KR20220056252A - B형 간염 감염을 치료하기 위해 PAPD5 또는 PAPD7 mRNA를 감소시키기 위한 핵산 분자 - Google Patents

B형 간염 감염을 치료하기 위해 PAPD5 또는 PAPD7 mRNA를 감소시키기 위한 핵산 분자 Download PDF

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KR20220056252A
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하싼 야판바크트
헨리크 뮐러
쇠렌 오토센
뤼케 페데르센
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것으로서, PAP 연관된 도메인 함유 5(PAPD5) 및/또는 PAP 연관된 도메인 함유 7(PAPD7)의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 화합물이 HBV 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 화합물로서 동정된다. 또한, 본 발명은 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 PAPD5 또는 PAPD7 억제제; 및 HBV 감염의 치료 또는 예방에서 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 PAPD5의 억제제 및 PAPD7의 억제제를 포함하는 조합 제제를 제공한다. 또한, 본 발명은 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물, 및 HBV 감염의 치료 동안 치료적 성과를 모니터링하는 방법을 포함한다.

Description

B형 간염 감염을 치료하기 위해 PAPD5 또는 PAPD7 mRNA를 감소시키기 위한 핵산 분자{NUCLEIC ACID MOLECULES FOR REDUCTION OF PAPD5 OR PAPD7 MRNA FOR TREATING HEPATITIS B INFECTION}
본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것으로서, PAP 연관된 도메인 함유 5(PAPD5) 및/또는 PAP 연관된 도메인 함유 7(PAPD7)의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 화합물이 HBV 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 화합물로서 동정된다. 또한, 본 발명은 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 PAPD5 또는 PAPD7의 억제제를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 PAPD5 또는 PAPD7의 억제제로서 핵산 분자, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi 제제, 뿐만 아니라 HBV 감염의 치료 또는 예방에서 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 PAPD5의 억제제 및 PAPD7의 억제제를 포함하는 조합 제제를 제공한다. 또한, 본 발명은 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물, 및 HBV 감염의 치료 동안 치료적 성과를 모니터링하는 방법을 포함한다.
B형 간염 바이러스(HBV)는 감싸진, 부분적인 이중-가닥의 DNA 바이러스이다. 조밀한 3.2 kb HBV 게놈은 코어, 중합효소(Pol), 외피 및 X-단백질을 코딩하는 4개의 중첩된 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 이루어진다. Pol ORF는 가장 길고 외피 ORF는 Pol ORF 내에 위치되는 반면, X 및 코어 ORF는 Pol ORF와 중첩된다. HBV의 생명주기는 2개의 주요 사건을 갖는다: 1) 이완 환형 DNA(RC DNA)로부터 폐환형 DNA(cccDNA)의 생성, 및 2) RC DNA를 생성하기 위한 전게놈 RNA(pgRNA)의 역 전사. 숙주 세포의 감염 전에, HBV 게놈은 RC DNA로서 비리온 내에 존재한다. HBV 비리온은 인간 간세포의 표면에 존재하는 음전하 프로테오글리칸에 비특이적으로 결합하고(문헌[Schulze, Hepatology, 46, (2007), 1759-68]), 간세포 나트륨-타우로콜레이트 동반 수송 폴리펩티드(NTCP) 수용체에 대한 HBV 표면 항원(HBsAg)의 특이적 결합을 통해 숙주 세포 내로 들어갈 수 있는 것으로 입증되었다(문헌[Yan, J Virol, 87, (2013), 7977-91]). 바이러스 감염의 제어는 바이러스의 초기 성장시 영향을 주는 감염 후 몇 분 내지 몇 시간 내에 반응시키고 만성적이고 지속적인 감염의 발생을 제한할 수 있는 숙주 내재 면역계의 엄격한 감시를 요구한다. IFN 및 뉴클레오시드(뉴클레오티드) 유사체에 기초한 현재 이용가능한 치료에도 불구하고, HBV 감염은 간경화증 및 간세포 암종의 높은 위험이 있는 약 3억 5천만명의 만성 보균자와 관련하여 세계적으로 중요한 건강 문제로 남아있다.
간세포 및/또는 간내 면역 세포에 의한 HBV 감염에 대응하여 항바이러스 사이토카인의 분비는 감염된 간의 바이러스 제거에서 중요한 역할을 한다. 그러나, 만성적으로 감염된 환자는 숙주 세포 인지 시스템 및 후속 항바이러스 반응에 대응하는 바이러스에 의해 채택된 다양한 탈출 전략으로 인해 약한 면역 반응만을 보인다.
많은 관찰은, 여러 HBV 바이러스 단백질이 바이러스 인지 신호화 시스템을 방해하는 초기 숙주 세포 반응 및 후속 인터페론(IFN) 항바이러스 활성에 대응할 수 있음을 나타냈다. 특히, HBV 비어있는 서브바이러스 입자(SVP, HBsAg)의 과도한 분비는 만성적으로 감염된 환자(CHB)에서 관찰된 면역학적 내성 상태의 유지에 관여하는 것으로 생각된다. HBsAg 및 다른 바이러스 항원에 대한 지속적인 노출은 HBV-특이적 T 세포 결실 또는 점진적인 기능 장애를 야기할 수 있다(문헌[Kondo, Journal of Immunology (1993), 150, 4659-4671]; 문헌[Kondo, Journal of MediCal Virology (2004), 74, 425-433]; 문헌[Fisicaro, Gastroenterology, (2010), 138, 682-93]). 더욱이 HBsAg는 직접적인 상호작용에 의해 면역 세포, 예컨대 단핵구, 수지상 세포(DC) 및 천연 살해(NK) 세포의 기능을 억제하는 것으로 보고되었다(문헌[Op den Brouw, Immunology, (2009b), 126, 280-9]; 문헌[Woltman, PLoS One, (2011), 6, e15324]; 문헌[Shi, J Viral Hepat. (2012), 19, e26-33]; 문헌[Kondo, ISRN Gasteroenterology, (2013), Article ID 935295]).
HBsAg 정량화는 만성 B형 간염의 진단 및 치료 반응을 위한 유의미한 바이오마커이다. 그러나, HBsAg 손실 및 형질전환의 달성은 만성적으로 감염된 환자에서 드물게 관찰되지만 치료법의 궁극적인 목표 중 하나로 남아있다. 현재 치료법, 예컨대 뉴클레오시드(뉴클레오티드) 유사체는 HBV DNA 합성을 억제하는 분자이지만, HBsAg 수준을 감소시키는데 관여하지 않는다. 뉴클레오시드(뉴클레오티드) 유사체는, 심지어 장기간의 치료법과 함께, 자연적으로 관찰된 것과 필적할만한 약한 HBsAg 제거(-1% 내지 2%)만을 나타냈다(문헌[Janssen et al., Lancet, (2005), 365, 123-9]; 문헌[Marcellin et al., N. Engl. J. Med., (2004), 351, 1206-17]; 문헌[Buster et al., Hepatology, (2007), 46, 388-94]).
B형 간염 e-항원(HBV 외피 항원 또는 HBeAg로도 지칭됨)은 B형 간염 감염된 세포에 의해 분비되는 바이러스성 단백질이다. HBeAg는 만성 B형 간염 감염과 연관되고, 활성 바이러스 질병의 마커 및 환자의 전염력의 정도로 사용된다.
B형 간염 바이러스 프리코어(precore) 또는 HBeAg의 기능은 완전히 알려지지 않았다. 그러나, HBeAg는 바이러스 내구력에서 중요한 역할을 하는 것으로 널리 공지되어 있다. HBeAg는 면역조절 단백질로서 기능함으로써 HBV 만성을 촉진하는 것으로 여겨진다. 특히, HBeAg는 세포내 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 숙주 면역 반응을 약화시키는 것으로 나타난 분비된 부속 단백질이다(문헌[Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141]). HBeAg는 HBV 내구력에 기여하는 면역 내성원으로서 작용하고, 가용성 HBeAg가 태반을 횡단함을 고려하면 아마도 자궁 내에서 기능할 것이다(문헌[Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141]). 또한, HBeAg는 i) 세포내 신호전달을 제어하는 세포 유전자; 및 ii) 바이러스 감염에 대한 선천적인 면역 반응을 줄이는 Toll-유사 수용체 2(TLR-2)를 하향조절한다(문헌[Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141]). HBeAg의 부재 하에, HBV 복제는 TLR2 경로의 상향조절과 연관된다(문헌[Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141]). 따라서, HBeAg는 숙주 면역 반응에 영향을 주는 바이러스/숙주 상호작용을 조절하는데 중요한 역할을 갖는다(문헌[Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141]). 따라서, HBeAg 양성 환자 집단에서 HBeAg의 감소는 HBV 특이적 면역기능장애의 반전을 야기할 수 있다(문헌[Milich, 1997, J. Viral. Hep. 4: 48-59]; 문헌[Milich, 1998, J. Immunol. 160: 2013-2021]). 또한, 분비된 HBeAg는 T 세포 내성의 유도에서 세포내 간염 코어 항원(HBcAg)보다 상당히 더 효율적이고, HBeAg와 HBcAg 사이의 분할 T 세포 내성 및 HBc/HBeAg-특이적 T 세포 내성의 클론 이질성은 천연 HBV 감염, 특히 프리코어-음성 만성 간염에 대해 상당한 관련성을 가질 수 있다(문헌[Chen, 2005, Journal of Virology, 79: 3016-3027]]).
따라서, HBsAg의 분비에 더해 HBeAg의 감소는 HBsAg 단독의 분비의 억제와 비교하여, 만성 HBV 감염의 발생의 개선된 억제를 야기할 수 있다. 또한, 만성으로의 급성 감염의 최고 전염 속도(80% 초과)가 HBeAg-양성 모체로부터의 모체-태아 및 신생아 HBV 전염의 경우에 보고되었다(문헌[Liaw, Lancet, 2009, 373: 582-592]; 문헌[Liaw, Dig. Dis. Sci., 2010, 55: 2727-2734]; 및 문헌[Hadziyannis, 2011, Journal of hepatology, 55: 183-191]). 따라서, 출산을 앞둔 모체에서의 HBeAg의 감소는 환자의 전염력의 정도를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 자식의 만성 HBV 감염의 발생을 억제할 수 있다.
따라서, HBV의 치료법에서, 바이러스 발현을 억제하기 위한, 특히 HBsAg 및 HBeAg의 분비를 억제하기 위한 충족되지 않은 의학적 요구가 존재한다(문헌[Wieland, S. F. & F. V. Chisari. J Virol, (2005), 79, 9369-80]; 문헌[Kumar et al. J Virol, (2011), 85, 987-95]; 문헌[Woltman et al. PLoS One, (2011), 6, e15324]; 문헌[Op den Brouw et al. Immunology, (2009b), 126, 280-9]).
국제 특허공개공보 제03/022987호는, 예를 들어 표 7A에서 C형 간염 양성 조직에서 상향조절된 1,298개의 유전자를 개시한다. 언급된 유전자 중 하나는 토포이소머라제-관련 기능 단백질 4(TRF4, AF089897)이다. AF089897은 또한 TRF4-2로 지칭되고, 서열번호 4의 위치 880 내지 2340과 아주 유사하다. PAPD5의 단편이 C형 간염 양성 세포에서 약간 상향조절된 관찰이 PAPD5의 억제가 효과적인 치료법을 대표한다는 임의의 표시를 제공하는 것은 아니다. 국제 특허공개공보 제03/022987 A2호는 PAPD5의 단편이 C형 간염 감염 중에 어떠한 중요한 역할도 하지 않음을 나타내는 어떠한 힌트도 개시하지 않는다. 또한, HCV 및 HBV는 상이한 병인론, 상이한 진행 및 상이한 약물치료를 갖는 2개의 완전히 상이한 질병을 야기하는 2개의 완전히 상이한 바이러스이다. 이것은 PAPD5 및 PAPD7 억제제 DHQ 및 THP가 C형 간염 바이러스(HCV), 또는 HBV 이외의 다른 바이러스(데이터는 제시되지 않음)에 대해 불활성인 본 발명자들의 관찰과 비슷하다.
국제 특허공개공보 제2010/040571호에서, PAPD5는 다른 유전자의 긴 목록에서 임의의 실질적인 증거의 제공 없이 대사성 및 종양성 질병에서 세포 증식에 잠재적인 역할을 갖는 것으로 시사되었다.
국제 특허공개공보 제2013/166264호에서, PAPD5는 다른 유전자의 긴 목록에서 임의의 실질적인 증거의 제공 없이 바이러스 복제의 증가에 잠재적인 역할을 갖는 것으로 시사되었다.
국제 특허공개공보 제2017/066712호에서, 텔로미어의 치료 및 진단에 관한 PAPD5의 하향조절이 기술되었다. 이러한 목적을 위한 5개의 shRNA 구조가 기술되었다.
본 발명자들이 알기로는, PAPD5 또는 PAPD7의 발현은 HBV 감염과 결코 연관되지 않았고, 이들 표적에 대해 제조된 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드를 변형시키지 않았다.
따라서, 본 발명의 근원적인 기술적인 문제는 HBV 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 개선된 수단 및 방법의 동정 및 제공이다.
이러한 기술적 문제는 본원에 기술되고 청구범위에 특징지어진 양태의 제공에 의해 해결된다.
도 1은 HBX129653/HBX129654 화학적 프로브 및 3개의 프레이(prey) 단편을 사용한 원-바이-원(1-by-1) 실험으로부터의 사진을 도시한다.
도 2는 HBX129653/HBX129654 화학적 프로브 및 PAPD5/7 전장 단백질을 사용하는 원-바이-원 실험으로부터의 사진을 도시한다.
도 3은 경쟁을 위해 HBX129653(DHQ) 및 MOL653/654를 사용하는 경쟁 검정으로부터의 사진을 도시한다.
도 4는 경쟁을 위해 HBX129654(THP) 및 MOL653/654를 사용하는 경쟁 검정으로부터의 사진을 도시한다.
도 5는 경쟁을 위해 HBX129653(DHQ) 및 INACT653/INACT654를 사용하는 경쟁 검정으로부터의 사진을 도시한다. MOL653은 양성 대조군으로서 포함되었다.
도 6은 경쟁을 위해 HBX129654(THP) 및 INACT653/INACT654를 사용하는 경쟁 검정으로부터의 사진을 도시한다. MOL653은 양성 대조군으로서 포함되었다.
도 7a: HBV-감염된 dHepaRG에서 PAPD5 및 PAPD7의 SiRNA 녹-다운(knock-down, KD)은 HBV 발현의 감소를 야기한다. 분화된 HepaRG 세포는 HBV에 의해 감염되었고, HBV 감염 전 1일 및 감염 후 4일에 PAPD5, PAPD7 또는 둘 다(각각 25 nM)에 대한 siRNA로 처리되었다. 상청액을 제11일에 수확하였고, 상청액에서 분비된 HBsAg 및 HBeAg의 수준을 ELISA로 측정하였고, 처리되지 않은 대조군에 대해 정규화시켰다. 이어서, 유전자 발현의 세포 독성 및 억제를 측정하고, 또한 처리되지 않은 대조군에 대해 정규화시켰다. 도 7b: 상청액에 분비된 HBsAg의 수준만을 측정한 것을 제외하고는, 도 7a에 기술된 바와 동일한 실험을 수행하였다.
도 8은, 실시예 4에서 시험된, HeLa 세포 배양물에서 PAPD5의 발현을 감소시키는 올리고뉴클레오티드의 능력을 묘사한 것이다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 염색체 위치에 의해 PAPD5 mRNA 상의 이의 위치를 나타내는 점으로 표현된다. 올리고뉴클레오티드 농도는 각각의 플롯에 대해 오른쪽에 표시된 바와 같이 5 및 25 μM이었다.
도 9는, 실시예 5에서 시험된, HeLa 세포 배양물에서 PAPD7의 발현을 감소시키는 올리고뉴클레오티드의 능력을 묘사한 것이다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 염색체 위치에 의해 PAPD7 mRNA 상의 이의 위치를 나타내는 점으로 표현된다. 올리고뉴클레오티드 농도는 각각의 플롯에 대해 오른쪽에 표시된 바와 같이 5 및 25 μM이었다.
도 10은, 조합에 존재하는 단일 올리고뉴클레오티드(20 μM)를 사용하여 수득된 억제와 비교한, PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 올리고뉴클레오티드의 조합(각각 20 μM)에 의한 HBV 감염된 HepaRG 세포에서 HBsAg의 억제를 묘사한 것이다. 검정을 짐노시즈(gymnosis)에 의해 수행하였다.
도 11은, 조합으로부터의 단일 올리고뉴클레오티드(500 nM)를 사용하여 수득된 억제와 비교한, PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 올리고뉴클레오티드의 조합(각각 500 nM)에 의한 HBV 감염된 HepaRG 세포에서 HBsAg의 억제를 묘사한 것이다. 검정을 형질감염에 의해 수행하였다.
<발명의 요약>
본 발명의 한 양상은 B형 간염 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 핵산 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이되, 상기 핵산 분자는 PAPD5의 발현 및/또는 활성을 억제한다. 특히, PAPD5의 발현 및/또는 활성을 억제하는 핵산 분자 및 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 억제하는 또 다른 핵산 분자의 조합 제제를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양상은 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 억제하는 핵산 분자에 관한 것이다. 특히, 단일가닥 안티센스, siRNA 및 shRNA 분자에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양상은 PAPD5의 발현 및/또는 활성을 억제하는 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 특히, 2' 당 변형된 올리고뉴클레오티드 및 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 포함하는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양상은 본 발명의 핵산 분자의 접합체, PAPD5 및 PAPD7 둘 다의 발현 및/또는 활성을 억제할 수 있는 핵산 분자의 조합 제제, 및 본 발명의 분자를 포함하는 약학 조성물이다.
본 발명의 추가적 양상은, (a) 시험 화합물 또는 조성물을 PAPD5 및/또는 PAPD7을 발현하는 세포와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험 화합물 또는 조성물의 존재 및 부재 하에 PAPD5 및/또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) PAPD5 및/또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 화합물 또는 조성물을, HBV 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 화합물로서 동정하는 단계
를 포함하는, B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 화합물 또는 조성물을 동정하는 방법이다.
<발명의 상세한 설명>
PAPD5 및 PAPD7은 폴리머라제 β-유사 뉴클레오티딜 전달효소의 상과에 속하는 비-정규 poly-A 폴리머라제이다. 본 발명에 있어서, 놀랍게도, 시험 화합물이 PAPD5 또는 PAPD7을 억제하는지 여부를 분석함으로써, HBV 감염의 치료적 개입에 유용한 화합물이 성공적으로 동정될 수 있는 것으로 나타났다. 즉, PAPD5 및/또는 PAPD7의 억제, 또는 둘 모두의 억제는 HBV 감염을 억제하는 화합물의 효능에 대한 지시자인 것으로 하기 실시예에서 동정되었다. 하기 실시예는, 재료 및 방법 섹션에서 나타낸 화학식 III을 갖는 다이하이드로퀴놀리진온 화합물(본원에서 DHQ로 지칭됨) 및 재료 및 방법 섹션에서 나타낸 화학식 IV의 테트라하이드로피리도피리미딘 화합물(본원에서 THP로 지칭됨)이 PAPD5 및 PAPD7 폴리펩티드(각각 서열번호 1 및 2)에 결합함을 증명한다. 이러한 화합물은 HBV 감염 동안 HBV 표면 항원(HBsAg)의 생산 및 HBV RNA의 발현을 억제하는 능력을 갖는다(국제 특허공개공보 제2015/113990 A1호 및 국제 특허공개공보 제2016/177655호). 또한, 첨부된 실시예는 siRNA의 풀의 사용에 의한 PAPD5 또는 PAPD7, 또는 둘 다의 억제가 바이러스 발현, 특히 HBsAg 및 HBeAg의 분비 및 세포내 HBV mRNA의 생산의 억제를 야기함을 보여준다. 이러한 결과는 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성(예컨대, 양)을 감소시킴으로써, HBV 감염(예컨대, 만성 HBV 감염)이 예방되거나 치료될 수 있음(즉, 개선되고/되거나 억제될 수 있음)을 직접적으로 나타낸다.
본 발명의 선별 방법
따라서, 본 발명은 PAPD5 또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성(예컨대, 발현)을 감소시키는 화합물(또는 PAPD5 및 PAPD7을 감소시키는 화합물의 조합)이 HBV 감염을 예방하고/거나 치료하는(즉, 개선하고/거나 억제하는) 화합물로서 동정되는 선별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 화합물은 RNAi 분자, 특히 핵산 분자, 예컨대 siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 선별 방법을 사용하여, PAPD5 또는 PAPD7 mRNA를 표적화하는 240 LNA 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 화합물의 조합을 사용하여 PAPD5 또는 PAPD7, 또는 둘 다의 발현을 감소시키는 이들의 능력에 대해 선별되었다. 이중 일부는 단독으로 또는 조합으로 HBV 감염을 개선하고/거나 억제하는 이들의 능력을 확인하도록 시험되었다.
본 발명의 한 양상은, a) 시험 화합물을, PAP 연관된 도메인 함유 5(PAPD5) 및/또는 PAP 연관된 도메인 함유 7(PAPD7)을 발현하는 세포와 접촉시키는 단계;
b) 상기 시험 화합물 또는 조성물의 존재 및 부재 하에 PAPD5 및/또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 측정하는 단계; 및
c) PAPD5 또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 화합물을, HBV 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 화합물 또는 조성물로서 동정하는 단계;
임의적으로, d) PAPD5 및 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 화합물의 조합을 시험하는 단계
를 포함하는, B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 화합물 또는 조성물을 동정하는 방법이다.
본 발명에 있어서, PAPD5 또는 PAPD7을 감소시키는 화합물(또는 조성물) 또는 조합된 PAPD5 및 PAPD7을 감소시키는 화합물의 조합이 HBV 유전자 발현 및 복제의 억제를 야기하고, 이에 따라 HBV 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제함이 밝혀졌다. 이러한 화합물은 PAPD5 및/또는 PAPD7 발현 및/또는 활성의 10 내지 100%, 바람직하게는 20 내지 100%, 더욱 바람직하게는 30 내지 100%, 더욱 더 바람직하게는 40 내지 100%, 더욱 더 바람직하게는 50 내지 100%, 더욱 더 바람직하게는 60 내지 100%, 더욱 더 바람직하게는 70 내지 100%, 더욱 더 바람직하게는 80 내지 100%, 가장 바람직하게는 90 내지 100%의 감소를 야기할 수 있다.
본원에 제공된 선별 방법에서, 단계 (a)에서 PAPD5 및/또는 PAPD7을 발현하는 세포, 예컨대 HeLa 또는 HepaRG 세포주를 사용함으로써, PAPD5 및/또는 PAPD7의 발현이 측정(즉, 분석/결정)됨이 예견된다. (i) PAPD5 및/또는 PAPD7 폴리펩티드를 결정함; 또는 (ii) PAPD5 및/또는 PAPD7을 발현하는 세포에서 전사 수준을 결정함으로써, PAPD5 및/또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성이 측정(즉, 분석/결정)될 수 있다.
본 발명의 한 양상에서, PAPD5 및/또는 PAPD7(예컨대, PAPD5)의 발현을 감소시키는 화합물(또는 바람직하게는 PAPD5 및 PAPD7 둘 다를 감소시키는 화합물의 조합)은 HBV 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는(즉, 치료하는) 화합물로서 동정된다. 본 발명의 다른 양상에서, PAPD5 및/또는 PAPD7 폴리펩티드(예컨대, PAPD5)의 활성을 감소시키는 화합물(또는 바람직하게는 PAPD5 및 PAPD7 둘 다를 감소시키는 화합물의 조합)은 HBV 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는(즉, 치료하는) 화합물로서 동정된다. 바람직하게는, PAPD5의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 화합물 또는 둘 다의 분자(PAPD5 및 PAPD7)를 감소시키는 화합물의 조합은 HBV 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 화합물로서 동정된다. 가장 바람직하게는, 분자 PAPD5 및 PAPD7 둘 다의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 화합물의 조합은 HBV 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 조성물로서 동정된다.
상기 기술된 선별 방법은 HBV 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 화합물 또는 화합물의 조합의 동정을 야기한다. 바람직하게는, 상기 화합물은 HBV 감염을 개선하고/거나 억제한다(즉, 치료한다). 따라서, 본원에 제공된 선별 방법은 HBV 감염을 치료하는 화합물의 동정에 유용하다.
본 발명에 있어서, PAPD5는 PAPD5 폴리펩티드 또는 PAPD5 mRNA일 수 있다. 본원에 제공된 선별 방법에 있어서, 바람직하게는 PAPD5는 PAPD5 mRNA이다.
본 발명의 한 양상은 본원에 제공된 선별 방법에 관한 것이되, 여기서 PAPD5를 발현하는 세포는 하기를 포함하거나 하기로 이루어진 PAPD5 표적 핵산을 함유한다:
(i) 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(ii) 서열번호 4, 5 또는 10의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 천연 변이체;
(iii) 폴리뉴클레오티드가 poly-A 폴리머라제 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 1 또는 2에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(iv) 뉴클레오티드 서열로부터 발현된 폴리펩티드가 poly-A 폴리머라제 기능을 갖는, 상기 (ii)의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열;
(v) 서열번호 1 또는 2의 효소적 활성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 서열번호 7 또는 8을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(vi) 폴리뉴클레오티드가 poly-A 폴리머라제 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 1 또는 2의 효소적 활성 단편의 아미노산 서열에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는
(vii) 서열번호 4, 5 또는 10을 포함하거나 이로 이루어진 뉴클레오티드 서열.
바람직한 양태에서, PAPD5 표적 핵산은 mRNA, 예컨대 미성숙 mRNA(pre-mRNA) 또는 성숙 mRNA이다. 추가적 양태에서, PAPD5 표적 핵산은 서열번호 4, 5 또는 10의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 천연 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드이다. 그러나, PAPD5 mRNA는 또한, 폴리뉴클레오티드가 poly-A 폴리머라제 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 4, 5 또는 10에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에 있어서, PAPD7는 PAPD7 폴리펩티드 또는 PAPD7 mRNA일 수 있다. 본원에 제공된 선별 방법에 있어서, 바람직하게는 PAPD7은 PAPD7 mRNA이다.
본 발명의 한 양상은 본원에 제공된 선별 방법에 관한 것이되, 여기서 PAPD7을 발현하는 세포는 하기를 포함하거나 하기로 이루어진 PAPD7 표적 핵산을 함유한다:
(i) 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(ii) 서열번호 6 또는 11의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 천연 변이체;
(iii) 폴리뉴클레오티드가 poly-A 폴리머라제 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 3에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(iv) 핵산 서열로부터 발현된 폴리펩티드가 poly-A 폴리머라제 기능을 갖는, 상기 (ii)의 핵산 서열에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열;
(v) 서열번호 3의 효소적 활성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 서열번호 9를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는
(vi) 폴리뉴클레오티드가 poly-A 폴리머라제 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 3의 효소적 활성 단편, 예컨대 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는
(vii) 서열번호 6 또는 11을 포함하거나 이로 이루어진 뉴클레오티드 서열.
