CN103814132B - Gcgr表达的反义调节 - Google Patents

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Abstract

本文提供用于降低GCGR mRNA和蛋白质在动物体内的表达的方法、化合物以及组合物。此类方法、化合物以及组合物可用于治疗、预防、延迟或改善代谢疾病，例如糖尿病，或其症状。

Description

GCGR表达的反义调节
序列表
本申请是与序列表一起以电子格式提交的。该序列表以创建于2012年9月19日的命名为BIOL0161USSEQ.txt的文件提供，其大小为60Kb。该序列表的电子格式的信息以全文引用的方式并入本文中。
领域
本文提供用于降低GCGR mRNA和蛋白质在动物体内的表达的方法、化合物以及组合物。此类方法、化合物以及组合物可用于例如治疗、预防、延迟或改善与代谢病症相关的疾病，特别是与糖尿病相关的病症。
背景
胰岛素和胰高血糖素是参与调控葡萄糖体内平衡和代谢的两种胰腺激素。胰高血糖素是从胰岛的α细胞分泌的并且通过调节肝葡萄糖产生来调控葡萄糖体内平衡(Quesada等人，J.Endocrinol.2008.199：5-19)。胰高血糖素的主要功能是对抗胰岛素的作用。
葡萄糖代谢失调可能是由有缺陷的胰岛素分泌和/或作用、或受损的餐后胰高血糖素抑制造成的(Shah等人，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.1999.277：E283-E290)。糖尿病受试者中的餐后胰高血糖素分泌的抑制已经显示出大幅降低血糖，这表明胰高血糖素显著有助于在具有2型糖尿病的受试者中可见的高血糖(Shah等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.2000.85：4053-4059)。
2型糖尿病的特征为胰岛素分泌和/或作用受损，并且许多受试者还展现出在空腹和餐后状态下不当的循环胰高血糖素水平。胰高血糖素/胰岛素比率增大可能是2型糖尿病患者中可见的高血糖的重要决定因素(Baron等人，Diabetes.1987.36：274-283)。具有T2DM的受试者中缺乏餐后胰高血糖素分泌的抑制在餐后高血糖的发病机理中也起到重要的作用(Henkel等人，Metabolism.2005.54：1168-1173)。
胰高血糖素通过活化其受体GCGR而对靶标组织发挥其作用。胰高血糖素受体是一种作为B族G蛋白偶联受体家族成员的62kDa蛋白质(Brubaker等人，Recept.Channels.2002.8：179-88)。GCGR活化导致G蛋白(Gsα和Gq)的信号转导，由此Gsα活化腺苷酸环化酶，这造成cAMP产生，从而导致蛋白激酶A的水平增加。肝脏中的GCGR信号传导通过诱导糖原分解和糖质新生以及抑制糖原生成而导致肝葡萄糖产生增加(Jiang和Zhang.Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.2003.284：E671-E678)。GCGR也在肝外组织中表达，所述肝外组织包括心脏、肠平滑肌、肾脏、大脑以及脂肪组织(Hansen等人，Peptides.1995.16：1163-1166)。
GCGR的反义抑制相比于传统的小分子抑制剂的独特优势在于：反义抑制剂不依赖于化合物与蛋白质的竞争性结合并且直接通过降低GCGR的表达来抑制活性。教示GCGR反义抑制剂的代表性美国专利包括美国专利No.7,750,142，其通过全文引用的方式并入本文中。反义技术作为降低某些基因产物表达的有效手段而出现并且可因此被证实可独特地用于多种用于调节GCGR的治疗、诊断以及研究应用中。
目前缺乏可接受的用于治疗代谢病症的选择。因此本文的目的在于提供用于治疗此类疾病和病症的化合物和方法。本发明涉及GCGR基因表达的新颖高效抑制剂的发现。
本申请中引用的所有文献或文献的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍以及论文，特此通过引用本文讨论的文献部分以及其全文的方式明确地并入。
概述
本文提供用于调节GCGR的表达以及治疗、预防、延迟或改善与代谢病症相关的疾病、特别是与糖尿病相关的病症和/或其症状的方法、化合物以及组合物。
详述
应理解的是，本文所述的前述一般描述和下列详细描述都只是示例性和说明性而非限制性的，如所要求的一样。本文中，除非另外明确说明，否则单数的使用包括复数。如本文所用，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不具限制性。此外，除非另外明确说明，否则术语如“要素”或“成分”涵盖包括一个单元的要素和成分以及包括不止一个子单元的要素和成分。
本文使用的章节标题仅用于组织目的而不应理解为限制所述的主题。本申请中引用的所有文献或文献的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍以及论文，特此通过引用本文讨论的文献部分以及其全文的方式明确地并入。
定义
除非提供具体的定义，否则关于本文所述的分析化学、合成有机化学、以及医学和制药化学所用的命名法以及其程序和技术是本领域中众所周知并且常用的。标准技术可以用于化学合成和化学分析。在许可时，本申请中引用的所有文献或文献的部分，包括但不限于所有专利、申请、公开申请和其他期刊出版物、可通过诸如国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)等数据库获得的GENBANK登录号和相关序列信息以及在整个本文公开内容中提及的其他数据通过引用本文讨论的文献部分以及其全文的方式并入。
除非另外指出，否则下列术语具有下列含义：
“2′-O-甲氧基乙基”(又为2′-MOE和2′-O(CH2)2-OCH3)是指呋喃糖基环的2′位置的O-甲氧基-乙基修饰。被2′-O-甲氧基乙基修饰的糖为修饰糖。
“2′-O-甲氧基乙基核苷酸”意指包含被2′-O-甲氧基乙基修饰的糖部分的核苷酸。
“3′靶标位点”是指与特定反义化合物的3′最末端核苷酸互补的靶标核酸的核苷酸。
“5′靶标位点”是指与特定反义化合物的5′最末端核苷酸互补的靶标核酸的核苷酸。
“5-甲基胞嘧啶”意指用连接至5′位置的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。
“约”意指在数值的±10％内。例如，如果陈述“标志物可能增加约50％”，则暗示着该标志物可能增加45％-55％之间。
“活性药物剂”意指当施用至个体时提供治疗益处的药物组合物中的一种或多种物质。例如，在某些实施方案中，靶向GCGR的反义寡核苷酸是一种活性药物剂。
“活性靶标区域”或“靶标区域”意指一种或多种活性反义化合物所靶向的区域。“活性反义化合物”意指降低靶标核酸水平或蛋白质水平的反义化合物。
“肥胖”或“肥胖症”是指相对于瘦体重处于肥胖或身体脂肪或脂肪组织量过高的状态。身体脂肪量包括对于脂肪在整个身体内的分布以及脂肪组织沉积物的大小和质量的关注。身体脂肪分布可以通过皮褶测量、腰臀围比、或诸如超声、计算机断层扫描或磁共振成像等技术来估算。根据疾病控制与预防中心(Center for Disease Control andPrevention)，身体质量指数(BMI)为30或更大的个体被视为肥胖的。如本文所用的术语“肥胖症”包括由于脂肪组织在体内过量积聚而导致身体脂肪增加超过身体需求的病状。术语“肥胖症”包括但不限于下列病状：成年发病型肥胖症；营养性肥胖症；内源性或炎性肥胖症；内分泌肥胖症；家族性肥胖症；胰岛功能亢进性肥胖症；增生肥大性肥胖症；性腺机能减退性肥胖症；甲状腺机能减退性肥胖症；终身性肥胖症；病态肥胖症与外源性肥胖症。
“同时施用”是指两种剂以任何方式共同施用，其中两者的药理学作用同时在患者中显现。同时施用不需要两种剂以单一药物组合物、以相同的剂型或通过相同的施用途径来施用。两种剂的作用不需同时亲自显现。所述作用仅需要在一段时间内重叠并且无需在时间上共同延伸。
“施用”意指向动物提供剂，并且包括但不限于由医学专业人员施用和自己施用。
“剂”意指当施用至动物时可以提供治疗益处的活性物质。“第一剂”意指本文提供的治疗性化合物。例如，第一剂可以是靶向GCGR的反义寡核苷酸。“第二剂”意指本文所述的第二治疗性化合物(例如靶向GCGR的第二反义寡核苷酸)和/或非GCGR治疗性化合物。
“改善”是指相关疾病、病症或病状的至少一种指标、体征或症状的减轻。可以通过本领域技术人员已知的主观或客观措施来测定指标的严重程度。
“动物”是指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪，以及非人灵长类动物，包括但不限于猴子和黑猩猩。
“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶标核酸的杂交的任何可检测或可测量的活性。在某些实施方案中，反义活性是靶标核酸或由此种靶标核酸编码的蛋白质的量或表达的降低。
“反义化合物”意指能够通过氢键键合与靶标核酸进行杂交的寡聚化合物。
“反义抑制”意指与不存在反义化合物的情况下的靶标核酸水平或靶标蛋白水平相比，靶标核酸水平或靶标蛋白水平在与靶标核酸互补的反义化合物存在下的降低。
“反义寡核苷酸”意指具有允许与靶标核酸的相应区域或区段杂交的核碱基序列的单链寡核苷酸。
“双环糖”意指通过两个非成对的环原子桥联而修饰的呋喃糖基环。双环糖是修饰的糖。
“双环核酸”或“BNA”是指如下的核苷或核苷酸，其中该核苷或核苷酸的呋喃糖部分包括连接该呋喃糖环上的两个碳原子的桥联，从而形成双环系统。
“帽部分”或“端帽部分”意指已经在反义化合物的任一末端处并入的化学修饰。
“化学相异区域”是指反义化合物的一个区域在某些方面在化学上不同于同一反义化合物的另一个区域。例如，具有2′-O-甲氧基乙基核苷酸的区域与具有不含2′-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸的区域在化学上相异。
“嵌合反义化合物”意指具有至少两个化学上相异区域的反义化合物。
“共同施用”意指向个体施用两种或更多种剂。所述两种或更多种剂可以处于单一药物组合物中，或可以处于单独的药物组合物中。两种或更多种剂各自可以通过相同或不同的施用途径来施用。共同施用涵盖平行或依序施用。
“胆固醇”是可见于所有动物组织的细胞膜中的甾醇分子。胆固醇必须在动物的血浆中由脂蛋白转运，包括极低密度脂蛋白(VLDL)、中间密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)以及高密度脂蛋白(HDL)。“血浆胆固醇”是指血浆或血清中存在的所有被酯化和/或未被酯化的脂蛋白(VDL、IDL、LDL、HDL)胆固醇的总和。
“互补性”意指第一核酸与第二核酸的核碱基之间配对的能力。
“连续核碱基”意指彼此直接相邻的核碱基。
“脱氧核糖核苷酸”意指在核苷酸的糖部分的2′位置具有氢的核苷酸。脱氧核糖核苷酸可用多种取代基中的任一者修饰。
“糖尿病(diabetes mellitus/diabetes)”是一种特征为由胰岛素水平不足或胰岛素敏感性降低所导致的代谢紊乱和异常高血糖(高血糖症)的综合征。特征性症状是由于高血糖水平所致的尿量过多(多尿)、试图补偿排尿增加的过度口渴和液体摄入量增加(烦渴)、由于高血糖对眼睛光学器件的影响所致的视力模糊、不明原因的体重减轻、以及嗜睡。
“糖尿病性血脂异常”或“具有血脂异常的2型糖尿病”意指特征为2型糖尿病、HDL-C降低、甘油三酯升高以及小而密的LDL粒子升高的病状。
“稀释剂”意指组合物中缺乏药理学活性、但在药学上为必需或需要的成分。例如，注射组合物中的稀释剂可以是液体，例如盐水溶液。
“血脂异常”是指脂质和/或脂蛋白代谢病症，包括脂质和/或脂蛋白过度产生或缺乏。血脂异常可体现为脂质如胆固醇和甘油三酯以及脂蛋白如低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的升高。
“剂量单位”意指提供药物剂的形式，例如丸剂、片剂或本领域中已知的其他剂量单位。在某些实施方案中，剂量单位是含有冻干的反义寡核苷酸的小瓶。在某些实施方案中，剂量单位是含有重配的反义寡核苷酸的小瓶。
“剂量”意指以单次施用或以指定时段提供的药物剂的指定量。在某些实施方案中，剂量可以一个、两个或更多个大丸剂、片剂或注射剂施用。例如，在需要皮下施用的某些实施方案中，所需剂量需要不易由单次注射供应的容量，因此，可以使用两次或更多次注射来达到所需剂量。在某些实施方案中，通过在延长的时段内或连续地输液来施用药物剂。剂量可以称为每小时、每天、每周或每个月的药物剂的量。
“有效量”或“治疗有效量”意指足以在需要剂的个体中实现所需的生理学结果的活性药物剂的量。取决于有待治疗的个体的健康和身体状况、有待治疗的个体的分类群、组合物的配制、个体的医学病况的评估以及其他相关因素，不同个体之间的有效量可能不同。
“完全互补”或“100％互补”意指第一核酸的核碱基序列的每个核碱基都在第二核酸的第二核碱基序列中具有互补的核碱基。在某些实施方案中，第一核酸是反义化合物并且靶标核酸是第二核酸。
“缺口聚体(gapmer)”意指一种嵌合反义化合物，其中，具有多个支持RNA酶H裂解的核苷的内部区域定位于具有一个或多个核苷的外部区域之间，其中构成该内部区域的核苷在化学上相异于构成所述外部区域的一个或多个核苷。该内部区域可以被称为“缺口区段”，而所述外部区域可以被称为“侧翼区段”。
“缺口加宽的”意指具有定位于具有一至六个核苷的5′和3′侧翼区段之间并且与其直接相邻的含12个或更多个连续的2′-脱氧核糖核苷的缺口区段的嵌合反义化合物。
“胰高血糖素受体”或“GCGR”意指GCGR的任何核酸或蛋白质。
“GCGR表达”意指从编码GCGR的基因转录的mRNA的水平或从mRNA翻译的蛋白质的水平。可以利用本领域已知的方法如Northern或Western印迹法来测定GCGR表达。
“GCGR核酸”意指任何编码GCGR的核酸。例如，在某些实施方案中，GCGR核酸包括编码GCGR的DNA序列、从编码GCGR的DNA转录的RNA序列(包括包含内含子和外显子的基因组DNA)，以及编码GCGR的mRNA序列。“GCGR mRNA”意指编码GCGR蛋白的mRNA。
“葡萄糖”是被细胞用作能量来源和炎性中间物的单糖。“血浆葡萄糖”是指存在于血浆中的葡萄糖。
“杂交”意指互补的核酸分子的粘接。在某些实施方案中，互补的核酸分子包括反义化合物和靶标核酸。
“高脂血症”或“高脂血”是一种特征为血清脂质或循环(血浆)脂质升高的病状。这种病状体现为脂肪浓度异常高。循环血液中的脂质部分是胆固醇、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白以及甘油三酯。
“高甘油三酯血症”意指特征为甘油三酯水平升高的病状。
“鉴定”或“选择具有代谢问题的动物”意指鉴定或选择已经被诊断出具有代谢疾病或代谢病症的受试者；或者，鉴定或选择具有代谢疾病的任何症状的受试者，所述症状包括但不限于代谢综合征、高血糖症、高甘油三酯血症、高血压、胰岛素抵抗增加、胰岛素敏感性降低、超过正常体重、和/或超过正常身体脂肪或其任何组合。可利用任何方法来实现此种鉴定，包括但不限于标准的临床试验或评估，例如测量血清或循环(血浆)血糖、测量血清或循环(血浆)甘油三酯、测量血压、测量身体脂肪、测量体重等。
“直接相邻”意指在直接相邻的要素之间不存在任何插入的要素。
“个体”或“受试者”或“动物”意指被选择用于处理或治疗的人类或非人动物。
“抑制表达或活性”是指降低或阻断RNA或蛋白质的表达或活性并且未必指示表达或活性的完全消除。
“胰岛素抵抗”被定义为正常量的胰岛素不足以从脂肪、肌肉和肝细胞产生正常的胰岛素反应的病状。脂肪细胞中的胰岛素抵抗导致储存的甘油三酸脂的水解，这使血浆中的游离脂肪酸升高。肌肉中的胰岛素抵抗降低了葡萄糖摄取，而肝脏中的胰岛素抵抗降低了葡萄糖储存，这两种作用使血糖升高。由于胰岛素抵抗所致的胰岛素和葡萄糖的高血浆水平通常导致代谢综合征和2型糖尿病。
“胰岛素敏感性”是个体处理葡萄糖的有效性的量度。具有高胰岛素敏感性的个体会有效地处理葡萄糖，而具有低胰岛素敏感性的个体不会有效地处理葡萄糖。
“核苷间键联”是指核苷之间的化学键。
“静脉内施用”意指施用至静脉中。
“连接的核苷”意指键合在一起的相邻的核苷。
“降脂疗法”或“降脂剂”意指提供至受试者以降低受试者中的一种或多种脂质的治疗方案。在某些实施方案中，提供降脂疗法以降低受试者中ApoB、总胆固醇、LDL-C、VLDL-C、IDL-C、非HDL-C、甘油三酯、小而密的LDL粒子以及Lp(a)的一者或多者。降脂疗法的例子包括他汀类、贝特类以及MTP抑制剂。
“主要风险因素”是指促进特定疾病或病状的高风险的因素。在某些实施方案中，冠状动脉心脏病的主要风险因素包括但不限于抽烟、高血压、低HDL-C、冠状动脉心脏病家族史、年龄以及本文公开的其他因素。
“代谢疾病”或“代谢病症”是指特征为代谢功能改变或紊乱的病状。“代谢的”和“代谢”是本领域中众所周知的术语并且一般包括在活有机体内发生的完全范围的生物化学过程。代谢疾病或病症包括但不限于肥胖症、糖尿病、高血糖症、前驱糖尿病、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、代谢综合征、胰岛素抵抗、糖尿病性血脂异常、或高甘油三酯血症或其组合。
“代谢综合征”意指特征为代谢起源的脂质和非脂质心血管风险因素的簇集的病状。在某些实施方案中，通过下列因素中的任意3种的存在来鉴定代谢综合征：男性腰围大于102cm或女性腰围大于88cm；血清甘油三酯为至少150mg/dL；男性中HDL-C小于40mg/dL或女性中HDL-C小于50mg/dL；血压为至少130/85mmHg；以及空腹葡萄糖为至少110mg/dL。这些决定因素可以在临床实践中容易地测量(JAMA，2001，285：2486-2497)。
“错配”或“非互补性核碱基”是指当第一核酸的核碱基不能与第二核酸或靶标核酸的相应核碱基配对的情形。
“混合型血脂异常”意指特征为胆固醇升高和甘油三酯升高的病状。
“修饰的核苷间键联”是指天然存在的核苷间键(即磷酸二酯核苷间键)的取代或任何改变。
“修饰的核碱基”是指除了腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之外的任何核苷碱基。“未修饰的核碱基”意指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“修饰的核苷”意指独立地具有修饰的糖部分或修饰的核碱基的核苷。
“修饰的核苷酸”意指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷间键联或修饰的核碱基的核苷酸。“修饰的核苷”意指独立地具有修饰的糖部分或修饰的核碱基的核苷。
“修饰的寡核苷酸”意指包含至少一个修饰的核苷酸的寡核苷酸。
“修饰的糖”是指从天然糖的取代或改变。
“基序”意指反义化合物中的化学相异区域的模式。
“天然存在的核苷间键联”意指3′至5′磷酸二酯键联。
“天然糖部分”意指以DNA(2′-H)或RNA(2′-OH)存在的糖。
“非酒精性脂肪肝疾病”或“NAFLD”意指特征为并非由于过量酒精使用(例如，酒精消耗超过20克/天)所致的肝脏的脂肪炎症的病状。在某些实施方案中，NAFLD与胰岛素抵抗和代谢综合征有关。NAFLD涵盖从肝细胞中单纯的甘油三酯积聚(肝脂肪变性)至具有炎症的肝脂肪变性(脂肪性肝炎)、纤维化以及肝硬化的疾病谱。
“非酒精性脂肪性肝炎”(NASH)由NAFLD进展发生，晚于甘油三酯沉积。NASH的发展需要能够诱发坏死、炎症和纤维化的“第二次击中(second hit)”。第二次击中的候选者可以分组成以下宽泛类别：造成氧化应激增加的因素和促进促炎性细胞因子表达的因素。
“核酸”是指由单聚核苷酸构成的分子。核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小的干扰核糖核酸(siRNA)以及微RNA(miRNA)。核酸还可以包括这些要素于单一分子中的组合。
“核碱基”意指能够与另一个核酸的碱基配对的杂环部分。
“核碱基序列”意指不依赖于任何糖、键联或核碱基修饰的连续核碱基的次序。
“核苷”意指与糖连接的核碱基。
“核苷模拟物”包括用于替代糖或糖与碱基但未必替代寡聚化合物的一个或多个位置处的键联的那些结构，例如具有吗啉基、环己烯基、环己基、四氢吡喃基、双环或三环糖模拟物例如非呋喃糖单元的核苷模拟物。
“核苷酸”意指具有共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基的核苷。
“核苷酸模拟物”包括用于替代核苷和寡聚化合物的一个或多个位置处的键联的那些结构，例如肽核酸或吗啉基(由-N(H)-C(＝O)-O-或其他非磷酸二酯键联连接的吗啉基)。
“寡聚化合物”或“寡聚物”是指包含两个或更多个子结构并且能够与核酸分子的一个区域杂交的聚合物结构。在某些实施方案中，寡聚化合物是寡核苷。在某些实施方案中，寡聚化合物是寡核苷酸。在某些实施方案中，寡聚化合物是反义化合物。在某些实施方案中，寡聚化合物是反义寡核苷酸。在某些实施方案中，寡聚化合物是嵌合寡核苷酸。
“寡核苷酸”意指连接的核苷的聚合物，其中每一者可以彼此独立地被修饰或未被修饰。
“肠胃外施用”意指通过注射或输液施用。肠胃外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用，例如鞘内施用或脑室内施用。施用可以是连续的、或长期的、或短期或间歇的。
“肽”意指通过酰胺键将至少两个氨基酸连接而形成的分子。肽是指多肽和蛋白质。
“药物剂”意指当施用至个体时提供治疗益处的物质。例如，在某些实施方案中，靶向GCGR的反义寡核苷酸是药物剂。
“药物组合物”意指适于施用至个体的物质的混合物。例如，药物组合物可以包含一种或多种活性剂和无菌水溶液。
“药学上可接受的载体”意指不会干扰寡核苷酸的结构的介质或稀释剂。某些此类载体使得药物组合物能够被配制成例如用于被受试者经口摄取的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液以及锭剂。例如，药学上可接受的载体可以是无菌水溶液。
“药学上可接受的衍生物”涵盖药学上可接受的本文所述化合物的盐、缀合物、前药或异构体。
“药学上可接受的盐”意指生理学上和药学上可接受的反义化合物的盐，即，保留亲本寡核苷酸的所需生物活性并且不会赋予其不希望的毒理学作用的盐。
“硫代磷酸酯键联”意指核苷之间的键联，其中通过用硫原子置换一个非桥联氧原子来修饰磷酸二酯键。硫代磷酸酯键联是修饰的核苷间键联。
“部分”意指核酸的限定数目的连续的(即连接的)核碱基。在某些实施方案中，一个部分是靶标核酸的限定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，一个部分是反义化合物的限定数目的连续核碱基。
“预防”是指延迟或阻止疾病、病症或病状的发作或发展，持续从数分钟至无限期的一段时间。预防还意指降低患上疾病、病症或病状的风险。
“前药”意指以非活性形式制备的治疗剂，其通过内源性酶或其他化学剂或条件的作用而在体内或其细胞内转化为活性形式。
“副作用”意指除所需作用以外的可归因于治疗的生理反应。在某些实施方案中，副作用包括注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常、肌病以及不适感。例如，血清中的转氨酶水平增加可以指示肝毒性或肝功能异常。例如，胆红素增加可以指示肝毒性或肝功能异常。
“单链寡核苷酸”意指不与互补链杂交的寡核苷酸。
“可特异性杂交”是指在需要特异性结合的条件下(即在体内测定法和治疗性处理情况下的生理条件下)，在反义寡核苷酸与靶标核酸之间具有足够程度的互补性以诱发所需作用并且同时展现对非靶标核酸的作用最小或无作用的反义化合物。
“他汀类”意指抑制HMG-CoA还原酶的活性的药剂。
“皮下施用”意指在皮肤下方施用。
“靶向”或“靶向的”意指将与靶标核酸特异性杂交并诱发所需作用的反义化合物的设计和选择的过程。
“靶标核酸”、“靶标RNA”和“靶标RNA转录物”都是指能够被反义化合物靶向的核酸。
“靶标区段”意指反义化合物所靶向的靶标核酸的核苷酸的序列。“5′靶标位点”是指靶标区段的5′最末端核苷酸。“3′靶标位点”是指靶标区段的3′最末端核苷酸。
“治疗有效量”意指向个体提供治疗益处的剂的量。
“治疗性生活方式改变”意指意欲降低脂肪/脂肪组织质量和/或胆固醇的饮食和生活方式改变。此种改变可以降低患上心脏病的风险，并且可包括关于每日总热量、总脂肪、饱和脂肪、多不饱和脂肪、单不饱和脂肪、碳水化合物、蛋白质、胆固醇、不溶性纤维的饮食摄入的建议，以及关于体育活动的建议。
“甘油三酯”或“TG”意指由与三个脂肪酸分子组合的甘油构成的脂质或中性脂肪。
“2型糖尿病”(也称为“2型糖尿病”或“糖尿病，第2型”，并且之前称为“第2型糖尿病”、“非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)”、“肥胖症相关性糖尿病”或“成年发病型糖尿病”)是主要特征为胰岛素抵抗、相对胰岛素缺乏以及高血糖症的代谢病症。
“治疗”是指向动物施用药物组合物以实现疾病、病症或病状的改变或改善。
“未修饰的核苷酸”意指由天然存在的核碱基、糖部分以及核苷间键联构成的核苷酸。在某些实施方案中，未修饰的核苷酸是RNA核苷酸(即β-D-核糖核苷)或DNA核苷酸(即β-D-脱氧核糖核苷)。
某些实施方案
某些实施方案提供用于抑制GCGR表达的方法、化合物以及组合物。
某些实施方案提供靶向GCGR核酸的反义化合物。在某些实施方案中，GCGR核酸是以GENBANK登录No.NM_000160.3(以SEQ ID NO：1并入本文)或GENBANK登录No：NW_926918.1(从核苷酸16865000至16885000截短)(以SEQ ID NO：2并入本文)所示的序列中的任一者。在某些实施方案中，GCGR具有如SEQ ID NO：3所示的恒河猴序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由12至30个核苷组成并具有与SEQ ID NO：1-3中的任一者的相等长度部分互补的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：4-115中的任一者的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85中的任一者的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物为或包含ISIS NO：449884、459014、398471、448766或459157。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：11的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：80的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，该化合物或组合物为或包含ISIS NO：449884。
