RU2768699C2 - МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ УРОВНЯ мРНК PAPD5 ИЛИ PAPD7 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОГО ГЕПАТИТА В - Google Patents

МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ УРОВНЯ мРНК PAPD5 ИЛИ PAPD7 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОГО ГЕПАТИТА В Download PDF

Info

Publication number
RU2768699C2
RU2768699C2 RU2019100094A RU2019100094A RU2768699C2 RU 2768699 C2 RU2768699 C2 RU 2768699C2 RU 2019100094 A RU2019100094 A RU 2019100094A RU 2019100094 A RU2019100094 A RU 2019100094A RU 2768699 C2 RU2768699 C2 RU 2768699C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
nucleic acid
papd5
papd7
oligonucleotide
hbv
Prior art date
Application number
RU2019100094A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2019100094A (ru
RU2019100094A3 (ru
Inventor
Хассан ЯВАНБАКХТ
Хенрик МЮЛЛЕР
Сёрен Оттосен
Люкке ПЕДЕРСЕН
Original Assignee
Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Publication of RU2019100094A publication Critical patent/RU2019100094A/ru
Publication of RU2019100094A3 publication Critical patent/RU2019100094A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2768699C2 publication Critical patent/RU2768699C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/91245—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • G01N2333/9125—Nucleotidyltransferases (2.7.7) with a definite EC number (2.7.7.-)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ лечения или предупреждения инфекции вируса гепатита В (HBV) у субъекта. Способ включает введение эффективного количества композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты и фармацевтически приемлемый носитель, где указанная молекула нуклеиновой кислоты непосредственно ингибирует экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени поли(А)-полимераза-ассоциированного доменсодержащего 5 (PAPD5). В одном из вариантов реализации изобретения нуклеиновая кислота-мишень содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения инфекции вируса гепатита В. 13 з.п. ф-лы, 11 ил., 22 табл., 9 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу идентификации соединения, которое предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию вирусом гепатита В (HBV), где соединение, которое уменьшает экспрессию и/или активность РАР-ассоциированного доменсодержащего 5 (PAPD5) или РАР-ассоциированного доменсодержащего 7 (PAPD7), идентифицируется как соединение, которое предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV. Согласно данному изобретению также предложены ингибиторы PAPD5 или PAPD7 для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV. В частности, согласно настоящему изобретению идентифицированы молекулы нуклеиновых кислот, такие как антисмысловые олигонуклеотиды или агенты на основе РНКи (молекула РНК-интерференции), в качестве ингибиторов PAPD5 или PAPD7, а также их комбинированный препарат, содержащий ингибитор PAPD5 и ингибитор PAPD7, для одновременного или последовательного применения в лечении или предупреждении инфекции HBV. Также настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV, и способ отслеживания терапевтического успеха во время лечения инфекции HBV.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Вирус гепатита В (HBV) представляет собой оболочечный, частично двухцепочечный ДНК-вирус. Компактный геном HBV из 3,2 т.п.н. состоит из четырех перекрывающихся открытых рамок считывания (ORF), которые кодируют коровые, полимеразные (Pol), оболочечные и Х-белки. ORF Pol является самой длинной, a ORF оболочки располагается внутри нее, тогда как ORF X и кора перекрываются с ORF Pol. Жизненный цикл HBV имеет два главных события: 1) образование замкнутой кольцевой ДНК (зкДНК) из релаксированной кольцевой (РК ДНК) и 2) обратная транскрипция предгеномной РНК (пгРНК) с образованием РК ДНК. До инфекции клеток-хозяев геном HBV существует в пределах вириона в виде РК ДНК. Определили то, что вирионы HBV способны получать доступ в клетки-хозяева посредством неспецифичного связывания с отрицательно заряженными протеогликанами, присутствущими на поверхности человеческих гепатоцитов (Schulze, Hepatology, 46, (2007), 1759-68), и посредством специфичного связывания антигенов поверхности HBV (HBsAg) с гепатоцитарным рецептором на основе натрий-таурохолатного котранспортирующего полипептида (NTCP) (Yan, J Virol, 87, (2013), 7977-91). Для контроля вирусной инфекции необходимо точное наблюдение за врожденной иммунной системой хозяина, которая могла бы отвечать в пределах минут-часов после инфекции для влияния на исходный рост вируса и ограничения хронической и стойкой инфекции. Несмотря на доступные в настоящее время лечения на основе IFN (интерферон) и нуклеоз(т)идных аналогов, инфекция HBV остается важной проблемой для здоровья во всем мире, которая оценочно касается 350 миллионов хронических носителей, которые имеют высокий риск цирроза печени и печеночно-клеточной карциномы.
Секреция противовирусных цитокинов в ответ на инфекцию HBV гепатоцитами и/или внутрипеченочными иммунными клетками играет центральную роль в клиренсе вируса инфицированной печенью. Однако хронически инфицированные пациенты демонстрируют только слабый иммунный ответ из-за разных стратегий избегания, принятых вирусом для противодействия системам распознавания клетки-хозяина и последующим противовирусным ответам.
Многие наблюдения показали то, что несколько вирусных белков HBV могли противодействовать исходному клеточному ответу хозяина, препятствуя системе сигнализации распознавания вируса и затем противовирусной активности интерферона (IFN). Полагают то, что среди них избыточная секреция пустых субвирусных частиц HBV (SVP, HBsAg) участвует в поддержании иммунотолерантного состояния, наблюдаемого у хронически инфицированных пациентов (СНВ). Стойкое воздействие HBsAg и других вирусных антигенов может приводить к HBV-специфичному устранению Т-клеток или к прогрессирующему функциональному ухудшению (Kondo, Journal of Immunology (1993), 150, 4659-4671; Kondo, Journal of Medical Virology (2004), 74, 425-433; Fisicaro, Gastroenterology, (2010), 138, 682-93). Кроме того, сообщали о том, что HBsAg подавляет функцию иммунных клеток, таких как моноциты, дендритные клетки (DC) и клетки-природные киллеры (NK) посредством прямого взаимодействия (Op den Brouw, Immunology, (2009b), 126, 280-9; Woltman, PLoS One, (2011), 6, e15324; Shi, J Viral Hepat. (2012), 19, e26-33; Kondo, ISRN Gasteroenterology, (2013), Article ID 935295).
Количественное измерение HBsAg является значимым биомаркером для прогнозирования и ответа на лечение при хроническом гепатите В. Однако достижение потери HBsAg и сероковерсии редко наблюдается у хронически инфицированных пациентов, но является одной из конечных целей терапии. Современной терапией, такой как нуклеоз(т)идные аналоги, являются молекулы, которые ингибируют синтез ДНК HBV, но не направлены на уменьшение уровня HBsAg. Нуклеоз(т)идные аналоги, даже при длительной терапии, демонстрируют лишь слабый клиренс HBsAg, сравнимый с клиренсом, наблюдаемым в природе (от 1% до 2%) (Janssen, Lancet, (2005), 365, 123-9; Marcellin, N. Engl. J. Med., (2004), 351, 1206-17; Buster, Hepatology, (2007), 46, 388-94).
е-Антиген вируса гепатита В (также именуемый антиген оболочки HBV или HBeAg) представляет собой вирусный белок, который секретируется клетками, инфицированными гепатитом В. HBeAg ассоциирован с хроническими инфекциями гепатитом В и используется в качестве маркера активного вирусного заболевания и степени зараженности пациента.
Функция пред кора вируса гепатита В или HBeAg не полностью известна. Однако хорошо известно то, что HBeAg играет ключевую роль в стойкости вируса. Полагают то, что HBeAg стимулирует хроничность HBV посредством функционирования в качестве иммунорегулирующего белка. В частности, HBeAg представляет собой секретируемый вспомогательный белок, который, по-видимому, ослабляет иммунный ответ хозяина на внутриклеточный белок нуклеокапсида (Walsh, Virology, 2011, 411 (1): 132-141). HBeAg действует в качестве иммунотолеогена, способствующего стойкости HBV, и возможно функционирует во время внутриутробного развития, принимая во внимание то, что растворимый HBeAg проходит через плаценту (Walsh, Virology, 2011, 411 (1): 132-141). Кроме того, HBeAg осуществляет понижающую регуляцию: i) клеточных генов, контролирующих внутриклеточную сигнализацию; и ii) Toll-подобного рецептора 2 (TLR-2) для глушения врожденного иммунного ответа на вирусную инфекцию (Walsh, Virology, 2011, 411 (1): 132-141). В отсутствие HBeAg репликация HBV ассоциирована с повышающей регуляцией пути TLR2 (Walsh, Virology, 2011, 411(1): 132-141). Соответственно, HBeAg имеет значительную роль в модулировании взаимодействий вирус/хозяин для влияния на иммунный ответ хозяина (Walsh, Virology, 2011, 411 (1): 132-141). Таким образом, уменьшение HBeAg в HBeAg-позитивной популяции пациентов может приводить к обращению HBV-специфичной иммунодисфункции (Milich, 1997, J. Viral. Hep. 4: 48-59; Milich, 1998, J. Immunol. 160: 2013-2021). Кроме того, секретируемый HBeAg является значительно более эффективным, чем внутриклеточный коровый антиген гепатита (HBeAg) в вызове толерантности Т-клеток, и разделение толерантности Т-клеток между HBeAg и HBcAg, и клональная гетерогенность НВс/HBeAg-специфичной толерантности Т-клеток могут иметь значительные последствия для природной инфекции HBV и особенно для предкор-негативного хронического гепатита (Chen, 2005, Journal of Virology, 79: 3016-3027).
Соответственно, уменьшение секреции HBeAg, помимо секреции HBsAg, приводило бы к улучшенному ингибированию развития хронической инфекции HBV по сравнению с ингибированием секреции одного HBsAg. Кроме того, наивысшие показатели перехода острой инфекции в хроническую (больше 80%) были описаны в случаях передачи от матери к плоду и неонатальной передачи HBV от HBeAg-позитивных матерей (Liaw, Lancet, 2009, 373: 582-592; Liaw, Dig. Dis. Sci., 2010, 55: 2727-2734 и Hadziyannis, 2011, Journal of hepatology, 55: 183-191). Следовательно, уменьшение уровня HBeAg у будущей матери может не только уменьшать степень зараженности пациента, но также может ингибировать развитие хронической инфекции HBV ее ребенка.
Следовательно, при терапии HBV имеется неудовлетворенная медицинская потребность в ингибировании вирусной экспрессии, в частности, в ингибировании секреции HBsAg и HBeAg (Wieland, S.F. & F.V. Chisari. J Virol, (2005), 79, 9369-80; Kumar et al. J Virol, (2011), 85, 987-95; Woltman et al. PLoS One, (2011), 6, e15324; Op den Brouw et al. Immunology, (2009b), 126, 280-9).
В WO 03/022987, например, в Таблице 7A, раскрыты 1298 генов, которые подвергаются повышающей регуляции в ткани, позитивной в отношении гепатита С. Одним из упомянутых генов является белок 4 с функцией, связанной с топоизомеразой (TRF4, AF089897). AF089897 также называется TRF4-2, который является весьма сходным с положениями 880-2340 SEQ ID NO: 4, приведенными в настоящей заявке. Наблюдение того, что фрагмент PAPD5 подвергается легкой повышающей регуляции в клетках, позитивных в отношении гепатита С, не дает какого-либо указания на то, что ингибирование PAPD5 представляет эффективную терапию. В WO 03/022987 А2 не раскрыт какой-либо намек на то, что фрагменты PAPD5 вообще играют какую-либо критическую роль во время инфекции гепатитом С. Кроме того, HCV и HBV представляют собой два совершенно разных вируса, приводящих к двум совершенно разным заболеваниям с разными этиологиями, разным прогрессированием и разными применяемыми лекарственными средствами. Это согласуется с наблюдением авторов настоящего изобретения о том, что ингибиторы PAPD5 и PAPD7 - DHQ и ТНР - не являются активными против вируса гепатита С (HCV) или других вирусов, помимо HBV (данные не показаны).
В WO 2010/040571 PAPD5 был предложен в длинном списке других генов, как имеющий потенциальную роль в пролиферации клеток при метаболическом и опухолевом заболевании без предоставления какого-либо действительного доказательства.
В WO 2013/166264 PAPD5 был предложен в длинном списке других генов, как имеющий потенциальную роль в увеличении репликации вирусов без предоставления какого-либо действительного доказательства.
В WO 2017/066712 была описана понижающая регуляция PAPD5 в связи с лечением и диагностикой заболеваний теломеров. С этой целью были описаны пять структур кшРНК (короткая шпилечная РНК).
Насколько известно авторам изобретения, PAPD5 или PAPD7 никогда не были ассоциированы с инфекцией HBV, и модифицированные одноцепочечные антисмысловые олигонуклеотиды никогда не делали против данных мишеней.
ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Таким образом, технической проблемой, лежащей в основе настоящего изобретения, является идентификация и предоставление улучшенных средств и способов лечения и/или предупреждения инфекции HBV.
Данная техническая проблема решается посредством предоставления воплощений, описанных в данном документе и охарактеризованных в формуле изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Данные графические материалы показывают:
Фиг. 1: иллюстрации из эксперимента 1-1 с химическими зондами НВХ129653/НВХ129654 и 3 фрагментами «добычи».
Фиг. 2: иллюстрации из эксперимента 1-1 с химическими зондами НВХ129653/НВХ129654 и полноразмерными белками PAPD5/7.
Фиг. 3: иллюстрации из конкурентного анализа с использованием НВХ129653 (DHQ) и MOL653/654 для конкуренции.
Фиг. 4: иллюстрации из конкурентного анализа с использованием НВХ129654 (ТНР) и MOL653/654 для конкуренции.
Фиг.5: иллюстрации из конкурентного анализа с использованием НВХ129653 (DHQ) и INACT653/INACT654 для конкуренции. MOL653 был включен в качестве позитивного контроля.
Фиг. 6: иллюстрации из конкурентного анализа с использованием НВХ129654 (ТНР) и INACT653/INACT654 для конкуренции. MOL653 был включен в качестве позитивного контроля.
Фиг. 7: (А) Нокдаун (KD) посредством миРНК (малая интерферирующая РНК) PAPD5 и PAPD7 в инфицированных HBV dHepaRG приводит к уменьшению экспрессии HBV. Дифференцированные клетки HepaRG инфицировали HBV и обрабатывали миРНК против одного из PAPD5, PAPD7 или обоих (25 нМ каждая) за одни сутки до инфекции HBV и в сутки 4 после инфекции. Супернатант отбирали в сутки 11, уровни HBsAg и HBeAg, секретированных в супернатант, измеряли посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) и нормировали к необработанному контролю. Затем измеряли клеточную токсичность и ингибирование экспрессии генов и также нормировали к необработанному контролю. (Б) Проводили такой же эксперимент, как и описанный в (А), за исключением того, что измеряли только уровень HBsAg, секретированного в супернатант.
Фиг. 8: представление способности олигонуклеотидов, протестированных в Примере 4, уменьшать экспрессию PAPD5 в культурах клеток HeLa. Каждый олигонуклеотид представлен точкой, указывающей его место на мРНК PAPD5 по положению на хромосоме. Концентрации олигонуклеотидов составляли 5 и 25 микроМ, как указано на правой стороне каждого графика.
Фиг. 9: представление способности олигонуклеотидов, протестированных в Примере 5, уменьшать экспрессию PAPD7 в культурах клеток HeLa. Каждый олигонуклеотид представлен точкой, указывающей его место на мРНК PAPD7 по положению на хромосоме. Концентрации олигонуклеотидов составляли 5 и 25 микроМ, как указано на правой стороне каждого графика.
Фиг. 10: представление ингибирования HBsAg в инфицированных HBV клетках HepaRG с использованием комбинаций олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5 и PAPD7 (20 мкМ каждого), по сравнению с ингибированием, полученным с использованием одного олигонуклеотида (20 мкМ), присутствующего в комбинации. Данный анализ проводили с использованием гимнозиса (gymnosis).
Фиг. 11: представление ингибирования HBsAg в инфицированных HBV клетках HepaRG с использованием комбинаций олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5 и PAPD7 (500 нМ каждого), по сравнению с ингибированием, полученным с использованием одного олигонуклеотида (500 нМ) из комбинации. Данный анализ проводили с использованием трансфекции.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Один аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, для применения в лечении и/или предупреждении инфекции вирусом гепатита В, где указанная молекула нуклеиновой кислоты ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5. В частности, композиция, содержащая комбинированный препарат молекулы нуклеиновой кислоты, ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5, а другая молекула нуклеиновой кислоты ингибирует экспрессию и/или активность PAPD7, для применения в лечении и/или предупреждении инфекции вирусом гепатита В.
Другой аспект настоящего изобретения относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые ингибируют экспрессию и/или активность PAPD7, в частности, к одноцепочечным антисмысловым молекулам миРНК и кшРНК.
Другой аспект настоящего изобретения относится к одноцепочечным антисмысловым олигонуклеотидам, которые ингибируют экспрессию и/или активность PAPD5, в частности, к модифицированным антисмысловым олигонуклеотидам, содержащим олигонуклеотид, модифицированный 2'-сахаром, и фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.
Другими аспектами данного изобретения являются конъюгаты молекул нуклеиновых кислот по изобретению, комбинированные препараты молекул нуклеиновых кислот, способные к ингибированию экспрессии и/или активности и PAPD5, и PAPD7, и фармацевтические композиции, содержащие молекулы по изобретению.
Другим аспектом изобретения является способ идентификации соединения или композиции, которая предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию вирусом гепатита В (HBV), включающий:
а. приведение в контакт тестируемого соединения или композиции с клеткой, экспрессирующей PAPD5 и/или PAPD7;
б. измерение экспрессии и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в присутствии и в отсутствие указанного тестируемого соединения или композиции; и
в. идентификацию соединения или композиции, которая уменьшает экспрессию и/или активность PAPD5 и/или PAPD7, в качестве соединения, которое предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
PAPD5 и PAPD7 представляют собой неканонические поли(А)-полимеразы, которые принадлежат к надсемейству нуклеотидилтрансфераз, подобных полимеразе β. В контексте настоящего изобретения неожиданно было показано то, что соединение, которое является полезным для терапевтического вмешательства в течение инфекции HBV, можно успешно идентифицировать посредством проведения анализа того, ингибирует ли тестируемое соединение PAPD5 или PAPD7. Или, другими словами, ингибирование PAPD5 или PAPD7, или ингибирование и того, и другого было идентифицировано в приложенных примерах как являющееся индикатором эффективности соединения по ингибированию инфекции HBV. В приложенных примерах продемонстрировано то, что дигидрохинолизиноновое соединение, имеющее формулу (III), показанное в разделе Материалы и Методы, именуемое в данном документе DHQ, и тетрагидропиридопиримидиновое соединение, имеющее формулу (IV), как показано в разделе Материалы и Методы, именуемое в данном документе ТНР, связываются с полипептидами PAPD5 или PAPD7 (SEQ ID NO: 1 и 2 соответственно). Данные соединения имеют способность ингибировать продукцию антигена поверхности HBV (HBsAg) и экспрессию РНК HBV во время инфекции HBV (WO 2015/113990 А1 и WO 2016/177655). Кроме того, в приложенных примерах показано то, что ингибирование PAPD5 или PAPD7, или и того, и другого, посредством применения пулов миРНК приводит к ингибированию вирусной экспрессии, особенно секреции HBsAg и HBeAg, а также продукции внутриклеточной мРНК HBV. Данные результаты прямо показывают то, что посредством уменьшения количества и/или активности (например, количества) PAPD5 и/или PAPD7 можно предупреждать или лечить (т.е. уменьшать интенсивность и/или ингибировать) инфекцию HBV (например, хроническую инфекцию HBV).
Способы скрининга по изобретению
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу скрининга, в котором идентифицируется соединение, которое уменьшает экспрессию и/или активность (например, экспрессию) PAPD5 или PAPD7 (или комбинации соединений, которые уменьшают уровень PAPD5 и PAPD7), в качестве соединения, которое предупреждает и/или лечит (т.е. уменьшает интенсивность и/или ингибирует) инфекцию HBV. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения данное соединение представляет собой молекулу РНКи (интерферирующая РНК), в частности, молекулу нуклеиновой кислоты, такую как миРНК, кшРНК или антисмысловой олигонуклеотид. С использованием способа скрининга по изобретению 240 антисмысловых олигонуклеотидов, модифицированных LNA (запертая нуклеиновая кислота), нацеленных на мРНК либо PAPD5, либо PAPD7, было подвергнуто скринингу на их способность уменьшать экспрессию PAPD5 или PAPD7, или и того, и другого, используя комбинации соединений. Некоторые из них были дополнительно протестированы для подтверждения их способности уменьшать интенивность и/или ингибировать инфекцию HBV либо одни, либо в комбинации.
Одним аспектом данного изобретения является способ идентификации соединения или композиции, которая предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию вирусом гепатита В (HBV), включающий:
а) приведение в контакт тестируемого соединения с клеткой, экспрессирующей РАР-ассоциированный доменсодержащий 5 (PAPD5), и/или РАР-ассоциированный доменсодержащий 7 (PAPD7);
б) измерение экспрессии и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в присутствии и в отсутствие указанного тестируемого соединения или композиции; и
в) идентификация соединения, которое уменьшает экспрессию и/или активность PAPD5 и PAPD7, в качестве соединения или композиции, которая предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV; возможно
г) проведение анализа комбинаций соединений для уменьшения экспрессии и/или активности PAPD5 и PAPD7.
В контексте настоящего изобретения было обнаружено то, что соединение (или композиция), которая уменьшает уровень PAPD5 или PAPD7, или комбинации соединений, которые уменьшают PAPD5 и PAPD7 в комбинации, приводит к ингибированию экспрессии и репликации генов HBV; и, таким образом, предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV. Такое соединение может приводить к уменьшению экспрессии и/или активности PAPD5 или PAPD7 на 10-100%, предпочтительно 20-100%, более предпочтительно 30-100%, даже более предпочтительно 40-100%, даже более предпочтительно 50-100%, даже более предпочтительно 60-100%, даже более предпочтительно 70-100%, даже более предпочтительно 80-100% и наиболее предпочтительно на 90-100%.
В предложенном в данном документе способе скрининга рассматривается то, что измеряется экспрессия PAPD5 и/или PAPD7 (т.е. анализируется/определяется) посредством применения на стадии (а) клетки, экспрессирующей PAPD5 и/или PAPD7, такой как линия клеток HeLa или HepaRG. Экспрессию и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 можно измерять (т.е. анализировать/определять) либо (i) определяя полипептид PAPD5 и/или PAPD7; либо (ii) определяя уровни транскрипта в клетке, экспрессирующей PAPD5 и/или PAPD7.
В одном аспекте изобретения соединение, которое уменьшает экспрессию PAPD5 или PAPD7 (например, PAPD5 или предпочтительно комбинации соединений, которые снижают уровень и PAPD5, и PAPD7), идентифицируется как соединение(ния), которое(рые) предупреждает(ют), уменьшает(ют) интенсивность и/или ингибирует(ют) (например, лечит(чат)) инфекцию HBV. В другом аспекте изобретения соединение, которое уменьшает активность полипептида PAPD5 или PAPD7 (например, PAPD5 или, предпочтительно, комбинации соединений, которые снижают уровень и PAPD5, и PAPD7), идентифицируется как соединение(ния), которое(рые) предупреждает(ют), уменьшает(ют) интенсивность и/или ингибирует(ют) (например, лечит(чат)) инфекцию HBV. Приоритетным является то, что соединение, которое уменьшает экспрессию и/или активность PAPD5 или комбинации соединений, которые уменьшают уровень обеих молекул - PAPD5 и PAPD7 - идентифицируется как соединения, которые предупреждют, уменьшают интенсивность и/или ингибируют инфекцию HBV. Наиболее предпочтительно комбинация соединений, которая уменьшает экспрессию и/или активность обеих молекул - PAPD5 и PAPD7 - идентифицируется как композиция, которая предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV.
Вышеописанный способ скрининга приводит к идентификации соединения или комбинации соединений, которая предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV. Приоритетным является то, что указанные соединения уменьшают интенсивность и/или ингибируют (т.е. лечат) инфекцию HBV. Таким образом, предложенный в данном документе способ скрининга является полезным в идентификации соединения, которое лечит инфекцию HBV.
В контексте настоящего изобретения PAPD5 может представлять собой полипептид PAPD5 или мРНК PAPD5. Приоритетным является то, что в контексте способов скрининга, предложенных в данном документе, PAPD5 представляет собой мРНК PAPD5.
Один аспект настоящего изобретения относится к предложенному в данном документе способу скрининга, в котором клетки, экспрессирующие PAPD5, содержат нуклеиновую кислоту-мишень PAPD5, содержащую или состоящую из:
(i) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2;
(ii) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, 5 или 10, или ее природных вариантов;
(iii) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1 или 2, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы;
(iv) нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью (ii), где полипептид, экспрессируемый от нуклеотидной последовательности, имеет функцию поли-А полимеразы;
(v) нуклеотидной последовательности, кодирующей ферментативно активный фрагмент SEQ ID NO: 1 или 2, такой как нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO: 7 или 8;
(vi) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью ферментативно активного фрагмента SEQ ID NO: 1 или 2, такой как SEQ ID NO: 7 или 8, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы; или
(vii) нуклеотидной последовательности, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 4, 5 или 10.
В предпочтительных воплощениях нуклеиновая кислота-мишень PAPD5 представляет собой мРНК, такую как пре-мРНК или зрелую мРНК. В других воплощениях нуклеиновая кислота-мишень PAPD5 представляет собой полинуклеотид, содержащий или состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, 5 или 10, или ее природных вариантов. Однако мРНК PAPD5 также может представлять собой полинуклеотид, содержащий или состоящий из нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с SEQ ID NO: 4, 5 или 10, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы.
В контексте настоящего изобретения PAPD7 может представлять собой полипептид PAPD7 или мРНК PAPD7. Приоритетным в контексте способов скрининга, предложенных в данном документе, является то, что PAPD7 представляет собой мРНК PAPD7.
Один аспект настоящего изобретения относится к предложенным в данном документе способам скрининга, в которых клетки, экспрессирующие PAPD7, содержат нуклеиновую кислоту-мишень PAPD7, содержащую или состоящую из:
(i) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;
(ii) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6 или 11, или ее природных вариантов;
(iii) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с SEQ ID NO: 3, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы;
(iv) нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью (ii), где полипептид, экспрессируемый от последовательности нуклеиновой кислоты, имеет функцию поли-А полимеразы;
(v) нуклеотидной последовательности, кодирующей ферментативно активный фрагмент SEQ ID NO: 3, такой как нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO: 9; или
(vi) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью ферментативно активного фрагмента SEQ ID NO: 3, такой как SEQ ID NO: 9, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы; или
(vii) нуклеотидной последовательности, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 6 или 11.
В предпочтительных воплощениях нуклеиновая кислота-мишень PAPD7 представляет собой мРНК, такую как пре-мРНК или зрелая мРНК. В других воплощениях нуклеиновая кислота-мишень PAPD7 представляет собой полинуклеотид, содержащий или состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6 или 11, или ее природных вариантов. Однако мРНК PAPD7 также может представлять собой полинуклеотид, содержащий или состоящий из нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с SEQ ID NO: 6 или 11, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы.
В контексте настоящего изобретения клетка, используемая для скрининга, может представлять собой эукариотическую клетку. Например, указанная клетка может представлять собой дрожжевую клетку или клетку позвоночного. Клетки позвоночных включают клетки рыб, птиц, рептилий, амфибий, сумчатых и млекопитающих. Предпочтительно клетка представляет собой клетку млекопитающего, наиболее предпочтительно - человеческую клетку. Клетки млекопитающих также включают клетки кошек, собак, крупного рогатого скота, лошадей, коз, овец, свиней, мышиных, таких как мышь и крыса, и кроликов. В способах скрининга, предложенных в данном документе, «клетка» может эндогенно экспрессировать PAPD5 и/или PAPD7, или сверхэкспрессировать PAPD5 и/или PAPD7. Для сверхэкспрессии PAPD5 и/или PAPD7 клетка может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид PAPD5 и/или полипептид PAPD7 в пределах экспрессионного вектора. В предпочтительных воплощениях клетка содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид PAPD5, и нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид PAPD7. Клетка по предложенным в данном документе способам скрининга может содержаться в животном, не являющемся человеком, например, в мыши, крысе, кролике или хорьке. Клетки, предложенные для способа скрининга, описанного в данном документе, также могут называться клетками-мишенями.
В предложенном в данном документе способе скрининга, где измеряется активность полипептида PAPD5 и/или полипептида PAPD7, указанная активность PAPD5 и PAPD7 предпочтительно представляет собой функцию поли-А полимеразы (т.е. активность поли-А полимеразы). Функцию/активность полипептида поли-А полимеразы (например, PAPD5 или PAPD7) можно измерять, например, отслеживанием полиаденилирования мРНК in vitro, например, как описано в Rammelt, RNA, 2011, 17:1737-1746. Данный способ также можно использовать для измерения функции поли-А полимеразы PAPD5 и/или PAPD7 в присутствии и в отсутствие тестируемого соединения. Вкратце, рибоолигонуклеотид А15 можно инкубировать с рекомбинантным белком PAPD5, экспрессируемым в Escherichia coli в присутствии АТР(А), СТР (С), GTP(G), UTP(U) или смеси всех четырех dNTP соответственно.
Экспрессию PAPD5 и/или PAPD7 в клетке в присутствии и в отсутствие тестируемого соединения можно измерять, например, с использованием (к)ПЦР, вестерн-блоттинга или масс-спектрометрии.
Соединение, которое ингибирует размножение HBV, может представлять собой соединение, которое уменьшает экспрессию вирусной РНК, которое уменьшает продукцию вирусной ДНК (ДНК HBV), происходящей от вирусной РНК (РНК HBV), которое уменьшает продукцию новых вирусных частиц (частиц HBV), и/или которое уменьшает продукцию и/или секрецию HBsAg и/или HBeAg. Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к предложенным в данном документе способам скрининга, в которых соединение, которое ингибирует размножение HBV, ингибирует секрецию HBsAg, ингибирует секрецию HBeAg и/или ингибирует продукцию внутриклеточной мРНК HBV или ДНК HBV. Предпочтительно соединение, которое ингибирует размножение HBV, представляет собой соединение, которое ингибирует секрецию HBsAg, секрецию HBeAg и продукцию внутриклеточной мРНК HBV или ДНК HBV.
Например, соединение, которое ингибирует размножение HBV, может уменьшать экспрессию вирусной РНК (РНК HBV), продукцию вирусной ДНК (ДНК HBV), происходящей от вирусной РНК, продукцию новых вирусных частиц (частиц HBV), продукцию и/или секрецию HBsAg и/или HBeAg на 10-100%, предпочтительно на 20-100%, более предпочтительно на 30-100%, даже более предпочтительно на 40-100%, даже более предпочтительно на 50-100%, даже более предпочтительно на 60-100%, даже более предпочтительно на 70-100%, даже более предпочтительно на 80-100% и наиболее предпочтительно на 90-100% по сравнению с необработанными клетками или животными, или клетками или животными, обработанными подходящим контролем.
Ингибирование размножения HBV можно измерять, например, измерением того, имеет ли тестируемое соединение активность по ингибированию секреции HBsAg и/или HBeAg, или по ингибированию продукции мРНК HBV или ДНК HBV. Ингибирование секреции HBsAg и/или HBeAg можно измерять ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), например, посредством применения набора CLIA ELISA (Autobio Diagnostic) согласно инструкциям изготовителей. Ингибирование продукции внутриклеточной мРНК HBV можно измерять ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени, например, как описано в приложенных примерах. Дополнительными способами для оценки того, ингибирует ли тестируемое соединение размножение HBV, являются измерение секреции ДНК HBV посредством кПЦР-ОТ (количественная полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией), например, как описано в WO 2015/173208, или как описано в приложенных примерах; норзерн-блоттинг; гибридизация in situ или иммунофлуоресценция.
Предложенные в данном документе способы скрининга могут дополнительно включать стадию сравнения тестируемого соединения с контролем. Указанным контролем может быть неактивное тестируемое соединение, где указанное неактивное тестируемое соединение представляет собой соединение, которое не уменьшает экспрессию и/или активность PAPD5 и PAPD7.
Это неактивное тестируемое соединение не имеет активности против HBV, например, оно не приводит к ингибированию секреции HBsAg и HBeAg, и к ингибированию продукции внутриклеточной мРНК HBV. Например, неактивное тестируемое соединение может иметь значение IC50 (полумаксимальная ингибирующая концентрация) при ингибировании HBsAg более чем 6 мкМ. В предложенном в данном документе способе скрининга неактивное тестируемое соединение может представлять собой ненацеленный антисмысловой олигонуклеотид, миРНК или кшРНК. В способе скрининга, в котором измеряется экспрессия и/или активность PAPD5 и/или PAPD7, может использоваться тестируемое соединение, как определено выше в (i). Неактивное соединение может быть разработано из активного соединения, например, посредством химической модификации и/или функционального нарушения.
Для проведения предложенных в данном документе способов скрининга можно использовать общедоступные или коммерчески доступные библиотеки молекул. Таким образом, в контексте данного изобретения указанное тестируемое соединение может представлять собой подвергаемую скринингу библиотеку молекул нуклеиновых кислот, выбранных из:
(i) одноцепочечных антисмысловых олигонуклеотидов, предпочтительно содержащих по меньшей мере один 2'-модифицированный нуклеозид; или
(ii) молекул миРНК; или
(iii) молекул кшРНК.
В приложенных примерах продемонстрировано то, что посредством ингибирования полипептида или мРНК PAPD5 и/или PAPD7, может эффективно ингибироваться секреция HBsAg и HBeAg, а также продукция внутриклеточной мРНК HBV. Эти данные демонстрируют то, что ингибитор PAPD5 и/или PAPD7 может использоваться для предупреждения и/или лечения инфекции HBV.
В данной области было описано несколько низкомолекулярных соединений, которые имеют определенную эффективность в лечении инфекции HBV (см., например, WO 2015/113990 А1 и WO 2016/177655). В приложенных примерах впервые продемонстрирована явная корреляция между активностью низкомолекулярного соединения против инфекции HBV и аффинностью связывания по отношению к PAPDP5 и PAPD7. Данное осознание открыло возможности для конструирования молекул нуклеиновых кислот, нацеленных на мРНК PAPD5 или PAPD7, приводя к особенно высокой эффективности против HBV. Данные молекулы нуклеиновых кислот могут быть нацелены непосредственно в печень с использованием конъюгатов, способных к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (ASGPr). По сравнению с вводимыми системно маленькими молекулами данные молекулы нуклеиновых кислот будут иметь отличный профиль РК (фармакокинетика) / PD (фармакодинамика) и профиль токсичности. Кроме того, согласно настоящему изобретению впервые показано то, что соединение(ния), которое(рые) ингибирует(ют) PAPD5 или PAPD7, или, в частности, PAPD5 и PAPD7, имеет(ют) экстраординарно высокую активность в показателях ингибирования секреции HBsAg и HBeAg, а также продукции внутриклеточной мРНК HBV. Уменьшение секреции HBsAg и HBeAg ингибирует развитие хронической инфекции HBV более эффективно по сравнению с уменьшением секреции одного HBsAg. Кроме того, ингибирование секреции HBsAg и HBeAg уменьшает зараженность человека, инфицированного HBV. Кроме того, уменьшение уровня HBeAg у будущей матери также может ингибировать развитие хронической инфекции HBV ее ребенка. Таким образом, настоящее изобретение неожиданно демонстрирует то, что селективное применение соединений, которые ингибируют нуклеиновые кислоты-мишени PAPD5 или PAPD7, или комбинаций соединений, которые ингибируют нуклеиновые кислоты-мишени и PAPD5, и PAPD7, приводит к улучшенному терапевтическому успеху при лечении инфекции HBV в показателях значительно более эффективного уменьшения уровня HBsAg и HBeAg.
Соответственно, одним аспектом настоящего изобретения является применение одного или более чем одного ингибитора, способного уменьшать уровни нуклеиновых кислот-мишеней PAPD5 или PAPD7, или комбинаций соединений, которые ингибируют экспрессию нуклеиновых кислот-мишеней и PAPD5, и PAPD7, в лечении инфекции HBV, в частности, хронической инфекции HBV. В другом воплощении данное изобретение относится к применению по меньшей мере двух ингибиторов, способных уменьшать уровни нуклеиновых кислот-мишеней PAPD5 и/или PAPD7 при уменьшении уровней вирусных антигенов HBsAg и HBeAg.
Таким образом, настоящее изобретение относится к ингибитору или комбинации ингибиторов PAPD5 и/или PAPD7 для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV, где указанный(ные) ингибитор(ры) независимо выбран(ны) из группы, состоящей из:
(а) одной или более чем одной молекулы интерферирующей РНК (РНКи) против PAPD5 или PAPD7;
(б) аппарата редактирования генома, включающего:
(i) сайт-специфичную ДНК-нуклеазу или полинуклеотид, кодирующий сайт-специфичную ДНК-нуклеазу; и
(ii) РНК-проводник или полинуклеотид, кодирующий РНК-проводник.
Молекулы РНКи могут быть независимо выбраны из группы состоящей из:
а) одноцепочечного антисмыслового олигонуклеотида;
б) молекулы миРНК; и
в) молекулы кшРНК.
Ингибитор по настоящему изобретению также может представлять собой молекулу запертой нуклеиновой кислоты (LNA), специфичную в отношении PAPD5 или PAPD7.
Рассматривается то, что ингибитор по изобретению используется для лечения (например, уменьшения интенсивности) инфекции HBV.
Данный ингибитор может представлять собой молекулу, которая специфично ингибирует PAPD7. Предпочтительно ингибитор представляет собой молекулу, которая специфично ингибирует PAPD5. Более предпочтительно ингибиторы объединяются таким образом, что они ингибируют и PAPD5, и PAPD7. Таким образом, приоритетным является то, что ингибиторы по настоящему изобретению либо ингибируют PAPD5, либо объединяются таким образом, что они ингибируют и PAPD5, и PAPD7. Наиболее предпочтительно ингибиторы по настоящему изобретению объединяются таким образом, что они ингибируют PAPD5 и PAPD7. В одном аспекте данного изобретения ингибиторы по настоящему изобретению объединяются таким образом, что они ингибируют и PAPD5, и PAPD7, и приводят к уменьшению секреции HBsAg и/или HBeAg по меньшей мере на 50% по сравнению с контролем без лекарственного средства (т.е. по сравнению с клетками или субъектами, которым не вводилось лекарственное средство).
Ингибитор по настоящему изобретению может иметь значение IC50 в ингибировании HBsAg и HBeAg меньше 6 мкМ, предпочтительно меньше 5 мкМ, предпочтительно меньше 4 мкМ, предпочтительно меньше 3 мкМ, предпочтительно меньше 2 мкМ, более предпочтительно меньше 1 мкМ, более предпочтительно меньше 0,5 мкМ и наиболее предпочтительно меньше 0,1 мкМ.
Редактирование генома посредством применения сайт-специфичной ДНК-нуклеазы (такой как Cas9 или Cpf1) и РНК-проводника обычно известно в данной области и описывается, например, в "CRISPR-Cas: A Laboratory Manual", 2016, под редакцией Jennifer Doudna, ISBN 978-1-621821-31-1.
Например, если указанная сайт-специфичная ДНК-нуклеаза представляет собой нуклеазу Cas9, тогда аппарат редактирования генома предпочтительно дополнительно содержит:
(i) по меньшей мере одну РНК-проводник, состоящую из по меньшей мере одной специфичной в отношении последовательности-мишени молекулы РНК CRISPR (крРНК) и по меньшей мере одной транс-активирующей молекулы крРНК (тракрРНК);
(ii) полинуклеотид, кодирующий молекулы РНК (i);
(iii) по меньшей мере одну РНК-проводник, которая представляет собой молекулу химерной РНК, содержащую по меньшей мере одну специфичную в отношении последовательности-мишени крРНК и по меньшей мере одну тракрРНК; или
(iv) полинуклеотид, кодирующий химерную РНК (iii).
В альтернативном примере сайт-специфичная ДНК-нуклеаза представляет собой нуклеазу Cpf1, и аппарат редактирования генома предпочтительно дополнительно содержит:
(i) по меньшей мере одну РНК-проводник, содержащую специфичную в отношении последовательности-мишени молекулу PHKCRISPR (крРНК); или
(ii) полинуклеотид, кодирующий молекулы РНК (i).
Предложенные в данном документе ингибиторы PAPD5 или PAPD7 также могут представлять собой аппарат редактирования генома, который содержит по меньшей мере один предварительно собранный рибонуклеопротеиновый комплекс белок Cas9-РНК-проводник (RNP).
В данном документе РНК-проводник конструируют для нацеливания на геномную ДНК PAPD5 или PAPD7. В качестве альтернативы, используются несколько РНК-проводников таким образом, что может осуществляться нацеливание на геномную ДНК PAPD5 и PAPD7. Ингибирование PAPD5 и/или PAPD7 может достигаться посредством введения нокаутирующих мутаций со сдвигом рамки считывания в геномную ДНК PAPD5 и/или PAPD7 посредством негомологичного соединения концов (NHEJ) или посредством модифицирования геномной ДНК PAPD5 и/или PAPD7 через направляемую гомологией репарацию (HDR). Как можно индуцировать данные механизмы является общеизвестным в данной области, и это описывается, например, в Heidenreich, 2016, Nat Rev Neurosci 17 36-44.
Ингибитор по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой молекулу, не встречающуюся в природе. Ингибитор по изобретению может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из агентов на основе РНКи, включающих миРНК, кшРНК, криспер РНК и одноцепочечные антисмысловые олигонуклеотиды. Предпочтительно молекулы РНКи содержат по меньшей мере один не встречающийся в природе нуклеотид, такой как олигонуклеотидтрифосфат, замещенный рибоолигонуклеотид, нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, нуклеозид LNA, нуклеозид PNA (пептидилнуклеиновая кислота), молекула GNA (гликольнуклеиновая кислота), молекула TNA (треозонуклеиновая кислота), морфолинонуклеотид или нуклеиновая кислота с модифицированным остовом, таким как полисилоксан, 2'-O-(2-метокси)-этил-фосфоротиоат, или нуклеиновая кислота с заместителем, таким как метил-, тио-, сульфат, бензоил-, фенил-, амино-, пропил-, хлор- и метанокарбануклеозид, или репортерную молекулу для облегчения ее выявления. Ингибитор по изобретению также может быть встречающейся в природе или невстречающейся в природе маленькой молекулой или аппаратом редактирования генома.
В контексте настоящего изобретения предложенный в данном документе ингибитор ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5 или PAPD7.
Например, ингибитор по настоящему изобретению может связываться с нуклеиновой кислотой-мишенью PAPD5 и ингибировать активность полипептида PAPD5. В другом примере ингибитор по настоящему изобретению связывается нуклеиновой кислотой-мишенью PAPD7 и ингибирует активность полипептида PAPD7. В данном документе приоритетным является то, что ингибиторы объединяются для нацеливания на мРНК и PAPD5, и PAPD7 и ингибируют активность обоих: полипептида PAPD5 и PAPD7. Ингибитор по настоящему изобретению может ингибировать экспрессию PAPD5 или PAPD7; или комбинация ингибиторов может ингибировать экспрессию и PAPD5, и PAPD7.
Соединения по изобретению
Как описано выше, ингибитор по настоящему изобретению может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты.
В одном аспекте изобретения ингибитор по настоящему изобретению представляет собой молекулу РНКи против PAPD5 или PAPD7. Указанная молекула РНКи может представлять собой миРНК или кшРНК.
Например, ингибитор по настоящему изобретению может представлять собой миРНК, которая направлена против PAPD5, где указанная миРНК представляет собой любую из комбинации следующих миРНК:
Пул миРНК к PAPD5 (L-010011-00-0010; ON-TARGETplus человеческий PAPD5):
миРНК - 1 - J-010011-05 - последовательность-мишень:
Figure 00000001
миРНК - 2 - J-010011-06 - последовательность-мишень:
Figure 00000002
миРНК - 3 - J-010011-07 - последовательность-мишень:
Figure 00000003
миРНК - 4 - J-010011-08 - последовательность-мишень:
Figure 00000004
Ингибитор по настоящему изобретению также может представлять собой миРНК, которая направлена против PAPD7, где указанная миРНК представляет собой любую из комбинации следующих миРНК:
Пул миРНК к PAPD7 (L-009807-00-0005; ON-TARGETplus человеческий PAPD7):
миРНК - 1 - J-009807-05 - последовательность-мишень:
Figure 00000005
миРНК - 2 - J-009807-06 - последовательность-мишень:
Figure 00000006
миРНК - 3 - J-009807-07 - последовательность-мишень:
Figure 00000007
миРНК - 4 - J-009807-08 - последовательность-мишень:
Figure 00000008
Выше показаны последовательности-мишени подходящих миРНК. Последовательности соответствующих миРНК являются непосредственно комплементарными данным последовательностям-мишеням.
В контексте настоящего изобретения рассматривается то, что объединенный препарат может содержать: (а) миРНК, направленную(ные) против PAPD5, объединенную(ные) с (б) миРНК, направленной(ными) против PAPD7, для того, чтобы ингибировать экспрессию и PAPD5, и PAPD7.
В контексте настоящего изобретения также рассматривается то, что объединенный препарат может содержать: (а) кшРНК, направленную против PAPD5, объединенную с (б) кшРНК, направленной против PAPD7, для того, чтобы ингибировать экспрессию и PAPD5, и PAPD7. В данном контексте молекула кшРНК в (а) может быть одной или более чем одной из следующих молекул кшРНК:
Figure 00000009
В другом аспекте изобретения молекула РНКи представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, способный ингибировать экспрессию PAPD5 или PAPD7. Данная модуляция достигается посредством гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, кодирующей PAPD5 или PAPD7. Нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой PAPD5 млекопитающего, такую как последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5 и 10, или ее природные варианты.
Нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой PAPD7 млекопитающего, такой как последовательность, выбранная из SEQ ID NO: 6 или 11, или ее природные варианты.
Олигонуклеотид по изобретению представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, который нацелен на PAPD5 или PAPD7.
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид по изобретению способен модулировать экспрессию мишени посредством ее ингибирования или понижающей регуляции. Предпочтительно такая модуляция дает ингибирование экспрессии по меньшей мере на 20% по сравнению с нормальным уровнем экспрессии мишени, более предпочтительно, по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% ингибирования по сравнению с нормальным уровнем экспрессии мишени. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды по изобретению могут быть способны ингибировать уровни экспрессии мРНК PAPD5 или PAPD7 по меньшей мере на 60% или 70% in vitro с использованием клеток HeLa или HepaRG. В некоторых воплощениях соединения по изобретению могут быть способны ингибировать уровни экспрессии белка PAPD5 или PAPD7 по меньшей мере на 50% in vitro с использованием клеток HeLa или HepaRG. Подходящим образом анализы, которые можно использовать для измерения ингибирования РНК или белка PAPD5 или PAPD7, описываются выше в разделе способов скрининга. Модулирование мишени запускается гибридизацией между непрерывной нуклеотидной последовательностью олигонуклеотида и нуклеиновой кислотой-мишенью.
Один аспект настоящего изобретения относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину, где данная непрерывная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 90% комплементарной PAPD5. Данные антисмысловые олигонуклеотиды способны уменьшать экспрессию PAPD5. Предпочтительно антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере один нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром.
Другой аспект настоящего изобретения относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину, где данная непрерывная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 90% комплементарной PAPD7. Данный антисмысловой олигонуклеотид способен уменьшать экспрессию PAPD7. Предпочтительно антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере один нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит непрерывную последовательность, которая является по меньшей мере на 90% комплементарной, как, например, по меньшей мере на 91%, как, например, по меньшей мере на 92%, как, например, по меньшей мере на 93%, как, например, по меньшей мере на 94%, как, например, по меньшей мере на 95%, как, например, по меньшей мере на 96%, как, например, по меньшей мере на 97%, как, например, по меньшей мере на 98% или на 100% комплементарной области нуклеиновой кислоты-мишени или последовательности-мишени.
В предпочтительном воплощении олигонуклеотид по изобретению или его непрерывная нуклеотидная последовательность является полностью комплементарной (на 100% комплементарной) области нуклеиновой кислоты-мишени, или в некоторых воплощениях может содержать одно или два несоответствия между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью.
В некоторых воплощениях данный олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, полной (или 100%-ной) комплементарностью к области нуклеиновой кислоты-мишени, такой как последовательность-мишень, присутствующая в SEQ ID NO: 4, 5 или 10. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 10. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 4, 5 или 10.
В некоторых воплощениях данный олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, полной (или 100%-ной) комплементарностью к области нуклеиновой кислоты-мишени, такой как последовательность-мишень, присутствующая в SEQ ID NO: 6 или 11. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 11. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 6 или 11.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит или состоит из 10-35 нуклеотидов в длину, как, например, от 10 до 30, как, например, от 11 до 22, как, например, от 12 до 20, как, например, от 14 до 20, как, например, от 14 до 18, как, например, от 14 до 16, как, например, от 16 до 20 смежных нуклеотидов в длину.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид или его непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 22 или меньшего числа нуклеотидов, как, например, из 20 или меньшего числа нуклеотидов. Следует понимать то, что любой интервал, приведенный в данном документе, включает конечные точки данного интервала. Соответственно, при указании того, что олигонуклеотид включает от 10 до 30 нуклеотидов, включаются и 10, и 30 нуклеотидов.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, перечисленных в Таблице 3 в разделе Материалы и метод.
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-131 (см. мотивы последовательностей, перечисленные в Таблице 3).
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 18, 23, 25, 26, 30, 32, 39, 54, 56, 58, 65, 80, 88, 92, 93, 111, 115, 116 и 118 (см. мотивы последовательностей, перечисленные в Таблице 3).
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, 26, 54, 56, 80, 93 и 115.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, перечисленных в Таблице 4 в разделе Материалы и метод.
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 132-251 (см. мотивы последовательностей, перечисленные в Таблице 4).
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 и 244 (см. мотивы последовательностей, перечисленные в Таблице 4).
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 172, 188, 190, 229 и 239.
В другом аспекте данное изобретение относится к комбинированному препарату, содержащему: а) молекулу нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5; и б) молекулу нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD7. В конкретных воплощениях молекулы нуклеиновых кислот независимо выбраны из миРНК, кшРНК и антисмысловых олигонуклеотидов, описанных в данном документе.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) одну или более чем одну молекулу миРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD5, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 252, 253, 254 и 255; и б) одну или более чем одну молекулу миРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD7, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 256, 257, 258 и 259.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) одну или более чем одну молекулу кшРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD5, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 252, 253, 254 и 255; и б) один или более чем один антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на последовательность-мишень PAPD7, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 и 244.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) одну или более чем одну молекулу антисмыслового олигонуклеотида, нацеленную на последовательность-мишень PAPD5, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 18, 23, 25, 26, 30, 32, 39, 54, 56, 58, 65, 80, 88, 92, 93, 111, 115, 116 и 118; и б) одну или более чем одну молекулу миРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD7, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 256, 257, 258 и 259.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) одну или более чем одну молекулу кшРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD5, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 260, 261, 262, 263 и 264; и б) одну или более чем одну молекулу миРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD7, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 256, 257, 258 и 259.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) одну или более чем одну молекулу кшРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD5, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 260, 261, 262, 263 и 264; и б) один или более чем один антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на последовательность-мишень PAPD7, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 и 244.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 18, 23, 25, 26, 30, 32, 39, 54, 56, 58, 65, 80, 88, 92, 93, 111, 115, 116 и 118, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 и 244.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, 23, 25, 26, 32, 39, 54, 80, 92, 93, 116 и 118, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 153, 155, 172, 174, 183, 188, 190, 195, 197, 221, 224, 229, 232 и 244.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 18 и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 221.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 23 и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 172 или 188.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 25 и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 174 или 183.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 26, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 183.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 39, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 229.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 54, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 190 или 232.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 56, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 153 или 244.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 80, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 153 или 244.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 92, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 190 или 232.
В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 116, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 155 или 195.
Конструкция олигонукпеотида
Термин «конструкция олигонуклеотида» относится к картине модификаций сахара нуклеозидов в последовательности олигонуклеотида. Олигонуклеотиды по изобретению содержат нуклеозиды с модифицированным сахаром и также могут содержать нуклеозиды ДНК или РНК. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит нуклеозиды с модифицированным сахаром и нуклеозиды ДНК. Включение модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотид по изобретению может увеличивать аффинность олигонуклеотида в отношении нуклеиновой кислоты-мишени. В данном случае модифицированные нуклеозиды можно называть модифицированными нуклеотидами, увеличивающими аффинность. Модифицированные нуклеозиды также можно называть звеньями.
В одном воплощении олигонуклеотид содержит по меньшей мере 1 модифицированный нуклеозид, как, например, от 1 до 8 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 2 до 8 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 3 до 7 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 4 до 6 модифицированных нуклеозидов.
В одном воплощении олигонуклеотид содержит один или более чем один нуклеозид с модифицированным сахаром, как, например, нуклеозиды, модифицированные 2'-сахаром. Предпочтительно олигонуклеотид по изобретению содержит один или более чем один нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, независимо выбранный из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-O-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, арабинонуклеиновой кислоты (ANA), 2'-фтор-ANA и нуклеозидов LNA. Даже более предпочтительно один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой запертую нуклеиновую кислоту (LNA).
В другом воплощении олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. В предпочтительном воплощении все межнуклеозидные связи в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные или боранофосфатные межнуклеозидные связи. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи в непрерывной последовательности олигонуклеотида представляют собой фосфоротиоатные связи.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA, как, например, от 1 до 8 нуклеозидов LNA, как, например, от 2 до 8 нуклеозидов LNA, как, например, от 3 до 7 нуклеозидов LNA, как, например, от 4 до 6 нуклеозидов LNA.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA и по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид.
В одном воплощении изобретения олигонуклеотид по изобретению способен рекрутировать РНКазу Н.
Конструкция гэпмера
В предпочтительном воплощении олигонуклеотид по изобретению имеет конструкцию или структуру гэпмера, также именуемую в данном документе просто «гэпмер». В структуре гэпмера олигонуклеотид содержит по меньшей мере три отличные структурные области: 5'-фланг, гэп и 3'-фланг, F-G-F' в ориентации '5->3'. В данной конструкции фланкирующие области F и F' (также именуемые области крыльев) содержат непрерывный отрезок модифицированных нуклеозидов, которые являются комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени PAPD5 или PAPD7, тогда как область гэпа - G - содержит непрерывный отрезок нуклеотидов, который способен рекрутировать нуклеазу, предпочтительно эндонуклеазу, такую как РНКаза, например, РНКаза Н, когда олигонуклеотид находится в дуплексе с нуклеиновой кислотой-мишенью. В предпочтительных воплощениях область гэпа состоит из нуклеозидов ДНК. Области F и F', фланкирующие 5'- и 3'-концы области G, предпочительно содержат нуклеозиды, не рекрутирующие нуклеазу (нуклеозиды с 3'-эндоструктурой), более предпочтительно один или более чем один модифицированный нуклеозид, увеличивающий аффинность. В некоторых воплощениях 3'-фланг содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA, предпочтительно по меньшей мере 2 нуклеозида LNA. В некоторых воплощениях 5'-фланг содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA. В некоторых воплощениях обе 5'- и 3'-фланкирующие области содержат нуклеозид LNA. В некоторых воплощениях все нуклеозиды в данных фланкирующих областях представляют собой нуклеозиды LNA. В других воплощениях фланкирующие области могут содержать и нуклеозиды LNA, и другие нуклеозиды (смешанные фланги), такие как нуклеозиды ДНК и/или модифицированные нуклеозиды, не являющиеся нуклеозидами LNA, такие как 2'-замещенные нуклеозиды. В данном случае гэп определяется как непрерывная последовательность из по меньшей мере 5 нуклеозидов, рекрутирующих РНКазу Н (нуклеозиды с 2'-эндоструктурой, предпочтительно ДНК), фланкированная на 5'- и 3'-конце модифицированным нуклеозидом, увеличивающим аффинность, предпочтительно LNA, таким как бета-D-окси-LNA. Следовательно, нуклеозиды 5'-фланкирующей области и 3'-фланкирующей области, которые являются смежными с областью гэпа, представляют собой модифицированные нуклеозиды, предпочтительно нуклеозиды, не рекрутирующие нуклеазу или нуклеозиды с высокой аффинностью.
Область F
Область F (5'-фланг или 5'-крыло) присоединяется к '5-концу области G и включает, содержит или состоит из по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида, как, например, из по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении область F содержит или состоит из от 1 до 4 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-4 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1-3 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозидов. Область F определяется наличием по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида на 5'-конце и 3'-конце данной области.
В некоторых воплощениях модифицированные нуклеозиды в области F имеют З'-эндоструктуру.
В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид. В одном воплощении все нуклеозиды в области F представляют собой 2'-модифицированные нуклеозиды.
В другом воплощении область F содержит нуклеозиды ДНК и/или РНК, помимо 2'-модифицированных нуклеозидов. Фланги, содержащие ДНК и/или РНК, характеризуются наличием 2'-модифицированного нуклеозида на 5'-конце и 3'-конце (рядом с областью G) области F. Нуклеозиды ДНК во флангах предпочтительно не должны быть способны рекрутировать РНКазу Н. Длина 5'-фланга (области F) в олигонуклеотидах с нуклеотидами ДНК и/или РНК во флангах может быть больше, поддерживая число 2'-модифицированных нуклеозидов от 1 до 4, как описано выше. В другом воплощении один или более чем один 2'-модифицированный нуклеозид в области F выбран из звеньев 2'-O-алкил-РНК, 2'-О-метил-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, звеньев 2'-фтор-ДНК, 2'-алкокси-РНК, звеньев МОЕ, звеньев LNA, звеньев арабинонуклеиновой кислоты (ANA) и звеньев 2'-фтор-ANA.
В некоторых воплощениях область F содержит и нуклеозид LNA, и 2'-замещенный модифицированный нуклеозид. Они часто называются олигонуклеотидами со смешанными крыльями или со смешанными флангами.
В одном воплощении изобретения все модифицированные нуклеозиды в области F представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении все нуклеозиды в области F представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении нуклеозиды LNA в области F независимо выбраны из группы, состоящей из окси-LNA, тио-LNA, амино-LNA, сЕТ и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В предпочтительном воплощении область F содержит по меньшей мере 1 звено бета-D-окси LNA на 5'-конце непрерывной последовательности. В другом предпочтительном воплощении область F состоит из бета-D-окси нуклеозидов LNA.
Область G
Область G (область гэпа) предпочтительно включает, содержит или состоит из 4-18 или из 5-17, или из 6-16, или из 8-12 последовательных нуклеозидных звеньев, способных рекрутировать РНКазу Н.
Нуклеозидные звенья в области G, которые способны рекрутировать нуклеазу, в одном воплощении выбраны из группы, состоящей из ДНК, альфа-L-LNA, С4'-алкилированой ДНК (как описано в РСТ/ЕР2009/050349 и Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300, которые обе включены в данный документ посредством ссылки), нуклеозидов, происходящих из арабинозы, подобных ANA и 2'F-ANA (Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (незапертая нуклеиновая кислота) (как описано в Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, включенной в данный документе посредством ссылки). UNA представляет собой незапертую нуклеиновую кислоту, типично где связь между С2 и С3 рибозы была удалена, образуя незапертый «сахарный» остаток.
В некоторых воплощениях область G состоит из 100% звеньев ДНК.
В других воплощениях область G может состоять из смеси ДНК и других нуклеозидов, способных опосредовать расщепление РНКазой Н.
В некоторых воплощениях нуклеозиды в области G имеют 2'-эндоструктуру.
Область F'
Область F' (3'-фланг или 3'-крыло) присоединяется к 3'-концу области G и включает, содержит или состоит из по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида, как, например, из по меньшей мере 2, по меньшей мере 3 или по меньшей мере 4 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении область F' содержит или состоит из от 1 до 3 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1-3 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозидов. Область F' определяется наличием по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида на 5'-конце и на 3'-конце данной области.
В некоторых воплощениях модифицированные нуклеозиды в области F' имеют 3'-эндоструктуру.
В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F' представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид. В одном воплощении все нуклеозиды в области F' представляют собой 2'-модифицированные нуклеозиды.
В другом воплощении область F' содержит нуклеозиды ДНК и/или РНК, помимо 2'-модифицированных нуклеозидов. Фланги, содержащие ДНК и/или РНК, характеризуются наличием 2'-модифицированного нуклеозида на 5'-конце и 3'-конце (смежном с областью G) области F'. Данные нуклеозиды ДНК во флангах предпочтительно не должны быть способны рекрутировать РНКазу Н. Длина 3'-фланга (области F') в олигонуклеотидах с нуклеотидами ДНК и/или РНК во флангах может быть больше, поддерживая число 2'-модифицированных нуклеотидов от 1 до 4, как описано выше. В другом воплощении один или более чем один 2'-модифицированный нуклеозид в области F' выбран из звеньев 2'-O-алкил-РНК, 2'-О-метил-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, звеньев 2'-фтор-ДНК, 2'-алкокси-РНК, звеньев МОЕ, звеньев LNA, звеньев арабинонуклеиновой кислоты (ANA) и звеньев 2'-фтор-ANA.
В некоторых воплощениях область F' содержит и LNA и 2'-замещенный модифицированный нуклеозид. Они часто называются олигонуклеотидами со смешанными крыльями или со смешанными флангами.
В одном воплощении изобретения все модифицированные нуклеозиды в области F' представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении все нуклеозиды в области F' представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении нуклеозиды LNA в области F' независимо выбраны из группы, состоящей из окси-LNA, тио-LNA, амино-LNA, сЕТ и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В предпочтительном воплощении область F' содержит по меньшей мере два звена бета-D-окси LNA на 3'-конце непрерывной последовательности. В другом предпочтительном воплощении область F' состоит из бета-D-окси LNA нуклеозидов.
Область D' и D''
Область D' и D'' может быть присоединена к 5'-концу области F или к 3'-концу области F' соответственно.
Область D' и D'' может независимо содержать 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных нуклеотидов, которые могут быть комплементарными или некомплементарными нуклеиновой кислоте-мишени. В данном отношении олигонуклеотид по изобретению может в некоторых воплощениях содержать непрерывную нуклеотидную последовательность, способную модулировать мишень, которая фланкирована на 5'- и/или 3'-конце дополнительными нуклеотидами. Такие дополнительные нуклеотиды могут служить в качестве нуклеазочувствительного биорасщепляемого линкера (см. определение линкеров). В некоторых воплощениях дополнительные 5'- и/или 3'-концевые нуклеотиды связаны фосфодиэфирными связями и могут представлять собой ДНК или РНК. В другом воплощении дополнительные 5'- и/или 3'-концевые нуклеотиды представляют собой модифицированные нуклеотиды, которые могут быть включены, например, для увеличения нуклеазоустойчивости или для легкости синтеза. В одном воплощении олигонуклеотид по изобретению содержит область D' и/или D'', помимо непрерывной нуклеотидной последовательности.
Гэпмерный олигонуклеотид по настоящему изобретению может быть представлен следующими формулами:
F-G-F'; в частности, F1-7-G4-12-F'1-7
D'-F-G-F', в частности, D'1-3-F1-7-G4-12-F'1-7
F-G-F'-D'', в частности, F1-7-G4-12-F'1-7-D''1-3
D'-F-G-F'-D'', в частности, D'1-3-F1-7-G4-12-F'1-7-D''1-3
Предпочтительное число и типы нуклеозидов в областях F, G и F', D' и D'' были описаны выше.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид представляет собой гэпмер, состоящий из 14-20 нуклеотидов в длину, где каждая из областей F и F' независимо состоит из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозных звеньев, и область G состоит из 6-17 нуклеозидных звеньев, способных рекрутировать нуклеазу при нахождении в дуплексе с нуклеиновой кислотой-мишенью PAPD5 или PAPD7, и где данный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени PAPD5 или PAPD7.
Во всех случаях конструкция F-G-F' может дополнительно включать область D' и/или D'', которая может иметь 1, 2 или 3 нуклеозидных звена, таких как звенья ДНК. Предпочтительно нуклеозиды в области F и F' представляют собой модифицированные нуклеозиды, тогда как нуклеотиды в области G представляют собой немодифицированные нуклеозиды.
При каждой конструкции предпочтительным модифицированным нуклеозидом является LNA.
В другом воплощении все межнуклеозидные связи в гэпе в гэпмере представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. В другом воплощении все межнуклеозидные связи во флангах (области F и F') в гэпмере представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. В другом предпочтительном воплощении все межнуклеозидные связи в области D' и D'' в гэпмере представляют собой фосфодиэфирные связи.
Для специфических гэпмеров, как раскрыто в данном документе, когда остатки цитозина (С) аннотируются как 5-метил-цитозин, в разных воплощениях один или более чем один С, присутствующий в олигонуклеотиде, может представлять собой немодифицированные остатки С.
Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO: от 12_1 до 131_1 (см. олигонуклеотиды, перечисленные в Таблице 3).
Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO: 15_1, 18_1, 23_1, 25_1, 26_1, 30_, 32_1, 39_1, 54_1, 56_1, 58_1, 65_1, 80_1, 88_1, 92_1, 93_1, 111_1, 115_1, 116_1 и 118_1 (см. олигонуклеотиды, перечисленные в Таблице 3).
Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO: 23_1, 26_1, 54_1, 56_1, 80_1, 93_1 и 115_1.
Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO: от 132_ до 251_1 (см. олигонуклеотиды, перечисленные в Таблице 4).
Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO: 153_1, 155_1, 168_1, 171_1, 172_1, 174_1, 183_1, 184_1, 188_1, 190_1, 191_1, 194_1, 195_1, 197_1, 221_1, 224_1, 229_1, 232_1, 239_1 и 244_1 (см. олигонуклеотиды, перечисленные в Таблице 4).
Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO: 172_1, 188_1, 190_1, 229_1 и 237_1.
Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотид, выбранный из группы олигонуклеотидных соединений с CMP ID NO: 18_1, 25_1, 26_1, 32_1, 39_1, 54_1, 56_1, 80_1, 92_1, 93_1, 116_1 и 118_1, и б) олигонуклеотид, выбранный из группы олигонуклеотидных соединений с CMP ID NO: 153_1, 155_1, 168_1, 171_1, 172_1, 174_1, 183_1, 184_1, 188_1, 190_1, 191_1, 194_1, 195_1, 197_1, 221_1, 224_1, 229_1, 232_1, 23_19 и 244_1.
Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 18_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 221_1.
Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 23_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 172_1 или 188_1.
Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 25_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 174_1 или 183_1.
Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 26_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 183_1.
Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 39_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 229_1.
Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 54_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 190_1 или 232_1.
Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 56_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 153_1 или 244_1.
Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 80_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 153_1 или 244_1.
Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 116_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 155_1 или 195_1.
Применения
В контексте настоящего изобретения неожиданно было показано то, что комбинированное ингибирование PAPD5 и PAPD7 приводит к синергическому эффекту при ингибировании размножения HBV. В приложенных примерах показано то, что уменьшение экспрессии одного PAPD5 приводит к уменьшению секреции HBsAg и HBeAg примерно на 50%, подобным образом, уровень внутриклеточной мРНК HBV был снижен при использовании ингибитора PAPD5. Уменьшение экспрессии одного PAPD7 приводит к уменьшению секреции HBsAg и HBeAg не более чем на 15%. Одновременный нокдаун PAPD5 и PAPD7 приводит к синергическому эффекту при уменьшении секреции HBsAg и HBeAg, который находится выше суммы эффектов одиночных нокдаунов. Не будучи связанными теорией, данный синергический эффект может быть обусловлен компенсаторным эффектом PAPD5 и PAPD7, так как оба белка имеют высокую гомологию последовательности и одинаковые ферментативные функции. Из-за уменьшения секреции HBsAg ингибитор по настоящему изобретению ингибирует развитие хронической инфекции HBV. В частности, из-за ингибирования секреции HBeAg ингибитор по настоящему изобретению более эффективно ингибирует развитие хронической инфекции HBV по сравнению с соединением, которое только уменьшает секрецию HBsAg. Кроме того, уменьшение уровня HBeAg у будущей матери также может ингибировать развитие хронической инфекции HBV ее ребанка. Таким образом, из-за уменьшения секреции HBeAg ингибитор по настоящему изобретению ингибирует развитие хронической инфекции HBV (как, например, развитие хронической инфекции HBV у потомства матери, инфицированной HBV) и уменьшает зараженность человека, инфицированного HBV. Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к предложенному в данном документе ингибитору, где данный ингибитор уменьшает секрецию HBsAg и HBeAg. В соответствии с этим, другой аспект данного изобретения относится к предложенному в данном документе ингибитору, в частности, к молекуле нуклеиновой кислоты или к комбинации молекул нуклеиновых кислот, где данный ингибитор ингибирует развитие хронической инфекции HBV и уменьшает зараженность человека, инфицированного HBV. В конкретном аспекте изобретения предложенный в данном документе ингибитор ингибирует развитие хронической инфекции HBV у потомства матери, инфицированной HBV. Данная мать предпочтительно является HBeAg-позитивной.
Субъектом, подлежащим лечению ингибитором по изобретению (или который получает ингибитор по настоящему изобретению профилактически), предпочтительно является человек, более предпочтительно человеческий пациент, который является HBsAg-позитивным и/или HBeAg-позитивным, даже более предпочтительно человеческий пациент, который является HBsAg-позитивным и HBeAg-позитивным. Указанным человеческим пациентом может быть будущая мать, например, будущая мать, которая является HBeAg-позитивной и/или HBsAg-позитивной, более предпочтительно будущая мать, которая является HBeAg-позитивной и HBsAg-позитивной.
Одно воплощение настоящего изобретения относится к ингибитору PAPD5, в частности, к молекуле нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5, для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV, в частности, хронической инфекции HBV. Другое воплощение настоящего изобретения относится к комбинированному препарату, содержащему ингибитор PAPD5 и ингибитор PAPD7, для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV, в частности, хронической инфекции HBV. В предпочтительном воплощении комбинированная композиция для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV содержит а) молекулу нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5; и б) молекулу нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD7. Таким образом, настоящее изобретение относится к комбинированному препарату, содержащему ингибитор PAPD5 и ингибитор PAPD7, для одновременного или последовательного применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV.
Настоящее изобретение также относится к комбинированному препарату, содержащему а) молекулу нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5; и б) молекулу нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD7. В контексте данного изобретения рассматривается то, что указанный комбинированный препарат используется для лечения (например, уменьшения интенсивности) инфекции HBV. Определения, раскрытые в данном документе в связи с ингибитором по настоящему изобретению, применимы, с учетом необходимых изменений, к комбинированному препарату по настоящему изобретению. Данный комбинированный препарат может содержать молекулу, которая является ингибитором PAPD5, и отдельную молекулу, которая является ингибитором PAPD7 (например, две отдельные молекулы РНКи, такие как молекулы миРНК, кшРНК и антисмысловые олигонуклеотиды или две отдельные маленькие молекулы). Эти два отдельных ингибитора могут быть приготовлены в одной единице, например, в одной пилюле или флаконе. В качестве альтернативы, данные два отдельных ингибитора могут быть приготовлены отдельно, в отдельных единицах, например, отдельных пилюлях или флаконах. Два отдельных ингибитора могут вводиться совместно (т.е. одновременно) или раздельно (т.е. последовательно), при условии, что достигается синергический эффект двух ингибиторов. В одном аспекте изобретения данный комбинированный препарат приводит к уменьшению секреции HBsAg и HBeAg по меньшей мере на 50% по сравнению с контролем без лекарственного средства (т.е. по сравнению с клетками или субъектами, которым не вводится лекарственное средство).
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для применения в лечении и/или предупреждении инфекции, где данная фармацевтическая композиция содержит:
(i) ингибитор по изобретению или комбинированный препарат по изобретению; и
(ii) возможно фармацевтически приемлемый носитель.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или предупреждения инфекции HBV, где данный способ включает введение эффективного количества ингибитора по изобретению, в частности, молекулы нуклеиновой кислоты, конъюгата ингибитора, фармацевтической композиции по изобретению или комбинированного препарата по изобретению субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
Согласно данному изобретению также предложено применение ингибитора по изобретению, в частности, молекулы нуклеиновой кислоты, конъюгата ингибитора, фармацевтической композиции по изобретению или комбинированного препарата по изобретению для изготовления лекарственного средства. В предпочтительных воплощениях данное лекарственное средство изготовлено в лекарственной форме для подкожного введения, и для комбинированного препарата соотношение ингибитора PAPD5 и ингибитора PAPD7 составляет 1:1 по массе.
Согласно данному изобретению также предложено применение ингибитора по изобретению, в частности, молекулы нуклеиновой кислоты, конъюгата ингибитора, фармацевтической композиции по изобретению или комбинированного препарата по изобретению, как описано для изготовления лекарственного средства, где данное лекарственное средство находится в лекарственной форме для внутривенного введения, и для комбинированного препарата соотношение ингибитора PAPD5 и ингибитора PAPD7 составляет 1:1 по массе.
Ингибитор по изобретению, комбинированный препарат по изобретению или фармацевтическая композиция по изобретению могут использоваться в комбинированной терапии. Например, ингибитор по изобретению, комбинированный препарат по изобретению или фармацевтическую композицию по изобретению можно объединять с другими агентами против HBV, такими как интерферон-альфа-2b, интерферон-альфа-2а и интерферон-альфакон-1 (пегилированный и непегилированный), рибавирин, ламивудин (ЗТС), энтекавир, тенофовир, телбивудин (LdT), адефовир или другие появляющиеся агенты против HBV, такие как ингибитор репликации РНК HBV, ингибитор секреции HBsAg, ингибитор капсида HBV, антисмысловой олигомер (например, как описано в WO 2012/145697 и WO 2014/179629), миРНК (например, описанная WO 2005/014806, WO 2012/024170, WO 2012/2055362, WO 2013/003520, WO 2013/159109, WO 2017/027350 и WO 2017/015175), терапевтическая вакцина против HBV, профилактическая вакцина против HBV, терапия антителами против HBV (моноклональными или поликлональными) или агонистами TLR 2, 3, 7, 8 или 9 для лечения и/или профилактики HBV.
Приложенные примеры демонстрируют то, что понижающая регуляция PAPD5 и/или PAPD7 идет параллельно с уменьшением продукции HBsAg и HBeAg, а также внутриклеточной мРНК HBV в клетках, инфицированных HBV. Данные результаты показывают то, что количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 можно использовать для отслеживания терапевтического успеха во время лечения инфекции HBV, например, если лечение ингибитором PAPD5 и/или PAPD7 продолжается или было проведено. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу отслеживания терапевтического успеха во время лечения инфекции HBV, где данный способ включает:
(а) проведение анализа количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце, полученном от опытного субъекта,
(б) сравнение указанного количества и/или активности с контрольными данными, соответствующими количеству и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 по меньшей мере одного контрольного субъекта; и
(в) прогнозирование терапевтического успеха на основе стадии сравнения (б).
В способе отслеживания по изобретению опытный субъект может представлять собой человека, который получает лекарственное средство против инфекции HBV или получал лекарственное средство против инфекции HBV. Данное лекарственное средство может содержать агенты против HBV, как описано выше. Данное лекарственное средство также может содержать ингибитор PAPD5 и/или PAPD7.
В способе отслеживания по изобретению контрольные данные могут соответствовать количеству и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта. Указанный образец может представлять собой кровь или биопсию печени.
Один аспект данного изобретения относится к способу отслеживания по изобретению, в котором по меньшей мере один контрольный субъект имеет инфекцию HBV, но не получал лекарственное средство против инфекции HBV; и в котором на стадии (в) пониженное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 опытного субъекта по сравнению с контрольными данными показывает терапевтический успех в лечении инфекции HBV. Например, указанное пониженное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 могут означать то, что количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 в образце опытного субъекта составляют от 0 до 90% количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта. Например, указанное пониженное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 могут составлять от 0 до 80%, предпочтительно от 0 до 70%, более предпочтительно от 0 до 60%, даже более предпочтительно от 0 до 50%, даже более предпочтительно от 0 до 40%, даже более предпочтительно от 0 до 30%, даже более предпочтительно от 0 до 20% и наиболее предпочтительно от 0 до 10% количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта.
Другой аспект данного изобретения относится к способу отслеживания по изобретению, в котором по меньшей мере один контрольный субъект имеет инфекцию HBV и получал лекарственное средство против инфекции HBV; и в котором на стадии (в) идентичное или аналогичное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 опытного субъекта по сравнению с контрольными данными показывает терапевтический успех в лечении инфекции HBV. Другой аспект данного изобретения относится к способу отслеживания по изобретению, в котором по меньшей мере один контрольный субъект не имеет инфекции HBV; и в котором на стадии (в) идентичное или аналогичное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 опытного субъекта по сравнению с контрольными данными показывает терапевтический успех в лечении инфекции HBV. Идентичное или аналогичное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 может означать то, что количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 в образце опытного субъекта составляет 90-110% количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта. Например, указанное идентичное или аналогичное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 может составлять 95-105% количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта.
Также настоящим изобретением охватывается клетка или животное, не являющееся человеком (например, мышь, крыса, хорек или кролик), с повышенной, пониженной или отсутствующей экспрессией PAPD5 и/или PAPD7, которых можно использовать для идентификации и/или характеристики соединения, которое предупреждает и/или лечит (например, уменьшает интенсивность) инфекции HBV. Например, указанная клетка или животное, не являющееся человеком, может содержать экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую PAPD5 и/или PAPD7, например, клонированную в экспрессионный вектор и связанную функциональным образом с экзогенным промотором. Указанная клетка или животное, не являющееся человеком, может сверхэкспрессировать PAPD5 и/или PAPD7, предпочтительно PAPD5 и PAPD7. В качестве альтернативы, указанная клетка или животное, не являющееся человеком, могут иметь нокдаун PAPD5 и/или PAPD7, предпочтительно PAPD5 и PAPD7.
Воплощения изобретения
Таким образом, настоящее изобретение относится к следующим пунктам:
1. Способ идентификации соединения, которое предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию вирусом гепатита В (HBV), включающий:
а. приведение в контакт тестируемого соединения с клеткой, экспрессирующей PAPD5 и/или PAPD7;
б. измерение экспрессии и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в присутствии и в отсутствие указанного тестируемого соединения; и
в. идентификацию соединения, которое уменьшает экспрессию и/или активность PAPD5 или PAPD7, в качестве соединения, которое предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию тестирования способности комбинаций соединений, идентифицированных в в), уменьшать экспрессию и/или активность PAPD5 и PAPD7.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором PAPD5 представляет собой нуклеиновую кислоту-мишень PAPD5.
4. Способ по п. 3, в котором нуклеиновая кислота-мишень PAPD5 содержит или состоит из:
а. нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 или 5, или 10, или ее природного варианта;
б. нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью а.), где полипептид, экспрессируемый от данной последовательности нуклеиновой кислоты, имеет функцию поли-А полимеразы;
в. нуклеотидной последовательности, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 4, 5 или 10;
г. нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2;
д. нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1 или 2, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы;
е. нуклеотидной последовательности, кодирующей ферментативно активный фрагмент SEQ ID NO: 1 или 2, такой как SEQ ID NO: 7 или 8; или
ж. нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью ферментативно активного фрагмента SEQ ID NO: 1 или 2, такой как SEQ ID NO: 7 или 8, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы.
5. Способ по п. 1 или 2, в котором PAPD7 представляет собой нуклеиновую кислоту-мишень PAPD7.
6. Способ по п. 5, в котором нуклеиновая кислота-мишень PAPD7 содержит или состоит из:
а. нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6 или 11, или ее природного варианта;
б. нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью а.), где полипептид, экспрессируемый от данной последовательности нуклеиновой кислоты, имеет функцию поли-А полимеразы;
в. нуклеотидной последовательности, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 6 или 11;
г. нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;
д. нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID NO: 3, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы;
е. нуклеотидной последовательности, кодирующей ферментативно активный фрагмент SEQ ID NO: 3, такой как SEQ ID NO: 9; или
ж. нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью ферментативно активного фрагмента SEQ ID NO: 3, такой как SEQ ID NO: 9, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором указанная клетка представляет собой эукариотическую клетку.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором соединение, которое ингибирует размножение HBV, ингибирует секрецию антигена поверхности HBV (HBsAg), ингибирует секрецию антигена оболочки HBV (HBeAg) и/или ингибирует продукцию внутриклеточной мРНК HBV или ДНК HBV.
9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором тестируемое соединение представляет собой предназначенную для скрининга библиотеку молекул нуклеиновых кислот, выбранных из:
а. одноцепочечных антисмысловых олигонуклеотидов или
б. молекул миРНК; и
в. молекул кшРНК.
10. Способ по любому из пп. 1-9, в котором соединение, идентифицированное на стадии в. п. 1, уменьшает экспрессию мРНК PAPD5 или PAPD7 по меньшей мере на 50%.
11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором тестируемое соединение представляет собой комбинированный препарат молекулы нуклеиновой кислоты, способной уменьшать уровень PAPD5, и молекулы нуклеиновой кислоты, способной уменьшать уровень PAPD7.
12. Способ по п. 11, в котором комбинированный препарат уменьшает уровень антигена поверхности HBV (HBsAg), антигена оболочки HBV (HBeAg) и/или внутриклеточной мРНК HBV или ДНК HBV по меньшей мере на 70%.
13. Способ по любому из пп. 1-12, который дополнительно включает стадию сравнения опытного соединения с контролем.
14. Способ по п. 13, в котором указанный контроль представляет собой неактивное тестируемое соединение, которое не уменьшает экспрессию и/или активность PAPD5 или PAPD7.
15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором активностью PAPD5 и PAPD7 является функция поли-А полимеразы.
16. Ингибитор PAPD5 или PAPD7 для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV, где указанный ингибитор представляет собой:
а. молекулу РНК-интерференции (РНКи) против PAPD5 или PAPD7; или
б. аппарат редактирования генома, содержащий:
i. сайт-специфичную ДНК-нуклеазу или полинуклеотид, кодирующий сайт-специфичную ДНК-нуклеазу; и
ii. РНК-проводник или полинуклеотид, кодирующий РНК-проводник.
17. Ингибитор для применения по п. 16, где данный ингибитор представляет собой молекулу РНКи, выбранную из группы, состоящей из:
а. одноцепочечного антисмыслового олигонуклеотида;
б. молекулы миРНК; и
в. молекулы кшРНК.
18. Ингибитор для применения по п. 16 или 17, где данный ингибитор представляет собой комбинированный препарат, содержащий:
а. молекулу РНКи, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5; и
б. молекулу РНКи, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD7.
19. Ингибитор для применения по любому из пп. 16-18, где данный ингибитор снижает секрецию HBsAg и HBeAg.
20. Ингибитор для применения по любому из пп. 16-18, где данный ингибитор уменьшает продукцию внутриклеточной мРНК HBV или ДНК HBV.
21. Ингибитор для применения по любому из пп. 16-20, где данный ингибитор ингибирует развитие хронической инфекции HBV и/или уменьшает зараженность человека, инфицированного HBV.
22. Антисмысловой олигонуклеотид или молекула миРНК, которая содержит или состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности из 10-30 нуклеотидов в длину, где данная непрерывная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 80% комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени PAPD5, и данный антисмысловой олигонуклеотид способен понижать экспрессию PAPD5.
23. Молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит или состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности из 10-30 нуклеотидов в длину, где данная непрерывная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 80% комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени PAPD7, и антисмысловой олигонуклеотид способен понижать экспрессию PAPD7.
24. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 23, где данная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид.
25. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 22, где данный олигонуклеотид способен к гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5 и 10, с ΔG° меньше -41,87 кДж.
26. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 23 или 24, где данный олигонуклеотид способен к гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, выбранной из SEQ ID NO: 6 или 11, с ΔG° меньше -41,87 кДж.
27. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-26, где нуклеиновая кислота-мишень представляет собой РНК.
28. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 27, где РНК представляет собой мРНК.
29. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 28, где мРНК представляет собой пре-мРНК или зрелую мРНК.
30. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-29, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 12-22 нуклеотидов.
31. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 30, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 14-20 нуклеотидов.
32. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-31, где данный антисмысловой олигонуклеотид содержит или состоит из 12-25 нуклеотидов в длину.
33. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-32, где данный олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность является одноцепочечной.
34. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-32, где данный олигонуклеотид не является ни миРНК, ни комплементарным самому себе.
35. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22 или 25, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 12-131.
36. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 35, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 15, 18, 23, 25, 26, 30, 32, 39, 54, 56, 58, 65, 80, 88, 92, 93, 111, 115, 116 и 118.
37. Молекула нуклеиновой кислоты или антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 23, 24 или 26, где непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 132-151.
38. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 37, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 и 244.
39. Молекула антисмыслового олигонуклеотида по любому из пп. 22-38, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность имеет от нуля до трех несоответствий по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью, которой она комплементарна.
40. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 39, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет одно несоответствие по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью.
41. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 39, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность является полностью комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
42. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-41, содержащий один или более чем один модифицированный нуклеозид.
43. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 42, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой высокоаффинный модифицированный нуклеозид.
44. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-43, где данный антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.
45. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 44, в котором модифицированная межнуклеозидная связь является нуклеазоустойчивой.
46. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 44 или 45, в котором по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности являются фосфоротиоатными межнуклеозидными связями или боранофосфатными межнуклеозидными связями.
47. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 44 или 45, в котором все межнуклеозидные связи в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности являются фосфоротиоатными межнуклеозидными связями.
48. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-47, где данный олигонуклеотид способен рекрутировать РНКазу Н.
49. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 48, где данный олигонуклеотид представляет собой гэпмер.
50. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 48 или 49, где данный олигонуклеотид представляет собой гэпмер формулы 5'-F-G-F'-3', в котором область F и F' независимо содержит или состоит из 1-4 модифицированных нуклеозидов, и G представляет собой область из 6-17 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазуН.
51. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 42-44 или 50, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид, модифицированный 2' сахаром, независимо выбранный из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, арабинонуклеиновой кислоты (ANA), 2'-фтор-ANA и нуклеозидов LNA.
52. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 50 или 51, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F и F' представляет собой нуклеозид LNA.
53. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 52, в котором все модифицированные нуклеозиды в области F и F' представляет собой нуклеозиды LNA.
54. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 53, в котором область F и F' состоит из нуклеозидов LNA.
55. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 51-54, в котором нуклеозид LNA выбран из бета-D-окси-LNA, альфа-L-окси-LNA, бета-D-амино-LNA, альфа-L-амино-LNA, бета-D-тио-LNA, альфа-L-тио-LNA, (S)cET, (R)cET, бета-D-ENA и альфа-L-ENA.
56. Олигонуклеотид по любому из пп. 51-54, в котором нуклеозид LNA представляет собой окси-LNA.
57. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 51-56, в котором нуклеозид LNA представляет собой бета-D-окси-LNA.
58. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 51-54, в котором нуклеозид LNA представляет собой тио-LNA.
59. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 51-54, в котором нуклеозид LNA представляет собой амино-LNA.
60. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 51-54, в котором нуклеозид LNA представляет собой сЕТ.
61. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 51-54, в котором нуклеозид LNA представляет собой ENA.
62. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 52, в котором по меньшей мере одна из областей F или F' дополнительно содержит по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид, независимо выбранный из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК и 2'-фтор-ДНК.
63. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 52-62, в котором нуклеозиды, рекрутирующие РНКазу Н в области G, независимо выбраны из ДНК, альфа-L-LNA, С4'-алкилированной ДНК, ANA, 2' F-ANA и UNA.
64. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 50 или 63, в котором нуклеозиды в области G представляют собой нуклеозиды ДНК.
65. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22 или 25, где данный антисмысловой олиг онуклеотид выбран из CMP ID NO: от 12_1 до 131_1.
66. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 65, где антисмысловое соединение выбрано из CMP ID NO: 15_1, 18_1, 23_1, 25_1, 26_1, 30_, 32_1, 39_1, 54_1, 56_1, 58_1, 65_1, 80_1, 88_1, 92_1, 93_1, 111_1, 115_1, 116_1 и 118_1.
67. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 24, где данный антисмысловой олигонуклеотид выбран из CMP ID NO: от 132_ до 151_1.
68. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 67, где антисмысловое соединение выбрано из CMP ID NO: 153_1, 155_1, 168_1, 171_1, 172_1, 174_1, 183_1, 184_1, 188_1, 190_1, 191_1, 194_1, 195_1, 197_1, 221_1, 224_1, 229_1, 232_1, 239_1 и 244_1.
69. Молекула миРНК по п. 22, где молекула миРНК нацелена на последовательность-мишень PAPD5, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 252, 253, 254 и 255.
70. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 23, где данная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу миРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD7, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 256, 257, 258 и 259.
71. Конъюгат, содержащий антисмысловой олигонуклеотид или миРНК по любому из пп. 22-70 и по меньшей мере одну конъюгатную группировку, ковалентно присоединенную к указанному олигонуклеотиду.
72. Конъюгат по п. 71, в котором конъюгатная группировка выбрана из углеводов, лигандов рецепторов поверхности клетки, лекарственных веществ, гормонов, липофильных веществ, полимеров, белков, пептидов, токсинов, витаминов, вирусных белков или их комбинаций.
73. Конъюгат по п. 71 или 72, в котором конъюгатная группировка способна связываться с рецептором асиалогликопротеина.
74. Конъюгат по любому из пп. 71-73, содержащий линкер, который расположен между антисмысловым олигонуклеотидом и конъюгатной группировкой.
75. Конъюгат по п. 74, в котором линкер представляет собой физиологически лабильный линкер.
76. Конъюгат по п. 75, в котором физиологически лабильный линкер представляет собой нуклеазочувствительный линкер.
77. Конъюгат по п. 75 или 76, в котором олигонуклеотид имеет формулу D'-F-G-F' или F-G-F'-D'', где F, F' и G являются такими, как определено в любом из пп. Ошибка! Источник ссылки не найден.52-Ошибка! Источник ссылки не найден.65, и D' или D'' содержит 1, 2 или 3 нуклеозида ДНК с фосфоротиоатными межнуклеозидными связями.
78. Комбинированный препарат, содержащий:
а. молекулу РНКи, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5; и
б. молекулу РНКи, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD7.
79. Комбинированный препарат по п. 78, в котором молекулы РНКи выбраны из пп. 22-70 или конъюгата по любому из пп. 71-77.
80. Комбинированный препарат по п. 78, в котором молекула РНКи в а) представляет собой антисмысловые соединения по п. 36 или 66, и где молекула РНКи в б) представляет собой антисмысловые соединения по п. 38 или 68.
81. Фармацевтическая композиция, содержащая антисмысловой олигонуклеотид или молекулу миРНК по любому из пп. 22-70, или конъюгат по любому из пп. 71-77, или комбинированный препарат по пп. 78-80 и возможно фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль и/или адъювант.
82. Способ in vivo или in vitro модулирования экспрессии PAPD5 и/или PAPD7 в клетке-мишени, которая экспрессирует PAPD5 и/или PAPD7, причем указанный способ включает введение антисмыслового олигонуклеотида или молекулы миРНК по пп. 22-70 или конъюгата по пп. 71-77, или комбинированного препарата по п. 78 или 79, или фармацевтической композиции по п. 81 в эффективном количестве в указанную клетку.
83. Способ лечения или предупреждения заболевания, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества антисмыслового олигонуклеотида или молекулы миРНК по пп. 22-70, или конъюгата по пп. 71-77, или комбинированного препарата по пп. 78-80, или фармацевтической композиции по п. 81 субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию.
84. Антисмысловой олигонуклеотид или молекула миРНК по пп. 22-70, или конъюгат по пп. 71-77, или комбинированный препарат по пп. 78-80, или фармацевтическая композиция по п. 81 для применения в качестве лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания у субъекта.
85. Применение олигонуклеотида или молекулы миРНК по пп. 22-70, или конъюгата по пп. 71-77, или комбинированного препарата по пп. 78-80 для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания у субъекта.
86. Способ, антисмысловой олигонуклеотид или применение по любому из пп. 83-85, где уровень PAPD5 и/или PAPD7 уменьшается по меньшей мере на 30% или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95% по сравнению с экспрессией без антисмыслового олигонуклеотида или молекулы миРНК по пп. 22-70 или конъюгата по пп. 71-77, или комбинированного препарата по пп. 78-80.
87. Способ, антисмысловой олигонуклеотид или применение по пп. 83-85, где заболевание выбрано из инфекции HBV, в частности, хронической инфекции HBV.
88. Способ отслеживания терапевтического успеха во время лечения инфекции HBV, где данный способ включает:
а. проведение анализа в образце, полученном от опытного субъекта, количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7;
б. сравнение указанного количества и/или активности с контрольными данными, соответствующими количеству и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 по меньшей мере одного контрольного субъекта; и
в. прогнозирование терапевтического успеха на основе стадии сравнения (б).
89. Способ отслеживания по п. 88, в котором опытный субъект представляет собой человека, который получает лекарственное средство против инфекции HBV или получал лекарственное средство против инфекции HBV.
90. Способ отслеживания по п. 88 или 89, в котором контрольные данные соответствуют количеству и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта.
91. Способ отслеживания по любому из пп. 88-90, в котором по меньшей мере один контрольный субъект имеет инфекцию HBV, но не получал лекарственное средство против инфекции HBV; и в котором на стадии (в) пониженное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 опытного субъекта по сравнению с контрольными данными показывает терапевтический успех в лечении инфекции HBV.
92. Способ отслеживания по п. 91, в котором указанное пониженное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 означает то, что количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 в образце опытного субъекта составляет от 0 до 90% количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта.
93. Способ отслеживания по любому из пп. 88-90, в котором по меньшей мере один контрольный субъект имеет инфекцию HBV и получал лекарственное средство против инфекции HBV; и в котором на стадии (в) идентичное или аналогичное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 опытного субъекта по сравнению с контрольными данными показывает терапевтический успех в лечении инфекции HBV.
94. Способ отслеживания по любому из пп. 88-90, в котором по меньшей мере один контрольный субъект не имеет инфекцию HBV; и в котором на стадии (в) идентичное или аналогичное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 опытного субъекта по сравнению с контрольными данными показывает терапевтический успех в лечении инфекции HBV.
95. Способ отслеживания по п. 93 или 94, в котором указанное идентичное или аналогичное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 означает то, что количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 в образце опытного субъекта составляет от 90-110% количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта.
Фармацевтические композиции
Как описано выше, данное изобретение относится к композиции, содержащей ингибитор PAPD5, один или в комбинации с ингибитором PAPD7, для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV. Данный ингибитор предпочтительно представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, как определено в данном документе. В частности, рассматривается комбинированный препарат, содержащей ингибитор PAPD5 и ингибитор PAPD7, для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV; и фармацевтическая композиция, содержащая указанную композицию ингибитора или указанный комбинированный препарат. Указанная фармацевтическая композиция (т.е. лекарственное средство) возможно содержит фармацевтически приемлемый носитель. Указанная фармацевтическая композиция может дополнительно содержать терапевтически приемлемый разбавитель, соль, эксципиент и/или адъювант.
Типичную фармацевтическую композицию готовят смешиванием ингибитора PAPD5, одного или с ингибитором PAPD7, и носителя или эксципиента. Подходящие носители и эксципиенты являются хорошо известными специалистам в данной области и подробно описываются, например, в Ansel,
Figure 00000010
Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004; Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000 и Rowe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, Chicago, Pharmaceutical Press, 2005. Данные препараты также могут включать один или более чем один буфер, стабилизатор, поверхностно-активное вещество, увлажнитель, смазывающий агент, эмульгатор, суспендирующий агент, консервант, антиоксидант, замутнитель, скользящее вещество, вспомогательное вещество для переработки, краситель, подсластитель, отдушку, корригент, разбавитель и другие известные добавки для улучшения внешнего вида лекарственного средства или помощи в изготовлении фармацевтического продукта (например, лекарственного средства). Например, фармацевтическая композиция по изобретению может быть приготовлена смешиванием ингибитора PAPD5 и/или ингибитора PAPD7 при температуре окружающей среды при подходящем рН и с желательной степенью чистоты с физиологически приемлемыми носителями, т.е. носителями, которые не являются токсичными для реципиентов при дозировках и концентрациях, используемых в подходящей форме введения. Фармацевтическая композиция по изобретению может быть стерильной.
Подходящие препараты для молекул нуклеиновых кислот находятся в
Figure 00000011
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985. Относительно короткого обзора способов доставки лекарственных средств, см., например, Langer (Science 249:1527-1533, 1990). В WO 2007/031091 предложены дополнительные подходящие и предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей и адъювантов (включенных в данный документ посредством ссылки). Подходящие дозировки, препараты, пути введения, композиции, лекарственные формы, комбинации с другими терапевтическими агентами, препараты пролекарств также приводятся в WO 2007/031091.
Соединения согласно настоящему изобретению могут существовать в виде их фармацевтически приемлемых солей. Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к традиционным солям присоединения кислоты или солям присоединения основания, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства соединений по настоящему изобретению и образуются из подходящих нетоксичных органических или неорганических кислот, или органических или неорганических оснований. Соли присоединения кислоты включают, например, соли, происходящие из неорганических кислот, таких как соляная кислота, бромисто-водородная кислота, йодисто-водородная кислота, серная кислота, сульфаминовая кислота, фосфорная кислота и азотная кислота, и соли, происходящие из органических кислот, таких как п-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота, метансульфоновая кислота, щавелевая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, молочная кислота, фумаровая кислота и тому подобное. Соли присоединения основания включают соли, полученные из аммония, калия, натрия и гидроксидов четвертичного аммония, таких как, например, гидроксид тетраметиламмония. Химическая модификация фармацевтического соединения до соли представляет собой методику, хорошо известную химикам-фармацевтам, для того, чтобы получать улучшенную физическую и химическую стабильность, гигроскопичность, текучесть и растворимость соединений. Она, например, описывается в Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435 или в Ansel, в: Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed. (1995), pp. 196 и 1456-1457. Например, фармацевтически приемлемая соль соединений, предложенных в данном документе, может представлять собой натриевую соль.
Фармацевтическую композицию по изобретению готовят, дозируют и вводят способом, совместимым с надлежащей медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в данном контексте включают конкретное животное, которое лечат, клиническое состояние индивидуального пациента, место доставки агента, способ введения, схему введения, возраст и пол пациентов, и другие факторы, известные практикующим врачам. В данном документе термин «эффективное количество» (также известное как «(терапевтически) эффективная доза») означает количество соединения, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ субъекта, которого пытается добиться врач или другой медицинский работник. «Эффективное количество» ингибитора по изобретению, комбинированного препарата по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению будет управляться такими соображениями, и оно представляет собой минимальное количество, необходимое для ингибирования HBsAg и/или HBeAg. Например, такое количество может быть меньше количества, которое является токсичным для клеток реципиента или млекопитающего в целом.
Например, если ингибитор PAPD5 или ингибитор PAPD7 представляет(ют) собой антисмысловой олигонуклеотид, тогда введенное фармацевтически эффективное количество составляет дозу 0,1-15 мг/кг, как, например, 0,2-10 мг/кг, как, например, 0,25-5 мг/кг. Введение может осуществляться один раз в неделю, каждую 2-ую неделю, каждую третью неделю или даже один раз в месяц.
Молекулы нуклеиновых кислот или фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут вводиться местно (как, например, на кожу, ингаляцией, глазным или ушным путем) или энтерально (как, например, перорально или через желудочно-кишечный тракт), или парентерально (как, например, внутривенно, подкожно, внутримышечно, интрацеребрально, интрацеребровентрикулярно или интратекально).
В предпочтительном воплощении молекула нуклеиновой кислоты или фармацевтические композиции по настоящему изобретению вводятся парентеральным путем, включающим внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию, подоболочечное или внутричерепное, например, интрацеребральное или интравентрикулярное, интравитральное введение. В одном воплощении активный олигонуклеотид или олигонуклеотидный конъюгат вводится внутривенно. В другом воплощении молекула активной нуклеиновой кислоты или конъюгат молекулы нуклеиновой кислоты вводится подкожно.
Ингибитор по изобретению, комбинированный препарат по изобретению или фармацевтическая композиция по изобретению является полезной в предупреждении и/или лечении HBV по изобретению. Они предпочтительно ингибируют секрецию HBsAg и/или HBeAg, наиболее предпочтительно - HBsAg и HBeAg.
Определения
Нуклеотидная последовательность
Термин «нуклеотидная последовательность» или «полинуклеотид» является общеизвестным в данной области и включает молекулы, содержащие или состоящие из встречающихся в природе молекул, таких как ДНК и РНК, а также аналогов нуклеиновых кислот, таких как, например, трифосфаты олигонуклеотидов, замещенные рибоолигонуклеотиды, молекулы LNA, молекулы PNA, молекулы GNA (гликольнуклеиновая кислота), молекулы TNA (треозонуклеиновая кислота), морфолинополинуклеотиды или нуклеиновые кислоты с модифицированными остовами, такими как полисилоксан и 2'-O-(2-метокси)этил-фосфоротиоат, или нуклеиновая кислота с заместителями, такими как метил-, тио-, сульфат, бензоил-, фенил-, амино-, пропил-, хлор- и метанокарбануклеозиды, или репортерные молекулы для облегчения ее выявления. Кроме того, термин «нуклеотидная последовательность» в контексте настоящего изобретения следует истолковывать эквивалентно термину «молекула нуклеиновой кислоты», и, среди прочих, он может относиться к ДНК, РНК, PNA или LNA, или их гибридам, или их любой модификации, которая известна в данной области (см., например, US 5525711, US 4711955, US 5792608 или ЕР 302175 для примеров модификаций). Остатки нуклеиновой кислоты, содержащиеся в описанной последовательности нуклеиновой кислоты и предложенные в данном документе, могут представлять собой встречающиеся в природе остатки нуклеиновых кислот или остатки нуклеиновых кислот, полученные искусственно. Примерами остатков нуклеиновых кислот являются аденин (А), гуанин (G), цитозин (С), тимин (Т), урацил (U), ксантин (X) и гипоксантин (НХ). Как понятно специалисту в данной области, тимин (Т) и урацил (U) можно использовать взаимозаменяемо, в зависимости от соответствующего типа полинуклеотида. Например, как известно специалисту, тимин (Т) как часть ДНК соответствует урацилу (U) как части соответствующей транскрибированной мРНК. Полинуклеотиды, описанные и предложенные в данном документе, могут быть одно- или двухцепочечными, линейными или кольцевыми, природными или синтетическими.
Нуклеотидные последовательности, предложенные в данном документе, могут быть клонированы в вектор. Термин «вектор» в том виде, в котором он используется в данном документе, включает плазмиды, космиды, вирусы, бактериофаги и другие векторы, обычно используемые в генной инженерии. В предпочтительном воплощении данные векторы подходят для трансформации клеток, подобных клеткам млекопитающих или клеткам дрожжей. В данном документе вектор может представлять собой экспрессионный вектор. В общем, экспрессионные векторы были широко описаны в литературе. Они могут содержать селектируемый маркерный ген и репликатор, обеспечивающий репликацию у хозяина, промотор и сигнал терминации для транскрипции. Между промотором и сигналом терминации может быть по меньшей мере один сайт рестрикции или полилинкер, который делает возможной вставку последовательности нуклеиновой кислоты, желательной для экспрессии. Неограничивающие примеры вектора, в который можно клонировать предложенную в данном документе нуклеотидную последовательность, представляют собой аденовирусные, на основе аденосателлитного вируса (AAV), лентивирусные, лентивирусные на основе ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), невирусные миникольцевые векторы или другие векторы для бактериальных и эукариотических систем экспрессии.
Молекула нуклеиновой кислоты
Термин «молекула нуклеиновой кислоты» или «терапевтическая молекула нуклеиновой кислоты» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется, как его обычно понимает специалист: как молекула, содержащая два или более чем два ковалентно связанных нуклеозида (т.е. нуклеотидная последовательность). Молекула(лы) нуклеиновой кислоты, на которые дается ссылка в способе по изобретению, обычно представляют собой терапевтические олигонуклеотиды меньше 50 нуклеотидов в длину. Молекулы нуклеиновой кислоты могут представлять собой или содержат антисмысловой олигонуклеотид или могут представлять собой другую олигомерную молекулу нуклеиновой кислоты, такую как РНК CRISPR, миРНК, кшРНК, аптамер или рибозим. Молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой композиции, которые обычно получают в лаборатории посредством твердофазного химического синтеза, с последующей очисткой. При ссылке на последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, делается ссылка на последовательность или порядок группировок нуклеиновых оснований или их модификаций ковалентно связанных нуклеотидов или нуклеозидов. Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению является искусственной, синтезируется химически и типично очищается или выделяется. Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать один или более чем один модифицированный нуклеозид или нуклеотид.
В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит или состоит из 8-40 нуклеотидов в длину, как, например, из 9-35, как, например, из 10-30, как, например, из 11-22, как, например, из 12-20, как, например, из 13-18 или 14-16 непрерывных нуклеотидов в длину.
В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты или ее непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 22 или менее нуклеотидов, как, например, 20 или менее нуклеотидов, как, например, 18 или менее нуклеотидов, как, например, 14, 15, 16 или 17 нуклеотидов. Следует понимать то, что любой интервал, приведенный в данном документе, включает конечные точки интервала. Соответственно, если указано то, что молекула нуклеиновой кислоты включает от 10 до 30 нуклеотидов, включаются и 10, и 30 нуклеотидов.
В некоторых воплощениях непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 непрерывных нуклеотидов в длину.
Молекула(лы) нуклеиновой кислоты типично служит(жат) для модулирования экспрессии нуклеиновых кислот-мишеней у млекопитающего. В некоторых воплощениях молекулы нуклеиновых кислот, такие как миРНК, кшРНК и антисмысловые олигонуклеотиды, типично служат для ингибирования экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени. Молекулы нуклеиновой кислоты, при объединении, могут, следовательно, быть эффетивными в модулировании экспрессии одной или более чем одной нуклеиновой кислоты-мишени у млекопитающего.
В одном воплощении изобретения молекула нуклеиновой кислоты выбрана из реактива на основе РНКи, такой как миРНК, кшРНК или антисмысловой олигонуклеотид. В предпочтительных воплощениях молекула нуклеиновой кислоты представляет собой высокоаффинный модифицированный антисмысловой олигонуклеотид.
В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу фосфоротиоатной нуклеиновой кислоты. В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты содержит фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.
В некоторых воплощениях молекула(лы) нуклеиновой кислоты может(гут) быть конъюгированы с ненуклеозидными группировками (конъюгатными группировками).
Библиотеку молекул нуклеиновой кислоты следует понимать как набор вариантов молекул нуклеиновой кислоты. Цель библиотеки молекул нуклеиновой кислоты может варьировать. В некоторых воплощениях библиотека молекул нуклеиновой кислоты состоит из олигонуклеотидов с разными последовательностями нуклеиновых оснований, например, она может представлять собой библиотеку молекул нуклеиновой кислоты, которая сконструирована по всей длине нуклеиновой кислоты-мишени (например, последовательности РНК), например, может быть получена библиотека антисмысловых олигонуклеотидов или молекул миРНК посредством «прогулки по гену» мРНК с целью идентификации областей на нуклеиновой кислоте-мишени, где молекулы нуклеиновой кислоты эффективно модулируют нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых воплощениях библиотека молекул нуклеиновой кислоты состоит из олигонуклеотидов с перекрывающейся последовательностью нуклеиновых оснований, нацеленной на конкретную область на нуклеиновой кислоте-мишени, с целью идентификации наиболее эффективной последовательности в библиотеке молекул нуклеиновой кислоты. В некоторых воплощениях библиотека молекул нуклеиновой кислоты представляет собой библиотеку сконструированных вариантов молекулы нуклеиновой кислоты («потомство» молекул нуклеиновой кислоты) родительской или предковой молекулы нуклеиновой кислоты, где сконструированные варианты молекулы нуклеиновой кислоты сохраняют коровую последовательность нуклеиновых оснований родительской молекулы нуклеиновой кислоты.
Олигонуклеотид
Термин «олигонуклеотид» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется таким образом, как обычно понятно специалисту, как молекула, содержащая два или более чем два ковалентно связанных нуклеозида. Такие ковалентно связанные нуклеозиды также могут называться молекулами нуклеиновой кислоты или олигомерами. Олигонуклеотиды обычно получают в лаборатории посредством твердофазного химического синтеза с последующей очисткой. При ссылке на последовательность олигонуклеотида, делается ссылка на последовательность или порядок группировок нуклеиновых оснований или их модификаций ковалентно связанных нуклеотидов или нуклеозидов. Олигонуклеотид по изобретению является искусственным, синтезируется химически и типично очищается или выделяется. Олигонуклеотид по изобретению может содержать один или более чем один модифицированный нуклеозид или нуклеотид. Антисмысловой олигонуклеотид представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид с минимальным образованием или отсутствием образования внутреннего дуплекса. Молекула миРНК обычно состоит из 2 комплементарных олигонуклеотидных нитей (смысловой нити и антисмысловой нити), которые образуют двухцепочечную молекулу. Молекула кшРНК представляет собой олигонуклеотид, который обычно длиннее, чем антисмысловой олигонуклеотид, и который образует структуру внутреннего дуплекса (шпильки) в пределах молекулы.
Антисмысловые олигонуклеотиды
Термин «антисмысловой олигонуклеотид» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется как олигонуклеотид, способный модулировать экспрессию гена-мишени посредством гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, в частности с непрерывной последовательностью на нуклеиновой кислоте-мишени. Антисмысловые олигонуклеотиды по существу не являются двухцепочечными и, следовательно, не являются миРНК или кшРНК. Предпочтительно антисмысловые олигонуклеотиды по настоящему изобретению являются одноцепочечными.
РНКи
В данном документе термин «молекула РНК-интерференции (РНКи)» относится к любой молекуле, ингибирующей экспрессию или трансляцию РНК, включая молекулы нуклеиновых кислот, определенные в данном документе. Малая интерферирующая РНК (миРНК) представляет собой двухцепочечную молекулу РНК, которая посредством комплементарного связывания с мРНК после транскрипции, приводит к их деградации и потере трансляции. Малая шпилечная РНК (мшРНК) представляет собой искусственную молекулу РНК со структурой шпильки, которая способна при экспрессии уменьшать уровень мРНК посредством дайсер (Dicer) и комплекса сайленсинга, уменьшающего уровень мРНК (RISC). Молекулы РНКи могут быть сконструированы на основе последовательности РНК интересующего гена. Соответствующие РНКи могут быть затем синтезированы химически или посредством транскрипции in vitro, или экспрессированы от вектора или ПЦР-продукта.
Молекулы миРНК и кшРНК обычно имеют от 20 до 50 нуклеотидов в длину, как, например, от 25 до 35 нуклеотидов в длину, и они взаимодействуют с эндонуклеазой, известной как дайсер (Dicer), которая, как считается, подвергает процессингу дцРНК до малых интерферирующих РНК из 19-23 пар оснований с характерными 3' липкими концами из двух оснований, которые затем включаются в комплекс РНК-индуцированного сайленсинга (RISC). Эффективные удлиненные формы субстратов дайсер были описаны в US 8349809 и US 8513207, тем самым включенных посредством ссылки. При связывании с подходящей мРНК-мишенью одна или более чем одна эндонуклеаза в пределах RISC расщепляет мишень с индукцией сайленсинга. Агенты РНКи могут быть химически модифицированными с использованием модифицированных межнуклеозидных связей и высокоаффинных нуклеозидов, таких как нуклеозиды, модифицированные 2'-4' бициклической рибозой, включающие LNA и сЕТ.
Непрерывная нуклеотидная последовательность
Термин «непрерывная нуклеотидная последовательность» относится к области олигонуклеотида, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени. Данный термин используется в данном документе взаимозаменяемо с термином «непрерывная последовательность нуклеиновых оснований» и термином «последовательность олигонуклеотидного мотива». В некоторых воплощениях все нуклеотиды данного олигонуклеотида составляют непрерывную нуклеотидную последовательность. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность и, возможно, может содержать дополнительный(ные) нуклеотид(ды), например, область нуклеотидного линкера, которая может использоваться для присоединения функциональной группы к непрерывной нуклеотидной последовательности. Область нуклеотидного линкера может быть или может не быть комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.
Нуклеотиды
Нуклеотиды представляют собой структурные элементы олигонуклеотидов и полинуклеотидов и для целей настоящего изобретения включают и встречающиеся в природе, и не встречающиеся в природе нуклеотиды. В природе нуклеотиды, такие как нуклеотиды ДНК и РНК, содержат группировку сахара рибозы, группировку нуклеинового основания и одну или более чем одну фосфатную группу (которая отсутствует в нуклеозидах). Нуклеозиды и нуклеотиды также могут взаимозаменяемо называться «звеньями» или «мономерами».
Модифицированный нуклеозид
Термин «модифицированный нуклеозид» или «модификация нуклеозида» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к нуклеозидам, модифицированным по сравнению с эквивалентным нуклеозидом ДНК или РНК посредством введения одной или более чем одной модификации сахарной группировки или группировки (нуклеинового) основания. В предпочтительном воплощении модифицированный нуклеозид содержит модифицированную сахарную группировку. Термин «модифицированный нуклеозид» также может использоваться в данном документе взаимозаменяемо с термином «аналог нуклеозида» или модифицированные «звенья», или модифицированные «мономеры». Нуклеозиды с немодифицированной сахарной группировкой ДНК или РНК называются в данном документе нуклеозидами ДНК или РНК. Нуклеозиды с модификациями в области основания нуклеозида ДНК или РНК все еще, в общем, называются ДНК или РНК, если они обеспечивают образование пар оснований по Уотсону-Крику.
Модифицированная межнуклеозидная связь
Термин «модифицированная межнуклеозидная связь» определяется так, как обычно понятно специалисту: как связи, отличные от фосфодиэфирных (РО) связей, которые ковалентно связывают вместе два нуклеозида. Нуклеотиды с модифицированными межнуклеозидными связями также называются «модифицированными нуклеотидами». В некоторых воплощениях модифицированная межнуклеозидная связь увеличивает устойчивость молекул нуклеиновых кислот по изобретению к нуклеазе по сравнению с фосфодиэфирной связью. Для олигонуклеотидов, встречающихся в природе, межнуклеозидная связь включает фосфатные группы, создающие фосфодиэфирную связь между соседними нуклеозидами. Модифицированные межнуклеозидные связи являются особенно полезными в стабилизации олигонуклеотидов, а также миРНК для применения in vivo, и они могут служить для защиты против нуклеазного расщепления в областях нуклеозидов ДНК или РНК в олигонуклеотиде или миРНК по изобретению, например, в пределах области гэпа гэпмерного олигонуклеотида, а также в областях модифицированных нуклеозидов.
В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты, например, антисмысловой олигонуклеотид, кшРНК или миРНК, содержит одну или более чем одну межнуклеозидную связь, модифицированную от природного фосфодиэфира до связи, которая, например, является более устойчивой к нуклеазной атаке. Устойчивость к нуклеазе можно определять посредством инкубирования олигонуклеотида в сыворотке крови или посредством применения анализа устойчивости к нуклеазе (например, фосфодиэстеразе яда змеи (SVPD)), которые оба хорошо известны в данной области. Межнуклеозидные связи, которые способны усиливать устойчивость олигонуклеотида к нуклеазе, называются нуклеазоустойчивыми межнуклеозидными связями. В некоторых воплощениях по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в антисмысловом олигонуклеотиде или в его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными как, например, по меньшей мере 60%, как, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 80% или как, например, по меньшей мере 90% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или в его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными. Будет понятно то, что в некоторых воплощениях нуклеозиды, которые связывают олигонуклеотид по изобретению с ненуклеотидной функциональной группой, такой как конъюгат, могут содержать фосфодиэфир. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности являются нуклеазоустойчивыми межнуклеозидными связями.
Модифицированные межнуклеозидные связи могут быть выбраны из группы, содержащей фосфоротиоат, дифосфоротиоат и боранофосфат. В некоторых воплощениях модифицированные межнуклеозидные связи, например, фосфоротиоатная, дифосфоротиоатная или боранофосфатная, являются совместимыми с рекрутированием олигосахаридом по изобретению РНКазы Н.
В некоторых воплощениях межнуклеозидная связь, такая как фосфоротиоатная межнуклеозидная связь, содержит серу (S).
Фосфоротиоатная межнуклеозидная связь является особенно полезной из-за устойчивости к нуклеазе, полезной фармакокинетики и легкости получения. В некоторых воплощениях по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат, как, например, по меньшей мере 60%, как, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 80% или как, например, по меньшей мере 90% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит одну или более чем одну нейтральную межнуклеозидную связь, в частности, межнуклеозидную связь, выбранную из фосфотриэфира, метилфосфоната, MMI, амида-3, формацеталя или тиоформацеталя.
Дополнительные межнуклеозидные связи раскрываются в WO 2009/124238 (включенной в данный документ посредством ссылки). В одном воплощении межнуклеозидная связь выбрана из линкеров, раскрытых в WO 2007/031091 (включенной в данный документ посредством ссылки). В частности, межнуклеозидная связь может быть выбрана из -O-Р(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, 0-PO(OCH3)-0-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, и/или межнуклеозидный линкер может быть выбран из группы, состоящей: -O-СО-O-, -О-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRHCO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-, где RH выбран из водорода и С1-4-алкила.
Нуклеазоустойчивые связи, такие как фосфотиоатные связи, являются особенно полезными в областях антисмысловых олигонуклеотидов, способных рекрутировать нуклеазу, при формировании дуплекса с нуклеиновой кислотой-мишенью, таких как область G для гэпмеров или область немодифицированных нуклеозидов хэдмеров (headmer) и тэйлмеров (tailmer). Однако, фосфоротиоатные связи также могут быть полезными в областях, не рекрутирующих нуклеазу, и/или в областях, усиливающих аффинность, таких как области F и F' для гэпмеров, или в области модифицированных нуклеозидов хэдмеров и тэйлмеров.
Каждая из сконструированных областей может, однако, содержать межнуклеозидные связи, отличные от фосфоротиоатных, такие как фосфодиэфирные связи, в частности, в областях, где модифицированные нуклеозиды, такие как LNA, защищают связь от нуклеазной деградации. Включение фосфодиэфирных связей, как, например, одной или двух связей, в частности между или рядом с модифицированными нуклеозидными звеньями (типично в областях, не рекрутирующих нуклеазу), может модифицировать биодоступность и/или биораспределение олигонуклеотида - см. WO 2008/113832, включенную в данный документ посредством ссылки.
В одном воплощении все межнуклеозидные связи в антисмысловом олигонуклеотиде представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. Предпочтительно все межнуклеозидные связи в олигонуклеотиде представляют собой фосфоротиоатные связи.
Нуклеиновое основание
Термин «нуклеиновое основание» включает пуриновую (например, аденин и гуанин) и пиримидиновую (например, урацил, тимин и цитозин) группировку, присутствующую в нуклеозидах и нуклеотидах, которые образуют водородные связи при гибридизации нуклеиновых кислот. В контексте настоящего изобретения термин нуклеиновое основание также охватывает модифицированные нуклеиновые основания, которые могут отличаться от встречающихся в природе нуклеиновых оснований, но являются функциональными во время гибридизации нуклеиновых кислот. В данном контексте термин «нуклеиновое основание» относится и к встречающимся в природе нуклеиновым основаниям, таким как аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин и гипоксантин, также как и к не встречающимся в природе вариантам. Такие варианты, например, описываются в Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research, том 45, страница 2055 и Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1.
В некоторых воплощениях группировка нуклеинового основания модифицируется заменой пурина или пиримидина на модифицированный пурин или пиримидин, такой как замещенный пурин или замещенный пиримидин, как, например, нуклеиновое основание, выбранное из изоцитозина, псевдоизоцитозина, 5-метилцитозина, 5-тиозолоцитозина, 5-пропинилцитозина, 5-пропинилурацила, 5-бромурацил-5-тиазолоурацила, 2-тиоурацила, 2'-тиотимидина, инозина, диаминопурина, 6-аминопурина, 2-аминопурина, 2,6-диаминопурина и 2-хлор-6-аминопурина.
Группировки нуклеиновых оснований могут быть указаны буквенным кодом для каждого соответствующего нуклеинового основания, например, А, Т, G, С или U, где каждая буква возможно может включать модифицированные нуклеиновые основания с эквивалентной функцией. Например, в проиллюстрированных в качестве примеров олигонуклеотидах группировки нуклеиновых оснований выбраны из А, Т, G, С и 5-метилцитозина. Возможно для гэпмеров LNA можно использовать 5-метилцитозин нуклеозидов LNA.
Модифицированный олигонуклеотид
Термин «модифицированный олигонуклеотид» или «модифицированная молекула нуклеиновой кислоты» описывает олигонуклеотид или молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую один или более чем один нуклеозид с модифицированным сахаром и/или модифицированными межнуклеозидными связями. Термин «химерный» представляет собой термин, который использовали в литературе для описания олигонуклеотидов или молекул нуклеиновых кислот с модифицированными нуклеозидами, в частности, олигонуклеотидами гэпмера.
Комплементарность
Термин «комплементарность» описывает способность
нуклеозидов/нуклеотидов к образованию пар оснований по Уотсону-Крику. Парами оснований по Уотсону-Крику являются гуанин (С)-цитозин (С) и аденин (А)-тимин (Т)/урацил (U). Будет понятно то, что олигонуклеотиды могут содержать нуклеозиды с модифицированными нуклеиновыми основаниями, например, 5-метилцитозин часто используется вместо цитозина, и термин «комплементарность», как таковой, охватывает образование пар оснований по Уотсону-Крику между немодифицированными и модифицированными нуклеиновыми основаниями (см., например, Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research, том 45, страница 2055 и Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1).
Термин «% комплементарности» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к числу нуклеотидов непрерывной нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты (например, в олигонуклеотиде) в процентах, которые, в данном положении, являются комплементарными (т.е. образуют пары оснований по Уотсону-Крику) в данном положении непрерывной нуклеотидной последовательности отдельной молекулы нуклеиновой кислоты (например, нуклеиновой кислоты-мишени). Данная процентная доля рассчитывается подсчетом числа выровненных оснований, которые образуют пары между двумя последовательностями (при выравнивании с использованием последовательности-мишени 5'-3' и последовательности олигонуклеотида от 3' к 5'), деля на общее число нуклеотидов в олигонуклеотиде и умножая на 100. При таком сравнении нуклеиновое основание/нуклеотид, который не выравнивается (не образует пару оснований), называется несоответствием. Предпочтительно при расчете % комплементарности непрерывной нуклеотидной последовательности не допускаются вставки и делеции.
Термин «полностью комплементарный» относится к 100%-ной комплементарности.
Следующее представляет собой пример олигонуклеотида (SEQ ID NO: 12), который является полностью комплементарным области нуклеиновой кислоты-мишени (SEQ ID NO: 10).
Figure 00000012
Идентичность
В контексте настоящего изобретения термин «идентичность» или «процент идентичности» означает то, что аминокислотные или нуклеотидные последовательности имеют идентичности по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, даже более предпочтительно по меньшей мере 98% и даже более предпочтительно по меньшей мере 99% идентичности последовательностям, показанным в данном документе, например, последовательностям SEQ ID NO: 1, 2 или 3, где более высокие значения идентичности являются предпочтительными по отношению к более низким значениям. Согласно настоящему изобретению термин «идентичность/идентичности» или «процент идентичности/идентичностей» в контексте двух или более чем двух последовательностей нуклеиновой кислоты или аминокислотных последовательностей относится к двум или более чем двум последовательностям, которые являются одинаковыми, или которые имеют определенную процентную долю аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с аминокислотными последовательностями, например, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 7, 8 или 9, или с нуклеотидными последовательностями, например, SEQ ID NO: 4, 5, 6, 10 или 11) при сравнении и выравнивании на максимальное соответствие в окне сравнения или по обозначенной области, при измерении с использованием алгоритма сравнения последовательности, как известно в данной области, или посредством выравнивания вручную и визуальной проверки.
Для аминокислотных последовательностей предпочтительно существует описанная идентичность в области, которая состоит из по меньшей мере примерно 50 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 100 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 400 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 500 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 600 аминокислот и наиболее предпочтительно для всех аминокислот по длине.
В случае нуклеотидных последовательностей описанная идентичность наиболее предпочтительно существует в области, которая состоит из по меньшей мере 100 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 1000 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 2000 нуклеотидов и наиболее предпочтительно всех нуклеотидов по длине. Однако для молекул нуклеиновых кислот, которые обычно меньше 50 нуклеотидов, идентичность может оцениваться по значительно более короткой области. Обычно процентная доля идентичности молекул нуклеиновых кислот рассчитывается путем подсчета числа выровненных оснований, которые являются идентичными между двумя последовательностями, деля на общее число нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты и умножая на 100. Процентная доля идентичности = (совпадения × 100) / длина выровненной области. Предпочтительно при расчете % идентичности непрерывной нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты не допускаются вставки и делеции.
Специалистам в данной области будет известно как определять процент идентичности между/среди последовательностей, используя, например, такие алгоритмы, как алгоритмы, основанные на компьютерной программе CLUSTALW (Thompson, 1994, Nucl Acids Res, 2: 4673-4680) или FASTDB (Brutlag, 1990, Comp App Biosci, 6: 237-245), как известно в данной области. Специалистам в данной области также доступны алгоритмы BLAST и BLAST 2.0 (Altschul, 1997, Nucl Acids Res 25: 3389-3402; Altschul, 1993, J Mol Evol, 36: 290-300; Altschul, 1990, J Mol Biol 215: 403-410). Например, BLAST 2.0, которая обозначает инструмент поиска основного местного выравнивания BLAST (Altschul, 1997, местн. цит.; Altschul, 1993, местн. цит.; Altschul, 1990, местн. цит.), можно использовать для поиска местных выравниваний последовательностей. BLAST, как обсуждалось выше, дает выравнивания и нуклеотидной, и аминокислотной последовательностей для определения сходства последовательностей. Из-за местной природы выравниваний BLAST является особенно полезным в определении точных совпадений или в идентификации аналогичных последовательностей. Аналогичные компьютерные методики с использованием BLAST (Altschul, 1997, местн. цит.; Altschul, 1993, местн. цит.; Altschul, 1990, местн. цит.) используются для поиска идентичных или родственных молекул в базах данных нуклеотидов, таких как GenBank или EMBL.
Гибридизация
Термин «осуществление гибридизации» или «гибридизуется» в том виде, в котором он используется в данном документе, следует понимать как две нити нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотид и нуклеиновая кислота-мишень), образующие водородные связи между парами оснований на противоположных нитях, формируя, посредством этого, дуплекс. Аффинность связывания между двумя нитями нуклеиновой кислоты представляет собой силу гибридизации. Она часто описывается в показателях температуры плавления (Tm), определенной как температура, при которой половина олигонуклеотидов образует дуплекс с нуклеиновой кислотой-мишенью. При физиологических условиях Tm не является строго пропорциональной аффинности (Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537). Свободная энергия Гиббса в стандартном состоянии - ΔG° - является более точным представлением аффинности связывания и связана с константой диссоциации (Kd) реакции согласно уравнению ΔG°=-RTIn(Kd), где R представляет собой газовую постоянную, и Т представляет собой абсолютную температуру. Следовательно, очень низкая ΔG° реакции между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью отражает сильную гибридизацию между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью. ΔG° представляет собой энергию, связанную с реакцией, где концентрации в воде составляют 1 М, рН составляет 7, и температура составляет 37°С. Гибридизация олигонуклеотидов с нуклеиновой кислотой-мишенью представляет собой спонтанную реакцию, и для спонтанных реакций ΔG° меньше, чем ноль. ΔG° можно измерять экспериментально, например, посредством применения способа изотермической титрационной калориметрии (ITC), как описано в Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38 и Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. Специалисту будет известно то, что доступно имеющееся в продаже оборудование для измерений ΔG°. ΔG° также можно оценивать численно посредством применения модели ближайшего соседа, как описывается SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465, с использованием подходящим образом выведенных термодинамических параметров, описанных Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 и McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405. Для того чтобы иметь возможность модулирования их намеченной нуклеиновой кислоты-мишени посредством гибридизации, олигонуклеотиды по настоящему изобретению гибридизуются с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочными значениями ΔG° меньше -41,8 кДж для олигонуклеотидов, которые имеют 10-30 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях степень или сила гибридизации измеряется посредством свободной энергии Гиббса в стандартном состоянии - ΔG°. Олигонуклеотиды могут гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочными значениями ΔG° меньше интервала -41,8 кДж, как, например, меньше -62,8 кДж, как, например, меньше -83,7 кДж и как, например, меньше -104,6 кДж для олигонуклеотидов, которые имеют 8-30 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды гибридизуются с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочным значением ΔG° от -41,8 до -251 кДж, как, например, от -50,2 до -167,4 кДж, как, например, от -62,8 до -125,5 кДж или от -66,9 до 113 кДж, как, например, от -75,3 до -104,6 кДж.
Нуклеиновая кислота-мишень
Согласно настоящему изобретению нуклеиновая кислота-мишень представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует PAPD5 или PAPD7 млекопитающего и может представлять собой, например, ген, РНК, мРНК и пре-мРНК, зрелую мРНК или последовательность кДНК. Следовательно, данная мишень может называться нуклеиновая кислота-мишень PAPD5 или PAPD7. Олигонуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты по изобретению, например, может быть нацелена на области экзонов PAPD5 или PAPD7 млекопитающего, или, например, может быть нацелена на область интрона пре-мРНК PAPD5 или PAPD7. Подходящим образом, нуклеиновая кислота-мишень кодирует белок PAPD5 или PAPD7, в частности PAPD5 или PAPD7 млекопитающего, такой как PAPD5 или PAPD7 человека (см., например, Таблицы 1А и Б, и Таблицу 2А и Б), в которых приводятся последовательности мРНК и пре-мРНК для человеческого, обезьяньего, крысиного и свиного PAPD5 или PAPD7).
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота-мишень выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5 и 10 или их встречающихся в природе вариантов (например, последовательностей, кодирующих PAPD5 млекопитающего).
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота-мишень выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6 или 11, или их встречающихся в природе вариантов (например, последовательностей, кодирующих PAPD7 млекопитающего).
При использовании олигонуклеотида по изобретению в исследовании или диагностике нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой кДНК или синтетическую нуклеиновую кислоту, происходящую из ДНК или РНК.
Для применения in vivo или in vitro олигонуклеотид по изобретению типично способен ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени PAPD5 или PAPD7 в клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту-мишень PAPD5 или PAPD7. Непрерывная последовательность нуклеиновых оснований олигонуклеотида по изобретению типично комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени PAPD5 или PAPD7 при измерении по длине олигонуклеотида, возможно, за исключением одного или двух несоответствий, и, возможно, исключая линкерные области на основе нуклеотидов, которые могут связывать олигонуклеотид с возможной функциональной группой, такой как конъюгат или другие некомплементарные концевые нуклеотиды (например, область D' или D''). Нуклеиновая кислота-мишень в некоторых воплощениях может представлять собой РНК или ДНК, такую как матричная РНК, как, например, зрелая мРНК или пре-мРНК. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота-мишень представляет собой РНК или ДНК, которая кодирует белок PAPD5 или PAPD7 млекопитающего, такой как человеческий PAPD5 или PAPD7, например, последовательность мРНК человеческого PAPD5, такую как последовательность, раскрытая как SEQ ID NO 4, 5 или 10, или последовательность мРНК человеческого PAPD7, такую как последовательность, раскрытая как SEQ ID NO 6 или 11. Дополнительная информация по типичым нуклеиновым кислотам-мишеням приводится в Таблицах 1А и Б, и Таблице 2А и Б.
Figure 00000013
Figure 00000014
Прям. - прямая нить. Обр. - обратная нить. Геномные координаты дают последовательность пре-мРНК (геномная последовательность).
Последовательность-мишень
Термин «последовательность-мишень» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к последовательности нуклеотидов, присутствующей в нуклеиновой кислоте-мишени, которая содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая является комплементарной олигонуклеотиду или молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению. В некоторых воплощениях последовательность-мишень состоит из области на нуклеиновой кислоте-мишени, которая является комплементарной непрерывной нуклеотидной последовательности олигонуклеотида по изобретению (т.е. подпоследовательности).
Олигонуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной или гибридизуется с областью на нуклеиновой кислоте-мишени, такой как подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени, такой как последовательность-мишень, описанная в данном документе.
Последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, которой является комплементарным или с которой гибридизуется олигонуклеотид, обычно содержит отрезок непрерывных нуклеиновых оснований из по меньшей мере 10 нуклеотидов. Непрерывная нуклеотидная последовательность содержит от 10 до 50 нуклеотидов, как, например, 12-30, как, например, 13-25, как, например, 14-20, как, например, 15-18 смежных нуклеотидов.
Вариант, встречающийся в природе
Термин «вариант, встречающийся в природе» относится к вариантам PAPD5 или PAPD7, или транскриптам, которые происходят из тех же самых генетических локусов, что и нуклеиновая кислота-мишень, но могут отличаться, например, за счет вырожденности генетического кода, вызывающей множественность кодонов, кодирующих ту же самую аминокислоту, или благодаря альтернативному сплайсингу пре-мРНК, или присутствию полиморфизмов, таких как однонуклеотидные полиморфизмы и аллельные варианты. На основе присутствия достаточно комплементарной последовательности к олигонуклеотиду, олигонуклеотид по изобретению, следовательно, может быть нацелен на нуклеиновую кислоту-мишень и ее встречающиеся в природе варианты.