바람직한 양태에서, PAPD7 표적 핵산은 mRNA, 예컨대 미성숙 mRNA 또는 성숙 mRNA이다. 추가적 양태에서, PAPD7 표적 핵산은 서열번호 6 또는 11의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 천연 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드이다. 그러나, PAPD7 mRNA는 또한 서열번호 6 또는 11과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 이때 폴리뉴클레오티드는 poly-A 폴리머라제 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명에 있어서, 선별에 사용되는 세포는 진핵생물 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 효모 세포 또는 척추동물 세포일 수 있다. 척추동물 세포는 어류, 조류, 파충류, 양서류, 유대류 및 포유류 세포를 포함한다. 바람직하게는, 세포는 포유류 세포, 가장 바람직하게는, 인간 세포이다. 포유류 세포는 또한 고양이, 개, 소, 말, 염소, 양, 돼지, 쥐, 예컨대 마우스 및 래트, 및 토끼 세포를 포함한다. 본원에 제공된 선별 방법에서, "세포"는 PAPD5 및/또는 PAPD7을 내인성으로 발현하거나 PAPD5 및/또는 PAPD7을 과발현할 수 있다. PAPD5 및/또는 PAPD7을 과발현하기 위하여, 세포는 발현 벡터 내에서 PAPD5 폴리펩티드 및/또는 PAPD7 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 세포는 PAPD5 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 PAPD7 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 제공된 선별 방법의 세포는 비-인간 동물, 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 흰족제비에 포함될 수 있다. 본원에 기술된 선별 방법에 제공된 세포는 또한 표적 세포로 지칭될 수 있다.
PAPD5 폴리펩티드 및/또는 PAPD7 폴리펩티드의 활성이 측정되는 본원에 제공된 선별 방법에서, 상기 PAPD5 및 PAPD7의 활성은 바람직하게는 poly-A 폴리머라제 기능(즉, poly-A 폴리머라제 활성)이다. 폴리펩티드(예를 들어 PAPD5 또는 PAPD7)의 poly-A 폴리머라제 기능/활성이 예컨대 문헌[Rammelt, RNA, 2011, 17:1737-1746]에 기술된 바와 같이, mRNA의 시험관내 폴리아데닐화를 모니터링함으로써 측정될 수 있다. 이러한 방법은 시험 화합물의 존재 및 부재 하에 PAPD5 및/또는 PAPD7의 poly-A 폴리머라제 기능을 측정하는데 사용될 수있다. 간략하게, 리보-올리고뉴클레오티드 A15는 ATP(A), CTP(C), GTP(G), UTP(U), 또는 4개 모두의 dNTP의 혼합물 각각의 존재 하에 대장균(Escherichia coli)에서 발현된 재조합 PAPD5 단백질과 함께 항온처리될 수 있다.
시험 화합물의 존재 및 부재 하에 PAPD5 및/또는 PAPD7의 발현은 예를 들어 (q)PCR, 웨스턴 블롯(western blot) 또는 질량 분석에 의해 측정될 수 있다.
HBV의 번식을 억제하는 화합물은 바이러스 RNA의 발현을 감소시키고/거나 바이러스 RNA(HBV RNA)로부터 유래하는 바이러스 DNA(HBV DNA)의 생산을 감소시키고/거나 신규한 바이러스 입자(HBV 입자)의 생산을 감소시키고/거나 HBsAg 및/또는 HBeAg의 생산 및/또는 분비를 생성하는 화합물일 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 양상은 HBV의 번식을 억제하는 화합물이 HBsAg의 분비를 억제하고/거나 HBeAg의 분비를 억제하고/거나 세포내 HBV mRNA 또는 HBV DNA의 생산을 억제하는 본원에 제공된 선별 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, HBV의 번식을 억제하는 화합물은 HBsAg의 분비, HBeAg의 분비 및 세포내 HBV mRNA의 생산을 억제하는 화합물이다.
예를 들어, HBV의 번식을 억제하는 화합물은 바이러스 RNA(HBV RNA)의 발현, 바이러스 RNA로부터 유래하는 바이러스 DNA(HBV DNA)의 생산, 신규한 바이러스 입자(HBV 입자)의 생산, HBsAg 및/또는 HBeAg의 생산 및/또는 분비를, 처리되지 않은 세포 또는 동물, 또는 적절한 대조군으로 처리된 세포 또는 동물과 비교할 때, 10 내지 100%, 바람직하게는 20 내지 100%, 더욱 바람직하게는 30 내지 100%, 더욱 더 바람직하게는 40 내지 100%, 더욱 더 바람직하게는 50 내지 100%, 더욱 더 바람직하게는 60 내지 100%, 더욱 더 바람직하게는 70 내지 100%, 더욱 더 바람직하게는 80 내지 100%, 가장 바람직하게는 90 내지 100%만큼 감소시킬 수 있다.
HBV의 번식의 억제는, 예컨대 시험 화합물이 HBsAg 및/또는 HBeA의 분비를 억제하고/거나 세포내 HBV mRNA 또는 HBV DNA의 생산을 억제하는 활성을 갖는지 여부를 측정함으로써 측정될 수 있다. HBsAg 및/또는 HBeAg의 분비의 억제는 ELISA, 예컨대 제조사의 설명에 따라 CLIA ELISA 키트(오토바이오 다이아그노스틱(Autobio Diagnostic))를 사용하여 측정될 수 있다. 세포내 HBV mRNA의 생산의 억제는 실시간 PCR에 의해, 예컨대 하기 실시예에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다. 시험 화합물이 HBV의 번식을 억제하는지 여부를 평가하기 위한 추가 방법은 RT-qPCR(예컨대 국제 특허공개공보 제2015/173208호에 기술된 바와 같거나 하기 실시예에 기술된 바와 같음); 노던 블롯(Northern Blot); 동일 반응계 혼성화 또는 면역-형광에 의해 HBV DNA의 분비를 측정하는 것이다.
본원에 제공된 선별 방법은 시험 화합물을 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수있다. 상기 대조군은 불활성 시험 화합물일 수 있고, 여기서 상기 불활성 시험 화합물은 PAPD5 또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 감소시키지 않는 화합물이다.
이러한 불활성 시험 화합물은 HBV에 대한 활성을 갖지 않고, 예를 들어 이는 HBsAg 및 HBeAg 분비의 억제 및 세포내 HBV mRNA 생산의 억제를 야기하지 않는다. 예를 들어, 불활성 시험 화합물은 6 μM 초과의 HBsAg의 억제에 있어서의 IC50 값을 가질 수 있다. 본원에 제공된 선별 방법에서, 불활성 시험 화합물은 비-표적화 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA일 수 있다. PAPD5 및/또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성이 측정되는 선별 방법에서, 상기 (i)에서 정의된 시험 화합물이 사용될 수 있다. 불활성 화합물은 활성 화합물로부터 화학적 변형 및/또는 기능 방해에 의해 디자인될 수 있다.
본원에 제공된 선별 방법을 수행하기 위해, 공개적으로 또는 상업적으로 입수가능한 분자 라이브러리가 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 상기 시험 화합물은 하기로부터 선택되는 핵산 분자의 선별 라이브러리일 수 있다:
(i) 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 하나 이상의 2' 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드;
(ii) siRNA 분자; 또는
(iii) shRNA 분자.
하기 실시예는 PAPD5 및/또는 PDPD7 폴리펩티드 또는 mRNA를 억제함으로써 HBsAg 및 HBeAg의 분비 및 세포내 HBV mRNA의 생산을 효과적으로 억제할 수 있음을 입증한다. 이들 데이터는 PAPD5 및/또는 PAPD7의 억제제가 HBV 감염을 예방하고/거나 치료하는데 사용될 수 있음을 보여준다.
HBV 감염의 치료에 있어서 특정 효능을 갖는 여러 소분자는 당분야에 기술되어 있다(예를 들어 국제 특허공개공보 제2015/113990 A1호 및 국제 특허공개공보 제2016/177655호 참조). 하기 실시예는 HBV 감염에 대한 소분자 화합물의 활성과 PAPD5 및 PAPD7에 대한 결합 친화도 사이의 명백한 상호연관성을 처음으로 입증한다. 이러한 깨달음은 특히 높은 항-HBV 효능을 야기하는 PAPD5 또는 PAPD7 mRNA를 표적화하는 핵산 분자의 디자인을 가능하게 하였다. 핵산 분자는 아시알로당단백질 수용체(ASGPr)에 결합할 수 있는 접합체를 사용하여 간에 직접적으로 표적화될 수 있다. 전신 투여된 소분자와 비교하여, 핵산 분자는 상이한 PK/PD 프로필 및 독성 프로필을 가질 것이다. 또한, 본 발명은 PAPD5 또는 PAPD7, 또는 특히 PAPD5 및 PAPD7을 억제하는 화합물이 HBsAg 및 HBeAg 분비 및 세포내 HBV mRNA 생산의 억제의 측면에서 대단히 높은 활성을 가짐을 처음으로 증명한다. HBsAg 및 HBeAg 분비의 감소는 HBsAg 분비만을 감소시키는 것과 비교하여 보다 효과적으로 만성 HBV 감염의 발생을 억제한다. 또한, HBsAg 및 HBeAg 분비의 억제는 HBV 감염된 인간의 전염력을 감소시킨다. 또한, 출산을 앞둔 모체에서 HBeAg의 감소는 그녀의 자식의 만성 HBV 감염의 발생을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명은, PAPD5 또는 PAPD7 표적 핵산을 억제하는 화합물 또는 PAPD5 및 PAPD7 표적 핵산 모두를 억제하는 화합물의 조합을 선택적으로 사용하는 것이 HBsAg 및 HBeAg를 상당히 보다 효과적으로 감소시키는 면에서 HBV 감염의 개선된 치료적 성과를 야기함을 예상외로 입증하였다.
따라서, 본 발명의 한 양상은 HBV 감염, 특히 만성 HBV 감염에서 PAPD5 또는 PAPD7 표적 핵산을 감소시킬 수 있는 하나 이상의 억제제 또는 PAPD5 및 PAPD7 표적 핵산 모두의 발현을 억제하는 화합물의 조합을 사용하는 것이다. 추가적 양태에서, 본 발명은 바이러스 항원 HBsAg 및 HBeAg의 감소에서 PAPD5 및/또는 PAPD7 표적 핵산을 억제할 수 있는 2개 이상의 억제제의 사용에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 PAPD5 및/또는 PAPD7의 억제제 또는 억제제의 조합에 관한 것으로서, 상기 억제제는 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) PAPD5 또는 PAPD7에 대한 하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자; 및
(b) (i) 부위-특이적 DNA 뉴클레아제 또는 부위-특이적 DNA 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
(ii) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 게놈 편집 기계.
RNAi 분자는 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
a) 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드;
b) siRNA 분자; 및
c) shRNA 분자.
또한, 본 발명의 억제제는 PAPD5 또는 PAPD7 특이적 잠금 핵산(LNA) 분자일 수 있다.
본 발명의 억제제가 HBV 감염의 치료(예를 들어 개선)를 위해 사용될 수 있음이 예상된다.
억제제는 PAPD7을 특이적으로 억제하는 분자일 수 있다. 바람직하게는, 억제제는 PAPD5를 특이적으로 억제하는 분자일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 억제제는 PAPD5 및 PAPD7 모두를 억제하도록 조합된다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 억제제는 PAPD5를 억제하거나, PAPD5 및 PAPD7 모두를 억제하도록 조합된다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 억제제는 PAPD5 및 PAPD7을 억제하도록 조합된다. 본 발명의 한 양상에서, 본 발명의 억제제는 PAPD5 및 PAPD7 모두를 억제하도록 조합되고 약물 부재의 대조군과 비교하여(즉, 약물을 투여받지 않은 세포 또는 개체와 비교하여) 50% 이상의 HBsAg 및/또는 HBeAg 분비의 감소를 야기한다.
본 발명의 억제제는 HBsAg 및 HBeAg의 억제에서 6 μM 미만, 바람직하게는 5 μM 미만, 바람직하게는 4 μM 미만, 바람직하게는 3 μM 미만, 바람직하게는 2 μM 미만, 더욱 바람직하게는 1 μM 미만, 더욱 바람직하게는 0.5 μM 미만, 가장 바람직하게는 0.1 μM 미만의 IC50 값을 가질 수 있다.
부위-특이적 DNA 뉴클레아제(예컨대, Cas9 또는 Cpf1) 및 가이드 RNA를 사용하는 게놈 편집은 당분야에 통상적으로 공지되어 있고, 예컨대 문헌["CRISPR-Cas: A Laboratory Manual", 2016, edited by Jennifer Doudna, ISBN 978-1-621821-31-1]에 기술된다.
예를 들어, 상기 부위-특이적 DNA 뉴클레아제가 Cas9 뉴클레아제인 경우, 게놈 편집 기계는 바람직하게는 (i) 하나 이상의 표적 서열 특이적 CRISPR RNA(crRNA) 분자 및 하나 이상의 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA) 분자로 이루어진 하나 이상의 가이드 RNA; (ii) 상기 (i)의 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iii) 하나 이상의 가이드 RNA(하나 이상의 표적 서열 특이적 crRNA 및 하나 이상의 tracrRNA를 포함하는 키메라 RNA 분자임); 또는 (iv) 상기 (iii)의 키메라 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
다른 예에서, 부위-특이적 DNA 뉴클레아제는 Cpf1 뉴클레아제이고, 게놈 편집 기계는 바람직하게는 (i) 표적 서열 특이적 CRISPR RNA(crRNA) 분자를 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA; 또는 (ii) 상기 (i)의 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
본원에 제공된 PAPD5 및/또는 PAPD7의 억제제는 또한 하나 이상의 사전-조립된 Cas9 단백질-가이드 RNA 리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)를 포함하는 게놈 편집 기계일 수 있다.
본원에서, 가이드 RNA는 게놈 PAPD5 또는 PAPD7 DNA를 표적화시키도록 고안된다. 다르게는, PAPD5 및 PAPD7의 게놈 DNA가 표적화될 수 있도록 여러 가이드 RNA가 사용된다. PAPD5 및/또는 PAPD7의 억제는 비-상동성 말단-연결(NHEJ)을 통해 골격-이동 녹-아웃 돌연변이를 게놈 PAPD5 및/또는 PAPD7 DNA로 도입함으로써, 또는 상동-유도 수선(HDR)을 통해 게놈 PAPD5 및/또는 PAPD7 DNA를 변형시킴으로써, 달성될 수 있다. 이러한 기전이 유도될 수 있는 방법은 당분야에 통상적으로 공지되어 있고, 예컨대 문헌[Heidenreich, 2016, Nat Rev Neurosci 17 36-44]에 기술된다.
본 발명의 억제제는 바람직하게는 비-천연 발생 분자이다. 본 발명의 억제제는 siRNA, shRNA, Crisper RNA 및 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 제제로부터 선택된 핵산 분자일 수 있다. 바람직하게는, RNAi 분자는 하나 이상의 비-천연 발생 뉴클레오티드, 예컨대 올리고뉴클레오티드 티오포스페이트 치환된 리보-올리고뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오시드, LNA 뉴클레오시드, PNA 뉴클레오시드, GNA(글리콜 핵산) 분자, TNA(트레오스 핵산) 분자, 모폴리노 뉴클레오티드, 또는 변형된 주쇄, 예컨대 폴리실록산, 2'-O-(2-메톡시) 에틸-포스포로티오에이트를 갖는 핵산, 또는 치환기를 갖는 핵산, 예컨대 메틸-, 티오-, 설페이트, 벤조일-, 페닐-, 아미노-, 프로필-, 클로로- 및 메타노카바뉴클레오시드, 또는 이의 검출을 가능하게 하는 리포터 분자를 포함한다. 또한, 본 발명의 억제제는 천연 발생 또는 비-천연 발생 소분자 또는 게놈 편집 기계일 수 있다.
본 발명에 있어서, PAPD5 또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 억제하는 억제제가 본원에 제공된다.
예를 들어, 본 발명의 억제제는 PAPD5 표적 핵산에 결합하고 PAPD5 폴리펩티드의 활성을 억제한다. 또 다른 예에서, 본 발명의 억제제는 PAPD7 표적 핵산에 결합하고 PAPD7 폴리펩티드의 활성을 억제한다. 본원에서 바람직하게, 억제제는 PAPD5 및 PAPD7 mRNA 모두를 표적화하도록 조합되고 PAPD5 및 PAPD7 폴리펩티드 모두의 활성을 억제한다. 본 발명의 억제제는 PAPD5 또는 PAPD7의 발현을 억제할 수 있거나; 억제제의 조합이 PAPD5 및 PAPD7 모두의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 화합물
상기에 기술된 바와 같이, 본 발명의 억제제는 핵산 분자일 수 있다.
본 발명의 한 양상에서, 본 발명의 억제제는 PAPD5 또는 PAPD7에 대한 RNAi 분자이다. 상기 RNAi 분자는 siRNA 또는 shRNA일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 억제제는 PAPD5를 지향하는 siRNA일 수 있되, 상기 siRNA는 하기 siRNA 중 어느 하나 또는 이들의 조합이다:
PAPD5 siRNA 풀(L-010011-00-0010; ON-TARGETplus 인간 PAPD5):
siRNA - 1 - J-010011-05 - 표적 서열: CAUCAAUGCUUUAUAUCGA(서열번호 252)
siRNA - 2 - J-010011-06 - 표적 서열: GGACGACACUUCAAUUAUU(서열번호 253)
siRNA - 3 - J-010011-07 - 표적 서열: GAUAAAGGAUGGUGGUUCA(서열번호 254)
siRNA - 4 - J-010011-08 - 표적 서열: GAAUAGACCUGAGCCUUCA(서열번호 255)
또한, 본 발명의 억제제는 PAPD7을 지향하는 siRNA일 수 있되, 상기 siRNA는 하기 siRNA 중 어느 하나 또는 이들의 조합일 수 있다:
PAPD7 siRNA 풀(L-009807-00-0005; ON-TARGETplus 인간 PAPD7):
siRNA - 1 - J-009807-05 - 표적 서열: GGAGUGACGUUGAUUCAGA(서열번호 256)
siRNA - 2 - J-009807-06 - 표적 서열: CGGAGUUCAUCAAGAAUUA(서열번호 257)
siRNA - 3 - J-009807-07 - 표적 서열: CGGAGUUCAUCAAGAAUUA(서열번호 258)
siRNA - 4 - J-009807-08 - 표적 서열: GCGAAUAGCCACAUGCAAU(서열번호 259)
상기에서, 적합한 siRNA의 표적 서열을 나타냈다. 상응하는 siRNA의 서열은 이들 표적 서열에 직접적으로 상보성이다.
본 발명에 있어서, 조합 제제가 PAPD5 및 PAPD7 모두의 발현을 억제하기 위해 (a) PAPD5를 지향하는 siRNA와 (b) PAPD7을 지향하는 siRNA의 조합을 포함할 수 음이 예상된다.
또한, 본 발명에 있어서, 조합 제제가 PAPD5 및 PAPD7 모두의 발현을 억제하기 위해 (a) PAPD5를 지향하는 shRNA와 (b) PAPD7을 지향하는 shRNA의 조합을 포함할 수 있음이 예상된다. 이와 관련해서, (a)의 shRNA 분자는 하기 shRNA 분자 중 하나 이상일 수 있다:
CCGGGCCACATATAGAGATTGGATACTCGAGTATCCAATCTCTATATGTGGCTTTTTG(서열번호 260)
CCGGCCAACAAATCTCAGCATGGATCTCGAGATCCATGCTGAGATTTGTTGGTTTTTG(서열번호 261)
CCGGCGCCTGTAATCCCAGCACTTTCTCGAGAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTTTTTG(서열번호 262)
CCGGGCCTGTAATCCCAGCACTTTACTCGAGTAAAGTG CTG GGATTACAGGCTTTTTG(서열번호 263)
CCGGCGATGTTGGAAGGAGTTCATACTCGAGTATGAACTCCTTCCAACATCGTTTTTG(서열번호 264)
본 발명의 추가적 양상에서, RNAi 분자는 PAPD5 또는 PAPD7의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. PAPD5 또는 PAPD7을 코딩하는 표적 핵산을 혼성화함으로써 조절할 수 있다. 표적 핵산은 포유류 PAPD5, 예컨대 서열번호 4, 5 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 이의 천연 변이체일 수 있다.
표적 핵산은 포유류 PAPD7, 예컨대 서열번호 6 또는 11로부터 선택된 서열 또는 이의 천연 변이체일 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 PAPD5 또는 PAPD7을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이를 억제하거나 하향조절함으로써 발현을 조절할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 조절은 표적의 정상 발현 수준과 비교하여 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 표적의 정상 발현 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 발현의 억제를 생성한다. 일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 시험관내 HeLa 세포 또는 HepaRG 세포의 사용시 PAPD5 또는 PAPD7 mRNA의 발현 수준을 적어도 60% 또는 70%만큼 억제할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 화합물은 시험관내 HeLa 세포 또는 HepaRG 세포의 사용시 PAPD5 또는 PAPD7 단백질의 발현 수준을 적어도 50%만큼 억제할 수 있다. PAPD5 또는 PAPD7 RNA 또는 단백질 억제를 측정하는데 사용될 수 있는 적합한 검정은 상기 선별 방법 하에 기술되어 있다. 표적 조절은 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열과 표적 핵산 사이의 혼성화에 의해 촉발된다.
본 발명의 한 양상은 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 인접 뉴클레오티드 서열은 PAPD5에 대해 90% 이상 상보성이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 PAPD5의 발현을 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 인접 뉴클레오티드 서열은 PAPD7에 대해 90% 이상 상보성이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 PAPD7의 발현을 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 영역 또는 표적 서열에 대해 90% 이상, 예컨대 91% 이상, 예컨대 92% 이상, 예컨대 93% 이상, 예컨대 94% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예컨대 98% 이상 또는 100% 상보성인 인접 서열을 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산의 영역에 대해 완전히 상보성(100% 상보성)이거나, 일부 양태에서 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이에 1 또는 2개의 미스매치(mismatch)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4, 5 또는 10에 존재하는 표적 핵산 영역, 예컨대 표적 서열에 대해 90% 이상 상보성인, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성인 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 서열번호 10에 존재하는 상응하는 표적 핵산 영역에 대해 100% 상보성이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 서열번호 4, 5 또는 10에 존재하는 상응하는 표적 핵산 영역에 대해 100% 상보성이다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 6 또는 11에 존재하는 표적 핵산 영역, 예컨대 표적 서열에 대해 90% 이상 상보성인, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성인 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 서열번호 11에 존재하는 상응하는 표적 핵산 영역에 대해 100% 상보성이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 서열번호 6 또는 11에 존재하는 상응하는 표적 핵산 영역에 대해 100% 상보성이다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 10 내지 35개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 10 내지 30개, 예컨대 11 내지 22개, 예컨대 12 내지 20개, 예컨대 14 내지 20개, 예컨대 14 내지 18개, 예컨대 14 내지 16개, 예컨대 16 내지 20개의 인접 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은 22 개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 20개 이하의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 제시된 임의의 범위는 범위의 종점을 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드가 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다고 하는 경우, 10개 뉴클레오티드 및 30개의 뉴클레오티드가 포함된다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 재료 및 방법 섹션의 표 3에 열거된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12 내지 131(표 3에 열거된 모티프 서열 참조)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15, 18, 23, 25, 26, 30, 32, 39, 54, 56, 58, 65, 80, 88, 92, 93, 111, 115, 116 및 118(표 3에 열거된 모티프 서열 참조)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 23, 26, 54, 56, 80, 93 및 115로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 재료 및 방법 섹션의 표 4에 열거된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 132 내지 251(표 4에 열거된 모티프 서열 참조)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 및 244(표 4에 열거된 모티프 서열 참조)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 172, 188, 190, 229 및 239로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
추가적 양상에서, 본 발명은 a) PAPD5의 발현 및/또는 활성을 억제하는 핵산 분자; 및 b) PAPD7의 발현 및/또는 활성을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 조합 제제에 관한 것이다. 특정 양태에서, 핵산 분자는 본원에 기술된 siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 252, 253, 254 및 255 중 하나 이상으로부터 선택된 PAPD5 표적 서열을 표적화하는 하나 이상의 siRNA 분자; 및 b) 서열번호 256, 257, 258 및 259 중 하나 이상으로부터 선택된 PAPD7 표적 서열을 표적화하는 하나 이상의 siRNA 분자를 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 252, 253, 254 및 255 중 하나 이상으로부터 선택된 PAPD5 표적 서열을 표적화하는 하나 이상의 siRNA 분자; 및 b) 서열번호 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 및 244로 이루어진 군으로부터 선택된 PAPD7 표적 서열을 표적화하는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 15, 18, 23, 25, 26, 30, 32, 39, 54, 56, 58, 65, 80, 88, 92, 93, 111, 115, 116 및 118로 이루어진 군으로부터 선택된 PAPD5 표적 서열을 표적화하는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자; 및 b) 서열번호 256, 257, 258 및 259 중 하나 이상으로부터 선택된 PAPD7 표적 서열을 표적화하는 하나 이상의 siRNA 분자를 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 260, 261, 262, 263 및 264 중 하나 이상으로부터 선택된 PAPD5 표적 서열을 표적화하는 하나 이상의 shRNA 분자; 및 b) 서열번호 256, 257, 258 및 259 중 하나 이상으로부터 선택된 PAPD7 표적 서열을 표적화하는 하나 이상의 siRNA 분자를 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 260, 261, 262, 263 및 264 중 하나 이상으로부터 선택된 PAPD5 표적 서열을 표적화하는 하나 이상의 shRNA 분자; 및 b) 서열번호 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 및 244로 이루어진 군으로부터 선택된 PAPD7 표적 서열을 표적화하는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 15, 18, 23, 25, 26, 30, 32, 39, 54, 56, 58, 65, 80, 88, 92, 93, 111, 115, 116 및 118로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열; 및 b) 서열번호 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 및 244로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 18, 23, 25, 26, 32, 39, 54, 56, 80, 92, 93, 116 및 118로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열; 및 b) 서열번호 153, 155, 172, 174, 183, 188, 190, 195, 197, 221, 224, 229, 232 및 244로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 18의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열; 및 b) 서열번호 221의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 23의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열; 및 b) 서열번호 172 또는 188의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 25의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열; 및 b) 서열번호 174 또는 183의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 26의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열; 및 b) 서열번호 183의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 39의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열; 및 b) 서열번호 229의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 54의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열; 및 b) 서열번호 190 또는 232의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 56의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열; 및 b) 서열번호 153 또는 244의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 80의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열; 및 b) 서열번호 153 또는 244의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 92의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열; 및 b) 서열번호 190 또는 232의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 조합 제제는 a) 서열번호 116의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열; 및 b) 서열번호 155 또는 195의 서열에 대해 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
올리고뉴클레오티드 디자인
올리고뉴클레오티드 디자인은 올리고뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드 당 변형의 패턴을 지칭한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하고, DNA 또는 RNA 뉴클레오시드를 또한 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 당 변형된 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드로의 변형된 뉴클레오시드의 혼입은 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 강화시킬 수 있다. 이러한 경우, 변형된 뉴클레오시드는 친화도 강화 변형된 뉴클레오티드로 언급될 수 있다. 변형된 뉴클레오시드는 또한 단위로 지칭될 수 있다.
양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 8개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 8개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 3 내지 7개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 6개의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산(ANA), 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 더욱 더 바람직하게는, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드는 잠금 핵산(LNA)이다.
추가 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다. 바람직한 양태에서, 인접 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트 뉴클레오시드간 연결기이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 모든 뉴클레오티드간 연결기는 포스포로티오에이트 연결기이다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 8개의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 8개의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 3 내지 7개의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 6개의 LNA 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드 및 하나 이상의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 모집할 수 있다.