在某些实施方案中，该化合物或组合物为或包含ISIS NO：459014。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由15至30个核苷组成并具有与SEQ ID NO：1-3中的任一者的相等长度部分互补的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物由15至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：4-115中的任一者的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物由15至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85中的任一者的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物为或包含ISIS NO：449884、459014、398471、448766或459157。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物由15至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：11的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物由15至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：80的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物为或包含ISIS NO：449884。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物为或包含ISIS NO：459014。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由16至21个核苷组成并具有与SEQ ID NO：1-3中的任一者的相等长度部分互补的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由16至21个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：4-115中的任一者的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由16至21个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85中的任一者的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由16至21个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由16至21个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：80的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至35个核苷组成并具有与SEQ ID NO：1-3中的任一者的相等长度部分互补的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至35个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：4-115的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由20至35个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物可以由17至35个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：11的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物可以由17至35个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：80的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至30个核苷组成并具有与SEQ ID NO：1-3中的任一者的相等长度部分互补的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：4-115的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：80的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至25个核苷组成并具有与SEQ ID NO：1-3中的任一者的相等长度部分互补的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至25个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：4-115的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至25个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至25个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至25个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：80的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文所述的化合物或组合物包含由17至24个核苷组成并具有与SEQ ID NO：1-3中的任一者的相等长度部分互补的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至24个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：4-115的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至24个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至24个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至24个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：80的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至23个核苷组成并具有与SEQ ID NO：1-3中的任一者的相等长度部分互补的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至23个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：4-115的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至23个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至23个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至23个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：80的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至22个核苷组成并具有与SEQ ID NO：1-3中的任一者的相等长度部分互补的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至22个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：4-115的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至22个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至22个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至22个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：80的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至21个核苷组成并具有与SEQ ID NO：1-3中的任一者的相等长度部分互补的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至21个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：4-115的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至21个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至21个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17至21个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：80的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由20个核苷组成并具有与SEQ ID NO：1-3中的任一者的相等长度部分互补的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由20个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：4-115的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由20个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由20个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由20个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：80的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17个核苷组成并具有与SEQ ID NO：1-3中的任一者的相等长度部分互补的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：4-115的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：11的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸并且具有包含SEQ ID NO：80的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含修饰寡核苷酸的盐。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物进一步包含药学上可接受的载体或稀释剂。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：1-3中的任一者具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补性，如对整个修饰寡核苷酸所测量。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：4-115中的任一者具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，如对整个修饰寡核苷酸所测量。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：11、17、31、80或85中的任一者具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，如对整个修饰寡核苷酸所测量。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：11具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，如对整个修饰寡核苷酸所测量。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：80具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，如对整个修饰寡核苷酸所测量。
在某些实施方案中，反义化合物或修饰寡核苷酸靶向GCGR核酸的一个区域。在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的一个区域的此类化合物或寡核苷酸具有与该区域的相等长度核碱基部分互补的连续核碱基部分。例如，该部分可以是与本文所述区域的相等长度部分互补的至少一个含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的部分。在某些实施方案中，此类化合物或寡核苷酸靶向SEQ ID NO：2的下列核苷酸区域：6691-6707、7267-7280、7267-7283、7267-7284、7267-7285、7267-7286、7267-7287、7267-7457、7268-7284、7268-7285、7268-7286、7268-7287、7269-7285、7269-7286、7269-7287、7270-7285、7270-7286、7270-7287、7271-7287、7291-7312、7292-7308、7292-7309、7292-7310、7292-7311、7292-7312、7293-7309、7293-7310、7293-7311、7293-7312、7294-7310、7294-7311、7294-7312、7295-7310、7295-7311、7295-7312、7296-7312、7316-7332、7316-7333、7316-7334、7316-7335、7316-7336、7317-7333、7317-7334、7317-7335、7317-7336、7318-7334、7318-7335、7318-7336、7319-7334、7319-7335、7319-7336、7320-7336、7339-7405、7339-7406、7339-7407、7339-7408、7339-7409、7341-7354、7341-7357、7341-7358、7341-7359、7341-7360、7341-7361、7342-7358、7342-7359、7342-7360、7342-7361、7343-7359、7343-7360、7343-7361、7344-7360、7344-7361、7345-7361、7347-7456、7365-7381、7365-7382、7365-7383、7365-7384、7365-7385、7366-7382、7366-7383、7366-7384、7366-7385、7367-7383、7367-7384、7367-7385、7368-7383、7368-7384、7368-7385、7369-7385、7388-7382、7389-7407、7389-7408、7389-7409、7390-7406、7390-7407、7390-7408、7390-7409、7391-7407、7391-7408、7391-7409、7392-7407、7392-7408、7392-7409、7393-7409、7413-7433、7414-7430、7414-7431、7414-7432、7414-7433、7415-7431、7415-7432、7415-7433、7416-7432、7416-7433、7417-7433、7437-7453、7437-7454、7437-7455、7437-7456、7437-7457、7438-7454、7438-7455、7438-7456、7438-7457、7439-7455、7439-7456、7439-7457、7440-7455、7440-7456、7440-7457、7441-7457、7740-7756、7782-7798、7782-7801、7782-7913、7783-7799、7785-7801、7785-7913、7897-7913、8030-8049、8132-8151、8133-8152、8133-8155、8133-8156、8133-8157、8133-8159、8139-8155、8139-8156、8139-8157、8139-8159、8140-8156、8140-8157、8140-8159、8141-8157、8141-8159、8141-8160、8143-8159、8144-8160、8386-8402、8448-8464、8454-8473、9002-9019、9002-9020、9002-9021、9002-9026、9003-9019、9003-9020、9003-9021、9003-9026、9004-9020、9004-9021、9004-9026、9008-9027、9010-9026、9130-9146、9245-9264、9246-9262、9249-9265、9592-9611、9804-9823、9808-9824、10667-10683、10667-10684、10667-10695、10668-10684、10668-10695、10676-10683、10676-10684、10676-10695、10718-10734、10772-10788、11667-11686、11667-11691、11667-11695、11675-11691、11675-11695、11676-11695、11724-11741、11724-11743、11725-11741、11725-11743、11818-11834、11819-11835、11819-11838、11819-11842、11826-11842、11962-11978、12025-12044、12025-12046、12025-12049、12025-12051、12025-12052、12026-12042、12026-12044、12026-12046、12026-12047、12026-12048、12026-12049、12026-12050、12026-12051、12026-12055、12027-12046、12027-12049、12027-12051、12027-12052、12028-12044、12028-12046、12028-12047、12028-12048、12028-12049、12028-12050、12028-12051、12028-12055、12029-12045、12029-12046、12029-12047、12029-12048、12029-12049、12029-12050、12029-12051、12029-12055、12030-12046、12030-12047、12030-12048、12030-12049、12030-12050、12030-12051、12030-12055、12031-12045、12031-12048、12031-12049、12031-12050、12031-12051、12031-12055、12032-12048、12032-12049、12032-12050、12032-12051、12032-12052、12032-12055、12033-12049、12033-12050、12033-12051、12033-12052、12033-12055、12035-12051、12035-12055、12036-12055、12175-12091、12175-12094、12178-12194、13003-13022、13034-13050、13303-13022、13314-13333、13366-13382、13490-13509、13515-13534、14138-14157、14779-14795、15007-15023、15075-15094、15075-15113、15075-15121、15075-15127、15075-15133、15094-15113、15094-15121、15094-15127、15094-15133、15102-15121、15102-15127、15102-15133、15108-15127、15108-15133、15114-15133、15374-15390、15716-15735、15742-15761、15742-15762、15743-15762、15744-15760、15744-15762、15744-15763、15744-15764、15744-15765、15745-15764、15745-15765、15746-15760、15746-15762、15746-15763、15746-15764、15746-15765、15747-15763、15747-15764、15747-15765、15748-15764、15748-15765以及15749-15765。
在某些实施方案中，反义化合物或修饰寡核苷酸靶向GCGR核酸的一个区域。在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的一个区域的此类化合物或寡核苷酸具有与该区域的相等长度核碱基部分互补的连续核碱基部分。例如，该部分可以是与本文所述区域的相等长度部分互补的至少一个含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的部分。在某些实施方案中，此类化合物或寡核苷酸靶向SEQ ID NO：2的下列核苷酸区域：7267-7287、7270-7286、7292-7312、7295-7311、7316-7336、7319-7335、7341-7361、7344-7360、7365-7385、7368-7384、7389-7409、7392-7408、7416-7432、7437-7457、7440-7456、7783-7799、8133-8152、8144-8160、9804-9823、10718-10734以及15743-15762。
在某些实施方案中，反义化合物或修饰寡核苷酸靶向GCGR核酸的一个区域。在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的一个区域的此类化合物或寡核苷酸具有与该区域的相等长度核碱基部分互补的连续核碱基部分。例如，该部分可以是与本文所述区域的相等长度部分互补的至少一个含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基的部分。在某些实施方案中，此类化合物或寡核苷酸靶向SEQ ID NO：2的下列核苷酸区域：7270-7286、7295-7311、7319-7335、7344-7360、7368-7384、7392-7408、7416-7432、7440-7456以及10716-10734。
在某些实施方案中，下列反义化合物靶向SEQ ID NO：2(编码人类GCGR的核酸)的以下区域并且展现对GCGR基因序列的至少70％抑制：ISIS NO：325568、310457、449823、450035、449881、449882、398457、449883、449884、449885、450039、449894、449895、450040、398471、449905、449906、449907、449908、449910、449912、398486、449916、449917、449922、450049、450050、448762、448766、450054、449759、449760、436034、450059、448799、449938、448802、398585、449944、449945、448806、450061、449948、449949、449951、398504、449952、449953、449954、448817、449955、449956、449958、448818、449960、448819、449797、448840、449967、448848、448850、449819、448860、449836、450074、448890、448897、448901、448903、448905、449851、449856、449858、449859、449860、449861、315163、459032、459046、459076、459157、459010、459011、459058、459088、459087、459086、459083、459082、459158、448754、448718、448730、448738、436140、398455、398470、398491、398501、398503、398506、398507、398508、304535、304538、304539、436141以及436164。
在某些实施方案中，下列反义化合物靶向SEQ ID NO：2(编码人类GCGR的核酸)的以下区域并且展现对GCGR基因序列的至少75％抑制：ISIS NO：325568、310457、449823、450035、449881、449882、398457、449883、449884、449885、450039、449894、449895、450040、398471、449905、449906、449907、449908、449910、449912、398486、449916、449917、449922、450049、450050、448762、448766、450054、449759、449760、450059、448799、449938、448802、398585、449944、449945、448806、450061、449948、449949、449951、398504、449952、449953、449954、448817、449955、449956、449958、448818、449960、448819、449797、448840、449967、448848、448850、449819、448860、449836、450074、448890、448897、448901、448903、448905、449851、449856、449858、449859、449860、449861、459032、459076、459157、459010、459011、459058、459088、459087、459086、459083、459082、459158、448754、448718、448738、436140、398455、398470、398491、398501、398503、398506、398507、398508、304535、304538、304539、436141以及436164。
在某些实施方案中，下列反义化合物靶向SEQ ID NO：2(编码人类GCGR的核酸)的以下区域并且展现对GCGR基因序列的至少80％抑制：ISIS NO：310457、449823、450035、449881、449882、398457、449883、449884、449885、450039、449894、449895、450040、398471、449905、449906、449907、449908、449910、449912、398486、449916、449917、449922、450049、450050、448762、448766、450054、449759、449760、450059、448799、449938、448802、398585、449944、449945、448806、450061、449948、449949、449951、398504、449952、449953、449954、448817、449955、449956、449958、448818、449960、448819、449797、448840、449967、448848、448850、449819、449836、450074、448890、448897、448901、448903、448905、449851、449856、449858、449859、449860、449861、459032、459076、459157、459010、459011、459088、459087、459086、459083、459082、459158、448718、436140、398455、398470、398491、398501、398503、398506、398507、398508、304535、304538、304539、436141以及436164。
在某些实施方案中，下列反义化合物靶向SEQ ID NO：2(编码人类GCGR的核酸)的以下区域并且展现对GCGR基因序列的至少85％抑制：ISIS NO：310457、449823、449881、449882、398457、449883、449884、449885、450039、449894、449895、449905、449906、449907、449910、398486、449916、449917、449922、450049、448766、449760、450059、449938、448802、398585、449945、448806、450061、449948、449949、449951、398504、449952、449953、449954、448817、449955、449956、449958、449960、448819、449967、448848、449836、450074、448890、448903、449851、449856、449858、449859、449860、459157、459010、459011、459088、459087、459086、459083、459082、459158、436140、398455、398470、398503、398506、398507、398508、304535、304538、304539、436141以及436164。
在某些实施方案中，下列反义化合物靶向SEQ ID NO：2(编码人类GCGR的核酸)的以下区域并且展现对GCGR基因序列的至少90％抑制：ISIS NO：449823、398457、449883、449884、449885、449894、449895、449906、398486、449917、449938、449945、448806、450061、449951、398504、449952、449953、449954、448817、449955、449958、449960、448819、448848、450074、449859、459157、459010、459087、459086、459083、459082、459158、436140、398503、398507、304535、304538、304539、436141以及436164。
在某些实施方案中，下列反义化合物靶向SEQ ID NO：2(编码人类GCGR的核酸)的以下区域并且展现对GCGR基因序列的至少90％抑制：ISIS NO：398457、449883、398486、448806、448817、448819、459010、459087、459086、398507、304535以及304538。
在某些实施方案中，下列反义化合物靶向SEQ ID NO：2(编码人类GCGR的核酸)的以下区域并且展现小于3μM的IC50值：ISIS NO：304535、304538、304539、398455、398457、398470、398471、398486、398491、398501、398503、398504、398506、398507、398508、398585、436034、436140、436141、436164、448718、448730、448738、448754、448762、448766、448799、448802、448806、448817、448818、448819、448840、448848、448850、448860、448890、448897、448901、448903、448905、449884、459009、459010、459011、459014、459024、459032、459040、459046、459058、459063、459076、459082、459083、459086、459087、459088、459157以及459158。
在某些实施方案中，下列反义化合物靶向SEQ ID NO：2(编码人类GCGR的核酸)的以下区域并且展现小于1μM的IC50值：ISIS NO：304535、304538、304539、398455、398457、398470、398471、398486、398491、398501、398503、398504、398506、398507、398508、398585、436034、436140、436141、436164、448718、448730、448738、448754、448762、448766、448799、448802、448806、448817、448818、448819、448840、448848、448850、448860、448890、448897、448901、448903、448905、449884、459009、459010、459011、459024、459032、459040、459046、459058、459063、459076、459082、459083、459086、459087、459088、459157以及459158。
在某些实施方案中，下列反义化合物靶向SEQ ID NO：2(编码人类GCGR的核酸)的以下区域并且展现小于0.5μM的IC50值：ISIS NO：304535、304538、304539、398455、398457、398470、398471、398486、398491、398501、398503、398504、398506、398507、398508、398585、436034、436140、436141、436164、448718、448730、448738、448754、448762、448799、448802、448806、448817、448818、448819、448840、448848、448850、448860、448890、448897、448901、448903、448905、449884、459009、459010、459011、459024、459040、459046、459058、459063、459076、459082、459083、459086、459087、459088、459157以及459158。