В некоторых воплощениях встречающиеся в природе варианты имеют по меньшей мере 95%, как, например, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологии с нуклеиновой кислотой-мишенью PAPD5 млекопитающего, такой как нуклеиновая кислота-мишень, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO 4, 5 или 10.
В некоторых воплощениях встречающиеся в природе варианты имеют по меньшей мере 95%, как, например, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологии с нуклеиновой кислотой-мишенью PAPD5 млекопитающего, такой как нуклеиновая кислота-мишень, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6 или 11.
В гене PAPD5 или PAPD7 известны многочисленные однонуклеотидные полиморфизмы, например, однонуклеотидные полиморфизмы, раскрытые в Таблице 2А (исходной/эталонной последовательностью человеческой пре-мРНК является SEQ ID NO: 10) и Таблице 2Б (исходной/эталонной последовательностью человеческой пре-мРНК является SEQ ID NO: 11).
Figure 00000015
Figure 00000016
Figure 00000017
Figure 00000018
Модуляция экспрессии
Термин «модуляция экспрессии» в том виде, в котором он используется в данном документе, следует понимать как общий термин для способности молекул нуклеиновых кислот изменять количество PAPD5 или PAPD7 по сравнению с количеством PAPD5 или PAPD7 до введения молекулы нуклеиновой кислоты. В качестве альтернативы, модуляцию экспрессии можно определять посредством ссылки на контрольный эксперимент. Обычно понятно то, что контроль представляет собой индивида или клетку-мишень, обработанную композицией физиологического раствора, или индивида или клетку-мишень, обработанную ненацеленой молекулой нуклеиновой кислоты (имитация). Однако он также может представлять собой индивида, которого лечили стандартом лечения.
Одним типом модуляции является способность молекул нуклеиновых кислот ингибировать, осуществлять понижающую регуляцию, уменьшать, подавлять, удалять, останавливать, блокировать, предотвращать, ослаблять, снижать, устранять или прекращать экспрессию PAPD5 или PAPD7, например, посредством деградации мРНК или блокировки транскрипции.
Высокоаффинные модифицированные нуклеозиды
Высокоаффинный модифицированный нуклеозид представляет собой модифицированный нуклеотид, который, при включении в олигонуклеотид, увеличивает аффинность олигонуклеотида в отношении его комплементарной мишени, например, при измерении по температуре плавления (Tm). Высокоаффинный модифицированный нуклеозид по настоящему изобретению предпочтительно приводит к увеличению температуры плавления от +0,5 до +12°С, более предпочтительно - от +1,5 до +10°С, и наиболее предпочтительно - от +3 до +8°С на модифицированный нуклеозид. В данной области известны многочисленные высокоаффинные модифицированные нуклеозиды, и они включают, например, многие 2'-замещенные нуклеозиды, а также запертые нуклеиновые кислоты (LNA) (см., например, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 и Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213).
Модификации сахара
Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать один или более чем один нуклеозид, который имеет модифицированную сахарную группировку, т.е. модификацию сахарной группировки по сравнению с рибозной сахарной группировкой, находящейся в ДНК и РНК.
Были получены многочисленные нуклеозиды с модификацией рибозной сахарной группировки, главным образом, с целью улучшения определенных свойств молекул нуклеиновых кислот, таких как аффинность и/или нуклеазоустойчивость.
Такие модификации включают модификации, где модифицируется структура рибозного кольца, например, посредством замены на гексозное кольцо (HNA) или бициклическое кольцо, которое типично имеет бирадикальный мостик между углеродами С2 и С4 на рибозном кольце (LNA), или на несвязанное рибозное кольцо, у которого типично отсутствует связь между углеродами С2 и С3 (например, UNA). Другие нуклеозиды с модифицированным сахаром включают, например, бициклогексозные нуклеиновые кислоты (WO 2011/017521) или трициклические нуклеиновые кислоты (WO 2013/154798). Модифицированные нуклеозиды также включают нуклеозиды, где сахарная группировка заменяется на несахарную группировку, например, в случае пептидных нуклеиновых кислот (PNA) или морфолинонуклеиновых кислот.
Модификации Сахаров также включают модификации, сделанные посредством изменения замещающих групп на рибозном кольце на группы, отличные от водорода, или группы 2'-ОН, находящихся в природе в нуклеозидах ДНК и РНК. Заместители, например, можно вводить в 2'-, 3'-, 4'- или 5'-положения. Нуклеозиды с модифицированными сахарными группировками также включают 2'-модифицированные нуклеозиды, такие как 2'-замещенные нуклеозиды. В самом деле, значительное внимание было потрачено на разработку 2'-замещенных нуклеозидов, и было обнаружено то, что многочисленные 2'-замещенные нуклеозиды имеют полезные свойства при включении в олигонуклеотиды, такие как повышенная устойчивость нуклеозидов и повышенная аффинность.
2'-Модифицированные нуклеозиды
Нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, представляет собой нуклеозид, который имеет в положении 2' заместитель, отличный от Н или -ОН (2'-замещенный нуклеозид) или содержит 2'-связанный бирадикал и включает 2'-замещенные нуклеозиды и нуклеозиды LNA (связанные 2'-4' бирадикальным мостиком). Например, 2'-модифицированный сахар может обеспечивать повышенную аффинность связывания и/или повышенную нуклеазоустойчивость олигонуклеотида. Примерами 2'-замещенных модифицированных нуклеозидов являются 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-РНК и 2'-F-ANA (F-ANA) нуклеозид. Относительно дополнительных примеров, пожалуйста, см., например, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 и Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. Ниже приводятся иллюстрации некоторых 2'-замещенных модифицированных нуклеозидов.
Figure 00000019
Нуклеозиды запертых нуклеиновых кислот (LNA)
Нуклеозиды LNA представляют собой модифицированные нуклеозиды, которые содержат линкерную группу (именуемую бирадикал или мостик) между С2' и С4' рибозного сахарного кольца нуклеотида. Данные нуклеозиды также называются в литературе мостиковой нуклеиновой кислотой или бициклической нуклеиновой кислотой (BNA).
В некоторых воплощениях модифицированный нуклеозид или нуклеозиды LNA олигомера по изобретению имеют общую структуру формулы I или II:
Figure 00000020
Figure 00000021
где W выбран из -O-, -S-, -N(Ra)-, -C(RaRb)-, таким образом, что в некоторых воплощениях -О-; В обозначает нуклеиновое основание или модифицированную группировку нуклеинового основания;
Z обозначает межнуклеозидную связь с соседним нуклеозидом или 5'-концевую группу;
Z* обозначает межнуклеозидную связь с соседним нуклеозидом или 3'-концевую группу;
X обозначает группу, выбранную из списка, состоящего из -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -О-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- и >C=Z.
В некоторых воплощениях X выбран из группы, состоящей из: -О-, -S-, NH-, NRaRb, -СН2-, CRaRb, -С(=СН2)- и -C(=CRaRb)-.
В некоторых воплощениях X представляет собой -О-.
Y обозначает группу, выбранную из группы, состоящей из -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -О-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- и >C=Z.
В некоторых воплощениях Y выбран из группы, состоящей из: -СН2-, -C(RaRb)-, -СН2СН2-, -C(RaRb)-C(RaRb)-, -СН2СН2СН2-, -C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)- и -C(Ra)=N-.
В некоторых воплощениях Y выбран из группы, состоящей из: -СН2-, -CHR3-, -СНСН3-, CRaRb-.
или -X-Y- совместно обозначают двухвалентную линкерную группу (также именуемую радикал), состоящую из 1, 2, 3 или 4 групп/атомов, выбранных из группы, состоящей из -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -О-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- и >C=Z.
В некоторых воплощениях -X-Y- обозначает бирадикал, выбранный из групп, состоящих из: -Х-СН2-, -X-CRaRb-, -X-CHRa-, -Х-С(НСН3)-, -O-Y-, -O-CH2-, -S-СН2-, -NH-CH2-, -О-СНСН3-, -СН2-O-СН2, -О-СН(СН3СН3)-, -O-СН2-СН2-, ОСН2-СН2-СН2-, -O-СН2ОСН2-, -O-NCH2-, -С(=СН2)-СН2-, -NRa-CH2-, N-O-CH2, -S-CRaRb- и -S-CHRa-.
В некоторых воплощениях -X-Y- обозначает -O-СН2- или -O-СН(СН3)-, где Z выбран из -О-, -S- и -N(Ra)-,
и Ra, и, при наличии Rb, каждый независимо выбран из водорода, возможно замещенного C1-6-алкила, возможно замещенного С2-6-алкенила, возможно замещенного С2-6-алкинила, гидрокси, возможно замещенного C1-6-алкокси, С2-6-алкоксиалкила, С2-6-алкенилокси, карбокси, C1-6-алкоксикарбонила, C1-6-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С1-6-алкил)-амино-карбонила, амино-С1-6-алкил-аминокарбонила, моно- и ди(С1-6-алкил)амино-С1-6-алкил-аминокарбонила, C1-6-алкил-карбониламино, карбамидо, C1-6-алканоилокси, сульфоно, C1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, C1-6-алкилтио, галогена, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены, и где два геминальных заместителя Ra и Rb могут вместе обозначать возможно замещенный метилен (=СН2), где для всех хиральных центров асимметрические группы могут находиться либо в R, либо в S ориентации.
где R1, R2, R3, R5 и R5* независимо выбраны из группы, состоящей из: водорода, возможно замещенного C1-6-алкила, возможно замещенного С2-6-алкенила, возможно замещенного С2-6-алкинила, гидрокси, C1-6-алкокси, С2-6-алкоксиалкила, С2-6-алкенилокси, карбокси, C1-6-алкоксикарбонила, C1-6-алкилкарбонила, формила, арила, арилокси-карбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилокси-карбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С1-6-алкил)-амино-карбонила, амино-С1-6-алкил-аминокарбонила, моно- и ди(С1-6-алкил)амино-С1-6-алкил-аминокарбонила, C1-6-алкил-карбониламино, карбамидо, C1-6-алканоилокси, сульфоно, C1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, C1-6-алкилтио, галогена, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены, и где два геминальных заместителя могут вместе обозначать оксо, тиоксо, имино или возможно замещенный метилен.
В некоторых воплощениях R1, R2, R3, R5 и R5* независимо выбраны из C1-6-алкила, такого как метил, и водорода.
В некоторых воплощениях все R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода.
В некоторых воплощениях все R1, R2, R3 представляют собой атомы водорода, и либо R5, либо R5* также представляет собой атом водорода, а другой из R5 и R5* отличается от атома водорода, как, например, представляет собой C1-6-алкил, такой как метил.
В некоторых воплощениях Ra представляет собой либо атом водорода, либо метил. В некоторых воплощениях Rb, при наличии, представляет собой либо атом водорода, либо метил.
В некоторых воплощениях один или оба из Ra и Rb представляют собой атом водорода.
В некоторых воплощениях один из Ra и Rb представляет собой атом водорода, а другой отличается от атома водорода.
В некоторых воплощениях один из Ra и Rb представляет собой метил, а другой представляет собой атом водорода.
В некоторых воплощениях оба из Ra и Rb представляют собой метил.
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CH2-, W представляет собой О, и все R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA раскрыты в WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 и WO 2004/046160, которые все включены тем самым посредством ссылки, и они включают то, что обычно известно как нуклеозиды бета-О-окси LNA и альфа-L-окси LNA.
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -S-CH2-, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды тио LNA раскрыты в WO 99/014226 и WO 2004/046160, которые включены тем самым посредством ссылки.
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -NH-CH2-, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды амино LNA раскрыты в WO 99/014226 и WO 2004/046160, которые тем самым включены посредством ссылки.
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-СН2-СН2- или -O-CH2-CH2-CH2-, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA раскрыты в WO 00/047599 и Morita et al, Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12 73-76, которые тем самым включены посредством ссылки, и включают то, что обычно известно как нуклеиновые кислоты, связанные 2'-O-4'С-этиленовым мостиком (ENA).
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CH2-, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3 и один из R5 и R5* представляют собой атомы водорода, а другой из R5 и R5* отличается от атома водорода, как, например, C1-6алкил, такой как метил. Такие 5'-замещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 2007/134181, которая тем самым включена посредством ссылки.
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CRaRb, где один или оба из Ra и Rb отличаются от атома водорода, как, например, метил, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3 и один из R5 и R5* представляют собой атом водорода, а другой из R5 и R5* отличается от атома водорода, как, например, C1-6алкил, такой как метил. Такие бис-модифицированные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 2010/077578, которая тем самым включена посредством ссылки.
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-СН(СН2ОСН3)- (2' О-метоксиэтилбициклическая нуклеиновая кислота - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -О-СН(СН2СН3) - (2' O-этилбициклическая нуклеиновая кислота - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CHRa, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-замещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 10036698 и WO 07090071, которые обе тем самым включены посредством ссылки.
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН(СН2ОСН3)-, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA также известны в данной области как циклические МОЕ (сМОЕ) и раскрыты в WO 07090071.
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-СН(СН3)- либо в R-, либо в S-конфигурации. В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- вместе обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH2-O-CH2- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CH(CH3)-, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-метилнуклеозиды LNA также известны в данной области как сЕТ нуклеозиды и могут представлять собой либо (S)cET, либо (R)cET стереоизомеры, как раскрыто в WO 07090071 (бета-D) и WO 2010/036698 (альфа-L), которые оба тем самым включены посредством ссылки).
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CRaRb-, в котором ни один из Ra или Rb не является атомом водорода, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях и Ra, и Rb представляют собой метил. Такие 6'-двухзамещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 2009006478, которая тем самым включена посредством ссылки.
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -S-CHRa-, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-замещенные нуклеозиды тио LNA раскрыты в WO 11156202, которая тем самым включена посредством ссылки. В некоторых воплощениях 6'-замещенных тио LNA Ra представляет собой метил.
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -С(=СН2)-C(RaRb)-, как, например, -С(=СН2)-СН2- или -С(=СН2)-СН(СН3)-, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды винилкарбо LNA раскрыты в WO 08154401 и WO 09067647, которые обе тем самым включены посредством ссылки.
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -N(-ORa)-, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях Ra представляет собой С1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как N-замещенные LNA и раскрываются в WO 2008/150729, которая тем самым включена посредством ссылки. В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- вместе обозначает двухвалентную линкерную группу -O-NRa-CH3- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -N(Ra)-, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях Ra представляет собой С1-6алкил, такой как метил.
В некоторых воплощениях один или оба из R5 и R5* представляют собой атом водорода, и, при замещении, другой из R5 и R5* представляет собой С1-6алкил, такой как метил. В таком воплощении все из R1, R2, R3 могут представлять собой атомы водорода, и бирадикал -X-Y- может быть выбран из -O-СН2- или -О-C(HCRa)-, такого как -О-С(НСН3)-.
В некоторых воплощениях бирадикал представляет собой -CRaRb-O-CRaRb-, такой как CH2-O-CH2-, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях Ra представляет собой C1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как конформационно ограниченные нуклеотиды (CRN) и раскрываются в WO 2013036868, которая тем самым включена посредством ссылки.
В некоторых воплощениях бирадикал представляет собой -O-CRaRb-O-CRaRb-, такой как O-CH2-O-CH2-, W представляет собой О, и все из R1, R2, R3, R5 и R5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях Ra представляет собой С1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как нуклеотиды СОС и раскрываются в Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238, которая тем самым включена посредством ссылки.
Будет понятно то, что, если не определено, нуклеозиды LNA могут находиться в бета-D или альфа-L стереоизоформе.
Некоторые примеры нуклеозидов LNA представлены на Схеме 1.
Схема 1
Figure 00000022
Как проиллюстрировано в Примерах, в некоторых воплощениях изобретения нуклеозиды LNA в олигонуклеотидах представляют собой нуклеозиды бета-D-окси-LNA.
Деградация, опосредованная нуклеазой
Термин «деградация, опосредованная нуклеазой» относится к олигонуклеотиду, способному опосредовать деградацию комплементарной нуклеотидной последовательности при образовании дуплекса с такой последовательностью.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид может функционировать посредством деградации нуклеиновой кислоты-мишени, опосредованной нуклеазой, где олигонуклеотиды по изобретению способны рекрутировать нуклеазу, в частности, эндонуклеазу, предпочтительно эндорибонуклеазу (РНКазу), такую как РНКаза Н. Примерами конструкций олигонуклеотидов, которые работают посредством механизмов, опосредованных нуклеазой, являются олигонуклеотиды, которые типично содержат область из по меньшей мере 5 или 6 нуклеозидов ДНК и фланкированы на одной стороне или на обеих сторонах нуклеозидами, увеличивающими аффинность, например, гэпмеры, хэдмеры и тэйлмеры.
Активность и рекрутирование РНКазы Н
Термин «активность РНКазы Н антисмыслового олигонуклеотида» относится к его способности при нахождении в дуплексе с комплементарной молекулой РНК рекрутировать РНКазу Н. В WO 01/23613 предложены способы in vitro для определения активности РНКазы Н, которые можно использовать для определения способности рекрутировать РНКазу Н. Типично олигонуклеотид считается способным рекрутировать РНКазу Н, если он, при предоставлении с комплементарной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, имеет исходную скорость, измеренную в пмоль/л/мин, по меньшей мере 5%, как, например, по меньшей мере 10% или больше, чем 20% от исходной скорости, определенной при использовании олигонуклеотида, имеющего такую же последовательность оснований, что и тестируемый модифицированный олигонуклеотид, но содержащего только мономеры ДНК с фосфоротиоатными связями между всеми мономерами в олигонуклеотиде, и с использованием методологии, предложенной в Примерах 91-95 WO 01/23613 (включенной тем самым посредством ссылки).
Гэпмер
Термин «гэпмер» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит область олигонуклеотидов (гэп), рекрутирующую РНКазу Н, которая фланкирована 5' и 3' областями (фланги или крылья), которые содержат один или более чем один модифицированный нуклеозид, усиливающий аффинность. В данном документе описываются разные конструкции гэпмеров. Хэдмеры и тэйлмеры представляют собой олигонуклеотиды, способные рекрутировать РНКазу Н, где отсутствует один из флангов, т.е. только один из концов олигонуклеотида содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность. Для хэдмеров отсутствует 3'-фланг (т.е. 5'-фланг содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность), и для тэйлмеров отсутствует 5'-фланг (т.е. 3'-фланг содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность).
Гэпмер LNA
Термин «гэпмер LNA» относится к гэпмерному олигонуклеотиду, в котором по меньшей мере один из модифицированных нуклеозидов, усиливающих аффинность, представляет собой нуклеозид LNA.
Гэпмер со смешанными крыльями
Термин «гэпмер со смешанными крыльями» или «гэпмер со смешанными флангами» относится к гэпмеру LNA, в котором по меньшей мере одна фланговая область содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA и по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, не являющийся LNA, такой как по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид, такой как, например, нуклеозид(ды) 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-РНК и 2'-F-ANA. В некоторых воплощениях гэпмер со смешанными крыльями имеет один фланг, который содержит только нуклеозиды LNA (например, 5' или 3'), и другой фланг (3' или 5' соответственно) содержит 2'-замещенный(ные) модифицированный(ные) нуклеозид(ды) и возможно нуклеозиды LNA.
Конъюгат
Термин «конъюгат» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к олигонуклеотиду, который ковалентно связан с ненуклеотидной группировкой (конъюгатная группировка или область С, или третья область).
Конъюгирование олигонуклеотида по изобретению с одной или более чем одной ненуклеотидной группировкой может улучшать фармакологию данного олигонуклеотида, например, посредством влияния на активность, клеточное распределение, клеточное поглощение или стабильность олигонуклеотида. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка модифицирует или улучшает фармакокинетические свойства олигонуклеотида посредством улучшения распределения в клетке, биодоступности, метаболизма, выведения, проницаемости и/или поглощения олигонуклеотида клеткой. В частности, конъюгат может нацеливать олигонуклеотид в конкретный орган, ткань или тип клеток и, посредством этого, улучшать эффективность данного олигонуклеотида в этом органе, ткани или типе клеток. В то же самое время конъюгат может служить для уменьшения активности олигонуклеотида в типах клеток, тканях или органах, не являющихся мишенями, например, активность вне мишени или активность в типах клеток, тканях или органах, не являющихся мишенями. В WO 93/07883 и WO 2013/033230 предложены подходящие конъюгатные группировки, которые тем самым являются включенными посредством ссылки. Дополнительными подходящими конъюгатными группировками являются группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (ASGPr). В частности, подходящими для связывания с ASGPr являются трехвалентные N-ацетилгалактозаминные конъюгатные группировки, см., например, WO 2014/076196, WO 2014/207232 и WO 2014/179620 (включенные тем самым посредством ссылки).
Конъюгаты олигонуклеотидов и их синтез также были описаны во всеохватывающих обзорах Manoharan в Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, ST. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 и Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.
В одном воплощении ненуклеотидная группировка (конъюгатная группировка) выбрана из группы, состоящей из углеводов, лигандов рецептора поверхности клетки, лекарственных веществ, гормонов, липофильных веществ, полимеров, белков, пептидов, токсинов (например, бактериальных токсинов), витаминов, вирусных белков (например, капсидов) или их комбинаций.
Линкеры конъюгатов
Связка или линкер представляет собой соединение между двумя атомами, которое связывает одну химическую группу или интересующий сегмент с другой химической группой или интересующим сегментом посредством одной или более чем одной ковалентной связи. Конъюгатные группировки могут присоединяться к олигонуклеотиду непосредственно или через связывающую группировку (например, линкер или связку). Линкеры служат для ковалентного присоединения третьей области, например, конъюгатной группировки к олигонуклеотиду (например, концам области А или С).
В некоторых воплощениях изобретения конъюгат или конъюгат олигонуклеотида по изобретению возможно может содержать линкерную область, которая располагается между олигонуклеотидом и конъюгатной группировкой. В некоторых воплощениях линкер между конъюгатом и олигонуклеотидом является биорасщепляемым.
Биорасщепляемые линкеры содержат или состоят из физиологически лабильной связи, которая является расщепляемой при условиях, которые обычно встречаются или являются аналогичными условиям, которые встречаются в организме млекопитающего. Условия, при которых физиологически лабильные линкеры подвергаются химическому превращению (например, расщеплению), включают такие химические условия, как рН, температура, окислительные или восстановительные условия или агенты и концентрация соли, обнаруженные или аналогичные условиям, встречающимся в клетках млекопитающих. Внутриклеточные условия у млекопитающих также включают присутствие ферментативной активности, обычно присутствующей в клетке млекопитающего, как, например, от протеолитических ферментов или гидролитических ферментов, или нуклеаз. В одном воплощении биорасщепляемый линкер чувствителен к расщеплению нуклеазой S1. В предпочтительном воплощении нуклеазочувствительный линкер содержит от 1 до 10 нуклеозидов, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов, более предпочтительно - от 2 до 6 нуклеозидов, и наиболее предпочтительно - от 2 до 4 связанных нуклеозидов, содержащих по меньшей мере две последовательные фосфодиэфирные связи, как, например, по меньшей мере 3 или 4, или 5 последовательных фосфодиэфирных связей. Предпочтительно нуклеозидами являются нуклеозиды ДНК или РНК. Биорасщепляемые линкеры, содержащие фосфодиэфир, более подробно описываются в WO 2014/076195 (включенной тем самым посредством ссылки).
Конъюгаты также могут быть связаны с олигонуклеотидом через небиорасщепляемые линкеры, или в некоторых воплощениях конъюгат может содержать нерасщепляемый линкер, который ковалентно присоединяется к биорасщепляемому линкеру. Линкеры не обязательно являются биорасщепляемыми, но, главным образом, служат для ковалентного присоединения конъюгатной группировки к олигонуклеотиду или биорасщепляемому линкеру. Такие линкеры могут содержать структуру цепи или олигомер из повторяющихся звеньев, такой как этиленгликоль, аминокислотные звенья или аминоалкильные группы. В некоторых воплощениях линкер (область Y) представляет собой аминоалкил, как, например, С2-С36 аминоалкильную группу, включающую, например, C6-C12 аминоалкильные группы. В некоторых воплощениях линкер (область Y) представляет собой С6 аминоалкильную группу. Конъюгатные группы линкера могут традиционно присоединяться к олигонуклеотду посредством применения аминомодифицированного олигонуклеотида и активированной сложноэфирной группы на конъюгатной группе.
Лечение
Термины «лечение», «осуществление лечения», «лечит» или тому подобные используются в данном документе для общего обозначения получения желательного фармакологического и/или физиологического эффекта. Данный эффект является терапевтическим в показателях частичного или полного излечения заболевания и/или вредного эффекта, приписываемого заболеванию. Термин «лечение» в том виде, в котором он используется в данном документе, охватывает любое лечение заболевания у субъекта и включает: (а) ингибирование заболевания, т.е. задержку его развития, подобную ингибированию увеличения уровня HBsAg и/или HBeAg; или (б) уменьшение интенсивности (т.е. облегчение) заболевания, т.е. вызов регрессии заболевания, подобно подавлению продукции HBsAg и/или HBeAg. Таким образом, соединение, которое уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV, представляет собой соединение, которое лечит инфекцию HBV. Предпочтительно термин «лечение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к медицинскому вмешательству в уже проявившееся расстройство, подобно лечению уже определенной и проявившейся инфекции HBV.
Предупреждение
В данном документе термин «осуществление предупреждения», «предупреждение» или «предупреждает» относится к профилактическому лечению, например, к мерам или процедуре, целью которой является предупреждение, а не излечение заболевания. Предупреждение означает то, что получается желательный фармакологический и/или физиологический эффект, который является профилактическим в показателях полного или частичного предупреждения заболевания или его симптома. Соответственно, фраза «предупреждение инфекции HBV» в данном документе включает предупреждение у субъекта появления инфекции HBV и предупреждение появления симптомов инфекции HBV. В настоящем изобретении, в частности, рассматривается предупреждение инфекции HBV у детей от матерей, инфицированных HBV.
Пациент
Для целей настоящего изобретения «субъект» (или «пациент») может представлять собой позвоночное. В контексте настоящего изобретения термин «субъект» включает и людей, и других животных, особенно млекопитающих, и другие организмы. Таким образом, предложенные в данном документе средства и способы являются применимыми и к терапии человека, и к ветеринарным применениям. Соответственно, описанный в данном документе субъект может быть животным, таким как мышь, крыса, хомяк, кролик, морская свинка, хорек, кошка, собака, курица, овца, виды крупного рогатого скота, лошадь, верблюд или примат. Предпочтительно субъект представляет собой млекопитающее. Более предпочтительно субъект представляет собой человека.
Инфекция HBV
Термин «инфекция вирусом гепатита В» или «инфекция HBV» является общеизвестным в данной области и относится к инфекционному заболеванию, которое вызвано вирусом гепатита В (HBV) и поражает печень. Инфекция HBV может быть острой или хронической инфекцией. Некоторые инфицированные люди не имеют симптомов во время исходной инфекции, и у некоторых развивается быстрое начало заболевания со рвотой, желтоватой кожей, утомляемостью, темной мочой и болью в области живота ("Hepatitis В Fact sheet №204". who.int. Июль 2014 г. Скачанный 4 ноября 2014 г.). Данные симптомы часто длятся несколько недель и могут приводить к смерти. До начала симптомов может проходить от 30 до 180 суток. У 90% тех, кто инфицировался около момента рождения, развивается хроническая инфекция гепатитом В, тогда как она развивается у 10% инфицированных в возрасте старше пяти лет ("Hepatitis В FAQs for the Public - Transmission", U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC), скачано 29.11.2011). У большинства с хроническим заболеванием нет симптомов; однако, в конечном счете, могут развиваться цирроз и рак печени (Chang, 2007, Semin Fetal Neonatal Med, 12: 160-167). Данные осложнения приводят к смерти 15-25% имеющих хроническое заболевание ("Hepatitis В Fact sheet №204". who.int. July 2014, скачанный 4 ноября 2014 г.). В данном документе термин «инфекция HBV» включает острую и хроническую инфекцию гепатитом В. Термин «инфекция HBV» также включает бессимптомную стадию исходной инфекции, симптоматические стадии, а также бессимптомную хроническую стадию инфекции HBV.
Ферментативно активные фрагменты
В данном документе ферментативно активный фрагмент SEQ ID NO: 1 или 2 (т.е. PAPD5) относится к тем полипептидам, которые содержат отрезок смежных аминокислотных остатков SEQ ID NO: 1 или 2 (т.е. PAPD5), и которые сохраняют биологическую активность (т.е. функциональность) PAPD5, в частности, функцию поли-А полимеразы. В соответствии с этим в данном документе ферментативно активный фрагмент SEQ ID NO: 3 (т.е. PAPD7) относится к тем полипептидам, которые содержат отрезок смежных аминокислотных остатков SEQ ID NO: 3 (т.е. PAPD7), и которые сохраняют биологическую активность (т.е. функциональность) PAPD7, в частности, функцию поли-А полимеразы. Примерами ферментативно активных фрагментов PAPD5 и PAPD7 являются нуклеотидилтрансферазный домен и поли-А полимераза Cid1.
Полипептид
В данном документе термин «полипептид» включает все молекулы, которые содержат или состоят из аминокислотных мономеров, связанных пептидными (амидными) связями. Таким образом, термин «полипептид» включает все аминокислотные последовательности, такие как пептиды, олигопептиды, полипептиды и белки. «Полипептид», описанный в данном документе, может представлять собой встречающийся в природе полипептид или полипептид, не встречающийся в природе. Полипептид, не встречающийся в природе, может содержать по меньшей мере одну мутацию (например, замену аминокислоты, делецию аминокислоты или присоединение аминокислоты) по сравнению с аналогом, встречающимся в природе. Полипептид, не встречающийся в природе, также может быть клонирован в вектор и/или связан функциональным образом с промотором, который не является природным промотором указанного полипептида. Указанный промотор может быть конститутивно активным промотором. Термин «аминокислота» или «остаток» в том виде, в котором он используется в данном документе, включает и L-, и D-изомеры встречающихся в природе аминокислот, а также других аминокислот (например, аминокислот, не встречающихся в природе, аминокислот, которые не кодируются последовательностями нуклеиновых кислот, синтетических аминокислот и т.д.). Примерами встречающихся в природе аминокислот являются аланин (Ala; А), аргинин (Arg; R), аспарагин (Asn; N), аспарагиновая кислота (Asp; D), цистеин (Cys; С), глутамин (Gln; Q), глутаминовая кислота (Glu; Е), глицин (Gly; G), гистидин (His; Н), изолейцин (lie; I), лейцин (Leu; L), лизин (Lys; K), метионин (Met; М), фенилаланин (Phe; F), пролин (Pro; P), серии (Ser; S), треонин (Thr; T), триптофан (Trp; W), тирозин (Tyr; Y), валин (Val; V). Посттрансляционно модифицированными встречающимися в природе аминокислотами являются дегидробутирин (Dhb) и лабионин (Lab). Примеры аминокислот, не встречающихся в природе, описаны выше. Полипептид, не встречающийся в природе, может содержать один или более чем один неаминокислотный заместитель или гетерологичные аминокислотные заместители, по сравнению с аминокислотной последовательностью, встречающейся в природе формы полипептида, например, молекулу-репортер или другой лиганд, ковалентно или нековалентно связанный с аминокислотной последовательностью.
Соединение
В данном документе термин «соединение» означает любую молекулу нуклеиновой кислоты, такую как молекулы РНКи согласно изобретению или любой конъюгат, содержащий такую молекулу нуклеиновой кислоты. Например, описанное в данном документе соединение может представлять собой молекулу РНКи против PAPD5 или PAPD7, в частности, антисмысловой олигонуклеотид, миРНК или кшРНК.
Композиция
Для описания соединения - молекулы нуклеиновой кислоты - также можно использовать термин «композиция». Композиция молекулы нуклеиновой кислоты содержит меньше, чем 20% примесей, предпочтительно меньше, чем 15% примесей или 10% примесей, более предпочтительно меньше, чем 9, 8, 7 или 6% примесей, наиболее предпочтительно меньше, чем 5% примесей. Данные примеси типично представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, которые на один или два нуклеотида короче (n-1 или n-2), чем компонент в виде молекулы главной нуклеиновой кислоты.
Ингибитор
Термин «ингибитор» известен в данной области и относится к соединению/веществу или композиции, способным полностью или частично предотвращать или уменьшать физиологическую функцию (т.е. антивность) (а) специфического(ких) белка(ков) (например, PAPD5 и/или PAPD7). В контексте настоящего изобретения «ингибитор» PAPD5 и PAPD7 способен предупреждать или уменьшать активность/функцию PAPD5 или PAPD7, соответственно, посредством предотвращения или уменьшения экспрессии генных продуктов PAPD5 или PAPD7. Таким образом, ингибитор PAPD5 или PAPD7 может приводить к пониженному уровню экспрессии PAPD5 или PAPD7 (например, пониженному уровню мРНК PAPD5 или PAPD7, или белка PAPD5 или PAPD7), что отражается в пониженной функциональности (т.е. активности) PAPD5 или PAPD7, где указанная функция включает функцию поли-А полимеразы. Ингибитор PAPD5 или PAPD7 в контексте настоящего изобретения, соответственно, также может охватывать транскрипционные репрессоры экспрессии PAPD5 или PAPD7, которые способны уменьшать уровень PAPD5 или PAPD7. Предпочтительные ингибиторы представляют собой молекулы нуклеиновых кислот по изобретению.
Измерение
В данном документе термин «измерение» также означает «проведение анализа» или «определение» (т.е. выявление и/или проведение количественного анализа). Например, термин «измерение экспрессии и/или активности PAPD5 и/или PAPD7» означает определение количества экспрессии и/или активности PAPD5 и/или PAPD7, например, определение количества полипептида PAPD5 и/или PAPD7 (т.е. белка). Способы измерения (т.е. определения) количества и/или активности белка PAPD5 и/или PAPD7 известны в данной области и описываются выше в данном документе. В соответствии с этим, фраза «измерение того, ингибирует ли тестируемое соединение размножение HBV» означает проведение анализа или определение (т.е. выявление и/или количественное измерение) того, ингибирует ли тестируемое соединение или композиция размножение HBV.
Настоящее изобретение дополнительно описывается со ссылкой на неограничивающие графические материалы и примеры.
ПРИМЕРЫ
Примеры иллюстрируют данное изобретение.
Материал и методы
Последовательности олигонуклеотидных мотивов и олигонуклеотидные соединения
Figure 00000023
Figure 00000024
Figure 00000025
Figure 00000026
Последовательности мотива представляют непрерывную последовательность, представленную в олигонуклеотиде.
Конструкции относятся к конструкции гэпмера - F-G-F'- где каждое число представляет число последовательных модифицированных нуклозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (первое число - 5'-фланг), с последующим числом нуклеозидов ДНК (второе число - область гэпа), с последующим числом модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (третье число - 3'-фланг), которым возможно предшествуют или после которых следуют дополнительные повторяющиеся области ДНК и LNA, которые не обязательно являются частью непрерывной последовательности, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.
Figure 00000027
Figure 00000028
Figure 00000029
Figure 00000030
Последовательности мотива представляют непрерывную последовательность нуклеиновых оснований, представленную в олигонуклеотиде.
Конструкции относятся к конструкции гэпмера - F-G-F'- где каждое число представляет число последовательных модифицированных нуклозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (первое число - 5'-фланг), с последующим числом нуклеозидов ДНК (второе число - область гэпа), с последующим числом модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (третье число - 3'-фланг), которым возможно предшествуют или после которых следуют дополнительные повторяющиеся области ДНК и LNA, которые не обязательно являются частью непрерывной последовательности, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.
Химия соединений
Каждое соединение из двух химических серий DHQ и ТНР синтезировали так, чтобы оно подходило для скрининга Y3H, проводимого HYBRIGENICS SERVICES SAS. Оба соединения включали линкер PEG5 и были мечены лигандом на основе триметопримового (ТМР) якоря (Таблица 5).
Figure 00000031
Скрининг Y3H ULTImate YChemH™
Два данных соединения были предоставлены Roche для HYBRIGENICS SERVICES SAS и протестированы на проницаемость и токсичность. Соединения были затем подвергнуты скринингу против библиотеки кДНК человеческой плаценты (PLA) HYBRIGENICS. Скрининги проводили согласно оптимизированному потоколу спаривания клетка-клетка, разработанному для Hybrigenics ULTImate Y2H™, используемому при разных концентрациях соединений (Таблица 6).
Figure 00000032
Анализ зависимости Y3H ULTImate YChemH™
Клоны, полученные из скрининга, собирали в 96-луночный формат, и позитивные клоны в отношении роста при селективных условиях (HIS+) оценивали в анализе зависимости с использованием анализов пятен. Только клоны, которые могли расти на селективной среде в присутствии меченого соединения, собирали, обрабатывали (лизис клеток, ПЦР, секвенирование генов) и картировали для выравнивания белка с использованием анализа Blast.
Эксперимент по подтверждению 1 к 1 Y3H ULTImate YChemH™ - фрагменты добычи
На данной стадии подтверждения каждый идентифицированный фрагмент добычи и один химический зонд (НВХ129653, НВХ129654) тестируется в эксперименте 1 к 1. Плазмиды из 3 отобранных добыч из библиотеки скрининга экстрагировали из дрожжевых клеток, амплифицировали в E. coli и повторно трансформировали в дрожжевые клетки YHGX13. Для каждого взаимодействия DO1, 1/10, 1/100 и 1/1000 культуры диплоидных дрожжей, экспрессирующих и конструкцию приманки, и добычи, наносили в виде пятен на селективную среду без триптофана, лейцина и гистидина, и дополняли химическим зондом и FK506. Взаимодействия тестировали в двойной повторности. Одну чашку использовали на химическое соединение и концентрацию (DMSO (диметилсульфоксид), 5, 10 и 20 мкМ НВХ129653, 5, 10 и 20 мкМ НВХ129654, 5 мкМ НВХ24786 Триметоприм (ТМР) и 5 мкМ НВХ129634 (TMP-PEG5-OH)). Чашки инкубировали при 30°С в течение 3 суток.
Эксперимент по подтверждению 1 к 1 Y3H ULTImate YChemH™ - полноразмерные белки
Кодирующую последовательность полноразмерного PAPD5var1 (NM_001040284.2) и PAPD7varX1 (XM_005248234.2) восстанавливали из N-концевого фрагмента гена с оптимизированными кодонами (для удаления высокого содержания GC) и имеющихся в продаже клонов С-концевых областей белков, и клонировали в рамке считывания с доменом активации Gal4 (AD) в плазмиду рР7 (AD-добыча), полученную из исходной pGADGH (Bartel et al., 1993 in Cellular interactions in development: A practical approach, ed. Hartley, D.A., Oxford University Press, Oxford, pp. 153-179). Данные конструкции проверяли секвенированием полных вставок. Для каждой добычи проводили миниспаривание между дрожжевыми клетками YHGX13 (Y187 ade2-101::loxP-kanMX-loxP, matα), трансформированными плазмидами добычи, и YPT6AT (mata), трансформированными DHFR (дигидрофолатредуктаза) приманки, с получением культуры диплоидных дрожжей. Для каждого взаимодействия DO1, 1/10, 1/100 и 1/1000 культуры диплоидных дрожжей, экспрессирующих и конструкцию приманки, и добычи, наносили в виде пятен на селективную среду без триптофана, лейцина и гистидина, и дополняли химическим зондом и FK506. Взаимодействия тестировали в двойной повторности. Одну чашку использовали на химическое соединение и концентрацию (DMSO, 5, 10 и 20 мкМ НВХ129653, 5, 10 и 20 мкМ НВХ129654, 5 мкМ НВХ24786 Триметоприм (ТМР) и 5 мкМ НВХ129634 (TMP-PEG5-OH)). Чашки инкубировали при 30°С в течение 3 суток.
Y3H ULTImate YChemH™ - конкуренция со свободным соединением
Конкурентный анализ основывается на описанном ранее подтверждении 1 к 1 с постоянной концентрацией химического зонда (НВХ129653, НВХ129654) и возрастающими концентрациями родительского соединения химического зонда (MOL653, MOL654) или его неактивного энантиомера (INACT653, INACT654) (Таблица 7). Конкурентные анализы проводили на селективной среде при 8 концентрациях свободного соединения (0; 0,25; 0,5; 1; 2; 5; 10 и 20 мкМ) и согласующейся концентрации меченого У3Н-соединения (1 мкМ).
Figure 00000033
Figure 00000034
Культура клеток HepaRG
Клетки HepaRG (Biopredics International, Rennes, Франция, Кат. № HPR101) культивировали при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в полной ростовой среде HepaRG, состоящей из среды Уильяма Е (GIBCO), добавки в ростовую среду (Biopredics, Кат. № ADD710), 1% (об./об.) GlutaMAX-I (Gibco #32551) и 1× пенициллина/стрептомицина (Gibco, #15140), в течение 2 недель. Для инициации дифференциации в ростовую среду на конфлюентные клетки добавляли 0,9% (об./об.) DMSO (Sigma-Aldrich, D2650). Через одну неделю среду заменяли полной средой для дифференциации (ростовая среда HepaRG, дополненная 1,8% (об./об.) DMSO), в которой клетки поддерживали в течение приблизительно 4 недель с обновлением среды для дифференциации каждые 7 суток. Дифференцированные клетки HepaRG (dHepaRG) демонстрировали гепатоцитоподобные островки клеток, окруженные монослоем билиарно-подобных клеток. До инфицирования HBV и обработки соединением клетки dHepaRG высевали в 96-луночные планшеты, покрытые коллагеном I (Gibco, кат. № А11428-03), в количестве 60000 клеток на лунку в 100 мкл полной среды для дифференциации. Клеткам давали восстанавливать их дифференцированный фенотип в 96-луночных планшетах в течение приблизительно 1 недели после посева на чашки до инфицирования HBV.
Инфицирование HBV клеток dHepaRG
Клетки dHepaRG инфицировали частицами HBV при MOI (множественность заражения) 30. Частицы HBV продуцировались из клеток HepG2.2.15, продуцирующих HBV (Sells et al 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84, 1005-1009). Условия культивирования, дифференциация и инфицирование HBV dHepaRG были описаны ранее (Hantz, 2009, J. Gen. Virol., 2009, 90: 127-135). Вкратце, добавляли полную среду для дифференциации (120 мкл/лунку) (ростовая среда HepaRG, состоящая из среды Уильяма (GIBCO), добавки в ростовую среду (Biopredics, Кат. № ADD710) и 1% (об./об.) GlutaMAX-I (Gibco #32551) и 1× пенициллина/стрептомицина (Gibco, #15140), дополненную 1,8% (об./об.) DMSO), содержащую 4% PEG-8000 (полиэтиленгликоль-8000) и маточный раствор вируса (от 20 до 30 GE/клетку). Через одни сутки после инфицирования клетки три раза промывали фосфатно-солевым буферным раствором, и заменяли среду (полная среда для дифференциации) каждые двое суток на протяжении эксперимента.
Обработка HepaRG, инфицированных HBV, миРНК
Пул из четырех разных миРНК приобретали у GE Dharmacon (ON TARGETplus) (Таблица 8).
Figure 00000035
За одни сутки до инфицирования клеток HBV и через 4 суток после инфицирования клетки обрабатывали пулом миРНК либо против PAPD5, против PAPD7, против обоих, либо ненацеленной миРНК в качестве контроля. миРНК (25 нМ каждой) трансфицировали с использованием DharmaFect 4 (GE Dharmacon; Кат. № T-2004-01) и OPTI-MEM (Thermo Scientific; Кат. №51985034) согласно протоколу изготовителя. Данный эксперимент шел в течение 11 суток.
Измерения антигена HBV
Для оценки влияния на экспрессию и секрецию антигена HBV супернатанты отбирали в сутки 11. Уровни HBsAg и HBeAg HBV измеряли с использованием наборов для CLIA ELISA (Autobio Diagnostic #CL0310-2, #CL0312-2), согласно протоколу изготовителя. Вкратце, 25 мкл супернатанта на лунку переносили в соответствующий планшет для микротитрования, покрытый антителом, и добавляли 25 мкл реактива на основе конъюгата фермента. Планшет инкубировали в течение 60 мин на шейкере при комнатной температуре перед промывкой лунок пять раз промывочным буфером с использованием автоматического промывателя. В каждую лунку добавляли 25 мкл субстрата А и Б. Планшеты инкубировали на шейкере в течение 10 мин при комнатной температуре перед измерением люминисценции с использованием ридера люминисценции Envision (Perkin Elmer).
Жизнеспособность клеток
После удаления от клеток dHepaRG, инфицированных HBV, сред супернатанта клетки инкубировали с раствором CellTiterGlo One (Promega) для измерения жизнеспособности клеток.
После обработок клеток dHepaRG, инфицированных HBV, олигонуклеотидами LNA измеряли жизнеспособность клеток с использованием набора для подсчета клеток-8 (Sigma-Aldrich, #96992) согласно протоколу изготовителя. Вкратце, среду удаляли от клеток и заменяли 110 мкл среды, содержащей 9% набора для подсчета клеток-8. Клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Супернатант переносили в новый 96-луночный планшет, и измеряли поглощение при 450 нм с использованием ридера люминисценции Envision (Perkin Elmer).
ПЦР в реальном времени внутриклеточной мРНК
Для выделения внутриклеточной мРНК dHepaRG один раз промывали PBS (Gibco) и лизировали с использованием MagNA Pure "96 Cellular RNA Large Volume Kit" (Roche #05467535001). Лизаты можно хранить при -80°С. Для реакции кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция) в реальном времени использовали систему выявления последовательности АВ7900 НТ (Applied Biosystems), мастер-микс для экспрессии генов TaqMan® (ThermoFisher Scientific). Для выявления мРНК HBV использовали праймер, специфичный в отношении кора HBV (Integrated DNA Technologies) (Таблица 9), а для измерения уменьшения уровня PAPD5 и PAPD7 в присутствии миРНК использовали геноспецифичные зонды для анализа экспрессии TaqMan® (ThermoFisher Scientific; PAPD5 Кат. №4331182; PAPD7 Кат. №4331182). Образцы нормировали с использованием зонда анализа экспрессии TaqMan® против β-актина (ThermoFisher Scientific; PAPD5 Кат. №4331182).
Figure 00000036
Экстракция и количественное измерение ДНК HBV из препарата вируса
Экстракция ДНК HBV проводится с использованием набора для вирусов QIAamp UltraSens (Qiagen, #53704) согласно протоколу изготовителя со следующими оптимизациями. 30 мкл и 3 мкл образца вируса разводят в 1 мл PBS перед добавлением буфера АС. Первая стадия центрифугирования осуществляется в течение 45 мин при полной скорости и 4°С. ДНК HBV количественно измеряется в двойной повторности посредством кПЦР с использованием QuantStudio 12K Flex (Applied Biosystems), мастер-микса для экспрессии генов TaqMan (Applied Biosystems, #4369016) и премикса 1:1:0,5 праймеров, показанных в Таблице 9 выше, и зонда разведенного до концентрации 100 мкМ. кПЦР проводится с использованием следующих установок: инкубация UDG (2 мин, 50°С), активация фермента (10 мин, 95°С) и кПЦР (40 циклов по 15 с, 95°С для денатурации и 1 мин, 60°С для отжига и удлинения). Расчет геномных эквивалентов основывается на стандартной кривой, полученной от разведении плазмиды генотипа D HBV с известными концентрациями.
Синтез олигонуклеотидов
Синтез олигонуклеотидов, в общем, известен в данной области. Ниже приводится протокол, который можно применять. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению возможно были получены слегка отличающимися способами в показателях использованных прибора, подложки и концентраций.
Олигонуклеотиды синтезируются на уридиновых универсальных подложках с использованием фосфорамидитного подхода на Oligomaker 48 в 1 мкмольном масштабе. В конце синтеза Олигонуклеотиды отщепляются от твердой подложки с использованием водного аммония в течение 5-16 часов при 60°С. Олигонуклеотиды очищают посредством ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) с обращенной фазой (ВЭЖХ-ОФ) или посредством экстракций твердой фазы и характеризуют последством СВЭЖХ (сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография), а молекулярная масса дополнительно подтверждается посредством МС-ЭРИ (масс-спектрометрия с электрораспылительной ионизацией).
Удлинение олигонуклеотида:
Связывание β-цианоэтилфосфорамидитов (ДНК-А(Bz), ДНК-G(ibu), ДНК-C(Bz), ДНК-Т, LNA-5-метил-С(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf) или LNA-T) проводится с использованием раствора 0,1 М амидита, защищенного 5'-O-DMT, в ацетонитриле и DCI (4,5-дицианоимидазол) в ацетонитриле (0,25 М) в качестве активатора. Для конечного цикла можно использовать фосфорамидит с желательными модификациями, например, С6 линкер для присоединения конъюгатной группы или конъюгатную группу, как таковую. Тиолирование для введения фосфоротиоатных связей проводится с использованием ксантангидрида (0,01 М в ацетонитриле/пиридине 9:1). Фосфодиэфирные связи могут вводиться с использованием 0,02 М йода в THF (тетрагидрофуран)/пиридине/воде 7:2:1. Остальными реактивами являются реактивы, типично используемые для синтеза олигонуклеотидов.
Для конъюгирования после твердофазного синтеза в последнем цикле твердофазного синтеза можно использовать имеющийся в продаже С6 аминолинкер-фосфорамидит, и после снятия защиты и отщепления от твердой подложки выделяется аминосвязанный олигонуклеотид со снятой защитой. Конъюгаты вводятся посредством активации функциональной группы с использованием стандартных способов синтеза.
Очистка посредством ВЭЖХ-ОФ:
Неочищенные соединения очищают посредством препаративной ВЭЖХ-ОФ на колонке Phenomenex Jupiter C18 10 мкм 150×10 мм. В качестве буферов используют 0,1 М ацетат аммония, рН 8, при скорости тока 5 мл/мин. Отобранные фракции лиофилизируют с получением очищенного соединения, типично в виде белого твердого вещества.
Сокращения:
DCI: 4,5-дицианоимидазол
DCM: дихлорметан
DMF: диметилформамид
DMT: 4,4'-диметокситритил
THF: тетрагидрофуран
Bz: бензоил
Ibu: изобутирил
ВЭЖХ-ОФ: высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой.
Анализ Tm:
Дуплексы олигонуклеотида и РНК-мишени (связанной фосфатом - РО) разводят до 3 мМ в 500 мл воды, не содержащей РНКазы, и смешивают с 500 мл 2× Tm-буфера (200 мМ NaCl, 0,2 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 20 мМ фосфат Na, pH 7,0). Данный раствор нагревают до 95°С в течение 3 мин и затем дают осуществляться отжигу при комнатной температуре в течение 30 мин. Температуры плавления дуплекса (Tm) измеряют на спектрофотометре Lambda 40, работающем в ультрафиолетовой/видимой области, оснащенном программатором температуры Пелетье РТР6, используя программу РЕ Templab (Perkin Elmer). Температура повышается от 20°С до 95°С и затем снижается до 25°С, с записью поглощения при 260 нм. Для оценки Tm дуплекса используются первая производная и локальные максимумы как плавления, так и отжига.
Пример 1: DHQ и ТНР связывается с PAPD5 и PAPD7
PAPD5/7 идентифицировали в скрининге Y3H Ultimate YChemH как общего партнера взаимодействия с DHQ и ТНР
Оба белка PAPD5 (вариант 1: NP_001035374; вариант 2: NP_001035375) и PAPD7 (ХР_005248291) идентифицировали по большому числу фрагментов в скрининге Y3H для обоих соединений (DHQ и ТНР), как описано в разделе Материалы и Метод. Идентифицированные белки были ранжированы HYBRIGENICS с баллом достоверности А (шкала от А до D) (Таблица 10).
Figure 00000037
Figure 00000038
Взаимодействие PAPD5/7 с DHQ и ТНР могло быть подтверждено с использованием подтверждения 1 к 1 Y3H Ultimate YChemH идентифицированных фрагментов добычи и дополнительно с полноразмерными белками
На первом этапе подтверждения три фрагмента, идентифицированных в первом скрининге, были отобраны для анализа подтверждения 1 к 1 (как описано в разделе Материалы и Метод) и протестированы в трех разных концентрациях (5, 10 и 20 мкМ) (Таблица 11).
Figure 00000039
Все три фрагмента могли быть подтверждены в качестве специфичных партнеров связывания для DHQ и ТНР уже при наименьшей протестированной концентрации (Фиг. 1).
На второй стадии подтверждения были синтезированы полноразмерные белки PAPD5 и PAPD7, и использованы для подтверждения 1 к 1 (как описано в разделе Материалы и Метод) с DHQ и ТНР (Таблица 12).
Figure 00000040
Взаимодействия между данными полноразмерными белками и соединениями DHQ и ТНР были подтверждены при наименьшей протестированной концентрации, и было показано то, что они являются специфичными в отношении химических зондов (Фиг. 2).
Конкуренцию взаимодействию PAPD5/7 с DHQ и ТНР в Y3H могут составлять оба свободных активных соединения, но не неактивный энантиомер
После подтверждения связывания DHQ и ТНР с фрагментами белков и полноразмерными PAPD5 и PAPD7, связывание было подтверждено в конкурентном эксперименте Y3H ULTImate YChenH (как описано в разделе Материалы и Метод) с использованием либо неактивного, либо активного свободного соединения (Таблица 13). Уменьшение потери роста дрожжей в присутствии родительского активного соединения, но не в присутствии неактивного энантиомера означает то, что родительское соединение конкурирует с химическим зондом и взаимодействует с белком-мишенью.
Для всех тестируемых соединений анализировали токсичность на неселективной среде при наивысшей концентрации (20 мкМ) с использованием люминисцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (Promega) согласно протоколу изготовителя. При данной концентрации для любого соединения не наблюдали токсичности, так как рост дрожжей не подвергался влиянию (данные не показаны). Для обоих свободных активных родительских соединений (DHQ и ТНР, MOL653 и MOL654 соответственно) могла наблюдаться конкуренция, причем для конкуренции за связывание с полноразмерным белком нужна меньшая концентрация, чем взаимодействий с фрагментом (Фиг. 3 и 4). Успешная перекрестная конкуренция свидетельствует об общем сайте связывания DHQ и ТНР с PAPD5/7 и/или по меньшей мере связывании в тесной близости друг с другом.
Figure 00000041
Пример 2: ингибирование PAPD5 и/или PAPD7 с использованием миРНК приводит к эффективному лечению инфекции HBV
Для нахождения корреляции между связыванием DHQ и ТНР с PAPD5/7 и влиянием двух данных белков на экспрессию генов HBV авторы изобретения использовали технологию РНКи для уменьшения уровня данных белков в dHepaRG, инфицированных HBV в природе, и для отслеживания влияния этого уменьшения на параметры вируса. Для этого авторы изобретения использовали пулы миРНК против PAPD5 и PAPD7 (см. Таблицу 8) в клетках dHepaRG, инфицированных HBV, как описано в разделе Материалы и метод.
Уменьшение уровня PAPD5 приводило к ингибированию экспрессии вируса, измеренной по секретируемым HBsAg и HBeAg, а также по внутриклеточной мРНК HBV (измеренной с использованием CLIA ELISA и ПЦР в реальном времени, как описано в разделе Материалы и Методы). В то время как уменьшение уровня мРНК PAPD5 кардинально уменьшало экспрессию генов HBV, ингибирование PAPD7 имело умеренный эффект на экспрессию HBV (Фиг. 7). Однако при объединении миРНК против PAPD7 и против PAPD5 наблюдали усиленную синергическую активность против HBV (Фиг. 7), свидетельствующую о компенсаторной роли PAPD7 в отсутствие PAPD5.
Пример 3: DHQ и ТНР эффективно уменьшает уровень HBsAg и HBeAg
Эффективность DHQ и ТНР и их вариантов против инфекции HBV измеряли в клетках HepG2.2.15 с использованием HBsAg и HBeAg в качестве показателя.
Клетки HepG2.2.15 (Sells et al 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84, 1005-1009) культивировали в 96-луночных планшетах (15000 клеток/лунку в 100 мкл) в DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) плюс GluTaMax-1 (GiBCO, Кат. №10569), 1% пенициллине/стрептомицине (Gibco, Кат. №15140), 10% FBS (фетальная телячья сыворотка) (Clontech, Кат. №631106), генетицине, 0,25 мкг/мл (Invitrogen, 10131035). Соединения тестировали с использованием трехкратных серийных разведении в DMSO с максимальной концентрацией 100 мкМ и 9 серийными разведениями. Каждое соединение тестировали в четырех повторностях. Клетки инкубировали в течение 3 суток, отбирали супернатанты, и измеряли в HBsAg и HBeAg, как описано в разделе Материалы и Методы.
Значения IC50 тестируемых соединений при уменьшении секреции HBsAg и HBeAg показаны далее:
НВХ129653 (DHQ - TMP): IC50 HBsAg 1,181 мкМ
НВХ129654 (ТНР - ТМР): IC50 HBsAg 0,299 мкМ
MOL653 (DHQ - свободное - активное): IC50 HBsAg 0,003 мкМ; IC50 HBeAg 0,007 мкМ
MOL654 (ТНР - свободное - активное): IC50 HBsAg 0,003 мкМ
INACT653 (DHQ - свободное - неактивное): IC50 HBsAg 3,15 мкМ
INACT654 (ТНР - свободное - неактивное): IC50 HBsAg больше 25 мкМ
Пример 4: скрининг эффективности in vitro антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5
Скрининг олигонуклеотидов осуществляли по длине мРНК PAPD5 с использованием 16-20 мерных гэпмеров. Анализ эффективности осуществляли в эксперименте in vitro в клетках HeLa.
Линии клеток
Линию клеток HeLa приобретали в Европейской коллекции аутентичных клеточных культур (ЕСАСС, #93021013) и поддерживали, как рекомендовано поставщиком, в увлажненном инкубаторе при 37°C с 5% CO2. Для анализов 2500 клеток/лунку высевали в 96-многолуночный планшет в минимальную питательную среду Игла (Sigma, M2279) с 10% фетальной телячей сыворотки (FBS), 2 мМ глутамином AQ, 1% NEAA, 25 мкг/мл гентамицина.
Эффективность олигонуклеотидов
Клетки инкубировали в течение 24 часов до добавления олигонуклеотидов, растворенных в PBS. Конечная концентрация олигонуклеотидов составляла 5 и 25 мкМ, конечный объем культуры составлял 100 мкл/лунку. Клетки отбирали через 3 суток после добавления олигонуклеотидных соединений, и РНК экстрагировали с использованием набора для очистки РНК PureLink Pro 96 (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. После денатурации дуплекса PHК/LNA (90°С, 40 с) проводили кПЦР с одноэтапным протоколом (qScript™ XLT одноэтапная кПЦР-ОТ ToughMix®, Low ROX™ от Quanta Bioscience, #95134-500) в дуплексной системе с анализами с праймерами TaqMan для интересующего гена - PAPD5 (Hs00223727_m1, FAM-MGB, Life Technologies) и гена домашнего хозяйства - GUSB (Hu_4326320E, VIC-MGB, Life Technologies), следуя рекомендациям поставщика. Относительный уровень экспрессии мРНК PAPD5 показан в Таблице 14 в виде % относительно среднего контрольных образцов (клетки, обработанные PBS). На Фиг. 8 представлен нокдаун мишени, достигаемый с индивидуальными олигонуклеотидными соединениями по всей кодирующей последовательности PAPD5.
Figure 00000042
Figure 00000043
Figure 00000044
Figure 00000045
Figure 00000046
Figure 00000047
Пример 5: скрининг на эффективность in vitro антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD7
Скрининг олигонуклеотидов по длине мРНК PAPD7 проводили по существу, как описано в Примере 4, с заменой на анализ на основе праймеров TaqMan для интересующего гена PAPD7 (Hs00173159_m1, FAM-MGB, Life Technologies).
Относительный уровень экспрессии мРНК PAPD7 показан в Таблице 15 в виде % относительно среднего контрольных образцов (клетки, обработанные PBS). На Фиг. 9 представлен нокдаун мишени, достигаемый с индивидуальными олигонуклеотидными соединениями по всей кодирующей последовательности PAPD7.
Figure 00000048
Figure 00000049
Figure 00000050
Figure 00000051
Figure 00000052
Figure 00000053
Пример 6: влияние на клетки dHepaRG, инфицированные HBV, с использованием отобранных антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5 или PAPD7, доставленных в клетки посредством гимнозиса
Выбирали набор самых эффективных олигонуклеотидов из Примера 4 и 5 для анализа их влияния на параметры размножения HBV в клетках dHepaRG, инфицированных HBV.
Клетки dHepaRG, инфицированные HBV (описанные в разделе Материалы и Методы, инфицирование HBV клеток dHepaRG), культивировали в 96-луночных планшетах. Через одни сутки после инфекции HBV 20 мкМ олигонуклеотида доставляли в клетки с использованием самостоятельного поглощения (гимнозиса). Всего анализировали 40 олигонуклеотидов: 20, нацеленных на PAPD5, и 20, нацеленных на PAPD7. Данные эксперименты проводили в тройной повторности с контролями в виде PBS. Обработку олигонуклеотидами, включающую замену среды, повторяли в сутки 4 и 7 (это отличается от замены каждые 2 суток, описанной в разделе Материалы и Методы).
В сутки 11 после инфекции супернатанты отбирали, и уровни HBsAg и HBeAg оценивали с использованием анализа CLIA ELISA (см. Материалы и Методы, измерения антигена HBV). Жизнеспособность клеток измеряли, как описано в разделе Материалы и Метод, Жизнеспособность клеток. мРНК экстрагировали из клеток с использованием робота MagNA Pure и набора для клеточной РНК большого объема MagNA Pure 96 (Roche, #05467535001) согласно протоколу изготовителя. мРНК HBV и мРНК PAPD5 или PAPD7 количественно измеряли в двойной технической повторности посредством кПЦР с использованием QuantStudio 12K Flex (Applied Biosystems), 1-этапного набора TaqMan RNA-to-CT (Applied Biosystems, #4392938), эндогенного контроля в виде человеческого АСТВ (Applied Biosystems, #4310881Е). Реактивы Taqman использовали вместе со следующими имеющимися в продаже праймерами ThermoFisher Sceintific (HBV Pa03453406_s1; PAPD5 Hs00900790_m1 и PAPD7 Hs00173159_m1). Экспрессию мРНК анализировали с использованием способа 2-ΔΔCt сравнительного порогового цикла с нормированием к контрольному гену АСТВ (ThermoFisher Sceintific 4310881Е) и к клеткам, обработанным PBS.
Влияния обработки олигонуклеотидами на мРНК PAPD5 или PAPD7, а также влияние на параметр размножения HBV - HBsAg - показаны в Таблице 16 и Таблице 17.
Figure 00000054
Figure 00000055
Figure 00000056
Из этих данных можно видеть то, что ингибирование мРНК PAPD5 (Таблица 16) и мРНК PAPD7 (Таблица 17) было очень эффективным для большинства олигонуклеотидных соединений.
Наблюдаемое влияние уменьшения уровня мРНК PAPD5 и PAPD7 на уровни HBsAg является, однако, менее отчетливым даже в клетках, обработанных в течение 11 суток после самостоятельной доставки олигонуклеотида. Здесь только нацеленные на PAPD5 СМР ID NO: 23_1, 26_1 и 115_1 демонстрировали явное ингибирование HBsAg, а из соединений, нацеленных на PAPD7, только СМР ID NO: 229_1 демонстрировало явное ингибирование HBsAg. Не будучи связанными теорией, это могло быть обусловлено медленным началом влияния, вызванного нокдауном мишени, на ингибирование HBsAg в настоящем анализе и, таким образом, для некоторых соединений ингибирование HBsAg не было бы заментным, если оно не анализируется в более поздний момент времени.
Пример 7: влияние на клетки dHepaRG, инфицированные HBV, с использованием комбинированного препарата антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5 и PAPD7, доставленных в клетки посредством гимнозиса
В Примере 2 наблюдали то, что смешивание пула миРНК, нацеленных на PAPD7, с пулом миРНК, нацеленных на PAPD5, приводило к синергической активности против HBV. Целью настоящего примера является иследование того, могла ли аналогичная синергия наблюдаться при объединении двух индивидуальных одноцепочечных олигонуклеотидов, где один нацелен на PAPD5, и один нацелен на PAPD7.
Данный эксперимент проводили, как описано в Примере 6, с тем изменением, что, вместо добавления индивидуальных олигонуклеотидов, добавляли к клеткам комбинацию двух олигонуклеотидов, таким образом, что 20 мкМ одного олигонуклеотида, нацеленного на PAPD5, было добавлено вместе с 20 мкМ второго олигонуклеотида, нацеленного на PAPD7. Для данных комбинаций измеряли только HBsAg. Комбинацию олигонуклеотидов можно видеть в Таблице 18, включая результаты по параметрам размножения HBV, ингибированию HBsAg.
Figure 00000057
Figure 00000058
Данные результаты также обобщаются на Фиг. 10. Из 40 комбинаций, протестированных выше, 18 приводили к очевидному синергическому влиянию на ингибирование HBsAg. 7 из данных синергических комбинаций образованы с олигонуклеотидами, которые индивидуально не дают какого-либо влияния на ингибирование HBsAg в текущем анализе. Из данного эксперимента можно заключить то, что комбинация олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5 и PAPD7, имеет высокую вероятность продуцирования синергического влияния на ингибирование HBsAg.
Пример 8: повтор отобранных комбинаций из Примера 7
Эксперимент в Примере 7 повторяли с комбинациями олигонуклеотидов, указанными в Таблице 19.
Figure 00000059
Из этих данных можно видеть то, что синергический эффект, наблюдаемый в Примере 7, является воспроизводимым.
Пример 9: влияние на клетки dHepaRG, инфицированные HBV, с использованием отобранных антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5 и PAPD7, доставленных в клетки посредством трансфекции
В следующем эксперименте исследовали, могли ли быть достигнуты аналогичные синергические результаты с использованием трансфекции олигонуклеотидов в клетки dHepaRG, инфицированные HBV, вместо самостоятельной доставки.
Двенадцать олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5 (Таблица 20), и тринадцать олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD7 (Таблица 21), индивидуально тестировали с использованием трансфекционного анализа, описанного в данном документе.