갭머(gapmer) 디자인
바람직한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 본원에서 단지 "갭머"로도 지칭되는 갭머 디자인 또는 구조를 갖는다. 갭머 구조에서, 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 별개의 구조 영역 5'-플랭크, 갭 및 3'-플랭크, F-G-F'를 '5 -> 3' 방향으로 포함한다. 이러한 디자인에서, 플랭킹 영역 F 및 F'(또한 윙 영역으로 지칭됨)은 PAPD5 또는 PAPD7 표적 핵산에 상보성인 변형된 뉴클레오시드의 인접 스트레치를 포함하는 한편, 갭 영역(G)은 뉴클레아제, 바람직하게는 엔도뉴클레아제, 예컨대 RNase, 예를 들어 RNase H를 모집할 수 있는 뉴클레오티드의 인접 스트레치를 포함하고, 이때 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산과 듀플렉스로 존재한다. 바람직한 양태에서, 갭 영역은 DNA 뉴클레오시드로 이루어진다. 영역 G의 5' 및 3' 말단을 플랭킹하는 영역 F 및 F'는, 바람직하게는 비-뉴클레아제 모집 뉴클레오시드(3' 엔도 구조를 갖는 뉴클레오시드), 더욱 바람직하게는 하나 이상의 친화도 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 3' 플랭크는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드, 바람직하게는 2개 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 5' 플랭크는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 5' 및 3' 플랭킹 영역 둘 다는 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 플랭킹 영역 내의 모든 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 다른 양태에서, 플랭킹 영역은 LNA 뉴클레오시드 및 다른 뉴클레오시드를 둘 다(예컨대, DNA 뉴클레오시드 및/또는 비-LNA 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오시드) 포함할 수 있다(혼합된 플랭크). 이러한 경우, 갭은 친화도 강화 변형된 뉴클레오시드, 바람직하게는 LNA, 예컨대 베타-D-옥시-LNA에 의해 5' 및 3' 말단에서 플랭킹된 5개 이상의 RNase H 모집 뉴클레오시드(2' 엔도 구조를 갖는 뉴클레오시드, 바람직하게는 DNA)의 인접 서열로 정의된다. 결과적으로, 갭 영역의 인근에 존재하는 5' 플랭킹 영역 및 3' 플랭킹 영역의 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드, 바람직하게는 비-뉴클레아제 모집 뉴클레오시드 또는 고친화도 뉴클레오시드이다.
영역 F
영역 F(5' 플랭크 또는 5' 윙)는 영역 G의 5' 말단에 부착되고, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 함유하거나 이로 이루어진다. 한 양태에서, 영역 F는 1 내지 4개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 4개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 3개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3 또는 4개의 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어진다. F 영역은 영역의 5' 말단 및 3' 말단에 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 가짐으로써 정의된다.
일부 양태에서, 영역 F의 변형된 뉴클레오시드는 3' 엔도 구조를 갖는다.
한 양태에서, 영역 F의 변형된 뉴클레오시드 중 하나 이상은 2' 변형된 뉴클레오시드이다. 한 양태에서, 영역 F의 모든 뉴클레오시드는 2' 변형된 뉴클레오시드이다.
또 다른 양태에서, 영역 F는 2' 변형된 뉴클레오시드 이외에 DNA 및/또는 RNA 뉴클레오시드를 포함한다. DNA 및/또는 RNA를 포함하는 플랭크는 F 영역의 5' 말단 및 3' 말단(G 영역의 인근임)에 2' 변형된 뉴클레오시드를 갖는 것에 의해 특성규명된다. 플랭크의 DNA 뉴클레오시드는 바람직하게는 RNase H를 모집할 수 없어야 한다. 플랭크에 DNA 및/또는 RNA 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드의 5' 플랭크(영역 F)의 길이는 보다 길어 상기에 기술된 바와 같이 2' 변형된 뉴클레오티드의 수를 1 내지 4로 유지할 수 있다. 추가적 양태에서, 영역 F의 2' 변형된 뉴클레오시드 중 하나 이상은 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, LNA 단위, 아라비노 핵산(ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위로부터 선택될 수 있다.
일부 양태에서, F 영역은 LNA 및 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드를 둘 다 포함한다. 이들은 종종 혼합된 윙 또는 혼합된 플랭크 올리고뉴클레오티드로 지칭된다.
본 발명의 한 양태에서, 영역 F 내의 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 양태에서, 영역 F 내의 모든 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 양태에서, 영역 F 내의 LNA 뉴클레오시드는 독립적으로 옥시-LNA, 티오-LNA, 아미노-LNA, cET 및/또는 ENA(베타-D 또는 알파-L 배열 또는 이들의 조합임)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 영역 F는 인접 서열의 5' 말단에서 1개 이상의 베타-D-옥시 LNA 단위를 포함한다. 추가적 바람직한 양태에서, 영역 F는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드로 이루어진다.
영역 G
영역 G(갭 영역)는 바람직하게는 RNase H 뉴클레아제를 모집할 수 있는 4 내지 18개, 5 내지 17개, 6 내지 16개 또는 8 내지 12개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나 함유하거나 이로 이루어진다.
뉴클레아제를 모집할 수 있는 영역 G의 뉴클레오시드 단위는 한 양태에서 DNA, 알파-1-LNA, C4' 알킬화된 DNA(국제 특허출원 제PCT/EP2009/050349호 및 문헌[Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300], 둘 다 참고로서 본원에 혼입됨), 아라비노스 유래된 뉴클레오시드, 예컨대 ANA 및 2'F-ANA(문헌[Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661]), UNA(비잠금 핵산)(문헌[Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039]에 기술됨, 참고로서 본원에 혼입됨)로 이루어진 군으로부터 선택된다. UNA는, 전형적으로 리보스의 C2와 C3 사이의 결합이 제거되어 비잠금 "당" 잔기를 형성하는 비잠금 핵산이다.
일부 양태에서, 영역 G는 100% DNA 단위로 이루어진다.
추가적 양태에서, 영역 G는 DNA, 및 RNase H 절단을 매개할 수 있는 다른 뉴클레오시드의 혼합물로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 영역 G의 뉴클레오시드는 2' 엔도 구조를 갖는다.
영역 F'
영역 F'(3' 플랭크 또는 3' 윙)는 영역 G의 3' 말단에 부착되고, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 함유하거나 이로 이루어진다. 한 양태에서, 영역 F'는 1 내지 4개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 4개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 3개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3 또는 4개의 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어진다. F' 영역은 영역의 5' 말단 및 3' 말단에 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 갖는 것에 의해 정의된다.
일부 양태에서, 영역 F' 내의 변형된 뉴클레오시드는 3' 엔도 구조를 갖는다.
한 양태에서, 영역 F' 내의 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드는 2' 변형된 뉴클레오시드이다. 한 양태에서, 영역 F' 내의 모든 뉴클레오시드는 2' 변형된 뉴클레오시드이다.
또 다른 양태에서, 영역 F'는 2' 변형된 뉴클레오시드 이외에 DNA 및/또는 RNA 뉴클레오시드를 포함한다. DNA 및/또는 RNA를 포함하는 플랭크는 F' 영역의 5' 말단 및 3'말단에서(G 영역의 인근임) 2' 변형된 뉴클레오시드를 갖는 것에 의해 특성규명된다. 플랭크의 DNA 뉴클레오시드는 바람직하게는 RNase H를 모집할 수 없어야 한다. 플랭크에서 DNA 및/또는 RNA 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드의 3' 플랭크(영역 F')의 길이는 보다 길어 상기에 기술된 바와 같이 2' 변형된 뉴클레오티드의 수를 1 내지 4로 유지할 수 있다. 추가적 양태에서, 영역 F'의 2' 변형된 뉴클레오시드 중 하나 이상은 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, LNA 단위, 아라비노 핵산(ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위로부터 선택된다.
일부 양태에서, F' 영역은 LNA 및 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드를 둘 다 포함한다. 이들은 종종 혼합된 윙 또는 혼합된 플랭크 올리고뉴클레오티드로 지칭된다.
본 발명의 한 양태에서, 영역 F' 내의 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 양태에서, 영역 F' 내의 모든 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 양태에서, 영역 F' 내의 LNA 뉴클레오시드는 독립적으로 옥시-LNA, 티오-LNA, 아미노-LNA, cET 및/또는 ENA(베타-D 또는 알파-L 배열 또는 이들의 조합)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 영역 F'는 인접 서열의 3' 말단에서 2개 이상의 베타-D-옥시 LNA 단위를 갖는다. 추가적 바람직한 양태에서, 영역 F'는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드로 이루어진다.
영역 D' 및 D''
영역 D' 및 D"는 각각 영역 F의 5' 말단 또는 영역 F'의 3' 말단에 부착될 수 있다.
영역 D' 또는 D"는 독립적으로 표적 핵산에 상보성이거나 비-상보성일 수 있는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 일부 양태에서 추가적인 뉴클레오티드에 의해 5' 및/또는 3' 말단에서 플랭킹되는 표적을 조절할 수 있는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 뉴클레오티드는 생체절단성 연결기에 민감한 뉴클레아제로서 역할을 할 수 있다(연결기의 정의 참고). 일부 양태에서, 추가적인 5' 및/또는 3' 말단 뉴클레오티드는 포스포다이에스터 연결기와 연결되고, DNA 또는 RNA일 수 있다. 또 다른 양태에서, 추가적인 5' 및/또는 3' 말단 뉴클레오티드는, 예를 들어 뉴클레아제 안정성을 강화시키기 위해 또는 합성의 용이함을 위해 포함될 수 있는 변형된 뉴클레오티드이다. 한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 서열에 어하여 영역 D' 및/또는 D"를 포함한다.
본 발명의 갭머 올리고뉴클레오티드는 하기 구조식으로 표시될 수 있다:
F-G-F'; 특히 F1-7-G4-12-F'1-7
D'-F-G-F', 특히 D'1-3-F1-7-G4-12-F'1-7
F-G-F'-D'', 특히 F1-7-G4-12-F'1-7-D''1-3
D'-F-G-F'-D'', 특히 D'1-3-F1-7-G4-12-F'1-7-D''1-3
영역 F, G 및 F', D' 및 D" 내의 바람직한 개수 및 유형은 상기 기술되어 있다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 14 내지 20개의 뉴클레오티드 길이로 이루어진 갭머이되, 각각의 영역 F 및 F'는 독립적으로 1, 2, 3 또는 4개의 변형된 뉴클레오시드 단위로 이루어지고, 영역 G는 PAPD5 또는 PAPD7 표적 핵산과의 듀플렉스로 존재할 때 뉴클레아제를 모집할 수 있는 6 내지 17개의 뉴클레오시드 단위로 이루어지고, 올리고뉴클레오티드는 PAPD5 또는 PAPD7 표적 핵산에 상보성이다.
모든 경우에, F-G-F' 디자인은 1, 2 또는 3개의 뉴클레오시드 단위, 예컨대 DNA 단위를 가질 수 있는 영역 D' 및/또는 D"를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 영역 F 및 F' 내의 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드인 반면, 영역 G 내의 뉴클레오티드는 바람직하게는 비변형된 뉴클레오시드이다.
각각의 디자인에서, 바람직한 변형된 뉴클레오시드는 LNA이다.
또 다른 양태에서, 갭머 내의 갭 내의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 및/또는 보라노포스페이트 연결기이다. 다른 양태에서, 갭머 내의 플랭크(F 및 F' 영역) 내의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 및/또는 보라노포스페이트 연결기이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 갭머 내의 D' 및 D" 영역 내의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포다이에스터 연결기이다.
본원에 개시된 특정 갭머의 경우, 사이토신(C) 잔기가 5-메틸-사이토신으로 주석이 달릴 때, 다양한 양태에서, 올리고뉴클레오티드에 존재하는 C 중 하나 이상은 비변형된 C 잔기일 수 있다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 12_1 내지 131_1(표 3에 열거된 올리고뉴클레오티드 참조)을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 15_1, 18_1, 23_1, 25_1, 26_1, 30_, 32_1, 39_1, 54_1, 56_1, 58_1, 65_1, 80_1, 88_1, 92_1, 93_1, 111_1, 115_1, 116_1 및 118_1(표 3에 열거된 올리고뉴클레오티드 참조)을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 23_1, 26_1, 54_1, 56_1, 80_1, 93_1 및 115_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 132_ 내지 251_1(표 4에 열거된 올리고뉴클레오티드 참조)을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 153_1, 155_1, 168_1, 171_1, 172_1, 174_1, 183_1, 184_1, 188_1, 190_1, 191_1, 194_1, 195_1, 197_1, 221_1, 224_1, 229_1, 232_1, 239_1 및 244_1(표 4에 열거된 올리고뉴클레오티드 참조)을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 172_1, 188_1, 190_1, 229_1 및 237_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 양태는 a) 화합물 번호 18_1, 25_1, 26_1, 32_1, 39_1, 54_1, 56_1, 80_1, 92_1, 93_1, 116_1 및 118_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드; 및 b) 화합물 번호 153_1, 155_1, 168_1, 171_1, 172_1, 174_1, 183_1, 184_1, 188_1, 190_1, 191_1, 194_1, 195_1, 197_1, 221_1, 224_1, 229_1, 232_1, 23_19 및 244_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조합 제제이다.
본 발명의 한 양태는 a) 화합물 번호 18_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 및 b) 화합물 번호 221_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 조합 제제이다.
본 발명의 한 양태는 a) 화합물 번호 23_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 및 b) 화합물 번호 172_1 또는 188_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 조합 제제이다.
본 발명의 한 양태는 a) 화합물 번호 25_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 및 b) 화합물 번호 174_1 또는 183_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 조합 제제이다.
본 발명의 한 양태는 a) 화합물 번호 26_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 및 b) 화합물 번호 183_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 조합 제제이다.
본 발명의 한 양태는 a) 화합물 번호 39_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 및 b) 화합물 번호 229_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 조합 제제이다.
본 발명의 한 양태는 a) 화합물 번호 54_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 및 b) 화합물 번호 190_1 또는 232_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 조합 제제이다.
본 발명의 한 양태는 a) 화합물 번호 56_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 및 b) 화합물 번호 153_1 또는 244_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 조합 제제이다.
본 발명의 한 양태는 a) 화합물 번호 80_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 및 b) 화합물 번호 153_1 또는 244_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 조합 제제이다.
본 발명의 한 양태는 a) 화합물 번호 116_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 및 b) 화합물 번호 155_1 또는 195_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 조합 제제이다.
적용례
본 발명에 있어서, PAPD5 및 PAPD7의 조합된 억제가 HBV 번식 억제의 상승효과를 야기함이 놀랍게도 증명되었다. 하기 실시예는, PAPD5 발현만을 감소시키는 것이 약 50%의 HBsAg 및 HbeAg 분비 감소를 야기하고, 비슷하게 PAPD5 억제제를 사용하여 세포내 HBV mRNA가 감소됨을 증명한다. PAPD7의 발현만을 감소시키는 것이 15% 이하의 HBsAg 및 HBeAg 분비 감소를 야기한다. PAPD5 및 PAPD7의 동시적 녹-다운은 HBsAg 및 HBeAg 분비 감소의 상승효과를 야기하고, 이는 단일 녹-다운의 합보다 크다. 이론에 구애됨 없이, 이러한 상승효과는 PAPD5 및 PAPD7의 보상효과에 기인할 수 있는데, 이는 둘 다의 단백질이 높은 서열 상동성 및 동일한 효소 기능을 가지기 때문이다. HBsAg 분비 감소에 기인하여, 본 발명의 억제제는 만성 HBV 감염의 발생을 억제한다. 특히, HBeAg 분비 억제에 기인하여, 본 발명의 억제제는 HBsAg 분비만을 감소시키는 화합물과 비교하여 만성 HBV 감염 발생을 보다 효과적으로 억제한다. 또한, 출산을 앞둔 모체에서 HBeAg의 감소는 그녀의 자식의 만성 HBV 감염의 발생을 또한 억제한다. 따라서, HBeAg 분비 감소에 기인하여, 본 발명의 억제제는 만성 HBV 감염의 발생(예컨대 HBV 감염된 모체의 자식에서 만성 HBV 감염의 발생)을 억제하고 HBV 감염된 인간의 전염력을 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 한 양상은 본원에 제공된 억제제에 관한 것으로서, 상기 억제제는 HBsAg 및 HBeAg 분비를 감소시킨다. 이에 따라, 본 발명의 추가적 양상은 본원에 제공된 억제제, 특히 핵산 분자 또는 핵산 분자의 조합에 관한 것으로서, 상기 억제제는 만성 HBV 감염의 발생을 억제하고 HBV 감염된 인간의 전염력을 감소시킨다. 본 발명의 특정 양상에서, 본원에 제공된 억제제는 HBV 감염된 모체의 자식에서 만성 HBV 감염의 발생을 억제한다. 이러한 모체는 바람직하게는 HBeAg 양성이다.
본 발명의 억제제로 치료받을(또는 예방을 위해 본 발명의 억제제를 수용하는) 개체는 바람직하게는 인간, 더욱 바람직하게는 HBsAg 양성이고/이거나 HBeAg 양성인 인간 환자, 더욱 더 바람직하게는 HBsAg 양성이고 HBeAg 양성인 인간 환자이다. 상기 인간 환자는 출산을 앞둔 모체, 예를 들어 HBeAg 양성이고/이거나 HBsAg 양성인 출산을 앞둔 모체, 더욱 바람직하게는 HBeAg 양성이고 HBsAg 양성인 출산을 앞둔 모체일 수 있다.
본 발명의 한 양태는 HBV 감염, 특히 만성 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 PAPD5 억제제, 특히 PAPD5의 발현 및/또는 활성을 억제하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 추가적 양태는 HBV 감염, 특히 만성 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 PAPD5의 억제제 및 PAPD7의 억제제를 포함하는 조합 제제에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조합 조성물은 a) PAPD5의 발현 및/또는 활성을 억제하는 핵산 분자; 및 b) PAPD7의 발현 및/또는 활성을 억제하는 핵산 분자를 포함한다. 따라서, 본 발명은 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에서 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 PAPD5의 억제제 및 PAPD7의 억제제를 포함하는 조합 제제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 a) PAPD5의 발현 및/또는 활성을 억제하는 핵산 분자; 및 b) PAPD7의 발현 및/또는 활성을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 조합 제제에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 조합 제제는 HBV 감염의 치료(예를 들어 개선)를 위해 사용되는 것으로 예상된다. 본 발명의 억제제와 관련하여 본원에 개시된 정의는 필요한 부분만 약간 수정하여 본 발명의 조합 제제에 적용된다. 조합 제제는 PAPD5 억제제인 분자 및 PAPD7 억제제인 별개의 분자(예를 들어 2개의 별개의 RNAi 분자, 예컨대 siRNA 분자, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 2개의 별개의 소분자)를 포함할 수 있다. 이들 2개의 별개의 억제제는 하나의 단위체 내에, 예를 들어 하나의 환약 또는 물약병 내에 제형화될 수 있다. 다르게는, 이들 2개의 별개의 억제제는 별개의 단위체, 예를 들어 별개의 환약 또는 물약병으로 제형화될 수 있다. 2개의 별개의 억제제는 이들 2개의 억제제의 상승효과가 달성된다면 함께(즉, 동시에) 또는 별개로(즉, 순차적으로) 투여될 수 있다. 본 발명의 한 양상에서, 조합 제제는 약물 부재 대조군과 비교하여(즉, 약물을 투여받지 않은 세포 또는 개체와 비교하여) 50% 이상의 HBsAg 및 HbeAg 분비의 감소를 야기한다.
또한, 본 발명은 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물에 관한 것으로서, 상기 약학 조성물은 하기를 포함한다:
(i) 본 발명의 억제제, 또는 본 발명의 조합 제제; 및
(ii) 임의적으로, 약학적으로 허용되는 담체.
따라서, 본 발명은 HBV 감염의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 효과량의 본 발명의 억제제, 특히 핵산 분자, 억제제의 접합체, 본 발명의 약학 조성물 또는 본 발명의 조합 제제를 HBV 감염의 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 약제의 제조를 위한 본 발명의 억제제, 특히 핵산 분자, 억제제의 접합체, 본 발명의 약학 조성물 또는 본 발명의 조합 제제의 용도를 제공한다. 바람직한 양태에서, 약제는 피하 투여용 투여량 형태로 제조되고, 조합 제제의 경우 PAPD5 억제제 및 PAPD7 억제제의 비는 1:1(중량)이다.
본 발명은 또한 약제의 제조를 위한 기술된 본 발명의 억제제, 특히 핵산 분자, 억제제의 접합체, 본 발명의 약학 조성물 또는 본 발명의 조합 제제의 용도를 제공하되, 상기 약제는 정맥내 투여용 투여량 형태이고, 조합 제제의 경우, PAPD5 억제제 및 PAPD7 억제제의 비는 1:1(중량)이다.
본 발명의 억제제, 본 발명의 조합 제제 또는 본 발명의 약학 조성물은 병용 요법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 억제제, 본 발명의 조합 제제 또는 본 발명의 약학 조성물은 다른 항-HBV 제제, 예컨대 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a 및 인터페론 알파콘-1(페길화되거나 페길화되지 않음), 리바피린, 라미부딘(3TC), 엔테카비르, 테노포비르, 텔비부딘(LdT), 아데포비르, 또는 최근에 생긴 다른 항-HBV 제제, 예컨대 HBV RNA 복제 억제제, HBsAg 분비 억제제, HBV 캡시드 억제제, 안티센스 올리고머(예를 들어 국제 특허공개공보 제2012/145697호 및 국제 특허공개공보 제2014/179629호에 기술됨), siRNA(예를 들어 국제 특허공개공보 제2005/014806호, 국제 특허공개공보 제2012/024170호, 국제 특허공개공보 제2012/2055362호, 국제 특허공개공보 제2013/003520호, 국제 특허공개공보 제2013/159109호, 국제 특허공개공보 제2017/027350호 및 국제 특허공개공보 제2017/015175호에 기술됨), HBV 치료 백신, HBV 예방 백신, HBV 항체 요법(단클론성 또는 다클론성), 또는 HBV의 치료 및/또는 예방을 위한 TLR 2, 3, 7, 8 또는 9 작용제와 병용될 수 있다.
하기 실시예는 PAPD5 및/또는 PAPD7의 하향조절이 HBV 감염된 세포에서 HBsAg 및 HbeAg의 생산 및 세포내 HBV mRNA의 생산의 감소에 동조함을 입증한다. 이러한 결과는, 예를 들어 PAPD5 및/또는 PAPD7의 억제제에 의한 치료를 계속 진행하거나 수행했던 경우, PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성을 HBV 감염의 치료 동안 치료적 성과를 모니터링하는데 사용될 수 있음을 시사한다. 따라서, 본 발명은 HBV 감염의 치료 동안 치료적 성과를 모니터링하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(a) 시험 개체로부터 수득한 샘플에서 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성을 분석하는 단계;
(b) 상기 양 및/또는 활성을 1명 이상의 기준 개체의 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성에 해당하는 기준 데이터와 비교하는 단계; 및
(c) 상기 비교 단계 (b)를 기반으로 치료적 성과를 예측하는 단계.
본 발명의 모니터링 방법에서, 시험 개체는 HBV 감염에 대한 약제를 수용하거나 HBV 감염에 대한 약제를 수용했던 인간일 수 있다. 약제는 상기에 기술된 항-HBV 제제를 포함할 수 있다. 또한, 약제는 PAPD5 및/또는 PAPD7의 억제제를 포함할 수 있다.
본 발명의 모니터링 방법에서, 기준 데이터는 1명 이상의 기준 개체의 샘플에서 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성에 일치할 수 있다. 상기 샘플은 혈액 또는 간 생검일 수 있다.
본 발명의 한 양상은 본 발명의 모니터링 방법에 관한 것으로서, 여기서 1명 이상의 기준 개체는 HBV 감염되었으나 HBV 감염에 대한 약제를 수용하지 않았고; 단계 (c)에서 기준 데이터와 비교한 시험 개체의 PAPD5 및/또는 PAPD7의 감소된 양 및/또는 활성은 HBV 감염의 치료에서 치료적 성과를 시사한다. 예를 들어, 상기 PAPD5 및/또는 PAPD7의 감소된 양 및/또는 활성은, 시험 개체의 샘플에서 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성이 1명 이상의 기준 개체의 샘플에서 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성의 0 내지 90%임을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 PAPD5 및/또는 PAPD7의 감소된 양 및/또는 활성은 1명 이상의 기준 개체의 샘플에서 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성의 0 내지 80%, 바람직하게는 0 내지 70%, 더욱 바람직하게는 0 내지 60%, 더욱 더 바람직하게는 0 내지 50%, 더욱 더 바람직하게는 0 내지 40%, 더욱 더 바람직하게는 0 내지 30%, 더욱 더 바람직하게는 0 내지 20%, 가장 바람직하게는 0 내지 10%일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 모니터링 방법에 관한 것으로서, 여기서 1명 이상의 기준 개체는 HBV 감염되거나 HBV 감염에 대한 약제를 수용했었고; 단계 (c)에서, 기준 데이터와 비교하여 시험 개체의 PAPD5 및/또는 PAPD7의 동일하거나 비슷한 양 및/또는 활성은 HBV 감염의 치료에서 치료적 성과를 시사한다. 본 발명의 추가적 양상은 본 발명의 모니터링 방법에 관한 것으로서, 여기서 1명 이상의 기준 개체는 HBV 감염되지 않고; 단계 (c)에서 기준 데이터와 비교하여 시험 개체의 PAPD5 및/또는 PAPD7의 동일하거나 비슷한 양 및/또는 활성은 HBV 감염의 치료에서 치료적 성과를 시사한다. PAPD5 및/또는 PAPD7의 동일하거나 비슷한 양 및/또는 활성은 시험 개체의 샘플에서 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성이 1명 이상의 기준 개체의 샘플에서 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성의 90 내지 110%임을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 PAPD5 및/또는 PAPD7의 동일하거나 비슷한 양 및/또는 활성은 1명 이상의 기준 개체의 샘플에서 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성의 95 내지 105%일 수 있다.
또한, HBV 감염을 예방하고/거나 치료하는(예를 들어 개선하는) 화합물을 동정하고/거나 특성규명하는데 사용될 수 있는, PAPD5 및/또는 PAPD7 발현이 증가되거나 감소되거나 부재하는 세포 또는 비-인간 동물(예를 들어 마우스, 래트, 흰족제비 또는 토끼)이 본 발명에 포괄된다. 예를 들어, 상기 세포 또는 비-인간 동물은 예를 들어 발현 벡터 내로 클로닝되고 외인성 프로모터에 작동적으로 연결되는 PAPD5 및/또는 PAPD7을 코딩하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 세포 또는 비-인간 동물은 PAPD5 및/또는 PAPD7, 바람직하게는 PAPD5 및 PAPD7을 과발현할 수 있다. 다르게는, 상기 세포 또는 비-인간 동물은 PAPD5 및/또는 PAPD7의 녹-다운, 바람직하게는 PAPD5 및 PAPD7의 녹-다운을 가질 수 있다.
본 발명의 양태
따라서, 본 발명은 하기 항목에 관한 것이다:
1. (a) 시험 화합물을 PAPD5 및/또는 PAPD7을 발현하는 세포와 접촉시키는 단계
(b) 상기 시험 화합물의 존재 및 부재 하에 PAPD5 및/또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) PAPD5 또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 화합물을 HBV 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 화합물로서 동정하는 단계
를 포함하는 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 화합물을 동정하는 방법.