在某些实施方案中，下列反义化合物靶向SEQ ID NO：2(编码人类GCGR的核酸)的以下区域并且展现小于0.3μM的IC50值：ISIS NO：304535、304538、398455、398457、398470、398471、398486、398504、398506、398507、436164、448718、448730、448762、446766、448799、448802、448806、448817、448819、448848、448850、448860、448890、448897、448905、449884、459010、459011、459040、459046、459076、459082、459083、459086、459087、459088、459157以及459158。
在某些实施方案中，下列反义化合物靶向SEQ ID NO：2(编码人类GCGR的核酸)的以下区域并且展现小于0.2μM的IC50值：ISIS NO：304538、398457、398486、398504、398506、398507、448730、448802、448819、448848、448850、448890、449884、459010、459011、459040、459076、459082、459083、459157以及459158。
在某些实施方案中，下列反义化合物靶向SEQ ID NO：2(编码人类GCGR的核酸)的以下区域并且展现小于0.1μM的IC50值：ISIS NO：398457、398507、448819、448848、448850、459010、459011、459083、459157以及459158。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述连接的核苷包含与选自SEQ ID NO：2的核苷酸7270-7286、7295-7311、7319-7335、7344-7360、7368-7384、7392-7408、7416-7432、7440-7456或10716-10734的区域内的相等长度核碱基部分互补的至少一个含8个连续核碱基的部分。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有至少一个含9个连续核碱基的部分、至少一个含10个连续核碱基的部分、至少一个含11个连续核碱基的部分、至少一个含12个连续核碱基的部分、至少一个含13个连续核碱基的部分、至少一个含14个连续核碱基的部分、至少一个含15个连续核碱基的部分或至少一个含16个连续核碱基的部分，其与选自SEQ ID NO：2的核苷酸7270-7286、7295-7311、7319-7335、7344-7360、7368-7384、7392-7408、7416-7432、7440-7456或10716-10734的区域内的相等长度部分互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸与编码人类GCGR的核酸(例如SEQ ID No：2)具有90％、95％、99％或100％互补性。
某些实施方案提供包含由至少17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与选自SEQ ID NO：2的核苷酸7267-7287、7270-7286、7292-7312、7295-7311、7316-7336、7319-7335、7341-7361、7344-7360、7365-7385、7368-7384、7389-7409、7392-7408、7416-7432、7437-7457、7440-7456、7783-7799、8133-8152、8144-8160、9804-9823、10718-10734或15743-15762的区域具有60％互补性。
某些实施方案提供包含由至少17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与选自SEQ ID NO：2的核苷酸7267-7287、7270-7286、7292-7312、7295-7311、7316-7336、7319-7335、7341-7361、7344-7360、7365-7385、7368-7384、7389-7409、7392-7408、7416-7432、7437-7457、7440-7456、7783-7799、8133-8152、8144-8160、9804-9823、10718-10734或15743-15762的区域具有70％互补性。
某些实施方案提供包含由至少17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与选自SEQ ID NO：2的7267-7287、7270-7286、7292-7312、7295-7311、7316-7336、7319-7335、7341-7361、7344-7360、7365-7385、7368-7384、7389-7409、7392-7408、7416-7432、7437-7457、7440-7456、7783-7799、8133-8152、8144-8160、9804-9823、10718-10734或15743-15762的区域具有80％互补性。
某些实施方案提供包含由至少17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与选自SEQ ID NO：2的核苷酸7267-7287、7270-7286、7292-7312、7295-7311、7316-7336、7319-7335、7341-7361、7344-7360、7365-7385、7368-7384、7389-7409、7392-7408、7416-7432、7437-7457、7440-7456、7783-7799、8133-8152、8144-8160、9804-9823、10718-10734或15743-15762的区域具有90％互补性。
某些实施方案提供包含由至少17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与选自SEQ ID NO：2的核苷酸7267-7287、7270-7286、7292-7312、7295-7311、7316-7336、7319-7335、7341-7361、7344-7360、7365-7385、7368-7384、7389-7409、7392-7408、7416-7432、7437-7457、7440-7456、7783-7799、8133-8152、8144-8160、9804-9823、10718-10734或15743-15762的区域具有95％互补性。
某些实施方案提供包含由至少17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与选自SEQ ID NO：2的核苷酸7267-7287、7270-7286、7292-7312、7295-7311、7316-7336、7319-7335、7341-7361、7344-7360、7365-7385、7368-7384、7389-7409、7392-7408、7416-7432、7437-7457、7440-7456、7783-7799、8133-8152、8144-8160、9804-9823、10718-10734或15743-15762的区域具有99％互补性。
某些实施方案提供包含由至少17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与选自SEQ ID NO：2的核苷酸7267-7287、7270-7286、7292-7312、7295-7311、7316-7336、7319-7335、7341-7361、7344-7360、7365-7385、7368-7384、7389-7409、7392-7408、7416-7432、7437-7457、7440-7456、7783-7799、8133-8152、8144-8160、9804-9823、10718-10734或15743-15762的区域具有100％互补性。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸7270-7286、7295-7311、7319-7335、7344-7360、7368-7384、7392-7408、7416-7432以及7440-7456具有60％互补性。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸7270-7286、7295-7311、7319-7335、7344-7360、7368-7384、7392-7408、7416-7432以及7440-7456具有70％互补性。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸7270-7286、7295-7311、7319-7335、7344-7360、7368-7384、7392-7408、7416-7432以及7440-7456具有80％互补性。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸7270-7286、7295-7311、7319-7335、7344-7360、7368-7384、7392-7408、7416-7432以及7440-7456具有90％互补性。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸7270-7286、7295-7311、7319-7335、7344-7360、7368-7384、7392-7408、7416-7432以及7440-7456具有95％互补性。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸7270-7286、7295-7311、7319-7335、7344-7360、7368-7384、7392-7408、7416-7432以及7440-7456具有99％互补性。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸7270-7286、7295-7311、7319-7335、7344-7360、7368-7384、7392-7408、7416-7432以及7440-7456具有100％互补性。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸10718-10734具有60％互补性。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸10718-10734具有70％互补性。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸10718-10734具有80％互补性。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸10718-10734具有90％互补性。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸10718-10734具有95％互补性。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸10718-10734具有99％互补性。
某些实施方案提供包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸10718-10734具有100％互补性。
在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的一个区域的此类化合物或寡核苷酸具有与SEQ ID NO：2的区域7270-7286、7295-7311、7319-7335、7344-7360、7368-7384、7392-7408、7416-7432、7440-7456或10718-10734的相等长度核碱基部分互补的连续核碱基部分。
在某些实施方案中，SEQ ID NO：2的下列核苷酸区域，当被反义化合物或寡核苷酸靶向时，显示至少65％抑制作用：7267-7287、7270-7286、7292-7312、7295-7311、7316-7336、7319-7335、7341-7361、7344-7360、7365-7385、7368-7384、7389-7409、7392-7408、7416-7432、7437-7457、7440-7456、7783-7799、8133-8152、8144-8160、9804-9823、10718-10734或15743-15762。
在某些实施方案中，下列SEQ ID NO中所述的核碱基序列显示对GCGR核酸的至少70％抑制作用：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、81、83、84、85、86、87、88、90、91、92、93、95、96、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114以及115。
在某些实施方案中，下列SEQ ID NO中所述的核碱基序列显示对GCGR核酸的至少75％抑制作用：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、81、84、85、86、87、88、90、91、92、93、95、96、98、99、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114以及115。
在某些实施方案中，下列SEQ ID NO中所述的核碱基序列显示对GCGR核酸的至少80％抑制作用：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、81、84、85、86、87、90、91、92、93、95、96、99、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115。
在某些实施方案中，下列SEQ ID NO中所述的核碱基序列显示对GCGR核酸的至少85％抑制作用：4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、22、24、25、26、27、28、31、34、36、38、39、40、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、57、58、61、62、66、67、68、71、73、74、75、76、77、85、86、87、90、91、92、93、95、96、102、103、104、107、108、109、110、111、112、113、114、115。
在某些实施方案中，下列SEQ ID NO中所述的核碱基序列显示对GCGR核酸的至少90％抑制作用：5、9、10、11、12、14、15、19、24、26、38、42、43、44、47、48、49、50、51、52、53、55、57、58、62、67、76、85、86、91、92、93、95、96、102、107、109、111、112、113、114以及115。
在某些实施方案中，下列SEQ ID NO中所述的核碱基序列显示对GCGR核酸的至少95％抑制作用：9、10、24、43、52、58、86、91、92、109、111以及112。
在某些实施方案中，本文提供的化合物具有比ISIS NO：315163、325568以及310457(公开于美国专利No.7,399,853和美国公开专利申请No.US2007-0087987中，以引用的方式并入本文中)更大的治疗潜力。在某些实施方案中，本文提供的化合物具有比ISISNO：315163、325568以及310457更好的体内抑制作用。在某些实施方案中，本文提供的化合物具有比ISIS NO：315163、325568以及310457更好的耐受性特征曲线。
在某些实施方案中，本文提供的化合物由单链修饰寡核苷酸组成。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个连接的核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由21个连接的核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由20个连接的核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由19个连接的核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由18个连接的核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由17个连接的核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由16个连接的核苷组成。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的至少一个核苷间键联是修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，每一核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，所述修饰寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含：a)由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间并且每一侧翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由20个连接的核苷组成，缺口区段由十个连接的脱氧核苷组成，5′侧翼区段由五个连接的核苷组成，3′侧翼区段由五个连接的核苷组成，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由17个连接的核苷组成，缺口区段由十个连接的脱氧核苷组成，5′侧翼区段由三个连接的核苷组成，3′侧翼区段由四个连接的核苷组成，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由21个连接的核苷组成，缺口区段由十个连接的脱氧核苷组成，5′侧翼区段由五个连接的核苷组成，3′侧翼区段由六个连接的核苷组成，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由20个连接的核苷组成并具有包含与SEQ ID NO：1-3中的任一者的相等长度部分互补的至少8个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中该修饰寡核苷酸包含：a)由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由五个连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由五个连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由20个连接的核苷组成并具有包含与SEQ ID NO：2中的任一者的相等长度部分互补的至少8个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中该修饰寡核苷酸包含：a)由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由五个连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由五个连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由20个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：4、17、24、30、31、35、37、39、40、43、48、52、56、58、60、62、63、65、68、69、70、71、72、79、79、79、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114以及115的至少19个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中该修饰寡核苷酸包含：a)由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由五个连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由五个连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由20个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：17或31的至少19个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中该修饰寡核苷酸包含：a)由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由五个连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由五个连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：17的至少16个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中该修饰寡核苷酸包含：a)由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由四个连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由四个连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：31的至少16个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中该修饰寡核苷酸包含：a)由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由三个连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由四个连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17个连接的核苷组成并具有包含与SEQ ID NO：1-3中的任一者的相等长度部分互补的至少8个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中该修饰寡核苷酸包含：a)由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由三个连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由四个连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17个连接的核苷组成并具有包含与SEQ ID NO：2中的任一者的相等长度部分互补的至少8个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中该修饰寡核苷酸包含：a)由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由三个连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由四个连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23、25、26、27、28、29、32、33、34、36、38、41、42、44、45、46、47、49、50、51、53、54、55、57、59、61、64、66、67、73、74、75、76、77、78、80、81、82、83、84、88、89以及97的至少16个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中该修饰寡核苷酸包含：a)由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由三个连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由四个连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：11或80的至少16个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中该修饰寡核苷酸包含：a)由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由三个连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由四个连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：11的至少16个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中该修饰寡核苷酸包含：a)由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由四个连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由四个连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-0-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由17个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：80的至少16个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中该修饰寡核苷酸包含：a)由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由三个连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由四个连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-0-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由21个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：85和96的至少20个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中该修饰寡核苷酸包含：a)由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由五个连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由六个连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含由21个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：85的至少20个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中该修饰寡核苷酸包含：a)由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由五个连接的核苷组成的5′侧翼区段；以及c)由六个连接的核苷组成的3′侧翼区段。该缺口区段定位于该5′侧翼区段与该3′侧翼区段之间，每一侧翼区段的每个核苷包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖，每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联并且每一胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
某些实施方案提供用于抑制GCGR表达的方法、化合物以及组合物。
某些实施方案提供一种降低动物体内的GCGR表达的方法，其包括向该动物施用如本文所述的化合物。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为12至30个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为15至30个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为18至21个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为17至35个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为17至25个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为17至24个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为17至23个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为17至22个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为17至21个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为17个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为20个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为21个连接的核苷的修饰寡核苷酸。