Олигонуклеотиды трансфицировали в формате 96-луночного планшета в конечной концентрации 500 нМ на лунку в дифференцированные клетки HepaRG через одни сутки после инфекции HBV (описано в разделе Материалы и Методы, инфекция HBV клеток dHepaRG). До трансфекции среду заменяли 100 мкл полной среды для дифференциации, не содержащей пенициллин/стрептомицин. Для обработки одним олигонуклеотидом олигонуклеотид разводили в среде Opti-MEM+Glutamax-I с пониженным содержанием сыворотки (Gibco, #51985) и инкубировали при соотношении 1:1 с липофектамином RNAiMax (Invitrogen, #56532) в течение 5 минут при комнатной температуре согласно инструкциям изготовителя. Из данной смеси LNA-трансфекционный реактив 20 мкл затем добавляли на поверхность клеток. Через 3 суток среду заменяли полной средой для дифференциации. В сутки 5 после трансфекции измеряли HBsAg, как описано в разделе Материалы и Метод, уровень мРНК PAPD5 и PAPD7 измеряли, как описано в Примере 6.
Кроме того, некоторые из олигонуклеотидов против PAPD5 и PAPD7 тестировали в комбинации (Таблица 22). Данные олигонуклеотды сотрансфицировали в клетки HepaRG, инфицированные HBV, с использованием того же самого протокола, что и одна обработка 500 нМ каждого олигонуклеотида в конечной концентрации.
Figure 00000060
Figure 00000061
Figure 00000062
Из этих данных можно видеть то, что при использовании трансфекционного анализа 6 из 12 олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5, имеют явное влияние на ингибирование HBsAg, которое значительно больше, чем наблюдаемое с использованием гимнотического анализа в Примере 6. Также число соединений, нацеленных на PAPD7, которые имеют влияние на ингибирование HBsAg, было увеличено при применении трансфекционного анализа таким образом, что 4 из 12 соединений имеют явное влияние на ингибирование HBsAg. Данные от комбинаций обобщаются в Таблице 22 и на Фиг. 11. Из этих данных можно видеть то, что 9 из 12 протестированных комбинаций дают очевидное синергическое влияние на ингибирование HBsAg.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> F. Hoffmann la Roche
<120> МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ УРОВНЯ мРНК PAPD5 И/ИЛИ
PAPD7 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОГО ГЕПАТИТА В
<130> P33547-WO
<160> 267
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 698
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Arg Pro Arg Pro Arg Ser Ala Pro Gly Lys Pro Arg Arg Arg Ser
1 5 10 15
Arg Ala Arg Leu Arg Ser Ser Arg Thr Pro Ser Gly Gly Ala Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ala Thr Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Gly Ala Ala Ser Ala Pro Ala Pro Ala
50 55 60
Pro Ala Gly Met Tyr Arg Ser Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ser His Ala
65 70 75 80
Leu Pro Ala Glu Gln Arg Asp Phe Leu Pro Leu Glu Thr Thr Asn Asn
85 90 95
Asn Asn Asn His His Gln Pro Gly Ala Trp Ala Arg Arg Ala Gly Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Ser Pro Pro Ser Ala Ser Ser Ser Pro His Pro Ser Ala
115 120 125
Ala Val Pro Ala Ala Asp Pro Ala Asp Ser Ala Ser Gly Ser Ser Asn
130 135 140
Lys Arg Lys Arg Asp Asn Lys Ala Ser Thr Tyr Gly Leu Asn Tyr Ser
145 150 155 160
Leu Leu Gln Pro Ser Gly Gly Arg Ala Ala Gly Gly Gly Arg Ala Asp
165 170 175
Gly Gly Gly Val Val Tyr Ser Gly Thr Pro Trp Lys Arg Arg Asn Tyr
180 185 190
Asn Gln Gly Val Val Gly Leu His Glu Glu Ile Ser Asp Phe Tyr Glu
195 200 205
Tyr Met Ser Pro Arg Pro Glu Glu Glu Lys Met Arg Met Glu Val Val
210 215 220
Asn Arg Ile Glu Ser Val Ile Lys Glu Leu Trp Pro Ser Ala Asp Val
225 230 235 240
Gln Ile Phe Gly Ser Phe Lys Thr Gly Leu Tyr Leu Pro Thr Ser Asp
245 250 255
Ile Asp Leu Val Val Phe Gly Lys Trp Glu Asn Leu Pro Leu Trp Thr
260 265 270
Leu Glu Glu Ala Leu Arg Lys His Lys Val Ala Asp Glu Asp Ser Val
275 280 285
Lys Val Leu Asp Lys Ala Thr Val Pro Ile Ile Lys Leu Thr Asp Ser
290 295 300
Phe Thr Glu Val Lys Val Asp Ile Ser Phe Asn Val Gln Asn Gly Val
305 310 315 320
Arg Ala Ala Asp Leu Ile Lys Asp Phe Thr Lys Lys Tyr Pro Val Leu
325 330 335
Pro Tyr Leu Val Leu Val Leu Lys Gln Phe Leu Leu Gln Arg Asp Leu
340 345 350
Asn Glu Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly Ser Tyr Ser Leu Phe Leu Met
355 360 365
Ala Val Ser Phe Leu Gln Leu His Pro Arg Glu Asp Ala Cys Ile Pro
370 375 380
Asn Thr Asn Tyr Gly Val Leu Leu Ile Glu Phe Phe Glu Leu Tyr Gly
385 390 395 400
Arg His Phe Asn Tyr Leu Lys Thr Gly Ile Arg Ile Lys Asp Gly Gly
405 410 415
Ser Tyr Val Ala Lys Asp Glu Val Gln Lys Asn Met Leu Asp Gly Tyr
420 425 430
Arg Pro Ser Met Leu Tyr Ile Glu Asp Pro Leu Gln Pro Gly Asn Asp
435 440 445
Val Gly Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Gln Val Lys Gln Ala Phe Asp
450 455 460
Tyr Ala Tyr Val Val Leu Ser His Ala Val Ser Pro Ile Ala Lys Tyr
465 470 475 480
Tyr Pro Asn Asn Glu Thr Glu Ser Ile Leu Gly Arg Ile Ile Arg Val
485 490 495
Thr Asp Glu Val Ala Thr Tyr Arg Asp Trp Ile Ser Lys Gln Trp Gly
500 505 510
Leu Lys Asn Arg Pro Glu Pro Ser Cys Asn Gly Asn Gly Val Thr Leu
515 520 525
Ile Val Asp Thr Gln Gln Leu Asp Lys Cys Asn Asn Asn Leu Ser Glu
530 535 540
Glu Asn Glu Ala Leu Gly Lys Cys Arg Ser Lys Thr Ser Glu Ser Leu
545 550 555 560
Ser Lys His Ser Ser Asn Ser Ser Ser Gly Pro Val Ser Ser Ser Ser
565 570 575
Ala Thr Gln Ser Ser Ser Ser Asp Val Asp Ser Asp Ala Thr Pro Cys
580 585 590
Lys Thr Pro Lys Gln Leu Leu Cys Arg Pro Ser Thr Gly Asn Arg Val
595 600 605
Gly Ser Gln Asp Val Ser Leu Glu Ser Ser Gln Ala Val Gly Lys Met
610 615 620
Gln Ser Thr Gln Thr Thr Asn Thr Ser Asn Ser Thr Asn Lys Ser Gln
625 630 635 640
His Gly Ser Ala Arg Leu Phe Arg Ser Ser Ser Lys Gly Phe Gln Gly
645 650 655
Thr Thr Gln Thr Ser His Gly Ser Leu Met Thr Asn Lys Gln His Gln
660 665 670
Gly Lys Ser Asn Asn Gln Tyr Tyr His Gly Lys Lys Arg Lys His Lys
675 680 685
Arg Asp Ala Pro Leu Ser Asp Leu Cys Arg
690 695
<210> 2
<211> 698
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Arg Pro Arg Pro Arg Ser Ala Pro Gly Lys Pro Arg Arg Arg Ser
1 5 10 15
Arg Ala Arg Leu Arg Ser Ser Arg Thr Pro Ser Gly Gly Ala Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ala Thr Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Gly Ala Ala Ser Ala Pro Ala Pro Ala
50 55 60
Pro Ala Gly Met Tyr Arg Ser Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ser His Ala
65 70 75 80
Leu Pro Ala Glu Gln Arg Asp Phe Leu Pro Leu Glu Thr Thr Asn Asn
85 90 95
Asn Asn Asn His His Gln Pro Gly Ala Trp Ala Arg Arg Ala Gly Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Ser Pro Pro Ser Ala Ser Ser Ser Pro His Pro Ser Ala
115 120 125
Ala Val Pro Ala Ala Asp Pro Ala Asp Ser Ala Ser Gly Ser Ser Asn
130 135 140
Lys Arg Lys Arg Asp Asn Lys Ala Ser Thr Tyr Gly Leu Asn Tyr Ser
145 150 155 160
Leu Leu Gln Pro Ser Gly Gly Arg Ala Ala Gly Gly Gly Arg Ala Asp
165 170 175
Gly Gly Gly Val Val Tyr Ser Gly Thr Pro Trp Lys Arg Arg Asn Tyr
180 185 190
Asn Gln Gly Val Val Gly Leu His Glu Glu Ile Ser Asp Phe Tyr Glu
195 200 205
Tyr Met Ser Pro Arg Pro Glu Glu Glu Lys Met Arg Met Glu Val Val
210 215 220
Asn Arg Ile Glu Ser Val Ile Lys Glu Leu Trp Pro Ser Ala Asp Val
225 230 235 240
Gln Ile Phe Gly Ser Phe Lys Thr Gly Leu Tyr Leu Pro Thr Ser Asp
245 250 255
Ile Asp Leu Val Val Phe Gly Lys Trp Glu Asn Leu Pro Leu Trp Thr
260 265 270
Leu Glu Glu Ala Leu Arg Lys His Lys Val Ala Asp Glu Asp Ser Val
275 280 285
Lys Val Leu Asp Lys Ala Thr Val Pro Ile Ile Lys Leu Thr Asp Ser
290 295 300
Phe Thr Glu Val Lys Val Asp Ile Ser Phe Asn Val Gln Asn Gly Val
305 310 315 320
Arg Ala Ala Asp Leu Ile Lys Asp Phe Thr Lys Lys Tyr Pro Val Leu
325 330 335
Pro Tyr Leu Val Leu Val Leu Lys Gln Phe Leu Leu Gln Arg Asp Leu
340 345 350
Asn Glu Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly Ser Tyr Ser Leu Phe Leu Met
355 360 365
Ala Val Ser Phe Leu Gln Leu His Pro Arg Glu Asp Ala Cys Ile Pro
370 375 380
Asn Thr Asn Tyr Gly Val Leu Leu Ile Glu Phe Phe Glu Leu Tyr Gly
385 390 395 400
Arg His Phe Asn Tyr Leu Lys Thr Gly Ile Arg Ile Lys Asp Gly Gly
405 410 415
Ser Tyr Val Ala Lys Asp Glu Val Gln Lys Asn Met Leu Asp Gly Tyr
420 425 430
Arg Pro Ser Met Leu Tyr Ile Glu Asp Pro Leu Gln Pro Gly Asn Asp
435 440 445
Val Gly Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Gln Val Lys Gln Ala Phe Asp
450 455 460
Tyr Ala Tyr Val Val Leu Ser His Ala Val Ser Pro Ile Ala Lys Tyr
465 470 475 480
Tyr Pro Asn Asn Glu Thr Glu Ser Ile Leu Gly Arg Ile Ile Arg Val
485 490 495
Thr Asp Glu Val Ala Thr Tyr Arg Asp Trp Ile Ser Lys Gln Trp Gly
500 505 510
Leu Lys Asn Arg Pro Glu Pro Ser Cys Asn Gly Asn Gly Val Thr Leu
515 520 525
Ile Val Asp Thr Gln Gln Leu Asp Lys Cys Asn Asn Asn Leu Ser Glu
530 535 540
Glu Asn Glu Ala Leu Gly Lys Cys Arg Ser Lys Thr Ser Glu Ser Leu
545 550 555 560
Ser Lys His Ser Ser Asn Ser Ser Ser Gly Pro Val Ser Ser Ser Ser
565 570 575
Ala Thr Gln Ser Ser Ser Ser Asp Val Asp Ser Asp Ala Thr Pro Cys
580 585 590
Lys Thr Pro Lys Gln Leu Leu Cys Arg Pro Ser Thr Gly Asn Arg Val
595 600 605
Gly Ser Gln Asp Val Ser Leu Glu Ser Ser Gln Ala Val Gly Lys Met
610 615 620
Gln Ser Thr Gln Thr Thr Asn Thr Ser Asn Ser Thr Asn Lys Ser Gln
625 630 635 640
His Gly Ser Ala Arg Leu Phe Arg Ser Ser Ser Lys Gly Phe Gln Gly
645 650 655
Thr Thr Gln Thr Ser His Gly Ser Leu Met Thr Asn Lys Gln His Gln
660 665 670
Gly Lys Ser Asn Asn Gln Tyr Tyr His Gly Lys Lys Arg Lys His Lys
675 680 685
Arg Asp Ala Pro Leu Ser Asp Leu Cys Arg
690 695
<210> 3
<211> 792
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Asp Pro Arg Val Ala Trp Ile Gln Pro Glu Gln Lys Gly Pro Ala
1 5 10 15
Asn Ala Leu Trp Met Gln Ile Trp Glu Thr Ser Gln Gly Val Gly Arg
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Phe Ala Ser Tyr Phe Cys Leu Asn Ser Pro Ala Leu
35 40 45
Asp Thr Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Arg Gly Ser Gly Gly Leu
50 55 60
Gly Pro Ala Leu Pro Ala Ala Ser Pro Pro Pro Pro Gly Pro Thr Ala
65 70 75 80
Pro Ala Ala Leu Pro Pro Ala Leu Leu Thr Ala Leu Gly Pro Ala Ala
85 90 95
Glu Gly Ala Arg Arg Leu His Lys Ser Pro Ser Leu Ser Ser Ser Ser
100 105 110
Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ala Glu Ser Gly Thr Glu Ser Pro Gly Cys
115 120 125
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Leu Gly Arg Pro Gly Gly Gly
130 135 140
Arg Gly Gly Ala Phe Phe Asn Phe Ala Asp Gly Ala Pro Ser Ala Pro
145 150 155 160
Gly Thr Ala Asn Gly His Pro Gly Pro Arg Gly Pro Ala Pro Ala Gly
165 170 175
Ser Pro Ser Gln His Gln Phe His Pro Gly Arg Arg Lys Arg Glu Asn
180 185 190
Lys Ala Ser Thr Tyr Gly Leu Asn Tyr Leu Leu Ser Gly Ser Arg Ala
195 200 205
Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gln Ala Pro Arg Pro
210 215 220
Gly Thr Pro Trp Lys Ser Arg Ala Tyr Ser Pro Gly Ile Gln Gly Leu
225 230 235 240
His Glu Glu Ile Ile Asp Phe Tyr Asn Phe Met Ser Pro Cys Pro Glu
245 250 255
Glu Ala Ala Met Arg Arg Glu Val Val Lys Arg Ile Glu Thr Val Val
260 265 270
Lys Asp Leu Trp Pro Thr Ala Asp Val Gln Ile Phe Gly Ser Phe Ser
275 280 285
Thr Gly Leu Tyr Leu Pro Thr Ser Asp Ile Asp Leu Val Val Phe Gly
290 295 300
Lys Trp Glu Arg Pro Pro Leu Gln Leu Leu Glu Gln Ala Leu Arg Lys
305 310 315 320
His Asn Val Ala Glu Pro Cys Ser Ile Lys Val Leu Asp Lys Ala Thr
325 330 335
Val Pro Ile Ile Lys Leu Thr Asp Gln Glu Thr Glu Val Lys Val Asp
340 345 350
Ile Ser Phe Asn Met Glu Thr Gly Val Arg Ala Ala Glu Phe Ile Lys
355 360 365
Asn Tyr Met Lys Lys Tyr Ser Leu Leu Pro Tyr Leu Ile Leu Val Leu
370 375 380
Lys Gln Phe Leu Leu Gln Arg Asp Leu Asn Glu Val Phe Thr Gly Gly
385 390 395 400
Ile Ser Ser Tyr Ser Leu Ile Leu Met Ala Ile Ser Phe Leu Gln Leu
405 410 415
His Pro Arg Ile Asp Ala Arg Arg Ala Asp Glu Asn Leu Gly Met Leu
420 425 430
Leu Val Glu Phe Phe Glu Leu Tyr Gly Arg Asn Phe Asn Tyr Leu Lys
435 440 445
Thr Gly Ile Arg Ile Lys Glu Gly Gly Ala Tyr Ile Ala Lys Glu Glu
450 455 460
Ile Met Lys Ala Met Thr Ser Gly Tyr Arg Pro Ser Met Leu Cys Ile
465 470 475 480
Glu Asp Pro Leu Leu Pro Gly Asn Asp Val Gly Arg Ser Ser Tyr Gly
485 490 495
Ala Met Gln Val Lys Gln Val Phe Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Leu Ser
500 505 510
His Ala Val Ser Pro Leu Ala Arg Ser Tyr Pro Asn Arg Asp Ala Glu
515 520 525
Ser Thr Leu Gly Arg Ile Ile Lys Val Thr Gln Glu Val Ile Asp Tyr
530 535 540
Arg Arg Trp Ile Lys Glu Lys Trp Gly Ser Lys Ala His Pro Ser Pro
545 550 555 560
Gly Met Asp Ser Arg Ile Lys Ile Lys Glu Arg Ile Ala Thr Cys Asn
565 570 575
Gly Glu Gln Thr Gln Asn Arg Glu Pro Glu Ser Pro Tyr Gly Gln Arg
580 585 590
Leu Thr Leu Ser Leu Ser Ser Pro Gln Leu Leu Ser Ser Gly Ser Ser
595 600 605
Ala Ser Ser Val Ser Ser Leu Ser Gly Ser Asp Val Asp Ser Asp Thr
610 615 620
Pro Pro Cys Thr Thr Pro Ser Val Tyr Gln Phe Ser Leu Gln Ala Pro
625 630 635 640
Ala Pro Leu Met Ala Gly Leu Pro Thr Ala Leu Pro Met Pro Ser Gly
645 650 655
Lys Pro Gln Pro Thr Thr Ser Arg Thr Leu Ile Met Thr Thr Asn Asn
660 665 670
Gln Thr Arg Phe Thr Ile Pro Pro Pro Thr Leu Gly Val Ala Pro Val
675 680 685
Pro Cys Arg Gln Ala Gly Val Glu Gly Thr Ala Ser Leu Lys Ala Val
690 695 700
His His Met Ser Ser Pro Ala Ile Pro Ser Ala Ser Pro Asn Pro Leu
705 710 715 720
Ser Ser Pro His Leu Tyr His Lys Gln His Asn Gly Met Lys Leu Ser
725 730 735
Met Lys Gly Ser His Gly His Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Val
740 745 750
Gly Ser Gly Gly Val Arg Pro Pro Val Gly Asn Arg Gly His His Gln
755 760 765
Tyr Asn Arg Thr Gly Trp Arg Arg Lys Lys His Thr His Thr Arg Asp
770 775 780
Ser Leu Pro Val Ser Leu Ser Arg
785 790
<210> 4
<211> 8114
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 4
acaacgcgct ccctgcgggg cgggcggcaa cctccatgcg gcctcgtcca cgctcagcac 60
cggggaagcc gaggcggaga agccgcgcgc gcctcagaag ctcccggacg cccagcggcg 120
gcgcgagcgg cggcggcggc agcagcagca gcagcagcac ggccaccggc gggagcggca 180
gcagcaccgg cagccccggc ggcgcggcct cggccccggc cccggccccg gccggcatgt 240
atcgctccgg ggagcgcctg ctgggcagcc acgcgctgcc cgcggagcag cgggacttcc 300
tgcccctaga gacgaccaac aacaacaaca accaccacca gcccggggcc tgggcccgcc 360
gggcgggctc ctcggcgtcc tcgcctccct cggcgtcctc gtccccgcac ccttcggccg 420
ccgtccccgc cgccgatcca gccgattcgg cctcgggcag cagcaacaag aggaagcgcg 480
acaacaaggc cagcacgtat ggactcaact acagcctgct gcagcccagc ggagggcggg 540
ccgcgggggg cggccgagca gacggcggcg gggtcgtgta cagcgggacc ccgtggaaac 600
ggaggaacta caaccaggga gtcgtgggtc tgcatgaaga aatcagtgat ttttatgaat 660
acatgtctcc aagacctgag gaggagaaga tgcggatgga ggtggtgaac aggatcgaga 720
gtgtaattaa ggagctctgg cccagcgctg acgtccagat atttggaagt tttaaaactg 780
gactttattt acctactagt gacatcgacc tagtggtgtt tgggaagtgg gagaacctac 840
ccctctggac tctggaagaa gctcttcgga aacacaaagt cgcagatgag gattcggtga 900
aagttttaga caaagcaact gtacctatta ttaaattaac agattctttt actgaagtga 960
aagttgatat cagctttaat gtacagaatg gcgtgagagc agctgacctc atcaaagatt 1020
ttaccaagaa atatcctgta ttgccatact tggttttagt attgaaacaa ttcctattgc 1080
agagggacct taatgaagta tttacaggtg gaattggttc ttatagtctc tttttaatgg 1140
cagtcagttt ccttcagtta catcccaggg aagatgcttg catccccaat acaaactatg 1200
gtgttctctt aatagaattt tttgaattat atggacgaca cttcaattat ttaaagactg 1260
gcatccggat aaaggatggt ggttcatatg tggccaaaga tgaagtacag aaaaatatgc 1320
tagatggcta caggccatca atgctttata tcgaagatcc tttacaacca ggtaacgatg 1380
ttggaaggag ttcatatggg gccatgcaag tgaagcaggc ctttgattat gcctacgttg 1440
ttttgagtca tgctgtatca ccaatagcaa agtactatcc caacaatgaa acagaaagca 1500
tactaggtag aataattaga gtaacagatg aagttgccac atatagagat tggatatcaa 1560
agcagtgggg cttgaagaat agacctgagc cttcatgcaa tggaaatggt gttaccttga 1620
tagtagatac tcagcagtta gataaatgta ataataatct atctgaagaa aatgaagccc 1680
ttggaaaatg tagaagtaaa acctcggaat ctcttagtaa acactcttca aactcttcat 1740
caggtccagt gtcgtcctct tctgccacac agtccagctc tagtgatgta gattccgatg 1800
caacaccatg caaaaccccg aaacagctgc tttgccgtcc gtccactggg aaccgagtag 1860
ggtcgcaaga tgtatccttg gagtcctctc aggcagttgg gaaaatgcaa agcacccaaa 1920
ccactaacac atccaacagc accaacaaat ctcagcatgg atcagcaagg ctctttcgtt 1980
cttccagcaa aggcttccaa ggtacaactc aaacaagcca tggttccttg atgacaaaca 2040
aacaacatca aggcaaatcc aataatcagt attaccatgg caaaaagagg aaacacaaga 2100
gggacgcgcc cctctcagac ctctgtagat agtcagcgct gcgcggtgga ctgtcttctc 2160
tgtgcaatga tctcatgctc aggacagttg cgcagggact cctgggagat attcaggagc 2220
ctcacactgt tcagacgttg acttagcaac tgcgtttttt cccagctcgc cacagaatgg 2280
atcatgaaga ctgacaactg caaaaaaaac aaaacaaaac aaaaaaaaaa gcaagcaaaa 2340
aagagggaaa aaaaaggctg cttatttgat aagtcatatg ctacaacagg gtcattttaa 2400
gatttaaagc ttgaatgtaa aataaatata tttctcattg gctttatgca gagttatagg 2460
gaatagtatt cagtgttggt agggtgatag aaacaaaaaa cagtatcaga ggatgaggtg 2520
gggaaggaaa acaaaggtat ctgataggaa gtccagattc caaaggggaa agtgatctgt 2580
gcatgttttt tttttaaata tttttgcata tatttaccat tttattgtgt gtatatatag 2640
aagaccatat aggagattga tatttgtaat agtggatttg ttaataatac tttttacata 2700
acattactgt ttaaattgta aacagatttt ttctcaggat tagtttgaaa aataatctaa 2760
attgtcatct taacatccat atatagggaa gtgattagtt ctattactca atttgttttt 2820
ctcagcattg aaatgactta atagaaccct tgtgtcctgc tgcaaaaatt tttcctctct 2880
aaagaaaagg tttatggtgg caaatgatgt ttattttatt ttgtaaaaaa aaaaaaatgt 2940
actatgtact tttgtgtaaa cactgaaaaa tctctggtca tctccgagaa ttaacttgca 3000
actgttttct atagtgctgt cgtcttgggc aatgggcaat tacatgactt tgtgtttgct 3060
tcctttgcag tctttttttt ttccccccat ttcttcctaa taggaaaaaa aaaaaaaaaa 3120
aggtcaccca tgtctggtct cattcctgtt gcagtgaaac ttcgagttcc acagactttg 3180
catgctggct tctctaaccc tgtgtgctgc gtgtgcctgt ttctcatctc ttattctttt 3240
taaaattcat gcttaactac tgtgggagaa taactgtaaa cagctttaat taaatcatac 3300
ttataaaaaa ctattttctt atattccact ctatgctttt ggtattgttg atctttacaa 3360
attaaatggt ctttgataat ggatctattt tgtattgcct tattaagacc aaatacttct 3420
tgtcatccca ttctttatcc tcttctttca tggaattgtt atcgttaatt aaaacttttt 3480
taaacattgg cttgtttcaa tcatactgta aattttggtt gtagtcagct ttgagtgcaa 3540
tgagatgtat aattctgtta tcattacctg ttgagtttga aactcagttg ggaatattta 3600
atataataga atgtaagtga catttctgaa aatgctttct ttcagggtga aagctcttat 3660
gtttagcatc aatgtgtatg gctctgttaa atgcagccat ttctgagacg agattctttt 3720
atatatatat acatataaag tactattggc ttttaggagt ttcttttata tacatttatg 3780
aaatactgaa gaccaatcag accattaatg gacacttagt gtaacttttt ataaagaaaa 3840
taatgctaaa gtaagaccaa aactgatgtc atcactgaaa ttaacaattt tcaatatgtt 3900
catattttaa ttcacaatgg aaaaatgtgt tccaaaactg gaaactcata gtactcgtgt 3960
aaactgtgga agatttcaaa tgtgatgtta ttttgacaat gttttaaatt ttagagtcac 4020
attttattct gatcagaatt tttattgaga tgttgagctt ttgtttttga aactagtttg 4080
tcataacatt gtgcataatc acagtattta ttttctagga caattgtgaa tgtgtagact 4140
tatgtttact gctaagggaa caattattta taaaataata ttaaatccag tattagctgc 4200
ctatttcaga cacttaatac ttgcagagat ctatgttaca tttaccacac tgaagttttt 4260
tttgttgttt tttgtttgtt tttaaagaat caccctcatt gttgaaagta aatgtactct 4320
tagggtgcga atattagtgt tccaataagc atgtgattat attaaggtgg tggtagcggg 4380
aagataattc tgattccatt gggaatctta ggttttcgta aatttattgg gaaaatagtt 4440
tttcctgtac tgctgaagtt tctttttggt aaacagtatc tttctaaaag aaaaaagcat 4500
gaaggagaaa ttgaggtgtg tatacatttc ctcaaatgac cagcattgta ttcgtgaata 4560
ctgtgtatct tgcagtgaac agtgtggaag ctgttcattt ttcaatctga agtaaaatac 4620
tttcaagaac ttttagtttg cctgctcatt tgttttatac atttcatcta tttgactcct 4680
atcttatttc ttttttgagt tttaatactt cctatatttt gtgaatatat cagaaatgtg 4740
tcatttatat attagagtcc attcatatcc atgaatcata accttccttt gctaatactt 4800
gttgaatggg attttacaaa ttctccctca ctctggtgac atttctcagg cagtcatgta 4860
tgtgtacctg gccattagaa atattaatat ttaaagactg ttttttagag gagctgatgg 4920
gttggtgagg tgtcagcaca aaatcttact ggttatgttt tgatgataaa agtatatcca 4980
ttttttccct ccagctttaa ggtgactgtg aaggtgcctg gttttgaatg tctttgtttg 5040
gtttggagat gtcgcactca gttttcaaat ctagcttgga tctgtaggac ctatgttttt 5100
tacaagtaat tgccctccag tcttcaacag ttgattctgt tttattttta tcctgttttg 5160
agtgtacttt acctttactt gcattttgag cctcattaat atttaggtta tttgatttgg 5220
ctccagatat tcctagatct gcacagggca aaacatgggc tatagggtga gcatttttaa 5280
ttgtcttttt ctgctggaac cttatatctc tccatgtgtt ttctgctcct tccctccccc 5340
atgaaatggt aagtgtgact tgtgtttgcc tgaacctgtg gactagtgtt tggggtttct 5400
ggaaacacta gagggtcaga aaagagtaat gaccaccgtg acgtgcagga ttctcttgct 5460
gtgacatgtt cattgcaaag ccctctccag tgactaggag gtgtagttat taaggttgat 5520
ctgttagaaa tcaccattat taggtattag tggtagatgt tgctgatact tttattggtc 5580
atgactacat ctcagtttta ctttaatatt gatctatagt ttgatcagtt ccttgaattc 5640
taatatgttg atttctcagt gtttctgtca ctaaccaaga atgtttctag gcagttggtt 5700
gcttcacagt caaaactaaa tggtaaacta tcaaaaatac attcccaatt ttgctgtgat 5760
aaatattgaa atgttaaaat taatgaacag aagaatttat tcttacccat ctattcttgt 5820
tctcctagtt cattaaactt tcagttattg gaaaggcaca ttctcaaagt attttatgag 5880
caaaatattc tataaatgcg tctaacaaac ctaattgaat ataaaagtta tatttagtag 5940
ttactgttga tagtaatttt catcagggtc atagttcatc tagtaaaata tttagagaat 6000
gatgttaaca ttccagcatt aaagtgggaa caaagattta tatatgaaat tccttaaaag 6060
agttcatctt gccttggttt ctgaccctca agactctagc tacctgccat cttgtcaaaa 6120
catttgtggg tagaataagt gttaaagatc aaattttaat atgcttctcg atatttaaca 6180
tagctaagaa gccagatttt actgtagaag ttatttacat gatttgaaaa cttgacctaa 6240
ctggaagcct ttttctcagt catcttgttc taagccatct tgacttcaca cccttagcga 6300
cttttctttt ttttttggtc aaagataatg agctaaatat atatagacgt tgaatgttga 6360
caaaattatt aaccagaaaa attgcttata aaggctgctg atctatttga tacctagaat 6420
taaatatttg aggacagttt ttagttaata aactgctaat gtttatttta ctgtctctca 6480
ggtttttggt ttttttaaaa aaaatgtgtt tggcctttac attttctact taagtgtgta 6540
ctttattgag tttaaccttg tctgtagcct agtagcctga aagaaaagga gacagaacca 6600
gagagatgga tgtagtgcat tccctttggt tattacacat ttgtggtagc tcctggattt 6660
actgagagat attttagcta tgtcaataag aacagctaat gatgtggaaa tcaggtgttc 6720
tcttgtgtat ttcagtgaac atttttatta gtagttgcat atcatctcta gttccacatt 6780
ttaacttaac gtctttgtgg cttcaccact gagctacctt tcactacacc agcttctgtg 6840
tggcctggta acatggaagg tctctcctaa ggacagtctg gacgtatttt gggggaatgt 6900
tatttatctt aaagatgcct agaaacaaaa cgcatatagt accagtgaga aactatgaag 6960
taaacaagtt gctcaggccg ggcatggtgg ctcacgcctg taatcccagc actttgggag 7020
gccgaagcgg gaggatggct tgaggctggg agtttgagac cttcatctct taaaaaaaca 7080
aacaaaaacc tgaatggtga ggtgtggtgg aattgggtag gggagggaaa ggaggacttg 7140
gaaaagcatt ctccaaagcc agcaacttgg tgaagttcag tacttgcctc ttagaggtta 7200
ggccatgcct ttcaaagaga gtgaaatgat gggttatcag ccacattctt ggagttaata 7260
tttttcttca tctttcagtt tgggttctgt gctattcata gttcttccct aagaccattt 7320
cattattacc ttttatattt agttgcaatt tattataata tgttgttttg tccctgaact 7380
taatctccta attttaagat cctctctgat ttttgcatat tgaaacttac agaagtcact 7440
ttaaaaaagt cttttgaaag tcctacaatc ctaaaataaa tcacaagctt gtttgttaga 7500
cgtgtcaaga gtctccagtc tttactacta aaaagcagca ctgccttaac acacattgtt 7560
atgggtgaaa agtgagggac gaccagtgta gtttctggat ataaagtgtg aaggactgtt 7620
gagttaaaca tttttagtgg aatatacata gataacgtgt atttagaaac tttggtgaag 7680
ccagtatttg tttttagtaa cctttttatg tatttccttc tttgattagc attgtcttca 7740
gtgttaagaa atgtggactc ctgtgaggtg ctggaggttt gaatcatctt gaaaactttc 7800
caatcttgtc tagttaccac tgcagagaca ctaaggaatt taccagaaaa agatatttga 7860
tacaagtgat ttaagaaatc tcaacatttc ctgaggccgt atcactgggc aaccagtgat 7920
gaaaactatg aatgaattgc acacctggaa gattttttaa gctaatgaca gtttcttcaa 7980
agatgtcaat tatttgcctt ggaaatttta taaattgcat ttctatgcac atcggcctct 8040
agtgcttacc actcggttta ttattcataa tctgcaattc aataaaggct ttgtgttttc 8100
atttatcttc aaaa 8114
<210> 5
<211> 7973
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 5
acaacgcgct ccctgcgggg cgggcggcaa cctccatgcg gcctcgtcca cgctcagcac 60
cggggaagcc gaggcggaga agccgcgcgc gcctcagaag ctcccggacg cccagcggcg 120
gcgcgagcgg cggcggcggc agcagcagca gcagcagcac ggccaccggc gggagcggca 180
gcagcaccgg cagccccggc ggcgcggcct cggccccggc cccggccccg gccggcatgt 240
atcgctccgg ggagcgcctg ctgggcagcc acgcgctgcc cgcggagcag cgggacttcc 300
tgcccctaga gacgaccaac aacaacaaca accaccacca gcccggggcc tgggcccgcc 360
gggcgggctc ctcggcgtcc tcgcctccct cggcgtcctc gtccccgcac ccttcggccg 420
ccgtccccgc cgccgatcca gccgattcgg cctcgggcag cagcaacaag aggaagcgcg 480
acaacaaggc cagcacgtat ggactcaact acagcctgct gcagcccagc ggagggcggg 540
ccgcgggggg cggccgagca gacggcggcg gggtcgtgta cagcgggacc ccgtggaaac 600
ggaggaacta caaccaggga gtcgtgggtc tgcatgaaga aatcagtgat ttttatgaat 660
acatgtctcc aagacctgag gaggagaaga tgcggatgga ggtggtgaac aggatcgaga 720
gtgtaattaa ggagctctgg cccagcgctg acgtccagat atttggaagt tttaaaactg 780
gactttattt acctactagt gacatcgacc tagtggtgtt tgggaagtgg gagaacctac 840
ccctctggac tctggaagaa gctcttcgga aacacaaagt cgcagatgag gattcggtga 900
aagttttaga caaagcaact gtacctatta ttaaattaac agattctttt actgaagtga 960
aagttgatat cagctttaat gtacagaatg gcgtgagagc agctgacctc atcaaagatt 1020
ttaccaagaa atatcctgta ttgccatact tggttttagt attgaaacaa ttcctattgc 1080
agagggacct taatgaagta tttacaggtg gaattggttc ttatagtctc tttttaatgg 1140
cagtcagttt ccttcagtta catcccaggg aagatgcttg catccccaat acaaactatg 1200
gtgttctctt aatagaattt tttgaattat atggacgaca cttcaattat ttaaagactg 1260
gcatccggat aaaggatggt ggttcatatg tggccaaaga tgaagtacag aaaaatatgc 1320
tagatggcta caggccatca atgctttata tcgaagatcc tttacaacca ggtaacgatg 1380
ttggaaggag ttcatatggg gccatgcaag tgaagcaggc ctttgattat gcctacgttg 1440
ttttgagtca tgctgtatca ccaatagcaa agtactatcc caacaatgaa acagaaagca 1500
tactaggtag aataattaga gtaacagatg aagttgccac atatagagat tggatatcaa 1560
agcagtgggg cttgaagaat agacctgagc cttcatgcaa tggtccagtg tcgtcctctt 1620
ctgccacaca gtccagctct agtgatgtag attccgatgc aacaccatgc aaaaccccga 1680
aacagctgct ttgccgtccg tccactggga accgagtagg gtcgcaagat gtatccttgg 1740
agtcctctca ggcagttggg aaaatgcaaa gcacccaaac cactaacaca tccaacagca 1800
ccaacaaatc tcagcatgga tcagcaaggc tctttcgttc ttccagcaaa ggcttccaag 1860
gtacaactca aacaagccat ggttccttga tgacaaacaa acaacatcaa ggcaaatcca 1920
ataatcagta ttaccatggc aaaaagagga aacacaagag ggacgcgccc ctctcagacc 1980
tctgtagata gtcagcgctg cgcggtggac tgtcttctct gtgcaatgat ctcatgctca 2040
ggacagttgc gcagggactc ctgggagata ttcaggagcc tcacactgtt cagacgttga 2100
cttagcaact gcgttttttc ccagctcgcc acagaatgga tcatgaagac tgacaactgc 2160
aaaaaaaaca aaacaaaaca aaaaaaaaag caagcaaaaa agagggaaaa aaaaggctgc 2220
ttatttgata agtcatatgc tacaacaggg tcattttaag atttaaagct tgaatgtaaa 2280
ataaatatat ttctcattgg ctttatgcag agttataggg aatagtattc agtgttggta 2340
gggtgataga aacaaaaaac agtatcagag gatgaggtgg ggaaggaaaa caaaggtatc 2400
tgataggaag tccagattcc aaaggggaaa gtgatctgtg catgtttttt ttttaaatat 2460
ttttgcatat atttaccatt ttattgtgtg tatatataga agaccatata ggagattgat 2520
atttgtaata gtggatttgt taataatact ttttacataa cattactgtt taaattgtaa 2580
acagattttt tctcaggatt agtttgaaaa ataatctaaa ttgtcatctt aacatccata 2640
tatagggaag tgattagttc tattactcaa tttgtttttc tcagcattga aatgacttaa 2700
tagaaccctt gtgtcctgct gcaaaaattt ttcctctcta aagaaaaggt ttatggtggc 2760
aaatgatgtt tattttattt tgtaaaaaaa aaaaaatgta ctatgtactt ttgtgtaaac 2820
actgaaaaat ctctggtcat ctccgagaat taacttgcaa ctgttttcta tagtgctgtc 2880
gtcttgggca atgggcaatt acatgacttt gtgtttgctt cctttgcagt cttttttttt 2940
tccccccatt tcttcctaat aggaaaaaaa aaaaaaaaaa ggtcacccat gtctggtctc 3000
attcctgttg cagtgaaact tcgagttcca cagactttgc atgctggctt ctctaaccct 3060
gtgtgctgcg tgtgcctgtt tctcatctct tattcttttt aaaattcatg cttaactact 3120
gtgggagaat aactgtaaac agctttaatt aaatcatact tataaaaaac tattttctta 3180
tattccactc tatgcttttg gtattgttga tctttacaaa ttaaatggtc tttgataatg 3240
gatctatttt gtattgcctt attaagacca aatacttctt gtcatcccat tctttatcct 3300
cttctttcat ggaattgtta tcgttaatta aaactttttt aaacattggc ttgtttcaat 3360
catactgtaa attttggttg tagtcagctt tgagtgcaat gagatgtata attctgttat 3420
cattacctgt tgagtttgaa actcagttgg gaatatttaa tataatagaa tgtaagtgac 3480
atttctgaaa atgctttctt tcagggtgaa agctcttatg tttagcatca atgtgtatgg 3540
ctctgttaaa tgcagccatt tctgagacga gattctttta tatatatata catataaagt 3600
actattggct tttaggagtt tcttttatat acatttatga aatactgaag accaatcaga 3660
ccattaatgg acacttagtg taacttttta taaagaaaat aatgctaaag taagaccaaa 3720
actgatgtca tcactgaaat taacaatttt caatatgttc atattttaat tcacaatgga 3780
aaaatgtgtt ccaaaactgg aaactcatag tactcgtgta aactgtggaa gatttcaaat 3840
gtgatgttat tttgacaatg ttttaaattt tagagtcaca ttttattctg atcagaattt 3900
ttattgagat gttgagcttt tgtttttgaa actagtttgt cataacattg tgcataatca 3960
cagtatttat tttctaggac aattgtgaat gtgtagactt atgtttactg ctaagggaac 4020
aattatttat aaaataatat taaatccagt attagctgcc tatttcagac acttaatact 4080
tgcagagatc tatgttacat ttaccacact gaagtttttt ttgttgtttt ttgtttgttt 4140
ttaaagaatc accctcattg ttgaaagtaa atgtactctt agggtgcgaa tattagtgtt 4200
ccaataagca tgtgattata ttaaggtggt ggtagcggga agataattct gattccattg 4260
ggaatcttag gttttcgtaa atttattggg aaaatagttt ttcctgtact gctgaagttt 4320
ctttttggta aacagtatct ttctaaaaga aaaaagcatg aaggagaaat tgaggtgtgt 4380
atacatttcc tcaaatgacc agcattgtat tcgtgaatac tgtgtatctt gcagtgaaca 4440
gtgtggaagc tgttcatttt tcaatctgaa gtaaaatact ttcaagaact tttagtttgc 4500
ctgctcattt gttttataca tttcatctat ttgactccta tcttatttct tttttgagtt 4560
ttaatacttc ctatattttg tgaatatatc agaaatgtgt catttatata ttagagtcca 4620
ttcatatcca tgaatcataa ccttcctttg ctaatacttg ttgaatggga ttttacaaat 4680
tctccctcac tctggtgaca tttctcaggc agtcatgtat gtgtacctgg ccattagaaa 4740
tattaatatt taaagactgt tttttagagg agctgatggg ttggtgaggt gtcagcacaa 4800
aatcttactg gttatgtttt gatgataaaa gtatatccat tttttccctc cagctttaag 4860
gtgactgtga aggtgcctgg ttttgaatgt ctttgtttgg tttggagatg tcgcactcag 4920
ttttcaaatc tagcttggat ctgtaggacc tatgtttttt acaagtaatt gccctccagt 4980
cttcaacagt tgattctgtt ttatttttat cctgttttga gtgtacttta cctttacttg 5040
cattttgagc ctcattaata tttaggttat ttgatttggc tccagatatt cctagatctg 5100
cacagggcaa aacatgggct atagggtgag catttttaat tgtctttttc tgctggaacc 5160
ttatatctct ccatgtgttt tctgctcctt ccctccccca tgaaatggta agtgtgactt 5220
gtgtttgcct gaacctgtgg actagtgttt ggggtttctg gaaacactag agggtcagaa 5280
aagagtaatg accaccgtga cgtgcaggat tctcttgctg tgacatgttc attgcaaagc 5340
cctctccagt gactaggagg tgtagttatt aaggttgatc tgttagaaat caccattatt 5400
aggtattagt ggtagatgtt gctgatactt ttattggtca tgactacatc tcagttttac 5460
tttaatattg atctatagtt tgatcagttc cttgaattct aatatgttga tttctcagtg 5520
tttctgtcac taaccaagaa tgtttctagg cagttggttg cttcacagtc aaaactaaat 5580
ggtaaactat caaaaataca ttcccaattt tgctgtgata aatattgaaa tgttaaaatt 5640
aatgaacaga agaatttatt cttacccatc tattcttgtt ctcctagttc attaaacttt 5700
cagttattgg aaaggcacat tctcaaagta ttttatgagc aaaatattct ataaatgcgt 5760
ctaacaaacc taattgaata taaaagttat atttagtagt tactgttgat agtaattttc 5820
atcagggtca tagttcatct agtaaaatat ttagagaatg atgttaacat tccagcatta 5880
aagtgggaac aaagatttat atatgaaatt ccttaaaaga gttcatcttg ccttggtttc 5940
tgaccctcaa gactctagct acctgccatc ttgtcaaaac atttgtgggt agaataagtg 6000
ttaaagatca aattttaata tgcttctcga tatttaacat agctaagaag ccagatttta 6060
ctgtagaagt tatttacatg atttgaaaac ttgacctaac tggaagcctt tttctcagtc 6120
atcttgttct aagccatctt gacttcacac ccttagcgac ttttcttttt tttttggtca 6180
aagataatga gctaaatata tatagacgtt gaatgttgac aaaattatta accagaaaaa 6240
ttgcttataa aggctgctga tctatttgat acctagaatt aaatatttga ggacagtttt 6300
tagttaataa actgctaatg tttattttac tgtctctcag gtttttggtt tttttaaaaa 6360
aaatgtgttt ggcctttaca ttttctactt aagtgtgtac tttattgagt ttaaccttgt 6420
ctgtagccta gtagcctgaa agaaaaggag acagaaccag agagatggat gtagtgcatt 6480
ccctttggtt attacacatt tgtggtagct cctggattta ctgagagata ttttagctat 6540
gtcaataaga acagctaatg atgtggaaat caggtgttct cttgtgtatt tcagtgaaca 6600
tttttattag tagttgcata tcatctctag ttccacattt taacttaacg tctttgtggc 6660
ttcaccactg agctaccttt cactacacca gcttctgtgt ggcctggtaa catggaaggt 6720
ctctcctaag gacagtctgg acgtattttg ggggaatgtt atttatctta aagatgccta 6780
gaaacaaaac gcatatagta ccagtgagaa actatgaagt aaacaagttg ctcaggccgg 6840
gcatggtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg ccgaagcggg aggatggctt 6900
gaggctggga gtttgagacc ttcatctctt aaaaaaacaa acaaaaacct gaatggtgag 6960
gtgtggtgga attgggtagg ggagggaaag gaggacttgg aaaagcattc tccaaagcca 7020
gcaacttggt gaagttcagt acttgcctct tagaggttag gccatgcctt tcaaagagag 7080
tgaaatgatg ggttatcagc cacattcttg gagttaatat ttttcttcat ctttcagttt 7140
gggttctgtg ctattcatag ttcttcccta agaccatttc attattacct tttatattta 7200
gttgcaattt attataatat gttgttttgt ccctgaactt aatctcctaa ttttaagatc 7260
ctctctgatt tttgcatatt gaaacttaca gaagtcactt taaaaaagtc ttttgaaagt 7320
cctacaatcc taaaataaat cacaagcttg tttgttagac gtgtcaagag tctccagtct 7380
ttactactaa aaagcagcac tgccttaaca cacattgtta tgggtgaaaa gtgagggacg 7440
accagtgtag tttctggata taaagtgtga aggactgttg agttaaacat ttttagtgga 7500
atatacatag ataacgtgta tttagaaact ttggtgaagc cagtatttgt ttttagtaac 7560
ctttttatgt atttccttct ttgattagca ttgtcttcag tgttaagaaa tgtggactcc 7620
tgtgaggtgc tggaggtttg aatcatcttg aaaactttcc aatcttgtct agttaccact 7680
gcagagacac taaggaattt accagaaaaa gatatttgat acaagtgatt taagaaatct 7740
caacatttcc tgaggccgta tcactgggca accagtgatg aaaactatga atgaattgca 7800
cacctggaag attttttaag ctaatgacag tttcttcaaa gatgtcaatt atttgccttg 7860
gaaattttat aaattgcatt tctatgcaca tcggcctcta gtgcttacca ctcggtttat 7920
tattcataat ctgcaattca ataaaggctt tgtgttttca tttatcttca aaa 7973
<210> 6
<211> 4511
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 6
gggcgcgcgg gccccgcggg ggcggcgcgt ggatggatcc gcgcgtggcc tggatccagc 60
ccgagcagaa ggggccggcc aatgccctgt ggatgcagat ctgggagacc tcgcagggcg 120
tgggccgcgg cggctcgggc ttcgcgtcct atttctgcct caactcgccg gcgctggaca 180
cggcggccgc ggcgggggcg gccgggcggg gcagtggcgg cctgggcccc gcgctgcccg 240
ccgcgtcgcc cccgccgccc ggccccaccg cgcccgccgc gctgcccccc gcgctgctga 300
cggcgctggg gcccgcggcc gagggcgcgc ggcgcttgca caagtcgccg tcgctgtcgt 360
cctcgtcgtc gtcctcctcg tccaacgcgg agtcgggcac cgagagcccc ggctgctcgt 420
cgtcgtcctc cagcagcgcc tcgctgggcc ggccgggcgg cggccgcggc ggcgccttct 480
tcaacttcgc cgacggcgcg cccagcgccc ctggcacagc caacgggcac cccgggccgc 540
gcggccccgc gcccgccggc tccccgtcgc agcaccagtt ccacccgggt cgccggaaac 600
gcgagaacaa ggccagcacc tacggcctca actacctgct gtccggcagc cgcgcggccg 660
ctctcagcgg agggggcggc cccggggccc aggcgccgcg gcccggcacc ccgtggaaga 720
gccgcgcgta cagcccgggc atccagggac tacatgagga aataattgac ttttataact 780
tcatgtcccc ttgtcctgaa gaagcagcta tgagaagaga ggtggtgaaa cggatcgaaa 840
ctgtggtgaa agacctttgg ccgacggctg atgtacagat atttggcagc tttagtacag 900
gtctttatct tccaactagc gacatagacc tggtggtctt cgggaaatgg gagcgtcctc 960
ctttacagct gctggagcaa gccctgcgga agcacaacgt ggctgagccg tgttccatca 1020
aagtccttga caaggctacg gtaccaataa taaagctcac agatcaggag actgaagtga 1080
aagttgacat cagctttaac atggagacgg gcgtccgggc agcggagttc atcaagaatt 1140
acatgaagaa atattcattg ctgccttact tgattttagt attgaaacag ttccttctgc 1200
agagggacct gaatgaagtt tttacaggtg gaattagctc atacagccta attttaatgg 1260
ccattagctt tctacagttg catccaagaa ttgatgcccg gagagctgat gaaaaccttg 1320
gaatgcttct tgtagaattt tttgaactct atgggagaaa ttttaattac ttgaaaaccg 1380
gtattagaat caaagaagga ggtgcctata tcgccaaaga ggagatcatg aaagccatga 1440
ccagcgggta cagaccgtcg atgctgtgca ttgaggaccc cctgctgcca gggaatgacg 1500
ttggccggag ctcctatggc gccatgcagg tgaagcaggt cttcgattat gcctacatag 1560
tgctcagcca tgctgtgtca ccgctggcca ggtcctatcc aaacagagac gccgaaagta 1620
ctttaggaag aatcatcaaa gtaactcagg aggtgattga ctaccggagg tggatcaaag 1680
agaagtgggg cagcaaagcc cacccgtcgc caggcatgga cagcaggatc aagatcaaag 1740
agcgaatagc cacatgcaat ggggagcaga cgcagaaccg agagcccgag tctccctatg 1800
gccagcgctt gactttgtcg ctgtccagcc cccagctcct gtcttcaggc tcctcggcct 1860
cttctgtgtc ttcactttct gggagtgacg ttgattcaga cacaccgccc tgcacaacgc 1920
ccagtgttta ccagttcagt ctgcaagcgc cagctcctct catggccggc ttacccaccg 1980
ccttgccaat gcccagtggc aaacctcagc ccaccacttc cagaacactg atcatgacaa 2040
ccaacaatca gaccaggttt actatacctc caccgaccct aggggttgct cctgttcctt 2100
gcagacaagc tggtgtagaa ggaactgcgt ctttgaaagc cgtccaccac atgtcttccc 2160
cggccattcc ctcagcgtcc cccaacccgc tctcgagccc tcatctgtat cataagcagc 2220
acaacggcat gaaactgtcc atgaagggct ctcacggcca cacccaaggc ggcggctaca 2280
gctctgtggg tagcggaggt gtgcggcccc ctgtgggcaa caggggacac caccagtata 2340
accgcaccgg ctggaggagg aaaaaacaca cacacacacg ggacagtctg cccgtgagcc 2400
tcagcagata atggctcctg gctgcgtcag cctcccccac ccctctgcag actgccccgc 2460
ggcctcggcc accggcaggg gaaccgagac cagcaccccg cacgtcagcc gggctcgcgg 2520
cacgcccgcc gctgatcact ctgcatgttt cttcgtgtgg tggtcgcgtc catcttcaag 2580
aacagctcgt tgtgctcatc tgtgaagcct tattaaacgt ggacgttgtt ttctgccttc 2640
ccaggattct tccttcagtg ctgaggcagg tcgggctcag gaactgcagg gacgtgaaca 2700
tgcgcttgcg gtttgaggta gccgtgtctg ttccttcgcg gtttgctatt ttcatttcct 2760
gttcgtcaaa gcagcagagg agatcaaacc ccgttcgtgt gtctttcctc cacggataag 2820
cttgggaggt cattgtttta ctgccctcac attttgtttg aaatttcaga actgtttttc 2880
tatgtaaata ttgaaaactt atgatttgtg caataactca gatatttttt atttaatttc 2940
ctattttcac ataagttata tttaagggag gagggaattt tttttaaaca agcttaggtc 3000
ctttcccgag ctgcattttc taagttgggt catcgtgtcg gctggttgtc tgacgagcat 3060
cgttacaaac accatgatga ggggtttggg gttttatttt gatgtctttt cttttggtcg 3120
gaagtgagtg aaggagccag gtcgccctga aggttttcca aagggcttgg ctccagagcc 3180
acctggcaga ctgcccgtgg ccctgctgtc gggccccagg ccgttgtcct gctctgacca 3240
cagagtttta atgttttggt tttcacttct tttaaactgg acaacaaatc cagcatttca 3300
agtgccagaa gtataacttt ctaaggagag aagggttgtc acattataaa atctttagga 3360
aaatgtgaac tggaaaacgc ttcggtcagt tttagtgaca tagcctgtga tgatgggtct 3420
ggtgactatt attgcggacc gtggtaccca gttttaggaa tgtggagaaa ggaattctgt 3480
tgattccgtt gaggaatctg tagcgtatgc attcgttctg ttaagagcaa atctaggaga 3540
agtgcttcag ctgcccagtg cgccgtgggg agtgttttaa cggatcgtgt cgcaggagag 3600
cacagcccag cgttggggcc gggaccgctg gcgcccgacg tcggaagcat acaggtatac 3660
tatgcaagtg tattctgcca caacaaccac tgtctttgtt accttttttt gaacaagaat 3720
atatccatcc tgcctaaccc tgagtttttg gagcaccaca gttgtcctgg gagttggttg 3780
catcttgtag gccatctgac ttcctgtttt taaaacgggg gtctggtctt gctaaacact 3840
acaggtaggt tggtctttga agtccactag tggagaatgt caagacaaga tacttattac 3900
catgacatct gatgcatgtg cagcagtggg gagttctaga ttgatctctg aatgtgatcg 3960
acgcccagca aggacaagct ttaaaatgtc tgcggtctgc ccttttgaag caggactggc 4020
tcactctgtc attgggagct gtcagctgcg actgcaggtt ctctaggagg cattccagaa 4080
tagagtagca cactgtgtct gcagttctcg atgaccgaaa gttatcaaaa atatttaaaa 4140
tatttaaatt gtgaacctat tgataaagaa tatttataaa aactgatctg taggcctgta 4200
ctaatctcta cgcattagca atattgactg taaacccaca ttaaggaaac cactacgggt 4260
ctggcagtgc gtgtcccgtg gggtgtgcat tttaaaactc gattcataga cacaggtacc 4320
atgttccatt tccgtcatgg tgaagcaaat gaattggcct ggctaccact gtggtcgcgt 4380
gctacaggtt tgacaaaaag atatcatgtt tcgatttttt tgtgtgtgga caacaatatg 4440
gaagctaaaa ttgacatatt tttatgtaaa gtttttctat tctttgattt ttaataaact 4500
ttggaaacca g 4511
<210> 7
<211> 474
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 7
Thr Tyr Gly Leu Asn Tyr Ser Leu Leu Gln Pro Ser Gly Gly Arg Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Arg Ala Asp Gly Gly Gly Val Val Tyr Ser Gly Thr
20 25 30
Pro Trp Lys Arg Arg Asn Tyr Asn Gln Gly Val Val Gly Leu His Glu
35 40 45
Glu Ile Ser Asp Phe Tyr Glu Tyr Met Ser Pro Arg Pro Glu Glu Glu
50 55 60
Lys Met Arg Met Glu Val Val Asn Arg Ile Glu Ser Val Ile Lys Glu
65 70 75 80
Leu Trp Pro Ser Ala Asp Val Gln Ile Phe Gly Ser Phe Lys Thr Gly
85 90 95
Leu Tyr Leu Pro Thr Ser Asp Ile Asp Leu Val Val Phe Gly Lys Trp
100 105 110
Glu Asn Leu Pro Leu Trp Thr Leu Glu Glu Ala Leu Arg Lys His Lys
115 120 125
Val Ala Asp Glu Asp Ser Val Lys Val Leu Asp Lys Ala Thr Val Pro
130 135 140
Ile Ile Lys Leu Thr Asp Ser Phe Thr Glu Val Lys Val Asp Ile Ser
145 150 155 160
Phe Asn Val Gln Asn Gly Val Arg Ala Ala Asp Leu Ile Lys Asp Phe
165 170 175
Thr Lys Lys Tyr Pro Val Leu Pro Tyr Leu Val Leu Val Leu Lys Gln
180 185 190
Phe Leu Leu Gln Arg Asp Leu Asn Glu Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly
195 200 205
Ser Tyr Ser Leu Phe Leu Met Ala Val Ser Phe Leu Gln Leu His Pro
210 215 220
Arg Glu Asp Ala Cys Ile Pro Asn Thr Asn Tyr Gly Val Leu Leu Ile
225 230 235 240
Glu Phe Phe Glu Leu Tyr Gly Arg His Phe Asn Tyr Leu Lys Thr Gly
245 250 255
Ile Arg Ile Lys Asp Gly Gly Ser Tyr Val Ala Lys Asp Glu Val Gln
260 265 270
Lys Asn Met Leu Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Met Leu Tyr Ile Glu Asp
275 280 285
Pro Leu Gln Pro Gly Asn Asp Val Gly Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met
290 295 300
Gln Val Lys Gln Ala Phe Asp Tyr Ala Tyr Val Val Leu Ser His Ala
305 310 315 320
Val Ser Pro Ile Ala Lys Tyr Tyr Pro Asn Asn Glu Thr Glu Ser Ile
325 330 335
Leu Gly Arg Ile Ile Arg Val Thr Asp Glu Val Ala Thr Tyr Arg Asp
340 345 350
Trp Ile Ser Lys Gln Trp Gly Leu Lys Asn Arg Pro Glu Pro Ser Cys
355 360 365
Asn Gly Asn Gly Val Thr Leu Ile Val Asp Thr Gln Gln Leu Asp Lys
370 375 380
Cys Asn Asn Asn Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ala Leu Gly Lys Cys Arg
385 390 395 400
Ser Lys Thr Ser Glu Ser Leu Ser Lys His Ser Ser Asn Ser Ser Ser
405 410 415
Gly Pro Val Ser Ser Ser Ser Ala Thr Gln Ser Ser Ser Ser Asp Val
420 425 430
Asp Ser Asp Ala Thr Pro Cys Lys Thr Pro Lys Gln Leu Leu Cys Arg
435 440 445
Pro Ser Thr Gly Asn Arg Val Gly Ser Gln Asp Val Ser Leu Glu Ser
450 455 460
Ser Gln Ala Val Gly Lys Met Gln Ser Thr
465 470
<210> 8
<211> 419
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 8
Leu Leu Gln Pro Ser Gly Gly Arg Ala Ala Gly Gly Gly Arg Ala Asp
1 5 10 15
Gly Gly Gly Val Val Tyr Ser Gly Thr Pro Trp Lys Arg Arg Asn Tyr
20 25 30
Asn Gln Gly Val Val Gly Leu His Glu Glu Ile Ser Asp Phe Tyr Glu
35 40 45
Tyr Met Ser Pro Arg Pro Glu Glu Glu Lys Met Arg Met Glu Val Val
50 55 60
Asn Arg Ile Glu Ser Val Ile Lys Glu Leu Trp Pro Ser Ala Asp Val
65 70 75 80
Gln Ile Phe Gly Ser Phe Lys Thr Gly Leu Tyr Leu Pro Thr Ser Asp
85 90 95
Ile Asp Leu Val Val Phe Gly Lys Trp Glu Asn Leu Pro Leu Trp Thr
100 105 110
Leu Glu Glu Ala Leu Arg Lys His Lys Val Ala Asp Glu Asp Ser Val
115 120 125
Lys Val Leu Asp Lys Ala Thr Val Pro Ile Ile Lys Leu Thr Asp Ser
130 135 140
Phe Thr Glu Val Lys Val Asp Ile Ser Phe Asn Val Gln Asn Gly Val
145 150 155 160
Arg Ala Ala Asp Leu Ile Lys Asp Phe Thr Lys Lys Tyr Pro Val Leu
165 170 175
Pro Tyr Leu Val Leu Val Leu Lys Gln Phe Leu Leu Gln Arg Asp Leu
180 185 190
Asn Glu Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly Ser Tyr Ser Leu Phe Leu Met
195 200 205
Ala Val Ser Phe Leu Gln Leu His Pro Arg Glu Asp Ala Cys Ile Pro
210 215 220
Asn Thr Asn Tyr Gly Val Leu Leu Ile Glu Phe Phe Glu Leu Tyr Gly
225 230 235 240
Arg His Phe Asn Tyr Leu Lys Thr Gly Ile Arg Ile Lys Asp Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Val Ala Lys Asp Glu Val Gln Lys Asn Met Leu Asp Gly Tyr
260 265 270
Arg Pro Ser Met Leu Tyr Ile Glu Asp Pro Leu Gln Pro Gly Asn Asp
275 280 285
Val Gly Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Gln Val Lys Gln Ala Phe Asp
290 295 300
Tyr Ala Tyr Val Val Leu Ser His Ala Val Ser Pro Ile Ala Lys Tyr
305 310 315 320
Tyr Pro Asn Asn Glu Thr Glu Ser Ile Leu Gly Arg Ile Ile Arg Val
325 330 335
Thr Asp Glu Val Ala Thr Tyr Arg Asp Trp Ile Ser Lys Gln Trp Gly
340 345 350
Leu Lys Asn Arg Pro Glu Pro Ser Cys Asn Gly Pro Val Ser Ser Ser
355 360 365
Ser Ala Thr Gln Ser Ser Ser Ser Asp Val Asp Ser Asp Ala Thr Pro
370 375 380
Cys Lys Thr Pro Lys Gln Leu Leu Cys Arg Pro Ser Thr Gly Asn Arg
385 390 395 400
Val Gly Ser Gln Asp Val Ser Leu Glu Ser Ser Gln Ala Val Gly Lys
405 410 415
Met Gln Ser
<210> 9
<211> 320
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 9
Tyr Ser Pro Gly Ile Gln Gly Leu His Glu Glu Ile Ile Asp Phe Tyr
1 5 10 15
Asn Phe Met Ser Pro Cys Pro Glu Glu Ala Ala Met Arg Arg Glu Val
20 25 30
Val Lys Arg Ile Glu Thr Val Val Lys Asp Leu Trp Pro Thr Ala Asp
35 40 45
Val Gln Ile Phe Gly Ser Phe Ser Thr Gly Leu Tyr Leu Pro Thr Ser
50 55 60
Asp Ile Asp Leu Val Val Phe Gly Lys Trp Glu Arg Pro Pro Leu Gln
65 70 75 80
Leu Leu Glu Gln Ala Leu Arg Lys His Asn Val Ala Glu Pro Cys Ser
85 90 95
Ile Lys Val Leu Asp Lys Ala Thr Val Pro Ile Ile Lys Leu Thr Asp
100 105 110
Gln Glu Thr Glu Val Lys Val Asp Ile Ser Phe Asn Met Glu Thr Gly
115 120 125
Val Arg Ala Ala Glu Phe Ile Lys Asn Tyr Met Lys Lys Tyr Ser Leu
130 135 140
Leu Pro Tyr Leu Ile Leu Val Leu Lys Gln Phe Leu Leu Gln Arg Asp
145 150 155 160
Leu Asn Glu Val Phe Thr Gly Gly Ile Ser Ser Tyr Ser Leu Ile Leu
165 170 175
Met Ala Ile Ser Phe Leu Gln Leu His Pro Arg Ile Asp Ala Arg Arg
180 185 190
Ala Asp Glu Asn Leu Gly Met Leu Leu Val Glu Phe Phe Glu Leu Tyr
195 200 205
Gly Arg Asn Phe Asn Tyr Leu Lys Thr Gly Ile Arg Ile Lys Glu Gly
210 215 220
Gly Ala Tyr Ile Ala Lys Glu Glu Ile Met Lys Ala Met Thr Ser Gly
225 230 235 240
Tyr Arg Pro Ser Met Leu Cys Ile Glu Asp Pro Leu Leu Pro Gly Asn
245 250 255
Asp Val Gly Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Gln Val Lys Gln Val Phe
260 265 270
Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Leu Ser His Ala Val Ser Pro Leu Ala Arg
275 280 285
Ser Tyr Pro Asn Arg Asp Ala Glu Ser Thr Leu Gly Arg Ile Ile Lys
290 295 300
Val Thr Gln Glu Val Ile Asp Tyr Arg Arg Trp Ile Lys Glu Lys Trp
305 310 315 320
<210> 10
<211> 82393
<212> ДНК
<213> homo sapiens
<400> 10
acaacgcgct ccctgcgggg cgggcggcaa cctccatgcg gcctcgtcca cgctcagcac 60
cggggaagcc gaggcggaga agccgcgcgc gcctcagaag ctcccggacg cccaggtacg 120
tgggagcact ccacagatgg cgcaagtacg gttgggccag gcggttgcgg ccccgtcgcg 180
ccgcggcctc tgtgacgcac ggcgaggcct cccgggctgc tgcgcggcgc agcgggggcg 240
gggcgagcgc gtgagggcgg ggcggtgggg ggggggggcg gagcgagagg ggcggagccg 300
gcagaggccc cgccccgggg ccggaggagc gaggacgcta cggagcaggc gcgtctcgct 360
gccgccgctg ccgccgccgc cgctcgctct tctgtggagc cgccgccgcc gccgccgcca 420
tttgcacggg gaccccagtg acaggggctc ggcggagggg cggaggggcg gagggagggg 480
gggagggccc gcggagcccc cgagggcggg agcgacgccg ccggcgccgg ccgggctccc 540
tgcgcgaccg cgccgcccgc ggcgggcccc gagcagcagc agcagcagca gcggcagcag 600
cggcagcagc agcagcagcc gaggccgggc gtgcgcctga ggcggcggcg gcggcggccc 660
tgcgggcggc cgggaggggc gggggcagcg gccgccgccg tttgatggat ccgaggatcg 720
cctggtttca gccagagcag ctcggaccgt ccaacagtct gtggatgcag atctgggaga 780
cgacccaggg gctgaggaac ctctacttca accaccactg tcacagcagc ggcggcgcga 840
gcggcggcgg cggcagcagc agcagcagca gcacggccac cggcgggagc ggcagcagca 900
ccggcagccc cggcggcgcg gcctcggccc cggccccggc cccggccggc atgtatcgct 960
ccggggagcg cctgctgggc agccacgcgc tgcccgcgga gcagcgggac ttcctgcccc 1020
tagagacgac caacaacaac aacaaccacc accagcccgg ggcctgggcc cgccgggcgg 1080
gctcctcggc gtcctcgcct ccctcggcgt cctcgtcccc gcacccttcg gccgccgtcc 1140
ccgccgccga tccagccgat tcggcctcgg gcagcagcaa caagaggaag cgcgacaaca 1200
aggccagcac gtatggactc aactacagcc tgctgcagcc cagcggaggg cgggccgcgg 1260
ggggcggccg agcagacggc ggcggggtcg tgtacagcgg gaccccgtgg aaacggagga 1320
actacaacca gggagtcgtg gggtgagtgc tggctctgcg gcccgatggc ctggccggtg 1380
cgaatgcgca gccgggcaca cgcccacaga ggggggttgt gagggtctag gagcggccac 1440
ccccacggcc tgccttcgct gctgttgcac gggggtgctg ctggccatcc ccaacccccc 1500
agtcgttcac acctttcccc aagcctcctt agccgtccac accctccgtc tcctgtcctc 1560
ccttagtcgt ccacaccttc ctcccctccc tcttaaccgt ccacaccttc cccaggcccc 1620
cccctttatc cattcactct cctcccatcc cccttagtta aacacatcta cccttgacca 1680
ccaccccgcc tccagccctc cacacctttt tccccatcat cacaactcaa gatgagaccg 1740
cttagcacgg gcctatcatt cattccctga gaacattggt gtgtgagtgt tttttgatgg 1800
tgcaggaccc ggaggtgctt tccttgccaa gaatagaaac atccagaatg ctcctcccca 1860
tcccccaatc ccagacagca attatgtcag ccctgtaagg cattgcctgc tcttgaccct 1920
ttggcccatc tttttatttt taaaaaattc ccatgtcaca gatgccctgt ctatgcagag 1980
ggtggcgtgg gatgggtgac cactaagttt aggctggtga aggtggtgag cccttctgag 2040
gccctgatag aactttccag gagttcatgg tccgcggctc cagcttctca ctgtaaagtt 2100
gtcatcctgg cagaggcagc caatgctttt cattctaggg ggtagagatt tatgctaatg 2160
agtgaatatt gcaccactag tgactttctg tttaaagttc agctcttaga aaatggaatc 2220
ttacctgacc cctagtgaat tatgtacata agcagggaat gtttccaact agatctccct 2280
tcagaagagt ccctgtgctg gaataggtca ctgaatctta tttgttttgt aaaacaaagc 2340
ttttgggtct cgtgggtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtagctt 2400
gagtatggag aaccggcttt caaattgctt ttcatttttc aggttgtgtt ttacattgag 2460
ggctttagca tgcaaatgaa attaccaatt agtaatccca tgtgaacctt ttcctggatt 2520
tattcattca gatctgccct gctttggctg agagagagag ttctgtgtac ctttttgaag 2580
gtctggataa aatgagttgg tgggttccat ctgcttccag tgggctggtg tctgctctat 2640
gctactatta caactcctac cttttgtgga aaatgcagtc aagcgttcta ggactggtgc 2700
tgtggtacat gtcaaacctg ccctcacatt ccagaaaggg aaccctttta gggttgagtc 2760
ctctgttgct aagcttcaag ggtgctctcc atggtcatca cgttttatta aaggcttgtg 2820
gttccatcct gttagcattt ccaagtctac gcgtaaacct gtggtttagt gacaagcaaa 2880
ttgatgttga gggtttctgg tagtttcatt tcacaggagt aagctccagt taggtaatca 2940
ctgtcaacga aaaccttgaa gttccttaat tgcattttac tgaagcctct ttgcatgtgt 3000
ctagcaaaag atataagtcc aagatgctta tttttttttt gataaattag aaattgtcct 3060
ctcctctact tgctatttaa tgcagaagat actctaaaag gttcatattt atacttagaa 3120
gcaagatgtt cttgttcctg attcaaatat attgccctca aagggattag gagaggaatt 3180
ttcatttccc ggagggatta ctgtttaaaa actggttgta aacctcttta aaaactgctt 3240
atcacttcac cagattttcc attcttttgc ctcctccctt agaggatgtc agcagttaat 3300
ttttttttta aattaaaaaa agttcaattc tgagacctcc tagtttcaaa aaatacatta 3360
aacaattccc aagagtgtta agagtgtctg ggtgcttaga aattcttgct ttgattcatg 3420
tattctgatt tttttttttt ttttgagacg gagtttcgct cttgttgccc aggctggagt 3480
gcagtggctc gatctcagct caccgcaacc tctgcctccc aggttcaagc gattctgctg 3540
cctcagcctc ccgagtagct gggattacag gcgcttgcca ccacgcctgg ctaatttttt 3600
atttttagta gagacggggt ttcttcatgt tggtcaggct ggtctcgaac tcctgacctc 3660
aggtgatctg cccgtcttgg cctcccaaag gactgggatt acaggcatga gccaccgtgc 3720
ccggcctcat tatcctgatt tctttttttt cttttgagac tgggtctcac tctgctgcct 3780
aggctggagt ggagtgacgt gatcatagct cactgtatcc tctaactctt gggctcaagt 3840
gatcctcctg ccttagcttc ctggagtagc tgggactaca ggcacatgtc accacacctg 3900
cctaattttt ttatttttac tttttgtaga gatggggcct ccatttgttg cctaggctgg 3960
tcttcaaccg gcctcaagca gtcctcccac cttggcctca cagagtgctg ggattatagg 4020
catgagccac cattctcgcc agtatcctta tttcttaact ttagaaagtt tttctatttt 4080