2. PAPD5 및 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 (c)에서 동정된 화합물의 조합의 능력을 시험하는 단계를 추가로 포함하는, 항목 1의 방법.
3. PAPD5가 PAPD5 표적 핵산인, 항목 1 또는 2의 방법.
4. PAPD5 표적 핵산이 하기를 포함하거나 하기로 이루어지는, 항목 3의 방법:
(a) 서열번호 4, 5 또는 10의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 천연 변이체;
(b) 핵산 서열로부터 발현된 폴리펩티드가 poly-A 폴리머라제 기능을 갖는, a)의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열;
(c) 서열번호 4, 5 또는 10을 포함하거나 이로 이루어진 뉴클레오티드 서열;
(d) 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(e) 폴리뉴클레오티드가 poly-A 폴리머라제 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 1 또는 2에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(f) 서열번호 1 또는 2의 효소적 활성 단편, 예컨대 서열번호 7 또는 8을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는
(g) 폴리뉴클레오티드가 poly-A 폴리머라제 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 1 또는 2의 효소적 활성 단편, 예컨대 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
5. PAPD7이 PAPD7 표적 핵산인, 항목 1 또는 2의 방법.
6. PAPD7 표적 핵산이 하기를 포함하거나 하기로 이루어지는, 항목 5의 방법:
(a) 서열번호 6 또는 11의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 천연 변이체;
(b) 핵산 서열로부터 발현된 폴리펩티드가 poly-A 폴리머라제 기능을 갖는, 상기 (a)의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열;
(c) 서열번호 6 또는 11을 포함하거나 이로 이루어진 뉴클레오티드 서열;
(d) 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(e) 폴리뉴클레오티드가 poly-A 폴리머라제 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 3에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(f) 서열번호 3의 효소적 활성 단편, 예컨대 서열번호 9를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는
(g) 폴리뉴클레오티드가 poly-A 폴리머라제 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 3의 효소적 활성 단편, 예컨대 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
7. 상기 세포가 진핵생물 세포인, 항목 1 내지 6 중 어느 하나의 방법.
8. 화합물이 HBV의 번식를 억제하고/거나 HBV 표면 항원(HBsAg)의 분비를 억제하고/거나 HBV 외피 항원(HBeAg)의 분비를 억제하고/거나 세포내 HBV mRNA 또는 HBV DNA의 생산을 억제하는, 항목 1 내지 7 중 어느 하나의 방법.
9. 시험 화합물이, (a) 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드; (b) siRNA 분자; 및 (c) shRNA 분자로부터 선택된 핵산 분자의 선별 라이브러리인, 항목 1 내지 8 중 어느 하나의 방법.
10. 항목 1의 단계 c에서 동정된 화합물이 PAPD5 또는 PAPD7 mRNA 발현을 50% 이상만큼 감소시키는, 항목 1 내지 9 중 어느 하나의 방법.
11. 시험 화합물이 PAPD5를 감소시킬 수 있는 핵산 분자 및 PAPD7을 감소시킬 수 있는 핵산 분자의 조합 제제인, 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 방법.
12. 조합 제제가 HBV 표면 항원(HBsAg), HBV 외피 항원(HBeAg) 및/또는 세포내 HBV mRNA 또는 HBV DNA를 70% 이상만큼 감소시키는, 항목 11의 방법.
13. 시험 화합물을 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 항목 1 내지 12 중 어느 하나의 방법.
14. 상기 대조군이 PAPD5 또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 감소시키지 않는 불활성 시험 화합물인, 항목 13의 방법.
15. PAPD5 및 PAPD7의 활성이 poly-A 폴리머라제 기능인, 항목 1 내지 14 중 어느 하나의 방법.
16. (a) PAPD5 또는 PAPD7에 대한 RNA 간섭(RNAi) 분자; 또는
(b) (i) 부위-특이적 DNA 뉴클레아제 또는 부위-특이적 DNA 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
(ii) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 게놈 편집 기계
인 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 PAPD5 또는 PAPD7의 억제제.
17. 억제제가 (a) 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드; (b) siRNA 분자; 및 (c) shRNA 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 RNAi 분자인, 항목 16의 억제제.
18. 억제제가 (a) PAPD5의 발현 및/또는 활성을 억제하는 RNAi 분자; 및 (b) PAPD7의 발현 및/또는 활성을 억제하는 RNAi 분자를 포함하는 조합 제제인, 항목 16 또는 17의 억제제.
19. 억제제가 HBsAg 및 HBeAg의 분비를 감소시키는, 항목 16 내지 18 중 어느 하나의 억제제.
20. 억제제가 세포내 HBV mRNA 또는 HBV DNA의 생산을 감소시키는, 항목 16 내지 18 중 어느 하나의 억제제.
21. 억제제가 만성 HBV 감염의 발생을 억제하고/거나 HBV 감염된 인간의 전염력을 감소시키는, 항목 16 내지 20 중 어느 하나의 억제제.
22. 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 분자로서, 인접 뉴클레오티드 서열이 PAPD5 표적 핵산에 대해 80% 이상 상보성이고, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 PAPD5의 발현을 감소시킬 수 있는, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 분자.
23. 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 분자로서, 인접 뉴클레오티드 서열이 PAPD7 표적 핵산에 대해 80% 이상 상보성이고, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 PAPD7의 발현을 감소시킬 수 있는, 핵산 분자.
24. 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드인 항목 23의 핵산 분자.
25. 올리고뉴클레오티드가 서열번호 4, 5 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 핵산을 -10 kcal 미만의 ΔG°에 의해 혼성화할 수 있는, 항목 22의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
26. 올리고뉴클레오티드가 서열번호 6 또는 11로부터 선택된 표적 핵산을 -10 kcal 미만의 ΔG°에 의해 혼성화할 수 있는, 항목 23 또는 24의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
27. 표적 핵산이 RNA인, 항목 22 내지 26 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
28. RNA가 mRNA인, 항목 27의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
29. mRNA가 미성숙 mRNA 또는 성숙 mRNA인, 항목 28의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
30. 인접 뉴클레오티드 서열이 12 내지 22개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루지는, 항목 22 내지 29 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
31. 인접 뉴클레오티드 서열이 14 내지 20개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지는, 항목 30의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
32. 12 내지 25개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어지는, 항목 22 내지 31 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
33. 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열이 단일가닥인, 항목 22 내지 32 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
34. 올리고뉴클레오티드가 siRNA가 아니고 자기-상보성도 아닌, 항목 22 내지 32 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
35. 인접 뉴클레오티드 서열이 서열번호 12 내지 131로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 항목 22 또는 25의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
36. 인접 뉴클레오티드 서열이 서열번호 15, 18, 23, 25, 26, 30, 32, 39, 54, 56, 58, 65, 80, 88, 92, 93, 111, 115, 116 및 118로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 항목 35의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
37. 인접 뉴클레오티드 서열이 서열번호 132 내지 151로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 항목 23, 24 및 26 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
38. 인접 뉴클레오티드 서열이 서열번호 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 및 244로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 항목 37의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
39. 인접 뉴클레오티드 서열이 상보성인 표적 핵산과 비교하여 0 내지 3개의 미스매치를 갖는, 항목 22 내지 38 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자.
40. 인접 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산과 비교하여 1개의 미스매치를 갖는, 항목 39의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
41. 인접 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산 서열에 대해 완전히 상보성인, 항목 39의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
42. 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 항목 22 내지 41 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
43. 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드가 고친화도 변형된 뉴클레오시드인, 항목 42의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
44. 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 포함하는, 항목 22 내지 43 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
45. 변형된 뉴클레오시드간 연결기가 뉴클레아제 저항성을 갖는, 항목 44의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
46. 인접 뉴클레오티드 서열 내 뉴클레오시드간 연결기의 50% 이상이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기 또는 보라노포스페이트 뉴클레오시드간 연결기인, 항목 44 또는 45의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
47. 인접 뉴클레오티드 서열 내 모든 뉴클레오시드간 연결기가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기인, 항목 44 또는 45의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
48. 올리고뉴클레오티드가 RNase H를 모집할 수 있는, 항목 22 내지 47 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
49. 올리고뉴클레오티드가 갭머인, 항목 48의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
50. 올리고뉴클레오티드가 식 5'-F-G-F'-3'의 갭머이되, 여기서, 영역 F 및 F'는 독립적으로 1 내지 4개의 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어지고, G는 RNaseH를 모집할 수 있는 6 내지 17개의 뉴클레오시드 영역인, 항목 48 또는 49의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
51. 변형된 뉴클레오시드가 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산(ANA), 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2' 당 변형된 뉴클레오시드인, 항목 42 내지 44 및 50 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
52. 영역 F 및 F'의 변형된 뉴클레오시드 중 하나 이상이 LNA 뉴클레오시드인, 항목 50 또는 51의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
53. 영역 F 및 F'의 모든 변형된 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인, 항목 52의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
54. 영역 F 및 F'가 LNA 뉴클레오시드로 이루어지는, 항목 53의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
55. LNA 뉴클레오시드가 베타-D-옥시-LNA, 알파-L-옥시-LNA, 베타-D-아미노-LNA, 알파-L-아미노-LNA, 베타-D-티오-LNA, 알파-L-티오-LNA, (S)cET, (R)cET 베타-D-ENA 및 알파-L-ENA로부터 선택되는, 항목 51 내지 54 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
56. LNA 뉴클레오시드가 옥시-LNA인, 항목 51 내지 54 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
57. LNA 뉴클레오시드가 베타-D-옥시-LNA인, 항목 51 내지 56 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
58. LNA 뉴클레오시드가 티오-LNA인, 항목 51 내지 54 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
59. LNA 뉴클레오시드가 아미노-LNA인, 항목 51 내지 54 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
60. LNA 뉴클레오시드가 cET인, 항목 51 내지 54 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
61. LNA 뉴클레오시드가 ENA인, 항목 51 내지 54 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
62. 영역 F 또는 F' 중 하나 이상이 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA 및 2'-플루오로-DNA로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드를 추가로 포함하는, 항목 52의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
63. 영역 G의 RNaseH 모집성 뉴클레오시드가 DNA, 알파-L-LNA, C4' 알킬화된 DNA, ANA 및 2' F-ANA, 및 UNA로부터 독립적으로 선택되는, 항목 52 내지 62 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
64. 영역 G의 뉴클레오시드가 DNA 뉴클레오시드인, 항목 50 또는 63의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
65. 화합물 번호 12_1 내지 131_1로부터 선택되는, 항목 22 또는 25의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
66. 안티센스 화합물이 화합물 번호 15_1, 18_1, 23_1, 25_1, 26_1, 30_, 32_1, 39_1, 54_1, 56_1, 58_1, 65_1, 80_1, 88_1, 92_1, 93_1, 111_1, 115_1, 116_1 및 118_1로부터 선택되는, 항목 65의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
67. 화합물 번호 132_ 내지 151_1로부터 선택되는 항목 24의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
68. 안티센스 화합물이 화합물 번호 153_1, 155_1, 168_1, 171_1, 172_1, 174_1, 183_1, 184_1, 188_1, 190_1, 191_1, 194_1, 195_1, 197_1, 221_1, 224_1, 229_1, 232_1, 239_1 및 244_1로부터 선택되는, 항목 67의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
69. siRNA 분자가 서열번호 252, 253, 254 및 255 중 하나 이상으로부터 선택된 PAPD5 표적 서열을 표적화하는, 항목 22의 siRNA 분자.
70. 핵산 분자가 서열번호 256, 257, 258 및 259 중 하나 이상으로부터 선택된 PAPD7 표적 서열을 표적화하는 siRNA 분자인, 항목 23의 핵산 분자.
71. 항목 22 내지 70 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA, 및 상기 올리고뉴클레오티드에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 접합체 모이어티를 포함하는 접합체.
72. 접합체 모이어티가 탄수화물, 세포 표면 수용체 리간드, 약물 물질, 호르몬, 친유성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소, 비타민, 바이러스 단백질 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 항목 71의 접합체.
73. 접합체 모이어티가 아시알로당단백질 수용체에 결합할 수 있는, 항목 71 또는 72의 접합체.
74. 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접합체 모이어티 사이에 위치된 연결기를 포함하는 항목 71 내지 73 중 어느 하나의 접합체.
75. 연결기가 생리학적 불활성 연결기인, 항목 74의 접합체.
76. 생리학적 불활성 연결기가 뉴클레아제 민감성 연결기인, 항목 75의 접합체.
77. 올리고뉴클레오티드가 식 D'-F-G-F' 또는 F-G-F'-D''을 갖되, F, F' 및 G가 항목 52 내지 65 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, D' 또는 D''가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 갖는 1, 2 또는 3개의 DNA 뉴클레오시드를 포함하는, 항목 75 또는 76의 접합체.
78. (a) PAPD5의 발현 및/또는 활성을 억제하는 RNAi 분자; 및
(b) PAPD7의 발현 및/또는 활성을 억제하는 RNAi 분자
를 포함하는 조합 제제.
79. RNAi 분자가 항목 22 내지 70, 및 항목 71 내지 77 중 어느 하나의 접합체로부터 선택되는 항목 78의 조합 제제.
80. (a)의 RNAi 분자가 항목 36 또는 66의 안티센스 화합물이고, b)의 RNAi 분자가 항목 38 또는 68의 안티센스 화합물인, 항목 78의 조합 제제.
81. 항목 22 내지 70 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 분자, 항목 71 내지 77 중 어느 하나의 접합체, 또는 항목 78 내지 80 중 어느 하나의 조합 제제, 및 임의적으로, 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 보조제를 포함하는 약학 조성물.
82. 항목 22 내지 70 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 분자, 항목 71 내지 77 중 어느 하나의 접합체, 항목 78 또는 79의 조합 제제 또는 항목 81의 약학 조성물을 효과량으로 PAPD5 및/또는 PAPD7을 발현하는 표적 세포에 투여하는 단계를 포함하는, PAPD5 및/또는 PAPD7을 발현하는 표적 세포에서 PAPD5 및/또는 PAPD7 발현을 조절하는 생체내 또는 시험관내 방법.
83. 치료 효과량 또는 예방 효과량의 항목 22 내지 70 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 분자, 항목 71 내지 77 중 어느 하나의 접합체, 항목 78 내지 80 중 어느 하나의 조합 제제 또는 항목 81의 약학 조성물을 질병을 앓거나 질병에 걸리기 쉬운 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 질병의 치료 또는 예방 방법.
84. 개체에서 질병의 치료용 또는 예방용 약제로서 사용하기 위한 항목 22 내지 70 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 분자, 항목 71 내지 77 중 어느 하나의 접합체, 항목 78 내지 80 중 어느 하나의 조합 제제 또는 항목 81의 약학 조성물.
85. 개체에서 질병의 치료용 또는 예방용 약제의 제조를 위한 항목 22 내지 70 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 분자, 항목 71 내지 77 중 어느 하나의 접합체, 항목 78 내지 80 중 어느 하나의 조합 제제의 용도.
86. 항목 22 내지 70 중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 분자, 항목 71 내지 77 중 어느 하나의 접합체 또는 항목 78 내지 80 중 어느 하나의 조합 제제의 부재 하의 발현과 비교하여 PAPD5 및/또는 PAPD7이 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상만큼 감소되는, 항목 83 내지 85 중 어느 하나의 방법, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
87. 질병이 HBV 감염, 특히 만성 HBV 감염으로부터 선택되는, 항목 83 내지 85 중 어느 하나의 방법, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
88. (a) 시험 개체로부터 수득한 샘플에서 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성을 분석하는 단계;
(b) 상기 양 및/또는 활성을 1명 이상의 기준 개체의 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성에 해당하는 기준 데이터와 비교하는 단계; 및
(c) 상기 비교 단계 (b)를 기반으로 치료적 성과를 예측하는 단계
를 포함하는 HBV 감염의 치료 동안 치료적 성과를 모니터링하는 방법.
89. 시험 개체가 HBV 감염에 대한 약제를 수용하거나 HBV 감염에 대한 약제를 수용했었던 인간인, 항목 88의 모니터링 방법.
90. 기준 데이터가 1명 이상의 기준 개체의 샘플에서 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성에 일치하는, 항목 88 또는 89의 모니터링 방법.
91. 1명 이상의 기준 개체가 HBV 감염되었으나 HBV 감염에 대한 약제를 수용하지 않았고; 단계 (c)에서 기준 데이터와 비교하여 시험 개체의 PAPD5 및/또는 PAPD7의 감소된 양 및/또는 활성이 HBV 감염의 치료에서 치료적 성과를 시사하는, 항목 88 내지 90 중 어느 하나의 모니터링 방법.
92. 상기 PAPD5 및/또는 PAPD7의 감소된 양 및/또는 활성은, 시험 개체의 샘플에서 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성이 1명 이상의 기준 개체의 샘플에서 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성의 0 내지 90%임을 의미하는, 항목 91의 모니터링 방법.
93. 1명 이상의 기준 개체가 HBV 감염되고 HBV 감염에 대한 약제를 수용했었고; 단계 (c)에서 기준 데이터와 비교하여 시험 개체의 PAPD5 및/또는 PAPD7의 동일하거나 비슷한 양 및/또는 활성이 HBV 감염의 치료에서 치료적 성과를 시사하는, 항목 88 내지 90 중 어느 하나의 모니터링 방법.
94. 1명 이상의 기준 개체가 HBV 감염되지 않고; 단계 (c)에서 기준 데이터와 비교하여 시험 개체의 PAPD5 및/또는 PAPD7의 동일하거나 비슷한 양 및/또는 활성이 HBV 감염의 치료에서 치료적 성과를 시사하는, 항목 88 내지 90 중 어느 하나의 모니터링 방법.
95. 상기 PAPD5 및/또는 PAPD7의 동일하거나 비슷한 양 및/또는 활성은, 시험 개체의 샘플에서 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성이 1명 이상의 기준 개체의 샘플에서 PAPD5 및/또는 PAPD7의 양 및/또는 활성의 90 내지 110%임을 의미하는, 항목 93 또는 94의 모니터링 방법.
약학 조성물
상기에 기술된 바와 같이, 본 발명은 PAPD5의 억제제를 단독으로 또는 PAPD7 억제제와의 조합으로 포함하는, HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다. 억제제는 바람직하게는 본원에 정의된 핵산 분자이다. 구체적으로, HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 PAPD5의 억제제 및 PAPD7의 억제제를 포함하는 조합 제제; 및 상기 억제제 조성물 또는 상기 조합 제제를 포함하는 약학 조성물이 고려된다. 상기 약학 조성물(즉, 약제)은 임의적으로, 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기 약학 조성물은 치료적으로 허용되는 희석제, 염, 부형제 및/또는 보조제를 추가로 포함할 수 있다.
전형적인 약학 조성물은 PAPD5 억제제를 단독으로 또는 PAPD7 억제제와 함께 담체 또는 부형제와 혼합함으로써 제조된다. 적합한 담체 및 부형제는 당업자에게 주지되어 있고 예를 들어 문헌[Ansel, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004]; [Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000]; 및 [Rowe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, Chicago, Pharmaceutical Press, 2005]에 상세히 기술되어 있다. 또한, 제형은 하나 이상의 완충제, 안정화제, 계면활성제, 습윤제, 활택제, 유화제, 현탁제, 보존제, 산화 방지제, 불투명화제, 유연제, 가공 보조제, 착색제, 감미제, 향료, 향미제, 희석제, 및 약물의 외관을 개선하거나 약학 제품(즉, 약제)의 제조를 보조하는 것으로 공지된 다른 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 주위 온도에서 적절한 pH에서 목적하는 정도의 순도를 갖는 PAPD5의 억제제 및/또는 PAPD7의 억제제를 생리학적으로 허용되는 담체(즉, 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성인 담체)와 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 적합한 투여 형태로 제형화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 멸균 상태일 수 있다.
핵산 분자에 대한 적합한 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985]에서 발견된다. 약물 전달 방법의 간략한 검토를 위해, 예를 들어 문헌[Langer (Science 249:1527-1533, 1990)]을 참조한다. 국제 특허공개공보 제2007/031091호는 약학적으로 허용되는 희석제, 담체 및 보조제의 추가로 적합하고 바람직한 예를 제공한다(본원에 참고로 혼입됨). 적합한 투여량, 제형, 투여 경로, 조성, 투여량 형태, 다른 치료제와의 조합, 전구-약물 제형이 또한 국제 특허공개공보 제2007/031091호에 제공된다.
본 발명에 따른 화합물은 이의 약학적으로 허용되는 염의 형태로 존재할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 생물학적 효과 및 특성을 보유하는 통상적인 산-부가 염 또는 염기-부가 염을 지칭하고, 적합한 비독성 유기 또는 무기 산 또는 유기 또는 무기 염기로부터 형성된다. 산-부가 염은 예를 들어 무기 산(예컨대 염산, 브롬화 수소산, 요오드화 수소산, 황산, 설팜산, 인산 및 질산)으로부터 유도된 것, 및 유기 산(예컨대 p-톨루엔설폰산, 살리실산, 메탄설폰산, 옥살산, 석신산, 시트르산, 말산, 락트산, 퓨마르산 등)으로부터 유도된 것을 포함한다. 염기-부가 염은 암모늄, 칼륨, 나트륨 및 사차 암모늄 수산화물, 예컨대 테트라메틸 암모늄 수산화물로부터 유도된 것을 포함한다. 약학 화합물을 염으로 화학적으로 변형시키는 것은 화합물의 개선된 물리적 및 화학적 안정성, 흡습성, 유동성 및 가용성을 수득하기 위해 약제사에게 주지된 기술이다. 이는 예를 들어 문헌[Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435] 또는 [Ansel, In: Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed. (1995), pp. 196 and 1456-1457]에 기술되어 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 나트륨 염일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 올바른 의료 행위에 일치하는 방식으로 제형화되고 투여되고 투약된다. 이러한 맥락에서 고려 인자는 치료받을 특정 포유동물, 개별적 환자의 임상적 상태, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 환자의 나이 및 성별, 및 개업의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 본원에서, "효과량"("(치료적) 효과 투여량"으로도 공지됨)은, 의학 박사 또는 임상의에 의해 모색된, 개체의 생물학적 또는 의료적 반응을 유도하는 화합물의 양을 의미한다. 본 발명의 억제제, 본 발명의 조합 제제 또는 본 발명의 약학 조성물의 "효과량"은 이러한 고려사항에 의해 좌우될 것이며, HBsAg 및/또는 HBeAg를 억제하는데 필요한 최소량이다. 예를 들어, 이러한 양은 수용자의 세포 또는 완전체로서 포유동물에 독성인 양보다 적을 수 있다.
예를 들어, PAPD5 억제제 또는 PAPD7 억제제가 안티센스 올리고뉴클레오티드인 경우, 투여되는 약학 효과량은 0.1 내지 15 mg/kg, 예컨대 0.2 내지 10 mg/kg, 예컨대 0.25 내지 5 mg/kg의 투여량이다. 투여는 1주일에 1회, 2주일 마다, 3주일 마다 또는 1개월에 1회 투여될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 또는 약학 조성물은 국소적으로(예컨대 흡입에 의해, 또는 피부, 눈 또는 귀에), 장관내로(예컨대, 경구적으로 또는 위장관을 통해) 또는 비경구적으로(예컨대 정맥내, 피하, 근육내, 대뇌내, 뇌실내 또는 경막내) 투여될 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산 분자 또는 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입, 경막내 또는 두개내(예를 들어 대뇌내), 심실내 또는 유리체내 투여를 포함하는 비경구적 경로에 의해 투여된다. 한 양태에서, 활성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 정맥내로 투여된다. 또 다른 양태에서, 활성 핵산 분자 또는 핵산 분자 접합체는 피하로 투여된다.
본 발명의 억제제, 본 발명의 조합 제제 또는 본 발명의 약학 조성물은 HBV 감염의 예방 및/또는 치료에 유용하다. 이들은 바람직하게는 HBsAg 및/또는 HBeAg, 가장 바람직하게는 HBsAg 및 HBeAg의 분비를 억제한다.
정의
뉴클레오티드 서열
용어 "뉴클레오티드 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 당분야에 통상적으로 공지되어 있고, 천연 발생 분자, 예컨대 DNA 및 RNA, 뿐만 아니라 핵산 유사체, 예컨대 올리고뉴클레오티드 티오포스페이트, 치환된 리보-올리고뉴클레오티드, LNA 분자, PNA 분자, GNA(글리콜 핵산) 분자, TNA(트레오스 핵산) 분자, 모폴리노 폴리뉴클레오티드, 또는 변형된 주쇄, 예컨대 폴리실록산, 2'-O-(2-메톡시) 에틸-포스포로티오에이트를 갖는 핵산, 또는 치환기를 갖는 핵산, 예컨대 메틸-, 티오-, 설페이트, 벤조일-, 페닐-, 아미노-, 프로필-, 클로로- 및 메타노카바뉴클레오시드, 또는 이의 검출을 가능하게 하는 리포터 분자를 포함하거나 이로 이루어진 분자를 포함한다. 또한, 용어 "뉴클레오티드 서열"은 본 발명에 있어서 용어 "핵산 분자"와 동일하게 구성되고, 특히 DNA, RNA, PNA 또는 LNA, 또는 이들의 혼성체 또는 당분야에 공지된 임의의 이들의 변형을 지칭할 수 있다(예를 들어, 변형의 예에 대해 US 5,525,711, US 4,711,955, US 5,792,608 또는 EP 302175 참조). 본원에 기술되고 제공된 핵산 서열에 포함되는 핵산 잔기는 천연 발생 핵산 잔기 또는 인공 생산 핵산 잔기일 수 있다. 핵산 잔기의 예는 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 티민(T), 우라실(U), 잔틴(X) 및 하이포잔틴(HX)이다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 티민(T) 및 우라실(U)은 각각의 유형의 폴리뉴클레오티드에 따라 상호교환적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 당업자에게 공지된 바와 같이, DNA의 부분으로서 티민(T)은 상응하는 전사된 mRNA의 부분으로서 우라실(U)에 상응한다. 본원에 기술되고 제공된 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 또는 이중가닥, 선형 또는 환형, 천연물 또는 합성물일 수 있다.
본원에 제공된 뉴클레오티드 서열은 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "벡터"는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지, 및 유전자 조작에 통상적으로 사용되는 다른 벡터를 포함한다. 바람직한 양태에서, 이들 벡터는 세포, 예컨대 포유류 세포 또는 효모 세포의 형질전환에 적합하다. 본원에서, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 문헌에 폭넓게 기술되었다. 이는 선별 마커 유전자 및 숙주에서 복제를 보장하는 복제-기점, 프로모터, 및 전사를 위한 종결 신호를 포함할 수 있다. 프로모터와 종결 신호 사이에, 하나 이상의 제한 부위 또는 다중연결기가 존재할 수 있고, 이는 목적하는 핵산 서열의 삽입을 발현할 수 있다. 본원에 제공된 뉴클레오티드 서열이 클로닝될 수 있는 벡터의 비제한적인 예는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(AAV), 렌티바이러스, HIV-기반 렌티바이러스, 비-바이러스 미니서클-벡터, 또는 박테리아 및 진핵생물 발현 시스템을 위한 다른 벡터이다.
핵산 분자
본원에 사용된 용어 "핵산 분자" 또는 "치료적 핵산 분자"는 일반적으로 당업자에게 이해되는 바와 같이 2개 이상의 공유결합으로 연결된 뉴클레오시드(즉, 뉴클레오티드 서열)를 포함하는 분자로서 정의된다. 본 발명의 방법에서 언급되는 핵산 분자는 일반적으로 50개 미만의 뉴클레오티드 길이의 치료적 올리고뉴클레오티드이다. 핵산 분자는 안티센스 올리고뉴클레오티드이거나 이를 포함할 수 있거나, 또 다른 올리고머성 핵산 분자, 예컨대 CRISPR RNA, siRNA, shRNA, 압타머 또는 리보자임일 수 있다. 핵산 분자는 고체-상 화학 합성 후에 정제에 의해 실험실에서 통상적으로 생산되는 조성물이다. 핵산 분자의 서열이 언급될 때, 이는 공유결합으로 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 핵염기 모이어티 또는 이의 변형의 서열 및 순서를 지칭한다. 본 발명의 핵산 분자는 인공물이고 화학적으로 합성되고 전형적으로 정제되거나 단리된다. 본 발명의 핵산 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 8 내지 40개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 9 내지 35개, 예컨대 10 내지 30개, 예컨대 11 내지 22개, 예컨대 12 내지 20개, 예컨대 13 내지 18개 또는 14 내지 16개의 인접 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 핵산 분자 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은 22개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 20개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 18개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 14, 15, 16 또는 17개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 제시된 임의의 범위는 범위의 종점을 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 핵산 분자가 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다고 하는 경우, 10개의 뉴클레오티드 및 30개의 뉴클레오티드 모두가 포함된다.
