggtctgg gctgggtcca gcagggtcag agaagggaga 46620
gggcggggtg tttatatttc ctaggatttt gggcagaggg gtggcagcaa tagggaggga 46680
tggcggtggc ccaggtgtca gagtagaagt ggagggggcg cgctgagagg tttaggatgt 46740
ggcagaggca gcccagggct ctccctagag ttctgttttc tggctcccgg ccaggtaggg 46800
caggtgctct ggtatccggc cccagggcaa aggatatagc cagttcccca agccctccct 46860
gcaacacaca caggaaaatg acaacagggc agcgtccctg ggcttttggg acaaagccgc 46920
gttcctttgg accagactac cacaccttta gtttagcccc gtccccaaaa gtggcccaga 46980
gaaagagggc aacagccagg c 47001
<210> 3
<211> 2691
<212> DNA
<213> 智人()
<400> 3
ggacaaacag aggctcctga ggcctgtgtg caggcccggc acctatctgc cactcccaaa 60
ggatgcccgt ggccgaggcc ccccaggtgg ctggcgggca gggggacgga ggtgatggcg 120
aggaagcgga gccagagggg atgttcaagg cctgtgagga ctccaagaga aaagcccggg 180
gctacctccg cctggtgccc ctgtttgtgc tgctggccct gctcgtgctg gcttcggcgg 240
gggtgctact ctggtatttc ctagggtaca aggcggaggt gatggtcagc caggtgtact 300
caggcagtct gcgtgtactc aatcgccact tctcccagga tcttacccgc cgggaatcta 360
gtgccttccg cagtgaaacc gccaaagccc agaagatgct caaggagctc atcaccagca 420
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cctgcttctt ctggttcatt ctccaaatcc ccgagcaccg ccggctgatg ctgagccccg 540
aggtggtgca ggcactgctg gtggaggagc tgctgtccac agtcaacagc tcggctgccg 600
tcccctacag ggccgagtac gaagtggacc ccgagggcct agtgatcctg gaagccagtg 660
tgaaagacat agctgcattg aattccacgc tgggttgtta ccgctacagc tacgtgggcc 720
agggccaggt cctccggctg aaggggcctg accacctggc ctccagctgc ctgtggcacc 780
tgcagggccc caaggacctc atgctcaaac tccggctgga gtggacgctg gcagagtgcc 840
gggaccgact ggccatgtat gacgtggccg ggcccctgga gaagaggctc atcacctcgg 900
tgtacggctg cagccgccag gagcccgtgg tggaggttct ggcgtcgggg gccatcatgg 960
cggtcgtctg gaagaagggc ctgcacagct actacgaccc cttcgtgctc tccgtgcagc 1020
cggtggtctt ccaggcctgt gaagtgaacc tgacgctgga caacaggctc gactcccagg 1080
gcgtcctcag caccccgtac ttccccagct actactcgcc ccaaacccac tgctcctggc 1140
acctcacggt gccctctctg gactacggct tggccctctg gtttgatgcc tatgcactga 1200
ggaggcagaa gtatgatttg ccgtgcaccc agggccagtg gacgatccag aacaggaggc 1260
tgtgtggctt gcgcatcctg cagccctacg ccgagaggat ccccgtggtg gccacggccg 1320
ggatcaccat caacttcacc tcccagatct ccctcaccgg gcccggtgtg cgggtgcact 1380
atggcttgta caaccagtcg gacccctgcc ctggagagtt cctctgttct gtgaatggac 1440
tctgtgtccc tgcctgtgat ggggtcaagg actgccccaa cggcctggat gagagaaact 1500
gcgtttgcag agccacattc cagtgcaaag aggacagcac atgcatctca ctgcccaagg 1560
tctgtgatgg gcagcctgat tgtctcaacg gcagcgacga agagcagtgc caggaagggg 1620
tgccatgtgg gacattcacc ttccagtgtg aggaccggag ctgcgtgaag aagcccaacc 1680
cgcagtgtga tgggcggccc gactgcaggg acggctcgga tgaggagcac tgtgactgtg 1740
gcctccaggg cccctccagc cgcattgttg gtggagctgt gtcctccgag ggtgagtggc 1800
catggcaggc cagcctccag gttcggggtc gacacatctg tgggggggcc ctcatcgctg 1860
accgctgggt gataacagct gcccactgct tccaggagga cagcatggcc tccacggtgc 1920
tgtggaccgt gttcctgggc aaggtgtggc agaactcgcg ctggcctgga gaggtgtcct 1980
tcaaggtgag ccgcctgctc ctgcacccgt accacgaaga ggacagccat gactacgacg 2040
tggcgctgct gcagctcgac cacccggtgg tgcgctcggc cgccgtgcgc cccgtctgcc 2100
tgcccgcgcg ctcccacttc ttcgagcccg gcctgcactg ctggattacg ggctggggcg 2160
ccttgcgcga gggcgcccta cgggcggatg ctgtggccct attttatgga tggagaaacc 2220
aaggctcaga gacatgttgc tgccccatca gcaacgctct gcagaaagtg gatgtgcagt 2280
tgatcccaca ggacctgtgc agcgaggtct atcgctacca ggtgacgcca cgcatgctgt 2340
gtgccggcta ccgcaagggc aagaaggatg cctgtcaggg tgactcaggt ggtccgctgg 2400
tgtgcaaggc actcagtggc cgctggttcc tggcggggct ggtcagctgg ggcctgggct 2460
gtggccggcc taactacttc ggcgtctaca cccgcatcac aggtgtgatc agctggatcc 2520
agcaagtggt gacctgagga actgcccccc tgcaaagcag ggcccacctc ctggactcag 2580
agagcccagg gcaactgcca agcaggggga caagtattct ggcggggggt gggggagaga 2640
gcaggccctg tggtggcagg aggtggcatc ttgtctcgtc cctgatgtct g 2691
<210> 4
<211> 1732
<212> DNA
<213> 智人()
<400> 4
gttcttgagc cagacccagt ccagctctgg tgcctgccct ctggtgcgag ctgacctgag 60
atgcacttcc ctcctctgtg agctgtctcg gcacccactt gcagtcactg ccgcctgatg 120
ttgttactct tccactccaa aaggatgccc gtggccgagg ccccccaggt ggctggcggg 180
cagggggacg gaggtgatgg cgaggaagcg gagccagagg ggatgttcaa ggcctgtgag 240
gactccaaga gaaaagcccg gggctacctc cgcctggtgc ccctgtttgt gctgctggcc 300
ctgctcgtgc tggcttcggc gggggtgcta ctctggtatt tcctagggta caaggcggag 360
gtgatggtca gccaggtgta ctcaggcagt ctgcgtgtac tcaatcgcca cttctcccag 420
gatcttaccc gccgggaatc tagtgccttc cgcagtgaaa ccgccaaagc ccagaagatg 480
ctcaaggagc tcatcaccag cacccgcctg ggaacttact acaactccag ctccgtctat 540
tcctttgggg agggacccct cacctgcttc ttctggttca ttctccaaat ccccgagcac 600
cgccggctga tgctgagccc cgaggtggtg caggcactgc tggtggagga gctgctgtcc 660
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ctagtgatcc tggaagccag tgtgaaagac atagctgcat tgaattccac gctgggttgt 780
taccgctaca gctacgtggg ccagggccag gtcctccggc tgaaggggcc tgaccacctg 840
gcctccagct gcctgtggca cctgcagggc cccaaggacc tcatgctcaa actccggctg 900
gagtggacgc tggcagagtg ccgggaccga ctggccatgt atgacgtggc cgggcccctg 960
gagaagaggc tcatcacctc ggtgtacggc tgcagccgcc aggagcccgt ggtggaggtt 1020
ctggcgtcgg gggccatcat ggcggtcgtc tggaagaagg gcctgcacag ctactacgac 1080
cccttcgtgc tctccgtgca gccggtggtc ttccaggcct gtgaagtgaa cctgacgctg 1140
gacaacaggc tcgactccca gggcgtcctc agcaccccgt acttccccag ctactactcg 1200
ccccaaaccc actgctcctg gcacctcacg gtgccctctc tggactacgg cttggccctc 1260
tggtttgatg cctatgcact gaggaggcag aagtatgatt tgccgtgcac ccagggccag 1320
tggacgatcc agaacaggag gtaccacttc ctctcctccc tctggcttcc tttcctccct 1380
ccccctccct ctcttccctc ctcaacagtg accccctcat tggaagccca agtccccaat 1440
ctcagagggg cagcaagggg agcgagcaga ggctggggct ggtgtcaggc ctgctgccct 1500
tgaccttgtc ctcgtcccaa cctccgccct ggccccggct tcccctctgg ctaccccaga 1560
ggtctcagac acgtttggtc atcagacacc ttggatgttt attctaatta cagcaaaatt 1620
gtctcatctt cttgggtgct gtaaccccct ctggcaccct caatccttca ataaaatgtt 1680
tccagagcca aaggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1732
<210> 5
<211> 3143
<212> DNA
<213> 智人()
<400> 5
gagccaccta ccctgctccg aggccaggcc tgcagggcct catcggccag agggtgatca 60
gtgagcagaa ggatgcccgt ggccgaggcc ccccaggtgg ctggcgggca gggggacgga 120
ggtgatggcg aggaagcgga gccagagggg atgttcaagg cctgtgagga ctccaagaga 180
aaagcccggg gctacctccg cctggtgccc ctgtttgtgc tgctggccct gctcgtgctg 240
gcttcggcgg gggtgctact ctggtatttc ctagggtaca aggcggaggt gatggtcagc 300
caggtgtact caggcagtct gcgtgtactc aatcgccact tctcccagga tcttacccgc 360
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ggacccctca cctgcttctt ctggttcatt ctccaaatcc ccgagcaccg ccggctgatg 540
ctgagccccg aggtggtgca ggcactgctg gtggaggagc tgctgtccac agtcaacagc 600
tcggctgccg tcccctacag ggccgagtac gaagtggacc ccgagggcct agtgatcctg 660
gaagccagtg tgaaagacat agctgcattg aattccacgc tgggttgtta ccgctacagc 720