taatataggt atttaaaaaa atctgaattc agagtgcacc tcgatgttat gctgttctga 4140
gattaaatat actaaaactg ttaccattgt tttctgaatt cttaagatgt gactgatagt 4200
tagctaatag gttaacacat tgtggtggtt cttggcctct gaactgatag tccagatggg 4260
gagaggagac cagaaagcat gtgaaaatgg actagaacca tgggacagct atatagtctc 4320
tcgcagctgt cttttgtgtt ctctgcttcc accaaattgg ttgatttatt tagaatgctg 4380
acctcttgca ttgcctaagt ccttgatgtt tttggtttct cctctgaact ctcaaaggta 4440
ctcacttcat gctcttggta tagcccactt atgtttaact ttccttttat tatgtgttcc 4500
ctcttacaca tgacatggac atttctttaa tatgtagagt aagatattgg atttcatcct 4560
aaagtcttca aaataaaact cttgagctca tcatctcaga cttcttcatg tacccacaga 4620
ccagggattt tgtttgcttt ttaaaacatt tttttatttt gtgttttatt atttttaaat 4680
tttaatttaa ttttatggag acagggtctc gctctgttgc ccaggctgga gtgcagtggt 4740
gtgatctcgg ctcactgcag cctttgcctg ggctcaagcc atccacatgc cttggcctcc 4800
cagtgtgctg ggattacagg tgtgagccac tgtgcctggc ctaaatttat ttttttaatt 4860
ttttttgaga cagggtcttg ctctgtcgct caggctggag tgcagtgtca taatcatggg 4920
tcacagcagc cttggcctcc caggctgaag tgaacttccc acctcagcct cctgagtagt 4980
tgggactaca ggcgagtgcc accatgcctg gctcattttg gttttttttg taaagatggg 5040
gtcttgtcat gttgcccatg aaggtctcca actcctggtc caagtgatcc tcccgcctcc 5100
gcctagcaaa atgttgggat tacaggtgtg agccaccatg cctggcctta tttatttatt 5160
taattatgaa tgaatgaatg aattaatgag agggagtctt gctctcttgc ccaggctgga 5220
gtgtggtggc acaatcttgg cccactgcaa cctccgtctc ccaggttcga gcaattctcc 5280
tgcctcagcc tcccgagtaa ctgggattac aggcgcccgc caccatgccc aggtaatttt 5340
tgtattttta gtagagatgg ggtctcacca tgttggccag actggtttcg aacttctgac 5400
ctcaagtgat ctgcccacct tggcttccca aagtgtcagg attacaggca tgagccacca 5460
tgcctggcct ggccttttat gttttaagtt gcttccactg attctcttgg gctttgctcc 5520
cctccagaac tggccatggt ttaggatgct gtccacctgc tgctgcttgt ccatgaaaac 5580
gagccataaa cccttttctt ttgaaagact taattgttta tcactatgga gaaagagggg 5640
atggcaagaa gtagcaaata cagggaattt gcagaacttg gtcttgagcc ctgggtccag 5700
aaacttcttc tggaaggtgc ttggtgtttg tccaagctca tgataggttt ctgttggctg 5760
tactgccaga tctgtagatg cttttttaag gcttggatga cttgttcaaa acaatgtttt 5820
ggagtacaaa tttggctgtg gggacatcaa gaccttgttg ggaaacttgg gtttaaggta 5880
caatttctta aactaggatg gtgggaatgg ggatgtgaag ggagaatgaa tgtgagaggt 5940
attacagggt aaggatggag atgattcaga ttccttaagt ggatttaata atcacactgt 6000
agctttgaac ttgagtgact ggggaaatat ttgtggtgtt tttggaaata agggccagaa 6060
ggactattgg tttgggtaag aagatagtag ggggatgtat aggtggacct gctagtgggg 6120
agctgagatt tggagggctg agatgtagtg ctcttcactg ccgtagggca gtatcctctt 6180
gtatgtgcca tcctctagtg cccattgttc atcatgtcat agtaagccca agatgttcat 6240
gccttttttc agcactgcat tagggcttat atctgcttct ctttctctct ctctctcgct 6300
ctcgctccct ccctctctct ctctttctgt tttttttttt tttttagacg gagtttcact 6360
tgtgttgccc aggttggagt gcagtggcgc gatcttggct cattgcaacc tctgactccc 6420
gggttcaagc aattctcctg cctcagcctc ccaagtagct gggattacag gcatgtgcca 6480
ccatgcctaa ttttgtatct ttagtagaga tggggtttct ccatgttggt caggctggtg 6540
tcaaactccc aacatcaggt gatctacctg cctcggccgc ccaaagtgct gggattacag 6600
gcatgagcca ccgcgcccgg cctctctctg cttatttcta cacagtgtta ccaatgagat 6660
tggtgttact gctgggctcc aaagcaatca gacagattaa agtagattga atatgaaaga 6720
atttagaggc ctttttccaa gtgatttgtg ctctatttaa tttctgtgca tttgcagata 6780
tagcccacag taattcttag tgaactagaa ccttcaggtt attgaatttt actgatttgg 6840
gtactgacat gcgcttttaa gaagacatta ggttttctat agtgtagatt gtacactaac 6900
aatataattc atatttaaga atgtctcaaa atttagtata ctgtgttcaa ctaacttaac 6960
tttctttgtt ttttttgttt tgttttgttt ttgttttttg agacggagtc ttgctatgcc 7020
acccaggctg gagtgcagtg gcgtgatctt ggcttactgc aacttcaaca ctcctgggtt 7080
caagtgattt tcctgcctca gcctcctgag tagctgggat tacaggcacc cgccaccaca 7140
ccggctaatt tttgtatttt tagtagagac ggggtttcgc cgtgttggcc aggctggtct 7200
tggactcctg actcaaatga tctgcctgcc ttggcctccc acagtgctag gattacagac 7260
atgagccact gcgcccggcc gctaacttaa ctttcattcc acaacttcca tcttttatcc 7320
aaaatctgtg atcattgaat actgtcacca ttaatcattg gcatttcagt gtttggactt 7380
tttttttccc ccttcgtctt tgtggactct tttttaacac tcataaagtt ttaactattg 7440
aaaagcaaag gaaacggtga gtgacttttt ggagtctgtc tacccagtgg tcacacaaaa 7500
ggcttactac attacaggaa agataggatg ggaaagggat actagaaaat tctaagtcag 7560
gaacgggggt gtgtattaga aaaattctga tcctggcatg ccagatggcc ttacatctca 7620
atttcttccg tgaaattcct gccaacaaat catagtgtta gaagtacaga agggtccatg 7680
ggaacagaat ttaagggctc cgttggtgat acggaactga tcagatggtt ctcacttgtt 7740
ctcagataac ctgtatactg aatatcacag gaagggtata gacgtcatgg cagtggttag 7800
atattcttgc acctgctgaa gctgagaaaa ttaaagtaat tttttttcct gtggaaagta 7860
gaaaatcaag cttttgtatg atttcacaca gctttctatt ctctcttttg ttgactctgt 7920
taagagtaac atttagtggt ggaaactatt tcaggatcac acccacaaca ctagagactg 7980
tattaatcac ttacacacac ataggtatag agtaatcttg aaggggctgt aggccaaaga 8040
taatgctttt ttgaagaatt agagactagt taccagcacc tggtatttgc tgtttcctac 8100
agagctgact ggacagccta gagtctgctg aggaattcag aggatggcca gtagaatgtt 8160
ctttccaccc cagaatattt ggtagggact cagctgctgt ggaatgccaa aaaggctttg 8220
agtttgtttc actattctta agattacacg taattgtttt tttgtaagag attatatata 8280
ttcaagttga ggatggcttt gagttagact ttccttaatt tggaatcaca cagcagatga 8340
tacatttatt tccatctgat aagttacttg atgatgtaaa aagacatttg agttaaagat 8400
ttttgggaaa aaagctgaat gttgagccat ttatgttgtg tactggttcc ctattcactt 8460
ggacaatttt aagtcttaaa acaatcttaa ccatgtgcac aagagatttc acatagtatt 8520
tggtaattaa attaaggaat tctagctcaa gtcatgcttt ttgctgaaat agttgtatat 8580
atttagtgcg gaaacctgtg ttttcaaatt aatgtaataa aagtttcaat aaaatggaag 8640
cctttattac cgtgtttcaa atgctatgct aaaccttttc catttgttat tatattaacc 8700
tcctcataca tagccctact aattttttta ctttctattt tgaaataatt acagatttat 8760
aggaagttgt gaaaaatagt acagagccca tgttcccttc accaagtttc acctaatggt 8820
agtagctcac ataacgataa tttaatgtca agaaccagga aattgtcatc gttgcaatcc 8880
ataagccttt tttagatttc accagtttca catgtatttg tgtgtgtgtg tatatatata 8940
attgtatgca attttatcat gtgtagatct ggatagccac tgtaacagtc tatagttcta 9000
tatacagagc tactccatca cctcagggct ccctatgcta ccactttata gccgcacgca 9060
cccttccagc aaccactaat ctgtttgcat ctctgtaatt ttgccatttt gagaatgtta 9120
tataaatgga atcatacaga atgtaacttt ggcttttttt cttttaccat acttcctttg 9180
agagccatcc aaattgctgc atgtatcagt agttcatttc tttttactat tgagtagtag 9240
tccatagtat ggctgaacca cacaatttgt ttaaccattt acttattgaa ggacatacca 9300
gaagggtggt ttccagtttt ttggctattg caaataaagc tgctataaac attcatgtat 9360
ataaatattt ttatgtgaat ataaagtttt cattttgggg gaataaatgc ccaaatgttt 9420
ggattgtatg gtaagtgcat gtttggtttt tagagaaact gctgaactat ttattttcta 9480
gaatgactat atcctcttat attcctatca acaatatatg agatatccag tttctctgca 9540
tccttgctag catttagtgt taccactttt ttatttgagc ggttctaata tgtgtagtga 9600
tagcctgttt tgccttatat taatcaataa aaatagcctc atctaatctt aacttttttt 9660
attttaaaac atcttggcag tattgaactt tctcaatgaa aaatctctaa aattgtgact 9720
tgaaaggctt taattttcca gtttttcttt ggttttactc ttagcagtaa cattttaact 9780
tttttttgtc tttgaagtaa ttttcagtgt ttcctttaca tgttgctttt tcttagaaac 9840
tagttactag catgaagtag atctttagcc tcgttttcta aaaacataaa aaagtaaaac 9900
tgtggggttt atttcaaaat tgagagtcct gtcttttcat atgaggatat tttatagtct 9960
gttggcttgg ctatatttta gggagtaaac ctgtggttag tggtttgttg ttggtggtgg 10020
taaagttttc ttacagtatt tttatacctg aataatacct ttagactcta tagaatagat 10080
acttgatctt caaatctatc ctagaataaa ttgttttatc taaacagctt tgtgacctga 10140
gaattgggac ttagtccctt agttttccct tactggccct ttgtagtcac tgttttgatt 10200
ttgtgaaagt aacttaactc ttagcactgt caggtattgt acattcctgc caaagcaaga 10260
ataagaatac ataggattgt gttttaattc tataattagg tgacttttgg ctaatttcca 10320
ggaacttgga cttaataaag tactagtgat aagtttggaa attttagtgt ccttgttctt 10380
tgaagttatt caccctttac tttcttgttt gtttggggtg tttatactac tgtccctaaa 10440
tatagctgaa ataaaggaag aaaaataacc cctgtaatat cactaccagg atataatttc 10500
tttttttttt ttttttttga gatggagtct cgctctgtcg cccaccatct cggctcactg 10560
caagctctgc ctcctgggtt cacgccattc tcctgcctca tcctcccgag tagctgggac 10620
tacaggcgcc cgccaccaca cccggcttat tttttgtatt tttagtagag acggggtttc 10680
actgtgttag ccaggatggt cttgatctcc tgatcttgtg atccacctgc ctcggcctcc 10740
caaagtactg ggattacagg catgagccac cgcgcccggc ctgatataat ttctgttaac 10800
agtttgatgt aaatattttt tgacttttta gtgtttttat atatatatat attttatgtt 10860
tttcttttat caatacgcac tcttactgtg ggaataattt taatgttttt aaagagttgg 10920
gttttatttg tttattttat tttatagaaa tggggtctcg ccgggtgcga tggctcacgc 10980
ctgtaatccc agtactttgg gaggccaagg caggagcatc acctgaggtc gggagttcga 11040
gaccagcctg accaacatgg ataaaccgcc tctctactaa aaatacaaaa ttagccgggc 11100
gtggtggcac gtgcctgtaa ttccagctac ttgggaggct gaggcaggag aatcacttga 11160
acccggccgg tggaggttgc agtgagcaaa gattgtgcca ttgcactcca tcctgggcag 11220
caagagtgaa acttcatctc aaaaaaaata aaaaataaaa aagaaagaaa gaaagaaatg 11280
ggatctcacc attttggctg gttttgaact tgtggtctca agcagtcttc ctacctcagc 11340
atcccaaagt attgggatta caggtgtgag cccatcctgt ttgttgttgt tcttttgttg 11400
ttgttgtttt tagatgaagt ctccctctgt cacccaggct ggagtgcagt ggcgctatct 11460
tggctcactg caagccccgc cacccaagtt caagcaattt tctgcctcag cctcccgagt 11520
agctgggatt acaggcgccc accaccatac ctggctaatt tttgtatttt tagtggagac 11580
gaggtttcac catattggcc aggctagtct tgagctcctg acctcgtgat ccacctgcct 11640
cggcctccca aagtgctggg attacaggtg tgagccactg cgcctggcct gttgttgttt 11700
aaataaaaga aatttattct cttacagtcg aggccagaac ttagaactgg ttttcaatct 11760
aaattttttt tcttctttgg gagaagggca tcagaatatt gtggatatac ttttttgact 11820
taaaaaaaaa ggttttactg ggctgggcat ggtggctcac ctgggattaa ctgcctgtaa 11880
ccttggcact ttgggaggct gaggcaggtg gatcgcttga gtccaggagt tcaagagcag 11940
cttgggtgac atggtgaaac tccgtctcta ccaaaaaaaa aaaattagcc aggcatggtg 12000
atggcgtgcc cttgaagtcc cagctacttg ggaggcttag ctgggaggat cgcttgagac 12060
caagaggcag aggttgcagt gagctaagtt catgccactg cactccagcc tgggtgacag 12120
agcgagacct cgtctgaaaa attttttttt ttttttacta atatgacaaa catcttttca 12180
tttcaaatat atttctatac catttttaat atctcattgc ctttagaatg accttgtatt 12240
catagtacat atgtatgtga tattccattt atttattttt tttcttttgt ctttttttgg 12300
ttatattcca ttgatttaat gtaccttaat ttatcttacc aatttcttgt tgaccatttt 12360
gtttccagtc ttttgttttt ttaccagaca tggattaagc tgagcctttg ccccagacga 12420
cattatttct tttttatcag caaaatatgc gtgtaatgaa attagaatta aaaggcaaaa 12480
aaggttatcc tttatttttc tacttatttt tattgagata gtaattcaca taccataaat 12540
ttaacccttt taaagtgtac agttcagtgg ttttcatata ttagaaggtt gtacaaccat 12600
cgcaactaat tccagaacat tttcatcacc ccagaaagaa actctgaacc cattatcact 12660
ccccactccc tcacacaccc taaccctggc agtcacatat agactctctg tctctgtgga 12720
tttgtttact ctggaccttt catataagtg gaatcataac agtttgtggc cttttgtgct 12780
tggcttctca aacttatctg tttccaaagg ttatctgtgt cgtagcatgt gtcagtactt 12840
cattcctttt tatggctgaa tattttattg catgtatatg ccacattttg tttatccatt 12900
cacctgtaga aggacattta ggttgtttcc attttttggc tgttatgaat attactgctg 12960
tagacgttca tgtacaagtt tttatgtgaa cgtgttttca tttttcttgg gtatatactt 13020
aagtgaggaa ttcctgggtc ttaagttaac tctctgttta acattttgag gaactgccaa 13080
attatttttt aaagtggctg tgacatttta tattctacca gcagtgaatg aaatttccaa 13140
tttctccaca tacttgacag cacttttttt tttttttttt tttgaggtga agtcttgctt 13200
tattgcccag gctggagtgc agtagcatga tcttggctca ctgcaacctc cacctcccag 13260
gttcaagcaa ttcttgtatc tctcagcctc ccgagtagct gggattacag gcgcatgtca 13320
ccatgcctgg ctaatttttg tattttttat agagacaggg ttttgccatg ttggtcaggc 13380
tggtcttgaa ctcctgattt caagtgatcc acctgcctta gcctcccaga gttctgggat 13440
tacaggcgtg agccactgca cccagtctgc actttcttta ttatctgtct tctttattat 13500
agccaatcta gtgggtatga agtaagtgtg tcatttgtga ttttgattgt tagtggtgac 13560
taaaaatgtt gaatatcttt acatgagctt gttggccatg tgcacatctt tgttggagaa 13620
atatctattc aaatcttttg actattttaa aattgggtta tttatctttt tattgttgag 13680
ctataggagt tctttatttt attttactga gacagggtct tgctctgtca cctaggctgg 13740
agtgtagtga tgccatcttg actcactgca acctctgccc ccaccccagg ctcaagtgat 13800
cctcccacct cagtcagcat cccacagctg ggaccacagg cgcatgccac catgcctggc 13860
taattttttt tttttttttt tttttgtatt ttagtataga cagagtctca ccttattgcc 13920
caggctggtc tcaaactcct gagctgaagc aatccgccca tctcagcttc ccaaagtgct 13980
ggaattagag gcatgagcca ctgtgcctgg cctattttat tttaaagatg aggcctcact 14040
ttgtcaccca ggttggagtg cagtggcgtg atcatagttc actgccattt tgccctcctg 14100
ggctcaaaca gtactcacga ctcatcttcc tgagtagcta ggactgcagg catgtcgcta 14160
gcatgcccag ctaaaacagt tctttatatt ctagatcggg gtgtccaatc ttttgacttc 14220
cctgggccac attagaagaa gaagaattgt cttgggccac acataaaata cactaacagt 14280
aatgacagct gatgagctaa aaaaagaatt accaaaacat ctcataatgt tttaagaaag 14340
tttacaagtt tatgttgggc cacattcaaa gccatcgtgg gcctctggcc gtgggttgga 14400
tgagcttgtt ctaaatgcta gacccttatc agatggatgg tttgtagata tttatcgcat 14460
gctgtgggtt tttttttttt actttctttt aggttttttt ttttcttaaa taattaaact 14520
gattaaaagc tttaatcttt tcattttctt gataatgtct tttaaagcac aaagttttgt 14580
ttcaatgatg tctaatttgt ctattttttt ttctttggtt gcttgtcata cgtaagaaac 14640
tgttgctaaa tccagaatgc tgaagattta cttgtgaact ttgtttcctt ctatgagttt 14700
tatagtttta gctcttgtat ttaggtcttt gatacatttt gaggtttttt tgttgttgtt 14760
gagacagtct tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtgg tgtgatcttg gcttactgca 14820
ccctctgcct cctcggttca agcaattctc atgcttcagc acccgagtag ctcggattac 14880
aggcgtgcac caccaagcct ggctaatttt tgtattttta gtaaagaggg ggcttcacca 14940
tgtttgtcag gttggtcttg aactcctggg ctcaagcaat cctctcatct cggcctcccc 15000
aagtgctggg attacaggca tgagccacca cgcccagcct gttttgagtt catttttaaa 15060
atatggtgtg aggtagaggt cccatttcat tcctttgcct gtgggtatcc agttgtccca 15120
gaaccatttg ttgaaatgac tcttgtttcc tcattgagca atgtcgtgag accctatctc 15180
cataaaaaat aattaaaaaa aaaaaagaat gcagaaggaa acagttttgc caattttgta 15240
gtatttactg acaatttgca tatgtcttta cattctttag ctatttattt ttcttttgaa 15300
ttactgcctt tgttcatttt tcttttggag ttgtttgtct ttttcttatt aatttgtaag 15360
agattttgca aatatataca atttcttttc tctttttttt gagatggagt tttgctcttc 15420
ttgcccaggc tggagtgcag tggcatgatc ttggcttact gcagcctctg cctcctggtt 15480
tcaagagatt cttctgcctc agcttcctga gtagctggga ttacaggtgc ccaccaccac 15540
acccagctaa tttttttttt ttttttttgt atttttagta gagactcggt ttcatcatgt 15600
tggccagact ggtctcaaac tcctcacctc agttgatcca cccaccttgg cctcccaaag 15660
tgctgggatt acagttgtga gccaccgtgc ctggacctcc cacattattt tgaaacaaat 15720
tccatatcac ataatttctt ttttttgaga cagagtctcg ctctgtcacc caggctggaa 15780
tgctgtggcg tgacctgtgc ttactgtacc ttctgcctcc taggttcaag cgattctcct 15840
gcctcagtct cctgagtagc tgggattaca ggcacgcacc accacacctg gctagttttt 15900
gtatttttag tagagatggg gtttcaacat gttggccagg ctggtcttga actcctggcc 15960
tcaggtggtc cgtccacttc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggctt gagccactgc 16020
acccagccaa tatcatataa tttcatataa atagttcttt gtgtatcttt agataaggac 16080
ttaaaagaag gcataatcgt aacaccatta ttaataccta aaagaagtga gcaataaata 16140
attcatttgc cgtatcaaat atccaatgtt catatttcct ccattgtccc ataataattt 16200
ttaaaagttt gctcaaatca aaatccaaac aagattattt caaagcattg tttgaggtac 16260
attttaaatc ttaatttata gatttctctg ctgtctcttt tcccccatat ttatttgttg 16320
aagaaaccaa gcgttgtttc ctgtggactt tcctactctc tggattttgc tggttatatt 16380
cctctggtat cagtttacta tgatcccttt ttcccctgta ttttctgtaa atttgtaact 16440
agatctagag atttgtttag attttgtggg tttttttttt tttttttttt ttttttgcaa 16500
aaatgcatca taaatggtgg tgtgtacatc tctcagaaga cacatatctt aatgtctttt 16560
tgtggtatta gttattaatg attactgcct atatttatta attcattatt tggattgtaa 16620
gtttatgata gtctcttgat gctttttctg ttgttagctg gaatgcttct aaaaggagaa 16680
ggctttcctc ttcaagctac ttggttgtct tgagggtttg cttcttatag ggaaagcagg 16740
ctaagggtga aaaaggaaat agtttctaac tgggtctgtt aatgagctgt caccccaggc 16800
aaagagaagc aaggcaggtc acaggaaagt gaagtgggct tgggatgatt ggtgccccat 16860
gcgtgcatgc atgaagggaa gttaatcctc cctgtagtga actctactgg gcttttggtc 16920
agtagccaag actgtcaagg aagacctttg tcagaagcca tacctggcct ttgcttttag 16980
ctgttggtag ctgaaggaaa ccagaacaga cctatgacct gtgaacttct gctcagtaga 17040
caaagttctc tcagcctaaa ttcagtaagc aggagtaaga tgcttgcttt cccttgaagt 17100
gaaacgtgaa ttatatgttt cttcaacttg tgctaatatt cttttttttt ttgagatgga 17160
gtctcacact gtctcccagg ctggagtgca gtggtgcaat ctccgctcac tgcaacctca 17220
gcctcccgag tagctgggat tacaggcgcc tgccaccacg cctggctaat tttttgtatt 17280
tttagcagag atggggtttc actatgttgg ccaggctgga cttgaactcc tgacctcacg 17340
atctgcctgc ctcggtctcc caaagtgctg ggattacagg cgtgagccac cacacctggg 17400
caacttgtgc taatattctt aaccttcatg tgaatcattc ctgccctcag gctagcataa 17460
cccatacagc cttccttata ggaagatttc ctactgggag tgaatttgtc cagtgattcc 17520
cccaagatat cccccaatca aatattttaa aagtcatcat ttacatgtaa aaactatgta 17580
acaagcatgg tagcagcagc gttaaagaaa tggcagtatg gcccctgtaa gggaaggctc 17640
cagaagatga gccgcactca gcctctaggt cacagctacc ttaggagttt gcagttgttc 17700
ctggggaagt cagtagacaa agctatctct caggcctggg caagataggg attttttttt 17760
tttctttgag atggagtctc accctgtcat ccaggctgga gtgcagcagc atgatctcgg 17820
ttcaccacaa cctccacctc ctgggttcaa gtgattttac tgcctcagcc tcctgagtag 17880
ctgggactac aggtgcgggc catcatgcct ggctcatttt tgtattttta gtagagatgg 17940
ggtttcacca tgttggctag gctagtctca aactcctgac ctcaggtgat ccacctgcct 18000
cccagagtgc tgggattata ggcatgagcc actgtgccca gtgttttttt ttttttaatt 18060
gtagtgacag gatctcactt tgtttcctgg gctattccca aactccaggc ctcaagccgt 18120
cctcctacct tagcctccca gagtgctggg gttacaggtt tgacccactg tgcctagtct 18180
cagaattcat gtttttaaaa gtcactctgt gccaggctca tgcctgtaat cctaatactt 18240
tgggaggctg aggcaggagg gttgcttgag cccaggagtt tgagaccagc ctggaaacca 18300
tagcaaaatc ctaactctac aaaaaataca aaaaatagcc aggtgtggtg gcatgcacct 18360
gtagtcccgg ttacttggga ggctgaagtg caaggatcgc ttgagcctag gaagttgagg 18420
ctgcagtgag ctgtgatcat gccactgcac aacagcctgg gcaacagagt gagaagtaac 18480
tctggctgtg gtggggaaag tggattagtg gagaatggaa gctgggaaac atggtggttc 18540
ttgctaagtc agtatcaagg gatcacagat gagggggcta tttcgtccta ataagggcct 18600
tggtctccca gatagtcatg gatttttcta tttagaagct ccttctcagt ttttcttgcc 18660
caaggcatat acggttgata tttgtacaac acaggctgga tctgtatggg tccacttata 18720
tgtggatttt ttttcaacca aacttggatt aaaaatatag ttgtaggcca ggcacagtga 18780
cttatgcctg taagcctagc actttgggag cccaaggcag gcggatcagc tgaggtcagg 18840
agtttgagac cagcctggcc aatgtggtga aaccatgtgc ctactaaaaa tacaaaaaat 18900
agctgggtgt ggtggtgtgc acttgtaatc ccagctactc aggaggctga agccagagaa 18960
ttgcttgaac ccgggaggtg gaggttgcag tgagctaacg cagcagaggt tgcagtgagc 19020
taacgcagca gaggttgcag tgagccaacg gggtggaggt tgcagtgagc caagattgca 19080
ccaccacact ctagcctgtg tgacagagca agactctgtc tcaaaaataa ataaataaaa 19140
atacagtgta ggccaggtat agtggctcat gcctataatc ccagaacttt gagaggccaa 19200
ggcaggcaga tcagttgaag ccaggagttt gagaccaacc tggctaacat ggtagaaccc 19260
cacctctact aaacagaagt acagaaatta accaggcata ggtggtgcat gcctgtaatc 19320
ccagctgctt gctaaactga ggcaggagaa ttgggaggca gaggttgcag tgagctacga 19380
ttgtgccact ggactccaga ctgggtgaca gagcgagact ctgtctccaa gagaaaaaaa 19440
aaaattgtac ttacaggaca tgaaacccac ctgtacggtg tgctgactgg gagactggag 19500
tatgcatagt tcttggtaaa caaggggatt cctgaaacca atcccctgag tatatggagg 19560
gttgactata tattttaata gaatttatta cttttttttt tttttttagc agttttaggt 19620
ttatggaaaa attgagcagg agtacatagt ttctctatct ccctcacatt tccccattac 19680
tagcatcttg aaatagtgtg gtacatttgt tacaactgaa gagccaaata ttgatacatt 19740
actgttaact aaggtccgta atttacttta gagttcactc ttggtgttgc agtttctatg 19800
agtgttggca aatatatcat gacatgtatc tagcattata gtatcatatt gagtagtttc 19860
actgccctaa aaatcccctt tgttccacct tttcatccct ccatctacct gaacccctga 19920
taaccactga tccttttaca gtctctatag ttttaccttt tacagaatgt catatagttg 19980
gaatcataca gattggcttc tttccatgtt ccttcctggc ttgatagctc ttttcttttt 20040
tttgagatgg agtctcgctc tcgcccaggc tggagtgcag tggcgcaatc ttggctcact 20100
gcaaactctc cgcctcctgg gttcaagcaa ttctcctgtc tcagcctccc aagtagcttg 20160
gactacaggc gcatacctcc cctgcctggc taatgtttgt atttttggta aaggtggggt 20220
tttaccatat tggtcaggct ggtctcaaac acctgtcctc aggtgatcca cccacctcgg 20280
cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtga gccaccctgc cctgccagct cttttttttg 20340
tactgctgaa taatactcca ttgtataggt gtatgagttt atctattcac cttctgaagg 20400
acattttggt tgctcctaag ttttggcaat tatgcatgaa gttactataa acatctgtgt 20460
gtaggttttt gtgtggtcat gtttttagct catttggata aataccaagg agcacgattg 20520
ttggatcgta tggtaagagt atgtttagtt ttgtaagaaa ctgccaaact gtctttcagg 20580
gtgactgtac cattttgcat tcccaccagc aatgaatcaa gttcctgtcg ctccacatcc 20640
tcgttagcat ttggtgttgt cagtgttttg gcttttcacc attctaatag atatgtagtg 20700
atatcttgtc ttactttgca gttctctaat gacgtatgat gttgagcatc ttttcatctg 20760
cttatttgtt gttgttgttg ttgtgttgtt cattgaaatg gaatctcgct ctattgccca 20820
ggctggagtg caatggtaca atcttggctc actgcaacct ctgcctcctg ggttcaagtg 20880
attctcctgc ctcagctccc caggtagctg ggattacagg cgcccgccac catgcccggc 20940
tagtttttgt atttttagta gagacaggat ttcaccatgt tggccaggct ggtcttgaac 21000
tcctgacctt aggtgatctg cccgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtga 21060
gccactgcgc ctggctttca tctgcttatt tgatatgtgt atatgttatt tggcaaagta 21120
tctgttctga tcttttgccc attttttaat cagattgttc ttttattgct tctggggttc 21180
tttttgtttg ctttttttga gacagagtct tgctctgtcg cccagtctgg aatgcagtgg 21240
catgatctca gctcactgcg acctctgctt cctgggttca agtgattctt gtgccttagc 21300
ctcccaaata gctgggatta caagcatgtg ccactgcacc tggctaattt ttgtatttat 21360
agtagggaca gggttttgcc atgttggcca ggctggtctt ggactcctgg tcttcagtga 21420
tccacccacc tttgcctccc aaagtaatga gattacaggc gtgagccacc atgcccggct 21480
tattgttaag ttttaagagt tctttgtata tgtgtatttt ttgattcttt taaaattaat 21540
acttaataaa ataattgtac atatttatgg gatgcatgtg atattttgat acatgcatac 21600
aatgtggatc aaatcaaggt aattagagta ttacctcaaa catttgtcat ttctttatgt 21660
tgggaacatt tcaaaatgtc tagctatttt gaaatataca ataaattatt atctataagt 21720
cacctcattg tgctgtcaaa cattagaact tattctttct acctggcttt atttttttta 21780
ccccttaacc aaccattctt catcagctcc ccgtctcccc tactcttttt tttttttttt 21840
ttttttgata cggagtcgct ctgttaccca ggctagagta cagtggcaca atctcgactc 21900
actgcagctt ccgcctccca ggtttaagca attctctgcc tcagcctccc gagtagctgg 21960
gattacaggc gaatgctacc acacccgact aatttttata tttttagtag agatggggtt 22020
tcaccatctt agccagactg gtcttgaact cttgacctcc tgatccaccc gcctcagcct 22080
cccaaagtgc cgggattaca ggggtgagcc accatgcctg gcccctctta ctcttttctt 22140
agcctctggt atctatcatt ctactctcta cttctatgag atcaactttt ttttagctcc 22200
cacatatgag taagaacatg taatatttct ctttctgggt ctggcttctt tgtatatttt 22260
ggataataag tcttttatta gatacgtgtt ttgcaaatat tttttccgag tccgtgactt 22320
atcttttcat tctcttaaat agtgtctttt gcagagcaca cattatacat tttagtgcag 22380
tccagtttac caattctttc tttgatggat tttgcttttg gtattgtgtc tagaaagtct 22440
tcgccaaacc acagtcatct agagttcccc ttatattatc ttacaggagt tttatagttt 22500
ttgttttaca tttaggtctg tgatctattt taagttaatt tttatgtgaa agatataaga 22560
tctatgtctg gattctctct ttttttgaga tggagtctcg ctttgtcgcc aggctgaagt 22620
gcagtggcgc gatctcggct cactgcaacc tctgactccc tggttcaagg gattctcctg 22680
cctcagcctc ccgagtagca catgacacca cgcccagcta atttttgtat tttgagtaga 22740
gacggggttg caccatgttg gccaggatgg tcttgatctc ttgacctcgt gatccgcccg 22800
cctcagcctc ccaaagtgct gagattacag gcatgagcca ccacgtccgg ccagtttttt 22860
tgttttattt atttatttat ttgaaacagg gtcttgttct gttgcccagg ctgcagtata 22920
gtgacaccat caaggcttcg ttgcagcctt gacctcctag ggtcaagtta tcttcttgct 22980
tcagcctcct gagtagctgg gactacaggt gagcaccact ctgaccaggt actttttaaa 23040
tttattttag agacagggtt ttaccatgtt gcccaggctg gtcttgaact cctgggctga 23100
aatgcccctc ctaccttggc ctcccaaagt gttgggatta cagacatgag gcactcagcc 23160
cagccaatat aattcttttt tttttttttg agacagtctt actctgttgc ccaggctgga 23220
gtgcagtggc atgatcacag ctcactgcaa cctctgcctc ctggactcaa gctgtcctcc 23280
cacctcagcc tcccaagcag ctgggattat gggtgcccat gaccacaccc agctaagttt 23340
ttaaattttt ttagagattg aatctttctt tttctcagcc tggtctcaaa ctcctgagct 23400
catatgatct gcccgcctcc gtctcccaaa gtgctgcgat tacaggcatg aaccactacg 23460
cccagcctac aatttatttg taatccaagt tttattgaaa aaaaaatcca catataagtg 23520
gacatatgta gatccaacct gtgttgttcc agtgtcaacc atatatacca ataattcttt 23580
tttttttttt tttttttttt tttttttgag atggagtctt gctctgtcgc ccaggctgga 23640
gtgcagcggt gcaatctcat ctcactgcaa cctctgcctc ccgggttcaa gtaattctcc 23700
tgcctcagcc tcctgagcag ctgggactac aggcatgcac caccacgccc agataatttt 23760
tgtattttta gtagagatgg ggtttcacca tattggccag gctggtctca aactcctgac 23820
ctcaagtgat ccacccgcct tggcctccca aagtgttggg attacaggag tgagccactg 23880
tgcctggcct ataattcttt acgtatattg ttagattcag tttgctagta ttttatttag 23940
catttgtgta tctgtgttca tgagaggtat tgttctgtag ttttctttgg tttcttttct 24000
gtctggttta gggtaatgct ggcctcatag aataggttag gaaatatttc ctctgcttct 24060
gtttctgaaa gagaattgag gtaatatcta tttttttttt tttgagatgg aatcttgctc 24120
tgtcgcctag gctggagtgt agtggcgcaa tcttggttca ctgcaacctc tgcctcccag 24180
gttcaagtga ttctcctgcc tcagtctcct gagtagctag aattacaggc atgcaccacc 24240
atgcctggct aatttttgta tttttagtag agatggggtt tcactatgtg ggccaggctg 24300
gtcttgaact tctgatctca ggtgatccac ctgtcttgtc ctcccaatgt gctgggatta 24360
caggcgtgag tcactgtgcc tggcccgaga taatatctaa tttaacagtt tggtagaatt 24420
caccagtgaa cccatctggg cctggtgcct tttgctttag aaggttattg attattgatt 24480
caatttcctt aatagataaa ggtgcattga gattgtcttt tcttcttggg taagttttaa 24540
tacattgtgt ctttcaagaa attgttccat ttcatctagg ttatcaaatt tgtgggatta 24600
gagtccttca taatatttct ttgttttgct tttggtgtcc ataggttcag aagtgatggc 24660
cctttttcat tttttctatt agtaatttgt gtctttgccc ttttttttct ttgttaatct 24720
ggctagaagc ttatcaattt tgttgatctt ttcaaagaac cagtttttgg tttcactgat 24780
ttttctctat taattttgtt ttcaatttaa ttgatttctg ctctaattgg ttttcttctg 24840
ctcactttgg atttaatttt ttttagtttt tctagaaaac taagttttta agtgaaaact 24900
gagattattg atttttagat cttttttcta atgtttacag ttaacactgt acaatttcct 24960
gtaagcactg ctttctctat atcttacaaa ttttgatgtc atattttcat tttcatttag 25020
ttagaaatat ctcttgagac ttctttgacc catctgttat ttagaagtgt attgtttaat 25080
ctccaagtat gtattttggg atttttctgg ctatctttct gctgttgatt tctagtttaa 25140
ttacatgtgg tctgagagca taccttgtat gctttctatt cttttcaatt tgttaaggtg 25200
ctctttgtgg ctcaaggtgg tctacttttt tttttttttt ttttttaaag aaaagctggc 25260
caggtgcagt ggcttatgcc tgtactccag cactttggga ggcgtaagtg ggaggatcac 25320
ttgaggtcag gagtttgaga ccagcctggg caacatatag agacttcact tgcacaacaa 25380
atttttaaaa tattagttgg gtatggtggc atatacctgt atatggctga agtgggagga 25440
ttgcttgagc cctggaggtt gaggctacat gagccatgat cgcaccactg tactccagcc 25500
tgggcaacag agtgaaattt tgttctctct tgaaaagaaa aaaaaagttg atgacataaa 25560
gttcattcat cttttttgta tgtgacttca aaataactac tgatggttaa aaaaaaaatc 25620
agaatgatgc aacccaagtg tccatcaatg gatgaataga taatatgtgg tgtatgaata 25680
caatgggcta ctattattca gcctttaaaa ataagaaaat gctgacactg ctgtaacatg 25740
gatgaacgtt cagatcatta tgctaaatga gaaaagccag acacaaaagg acaaatattg 25800
catgattgca cttatatgag gtatctggaa tataagagtc atagaaacag taattcagta 25860
attagaataa tgcttgccag ggcctgtggg gaggagggaa tgaggaattc atgtttaatg 25920
ggtacagagt ttcatttgga aaagattaaa aagttatgga ggtggatggt ggtgaggatt 25980
gcacaacagt gtgaatgtac ttaataccac tgaactgtac acctaaaaat gattaaaatg 26040
gtacatttta tgttacatat gttttacaac aatttttaca gatggaaaaa aattataaaa 26100
aacatcagga tggtgttgac agtgaaaagg ttaaagagtt actttaaaaa tttactttat 26160
tccagccggg tgcggtggct cacacctgta atcccagcac tttgggagac cgaggcgggt 26220
ggatcacctg aggtcaggag tttgagacca gcctgaccaa catggagaaa ccccgtctct 26280
actaaaaata caaaattagc caggtgtggt ggcgcatgcc tgtaatccca gctacttggg 26340
aggctgaggc aggagaatcg cttgaacccg ggtggtggag gttgcagtga gccgagatct 26400
tgccattgca ctccagcctg ggcaacaaag cgcaactccg tctcaaaaga aaattttttt 26460
tttttacttt atcccaaatg tttatattta ctttggggct tatgtgacca gtttaatttt 26520
catttgtaat tgacttgata gaacacacta atgttcagtt aagatttctt atggtgtggt 26580
gaggagtagg atttttatgt aaataagccc aaaattgtat atatgaggtt aatctgatat 26640
ttgcagaaga tattcatgca ttactgtaag gaccactctg cttattcatt tgaccgattt 26700
gttacaacat ggttagaaat catcaaggtg tttgagatca aaggatcttc agaggtgatt 26760
tactccaatc cttttttaaa aaattaataa cttgagcctc agagaagtta agtgacatta 26820
ccaagttctg ctgttagtat agtgacttta tctttacctg aatccagggt ttcttagccc 26880
tagtctgtaa tgtgtcctag tgtgcctcta gaatctggtc ctgtcagccc aagtctgtta 26940
aatcaaataa aaccagggct tggtgcttca ccttgtcttc tgccataccg ttgggtttcc 27000
tgtggaccat gcagataatg atgatgggct cagtgggctt gatagtgata actcctaaag 27060
cagctccttc taagtgcggt tctcaatctg aggaagttaa aaaaaaaatt agtgactaga 27120
acccacttct caggtactct gataaaatac atttgtaggg gagtgatagt tttcactttc 27180
tttttttctt tttctttttt ttttgagatg gcgtctcgct cttttgccca ggctggagtg 27240
caatggtgcg atctcagctt actgcaacct ctgcctccca gtttcaagtg attcttctgc 27300
cttagcttcc tgagtagctg agattacagg tgtgtgccac catgcctggc taatttttgt 27360
atttttatta gagacgggat ttcaccatgg ttggtcaggt tggtctcgaa ctcctaacct 27420
tgtgatctgc ctgcctcagc ctcccagagt gctgggatta caggcatgag ccactgtgcc 27480
cagccttcac atattttttg aaataatagg ccagttgcgg tggttcatgc ctgtaatctc 27540
acactttggg aggccgaggt gggcagatca cttgaggcca ggagttcaag gccaccctgg 27600
ccaacatggc gaaaccctgt ttctactaaa aatacaaaaa aattagccgg gtatgatggc 27660
atgtgcctgt ggtcccagct actctggaag ttgaggcatg agaatcgctt taacttagga 27720
ggtggaggtt gcagtgaggc aagatcgtgc ccctgcactc cagcctgggt gacagagcga 27780
gactccatct caaaaaaaaa aaaaaaaatc gtatgcagta aaggttgaaa actgctgccc 27840
aaaggcgcta ttaaactata ggttcccaaa cctggccaat tgtcaaaatc cctcaagaag 27900
gggcagtggg gtctaaggga ccccattgct gtagaggaga ttagtagtcc aagagtgaga 27960
tgaactgttg gaagtcctca aacttccaaa ctattaaaat agaatagttt tgcttcctta 28020
aaatagaata gttttcttcc tcactgattt ttctgtattg attagaacca taacaagtga 28080
attaaacaac tacaaaatag ttatgtgggc cacagacatt attgtaatga agtgaagttt 28140
ggctcaggcc ttgtaacaca attgcttttt ggattaaaag taaaaatatt aaattgtgaa 28200
attatgtgta agttttaaaa aattggtctt gtacaaaagt gttgggtttt tctttgtttt 28260
taactggatt tgtttttaag caagacagaa tatttatatt gttggagagt cacaaaggag 28320
gtgtgtttgt ggatttaaat gtggagacag tgtgccttga aatgcccttt atcagtctga 28380
ttcaagccac ctgcaatcat ggatttgaac tttttttttt ttttcccctg agatagggtt 28440
gcctaggctg gggtgcagtg gtgtgatctt ggctcactgc aacctctggc tcagcctctt 28500
ggagtacctg ggactatagg cacacaacat catatccagc tattgtattt tttttttttt 28560
ttttttttat agagacagag tttcaccatg ttgtccaggc tggtcttgaa ctcctgagct 28620
caagcaactc acctgcctcg gccttccaga gtgctgagat tataggtgtg agccaccatg 28680
cccagccttc actttattta aaaaccatag tttttaaaag ccacattcct actgatgaac 28740
acagaggttg tttccagtgt tttcatttgc agggctgtag tgattgtttt tgcacatgcc 28800
tctttatgta catgtgctgt gtcttctggg acagagagtg gacattttaa gtgttttatt 28860
ggtcctgcta aattgtcttt cagccaaact gctgcagagg tgatggagat gaggtgggta 28920
ctcaggagaa ttatgctcag tgcttgtgtg ctagtcactg acctggaaac attttattaa 28980
aaatgctaga ttaggttagt gatgtaaata ccaggtgata gtaaccagaa taattgtgtc 29040
aaaacatcaa gaatcatcaa gagatgccag gcatggtggc tcatgcctgt aatctcagcc 29100
ctttagtagg aggccgaggt gggcagattg cttgagctca ggagttcaag accagcctag 29160
gcaacatggt gaaaccctgt ctctaccaaa aatacaaaaa tttgctggat gcagtggtac 29220
gtgcatgtgg tcccagctac tcagtaggct gaggcgggag gatcgcttga gcctgggagg 29280
cagaggttgc agtgagccaa gactacacta cagcccgggc aacagagtga aaccctgcca 29340
taaaaaaagg agaaaaagaa tcatcaagag aaaacttaat ttgatgtgct ctgcgttttc 29400
tttggtgctt catgtcagtg ttagaaacta taggttgtat atttattaat ttttctccta 29460
catttgttca acttgactaa aatattaact ccaaatgcct agaatttcaa aatacctctt 29520
cgttataaag tatcaactat ttcttagtcc ccttaagctg atagtattgt gtcattgtaa 29580
aagatccctt gtgaaaaata atttttgtca acatgaaagg tcttaatgtg tctcctagtt 29640
tacattttac atggtctttt ccatgtattt atatagttga catatatagc tttttttgta 29700
aatacacttt cctatgtgaa catgccaagg tttacttaag cattctctta ttcttggaca 29760
tctaaattgc ttcttatttt ctattgtaaa taaagtgcta gaagcttctt tcctgaaaag 29820
ttatttactt ttcacctagt atttccatct gtgttcctca aaataagatt gctgagattc 29880
atgtatgttg ccagaaagat tgtgaggttt aacagtgaat gaggaaaact tttaacactc 29940
aaggtctacc aagtacagca agttttattt tacctttttt tttttttttt tttttttttt 30000
tttttgagtt aggccaagtt gcctaggctg ggctcaagca atccttctgc ctcagcctcc 30060
ggagtagctg ggattatagg tgtgcagcac cacacccggc tttcttgtat ttttttttta 30120
tttttattta tttatttatt tttgagatgg agtttcactc ttgtcaccca ggctggagtg 30180
caatggccca atctcgactc accgcaacct ctgcctccca ggttcaagcg attcttctgc 30240
ctcagcctcc caagtagctg ggattacagg catgtgccac cacacccggc taatttttct 30300
atttttagta gagacggggt tcctccatgt tggtcaggct ggtctcaaac tcccgacctc 30360
aggtgatcca cccacctgag cctcccaaag tgctgggatt acaggtgtga gccaccgtgc 30420
ctggctgctt tcttgtattt tatcttgctg tagcggttgt gggatttttg cctggtgtgt 30480
tcattggagt gtgtgtgtgt gttttgagat gtatgactgt gttggttgtg ttgtcatact 30540
ttgaaggttc attaatgtgc tggtctttct atttttcttg ttatacttag tcacttaaaa 30600
accctttttt tttttttttt ggaattctta tttttacagt actttgaatt cctgttttat 30660
taatcacctt cttatctgaa agtgaagtaa tagtgtactt ggcaccattg aattagaaaa 30720
ttgtgtgtcc ttggccagaa gatcacatac acaggaactc gataagttga gagatttagc 30780
cgtttcagaa atgggcattt gtgtcttcca gtggagaagc atctgcaaaa gaattgggca 30840
gatttggcca ggcgcggtag ctcatgcctg taatcccagc actttgggag gccgaggtgg 30900
gcagatcacc tgaggtcagg agtttgagac cagcctggcc aacatggtga aaccccgtct 30960
ctactaaaaa tacaaaatta gccaggcgtg gtggctaacc catttaaagt gggtgaatta 31020
tatcttttat gttttaatgt attcctagag ttgtgcaacc atcaccagaa taagttgtag 31080
aacattttca tcaacccaaa aagaaacttt gtattcatta gtcgttcctc ctcatttctc 31140
ccctaacctc ccagcactag gcaaccatca gaatactttt tgtctccacg gatttgactg 31200
ttttggacat ttcatattaa tggaatgcac aatacagtag tataatacat taattttgga 31260
aggccaaaat taatggcttt tgatgtctgc cttttttcac ttagaataat gtcttccagg 31320
tccatctgtg ttatagcatg tatcattact ttatccttta tgtggctggg taatattcca 31380
ttgtatggtt ataccatgtt ttgtttatct attcatcagt tgatggacat ttaggttgtt 31440
ttccattgac tattaagagt aatgctgccg gccgggcgcg gtggctcacg cctgtaatcc 31500
cagcactttg ggaggctgag gcgggtggat acgagggtca ggagatcgag accatcctgg 31560
ctaacacggt gaaaccccgt ctctactaaa aaacaaaaaa ttagccgggc gtggtggcgg 31620
gcgcctatag tcccagctac gcaggaggct gaggcaggag aatggcgtaa acccgggagg 31680
cggagctggc agtgagccga gatggcgcca ctgcactcca gcctgggcga cagagcgaga 31740
ctccatctca aaaagaaaaa aaaaagagaa taatgctgcc atcatgcttg agggtttttt 31800
tttattttgt tttgttttgt ttgtgggggg agcggagggc acagtctcac tctgttacgc 31860
aggctggagt gtagtaggct tactgcagcc tcctccgccc cctggttcta gtgattcttg 31920
tgcctcaggc tcctgagtat catgctgcaa tttttgtgtg agcatacatt tttcatttct 31980
cttgggtcaa tatctaggag tatccccact tttggttctg agtgttaatt gagcctgttg 32040
tgttctcaca ttccctgtac ttagatggaa atagtgcttt gcctaaaaag aaaataaaag 32100
acctgattgt gcaggcgagt gagaaagaga gagaggcgct agggttattt ccaccctgat 32160
actctttggg tagtcttggt atgactagca aagaagcaag ctccaagttg tagtttgctt 32220
ccaagtttct ggcttctgtg ggaatttctg catctaagta atgacaattt tcagttactt 32280
gcagtaagta aattatcaac caatcttact gtgtattact agcctagtag gaatttactt 32340
gtatatcgag aggaatgctg cagctttcac cttacttcta atggggatta atgcttactt 32400
aacttgcagt tttggaggca agtacaaagt acaggaccaa ttatggtcat gaagtgagag 32460
agaagtctgg ctagtgaatg gtgattggca actccagttg actgttcatg gcatcttaga 32520
tctgtgagga gggaggaggg aaggaaagtt caagctggtc tttatggtaa gttctggaac 32580
atttccctgt gtcaatgggt catctgttca ttcactgtgt aaaatggttg agggaagttt 32640
taatttacat gcttccttat tgtgtaaacc tttgattttt agtgatttca gagtttgttt 32700
ttataattac ttaacacgtg aagaggatgc agagtaacgt atcgaagctc tggttacctt 32760
ccactgggat ttgacacatt tgatttcctt tattccctcc ttccttccct tcctccctct 32820
ctcttttctt aaggaatgca actactcaga ttcacctgca cacccttggc atacctctca 32880
ctccccctta cccccacttc ctcagaggtg acctgtcctc agaggcaaat gtgtgccctt 32940
tccatccgta cttttatgct ctcatctatg tttacatcta ttagtacact attgtctgta 33000
tttttaaaca ttacataaat ggtgtaattt ttacttttaa ttctgtagtg gtgtttctca 33060
aattaagttc tgcacaaaac atttttatag atatccagtg ttagcttaac gtttttctta 33120
ttgtggtaaa atatacataa gataaaattt accattttag ccatttttaa gtttacaagt 33180
cagtggcatt aagtacattc acagtgttgt ataaccatca ccattgtcca ttgccagaac 33240
ttttcatcat cctaaacaga aactctgtac tcattaaaca atagtttatc actccttccc 33300
tgcaactaga tgctggcaat caccattcta ctttctatct ctatcaattt gcctcttcca 33360
tctaagtgga atcctacata tttgtcgctt tgtttctggc ttttttttct tcttgtgatg 33420
ctttgtttta attatgttcc tggctttcat catctagcag gctgattcca aggtttgtcc 33480
atgtggtagc ttgtatcact ttaatgtttt tagagatagt taatattaca ttgtttatat 33540
ataccacatt ttgttttttc attcaacctt gatggacatt tgaattgttt ccccctttac 33600
ctgttgtgaa taatgctgcc gtgaacattg ataaccaaat atttgtttga atctctgatt 33660
tcagttcttt tggttccata cctaggagtg gaattgctgg atcatatgat aattctatgt 33720
ttaactcttt gagggatggc cagacttttc caccatagct aaatcatttt accttcccac 33780
aagcaaagtt caagggctcc agtctctccc cataaggtcc tttgcacttt tttttttgag 33840
acggaatctc actctgttgc ccaggctgga gaacagtggc accatcttgc ctgacctcaa 33900
gtggcacctg ccttggcctc ccaaagtgct aggattgtag gcgtgggcca ctgcactctg 33960
ccaatttttt aatttttatt ttcatttatt tttctttttt taatttttaa tttttttatt 34020
ttttgaaggg ataaggtctc actttgttgc ccaggctggt cttgaactcc tggcttcaag 34080
caatcctcct acctcggctt ctcagagtgc tgagattata ggtgtaagcc cctgcacatg 34140
gcctttactc tcttgatagt gtcctttgat gcacaaaagc tttcaatttt gatgaagttt 34200
attttttatc ttgttacctg tacatttggt gtcatatatc taagagacca ttgccaaatg 34260
cagtgtcatg aagctttccc tcagtgtttt ctttctgcag ttttatgatt ttagctccta 34320
agtttaggtc tttgatccat tttgagttaa tttttgtata cagtttgaga gtcacacttg 34380
aggctctggg cgcagtggct cacgcctgta atcccactac ttggggaggc cgaggcggat 34440
ggatcacctg aggtcaggag tttgagacca gcctggccaa catgccgaaa ccctgtctct 34500
actaaaaata caaaaattag ccaggcatgg tgatgcatac ctgtggtccc agctacttgg 34560
gaggctgagg caggagaatt gcttgaacac aggaggcgga ggttgcagtg agccgagatt 34620
gtgccactgc actccagcct gggcgacaga gcgagactcc atcgtgcggg gtggggggta 34680
aaagtcaaac ttgagtcttt tgcctgtgga tatccagttt tcccatcact atttgttgaa 34740
aagactatcc tttctcaact gtgaatggtc ttggtaccct agctgaagtt atttttatta 34800
ttatgttact taggaatgca cataaggcct ggcacggtgg ctcatgcttg taattgcagc 34860
actttgagag gtcaaggtgg gaggattcct tgagccgagg agtttgagac cagcctgggc 34920
aatatagcag caagacccca tctctatatt ttaaaaaaag aagaaaaaaa aacctctgat 34980
gcataaaata tttaaacttg tatgcattct tttctttctt tattttttaa aaattgagac 35040
agcagcttac tctgttgtcc aggctggtct tgaactcctg ggctcaagca gttcctctca 35100
ccttggcctg cagtgctgag atgacaggtg tgaaccacta cacctggcct gcttacagat 35160
tataaaaaga aaataagttt acaagttaaa gacagataaa atgacaaaat cagtaaaatt 35220
aaaattactt ttatggagcc gatgatgttt attccagttg ctcctctcat tgtgaatatg 35280
gtattgttgc tgtggcagat ttggaggccg tggcagattt ggaggctttg gcaatggctt 35340
ctgttacctt gccatgaggt aactcagttc cctcatcact tttctctgag aactataaaa 35400
ccttggaggg gtgccttctg cccttcgctt ggcatgtata ttatgcaggg atcaggtctt 35460
actccgttct tgattgttag tacaaattag ttaaaattgt attgtttggc cttagcctga 35520
tggtaaacac aacagcacac gtgggctgtg aaatctctgg gcagctctgt gtttctaggg 35580
aagcatctcg atgatccaga acaggcttat actaatgttt tagtgtaatt ttgaaatgaa 35640
aacacagcat ttaaaaattc ttatagagaa tgtatagacc ttgagaagtg ttagcagacc 35700
cagtttacga catgtctcaa tattatgaaa cattgcttta ttccctatcc tgcttgtaca 35760
tttaattttt tcatccagtt ttaaacaact tgggtactgt ggcctgtgcc tgtattccca 35820
gctactaggg aggctgaggc aggaggattg cttgagcaca ggactttgag ggctgtagtg 35880
agctgtgatt gtgcctgtga atagccattg tgctccagcc tgggcaacat agcaagaccc 35940
tgataccttg ggtttttaaa aaacaaaaca agatacatgc tgacatttct ggtttggcag 36000
gcagagcttg ttctgctccc caccctccct tttcccatag taaccattta taggacatct 36060
cactgttgtc tactctgtgt tgcctctgct tccctgcgtg gtagatctag gaatcttagg 36120
atttcttagt tttagctggt gatccgtatc tttttcttaa ttccattgta acttcagctt 36180
ttcttattgc ttgtaggaag gctgtttcca ttgaatacaa acaaaataaa agcttttatt 36240
cttaatctta gagataggat gtttgtattt aaaaataatt gtgctgtcaa aattctgtca 36300
agttggcttt taccacatta gtttttttta atgtggttta tatgaccctg gagtaccttg 36360
tcttctcact gttaaattct caactgagtt gtccctattt aaagtgtgag actgtgccag 36420
tttgatttta aaatattgca agtgcgttat ggcaagataa aactgcaaag aaagaacctt 36480
catgtccctt tgattataaa tgcttttggc acttgtttct actttttcct aatgtttttt 36540
gaggaaagaa cctccaactc tccagacagg tctgggggca aatgactaaa acatgaactg 36600
aggccctggg ctgtctctgt gaggatatcc cctctattct ctctgaaatg tcccagcatg 36660
tggtgcattt cttgttagtg tggactcctc tgtatataac acatcttatt tatcttctgt 36720
gcataacatg aagtagtgcc ctaatgcaat tccaggatgt aattcagcat ttctataaaa 36780
atacagtgtt tttctacatt tgcatcaaaa aataaccaga taattatatt tattaagaaa 36840
atagcatttt tggctgggtg tggtagctca cgtaatccca gcactttggg aggccgaggc 36900
aggcagatca cttgaggtca ggagtgaggc aggcagatca cttgagatca ggagttcgag 36960
accagcctgg ccaacatggt gaaaccccat ctctactaaa aatgcaaaat tagcctggcg 37020
tagtggtgca tgcctgtaat cctagctact caggagactg aggcaggaga atcacttgaa 37080
cttgggaagg ggagattgca gtgagctgag attgtgccac tgcactccag cctaggcaac 37140
agagtgagac tctgtttcaa aaaaaaaaaa aaaaaacaaa gaaaagaaaa gaaagaaaga 37200
aatgtatttt tggtatttgt tttcacaaac tagagcattt atgtgaaata acattgctag 37260
tattgatatt ataccatagt ataatactta gttcttcagc gatgtatctc tgctgatcag 37320
ctacatgata tctacttgag ctgttggatt ttttttaaga acagtgcatt tttgaatgct 37380
tttgaaaaat tgtagtaaaa tacataaaac aacatttacc ttgtaagcat tttaattggt 37440
acaattcagt gacattaagt acagtcccag tttagtgcaa ccactgttac tgtctagttt 37500
cagaacgttt ttgccccaga tggatactct gtacctgttg aacattcagt cctcatggcc 37560
caataatctt tatgtctgta tagatttgcc tattctgcat attttatata aatggaatca 37620
tgtcttttgt gtctggcttc ttttacctag catagtattt tcaaggttca tccatgttgc 37680
agcatgtttc aatactttgt tcctttttat gtccattgta tggatatgcc acatttcgtt 37740
aatgacaatt cttttgggta gctacatttt aaaacattat agtagaatac atatagcata 37800
caatttacta tcttaaccat ttaagcctgc agttcagtgg cattaaatac attcacgtta 37860
ctgtgcaatt atcaccacca tctgtttgca gaaacttttc atctcctcca tttgaaactc 37920
tgtatacatt aaacatgaac tctcccttct ccccttcctc cagccctggc agccaccgtt 37980
ctacattttt atctttctga cagagatttt actactctag gtacctcaca taagtgaaat 38040
caaccagtat ttatcctttt gtgaccagct tatttcatta gcttaatgtc ctcaaggttc 38100
atccatgttg tagcatatgt caacatgact ttccttttaa ggttgaataa tattccattg 38160
tatgtatatg tcacaatttg tttctccatt tatccatcac tggacatttg ggttgctttt 38220
acctatcggc tgtcttgaat catgttgcta tagctgtaca agtatctatt tgagtttctg 38280
ctatcaattc tttaagtata tgcccagaag tggaattgct ggatcatatg gtaattccgt 38340
gtctggtttt ttttttgagg aagtgccatg ctgttttcca cacagctgta ccattgtaca 38400
ttccccccag caatgtacga gggctctgat ttcttcacat ccttgctaac acttagtatt 38460
ttttttgata gaatagccat cctaatggct acttttaaag tatgtttaac attatttatt 38520
tatttttaat tttttttgta gagatggcat cttactgtgt tgcccaggct ggtcatgaac 38580
tcctgggctc aagcagtcct cctgcttcag cctcccaaag tgttcggatt ataggcgtga 38640
gccaccatgc ccagcccaaa tttaaatata taactaaaca catagcagct aacaccaagc 38700
ctttaaaaat atcattaata ggccaggcgc agtggctcat gcctgtaatc ccagcacttt 38760
gggaggccga ggcgggcaga tcacctgagg tcgcgagttc gagaccagcc tgaccaacat 38820
ggagaaaccc tgtctctact aaaaatacaa aattagccgg gcatggtggc acatgcctgt 38880
aatcccagct actggggagg ctgaggcagg agaatcactt gaacctggga ggcggaggtt 38940
gcggtgagtc gagatcgcac cattgccctc cagcctgggc aacaagagca aaactccatc 39000
tcaaaaaaac aaacaaacaa acaaaatata tatatcatta ataggccggg catggtgtct 39060
cacgcttgta atcccagtgc tttgagaggc cgaggtgggc agatcactgg ggtcaggagt 39120
tcgataccag cctgggcaac atggtgaaac cctgtctctg ctaaaaatac aaaaattagc 39180
cacgcatggt ggtaagcacc tgtaatccca gctactcagg aggctgaggc tggagaatgc 39240
ttggacctgg gaggtggagg ctacagtgag ctgagatcac actccagcct gggtgacaga 39300
gcaagactct gtctcaaaaa aaaaaaaaaa aatcattaat aaatgtgatc ttttttcttc 39360
ctatacaaca agttgtcaag caagtatgac cttcttaatt gaccctttga catgaactgg 39420
gatgagatcg tggaggatgt tgaggagaca gttgttacca tagtgcactt ctaaaaactt 39480
taattctata gatttcttta aaattttttt taaaattatt atgagtacac aataggtgca 39540
tctatagatt tcattaccct caaataaatg tacaaggcaa tgcagagaaa tgcacagtgt 39600
aacttggtag acttgaccta tcaagttact gttgaatata ttatggagcc tgtgtattac 39660
caggggcagc agacttttcc tgtaaagata gttgttttca gctttgttga atctgtggtc 39720
tctgtcttaa ctacaactga gaaagccatt gacaatatat agatgaatgt acatgactat 39780
tctaataaaa ctgtgtacac tgtaatttga attgcacata attttcatgt gtctcctgta 39840
taattcttct tttgacttct tttcaaccat taaaaaatgt aaaaacaggc caggcgtggt 39900
ggctcatgct tgtaatccca gcactttggg aggctgggtg gattgctgga gcccaggagc 39960
ttgagatcag cctgagcaat gtgatgaaac cctgtctcta caaaaaatta gctgggcatg 40020
gtgttatgtg cctgtggtcc cagctacttg ggaggctgag gtaggaggat tgcctgaacc 40080
cgaggaagtc aaggctacag tggtttgtgc cactgcactc tagcctaggt gacagagtga 40140
gaccctgtct cagtgaatga atgaatacat tattagcttg tggactatac aaaaatcaga 40200
ggctggaggt gagctgggta tggccattgg gtgtggtttg ctgacttctg gtagagagga 40260
attaggagat gttaaaggtg gtggaactgt cagatacttg cattctttta gaaatacttt 40320
ggagttagct ttttggttca ggcaaaggac caaagggtta ggagagtcag gccggtaaag 40380
aggagtggtg ggcccatagc agcagttcct ggagtttttt tttttttttt ttttttgtga 40440
gacggagttt tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtgg cacgatctcg gctcactgca 40500
acctctgcct cctgggctca agcaattctc ctgcctcagc ctcccgagta gctgggacta 40560
caggtgccca ccgccacgcc cggccaattt ttttctattt ttagtagaga tgggatttca 40620
ccgtgtttgc taggatggtc tcgatctcct gacctcgtga tccacctgcc tcggcctccc 40680
aaagtgttgg gattacaggt gtgagtcacc gcgcctggcc aggtcctgga gtctttaaga 40740
ggaggtttgt ctgatggttg gttggacaaa agcctgggca tgttgtcacc ttccataagt 40800
gtttgtggga atgtaggtaa tgaggaggag taaaggattc ctgaaggatg aggaggaggg 40860
ctggtggctg ccataggaag tgatcactgt tttggcagac ctgtcttaga gtaatgaccg 40920
tcatactctc tcattgccct tgtgaactca tgaaatccca tggctgctaa agctgaaggt 40980
caagtgggga cttcccggcc actgggctta gcaccccaca gagctgtgga gtgggcatta 41040
atgtcccttt tttatagatg cggagactga gaatgaggac tgttggtaac ttttgaaagg 41100
gcactcagct agaaaagtct gagccaggat ttcaagtccc atggctttac ctctgtggtc 41160
ctaatatttg gtgtgttcaa gtgagatctg tttttttcct atttcatttt gattattgat 41220
tttcataaat ttttttctct tttgagatag tatcttctct ctcttttctt ttttctgttc 41280
tttctttctc ttttctttct tttttttttt ttctctgaga cggagtcttg ctctgtcgcc 41340
caggctggag tgcaatggtg caatctcagt tcactgcaac ctctgcctct cgggttcaag 41400
cgattctccc atctcagcct cctgagttgc tgagattaca ggcacctgcc atcttgcctg 41460
gctagttttt gtatttttgt agagacgggg tttcatcacg ttggccaggc tggtcttgaa 41520
cttctgacct caggcgatcc acccgcctct gcctcccaaa gcgctgtgat tatatgcatg 41580
agccaccatg cctggccatt atttctttct ttctttcttt ttcttttttt caggttcatt 41640
gaatttgctt tgagacaggg tcttgctctg ttgcccaggc tgaagcgcag tggtgcagtc 41700
atggctcact ggagcatcaa tttcctgggc tcaagcgata cttgcacttc agcacccctc 41760
cacccccacc cgctcctttc ccccacagta gctggaacta caggcgctag ccaccgtgct 41820
tggctaattt tttttttttt tttttttttg agacggagtc tcgctctgtc acccaggctg 41880
gagtgcagtg gcgcgatctc ggctcactgc aagctctgcc tcccaggttc acatcattct 41940
cctgcctcag cctcccaagt agctgggact acaggcgccc gccaccatgc ccggctaatt 42000
ttttgtattt tttagtagag acggggtttc accgtgttag ccaggatggt ctcgatctcc 42060
tgaccttgtg atccgcctgc ctcggcctcc caaagtgctg ggattacagg catgagccac 42120
tgcacccggc ctggctaatt tttaaatttt tttttgtaga ctgcccaggc ttgtttaatt 42180
gattttctat gtgatcttag ggaaatcgat tatttcccat aaacattttt ttaattagaa 42240
gttaaattct gcctagtttg attcacagga ttattgtgga tgactgaaac agagaatagg 42300
taagagcttc tttgaaaaat atgaggtacc atacagaagt tagatgcttt gtcctggtga 42360
taccccctcc aaagcacagc taaggaaatg tggaaggcac tcttatctca tcatatagct 42420
ttgaaagcct agcattgaaa gtacgaactt gattcttttg gagaaatcct ttggctctca 42480
gtgagtttac tttctattaa tgactgtgtt aagcggaatg aaaactgaaa gaggaaaggg 42540
gaggaagtca gaattaagca ggaagagtga gcccatagca gagtccagat ttagacccca 42600
agctacttgg aatgatactg gacaattatg ggtgtgttta atgatggtcc tgagtcatga 42660
aaacaaaagg aggctttaaa ttatgtctgg cttagtgtac agcatatttt tgtcattatt 42720
caagttttag catgtaaaga ggaaagtgtg cagtacttat gcatatcatt ttcattaatg 42780
aaactaaatg aggcctcttt aaaattatca gtgttcacag tatcttccaa aagacatgta 42840
aatgtataaa ggtataaaaa atatacatat aaattttaca attttgtgag ctatatagta 42900
gatctcttat tttgtccata ggtcttaaag atcttatact gtattcagga ataaagataa 42960
cttcagtggg aggcctttac agggctaatg agtaagcatt attttgataa agttctgtgt 43020
tgtctacaat agatatagta gaaatactct tggaatggta atcatcccag gccctgcttt 43080
ggagcggaag aaatagtcaa tgtagaactt tacagtatat tgtacacaga tgtgcctgct 43140
aataacttct gtagacagca aagtttaaga gaaattaggt ggtaaatgca acatatgtat 43200
ctaaataaat ttggtctgag ggatttgata agatgaaaca gtacatagtc cagaaaattt 43260
ttatactcaa agaattatag aaaatatctg aaatgttttc agttttgtgc atatccagaa 43320
aatgtcatcc tgtgatctgc tggttggcag cccaatggca gtattagatg tattgttttt 43380
attttgtttt gtttgctatt tatttggtta agagagttac ctaattagga gtgtgaaaaa 43440
aaagatttat tatagtagtg ggcttttgtt tgacttaaaa catttttgtt gttaccacag 43500
tatgagtgcc ttgtttgtga aatttgttta ccgggaagcc atatacttag agtagctttt 43560
agtttatcat tatcatcatc atcatcatca tcatcatcat catcatcatc tccttcatca 43620
tgaaaggaag aagctaccaa tgttgcttta ttctgcaaaa aatacaatag atgcttgttg 43680
aaagtatgga gtgaaatctt aaatatgtct gttaaaaaga gtacaactgg ccaggggtag 43740
tgcctcatgc ctgtaatccc agcactttgg gaggccaagg cgggcagatc gcttgagcca 43800
ggagtttgag accagcctgg gcaacatggt gaaatcctgt ctctacaaaa aaaaaaaaaa 43860
tagacaaaaa ttagctgggt gtgatggcat gcagctgtag tcccagctac agtggggctg 43920
aggcaggggg attgcttgag cccaggaagt aaaggctgca gtgagctatg gttgtgccac 43980
tgcattccag tgtgggtaac agaacgaaac cctgtctcaa aaaaaaaaaa atagtacaac 44040
tttaagcagg atgtgggcac atgcctgtag tctcagctac ttgggaggct aagtcaggag 44100
agtcacttga gcccaggagc ttgatgctgc agtgagatgt gattgtgcca ctgccttcca 44160
gcctggggat gatagcaaga ccccatctct aaaaaaaaaa caaaaaacaa aaaaaaaaca 44220
gagtacaaca acctttggta aacttggaat ataaaggtgt ttccttaacc tgttaaagag 44280
ctgataaaga gtggtacttt caaaccagta cacattatgt gaaacactag agacacttcc 44340
catttgttaa aagaaaaacc ttagccaaat taaatttaag ttttttttgg agacagagtc 44400
ttgctttgtc acccaggctg gagtgcagtg gtgcaagcac agctcactgc aacctccgcc 44460
ttctgggttc aagtgatttt cctgcctcag cctcctgcgt agctgggact acaggtgtgc 44520
accaccacgc ctgggtgatt tttgtatttt ttgtagacat ggggttttgc catgttgccc 44580
agtctggtct tgaactcctg ggctcaagca atctgcctgc ctgggcctct gaaagtgctg 44640
ggattacagg cgtgagccac catgccattt aatggtttaa ttgagcaaag aatgatttgc 44700
aaattgggca gcctcccgag ccagagtagg ttcagagact ccagcacagc catgtcgtgg 44760
aaaaagattt atgaatggaa agaggaaagt gatgtaccga aaacggaagt gaggtacaga 44820
aacagccgga ttggttacag ctctgaattt gccttatttg aacacaagtt gaggtttgta 44880
cagttggcca cctttgattg gccaaaactc ggtgattggc acaagagcag gttatagtct 44940