일부 양태에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 인접 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
핵산 분자는 전형적으로 포유동물에서 표적 핵산의 발현을 조절하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 핵산 분자, 예컨대 siRNAs, shRNAs 및 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 표적 핵산의 발현을 억제하기 위한 것이다. 따라서, 핵산 분자는 조합될 때, 포유동물에서 하나 이상의 표적 핵산의 발현을 조절함에 있어서 효과적 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 핵산 분자는 RNAi 제제, 예컨대 siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 핵산 분자는 고친화도의 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 핵산 분자는 포스포로티오에이트 핵산 분자이다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다.
일부 양태에서, 핵산 분자는 비-뉴클레오시드성 모이어티에 접합될 수 있다.
핵산 분자의 라이브러리는 변이체 핵산 분자의 무리로서 이해된다. 핵산 분자의 라이브러리의 목적은 다양할 수 있다. 일부 양태에서, 핵산 분자의 라이브러리는 상이한 핵염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되고, 예를 들어, 이는 표적 핵산(예를 들어 RNA 서열)에 걸쳐 디자인된 핵산 분자의 라이브러리일 수 있고, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 분자의 라이브러리는, 핵산 분자가 표적 핵산을 효과적으로 조절하는, 표적 핵산 상의 영역을 동정하기 위한 목적으로 mRNA 유전자-워크(gene-walk)에 의해 생산될 수 있다. 일부 양태에서, 핵산 분자의 라이브러리는, 핵산 분자의 라이브러리 내에서 가장 강력한 서열을 동정하기 위한 목적으로 표적 핵산 상의 특이적 영역을 표적화하는 핵염기 서열이 중첩된 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 일부 양태에서, 핵산 분자의 라이브러리는 부모 또는 조상 핵산 분자의 핵산 분자 디자인 변이체(자식 핵산 분자)의 라이브러리이되, 여기서 핵산 분자 디자인 변이체는 부모 핵산 분자의 코어 핵염기 서열을 보유한다.
올리고뉴클레오티드
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2개 이상의 공유결합으로 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 분자로서 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 이러한 공유결합으로 연결된 뉴클레오시드는 또한 핵산 분자 또는 올리고머로서 지칭될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 고체-상 화학 합성 후에 정제에 의해 실험실에서 통상적으로 제조된다. 올리고뉴클레오티드의 서열을 언급하는 경우, 공유결합으로 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 핵염기 모이어티 또는 이의 변형의 서열 또는 순서를 지칭한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인공적이고 화학적으로 합성되고 전형적으로 정제되거나 단리된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 내부 듀플렉스 형성이 없거나 최소인 단일가닥 올리고뉴클레오티드이다. siRNA 분자는 일반적으로 이중가닥 분자를 형성하는 2개의 상보성 올리고뉴클레오티드 가닥(센스 가닥 및 안티센스 가닥)으로 이루어진다. shRNA 분자는, 일반적으로 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 길고 분자 내에 내부 듀플렉스(헤어핀) 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 인접 서열에 혼성화함으로써 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드로서 정의된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중가닥이 아니고, 이에 따라 siRNA 또는 shRNA가 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일가닥이다.
RNAi
본원에서, 용어 "RNA 간섭(RNAi) 분자"는 본원에 정의된 핵산 분자를 포함하는, RNA 발현 또는 번역을 억제하는 임의의 분자를 지칭한다. 소간섭 RNA(siRNA)는, 전사 후에 상보성 mRNA를 결합함으로써 번역에서 이들의 저하 및 손실을 야기하는 이중가닥 RNA 분자이다. 작은 헤어핀 RNA(shRNA)는 헤어핀 구조를 갖는 인공 RNA 분자이고, 이는 발현시에 DICER 및 RNA-유도된 사일런싱 복합체(RISC)를 통해 mRNA를 감소시킬 수 있다. RNAi 분자는 관심 유전자의 RNA 서열을 기반으로 디자인될 수 있다. 상응하는 RNAi는 화학적으로 또는 시험관내 전사에 의해 합성될 수 있거나 벡터 또는 PCR 제품으로부터 발현될 수 있다.
siRNA 및 shRNA 분자는 일반적으로 20 내지 50개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 25 내지 35개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, Dicer로서 공지된 엔도뉴클레아제과 상호작용하고, 이는 dsRNA를 RNA-유도된 사일런싱 복합체(RISC) 내로 혼입되는 특징적인 2개의 염기 3' 오버행을 갖는 19·-23 염기쌍 짧은 간섭 RNA로 처리하는 것으로 생각된다. Dicer 기질의 효과적인 연장된 형태는 본원에 참고로 혼입된 US 8,349,809 및 US 8,513,207에 기술되어 있다. 적절한 표적 mRNA에 결합시, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 표적을 절단하여 사일런싱을 유도한다. RNAi제제는 변형된 뉴클레오시드간 연결기 및 고친화도 뉴클레오시드, 예컨대 2'-4' 바이사이클릭 리보스 변형된 뉴클레오시드(LNA 및 cET를 포함함)를 사용하여 화학적으로 변형될 수 있다.
인접 뉴클레오티드 서열
용어 "인접 뉴클레오티드 서열"은 표적 핵산에 상보성인 올리고뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 이러한 용어는 본원에서 용어 "인접 핵염기 서열" 및 용어 "올리고뉴클레오티드 모티프 서열"과 상호교환적으로 사용된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 서열을 구성한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 추가의 뉴클레오티드, 예를 들어 작용기를 인접 뉴클레오티드 서열에 부착하는데 사용될 수 있는 뉴클레오티드 연결기 영역을 임의적으로 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 연결기 영역은 표적 핵산에 상보성이지 않거나 상보성일 수 있다.
뉴클레오티드
뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 빌딩 블록이고, 본 발명의 목적을 위하여 천연 발생 및 비-천연 발생 뉴클레오티드를 둘 다 포함한다. 천연적으로, 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 및 RNA 뉴클레오티드는 리보스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 이상의 포스페이트 기(뉴클레오시드에는 부재함)를 포함한다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 "단위" 또는 "단량체"와 상호교환적으로 지칭될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드
본원에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 변형"은 당 모이어티 또는 (핵)염기 모이어티의 하나 이상의 변형을 도입함으로써, 등가의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 변형된 뉴클레오시드를 지칭한다. 바람직한 양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티를 포함한다. 용어 "변형된 뉴클레오시드"는 또한 본원에서 용어 "뉴클레오시드 유사체", 변형된 "단위" 또는 변형된 "단량체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 변형되지 않은 DNA 또는 RNA 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드는 본원에서 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드로 지칭된다. DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 염기 영역에 변형을 갖는 뉴클레오시드는 왓슨 크릭(Watson Cric) 염기 대합을 허용하는 경우 일반적으로 DNA 또는 RNA로 지칭된다.
변형된 뉴클레오시드간 연결기
용어 "변형된 뉴클레오시드간 연결기"는 2개의 뉴클레오시드를 함께 공유결합으로 커플링시키는, 포스포다이에스터(PO) 이외의 연결기로서 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 갖는 뉴클레오티드는 또한 "변형된 뉴클레오티드"로 지칭된다. 일부 양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 포스포다이에스터 연결기와 비교하여, 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레아제 내성을 증가시킨다. 천연 발생 올리고뉴클레오티드의 경우, 뉴클레오시드간 연결기는 인근 뉴클레오시드 사이에 포스포다이에스터 결합을 생산하는 포스페이트 기를 포함한다. 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 생체내 사용을 위해 올리고뉴클레오티드 및 siRNA를 안정화시키는데 특히 유용하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 중 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 영역에서, 예를 들어 변형된 뉴클레오시드의 영역뿐만 아니라 갭머 올리고뉴클레오티드의 갭 영역 내에서 뉴클레아제 절단에 대해 보호하는 역할을 할 수 있다.
한 양태에서, 핵산 분자, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA 또는 siRNA는 천연 포스포다이에스터로부터, 예를 들어 뉴클레아제 공격에 대해 더욱 내성인 연결기로 변형된 하나 이상의 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다. 뉴클레아제 내성은 혈청 중 올리고뉴클레오티드를 항온처리함으로써 또는 뉴클레아제 내성 검정(예컨대, 뱀 독액 포스포다이에스터라제(SVPD))(둘 다 당분야에 널리 공지됨)을 사용함으로써 측정될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 강화시킬 수 있는 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결기로 지칭된다. 일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오시드간 연결기의 50% 이상은 변형되고, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오시드간 연결기의 60% 이상, 예컨대 70% 이상, 예컨대 80% 이상, 또는, 예컨대 90% 이상은 변형된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 변형된다. 일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 비-뉴클레오티드 작용기, 예컨대 접합체에 연결하는 뉴클레오시드가 포스포다이에스터일 수 있음이 인정될 것이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결기이다.
변형된 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트, 다이포스포로티오에이트 및 보라노포스페이트를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스포로티오에이트, 다이포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트의 RNase H 모집과 상용성이다.
일부 양태에서, 뉴클레오시드간 연결기는 황(S)을 포함한다(예컨대, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기).
포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성, 이로운 약동학 및 제조 용이성에 기인하여 특히 유용하다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오시드간 연결기의 50% 이상은 포스포로티오에이트이고, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오시드간 연결기의 60% 이상, 예컨대 70% 이상, 예컨대 80% 이상 또는 90% 이상은 포스포로티오에이트이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 중성 뉴클레오시드간 연결기, 특히 포스포트라이에스터, 메틸포스포네이트, MMI, 아미드-3, 폼아세탈 및 티오폼아세탈로부터 선택되는 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다.
추가의 뉴클레오시드간 연결기는 국제 공개공보 제2009/124238호(참고로서 본원에 혼입됨)에 개시되어 있다. 한 양태에서, 뉴클레오시드간 연결기는 국제 공개공보 제2007/031091호(참고로서 본원에 혼입됨)에 개시된 연결기로부터 선택된다. 특히, 뉴클레오시드간 연결기는 -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, 0-PO(OCH3)-0-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-로부터 선택될 수 있고/거나 뉴클레오시드간 연결기는 O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRHCO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-(이때, RH는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택됨)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
뉴클레아제 내성 연결기, 예컨대 포스포티오에이트 연결기는 표적 핵산, 예컨대 갭머에 대한 영역 G, 또는 헤드머(headmer) 및 테일머(tailmer)의 비-변형된 뉴클레오시드 영역과 함께 듀플렉스를 형성할 때 뉴클레아제를 모집할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드 영역에 특히 유용하다. 그러나, 포스포로티에이트 연결기는 또한 비-뉴클레아제 모집 영역 및/또는 친화도 강화 영역, 예컨대 갭머에 대한 영역 F 및 F', 또는 헤드머 및 테일머의 변형된 뉴클레오시드 영역에 유용할 수 있다.
그러나, 각각의 디자인 영역은 특히 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA가 뉴클레아제 분해에 대해 연결기를 보호하는 영역에서 포스포로티오에이트 이외의 뉴클레오시드간 연결기, 예컨대 포스포다이에스터 연결기를 포함할 수 있다. 특히 변형된 뉴클레오시드 단위(전형적으로 비-뉴클레아제 모집 영역에서) 사이 또는 이의 인근의 포스포다이에스터 연결기, 예컨대 1 또는 2개의 연결기를 포함하는 것은 올리고뉴클레오티드의 생체이용 효능 및/또는 생체분포를 변형시킬 수 있다(참고로서 본원에 혼입된 국제 공개공보 제2008/113832호 참고).
한 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 내의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 및/또는 보라노포스페이트 연결기이다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 내의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 연결기이다.
핵염기
용어 "핵염기"는 핵산 혼성화에서 수소결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 푸린(예컨대, 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘(예컨대, 우라실, 티민 및 사이토신) 모이어티를 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어 "핵염기"는 또한 천연 발생 핵염기와 상이할 수 있지만 핵산 혼성화 동안 작용성인 변형된 핵염기를 포함한다. 이러한 맥락에서, "핵염기"는 천연 발생 핵염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티미딘, 우라실, 잔틴 및 하이포잔틴, 및 비-천연 발생 변이체를 둘 다 지칭한다. 이러한 변이체는, 예를 들어 문헌[Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055] 및 문헌[Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1]에 기술되어 있다.
일부 양태에서, 핵염기 모이어티는 푸린 또는 피리미딘을 변형된 푸린 또는 피리미딘, 예컨대 치환된 푸린 또는 치환된 피리미딘, 예컨대 이소사이토신, 슈도이소사이토신, 5-메틸-사이토신, 5-티오졸로-사이토신, 5-프로핀일-사이토신, 5-프로핀일-우라실, 5-브로모-우라실, 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 2'-티오-티민, 이노신, 다이아미노푸린, 6-아미노푸린, 2-아미노푸린, 2,6-다이아미노푸린 및 2-클로로-6-아미노푸린으로부터 선택되는 핵염기로 바꿈으로써 변형된다.
핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대한 문자 부호, 예컨대 A, T, G, C 또는 U로 표시될 수 있고, 이때 각각의 문자는 임의적으로 균등한 기능의 변형된 핵염기를 포함한다. 예를 들어, 예시적인 올리고뉴클레오티드에서, 핵염기 모이어티는 A, T, G, C 및 5-메틸-사이토신으로부터 선택된다. 임의적으로, LNA 갭머의 경우, 5-메틸-사이토신 LNA 뉴클레오시드가 사용될 수 있다.
변형된 올리고뉴클레오티드
용어 "변형된 올리고뉴클레오티드" 또는 "변형된 핵산 분자"는 하나 이상의 당-변형된 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자를 기술한다. 용어 "키메라"는 변형된 뉴클레오시드, 특히 갭머 올리고뉴클레오시드를 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자를 기술하기 위해 문헌에서 사용되는 용어이다.
상보성
용어 "상보성"은 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭 염기-대합을 위한 자격을 기술한다. 왓슨-크릭 염기 쌍은 구아닌(G)-사이토신(C) 및 아데닌(A)-티민(T)/우라실(U)이다. 올리고뉴클레오티드가 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있고, 예를 들어 5-메틸 사이토신이 종종 사이토신 대신에 사용되고, 상기 용어 "상보성"은 비-변형된 및 변형된 핵염기 사이의 왓슨-크릭 염기 대합을 포괄함이 이해될 것이다(예를 들어, 문헌[Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055] 및 문헌[Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1] 참고).
본원에 사용된 용어 "% 상보성"은 소정 위치에서, 별개의 핵산 분자(예컨대, 표적 핵산)의 소정 위치의 인접 뉴클레오티드 서열에 상보성인(즉, 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성하는) 핵산 분자(예컨대, 올리고뉴클레오티드) 내의 인접 뉴클레오티드 서열의 %인 뉴클레오티드의 수를 지칭한다. %는 2개의 서열 사이에 쌍을 형성하는 정렬된 염기의 수를 세고(표적 서열 5'-3' 및 올리고뉴클레오티드 서열 3'-5'로 정렬될 때), 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 총 수로 나누고, 100을 곱함으로써 계산된다. 이러한 비교에서, 정렬(염기 쌍을 형성)되지 않는 핵염기/뉴클레오티드는 미스매치로 지칭된다. 바람직하게는, 삽입 및 결실은 인접 뉴클레오티드 서열의 % 상보성의 계산에서 허용되지 않는다.
용어 "완전히 상보성"은 100% 상보성을 지칭한다.
하기 서열은 표적 핵산(서열번호 10)에 완전히 상보성인 올리고뉴클레오티드(서열번호 12)의 예이다.
Figure pat00001
동일성
본 발명에 있어서, 용어 "동일성" 또는 "% 동일성"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 본원에 제공된 서열(예를 들어 서열번호 1, 2, 또는 3의 서열)에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 가짐을 의미하되, 여기서 보다 높은 동일성 값은 낮은 것보다 바람직하다. 본 발명에 따라, 2개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열에 있어서 용어 "동일성" 또는 "% 동일성"은, 당분야에 공지된 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 측정시 비교의 윈도우에 대해 또는 디자인된 영역에 대해 최대 유사성에 대해 비교하고 정렬할 때, 동일하거나 명시된 %의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는(예를 들어 서열번호 1, 2, 3, 7, 8 또는 9의 아미노산 서열에 대해 또는 예를 들어 서열번호 4, 5, 6, 10 또는 11의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 갖는) 2개 이상의 서열을 지칭한다.
아미노산 서열의 경우, 바람직하게는 기술된 동일성은 약 50개 이상의 아미노산, 바람직하게는 100개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 400개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 500개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 600개 이상의 아미노산, 가장 바람직하게는 길이 내 모든 아미노산인 영역에 걸쳐 존재한다.
뉴클레오티드 서열의 경우, 기술된 동일성은 가장 바람직하게는 100개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 1,000개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 2,000개 이상의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 길이 내 모든 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재한다. 그러나, 일반적으로 50개 미만의 뉴클레오티드인 핵산 분자의 경우, 동일성은 상당히 보다 짧은 영역에 걸쳐 평가될 수 있다. 일반적으로, 핵산 분자의 % 동일성은, 2개의 서열 사이에 동정된 정렬된 염기의 수를 세고, 핵산 분자 내 뉴클레오티드의 총 수로 나누고 100을 곱하여 계산된다. % 동일성 = (매치 x 100)/정렬된 영역의 길이. 바람직하게는, 삽입 및 결실은 핵산 분자의 인접 뉴클레오티드 서열의 % 동일성의 계산에서 허용되지 않는다.
당업자는 당분야에 공지된 바와 같이 예를 들어 CLUSTALW 컴퓨터 프로그램(문헌[Thompson, 1994, Nucl Acids Res, 2: 4673-4680]) 또는 FASTDB(문헌[Brutlag, 1990, Comp App Biosci, 6: 237-245])를 기반으로 한 알고리즘을 사용하여 서열 사이의 % 동일성을 결정하는 방법을 알 것이다. 또한, BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘(문헌[Altschul, 1997, Nucl Acids Res 25: 3389-3402]; [Altschul, 1993, J Mol Evol, 36: 290-300]; [Altschul, 1990, J Mol Biol 215: 403-410])이 당업자에게 입수가능하다. 예를 들어, BLAST 2.0(Basic Local Alignment Search Tool BLAST(문헌[Altschul, 1997, loc. cit.]; [Altschul, 1993, loc. cit.]; [Altschul, 1990, loc. cit.]))은 부분 서열 정렬을 탐구하는데 사용될 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, BLAST는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 모두의 정렬을 생성하여 서열 유사성을 결정한다. 정렬의 부분 성질 때문에, BLAST는 정확한 매치를 결정하고 유사한 서열을 동정하는데 특히 유용하다. BLAST(문헌[Altschul, 1997, loc. cit.]; [Altschul, 1993, loc. cit.]; [Altschul, 1990, loc. cit.])를 사용하는 유사한 컴퓨터 기술은, 뉴클레오티드 데이터 베이스(예컨대 GenBank 또는 EMBL)에서 동일하거나 관련된 분자를 탐구하는데 사용된다.
혼성화
본원에 사용된 용어 "혼성화함" 또는 "혼성화하다"는 대향하는 가닥 상의 염기 쌍 사이에 수소결합을 형성하고 이에 의해 듀플렉스를 형성하는 2개의 핵산 가닥(예컨대, 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산)으로 이해되어야 한다. 2개의 핵산 가닥 사이의 결합의 친화도는 혼성화의 강도이다. 이것은 종종 올리고뉴클레오티드의 절반이 표적 핵산과 듀플렉싱된 온도로서 정의되는 용융 온도(Tm)에 의하여 기술된다. 생리학적 조건 Tm은 친화도에 엄격히 비례하지는 않는다(문헌[Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537]). 표준 상태 깁스(Gibbs) 자유 에너지 ΔG°는 결합 친화도의 더욱 정확한 표현이고, ΔG°= -RTln(Kd)(이때, R은 기체 상수이고, T는 절대 온도임)에 의해 반응의 해리 상수(Kd)와 관련된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 반응의 매우 낮은 ΔG°는 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 강한 혼성화를 반영한다. ΔG°는 수성 농도가 1 M이고, pH가 7이고, 온도가 37℃인 반응과 연관된 에너지이다. 표적 핵산으로의 올리고뉴클레오티드의 혼성화는 자발적인 반응이고, 자발적인 반응의 경우, ΔG°는 0 미만이다. ΔG°는, 예를 들어, 문헌[Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38] 및 문헌[Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today]에 기술된 등온 적정 열량계(ITC) 방법을 사용함으로써 실험적으로 측정될 수 있다. 당업자는 시판 중인 장비가 ΔG° 측정에 이용가능함을 알 것이다. ΔG°는 또한 문헌[Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216] 및 문헌[McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405]에 기술된 대략적으로 유도된 열역학 파라미터를 사용하는 문헌[SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465]에 기술된 최근접 이웃 모델(nearest neighbor model)을 사용함으로써, 수치적으로 추정될 수 있다. 혼성화에 의해 의도된 핵산 표적을 조절할 가능성을 갖기 위하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 미만의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화한다. 일부 양태에서, 혼성화의 정도 또는 강도는 표준 상태 깁스 자유 에너지 ΔG°에 의해 측정된다. 올리고뉴클레오티드는 8 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 미만, 예컨대 -15 kcal 미만, 예컨대 -20 kcal 미만, 예컨대 -25 kcal 미만의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화할 수 있다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 -10 내지 -60 kcal, 예컨대 -12 내지 -40 kcal, 예컨대 -15 내지 -30 kcal 또는 -16 내지 -27 kcal, 예컨대 -18 내지 -25 kcal의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화한다.
표적 핵산
본 발명에 따라서, 표적 핵산은 포유류 PAPD5 또는 PAPD7을 코딩하고, 예를 들어 유전자, RNA, mRNA 및 미성숙 mRNA, 성숙 mRNA 또는 cDNA 서열일 수 있는 핵산이다. 따라서, 표적은 PAPD5 또는 PAPD7 표적 핵산으로서 지칭될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자는, 예를 들어 포유류 PAPD5 또는 PAPD7의 표적 엑손 영역일 수 있거나, 예를 들어 PAPD5 또는 PAPD7 미성숙 mRNA의 표적 인트론 영역일 수 있다. 적합하게, 표적 핵산은 PAPD5 또는 PAPD7 단백질, 특히 포유류 PAPD5 또는 PAPD7, 예컨대 인간 PAPD5 또는 PAPD7(예를 들어 인간, 원숭이, 래트 및 돼지 PAPD5 또는 PAPD7에 대한 mRNA 및 미성숙 mRNA를 제공하는 표 1A 및 1B 및 표 2A 및 2B 참조)을 코딩한다.
일부 양태에서, 표적 핵산은 서열번호 4, 5 또는 10 또는 이의 천연 발생 변이체(예컨대, 포유류 PAPD5를 코딩하는 서열)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 표적 핵산은 서열번호 6 또는 11 또는 이의 천연 발생 변이체(예컨대, 포유류 PAPD7을 코딩하는 서열)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
연구 또는 진단에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우, 표적 핵산은 cDNA, 또는 DNA 또는 RNA로부터 유도된 합성 핵산일 수 있다.
생체내 또는 시험관내 적용의 경우, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 PAPD5 또는 PAPD7 표적 핵산을 발현하는 세포에서 PAPD5 또는 PAPD7 표적 핵산의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 핵염기의 인접 서열은 전형적으로, 1 또는 2개의 미스매치를 임의적으로 제외하고, 올리고뉴클레오티드를 임의적인 작용기, 예컨대 접합체, 또는 다른 비-상보성 종결 뉴클레오티드(예컨대, 영역 D' 또는 D")에 연결할 수 있는 뉴클레오티드 기반 연결기 영역을 임의적으로 제외하면서 올리고뉴클레오티드의 길이에 따라 측정된 바와 같이, PAPD5 또는 PAPD7 표적 핵산에 상보성이다. 표적 핵산은, 일부 양태에서, RNA 또는 DNA, 예컨대 메신저 RNA, 예컨대 성숙 mRNA 또는 미성숙 mRNA 일 수 있다. 일부 양태에서, 표적 핵산은 포유류 PAPD5 또는 PAPD7 단백질, 예컨대 인간 PAPD5 또는 PAPD7, 예를 들어 인간 PAPD5 mRNA 서열(예컨대 서열번호 4, 5 또는 10으로 개시된 것) 또는 인간 PAPD7 mRNA 서열(예컨대 서열번호 6 또는 11로서 개시된 것)을 코딩하는 RNA 또는 DNA이다. 예시적인 표적 핵산에 대한 추가 정보는 표 1A 및 1B 및 표 2A 및 2B에 제공된다.
[표 1A]
Figure pat00002
[표 1B]
Figure pat00003
표적 서열
본원에 사용된 용어 "표적 서열"은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자에 상보성인 핵염기 서열을 포함하는 표적 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 일부 양태에서, 표적 서열은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열에 상보성인 표적 핵산 상의 영역으로 이루어진다(즉, 하위-서열).
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자는 표적 핵산, 예컨대 본원에 기술된 표적 서열 상의 영역에 상보성이거나 이에 혼성화되는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
올리고뉴클레오티드가 상보성이거나 이에 혼성화되는 표적 핵산 서열은 일반적으로 10개 이상의 뉴클레오티드의 인접 핵염기의 스트레치를 포함한다. 인접 뉴클레오티드 서열은 10 내지 50개의 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 30개, 예컨대 13 내지 25개, 예컨대 14 내지 20개, 예컨대 15 내지 18개의 인접 뉴클레오티드이다.
천연 발생 변이체
용어 "천연 발생 변이체"는 표적 핵산과 동일한 유전자 자리로부터 유래하지만, 예를 들어, 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈의 다양성을 야기하는 유전자 코드의 퇴화에 기인하여, 또는 미성숙 mRNA의 대체적인 스플라이싱(splicing), 또는 다형태, 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형태, 및 대립형질 변이체의 존재에 기인하여 상이할 수 있는 PAPD5 또는 PAPD7 유전자 또는 전사체의 변이체를 지칭한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드에 대한 충분한 상보성 서열의 존재에 근거하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 및 이의 천연 발생 변이체를 표적화할 수 있다.
일부 양태에서, 천연 발생 변이체는 포유류 PAPD5 표적 핵산, 예컨대 서열번호 4, 5 또는 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 핵산에 대해 95% 이상, 예컨대 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖는다.
일부 양태에서, 천연 발생 변이체는 포유류 PAPD5 표적 핵산, 예컨대 서 서열번호 6 또는 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 핵산에 대해 95% 이상, 예컨대 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖는다.
수많은 단일 뉴클레오티드 다형태는 PAPD5 또는 PAPD7 유전자, 예를 들어 하기 표 2A(인간 미성숙 mRNA 개시/기준 서열은 서열번호 10임) 및 표 2B(인간 미성숙 mRNA 개시/기준 서열은 서열번호 11임)에 개시된 것들에서 공지되어 있다.
[표 2A]
Figure pat00004
[표 2B]
Figure pat00005
발현의 조절
본원에 사용된 용어 "발현의 조절"은 핵산 분자의 투여 전의 PAPD5 또는 PAPD7의 양과 비교시 PAPD5 또는 PAPD7의 양을 변화시키는 핵산 분자 능력에 대한 전반적인 용어로서 이해되어야 한다. 다르게는, 발현의 조절은 대조군 실험을 참고하여 결정될 수 있다. 대조군이 염수 조성물로 처리된 개체 또는 표적 세포, 또는 비-표적화 분자 또는 핵산 분자(모의군)로 처리된 개체 또는 표적 세포임이 일반적으로 이해된다. 그러나, 이는 또한 관리 기준으로 처리된 개체일 수 있다.