tacgtgggcc agggccaggt cctccggctg aaggggcctg accacctggc ctccagctgc 780
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gcagagtgcc gggaccgact ggccatgtat gacgtggccg ggcccctgga gaagaggctc 900
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tgctcctggc acctcacggt gccctctctg gactacggct tggccctctg gtttgatgcc 1200
tatgcactga ggaggcagaa gtatgatttg ccgtgcaccc agggccagtg gacgatccag 1260
aacaggaggc tgtgtggctt gcgcatcctg cagccctacg ccgagaggat ccccgtggtg 1320
gccacggccg ggatcaccat caacttcacc tcccagatct ccctcaccgg gcccggtgtg 1380
cgggtgcact atggcttgta caaccagtcg gacccctgcc ctggagagtt cctctgttct 1440
gtgaatggac tctgtgtccc tgcctgtgat ggggtcaagg actgccccaa cggcctggat 1500
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tgtgactgtg gcctccaggg cccctccagc cgcattgttg gtggagctgt gtcctccgag 1800
ggtgagtggc catggcaggc cagcctccag gttcggggtc gacacatctg tgggggggcc 1860
ctcatcgctg accgctgggt gataacagct gcccactgct tccaggagga cagcatggcc 1920
tccacggtgc tgtggaccgt gttcctgggc aaggtgtggc agaactcgcg ctggcctgga 1980
gaggtgtcct tcaaggtgag ccgcctgctc ctgcacccgt accacgaaga ggacagccat 2040
gactacgacg tggcgctgct gcagctcgac cacccggtgg tgcgctcggc cgccgtgcgc 2100
cccgtctgcc tgcccgcgcg ctcccacttc ttcgagcccg gcctgcactg ctggattacg 2160
ggctggggcg ccttgcgcga gggcggcccc atcagcaacg ctctgcagaa agtggatgtg 2220
cagttgatcc cacaggacct gtgcagcgag gcctatcgct accaggtgac gccacgcatg 2280
ctgtgtgccg gctaccgcaa gggcaagaag gatgcctgtc agggtgactc aggtggtccg 2340
ctggtgtgca aggcactcag tggccgctgg ttcctggcgg ggctggtcag ctggggcctg 2400
ggctgtggcc ggcctaacta cttcggcgtc tacacccgca tcacaggtgt gatcagctgg 2460
atccagcaag tggtgacctg aggaactgcc cccctgcaaa gcagggccca cctcctggac 2520
tcagagagcc cagggcaact gccaagcagg gggacaagta ttctggcggg gggtggggga 2580
gagagcaggc cctgtggtgg caggaggtgg catcttgtct cgtccctgat gtctgctcca 2640
gtgatggcag gaggatggag aagtgccagc agctgggggt caagacgtcc cctgaggacc 2700
caggcccaca cccagccctt ctgcctccca attctctctc ctccgtcccc ttcctccact 2760
gctgcctaat gcaaggcagt ggctcagcag caagaatgct ggttctacat cccgaggagt 2820
gtctgaggtg cgccccactc tgtacagagg ctgtttgggc agccttgcct ccagagagca 2880
gattccagct tcggaagccc ctggtctaac ttgggatctg ggaatggaag gtgctcccat 2940
cggaggggac cctcagagcc ctggagactg ccaggtgggc ctgctgccac tgtaagccaa 3000
aaggtgggga agtcctgact ccagggtcct tgccccaccc ctgcctgcca cctgggccct 3060
cacagcccag accctcactg ggaggtgagc tcagctgccc tttggaataa agctgcctga 3120
tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 3143
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<213> 智人()
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<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (433)..(433)
<223> n是a、c、g或t
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cctgtttgtg ctgctggccc tgctcgtgct ggcttcggcg ggggtgctac tctggtattt 300
cctagggtac aaggcggagg tgatggtcag ccaggtgtac tcaggcagtc tgcgtgtact 360
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<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
tcctccacca gcagtgcctg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 18
agctcctcca ccagcagtgc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 19
cagcagctcc tccaccagca 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 20
gctgtgcagg cccttcttcc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 21
gtagtagctg tgcaggccct 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
acggcaaatc atacttctgc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
gcacggcaaa tcatacttct 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 24
ccctgggtgc acggcaaatc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 25
caaacgcagt ttctctcatc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 26
tgcaaacgca gtttctctca 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 27
gatcacacct gtgatgcggg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 28
ctcctgccac cacagggcct 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 29
acctcctgcc accacagggc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 30
tgccatcact ggagcagaca 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 31
atcctcctgc catcactgga 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 32
tccattccca gatcccaagt 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 33
cttccattcc cagatcccaa 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
accttccatt cccagatccc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
caaagggcag ctgagctcac 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
ctttattcca aagggcagct 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 37
agctttattc caaagggcag 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 38
aggcagcttt attccaaagg 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 39
gatcaggcag ctttattcca 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 40
aggagcggcc accgtcctgt 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 41
ggcaggagcg gccaccgtcc 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
tccccctgag gctctcagga 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 43
taagtccccc tgaggctctc 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 44
aagactgttc cttctccttt 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 45
cagcttgtgc ctgcccagag 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 46
agtctatctg gccacagtga 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 47
ggtccttctt tgagcctcac 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 48
cctcaggtca ccacttgctg 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 49
gccacctcct gccaccacag 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 50
atgccacctc ctgccaccac 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 51
ctccatcctc ctgccatcac 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 52
gcagctgagc tcacctccca 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 53
ggcagctgag ctcacctccc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 54
ggcagcttta ttccaaaggg 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 55
caggcagctt tattccaaag 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 56
atcaggcagc tttattccaa 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 57
ccactggccc tgggtgcacg 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 58
tccactggcc ctgggtgcac 20
<210> 59
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 59
cttttggctt acagtg 16
<210> 60
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 60
gctgagctca cctccc 16
<210> 61
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 61
tattccaaag ggcagc 16
<210> 62
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 62
ctttattcca aagggc 16
<210> 63
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 63