gtttacatct ccattttggt tatagttcat tatggacaga aaaacctgta ggtcaaactt 45000
aaaatatgta aggagacagt tttaggctaa acttgattta acacattaaa tccgtaacaa 45060
gacaggatgc ctgccctcac catgttattt gatcttattt tagtaattct agccaatgta 45120
gtagggcaag aaaactgcct gcttggctac aaaataaaca cacaaaagtc agtatctgta 45180
atatgtgaca gaaaatataa ttaaaaaaaa aaaaaaaagc cgggcacagt ggcccatgac 45240
tgtaatccta gcactttggg aggccaacgt gggtggatct cttgagctca ggagttcaag 45300
accatcctag gcaacatggc aaaaccccgt ctctacaaaa aatacaaaaa aattagccac 45360
gtgtggtggt gagctcctat agtcccagct actttggagg ctgaggttgg aggatcattt 45420
gaacctgaga agcacaggtt atagtgagct gagatcacgc cactgcactc cagcctgggt 45480
gacaaagtga gactctgtct aaaaaaaaaa aaaaaagaag aaaaggaaag gaaagtaaaa 45540
gaaaaaataa tttcacttac tagagcatca aatccctaag ataatttaga gcaaagccag 45600
aaaagtgaag aaaatataaa aatctttaca gtgggttgca ttttaaaaaa aaacttgaag 45660
atatcagatc aactcactaa tgtattaatt aatataattt aaattaaaat cccactgatt 45720
tttttgtggg gagggtggga gagtcatttg ttaaaatgat tctaaagagc atctggaaga 45780
ataagcaggc aagaatagcc aagaacattt tgaaaactaa agatgagttt ggaagacgat 45840
tggttttgta ctgtcaacta cttatagatt ttacatgaat tttaaagggt aatctgagcc 45900
ctcgaataga cagaaatagc catagatctg aaagaacact taagacctga tccagctatc 45960
catgagagta tatataatca aagtctttgt gtgtgaatca ggagtctttc aggtgcaagg 46020
taaataaact cataattgct tacgcaaagg tggtatttgc tttagtgact ccagagaaag 46080
ctcaagtgcc tatctctccc ctgactttga ttctttttgg ggttggctcc attctctcct 46140
gttgctaatg gcttcctttg tgcagccaga ggaaaggagg tgtggttttt tgatacttcc 46200
aggcttctat ttttatagct tgagatcaaa gagggaagtg accttcctta gagtcagtgt 46260
gtaaagtcct aaggaagata ccacgtgggg tgctggggcc atgtgcccat ccctggccca 46320
tgaccatggg gatgctacac taactggggg ccacgcatgg ctgttcctgc cctgaactgc 46380
cagctggctt tgcagtgcag cctcaccaga atcacatgga atagtaggga tatgaattgt 46440
ttcccaaaga aagtgtgtgg ggtggtagaa ttactagtgg gggagtaagg ggacaggcca 46500
ttgggcatac tggagcagca tttactcagt cattgagaaa aggatggaac attcaataaa 46560
gggtgctgga cacatttgtg ctctaaaaat tttgtgtttc acctattaat ttatccctcc 46620
ccttagcccc tggcaaacac tgatctgttt actgtctcca tagttttgcc tttcccagaa 46680
tgtcacaccc ttggaatcat acagcatgta accttttcag attggcttct tttacgtagt 46740
aatatgcatt taggattcct tcatgccttt tcctggattg atagctcatt tctttttagt 46800
cctgaataat attccattct atggatatac cacaattgat ccattcacct actgaaggtc 46860
attttgattg cttccaagtt ttgataattt aaaaaatttt ttaagacagg gtgtcattgt 46920
gttttccata ctggtctcct gaacacctgg gctgatgtga acccctctcc tcagcctcct 46980
gggtaactgg gattacagct atacaccact gtgcccagtg tgacaattat gaataaggct 47040
gctgtaaact tctgtgtagg tttttttgtg tgtggacatt ggttttcagt tcattatggt 47100
aaataccaag gagtgcagtt gctggattgt atggtaaaag tatgtttagt ttgctaagga 47160
actgccagct gggtgtggtg gctcatgcct gtaatcctag cataatggga ggctgagaca 47220
ggaggatccc ttgaagccag gagttcgaga ctagcctggg caacatagtg agacctcatc 47280
tctacaaaaa atttaaaaat tagctgggcg tggtcttatg tgcctatagt cctaactgct 47340
tgggagactg aggtgggagg atcacttgag cccaggagct ggaggtggca gtaaactgtg 47400
atcataccac tgcactgctg cctgggtgac aaagcaagac cctgacttaa aaaaaaaaag 47460
agaaaagaaa aaaagatgag tcagagggta aggaagcaaa aataagtaaa taaataaata 47520
gaagagaaaa gaaaaaagaa aaaactgtct ttcaaagtgg ctgcgccatt ttgcattcct 47580
accagcaatg aatgagagtc tgttgttgca catcctcacc agcatttggt gttgtcagtg 47640
ttctggattt tgaatattct attaggtata taatgctgtc tcacttgttt taatcaatga 47700
tatatgacat tgagcatctt tttaatatgt ttacttctca tctatgtatc ttctttagtg 47760
aggcctttgt ttaggtcttc tgcccatttt aaaaaatggg ttcattttct tattgttgaa 47820
tatcatgagt tctttgtcta ttttgaatac ctgccttttg ctttattttt gtgtttttta 47880
tttttttttt ttattgagac aagttctcac tctgttgccc aggctagagt gcagtggcat 47940
gaacatggct cactgcagcc tcaacttctc ccagcctcaa gcaatcctct tgcctcagcc 48000
ttccgagtag ctgggactat aggcacacac caccatgccc tgctaattta aaagagtttt 48060
tttttgtaga ggtgggatct cgccatgtta cccaggtggt cttgaactcc tggcctcagg 48120
caatcttcca gccctcagcc tcccaaagtg ctgattatag gcctgagcca cttagcctag 48180
ctcagaattt attttttatt tgttaatttt gaaaaaatat aggacctcat aaaagtcagt 48240
ctacatttgt acacattatg tttttggtga atatgtaaat ggattctttg tgaatcaatt 48300
tggttttgtt tttttgcttt taaaaatacc agccctgggc tggatgcggt ggctcacgcc 48360
tgtaatccta gcactttggg aggctgaggc aggtggatct cctgaggtca ggagtttgag 48420
accagcctgg ccaacatggt gaaacgctgt ctctactaaa aatacaaaaa ttagctgggc 48480
gtggtggcgc atgtcagtaa tcccagctac ttaggaggct gaggcatgag aatcgattga 48540
acctgggagg cagaggttgc agtgagccga gatcgcgcca ctgcactcca accttggcga 48600
tagagcaaga ctctgtctca agaaaaaaaa aaatgccagc agtggctggc tgaggtggct 48660
cacacctata atcccagcac tttgggaagc caaggcaggt agatctcttg tggtcaggag 48720
ttcaagacca gcctggcgaa catggcgaaa ccccatctct accaaaaata caaaaattag 48780
ctggatgtgg tagtgcgcac ctgtaatttc agctgctggg gaggctgaga catgagaatc 48840
acttggaccc tggaggcaga ggttggagtg agccactgta ttccagcctg ggtgaaagag 48900
ggatactcta tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aagcgggctg gatacagtgg tgcacacctg 48960
taaccctagc actttgggag gctgaggtgc tcagattgct tgagctcagg agtttgagac 49020
cagcctagac aacatagtga gacatcgtcc ctaaagaaaa aaaaaaaata ccagcactta 49080
gccaaaagat ttcaacagtg cagaaaaaga aagttgtgat atcttttctc caaattagtc 49140
ttgttttcag tttcattatc caagtaacca ctactaatag ttaaaacatt tgaaatacgt 49200
gtgggagctt gtcctattta atataaatta tttattgagc aaataatcac cactagtatg 49260
ttttggatac tggaattttc atatgtagga gtccttgaat gtaaggtgcc cctttggtag 49320
ttctgtgctt cttttacctg tactgtaaca tagggaaaga tgttacaaat ggttgtattt 49380
ttaacagagc agtatctatt cttaaacacc agcccttcca ctaaaggtaa acaacaaatg 49440
aatacataaa tgaagttttg gtattgggat tatgtgggtt aaacacatcc atatttcatt 49500
attaatattt aagaatataa caaacttttt attggcattt ggaccttgta gctaaggaaa 49560
gattaaactt tgtttatttg tgctttgttt tttttcttca ctcagatatt tgaggatttc 49620
ccatttgagg aatacattta ttaatcaagc tttagtttca agatccttga tcttagggaa 49680
taccatcaac cgttcttctt taagcttcct aactttgccc aaatttggtt agaactactc 49740
aagagtagtt tgggtaattc agaaatttta ttggaagggg aaagaatttt tgacccaaat 49800
tagataaagc aactcttggg taatgatttc ttttcttgtt ctctctttat aatcaattga 49860
aagtagtagt aaggctgggt ggcaaaagaa agaggcctgg ggagaatcgc gtggttttca 49920
ttatctcttt tcatagcagc aaagtgggaa gggaccaaga ggaaatcaac tgaaaaacca 49980
tccttctgaa acattggcct aaaaaactgt agtccagaaa ttgagtgcaa ctggcagtgg 50040
catttaaaag gaatgctcta atttctagga aagcaggcac gagtacctct taaaagaaga 50100
aaaaaatgaa aactgtaatt taggacacat agacgagtat ccattccctg tacttttact 50160
ctcatgtcct aaccaaggaa gggttgccat agcaaatatg gcattcctta gccatgattc 50220
actgttgtaa atgcctgcag cattcataaa agtaagatat atgggctctt ctttttcctt 50280
ttaaatcttt atttctgtat ttaaatctgt atgtcatcat ctgtattttc tctcttgttt 50340
tttttaaatc ttgggagatg gtacaaatta tttaggggag ggaatgagtt tcttgtccac 50400
aaatagagga gagagagggc tttttgtctt tctgctttgg aactggagag cttcctattt 50460
aggcatggcc tttttcaagt gaccttgtat tgttatcagt actgtagaag gtaggcacgt 50520
tgtgtaaact ttaaaattga aagccattag gcattccact tgtaaacctt ggctttttaa 50580
agaaaattac atgttcattg tgaatatttt cttatcgacc tatctctgtg cacatgcaga 50640
cttcctttgc ctacattctg aaaggtgtaa ttgccttctt taaggacagc ggacatctat 50700
agttcttggg tcaaattgtc ctccttctgg ttttgtcagt tctcagccac actgtgtgag 50760
catccatttt cttggattct ggttcggagc tcattttaag gaacatcatg tcccttttga 50820
gactctgtgg acattggggt gggtagatgt ccccctgtga acagaaggtc cctccctaag 50880
gaggtgcttc tctgtgttga gtcctgcatc tgggcacaca gagcccgaag caggaagagt 50940
tgagtctgaa tagggaggcc tgtaagcctg actgctctgc cacgggtagg cctggtctgc 51000
catgctccag gagcccccag gaggctctga agtcattctg cctctgggaa ttttacagag 51060
gagctaatat ttgagctgag tgagaaggtg attcttgaaa aagcaaggcg tgccctggtc 51120
cagttctgtg gggctgtcgt agaagagggc tcggaagctc ttgggagtga ggctagaaag 51180
gtaggcagtg ttaccataag gaggttggaa gtgacacaga taggctaagg aaggggactt 51240
cagtaatcat gcagcaatgg cctggaaaag ggagaggctc atagtaggga gaccagtttg 51300
gaggctgcca tagtgttcta ctgagagaga aaaagacttg aactcagagc acggtcaggg 51360
aaggtggagg ggcagggtct gatttggaag tgttttgttt tttggttttg ggaacaagga 51420
tttggaaacc tcttggctcc gtagatgaag aaaggtgaac caaggaagac tgaagtttcc 51480
actcaaggaa acagtaactc agggaagaaa acacaggagt aggaataggt ttaagagaat 51540
gacaagcagt tgtgttttgg acttgtttag ttcgaggtga catctttgta gggatgtcta 51600
gctggtagct gcaagtatag gaggaggctg gatgtgtgca tgagtttctt ggtaaagatc 51660
catctgcagt ctcctgaaga tgtcacccag attgccctgc catcacccca gggccttgag 51720
tcactcgctt ctcttggtgt ctaggcaggc ttgaagaaaa tcaaacagta caaaatcatg 51780
caaattcaga cctctattcc accccagagg aaagtcctgc tagcagtttt tgtgtattct 51840
tccagaaatt tgccttgcaa cgcgtttgag tatataaata atcccagaaa ggatgggcca 51900
gacactagca gaaactcacc acacacactg cactgggcat gcagaaactt tgcaaaatgt 51960
actggtgtgt gctgtcactg cattcctggg tttggaggtc ttctgtgtcc ccagctgtca 52020
gtattgccca caggctgacc actgagctcc ttccacagcc ggcccatatc accctctttc 52080
gaagtgtgtc tgcaaggcta gattattaga gtaatttaag tgtttctgct ttgtgttttc 52140
tttaatgaat ttttttatga tgaagttctt gttttaaaaa tatacagtgg taattaacat 52200
gtatgcattt ttcttaaaat gaccccccca gtccctcttc ggatgtgatc actgttaaca 52260
gtatcgtata tagaccctgt tctgtgtggg gcgggcagag ggctggttag tgggtggaac 52320
atgcatactc acaaccatat ttttcacatg ggaaaatata aaggtgacaa caaatctcct 52380
ggactataat ctcatcaagc agacaataat ctctgtttca aaagtggaca aatacatgct 52440
gattttttaa aaaaaattat aatagtacag aaagatacaa aaataagtta aagtcttcct 52500
aactctcctg cctgtgccct ccactgggca aaagtccctg tccctaaggt aatatctgtt 52560
aacagttctc cttccagaaa acttgcaatg caaataggaa cattttgtgt gtctgcctct 52620
gtgtgtatgt gtttacatgt cttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 52680
tttttttttt tgagacagag tcttgctctg ttatccaggc tggagtgcag tggcatgatc 52740
tcagcttgct gtgatctctg cctcctgggt tcaagtgatt ctcatgcctc agcctcccga 52800
gtagctggaa ttacaggcgc ctgccaccac acccagctaa tttttgtatt tttagtagag 52860
atggggtttc gccatgttgg ccaggctggt ctgaaactcc tgacatcaag tgatctaccc 52920
gcctcagcct cccaaagtgc tgggattaca ggtgtgagcc actgcttctg cccctgcaca 52980
tgtctaacgc acacaaaaga gattctgctg aacacatttt ttatgctttt tctttccaat 53040
ttaacatatt tgacatcttt atcagcttat atagctttat ttttttaaga ggttattggc 53100
tataaaggga aagtgcttta tgggtgcttc tgttgttatt taattggatc ctgttgatgg 53160
acattgatat catttctaaa ttttttagta tcctaattaa tcctgtggtg agcatcctta 53220
tacagatatc cttgttccct catgaaaata tttctggagg atggaaagaa gggaaatttt 53280
aaaaattatt tgtgtaaaca ttatcgtttg ttagtagaat gacctcagga gagattgtag 53340
taatttatac ttccccacat gcatatgaat gccttttcaa tatattgttt caaaattgga 53400
tatcatgaac cttaagagat aaatatatat gtatgtattt tttttttttt tttttttttg 53460
gtgggggcat gtcctgttat tgacagtttg ttttggtgga gggatgtcct gttattgaca 53520
gttatcgaat agaactttgt cagttccttc atgtaaggga tgaatttggt aataaaacag 53580
gtctgacttc agttatggaa ctgggaaagc tggaccttga tgtggaggtg ggctcagaca 53640
tgctgtgtct gggcaggtat ctcttgggaa gcagtgtcat ccctgaacag aaacatggat 53700
gagccgcagg ggacggtgct gagcagaggg gctggccgtg ggtcatctgc ctcccttggc 53760
ctagaaggca caagggagct ttccaccttg cctttggttt tgagaatgca gaagctacta 53820
agcaactcac agtgtgccca gggtggtcca gctgaaggat gcgaaatggt tcttcctttt 53880
ccagccaaag atcttgaacc tcccacccca tgacaagcat tataaaattc acataatttt 53940
gataggctgg attccttttc tgtagcagat ctttcctcag aacagaagtt tgtttttttt 54000
ttttaaccta aattacctgt gagttttatt ttttaaatat ggaatctgtt ttttggacac 54060
ctccttgtca tattaaatgt tctgttatta attttgagat tttaatgtaa attttacccc 54120
agcaaattaa ttttgtttct cttgctctct cttttttttt ttttggcatc ctttcccgtt 54180
gtatagtggt gctcatttta tcatactgct tttatatgac ttttcttttg tgaacaggga 54240
tcttgttcac ttttcctttt ttaaaaattt ttttattttt ttgagacgga gtcttgctct 54300
gttgcccagg ctggagaaca gaggcacaat ctcagcccac tgcaagtttt gtcttccggg 54360
ctcaagcgat tctcccacct tagcctcttg agtagctggg attacaggcg tgcaccatca 54420
cgcctggcta atttttttgt atttttgtag agatggggtt tcactatgtc atccaggctg 54480
gtctcgaact cctggactca agcgatccac ccgcctcagc ctcacaaaat gctagggtta 54540
caggcgtgag ccactgtgcc cgagccactt ttccttttaa cataaaaaca ttgatatcct 54600
agagagggca ctgtattttg ggtacataca ggttcagatc acggaagagt tgtattctat 54660
actttttttc atcattctta gttcagtatg atgtatttta taatttcata tgagaaactg 54720
taacaatggg catgtgtcat ccagcaatac ctactcataa atcatattaa attttgatcc 54780
aaacatggga gaaactgaag ttttctctgt gtacttggat gctttcagag gcataaaatt 54840
atattaccat gtgaaagcaa gcctacaaaa ttcctcaggt ggtccactct gccactcaaa 54900
tgagagccag acttacagtg cacactctac aaacggactt ccagctcgtc agggtatttt 54960
aagtgcctga atatgcaagg cactgtgcca gtaaaattac tcagtcctga ggatagagcc 55020
tgttagaatt attttaaaat ctgtacttga agtttatttc ctcagtattc caagatattt 55080
tatctggttg ttctctgagt atttcacacg tagctagtta catataggtg agatggtgat 55140
gcttgtgcct ggtgtggatg agaaactgag cctggcagac ccgagattgg atttcctctt 55200
ctgactttgc aagtgtggct ttgctttaat aatagccctc ctctttttct gtattcctct 55260
tttctccttc cagtgtggca aatatgcatc aatcaaaata caataacctg tggaaccatt 55320
ttttctaaaa taggaaggtg gtgccatggg ctattgattg ttgagggtag tcttcagagc 55380
ctgtcttata aatctataat aattcccccc aaattaatgt gctagttaga accctagaat 55440
tgcagcactg aaagtgaatt ttagaatctt ttccaacttt ttaccaagct cagaaagccc 55500
ttttattgga cctttgtttg cctcatggtc atctggtttc tttatgctgg tagtaacagg 55560
aaccttacta acctacaagg tgacccagtc catcctgggc agctgtgatc attggaaagc 55620
tctgaatcat tcatctggaa gctgcctgtg gcagaatagt acagaacata tgcattgcac 55680
acactacaaa actgctttaa ataagtgttc cttttcattg ttagatggaa gtgacccagg 55740
gcaaggatca tgttttatga gccagttttc tcctagtgcc ttgaacatag gcacttggta 55800
gtgtttagag aatgaattgt cttttttttt tttgagacaa agtctcactc cattgcccag 55860
gctggattgc agtggcacgg tgtcagctca ctgcagcctc cacctcccaa gttgaagtga 55920
tttttgtgcc tcatcctccc gaggagctgg aattacaggc atgcgccacc acacccagct 55980
aatttttata tttttagtag agatggggtt ttgcgtgttg gccagatggt ctccaactcc 56040
tggcctcagg cgatctgcct gcctcagcct cccaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc 56100
actgcgcctg gccagagaat gaattcttaa taagtttctt atgacttcag attgactggc 56160
agttgtgcta aatatttttt gcctttattt gaattagaaa attcgtaagg gggccttgag 56220
agtagatgca gtcacattta ggagattttt cccccccatt ggttaaaatg cagtttttct 56280
atggatctgc tttagaacta caaataaact ccgatcactc acagcagact acgcaatgag 56340
ataagaagca gtccatttgt tctgtcgttt attcatggcc ctcatctttg ccagccaacc 56400
tgtgcagaag agcacagcaa agcataagct tcctaacagc tattcccatt cagctgctgt 56460
cttcaagaag cagaagggtt tagataacct tagagaacat aatcaaacct gggaaactca 56520
aatcaaaaca aaacttcgaa acggaagttg aaggtcctga ggtacccaga ggcatagcaa 56580
ggaaaacgtc cccactggga tatcttctgg attcacctac agacctctct ggagttttaa 56640
gatccacgtt ttatgacata ttgcatagca aacaggccga acgctgttgt aaatcatcct 56700
ctacgaaagg cccaggtttt gaaactgaag gcctgaaaag gctcctgctt accagctgtg 56760
tgctgtacct gacacactga agcctgagag tgccagtcac ctgtcagagg gaacacagct 56820
gccctcaggc agaacctgag tctagaactc aaggtttttg actcttaggc taaaaataaa 56880
aaatcagaag gaggaactat ggattgctta atcagtcaca ttttcacttt ctaaggtttc 56940
ttgtagcaaa agttatagtc tttggggatt gggatgtaga cacttttttt tccttcccta 57000
aaacaatttt tggcctgcca gtttttcgag cttcctgctc tggaccctga agttgccatg 57060
cagttgcaga catgctcctc cttcaaggct ctgttaagct gtggctgccc ttccttacca 57120
ctgctgtgcc ccaggccaaa ccccctgccc ctccttcccc taaggcactt tgcacctgtt 57180
gctccgagcc ttctggtcta tcccagttgg tagagtccct gtgcttacct ctgtggctca 57240
gtcctcgtgg gtggtcagtg ctctagggaa ggtgagctga ccacttcact ttcccttccc 57300
agccatagct cttcacagcc tcaccaactt agaaaggaat gctgcttttc tctctgtccc 57360
ccgtcctgac tatgttcaag tcattgctca gcccagtgag tttgtccttt cttccagacc 57420
agtagttttc ccccagtccc tcaggcttca gcccttgaag gcatccttag ccccccacca 57480
ccatgatagt caggcgctgc gcctatccgc agggtgtggg tatgtgtgtg tcttttgttt 57540
ctggagccca ttcctttcct tccaccagcc tctaggcctt catccaatcc ttttgcaact 57600
cagtgattca tgacttttcc ctgcatccag tctagtctct ttgctggtcc attgtttcca 57660
tagttgccag tttaatcttc ttaaaatgct gcatttttga agtcagtctc ttttggtccc 57720
tctcagaaac atttaaatag ctatctgttg ccacaggggg aaagcttgaa cctcttagcc 57780
agtcattcag agcctgccct ctgctggggc ctgctttcct ctacagatgc ttctcccact 57840
ctgcctgcca cagcccttgt agctggctga ttgccctgta cctcgcaggc tctggaagtc 57900
ttcagctcct tcatggagcc tttgccagcc attcttttca agactttgct gttgttcact 57960
gcctgatttg ttcatttgac acttaattca ctgagcaaac attatgaaag atgtactgtt 58020
tgctactgtg aggaatggat ccccaagaga taagagggtc agtccctact gccaggaaac 58080
ttgcctgtgt cacctgggtt cagtatcttg tgtctattag atcagaagtg gaaaggcaga 58140
ggccagcccg tatgcttgtt ttattttatt taaatcacca gcaccccagc aagtgttttg 58200
cacaggaaat ttctcattat ttaattattt tgggtttttt gattaaattc tgtacattcc 58260
cattttagct tatcttgagt tataacatta aaattaaggt agtcatcagc tgaattataa 58320
gacttaatta gataagatta tttaagatag tgatttctca ttagattggc cctgttcata 58380
ttaacttttc tgtttttttc ttcagtctgc atgaagaaat cagtgatttt tatgaataca 58440
tgtctccaag acctgaggag gagaagatgc ggatggaggt ggtgaacagg atcgagagtg 58500
taattaagga gctctggccc agcgctgacg tgagtccctt cctgggtagc ttatgcttcg 58560
gacagtcctt gtccacgggc tagaagccta tctgctggta tctcatgcta gtcctcacat 58620
gcaagtagaa gtgctctgta gagttgtggt ctaattaaat tttaaaggca aacaattttc 58680
tgcagtcttt agaattgagg cttcctaact attttcattg gattggatga ctaacaacta 58740
tttttttttt gtagtgctaa tagcaactac taaaggcaag ctatccttag aaattattag 58800
tgtaaagaga agaaagacaa atcaaacctc attgttgtag tggtctgtta ttggatatga 58860
tatatcaaaa cctcattact acttagttcc agcctgccag ggtaaacatt atataattgt 58920
ttacagctaa atgaaaatgt caagtaagaa cttttgtcac ttgaagttca tttcctttgg 58980
ctaatgcacg cataagtctt ttcttatttc tttcctgaaa ttgccatttt tcatctctct 59040
cagaccagct aattgccttt tagacagctc ccagtcagtg aacaaaatga ttactcagga 59100
tttcttcttg gcttatttgt cgtttttgtt actggtacta agtcttttgt tttttgtttt 59160
tgagatgggg tctcactctg ttgctgaggc tggagtgcaa tagtgcgatc acgacttact 59220
gcagcctcga tttcctgggc tcaggtgatc cacctcagca tcccgagtag ctgggactgc 59280
aggtgcacgc caccacactt agctaatttt tgtatttttt tgtagagact gagtctcact 59340
atgttgccca ggttggtctt gaactcctgg gttcaagcaa tgtgcccgcc ttggcctccc 59400
aaagtgctag gattacaggt gtgagccacc acacttggcc tgttactggt actaagttaa 59460
tacgtcactt tttagggcac tttgagggcc tgttctacaa ttttgtgtat gcaaagaagt 59520
acacaaaata atactaataa aatccattac tttgtgtttg tagcttttct tcaggcactg 59580
tcctgggtgg tggtgggaag ctagggaagg tttttttcca attggcaaaa caaagaagtt 59640
tcattgtatg taaaacttgc aagtatatga cagtatgtat atgacactgt aggtaaaggg 59700
aaaaggcaag ggtactaatg ttttatgagc aatgaccata catcgcattc tttctcctat 59760
gtgatccaaa tcagtggttc tcagctagtg gctattttgt tctccagggg gcatttggca 59820
atgtccgaga catatttgat tgtcctgact gggtacgcac tgctagtacc tagtgggtag 59880
aggccatgga tgccatcagc cattctatga tgaacagtat aggcccttac aacaaagaat 59940
tatccacccc caaatgccaa tgttgagaag ccgtgatcta acttaaccct tatctttctt 60000
aggtggaggt tgattatcta tctatctctt tctctccagc cagccaggca gccatcatct 60060
gtctacctac agatgaggaa catgagcttg tggttaggtt cccaggtcca tctcgcctca 60120
gaggttgaac tggtttcact gtttatcatt tttttccccc gagatggagt ctcgctctgt 60180
cgcccaggct ggagtgcagt gacatgatct cagctcactg cagcctttgc ctcccaggtt 60240
caagaaattt tcctgtctca gcctcccaag tagctggggt tcaggcgccc gtcaccacac 60300
ctggctgatt tttgtaattt tagtagaggt gggatttcat catgttggcc aggctggtct 60360
tgaactcctg acatcaggtg acccacctgc cttggcctcc caaagtgctg ggattacagg 60420
cgtgagccac tgtgcccggc ctatcctttt tttattacaa ttacctgcat acatatttct 60480
gcctgagttc caccgttctc catgggttga gatggaatgc atcccagttt tatgccacag 60540
catgatgtta cctgatgttc tttgtggaat tgacctaaag gccctcactt gccctacagt 60600
taaagtagtc tgatcccaat ttagtaatct attcgaagac tcctgcttag agaacaaaaa 60660
tgaaggattt gtgattgtgt ctctggataa tgagggaaca ttagtgatct gaactgcttc 60720
tgaaagtttc ctgtggttgg ctttctgtat ccacaggtac cacacctcca tattaaacca 60780
acaatggatt gaaaatattc agaaaaaact ataaaaataa caatgtacca ataaaaacaa 60840
tacaaattat tttaaaaata cagtataaca actatttagg tagcatttac atcatacttg 60900
gtattatagg tattataagt aatctaaaga tgatgtaaag tacatgggag gactagcata 60960
ggttgcatgc aaatactcta ccattttata gcagggactc aagcatcttc agattttggc 61020
atggtgggac tggaaccaat ctcctgccga taccaaggga caactgtatt ttggtctatg 61080
tgtttcatat tgaaccagat aagtttaaat tatattcaga atgtctgctt gtgaaacaga 61140
atccccgctt catgaagctt ggggttagaa aaaaatgctc ttgtcatacc aaaaagtacc 61200
agtagagggt agcaaaaact gacatttctc catatcttgg tgactcaata tgataacaac 61260
ttctgataac tcaatataat aacaacttct ttttctgttt caggtccaga tatttggaag 61320
ttttaaaact ggactttatt tacctactag gttagtacac tcatgaatct ttcaaaggac 61380
ttttcttaga gtgtattcat tttggctgtc aaatttgtaa ggagtagaaa caaaacaaat 61440
ttataaaaca aaatggggct gggcatggtg gctcatgcct gtaatcctag cacttcggga 61500
ggccaaggag ggtggatcat ttgaggtcag gagttcaaga ccagcctggc caacatggta 61560
aaaccccatc tctactagaa atacaagaat tagccaggcg tagcagtgcg cacctgtaat 61620
cccagctact caggaggctg aggcaggaga attgcttgaa cccgggaggt gaaggttgca 61680
gtgagccgag atcgcgccac tgcactccag cctgggcgac agagcaagac tctgtctcaa 61740
aaaataagta agtaaataaa taaaggattt accagcattt aatttgattt accttgaagt 61800
agaatatcac ttcacatcat cttaccaaga catagatggt acagagagat ggaaaaggga 61860
tcatgttgca atggaatcaa ttagttacta attttagaaa ttgactgcct ggcagagtat 61920
tgctcagtcc cataacttaa cccactgaca cagatgttaa tgtagtatca tgataaaatg 61980
tctgattata tatcctcttg aatgtgagtt cccgctgtct tgctcactca ctcttacact 62040
caccctcgct ttcaaattaa gaactcattc tactagttat ggctccagca tcctgatcca 62100
gaaattcagg gtacagatct cttctctgag aaagatcttg gcctttcagg actgttgttc 62160
agtttcagtc ttctcaaatg agacctcttg tgacgcacag ccttggaggc tctcttttgg 62220
gaaatgataa tgtttctcca aagggtgaat acttgctctc taagaattga aattgtttga 62280
acattccatc atggttatta ttattattac cttaaatttt aatctctcca gaataaagtc 62340
agcatcatgt ttttccattt gagcttgatt tggtatactt taccccaact taaagtgtgc 62400
tgaagtggat ggaccctggc aatttccgtt cttctcatag atgcccttgg cctgcaaaag 62460
tcataaaata ctcaacttcg agttaatatt tcttatttag gttgtcagca tcagtaaaac 62520
atgaaaaatc acctttctta aaaaatttaa ttaaatttta tgaataggta gtacattcac 62580
atagttcaca tttggaaaag gcacaaaaat caatacaggg aaaagtctca gtcccacctc 62640
tgccccctgg ttctccttgg aacagccgct tttaccagtt tctcacatat cctttcagag 62700
atatctgtgc atataaaagg acatgtgtgt atattaacac aaatggtagc atgctggata 62760
cctgttctgc atccagctta aagcacttca taatatttct gagttgcaat taatctcatc 62820
cggataggaa aatcattatg tctagtacca caagcgttta ttaaagaaaa tacatgaagt 62880
gctttttgtt tttttttctt tgaggtttta cttctttcaa aatcacccta tttcctgagg 62940
cctgaattct gtgaaatgac tgagaggagg agtttgttaa aatcaacaac tactatttcc 63000
cttctccaca aaaccattat caccaacaca tttagtcttc gttggccagg gtgggaaata 63060
ggttttaatt gtactaatga agtctataag catgagtgtc agttaaaaca agtttccaac 63120
ttcttccgac cctcttgtat atgtattctg tgttcagtga catcgaccta gtggtgtttg 63180
ggaagtggga gaacctaccc ctctggactc tggaagaagc tcttcggaaa cacaaagtcg 63240
cagatgagga ttcggtgaaa gttttagaca aagcaactgt aagttctgca gcatttcata 63300
ttaaaatcct tagttattta cctatgaaac ttgaattaaa attaaagttt ggtgagcaca 63360
gttgcattgc aagtgagtga ttctttcatt ttgttaatgt caccgtgctt gcacataaaa 63420
agttttctgg ttgtccacac tggagtgtga ccatacaatc tcggctcact acaacctgtg 63480
cctcctcggc tcaagtgatc cttctacctc agcctcttgg ggagctgtac tacaaacaca 63540
acctgccatg cctggctaat tttgttgtat tttttgtaga gacggggttt caccgtgtta 63600
cccagactga tctccaactc ctgggctcaa gtgatccacc cacctctgcc tcccaaaatg 63660
ctgggattac aggcgtgagc cactgcacct ggtctgcatt tcttttcaca gcagcaaaat 63720
atgcaatttt attatacaca gtactcactg tagagatttt tgtttgtttt attcattttt 63780
tttagagaga tacagtctca ctatgttgcc caggctggtc tctaactcct ggactcaagt 63840
gatcctccca cctcagcctt atgtgtatct gggactaagg cgcaccctac cacgccctgc 63900
ttatttaaaa aatttttttt tgtagagata gggtctccct gtgttgccca agttaggcca 63960
ttttttgaaa agaactgctg atagctcatg taaataatcc tgtcagcttt ttagaataat 64020
ttttatattt tatcttgtca ggttgttttt tgggctattt gcaaaactga ccagtaatgc 64080
aagtgggttg tagtgtacac cttaagaatc cagcaatttt cttattagaa acagtttgat 64140
gatacaaaac atttaatacc tggcattcct agttcttcat cttatactca gaaagtgttc 64200
tccaaattat tgaggaaggt ttttgttcat tttaaaatta tcattataac tatatgtcaa 64260
ctaataaatg agatgatggg catattaatt tatttaactg tagtaatcac ttcagtatgt 64320
atatcaagat aagtatatca aaacatgtac accttaaata taaacaataa aaataaataa 64380
taaaaaattg gacaccaaac aaaattctcg gttgatagaa attatactgt aatatactgt 64440
atgggaccca gtgctaaata tgcagcatat agtatttgta gcagaccagg tttactgggg 64500
tgtgccatat ttagaatact cagtgttctt atgctctcat gagatgatgg agacctcatg 64560
tctagtaggc ttccatcccc tgattttatc atttaatctg gttaaagcat ttacatttta 64620
cctttcttct ctttataggt acctattatt aaattaacag attcttttac tgaagtgaaa 64680
gttgatatca gctttaatgt acagaatggc gtgagagcag ctgacctcat caaagatttt 64740
accaaggtca gagaatttag cgtttataca acaaaactat tagaaacgta attttaagat 64800
tctgttgtgg tggtgttcta atatttttat atgcatgttg ctgtctctct ctctctcttt 64860
taaatagagc tagggtctca ctctgtcacc taggctggag tgcagtggct ggatcatggc 64920
ccgctgcagc ctcaaactcc tgggttcaag tggtcatctc acctcagcct cccaagtagc 64980
tgggactaca gacgtgagcc actacacctg gctatttttt gtattttttt ttttttttta 65040
gtgttggggt ctcgctgtgt tggccaggct ggtctcttaa ctcctggcct tagcctccca 65100
aagcactggg attacaggca tgagccacca tgctcagcct gcaccttact tttgtatgca 65160
acggttttgc tttctttgaa tctgcttgta atgatcagtg attaacttat aatgtgacct 65220
caagtaagaa ttaaaagttg agaaagcttt tgaagaaatt gtctgctcta gatccttcct 65280
tgtagagaca gaagagatgg aattctacta cacagttgat tccatctgtt tttaaccttc 65340
aggagttcag attaagaacc tttcctttaa cccatttccc atatgcccca agaatactgt 65400
gcgggcagtg agctgcactt tttttttttc ttttttcgag gcagagtctc tctctgtcac 65460
ccgggctgga gtgcagtggc acgatcttgg ttcactgcca cctccgcctc ccgggttcaa 65520
gcaattcttc tgcctcagtc tcatgagtac ctgggactcg tgcctgggac gagtaccagg 65580
cacctgccac catgcctggc taatttttgt atttttatta gagatggggt ttcaccatat 65640
tggccaggct ggtctcgaac tcctgacctt gtgatccgcc tacctcggcc tcccaaagtg 65700
cccggattac aggcgtgagc caccgtgccc agctgtactt ttttttttcc taaacaggaa 65760
ataggttaag agttttaaga gccttttcta gatttcaatc cctaaattac ctttaaggtg 65820
tttcctacag gcttccttac ttctgttttg aaattattta agtttatttc tattctgttt 65880
tcttccaaga tagagaataa tttgtcacca tcatctgtgg aacattttac atacttaggt 65940
agttgtcagc tttctcacct ctaacctaag ccattaactc ctttggcttc tgttagaata 66000
ttcacaattt tttttttctg tagcagctct aaagtttcta tttcttcttt tttgtttttt 66060
aagaaaaaaa tgttaactac ttgatgttac aagcattatc atcttgcata aatgtatgga 66120
agacagaaaa gcagaaaaat aaaagaaaga ttatccataa tcgcactata ttgggggtgt 66180
gtgtgtgtgt gtctgtctaa tattttcttt ttctggaaaa aacttttaaa aattgaaatt 66240
catatgcatg ataacattca tcagtataaa gagacagtgt aaagtgagtc acccttacac 66300
catagatact tagatcattt ttacagaatt tctcattgcc aattattgtt ttttgcgttg 66360
cttttttatg ttctttaaaa ttataagcaa aaggagtagc acattataca cacattgtct 66420
tataacttca taaaaactta atgttttgga ggtttcttcc atattagcac atacaggctt 66480
gctttattct ttttgttggt tacacaggca gtagtctttt ataaggctgt gactgcttga 66540
tttagcagtt cttcagtatt gttccagttt tcttttgcta ttagaaaaag ggattgatga 66600
atatacttcc atacatgcat cttgctttac acatgcaaaa tgtttgtaga aagattccca 66660
aaagcaaaat tttgaggtcg aagggtatat ccagataaaa ttctgttgga tatttcccta 66720
attatttatt ctttcatatt ctcattttct ctctctccct cccccttttc ttctccctcc 66780
ccctcttcct ctatccctcc ctttcccttt tctctctttt tctttccctc ccttttcttt 66840
tctcttttct cttcttcctt tttcttcctt cccctttccc ttttccttcc ttctgcttcc 66900
tttttttcct ttctttcatt ttttgacacc gagtctcact ctgttaccca ggctagagcg 66960
cagtgatcat ggctcactgc agcctcggct tcttgggctc aagtgatcct cccaccttgg 67020
cctgagtatc tgggatcaca ggcttgccca ccacacctgg ctaacttttt ttttaatttt 67080
tttttttttg agatggagtc tcactctgtt gcccaggctg gagtgcagtg gcgcgatctt 67140
ggctcactgc aacctccgtc tcccaggttc aagcgattct cctgccttag cctcctgagt 67200
agctgggatt agaggcgcac accaccacgc tcagctaatt tttgtatttg tagtagagat 67260
gtggttgcac catgttggcc agggtggtct caaaccctga cctcaggtga tccgccctcc 67320
tcagcctccc gcagtgctgg gattacaggc gtgagccact gagcccggcc acttttttat 67380
tttatttttt aagtagagat gaggtcttgc tatgtggcca cttttttttt tctttttttt 67440
taagtagaga taaggtcttg ctatgttgcc caagctgttc ttaaactcct gggctcaagc 67500
agtcctcctt ccttgacctc ccaaagtgtt gggattacag gcatgaacca ccacacctga 67560
cccctaattg ttctttgaaa gggaactgta tctagactga cttaaccacc atgttttgtt 67620
ttgttttttg agacagagtc ttgctctgtc actcaggctg gagtgcaatg gtgcgatcat 67680
ggctcattgt accctccgcc tcctgagttc aaacgattct tgtgcctcag cctccagaat 67740
agctgggact acatatgtgt gccaccacgc tgggctaatt tttgtatttt tagtagagat 67800
ggggtttctc catgttggcc aggctggtct tgaactcctg acctcaagag atccacccgc 67860
ctcagcctcc cagagtgctg ggattacaga tatgagccac cgtgcccagc ccacaatgtt 67920
taaaaatact tatttctcca tatttttgtt ctttcctatg cttgcttagt ttgatacaat 67980
ttgcaaaagt ataagctttt ttttcttttt tatagaagcc atgcgtgttc attgtaggac 68040
atctagaaaa cagagataag agtaaagaaa aaaaaatgga aatcaccggc caggtgctat 68100
gtttcacacc tgtaatccca acactttggg aggcccagac aggcagatca tttgagctta 68160
ggagttcaag accagcccgg gcaatgtggt gaaaccctgt ctctacaaaa atacaaaaat 68220
tagctgggca tggtgggctg aggtcggagg atcacttgag cccaggagct ggagattgca 68280
atgagccaag attgtgctac tgtactccag cctgggtgac agaatgaggg ggaaaaaaat 68340
ggaaatcact agtaatttta ccaccctaag taataatagc tgttaagact tctttgaaga 68400
tgttgtgcct gctttgtttc cctccgtggc cccagcctat ggcatggttt acagaggagt 68460
gaatgaatat gtgcacagca aaaggtggac tcattctgta catacttgcc cactcaggtg 68520
ttctctcggg tagccctgcc tcattccctg tgaagcgtgg aagggagggg tggtctgtgt 68580
gtagtcatca gcccatgtgc aagtcagcag gcaggactct tgtttgcccc agggctgtgg 68640
cagaataatc taaaggtcgc tagtctacag tggtacatca ccaagaaaag tgattcttaa 68700
aaatctcact gatttagtgc tttaagatgt tggttacttt gtccttgtac tctttctatt 68760
ctctgtttac aaatgaatat tagagggtca tggtcacaaa tgagcatcat cagttacatg 68820
ctgttagtgt ttctatccta tagcaagtac tttttttttt ttttgagatg gagtcttgct 68880
ctgtcaccca ggctggggtg caatggcacg atctcgcctc actacatcct ctgcctcccg 68940
ggttcaagtg attctcctgc ctcagcctcc caagtagctg ggattacagg ctcccaccac 69000
cactcctggc tattttttgt atttttagta gagataggcg tttcaccatg ttggccaggc 69060
tggtctcgaa ctcctgacct caggtgatct gcccgccttg gtctcccaaa gtgctaggat 69120
tacaggcatg agccaccatg cccagccctg tagcaagtac ttagatacta ttattcattt 69180
gtacatgtct tacaatttaa gtataagggg agaaccattc attacctata gtttactttt 69240
ttttaatagc ttactcttaa aatagaaaat taagtatgtt gtatatctct accaaatttt 69300
ataatgtaag gaccaattta tgcccctctt aatgcttaga tctgttgctg atacaggaat 69360
tcattgaaaa tacaattttc tttttcagaa atatcctgta ttgccatact tggttttagt 69420
attgaaacaa ttcctattgc agagggacct taatgaagta tttacaggtg gaattggttc 69480
ttatagtctc tttttaatgg cagtcagttt ccttcaggta agtcatatgg gtatagcatg 69540
ctagtgcaca ctaaaagcaa aagtgatcaa tcagctggga aacattttgg aaaaaatcga 69600
aatcaacctg taattgcatt gctttccttg attacttaac ggcttttccc tttaaactgg 69660
gtacatttta tcatttagca aatatgtatt tttaaattcc tatgaaagaa tatttttggt 69720
tttaaatccc atacattcta gtatttttga gacttttcac tgcaaatttt aacatgcaaa 69780
atgtacggcc tggtttccat aagcataaat agtataaatg ccaacaataa gaatgtcttc 69840
taagcagcta aatcttgtaa gtttagttgg aattgagacc agctatttgg gtaagcgaat 69900
tagagtctta gtattgtaag tgggtatgtt tatgtggcac agggttgcca actgcctgag 69960
tctattcgtg agtcagaacg actttgctga tgtgttgggc caagccagcc ctggttggca 70020
gcctggtgca gccgtaaaat tcagccttac aaacagtctc ccgccattcc cgcaccatgg 70080
gactttagtg ttgtgtgtaa caacagtata acctgctgtt agcccattat caactgactg 70140
ctatgctaaa ccaaaattat aataatattg cttgtagaag ttagaatata atttattccc 70200
cctctccttg ataatttagc aaaaatccaa tataatttct tcttttctgc ttttagttac 70260
atcccaggga agatgcttgc atccccaata caaactatgg tgttctctta atagaatttt 70320
ttgaattata tggacgacac ttcaattatt taaagactgg catccggata aaggatggtg 70380
gttcatatgt ggccaaagat gaagtacaga aaaatatgct agatggctac aggccatcaa 70440
tgctttatat cgaagatcct ttacaaccag gtattgaaat taggtaaatt tgtgggcatt 70500
caaagagagg gcactgtcag tcaccttatt atactttaaa ttctctttag atgaaaaatg 70560
aaggaacaac ttctaattgt tattcttttt tcatcgaaat atttcatgag caaacatact 70620
aaaataaaca gacacagaca atagaaaaac accttggaga cttccagata agtagggagt 70680
agaatctgtt taaccctaaa agcatagtag aaaaggcatt cacttatttg gatgggttca 70740
tgtttggtgg ctgtttctcc ttcttgggtc cttattgcct tgattacaac caattgtcag 70800
caattaatga ggctttaatg agatgattct gaagtcctga gaggcagcaa gcatagtaat 70860
atatctttga attcatgagc agaagggtgc aaggagacaa tgtattttct ttttgaattt 70920
ctcctttcct gtttgatttt gcatgtctct ttgtgctttt tccagcttca tgtgggcttg 70980
aaagtaagca gaaagtaaat tccttccatg cttttctgaa gttctgtttg cttgcttgtg 71040
tcctgatttt tgtgagcaat attttttctt gatataattg taaaatagat tctgcgttat 71100
tggacttcag tggaagtgct tttagtcatt tgctttaatg tgtaaacttt gaaaatgagt 71160
aaggaaaggg ggtgaagaga tagagtagtt gcctaggaac cattttctgg cttattgagc 71220
tgccttataa acattaatag ttctatgtgt ttattcattg aggaaacatt acattgattg 71280
ggagcctgct ctgttcaaaa gtattgggcc aaaggacacg aagacttttc agcaagacga 71340
tccttgcttt ttaggggctc ataatttaga gtgagaaata gatatatagc taatataaac 71400
ccaaaaaata tagaagtatt tctgatgtaa cttggggttt cactcttagg agtgaacagg 71460
gcactatttc ttttgtttgc ataactgttt atgtatggaa tgggataatt cttgatgggc 71520
cagaatacat tccggcaact gatacaccat aatgaagtac caactgcatg attcacatat 71580
tcagagactg gggagctttg gggacagctc acagctcagc ttccaggcac aactctggtg 71640
ggataactat ggcccttgct ctcctggaag agagtcatca acatttagtg catattaagc 71700
acagtcaggc ttactatgtt acgtatattt cttttaaagg taacgatgtt ggaaggagtt 71760
catatggggc catgcaagtg aagcaggcct ttgattatgc ctacgttgtt ttgagtcatg 71820
ctgtatcacc aatagcaaag tactatccca acaatgaaac agaaaggtaa aagttcatct 71880
ataaccagcc cattgtgtca aaattagttg tggcttctta tcttcaaatt aatgttattc 71940
cctccctctc cctttctttt taaacacatg cagcatacta ggtagaataa ttagagtaac 72000
agatgaagtt gccacatata gagattggat atcaaagcag tggggcttga agaatagacc 72060
tgagccttca tgcaatggta agatattttc cttggtcgat tgactgagta ttagaggctt 72120
ttctgtgttg tgtgcgttta atgggaagaa acgttttcca atcttttgcc actctttcag 72180
gaaatggtgt taccttgata gtagatactc agcagttaga taaatgtaat aataatctat 72240
ctgaagaaaa tgaagccctt ggaaaatgta gaagtaaaac ctcggaatct cttagtaaac 72300
actcttcaaa ctcttcatca ggtccagtgt cgtcctcttc tgccacacag tccagctcta 72360
gtgatgtagt aagtatgaaa gcctcggctc ttctgaactc agatgcatgc acgttctctt 72420
gctggggtta acactgtctc gaaggctaag gctacttcct ttgcttacat gttactggga 72480
tattttaata actttcatgc ttgtacattt tctcaacatt ttgttatgaa aaagttcaag 72540
catatagtaa aagtgaacaa attttagtga gcattcatgt actcaccagt agattctgct 72600
attaaccttt tacttgctta tgtcatacct gtctatccat cactctatcc attaattcat 72660
cttattcttt gatccatttc aaagtagatt acagacatca gttcccctag agtactgtag 72720
cttgtgcatc cttgtagcca gactccagta tttgtttatt gttttttcct tttttttttt 72780
tttgagacgg gatctccctc tgtcacccag gctggagtgc agtggtatga tctcggctca 72840
ctgcaacctc cgcctcccat gttcaaacga ttctcctgcc tcaacctcct gagtagctgg 72900
gattacaggt gcgtaccacc atacccagct aattttttgt atttttagta gagacggggt 72960
ttcaccatgt tggtcaggct ggtcctgaac tcctgatctt gtgatccacc cgcctcaacc 73020
tcctaaattg ctgggattac aggcatgagc caccacacct ggcctttaac gtttttcttt 73080
tcttttcttt tctttttttt gagacggagt cttgctctgt cacccaggct ggaatgtaat 73140
ggcatgatct tcactcacct caaccttcgc ctcctgggtt caagcgattc tcctgcctca 73200
gcctcctgag tatctaggat tacaggcatg tgccaccaca cccagctaat tttttgtatt 73260
tttagtagag atggggtttc accatgttgg ccaggctggt ctcgaattcc tgacctcaag 73320
agatccaccc gcctcagcct cccaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc cagctgttat 73380
gactttttaa caccatagtt agttttgcct gtttcagaat ttcatacaaa tggaaccaca 73440
tagaatatag tcttgtgtaa ggcttctttc actcaatttt ttttcagctt tctggttgaa 73500
ttttttgttg ttgttgtttt gttttgtttt ttgagacgga gtctcgctct gtcgcccagg 73560
ctggagtgca gtggcgcgat cttggctcac tgcaagctcc gcctcccggg ttcatgccat 73620
tctgcctcag cctcccaagt agctgggact acaggtgccc gccaccacac ccggctaatt 73680
ttttgtattt ttagtagagc cagggtttca ccgtggtctt gatcgcctga cctcatgatc 73740
cgactgcctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcgt gagccaccac gcctggccaa 73800
attttttttt agttgagata tagttaacat aaaattcagc attaaaaatg tacaattcag 73860
tggtttttag aacatattca caatgttgtg cagccatctc cagtaattct agaacatttc 73920
catcacccca agaagaaacc ctgcatttag cagtagtttc ttctaattct tccttccctc 73980
ccttaacctc tggtaacctc taatctactt tctctttcta tcctgataga attttttttg 74040
ttcccccatc ctgatagaat ttatgtgtca attataatgt aagttacctt ttaaaatcaa 74100
agtgaatttg tagtgtactg atttgagatc taaagcaggc ttacctgttt gagtttaact 74160
ttattaagtg taggacatga aaagtaatct aaatattgta tgttgttgat gatgaccatg 74220
tgtcaatatg gaatcataaa tcctcctgtg cagaatctcc ctgtgtgctt ttttggttcc 74280
tagagcagta tgctttggag gacagaagcc aagctagatg tcacagacac agggagatgg 74340
agtgttgggg actgagagaa tgtgactctg acatgctggg tagagtgcca gggccagggt 74400
ggagacctgc agagagacgt agcattgtca tggcccatgc agcccagaaa taggtggagc 74460
tcagcccact gtcgcgggaa gtccaccccc acccacacca gtatgtttgg ttagaatgat 74520
cactgatttg tcatcacaga ctctcagaga ttgaacccct taaacccatc atcttgtgtc 74580
tggctgaagc cagggactag gacctaggtt cctcactctt taccatactc tttcattttc 74640
tataaataaa aaaacaaata aacttagacc tctgtgagct ccttcaaggt cagatgtggg 74700
cagtggattt aacaatgaac agaagctctc tgataaaatc agtcatttta aatgtttgga 74760
ggaaaattta aacaaacagt taattttttg tgtgcttctt ttaactccca aatgtttaaa 74820
tttagtccag agagtacttt aaccaaaatt gtttttcttt ctgaatattg agtatctaaa 74880
ttactaatat gtcacattat aactcacgtg acttgtgtta ggattccgat gcaacaccat 74940
gcaaaacccc gaaacagctg ctttgccgtc cgtccactgg gaaccgagta gggtcgcaag 75000
atgtatcctt ggagtcctct caggcagttg ggaaaatgca aagcacccaa accactaaca 75060
catccaacag caccaacaaa tctcaggtgt gtggaacgtg ggtttttaat tgttagtatt 75120
tgatacaaaa tatttagaat ttcccacatg taaataatat gcagcatggg tttgaagaaa 75180
acgctagatt gaagaacaaa cttattttat tctaagaggt tccaacacat gacagtgctt 75240
ctaggaacag gatgtcctaa ggatccttgt gagacaccat tgtaacataa atctcttcag 75300
gaatctattg actggtcctt ataagatgtt ccagccaaac taccatataa aaagtgtctc 75360
agttgtacat gaaataagct ggcatgaagg ttttgtgagg cctcatggca gtgtgcatat 75420
ctgggaataa tgtatccttt tctaatattt taatgttcaa taccttgttg ctggtgttga 75480
aatgatcagc tggctgtcag gcgtggtcag ttgattaaca ttagcttgga cttaaaaggc 75540
cacagagata ctctagttta agtttttttg ttgcctagaa ttgtcattaa ctgagtaatg 75600
actcagagtg aggggaggaa gccattgata tggggctctg gcctaaggct gggtcactcc 75660
tcactatagc tgggaacctg ggaataggcc tcttggctgt aaccttgtgt ctgatttgac 75720
tcactgagtt cactttacct acgcggcctt agccatgtat gccagacaca gacttatcac 75780
aaaataccag ttcaagtgac agggttgaca gaagggactg aggtcacgag aaagccacag 75840
gccatgagta gcaggaaggg agtagccacc tgtgctgacc caaacctacc agtgtgcctg 75900
tcatgcccaa gagcctcttc ccgctctgtc acttatgatg tggtgtttgg gttggtaagt 75960
ttcttaagaa aacctttgca tcccacacac tgttaagaag gcgggcgagt ggtctatgct 76020
tttcattatt tccattaaaa taaagtaagg gttttagagc taaaaagaac ccctgtaaca 76080
gctttttctg cccactagat aagtcagtga tcagtaaggt aacaatctag ccagcatatt 76140
cctagttttg aaagcttccc caaatccagg tgtttgagaa cactctgctt ttctgcaata 76200
ctgatgtctt tgtggtcgtt ttctgtttct gcagcatgga tcagcaaggc tctttcgttc 76260
ttccagcaaa ggcttccaag gtacaactca aacaagccat ggttccttga tgacaaacaa 76320
acaacatcaa ggcaaatcca ataatcagta ttaccatggc aaaaagagga aacacaagag 76380
ggacgcgccc ctctcagacc tctgtagata gtcagcgctg cgcggtggac tgtcttctct 76440
gtgcaatgat ctcatgctca ggacagttgc gcagggactc ctgggagata ttcaggagcc 76500
tcacactgtt cagacgttga cttagcaact gcgttttttc ccagctcgcc acagaatgga 76560
tcatgaagac tgacaactgc aaaaaaaaca aaacaaaaca aaaaaaaaag caagcaaaaa 76620
agagggaaaa aaaaggctgc ttatttgata agtcatatgc tacaacaggg tcattttaag 76680
atttaaagct tgaatgtaaa ataaatatat ttctcattgg ctttatgcag agttataggg 76740
aatagtattc agtgttggta gggtgataga aacaaaaaac agtatcagag gatgaggtgg 76800
ggaaggaaaa caaaggtatc tgataggaag tccagattcc aaaggggaaa gtgatctgtg 76860
catgtttttt ttttaaatat ttttgcatat atttaccatt ttattgtgtg tatatataga 76920
agaccatata ggagattgat atttgtaata gtggatttgt taataatact ttttacataa 76980
cattactgtt taaattgtaa acagattttt tctcaggatt agtttgaaaa ataatctaaa 77040
ttgtcatctt aacatccata tatagggaag tgattagttc tattactcaa tttgtttttc 77100
tcagcattga aatgacttaa tagaaccctt gtgtcctgct gcaaaaattt ttcctctcta 77160
aagaaaaggt ttatggtggc aaatgatgtt tattttattt tgtaaaaaaa aaaaaatgta 77220
ctatgtactt ttgtgtaaac actgaaaaat ctctggtcat ctccgagaat taacttgcaa 77280
ctgttttcta tagtgctgtc gtcttgggca atgggcaatt acatgacttt gtgtttgctt 77340
cctttgcagt cttttttttt tccccccatt tcttcctaat aggaaaaaaa aaaaaaaaaa 77400
ggtcacccat gtctggtctc attcctgttg cagtgaaact tcgagttcca cagactttgc 77460
atgctggctt ctctaaccct gtgtgctgcg tgtgcctgtt tctcatctct tattcttttt 77520
aaaattcatg cttaactact gtgggagaat aactgtaaac agctttaatt aaatcatact 77580
tataaaaaac tattttctta tattccactc tatgcttttg gtattgttga tctttacaaa 77640
ttaaatggtc tttgataatg gatctatttt gtattgcctt attaagacca aatacttctt 77700
gtcatcccat tctttatcct cttctttcat ggaattgtta tcgttaatta aaactttttt 77760
aaacattggc ttgtttcaat catactgtaa attttggttg tagtcagctt tgagtgcaat 77820
gagatgtata attctgttat cattacctgt tgagtttgaa actcagttgg gaatatttaa 77880
tataatagaa tgtaagtgac atttctgaaa atgctttctt tcagggtgaa agctcttatg 77940
tttagcatca atgtgtatgg ctctgttaaa tgcagccatt tctgagacga gattctttta 78000
tatatatata catataaagt actattggct tttaggagtt tcttttatat acatttatga 78060
aatactgaag accaatcaga ccattaatgg acacttagtg taacttttta taaagaaaat 78120
aatgctaaag taagaccaaa actgatgtca tcactgaaat taacaatttt caatatgttc 78180
atattttaat tcacaatgga aaaatgtgtt ccaaaactgg aaactcatag tactcgtgta 78240
aactgtggaa gatttcaaat gtgatgttat tttgacaatg ttttaaattt tagagtcaca 78300
ttttattctg atcagaattt ttattgagat gttgagcttt tgtttttgaa actagtttgt 78360
cataacattg tgcataatca cagtatttat tttctaggac aattgtgaat gtgtagactt 78420
atgtttactg ctaagggaac aattatttat aaaataatat taaatccagt attagctgcc 78480
tatttcagac acttaatact tgcagagatc tatgttacat ttaccacact gaagtttttt 78540
ttgttgtttt ttgtttgttt ttaaagaatc accctcattg ttgaaagtaa atgtactctt 78600
agggtgcgaa tattagtgtt ccaataagca tgtgattata ttaaggtggt ggtagcggga 78660
agataattct gattccattg ggaatcttag gttttcgtaa atttattggg aaaatagttt 78720
ttcctgtact gctgaagttt ctttttggta aacagtatct ttctaaaaga aaaaagcatg 78780
aaggagaaat tgaggtgtgt atacatttcc tcaaatgacc agcattgtat tcgtgaatac 78840
tgtgtatctt gcagtgaaca gtgtggaagc tgttcatttt tcaatctgaa gtaaaatact 78900
ttcaagaact tttagtttgc ctgctcattt gttttataca tttcatctat ttgactccta 78960
tcttatttct tttttgagtt ttaatacttc ctatattttg tgaatatatc agaaatgtgt 79020
catttatata ttagagtcca ttcatatcca tgaatcataa ccttcctttg ctaatacttg 79080
ttgaatggga ttttacaaat tctccctcac tctggtgaca tttctcaggc agtcatgtat 79140
gtgtacctgg ccattagaaa tattaatatt taaagactgt tttttagagg agctgatggg 79200
ttggtgaggt gtcagcacaa aatcttactg gttatgtttt gatgataaaa gtatatccat 79260
tttttccctc cagctttaag gtgactgtga aggtgcctgg ttttgaatgt ctttgtttgg 79320
tttggagatg tcgcactcag ttttcaaatc tagcttggat ctgtaggacc tatgtttttt 79380
acaagtaatt gccctccagt cttcaacagt tgattctgtt ttatttttat cctgttttga 79440
gtgtacttta cctttacttg cattttgagc ctcattaata tttaggttat ttgatttggc 79500
tccagatatt cctagatctg cacagggcaa aacatgggct atagggtgag catttttaat 79560
tgtctttttc tgctggaacc ttatatctct ccatgtgttt tctgctcctt ccctccccca 79620
tgaaatggta agtgtgactt gtgtttgcct gaacctgtgg actagtgttt ggggtttctg 79680
gaaacactag agggtcagaa aagagtaatg accaccgtga cgtgcaggat tctcttgctg 79740
tgacatgttc attgcaaagc cctctccagt gactaggagg tgtagttatt aaggttgatc 79800
tgttagaaat caccattatt aggtattagt ggtagatgtt gctgatactt ttattggtca 79860
tgactacatc tcagttttac tttaatattg atctatagtt tgatcagttc cttgaattct 79920
aatatgttga tttctcagtg tttctgtcac taaccaagaa tgtttctagg cagttggttg 79980
cttcacagtc aaaactaaat ggtaaactat caaaaataca ttcccaattt tgctgtgata 80040
aatattgaaa tgttaaaatt aatgaacaga agaatttatt cttacccatc tattcttgtt 80100
ctcctagttc attaaacttt cagttattgg aaaggcacat tctcaaagta ttttatgagc 80160
aaaatattct ataaatgcgt ctaacaaacc taattgaata taaaagttat atttagtagt 80220
tactgttgat agtaattttc atcagggtca tagttcatct agtaaaatat ttagagaatg 80280
atgttaacat tccagcatta aagtgggaac aaagatttat atatgaaatt ccttaaaaga 80340
gttcatcttg ccttggtttc tgaccctcaa gactctagct acctgccatc ttgtcaaaac 80400
atttgtgggt agaataagtg ttaaagatca aattttaata tgcttctcga tatttaacat 80460
agctaagaag ccagatttta ctgtagaagt tatttacatg atttgaaaac ttgacctaac 80520
tggaagcctt tttctcagtc atcttgttct aagccatctt gacttcacac ccttagcgac 80580
ttttcttttt tttttggtca aagataatga gctaaatata tatagacgtt gaatgttgac 80640
aaaattatta accagaaaaa ttgcttataa aggctgctga tctatttgat acctagaatt 80700
aaatatttga ggacagtttt tagttaataa actgctaatg tttattttac tgtctctcag 80760
gtttttggtt tttttaaaaa aaatgtgttt ggcctttaca ttttctactt aagtgtgtac 80820
tttattgagt ttaaccttgt ctgtagccta gtagcctgaa agaaaaggag acagaaccag 80880
agagatggat gtagtgcatt ccctttggtt attacacatt tgtggtagct cctggattta 80940
ctgagagata ttttagctat gtcaataaga acagctaatg atgtggaaat caggtgttct 81000
cttgtgtatt tcagtgaaca tttttattag tagttgcata tcatctctag ttccacattt 81060
taacttaacg tctttgtggc ttcaccactg agctaccttt cactacacca gcttctgtgt 81120
ggcctggtaa catggaaggt ctctcctaag gacagtctgg acgtattttg ggggaatgtt 81180
atttatctta aagatgccta gaaacaaaac gcatatagta ccagtgagaa actatgaagt 81240
aaacaagttg ctcaggccgg gcatggtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg 81300
ccgaagcggg aggatggctt gaggctggga gtttgagacc ttcatctctt aaaaaaacaa 81360
acaaaaacct gaatggtgag gtgtggtgga attgggtagg ggagggaaag gaggacttgg 81420
aaaagcattc tccaaagcca gcaacttggt gaagttcagt acttgcctct tagaggttag 81480
gccatgcctt tcaaagagag tgaaatgatg ggttatcagc cacattcttg gagttaatat 81540
ttttcttcat ctttcagttt gggttctgtg ctattcatag ttcttcccta agaccatttc 81600
attattacct tttatattta gttgcaattt attataatat gttgttttgt ccctgaactt 81660
aatctcctaa ttttaagatc ctctctgatt tttgcatatt gaaacttaca gaagtcactt 81720
taaaaaagtc ttttgaaagt cctacaatcc taaaataaat cacaagcttg tttgttagac 81780
gtgtcaagag tctccagtct ttactactaa aaagcagcac tgccttaaca cacattgtta 81840
tgggtgaaaa gtgagggacg accagtgtag tttctggata taaagtgtga aggactgttg 81900
agttaaacat ttttagtgga atatacatag ataacgtgta tttagaaact ttggtgaagc 81960
cagtatttgt ttttagtaac ctttttatgt atttccttct ttgattagca ttgtcttcag 82020
tgttaagaaa tgtggactcc tgtgaggtgc tggaggtttg aatcatcttg aaaactttcc 82080
aatcttgtct agttaccact gcagagacac taaggaattt accagaaaaa gatatttgat 82140
acaagtgatt taagaaatct caacatttcc tgaggccgta tcactgggca accagtgatg 82200
aaaactatga atgaattgca cacctggaag attttttaag ctaatgacag tttcttcaaa 82260
gatgtcaatt atttgccttg gaaattttat aaattgcatt tctatgcaca tcggcctcta 82320
gtgcttacca ctcggtttat tattcataat ctgcaattca ataaaggctt tgtgttttca 82380
tttatcttca aaa 82393
<210> 11
<211> 44042
<212> ДНК
<213> macaca fascicularis
<400> 11
ccacgctgcc ctgcgcacgc gcagcgcggc tcaggcggca gcccggtgac accggcccta 60
gcgcgcatgt ctgcacgccg gggtctgcgc gccgcggcgg gccgagggcg gcgtgcgggc 120
cttccagccg ctgcctattc cacccaacgc cggcctagtc agtaatggct caacgccacc 180
gcctctccct ccagcccctc ccagtcgcgt agcttctgac gccgtcctca ccccgcccgc 240
ggccgacggg gccccaacgc gcaggcgcgg taaccacggc ggcagtgtct agtgaggatt 300
tgaaatcggt cgcgcgtgcg caccggcgac acggcccggc gaccgaggcc gcgcttcctc 360
ctgccgcccc cgtccccgcc ccctcccccg cccctcattg gagcggacgc ggcggcggcc 420
ccctccttcc cccgcgctgt cgccgccgag agtgtctttt caccgccgcc gccgccgccg 480
ccgcaggagc gccgagccag cggcgcgagc gtgactgagg gctagccgca cgggcggcgg 540
cgcctcccgc gggtccttca gccgctcggc gcctgggccc gccccctcgg ccccgccgcc 600
cgcccttctc cgatggcctc tccccgcggc ccgagtggaa cgccgccgcc gccgcggccc 660
ccgcgcccgc cccgcgccgc gtgaagcggg agcccggaga ccgcagccgc ccgctgggac 720
gcgccaagcg ccggagccgc ccgccgcggc ctgccggggc ccatcaccgc cgccgccgcc 780
ccacgccgga gcccgacggg agcgcggcta gagcaggagg ccggggctcg gcccgcccgc 840
cgccgccgcc gccgccgccg ccaccggccc aggcccgtcc gtccgtccgt gcgcgcgcgg 900
ccgggcctcg gggcgcggcg ggggcggggc cgcgtcgggg cgggcgggcg cgcgggcccc 960
gcgggggcgg cgcgtggatg gatccgcgcg tggcctggat ccagcccgag cagaaggggc 1020
cggccaatgc cctgtggatg cagatctggg agacctcgca gggcgtgggc cgcggcggct 1080
cgggcttcgc gtcctatttc tgcctcaact cgccggcgct ggacacggcg gccgcggcgg 1140
gggcggccgg gcggggcagt ggcggcctgg gccccgcgct gcccgccgcg tcgcccccgc 1200
cgcccggccc caccgcgccc gccgcgctgc cccccgcgct gctgacggcg ctggggcccg 1260
cggccgaggg cgcgcggcgc ttgcacaagt cgccgtcgct gtcgtcctcg tcgtcgtcct 1320
cctcgtccaa cgcggagtcg ggcaccgaga gccccggctg ctcgtcgtcg tcctccagca 1380
gcgcctcgct gggccggccg ggcggcggcc gcggcggcgc cttcttcaac ttcgccgacg 1440
gcgcgcccag cgcccctggc acagccaacg ggcaccccgg gccgcgcggc cccgcgcccg 1500
ccggctcccc gtcgcagcac cagttccacc cgggtcgccg gaaacgcgag aacaaggcca 1560
gcacctacgg cctcaactac ctgctgtccg gcagccgcgc ggccgctctc agcggagggg 1620
gcggccccgg ggcccaggcg ccgcggcccg gcaccccgtg gaagagccgc gcgtacagcc 1680
cgggcatcca ggggtgagtg cgcggggagg ccgcgggggc gggggcgggg cccatggtcc 1740
tggccggcgc ccgcggtgca gacacccgtc ccaggcgccc gggcttttgg aggatggatg 1800
ttgaaggcta aggccaaggc ccgactctgc actgaaagtt ttttttttaa acatcagact 1860
catttatcgt ggagtgactt gcccagatcc tacaagtaac agtccaagaa aaggggctgc 1920
tgggtaggac ctgcaggtat ttgtcttttt tactcttgag attggaacgg gaaatcgact 1980
ctctacccct ccaccccgcc tccgggcaag tgaggaaccc cttgtcaaag tggggcgtag 2040
ataagtgtgg agtttcacgt aagttaagtt gcagaataat ttagcattgc caggaactcg 2100
aatcacgtcg aaggtaaata ttaacctttt taatttcatt ttttaaaaaa atttaactgt 2160
caacttagag gtgattcatt ttttgggggg tgttgtgtcc tttaattttg tgctgcaatt 2220
accataagca tcgcctatgg tttataaaca ttggcttaat tcaaagaaaa aaccagattt 2280
gtcatatatg tctattcttt ggaaggtgcc atttttattt taaatatttc tacatccgcc 2340
tagagggaat tagaggctct acttaaattt agtgcactta cagacggcaa ggaatgaaac 2400
gaaaggtggt gtgtgtttcg gggttggaat tgtcccaggt gaggctgttc aggtgtgatg 2460
ctgttgacgc agcccctttg ccattttggg cttttctgag cgtctggaag caatttatgt 2520
gtaggttgta tgtcagtatt ttaagactta aatgataatt tttccttgca caatttttcc 2580
ccccaattta aaaaacaatt aaggatttgc tggggtatga gggttgttgc atgcagtaga 2640
gtcctacaaa taaccacaat tgctaggtgt tgggagttct tatagtaaac ttttgcttgt 2700
aactcttttt ctcatttgaa gtatgttggg aaacacgagt tgatacttct ttaaagcgtg 2760
tgatacactg taatagctgc atgttctgta acttatttca cctggcttgg gctacaagcg 2820
ataccttcta aatttcccga agtgtaaaca tgcagtgcag acgccggcag gagcgcagac 2880
tcctcttctc tccctccagt tcttacctgt agaactttct gagagcaggt ggttgggagc 2940
agtttcttct tgatgaatag caatatatac ctaagggctc gcttggggag gacctttagg 3000
tttccagcct gttatgtaac tggaatggac tccgtttctc ttagcactag aaaaaacagg 3060
aagacacgtg gtctctgcca gtcttgggtt gtacctctgc tcttagaaag tggtagcgca 3120
tcaggtccca tgcacctcac ttgggctccc cgagctgttt cctccaggta actctagtca 3180
ggctcagtag gtggtgttgc ttttgttagt gaatgagccc actaggatca ggtgctgtgc 3240