某些实施方案提供一种预防、改善或治疗动物体内的代谢疾病的方法，其包括向该动物施用如本文所述的化合物。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为12至30个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为17个连接的核苷的修饰寡核苷酸。代谢疾病或病症的例子包括但不限于糖尿病、高血糖症、前驱糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、代谢综合征、胰岛素抵抗、糖尿病性血脂异常或高甘油三酯血症或其组合。
某些实施方案提供一种预防、改善或治疗动物体内的肥胖症的方法，其包括向该动物施用如本文所述的化合物。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为12至30个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为17个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为20个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为21个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物或组合物包含ISIS NO：449884、459014、398471、448766或459157的化合物。在某些实施方案中，该化合物或组合物包含ISIS NO：449884的化合物。在某些实施方案中，该化合物或组合物包含ISIS NO：459014的化合物。
某些实施方案提供一种预防、改善或治疗动物体内的糖尿病的方法，其包括向该动物施用如本文所述的化合物。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为12至30个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为17个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为20个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为21个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物或组合物包含ISIS NO：449884、459014、398471、448766或459157的化合物。在某些实施方案中，该化合物或组合物包含ISIS NO：449884的化合物。在某些实施方案中，该化合物或组合物包含ISIS NO：459014的化合物。
某些实施方案提供一种降低动物的体重的方法，其包括向该动物施用如本文所述的化合物。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为12至30个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为17个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，降低动物的体重可预防、改善或治疗代谢疾病。在某些实施方案中，降低动物的体重可预防、改善或治疗糖尿病。在某些实施方案中，降低动物的体重可预防、改善或治疗肥胖症。在某些实施方案中，降低动物的体重可预防、改善或治疗代谢综合征。在某些实施方案中，降低动物的体重可预防、改善或治疗胰岛素抵抗。在某些实施方案中，降低动物的体重可预防、改善或治疗高血糖症。在某些实施方案中，降低动物的体重可预防、改善或治疗NAFLD。在某些实施方案中，降低动物的体重可预防、改善或治疗糖尿病性血脂异常。在某些实施方案中，葡萄糖水平降低至少5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
某些实施方案提供一种降低动物体内的葡萄糖水平的方法，其包括向该动物施用如本文所述的化合物。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为12至30个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，该化合物包含靶向GCGR的长度为17个连接的核苷的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，动物体内葡萄糖水平的降低可预防、改善或治疗代谢疾病。在某些实施方案中，动物体内葡萄糖水平的降低可预防、改善或治疗糖尿病。在某些实施方案中，动物体内葡萄糖水平的降低可预防、改善或治疗肥胖症。在某些实施方案中，动物体内葡萄糖水平的降低可预防、改善或治疗代谢综合征。在某些实施方案中，动物体内葡萄糖水平的降低可预防、改善或治疗胰岛素抵抗。在某些实施方案中，动物体内葡萄糖水平的降低可预防、改善或治疗高血糖症。在某些实施方案中，动物体内葡萄糖水平的降低可预防、改善或治疗NAFLD。在某些实施方案中，动物体内葡萄糖水平的降低可预防、改善或治疗糖尿病性血脂异常。在某些实施方案中，葡萄糖水平降低至少5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在某些实施方案中，GCGR具有如以下GENBANK登录号中的任一者所示的人类序列：GENBANK登录No.NM_000160.3(以SEQ ID NO：1并入本文)或GENBANK登录No：NW_926918.1(从核苷酸16865000至16885000截短)(以SEQ ID NO：2并入本文)。在某些实施方案中，GCGR具有以SEQ ID NO：3所示的恒河猴序列。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含其盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施方案中，该组合物包含由17至35个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85中所述的核碱基序列的至少17个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸或其盐以及药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施方案中，该组合物包含由20至25个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85中所述的核碱基序列的至少20个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸或其盐以及药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施方案中，该组合物包含由20个连接的核苷组成并具有包含SEQ IDNO：11、17、31、80或85中所述的核碱基序列的至少20个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸或其盐以及药学上可接受的载体或稀释剂。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含其盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施方案中，该组合物包含由17至35个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：11中所述的核碱基序列的至少17个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸或其盐以及药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施方案中，该组合物包含由17至25个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：16中所述的核碱基序列的至少17个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸或其盐以及药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施方案中，该组合物包含由17个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：16中所述的核碱基序列的至少17个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸或其盐以及药学上可接受的载体或稀释剂。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或组合物包含其盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施方案中，该组合物包含由17至35个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：80中所述的核碱基序列的至少17个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸或其盐以及药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施方案中，该组合物包含由17至25个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：45中所述的核碱基序列的至少17个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸或其盐以及药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施方案中，该组合物包含由17个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：45中所述的核碱基序列的至少17个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸或其盐以及药学上可接受的载体或稀释剂。
某些实施方案提供一种用于治疗具有GCGR相关疾病或病状的动物的方法，其包括：a)鉴定所述具有GCGR相关疾病或病状的动物；以及b)向所述动物施用治疗有效量的化合物，该化合物包含由12至30个连接的核苷组成并具有与SEQ ID NO：1-3中的任一者具有至少90％互补性的核碱基序列的修饰寡核苷酸，如对整个所述修饰寡核苷酸所测量。在某些实施方案中，治疗有效量的施用至动物的化合物可治疗或减少动物体内的GCGR相关疾病或病状，或其症状。在某些实施方案中，GCGR相关疾病或病状是肥胖症。在某些实施方案中，GCGR相关疾病或病状是糖尿病。
某些实施方案提供一种用于治疗具有GCGR相关疾病或病状的动物的方法，其包括：a)鉴定所述具有GCGR相关疾病或病状的动物；以及b)向所述动物施用治疗有效量的化合物，该化合物包含由17个连接的核苷组成并具有与SEQ ID NO：1-3中的任一者具有至少100％互补性的核碱基序列的修饰寡核苷酸，如对整个所述修饰寡核苷酸所测量。在某些实施方案中，治疗有效量的施用至动物的化合物可治疗或减少动物体内的GCGR相关疾病或病状，或其症状。在某些实施方案中，GCGR相关疾病或病状是肥胖症。在某些实施方案中，GCGR相关疾病或病状是糖尿病。
某些实施方案提供治疗、预防或改善代谢疾病的方法。在某些实施方案中，代谢疾病是肥胖症、糖尿病、高血糖症、前驱糖尿病、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、代谢综合征、胰岛素抵抗、糖尿病性血脂异常或高甘油三酯血症或其组合。
某些实施方案提供包括向动物施用如本文所述的化合物的方法。在某些实施方案中，该方法包括向动物施用由17至35个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：11、17、31、80或85中所述的核碱基序列的至少20个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
某些实施方案提供包括向动物施用如本文所述的化合物的方法。在某些实施方案中，该方法包括向动物施用由17至35个连接的核苷组成并具有包含SEQ ID NO：1、17、31、80或85中所述的核碱基序列的至少17个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
某些实施方案提供包括向动物施用如本文所述的化合物的方法。在某些实施方案中，该方法包括向动物施用由17至35个连接的核苷组成并具有包含从SEQ ID NO：11中所述的核碱基序列中选出的核碱基序列的至少17个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
某些实施方案提供包括向动物施用如本文所述的化合物的方法。在某些实施方案中，该方法包括向动物施用由17至35个连接的核苷组成并具有包含从SEQ ID NO：80中所述的核碱基序列中选出的核碱基序列的至少17个连续核碱基的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，动物是人类。
在某些实施方案中，施药可预防、治疗、改善或减缓如本文所述的代谢疾病的进展。
在某些实施方案中，施药可预防、治疗、改善或减缓如本文所述的肥胖症的进展。
在某些实施方案中，施药可预防、治疗、改善或减缓如本文所述的糖尿病的进展。
在某些实施方案中，该化合物与第二剂共同施用。
在某些实施方案中，该化合物与该第二剂是同时施用的。
在某些实施方案中，施用是肠胃外施用。
某些实施方案进一步提供一种降低动物体内的GCGR mRNA或蛋白质表达的方法，其包括向该动物施用如本文所述的化合物或组合物以降低动物体内的GCGR mRNA或蛋白质表达。在某些实施方案中，动物是人类。在某些实施方案中，降低GCGR mRNA或蛋白质表达可预防、治疗、改善或减缓代谢疾病的进展。在某些实施方案中，代谢疾病或病状是糖尿病。在某些实施方案中，代谢疾病或病状是肥胖症。
某些实施方案提供一种用于治疗具有代谢疾病的人类的方法，其包括鉴定具有该疾病的人类并且向该人类施用治疗有效量的如本文所述的化合物或组合物。在某些实施方案中，治疗降低了选自以下的症状：代谢综合征、高血糖症、高甘油三酯血症、高血压、葡萄糖水平增加、胰岛素抵抗增加、胰岛素敏感性降低、超过正常体重、和/或超过正常身体脂肪或其任何组合。
某些实施方案提供一种用于治疗具有肥胖症的人类的方法，其包括鉴定具有该疾病的人类并且向该人类施用治疗有效量的如本文所述的化合物或组合物。在某些实施方案中，治疗降低了选自以下的症状：代谢综合征、高血糖症、高甘油三酯血症、高血压、葡萄糖水平增加、胰岛素抵抗增加、胰岛素敏感性降低、超过正常体重、和/或超过正常身体脂肪或其任何组合。
某些实施方案提供一种用于治疗具有糖尿病的人类的方法，其包括鉴定具有该疾病的人类并且向该人类施用治疗有效量的如本文所述的化合物或组合物。在某些实施方案中，治疗降低了选自以下的症状：代谢综合征、高血糖症、高甘油三酯血症、高血压、葡萄糖水平增加、胰岛素抵抗增加、胰岛素敏感性降低、超过正常体重、和/或超过正常身体脂肪或其任何组合。
进一步提供一种用于降低或预防代谢疾病的方法，其包括向人类施用治疗有效量的如本文所述的化合物或组合物，从而降低或预防代谢疾病。
进一步提供一种用于降低或预防肥胖症的方法，其包括向人类施用治疗有效量的如本文所述的化合物或组合物，从而降低或预防糖尿病。
进一步提供一种用于降低或预防糖尿病的方法，其包括向人类施用治疗有效量的如本文所述的化合物或组合物，从而降低或预防糖尿病。
进一步提供一种用于改善代谢疾病的症状的方法，其包括向有需要的人类施用包含由17至35个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ IDNO：1、2或3特异性杂交，从而改善人类的代谢疾病的症状。
进一步提供一种用于改善糖尿病的症状的方法，其包括向有需要的人类施用包含由17至35个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ IDNO：1、2或3特异性杂交，从而改善人类的糖尿病的症状。
进一步提供一种用于改善代谢疾病的症状的方法，其包括向有需要的人类施用包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ IDNO：1、2或3特异性杂交，从而改善人类的代谢疾病的症状。
进一步提供一种用于改善糖尿病的症状的方法，其包括向有需要的人类施用包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ IDNO：1、2或3特异性杂交，从而改善人类的糖尿病的症状。
进一步提供一种用于改善代谢疾病的症状的方法，其包括向有需要的人类施用包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：1、2或3特异性杂交，从而改善人类的代谢疾病的症状。
进一步提供一种用于改善糖尿病的症状的方法，其包括向有需要的人类施用包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：1、2或3特异性杂交，从而改善人类的糖尿病的症状。
进一步提供一种用于降低与代谢疾病相关的症状的进展速率的方法，其包括向有需要的人类施用包含由17至35个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：1、2或3特异性杂交，从而降低人类的代谢疾病的症状的进展速率。
进一步提供一种用于降低与糖尿病相关的症状的进展速率的方法，其包括向有需要的人类施用包含由17至35个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：1、2或3特异性杂交，从而降低人类的糖尿病的症状的进展速率。
进一步提供一种用于降低与代谢疾病相关的症状的进展速率的方法，其包括向有需要的人类施用包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：1、2或3特异性杂交，从而降低人类的代谢疾病的症状的进展速率。
进一步提供一种用于降低与糖尿病相关的症状的进展速率的方法，其包括向有需要的人类施用包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：1、2或3特异性杂交，从而降低人类的糖尿病的症状的进展速率。
进一步提供一种用于降低与代谢疾病相关的症状的进展速率的方法，其包括向有需要的人类施用包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：1、2或3特异性杂交，从而降低人类的代谢疾病的症状的进展速率。
进一步提供一种用于降低与糖尿病相关的症状的进展速率的方法，其包括向有需要的人类施用包含由17个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：1、2或3特异性杂交，从而降低人类的糖尿病的症状的进展速率。
还提供了用于制备供治疗、预防或改善代谢疾病的药物的方法和化合物。
还提供了用于制备供治疗、预防或改善肥胖症的药物的方法和化合物。
还提供了用于制备供治疗、预防或改善糖尿病的药物的方法和化合物。
还提供了用于制备供治疗、预防或改善代谢综合征的药物的方法和化合物。
某些实施方案提供了如本文所述的化合物用于制造供治疗、改善或预防代谢疾病的药物的用途。
某些实施方案提供了如本文所述的化合物用于制造供治疗、改善或预防肥胖症的药物的用途。
某些实施方案提供了如本文所述的化合物用于制造供治疗、改善或预防糖尿病的药物的用途。
某些实施方案提供了如本文所述的化合物用于制造供治疗、改善或预防代谢综合征的药物的用途。
某些实施方案提供了通过与如本文所述的另一剂或疗法的组合疗法用于治疗、预防或改善如本文所述的代谢疾病的如本文所述的化合物。剂或疗法可以共同施用或同时施用。
某些实施方案提供了通过与如本文所述的另一剂或疗法的组合疗法用于治疗、预防或改善如本文所述的糖尿病的如本文所述的化合物。剂或疗法可以共同施用或同时施用。
某些实施方案提供了如本文所述的化合物用于制造通过与如本文所述的另一剂或疗法的组合疗法来治疗、预防或改善如本文所述的代谢疾病的药物的用途。剂或疗法可以共同施用或同时施用。
某些实施方案提供了如本文所述的化合物用于制造通过与如本文所述的另一剂或疗法的组合疗法来治疗、预防或改善如本文所述的肥胖症的药物的用途。剂或疗法可以共同施用或同时施用。
某些实施方案提供了如本文所述的化合物用于制造通过与如本文所述的另一剂或疗法的组合疗法来治疗、预防或改善如本文所述的糖尿病的药物的用途。剂或疗法可以共同施用或同时施用。
某些实施方案提供了如本文所述的化合物用于制造通过与如本文所述的另一剂或疗法的组合疗法来治疗、预防或改善如本文所述的糖尿病的药物的用途。剂或疗法可以共同施用或同时施用。
某些实施方案提供了如本文所述的化合物用于制造在随后施用如本文所述的另一剂或疗法的患者中治疗、预防或改善如本文所述的代谢疾病的药物的用途。
某些实施方案提供了如本文所述的化合物用于制造在随后施用如本文所述的另一剂或疗法的患者中治疗、预防或改善如本文所述的肥胖症的药物的用途。
某些实施方案提供了如本文所述的化合物用于制造在随后施用如本文所述的另一剂或疗法的患者中治疗、预防或改善如本文所述的糖尿病的药物的用途。
某些实施方案提供了如本文所述的化合物用于制造在随后施用如本文所述的另一剂或疗法的患者中治疗、预防或改善如本文所述的代谢综合征的药物的用途。
某些实施方案提供了一种用于治疗、预防或改善如本文所述的代谢疾病的试剂盒，其中该试剂盒包括：
(i)如本文所述的化合物；以及可选地
(ii)如本文所述的另一剂或疗法。
某些实施方案提供了一种用于治疗、预防或改善如本文所述的肥胖症的试剂盒，其中该试剂盒包括：
(i)如本文所述的化合物；以及可选地
(ii)如本文所述的另一剂或疗法。
某些实施方案提供了一种用于治疗、预防或改善如本文所述的糖尿病的试剂盒，其中该试剂盒包括：
(i)如本文所述的化合物；以及可选地
(ii)如本文所述的另一剂或疗法。
某些实施方案提供了一种用于治疗、预防或改善如本文所述的代谢综合征的试剂盒，其中该试剂盒包括：
(i)如本文所述的化合物；以及可选地
(ii)如本文所述的另一剂或疗法。
如本文所述的试剂盒可进一步包括关于使用该试剂盒通过如本文所述的组合疗法来治疗、预防或改善如本文所述的代谢疾病的说明书。在某些实施方案中，代谢疾病是肥胖症。在某些实施方案中，代谢疾病是糖尿病。
反义化合物
寡聚化合物包括但不限于寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义化合物、反义寡核苷酸以及siRNA。寡聚化合物可能与靶标核酸“反义”，意指能够通过氢键键合与靶标核酸进行杂交。
在某些实施方案中，反义化合物具有如下核碱基序列，当以5′至3′方向书写时，该核碱基序列包含其所靶向的靶标核酸的靶标区段的反向互补序列。在某些此类实施方案中，反义寡核苷酸具有如下核碱基序列，当以5′至3′方向书写时，该核碱基序列包含其所靶向的靶标核酸的靶标区段的反向互补序列。
在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的反义化合物的长度为10至30个核苷酸。换句话说，反义化合物是10至30个连接的核碱基。在其他实施方案中，反义化合物包含由8至80个、10至50个、15至30个、18至21个、20至80个、20至35个、20至30个、20至29个、20至28个、20至27个、20至26个、20至25个、20至24个、20至23个、20至22个、20至21个或20个连接的核碱基组成的修饰寡核苷酸。在某些此类实施方案中，反义化合物包含由长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连接的核碱基或由任意两个上述数值限定的范围组成的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，反义化合物包含缩短或截短的修饰寡核苷酸。该缩短或截短的修饰寡核苷酸可以具有从5′端缺失的单个核苷(5′截短)，或可选地从3′端缺失的单个核苷(3′截短)。缩短或截短的寡核苷酸可具有从5′端缺失的两个核苷，或可选地可具有从3′端缺失的两个亚单元。可选地，缺失的核苷可能分散在整个修饰寡核苷酸内，例如，分散在具有从5′端缺失的一个核苷和从3′端缺失的一个核苷的反义化合物中。
当单个另外的核苷存在于延长的寡核苷酸中时，该另外的核苷可位于该寡核苷酸的5′或3′端。当存在两个或更多个另外的核苷时，添加的核苷可彼此相邻，例如，在具有添加至寡核苷酸的5′端(5′添加)或可选地添加至寡核苷酸的3′端(3′添加)的两个核苷的寡核苷酸中。可选地，添加的核苷可能分散在整个反义化合物内，例如，分散在具有添加至5′端的一个核苷和添加至3′端的一个亚单元的寡核苷酸中。
有可能增大或减小反义化合物(例如反义寡核苷酸)的长度，和/或在不消除活性的情况下引入错配碱基。例如，在Woolf等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7305-7309，1992)中，对一系列长度为13-25个核碱基的反义寡核苷酸测试其在卵母细胞注射模型中诱导靶标RNA的裂解的能力。在接近反义寡核苷酸的末端处具有8或11个错配碱基的长度为25个核碱基的反义寡核苷酸能够引导靶标mRNA的特异性裂解，尽管其程度比不含错配的反义寡核苷酸更小。类似地，使用含13个核碱基的反义寡核苷酸(包括具有1或3个错配的那些)实现了靶标特异性裂解。
Gautschi等人(J.Natl.Cancer Inst.93：463-471，2001年3月)证实了与bcl-2mRNA具有100％互补性以及与bcl-xL mRNA具有3个错配的寡核苷酸在体外和体内降低bcl-2和bcl-xL的表达的能力。此外，这种寡核苷酸显示了有效的体内抗肿瘤活性。
Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16：3341-3358，1988)对一系列含14个串联核碱基的反义寡核苷酸、以及包括两个或三个串联反义寡核苷酸的序列的含28个和42个核碱基的反义寡核苷酸分别测试了其在兔网织红细胞测定法中阻止人类DHFR的翻译的能力。三种含14个核碱基的反义寡核苷酸各自单独能够抑制翻译，但比含28或42个核碱基的反义寡核苷酸的抑制水平较小。
反义化合物基序
在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的反义化合物具有以模式或基序排列的化学上修饰的亚单元，以赋予所述反义化合物诸如增强的抑制活性、增加的对靶标核酸的结合亲和力或对体内核酸酶降解的抗性等特性。
嵌合反义化合物典型地含有至少一个被修饰的区域以赋予增加的核酸酶降解抗性、增加的细胞摄取、增加的对靶标核酸的结合亲和力和/或增加的抑制活性。嵌合反义化合物的第二区域可任选地充当细胞核酸内切酶RNA酶H的底物，该细胞核酸内切酶使RNA：DNA双链体的RNA链裂解。
具有缺口聚体基序的反义化合物被视为嵌合反义化合物。在缺口聚体中，支持RNA酶H裂解的具有多个核苷酸的内部区域定位于具有与该内部区域的核苷化学上相异的多个核苷酸的外部区域之间。在具有缺口聚体基序的反义寡核苷酸的情况下，缺口区段一般充当核酸内切酶裂解的底物，而侧翼区段包含修饰的核苷。在某些实施方案中，通过包含各相异区域的糖部分的类型来区分缺口聚体的区域。用于区分缺口聚体的区域的糖部分的类型在一些实施方案中可包括β-D-核糖核苷、β-D-脱氧核糖核苷、2′-修饰核苷(此类2′-修饰核苷可尤其包括2′-MOE和2′-O-CH3)，以及双环糖修饰的核苷(此类双环糖修饰的核苷可包括具有受限乙基的那些)。在某些实施方案中，侧翼可包括若干修饰的糖部分，包括例如2′-MOE和受限乙基。在某些实施方案中，侧翼可包括若干修饰的和未修饰的糖部分。在某些实施方案中，侧翼可包括2′-MOE核苷、受限乙基核苷和2′-脱氧核苷的不同的组合。
各相异区域可包含一致的糖部分、变异或交替的糖部分。侧翼-缺口-例翼基序往往被描述为“X-Y-Z”，其中“X”表示5′侧翼的长度，“Y”表示缺口的长度，以及“Z”表示3′侧翼的长度。“X”和“Z”可包含一致、变异或交替的糖部分。在某些实施方案中，“X”和“Y”可包括一个或多个2′-脱氧核苷。“Y”可包含2′-脱氧核苷。如本文所用，被描述为“X-Y-Z”的缺口聚体具有使得缺口与5′侧翼和3′侧翼各自直接相邻定位的构型。因此，5′侧翼与缺口或缺口与3′侧翼之间直接不存在插入的核苷酸。任何本文所述的反义化合物都可以具有缺口聚体基序。在某些实施方案中，“X”与“Z”相同，在其他实施方案中它们不同。在某些实施方案中，“Y”是8至15个核苷。X、Y或Z可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30个或更多个核苷中的任一者。
在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的反义化合物具有3-10-4缺口聚体基序。
在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的反义化合物具有5-10-5缺口聚体基序。
在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的反义化合物具有5-10-6缺口聚体基序。
在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的反义化合物具有3-10-3缺口聚体基序。
在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的反义化合物具有4-10-4缺口聚体基序。
在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的反义化合物具有4-10-5缺口聚体基序。
靶标核酸、靶标区域以及核苷酸序列
在某些实施方案中，GCGR核酸是以GENBANK登录No.NM_000160.3(以SEQ ID NO：1并入本文)、GENBANK登录No：NW_926918.1(从核苷酸16865000至16885000截短)(以SEQ IDNO：2并入本文)所示的序列中的任一者；以及如SEQ ID NO：3所示的恒河猴序列。
应理解，本文所含实施例中的各SEQ ID NO所示的序列与对糖部分、核苷间键联或核碱基的任何修饰无关。因此，由SEQ ID NO定义的反义化合物可独立地包含对糖部分、核苷间键联或核碱基的一个或多个修饰。由Isis编号(Isis No)描述的反义化合物指示核碱基序列与基序的组合。
在某些实施方案中，靶标区域是靶标核酸的结构上限定的区域。例如，靶标区域可涵盖3′UTR、5′UTR、外显子、内含子、外显子/内含子接合处、编码区域、翻译起始区域、翻译终止区域或其他限定的核酸区域。可以通过来自序列数据库如NCBI的登录号获得GCGR的结构上限定的区域并且此种信息以引用的方式并入本文中。在某些实施方案中，靶标区域可涵盖从靶标区域内的一个靶标区段的5′靶标位点至同一靶标区域内的另一个靶标区段的3′靶标位点的序列。