agctttattc caaagg 16
<210> 64
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 64
tcaggcagct ttattc 16
<210> 65
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 65
atcaggcagc tttatt 16
<210> 66
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 66
gatcaggcag ctttat 16
<210> 67
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 67
attccaaagg gcagct 16
<210> 68
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 68
cttacagtgg cagcag 16
<210> 69
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 69
tggcttacag tggcag 16
<210> 70
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 70
ttggcttaca gtggca 16
<210> 71
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 71
gctttattcc aaaggg 16
<210> 72
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 72
caggcagctt tattcc 16
<210> 73
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 73
tttgatcagg cagctt 16
<210> 74
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 74
ttttgatcag gcagct 16
<210> 75
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 75
tttttgatca ggcagc 16
<210> 76
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 76
acatcaggga cgagac 16
<210> 77
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 77
cagctttatt ccaaag 16
<210> 78
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 78
gcagctttat tccaaa 16
<210> 79
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 79
aggcagcttt attcca 16
<210> 80
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 80
tgatcaggca gcttta 16
<210> 81
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 81
ttgatcaggc agcttt 16
<210> 82
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 82
ggcagcttta ttccaa 16
<210> 83
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 83
ttattccaaa gggcag 16
<210> 84
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 84
tttattccaa agggca 16
<210> 85
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 85
ggcagctgag ctcacc 16
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 86
tgataacagc tgcccactg 19
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 87
tcaccttgaa ggacacctct 20
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 探针
<400> 88
agttctgcca caccttgccc a 21
<210> 89
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 89
tcgccgcttg ctgca 15
<210> 90
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 90
atcggccgtg atgtcga 17
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 探针
<400> 91
ccatggtcaa ccccaccgtg ttc 23
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 92
caaagcccag aagatgctca a 21
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 93
ggaatagacg gagctggagt tg 22
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 探针
<400> 94
accagcaccc gcctgggaac tt 22
<210> 95
<211> 42001
<212> DNA
<213> 猕猴()
<220>
<221> misc_feature
<222> (26913)..(27448)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (31066)..(31221)
<223> n是a、c、g或t
<400> 95
acttggcctt ggaaacctct tgtgcgtctt ccctatgcag cttttctcag ttcagactgg 60
ctcaggagct gcgggtgacc agcggctacc gtcatggaca gcacagggct acggaaccag 120
gtaggaattc atgctgcgta tggtggtaat catgcctgta atcctagcat tttggaaggc 180
cgaggtgggt gggatcacct gaggtcatga gttcgagacc aggctggcca acatggtgaa 240
accccgtctc tactaaaaat ataaaattta gccaggcatg gtggtgggca cctgtaatcc 300
cagttactca ggagactgag gcaagagaat tgcttgaacc tggggaagtg gaggttgcag 360
tgagctgaaa tcgtaccact gcactctagc ctggttaaca gagtgagact ctatccccca 420
cccccgcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag aaaaaaagga acaaggtagg aattcaaata 480
aacagaaaat agcatcaaac cccacccctg cctctccttt ctcctctcca gtccccagag 540
tacatgggcc cagcctcctt tactctctct caggcctgta gctcctttag tttctcccgt 600
ccaggtaagc acctggcctt acctgtgtga gcccctgcac tcacctgcac tgggctctgc 660
atagtcccca gtccttgacc cccccccacc tcatgctctt ggggaccagg ggctgtaacc 720
aggcaggcat gtcaccaggc aacaggcctt gggggagagc tcagatctcc cgcacctgcc 780
tgccagcctc tggggtgccc atgggcgggg ggatgggaca ggccggccct gccttctcct 840
gcctcctgcc tgtttacctg tactcagtca cagtgctgtc ctgggcccag caggaggagc 900
cccatggagc ctggggccac aggccacagg ggacaagggc cagacaccct ggccatggct 960
ctaggccatt gatccaggcc gggctggcac ggtgggggta gggaggcctt ggcctggaca 1020
aacaaaggct tctgaggcct gcgtgcaggc ccagcaccta tccgccactc ccaaaggtaa 1080
gcgggggcct ccagaacagg ggaccaggat ctataaatga cttagtgaca gtgtccaccc 1140
taagagctgg gcctggctcc ctggggcctg agtcacctac cctgctccaa ggccaggcct 1200
gcagggcctc atcggccaga gggtgatcag tgagcagaag gtgaggggcc cacagagctg 1260
gggaggggag ggaccatgca gggtgacacc aggtgtgtgg acaggcacag catcagtgct 1320
gggtggttgg tggcctggga ttcaggcggc agggacagga ggaaggcaga ggccacccta 1380
cgcctgcctc gcaggactgg acgtgctgcc ccctccatac ccggtacccc acctgggcct 1440
tctggtgtag gagacaggcc cagagcccca cattgcacct gtgtactgac ttaagcacgg 1500
gaccctgggc tcgaaggctc agagttggcg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt cgtgtgtgtg 1560
ttcgtgtgtg tgggggaagg gcatgcatct gtgaattttt gtgtcatgaa tatccctcgc 1620
gtgtctccac ctgtgtacat ctgtgggtct gtgaatgtgt ttatatgtgt ggaagggagc 1680
cccgcccagt ctcccacact cgcaggtctc tagggcctaa tgacttcact gaaagatgca 1740
cctacaaccc tagcccagag tccccgctct gctctgctct gccctggcta agggacctcg 1800
ggtaagtcat gttactgctc tctacctcag tttccccagc cattaaacag agttagcaaa 1860
gcacacaccc caggctgttg gaggctgcag tggagttcgc agcgccgccc agcgcagggc 1920
tggcacatgg taggagttca cacgcagtgg ttgaatacag atctgcattg ccggggagtg 1980
gcggccccgc cccaaggagc tcagcctcca gcgggcagac tccagacccg ccaatggcca 2040
gaagggcagg agggagtgaa gagcaggtgc cagggtgggg tccaggtgct cagagctgcg 2100
ggactgcttc aggcccctgt ggcaattgca gcacagtccc cgcttccagg agctcaatgt 2160
gaggggcaga gagggtgccc ataggtgaac cgcacatcgc gaggcacagc tgctccttct 2220
agggcactct gggagagctg caaagaggtg aggtctgagt ggaggtgaca gaggctgcat 2280
aagagctggc caggctggga ggtgggggtc caggcagaag gaagagtgtg gggatgcctg 2340
gccgtgaaca agcactgaca gggctcaagg tccaggaggg ctcttggtgc tggctggctg 2400
ctcttaatcc gtaaatgttt gccaccatcc cattgttaaa atttcttacc aagggaagga 2460
agtccagtgt ccccggggtg tgacggggag aagagagggt gagaaaaaag gaggcaggag 2520
aaggtggcca ggccacatat gcacacagca ccttggagtt ccgtggggag gaaggagctg 2580
ggaccttgtc attcatttgt tcaacaatta ctgagtgtcc gctgagtacc agactctgct 2640
ctcacgcagc ttagacaggg aggagacaga taaacaacgt atttgcatat caggcaattt 2700
aggcctcagt cattgctata aagaaaaaag caggagagac aggggagtgc ccagggaagg 2760
cctctctgga aaggtgacat gtgacacctt ggaggaggta aaggagggag ctatgaggca 2820
agcagaaagg aaagcatccc aggctcagca aggagcaaac tcccattcag cgaagaggac 2880
agaaaaccta gcccctgggc cttgtgggac tgagttctag ttggatggaa gccgtgggag 2940
gctcgtggac agggcacata gtgacaacac gcagtgtttt ttttgtattt ttagtagaga 3000
cggggtttca ccttgttagc caggatggtc tctatctcct gacctggtga tccgcccgcc 3060