taggatctgg ggatctgggg cagggacggc atgggagaca cagtctcatg atcttgaccc 3300
accctgaaac ctgcctgcaa gtgccccctg cctagagcac aagagtaccc tgctcagttg 3360
tgcaggtccc ctctcacgct cttcgtcacc cacgtccagt ctctcatcac atgctgttcg 3420
tttggccctt ttaatctctc cacacctcat cctccctcat gcaggctctt gttacttctg 3480
tggagattgc tcaagcagcc ggaggtgcct ttgatgcact ctggtcctgc ttgagtcctt 3540
tcccatcaca ggtaatgggg caatcttctc tgccagcagg tctggtcaga ttccccttca 3600
ccctgtgatg tcacctcccc catctccaat cccccacatt aaagactaaa gcctaaaact 3660
cagcaacacc tccagggctc tgctgctcag atgcccctag gtcctggctc ctggccccac 3720
cccttgccaa cccgttagaa cctagctgta aggcagtatg gtgtagggca tgagagggct 3780
ctgaagccca ccaggaggtc tggtttgata ctgcagtcat gctcttggaa ctttcctttt 3840
cccctttgct ggagacctct ccttgcctgt ctctgggtgg tgtgtaccat gcctccagta 3900
tggccttggg tgcatccgct tcctgccgtc tctgcccaaa ggggcctgtg aggaccacct 3960
gctctgtgcc cagaagggca cggtgacctc tgcttgggct gctattccag ctactctttc 4020
agaagcaaac ctaagctgtg gtagagttgg gcctgtggct agaggaggta aggtcccccc 4080
tgtgatcatt tccacatggc ctgttggtcc tatataaact aacctttttg tatcaataaa 4140
tagttctgtc tagaacttgc ttctggccat cagcttaccc agagtgttga gaaaggccac 4200
caaaaagtct ttcggttgtg gcttagctaa ggaaataact gagttttaaa ggctcacctg 4260
ggctggccaa tagtaaagga ccttgttgct gagaagctgc ttggggttgt gatatagtcc 4320
caggacatgc acttctgaaa atgcagtgtg tattcctcat gggaggatga gcctgctgtg 4380
gagcattggc tgaacccagt tgggtctttg cctggtagcc catgtggcaa ccctcactgt 4440
ttgtcctttt ctggggagga gttttctgcc cttggacact ttgcctggtg gcttggcctt 4500
gtgagactgc cagtctgcct tctgcttcaa gtaggatgaa gaaaaagcag gtgaaagagg 4560
acagggattg gtgcaagaac cttcagagga gaggaggtga aatgcttctt ttggctctgg 4620
ttcttgaatc attgtttgat tgaaatctca agcctttgtt ttgggagtgg tgtgcttagc 4680
gtgagctgtg ctatctacct gggcttctga cctagagatg ttgggcaggt gtttggacag 4740
gccctgggcc ctttgcatcc cagcctctgg ctgctgtcac ttgcaagtgc tctcatcccc 4800
tgacccagca gggctttggg ctgttgttac tttgtcatgg tcgttctagc agctttggaa 4860
acctcttcag gttaagagtc ttgcataagt gagagtggga gcatggccct cagatatttg 4920
gccacatcct tactggtgtg ttacagagac ccaggaagaa tgtagttgaa cgaggacaca 4980
tgcaggtgtc ccgggccctg aacagcttct attcagagtt tggcctttcg aaggctgtgc 5040
catctcaggt gtgcctgcag tgtgcagcag gtgtatgcag cttcctcttt gcaggtttct 5100
tggtatttaa tctcatcctt taatatcttc tattaactca aaggaaattc tgttcttagt 5160
ttgaagtctg agagagaccg acgactgtcg gcataggaca tggtcagcca tgccccgcaa 5220
ggcgtctggt gagagtcgtt tccaacttgg tgcatgtttt tctcaattct ttcttgcgaa 5280
ggagtcacag cttggaggcg caaccaggat cccccctctc cctctagcct gacctcactg 5340
acataaagta gagcaggtgt gacctgtccg gaacatcctt gtgatgctca gcagggcctg 5400
ctgcagagca cgggaggcat cactctaggg gcctttccct cccatacttt cctgtgagtg 5460
tccaggatgc atgagagagg ttgttgtgag acctgcctta aagggtggcg gtggcacgtg 5520
tggaccttgc tttctgagtt tcactctccg agtcccagag gtataagctt gtgaagagaa 5580
gcgtgtatgt atgatcacac taagcagata cttgctcctg cactgttgga ggaggaagag 5640
gagttaattt catcaattaa ctcttccaac actccttcca tttagtaata gcatcacttg 5700
ttcctgtctt ttgttccatg gccaagctcc acaaggtgaa attgaaaatc gagtgcaaga 5760
cactggctgt gctggagttg aggaaagttt tgctggagac ctgcttgcac catatgtctg 5820
gtcactgata gatgaggact ggccaggtca ggacagctga cacttggaga aggggctgcc 5880
caggagggca tgacagactc tggaaaagga gggtcggagt attaaactgg ctgggaatga 5940
gaggcctcca atcttttcgc aggaaaaaaa aaaaaaggct taatgctcgt gctgtggaag 6000
tcagaatgga gcaaagtggg ttctgtctgt cttgctgctg tgagcgtgtg atggaacaac 6060
agtgtcattt gctttttctc agaaatattt aatgcatgtt tgtgacataa tttttcaaag 6120
taattttaag taaatatttt aaagtaaaaa gttctaagat ttgtgtctca aggtaaagtc 6180
tcaaacgttc tttggtcact atttaatatg agattttgtc ctcattttaa atggattcat 6240
gtaagcgtcc tgtggaagaa gagttaatag ttatccttgg aaaataagaa ctttttatgc 6300
ctcagttagg tcatatggtt taggatctga ttttgtagtt gtggagtaaa ggttaagaaa 6360
aaaaaacagc aaaccttgat attcaaattc agaaacttga tttttgagga tgcaaccaga 6420
atttggacta aaggtacaga ggggtggcag agtcagacca cccagacttg cagaagattg 6480
aagaagccgc agtgctgcca tgaagaggcc ctttctagga ggtgtggctg gcttgtcagt 6540
gctttgtctt ctctgcagtg aattggatgg caagcctcgc cctcttcgaa agctgccact 6600
ctgaacctgc cttgagaagc acctcaggga gggcaggcag gtggtctcag tcagcgctga 6660
caggtgtcca agttacctga cctgttggga acatgtgcct gagtgaggtg gccaggatgc 6720
cttttctccc aacactgggg atgcacactc gtcagcatcc tatttttgag atttctatgt 6780
tgtggtagtt ctctgttgct gtgtagcaaa ttaacataaa ctcagaggct tagaagaaca 6840
ctcacttatg gtcttaagga ttttgtgtgt cagatcaggg atggcggggc tgggttctct 6900
gcttaggctt ttgcaaggct gaagtcaagg tgttggccag ctgtgttctc agctggcact 6960
cagggtcctc ttaccagcac attcctgtta ttgtcagaat tcagttcctt gcaggatgga 7020
agtccttgat tgcttgctag ctgccagcag gggaattggg tagggcgctg tcagcttctt 7080
aaggccacct gcattccatc tgcaaagcaa ggtactttga atttctctga tgttttccgc 7140
cagctggagg aagccccctg tttctatggg cttgtgttat tgagtcaggc tcctgcagat 7200
aacctgccta cctgaaggtc atgtagtagt acaacatgat catggtgtga taacctcatc 7260
agagccacag gttccaagga gtagggtgta ggaccttgag gggaggaggt tcttctgtgg 7320
gtagacttcc cctggcatag aatccgttga tgagcaggtt gtggttcttc ttgtccaaca 7380
cttttcccct gactggactc cagcccatcg caatgactct tgcagattgc cagttccgtc 7440
ctctggcttg gtggttacta ctgaactcag gcagccacta taaccaggag aacctttctg 7500
tgctgcactc agatgaacat tctttaaaat atgtcattta agaaaagttt gcaggactac 7560
tcgggaggca gaggcaggag aatcctttga actggagagt tggaggttgc agtgagccga 7620
gatcgcacca cagcactcta gcctggtgac agagcgagac tctgtctcaa aataaataaa 7680
taaataaata aataaataaa taaataaata aataaaagtt tgcaggaaag ccgtgtgaat 7740
atatgaaaat acagtgattg aaaagtcctg ttcacgaggt gtcctgcatt ggctagttta 7800
ggaaaggggt ctttcctatg caggtggggg ttgatgactt acccaagagt cacctctgga 7860
acccagttct cttaagttga tagcagtcta tctttgcttt gcagaagatg tggggaacac 7920
ttgtcctgca agcccaggtt cgtagcaatg ttggcttccc cagaaccttg gcttcagagc 7980
actgtgcctc ctttaggagg cacaagaaaa ctcccacacg gttcttccct ctgtcccttc 8040
ctgagccccc tgagtgtttg gctcttgtgg agttgctgct attactaagt tgatcccact 8100
gccctcctga gtctcctcag ggaaggaggg gctgtattgt agcccgcatt cttagtgcca 8160
agcacacggt agccactaag taagtatctc ccaagaaaga agagcaggag gaggatctgc 8220
caactcagga gagcaggtgg gggatggcaa gtcttcggag tattcataaa ccaaatgcta 8280
agggaaactt ttgttgtttg tcttagaatt ttaaaaaata aagtctgttg cagtttatct 8340
gctttccttc ctggagagtg gctaaactag tgttctgttt tacaatgtag aatgcaaaag 8400
cagaaaacat tcaagaaaat tctatactgt atttgaaaaa catcaccatt tagttttaac 8460
tgctctttgt ttcttattat aaaaattaat acctaactat gaaaagttag aaagcctgga 8520
gaagtatgga ggtgagttgt ccaccattgg gccactagag agtgccctat gagcctgtcc 8580
ctggtgtcct ggactctggt ggtgtgcact gcatttgctg gcagtgagcc agggggtggg 8640
ccacatctgg gcccgggcgg ggtggatctc tgcagaagtt tatccatctc ttggctgaca 8700
gggtgggcga gatgggagca gctctgaggg tccctgttgg cagagaatgt ctttgattat 8760
caacaacatg cctttttgtt gtgggcttgt gatccttttc tttcctaaat cagctgccgt 8820
gcataaccag ttaggctctc ctgtggcttc agattggagt tagtttccca agtgctagga 8880
tgtgggtgtt aggtgatttc tgtctttccg tttgaaagag atttcagatc attgtaacat 8940
ttctggaatc ctgtcgatct gaaggaatgg ctaggatgta gtagtttaag ggaaatgaaa 9000
agtcgaatgt attttgatgt ttctgcatca gacctgctcg gtggagtcca tttctcagct 9060
tcgggagcca cgtgcttggc tcttgagagc ctagctccat cagcccatgt cacacactca 9120
caggtctggc tttagctggt ttcgccatgg tttctaactt gagcctcagt ttccccccct 9180
gtgaagcaga gcctgtggca cccacctcag agagtacatg aaagacttgg aagcactctg 9240
tgagttgtca tgcgagagat taaaaaggcc accgctgccc ttttctcctc tctttaagga 9300
aattgaaacc aaaaattaag tccttcttgc cagctggaca ggaaaagcct ttttcttggt 9360
ttttgaaaat acaacttcca ctttcagacc aaagtgaaaa ctgctaaaga ctgaatattc 9420
tgagtcttgg gagtgggggg ctagaggggt gttgtgaatt gaaagatacc tttctatttt 9480
taaaacattt taacaatgcc ttaatgatga ataatgtctg ttctagtttt gcatttgtta 9540
gttttttttt tttttttttt ttaactgttc tgaaggtaca tcagcactgt tctacagctt 9600
taaataagaa tctcatctcc ccagaggcaa gggtactctt gatgtatttg ctcagggctg 9660
tatgtgctgc tccgtgtaac tcatttaaag ttggttaagg tttttttatt tcttgcacat 9720
agtagaagga gtggatgaag tgttttctga actctttgca gcttctaaca tagtgttctg 9780
tgtatagtga aggaaaacaa aattaagggc cagggaacat taagtaggca actagaacag 9840
cactgtccag tagaacttcc tgtggagatg gaataattct atttttgcac taatacagta 9900
gccactggcc atatgtgact tttgagcact tgaaatgtga caaatgcaac tgaggagctg 9960
aattttaatt ttatttactt ttaattaaaa tttaaatggc catgtattta gacagctctg 10020
aactgcagta actttaggct ctatttgaaa cagtgtttga ttcagtaact gttgctgaaa 10080
taaattgaaa ctcatacaac agtaaaagct gtgttactca gcaagttatc actgtgaaag 10140
ctctagaaat tgtttgagtt tccaatgcaa atccttttca aaaagccgct gttttaatag 10200
cacatgaagc ataaaatagg ttcatagcag agcgcagcac agagcaacat ggagcaactg 10260
ttatgacctg gagtgtctcc agtccagcat gcaggtgata ggtctcagca tttttgcacg 10320
caggttaatg atggtgcaga cggtcacttc cttctctcaa cagtcttcct ggtcacgagc 10380
accattgtgg ctcgtgtgtg gggctctttt ggcttagctc tctgcacgag tttgctcctt 10440
tagttcccag agctgaccct tgaaatgagt gatattactc ctgttttgta gacagaaaac 10500
tgaagccttg acagtctgac gtgacctggc aagaggtgct gcagttggaa atgtgaattc 10560
acggctgaca tctgggcact ttactcctaa cagtgttcag tgaacaagac gtcgctaaca 10620
tgcgggggat ggaacctagc aactcattct acaaacatgg ttcaaatatg ttggtgcagg 10680
gccttttgct ttgttttcct aaagagatta gattcagatg tggtggggtg ctttgacagc 10740
caccgcagga caaagttgat agctgtgggg ttgcggagtg ttgaggattt catagggaag 10800
ccagtcctgc gcagtagtac gctcaggttc gtgctttctt gaggtgttcc agaactggcc 10860
tggagggagg ctgcagtgtg gaagcgggat ttctgtcacc tggagtattc ttagaagttg 10920
cattctatga agagtggagc atctgatgag ctgtttactc gctgtttcat ctgacggcag 10980
ttgaaagaca aggcaggact ggcagcgcag ctgcctcagt cagcactgct gcactggggg 11040
cttgacctgc agtctcgcaa tcctggacta taactcattt tgaagagaga aaaattaagc 11100
attaagtgat tcaagcgtct tgcccaaggc gctactagaa aataaaggca ctggtgccca 11160
gatgcaggtc tgcatggtat gcaagcctgg gcttcttccc acctccccca cagagagggc 11220
actggtatgt tggagtgaag agccacgcaa gacctctgtg aatgggcaga gatgggccag 11280
tgacgcaaca cagtaaagtg tattttggtt ataggcatcg tctctaaact tatgtaaaac 11340
attattaaaa aatggaagga caacgatgaa atgatggcca aaaatataga aaaggatacc 11400
ttgcatgtcc tgtgaaatgc aaaggaattc taaagtgtca ttatgagtta cctcatggaa 11460
gaaagcaaaa ggtgaatcta tctagagttt gtggttctga ctcacaagag actgatgttc 11520
atgctgaagg acgagtgtga caggtggaag gatagagcac cgagaccaca ctctaaaggg 11580
taggaatcta tgggaactat tcagggagat gaaagcatgg aatgaactga agcttgcaga 11640
ctcgttgagt aaaaagcgcg ttttaggatt ggttttagaa taaaataaca aggcctgtgg 11700
ttggggaaga tgacttgctg ttcacagagc ctcccttaat aggtggggac ctcagctttt 11760
cctctgctgc catcaggtga gtggtgtaca gtcctagcca cagtagtaat caccactggc 11820
ctgactgagc cctcaccctt tatacagtgt ctcctgccac cctcctggga gaggctgttc 11880
tcggcacagc tggcctgggg tcacacagct ggtaggtgta aagcaggcat tggagtccag 11940
gtagtctcac tccgtagcct gtctctttag ccactggaaa tgtagagcaa agcgagaatt 12000
gtccaaagag ataagctaat aaagaggaaa acaggctggg tgcaatggct cacgcctgta 12060
atcccagcac tttgggaggc caaggagggc ggatcacaag ttcaggagat cgagaccatc 12120
ctggctaaca cagtaaaacc ccatctctac taaaaataca aaaaattatc cgggcgtgat 12180
ggcacgcacc tgtagtccca gctacttggg aggctgaggc aggagaatct cttgaatcca 12240
ggaggcggag gttgcagtga gccgagatca cactactgca ctccagcctg cgtgacagag 12300
cgagactccg tctcaaaaaa agaaaaaaaa aagaaaacaa ttatgctgag ttccagagaa 12360
gtgatgtctg tcttctcagg agagatgccg atgctgtctg agggcctgcc cagtctccac 12420
atgattcaga gactccagag atggacagct agtgccctga ttttcccaag aggattctga 12480
gggtgacttc tgtcaaccaa acaggaggac ctggtgctgt catcaccagt tgtagagagg 12540
ctgcggacca cctgctgtgt gtgccatctt acactgccat ttgctgattg cttcaaagct 12600
agaggttgtt tctaagagtg cttcgtgcta actaactaaa acataatgac attgtttttg 12660
taaaactgat ccgtggtttg ttttttaaag cagaaagctc taaagtcact cagtcccacc 12720
acccagaagc acaagcaggt ggctgccact gtaggacctc tctctctagg ctcgtgtaga 12780
tggacacatg gattggtcag tagaaatact tttattaaaa gtcttatctt tacataaatt 12840
tgccaaatta ttaattttgc ttgaaaggga aaggtgtcca acttcagttg gaaatactag 12900
tttctaagag atactgctga gactaagagc ataaaacatg atgaaaacct taagtggcta 12960
agtgcagcaa cgtcagagta aaagctttga tgaagtcttg gtttgcttgg gctgtgtagg 13020
ttggaggctc agcctttgtt tctccctcct ctggtgccca gtggtggtgt ttgtgtccgt 13080
gaattttcaa cctctgtagt ttgtttgtag ttatgaccac tgttgcaccg aacccttacc 13140
gagggccagg ccctgtgcta agcacttgcc agtgtggatt tattaagtct tcatgacagc 13200
accatgtagg gggagctgcg tccctgtgtt gtacttggga cgcgatctga cctcaggcac 13260
ttcaggctcc tgaagggtct gcagtctcgt ctctgcctgg gaaaccacga tttgcagcat 13320
attccacaga cctcatgctc atcatcagga ggcttcccgg gactgctgcc tgagatttct 13380
aagttcctaa tgtggttcat gcttctggtg agtttctttg aggcgacgcc ccctgcgttg 13440
cctctggtca gctcagtcct gtggtcctgc agggcatcct acagtgtcct ctgtctgtga 13500
cttgtgccgt gccaccttga cctggcatcc actgtcctct accgcgtttg cagataggag 13560
ccactgttgg tgcctttttg tcgtgtgtgt tgaatggtca gggtcccaaa tagctgattg 13620
ggagcactct ccttgaatct gccatgtgcc tgggtctcag gtgactgggc ccctccttgc 13680
ttcagaaccc acgtgcgttg cctgtcctct ctggcttgga gggttgtgtg gaatcagagg 13740
tgagacccag tccccaggga tgggcagttg cctttgattg cccagctgtc ctcagcgccc 13800
tccctcctgc gcccaactgc tgtctcagtt gcttgcttga ggatccggat atagactgag 13860
gtcggcctta gcgtggcggg gggttttctc ttgagtcttg gatactttgt taccggtccc 13920
atcttcctgt gggtgggagt gtctgtcttg cttggcccag cctcccagag accttagctc 13980
tcttagtaca tgggctctgc ctaccttgat ccccagctca ccaccctagt gcagttgctt 14040
cttcgctctt gttccactcc ttgtcgccat ccaccctgtg ctttctcgat gtgtccttac 14100
tcggtgtttc tgtggagcag ggcatcctgg gcttcctttc tgatccctgg ctcctgtgat 14160
cttccgtgct gggctccctc ttcccttccc ttttccactg tgttgccctc acacagctgg 14220
catgccatgg atgtcgctca cccaagccct tcctaatgtt gctcaccaaa acccctccca 14280
ccttgcccct gggaccttct ccccttccag gctgcatgca ggccgagggc ctggcgtctc 14340
agcaggaggc agtggggcct ttgctggcac ctgggctctg catcctgacc ttctgagggc 14400
ttggtccttt aggtccatct tgaatctcct ccaggcttcg gactctctgc tctgtagctg 14460
gcccatggag acgggtacac tcaggcctgg tcttagactc cgctgcttgg gctgtgctgg 14520
tgcctttggt gccctcttag tccatcccac ctgggggccc tgtcctgctg tccattgtgc 14580
cagagtgctg tccccttgtc tttccgtaac tggctgctcg ttacctttcc catctcagcc 14640
tcagtaccag ccacttggta tcagggaggc tctccctgac caacctaaag ttcacagccg 14700
tggttgccag tttaaatttc tgcatagcaa ctttttggtt tattttggct acttatcttc 14760
cccatcatgc cccctgtccc tcccatataa actcagtgag agtaggggcc acatctcatc 14820
atcctgccca cagctctgct gtctgtatca gccagggtat gctgtgcaga ggctcacggt 14880
aaatagctgc agaccacgaa tcccatctgc ttgctgtgct ttaatattgg cttacatctt 14940
tggatccagt gagttctttt ctctgtctcc ctctctctca ctcgctcata cttactttgt 15000
gtaattggtg atttccagcc ttttgtatag tcctttctcg aatagttgtt ttctgtcatc 15060
ttggcggggg cctcaagggg ttgactgtac ggagggcagg ggctgcagag ctgcagctgc 15120
tgcctggggt ctcacggcgc ccgtgaggtg taggcaggtg ctttgcctct gagctgtctg 15180
tagaatgggg tgacggcggt ttcatcagac tcagtgaagc atgtcataca gtgagtgtct 15240
ggtcacagca ggaagatggt gaatgtcagc taatgagtat tcatcaccaa tgaatagtaa 15300
cagttttttt tactaaggct atgtaatgta gcctcagaat tccactcagc acagccccct 15360
ggcagcggtg cctctgagag ctggcatgat ggagagagcc tggttggcct tactggtgtg 15420
gttggggcac ttgggagaac gccttcctca caaagctcat ctggagggtt ttcggacttg 15480
taggatagct ttttcagggg ccttgccttt ggcagggcag ggacgtgtac tgctgcagtc 15540
tagggtatgg gataactttc taaaccagac ccagaacttc atggccgcag gggcctttta 15600
gccatgcggg gctaggagct gacacagcgt cagcagcatg agggcctgtg gtgctgggcg 15660
gcagagccca gagggagccc ctgctggtgt gactttagtg taaaggctgg gggataccag 15720
attcttacag aagacttaag acgggcacag tgatgtctgc tctttgaccc ttgcagtatg 15780
aattagtaaa actgaaatta ttacatttcc tttattagga ttataaaagc aatgatgact 15840
tattgaagaa aatttggaaa atacagaaac tacctataat ttttccattg ttaacatttg 15900
agcatatttc ttgtcacttt taatggtgct ttaaatatgt agcaaatgta tcatttcgta 15960
ttttaaaaaa atgctaggta agcatttcct cctgtcctta aaaagctctt ttaaacaact 16020
ttaaaatatt gtatagatag atgtacacaa ttttctgaat aattggagtt atatttacat 16080
cttttcactc tttaggaaag gactggcctg tttctgtgtt gggttccttc ctgagtgtgg 16140
cttccagctc agtggctcag acttcaagat gaagacttca gtcctggttg tgtatggtct 16200
tgggccagtt accatatgtc taatgaatac ttagttttgt catctacaaa atgaaaatag 16260
taatatttgc ctcaaagact attatttggg aggatctagt gcaaatgtta gtaatgtgga 16320
tattgtgtag tgtcccagga tattaatgtt tttagcctct tggcttttat tctgtattgt 16380
tgccccaaaa gatgatgctc acttatcttt catccagtgt aaggatatct ggaaagacaa 16440
cagaaagtat agctgttttc atttcaaaag tgatcagctg cttgagctag caagcaaggc 16500
ttgcactagc ttccaggcgc agtcacgcag tttcacagca ggcgcggttc cctcggagca 16560
cccagagctg ccctgcggta gtcagcagtt gtgctgtggc tgcactgcca ggctgggtgg 16620
caggtggatc ggagccagca gatgtggctc aggaagtgcc ttcttggcct ctccttaatc 16680
tctttcagag tctgtgggcc cttgattgca ctgtgggttg tttcagactc cagtattagg 16740
agactgaacc ccttggtggt ttttttgtgt gtgtgtgctg agctgggttg aggacatgtt 16800
aagcaggtgg ggtgcctccc ctgggtttgc tccgggtggt acctgtggtg tggggtggtt 16860
ctgagtagtt ctggccccac tgctggagta tctgcccact cagtttgtga gatggcaggg 16920
cttcatcctg gtctggtgcc tcattttctt ctttagcagt gggcttagaa ccaatgcaga 16980
ttcccaagtt aagtattttt tctgtagctt aattattaca ggcttctggt acctaagccc 17040
tttcttactt tctgttctga ggggaagaga agataatgtt gtttctccgc ccccccccgg 17100
agtggcccca ggaccttgca tggcatttgc agcatttgca gcgtgcttgg gtttgcttta 17160
ctagggtgaa agtgttgcac cccccagcac ccacaaaggc acctctgctc acactccggt 17220
gaggttctga ctggccctgg gacatcacct gctccaggat cctatgtggc tcatcccagg 17280
agagatgtgg gagggaaggg gaaaaaaggc ttacatttgc tgagtggaat tcatgtagat 17340
ctgagttccg cattgattcc taagctgcag agcccttatg ccttggctgt tttgtgaatg 17400
ttagtcggtc ttaacctttt tcaccgagtt agcattggct gtctcaggag gctcacagct 17460
cctgctcctc ctccagggga gtgcgccctc ctcctctgtc ggtagctgtc aggtgcccct 17520
ttcctctgca gcagactgtc ctgggtcctt gcctggcctt ccccttacac gtgagcctgc 17580
agcttcattc acagcccctg tgtagaaaga taggcacatc gataggtccc tccctgccca 17640
gagtgggcgg aactgaggca ggcactaaaa gcagctgact ggcagcccta gaaacatgaa 17700
gggtttcatt tatagtttca gtccttttcc ttctttcgag ccttaattta aaaaaaaaaa 17760
aaaaaaaagc cttgaagtcc tgcttctgag ttttctaatt tgtgcaggta ttagttgcct 17820
tgtaacataa tcaaaaataa ataaaaatga tttataatta gcttattaac tgtatcagta 17880
aatggatact ttaaagagga tcattgatcc ctcaaaatag aagcaatgca gtcattccct 17940
cattatgctt tacttgtgat ttgcttacaa cccactcttc ctagttaaag ttaaatatta 18000
atccagaccc tatcagtgcg atgtagtagt gtctgaatca gttgttgttt tggtgtaatc 18060
gtatcaaagc atgttataaa atctacaaaa ttgcagggtt aactccaaat attttcacta 18120
aggtattgtt tttttgggca aaaatgcata gtgaacattg tggagctgaa gtgagggaac 18180
ttcgatttct gagaaaccac tagttttaag ggttttgaag gaagagttgg aggaggagag 18240
gaagagaata aattcacagt taatgagttt ccagtatttt ctgtcgcatt ttacgttgta 18300
atggaaaaga ctgggaactg aactcacatg cagtttgtca aatcactttt tccctagaat 18360
tcaggattga tgagattaac ggggtgttaa aggtaaactg aggcacataa ttaacatgga 18420
cagaactgta gacctgagtg ttgagagttg ggaaatttca gtgagttggg aagactggaa 18480
gcacctgttc ttcagagtgc aggtcctcat attcagtggg tttaaggtgc tgaaactttt 18540
tttttttttt tgagatgggg tcttgcactg ttgcccagac tagagtgcag tggtgtaatc 18600
accactcact gtagcttcga atcctgggct gtcagcctat cctcccacat cagcctcctg 18660
actagctgga ctgcaggcct gggccaaaac tcctggcttg aaacttcttg taaccagatt 18720
ggaggaggag ggcatgttca ttttcgtgac gtttcctttc ccttaaacat ccagtgaaat 18780
ctgacctttg accatcactt tgcttaaaag aagctactgg atttaaagtc taggagaatg 18840
tcctagacaa gcccatagta tgttcctgta tgttccccac ccagagacct gcgttatgaa 18900
gtgtttggtg tgcttcttcc agccccactg ttctttctaa agtgttttat tttacatacg 18960
ctgtcctggc ttctgggcta tgacctttgc cttttttgcc ctttagttcc tttgcccttt 19020
acctactgca gtgcagctgc ctgtccttgg gttgactaca aagaagtcac ctttgaacaa 19080
cttagaaatt gtgacttttg gggaaggcag ggcagagcct tggggctgag atgggggagg 19140
agccagctct gccctgggag agatacaaag cgcctgcctg ggtgaggcag tgcacgggtg 19200
ggcttgcttc acctctttgg ccccagcttc aaaaccagcc agtcctccct ggctttggct 19260
ttaattcaca tttacaagct tgaaaaccag ttaatcccat tagctcagct tctaaagctg 19320
aaaatcgtcc cctaaatggg tcacctgttg tcatcaatag ctttattagc tatggaataa 19380
tatagttttg ttctctaact gtaggatcct tcttttgctc ttaaaatagc tcagtaagtt 19440
gggtctcata aatacataca gcaagcatat accagatact aaaatacaaa aacattgctg 19500
atcttgcttt tcagtactaa aagcagaaaa tcgggaattt actaaattga gaagtcagtc 19560
attacctttc gatgggtttg gactcttgca aggcagtgat tgtaaacgag agtgatcttt 19620
tgttgttttt caatgaactt tattctctaa tttttagtaa agcacactag gaaataatgc 19680
ttcagaattc tgttttcgag tagtttcctg actaaaataa aaattcacta aaaaaaacct 19740
ctgctgtcac catttccttt tttcttaaga taactaggaa atgaatcatt aagagtttgc 19800
tccgtggcaa tggatcggga agctgaccct gctctctgtg gggctggagc cttgctaatg 19860
tcccaggatt tcacttcaca gagacaagca tcagaggctt gcttcattta tagatcctac 19920
ttcttttcta caccacagcc aactcaaaat ggtgacagaa tctaagacga ggctagaagt 19980
caccacggag cagttggaag ctctgcttcc ggttctgggg gcagtgttcc tggcgttgtg 20040
tcctttggcc ccacctcagt ttgtccgttt agctcctcag ctgagaatga gatgtgtatc 20100
atataggagt ttcctgggcc actcacagcc ccaagctgga gagtgccagc ctaatgtgtc 20160
aggagtaggg ggtgaggcca gagggctgtg tgccaactcc tccctaagaa gcctcctggg 20220
aaagccctcc caggcacttc ccaggtctca ctggccgcct gaggctgcag gggaggatgg 20280
tcaggccgcc tcttggctgg cactgcttcc cggcgtgccg ccagcctttc tcatggggag 20340
gggaatgatg gcatgcctgg ggggcagcag ggccccaggg ctgcctaggg ctctcactgt 20400
gtcctcctgg ttctgagatg ccacctttgt gatccactgt agagggattt attctattat 20460
gatcaatgca tagaaatttc ttcgatttgg agactgaaca ctagtgagca gaactgaaat 20520
tgagctttaa aagatattga tgacgggtct gtggatagga gactttagtg tggtttttat 20580
gcagacgtcc tgccagctgt aaattccctg gaggtttggt atgtgagaac ataagactaa 20640
acttatttct attttgttga ggagaaatga ttaaaacttt tcattgatgt acttctgtgg 20700
cagacttttt ggagaattga accagcgggc atattcagta tttgaagtca tagatgagta 20760
aaggaggtat gttgtagttt gcgctggcgg cgtggcctgt ggtcggcagg gcttatctgt 20820
gaaggtatgt gcacagcttc ctaaggcagt gaaaagtcct ggcagtgtta gtattgaatg 20880
agataatcca aaaaatgtaa aaatgtttac atttttaaag ggatagttgg cgatttaaat 20940
ggtttctgct aacaaatcaa attattcatt gcagaggtaa aatattttca gaatgttaat 21000
tttagatgtc gtagagagtg tacatcagca atgacaaggt cagcaaaata tcttagcaaa 21060
acttgattga ttgattccat gcacaggcaa gcgctgttct gggcaccgga gacggagcag 21120
tgcgctgttg cgtccatcca cagatggcct ccagagtcat gcggttgcag ggaggccgaa 21180
gggccaggga ggccgctggg tgggcacggc tgggcggtgc cctcacgtgg gttttgttgg 21240
gctactctta ctgtgcactt tttctcagtt tggtcagtgt tccgccttgc tgcctggccc 21300
ccaaccctcg ccctctgagg gcctcacaaa gagccaagca gaaggcaggc tgggggcttt 21360
tcaggccagc ccagaggatg taatgatgat ggttggcact gtcccacggc cgccaccagt 21420
ctcacactgc ctcgtgggca gtcctggagt cgtgcggcac cttgctggtc cctgctctcc 21480
ttgaagaagg gccagtgggg cacttcgcca gagccttctt gtctgactcc gtcatccaag 21540
aggcatggat ggccgggccc ccggcagttt ccattctatt ctgagaaggc aaaacaaaat 21600
tattcctgtc tcttattatc taatatttgt tacagcagtt gctcactttt aggtgcattt 21660
tattacagat ttcagacagg tgtggttatt agtgcagctt actgtttgga cacaatgcca 21720
aggtcaggag gacagtgttc ccctgagcac cacttctgct aggagcatgg gcaggccatg 21780
cctcgccatt aatctctcct gatttagggg aggaatacca ggccaccccc tcttctccct 21840
gtgcaaggga acagacattt gacaaaaacg gatgccatgt tacgctgatt ttgtgtgtct 21900
aaggcagact gcagcaggtg ttatctccgt gctcttcctt tcctggagtg ttgagcatct 21960
cttgatagta ggggatgccc ctgagggtgg tgaatgtggc tgcacaggtc ctgaaagcta 22020
tttgatgttg ccgttacttc aggtagaact taaagttgac agtacattct actctgcagg 22080
tggaaatgtg gagtgccatt ttgacaaatt ggaatgccct gtttacaata tgctttaatg 22140
agttaaatct gggggatgtg gatagaattt tagtatccta gctttggcat tcttccatga 22200
ctttgggcca attatttaat aattccaagc ctgcatcttt gttagaatct ctaaatttct 22260
ctactcctgt tattatcctc agaacaggac tgtgaggtgc agtaggccac atggtgtagt 22320
ggtttaggtg gacagacttg ccagtgctgt tctcatggat agcctaggac tgtccctagc 22380
tctctgcagt gacagtgata gtgactggtg aaggtgaagg gatccaccca gacgttcttc 22440
ctgatggaga gaggctggcc tgtggctctt ccctggggtg gatgttaacc tgctaacgtg 22500
acatatctag tcctgcttac attactaagt ggtaggaaat tttaggtaac acctcagact 22560
ttaaagtggc ctactgagct ggtagaaaag tgtgtagttg gtgctcagta attgttgaaa 22620
agatagaagc tttacttcaa agctcttgta gtttgatcag tttggaaaaa atattttaat 22680
gttgggctct gttaacagct ggactggtgg ctgtctgaat tgggaccatg cttggggtga 22740
ggttttttct tacttttttt tttttttttg gtgagacaga gtcttgctct gtcgcccagg 22800
ctggagtaca gtggtgcaat ctcggcccac tgcagcctct gcctcctggg ttcaagcgat 22860
tctcctgcct cagttttctg agtagctggg actacaagca tgtgccacca cgcctggcta 22920
atttttttct atttttagca gagatggggt ttcaccattt tagtcaggat ggtcttgatc 22980
tcctgaactt gtgatccatc cacctcagcc tcccaaagtg ctgggattac aggcgtgagc 23040
caccgcatct ggccacatat ttttttaaat taaatgtgat acataaaatt aggctgcagg 23100
catggcctga tttgcaggtg cttcatgagc aagcgtgcac agcatttatt tgctgctcct 23160
ggagtctctc gtgtgtgctt gtagcctagc cttaagccct ctgtggacgg cttggaatgc 23220
gtactccaaa tgactctttt ggcggggtgg gaagtggcaa tactttaggt gactgacagt 23280
tgaaattaac cttacacaag agccaaactg taggctgatg cagggccact cacctttgta 23340
ctcacccctg gcaggtcctg taagaggtgc tacttgcttc cactttgcca gctgttcgtt 23400
ggccctgttt tgtcttctgc tgtttgcctt atttatgaaa cagaatggaa acaggcgagt 23460
ttgatttgtt ataattccta ggagtcatag aatggaagca ggtgagtttg atttgttata 23520
attcctagga ttggataatt tgccttcccc tctctccatc tttaattaat cccttaaagg 23580
aaaagaggac gacagcactt ttcctgcagt catctgtgta ggcctcagcc ttaactcatg 23640
acataggctg gtgccactgg ccacagggct gacctcagct cttggagccc atggggtgac 23700
aggagatcag cacctttgag gtggcggcgt gaggcgtctt ccaggccttg ctcatggtgc 23760
ttgaaaacac tgctttagag ctttgttaag agagagaggc cctacttact cctgtcccac 23820
aggcatttgg gtgttgacct ccttgttggc ctcttaagga gagaatactt gagtattgaa 23880
ttcgatcagc ttttctgcct ccagggaccc tgtttctctc tgctgagact gtggcggatg 23940
aaaccaggat ttagtggatg gtcaccaggt agcttgggca gacctgggcc gcggggcccc 24000
tgaggactca tacgtctttt tcctgttcac atgttccttc cccacacctt ggcccattct 24060
cagtccctcc catgctcctt agcgtgaggc actcagggag gtgcccatgg ggccttgggg 24120
cctgtgctgg agctggttcc cagcctcaga agtgtgccta actgtgccac attcattgga 24180
aagctgcttt cacacttcct ggatggaatt ctctcatttt ttcaatataa agtcactgag 24240
atgatttttt tggagaagtc tttaaaggcc agttatacat ttattgatac ttggtattga 24300
caaagttcag ttgtttagtg ttgctaagtc atactgtgta agtttgttga gcacagagtt 24360
ttcattttat actttcagag gagaaatgaa actgaatttc gtggccagaa atatgtttga 24420
gcgtcatcct gatgtaagaa cagaacagaa aatgtggtga catttcattg taactctagt 24480
atgttttctt ttttgtccat tagactacat gaggaaataa ttgactttta taacttcatg 24540
tccccttgtc ctgaagaagc agctatgaga agagaggtgg tgaaacggat cgaaactgtg 24600
gtgaaagacc tttggccgac ggctgatgtg agtatgttct ttggagttct gtgtcgcacg 24660
tcacgtgcga gtaaatttaa ataccctgtg atgatgatgt gtcggctaga tccacacaga 24720
ccttttctcg ttggcccgag gcagcagttc tccaagtgtg ctttgagaag gcctccgttg 24780
cctggaatgc atggcccccg gcgcacctgc acctgctgtc ttagacacct gcggtggccg 24840
cacatcttcg tgatgctggc gcgcactcaa gtgcgaagac catcggctga gggatttgtt 24900
gggttttttt tttttttttt tggaaggggg agaatggtgt gattgtttct cttaagttca 24960
ccttaaaatt tagaaatttc accctgtcac ccacccctgc ttccccacca ccacacatag 25020
tagcatataa tgtgctcatt tttgtaaaac ttggaagtgt tccctcatca cacaccactc 25080
ttgcagtgaa ggaacaagtg ttttttgaca tgtggagtgg ggccttctgg aatgcttggt 25140
gcaggtggcg tgaagcctgc ccctggccgg ctctattcag cagccttccc tactgctgac 25200
tgggctcagt ggaccagcag ggctggccgt gccccagctg tgaggggcat gtgtgctctt 25260
ggtgggcaag ggcaacccag ttttctgcgc ctcttttaaa atgatacaga tttttggctt 25320
taaacttcag agtcctagga caaagccctg ccccagtgcc ttagctgtgg gtttaagaag 25380
aggttgaagg gtttgaagct agctctgaaa agtcctcagc tttgaagggt tatagggtga 25440
ggacaaaact tgtttcacct cttaattttg agtttttaaa cattcctttt ttgggcatgt 25500
ctttaactta aagggaattt tctggttgat tgttatacgg tcccctccat cagtttccaa 25560
ggtagtttta ttttttaccc aagggtatag tgagggcttt cttttagtaa gaaataatgg 25620
tagtgtgact gcttggtttg tggtatacat tttaaggcaa ccactctttc tttcaggtac 25680
agatatttgg cagctttagt acaggtcttt atcttccaac taggtgagta ccagactgca 25740
tggcatgggc tagtgggggg ctgggatggt gtctatgcaa tattaagggc tacaaataga 25800
ttctttgtaa ttgagtctaa ggcgagaaat gccagctaaa ggaaaagact gtggttacag 25860
agggaaattg gcagaaagat ttaatttagt gttatgatga attcattgct ttgcattttt 25920
cctctcacac ttaatttgtt ggggtgcaaa aatgcttcat gctggaaata tgaagaagac 25980
aggtgggagg actgtgggaa gtaaacgcaa tagaagacat tctgctgata ttttaggaca 26040
tgtgtttgaa aaattgatct tatgttttga tgaagattca agcaaaattc tctttaaata 26100
gtattttcta agtattttta cctgatagga aaatgtcaaa caagtttgca ttctaaaata 26160
caaactagta ttttctcatt aaggattctt gatagccaaa taaatttcct gtgcactgtc 26220
tcattaaaag cttaccttct attaacccac tgctagttag catttggagg ccgaagaggc 26280
tataatctca ggatttgggg gttgacatta gcagggccag tgggtaattg aacaggtttg 26340
ggtatccagg aatctctggg tccgcaggag tgatccagcg taggcagtgc cggagtaggt 26400
gctgggagag cggggcctca gcctggtttg ggggcaggca ttttcatttg aatcccctca 26460
catacctagt gctgttggga gaatgattta accttcttgc tttccatctt atgctacaaa 26520
tatggaagtc ttcccttaag ttcagcgagg acttgctgta gttcatgaac tgcacttcac 26580
ctccttaggg gccataggct agtgggattg tgtcttggcc tttgtgggag acacaggcac 26640
atgtgccttg gtgcttatcc tccccacacg agtgtgtagg ctgtggcgag gggagcagtg 26700
gctgacgtgc gttttcttct gtcagcgaca tagacctggt ggtcttcggg aaatgggagc 26760
gtcctccttt acagctgctg gagcaagccc tgcggaagca caacgtggct gagccgtgtt 26820
ccatcaaagt ccttgacaag gctacggtga gtgcctggct ttggcccctc tgaccgggca 26880
ggagccttgt cacatcccag gtggtcacag gatacgcctg cgtcacgagc ttgtggtatt 26940
ttacacagtt attggctaca gttttgaaga ttaatctgct tctggtatag acatgtgttt 27000
tatgtttttg tttcatagtc gtgatcacca actgagaaca tgtttagtga cagtctgaac 27060
ttttgggact tgtgagccca ttaaactgtt cttggaatga aaatatatga ttgtgtctac 27120
ttgtgttagg atgaatagga aaggagagtc atctgaaacc ggacactgac attcaggtgc 27180
tgcccattat ggagagtgtg gctcaatgat taaaccatgg tttttatgat taccatttgc 27240
tatgttatgt taaagaggaa caacttagct gttcctttcg tggttccaaa aaatatacat 27300
atatgaaaag ccttttatct ttgggggaag tttgaagatg agactgtttc tggtgtgtac 27360
ttgctaaggt ttatgtcagt tcaagattat aagcccccca gggactatga ggtacttgcc 27420
tgttgtatga cagttcttag ctcacctgtg cgaccggcta gcatttcatt tttaaatttg 27480
tgtgtcaact tgtgtgtgat tcacatcctt atagtgttta gcagaatgta agttaaggca 27540
ggagcttcct cctgcctgtg tggtgatagg ggagggggca ttcacatgtt tctcattgtc 27600
aggtgctttt gattgaggct gggggcaagt tttaaaacat gatatatgca ctgaaaagtg 27660
cacatgtacc aggtgcacct cttggtgaga gttaacgaag tgcacatgct catgtcactg 27720
tcatgtggac cagagcgagc aggcagcacc agaggttccc tccaggccca ggttccagaa 27780
ggggctgttg gctcttctca ttagcacgag acaagccctg gccggccact ttctcaaatg 27840
cttacgggcc ttattgcact tagctctccc agccactctc atcagcagat gctgttgctg 27900
ttcacatttt acaggtgagg aaactgagat gcggagaggt gaggtcatta gcccaaggtg 27960
ggtcagcggc atagtccagg ccgctgttgt ctgctgctcc tctgtgtgtg ccaaggggca 28020
gcggggaggt gggtgggaat cctgaccagg cgaccacctt tggagtagag gaactaaggc 28080
gcggctgtcc tgaggccaca cagtaggttg agcagttaca gtaactgctt agtcccagtg 28140
acctcgttac tgtcgcatat tggctactaa gtatcttttc ctctgttacc tgagggccag 28200
tgtagactgt agggagagcc tggagcctgc cactgctcat ttctggggag cactgtgcag 28260
ccggccagtc atgggcacaa gagacccagg gcgagggctg agtttaaggt gaaatcttgt 28320
ctatttggaa caacaaccca aaactgtgtt acagtgttaa ctcctcacct ccaggatttg 28380
gggttcctgc cgtgagtgag tgtgtgcaag agtagggcag gagagtgcca ggagtgattg 28440
tgggaaggag tctatgagat ggaaaggaag ctgcttccta aactgtgggt gtcagggagg 28500
catagccatt gagtgttggc ttcttccaaa gcagtttctg atgagttctt tgggaaagta 28560
tttctttctc tgccttctta agaacatact ggcctcaggg cttaccctgc ctggtggtcg 28620
cagtggtgtc caggtgactc tggccccact ggcatgtcct cacacgctga gtccttggtt 28680
ggttgccctc aagtgtagac attaaagccc agaataggtg tgtactgaat gcactgtccc 28740
tacgttgcct atcactggca tttgaacttt tcgttagaca ctgattgttt tggttaaagg 28800
aattcctttt tttaatcctt caaggctgaa ggaaacaaaa cattgccttt tcttctggaa 28860
gaattcagtt ttactggtgg ggtggagggt ggggcatgag tgtggtctgg acagttgctc 28920
aggcagattt tgaatgccat tcggtgacag ttcttgttgg tgagaatatt tctaaaatag 28980
ccttttattt gctgaatttt ttaggggaaa aattttttta gtaaagttgt cttaaagagt 29040
gaaaacccaa agtagagaaa caatatcagt ataacataca atttaaaaaa tggcttcgaa 29100
gttacattaa atgatttcaa aaattctgcc aaataaaagt ctggggccaa gcacctctct 29160
ccatcccagc acatagggtg ggcgtggcag agactaactc ctgttccctg ttggctccct 29220
cccctcacgt ctctttgatg cttggtcacc tctggtgctg atccagggct acaggggctg 29280
ggcagaatgt gggtcctgct gtgaggggct ggggcctggg agtcgtcctg ggttcaggga 29340
ctactgatgc tgacagtgtt ctctgacccc ctttcattac taagaaaaaa caccaaacct 29400
ctgtacagct ttggcagcat tttgatgcct ggctgtggag agtcctgcat gttaaagcag 29460
tttttaaaat gaaatcttta caggtaccaa taataaagct cacagatcag gagactgaag 29520
tgaaagttga catcagcttt aacatggaga cgggcgtccg ggcagcggag ttcatcaaga 29580
attacatgaa ggtactgtgc ttggtgaccc agcgcggcga gagtgcagga ctggagtgct 29640
tgtgcttggt ggcatcctac gatgtttaca gctgtcagct gcacacacaa gtctttcgta 29700
acacagacta cacttacatt atttctccta caatattatt tctagagata ctttgaaatt 29760
acatagctgt ttttaaaatt tgcttttcct gagtaaccat tttataaagt tgacaattat 29820
tttagagagc tttgttaaaa tgttctttct agttattaca gactttgctt ctagctcagt 29880
gtgcctcatt cgcaggtttt acccaggtgg aagttgataa atcatgaggt gccttaaata 29940
tactcacttt gggaggtctc agtgcctgag gatgggcaga gagacttggt tgagctgaca 30000
tgtttgggac tctgaccatg tgcctggtct taaacgggtg gtcatgacct cctgttacag 30060
tagaggccgt gcagtcctta gcaggggcag acgcacctcc gggtggtcgt gacctcctgt 30120
tgcagtagag gctgttgcaa tccttagcag gggcaaatcc acccctgcaa tctggtccca 30180
tcttgttcca ttttcaaggg ccttgctctt caggttcccc cttccccctt gtcatctggt 30240
ctgagggagc atgtccaccc caagcgcaac acgaacagca gcagccaggc tttccctccc 30300
tcctgccatc tcctgccgct ctgccttcct tgccagcctc actctgctct cctgctccgg 30360
aggcccccac tgtcctcatg gcctgtgtag caagcacata aacactccag tgaacgcgct 30420
ggtctcttcc tgagttcctt tgtgcctgtg gactcgtcat ggtaggggtg cacccctgct 30480
gagtcgtaac ccagggagag ctccacagtc tcgattttca caagcccctc aggaaattaa 30540
ttcttagcgt cccccaacca aagtttgaga cttaatgact gagagccttc agatgggcaa 30600
gaggatcgag gaaactttcc tttctgtctt gtgtgatttg ctatgtgaaa tctctttgaa 30660
agtatggtaa ttactcagta aatctttttc ttttggaatt tacagaaata ttcattgctg 30720
ccttacttga ttttagtatt gaaacagttc cttctgcaga gggacctgaa tgaagttttt 30780
acaggtggaa ttagctcata cagcctaatt ttaatggcca ttagctttct acaggtatgt 30840
atgctttctt gagactgttt ctgttgagac atgtgtaaga gtagactctt ccaaccagtt 30900
gcctagtggg ttccagcagc ctttgctctc cttttactgt attgtttcaa tttggtagag 30960
gctgatttct gattcttaca atcaaaccct cttgattaat gcacctttct ggatgctcat 31020
tttgtactgg gtgtaactgt tggtgcaggg gtgcccgtct ggttctgtga gtccagtgca 31080
catcagtcca agctcaggga attctctgta ttcagaaatg tccatttcat ggtaaacaat 31140
aaacatttct tggtgcttgt ctgtgattta tattgaaaaa aatttgtctc agaataaagt 31200
tgagtaccac atatgagaaa aggatttaca agagagcttt ctcagactga tgaaacatca 31260
ttattttgtc ttaaattata tgtggtcctt attttgctga gtaacatgga aaatctatca 31320
atagaaaacc tacgtgtttt aaaaagtatt gttaaatgct gtgatgtatt gataaactgt 31380
aattatactt tttaaacata taaaatcatc tctaattgga acagtaatta ttccgtttat 31440
attttcttga gtgaagaatt ctgtccttta caaaatcttg cctatataat ttagccgcac 31500
ggctgtattt ctccagtgtt taccattaat ttggtctttg tgattgtgct gagattaccg 31560
aatctgtcca tgatttggta atgttctcac tgtcatgaat gctatgatag tagaatcact 31620
gggtaactac ctgtgatgat cgcagcttcc ttggtctgtc tctgccaaga tgctttaaaa 31680
gtagtgaaaa tggaattcca tgtctgtttt cttacagttc tagtcacact gtcctgtctt 31740
cactttcccc tctgagatgt ggcccttata tatagccttt cttccatagt ttttggacat 31800
tattttgaat taaacatggg cctctgttct ttactgatat actcctgact tgcactattt 31860
tcatggcctt gtagtaacaa cagctactta atactttgat catgcatgtg ccatgtgcca 31920
ggcctgggtc cagggcctcc tccaccccct cagggggtcc tttcagtgat cctgtgaccc 31980
cacaggaggc caccacagca tgagtgggat tcctgtgttc actgccacat ccctgtgcct 32040
tgtccagtgc ccagagcttg tcctgcctca gcggtgtgac tgtggcagca tctgagtttc 32100
ttgactaagt gaggggagga ggcccaccct ggcaccggcc aggctcttgg atatgtgatt 32160
ttggctaaaa gacaaggaat aaggaaggga ataaaggtca ggccagaatc ggaatcctcc 32220
tcttgtgtgg tggaaatatg cagagaactc cggaattctt ctgaacccta aaaacatttg 32280
tatgctttct agctgcagct cctcctggca ctctgtgtta taaatagttt caagcaccgt 32340
gcttctctga gggctttctc tcatgtgccc tcgtccatcc ctttcgagtt ggcactgtcc 32400
gatagaattc tgtgatggtg atggccactt ctgcatggtc cggcaagggg cagggcgcca 32460
catgtggcta ctgagtattg cagtgtggct ggtgagagca acaagctgga tttttaatta 32520
atttgtttta attcatttaa atagacatgt gggcaatgca ggtctggaca gctgagaatt 32580
atgaccctca ggaggtgtgg tggacagtgg tttacttccg aacaagccca gtgcctgctt 32640
ttgaagacga tatggcactg aactgagagt ggtgctcatc tgtgtgacaa gcaggatgga 32700
agcttgctat aaatattgtg atataatgct aatgaccttt acacagctaa aatcaatcct 32760
ttcacttttc cggttttatg tgatactgcc atactagtca gtctaacact gacccctgtt 32820
ggttgtgctt cagcataacg aaattaggat gacgagaatc tgaaattaca tctaccatcc 32880
aggtgactaa gttatgcaga atatagtcca acttatttgc ccatatttgg ttaatcagat 32940
atctgtgttt gcaggaagtt tgctgtatgg attaccaatt tcaaaaatca aactacacta 33000
aaattcagat gagtccgttg tgttcctttt gaacactcct cgttgaagag gctgctgttc 33060
aggcttcctc gtggtgctgg tgagtgagcg agtgccactc actggtattg ccttgaagag 33120
gctgctggac agcagacttc gtcgcgtgct attttcttta gaacatgcca tgaatccata 33180
caaattgtgg gtgcattgct tttacagttg catccaagaa ttgatgcccg gagagctgat 33240
gaaaaccttg gaatgcttct tgtagaattt tttgaactct atgggagaaa ttttaattac 33300
ttgaaaaccg gtattagaat caaagaagga ggtgcctata tcgccaaaga ggagatcatg 33360
aaagccatga ccagcgggta cagaccgtcg atgctgtgca ttgaggaccc cctgctgcca 33420
ggtaagggcg ccctgatctc cactgctgag agctgggcca gcctcgggga cgtgctggtg 33480
acagggcctg tgttggggct ctgagagccc cgggcagttc atttgctctt gatgcaggtt 33540
tctcttatac taaccagtta ataatcacac tttgagaaat ccttatttaa tgcttctaat 33600
taacttttgt ctttctaact gtttacattc tataataaag aagaattaag gaaaatcttt 33660
tctttttctg attattgaag tataacatat ccaccctaaa ccatttgttt ctctgaagta 33720
tgtaatatag aaaaaccatg gatgccataa tcccctttta tttggacatg tatttctcca 33780
ctttttccct atatggatat taatgtttat tattgttatc ttgttgaaca catcccacaa 33840
cgcaaacacg tttgtcactt ggcttttgac ttaacgctta cccttgaccc tttcctatgt 33900
gtgtaggttg tgttttgtcg tgaggattgc cgcattgaag agtctaaggc tgggctagag 33960
gtttcccggt tttattccca ttggcgtatt caggggtatt tatgtcctca ttcctttggt 34020
gacagtcttt taaaatcttt gccaatctga taaaaccatg tgttaacgct tttaaattta 34080
tatttcttta atgattagtg gggttaaaca cattgctatt tatgaattcc acaaattttg 34140
attgagcgtc tgttaggtga gataccattc ttactgttgg tgataaaatc gttggcggac 34200
gggtgacaga acaggtggtg gagagcccag ctccaggcgc gtgtccctgg gccttctcct 34260
ctgtgtggct ctgtgtgctg tccgcccggt tgctggctgc cctcctctgc tgtgtgcaag 34320
gcctgtgtgt gtcggggaag cctttcttgt cacacatgtc atactttttc caatttgttt 34380
tttgcatttg tattttttta ttcagctcct atacatttaa aaaaacacct cagatttaat 34440
ggttgttttt gttttatggc ttctgggatg tgagctttat ttatttccta aagatcgtct 34500
caaggaaaac acattggctg atgtgttttg ttgttgttta tagatggcat gatttgtgca 34560
ggctcttgag tggttttctt ggtagcacgg tatggcagtg tatcatccat ttttgtccgt 34620
tggatgagtc acattggaga cattggcatt gtcttcaagt gtctgctgaa atgtactcaa 34680
aaaacaaaga cccacataat cgttgagtta taatataaat ctagaaaaga taaaactcca 34740
gtacttagaa catatatcct ttaaaagaaa tccacactta acctgattgt gaagaatgag 34800
ttgtttgtag attaaaatta gaaacagtgc ttttcttatg aaaattaagc ttctcctgac 34860
tggcttcctt ggtgactgct gtgacagatt cctttgattt gctgtcccag ttttccacac 34920
gtgagaattc acattccatt ctaaaggatt tacttcctgt aggttccatt agcgttgact 34980
gagttgtgat gcacttgggg tgagctgccc ttctacctgc cctgttgggg cactgtgagg 35040
cctcctgatt gtcagatcag cgatcacagt gggtcggtgc tgctggtctg cacaatggta 35100
gtctttggct tcctcatgtt tctgccacct ggagaggtgg ctttttgtgg gctgtcactc 35160
cgtctgtgaa tggcagccgc ctccgtgagg tgggccatga gcacaggggc actgatgatg 35220
cagaccagtc ctctcggcac tcacagactg tgccctgtgc atggtgattg acagggcctt 35280
tgccagtgcc aagtgccacc cgtgcccatt gtgttcgcct gtctgggctt tgctggtagg 35340
gtctggaaga gtttcagtgg tgagggcctg cttcagagtc acttgtatga gaagatccaa 35400
aacatgtgga cgatggtgtg catgtgggga gggtctgaca tagccttttt gctgcaggga 35460
atgacgttgg ccggagctcc tatggcgcca tgcaggtgaa gcaggtcttc gattatgcct 35520
acatagtgct cagccatgct gtgtcaccgc tggccaggtc ctatccaaac agagacgccg 35580
aaaggtaatg ggttgtgtgt ctgcgtctgg gctcagcgtg cctgtgggat ggtacttatc 35640
cctttcctgt gtcatttacc tccatgaaat ttatgaaggg atgttctgcc gtatttcagt 35700
agaatctaga tatgttggtg aaggaaggcc ttctaggaat atgggatggc tgtgtgggat 35760
tcatccatgg ttgagagttg aaaatttctt tcttggagat ttgacatttt cttcagggtc 35820
ttttgttttg gggaggtgat ttctggcttt taaaattcag tccctaccat cttctcttat 35880
gtacactcgt cccttgttct acattttggg gcatttttac agtcccaaaa tgtagtcaga 35940
agtatttact tctcacccag atcattctgt ggtagtggaa agggtggtat ttgaaggggt 36000
gggagatgag ataggaatgg gaaggaagag taacgtggtc gtcaagagtg gaattcgaaa 36060
cagtttgata gatctgttct gtggtggatg atggaataaa caggtttcga ggcctggctc 36120
agcagccgct gcaggtgctg gtggtgctgg agctctgtgt gttcctgagc cgctgtctgc 36180
tcggtgtttt caggcggagc tctgggcccc atgtagggca ctcgtctcgg taccgtctcc 36240
attctcgtcc gtgcagtggg aagtgaaatg tcagcactgt atgatcatcg tgggtgggaa 36300
ggccccgctc ccctacttgg agctgcattt cacagtggtc ttctgtaggt agatgtactg 36360
cgatcccagg gtatgcttga gctgaatcat taaaagtcag agatatttgt caacgtattt 36420
tagctccttt cctactgtcc ttcacctagc gagatgatct gttaggggta taaggtagct 36480
gttcgagagg ggttctcagc tccctgacac ctgttgtact ctgttgatct ccaacaatgt 36540
ccctttgcag tactttagga agaatcatca aagtaactca ggaggtgatt gactaccgga 36600
ggtggatcaa agagaagtgg ggcagcaaag cccacccgtc gccaggcatg ggtgagagat 36660
taattcattt gtgttcatcc taaccactgg ctggcatgtt catgcagaag tgtctctatt 36720
cctttgtggt aaattggtca aattaagaaa atagctagtt tttctgatga gcattaatta 36780
agaagacaat aagatctaga gcagcactgt ccagtagaag caatataatg catgccacac 36840
atagaatttc aaagtttcta ggctgtgtca aatgtgaaaa gaaacaggtg aaataatttt 36900
gatagatttt attccactca agtcaaaata ttaacatttc aacatgtaat caacataaaa 36960
ataattaaga tattttatag ctgtttcttg tactgtctga aatccggtgt gtatttattc 37020
gtacttatag tacatcctaa ttaggatgct aaattttcgt aaaaaatact tgatctatat 37080
ttagatttta gaaagttcac agttgaagat gatttgcata cccaagttat tacaaacatg 37140
tttaatgttt tccaacaact aattgaatgt aatttttaaa attaaattag gcaaaaccta 37200
atgttgggtt tgttagtcac attagcagcg ttcccggctc agcagagccc gtgactgatg 37260
ctgccggggc ggctccacgc cgcagttctc aggagttatt aaccaaggct ttttccctcc 37320
acagacagca ggatcaagat caaagagcga atagccacat gcaatgggga gcagacgcag 37380
aaccgagagc ccgagtctcc ctatggccag cgcttgactt tgtcgctgtc cagcccccag 37440
ctcctgtctt caggctcctc ggcctcttct gtgtcttcac tttctgggag tgacgttgta 37500
agtgccctcc cctcctccgt gtgtctgttg gacagtttgt gtctctggta aatgtccata 37560
gccgcgagct taaaatctcc cccttggttt tgctcaggtt ttgtttcctt gtatgtgtgt 37620
ggaggtgggt ggggggcagc cccgtgatgt gggcaccagg cttcctttcc cctgccgtga 37680
accttcagaa cctgtctgtg cgactcatgc ggctgtcgag ggcagtaatc ctctaaatgg 37740
ttgaactaca gtggacttcc ttgagtagtt tttaaaaatt tatttgaaga ttaaaaaaaa 37800
aattaaatcc aagtatctct tctgtatttc ctttaacatt ctttttcagt tgtgatgaaa 37860
ttacttgaag gaagcctggg taggtttggg ctgcctgttc agaagttaga cttaatttga 37920
ataacctttc atagccagcc tggatgcagg cgtttctttt catagcttta aggaagtagt 37980
agtgcacctt tgtggtacag ctgtcctttt tgttttttgt accgggttca aggattcaga 38040
cacaccgccc tgcacaacgc ccagtgttta ccagttcagt ctgcaagcgc cagctcctct 38100
catggccggc ttacccaccg ccttgccaat gcccagtggc aaacctcagc ccaccacttc 38160
cagaacactg atcatgacaa ccaacaatca ggtacgtggc cctctggcac ccttcccgct 38220
ggtggcccct gggaacagca tccgagctgt gatatgcact agaggagatt gatggtcctt 38280
tgaattagaa gagtaacttt ttgagtattt ggccattggt gtgttgttct aggaaatcct 38340
ctcttttttg tggtgttgag gtcccccatg tatagtttca gcagcgagga cactgtggtt 38400
cttgagtgct gccgtggctt ttcacggggg ccaggttgac tgccttcctg caagtttcct 38460
cactgcccca gcatgagact gctgtcgagg gtcatcttga gagagcgact cagtcacgac 38520
ccacttagct gggcgccaag ccgtgccaga cacttgtccc tacttcctct cagaatctca 38580
atgaaagttt taatgtgaac ttattagact tttttcatgt ttgaaattag gcataatttc 38640
taaggctttt tctgttggaa tatactgttt ttaaaattta gataaaatta gaaatctaaa 38700
ggataatttt ataaatacta aattttgtat ctacttgcga ttatacatca cttgaatatg 38760
tgtgggtata aaacccaaca tgttaattga cttaaaacca ttttctgaaa tgtggggtat 38820
aatttgagca taaagctatg taggtacatg caaaagtgtt ttgactcatt tcttggagtt 38880
ttgcactctg ctctggggaa gacattctca caggatccac cgtgattctg gcggagcttc 38940
tgggatgctg gctctgtaat gacccacaga gctgatgagc agagccatgg cccagccgga 39000
caccgtaacg tgtctaattg cagcataagt gtaaaattca ggggcaatta tttacactct 39060
taaaatgaat tataccacag ataaacttgg tcgccttttt atggtcatca cagtggccct 39120
gacgtcctgg ccatgtgtca caaaggtgtt tgttttaacc acccacaagc cttggggccc 39180
ttgagagccc agtgcggctg ctgagctaca gagccacact ctgcggctgc ttgtgtggtt 39240
cgagtgtgaa gtccagggac gctgagggtt tataggtttt tatctaagaa gactcttggc 39300
cacagtcaat ctccagaggt tgttggggta aatgcacggg atgccaagat gcaaccaggt 39360
cagtattgca agtctgagaa aaggggttct cgttagcgca cttctgctgc tgacagtaac 39420
gggtgatgct gacatagaag cagcctggga cctggacagc aggcaaggaa ggaactgcca 39480
gccgtcccac ggcctctcag gccaccagtt gggccagcct tgggctgtga cccctgagtt 39540
cagcgtgtga gtagggggtt caccacgggg gtgacggttg ttcttctgat gactctaatg 39600
tcttgatcgt ttgatcttca atgagtttca aactttatga cttggattac tgggcatact 39660
ttatatgcca gttgctgttt tagaatacga agtatttcca attcaaagca caatattgtt 39720
aggtaatagt aaaacagact gctctatgga gcccacatgc aactgtgcca tttatcagct 39780
gccctttggt ggtgctgagc ttagaagccg gatggttttc ctctgattgc tttggtaccc 39840
atggccgtct ctcattttgt tcctagacca ggtttactat acctccaccg accctagggg 39900
ttgctcctgt tccttgcaga caagctggtg tagaaggaac tgcgtctttg aaagccgtcc 39960
accacatgtc ttccccggcc attccctcag cgtcccccaa cccgctctcg agccctcatc 40020
tgtatcataa ggtatagctc tgtcctggtg cattcaccta cctgttcaag ctgccatgtg 40080
agaggcggtg ctaaatgttt tctcctccag agagaattcc agagagatca tttgaaaacg 40140
gaatttgctt tgttgtcatt cagcctgttt gcttgtcttt ccaaacaaaa cttaaaaaag 40200
ttaaattatt ttaagatgta atatatagtt taattggttg ccacaaacat ctcttaattc 40260
ctctgttgaa ctgattagca taaaactgaa gtttgaaata aggctcaaaa tgaagacttt 40320
tcccatttac ataattcatt tatatgctaa ataccttggt tttcaagaag caaatgataa 40380
aaccaagagc agatcttgcc atgatgtccc gtgtatgctg ctgtcattcc cacgttgcct 40440
gatccccgcc tggggcagga gcaagcgtca gggctggcag agctgtgtgc tgggcctcag 40500
cagggccctg gcatgcgtgc ccttgtggct cctctcaagt ccagctgtgt gcatggagga 40560
aacaggtcac gttaagtctc tatattcttg aagtacctga atgattggga gagccatggc 40620
gaggatcttc caggtcagcc cccgtcgtgt gtgatgttcc ttgggctctg cggatgctcg 40680
gtgctttcat cggtgtccac acctctttat tccgctcctc ctttgcttgt ctaatcctat 40740
tttgccagta agttttttat tcttgaggct ttgttggccc tgtgttgtat gatgattgtt 40800
tttaggagtt aagtaataga acatttcctc ttggatttat ccatccccga tagacacatt 40860
cagggtgaaa gaacaacttc gcacaccggc ctcttctttg cattttggct ttgctttccc 40920
agtctcctcc tgctgttttt cttgctctga gactttcctg aagccggcgt gtgttccctc 40980
tcagtctgct tggccgcgac tttgcagtgc agggaatgtg ctttgggtgt agcccaagca 41040
caggctgctg catgctggga tcgacaggct gctgagggcg agagcgccag gtcctggcac 41100
gtgtgacttg cttggttctt tctagaaggt cacagctggg ggaagaacat gacagggacc 41160
ttcttacttc tgtttttttg gagacagaat ctcactccat cacccaggct ggagtgcagt 41220
ggtgtgatct cagctcactg caacctccgc ctcccgggtt caagcaattc ttgtgcctca 41280
gcttcttgag tagctggaat tacaggtgtg tgccaccaca cccagccaat ttttgtattt 41340
ttagtagaga cggggtttca ccatgttggt caggctggtc tcaagctcct gacctcaagt 41400
gacatgcctg cctcggcctc ccaaagtggt ggaattacag gtgcaagcca ttggcacctg 41460
gctagggacc ttcttatttc tatggataag tggaacaagt tagaagtgag gttctgctga 41520
atttgtgtgg tttgatcctg gtacatggtt cttgccttta gtcattcacg gaatgggaag 41580
aatgcttttc tctcagatgg aggagttggg aagtcccaga gggcaggtgt ccatccctgc 41640
tctctatgta acatcacgtc ggtgcttagt gtggtcactg cccgaggacg tgggcattgt 41700
gcctgctgtc tggctccaac actgctgtct ctctctttct ccagcagcac aacggcatga 41760
aactgtccat gaagggctct cacggccaca cccaaggcgg cggctacagc tctgtgggta 41820
gcggaggtgt gcggccccct gtgggcaaca ggggacacca ccagtataac cgcaccggct 41880
ggaggaggaa aaaacacaca cacacacggg acagtctgcc cgtgagcctc agcagataat 41940
ggctcctggc tgcgtcagcc tcccccaccc ctctgcagac tgccccgcgg cctcggccac 42000
cggcagggga accgagacca gcaccccgca cgtcagccgg gctcgcggca cgcccgccgc 42060
tgatcactct gcatgtttct tcgtgtggtg gtcgcgtcca tcttcaagaa cagctcgttg 42120
tgctcatctg tgaagcctta ttaaacgtgg acgttgtttt ctgccttccc aggattcttc 42180
cttcagtgct gaggcaggtc gggctcagga actgcaggga cgtgaacatg cgcttgcggt 42240
ttgaggtagc cgtgtctgtt ccttcgcggt ttgctatttt catttcctgt tcgtcaaagc 42300
agcagaggag atcaaacccc gttcgtgtgt ctttcctcca cggataagct tgggaggtca 42360
ttgttttact gccctcacat tttgtttgaa atttcagaac tgtttttcta tgtaaatatt 42420
gaaaacttat gatttgtgca ataactcaga tattttttat ttaatttcct attttcacat 42480
aagttatatt taagggagga gggaattttt tttaaacaag cttaggtcct ttcccgagct 42540
gcattttcta agttgggtca tcgtgtcggc tggttgtctg acgagcatcg ttacaaacac 42600
catgatgagg ggtttggggt tttattttga tgtcttttct tttggtcgga agtgagtgaa 42660
ggagccaggt cgccctgaag gttttccaaa gggcttggct ccagagccac ctggcagact 42720
gcccgtggcc ctgctgtcgg gccccaggcc gttgtcctgc tctgaccaca gagttttaat 42780
gttttggttt tcacttcttt taaactggac aacaaatcca gcatttcaag tgccagaagt 42840
ataactttct aaggagagaa gggttgtcac attataaaat ctttaggaaa atgtgaactg 42900
gaaaacgctt cggtcagttt tagtgacata gcctgtgatg atgggtctgg tgactattat 42960
tgcggaccgt ggtacccagt tttaggaatg tggagaaagg aattctgttg attccgttga 43020
ggaatctgta gcgtatgcat tcgttctgtt aagagcaaat ctaggagaag tgcttcagct 43080
gcccagtgcg ccgtggggag tgttttaacg gatcgtgtcg caggagagca cagcccagcg 43140
ttggggccgg gaccgctggc gcccgacgtc ggaagcatac aggtatacta tgcaagtgta 43200
ttctgccaca acaaccactg tctttgttac ctttttttga acaagaatat atccatcctg 43260
cctaaccctg agtttttgga gcaccacagt tgtcctggga gttggttgca tcttgtaggc 43320
catctgactt cctgttttta aaacgggggt ctggtcttgc taaacactac aggtaggttg 43380
gtctttgaag tccactagtg gagaatgtca agacaagata cttattacca tgacatctga 43440
tgcatgtgca gcagtgggga gttctagatt gatctctgaa tgtgatcgac gcccagcaag 43500
gacaagcttt aaaatgtctg cggtctgccc ttttgaagca ggactggctc actctgtcat 43560
tgggagctgt cagctgcgac tgcaggttct ctaggaggca ttccagaata gagtagcaca 43620
ctgtgtctgc agttctcgat gaccgaaagt tatcaaaaat atttaaaata tttaaattgt 43680
gaacctattg ataaagaata tttataaaaa ctgatctgta ggcctgtact aatctctacg 43740
cattagcaat attgactgta aacccacatt aaggaaacca ctacgggtct ggcagtgcgt 43800
gtcccgtggg gtgtgcattt taaaactcga ttcatagaca caggtaccat gttccatttc 43860
cgtcatggtg aagcaaatga attggcctgg ctaccactgt ggtcgcgtgc tacaggtttg 43920
acaaaaagat atcatgtttc gatttttttg tgtgtggaca acaatatgga agctaaaatt 43980
gacatatttt tatgtaaagt ttttctattc tttgattttt aataaacttt ggaaaccagt 44040
tt 44042
<210> 12
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 12
agggtagatg tgtttaact 19
<210> 13
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 13
cagcctaaac ttagtgg 17
<210> 14