조절의 하나의 유형은, 예컨대 mRNA의 분해 또는 전사의 봉쇄에 의해, PAPD5 또는 PAPD7의 발현을 억제하거나, 하향조절하거나, 감소시키거나, 저해시키거나, 제거하거나, 중단시키거나, 차단시키거나, 예방하거나, 줄이거나, 저하시키거나, 회피하거나, 종결하는 핵산 분자의 능력이다.
고친화도 변형된 뉴클레오시드
고친화도 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어 용융 온도(Tm)에 의해 측정시, 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 때, 상보성 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 강화시키는 변형된 뉴클레오티드이다. 본 발명의 고친화도 변형된 뉴클레오시드는 바람직하게는 변형된 뉴클레오시드 당 +0.5 내지 +12℃, 더욱 바람직하게는 +1.5 내지 +10℃, 가장 바람직하게는 +3 내지 +8℃의 용융 온도 증가를 야기한다. 수많은 고친화도 변형된 뉴클레오시드가 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 많은 2' 치환된 뉴클레오시드 및 잠금 핵산(LNA)을 포함한다(예컨대, 문헌[Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443] 및 문헌[Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213] 참고).
당 변형
본 발명의 핵산 분자는 DNA 및 RNA에서 발견되는 리보스 당 모이어티와 비교시, 변형된 당 모이어티, 즉, 당 모이어티의 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
리보스 당 모이어티의 변형을 갖는 수많은 뉴클레오시드는 주로 핵산 분자의 특정 특성, 예컨대 친화도 및/또는 뉴클레아제 내성을 개선할 목적으로 제조되었다.
이러한 변형은, 예컨대, 헥소스 고리(HNA), 리보스 고리 상의 C2와 C4 탄소 사이에 바이라디칼 가교를 전형적으로 갖는 이환형 고리(LNA), 또는 C2와 C3 탄소 사이에 결합이 전형적으로 결핍된 연결되지 않은 리보스 고리(예컨대, UNA)에 의한 치환에 의해, 리보스 고리 구조가 변형된 것들을 포함한다. 다른 당 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어, 바이사이클로헥소스 핵산(국제 공개공보 제2011/017521호) 또는 삼환형 핵산(국제 공개공보 제2013/154798호)을 포함한다. 변형된 뉴클레오시드는 또한, 예를 들어 펩티드 핵산(PNA) 또는 모폴리노 핵산의 경우, 당 모이어티가 비-당 모이어티로 대체되는 뉴클레오시드를 포함한다.
당 변형은 또한 리보스 고리 상의 치환기를 수소 이외의 기, 또는 DNA 및 RNA 뉴클레오시드에서 천연 발견되는 2'-OH 기로 변경함으로써 제조된 변형을 포함한다. 치환기는, 예를 들어 2', 3', 4' 또는 5' 위치에서 도입될 수 있다. 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드는 또한 2' 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오시드를 포함한다. 실제로, 2' 치환된 뉴클레오시드를 개발하는데 많은 초점이 맞춰졌고, 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 때, 강화된 뉴클레오시드 내성 및 강화된 친화도를 갖는 수많은 2' 치환된 뉴클레오시드가 발견되었다.
2' 변형된 뉴클레오시드
2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 위치에서 H 또는 -OH 이외의 치환기를 갖거나(2' 치환된 뉴클레오시드) 2' 연결된 바이라디칼을 포함하는 뉴클레오시드이고, 2' 치환된 뉴클레오시드 및 LNA(2'-4' 바이라디칼 가교된) 뉴클레오시드를 포함한다. 예를 들어, 2' 변형된 당은 강화된 결합 친화도 및/또는 증가된 뉴클레아제 내성을 올리고뉴클레오티드에 제공할 수 있다. 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드의 예는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드이다. 추가 예의 경우, 문헌[Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443], 문헌[Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213], 및 문헌[Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937]을 참고한다. 일부 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드가 하기 제시된다:
Figure pat00006
잠금 핵산(LNA) 뉴클레오시드
LNA 뉴클레오시드는 뉴클레오티드의 리보스 당 고리의 C2'와 C4' 사이에 연결기(바이라디칼 또는 가교로서 지칭됨)를 포함하는 변형된 뉴클레오시드이다. 이러한 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 가교된 핵산 또는 이환형 핵산(BNA)으로 지칭된다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고머의 변형된 뉴클레오시드 또는 LNA 뉴클레오시드는 하기 화학식 I 또는 II의 일반적인 구조를 갖는다:
[화학식 I]
Figure pat00007
[화학식 II]
Figure pat00008
상기 식에서,
W는 -O-, -S-, -N(Ra)-, -C(RaRb)-로부터 선택되고, 예컨대, 일부 양태에서 -O-이고;
B는 핵염기 또는 변형된 핵염기 모이어티이고;
Z는 인근 뉴클레오시드에 대한 뉴클레오시드간 연결기, 또는 5'-말단 기이고;
Z*는 인근 뉴클레오시드에 대한 뉴클레오시드간 연결기 또는 3'-말단 기이고;
X는 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z로 이루어진 군으로부터 선택되는 기이고(일부 양태에서, X는 -O-, -S-, NH-, NRaRb, -CH2-, CRaRb, -C(=CH2)- 및 -C(=CRaRb)-로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, X는 -O-이다),
Y는 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z로 이루어진 군으로부터 선택되는 기이거나(일부 양태에서, Y는 -CH2-, -C(RaRb)-, -CH2CH2-, -C(RaRb)-C(RaRb)-, -CH2CH2CH2-, -C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)- 및 -C(Ra)=N-으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, Y는 -CH2-, -CHRa-, -CHCH3- 및 CRaRb-로 이루어진 군으로부터 선택된다),
-X-Y-는 함께 2가 연결기(또한 라디칼로 지칭됨)이거나, -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4개의 기/원자로 이루어진 2가 연결기이고(일부 양태에서, -X-Y-는 -X-CH2-, -X-CRaRb-, -X-CHRa-, -X-C(HCH3)-, -O-Y-, -O-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH2-, -O-CHCH3-, -CH2-O-CH2, -O-CH(CH3CH3)-, -O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH2-, -O-CH2OCH2-, -O-NCH2-, -C(=CH2)-CH2-, -NRa-CH2-, N-O-CH2, -S-CRaRb- 및 -S-CHRa-로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이라디칼이다. 일부 양태에서, -X-Y-는 -O-CH2- 또는 -O-CH(CH3)-이다. 이때 Z는 -O-, -S- 및 -N(Ra)-로부터 선택된다);
Ra, 및 존재하는 경우 Rb는 각각 수소, 임의적으로 치환된 C1-6-알킬, 임의적으로 치환된 C2-6-알켄일, 임의적으로 치환된 C2-6-알킨일, 하이드록시, 임의적으로 치환된 C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알켄일옥시, 카복시, C1-6-알콕시카보닐, C1-6-알킬카보닐, 폼일, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)-아미노카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카브아미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 아릴 및 헤테로아릴은 임의적으로 치환될 수 있고, 2개의 같은자리 치환기 Ra 및 Rb는 함께 임의적으로 치환된 메틸렌(=CH2)을 나타낼 수 있고, 모든 키랄 중심에 대하여, 비대칭 기는 R 또는 S 배향으로 발견될 수 있고;
R1, R2, R3, R5 및 R5*는 수소, 임의적으로 치환된 C1-6-알킬, 임의적으로 치환된 C2-6-알켄일, 임의적으로 치환된 C2-6-알킨일, 하이드록시, C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알켄일옥시, 카복시, C1-6-알콕시카보닐, C1-6-알킬카보닐, 폼일, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)-아미노카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카브아미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 아릴 및 헤테로아릴은 임의적으로 치환될 수 있고, 2개의 같은자리 치환기는 함께 옥소, 티오옥소, 이미노 또는 임의적으로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있다.
일부 양태에서, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸 및 수소로부터 독립적으로 선택된다.
일부 양태에서, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다.
일부 양태에서 R1, R2 및 R3은 모두 수소이고, R5 또는 R5*는 또한 수소이고, R5 및 R5* 중 나머지 하나는 수소가 아니 것, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
일부 양태에서, Ra는 수소 또는 메틸이다. 일부 양태에서, 존재하는 경우, Rb는 수소 또는 메틸이다.
일부 양태에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 다는 수소이다.
일부 양태에서, Ra 및 Rb 중 하나는 수소이고, 다른 하나는 수소가 아니다.
일부 양태에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고, 다른 하나는 수소이다.
일부 양태에서, Ra 및 Rb는 둘 다 메틸이다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제99/014226호, 국제 공개공보 제00/66604호, 국제 공개공보 제98/039352호 및 국제 공개공보 제2004/046160호(모두 본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있고, 베타-D-옥시 LNA 및 알파-1-옥시 LNA 뉴클레오시드로서 공지된 것들을 포함한다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -S-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 티오 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제99/014226호 및 국제 공개공보 제2004/046160호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -NH-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 아미노 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제99/014226호 및 국제 공개공보 제2004/046160호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-CH2- 또는 -O-CH2-CH2-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제00/047599호 및 문헌[Morita et al, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76](본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있고, 2'-O-4'C-에틸렌 가교 핵산(ENA)으로 통상적으로 공지된 것들을 포함한다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2 및 R3 모두 및 R5 및 R5* 중 하나는 수소이고, R5 및 R5* 중 다른 하나는 수소가 아닌 것, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 5' 치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제2007/134181호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CRaRb-이고, 이때 Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 다는 수소가 아닌 것, 예컨대 메틸이고, W는 O이고, R1, R2 및 R3 모두 및 R5 및 R5* 중 하나는 수소이고, R5 및 R5* 중 다른 하나는 수소가 아닌 것, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 비스 변형된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제2010/077578호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 2가 연결기 -O-CH(CH2OCH3)-(2' O-메톡시에틸 이환형 핵산, 문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81])을 나타낸다. 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 2가 연결기 -O-CH(CH2CH3)-(2'O-에틸 이환형 핵산, 문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81])을 나타낸다. 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CHRa-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제10/036698호 및 국제 공개공보 제07/090071호(둘 다 본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH(CH2OCH3)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 당분야에서 환형 MOE(cMOE)로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제07/090071호에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 2가 연결기 -O-CH(CH3)-을 나타낸다(R- 또는 S-배열). 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 함께 2가 연결기 -O-CH2-O-CH2-를 나타낸다(문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem]). 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH(CH3)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 메틸 LNA 뉴클레오시드는 당분야에서 cET 뉴클레오시드로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제07/090071호(베타-D) 및 국제 공개공보 제2010/036698호(알파-L)(둘 다 본원에 참고로서 혼입됨)에 개시된 바와 같이, (S)cET 또는 (R)cET 입체 이성질체일 수 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CRaRb-이고, 이때 Ra 및 Rb는 모두 수소가 아니고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra 및 Rb는 둘 다 메틸이다. 이러한 6' 다이-치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제2009/006478호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -S-CHRa-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 치환된 티오 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제11/156202호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다. 일부 6' 치환된 티오 LNA 양태에서, Ra는 메틸이다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -C(=CH2)-C(RaRb)-, 예컨대 -C(=CH2)-CH2- 또는 -C(=CH2)-CH(CH3)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 비닐 카보 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제08/154401호 및 국제 공개공보 제09/067647호(둘 다 본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -N(-ORa)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 N 치환된 LNA로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제2008/150729호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다. 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 함께 2가 연결기 -O-NRa-CH3-을 나타낸다(문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem]). 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -N(Ra)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
일부 양태에서, R5 및 R5* 중 하나 또는 둘 다는 수소이고, 치환되는 경우, R5 및 R5* 중 다른 하나는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 양태에서, R1, R2 및 R3은 모두 수소일 수 있고, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2- 및 -O-C(HCRa)-, 예컨대 -O-C(HCH3)-으로부터 선택될 수 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼은 -CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 CH2-O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 형태적으로 제한된 뉴클레오티드(CRN)로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제2013/036868호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼은 -O-CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 O-CH2-O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 COC 뉴클레오티드로 공지되어 있고, 문헌[Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238](본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
달리 지시되지 않는 한, LNA 뉴클레오시드가 베타-D 또는 알파-L 입체 이성질형일 수 있음이 인정될 것이다.
LNA 뉴클레오시드의 특정 예는 하기 도식 1에 지시된다.
[도식 1]
Figure pat00009
상기 예에 예시된 바와 같이, 본 발명의 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 중 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA 뉴클레오시드이다.
뉴클레아제 매개된 분해
뉴클레아제 매개된 분해는 상보성 뉴클레오티드 서열과 듀플렉스를 형성할 때, 상보성 뉴클레오티드 서열의 분해를 매개할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 뉴클레아제 매개된 분해를 통해 작용할 수 있고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제, 특히 엔도뉴클레아제, 바람직하게는 엔도리보뉴클레아제(RNase), 예컨대 RNase H를 모집할 수 있다. 뉴클레아제 매개된 기전을 통해 작동하는 올리고뉴클레오티드 디자인의 예는 전형적으로 5 또는 6개 이상의 DNA 뉴클레오시드의 영역을 포함하고 친화도 강화 뉴클레오시드, 예를 들어 갭머, 헤드머 및 테일머에 의해 한 측면 또는 양 측면 상에 접하는 올리고뉴클레오티드이다.
RNase H 활성 및 모집
안티센스 올리고뉴클레오티드의 RNase H 활성은 상보성 RNA 분자와의 듀플렉스에서 RNase H를 모집하는 이의 능력을 지칭한다. 국제 공개공보 제01/23613호는 RNase H를 모집하는 능력을 측정하는데 사용될 수 있는 RNase H 활성을 측정하기 위한 시험관내 방법을 제공한다. 전형적으로, 상보성 표적 핵산 서열과 함께 제공될 때, 시험되는 변형된 올리고뉴클레오티드와 동일한 염기 서열을 갖지만, 올리고뉴클레오티드 내의 모든 단량체 사이에 포스포로티오에이트 연결기를 갖는 DNA 단량체만을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 국제 공개공보 제01/23613호(본원에 참고에 의해 혼입됨)의 실시예 91 내지 95에 제공된 방법을 사용하여 측정된 초기 속도의 5% 이상, 예컨대 10% 이상 또는 20% 초과의 초기 속도(pmol/L/분으로 측정됨)를 갖는다면, 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 모집할 수 있는 것으로 간주된다.
갭머
본원에 사용된 용어 "갭머"는 하나 이상의 친화도 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 영역에 의해 5' 및 3' 측면(플랭크 또는 윙)에 위치하는 RNase H 모집 올리고뉴클레오티드의 영역(갭)을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 다양한 갭머 디자인이 본원에 기술되어 있다. 헤드머 및 테일머는 하나의 플랭크가 소실되는, 즉 올리고뉴클레오티드의 단부 중 1개만이 친화도 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 RNase H를 모집할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 헤드머의 경우, 3' 플랭크가 소실되고(즉, 5' 플랭크는 친화도 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함함), 테일머의 경우, 5' 플랭크가 소실된다(즉, 3' 플랭크는 친화도 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함함).
LNA 갭머
용어 "LNA 갭머"는 하나 이상의 친화도 강화 변형된 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인 갭머 올리고뉴클레오티드이다.
혼합된 윙 갭머
용어 "혼합된 윙 갭머" 또는 "혼합된 플랭크 갭머"는 하나 이상의 플랭크 영역이 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드 및 하나 이상의 비-LNA 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 하나 이상의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드, 예컨대, 예를 들어, 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드를 포함하는 LNA 갭머를 지칭한다. 일부 양태에서, 혼합된 윙 갭머는 LNA 뉴클레오시드만을 포함하는 하나의 플랭크(예컨대, 5' 또는 3')를 갖고, 다른 플랭크(각각 3' 또는 5')는 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드 및 임의적으로 LNA 뉴클레오시드를 포함한다.
접합체
본원에 사용된 용어 "접합체"는 비-뉴클레오티드 모이어티(접합체 모이어티 또는 영역 C 또는 제3 영역)에 공유결합으로 연결되는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
하나 이상의 비-뉴클레오티드 모이어티로의 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 접합은, 예컨대, 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포, 세포 흡수 또는 안정성에 영향을 줌으로써, 올리고뉴클레오티드의 약리학을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 접합체 모이어티는, 올리고뉴클레오티드의 세포 분포, 생체 이용률, 대사, 배설, 침투성 및/또는 세포 섭취를 개선함으로써 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 변경하거나 강화시킨다. 특히 접합체는 특정 장기, 조직 또는 세포 유형에 대해 올리고뉴클레오티드를 표적화하여 상기 장기, 조직 또는 세포 유형에서 올리고뉴클레오티드의 효과를 강화시킬 수 있다. 동시에, 접합체는 비-표적 세포 유형, 조직 또는 장기에서 올리고뉴클레오티드의 활성, 예를 들어 또는 비-표적 세포 유형, 조직 또는 장기에서 오프 표적(off target)의 활성 또는 활성을 감소시키는 역할을 한다. 국제 공개공보 제93/07883호 및 국제 공개공보 제2013/033230호(본원에 참고로서 혼입됨)는 적합한 접합체 모이어티를 제공한다. 더욱 적합한 접합체 모이어티는 아시알로당단백질 수용체(ASGPr)로 결합할 수 있는 것이다. 특히, 3-가 N-아세틸갈락토사민 접합체 모이어티는 ASGPr로의 결합에 적합하다(예를 들어, 국제 공개공보 제2014/076196호, 국제 공개공보 제2014/207232호 및 국제 공개공보 제2014/179620호(본원에 참고에 의해 혼입됨) 참고).
올리고뉴클레오티드 접합체 및 합성은 또한 문헌[Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001] 및 문헌[Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103](이들은 각각 이의 전체 내용이 참고로서 본원에 혼입됨)에 의해 포괄적인 검토로서 보고되었다.
한 양태에서, 비-뉴클레오티드 모이어티(접합체 모이어티)는 탄수화물, 세포 표면 수용체 리간드, 약물 물질, 호르몬, 친유성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소(예컨대, 박테리아 독소), 비타민, 바이러스성 단백질(예컨대, 캡시드) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
접합체 연결기
연결기는 하나의 해당 화학적 기 또는 분절을 하나 이상의 공유결합을 통해 다른 해당 화학적 기 또는 분절로 연결하는 2개의 원자 사이의 결합이다. 접합체 모이어티는 직접적으로 또는 연결 모이어티(예컨대, 연결기 또는 테더)를 통해 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 연결기는 제3 영역, 예컨대 접합체 모이어티를 올리고뉴클레오티드에 공유결합으로 연결시키는 역할을 한다(예를 들어 영역 A 또는 C의 말단).
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 접합체 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 임의적으로 연결기 영역을 포함할 수 있고, 이는 올리고뉴클레오티드와 접합체 모이어티 사이에 위치된다. 일부 양태에서, 접합체와 올리고뉴클레오티드 사이의 연결기는 생체절단성이다.
생체절단성 연결기는 포유류 신체 내에서 통상적으로 맞닥뜨리거나 통상적으로 맞닥뜨리는 것과 유사한 조건 하에 절단성 생리학적으로 불안정한 결합을 포함하거나 이로 이루어진다. 생리학적으로 불안정한 연결기가 화학적 변형(예컨대, 절단)을 겪는 조건은 포유류 세포에서 발견되거나 포유류 세포에서 맞닥뜨리는 바와 유사한 pH, 온도, 산화 또는 환원 조건 또는 약품, 및 염 농도와 같은 화학적 조건을 포함한다. 포유류 세포내 조건은 또한 포유류 세포에 통상적으로 존재하는 효소적 활성, 예컨대 단백질 분해 효소 또는 가수분해 효소 또는 뉴클레아제로부터의 효소적 활성의 존재를 포함한다. 한 양태에서, 생체절단성 연결기는 S1 뉴클레아제 절단에 민감하다. 바람직한 양태에서, 뉴클레아제 민감성 연결기는 2개 이상의 연속적인 포스포다이에스터 연결기, 예컨대 3개 이상 또는 4 또는 5개의 연속적인 포스포다이에스터 연결기를 포함하는 1 내지 10개의 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오시드, 더욱 바람직하게는 2 내지 6개의 뉴클레오시드, 가장 바람직하게는 2 내지 4개의 연결된 뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게는, 뉴클레오시드는 DNA 또는 RNA이다. 포스포다이에스터 함유 생체절단성 연결기는 국제 공개공보 제2014/076195호(본원에 참고에 의해 혼입됨)에 더욱 상세히 기술되어 있다.
또한, 접합체는 비-생체절단성 연결기를 통해 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있거나, 일부 양태에서 접합체는 생체절단성 연결기에 공유결합으로 부착된 비-절단성 연결기를 포함할 수 있다. 연결기는 반드시 생체절단성인 것은 아니나 주로 접합체 모이어티를 올리고뉴클레오티드 또는 생체절단성 연결기에 공유결합으로 연결시킨다. 이러한 연결기는 반복 단위, 예컨대 에틸렌 글리콜, 아미노산 단위 또는 아미노 알킬 기의 쇄 구조 또는 또는 올리고머를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 연결기(영역 Y)는 아미노 알킬, 예컨대 C2-C36 아미노 알킬 기(예를 들어 C6 내지 C12 아미노 알킬 기를 포함함)이다. 일부 양태에서, 연결기(영역 Y)는 C6 아미노 알킬 기이다. 접합체 연결기는 아미노 변형된 올리고뉴클레오티드 및 접합체 기 상의 활성화된 에스터 기의 사용에 의해 올리고뉴클레오티드에 통상적으로 부착될 수 있다.
치료
용어 "치료", "치료함", "치료하다" 등은 일반적으로 목적하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 이러한 효과는 질병 및/또는 이러한 질병에 기인한 부작용을 부분적으로 또는 완전히 치료한다는 관점에서 치료 효과가 있다. 본원에 사용된 용어 "치료"는 개체에서 질병의 임의의 치료를 포괄하고 하기를 포함한다: (a) 질병의 억제, 즉, 이의 발생의 저지, 예컨대 HBsAg 및/또는 HBeAg의 증가의 억제; 또는 (b) 질병의 개선(즉, 완화), 즉, 질병의 퇴행, 예컨대 HBsAg 및/또는 HBeAg 생산의 퇴행의 유발. 따라서, HBV 감염을 개선하고/거나 억제하는 화합물은 HBV 감염을 치료하는 화합물이다. 바람직하게는, 본원에 사용된 용어 "치료"는 이미 나타난 장애, 예컨대 이미 규정되고 나타난 HBV 감염의 의료적 개입에 관한 것이다.
예방
본원에서, 용어 "예방함", "예방" 또는 "예방하다"는 예방적 치료, 즉, 질병을 치료하기보다는 예방하기 위한 목적의 조치 또는 절차에 관한 것이다. 예방은, 질병 또는 이의 증상을 부분적으로 또는 완전히 예방한다는 관점에서 목적하는 예방적인 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득함을 의미한다. 따라서, 본원에서 "HBV 감염을 예방함"은 개체에서 발생하는 HBV 감염을 예방함 및 HBV 감염의 증상의 발생을 예방함을 포함한다. 본 발명에서, 특히 HBV 감염된 모체의 자식에서 HBV 감염의 예방이 고려된다.
환자
본 발명의 목적을 위해, "개체"(또는 "환자")는 척추동물일 수 있다. 본 발명에 있어서, 용어 "개체"는 인간 및 다른 동물, 특히 포유동물, 및 다른 유기체를 포함한다. 따라서, 본원에 제공된 수단 및 방법은 인간 치료 및 수의학적 적용 모두에 적용가능하다. 따라서, 본원에서 개체는 동물, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 기니피그, 흰족제비, 고양이, 개, 닭, 양, 소 종, 말, 낙타 또는 영장류일 수 있다. 바람직하게는, 개체는 포유동물이다. 더욱 바람직하게는, 개체는 인간이다.
HBV 감염
용어 "B형 간염 바이러스 감염" 또는 "HBV 감염"은 당분야에 통상적으로 공지되어 있고, B형 간염 바이러스(HBV)에 의해 야기되고 간에 영향을 미치는 전염병을 지칭한다. HBV 감염은 급성 또는 만성 감염일 수 있다. 일부 감염된 인간은 초기 감염 동안 증상이 없고, 일부는 구토, 황달 피부, 피로, 어두운색 오줌 및 복통과 함께 질병이 급성 발병한다(문헌["Hepatitis B Fact sheet N°204". who.int. July 2014. Retrieved 4 November 2014]). 흔히, 이러한 증상은 몇 주 동안 지속되고 사망을 야기할 수도 있다. 증상이 시작되기까지 30 내지 180일이 걸릴 수 있다. 출생 즈음에 감염된 개체에서, 90%가 만성 B형 간염 감염으로 발달하는 반면에, 5세 이후에 감염된 개체의 10% 미만이 만성 B형 간염 감염으로 발달한다(문헌["Hepatitis B FAQs for the Public - Transmission", U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC), retrieved 2011-11-29]). 만성 질병을 앓는 대부분은 증상이 없다; 그러나, 간경변 및 간암이 궁극적으로 발생할 수 있다(문헌[Chang, 2007, Semin Fetal Neonatal Med, 12: 160-167]). 이들 합병증은 만성 질병을 앓는 개체의 15 내지 25%의 사망을 야기한다(문헌["Hepatitis B Fact sheet N°204". who.int. July 2014, retrieved 4 November 2014]). 본원에서, 용어 "HBV 감염"은 급성 및 만성 B형 간염 감염을 포함한다. 또한, 용어 "HBV 감염"은 초기 감염의 증상이 없는 단계, 증상이 있는 단계, 및 HBV 감염의 증상이 없는 만성 단계를 포함한다.
효소적 활성 단편
본원에서, 서열번호 1 또는 2(즉, PAPD5)의 효소적 활성 단편은, 서열번호 1 또는 2(즉, PAPD5)의 인접 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하고 PAPD5의 생물학적 활성(즉, 기능), 특히 poly-A 폴리머라제 기능을 보유하는 폴리펩티드와 관련된다. 이에 따라, 본원에서, 서열번호 3(즉, PAPD7)의 효소적 활성 단편은 서열번호 3(즉, PAPD7)의 인접 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하고 PAPD7의 생물학적 활성(즉, 기능), 특히 poly-A 폴리머라제 기능을 보유하는 폴리펩티드와 관련된다. PAPD5 및 PAPD7의 효소적 활성 단편에 대한 예는 뉴클레오티딜전달효소 도메인 및 Cid1 poly A 폴리머라제이다.