tcggcctccc aaagtgctgg gattacaggc ttgagccacc gcgccccggc ctgggtggga 3120
agttatgatg agcctggggg agttaatttc ctactaccac catttggact atggcttggg 3180
tttttacaga gggtttcctg aaaacgaacc cctctgtgct gctcaagtcc tcccagatgg 3240
atgcgagggg tattgagagg gaggcaaaat ctgcatagag aaggaggcct ggcttggagg 3300
atgagagggg aggggaggcc cacgaagcac ttcaccctga gctgcccctc ttcggggctc 3360
ctctaatgga cccatgacct tctctgagcc tcagtttccc tctctttaca ctgattatct 3420
gagaggtagt agggcaccag ggatactgtg aacatttgag gaagtgggca gggctctccc 3480
acccattgcc cattgccgga catttatcat ttaccattcc ctggccttgg ccccataaaa 3540
gccagtaggg cccatcccac atgtgggaat atcctagctt agggtgtgga ggggggtgcc 3600
atgcctaatg agggtcccct gcagtccctc ccttccttgt atctgatggg gaccgctcaa 3660
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gagggagccg ggaagctggg agaagggcca ggacccttca tatccacctg ggaggatttt 3780
gagcgtcact aaagagccgc atttttggaa acccactttg taaaatccta agacacagcc 3840
caaagggagc ccccgcctgc atctggggtg cattttattt tttttaacgg tttgtttgtt 3900
tgttttttat cagagtcttg ctctgtcacc caggctggag tataatggca tgatcttggc 3960
tcactgcaac ctcccttgcc caggttcaag tgattctcct gcctcagcct cccgagtagc 4020
tgggattaca ggcgcccacc accatgcccg gctaattttt gtatttttca tagtgacagg 4080
gtttcaccat attggccagg ctgatctcga actcctgacc tcaggtgatc cacccacctg 4140
aggtgttggg attacaggcg tgagccaccg cgcccggccc tggggtgcat tttaaagcta 4200
ctcagtattt gtggatacag taagagaaga tgagcttccc agtagtgtgg agcccttgct 4260
ctcctggtgg gcgggtcaaa ggctttctct gtactgtcgg gaaacctgcc tgaaaggcca 4320
catacattgg gatatttgct tcaaagcctc tcaaaataga gttggaaccc tggaacatgg 4380
agaggggtga cattcagttg ctatttaatc atgatttgtt aatcaacagc tcagttatgg 4440
gaggcatctt agattagtgg aaaaagcagg gagtcagaca tccagactca acctccgctt 4500
tcctgctgtg tgaccttggg caagtggctt agcctctctg ggcttcatgg tttttttttt 4560
tttaatctgt aaaatgcatc tgagagtgaa tgccaggtat tcaactcaca atggaaaaat 4620
gcagctagga aaagccctag actgcgttat tgctagaaca ctctgggtct cagtttcctc 4680
atctgttcaa tgggtacaga actggaggtt taagtgagat aatgcgggtg aagtacccat 4740
gtggtgtggg cttgaggaag aaaacatggg acaatggttc cacatccctg ggtgacctga 4800
agattaagtg tgaaatgtct catgagggca cgaaatgaat attagttttt gttcccttcc 4860
tctgctgtga gagtttgaga gtagaaaggt gagagagacg gtactctgtg aaggaaggca 4920
ggtccctggc ccagcacagt gccagctcag gggattctgg ggcaggggct aagtgcatgg 4980
gctgtgtggg cgtggtggga agctctgcga accagaacca ggagcaagaa acagcattcc 5040
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ccatctgtcc tctgaccaca gggaagccag cgggaagcaa aggtggggtt cttgagccac 5220
acccagtcca gctctggtgc ctgccctctg gggtgagctg ccttgagatg cacttcgctc 5280
ctctgtgaac tgtctcggca cccacttccg gtcactgccg cctgatgttg ttactcttcc 5340
actctgaaag gcagggaagt cctgcttctg taccccacca gtgctcagca gaggctccct 5400
tgcaaatgcg aggctgattc caacttcggt ctgtttctct ggcaggatgc ctgtggccaa 5460
ggccccccag gtggctggtg ggcaggggga cggaggtgat ggcgaggaag cggagccaga 5520
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gcccctgtgg ctgaccctgg ttgtgctgac ttcagtgggg gtgctactct ggtatttcct 5640
aggtaatgtc gtgggactgc ctgggagagg cacctgggga ggacttagta gcaggcacag 5700
caggacagaa cggggttcca ggctcagcca tgcttagcat gttgctgtgt gatcttgggc 5760
aagtcacttc tcctctctgg gtctccctcc ctgtcctgcc agctggagac gctgtcagag 5820
cctggctcca ggtcctatgg ctcaggcctg cttcccgctt gggcaaagtg ccccaaggct 5880
ccctaccagg tggggaaaat gggctctcct agcagtcagt tcttgtgaac cagcattccc 5940
cagagcataa acattgcctt cccttgccta cagtcctcct gggttgcccc tgaggcttgg 6000
agccaaccca ggcctgaaga aggaggccca gaggcactca tggtgcctgg taccaattag 6060
tgcctctgct cacttgagcc cagcctgcat tctcctctag ggtggggacc acagctctat 6120
cccttctggg tctccagggt ccagcatgaa tgggggatgg agcgggcagc tggagagcag 6180
ctagccttag gggcctctcc catgtcctta attatggctg gcacacaacc ctcagtcagt 6240
gtcctggtgc ttggggagca actggcctgt gctctgggtc catccatcca ggcttccatt 6300
cattcattca ttgaataaat gctcttgagc atctattatc tttctctaag attgatggag 6360
tctatcttct tccttctgcc tttgacagtg ggaagtaacg gagaaaccaa actagactgt 6420
gcctatacac tgtacactgt agaagcccca ttcattcgtt catttattca gtgccaagca 6480
cctcctgtgt gccaggtact ggggtcagcc cctgtccttg tgattagcca aggcgtcaga 6540
cctgacactt acgctaaagc acggcatgtg ctgggacaga gaaagctgag ggctgggagg 6600
ccacggcagg gacaatccag ctgcctgcgt gatcagaggc atcccattaa acatcctgca 6660
aaggttagct agtgctttta ctggccgaat ctcctggtgg aattccaggc ctgttgaaag 6720
caacctgggg accaaccttg cagcagtgga gcgaaatcca cgtaggccta gatccaaggg 6780
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gcagtagacg ctgtgtgcat ttcaccaccg gcaagaagcc agtgccccag atagcacagg 6960
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gggctggagg ggcaggaact cacctgccaa ttatttctct ttgcagagga gtttaattcc 7080
ccctgattat gctcctgggg taaatcatcc ccaccccagg agaggtgctc catggggctg 7140
aggacccaag gggtgagtgc tcccaagcca actcccccac agagggatta agggttggag 7200
gaggcacttc gggagctgtt tgaaagactc ctcccgcctg gaccaggctg tgctcctgag 7260
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tacacaagtg gccggtgaca ctggtgcaca ggccccaagc gaggagggca gcctggcccg 7380
aggagagggt ggggccgact tctcaaggag gatggtagca gagcccttaa taccaccaac 7440
cgtatttcct gggtcctttt cctttcctgc tctcccaggc aggagttttg tatgttctca 7500
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agagaagccc cacacatgtc ggcccacctg ccctcccagc tgcatcacgt gcactcctcc 7620
ggagcccccg atcccgcccc ctctgcgcac acaatggccc ggcaccagca agggtgccct 7680
ctttccccca gcagcagcgt ctatcagtgt cccttggggt gcctccccca tttctctgct 7740
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ccctgccccc caactccaac ggccattgtc aagctcacca ggttgctaaa tccaatgtcc 7860
agttctcagt cttcattgca cttgacccgg gggctcactc ccacctccag aagccctttg 7920
ctctcttgac tttgggccgc cactgggtcc tttttgctca gcgggttttg ctttttctgt 7980
gtccctgctg atgggggggg gggcctctcc tttctctctc caccacttct ttcgtgatct 8040
catctgctac ccttagcttc gagtgccctt tataccctga tgacacccac atttgcattt 8100
ctagcctggg cctctccctt gagcttgact ctagagctgc ccctgctctt cctctcatat 8160
gtctaaggag catctcaaac cccaggagtt cagaccgtga ggtctctgca taatttcccc 8220
cagacctgca cctcccacat cccagtccaa gaccacttct ttctggcacc ttccccttac 8280
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gggccaggct ctgtcccctt ggacatctct gccctggagc cctgcaggtg tgtcctcgat 8460
gctctgcctg cctctgtcca gcgttcttag agcctttctc aacgtaacag cagagggacc 8520
atttgatgaa gcaaaccaaa tcctctaatt tccctgctta aaatctcacg tggggccagg 8580
cacgtggctc acgcccgtaa tcccagcact ttgggaggcc gaggtggatg gatcacctga 8640
ggtcgggagt tcgagaccag cctgaccaac agggagaaac cctgtctcta ctaaaaatgc 8700
aaaattaaca gggcgtggtg gcacatgcct gtaatcccag ctactcgaga ggctgaggca 8760
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tcccaatctc ataccctcct gctgtcccct tcccaatctc ataccctcct gctgtccgct 9060
tcccaatctc ataccctcct gctgtcccct tcccaatctc ataccctcct gctgtcccct 9120