靶向包括测定与反义化合物杂交的至少一个靶标区段，以使得所需作用发生。在某些实施方案中，所需作用是mRNA靶标核酸水平降低。在某些实施方案中，所需作用是由靶标核酸编码的蛋白质水平降低或与靶标核酸相关的表型改变。
靶标区域可包含一个或多个靶标区段。靶标区域内的多个靶标区段可能重叠。可选地，它们可能不重叠。在某些实施方案中，靶标区域内的靶标区段缺口不超过约300个核苷酸。在某些实施方案中，靶标区域内的靶标区段在靶标核酸上间隔多个核苷酸，其为、为约、为不超过、为不超过约250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个核苷酸，或为由任意两个前述数值限定的范围。在某些实施方案中，靶标区域内的靶标区段在靶标核酸上间隔不超过或不超过约5个核苷酸。在某些实施方案中，靶标区段是连续的。考虑了由具有本文列出的5′靶标位点或3′靶标位点中的任一者的起始核酸的范围所限定的靶标区域。
合适的靶标区段可存在于5′UTR、编码区域、3′UTR、内含子、外显子或外显子/内含子接合处内。含有起始密码子或终止密码子的靶标区段也是合适的靶标区段。合适的靶标区段可特异性排除某些结构上限定的区域如起始密码子或终止密码子。
合适的靶标区段的测定可包括靶标核酸的序列与基因组内其他序列的比较。例如，可使用BLAST算法来鉴定不同核酸之间的相似性区域。这种比较可防止选择可以非特异性方式与除选定靶标核酸以外的序列(即非靶标或脱靶序列)杂交的反义化合物序列。
活性靶标区域内的反义化合物的活性(例如，如由靶标核酸水平降低百分比所定义)可能存在变化。在某些实施方案中，GCGR mRNA水平的降低指示GCGR表达的抑制。GCGR蛋白水平的降低也指示靶标mRNA表达的抑制。此外，表型改变指示GCGR表达的抑制。在某些实施方案中，降低的葡萄糖水平、降低的脂质水平以及降低的体重可能指示GCGR表达的抑制。在某些实施方案中，与代谢疾病相关的症状的改善可能指示GCGR表达的抑制。在某些实施方案中，与糖尿病相关的症状的改善可能指示GCGR表达的抑制。在某些实施方案中，胰岛素抵抗的降低指示GCGR表达的抑制。在某些实施方案中，糖尿病生物标志物的减少可能指示GCGR表达的抑制。
杂交
在一些实施方案中，在本文公开的反义化合物与GCGR核酸之间发生杂交。最常见的杂交机制包括核酸分子的互补核碱基之间的氢键键合(例如，Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键键合)。
杂交可在不同条件下发生。严格条件与序列有关并且由有待杂交的核酸分子的性质和组成决定。
测定序列是否可与靶标核酸特异性杂交的方法是本领域中众所周知的。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物可与GCGR核酸特异性杂交。
互补性
当反义化合物的足够数目的核碱基可以与靶标核酸的相应核碱基氢键键合以使得所需作用将发生(例如，靶标核酸如GCGR核酸的反义抑制)时，该反义化合物与该靶标核酸彼此互补。
反义化合物可在GCGR核酸的一个或多个区段上杂交以使得插入或相邻的区段不牵涉于杂交事件中(例如，环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与GCGR核酸、靶标区域、靶标区段或其指定部分具有或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补性。可以使用常规方法来确定反义化合物与靶标核酸的互补性百分比。
例如，反义化合物的20个核碱基中的18个与靶标区域互补并且因此会特异性杂交的反义化合物将表示90％互补性。在这个例子中，剩余的非互补性核碱基可能丛集或散布于互补性核碱基中并且无需彼此连续或与互补性核碱基连续。因此，具有由两个与靶标核酸具完全互补性的区域侧接的4个非互补性核碱基的18个核碱基长度的反义化合物具有与靶标核酸的77.8％总体互补性并且因此将落入本发明的范围内。可以常规地使用本领域中已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序(Altschul等人，J.Mol.Biol.，1990，215，403 410；Zhang和Madden，Genome Res.，1997，7，649 656)来确定反义化合物与靶标核酸的一个区域的互补性百分比。可以利用例如Gap程序(威斯康辛序列分析软件包，第8版用于Unix，威斯康辛州麦迪逊市大学研究园区遗传学计算机团体(Genetics Computer Group，University Research Park，Madison Wis.))使用默认设置来确定同源性、序列同一性或互补性百分比，该程序使用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.，1981，2，482 489)。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与靶标核酸或其指定部分完全互补(即100％互补)。例如，反义化合物可与GCGR核酸或靶标区域或靶标区段或其靶标序列完全互补。如本文所用，“完全互补”意指反义化合物的每一核碱基能够与靶标核酸的相应核碱基进行精确碱基配对。例如，含20个核碱基的反义化合物与400个核碱基长度的靶标序列完全互补，只要该靶标核酸的相应含20个核碱基的部分与该反义化合物完全互补即可。关于第一核酸和/或第二核酸的指定部分也可以使用完全互补。例如，30个核碱基长度的反义化合物的含20个核碱基的部分可以与400个核碱基长度的靶标序列“完全互补”。如果靶标序列具有相应的含20个核碱基的部分，其中每一核碱基与反义化合物的含20个核碱基的部分互补，则30个核碱基长度的寡核苷酸的含20个核碱基的部分与该靶标序列完全互补。同时，取决于反义化合物的剩余10个核碱基是否也与靶标序列互补，整个30个核碱基长度的反义化合物可能或可能不与该靶标序列完全互补。
非互补性核碱基的位置可能在反义化合物的5′端或3′端。可选地，所述一个或多个非互补性核碱基可能在反义化合物的内部位置。当存在两个或更多个非互补性核碱基时，它们可能是连续的(即连接的)或不连续的。在一个实施方案中，非互补性核碱基位于缺口聚体反义寡核苷酸的侧翼区段中。
在某些实施方案中，相对于靶标核酸如GCGR核酸或其指定部分，长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20个核碱基或为至多12、13、14、15、16、17、18、19或20个核碱基的反义化合物包含不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个非互补性核碱基。
在某些实施方案中，相对于靶标核酸如GCGR核酸或其指定部分，长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核碱基或为至多12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核碱基的反义化合物包含不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个非互补性核碱基。
本文提供的反义化合物还包括与靶标核酸的部分互补的那些。如本文所用，“部分”是指靶标核酸的区域或区段内指定数目的连续的(即连接的)核碱基。“部分”还可以是指反义化合物的指定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，反义化合物与靶标区段的至少一个含8个核酸碱基互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶标区段的至少一个含12个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶标区段的至少一个含13个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶标区段的至少一个含14个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶标区段的至少一个含15个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶标区段的至少一个含16个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶标区段的至少一个含17个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶标区段的至少一个含18个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶标区段的至少一个含19个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶标区段的至少一个含20个核碱基的部分互补。还考虑了与靶标区段的至少一个含9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核碱基的部分或由任意两个这些数值限定的范围互补的反义化合物。
同一性
本文提供的反义化合物还可以与特定核苷酸序列、SEQ ID NO或由具体Isis编号表示的化合物或其部分具有指定的同一性百分比。如本文所用，如果反义化合物具有相同的核碱基配对能力，则该反义化合物与本文公开的序列相同。例如，由于尿嘧啶与胸腺嘧啶都与腺嘌呤配对，因此在公开的DNA序列中含有尿嘧啶替代胸腺嘧啶的RNA会被视为与该DNA序列相同。也考虑了本文所述的缩短和延长形式的反义化合物以及相对于本文提供的反义化合物具有非同一性碱基的化合物。所述非同一性碱基可能彼此相邻或分散在整个反义化合物内。根据相对于反义化合物所比较的序列具有相同的碱基配对的碱基数目来计算反义化合物的同一性百分比。
在某些实施方案中，反义化合物或其部分与本文公开的一个或多个反义化合物或SEQ ID NO或其部分具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
修饰
核苷是碱基-糖组合。核苷的核碱基(也称为碱基)部分通常为杂环碱基部分。核苷酸是进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸酯基的核苷。对于包括戊呋喃糖基糖的那些核苷，磷酸酯基可以连接至糖的2′、3′或5′羟基部分。通过相邻核苷彼此的共价键联以形成线性的聚合寡核苷酸来形成寡核苷酸。在寡核苷酸结构内，磷酸酯基通常被称为形成寡核苷酸的核苷间键联。
对反义化合物的修饰涵盖对核苷间键联、糖部分或核碱基的取代或改变。被修饰的反义化合物由于所需的特性如例如增强的细胞摄取、增强的对核酸靶标的亲和力、在核酸酶存在下增加的稳定性、或增加的抑制活性而通常优于天然形式。
化学上修饰的核苷也可用于增加缩短或截短的反义寡核苷酸对于其靶标核酸的结合亲和力。因此，通常可以用具有此类化学上修饰的核苷的较短反义化合物来获得类似的结果。
修饰的核苷间键联
RNA和DNA的天然存在的核苷间键联是3′至5′磷酸二酯键联。通常选择具有一个或多个修饰的、即非天然存在的核苷间键联的反义化合物，其由于所需的特性如例如增强的细胞摄取、增强的对靶标核酸的亲和力以及在核酸酶存在下增加的稳定性而优于具有天然存在的核苷间键联的反义化合物。
具有修饰的核苷间键联的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键联以及不具有磷原子的核苷间键联。代表性含磷核苷间键联包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯以及硫代磷酸酯。众所周知含磷键联和不含磷键联的制备方法。
在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，反义化合物的每一核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
修饰的糖部分
本文提供的反义化合物可以任选地包含一个或多个其中糖基已被修饰的核苷。此类糖修饰的核苷可赋予反义化合物增强的核酸酶稳定性、增加的结合亲和力或一些其他有益的生物特性。在某些实施方案中，核苷包含化学上修饰的核糖呋喃糖环部分。化学上修饰的核糖呋喃糖环的例子包括但不限于取代基(包括5′和2′取代基)的添加；非成对环原子桥联形成双环核酸(BNA)；用S、N(R)或C(R1)(R)2(R＝H、C1-C12烷基或保护基)置换核糖基环氧原子；以及其组合。化学上修饰的糖的例子包括2′-F-5′-甲基取代的核苷(对于其他公开的5′，2′-双取代核苷，参见8/21/08公开的PCT国际申请WO2008/101157)、在2′位置用具有进一步取代的S置换核糖基环氧原子(参见2005年6月16日公开的已公开美国专利申请US2005/0130923)、或可选地BNA的5′取代(参见11/22/07公开的PCT国际申请WO 2007/134181，其中LNA被例如5′-甲基或5′-乙烯基取代)。
具有修饰的糖部分的核苷的例子包括但不限于包含5′-乙烯基、5′-甲基(R或S)、4′-S、2′-F、2′-OCH3以及2′-O(CH2)2OCH3取代基的核苷。2′位置的取代基还可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)以及O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中各Rm和Rn独立地是H或被取代或未被取代的C1-C10烷基。
如本文所用，“双环核苷”是指包含双环糖部分的修饰的核苷。双环核苷的例子包括但不限于包含4′核糖基环原子与2′核糖基环原子之间的桥联的核苷。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物包括一个或多个双环核苷，其中桥联包含4′至2′双环核苷。此类4′至2′双环核苷的例子包括但不限于下式之一：4′-(CH2)-O-2′(LNA)；4′-(CH2)-S-2′；4′-(CH2)2-O-2′(ENA)；4′-CH(CH3)-O-2′和4′-CH(CH2OCH3)-O-2′以及其类似物(参见2008年7月15日颁布的美国专利7,399,845)；4′-C(CH3)(CH3)-O-2′和其类似物(参见2009年1月8日公开的已公开PCT国际申请WO2009/006478)；4′-CH2-N(OCH3)-2′和其类似物(参见2008年12月11日公开的已公开PCT国际申请WO2008/150729)；4′-CH2-O-N(CH3)-2′(参见2004年9月2日公开的已公开美国专利申请US2004/0171570)；4′-CH2-N(R)-O-2′，其中R为H、C1-C12烷基或保护基(参见2008年9月23日颁布的美国专利7,427,672)；4′-CH2-C(H)(CH3)-2′(参见Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.，2009，74，118-134)；以及4′-CH2-C(＝CH2)-2′和其类似物(参见2008年12月8日公开的已公开PCT国际申请WO 2008/154401)。还参见例如：Singh等人，Chem.Commun.，1998，4，455-456；Koshkin等人，Tetrahedron，1998，54，3607-3630；Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，5633-5638；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219-2222；Singh等人，J.Org.Chem.，1998，63，10035-10039；Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc.，129(26)8362-8379(2007年7月4日)；Elayadi等人，Curr.Opinion Invens.Drugs，2001，2，558-561；Braasch等人，Chem.Biol.，2001，8，1-7；Orum等人，Curr.Opinion Mol.Ther.，2001，3，239-243；美国专利No U.S.6,670,461、7,053,207、6,268,490、6,770,748、6,794,499、7,034,133、6,525,191、7,399,845；已公开PCT国际申请WO 2004/106356、WO 94/14226、WO 2005/021570和WO 2007/134181；美国专利公开No.US2004/0171570、US2007/0287831和US2008/0039618；和美国专利序列No.12/129,154、60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787和61/099,844；以及PCT国际申请No.PCT/US2008/064591、PCT/US2008/066154和PCT/US2008/068922。可以制备前述双环核苷各具有一个或多个立体化学糖构型，包括例如α-L-核糖呋喃糖和β-D-核糖呋喃糖(参见PCT国际申请PCT/DK98/00393，于1999年3月25日公开为WO99/14226)。
在某些实施方案中，BNA核苷的双环糖部分包括但不限于在戊呋喃糖基糖部分的4′位置与2′位置之间具有至少一个桥联的化合物，其中此类桥联独立地包含1个或2至4个独立地选自-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-以及-N(Ra)-的连接基团；
其中：
x为0、1或2；
n为1、2、3或4；
各Ra和Rb独立地为H、保护基、羟基、C1-C12烷基、被取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、被取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、被取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、被取代的C5-C20芳基、杂环基、被取代的杂环基、杂芳基、被取代的杂芳基、C5-C7脂环基、被取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、被取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或硫氧基(S(＝O)-J1)；以及
各J1和J2独立地为H、C1-C12烷基、被取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、被取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、被取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、被取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、被取代的酰基、杂环基、被取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、被取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
在某些实施方案中，双环糖部分的桥联是-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或-C(RaRb)-O-N(R)-。在某些实施方案中，桥联是4′-CH2-2′、4′-(CH2)2-2′、4′-(CH2)3-2′、4′-CH2-O-2′、4′-(CH2)2-O-2′、4′-CH2-O-N(R)-2′以及4′-CH2-N(R)-O-2′-，其中各R独立地为H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，双环核苷由异构体构型进一步定义。例如，包含4′-2′亚甲基-氧基桥联的核苷可能为α-L构型或β-D构型。先前已经将α-L-亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)BNA并入显示反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等人，Nucleic Acids Research，2003，21，6365-6372)。
在某些实施方案中，双环核苷包括但不限于如下文所述的(A)α-L-亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)BNA、(B)β-D-亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)BNA、(C)亚乙基氧基(4′-(CH2)2-O-2′)BNA、(D)氨基氧基(4′-CH2-O-N(R)-2′)BNA、(E)氧基氨基(4′-CH2-N(R)-O-2′)BNA、(F)甲基(亚甲基氧基)(4′-CH(CH3)-O-2′)BNA、(G)亚甲基-硫代基(4′-CH2-S-2′)BNA、(H)亚甲基-氨基(4′-CH2-N(R)-2′)BNA、(I)甲基碳环(4′-CH2-CH(CH3)-2′)BNA以及(J)亚丙基碳环(4′-(CH2)3-2′)BNA。
其中Bx为碱基部分并且R独立地为H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，双环核苷具有式I：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
-Qa-Qb-Qc-为-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-或-N(Rc)-O-CH2；
Rc为C1-C12烷基或氨基保护基；以及
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接。
在某些实施方案中，双环核苷具有式II：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Za为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、被取代的C1-C6烷基、被取代的C2-C6烯基、被取代的C2-C6炔基、酰基、被取代的酰基、被取代的酰胺、硫醇或被取代的硫代基。
在一个实施方案中，被取代的基团各自独立地为被独立地选自卤素、氧代基、羟基、OJc、NJcJd、SJc、N3、OC(＝X)Jc以及NJeC(＝X)NJcJd的取代基单取代或多取代，其中各Jc、Jd和Je独立地为H、C1-C6烷基或被取代的C1-C6烷基并且X为O或NJc。
在某些实施方案中，双环核苷具有式III：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Zb为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、被取代的C1-C6烷基、被取代的C2-C6烯基、被取代的C2-C6炔基或被取代的酰基(C(＝O)-)。
在某些实施方案中，双环核苷具有式IV：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Rd为C1-C6烷基、被取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、被取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或被取代的C2-C6炔基；
各qa、qb、qc和qd独立地为H、卤素、C1-C6烷基、被取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、被取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或被取代的C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、被取代的C1-C6烷氧基、酰基、被取代的酰基、C1-C6氨基烷基或被取代的C1-C6氨基烷基；
在某些实施方案中，双环核苷具有式V：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
qa、qb、qe和qf各自独立地为氢、卤素、C1-C12烷基、被取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、被取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、被取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、被取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；
或qe与qf一起为＝C(qg)(qh)；
qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或被取代的C1-C12烷基。
已描述了亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)BNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备以及其寡聚和核酸识别特性(参见例如Koshkin等人，Tetrahedron，1998，54，3607-3630)。BNA和其制备也描述于WO 98/39352和WO 99/14226中。
也已制备了亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)BNA、亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)BNA和2′-硫代-BNA的类似物(参见例如Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219-2222)。此外已描述了包含寡脱氧核糖核苷酸双链体作为核酸聚合酶底物的锁定核苷类似物的制备(参见例如Wengel等人，WO 99/14226)。此外，本领域中已描述了2′-氨基-BNA(一种新颖的构象受限的高亲和力寡核苷酸类似物)的合成(参见例如Singh等人，J.Org.Chem.，1998，63，10035-10039)。另外，已制备了2′-氨基-BNA和2′-甲基氨基-BNA并且先前已报道了其具有互补性RNA和DNA链的双链体的热稳定性。
在某些实施方案中，双环核苷具有式VI：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
各qi、qj、qk和ql独立地为H、卤素、C1-C12烷基、被取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、被取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、被取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、被取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk，或N(H)C(＝S)NJjJk；以及
qi和qj或ql和qk一起为＝C(qg)(qh)，其中qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或被取代的C1-C12烷基。
已描述了一个具有4′-(CH2)3-2′桥联和烯基类似物、桥联4′-CH＝CH-CH2-2′的碳环双环核苷(参见例如Freier等人，Nucleic Acids Research，1997，25(22)，4429-4443；以及Albaek等人，J.Org.Chem.，2006，71，7731-7740)。也已描述了碳环双环核苷的合成和制备以及其寡聚和生物化学研究(参见例如Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc.2007，129(26)，8362-8379)。
如本文所用，“4′-2′双环核苷”或“4′至2′双环核苷”是指包含包括连接2′碳原子和4′碳原子的桥联的呋喃糖环的双环核苷。
如本文所用，“单环核苷”是指包含不为双环糖部分的修饰糖部分的核苷。在某些实施方案中，核苷的糖部分或糖部分类似物可在任意位置被修饰或取代。
如本文所用，“2′-修饰糖”意指在2′位置被修饰的呋喃糖基糖。在某些实施方案中，此类修饰包括选自以下的取代基：卤离子、包括但不限于被取代和未被取代的烷氧基、被取代和未被取代的硫基烷基、被取代和未被取代的氨基烷基、被取代和未被取代的烷基、被取代和未被取代的烯丙基、以及被取代和未被取代的炔基。在某些实施方案中，2′修饰是选自包括但不限于以下的取代基：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3以及O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m是1至约10。其他2′-取代基也可以选自：C1-C12烷基；被取代的烷基；烯基；炔基；烷芳基；芳烷基；O-烷芳基或O-芳烷基；SH；SCH3；OCN；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；被取代的硅烷基；RNA裂解基团；信息基团；插入物；用于改进药物动力学特性的基团；以及用于改进反义化合物的药效学特性的基团，和其他具有类似特性的取代基。在某些实施方案中，修饰的核苷包含2′-MOE侧链(参见例如Baker等人，J.Biol.Chem.，1997，272，11944-12000)。这种2′-MOE取代已经被描述为相比于未被修饰的核苷和其他修饰的核苷如2′-O-甲基、O-丙基和O-氨基丙基具有改进的结合亲和力。具有2′-MOE取代基的寡核苷酸还已显示为具有用于体内使用的有前景的特征的基因表达的反义抑制剂(参见例如Martin，P.，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504；Altmann等人，Chimia，1996，50，168-176；Altmann等人，Biochem.Soc.Trans.，1996，24，630-637；以及Altmann等人，Nucleosides Nucleotides，1997，16，917-926)。