폴리펩티드
본원에서, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드(아미드) 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체를 포함하거나 이로 이루어진 모든 분자를 포함한다. 따라서, 용어 "폴리펩티드"는 모든 아미노산 서열, 예컨대 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 본원에 기술된 "폴리펩티드"는 천연 발생 폴리펩티드 또는 비-천연 발생 폴리펩티드일 수 있다. 비-천연 발생 폴리펩티드는 천연 발생 대응물과 비교하여 하나 이상의 돌연변이(예를 들어 아미노산 치환, 아미노산 결실 또는 아미노산 부가)를 포함할 수 있다. 또한, 비-천연 발생 폴리펩티드는 벡터에 클로닝될 수 있고/거나 상기 폴리펩티드의 천연 프로모터가 아닌 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 상기 프로모터는 구성적으로 활성인 프로모터일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "아미노산" 또는 "잔기"는 천연 발생 아미노산 및 다른 아미노산(예를 들어 비-천연 발생 아미노산, 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산, 합성 아미노산 등)의 L-이성질체 및 D-이성질체 모두를 포함한다. 천연 발생 아미노산의 예는 알라닌(Ala; A), 아르기닌(Arg; R), 아스파라긴(Asn; N), 아스파르트산(Asp; D), 시스테인(Cys; C), 글루타민(Gln; Q), 글루탐산(Glu; E), 글리신(Gly; G), 히스티딘(His; H), 이소류신(Ile; I), 류신(Leu; L), 라이신(Lys; K), 메티오닌(Met; M), 페닐알라닌(Phe; F), 프롤린(Pro; P), 세린(Ser; S), 트레오닌(Thr; T), 트립토판(Trp; W), 티로신(Tyr; Y), 발린(Val; V)이다. 번역-후 변형된 천연 발생 아미노산는 디하이드로부티린(Dhb) 및 라비오닌(Lab)이다. 비-천연 발생 아미노산의 예는 상기에 기술되어 있다. 비-천연 발생 폴리펩티드는 폴리펩티드의 천연 발생의 아미노산 서열과 비교하여, 아미노산 서열에 공유결합 또는 비-공유결합으로 연결된, 하나 이상의 비-아미노산 치환기 또는 이종 아미노산 치환기(예를 들어 리포터 분자 또는 또 다른 리간드)를 포함할 수 있다.
화합물
본원에서, 용어 "화합물"은 임의의 핵산 분자, 예컨대 본 발명에 따른 RNAi 분자, 또는 이러한 핵산 분자를 포함하는 임의의 접합체를 의미한다. 예를 들어, 본원에서, 화합물은 PAPD5 또는 PAPD7에 대한 RNAi 분자, 특히 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA일 수 있다.
조성물
용어 "조성물"은 또한 핵산 분자 화합물을 기술하는데 사용될 수 있다. 핵산 분자 조성물은 20% 미만의 불순물, 바람직하게는 15% 미만 또는 10% 미만의 불순물, 더욱 바람직하게는 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만 또는 6% 미만의 불순물, 가장 바람직하게는 5% 미만의 불순물을 갖는다. 불순물은 전형적으로 주요 핵산 분자 성분보다 1 또는 2개의 뉴클레오티드가 짧은(n-1 또는 n-2) 핵산 분자이다.
억제제
용어 "억제제"는 당분야에 공지되어 있고 특정 단백질(예를 들어 PAPD5 및/또는 PAPD7)의 생리학적 기능(즉, 활성)을 완전히 또는 부분적으로 방지하거나 감소시킬 수 있는 화합물/물질 또는 조성물과 관련된다. 본 발명에 있어서, PAPD5 또는 PAPD7의 "억제제"는 PAPD5 또는 PAPD7 유전자 산물의 발현을 방지하거나 감소시킴으로써 각각 PAPD5 또는 PAPD7의 활성/기능을 방지하거나 감소시킬 수 있다. 따라서, PAPD5 또는 PAPD7의 억제제는 PAPD5 또는 PAPD7의 감소된 발현 수준(예를 들어 PAPD5 또는 PAPD7 mRNA, 또는 PAPD5 또는 PAPD7 단백질의 감소된 수준)을 야기할 수 있고, 이는 PAPD5 또는 PAPD7의 감소된 기능(즉, 활성)에 반영되되, 상기 기능은 poly-A 폴리머라제 기능을 포함한다. 따라서, 본 발명에 있어서, PAPD5 또는 PAPD7의 억제제는 PAPD5 또는 PAPD7 수준을 감소시킬 수 있는 PAPD5 또는 PAPD7 발현의 전사 억제물질을 포괄할 수 있다. 바람직한 억제제는 본 발명의 핵산 분자이다.
측정
본원에서, 용어 "측정"은 또한 "분석" 또는 "결정"(즉, 검출 및/또는 정량화)을 의미한다. 예를 들어, 용어 "PAPD5 및/또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성의 측정"은 PAPD5 및/또는 PAPD7 발현 및/또는 활성의 양의 결정, 예를 들어, PAPD5 및/또는 PAPD7 폴리펩티드(즉, 단백질)의 양의 결정을 의미한다. PAPD5 및/또는 PAPD7 단백질의 양 및/또는 활성의 측정(즉, 결정) 방법은 당분야에 공지되어 있고 상기에 기술되어 있다. 이에 따라, 용어 "시험 화합물이 HBV의 번식을 억제하는지를 측정함"은 시험 화합물 또는 조성물이 HBV의 번식을 억제하는지를 분석하거나 결정함(즉, 검출함 및/또는 정량화함)을 의미한다.
본 발명은 비제한적인 도면 및 실시예를 참조하여 추가로 설명된다.
실시예
실시예는 본 발명을 실증한다.
재료 및 방법
올리고뉴클레오티드 모티프 서열 및 올리고뉴클레오티드 화합물
[표 3]
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
[표 4]
Figure pat00013
Figure pat00014
Figure pat00015
화합물 화학
2개의 화학물질 시리즈 DHQ 및 THP로부터의 각각의 하나의 화합물을 하이브리제닉스 서비시즈 에스에이에스(HYBRIGENICS SERVICES SAS)에 의해 수행되는 Y3H 선별에 적합하도록 합성하였다. 둘 다의 화합물은 PEG5 연결기를 포함하였고 트라이메토프림(Trimethoprim; TMP) 앵커 리간드로 태깅되었다(표 5).
[표 5]
Figure pat00016
Y3H ULTImate YChemH(상표) 선별
상기 2개의 화합물을 로슈(Roche)에 의해 하이브리제닉스 서비시즈 에스에이에스에 제공하고 침투성 및 독성에 대해 시험하였다. 이어서, 화합물을 하이브리제닉스의 cDNA 인간 태반 라이브러리(PLA)에 대해 선별하였다. 선별을 하이브리제닉스 ULTImate Y2H(상표)에 대해 개발된 최적화된 세포-대-세포 메이팅(mating) 프로토콜에 따라 상이한 화합물 농도에서 사용하여 수행하였다(표 6).
[표 6]
Figure pat00017
Y3H ULTImate YChemH(상표) 의존성 검정
선별로부터 수득한 클론을 96-웰 포맷으로 수집하고, 선택성 조건 하에 성장에 대해 양성인 클론(HIS+)을 스폿 검정을 사용하여 의존성 검정에서 평가하였다. 태깅된 화합물의 존재 하에 선택적 배지 상에서 성장할 수 있는 클론만을 수집하고 처리(세포 용해, PCR, 유전자 서열결정)하고 단백질 정렬에 대해 블라스트(Blast) 분석을 사용하여 맵핑하였다.
Y3H ULTImate YChemH(상표) 원-바이-원 확인 실험 - 프레이 단편
본 확인 단계에서, 하나의 동정된 단편 프레이 및 하나의 화학적 프로브(HBX129653, HBX129654) 각각을 원-바이-원 실험에서 시험하였다. 선별 라이브러리의 3개의 선택된 프레이로부터의 플라스미드를 효모 세포로부터 추출하고 대장균에서 증폭시키고 YHGX13 효모 세포 내로 재-형질전환시켰다. 각각의 상호작용을 위해, 후크(hook) 및 프레이 구축물 모두를 발현하는 이배체의 효모 배양물의 DO1, 1/10, 1/100 및 1/1000을, 트립토판, 류신 및 히스티딘이 부재하고 화학적 프로브 및 FK506으로 보충된 선택적 배지 상에 스폿팅시켰다. 상호작용을 2회 시험하였다. 하나의 플레이트를 각 화학적 화합물 및 농도에 대해 사용하였다(DMSO, 5, 10 및 20 μM의 HBX129653, 5, 10 및 20 μM의 HBX129654, 5 μM의 HBX24786 트라이메토프림(TMP) 및 5 μM의 HBX129634(TMP-PEG5-OH)). 플레이트를 30℃에서 3일 동안 항온처리하였다.
Y3H ULTImate YChemH(상표) 원-바이-원 확인 실험 - 전장 단백질
전장 PAPD5var1(NM_001040284.2) 및 PAPD7varX1(XM_005248234.2)의 코딩 서열을 N-말단 코돈-최적화된 유전자 단편(높은 GC 함량을 제거하기 위함) 및 상업적으로 입수가능한 단백질의 C-말단 영역의 클론으로부터 재구성하고, 원래 pGADGH로부터 유래된, 플라스미드 pP7 내로 Gal4 활성화 도메인(AD)을 갖는 프레임으로 클로닝하였다(AD-Prey)(문헌[Bartel et al., 1993 in Cellular interactions in development: A practical approach. ed. Hartley, D.A., Oxford University Press, Oxford, pp. 153-179]). 구축물을 전체 삽입물의 서열결정에 의해 확인하였다. 각각의 프레이에 대해, 미니-메이팅(mini-mating)을 프레이 플라스미드로 형질전환된 YHGX13(Y187 ade2-101::loxP-kanMX-loxP, matα)과 DHFR 후크(다이하이드로폴레이트 리덕타제)로 형질전환된 YPT6AT 효모 세포(mata) 사이에 수행하여 이배체의 효모 배양물을 생산하였다. 각각의 상호작용을 위해, 후크 및 프레이 구축물 모두를 발현하는 이배체의 효모 배양물의 DO1, 1/10, 1/100 및 1/1000을, 트립토판, 류신 및 히스티딘이 부재하고 화학적 프로브 및 FK506으로 보충된 선택적 배지 상에 스폿팅시켰다. 상호작용을 2회 시험하였다. 하나의 플레이트를 각 화학적 화합물 및 농도에 대해 사용하였다(DMSO, 5, 10 및 20 μM의 HBX129653, 5, 10 및 20 μM의 HBX129654, 5 μM의 HBX24786 트라이메토프림(TMP) 및 5 μM의 HBX129634(TMP-PEG5-OH)). 플레이트를 30℃에서 3일 동안 항온처리하였다.
Y3H ULTImate YChemH(상표) - 자유 화합물과의 경쟁
경쟁 검정은, 일정한 농도의 화학적 프로브(HBX129653, HBX 129654) 및 증가하는 농도의 화학적 프로브의 모 화합물(MOL653, MOL654) 또는 이의 불활성 거울상 이성질체(INACT653, INACT654)를 사용하는 전술된 원-바이-원 확인을 기반으로 한다(표 7). 경쟁 검정을 자유 화합물의 8개의 농도에서(0, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10 및 20 μM) 및 태깅된 Y3H-화합물의 일정한 농도에서(1 μM) 선택적 배지 상에서 수행하였다.
[표 7]
Figure pat00018
HepaRG 세포 배양
HepaRG 세포(바이오프리딕스 인터네셔널(Biopredics International, 프랑스 렌 소재), 카탈로그 번호 HPR101)를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습된 대기에서 윌리엄 E 배지(깁코(GIBCO)), 성장 배지 보충물(바이오프리딕스, 카탈로그 번호 ADD710), 1%(v/v) GlutaMAX-I(깁코 #32551) 및 1x Pen/Strep(깁코, #15140)으로 이루어진 완전 HepaRG 성장 배지에서 2주 동안 배양하였다. 분화를 개시하기 위해, 0.9%(v/v) DMSO(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), D2650)를 융합성 세포에 대한 성장 배지에 첨가하였다. 1주일 후에, 배지를 완전 분화 배지(1.8%(v/v) DMSO로 보충된 HepaRG 성장 배지)로 대체하였고, 여기서 세포를 7일마다 분화 배지 리뉴얼에 의해 약 4주 동안 유지하였다. 분화된 HepaRG 세포(dHepaRG)는 담관-유사 세포의 단층으로 둘러 싸인 간세포-유사 세포 섬을 나타냈다. HBV 감염 및 화합물 처리 전에, dHepaRG 세포를 100 μL의 완전 분화 배지에서 콜라겐 I 코팅된 96-웰 플레이트(깁코, 카탈로그 번호 A11428-03)에 60,000 세포/웰로 시딩하였다. 세포를, HBV 감염 전에 플레이팅 후에 약 1주일 동안 96-웰 플레이트에서 이들의 분화된 표현형을 회수하도록 하였다.
dHepaRG 세포의 HBV 감염
dHepaRG 세포를, HBV 입자로 30의 MOI로 감염시켰다. HBV 입자를 HBV-생산 HepG2.2.15 세포로부터 생산하였다(문헌[Sells et al 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 1005-1009]). dHepaRG 배양 조건, 분화 및 HBV 감염은 이전에 기술되었다(문헌[Hantz, 2009, J. Gen. Virol., 2009, 90: 127-135]). 간략히, 4% PEG-8000 및 바이러스 스톡(20 내지 30 GE/세포)을 함유하는 완전 분화 배지(1.8%(v/v) DMSO로 보충된, 윌리엄 E 배지(깁코), 성장 배지 보충물(바이오프리딕스, 카탈로그번호 ADD710), 1%(v/v) GlutaMAX-I(깁코 #32551) 및 1x Pen/Strep(깁코, #15140)으로 이루어진 HepaRG 성장 배지)를 첨가하였다(120 μL/웰). 감염 1일 후, 세포를 포스페이트-완충된 염수로 3회 세척하고, 및 배지(완전 분화 배지)를 실험 동안 2일 마다 교체하였다.
HBV-감염된 HepaRG의 siRNA 처리
4개의 상이한 siRNA의 풀을 지이 다마콘(GE Dharmacon)으로부터 획득하였다(ON TARGETplus)(표 8).
[표 8]
Figure pat00019
HBV 세포로 감염시키기 1일 전 및 감염 4일 후에, 세포를 PAPD5, PAPD7 또는 둘 다에 대한 siRNA 풀, 또는 대조군으로서 비-표적화 siRNA로 처리하였다. siRNA(각각 25 nM)를 제조업자의 프로토콜에 따라 DharmaFect 4(지이 다마콘; 카탈로그 번호 T-2004-01) 및 OPTI-MEM(써모 사이언티픽; 카탈로그 번호 51985034)을 사용하여 형질감염시켰다. 실험을 11일 동안 실행하였다.
HBV 항원 측정
HBV 항원 발현 및 분비에 대한 영향을 평가하기 위해, 상청액을 제11일에 수집하였다. HBV HBsAg 및 HBeAg 수준을 제조업자의 프로토콜에 따라 CLIA ELISA 키트(오토바이오 다이아그노스틱 #CL0310-2, #CL0312-2)를 사용하여 측정하였다. 간략히, 웰 당 25 μL의 상청액을 각각의 항체 코팅된 마이크로역가 플레이트에 옮기고 25 μL의 효소 접합체 시약을 첨가하였다. 플레이트를 60분 동안 진탕기 상에서 실온에서 항온처리한 후에, 웰을 자동 세척기를 사용하여 세척 완충제에 의해 5회 세척하였다. 25 μL의 기질 A 및 B를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 진탕기 상에서 10분 동안 실온에서 항온처리한 후에, 발광을 엔비전(Envision) 발광 판독기(퍼킨 엘머)를 사용하여 측정하였다.
세포 생존능
상청액 배지를 HBV 감염된 dHepaRG 세포로부터 제거한 후에, 세포를 CellTiterGlo One Solution(프로메가(Promega))과 함께 항온처리하여 세포 생존능을 측정하였다.
HBV 감염된 dHepaRG 세포의 LNA 올리고뉴클레오티드 처리 후에, 세포 생존능을 제조업자의 프로토콜에 따라 셀 카운팅 키트(Cell Counting kit)-8(시그마-알드리치, #96992)을 사용하여 측정하였다. 간략히, 배지를 세포로부터 제거하고 9% 셀 카운팅 키트-8을 함유하는 110 μL의 배지로 교체하였다. 세포를 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 상청액을 새로운 96 웰 플레이트에 옮기고, 450 nm에서의 흡광도를 엔비전 발광 판독기(퍼킨 엘머)를 사용하여 측정하였다.
세포내 mRNA에 대한 실시간 PCR
세포내 mRNA 단리를 위해, dHepaRG를 PBS(깁코)로 1회 세척하고 MagNA Pure "96 셀룰러 RNA 라지 볼륨 키트(96 Cellular RNA Large Volume Kit)"(로슈 #05467535001)를 사용하여 용해시켰다. 용해물을 -80℃에서 저장할 수 있다. 실시간 qPCR 반응을 위해, AB7900 HT 서열 검출 시스템(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)), TaqMan(등록상표) 유전자 발현 마스터 믹스(써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))를 사용하였다. HBV mRNA HBV 코어-특이적 프라이머(인테그레이티드 디엔에이 테크톨로지스(Integrated DNA Technologies))의 검출을 위해(표 9) 및 PAPD5 및 PAPD7의 감소를 측정하기 위해, siRNA의 존재 하에, 유전자-특이적 TaqMan(등록상표) 발현 검정 프로브(써모피셔 사이언티픽; PAPD5 카탈로그 번호 4331182; PAPD7 카탈로그 번호 4331182)를 사용하였다. 샘플을 b-액틴에 대한 TaqMan(등록상표) 발현 검정 프로브(써모피셔 사이언티픽; PAPD5 카탈로그 번호 4331182)를 사용하여 정규화시켰다.
[표 9]
Figure pat00020
바이러스 생산으로부터 HBV DNA 추출 및 정량화
HBV DNA 추출을 제조업자의 프로토콜에 따라 QIAamp 울트라센스(UltraSens) 바이러스 키트(퀴아젠(Qiagen), #53704)의 사용 및 후속 최적화에 의해 수행하였다. 30 μL 및 3 μL의 바이러스 샘플을 1 mL의 PBS 내로 희석한 후에, 완충제 AC를 첨가하였다. 제1 원심분리 단계를 45분 동안 전속력으로 4℃에서 수행하였다. HBV DNA를, 퀀트스튜디오 12K 플렉스(QuantStudio 12K Flex)(어플라이드 바이오시스템즈), TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템즈, #4369016) 및 상기 표 9에 나타낸 프라이머와 100 μM에서 재구성된 프로브의 프리믹스 1:1:0.5를 사용하는 qPCR에 의해 2회 정량화하였다. qPCR을 하기 설정을 사용하여 수행하였다: UDG 항온처리(2분, 50℃), 효소 활성화(10분, 95℃) 및 qPCR(15초, 95℃(변성을 위함) 및 1분, 60℃(어닐링 및 연장을 위함)의 40주기). 게놈 당량 계산은 공지된 농도를 갖는 HBV 유전자형 D 플라스미드 희석액으로부터 생성된 표준 곡선을 기반으로 한다.
올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드 합성은 일반적으로 당분야에 공지되어 있다. 적용될 수 있는 프로토콜이 후술된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 사용된 장치, 지지체 및 농도의 면에서 방법을 약간 바꿈으로써 생산될 수 있다.
올리고뉴클레오티드를, 올리고메이커(Oligomaker) 48에 대한 포스포라미다이트 접근법을 1 μmol 규모로 사용하여 우리딘 유니버셜 지지체 상에서 합성하였다. 합성의 종료시, 올리고뉴클레오티드를, 60℃에서 5 내지 16시간 동안 수성 암모니아를 사용하여 고체 지지체로부터 절단하였다. 올리고뉴클레오티드를 역상 HPLC(RP-HPLC) 또는 고체 상 추출에 의해 정제하고, UPLC에 의해 특성규명하였고, 분자 질량을 또한 ESI-MS에 의해 확인하였다.
올리고뉴클레오티드의 신장:
β-시아노에틸-포스포라미다이트(DNA-A(Bz), DNA-G(ibu), DNA-C(Bz), DNA-T, LNA-5-메틸-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf) 또는 LNA-T)의 커플링을, 활성화제로서 아세토니트릴 중 DCI(4,5-다이시아노이미다졸)(0.25 M) 및 아세토니트릴 중 5'-O-DMT-보호된 아미다이트(0.1 M)의 용액을 사용하여 수행하였다. 최종 주기를 위해, 목적 변형을 갖는 포스포라미다이트, 예컨대 접합체 기를 부착하기 위한 C6 연결기 또는 접합체 기 자체를 사용할 수 있다. 포스포르티오에이트 연결기의 도입을 위한 티올화를, 잔탄 하이드라이드(아세토니트릴/피리딘 9:1 중 0.01 M)를 사용함으로써 수행하였다. 포스포르다이에스터 연결기를, THF/피리딘/물 7:2:1 중 0.02 M 요오드를 사용하여 도입할 수 있다. 나머지 시약은 올리고뉴클레오티드 합성에 전형적으로 사용되는 것이다.
고체 상 합성 후 접합을 위하여, 상업적으로 입수가능한 C6 아미노 연결기 포스포라미다이트를 고체 상 합성의 마지막 주기에 사용할 수 있고, 탈보호 및 고체 지지체로부터의 절단 후, 아미노연결되고 탈보호된 올리고뉴클레오티드를 단리하였다. 접합체를, 표준 합성 방법을 사용하는 작용기의 활성화에 의해 도입하였다.
RP-HPLC에 의한 정제:
조질 화합물을 페노메넥스 주피터(Phenomenex Jupiter) C18 10 μ 150 x 10 mm 컬럼 상에서 분취 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 0.1 M 암모늄 아세테이트 pH 8 및 아세토니트릴을 완충제로서 5 mL/분의 유량으로 사용하였다. 수집된 분획을 동결건조하여 정제된 화합물을 전형적으로 백색 고체로서 수득하였다.
약어:
DCI: 4,5-다이시아노이미다졸
DCM: 다이클로로메탄
DMF: 다이메틸폼아미드
DMT: 4,4'-다이메톡시트라이틸
THF: 테트라하이드로퓨란
Bz: 벤조일
Ibu: 이소부티릴
RP-HPLC: 역상 고성능 액체 크로마토그래피
T m 검정
올리고뉴클레오티드 및 RNA 표적(포스페이트 연결된, PO) 듀플렉스를 500 mL RNase-부재 물 중에서 3 mM까지 희석하고, 500 mL 2x Tm-완충제(200 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 20 mM Na 포스페이트, pH 7.0)와 혼합하였다. 용액을 3분 동안 95℃까지 가열한 후에, 30분 동안 실온에서 어닐링하였다. 듀플렉스 용융 온도(Tm)를, 펠티어(Peltier) 온도 프로그래머 PTP6이 장착된 람다(Lambda) 40 UV/VIS 분광광도계 상에서 PE 템프랩(Templab) 소프트웨어(퍼킨 엘머)를 사용하여 측정하였다. 온도를 20℃에서 95℃까지 상승시키고, 이어서 25℃까지 하락시켜 260 nm에서 흡광도를 기록하였다. 용융 및 어닐링 둘 다의 제1 미분계수 및 국소 최대치를 사용하여 듀플렉스 Tm을 평가하였다.
실시예 1: DHQ 및 THP는 PAPD5 및 PAPD7에 결합한다.
PAPD5/7을 Y3H Ultimate YChemH 선별에서 DHQ 및 THP의 공동 상호작용 파트너로서 동정하였다.
단백질 PAPD5(변이체 1: NP_001035374; 변이체 2: NP_001035375) 및 PAPD7(XP_005248291) 모두를 재료 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 둘 다의 화합물(DHQ 및 THP)에 대한 Y3H 선별에서 수많은 단편에 의해 동정하였다. 동정된 단백질을 하이브리제닉스에 의해 A의 신뢰도 점수(스케일 A 내지 D)로 등급매겼다(표 10).
[표 10]
Figure pat00021
PAPD5/7과 DHQ 및 THP의 상호작용을 동정된 프레이 단편 및 추가 전장 단백질의 Y3H ULTImate YChemH 원-바이-원 확인을 사용하여 확인할 수 있다.
제1 확인 단계에서, 제1 선별에서 동정된 3개의 단편을 원-바이-원 확인 검정(재료 및 방법 섹션에 기술된 바와 같음)을 위해 선택하고 3개의 상이한 농도에서(5, 10 및 20 μM) 시험하였다(표 11).
[표 11]
Figure pat00022
3개의 단편 모두는 이미 시험된 최저 농도에서 DHQ 및 THP에 대한 특이적 결합자로서 확인될 수 있었다(도 1).
제2 확인 단계에서, PAPD5 및 PAPD7에 대한 전장 단백질을 합성하고 DHQ 및 THP를 사용하는 원-바이-원 확인(재료 및 방법 섹션에 기술된 바와 같음)에 사용하였다(표 12).
[표 12]
Figure pat00023
이들 전장 단백질과 DHQ 및 THP 화합물 사이의 상호작용은 시험된 최저 농도에서 확인되었고 화학적 프로브에 대해 특이적인 것으로 나타났다(도 2).
Y3H에서 PAPD5/7과 DHQ 및 THP의 상호작용은 둘 다의 자유 활성 화합물에 의해 경쟁될 수 있으나 불활성 거울상 이성질체에 의해서는 아니다.
단백질 단편 및 전장 PAPD5 및 PAPD7에 대한 DHQ 및 THP의 결합을 확인 한 후에, 결합을, 불활성 또는 활성 자유 화합물을 사용하여 Y3H ULTImate YChenH 경쟁 실험(재료 및 방법 섹션에 기술된 바와 같음)에서 확인하였다(표 13). 불활성 거울상 이성질체의 존재 하에는 효모 성장 손실이 감소하지 않으나 모 활성 화합물의 존재 하에 효모 성장 손실이 감소하는 것은, 모 화합물이 화학적 프로브와 경쟁하고 단백질 표적과 상호작용함을 의미한다.
모든 시험된 화합물의 경우, 최고 농도(20 μM)에서 비-선택적 배지에 대한 독성을 제조업자의 프로토콜에 따라 CellTiter-Glo 발광성 세포 생존능 검정(프로메가)을 사용하여 시험하였다. 효모 성장이 영향을 받지 않았기 때문에 임의의 화합물에 대해 상기 농도에서 독성이 관찰되지 않았다(데이터는 표시되지 않음). 모든 활성 자유 모 화합물(각각 DHQ 및 THP, MOL653 및 MOL654)에 대해 경쟁이 관찰되되, 단편 상호작용에 대한 것보다 전장 단백질에 대한 결합의 경쟁을 위해 낮은 농도가 필요하였다(도 3 및 4). 성공적인 교차 경쟁은 PAPD5/7에 대한 DHQ 및 THP의 공유된 결합 사이드 또는 서로 아주 근접한 최소 결합을 시사한다.
[표 13]
Figure pat00024
실시예 2: siRNA에 의해 PAPD5 및/또는 PAPD7을 억제하는 것은 HBV 감염의 효과적인 치료를 야기한다.
PAPD5/7에 대한 DHQ 및 THP의 결합과 HBV 유전자 발현에 대한 이들 2개의 단백질의 영향의 상관관계를 보여주기 위해, 자연적으로 HBV 감염된 dHepaRG에서 이들 단백질을 감소시키고 바이러스 파라미터에 대한 이러한 감소의 영향을 모니터링하는 RNAi 기술을 사용하였다. 이를 위해, 재료 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이, HBV 감염된 dHepaRG 세포에서 PAPD5 및 PAPD7에 대한 siRNA 풀을 사용하였다(표 8 참조).
PAPD5의 감소는 분비된 HBsAg 및 HBeAg, 및 세포내 HBV mRNA에 의해 측정된 바이러스 발현의 억제를 야기하였다(재료 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 CLIA ELISA 및 실시간 PCR을 사용하여 측정함). PAPD5 mRNA의 감소가 HBV 유전자 발현을 극적으로 감소시키는 반면에, PAPD7의 억제는 HBV 발현에 대한 보통의 효과를 가졌다(도 7). 그러나, 향상된 상승작용성 항-HBV 활성이 PAPD7 및 PAPD5에 대한 siRNA가 조합되었을 때 관찰되었고(도 7), 이는 PAPD5의 부재 하에 PAPD7에 대한 상보적 역할을 시사한다.
실시예 3: DHQ 및 THP는 HBsAg 및 HBeAg를 효과적으로 감소시킨다.
HBV 감염에 대한 DHQ 및 THP, 및 이들의 변종의 효능을 HepG2.2.15 세포에서 판독한대로 HBsAg 및 HBeAg를 측정하였다.