tcccaatctc ataccctcct gctgtcctgt tgctcactct ttgctgctcc tgaaccacac 9180
caggcctttg cacttgcccc tgcctgtgat actctttcca cagatgtaca tcaccttctt 9240
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agggcagttt tttcttgatt gttctgttcg ttgttttgct catatagtcc caagtgcttt 9420
ggctcagttc ctacacatag caggctctca ggaagtattt gttgagtgga taaatagggg 9480
tgtaaaccag ggctatgagt ctaccctctt cacttcagcc aaaatagtct ttgcaaaaca 9540
gaagtatgat ggcatcactc ctgattttaa acctttcacg gtttctcttg ttcttcgggt 9600
aaagacccag tgggccctgc cctgcggagg ccccagctcc ttgccacccc tccccatccc 9660
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gtcctgtgcc ccatgctgct ccctctgttt gaaggtactt ctcttcctct tctcttacca 9780
atttacggtt tccccatccc tacataccag ctggagggtc actccactct ggcccagcct 9840
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ttacagatgg gtgccgcgtg ctgtgtgttt gccagcgcca cgcctttctt atccaccgtc 9960
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ttagcacaca cctgtgggat ccctggatga gctcacgaat ggaaggatgc ctagtggtgc 10080
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tcctggactg ctcgctgtgt cagcctctcc ctgggaacct gtaggacacc atccatctgg 10200
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catgatgaca atggcagtaa caaagatgat gatgatgagg atgatggtgc tgtggagacc 10320
caagacactg aggctgagcg gagggtgtgg gtggcaggag aaggcatgga agagacaggg 10380
gcctttccca tccgcttcct ccattaaccc tgctggttcc ttcctgggca gggtacaagg 10440
cggaggtgac ggtcagccag gtgtactcag gcagcctgcg cgtgctcaat cgccacttct 10500
cccaggatct tacccgccgg gaatccagtg ccttccgcag tgaaaccgcc aaagcccaga 10560
agatggtagg aaaggatttg ggggatgaga gggagggaat gtgagggtga aaagagagca 10620
gtggggtctg atcacatgga gccagttggt caacccatct ggagcactca cggggaccac 10680
agccctgctc caggcaccat ggaagcagat gaggttgagg gtgatgggaa agttagcgga 10740
cgcttgagtc aatcgcactc ggattagatc ctgatcctgc ctcttaccag gggtggagca 10800
tgaccttggg aaagctcccg cagtgcagct gacactgtca agggcccgat cctgcccttc 10860
cattacagga cgtggcctgc tcctgcctct ccgttacagg acggtggttc actgcacaga 10920
ggctggtcta ctgcctgcca ctctcaggct gcaggatcag tgcccagcaa ggcaggccag 10980
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caataccaca gcttctttgg ccctggctgg gggaacggtt cagagagtgt tccaggctgt 11100
ctcccagaga tgccctgctg ggctaagctc agaagctctc agctttacac tgcacattca 11160
tggccccgtg ttggttaccc actttccagt ctctccctcc caactactgt ttcccggaat 11220
cacctccaaa taaaccactt gccccacctt gtcaatggag ggtctgcttc tgggggaccc 11280
agcctgaggc tgcctgtttc ctcctccatg aagtgggagt gataacaaca ggacccggct 11340
gcagatttgt tgcgggttgc agtgaagttg agataacacg aacactattc ccacgccgcg 11400
caaatgcttg agagcctgta atcctgccag cagcgctgta gttggagatg tgcaaaaaat 11460
ccagccagct gtgctaccca tcagagctgc tggcttgtcc caggccacgg gaggaggtgc 11520
ggaggggacc caggagctga gtggggtttt tcagagttga ggagtgactt ttggcaaggc 11580
gcagaggggt catcggcagt gcgggtggag gtgagagtca ggtatagggg aaagggaaag 11640
atggggaggt tcatgcatgc cccggcctgg ccactcagca ctgtgtgact gtgatcaagc 11700
ctgtccacct tggaggctcc tgcatggagc ggggctgccg ggaggagcaa agggcaccct 11760
gaagtaggaa gtggccctcc ttgcagaggg tcccaggagc tcctgtcttc ccttcttaca 11820
gctcaaggag ctcatcgcca gcacccgcct gggaacttat tacaactcca gctccgtcta 11880
ttcctttggg tgagttgtcc ttgcccctga caagctcctg caagaagctg agacacaaag 11940
agtgggaggg gactctatag gcttctgatg caatgccttc atgtttcaaa tgggaaaact 12000
aaggcacgga gagggaactt ggcttcctgc atgtcaccct cccttcactg ggctcatctg 12060
tagaatggaa acatgggtgt gataggtttg caccaggcaa tgactgtgat gggtgatcaa 12120
gggcttgaca ccatcaggcg aggccatgtt ggagggcgat ggggttacga gcattggctc 12180
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aggcacaagt tcaactctcg tgcctcagtt ttctcattca taaaataagg atgatgagag 12300
cgcctccttc agaggttgct aggaggcttc tgtgtgaaga cggacagcaa tggctggggt 12360
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tgctggtgga ggagctgctg tccacagtca acagctcggc ggctgtcccc tacagggccg 12600
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cagagagccc tggcccagag tcacccaggg gatgccatgg tggactcagt gatgtgtccc 13140
cagcaagtct tggaaactgt agggggagag gaggtggctt tgtgcacgca tgtattttgt 13200
gtgtgtcttg tagacaagtg tgcatgtgtt cctgtgtggg tgtgagaatg agtcagattt 13260
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tagcggtgcc attgcattca aaaacactcc ttccaccttt tcctttcctt cccagtcagg 13440
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agtggaccca caatctttca gctgaccagc agagtcaccg cgctgcacaa ggcaggaggt 13560
gctgtccaag ttgtagtttg tgtgagttgt gcagtgcacc aactgggctg ctggactgta 13620
cggcccctaa attctcagat tcctcctaca gtatctagca ttgtcaccca gagccaaggt 13680
gggggtgagc gtctcaaccc cttctcaggg agggaggcag agtttaaatc cttgttatac 13740
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ttcaggcgtg ggggtaggca gggatttgtc agggtgagaa ggagaaaggg ttccctgggc 15060
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ggcatctttc cccagctgct ggtggaggct ctgtcccttc cctaggcaga tactgttggt 15360
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tacctctaca gagtccgagg ttgataatct acaatcaata gtaagtcaga gttattattc 15660
ctgagagcct ccgggggact taatcagacg atgcctgggg acagagactg gctcactgca 15720
gcctggacac cgaatctggt ccactgctgc ctgaccaaga atgacatcat cacacagctg 15780
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gtccaagctg aaagggggac ctttgcttgt cggtggcctt ccaaataaga cgatttaaag 15960
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ggatgacaag tcacaggcct ttcttcccag ccctacctgc tccgtttccg tcacacccac 16440
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ctcccctcaa ggcagcctcc cagactcctc cttggggcag tcccttctct ctaccagaag 16860
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ctcgcagcag ccagaggagt gtgtggtcca agccagccca tgtctagcct tgctcaacct 16980
tctgtggctc cctatggctg caggagaaag cagcgtcggt cctgggagtg gcctggtccg 17040
ggcctccctg ccttcagctt gtcctctaga cacatgtgcc ctgtgtgtac ttttctcaaa 17100
gctgcctggc tcgccccagc ctctttgctc acgcggggac ccccaggacg cccccagcct 17160
ataggctggg tttggaacca tcacctcctg agctattctt gcctgttctg tgtctgtttg 17220
tctccgctgt catccatgtc cccaggcagt gactgtatct ttacctgggc actgagaaac 17280
catgaagctc agtgggtgtc cgttccatga gtgaatgact gaaccaatga acaaatgcgt 17340
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gggtcccctc cttctgggtc acaggaatca ggggctttgc ccctcttccc gctccaggtt 17520
gttaccgcta cagctacgtg ggccagggtc aggtcctccg gctgaaggga cccgaccacc 17580
tggcctccag ctgcctgtgg cacctgcagg gccccgaaga cctcatgctg aaactccggc 17640
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aaggggaatg gctgattagg gggttaaaag tcacacacaa cattcttaga caagtggggg 17820
taggaccttg ggcctgggta tctgggagac aggacggcta gtctagaggg gataggagag 17880
aggaggctgg agatggttgt gtagtgcgag cgcttcccct ccccgagcct cggttttccc 17940
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cttgttggga tatttcagag cctggctgca gcctggacgt tcaacctctg ggctcattcc 18060