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 14
aagccctcaa tgtaaaacac 20
<210> 15
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 15
aatagcaagt agaggagag 19
<210> 16
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 16
aaataaggat actggcga 18
<210> 17
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 17
gagggaacac ataataaaag 20
<210> 18
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 18
gtaatacctc tcacattc 18
<210> 19
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 19
agtaacacca atctcattg 19
<210> 20
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 20
gtgacagtat tcaatgatc 19
<210> 21
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 21
cagttccgta tcaccaac 18
<210> 22
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 22
aagtctaact caaagccatc 20
<210> 23
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 23
aggcttccat tttattgaa 19
<210> 24
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 24
ttttagaaaa cgaggcta 18
<210> 25
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 25
gtattcttat tcttgct 17
<210> 26
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 26
attattccca cagtaaga 18
<210> 27
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 27
aacaacaaac aggatgggc 19
<210> 28
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 28
atatccacaa tattctgat 19
<210> 29
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 29
aaagaaataa tgtcgtctgg 20
<210> 30
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 30
ccagagtaaa caaatcc 17
<210> 31
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 31
attcaacatt tttagtcacc 20
<210> 32
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 32
tttggtaatt ctttttttag 20
<210> 33
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 33
caatgaggaa acaagagtca 20
<210> 34
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 34
ttcaaaataa tgtgggaggt 20
<210> 35
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 35
ggatatttga tacggcaaat 20
<210> 36
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 36
ctataagaag caaaccc 17
<210> 37
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 37
atataattca cgtttcactt 20
<210> 38
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 38
aatgattcac atgaaggtta 20
<210> 39
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 39
gttaggattt tgctatg 17
<210> 40
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 40
gtacaaatat caaccgtat 19
<210> 41
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 41
cacactattt caagatgcta 20
<210> 42
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 42
cacctataca atggagtatt 20
<210> 43
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 43
atcatacgtc attagagaac 20
<210> 44
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 44
cagaacagat actttgcca 19
<210> 45
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 45
aagaatggtt ggttaaggg 19
<210> 46
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 46
agaattggta aactggactg 20
<210> 47
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 47
agaattatat tggctgg 17
<210> 48
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 48
cctaaaccag acagaaaaga 20
<210> 49
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 49
accaattaga gcagaaatc 19
<210> 50
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 50
ttctaaataa cagatgggtc 20
<210> 51
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 51
tttataattt ttttccatct 20
<210> 52
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 52
gcaaatatca gattaacctc 20
<210> 53
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 53
aacggtatgg cagaagacaa 20
<210> 54
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 54
ttcaaccttt actgcat 17
<210> 55
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 55
actgataaag ggcatttcaa 20
<210> 56
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 56
cagtaggaat gtggctt 17
<210> 57
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 57
ttttatggca gggtttcac 19
<210> 58
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 58
tcactgttaa acctcac 17
<210> 59
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 59
caattttcta attcaatggt 20
<210> 60
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 60
aagatataat tcacccact 19
<210> 61
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 61
gccacataaa ggataaagt 19
<210> 62
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 62
cccattagaa gtaaggtga 19
<210> 63
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 63
atgtaaatta aaacttccc 19
<210> 64
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 64
tgagagcata aaagtacgga 20
<210> 65
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 65
ttcacaacag gtaaaggg 18
<210> 66
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 66
tgcattccta agtaacataa 20
<210> 67
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 67
agagaaaagt gatgagggaa 20
<210> 68
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 68
atacggatca ccagctaaa 19
<210> 69
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 69
catgttatgc acagaagat 19
<210> 70
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 70
cgctgaagaa ctaagtatta 20
<210> 71
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 71
caaacagatg gtggtgata 19
<210> 72
<211> 16
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 72
agtagccatt aggatg 16
<210> 73
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 73
atacacaggc tccataata 19
<210> 74
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 74
gatttttgta tagtccacaa 20
<210> 75
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 75
gcatctataa aaaagggaca 20
<210> 76
<211> 15
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 76
agtgcaagta tcgct 15
<210> 77
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 77
ccaaaagaat caagttcgta 20
<210> 78
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 78
cctcagacca aatttattt 19
<210> 79
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 79
ttcaacaagc atctattgta 20
<210> 80
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 80
caaaggttgt tgtactct 18
<210> 81
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 81
tcataaatct ttttccacg 19
<210> 82
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 82
cttgttacgg atttaatgtg 20
<210> 83
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 83
gctataaaaa tagaagcc 18
<210> 84
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 84
tccttagcaa actaaacat 19
<210> 85
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 85
agcaaaaggc aggtattcaa 20
<210> 86
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 86
gaatccattt acatattcac 20
<210> 87
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 87
tccagtatcc aaaacatac 19
<210> 88
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 88
agcttaaaga agaacggtt 19
<210> 89
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 89
cacaacgtgc ctacctt 17
<210> 90
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 90
ccagaatcca agaaaatgg 19
<210> 91
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 91
tcacctcgaa ctaaacaagt 20
<210> 92
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 92
gtatctttct gtactatt 18
<210> 93
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 93
gtcattctac taacaaacg 19
<210> 94
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 94
tggaaaagga agaaccatt 19
<210> 95
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 95
aatacaactc ttccgtgat 19
<210> 96
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 96
aataccctga cgagctg 17
<210> 97
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 97
tcataaaaca tgatccttgc 20
<210> 98
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 98
ctaaagcaga tccatagaa 19
<210> 99
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 99
agactataac ttttgctaca 20
<210> 100
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 100
agcaatgact tgaacatagt 20
<210> 101
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 101
ataaaacaag catacgggc 19
<210> 102
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 102
atgagatacc agcagatag 19
<210> 103
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 103
agaagaaatc ctgagtaatc 20
<210> 104
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 104
ccctaaaaag tgacgta 17
<210> 105
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 105
ttaagttaga tcacggc 17
<210> 106
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 106
gtggatacag aaagcca 17
<210> 107
<211> 16
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 107
gtatcggcag gagatt 16
<210> 108
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 108
taactaattg attccattgc 20
<210> 109
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 109
agaagaacgg aaattgcc 18
<210> 110
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 110
ataatgattt tcctatcc 18
<210> 111
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 111
atggttttgt ggagaagg 18
<210> 112
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 112
tgctgctgtg aaaagaaatg 20
<210> 113
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 113
gtgtccaatt ttttattat 19
<210> 114
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 114
gatggaatca actgtgtagt 20
<210> 115
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 115
gatggtgaca aattattct 19
<210> 116
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 116
tgcttttggg aatcttt 17
<210> 117
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 117
gatgtcctac aatgaacacg 20
<210> 118
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 118
gtacaaggac aaagtaacc 19
<210> 119
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 119
tgaaacgcct atctcta 17
<210> 120
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 120
atactattta tgcttatgga 20
<210> 121
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 121
ttgtaatcaa ggcaataagg 20
<210> 122
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 122
gaagtccaat aacgcaga 18
<210> 123
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 123
atatccaatc tctatatgtg 20
<210> 124
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 124
gccttacaca agactatatt 20
<210> 125
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 125
tgctgaattt tatgttaac 19
<210> 126
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 126
cacaagatga tgggtttaag 20
<210> 127
<211> 16
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 127
ttagtggttt gggtgc 16
<210> 128
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 128
agattgttac cttactgat 19
<210> 129
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 129
tattacaaat atcaatctcc 20
<210> 130
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 130
taccaaaagc atagagtgg 19
<210> 131
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 131
aattatcttc ccgctac 17
<210> 132
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 132
gttgggtgga ataggca 17
<210> 133
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 133
tcgatttccc gttccaa 17
<210> 134
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 134
acaacctaca cataaattgc 20
<210> 135
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 135
actataagaa ctcccaaca 19
<210> 136
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 136
gagaaaaaga gttacaagc 19
<210> 137
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 137
aactggaggg agagaagag 19
<210> 138
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 138
tttctaagag cagaggtaca 20
<210> 139
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 139
agaagtaaca agagcct 17
<210> 140
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 140
agtatcaaac cagacctc 18
<210> 141
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 141
ccacaaccga aagactt 17
<210> 142
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 142
aatacacact gcattttca 19
<210> 143
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 143
ccaggtagat agcacag 17
<210> 144
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 144
ccatgacaaa gtaacaacag 20
<210> 145
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 145
cagaatttcc tttgagtta 19
<210> 146
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 146
ccttcgcaag aaagaattga 20
<210> 147
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 147
tcatacatac acgcttct 18
<210> 148
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 148
tgcgaaaaga ttggagg 17
<210> 149
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 149
cacaggacgc ttacatgaat 20
<210> 150
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 150
gctgtttttt tttcttaac 19
<210> 151
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 151
accataagtg agtgttctt 19
<210> 152
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 152
acacaagccc atagaaacag 20
<210> 153
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 153
cagtagtaac caccaag 17
<210> 154
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 154
cctgcaaact tttatttat 19
<210> 155
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 155
acttagtaat agcagca 17
<210> 156
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 156
atgaatactc cgaagactt 19
<210> 157
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 157
aaagaaaagg atcacaagcc 20
<210> 158
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 158
agacagaaat cacctaaca 19
<210> 159
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 159
tagaacagac attattcatc 20
<210> 160
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 160
agttacacgg agcagcac 18
<210> 161
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 161
cactatacac agaacactat 20
<210> 162
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 162
agctgtctaa atacatgg 18
<210> 163
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 163
atgaacctat tttatgcttc 20
<210> 164
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 164
accatcatta acctgcgt 18
<210> 165
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 165
agtaaagtgc ccagatgt 18
<210> 166
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 166
ttccctatga aatcctcaa 19
<210> 167
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 167
cactcttcat agaatgcaac 20
<210> 168
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 168
aatgcttaat ttttctctct 20
<210> 169
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 169
ttagagacga tgcctataac 20
<210> 170
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 170
tgaatagttc ccatagatt 19
<210> 171
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 171
cagcataatt gttttcttt 19
<210> 172
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 172
atgtcattat gttttagtt 19
<210> 173
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 173
cagcagtatc tcttagaa 18
<210> 174
<211> 16
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 174
cggtaagggt tcggtg 16
<210> 175
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 175
catgaaccac attaggaac 19
<210> 176
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 176
cattcaacac acacgacaa 19
<210> 177
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 177
aagtatccaa gactcaaga 19
<210> 178
<211> 16
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 178
ccacagaaac accgag 16
<210> 179
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 179
tggaaaaggg aagggaaga 19
<210> 180
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 180
agagagtccg aagcctg 17
<210> 181
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 181
atgggaaagg taacgagc 18
<210> 182
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 182
ctatcctaca agtccgaa 18
<210> 183
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 183
cattgctttt ataatccta 19
<210> 184
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 184
ctttttaagg acaggagg 18
<210> 185
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 185
gatgaaagat aagtgagcat 20
<210> 186
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 186
gaagcctgta ataattaagc 20
<210> 187
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 187
caccctagta aagcaaac 18
<210> 188
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 188
gcaaatgtaa gccttttt 18
<210> 189
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 189
acctgacagc taccgac 17
<210> 190
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 190
aagagtgggt tgtaagc 17
<210> 191
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 191
tagtgaaaat atttggagtt 20
<210> 192
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 192
tttcagcacc ttaaaccc 18
<210> 193
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 193
ttaagggaaa ggaaacgtca 20
<210> 194
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 194
gtaggtaaag ggcaaaggaa 20
<210> 195
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 195
gtgaattaaa gccaaagc 18
<210> 196
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 196
tgtttttgta ttttagtat 19
<210> 197
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 197
gaggtttttt ttagtgaatt 20
<210> 198
<211> 17
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 198
gaggagctaa acggaca 17
<210> 199
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 199
gtttagtctt atgttctcac 20
<210> 200
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 200
caaatactga atatgcccg 19
<210> 201
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 201
accatttaaa tcgccaac 18
<210> 202
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 202
cagtaagagt agcccaacaa 20
<210> 203
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 203
taacggcaac atcaaatagc 20
<210> 204
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 204
actgagcacc aactacac 18
<210> 205
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 205
cctaatttta tgtatcacat 20
<210> 206
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 206
ctaggaatta taacaaatca 20
<210> 207
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 207
actccaaaga acatactcac 20
<210> 208
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 208
taagagaaac aatcacacca 20
<210> 209
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 209
tgtcctaaaa tatcagcag 19
<210> 210
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 210
cttttaatga gacagtgca 19
<210> 211
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 211
ttgtagcata agatggaaag 20
<210> 212
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 212
aaactgtagc caataactgt 20
<210> 213
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 213
attcatccta acacaagtag 20
<210> 214
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 214
cacgaaagga acagctaag 19
<210> 215
<211> 16
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 215
acaacaggca agtacc 16
<210> 216
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 216
gctaaacact ataaggat 18
<210> 217
<211> 18
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 217
cccgtaagca tttgagaa 18
<210> 218
<211> 20
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 218
agccaatatg cgacagtaac 20
<210> 219
<211> 20
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 219
taaccaaaac aatcagtgtc 20
<210> 220
<211> 18
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 220
aacagggaac aggagtta 18
<210> 221
<211> 17
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 221
atttatcaac ttccacc 17
<210> 222
<211> 17
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 222
cgtttaagac caggcac 17
<210> 223
<211> 20
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 223
acaaaggaac tcaggaagag 20
<210> 224
<211> 17
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 224
tcacagacaa gcaccaa 17
<210> 225
<211> 20
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 225
tactttttaa aacacgtagg 20
<210> 226
<211> 19
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 226
gcacaatcac aaagaccaa 19
<210> 227
<211> 18
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 227
tcagtaaaga acagaggc 18
<210> 228
<211> 19
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 228
catatttcca ccacacaag 19
<210> 229
<211> 16
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 229
agtaaaccac tgtcca 16
<210> 230
<211> 17
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 230
tcctctttgg cgatata 17
<210> 231
<211> 19
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 231
cataaatacc cctgaatac 19
<210> 232
<211> 17
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 232
cgattttatc accaaca 17
<210> 233
<211> 20
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 233
acaatcaggt taagtgtgga 20
<210> 234
<211> 17
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 234
gaagccaaag actacca 17
<210> 235
<211> 20
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 235
tggtagggac tgaattttaa 20
<210> 236
<211> 15
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 236
cggtagtcaa tcacc 15
<210> 237
<211> 20
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 237
ctatcaaaat tatttcacct 20
<210> 238
<211> 20
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 238
acgaaaattt agcatcctaa 20
<210> 239
<211> 15
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 239
tggtaaacac tgggc 15
<210> 240
<211> 17
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 240
gattgttggt tgtcatg 17
<210> 241
<211> 19
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 241
aattataccc cacatttca 19
<210> 242
<211> 19
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 242
tgcaattaga cacgttacg 19
<210> 243
<211> 17
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 243
ggcaaccaat taaacta 17
<210> 244
<211> 17
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 244
cagttttatg ctaatca 17
<210> 245
<211> 20
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide motif
<400> 245
gcaaaggagg agcggaataa 20
<210> 246
<211> 20
<212> ДНК
<213> Artificial sequence
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 246
aaacagaagt aagaaggtcc 20
<210> 247
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 247
tccacttatc catagaaa 18
<210> 248
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 248
gctttgacga acaggaaat 19
<210> 249
<211> 20
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 249
ttccgaccaa aagaaaagac 20
<210> 250
<211> 18
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 250
gcgacacgat ccgttaaa 18
<210> 251
<211> 15
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный мотиф
<400> 251
ccccgtttta aaaac 15
<210> 252
<211> 19
<212> РНК
<213> искусственная
<220>
<223> Human PAPD5 target RNA
<400> 252
caucaaugcu uuauaucga 19
<210> 253
<211> 19
<212> РНК
<213> искусственная
<220>
<223> Human PAPD5 target RNA
<400> 253
ggacgacacu ucaauuauu 19
<210> 254
<211> 19
<212> РНК
<213> искусственная
<220>
<223> Human PAPD5 RNA target sequence
<400> 254
gauaaaggau ggugguuca 19
<210> 255
<211> 19
<212> РНК
<213> искусственная
<220>
<223> последовательность мРНК-мишени человеческого PAPD5
<400> 255
gaauagaccu gagccuuca 19
<210> 256
<211> 19
<212> РНК
<213> искусственная
<220>
<223> последовательность мРНК-мишени человеческого PAPD7
<400> 256
ggagugacgu ugauucaga 19
<210> 257
<211> 19
<212> РНК
<213> искусственная
<220>
<223> последовательность мРНК-мишени человеческого PAPD7
<400> 257
cggaguucau caagaauua 19
<210> 258
<211> 19
<212> РНК
<213> искусственная
<220>
<223> последовательность РНК-мишени человеческого PAPD7
<400> 258
cggaguucau caagaauua 19
<210> 259
<211> 19
<212> РНК
<213> искусственная
<220>
<223> последовательность мРНК-мишени человеческого PAPD7
<400> 259
gcgaauagcc acaugcaau 19
<210> 260
<211> 58
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> кшРНК
<400> 260
ccgggccaca tatagagatt ggatactcga gtatccaatc tctatatgtg gctttttg 58
<210> 261
<211> 58
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> кшРНК
<400> 261
ccggccaaca aatctcagca tggatctcga gatccatgct gagatttgtt ggtttttg 58
<210> 262
<211> 58
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> кшРНК
<400> 262
ccggcgcctg taatcccagc actttctcga gaaagtgctg ggattacagg cgtttttg 58
<210> 263
<211> 58
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> кшРНК
<400> 263
ccgggcctgt aatcccagca ctttactcga gtaaagtgct gggattacag gctttttg 58
<210> 264
<211> 58
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> кшРНК
<400> 264
ccggcgatgt tggaaggagt tcatactcga gtatgaactc cttccaacat cgtttttg 58
<210> 265
<211> 19
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> праймер
<400> 265
ctgtgccttg ggtggcttt 19
<210> 266
<211> 24
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> праймер
<400> 266
aaggaaagaa gtcagaaggc aaaa 24
<210> 267
<211> 25
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> зонд
<400> 267
ttctttataa gggtcgatgt ccatg 25
<---

Claims (33)

1. Способ лечения или предупреждения инфекции вируса гепатита В (HBV) у субъекта, где указанный способ включает введение эффективного количества композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты и фармацевтически приемлемый носитель, где указанная молекула нуклеиновой кислоты непосредственно ингибирует экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени поли(А)-полимераза-ассоциированного доменсодержащего 5 (PAPD5);
где указанная нуклеиновая кислота-мишень содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10;
где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из 8-40 нуклеотидов в длину;
где указанная молекула нуклеиновой кислоты имеет по меньшей мере 90%-ную комплементарность указанной нуклеиновой кислоте-мишени PAPD5;
где указанная молекула нуклеиновой кислоты независимо выбрана из группы, состоящей из:
а. одноцепочечного антисмыслового олигонуклеотида;
б. молекулы миРНК (малая интерферирующая РНК); и
в. молекулы кшРНК (короткая шпилечная РНК).
2. Способ по п. 1, где указанная композиция представляет собой комбинированный препарат, дополнительно содержащий:
молекулу нуклеиновой кислоты, которая непосредственно ингибирует экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени поли(А)-полимераза-ассоциированного доменсодержащего 7 (PAPD7);
где указанная нуклеиновая кислота-мишень содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 11;
где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из 8-40 нуклеотидов в длину;
где указанная молекула нуклеиновой кислоты имеет по меньшей мере 90%-ную комплементарность указанной нуклеиновой кислоте-мишени PAPD7;
где указанная молекула нуклеиновой кислоты независимо выбрана из группы, состоящей из:
а. одноцепочечного антисмыслового олигонуклеотида;
б. молекулы миРНК; и
в. молекулы кшРНК.
3. Способ по п. 1 или 2, где молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой аппарат редактирования генома, содержащий:
i. сайт-специфичную ДНК-нуклеазу или полинуклеотид, кодирующий сайт-специфичную ДНК-нуклеазу; и
ii. РНК-проводник или полинуклеотид, кодирующий РНК-проводник.
4. Способ по п. 2 или 3, где молекулы нуклеиновой кислоты выбраны из следующих:
а. одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид, содержащий непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью с указанной нуклеиновой кислотой-мишенью PAPD5, и который способен уменьшать экспрессию PAPD5; и
б. одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид, содержащий непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью с указанной нуклеиновой кислотой-мишенью PAPD7, и который способен уменьшать экспрессию PAPD7.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где данная композиция уменьшает секрецию антигена поверхности вируса гепатита В (HBsAg), антигена оболочки HBV (HBeAg) и/или ингибирует продукцию внутриклеточной мРНК HBV или ДНК HBV.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где данная композиция ингибирует развитие хронической инфекции HBV и/или уменьшает зараженность человека, инфицированного HBV.
7. Способ по п. 1, где указанная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид, способный уменьшать экспрессию PAPD5, который содержит или состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности из 10-30 нуклеотидов в длину, где данная непрерывная нуклеотидная последовательность является на 100% комплементарной указанной нуклеиновой кислоте-мишени РАРD5.
8. Способ по п. 2, где указанная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, способную уменьшать экспрессию РАРD7, которая содержит или состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности из 10-30 нуклеотидов в длину, где данная непрерывная нуклеотидная последовательность является на 100% комплементарной указанной нуклеиновой кислоте-мишени РАРD7.
9. Способ по п. 8, где данная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид.
10. Способ по любому из пп. 7-9, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит 1-8 нуклеозидов, модифицированных 2' сахаром.
11. Способ по п. 10, где 1-8 нуклеозидов, модифицированных 2' сахаром, независимо выбраны из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, арабинонуклеиновой кислоты (ANA), 2'-фтор-ANA и нуклеозидов LNA (запертая нуклеиновая кислота).
12. Способ по п. 10 или 11, где 1-8 нуклеозидов, модифицированных 2' сахаром, представляют собой нуклеозиды LNA.
13. Способ по любому из пп. 7-12, где межнуклеозидные связи в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.
14. Способ по любому из пп. 7 или 10-13, где данный олигонуклеотид представляет собой гэпмер формулы 5'-F-G-F'-3', где область F и F' независимо состоит из 1-4 нуклеозидов, модифицированных 2' сахаром, и G представляет собой область из 6-16 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазуН.
RU2019100094A 2016-06-17 2017-06-19 МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ УРОВНЯ мРНК PAPD5 ИЛИ PAPD7 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОГО ГЕПАТИТА В RU2768699C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16175045 2016-06-17
EP16175045.0 2016-06-17
PCT/EP2017/064980 WO2017216390A1 (en) 2016-06-17 2017-06-19 Nucleic acid molecules for reduction of papd5 or papd7 mrna for treating hepatitis b infection

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2019100094A RU2019100094A (ru) 2020-07-17
RU2019100094A3 RU2019100094A3 (ru) 2021-04-06
RU2768699C2 true RU2768699C2 (ru) 2022-03-24

Family

ID=56321739

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019100094A RU2768699C2 (ru) 2016-06-17 2017-06-19 МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ УРОВНЯ мРНК PAPD5 ИЛИ PAPD7 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОГО ГЕПАТИТА В

Country Status (19)

Country Link
US (4) US11534452B2 (ru)
EP (3) EP3472362B1 (ru)
JP (5) JP7007304B2 (ru)
KR (3) KR20220056252A (ru)
CN (3) CN116196411A (ru)
AU (3) AU2017285351B2 (ru)
BR (2) BR112018075682A2 (ru)
CA (2) CA3027305A1 (ru)
CL (3) CL2018003561A1 (ru)
CR (1) CR20180590A (ru)
ES (1) ES2942407T3 (ru)
IL (2) IL263558A (ru)
MA (1) MA45496A (ru)
MX (2) MX367541B (ru)
PE (1) PE20190443A1 (ru)
PL (1) PL3472346T3 (ru)
RU (1) RU2768699C2 (ru)
SG (1) SG11201810594RA (ru)
WO (2) WO2017216391A1 (ru)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016183266A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Ehpatitis b antiviral agents
ES2938341T3 (es) 2016-03-07 2023-04-10 Enanta Pharm Inc Agentes antivirales contra la hepatitis B
MA45496A (fr) 2016-06-17 2019-04-24 Hoffmann La Roche Molécules d'acide nucléique pour la réduction de l'arnm de padd5 ou pad7 pour le traitement d'une infection par l'hépatite b
CN110066278B (zh) * 2017-06-01 2021-06-08 广东东阳光药业有限公司 稠合三环类化合物及其在药物中的应用
EA202090514A1 (ru) 2017-08-28 2020-06-24 Энанта Фармасьютикалс, Инк. Противовирусное средство против гепатита в
IL272566B1 (en) * 2017-10-16 2024-03-01 Hoffmann La Roche Nucleic acid molecule to reduce papd5 and papd7 mRNA to treat hepatitis b infection
US11058678B2 (en) 2018-01-22 2021-07-13 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Substituted heterocycles as antiviral agents
US10729688B2 (en) 2018-03-29 2020-08-04 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis B antiviral agents
SG11202009680XA (en) * 2018-04-05 2020-10-29 Hoffmann La Roche Use of fubp1 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
KR20230143199A (ko) 2018-07-03 2023-10-11 에프. 호프만-라 로슈 아게 타우 발현을 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드
SG11202100348SA (en) 2018-07-13 2021-02-25 Hoffmann La Roche Oligonucleotides for modulating rtel1 expression
WO2020051375A2 (en) 2018-09-05 2020-03-12 Children's Medical Center Corporation Papd5 inhibitors and methods of use thereof
US10865211B2 (en) 2018-09-21 2020-12-15 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Functionalized heterocycles as antiviral agents
KR20210093951A (ko) 2018-11-21 2021-07-28 이난타 파마슈티칼스, 인코포레이티드 항바이러스제로서의 작용화된 헤테로사이클
US20220220483A1 (en) * 2019-05-30 2022-07-14 Seoul National University R&Db Foundation Method for inhibiting infection and activation of virus
US11236111B2 (en) 2019-06-03 2022-02-01 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis B antiviral agents
WO2020247575A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis b antiviral agents
US11760755B2 (en) 2019-06-04 2023-09-19 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis B antiviral agents
US11738019B2 (en) 2019-07-11 2023-08-29 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Substituted heterocycles as antiviral agents
US11236108B2 (en) 2019-09-17 2022-02-01 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Functionalized heterocycles as antiviral agents
WO2021092159A1 (en) * 2019-11-07 2021-05-14 The Regents Of The University Of Colorado A Body Corporate Papd5 inhibition as a treatment for dyskeratosis congenita, aplastic anemia and myelodysplastic syndrome caused by reduced telomerase rna levels
CN114867856A (zh) 2019-12-19 2022-08-05 豪夫迈·罗氏有限公司 Saraf抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
EP4077668A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Use of scamp3 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
EP4077667A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Use of sept9 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
WO2021122910A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of sbds inhibitors for treating hepatitis b virus infection
WO2021122921A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of cops3 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
WO2021188414A1 (en) 2020-03-16 2021-09-23 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Functionalized heterocyclic compounds as antiviral agents
EP3955067A1 (en) 2020-08-11 2022-02-16 GF Machining Solutions SA A system for predicting anomalies of machining with a neuromorphic circuit
JP2023538630A (ja) 2020-08-21 2023-09-08 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｂ型肝炎ウイルス感染症を処置するためのａ１ｃｆ阻害剤の使用
CA3201466A1 (en) 2020-12-14 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating metabolic disorders and cardiovascular disease with inhibin subunit beta e (inhbe) inhibitors
TW202246500A (zh) 2021-02-02 2022-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於抑制 ｒｔｅｌ１ 表現之增強型寡核苷酸
EP4355759A1 (en) * 2021-06-18 2024-04-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing ifnar1 expression
WO2023039089A1 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Twentyeight-Seven, Inc. Papd5 and/or papd7 inhibiting 4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxylic acid derivatives
WO2023111210A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination of oligonucleotides for modulating rtel1 and fubp1
WO2023144750A1 (en) * 2022-01-28 2023-08-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy for treating hepatitis b virus infections

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2890789A1 (en) * 2012-08-31 2015-07-08 Aptamir Therapeutics, Inc. Mirna modulators of chronic visceral inflammation

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4711955A (en) 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
CA1223831A (en) 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
DE3538677A1 (de) 1985-10-31 1987-05-07 Schloemann Siemag Ag Wendehaspel
JP2823959B2 (ja) 1991-10-24 1998-11-11 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 改良された取り込みおよびその他の性質を持つ誘導化オリゴヌクレオチド
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
NL9201440A (nl) 1992-08-11 1994-03-01 Univ Leiden Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing.
JP2002502222A (ja) 1992-11-06 2002-01-22 ノバーティス アクチエンゲゼルシャフト Ｂ型肝炎表面抗原に対して活性なヒトモノクローナル抗体の生産
US20040157780A1 (en) * 1993-11-29 2004-08-12 Epimmune Inc. CTL inducing peptides from c-erb2 (HER-2/neu)
CA2185918A1 (en) 1994-04-05 1995-10-12 Genzyme Corporation Determination and identification of active compounds in a compound library
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
NZ503765A (en) 1997-09-12 2002-04-26 Exiqon As Bi-cyclic and tri-cyclic nucleotide analogues
ID30093A (id) 1999-02-12 2001-11-01 Sankyo Co Analog-analog nukleosida dan oligonukleotida baru
JP2002543214A (ja) 1999-05-04 2002-12-17 エクシコン エ／エス Ｌ−リボ−ｌｎａ類縁体
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
WO2003022987A2 (en) 2001-07-26 2003-03-20 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of hepatitis c infection, compositions and methods of screening for modulators of hepatitis c infection
AU2003295600A1 (en) 2002-11-14 2004-06-15 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
DK2752488T3 (da) 2002-11-18 2020-04-20 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense-design
US20060257851A1 (en) 2002-11-26 2006-11-16 Itzhak Bentwich Bioinformatically detectable group of novel viral regulatory genes and uses thereof
CN1836042A (zh) 2003-06-12 2006-09-20 原子核物理公司 用于基因沉默的hbv和hcv保守序列
JP2005116204A (ja) 2003-10-03 2005-04-28 Daikin Ind Ltd 放電装置および空気浄化装置
US7374927B2 (en) 2004-05-03 2008-05-20 Affymetrix, Inc. Methods of analysis of degraded nucleic acid samples
EP1752536A4 (en) 2004-05-11 2008-04-16 Alphagen Co Ltd POLYNUCLEOTIDE CAUSING RNA INTERFERENCE AND METHOD OF REGULATING GENE EXPRESSION WITH THE USE OF THE SAME
US20080125583A1 (en) 2005-02-11 2008-05-29 International Business Machines Corporation Ribonucleic acid interference molecules
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
CA2640171C (en) 2006-01-27 2014-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2007225238A1 (en) * 2006-03-10 2007-09-20 Wyeth Microarray for monitoring gene expression in multiple strains of Streptococcus pneumoniae
ES2471978T3 (es) 2006-05-05 2014-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compuestos y procedimientos para modular la expresión de ApoB
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
WO2007134181A2 (en) 2006-05-11 2007-11-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs
WO2008082730A2 (en) 2006-09-19 2008-07-10 Novartis Ag Biomarkers of target modulation, efficacy, diagnosis and/or prognosis for raf inhibitors
EP2092065B2 (en) 2006-10-18 2019-07-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds
US8580756B2 (en) 2007-03-22 2013-11-12 Santaris Pharma A/S Short oligomer antagonist compounds for the modulation of target mRNA
US8278425B2 (en) 2007-05-30 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
CA2692579C (en) 2007-07-05 2016-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
CA2701895A1 (en) 2007-10-04 2009-04-09 Santaris Pharma A/S Short rna antagonist compounds for the modulation of hif1alpha
WO2009067647A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs
CA3023900A1 (en) 2007-12-27 2009-07-09 Abbott Laboratories Anti-t. cruzi antibodies and methods of use
WO2009090182A1 (en) 2008-01-14 2009-07-23 Santaris Pharma A/S C4'-substituted - dna nucleotide gapmer oligonucleotides
DK2285819T3 (da) 2008-04-04 2013-12-02 Isis Pharmaceuticals Inc Oligomere forbindelser omfattende neutralt bundne, terminale bicykliske nukleosider
WO2010006111A2 (en) * 2008-07-10 2010-01-14 Merck & Co., Inc. Methods of using compositions comprising mir-192 and/or mir-215 for the treatment of cancer
DK2356129T3 (da) 2008-09-24 2013-05-13 Isis Pharmaceuticals Inc Substituerede alpha-L-bicykliske nukleosider
EP2177615A1 (en) 2008-10-10 2010-04-21 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Method for a genome wide identification of expression regulatory sequences and use of genes and molecules derived thereof for the diagnosis and therapy of metabolic and/or tumorous diseases
CA3151965A1 (en) 2008-12-18 2010-07-15 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
WO2010093788A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Multiplex dicer substrate rna interference molecules having joining sequences
WO2011017521A2 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
JP2013126374A (ja) * 2010-03-04 2013-06-27 Kyushu Univ イソフラボン類の作用に関連する遺伝子
US8846637B2 (en) 2010-06-08 2014-09-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2′-amino and 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP3587574B1 (en) 2010-08-17 2022-03-16 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of hepatitis b virus (hbv) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
SI3124610T1 (sl) 2010-10-28 2019-08-30 Benitec Biopharma Limited Zdravljenje HBV
US10017764B2 (en) * 2011-02-08 2018-07-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
EP3505528B1 (en) 2011-04-21 2020-11-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
CA2833778C (en) 2011-06-30 2021-09-28 Arrowhead Research Corporation Compositions and methods for inhibiting gene expression of hepatitis b virus
EP2742135B2 (en) 2011-08-11 2020-06-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified gapped oligomeric compounds and uses thereof
EP2751270B1 (en) 2011-08-29 2018-08-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
WO2013036868A1 (en) 2011-09-07 2013-03-14 Marina Biotech Inc. Synthesis and uses of nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers
WO2013113326A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
US9221864B2 (en) 2012-04-09 2015-12-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
WO2013159109A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
WO2013166264A2 (en) 2012-05-02 2013-11-07 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods for altering virus replication
EP4219516A3 (en) 2012-07-13 2024-01-10 Wave Life Sciences Ltd. Chiral control
PL2920304T3 (pl) 2012-11-15 2019-07-31 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Koniugaty oligonukleotydowe
AU2014259759B2 (en) 2013-05-01 2020-06-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods
PT3013959T (pt) 2013-06-27 2020-02-04 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligómeros antissentido e conjugados dirigidos para pcsk9
CN105980615A (zh) * 2013-08-28 2016-09-28 卡里斯生命科学瑞士控股有限公司 寡核苷酸探针及其用途
EA201691261A1 (ru) 2014-01-30 2016-11-30 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Новые дигидрохинолизиноны для лечения и профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита b
KR102287532B1 (ko) 2014-01-30 2021-08-11 에프. 호프만-라 로슈 아게 생분해성 컨쥬게이트를 갖는 폴리 올리고머 화합물
JP6568106B2 (ja) * 2014-05-13 2019-08-28 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｂ型肝炎ウイルス感染症の治療及び予防のための新規ジヒドロキノリジノン類
GB201408623D0 (en) 2014-05-15 2014-07-02 Santaris Pharma As Oligomers and oligomer conjugates
FR3026868B1 (fr) 2014-10-02 2019-08-16 Dav Dispositif et procede de commande pour vehicule automobile
JP6626101B2 (ja) 2014-10-10 2019-12-25 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ＧａｌＮＡｃホスホラミダイト、その核酸結合体およびそれらの使用
US9637485B2 (en) * 2014-11-03 2017-05-02 Hoffmann-La Roche Inc. 6,7-dihydrobenzo[a]quinolizin-2-one derivatives for the treatment and prophylaxis of hepatitis B virus infection
EP3220921A1 (en) 2014-11-19 2017-09-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Lna chiral phosphorothioates
WO2016096938A1 (en) 2014-12-16 2016-06-23 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Chiral toxicity screening method
JP6506845B2 (ja) 2014-12-30 2019-04-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｂ型肝炎ウイルス感染症の治療及び予防のための新規テトラヒドロピリドピリミジン類及びテトラヒドロピリドピリジン類
US20180023081A1 (en) 2015-02-04 2018-01-25 Bristol-Myers Squibb Company Lna oligonucleotides with alternating flanks
CN107207505B (zh) * 2015-02-11 2018-12-14 豪夫迈·罗氏有限公司 治疗和预防乙型肝炎病毒感染的 2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸衍生物
WO2016177655A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Tetrahydropyridopyrimidines and tetrahydropyridopyridines as inhibitors of hbsag (hbv surface antigen) and hbv dna production for the treatment of hepatitis b virus infections
AU2016296592B2 (en) 2015-07-17 2021-08-19 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and agents against Hepatitis B virus and uses thereof
WO2017027350A2 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Rnai therapy for hepatitis b virus infection
WO2017066712A2 (en) 2015-10-16 2017-04-20 The Children's Medical Center Corporation Modulators of telomere disease
JP6985288B2 (ja) 2016-04-14 2021-12-22 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft トリチル−モノ−ＧａｌＮＡｃ化合物とその利用
MA45496A (fr) 2016-06-17 2019-04-24 Hoffmann La Roche Molécules d'acide nucléique pour la réduction de l'arnm de padd5 ou pad7 pour le traitement d'une infection par l'hépatite b
WO2018059718A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. Peronospora resistance in spinacia oleracea
IL272566B1 (en) 2017-10-16 2024-03-01 Hoffmann La Roche Nucleic acid molecule to reduce papd5 and papd7 mRNA to treat hepatitis b infection
CL2020001638A1 (es) 2017-10-16 2020-10-16 Hoffmann La Roche Molécula de ácidos nucleicos para la reducción del arnm de papd5 y papd7 en el tratamiento de la infección de la hepatitis b. (divisional solicitud 202000945)
CA3088066A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for the preparation of galnac oligonucleotide conjugates
CL2019000945A1 (es) 2019-04-09 2019-07-12 Energy Harvest As Dispositivo de válvula rotatoria y sus métodos.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2890789A1 (en) * 2012-08-31 2015-07-08 Aptamir Therapeutics, Inc. Mirna modulators of chronic visceral inflammation

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
İnan et al. "Hepatitis B Virus: Biology and Life Cycle" Viral Hepatitis Journal 2015; 21(1): 1-7, Doi: 10.4274/vhd.36036. *
John E Tavis et al. "The Hepatitis B Virus Ribonuclease H as a Drug Target" Antiviral Research, 2015, 118 DOI:10.1016/j.antiviral.2015.04.002. *
John E Tavis et al. "The Hepatitis B Virus Ribonuclease H as a Drug Target" Antiviral Research, 2015, 118 DOI:10.1016/j.antiviral.2015.04.002. İnan et al. "Hepatitis B Virus: Biology and Life Cycle" Viral Hepatitis Journal 2015; 21(1): 1-7, Doi: 10.4274/vhd.36036. Тарантул В.З. Толковый биотехнологический словарь. Русско-английский. М.: Языки славянских культур 2009 - 936 с., стр. 470. *
Тарантул В.З. Толковый биотехнологический словарь. Русско-английский. М.: Языки славянских культур 2009 - 936 с., стр. 470. *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220096527A1 (en) 2022-03-31
BR112018075682A2 (pt) 2019-04-02
EP3472346A1 (en) 2019-04-24
EP3472362B1 (en) 2023-09-06
JP2022019747A (ja) 2022-01-27
CN116196411A (zh) 2023-06-02
KR102381682B1 (ko) 2022-03-31
EP4219767A1 (en) 2023-08-02
MA45496A (fr) 2019-04-24
PL3472346T3 (pl) 2023-05-22
CN109328237B (zh) 2022-12-06
EP3472346B1 (en) 2023-01-18
IL263558A (en) 2019-01-31
CL2020003330A1 (es) 2021-06-04
JP7007304B2 (ja) 2022-02-10
MX2018015516A (es) 2019-03-18
KR102391812B1 (ko) 2022-04-27
CR20180590A (es) 2019-03-05
US20190194768A1 (en) 2019-06-27
JP7258558B2 (ja) 2023-04-17
JP2022036182A (ja) 2022-03-04
US11191775B2 (en) 2021-12-07
RU2019100094A (ru) 2020-07-17
IL263552A (en) 2019-01-31
EP3472362A1 (en) 2019-04-24
AU2017285351B2 (en) 2023-04-20
MX2018015521A (es) 2019-03-18
CN109414448A (zh) 2019-03-01
JP2024026252A (ja) 2024-02-28
JP2019523649A (ja) 2019-08-29
MX367541B (es) 2019-08-22
BR112018075960A2 (pt) 2019-10-01
AU2023202562A1 (en) 2023-05-18
JP2019518037A (ja) 2019-06-27
CL2018003561A1 (es) 2019-03-15
KR20190018515A (ko) 2019-02-22
CN109414448B (zh) 2021-10-26
ES2942407T3 (es) 2023-06-01
MX367543B (es) 2019-08-22
CA3027811A1 (en) 2017-12-21
EP3472362C0 (en) 2023-09-06
CN109328237A (zh) 2019-02-12
KR20190019164A (ko) 2019-02-26
AU2017285350A1 (en) 2018-12-20
US20230210887A1 (en) 2023-07-06
CA3027305A1 (en) 2017-12-21
US11534452B2 (en) 2022-12-27
AU2017285351A1 (en) 2018-12-13
WO2017216391A1 (en) 2017-12-21
US20190216846A1 (en) 2019-07-18
PE20190443A1 (es) 2019-03-29
KR20220056252A (ko) 2022-05-04
WO2017216390A1 (en) 2017-12-21
CL2020003329A1 (es) 2021-06-04
RU2019100094A3 (ru) 2021-04-06
SG11201810594RA (en) 2018-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2768699C2 (ru) МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ УРОВНЯ мРНК PAPD5 ИЛИ PAPD7 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОГО ГЕПАТИТА В
AU2016234914B2 (en) Selective reduction of allelic variants
KR102279458B1 (ko) 헌팅틴 발현의 조절
KR102424991B1 (ko) 타우 발현 조절 조성물
DK2742135T3 (en) BINDING MODIFIED GAPPED OLIGOMERIC COMPOUNDS AND APPLICATIONS THEREOF
CN109790543B (zh) 用于减少tau表达的化合物和方法
AU2021203300B2 (en) Nucleic acid molecule for reduction of PAPD5 and PAPD7 mRNA for treating hepatitis B infection
KR20160002977A (ko) 조성물 및 방법
KR102585973B1 (ko) 타우 발현을 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드
AU2016381174A1 (en) Methods for reducing Ataxin-2 expression
TW202221014A (zh) 用於減少ａｐｐ表現之化合物及方法
US20040115641A1 (en) Modulation of ROCK 1 expression
KR20230137958A (ko) 헌팅틴을 조절하기 위한 화합물 및 방법
CN115516091A (zh) Cops3抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途