如本文所用，“修饰的四氢吡喃核苷”或“修饰的THP核苷”意指正常核苷中的六元四氢吡喃“糖”被取代为戊呋喃糖基残基的核苷(糖替代品)。修饰的THP核苷包括但不限于在本领域中被称为己糖醇核酸(HNA)、阿尼糖醇核酸(ANA)、甘露糖醇核酸(MNA)(参见Leumann，CJ.Bioorg.& Med.Chem.(2002)10：841-854)、氟HNA(F-HNA)者，或具有式X的那些化合物：
式X：
其中式X的所述至少一种四氢吡喃核苷类似物各自独立地：
Bx为杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地为连接四氢吡喃核苷类似物与反义化合物的核苷间连接基团或T3和T4中的一者为连接四氢吡喃核苷类似物与反义化合物的核苷间连接基团并且T3和T4中的另一者为H、羟基保护基、连接的缀合物基团、或5′或3′端基；
q1、q2、q3、q4、q5、q6以及q7各自独立地为H、C1-C6烷基、被取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、被取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或被取代的C2-C6炔基；以及
R1和R2中之一者为氢并且另一者是选自卤素、被取代或未被取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2以及CN，其中X为O、S或NJ1，并且各J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，提供式X的修饰的THP核苷，其中qm、qn、qp、qr、qs、qt以及qu各自为H。在某些实施方案中，qm、qn、qp、qr、qs、qt以及qu中的至少一者不为H。在某些实施方案中，qm、qn、qp、qr、qs、qt以及qu中的至少一者为甲基。在某些实施方案中，提供式X的THP核苷，其中R1和R2中的一者为F。在某些实施方案中，R1为氟并且R2为H，R1为甲氧基并且R2为H，以及R1为甲氧基乙氧基并且R2为H。
如本文所用，“2′-修饰”或“2′-取代”是指包含在2′位置包括不为H或OH的取代基的糖的核苷。2′修饰核苷包括但不限于其中连接糖环的两个碳原子的桥联连接糖环的2′碳和另一个碳的双环核苷，以及具有非桥联2′取代基的核苷，例如烯丙基、氨基、叠氮基、硫代基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2′-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中各Rm和Rn独立地为H或者被取代或未被取代的C1-C10烷基。2′修饰核苷可进一步包含其他修饰，例如，在糖的其他位置和/或在核碱基处。
如本文所用，“2′-F”是指在2′位置包含氟基的糖。
如本文所用，“2′-OMe”或“2′-OCH3”或“2′-O-甲基”各指在糖环的2′位置包含-OCH3基团的糖。
如本文所用，“寡核苷酸”是指包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方案中，多个核苷中的一个或多个被修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。
本领域中还已知许多其他双环和三环糖替代品环系统，其可用于修饰核苷以并入反义化合物中(参见例如综述文章：Leumann，J.C，Bioorganic & Medicinal Chemistry，2002，10，841-854)。
此类环系统可以经受各种另外的取代以增强活性。
本领域技术人员众所周知用于制备修饰糖的方法。
在具有修饰的糖部分的核苷酸中，保持核碱基部分(天然、修饰或其组合)用于与适当的核酸靶标杂交。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的糖部分是2′-MOE。在某些实施方案中，2′-MOE修饰的核苷酸是以缺口聚体基序排列。在某些实施方案中，修饰的糖部分是cEt。在某些实施方案中，cEt修饰的核苷酸排列在整个缺口聚体基序的侧翼内。
修饰的核碱基
核碱基(或碱基)修饰或取代与天然存在或合成的未修饰的核碱基在结构上可区分、但在功能上可互换。天然和修饰的核碱基都能够参与氢键键合。此类核碱基修饰可赋予反义化合物以核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益的生物特性。修饰的核碱基包括合成和天然的核碱基，例如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)。某些核碱基取代(包括5-甲基胞嘧啶取代)尤其可用于增加反义化合物对于靶标核酸的结合亲和力。例如，5-甲基胞嘧啶取代已显示使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，第276-278页)。
另外的未修饰的核碱基包括5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤基尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基尤其是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
杂环碱基部分还可包括嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环置换的那些，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。尤其可用于增加反义化合物的结合亲和力的核碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的缺口加宽的反义寡核苷酸包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每一胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
用于配制药物组合物的组合物和方法
反义寡核苷酸可与药学上可接受的活性或惰性物质混合用于制备药物组合物或配制物。用于配制药物组合物的组合物和方法取决于多个标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或有待施用的剂量。
可以通过将反义化合物与合适的药学上可接受的稀释剂或载体组合而将靶向GCGR核酸的反义化合物用于药物组合物中。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS是适用于待肠胃外递送的组合物中的稀释剂。因此，在一个实施方案中，本文所述的方法中使用包含靶向GCGR核酸的反义化合物和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施方案中，药学上可接受的稀释剂是PBS。在某些实施方案中，反义化合物是反义寡核苷酸。
包含反义化合物的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯、或此类酯的盐、或任何其他寡核苷酸，其在施用至动物(包括人类)时能够提供(直接或间接)生物活性代谢物或其残余物。因此，例如，本公开涉及反义化合物的药学上可接受的盐、前药、此类前药的药学上可接受的盐以及其他生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。
可利用本领域中众所周知的方法来制备本文所述化合物的药学上可接受的盐。关于药学上可接受的盐的综述，参见Stahl和Wermuth，Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties.Selection and Use(Wiley-VCH，Weinheim，Germany，2002)。反义寡核苷酸的钠盐是有用的并且被公认用于治疗性施用至人类。因此，在一个实施方案中，本文所述的化合物呈钠盐形式。
前药可以包括在反义化合物的一端或两端并入另外的核苷，其可在体内被内源性核酸酶裂解，以形成活性反义化合物。
缀合的反义化合物
可将反义化合物与一个或多个部分或缀合物共价连接，其增强所得反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。典型的缀合物基团包括胆固醇部分和脂质部分。另外的缀合物基团包括碳水化合物、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸盐、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素以及染料。
反义化合物还可以被修饰以具有一般连接至反义化合物的一个或两个末端以增强例如核酸酶稳定性等特性的一个或多个稳定化基团。稳定化基团包括帽部分。这些末端修饰保护具有末端核酸的反义化合物免于核酸外切酶降解，并且可以有助于在细胞内递送和/或定位。封盖可以存在于5′端(5′封盖)、或3′端(3′封盖)，或可以存在于两端。本领域中众所周知帽部分并且包括例如反向脱氧无碱基封盖。可以用于封盖反义化合物的一端或两端以赋予核酸酶稳定性的其他3′和5′稳定化基团包括2003年1月16日公开的WO 03/004602中所公开的那些。
细胞培养和反义化合物处理
可以在多种细胞类型中体外测试反义化合物对GCGR核酸的水平、活性或表达的影响。用于此类分析的细胞类型可获自商业供应商(例如弗吉尼亚州马纳萨斯的美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，Manassus，VA)；北卡罗来纳州三角研究园的Zen-Bio公司(Zen-Bio，Inc.，Research Triangle Park，NC)；马里兰州沃克斯维尔的Clonetics公司(Clonetics Corporation，Walkersville，MD))并且根据供应商的说明书使用可商购获得的试剂(例如加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰生命技术公司(InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA))培养细胞。说明性细胞类型包括但不限于HepG2细胞和原代肝细胞。
反义寡核苷酸的体外测试
本文描述了用反义寡核苷酸处理细胞的方法，这些方法可以被适当修改从而用其他反义化合物来处理。
一般来说，当细胞在培养物中达到约60-80％汇合时，用反义寡核苷酸处理细胞。
通常用于将反义寡核苷酸引入培养细胞的一种试剂包括阳离子脂质转染试剂(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))。将反义寡核苷酸与混合于1(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)中以达到反义寡核苷酸的所需最终浓度以及典型地每100nM反义寡核苷酸对应2至12ug/mL范围的浓度。
用于将反义寡核苷酸引入培养细胞的另一种试剂包括(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)。将反义寡核苷酸与混合于1减血清培养基(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)中以达到反义寡核苷酸的所需浓度以及典型地每100nM反义寡核苷酸对应2至12ug/mL范围的浓度。
用于将反义寡核苷酸引入培养细胞的另一种试剂包括(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)。将反义寡核苷酸与混合于1减血清培养基(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)中以达到反义寡核苷酸的所需浓度以及典型地每100nM反义寡核苷酸对应2至12ug/mL范围的浓度。
用于将反义寡核苷酸引入培养细胞的另一种技术包括电穿孔。
利用常规方法用反义寡核苷酸处理细胞。典型地在反义寡核苷酸处理后16-24小时收集细胞，此时利用本领域中已知并且本文描述的方法测量靶标核酸的RNA或蛋白水平。一般来说，当以多份重复进行处理时，以重复处理的平均值呈现数据。
所用的反义寡核苷酸的浓度在不同细胞系之间有所变化。针对特定细胞系确定最佳反义寡核苷酸浓度的方法是本领域中众所周知的。当用Lipofectin或Cytofectin转染时，典型地以1nM至300nM的浓度使用反义寡核苷酸。当使用电穿孔转染时，以625至20,000nM的更高浓度使用反义寡核苷酸。
RNA分离
可对总细胞RNA或poly(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法是本领域中众所周知的。使用本领域中众所周知的方法制备RNA，例如，根据制造商推荐的方案使用试剂(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)。
对靶标水平或表达的抑制的分析
GCGR核酸的水平或表达的抑制可以用本领域已知的多种方法来测定。例如，可以用例如Northen印迹分析、竞争性聚合酶链反应(PCR)或定量实时PCR来定量靶标核酸水平。可对总细胞RNA或poly(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法是本领域中众所周知的。Northen印迹分析也是本领域的常规方法。可以使用获自加利福尼亚州福斯特城的PE应用生物系统公司(PE-Applied Biosystems，Foster City，CA)并根据制造商的说明书使用的可商购获得的ABI7600、7700或7900序列检测系统方便地实现定量实时PCR。
靶标RNA水平的定量实时PCR分析
可以根据制造商的说明书使用ABI7600、7700或7900序列检测系统(加利福尼亚州福斯特城的PE应用生物系统公司)利用定量实时PCR来实现靶标RNA水平的定量。定量实时PCR的方法是本领域中众所周知的。
在实时PCR之前，使分离的RNA进行逆转录酶(RT)反应，其产生随后被用作实时PCR扩增的底物的互补DNA(cDNA)。RT和实时PCR反应在同样的样本孔中依序进行。RT和实时PCR试剂是从英杰公司(加利福尼亚州卡尔斯巴德)获得。利用本领域技术人员众所周知的方法来进行RT、实时PCR反应。
使用如亲环素A等表达恒定的基因的表达水平或通过使用(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)对总RNA的定量将由实时PCR获得的基因(或RNA)靶标量标准化。利用实时PCR，通过与靶标同时或多通路或分别地操作来定量亲环素A表达。使用RNA定量试剂(俄勒冈州尤金的英威杰公司(Invetrogen，Inc.Eugene，OR))定量总RNA。利用定量RNA的方法教示于Jones，L.J.等人(AnalyticalBiochemistry，1998，265，368-374)中。使用4000仪器(PE应用生物系统公司)来测量荧光。
设计与GCGR核酸杂交的探针和引物。用于设计实时PCR探针和引物的方法是本领域中众所周知的，并且可包括如PRIMER软件(加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司)等软件的使用。
蛋白水平的分析
可以通过测量GCGR蛋白水平来评估GCGR核酸的反义抑制。GCGR的蛋白水平可以用本领域中众所周知的各种方法来评估或定量，例如免疫沉淀反应、Western印迹分析(免疫印迹)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、定量蛋白质测定法、蛋白质活性测定法(例如，半胱天冬酶活性测定法)、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光活化细胞分选(FACS)。针对靶标的抗体可以被鉴定并从诸如MSRS抗体目录(密歇根州伯明翰的Aerie公司(AerieCorporation，Birmingham，MI)等各种来源获得，或可以通过本领域中众所周知的常规单克隆或多克隆抗体生成方法来制备。可用于检测人类和大鼠GCGR的抗体可商购获得。
反义化合物的体内测试
在动物体内测试反义化合物(例如，反义寡核苷酸)以评估其抑制GCGR的表达和产生表型改变的能力。测试可以在正常动物体内或在实验疾病模型中进行。对于施用至动物，在药学上可接受的稀释剂(例如磷酸盐缓冲盐水)中配制反义寡核苷酸。施用包括肠胃外施用途径。用反义寡核苷酸处理一段时期之后，从组织中分离出RNA并测量GCGR核酸表达的变化。还测量了GCGR蛋白水平的变化。
某些适应症
在某些实施方案中，本文提供治疗个体的方法，其包括施用一种或多种如本文所述的药物组合物。在某些实施方案中，个体具有代谢相关疾病。
如下文实施例中所示，如本文所述的靶向GCGR的化合物已显示降低代谢相关疾病的生理症状的严重程度，所述代谢相关疾病包括代谢综合征、糖尿病、胰岛素抵抗、糖尿病性血脂异常、高甘油三酯血症、肥胖症以及体重增加。在某些实验中，所述化合物降低血糖水平，例如，动物持续经历症状，但所述症状相比于未经治疗的动物的严重程度较小。然而，在其他实验中，所述化合物似乎降低糖尿病的症状；例如，被治疗较长一段时间的动物所经历症状的严重程度小于被施用所述化合物较短一段时间的动物。然而，在其他实验中，所述化合物似乎抑制体重增加；例如，被治疗较长一段时间的动物所经历症状的严重程度小于被施用所述化合物较短一段时间的动物。然而，在其他实验中，所述化合物似乎抑制高甘油三酯血症；例如，被治疗较长一段时间的动物所经历体征和/或症状的严重程度小于被施用所述化合物较短一段时间的动物。因此下文示例的化合物恢复功能的能力表明，可通过用如本文所述的化合物治疗来逆转疾病的症状。
糖尿病的特征为众多的物理和生理学体征和/或症状。本领域技术人员已知与2型糖尿病相关的任何症状可以如上文在上述方法中所述进行改善或以其他方式调节。在某些实施方案中，所述症状或体征是物理症状或体征，例如葡萄糖水平增加、体重增加提高、尿频、异常口渴、极度饥饿、极度疲劳、视力模糊、频繁感染、四肢麻刺或麻木、皮肤干痒、体重减轻、伤口愈合缓慢以及牙龈肿胀。在某些实施方案中，所述症状或体征是选自以下的生理学症状或体征：胰岛素抵抗增加、葡萄糖水平增加、脂肪质量增加、代谢速率降低、葡萄糖清除率降低、葡萄糖耐受性降低、胰岛素敏感性降低、肝胰岛素敏感性降低、脂肪组织尺寸和重量增加、身体脂肪增加以及体重增加。
在某些实施方案中，物理症状或体征是葡萄糖水平增加。在某些实施方案中，体征或症状是体重增加。在某些实施方案中，症状是尿频。在某些实施方案中，症状是异常口渴。在某些实施方案中，症状是极度饥饿。在某些实施方案中，症状是极度疲劳。在某些实施方案中，症状是视力模糊。在某些实施方案中，症状是频繁感染。在某些实施方案中，症状是四肢麻刺或麻木。在某些实施方案中，症状是皮肤干痒。在某些实施方案中，体征或症状是体重减轻。在某些实施方案中，症状是伤口愈合缓慢。在某些实施方案中，症状是牙龈肿胀。在某些实施方案中，症状或体征是胰岛素抵抗增加。在某些实施方案中，症状或体征是葡萄糖水平增加。在某些实施方案中，症状或体征是脂肪质量增加。在某些实施方案中，症状或体征是代谢速率降低。在某些实施方案中，症状或体征是葡萄糖清除率降低。在某些实施方案中，症状或体征是葡萄糖耐受性降低。在某些实施方案中，症状或体征是胰岛素敏感性降低。在某些实施方案中，症状或体征是肝胰岛素敏感性降低。在某些实施方案中，症状或体征是脂肪组织尺寸和重量增加。在某些实施方案中，症状或体征是身体脂肪增加。在某些实施方案中，体征或症状是体重增加。
在某些实施方案中，提供治疗个体的方法，其包括施用一种或多种如本文所述的药物组合物。在某些实施方案中，个体具有代谢相关疾病。
在某些实施方案中，靶向GCGR核酸的反义化合物的施用导致GCGR表达降低至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，或由任意两个这些数值限定的范围。
在某些实施方案中，包含靶向GCGR的反义化合物的药物组合物被用于制备用于治疗罹患或易患上代谢相关疾病的患者的药物。
在某些实施方案中，本文所述的方法包括施用包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO：11(ISIS 449884)中所述序列的如本文所述的连续核碱基部分。
在某些实施方案中，本文所述的方法包括施用包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO：80(ISIS 459014)中所述序列的如本文所述的连续核碱基部分。
某些组合疗法
在某些实施方案中，一种或多种本文所述的药物组合物是与一种或多种其他药物剂共同施用的。在某些实施方案中，此类一种或多种其他药物剂被设计来治疗与一种或多种本文所述的药物组合物相同的疾病、病症或病状。在某些实施方案中，此类一种或多种其他药物剂被设计来治疗与一种或多种本文所述的药物组合物不同的疾病、病症或病状。在某些实施方案中，此类一种或多种其他药物剂被设计来治疗一种或多种如本文所述的药物组合物的不需要的副作用。在某些实施方案中，一种或多种药物组合物与另一种药物剂共同施用以治疗该另一种药物剂的不需要的作用。在某些实施方案中，一种或多种药物组合物与另一种药物剂共同施用以产生组合作用。在某些实施方案中，一种或多种药物组合物与另一种药物剂共同施用以产生协同作用。
在某些实施方案中，第一剂和一种或多种第二剂是同时施用的。在某些实施方案中，第一剂和一种或多种第二剂是在不同时间施用的。在某些实施方案中，第一剂和一种或多种第二剂被一起制备于单一药物配制物中。在某些实施方案中，第一剂和一种或多种第二剂是单独制备的。
在某些实施方案中，在施用本文所述的药物组合物之前施用第二化合物。在某些实施方案中，在施用本文所述的药物组合物之后施用第二化合物。在某些实施方案中，第二化合物是与本文所述的药物组合物同时施用的。在某些实施方案中，共同施用的第二化合物的剂量与在单独施用第二化合物时将施用的剂量相同。在某些实施方案中，共同施用的第二化合物的剂量低于在单独施用第二化合物时将施用的剂量。在某些实施方案中，共同施用的第二化合物的剂量高于在单独施用第二化合物时将施用的剂量。
在某些实施方案中，第二化合物的共同施用增强了第一化合物的作用，因此所述化合物的共同施用导致其作用大于单独施用第一化合物的作用。在某些实施方案中，共同施用导致其作用为所述化合物在单独施用时的作用的累加。在某些实施方案中，共同施用导致其作用为所述化合物在单独施用时的作用的超累加。在某些实施方案中，第一化合物是反义化合物。在某些实施方案中，第二化合物是反义化合物。
在某些实施方案中，第二剂包括但不限于降糖剂。该降糖剂可以包括但不限于治疗性生活方式改变、PPAR激动剂、二肽基肽酶(IV)抑制剂、GLP-1类似物、胰岛素或胰岛素类似物、胰岛素促泌素、SGLT2抑制剂、人类胰淀素类似物、双胍类、α-葡糖苷酶抑制剂或其组合。该降糖剂可以包括但不限于二甲双胍、磺酰脲、罗格列酮、美格列奈、噻唑烷二酮、α-葡糖苷酶抑制剂或其组合。磺酰脲可能是醋磺环己脲、氯磺丙脲、甲苯磺丁脲、妥拉磺脲、格列美脲、格列吡嗪、格列本脲或格列齐特。美格列奈可能是那格列奈或瑞格列奈。噻唑烷二酮可能是吡格列酮或罗格列酮。α-葡糖苷酶可能是阿卡波糖或米格列醇。
在一些实施方案中，降糖治疗剂是GLP-1类似物。在一些实施方案中，该GLP-1类似物是艾塞那肽-4(exendin-4)或利拉鲁肽。
在其他实施方案中，降糖治疗剂是磺酰脲。在一些实施方案中，该磺酰脲是醋磺环己脲、氯磺丙脲、甲苯磺丁脲、妥拉磺脲、格列美脲、格列吡嗪、格列本脲或格列齐特。
在一些实施方案中，降糖药是双胍类。在一些实施方案中，该双胍是二甲双胍，以及在一些实施方案中，血糖水平降低而乳酸性酸中毒与在用二甲双胍单独治疗后观察到的乳酸性酸中毒相比无增加。
在一些实施方案中，降糖药是美格列奈。在一些实施方案中，该美格列奈是那格列奈或瑞格列奈。
在一些实施方案中，降糖药是噻唑烷二酮。在一些实施方案中，该噻唑烷二酮是吡格列酮、罗格列酮或曲格列酮。在一些实施方案中，血糖水平降低而无相比于单独罗格列酮治疗下所观察更大的体重增加。
在一些实施方案中，降糖药是α-葡糖苷酶抑制剂。在一些实施方案中，该α-葡糖苷酶抑制剂是阿卡波糖或米格列醇。
在一个特定实施方案中，共同施用的降糖剂是ISIS 113715。
在一个特定实施方案中，降糖疗法是治疗性生活方式改变。
在某些实施方案中，第二剂包括但不限于降脂剂。该降脂剂可以包括但不限于阿托伐他汀、辛伐他汀、瑞舒伐他汀以及依泽替米贝。在某些此类实施方案中，在施用本文所述的药物组合物之前施用降脂剂。在某些此类实施方案中，在施用本文所述的药物组合物之后施用降脂剂。在某些此类实施方案中，降脂剂是与本文所述的药物组合物同时施用的。在某些此类实施方案中，共同施用的降脂剂的剂量与在单独使用该降脂剂时将施用的剂量相同。在某些此类实施方案中，共同施用的降脂剂的剂量低于在单独使用该降脂剂时将施用的剂量。在某些此类实施方案中，共同施用的降脂剂的剂量高于在单独使用该降脂剂时将施用的剂量。
在某些实施方案中，共同施用的降脂剂是HMG-CoA还原酶抑制剂。在某些此类实施方案中，该HMG-CoA还原酶抑制剂是他汀类。在某些此类实施方案中，该他汀类是选自阿托伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀以及瑞舒伐他汀。
在某些实施方案中，共同施用的降脂剂是胆固醇吸收抑制剂。在某些此类实施方案中，胆固醇吸收抑制剂是依泽替米贝。
在某些实施方案中，共同施用的降脂剂是共同配制的HMG-CoA还原酶抑制剂和胆固醇吸收抑制剂。在某些此类实施方案中，共同配制的降脂剂是依泽替米贝/辛伐他汀。
在某些实施方案中，共同施用的降脂剂是微粒体甘油三酯转移蛋白抑制剂(MTP抑制剂)。
在某些实施方案中，共同施用的降脂剂是靶向ApoB的寡核苷酸。
在某些实施方案中，第二剂包括但不限于抗肥胖药物或抗肥胖剂。此类抗肥胖剂包括但不限于奥利司他、西布曲明或利莫那班，并且可如上所述作为降脂肪剂或降体重剂施用。在某些实施方案中，反义化合物可与胃口抑制剂共同施用。此类胃口抑制剂包括但不限于安非拉酮(diethylpropion/tenuate)、马吲哚、奥利司他、苯二甲吗啉、苯丁胺以及西布曲明并且可如本文所述施用。在某些实施方案中，抗肥胖药剂是基于CNS的，例如但不限于西布曲明；或基于GLP-1的，例如但不限于利拉鲁肽。
配制物
本文提供的化合物还可以与其他分子、分子结构或化合物(如例如脂质体、靶向受体的分子)的混合物或用于辅助摄取、分布和/或吸收的其他配制物混合、缀合或以其他方式缔合。教示此类辅助摄取、分布和/或吸收的配制物的制备的代表性美国专利包括但不限于U.S.：5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；以及5,595,756，其各自以引用的方式并入本文中。
本文提供的反义化合物可以包括于药物组合物或配制物中。药物组合物可以包括任何药学上可接受的盐、酯、或此类酯的盐、或任何其他化合物，其在施用至动物(包括人类)时能够提供(直接或间接)生物活性代谢物或其残余物。
术语“药学上可接受的盐”是指本文提供的化合物的生理学和药学上可接受的盐：即，保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予其不需要的毒理学作用的盐。术语“药学上可接受的盐”包括由药学上可接受的无毒酸或碱(包括无机或有机酸和碱)制备的盐。对于寡核苷酸，药学上可接受的盐的优选例子和其用途进一步描述于美国专利6,287,860中，其以全文引用的方式并入本文中。钠盐已显示为寡核苷酸药物的合适形式。
术语“药学上可接受的衍生物”涵盖但不限于本文所述化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、酯、前药、多晶型物、异构体、同位素标记的变体。
本文所述的药物组合物可以多种方法施用，取决于是否需要局部或全身治疗以及有待治疗的区域。施用可能是肠胃外。肠胃外施用包括但不限于皮下、静脉内或肌肉内注射或输液。
优选肠胃外施用以靶向肝脏和血浆中的GCGR表达。认为具有至少一个2′-O-甲氧基乙基修饰的寡核苷酸尤其可用于肠胃外施用。
可根据制药行业中众所周知的常规技术来制备本文所述的药物配制物，其可方便地以单位剂型呈现。此类技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂缔合的步骤。一般来说，通过使活性成分与液体载体或细粉状固体载体或两者均匀并紧密地缔合来制备配制物。
本文所述的组合物还可以配制为于水性、非水性或混合介质中的悬浮液。该悬浮液还可包含稳定剂。
本文所述的药物组合物包括但不限于溶液、乳液以及含脂质体的配制物。本文所述的药物组合物和配制物可包含一种或多种渗透增强剂、载体、赋形剂或其他活性或非活性成分。
配制物包括脂质体配制物。如本发明中所用，术语“脂质体”意指由排列在一个或多个球形双层中的两亲性脂质构成的囊泡。脂质体为单层或多层囊泡，其具有由亲脂物质形成的膜和含有待递送的组合物的水性内部。阳离子脂质体是带正电的脂质体，认为它们与带负电的DNA分子相互作用以形成稳定的复合物。认为具pH敏感性或带负电的脂质体截留DNA而并非与其复合。已使用阳离子脂质体和非阳离子脂质体来递送DNA至细胞。
脂质体还包括“空间稳定化的”脂质体，如本文所用的该术语是指包含一种或多种专用脂质的脂质体，所述专用脂质当并入脂质体中时导致循环寿命相对于缺乏此类专用脂质的脂质体有所增强。脂质体和其用途进一步描述于美国专利6,287,860中，该专利以全文引用的方式并入本文中。
在另一个实施方案中，配制物包括盐水配制物。在某些实施方案中，配制物由本文所述的化合物和盐水组成。在某些实施方案中，配制物主要由本文所述的化合物和盐水组成。在某些实施方案中，盐水是药学上可接受等级的盐水。在某些实施方案中，盐水是缓冲盐水。在某些实施方案中，盐水是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在某些实施方案中，配制物不包括脂质体。在某些实施方案中，配制物不包括空间稳定化的脂质体。在某些实施方案中，配制物不包括磷脂。在某些实施方案中，配制物主要由本文所述的化合物和盐水组成并且不包括脂质体。
药物配制物和组合物还可包括表面活性剂。表面活性剂和其用途进一步描述于美国专利6,287,860中，该专利以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，本发明使用多种渗透增强剂来影响核酸、尤其是寡核苷酸的有效递送。渗透增强剂和其用途进一步描述于美国专利6,287,860中，该专利以全文引用的方式并入本文中。
本领域技术人员应认识到，常规地根据其预期用途、即施用途径来设计配制物。