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cctagatcaa acgcacagtt ggtgtgcagc atctattttg agtgaaccaa tgaatgatgt 18240
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tcctagctgt gtgccctaag ttactttgcc tctcagaacc ttcttacctt gcatcttgcg 18420
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ccagtaaatg ctagccatta ttgttatcat tatatatagt ctaactggga ctgggccaca 18540
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ctagtcactg tggctcctgg tggctccctc atcccagacc cttggagaag ctctaaaatg 18840
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aggtgattcc gtagcagggt ggaggaggct ggggagggag catgagactt gagccagcca 20160
tcatcattga actgtaagct ccagaagtct ggggaacctc caggcctctc tcacccaagg 20220
agctggcctg gtccttggag ggccttcagt ctgtcctctg aggccaggga gatacagact 20280
ccccatggac acacagcggt ctctagtagc agacctgggt ccagaaccca gatatccaga 20340
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cacagctact acgacccctt tatgctctcc gtgcagtcgg tggtcttcca gggtgagggg 20580
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ctgctgctct ccactcccca ccctggcccc actcttcctt ccgccatttg cacttccacc 20760
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cctcttccct cggcacccac cagtggctgg gcctggaaca ccggtctgtt tgcagcagga 21000
ctcagaactc cttggattct gccctagaca gtccgcttac ggccaagagg gcacagggag 21060
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cacaggctca aggcaggagg gaacaaacgg ctttgggggc cctggcccca tggagagatg 21540
gccagggcag ctgagcgtgc tcctgtcctg acccctggac ccctcagctt ctcactgtgt 21600
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gcactttgct ggcagaggtg gtaggggtgg tggggttaca agctgcgctc gcctgctggg 21960
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caatttatct gggactagga ttaaaggaaa ggagaagaat tacccatggt atgatttagg 24000
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agactcagcc tctctggagg ttcccccacc tgctctgttt aaacaagtgt atcttcttgg 30660
tggtgttgtg gcaggggagc aggggcggtg ttgtccagca gggatgtgag ggtgctccca 30720
cagctggggg tggtcccacc ccgtgaggcc atgcacggag aaggtgctgc ccatcagcac 30780
taagttactg gtcatgggag aaggactggt ccttccctca aacccacagt gtcacaagga 30840
ggcaggaagg atggtgccta aacggggagc actgctgccc cctcgtccca caccaacctc 30900
aaggcgaata accttgcaca tctgtggaca gtaggccagt caagggcttt tgcctcgact 30960
gacacattga agccttttgt cagattcaag gtcaacagaa ataatttttc cttccctccc 31020
tccctccctc cctccctccc ttccttcctc tctctctctc tcccgnnnnn nnnnnnnnnn 31080
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 31140
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 31200
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntcctgcctc agcctccaga gtagctagga ttacaggcat 31260
gcgccaccac accccggcta attttgtatt tttagtagcg acggggtttc tccatgttgg 31320
tcaggctggt ctcaaactcc tgacctcagg tgatccaccc acctcggcct ctcaaaatgc 31380
tgggattaca ggtgtgagcc actgctcctg gccaattttt cttgttttat gagggaggaa 31440
agtgaggctc aaagaaggac cctgacttgc tagaacctca cagttcacag gtcactgtga 31500
ctagaattga gttttatctg gcaggcaatg ggaagccatt gaagaatttt gagcagggga 31560
gtgatatagc caggctactt tctagaagat aactctgggg gtgaacagtc acccaaggga 31620
gaaatcaggg cagaggaggc gcagtggggg tgcagctccc cctgcccctc tggctgccct 31680
gtccttgctc tgtgcacggg acccaggaga ccagccagtg cagccctgag ttgtgtctga 31740
tttcccccag gctgtgtggc ctgcgcatcc tgcagcctta cgccgagagg atccccgtgg 31800
tggccacggc cggcatcacc atcaatttca cctcccagat ctccctcaca gggcctggtg 31860
tgcgggtgca ctatggcttg tacaaccagt cggaccgtga gtatgggcag ccgggggaac 31920
cccctgcagt gactctctgc ctcttggcca tccctggaac caccaagggg gctgtaggca 31980
gctgcttatg aggccgaaca aaaggagaga gagagagaga gagagagaga gagagagtgt 32040
ttgtgcttgc acaaatttat gcagctttgt gtgtgcccac gtgtgcaagg cagccacacg 32100
ggtttgcaag aatacacact catacatagc ctgtgcgtgt gtctggatat gtatgtgtgt 32160
tctgtgcgtg tgtctggata tgtatgtctg cttggaatgt gtacacgggt gcccaggaac 32220
acatggcgcc tgtccatgtg tgtgtgagtg aacaggtgca ttcatgtctt tgtgcgcctt 32280
tggggctatg catggcctaa cggcgccctc cctgcctcca cggtcccctg tggtttcgca 32340
gcctgccctg gagagttcct ctgctctgtg aacggactct gcgtccctgc ctgtgatggg 32400
gtcaaggact gccccaacgg cctggatgag agaaactgcg gtgagcaacc cgcccgcgca 32460
tccctcctct ccccgccaat ccctcctccc tcctcacctt ccctgctctg agctgagtgg 32520
agaccccact cctacatgta gcttccatta tcaacaccca ggaagtgggg ttctctcact 32580
gtgcgggggt ggcaagatga caccacctcg tgggacagtg gcagggacaa gtggggagcc 32640
aggtctcctg acttccagct cagggctatc acccccaccc ctgtcccagc cagccttcca 32700
ataaaggaac agaatgggtg agggagatgt ccccctcctc tgccctgtca aaggtttaaa 32760
tatgtgtttt tccaaaggaa gcaagatgtt catggccggg gggatgatcc tgccacggtg 32820
ctgggggagg tgcctgatat tcggaaactg aacatctggc ttcaagttct ggctcagcca 32880
agtgaccttg gacaagtcac ctcatctgtt tccaccaatg aaatggggta tctcacaggg 32940
ttgctgtgaa actttgggtg taaaatagca gagaaagagg ccgggcgcag tggctcacgc 33000
ctgtaatccc agcactttgg gaggccgagt agagcggatc aactgaggtc aggagttcaa 33060
gatcagcctg gtcaacatgg tgaaacccta tctctacaaa aagtacaata attagctggg 33120
tgtagtggca ggagcctgca atcccagcta cttgggagtc tgaggcagga gaatcgcttg 33180
aacctgggag gttgcagtga gattgtgcca ttgcactcca gccttcatga caagagtgag 33240
attctgtctc aaaaaaataa taataataaa ataaaataaa ataaaattaa aataaagtag 33300
cagtgagaga tttgtgatcg gtaatgtgca atacagcaca ccttccacag gcatcgccaa 33360
gccccagctg gctcctctgg cttcctccca cctgtcccct ctctgtatct ccacacagtt 33420
tgcagagcca cattccagtg ccaagaggac agcacgtgca tctcactgct taaggtctgt 33480
gacgggcagc ctgactgtct caacggcagc gatgaagagc ggtgccagga aggtagggca 33540
gggcctggct gagtgtctgc agggacacca aaggcagtct aggcctgcta catgcttcag 33600
caaaggtttc tagcttcttg tcccaacacc caccaacccc tctgtattta cacctgtata 33660
tctatccatc catccatcca tccatccatc catccatcca tccactcatc tatcttctgg 33720
tctccaatca ccctgtctgt ccatcgattc atacagctac ccatttatcc atgcatctac 33780
tgacctttgc aaccactgat cttcctatca tcaaactgtc aatctaccca cttattagtt 33840
tggctgacta cctgcctgta atggccactg ttccatccat ctgtccatcc atccatccat 33900
catccatcca tcatccatcc atcatccatt catccatcca tccacccatc catcatccat 33960
ccatccatcc atccatccat catccatcca tcatccatcc atccacccat ccatcatcca 34020
tctatccatt catccatcaa tctatccatc atccatccat ccatccatcc atccatccat 34080
acatccatcc atcatccatc catccatcat ccatccaccc atccatcatc catccatcca 34140
tcatccatcc atccatctac ccatccatcc atccatccat ccatccatcc atccacccat 34200
ccacctaccc atccactgat ctccctagca ccctgtctat ccactggtcc ttacatccac 34260
acatttatcc aaccttctag ctgtctgtca gtctccctaa tggaccacca ctccacccat 34320
tggcttttct gctcaatctt ctgtctgggt ctatttatcc atccatccat ctacccaccc 34380
aactgaccaa ctgaccatca cttgcagact atccagcaat aggcaaggtg cagtgaggaa 34440
gtgggaataa aacagcagag atgcggcccc tgccttccaa ggcttatctg ttaggacgat 34500
acgatgagtg actctcctgc cgtgtaggca gattgtgggg cagggaggag gtcagacatg 34560
aaaagcttcc tggaggaggt aggcgtttgg cccttggtga gagctaaaac ttaaatgggc 34620
aggaggaaag gagagcggca aagaccaagt ggtggagtgg aaagttcttt acagtgaaga 34680
gcagggagga aaaggtggca accgggcagg gccagagcct gggagactgc caggctaggt 34740
ggggactctg gtctgaaagt ggaggcatag ttctgctttg aagttccaca ccagaggggg 34800
aggcatgatc ttgtggtcag gagctccagt ctgagaatgg agacactgct ttgcactcaa 34860
cagaccagtc tcagtggagg ggctgggggt gcgggggaca tggcctgctt ttaggaaacc 34920
ctaaaggaga ctcaggaaaa gactctccag tcacctcctg gatcttctgg ctccatcgtt 34980
cctgcaccct actttggaag tctcctttgg ggctcagaga cccaccttct gtgccctgtc 35040
cccatcccct ctgtcccagg ggtgccctgc gggacattca ccttccagtg tgaggaccag 35100
agctgcgtga agaagcccaa cccacagtgt gatgggcggc ccgactgcag ggacggctca 35160
gacgagcagc actgtggtga gccctgcccg gctgcctggg gccctggagc ttgggaggga 35220
ggggggtgcc cacagcagga cgctggaggg aaatctcacc cctgttccct ggtctctctc 35280
tatcccaccc tctgccccct cacacctggg tctttatgat ctctccccct ccattgttct 35340
cctgttctct gtctctccat ctctttcctt tgcccttcct ctctgtctgt ctgcttctcc 35400
ccttcccctc ctcctctgtc caccccacca cctgcccccc atccccagac tgtggcctcc 35460
agggcccctc cagtcgcatt gttggtgggg ccgtgtcctc cgagggtgag tggccatggc 35520
aggccagcct ccaggttcgg ggtcgacaca tctgtggggg cgccctcatc gctgaccgct 35580
gggtgataac agctgcccat tgcttccagg aggacaggta agggggaggg tgtgggggcc 35640
taggccataa gaggcaaggg cagggaaggc tgggtgggcg gtgcactgtg tctgagctct 35700
ttgcagatag agggaagggt ggtgaacccc tcagacaggc tactgtgatg tgggttctag 35760
ttctggctcc accaggacct actgggtccc tggacacatt gttctacctc tctgccatct 35820
actttcggta tcttgcttta agttgggcca gtgattcatt cattcatctc attcactcat 35880
tcagcaacac ttgttgtgct cttactatgt gccaggggct atggtagatg ctggggatac 35940
agtaaaggac agaactgccc tacctggtca taagctatga cactccccca ggtgtgacat 36000
gaagtagcag ggagccccca ggggacatct catcaggcct catggccatc tttcccatct 36060
gcttggtggg ctgaaacctc ccccaatcca cccgcagaca gatctgggct ccagatcctg 36120
cccccagaac ctgcacaggg atcctctttt gtatcctctc tggggcacag gttgctctga 36180
ccacctagct ctctttaacc ccatcccagg ctccgcactg ccctcaggta gagagacccg 36240
aaggctgccc gcctgccacg caggcagctg actgcggcag tccaattcct ccacggtcaa 36300
cgcccacccc ctccccacca ggacccacca acctcgggga actcagagca gcctgggtcc 36360
gtaaagtgct aaggaaaaaa gaaatttgtg tcgagggcct ggccctgtgc tacatttttt 36420
agatatacgg tcttactgga ttctctcaag aacagtcgag tagaaaatgc cgttcccatt 36480
ttgcagatga ggtggcagag gcttagagag gcacacacat gtctagggag ggataaagct 36540
ggggcctgga acccaggcag gccgaggggg tgaaggctga aagctgtacc accagctagg 36600
cggccttcag ggagggaagg gagggctggg tgtggagggc actgtcccag gcggcagttg 36660
gctatcctga gggtccctgg atggggagag gcagcttccc cccaccccac cccaccccac 36720
cccaccccac cccagcatgg cctccccggc gctgtggacg gtgttcctgg gcaaggtgtg 36780
gcagaactcg cgctggcctg gagaggtgtc cttcaaggtg agccgcctac tcctgcatcc 36840
gtatcacgaa gaggacagcc acgactacga cgtggcgctg ttgcagctcg accacccggt 36900
ggtgcgctcg gccgccgtgc gtccagtctg cctgcccgcg cgctcccact tcttcgaacc 36960
cggcctgcac tgctggatca ctggctgggg cgccctgcgc gaaggcggta agcggccggc 37020
acgtacggcg ggaggcggag ggagaccgtg cggagccaga ccgtgcggag ccgcttcgcc 37080
acacccggcc tggagaaggg cggggctggg gggtcccggg gctccacccc acaggccctt 37140
tactcctggg attcaaattg ggctgaattt tacggtacaa aaccaccctt taatgcggcc 37200
cataggcccc cgcccctgcc ctcctagctc ttgccttcat tctggaaggg cattatgtgt 37260
ggggcaaagg ggcaggtctg gggggccact gcccacgtgc aagctccacc tgctgctcct 37320
tggcctgcaa gggcggaggc tcttaattat tagcactttc cacatccagg ctgaatttta 37380
ggggaacatg acttcacgta atccatccaa tagccctggg gcggaagctg tggccccatt 37440
ttatggatgg agaaaccaag gctccacaca cagccagaga ggactggagc agagattaga 37500
acccaggact ggctgcctcc agagcccccg ctcttcctgc tactgctctc agaaacaggg 37560
tctctcccct ttctaccttc actaaccaga gctggctgtc cctggcggcc accgtacagt 37620
tttggggaca cagacccagc tggcaaacct acagacatgc cctgcagcct tagtgttggt 37680
ggcttcacaa atgtgtacag tgacttacaa tctggaggca ggcagggctg cagagatatt 37740
ttaaggatgg gaaaactgag gctcagagga acagtgactt acccaagggg atggcagaag 37800
tcatggcaaa gcaaaggctg gttcattcac tattccttca ctcattcagt cactcaatga 37860
cactttctga gcaccagcta tgtaccaggt atggggttaa gggaagggta catcaggatg 37920
gagagagaac attctcgggg gagacagtga taagagctgg catggatggg gaggtgtagg 37980
gacagtggag acacagaggc ggctcctgcc taggtagggt caagggaggc ttctagggga 38040
gggttgttta agctgaggcc tggaagatga gttggcaaca tccagacaaa gggaaaagac 38100
attcaggtga agacacaggt gccaagacag gaagacctga gaacatccgc agcctgccag 38160
aggggccaag gtggggggca ggtgtgcctg ggcaaggagc agccagtgta aggatcttgg 38220
gccaggagtt ctccctccta cctgcacctt agaaccatgc gtggttcaag aaaaaccctt 38280
gtatcaaggc ttcccagggg actgtgatat gctgccctcc tggagaagca ttggggtgga 38340
ctgcagagtt ggggctctgc agagttgtaa ggaaacggtg aaggggtcag atgtgggctt 38400
tggaaacatc cccaggtgct ataacatagc agcgaagagc cagccagagc ccagaggtgc 38460
ctgaacagac agaggtgggg gacaagacgc tggagtaaga cactcatcca cacgggcttc 38520
tttttttttt gagatggagt ttcactcttg ttgcccaggc tggagtgcaa tggtatgatc 38580
ttggctcact acaacctctg cctcctgggt tcaagcgatt ctcctgcctc aacctcctga 38640
gtaactggga ttacaggcat gcaccaccac acacagctaa ttttgtattt ttagtagaga 38700
cagggtttct ccatgttggt caggctggtc ttgaactctt gacctcaggt gatctgtccg 38760
ccttggccac ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca cttcgcctgg ctctccacat 38820
gggctttggt caggggctct gtctccatga accccacaga gaaagagcta gaataaagtg 38880
acagggaggc agaggggcag gtgcaacccc agcagaggta agggtgggca gagcaggaga 38940
gaagcaggct cctgagatgc aaaggagcgt tagggagaac aggtgctcca ggttccttag 39000
atctcacttc tgcccttgac cacggacagg ccccaccagc aatgctctgc agaaagtgga 39060
cgtgcagttg atcccacagg acctgtgcag cgaggcctat cgctaccagg tgacgccacg 39120
catgctgtgt gccggctacc gcaagggcaa gaaggatgcc tgccaggtga gtacccccag 39180
tgtgggaggg agaaagaaag gatgctgctc acatcatcag ggtctggccc tatgctcaca 39240
tcagcctgct gaagcctccc atcctcccag aaaggtggcg atggccgccc tcactttaca 39300
gaagaggaga ctgggggttg gaagggttga ggagcttgcc caaggttgca gagccatgga 39360
tcagaagaaa tgctgtgacg ggcaggtgtt aggctcaaac ccagttctgc tccttgccca 39420
tcacaaggca ctaggcccag ggtcccacag tgaggtggat gcaaggaaga agaaaggcgt 39480
gtcagccaca gaagggcggt ggagacagag tgggggtgtg gggacacagc cacagttcca 39540
ggagggccca ggctggctgg aggacaaaga gggttggctt ggactctctc catttagcag 39600
gcgaggaaaa agcagagctt taagactgaa cgtgagtctc tggcacccag tcaattccca 39660
acagtcagga cttaatcccc atggcccctc gcctggaaag ggggtgccct taccctgctt 39720
cagtcctttc tcctttcccc ctttcagggt gactcgggtg gtccgctggt atgcaaggca 39780
ctcagtggcc gctggttcct ggcagggctg gtcagctggg gcctgggctg tggccggcct 39840
aactacttcg gcgtctacac ccgcatcaca ggtgtgatcg gctggatcca gcaagtggtg 39900
acctgaggaa ctgcccccct gcagagcagg tcccacctct tggactcaga gagcccaggg 39960
caattgccaa gcagggggac aagtattctg gggggagggg ggcgcgagca ggccctgtgg 40020