用于肠胃外施用(包括皮下、静脉内和肌肉内注射或输液)的组合物和配制物可包括无菌水溶液，其还可包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂，例如但不限于渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一个相关实施方案中，本文提供的组合物可包含一种或多种靶向第一核酸的反义化合物(尤其是寡核苷酸)以及一种或多种靶向第二核酸靶标的另外的反义化合物。可选地，本文提供的组合物可包含两种或更多种靶向同一核酸靶标的不同区域的反义化合物。本领域中已知反义化合物的众多例子。两种或更多种组合化合物可一起使用或依序使用。
给药
给药取决于有待治疗的疾病状态的严重程度和反应性，其中治疗过程持续若干天至若干个月，或直到实现治愈或达到疾病状态的缩减。可以根据患者体内药物蓄积的测量结果来计算最佳的给药时程。最佳剂量可根据单独的寡核苷酸的相对效能而改变，并且一般可以基于在体外和体内动物模型中测得有效的EC50来估算。一般来说，剂量为每公斤体重0.01μg至100g，并且可每天、每周、每个月或每年一次或多次提供，或以所需时间间隔提供。在成功的治疗之后，可能需要患者进行维持治疗以防止疾病状态的复发，其中寡核苷酸以每公斤体重0.01μg至100g的维持剂量每天一次或多次施用。
尽管已根据某些本发明的优选实施方案具体地描述了本发明，但下列实施例仅用于说明本发明而不欲限制本发明。本申请中所述的参考文献、GenBank登录号等各自以全文引用的方式并入本文中。
某些化合物
对新近设计和先前公开的约777种具有不同长度、基序和主链组成的反义化合物体外测试其在若干细胞类型中对人类GCGR mRNA的影响(实施例1)。将新化合物与先前设计的化合物(包括ISIS 310457、ISIS 315163和ISIS 325568)进行比较，所述先前设计的化合物先前已经被测定为体外最有效反义化合物中的一些(参见例如美国专利公开No.美国专利No.7,399,853和美国公开专利申请No.US2007-0087987)。在新近设计和先前设计的约777种反义化合物中，仅呈现那些基于体外效能被选择用于进一步研究的化合物。在食蟹猴原代肝细胞和HepG2细胞中测试所选化合物的剂量依赖性抑制(实施例5-13)。在利用剂量反应测定法测试的120种化合物中，选择33种反义寡核苷酸用于体内耐受性测定法。
在CD1小鼠模型以及Sprague-Dawley大鼠模型中对最终选择的33种寡核苷酸ISIS304538(SEQ ID NO：112)、ISIS 304539(SEQ ID NO：113)、ISIS 325568(SEQ ID NO：4)、ISIS 398457(SEQ ID NO：9)、ISIS 398471(SEQ ID NO：17)、ISIS 398486(SEQ ID NO：24)、ISIS 398491(SEQ ID NO：105)、ISIS 398506(SEQ ID NO：108)、ISIS 398507(SEQ ID NO：109)、ISIS 398508(SEQ ID NO：110)、ISIS 436034(SEQ ID NO：35)、ISIS 436140(SEQ IDNO：102)、ISIS 436141(SEQ ID NO：114)、ISIS 448718(SEQ ID NO：99)、ISSI 448730(SEQID NO：100)、ISIS 448754(SEQ ID NO：98)、ISIS 448766(SEQ ID NO：31)、ISIS 448817(SEQ ID NO：52)、ISIS 448818(SEQ ID NO：56)、ISIS 448819(SEQ ID NO：58)、ISIS448848(SEQ ID NO：62)、ISIS 448860(SEQ ID NO：65)、ISIS 448890(SEQ ID NO：68)、ISIS449884(SEQ ID NO：11)、ISIS 449954(SEQ ID NO：51)、ISIS 449956(SEQ ID NO：54)、ISIS459014(SEQ ID NO：80)、ISIS 459024(SEQ ID NO：89)、ISIS 459032(SEQ ID NO：81)、ISIS459040(SEQ ID NO：82)、ISIS 459046(SEQ ID NO：83)、ISIS 459076(SEQ ID NO：84)以及ISIS 459157(SEQ ID NO：85)测试耐受性。所述化合物与SEQ ID NO：1的区域548-567、2016-2035和2018-2037以及SEQ ID NO：2的区域6682-6698、7267-7283、7270-7286、7292-7308、7295-7311、7316-7332、7317-7333、7319-7335、7341-7357、7344-7360、7365-7381、7368-7384、7389-7405、7392-7408、7416-7432、7437-7453、7440-7456、7783-7799、8030-8049、8133-8152、8141-8160、8144-8160、9002-9021、9008-9027、9245-9264、9246-9262、9804-9823、10676-10695、10718-10734、12030-12049、12031-12050、12031-12047、12032-12051、12033-12052、12033-12049、12036-12055、12175-12194、12178-12194、13490-13509、14138-14157、15075-15094、15743-15762、15744-15763、15745-15764和15746-15765互补。
在体内模型中，测量体重和器官重量、肝功能标志物(例如丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和胆红素)以及肾功能标志物(例如BUN和肌酐)。在小鼠模型中，在转氨酶水平方面，ISIS 304538、ISIS 325568、ISIS 398457、ISIS 398471、ISIS 398491、ISIS 436140、ISIS 448754、ISIS 448766、ISIS 448818、ISIS 449884、ISIS 449956、ISIS 459014、ISIS459024、ISIS 459032、ISIS 459040、ISIS 459046、ISIS 459076以及ISIS 459 157是可耐受的(实施例11)。在Sprague-Dawley大鼠模型中，在肝功能和肾功能标志物的水平方面，认为ISIS 325568、ISIS 398457、ISIS 398471、ISIS 398491、ISIS 436140、ISIS 448730、ISIS 448754、ISIS 448817、ISSI 448818、ISIS 448848、ISIS 449884、ISIS 449956、ISIS459014、ISIS 459032、ISIS 459040、ISIS 459046、ISIS 459076以及ISIS 459157是可耐受的(实施例12)。
九种化合物ISIS 325568(SEQ ID NO：4)、ISIS 398471(SEQ ID NO：17)、ISIS436140(SEQ ID NO：102)、ISIS 448766(SEQ ID NO：31)、ISIS 449884(SEQ ID NO：11)、ISIS 459014(SEQ ID NO：80)、ISIS 459032(SEQ ID NO：81)、ISIS 459040(SEQ ID NO：82)以及ISIS 459157(SEQ ID NO：85)是选自耐受性模型并且在CD/1GS大鼠模型中持续13周测定其对耐受性的长期影响(实施例13)。测量器官重量、肝功能标志物(例如丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和胆红素)以及肾功能标志物(例如BUN和肌酐)。还对九种化合物测试了其粘度，发现其对于所有寡核苷酸来说是最佳的(实施例14)。
对于在所有三种体内模型中显示极好耐受性的ISIS 449884测试其在CD1小鼠肝脏中的半衰期(实施例15)。ISIS 449884的半衰期经计算为15天。
这些研究的最终评估(实施例11-15)导致选择八种具有SEQ ID NO：17(ISIS398471)、102(ISIS 436140)、31(ISIS 448766)、11(ISIS 449884)、80(ISIS 459014)、81(ISIS 459032)、82(ISIS 459040)或85(ISIS 459157)的核碱基序列的寡核苷酸。所述化合物与SEQ ID NO：2的区域7267-7283、7270-7286、7292-7308、7295-7311、7316-7332、7319-7335、7341-7357、7344-7360、7437-7453、7365-7381、7368-7384、7389-7405、7392-7408、7416-7432、7440-7456、7783-7799、8133-8152、8144-8160、9804-9823、10718-10734、15743-15762互补。在某些实施方案中，靶向如本文进一步描述的所列区域的化合物包含具有如本文进一步描述的SEQ ID NO中所述的序列的一些核碱基部分的修饰寡核苷酸，在某些实施方案中，靶向所列区域或具有所列SEQ ID NO中所述的序列的核碱基部分的化合物可以具有如本文进一步描述的不同的长度，并且可以具有如本文进一步描述的不同的基序之一。在某些实施方案中，靶向一个区域或具有所列SEQ ID NO中所述的序列的核碱基部分的化合物具有特定的长度和基序，如由ISIS NO：398471、436140、448766、449884、459014、459032、459040以及459157所指示。
测试这八种化合物在食蟹猴中的活性、药物动力学特征曲线和耐受性(实施例16)。用一些化合物处理造成肝脏组织中的GCGR mRNA表达降低。明确地说，与PBS对照物相比，用ISIS 449884、ISIS 459157和ISIS 325568处理造成肝脏组织中的GCGR mRNA表达显著降低。注意到，与PBS对照物相比，ISIS 449884造成GCGR mRNA表达的降低量最高。胰高血糖素水平增加是GCGR mRNA水平抑制的结果。用ISIS 325568、ISIS 448766、ISIS 459157以及ISIS 449884处理造成血浆胰高血糖素水平显著增加，其中ISIS 449884造成增加量最高。因此，在活性方面，ISIS 449884在猴子研究中是最有效的。用所述化合物处理在猴子中可充分耐受，特别是，用ISIS 449884处理。
因此，本文提供具有任何一种或多种改进特征的反义化合物。在某些实施方案中，当如实施例8-11中所述使用电穿孔递送至HepG2细胞系时，如本文所述的化合物由于具有小于0.1μM、小于0.2μM、小于0.4μM、小于0.35μM、小于0.3μM、小于2.5μM、小于2.0μM、小于1.5μM、小于1.0μM的体外IC50中的至少一者而为有效的。在一个特定的此类实施方案中，所述化合物与SEQ ID NO：1的区域548-567、2016-2035和2018-2037以及SEQ ID NO：2的区域6682-6698、7267-7283、7270-7286、7292-7308、7295-7311、7316-7332、7317-7333、7319-7335、7341-7357、7344-7360、7365-7381、7368-7384、7389-7405、7392-7408、7416-7432、7437-7453、7440-7456、7783-7799、8030-8049、8133-8152、8141-8160、8144-8160、9002-9021、9008-9027、9245-9264、9246-9262、9804-9823、10676-10695、10718-10734、12030-12049、12031-12050、12031-12047、12032-12051、12033-12052、12033-12049、12036-12055、12175-12194、12178-12194、13490-13509、14138-14157、15075-15094、15743-15762、15744-15763、15745-15764和15746-15765中的一者或多者互补。
在某些实施方案中，如本文所述的化合物是高度可耐受的，如以下中的至少一者所显示：ALT或AST值相对于盐水处理动物的增加量不超过约100倍、约60倍、约50倍、约40倍、约30倍、约25倍、约10倍、约5倍、约4倍、约3倍或约2倍；或如实施例中所述的肝脏、脾脏或肾脏重量增加不超过约30％、约20％、约15％、约12％、约10％、约5％或约2％。在某些此类实施方案中，所述化合物与SEQ ID NO：2的区域7267-7283、7270-7286、7292-7308、7295-7311、7316-7332、7319-7335、7341-7357、7344-7360、7437-7453、7365-7381、7368-7384、7389-7405、7392-7408、7416-7432、7440-7456、7783-7799、8133-8152、8144-8160、9804-9823、10718-10734、15743-15762中的一者或多者互补。
实施例
非限制性公开内容和以引用的方式并入
尽管已根据某些实施方案具体地描述了本文所述的某些化合物、组合物以及方法，但下列实施例仅用于说明本文所述的化合物而不欲对其进行限制。本申请中所述的参考文献各自以全文引用的方式并入本文中。
实施例1：HepG2细胞中人类胰高血糖素受体(GCGR)的反义抑制
设计靶向GCGR核酸的反义寡核苷酸并且体外测试其对GCGR mRNA的作用。还测试了描述于早期公开(WO 2007/035771)中的ISIS 310457。使用电穿孔用4,000nM反义寡核苷酸转染密度为每孔40,000个细胞的所培养HepG2细胞。在约24小时的处理期后，从细胞中分离出RNA并且通过定量实时PCR测量GCGR mRNA水平。使用人类引物探针组RTS1508(正向序列GACACCCCCGCCAATACC，本文指定为SEQ ID NO：116；反向序列CCGCATCTCTTGAACACGAA，本文指定为SEQ ID NO：117；探针序列TTGGCACCACAAAGT，本文指定为SEQ ID NO：118)来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调节GCGR mRNA水平。以相对于未被处理的对照细胞的GCGR抑制百分比形式呈现结果。测试了总共309种寡核苷酸。仅那些被选择用于剂量反应测定法的寡核苷酸显示于表1中。
表1中新近设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为3-10-4MOE缺口聚体或5-10-5MOE缺口聚体。所述3-10-4MOE缺口聚体的长度为17个核苷，其中中心缺口区段由十个2′-脱氧核苷构成并且在5′方向侧接包含三个核苷的侧翼区段以及在3′方向侧接包含四个核苷的侧翼区段。所述5-10-5MOE缺口聚体的长度为20个核苷，其中中心缺口区段由十个2′-脱氧核苷构成并且在5′方向和3′方向各侧接包含五个核苷的侧翼区段。5′侧翼区段中的每一核苷和3′侧翼区段中的每一核苷都具有2′-MOE修饰。每一缺口聚体内的核苷间键联是硫代磷酸酯(P＝S)键联。每一缺口聚体内的所有胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人类基因序列中被缺口聚体靶向的5′最末端核苷。“终止位点”指示人类基因序列中被缺口聚体靶向的3′最末端核苷。表1中列出的每一缺口聚体是靶向人类GCGR mRNA(本文指定为SEQID NO：1)(GENBANK登录No.NM_000160.3)或人类GCGR基因组序列(本文指定为SEQ ID NO：2)(GENBANK登录No.NW_926918.1，从核苷酸16865000至16885000截短)。‘n/a’指示反义寡核苷酸并不靶向该特定的基因序列。
表1
靶向SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的嵌合反义寡核苷酸对人类GCGR mRNA水平的抑制
实施例2：HepG2细胞中人类胰高血糖素受体(GCGR)的反义抑制
设计另外的靶向GCGR核酸的反义寡核苷酸并且体外测试其对GCGR mRNA的作用。还测试了ISIS 315163(ACCTGGAAGCTGCTGTACAT(SEQ ID NO 79)；SEQ ID NO：1上的起始位点为702；SEQ ID NO：2上的起始位点为13003)，其描述于早期公开(WO 2004/096016)中。使用电穿孔用1,000nM反义寡核苷酸转染密度为每孔40,000个细胞的所培养HepG2细胞。在约24小时的处理期后，从细胞中分离出RNA并且使用人类引物探针组RTS1508通过定量实时PCR测量GCGR mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调节GCGR mRNA水平。以相对于未被处理的对照细胞的GCGR抑制百分比形式呈现结果。测试了总共156种反义寡核苷酸。仅那些被选择用于剂量反应测定法的寡核苷酸显示于表2中。
表2中新近设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为3-10-3MOE、3-10-4MOE、4-10-4MOE、4-10-5MOE或5-10-6MOE缺口聚体。所述3-10-3MOE缺口聚体的长度为16个核苷，其中中心缺口区段由十个2′-脱氧核苷构成并且在5′方向和3′方向各侧接包含三个核苷的侧翼区段。所述3-10-4MOE缺口聚体的长度为17个核苷，其中中心缺口区段由十个2′-脱氧核苷构成并且在5′方向侧接包含三个核苷的侧翼区段以及在3′方向侧接包含四个核苷的侧翼区段。所述4-10-4MOE缺口聚体的长度为18个核苷，其中中心缺口区段由十个2′-脱氧核苷构成并且在5′方向和3′方向各侧接包含四个核苷的侧翼区段。所述4-10-5MOE缺口聚体的长度为19个核苷，其中中心缺口区段由十个2′-脱氧核苷构成并且在5′方向侧接包含四个核苷的侧翼区段以及在3′方向侧接包含五个核苷的侧翼区段。所述5-10-6MOE缺口聚体的长度为21个核苷，其中中心缺口区段由十个2′-脱氧核苷构成并且在5′方向侧接包含五个核苷的侧翼区段以及在3′方向侧接包含六个核苷的侧翼区段。5′侧翼区段中的每一核苷和3′侧翼区段中的每一核苷都具有2′-MOE修饰。每一缺口聚体内的核苷间键联是硫代磷酸酯(P＝S)键联。每一缺口聚体内的所有胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人类基因序列中被缺口聚体靶向的5′最末端核苷。“终止位点”指示人类基因序列中被缺口聚体靶向的3′最末端核苷。表2中列出的每一缺口聚体是靶向人类GCGR mRNA(本文指定为SEQ ID NO：1)(GENBANK登录No.NM_000160.3)或人类GCGR基因组序列(本文指定为SEQ ID NO：2)(GENBANK登录No.NW_926918.1，从核苷酸16865000至16885000截短)。‘n/a’指示反义寡核苷酸并不靶向该特定的基因序列。
表2
靶向SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的嵌合反义寡核苷酸对人类GCGR mRNA水平的抑制
实施例3：HepG2细胞中人类胰高血糖素受体(GCGR)的反义抑制
设计另外的靶向GCGR核酸的反义寡核苷酸并且体外测试其对GCGR mRNA的作用。还测试了ISIS 315163。此外测试了ISIS 325568，其已描述于先前公开(WO 2007/035771)中。使用电穿孔用2,000nM反义寡核苷酸转染密度为每孔40,000个细胞的所培养HepG2细胞。在约24小时的处理期后，从细胞中分离出RNA并且使用人类引物探针组RTS1508通过定量实时PCR测量GCGR mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调节GCGRmRNA水平。以相对于未被处理的对照细胞的GCGR抑制百分比形式呈现结果。测试了总共78种反义寡核苷酸。仅那些被选择用于剂量反应测定法的寡核苷酸显示于表3中。
表3中新近设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE缺口聚体。所述缺口聚体的长度为20个核苷，其中中心缺口区段由十个2′-脱氧核苷构成并且在5′方向和3′方向各侧接包含五个核苷的侧翼区段。5′侧翼区段中的每一核苷和3′侧翼区段中的每一核苷都具有2′-MOE修饰。每一缺口聚体内的核苷间键联是硫代磷酸酯(P＝S)键联。每一缺口聚体内的所有胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人类基因序列中被缺口聚体靶向的5′最末端核苷。“终止位点”指示人类基因序列中被缺口聚体靶向的3′最末端核苷。表3中列出的每一缺口聚体是靶向人类GCGR mRNA(本文指定为SEQ ID NO：1)(GENBANK登录No.NM_000160.3)或人类GCGR基因组序列(本文指定为SEQ ID NO：2)(GENBANK登录No.NW_926918.1，从核苷酸16865000至16885000截短)。‘n/a’指示反义寡核苷酸并不靶向该特定的基因序列。
表3
靶向SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的嵌合反义寡核苷酸对人类GCGR mRNA水平的抑制
实施例4：HepG2细胞中人类胰高血糖素受体(GCGR)的反义抑制
设计另外的靶向GCGR核酸的反义寡核苷酸并且体外测试其对GCGR mRNA的作用。还测试了ISIS 315163和ISIS 325568。使用电穿孔用5,000nM反义寡核苷酸转染密度为每孔40,000个细胞的所培养HepG2细胞。在约24小时的处理期后，从细胞中分离出RNA并且使用人类引物探针组RTS1508通过定量实时PCR测量GCGR mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调节GCGR mRNA水平。以相对于未被处理的对照细胞的GCGR抑制百分比形式呈现结果。测试了总共234种反义寡核苷酸。仅那些被选择用于剂量反应测定法的寡核苷酸显示于表4中。
表4中新近设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE缺口聚体。所述缺口聚体的长度为20个核苷，其中中心缺口区段由十个2′-脱氧核苷构成并且在5′方向和3′方向各侧接包含五个核苷的侧翼区段。5′侧翼区段中的每一核苷和3′侧翼区段中的每一核苷都具有2′-MOE修饰。每一缺口聚体内的核苷间键联是硫代磷酸酯(P＝S)键联。每一缺口聚体内的所有胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人类基因序列中被缺口聚体靶向的5′最末端核苷。“终止位点”指示人类基因序列中被缺口聚体靶向的3′最末端核苷。表4中列出的每一缺口聚体是靶向人类GCGR mRNA(本文指定为SEQ ID NO：1)(GENBANK登录No.NM_000160.3)或人类GCGR基因组序列(本文指定为SEQ ID NO：2)(GENBANK登录No.NW_926918.1，从核苷酸16865000至16885000截短)。‘n/a’指示反义寡核苷酸并不靶向该特定的基因序列。
表4
靶向SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的嵌合反义寡核苷酸对人类GCGR mRNA水平的抑制
实施例5：食蟹猴原代肝细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
在食蟹猴原代肝细胞中在不同的条件下测试展现人类GCGR的显著体外抑制的来自实施例1的缺口聚体。细胞以每孔24,000个细胞的密度接种并使用电穿孔用如表5中所示的0.4μM、1.1μM、3.3μM以及10.0μM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期后，从细胞中分离出RNA并且通过定量实时PCR测量GCGR mRNA水平。使用人类GCGR引物探针组RTS1508来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调节GCGR mRNA水平。以相对于未被处理的对照细胞的GCGR抑制百分比形式呈现结果。
每一寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)也呈现于表5中并且通过绘制所用寡核苷酸的浓度相对于在每一浓度下实现的GCGR mRNA表达的抑制百分比的曲线并标注相比于对照物实现GCGR mRNA表达的50％抑制的寡核苷酸浓度来计算。如表5中所说明，在被反义寡核苷酸处理的细胞中，GCGR mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表5
在使用电穿孔的食蟹猴原代肝细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
实施例6：HepG2细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
选择展现GCGR mRNA的显著体外抑制的来自实施例5的缺口聚体并在HepG2细胞中在不同的剂量下测试。细胞以每孔40,000个细胞的密度接种并使用电穿孔用如表6中所示的0.12μM、0.37μM、1.11μM、3.33μM以及10.00μM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期后，从细胞中分离出RNA并且通过定量实时PCR测量GCGR mRNA水平。使用人类GCGR引物探针组RTS1508来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调节GCGR mRNA水平。以相对于未被处理的对照细胞的GCGR抑制百分比形式呈现结果。
每一寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)也呈现于表6中。如表6中所说明，在被反义寡核苷酸处理的细胞中，GCGR mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表6
在使用电穿孔的HepG2细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
实施例7：HepG2细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
进一步选择展现GCGR mRNA的显著体外抑制的来自实施例5的缺口聚体并在HepG2细胞中在不同的剂量下测试。细胞以每孔40,000个细胞的密度接种并使用电穿孔用如表7中所示的0.04μM、0.12μM、0.37μM、1.11μM、3.33μM以及10.00μM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期后，从细胞中分离出RNA并且通过定量实时PCR测量GCGR mRNA水平。使用人类GCGR引物探针组RTS1508来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调节GCGR mRNA水平。以相对于未被处理的对照细胞的GCGR抑制百分比形式呈现结果。
每一寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)也呈现于表7中。在被反义寡核苷酸处理的细胞中，GCGR mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。‘n/a’指示不存在关于用于该特定浓度的该ISIS寡核苷酸的数据。选择造成GCGR mRNA水平显著降低的ISIS 398457、ISIS449884和ISIS 449954用于进一步研究。显著地，在实施例5-7中呈现的头对头研究中，ISIS449884显示比基准ISIS 315163低10倍至50倍的IC50。
表7
在使用电穿孔的HepG2细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
实施例8：食蟹猴原代肝细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
在食蟹猴原代肝细胞中在不同的剂量下进一步测试来自实施例1-7中所述的研究的缺口聚体。细胞以每孔35,000个细胞的密度接种并使用电穿孔用如表8中所示的750nM、1,500nM、3,000nM、6,000nM以及12,000nM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期后，从细胞中分离出RNA并且通过定量实时PCR测量GCGR mRNA水平。使用人类GCGR引物探针组RTS1508来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调节GCGRmRNA水平。以相对于未被处理的对照细胞的GCGR抑制百分比形式呈现结果。如表8中所说明，在被反义寡核苷酸处理的细胞中，GCGR mRNA水平显著降低。
表8
在使用电穿孔的食蟹猴原代肝细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
实施例9：食蟹猴原代肝细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
进一步选择展现人类GCGR的显著体外抑制的来自实施例8的缺口聚体并在食蟹猴原代肝细胞中在不同的剂量下测试。还测试了ISIS 325568(GCACTTTGTGGTGCCAAGGC(SEQID NO：4)，SEQ ID NO：1上的靶标起始位点548)，其描述于早期公开(BIOL066USL)中。细胞以每孔35,000个细胞的密度接种并使用电穿孔用如表9中所示的0.006μM、0.020μM、0.063μM、0.200μM、0.632μM、2.000μM、6.325μM以及20.000μM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期后，从细胞中分离出RNA并且通过定量实时PCR测量GCGR mRNA水平。使用人类GCGR引物探针组RTS1508来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调节GCGR mRNA水平。以相对于未被处理的对照细胞的GCGR抑制百分比形式呈现结果。
每一寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)也呈现于表9中。在被反义寡核苷酸处理的细胞中，GCGR mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表9