tggcaggagg tggcatcttg tcttgtccct gatgtctgct ccagtgatgg caggaggatg 40080
gaggagtgcc agcagctggg ggtcaagacg tcccctaggg acccaggccc acacccagcc 40140
cttctgcctc ccgattctct ctcctctgtc cccttcctcc actgctgcct attgcaagga 40200
agtggctcag cagcaagaat gctggctcta cgtccccagg agtgtctgag ctgtgcccca 40260
ctctgtacag aggctgcttg ggcagccttg cctctagaga gcagatgcca gcttcggaag 40320
cccctggtct aacttgggat ctgggaatgg aaggtgcccc cataggaggg gaccctcaca 40380
gccccgggga ctgccaggtg ggccggctgc caccgtaagc caaaaaaggt ggggaagccc 40440
tgactccaag gtccttgccc cacccctgcc tgccacctgg cccctcacag cccagaccct 40500
caccggcagg tgagctcagc tgccctttgg aataaagctg cctgatccaa gcccctctgc 40560
tggagtttga atggggaccc gggcaccagc cttacgccct tgactgaagc agtccctgct 40620
tccagctcag cctgattgac aagtgtccag aaggccaagg tgggctcagt ggcagcaggc 40680
gtggccactg agggccactg agggctggga cctctggggc agctgcccag gtcctaggag 40740
aaatgctggg aaggcaatcg tttggggacc ctcaggtcac agggagggat gtgaggagca 40800
atggtctcct tttggaacct taaaggaaac aggctcagag aggcggttaa gacatcctca 40860
tggtggcact gggggttagg agtggaggtg gcatagactc cggtctccca gttccccgtc 40920
tgccatggcc ccctccagcg cgacactcat tccctttgaa ttctttgaat cattgagtag 40980
gcactgtgct ggcgccacag gggtgaagga cctggctcct gaccccagaa gcaatgggga 41040
tgatccagtg ggaaggggat ggaggggagc gcagaccggg caagtcaagg caagctgcct 41100
ggaggctgtg agacttgagc tggggttcag aggtagtcaa ggtgggaata tccgggaggg 41160
atattccagg caggggaaga gcatgtgcaa aggcacagag tcccggaaga atgagacaca 41220
ctaggaccca gcaagccgag tgagtgttac aacagagctt gagaggggaa ggactgaaga 41280
attcagaggg gcaaaccgag gcgggatagc agagcctgga gttgagccaa ggatttgacc 41340
ctgcaagttc tgtggagcca tggtaggctc tatagcatag gggtgacatg agtggactca 41400
cattttggaa ccagccttgg caccagtgtg cagggagtgg caggcaggga ggctgggtag 41460
gccactgcag gattccggga aggagaggat gggccgggac tgagcggcgc cacgggatgt 41520
actggaggat gatttcggac ccctgagggc agttgtgacg gagccggggg acccgctgga 41580
ggtgagggtg ggtgctcaag tgtggacaac tctttctgga agcctaactg ggagcggaag 41640
ggacagaggg cgcttcagag gggccctaga ctgaagaggg gtttttccag catgggcgct 41700
gctgccaggt ctgtgggtga atgaggcaga aggggaacca gggacgggaa gcacccacct 41760
gggtcctgcc aggaggagcc ggggcagctg ggcgagcagg gggcgtctcc agagcaggtg 41820
ggcagaacac atgcagaatc ccttgggtga tctggaatca ccgtgggccc taccccagtc 41880
ttcgtcggaa tcctggaggg gtgggggatg tcatctgttc tcctaacaag cctcctggcg 41940
actcttttgc aaggatagtt ggaccccaaa agtgaggcca gctttgaagt ggagcgtcct 42000
c 42001

Claims (36)

1.一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含与SEQ ID NO:1的核碱基3162至3184的等长部分互补的至少8个连续核碱基的部分，其中所述修饰的寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸由15至30个、15至25个、15至24个、16至24个、17至24个、18至24个、19至24个、20至24个、19至22个、20至22个、16至20个、16或20个连接的核苷组成。
3.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含含有与SEQ ID NO:1的等长部分互补的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的部分的核碱基序列。
4.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO:1至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。
5.一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO:63、77的核碱基序列中的任一个的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或16个连续核碱基。
6.一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO:23、36、37的核碱基序列中的任一个的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
7.一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO:36的核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
8.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸是单链的。
9.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中至少一个核苷间键联是修饰的核苷间键联。
10.如权利要求9所述的化合物，其中至少一个修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
11.如权利要求9所述的化合物，其中每个修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
12.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一种修饰的糖。
13.如权利要求12所述的化合物，其中至少一种修饰的糖是双环糖。
14.如权利要求12所述的化合物，其中至少一种修饰的糖包含2’-O-甲氧基乙基、受限的乙基、3’-氟-HNA或4’-(CH2)n-O-2’桥，其中n是1或2。
15.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中至少一个核苷包含修饰的核碱基。
16.如权利要求15所述的化合物，其中所述修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
17.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含：
a.由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
b.由连接的核苷组成的5’翼区段；以及
c.由连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
18.如权利要求17所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸由16至20个连接的核碱基组成。
19.如权利要求17所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成并且包含：
a.由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
b.由5个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
c.由5个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中至少一个核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
20.一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:36的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰的寡核苷酸包含：
a.由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
b.由5个连接的核苷组成的5’翼区段；
c.由5个连接的核苷组成的3’翼区段；以及
d.GalNAc缀合物；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中至少一个核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
21.一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:77的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰的寡核苷酸包含：
a.由9个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
b.由3个连接的核苷组成的5’翼区段；
c.由4个连接的核苷组成的5’翼区段；
d.GalNAc缀合物；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖，其中每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
22.一种化合物，其包含根据下式的修饰的寡核苷酸：mCes Teo Teo Teo Aeo Tds TdsmCds mCds Ads Ads Ads Gds Gds Gds mCeo Aeo Ges mCes Te(SEQ ID NO:36)；其中
A＝腺嘌呤，
mC＝5-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，
d＝2’-脱氧核苷，以及
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
23.一种化合物，其包含根据下式的修饰的寡核苷酸：mCks Aes Gks mCds Tds TdsTds Ads Tds Tds mCds mCds Aes Aes Aks Gk(SEQ ID NO:77)；其中
A＝腺嘌呤，
mC＝5-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，
d＝2’-脱氧核苷，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，以及
k＝受限的乙基。
24.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其还包含缀合的GalNAc部分。
25.一种修饰的寡核苷酸，其根据下式：
26.一种修饰的寡核苷酸，其根据下式：
27.一种组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的化合物或修饰的寡核苷酸，或其盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
28.一种包含如前述权利要求中任一项所述的化合物或修饰的寡核苷酸的组合物，其用于治疗。
29.一种包含如前述权利要求中任一项所述的化合物或修饰的寡核苷酸的组合物，其用于制备药物。
30.如前述权利要求中任一项所述的化合物或修饰的寡核苷酸，其用于减少细胞、组织、器官或动物中的TMPRSS6。
31.如前述权利要求中任一项所述的化合物或修饰的寡核苷酸，其用于在动物中减少铁积聚、提高铁调素表达水平和/或降低转铁蛋白饱和度百分比。
32.如前述权利要求中任一项所述的化合物或修饰的寡核苷酸，其用于治疗、预防动物中与过量铁积聚相关的疾病、病症或病状，或减缓所述疾病、病症或病状的进展。
33.如权利要求32所述的化合物或修饰的寡核苷酸，其中所述疾病、病症或病状是红细胞增多症、血色素沉着症或贫血。
34.如权利要求33所述的化合物或修饰的寡核苷酸，其中所述贫血是遗传性贫血、骨髓增生异常综合征或严重慢性溶血。
35.如权利要求34所述的化合物或修饰的寡核苷酸，其中所述遗传性贫血是镰状细胞性贫血、地中海贫血、范可尼贫血、戴-布二氏贫血、舒-戴二氏综合征、红细胞膜障碍、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏或遗传性出血性毛细血管扩张症。
36.如权利要求35所述的化合物或修饰的寡核苷酸，其中所述地中海贫血是β-地中海贫血。
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