在使用电穿孔的食蟹猴原代肝细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
基于抑制数据，选择ISIS 398471、ISIS 448766、ISIS 449884、ISIS 459014、ISIS459032以及ISIS 459157用于小鼠模型中的体内测试。
实施例10：HepG2细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
在HepG2细胞中在不同的剂量下进一步测试来自实施例1、4以及9中所述的研究的缺口聚体。细胞以每孔40,000个细胞的密度接种并使用电穿孔用如表10中所示的0.12μM、0.37μM、1.11μM、3.33μM以及10.00μM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期后，从细胞中分离出RNA并且通过定量实时PCR测量GCGR mRNA水平。使用人类GCGR引物探针组RTS1508来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调节GCGR mRNA水平。以相对于未被处理的对照细胞的GCGR抑制百分比形式呈现结果。如表10中所说明，在被反义寡核苷酸处理的细胞中，GCGR mRNA水平显著降低。
表10
在使用电穿孔的HepG2细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
基于抑制结果，选择ISIS 398457、ISIS 398471、ISIS 398486、ISIS 398491、ISIS398506、ISIS 398507、ISIS 398508以及ISIS 436034用于小鼠模型中的测试。
实施例11：HepG2细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
在HepG2细胞中在不同的剂量下进一步测试来自实施例4中所述的研究的缺口聚体。细胞以每孔40,000个细胞的密度接种并使用电穿孔用如表11中所示的0.04μM、0.12μM、0.37μM、1.11μM、3.33μM以及10.00μM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期后，从细胞中分离出RNA并且通过定量实时PCR测量GCGR mRNA水平。使用人类GCGR引物探针组RTS1508来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调节GCGR mRNA水平。以相对于未被处理的对照细胞的GCGR抑制百分比形式呈现结果。在被反义寡核苷酸处理的细胞中，GCGR mRNA水平显著降低。
表11
在使用电穿孔的HepG2细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
基于抑制结果，选择ISIS 304538、ISIS 304539、ISIS 436140以及ISIS 436141用于小鼠模型中的测试。
实施例12：HepG2细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
在HepG2细胞中在不同的剂量下进一步测试来自实施例1、3、8以及9中所述的研究的缺口聚体。细胞以每孔40,000个细胞的密度接种并使用电穿孔用如表12中所示的0.12μM、0.37μM、1.11μM、3.33μM以及10.00μM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期后，从细胞中分离出RNA并且通过定量实时PCR测量GCGR mRNA水平。使用人类GCGR引物探针组RTS1508来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调节GCGR mRNA水平。以相对于未被处理的对照细胞的GCGR抑制百分比形式呈现结果。在被反义寡核苷酸处理的细胞中，GCGR mRNA水平显著降低。
表12
在使用电穿孔的HepG2细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
基于抑制结果，选择ISIS 448718、ISIS 448730、ISIS 448754、ISIS 448766、ISIS448817、ISIS 448818、ISIS 448819、ISIS 448848、ISIS 448860以及ISIS 448890用于小鼠模型中的测试。
实施例13：HepG2细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
在HepG2细胞中在不同的剂量下进一步测试来自实施例1、2、8以及9中所述的研究的缺口聚体。细胞以每孔40,000个细胞的密度接种并使用电穿孔用如表13中所示的0.12μM、0.37μM、1.11μM、3.33μM以及10.00μM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期后，从细胞中分离出RNA并且通过定量实时PCR测量GCGR mRNA水平。使用人类GCGR引物探针组RTS1508来测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量来调节GCGR mRNA水平。以相对于未被处理的对照细胞的GCGR抑制百分比形式呈现结果。在被反义寡核苷酸处理的细胞中，GCGR mRNA水平显著降低。
表13
在使用电穿孔的HepG2细胞中人类GCGR的剂量依赖性反义抑制
基于抑制结果，选择ISIS 459024、ISIS 459032、ISIS 459040、ISIS 459046、ISIS459076以及ISIS 459157用于小鼠模型中的测试。
实施例14：靶向人类GCGR的反义寡核苷酸在CD1小鼠中的耐受性
小鼠(马萨诸塞州查尔斯河(Charles River，MA))是通常用于安全性和功效测试的多用途小鼠模型。用选自上述研究中的ISIS反义寡核苷酸处理小鼠并评估不同的血浆化学标志物的水平变化。
处理
向六周龄雄性CD1小鼠群组皮下注射50mg/kg的ISIS 304538、ISIS 304539、ISIS325568、ISIS 398457、ISIS 398471、ISIS 398486、ISIS 398491、ISIS 398506、ISIS398507、ISIS 398508、ISIS 436034、ISIS 436140、ISIS 436141、ISIS 448718、ISSI448730、ISIS 448754、ISIS 448766、ISIS 448817、ISIS 448818、ISIS 448819、ISIS448848、ISIS 448860、ISIS 448890、ISIS 449884、ISIS 449954、ISIS 449956、ISIS459014、ISIS 459024、ISIS 459032、ISIS 459040、ISIS 459046、ISIS 459076以及ISIS459157，每周两次，持续6周。向一组六周龄雄性CD1小鼠皮下注射PBS，每周两次，持续6周。在最后给药后48小时对小鼠实施安乐死，并且采集器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为了评估ISIS寡核苷酸对肝和肾功能的影响，使用自动化临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400e，纽约州梅尔维尔(Melville，NY))测量转氨酶、胆红素、白蛋白以及BUN的血浆水平。结果呈现于表14中。在进一步研究中排除造成肝或肾功能标志物中的任一者的水平变化超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表14
反义寡核苷酸处理对第6周时的CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物的影响
实施例15：靶向人类GCGR的反义寡核苷酸在Sprague-Dawley大鼠中的耐受性
Sprague-Dawley大鼠是用于安全性和功效评估的多用途模型。用来自实施例14中所述的研究的ISIS反义寡核苷酸处理大鼠并评估不同的血浆化学标志物的水平变化。
处理
使七周龄雄性Sprague-Dawley大鼠维持12小时光照/黑暗循环并随意进食Purina正常大鼠饲料diet 5001。向四只Sprague-Dawley大鼠的群组各自皮下注射50mg/kg的ISIS304538、ISIS 304539、ISIS 325568、ISIS 398457、ISIS 398471、ISIS 398486、ISIS398491、ISIS 398506、ISIS 398507、ISIS 398508、ISIS 436034、ISIS 436140、ISIS436141、ISIS 448718、ISSI 448730、ISIS 448754、ISIS 448766、ISIS 448817、ISIS448818、ISIS 448819、ISIS 448848、ISIS 448860、ISIS 448890、ISIS 449884、ISIS449954、ISIS 449956、ISIS 459014、ISIS 459024、ISIS 459032、ISIS 459040、ISIS459046、ISIS 459076以及ISIS 459157，每周两次，持续4周。在最后给药后48小时，对大鼠实施安乐死并且采集器官和血浆用于进一步分析。
肝功能
为了评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，使用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，纽约州梅尔维尔)测量转氨酶的血浆水平。测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血浆水平并且结果呈现于表16中，以IU/L表示。此外使用相同的临床化学分析仪测量胆红素的血浆水平并且结果也呈现于表16中。ALT和AST也以相对于PBS对照物的增加倍数表示，并且呈现于表17中。在进一步研究中排除造成任何肝功能标志物的水平变化超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表16
Sprague-Dawley大鼠中反义寡核苷酸处理对肝功能的影响
表17
Sprague-Dawley大鼠处理组中ALT和AST相对于PBS对照物的增加倍数
肾功能
为了评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，使用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，纽约州梅尔维尔)测量血尿素氮(BUN)和肌酐的血浆水平。结果呈现于表18中，以mg/dL表示。
表18
Sprague-Dawley大鼠中反义寡核苷酸处理对肾功能标志物(mg/dL)的影响
实施例16：CD/IGS大鼠中靶向人类GCGR的反义寡核苷酸的耐受性
CD/IGS大鼠是用于安全性和功效评估的多用途模型。用选自实施例14和15中所述的研究的ISIS反义寡核苷酸处理大鼠并评估不同的血浆化学标志物的水平变化。
处理
使10-12周龄雄性CD/IGS大鼠维持12小时光照/黑暗循环并随意进食Purina正常大鼠饲料diet 5001。向四只CD/IGS大鼠的群组各自皮下注射30mg/kg的ISIS 325568、ISIS398471、ISIS 436140、ISIS 448766、ISIS 449884、ISIS 459014、ISIS 459032、ISIS459040以及ISIS 459157，每周两次，持续13周。向一组6只大鼠皮下注射PBS，每周两次，持续13周，并充当对照组。在不同的时间点采集血样。在最后给药后48小时，测量体重，对大鼠实施安乐死并且采集器官和血浆用于进一步分析。
器官重量
在研究结束时测量肝脏、心脏、肺、脾脏以及肾脏重量，并且呈现于表19中。从进一步研究中排除造成器官重量的任何变化超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表19
反义寡核苷酸处理后第13周时CD/IGS大鼠的器官重量，以克(g)表示
心脏 肝脏 肺 脾脏 肾脏
PBS 1.8 21.3 1.9 1.0 4.1
ISIS 325568 1.3 16.9 2.6 2.1 3.6
ISIS 398471 1.6 19.8 2.1 1.6 3.3
ISIS 436140 1.4 22.7 2.4 2.4 4.9
ISIS 448766 1.5 22.6 2.2 2.3 3.4
ISIS 449884 1.6 19.0 2.0 1.3 3.3
ISIS 459014 1.6 16.4 1.9 1.0 3.2
ISIS 459032 1.6 33.3 2.8 6.1 4.0
ISIS 459040 1.5 18.7 2.7 2.3 4.5
ISIS 459157 1.4 19.4 2.1 1.5 3.3
肝功能
为了评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，使用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，纽约州梅尔维尔)在第8.5周(第57天)和第13周(第90天)测量不同的血浆化学标志物的水平。测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血浆水平并且结果呈现于表20和表21中，以IU/L表示。此外使用相同的临床化学分析仪测量胆红素和BUN的血浆水平并且结果也呈现于表20和表21中。在进一步研究中排除造成任何肝功能标志物的水平变化超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表20
第57天在CD/IGS大鼠中反义寡核苷酸处理对肝功能标志物的影响
ALT IU/L AST IU/L 胆红素mg/dL BUN mg/dL
盐水 28 48 0.12 12.7
325568 38 59 0.09 16.7
398471 29 49 0.10 10.4
436140 28 45 0.08 11.0
448766 31 64 0.08 13.2
449884 45 55 0.11 12.1
459014 27 44 0.13 23.2
459032 98 172 0.23 14.6
459040 25 43 0.08 14.1
459157 26 48 0.09 15.8
表21
第80天在CD/IGS大鼠中反义寡核苷酸处理对肝功能标志物的影响
肾功能
为了评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，测量总尿蛋白和尿肌酐水平，并且评估总尿蛋白与肌酐的比率。结果呈现于表22中。
表22
在CD/IGS大鼠的肾脏中反义寡核苷酸处理对尿蛋白/肌酐比率的影响
给药前 第8周 第12周
PBS 1.1 0.7 0.7
ISIS 325568 1.1 3.6 5.2
ISIS 398471 0.8 4.4 4.6
ISIS 436140 1.1 5.4 15.6
ISIS 448766 0.9 5.4 7.0
ISIS 449884 0.9 3.2 3.7
ISIS 459014 1.0 3.6 3.3
ISIS 459032 1.0 4.5 6.0
ISIS 459040 0.8 4.8 5.6
ISIS 459157 1.2 3.3 4.1
实施例17：靶向人类GCGR的ISIS反义寡核苷酸的粘度的测量
测量从实施例16中所述的研究中选出的反义寡核苷酸的粘度，旨在筛选出具有大于40cP的粘度的反义寡核苷酸。具有大于40cP的粘度的寡核苷酸的粘度过大以致于不能施用至任何受试者。
将ISIS寡核苷酸(32-35mg)称入玻璃小瓶中，添加120μL水并且通过在50℃下加热小瓶而将反义寡核苷酸溶解于溶液中。将预热样品的一部分(75μL)吸移至微型粘度计(Cambridge)。将该微型粘度计的温度设定为25℃并且测量样品的粘度。将预热样品的另一部分(20μL)吸移至10mL水中用于在85℃下在260nM下进行UV读数(Cary UV仪器)。结果呈现于表23中并且指示所有反义寡核苷酸溶液在上述标准下的粘度最佳。
表23
靶向人类GCGR的ISIS反义寡核苷酸的粘度和浓度
ISIS No. 基序 粘度(cP) 浓度(mg/mL)
398471 5-10-5 27 173
436140 5-10-5 6 162
448766 5-10-5 4 142
449884 3-10-4 4 145
459014 3-10-4 9 167
459032 3-10-4 7 154
459040 3-10-4 11 157
459157 5-10-6 5 144
实施例18：反义寡核苷酸在CD1小鼠肝脏中的药物动力学
用ISIS 449884处理CD1小鼠并且评估寡核苷酸半衰期以及寡核苷酸降解和从肝脏中消除的经过时间。
处理
向一组10只CD1小鼠皮下注射50mg/kg的ISIS 449884，每周两次，持续2周。在最后给药后第3天和第56天处死各五只小鼠的群组。采集肝脏用于分析。
寡核苷酸浓度的测量
测量全长寡核苷酸的浓度以及总寡核苷酸浓度(包括降解形式)。所用方法是先前公开方法(Leeds等人，1996；Geary等人，1999)的修改形式，其由苯酚-氯仿(液体-液体)萃取、接着固相萃取组成。在萃取之前添加内标(ISIS 355868，27聚体2′-O-甲氧基乙基修饰的硫代磷酸酯寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，本文指定为SEQ ID NO：119)。使用校准曲线计算组织样品浓度，其中定量下限(LLOQ)为约1.14μg/g。然后使用WinNonlin软件(PHARSIGHT)计算半衰期。
结果呈现于表24中，以μg/g肝脏组织表示。ISIS 449884的半衰期经计算为15.1天。
表24
在CD1小鼠的肝脏中ISIS 449884的寡核苷酸浓度
全长浓度(μg/g)
第3天 118.7
第56天 10.9
实施例19：靶向人类GCGR的ISIS反义寡核苷酸在食蟹猴中的影响
用选自实施例14-18中所述的研究的ISIS反义寡核苷酸处理食蟹猴。评估反义寡核苷酸功效和耐受性以及其在肝脏和肾脏中的药物动力学特征曲线。所测试的人类反义寡核苷酸也可与恒河猴基因组序列(本文指定为SEQ ID NO：3)交叉反应。人类寡核苷酸与恒河猴序列之间的互补性越大，则人类寡核苷酸可以与恒河猴序列交叉反应的可能性越大。SEQ ID NO：3的每一寡核苷酸的起始位点和终止位点呈现于表25中。“起始位点”指示在恒河猴基因序列中被缺口聚体靶向的5′最末端核苷酸。
表25
与SEQ ID NO：3互补的反义寡核苷酸
处理
在研究之前，使猴子保持隔离5周时间，在此期间每天观察动物的一般健康状况。所述猴子为2-3岁龄并且体重为2至5kg之间。使用具有适当尺寸的不锈钢给药针和注射器，在各具有五只随机分配的雄性食蟹猴的九个群组中向猴子的囊内区域和大腿外侧皮下注射ISIS寡核苷酸或PBS。向猴子给与40mg/kg的ISIS 325568、ISIS 398471、ISIS 436140、ISIS 448766、ISIS 449884、ISIS 459014、ISIS 459032、ISIS 459040或ISIS 459157，第一周为每周三四次(第1天、第3天、第5天以及第7天)作为负荷剂量，然后每周一次持续第2-13周。向具有8只食蟹猴的对照组皮下注射PBS，第一周为每周四次(第1天、第3天、第5天以及第7天)，然后每周一次持续第2-13周。
在研究期间，每天两次观察猴子的疾病或不适体征。在向研究主任咨询后由兽医人员用批准的镇痛剂或药剂来治疗由于治疗、损伤或疾病而经历不止瞬时或轻微疼痛或不适的任何动物以缓解疼痛。鉴定处于不良健康状况或处于可能的濒死状况的任何动物以用于进一步监测和可能的安乐死。例如，在第86天对来自用ISIS 436140处理的群组的一只动物实施安乐死，并且在第71天对来自用ISIS 459040处理的群组的一只动物实施安乐死。第93天在氯胺酮/甲苯噻嗪诱导的麻醉和施用戊巴比妥钠后通过放血实施预定的动物安乐死。实施例中所述的方案为实验动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care andUse Committee，IACUC)所批准。
肝靶标降低
RNA分析
第93天，从肝组织提取RNA，用于使用人类引物探针组RTS1508进行的GCGR的实时PCR分析。此外使用人类-恒河猴引物探针组RTS1479(正向序列ATCTCCTGCCCCTGGTACCT，本文指定为SEQ ID NO：120；反向序列GGTCCACGCACCCACTGA，本文指定为SEQ ID NO：121；探针序列ACCGCTTCGTGTTCAAGAGATGCG，本文指定为SEQ ID NO：122)进行了分析。以相对于PBS对照物并根据管家基因亲环蛋白标准化的GCGR mRNA抑制百分比呈现结果。在用标准化时获得类似的结果。如表26中所示，用ISIS反义寡核苷酸处理导致GCGR mRNA相比于PBS对照组显著降低。明确地说，用ISIS 449884处理导致GCGR mRNA表达的降低最显著。
表26
在食蟹猴肝脏中GCGR mRNA相对于PBS对照物的抑制百分比
胰高血糖素水平的分析
在给药之前以及在处理的第3周、第6周、第7周以及第10周测量血浆胰高血糖素水平。由于胰高血糖素水平基于动物体内应力水平而变化，因此在血液采样之前利用通过肌肉内注射递送的氯胺酮使猴子镇静。在采集之前使动物禁食整夜。从股静脉提取约1.8-2.0mL的血液并且放置在含有10μL/mL DPP-IV抑制剂和250KIU/mL抑肽酶的K2-EDTA管子中。将管子颠倒以混合血液与溶液，然后放置于冰水中。在血液采集30分钟内在4-8℃下使血样在3,000g下离心15分钟。
胰高血糖素水平增加是GCGR水平抑制的结果。使用自动化临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400e，纽约州梅尔维尔)测量胰高血糖素水平。结果呈现于表27中，并且指示通过反义寡核苷酸处理对胰高血糖素受体水平的抑制导致血浆胰高血糖素水平显著增加。明确地说，用ISIS 449884处理导致胰高血糖素水平以时间依赖性方式增加。
表27
在反义处理后食蟹猴肝脏中的胰高血糖素水平(pg/mL)
给药前 第3周 第6周 第7周 第10周
PBS 268 231 248 170 304
ISIS 325568 271 759 726 760 850
ISIS 398471 322 317 279 132 220
ISIS 448766 404 560 572 313 411
ISIS 449884 257 439 631 716 1018
ISIS 459014 348 281 245 122 180
ISIS 459157 369 471 486 538 828
耐受性研究
体重和器官重量测量
为了评估ISIS寡核苷酸对动物的总体健康状况的影响，在第93天测量体重和器官重量。测量体重并呈现于表28中。测量器官重量并且数据也呈现于表28中。结果指示用反义寡核苷酸处理对体重和器官重量的影响在反义寡核苷酸的预期范围内。明确地说，在猴子的体重和器官重量方面，用ISIS 448994处理是充分耐受的。
表28
食蟹猴中相对于给药前水平的最终体重和器官重量
体重(kg) 脾脏(g) 肾脏(g) 肝脏(g)
PBS 2.6 4 12 60
ISIS 325568 2.6 8 16 69
ISIS 398471 2.6 5 13 71
ISIS 436140 2.7 13 23 98
ISIS 448766 2.7 9 18 80
ISIS 449884 2.6 5 14 70
ISIS 459014 2.6 5 12 65
ISIS 459032 2.5 5 13 65
ISIS 459040 2.7 5 13 69
ISIS 459157 2.5 7 12 68
肝功能
为了评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，从所有研究群组中采集血样。在第95天(给药后48小时)通过股静脉穿刺采集血样。在采集血液之前使猴子禁食整夜。在含有K2-EDTA抗凝血剂的管子中采集血液，将所述管子离心以获得血浆。使用Toshiba 200FR NEO化学分析仪(日本东芝公司(Toshiba Co.，Japan))测量不同的肝功能标志物的水平。测量ALT和AST的血浆水平并且结果呈现于表29中，以IU/L表示。类似地测量胆红素(一种肝功能标志物)并且呈现于表29中，以mg/dL表示。结果指示反义寡核苷酸对肝功能无影响，超出了反义寡核苷酸的预期范围。明确地说，在猴子的肝功能方面，用ISIS 448994处理是充分耐受的。
表29
反义寡核苷酸处理对食蟹猴血浆中的肝功能标志物的影响
ALT(IU/L) AST(IU/L) 胆红素(mg/dL)
PBS 42 42 0.18
ISIS 325568 31 31 0.14
ISIS 398471 56 39 0.16
ISIS 448766 89 43 0.14
ISIS 449884 44 43 0.14
ISIS 459014 24 39 0.16
ISIS 459157 47 34 0.18
肾功能
为了评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，从所有研究群组中采集血样。在第95天(给药后48小时)通过股静脉穿刺采集血样。在采集血液之前使猴子禁食整夜。在含有K2-EDTA抗凝血剂的管子中采集血液，将所述管子离心以获得血浆。使用Toshiba 200FR NEO化学分析仪(日本东芝公司)测量BUN和肌酐的水平。结果呈现于表30中，以mg/dL表示。
血浆化学数据指示，大部分ISIS寡核苷酸对肾功能不具有任何影响，超出了反义寡核苷酸的预期范围。明确地说，在猴子的肾功能方面，用ISIS 449884处理是充分耐受的。
表30
在食蟹猴中反义寡核苷酸处理对血浆BUN和肌酐水平(mg/dL)的影响
血液学
为了评估ISIS寡核苷酸在食蟹猴中对血液学参数的任何影响，在第11周从可用研究动物中的每一者采集约1.3mL血液的血样于含有K2-EDTA的管子中。使用ADVIA120血液分析仪(美国拜耳公司(Bayer，USA))，分析样本的红血细胞(RBC)计数、白血细胞(WBC)计数、单独的白血细胞计数(例如单核细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞的计数)以及血小板计数、血红蛋白含量以及红细胞比容。数据呈现于表31和表32中。
数据指示寡核苷酸在这个剂量下对血液学参数未造成任何改变，超出了反义寡核苷酸的预期范围。明确地说，在猴子的血液学参数方面，用ISIS 448994处理是充分耐受的。
表31
食蟹猴中反义寡核苷酸处理对不同的血细胞的影响
表32
食蟹猴中反义寡核苷酸处理对血液学参数的影响
血红蛋白(g/dL) HCT(％)
PBS 13.1 43
ISIS 398471 13.1 44
ISIS 448766 12.3 41
ISIS 449884 12.6 41
ISIS 459014 13.2 44
ISIS 459157 13.2 43
ISIS 325568 13.3 44
总而言之，研究结果指示ISIS 449884是那些被测试用于抑制胰高血糖素受体中最有效并充分耐受的化合物并且是用于治疗代谢疾病如糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗和胰岛素缺乏的重要候选物。

Claims (20)

1.一种化合物，其包含单链修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸由SEQ ID NO:11的核碱基序列组成，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5'侧翼区段；
由四个连接的核苷组成的3'侧翼区段；
其中所述缺口区段定位于所述5'侧翼区段与所述3'侧翼区段之间，其中每一侧翼区段的每个核苷包含2'-O-甲氧基乙基修饰的糖，其中所述修饰寡核苷酸的每一核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中所述修饰寡核苷酸的每一胞苷残基是5-甲基胞嘧啶。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是缀合的。
3.一种组合物，其包含根据权利要求1或2中所述的化合物以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物或组合物在制备用于预防、治疗、改善或减缓糖尿病的进展的药物中的用途，其中所述药物向动物施用。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述动物是人类。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述糖尿病是2型糖尿病。
7.根据权利要求1或2所述的化合物在制备用于降低动物体内的血糖水平的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述动物是人类。
9.根据权利要求7所述的用途，其中所述血糖水平是血浆葡萄糖水平或血清葡萄糖水平。
10.根据权利要求7所述的用途，其中所述动物是糖尿病动物。
11.根据权利要求1或2所述的化合物在制备用于预防或延迟动物体内与GCGR相关的疾病或病状的发作的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述动物是人类。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述疾病或病状是糖尿病。
14.根据权利要求11所述的用途，其中所述疾病或病状是2型糖尿病。
15.根据权利要求1或2所述的化合物在制备用于预防或延迟动物体内血糖水平增加的发作的药物中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述动物是人类。
17.根据权利要求15所述的用途，其中所述血糖水平是血浆葡萄糖水平或血清葡萄糖水平。
18.根据权利要求15所述的用途，其中所述动物是糖尿病动物。
19.根据权利要求15所述的用途，其中所述药物可以用于一种方法，所述方法包括共同施用所述药物与第二剂。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述药物与所述第二剂是同时施用的。
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