HepG2.2.15 세포(문헌[Sells et al 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 1005-1009])를 DMEM+GluTaMax-1(깁코 카탈로그 번호 10569), 1% Pen Strep(깁코 카탈로그 번호15140), 10% FBS(클론테크(Clontech) 카탈로그 번호 631106) 및 제네티신 0.25 μg/mL(인비트로겐((Invitrogen) 10131035)에서 96 웰 플레이트(100 μL 중에 15.000 세포/웰)에서 배양하였다. 상기 화합물을, 100 μM의 최고 농도를 갖는 DMSO에서의 3-배 연속 희석물 및 9개의 연속 희석물을 사용하여 시험하였다. 각각의 화합물을 4회 시험하였다. 세포를 3일 동안 항온처리하고, 상청액을 수집하고, HBsAg 및 HBeAg를 재료 및 방법 섹션에서 기술된 바와 같이 측정하였다.
HBsAg 및 HBeAg 분비의 감소에서 시험된 화합물의 IC50 값은 하기와 같다:
HBX129653 (DHQ - TMP): IC50 HBsAg 1.181 μM
HBX129654 (THP - TMP): IC50 HBsAg 0.299 μM
MOL653 (DHQ - 자유 - 활성): IC50 HBsAg 0.003 μM; IC50 HBeAg 0.007 μM
MOL654 (THP - 자유 - 활성): IC50 HBsAg 0.003 μM
INACT653 (DHQ - 자유 - 불활성): IC50 HBsAg 3.15 μM
INACT654 (THP - 자유 - 불활성): IC50 HBsAg > 25 μM
실시예 4: PAPD5를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 효능의 선별
올리고뉴클레오티드 선별을 16 내지 20mer 갭머를 사용하여 PAPD5 mRNA에 대해 수행하였다. 효능 시험을 HeLa 세포에서 시험관내 실험으로 수행하였다.
세포주
HeLa 세포주를 유러피언 콜렉션 오브 어쎈티케이티드 셀 컬처스(European Collection of Authenticated Cell Cultures; ECACC, #93021013)로부터 구매하고 공급업자에 의해 권고되는 바와 같이 37℃에서 5% CO2를 갖는 가습된 항온처리기에서 유지하였다. 검정을 위해, 2,500 세포/웰을, 10% 소태아 혈청(FBS), 2 mM 글루타민 AQ, 1% NEAA 및 25 μg/mL 글루타미신을 갖는 이글 최소 필수 배지(시그마, M2279)에서 96 멀티 웰 플레이트에 시딩하였다.
올리고뉴클레오티드 효능
PBS에 용해된 올리고뉴클레오티드의 첨가 전에, 세포를 24시간 동안 항온처리 하였다. 올리고뉴클레오티드의 최종 농도는 5 및 25 μM이었고, 최종 배양 부피는 100 μL/웰이었다. 올리고뉴클레오티드 화합물의 첨가 3일 후에 세포를 채취하고, RNA를 제조업자의 설명서에 따라 PureLink Pro 96 RNA 정제 키트(앰비온(Ambion))를 사용하여 추출하였다. RNA/LNA 듀플렉스 변성(90℃, 40초) 후에, QPCR을 제공자의 권고에 따라 관심 PAPD5 유전자(Hs00223727_m1, FAM-MGB, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 및 하우스 키핑 유전자 GUSB(Hu_4326320E, VIC-MGB, 라이프 테크놀로지스)에 대한 TaqMan 프라이머 검정에 의해 듀플렉스 셋업의 1-단계 프로토콜(퀀타 바이오사이언스(Quanta Bioscience)의 qScript(상표) XLT 1-단계 RT-qPCR ToughMix(등록상표), Low ROX(상표), #95134-500)에 의해 수행하였다. 대조군 샘플(PBS-처리된 세포)의 평균 %에 대한 상대적 PAPD5 mRNA 발현 수준을 표 14에 나타냈다. 도 8은 PAPAD5 코딩 서열에 대해 개별적인 올리고뉴클레오티드 화합물에 의해 수득된 표적 녹-다운을 제공한다.
[표 14]
Figure pat00025
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Figure pat00027
Figure pat00028
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Figure pat00030
실시예 5: PAPD7을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 효능의 선별
PAPD7 mRNA에 대한 올리고뉴클레오티드 선별을, 관심 PAPD7 유전자(Hs00173159_m1, FAM-MGB, 라이프 테크놀로지스)에 대한 TaqMan 프라이머 검정으로 대체하여 근본적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다.
대조군 샘플(PBS-처리된 세포)의 평균 %에 대한 상대적 PAPD7 mRNA 발현 수준을 표 15에 나타냈다. 도 9는 PAPAD5 코딩 서열에 대한 개별적인 올리고뉴클레오티드 화합물에 의해 수득된 표적 녹-다운을 제공한다.
[표 15]
Figure pat00031
Figure pat00032
Figure pat00033
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실시예 6: 짐노시즈에 의해 세포에 전달된 PAPD5 또는 PAPD7을 표적화하는 선택된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용시 HBV 감염된 dHepaRG 세포에 대한 효과
실시예 4 및 5로부터 가장 효과적인 올리고뉴클레오티드의 선택은 HBV 감염된 dHepaRG 세포에서 HBV 번식 파라미터에 대한 이들의 효과를 시험하도록 선택되었다.
HBV 감염된 dHepaRG 세포(재료 및 방법 섹션의 dHepaRG 세포의 HBV 감염에 기술된 바와 같음)를 96-웰 플레이트에서 배양하였다. HBV 감염 1일 후에, 20 μM의 올리고뉴클레오티드를 보조되지 않은 흡수(짐노시즈)를 사용하여 세포에 전달하였다. 총 40개의 올리고뉴클레오티드를 시험하였고, 이중 20개는 PAPD5를 표적화하고, 나머지 20개는 PAPD7을 표적화한다. 실험을 PBS 대조군과 함께 3회 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 처리를 제4일 및 제7일에 배지 교체(이는 재료 및 방법 섹션에 기술된 2일 마다 교체와 상이함)와 함께 반복하였다.
감염-후 제11일에, 상청액을 채취하고, HBsAg 및 HBeAg 수준을 CLIA ELISA 검정(재료 및 방법의 HBV 항원 측정 참조)을 사용하여 평가하였다. 세포 생존능을 재료 및 방법 섹션의 세포 생존능에 기술된 바와 같이 측정하였다. mRNA를 제조업자의 프로토콜에 따라 MagNA Pure 로보트 및 MagNA Pure 96 셀룰러 RNA 라지 볼륨 키트(로슈, #05467535001)를 사용하여 세포로부터 추출하였다. HBV mRNA 및 PAPD5 또는 PAPD7 mRNA를 퀀트스튜디오 12K 플렉스(어플라이드 바이오시스템즈), TaqMan RNA-to-CT 1-단계 키트(어플라이드 바이오시스템즈, #4392938), 인간 ACTB 내인성 대조군(어플라이드 바이오시스템즈, #4310881E)을 사용하여 qPCR에 의해 기술적으로 2회 정량화하였다. Taqman 시약을 다음의 상업적인 써모피셔 사이언티픽 프라이머(HBV Pa03453406_s1; PAPD5 Hs00900790_m1; 및 PAPD7 Hs00173159_m1)와 함께 사용하였다. mRNA 발현을 기준 유전자 ACTB(써모피셔 사이언티픽 4310881E) 및 PBS-처리된 세포에 대해 정규화된 비교용 주기 임계값 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 분석하였다.
PAPD5 또는 PAPD7 mRNA에 대한 올리고뉴클레오티드 처리의 효과 및 HBV 번식 파라미터 HBsAg에 대한 효과를 표 16 및 표 17에 나타냈다.
[표 16]
Figure pat00037
[표 17]
Figure pat00038
이들 데이터로부터, PAPD5 mRNA(표 16) 및 PAPD7 mRNA(표 17)의 억제가 대부분의 올리고뉴클레오티드 화합물에 대해 매우 효과적이었음을 알 수 있다.
그러나, HBsAg 수준에 대한 PAPD5 및 PAPD7 mRNA 감소의 관찰된 효과는 올리고뉴클레오티드의 보조되지 않은 전달 후에 11일 동안 처리된 세포에서 조차도 덜 확연하였다. 여기서, PAPD5 표적화 화합물 중 화합물 번호 23_1, 26_1 및 115_1만이 분명한 HBsAg 억제를 나타냈고, PAPD7 표적화 화합물 중 화합물 번호 229_1만이 분명한 HBsAg 억제를 나타냈다. 이론에 구애됨 없이, 이는 본 검정에서 HBsAg 억제에 대한 표적 녹-다운에 의해 야기된 효과의 느린 개시 때문일 수 있고, 따라서, 일부 화합물의 경우, 나중에 검정되는 경우 외에는 HBsAg 억제가 나타나지 않을 수 있다.
실시예 7: 짐노시즈에 의해 세포에 전달되는 PAPD5 및 PAPD7 표적화 안티센스 올리고뉴클레오티드의 조합 제제의 사용시 HBV 감염된 dHepaRG 세포에 대한 효과
실시예 2에서, PAPD7 표적화 siRNA의 풀을 PAPD5 표적화 siRNA의 풀과 혼합하는 것이 상승작용성 항-HBV 활성을 야기하였음이 관찰되었다. 본 실시예를 수행하여 2개의 개별적 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드(하나가 PAPD5를 표적화 하고 다른 하나가 PAPD7을 표적화함)를 조합할 때 유사한 상승작용이 관찰될 수 있는지를 조사하였다.
개별적인 올리고뉴클레오티드를 첨가하는 것 대신에, 2개의 올리고뉴클레오티드의 조합을 세포에 첨가하여(즉, PAPD5를 표적화하는 20 μM의 하나의 올리고뉴클레오티드를 PAPD7을 표적화하는 20 μM의 제2 올리고뉴클레오티드와 함께 첨가하였음) 실시예 6에 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다. 단지 HBsAg를 조합에 대해 측정하였다.
올리고뉴클레오티드의 조합을, HBV 번식 파라미터, HBsAg 억제에 대한 결과를 포함하여 표 18에 나타냈다.
[표 18]
Figure pat00039
Figure pat00040
또한, 결과를 도 10에 요약하여 나타냈다. 시험된 40개의 조합 중 18개 이상이 HBsAg 억제에 대한 명백한 상승효과를 야기하였다. 이들 상승작용성 조합 중 7개가 본 검정에서 HBsAg 억제에 대한 임의의 효과를 개별적으로 생성하지 않는 올리고뉴클레오티드를 가지는 것이다. 이러한 실험으로부터, PAPD5 및 PAPD7 표적화 올리고뉴클레오티드의 조합이 HBsAg 억제에 대한 상승효과 생성의 높은 가능성을 가짐으로 결론내릴 수 있다.
실시예 8: 실시예 7로부터 선택된 조합의 반복
실시예 7의 실험을 표 19에 나타낸 올리고뉴클레오티드 조합을 사용하여 반복하였다.
[표 19]
Figure pat00041
이들 데이터로부터, 실시예 7에서 관찰된 상승효과가 반복가능함을 알 수 있다.
실시예 9: 형질감염에 의해 세포로 전달된 PAPD5 또는 PAPD7을 표적화하는 선택된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용시 HBV 감염된 dHepaRG 세포에 대한 효과
하기 실험에서, 보조되지 않은 전달 대신에 HBV 감염된 dHepaRG 세포 내로 올리고뉴클레오티드의 형질감염을 사용하여 유사한 상승작용성 결과가 수득될 수 있는지를 조사하였다.
12개의 PAPD5 표적화 올리고뉴클레오티드(표 20) 및 13개의 PAPD7 표적화 올리고뉴클레오티드(표 21)를 본원에 기술된 바와 같이 형질감염 검정을 사용하여 개별적으로 시험하였다. 올리고뉴클레오티드를, HBV로 감염 1일 후에(재료 및 방법 섹션의 dHepaRG 세포의 HBV 감염에 기술된 바와 같음) 분화된 HepaRG 세포에 500 nM/웰의 최종 농도로 96-웰 플레이트 포맷으로 형질감염시켰다. 형질감염 전에, 배지를 100 μL의 페니실린/스트렙토마이신 자유 완전 분화 배지로 교체하였다. 단일 올리고뉴클레오티드 처리의 경우, 올리고뉴클레오티드를 Opti-MEM+Glutamax-I 감소된 혈청 배지(깁코, #51985)에 희석하고 제조업자의 설명서에 따라 리포펙타민 RNAiMax(인비트로겐, #56532)와 1:1 비에서 5분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이러한 LNA-형질감염 시약 혼합물로부터, 20 μL를 세포의 상부에 첨가하였다. 3일 후에, 배지를 완전 분화 배지로 교체하였다. 형질감염-후 제5일에, HBsAg를 재료 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 측정하고, PAPD5 및 PAPD7 mRNA를 실시예 6에 기술된 바와 같이 측정하였다.
또한, PAPD5 및 PAPD7 올리고뉴클레오티드 중 일부를 조합으로 시험하였다(표 22). 올리고뉴클레오티드를 500 nM의 최종 농도의 각각의 올리고뉴클레오티드에 의한 단일 처리와 동일한 프로토콜을 사용하여 HBV 감염된 HepaRG 세포 내로 공동-형질감염시켰다.
[표 20]
Figure pat00042
[표 21]
Figure pat00043
[표 22]
Figure pat00044
이들 데이터로부터, 형질감염 검정을 사용할 때, PAPD5를 표적화하는 12개의 올리고뉴클레오티드 중 6개가 HBsAg 억제에 대한 분명한 효과를 가지며, 이는 실시예 6의 짐노틱(gymnotic) 검정에 의해 관찰된 것보다 훨씬 더 많음을 알 수 있다. 또한, HBsAg 억제에 대한 효과를 가지는 PAPD7 표적화 화합물의 수는 형질감염 분석을 사용하여 증가되어 12개의 화합물 중 4개가 HBsAg 억제에 대한 분명한 효과를 가졌다. 조합의 데이터를 표 22 및 도 11에 요약하여 나타냈다. 이들 데이터로부터 12개의 시험된 조합 중 9개가 HBsAg 억제에 대한 분명한 상승작용을 생성함을 알 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-la Roche AG <120> NUCLEIC ACID MOLECULES FOR REDUCTION OF PAPD5 OR PAPD7 mRNA FOR TREATING HEPATITIS B INFECTION <130> P33547-WO <140> PCT/EP2017/064980 <141> 2017-06-19 <150> EP 16175045.0 <151> 2016-06-17 <160> 267 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 698 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Pro Arg Pro Arg Ser Ala Pro Gly Lys Pro Arg Arg Arg Ser 1 5 10 15 Arg Ala Arg Leu Arg Ser Ser Arg Thr Pro Ser Gly Gly Ala Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ala Thr Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Gly Ala Ala Ser Ala Pro Ala Pro Ala 50 55 60 Pro Ala Gly Met Tyr Arg Ser Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ser His Ala 65 70 75 80 Leu Pro Ala Glu Gln Arg Asp Phe Leu Pro Leu Glu Thr Thr Asn Asn 85 90 95 Asn Asn Asn His His Gln Pro Gly Ala Trp Ala Arg Arg Ala Gly Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Ser Pro Pro Ser Ala Ser Ser Ser Pro His Pro Ser Ala 115 120 125 Ala Val Pro Ala Ala Asp Pro Ala Asp Ser Ala Ser Gly Ser Ser Asn 130 135 140 Lys Arg Lys Arg Asp 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Leu Ile Leu Met Ala Ile Ser Phe Leu Gln Leu 405 410 415 His Pro Arg Ile Asp Ala Arg Arg Ala Asp Glu Asn Leu Gly Met Leu 420 425 430 Leu Val Glu Phe Phe Glu Leu Tyr Gly Arg Asn Phe Asn Tyr Leu Lys 435 440 445 Thr Gly Ile Arg Ile Lys Glu Gly Gly Ala Tyr Ile Ala Lys Glu Glu 450 455 460 Ile Met Lys Ala Met Thr Ser Gly Tyr Arg Pro Ser Met Leu Cys Ile 465 470 475 480 Glu Asp Pro Leu Leu Pro Gly Asn Asp Val Gly Arg Ser Ser Tyr Gly 485 490 495 Ala Met Gln Val Lys Gln Val Phe Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Leu Ser 500 505 510 His Ala Val Ser Pro Leu Ala Arg Ser Tyr Pro Asn Arg Asp Ala Glu 515 520 525 Ser Thr Leu Gly Arg Ile Ile Lys Val Thr Gln Glu Val Ile Asp Tyr 530 535 540 Arg Arg Trp Ile Lys Glu Lys Trp Gly Ser Lys Ala His Pro Ser Pro 545 550 555 560 Gly Met Asp Ser Arg Ile Lys Ile Lys Glu Arg Ile Ala Thr Cys Asn 565 570 575 Gly Glu Gln Thr Gln Asn Arg Glu Pro Glu Ser Pro Tyr Gly Gln Arg 580 585 590 Leu Thr Leu Ser Leu Ser Ser Pro Gln Leu Leu Ser Ser Gly Ser Ser 595 600 605 Ala Ser Ser Val Ser Ser Leu Ser Gly Ser Asp Val Asp Ser Asp Thr 610 615 620 Pro Pro Cys Thr Thr Pro Ser Val Tyr Gln Phe Ser Leu Gln Ala Pro 625 630 635 640 Ala Pro Leu Met Ala Gly Leu Pro Thr Ala Leu Pro Met Pro Ser Gly 645 650 655 Lys Pro Gln Pro Thr Thr Ser Arg Thr Leu Ile Met Thr Thr Asn Asn 660 665 670 Gln Thr Arg Phe Thr Ile Pro Pro Pro Thr Leu Gly Val Ala Pro Val 675 680 685 Pro Cys Arg Gln Ala Gly Val Glu Gly Thr Ala Ser Leu Lys Ala Val 690 695 700 His His Met Ser Ser Pro Ala Ile Pro Ser Ala Ser Pro Asn Pro Leu 705 710 715 720 Ser Ser Pro His Leu Tyr His Lys Gln His Asn Gly Met Lys Leu Ser 725 730 735 Met Lys Gly Ser His Gly His Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Val 740 745 750 Gly Ser Gly Gly Val Arg Pro Pro Val Gly Asn Arg Gly His His Gln 755 760 765 Tyr Asn Arg Thr Gly Trp Arg Arg Lys Lys His Thr His Thr Arg Asp 770 775 780 Ser Leu Pro Val Ser Leu Ser Arg 785 790 <210> 4 <211> 8114 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 acaacgcgct ccctgcgggg cgggcggcaa cctccatgcg gcctcgtcca cgctcagcac 60 cggggaagcc 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oligonucleotide motif <400> 195 gtgaattaaa gccaaagc 18 <210> 196 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 196 tgtttttgta ttttagtat 19 <210> 197 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 197 gaggtttttt ttagtgaatt 20 <210> 198 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 198 gaggagctaa acggaca 17 <210> 199 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 199 gtttagtctt atgttctcac 20 <210> 200 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 200 caaatactga atatgcccg 19 <210> 201 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 201 accatttaaa tcgccaac 18 <210> 202 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 202 cagtaagagt agcccaacaa 20 <210> 203 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 203 taacggcaac atcaaatagc 20 <210> 204 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 204 actgagcacc aactacac 18 <210> 205 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 205 cctaatttta tgtatcacat 20 <210> 206 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 206 ctaggaatta taacaaatca 20 <210> 207 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 207 actccaaaga acatactcac 20 <210> 208 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 208 taagagaaac aatcacacca 20 <210> 209 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 209 tgtcctaaaa tatcagcag 19 <210> 210 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 210 cttttaatga gacagtgca 19 <210> 211 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 211 ttgtagcata agatggaaag 20 <210> 212 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 212 aaactgtagc caataactgt 20 <210> 213 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 213 attcatccta acacaagtag 20 <210> 214 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 214 cacgaaagga acagctaag 19 <210> 215 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 215 acaacaggca agtacc 16 <210> 216 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 216 gctaaacact ataaggat 18 <210> 217 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 217 cccgtaagca tttgagaa 18 <210> 218 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 218 agccaatatg cgacagtaac 20 <210> 219 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 219 taaccaaaac aatcagtgtc 20 <210> 220 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 220 aacagggaac aggagtta 18 <210> 221 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 221 atttatcaac ttccacc 17 <210> 222 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 222 cgtttaagac caggcac 17 <210> 223 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 223 acaaaggaac tcaggaagag 20 <210> 224 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 224 tcacagacaa gcaccaa 17 <210> 225 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 225 tactttttaa aacacgtagg 20 <210> 226 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 226 gcacaatcac aaagaccaa 19 <210> 227 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 227 tcagtaaaga acagaggc 18 <210> 228 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 228 catatttcca ccacacaag 19 <210> 229 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 229 agtaaaccac tgtcca 16 <210> 230 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 230 tcctctttgg cgatata 17 <210> 231 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 231 cataaatacc cctgaatac 19 <210> 232 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 232 cgattttatc accaaca 17 <210> 233 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 233 acaatcaggt taagtgtgga 20 <210> 234 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 234 gaagccaaag actacca 17 <210> 235 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 235 tggtagggac tgaattttaa 20 <210> 236 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 236 cggtagtcaa tcacc 15 <210> 237 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 237 ctatcaaaat tatttcacct 20 <210> 238 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 238 acgaaaattt agcatcctaa 20 <210> 239 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 239 tggtaaacac tgggc 15 <210> 240 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 240 gattgttggt tgtcatg 17 <210> 241 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 241 aattataccc cacatttca 19 <210> 242 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 242 tgcaattaga cacgttacg 19 <210> 243 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 243 ggcaaccaat taaacta 17 <210> 244 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 244 cagttttatg ctaatca 17 <210> 245 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 245 gcaaaggagg agcggaataa 20 <210> 246 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 246 aaacagaagt aagaaggtcc 20 <210> 247 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 247 tccacttatc catagaaa 18 <210> 248 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 248 gctttgacga acaggaaat 19 <210> 249 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 249 ttccgaccaa aagaaaagac 20 <210> 250 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 250 gcgacacgat ccgttaaa 18 <210> 251 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 251 ccccgtttta aaaac 15 <210> 252 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Human PAPD5 target RNA <400> 252 caucaaugcu uuauaucga 19 <210> 253 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Human PAPD5 target RNA <400> 253 ggacgacacu ucaauuauu 19 <210> 254 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Human PAPD5 RNA target sequence <400> 254 gauaaaggau ggugguuca 19 <210> 255 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> human PAPD5 Target mRNA sequence <400> 255 gaauagaccu gagccuuca 19 <210> 256 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> human PAPD7 target mRNA sequence <400> 256 ggagugacgu ugauucaga 19 <210> 257 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> human PAPD7 target mRNA sequence <400> 257 cggaguucau caagaauua 19 <210> 258 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> human PAPD7 target RNA sequence <400> 258 cggaguucau caagaauua 19 <210> 259 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> human PAPD7 target mRNA sequence <400> 259 gcgaauagcc acaugcaau 19 <210> 260 <211> 58 <212> DNA <213> artificial <220> <223> shRNA <400> 260 ccgggccaca tatagagatt ggatactcga gtatccaatc tctatatgtg gctttttg 58 <210> 261 <211> 58 <212> DNA <213> artificial <220> <223> shRNA <400> 261 ccggccaaca aatctcagca tggatctcga gatccatgct gagatttgtt ggtttttg 58 <210> 262 <211> 58 <212> DNA <213> artificial <220> <223> shRNA <400> 262 ccggcgcctg taatcccagc actttctcga gaaagtgctg ggattacagg cgtttttg 58 <210> 263 <211> 58 <212> DNA <213> artificial <220> <223> shRNA <400> 263 ccgggcctgt aatcccagca ctttactcga gtaaagtgct gggattacag gctttttg 58 <210> 264 <211> 58 <212> DNA <213> artificial <220> <223> shRNA <400> 264 ccggcgatgt tggaaggagt tcatactcga gtatgaactc cttccaacat cgtttttg 58 <210> 265 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 265 ctgtgccttg ggtggcttt 19 <210> 266 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 266 aaggaaagaa gtcagaaggc aaaa 24 <210> 267 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> probe <400> 267 ttctttataa gggtcgatgt ccatg 25

Claims (22)

  1. PAP 연관된 도메인 함유 5(PAPD5)의 발현 및/또는 활성을 억제하는 핵산 분자를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) PAPD5의 발현 및/또는 활성을 억제하는 핵산 분자; 및
    (b) PAP 연관된 도메인 함유 7(PAPD7)의 발현 및/또는 활성을 억제하는 핵산 분자
    를 포함하는 조합 제제인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    핵산 분자가
    (a) 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드;
    (b) siRNA 분자;
    (c) shRNA 분자; 및
    (d) (i) 부위-특이적 DNA 뉴클레아제 또는 부위-특이적 DNA 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
    (ii) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 게놈 편집 기계(genome editing machinery)
    로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    핵산 분자가
    (a) PAPD5 표적 핵산에 대해 80% 이상의 상보성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고 PAPD5의 발현을 감소시킬 수 있는 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드; 및
    (b) PAPD7 표적 핵산에 대해 80% 이상의 상보성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고 PAPD7의 발현을 감소시킬 수 있는 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드
    로부터 선택되는, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    B형 간염 바이러스(HBV) 표면 항원(HBsAg) 또는 HBV 외피 항원(HBeAg)의 분비를 감소시키고/거나 세포내 HBV mRNA 또는 HBV DNA의 생산을 억제하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    만성 HBV 감염의 발생을 억제하고/거나 HBV 감염된 사람의 전염력을 감소시키는 조성물.
  7. (a) 시험 화합물 또는 조성물을 PAPD5 및/또는 PAPD7을 발현하는 세포와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 시험 화합물 또는 조성물의 존재 및 부재 하에 PAPD5 및/또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) PAPD5 및/또는 PAPD7의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 화합물 또는 조성물을, HBV 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 화합물로서 동정하는 단계
    를 포함하는, HBV 감염을 예방하고/거나 개선하고/거나 억제하는 화합물 또는 조성물을 동정하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    시험 화합물이 핵산 분자의 라이브러리이고, 단계 (c)가 PAPD5 또는 PAPD7 mRNA 발현을 60% 이상 감소시키는 핵산 분자를 동정하는, 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    시험 조성물이 PAPD5를 감소시킬 수 있는 핵산 분자 및 PAPD7을 감소시킬 수 있는 핵산 분자의 조합 제제인, 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    HBV의 번식을 억제하는 화합물이 HBsAg의 분비를 억제하고/거나 HBeAg의 분비를 억제하고/거나 세포내 HBV mRNA의 생산을 억제하는, 방법.
  11. 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 상기 인접 뉴클레오티드 서열이 PAPD5 표적 핵산에 대해 100%의 상보성을 갖고, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 PAPD5의 발현을 감소시킬 수 있는, 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  12. 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 분자로서, 상기 인접 뉴클레오티드 서열이 PAPD7 표적 핵산에 대해 100%의 상보성을 갖고, 상기 핵산 분자가 PAPD7의 발현을 감소시킬 수 있는, 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서,
    단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드인 핵산 분자.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자.
  15. 제14항에 있어서,
    하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드가 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산(ANA), 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    인접 뉴클레오티드 서열 내에서 뉴클레오시드간 연결기가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기인, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자.
  18. 제11항 및 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드가 식 5'-F-G-F'-3'의 갭머이되, 상기 식에서, 영역 F 및 F'가 독립적으로 1 내지 7개의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하고, G가 RNaseH를 모집할 수 있는 6 내지 16개의 뉴클레오시드 영역인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자, 및 상기 올리고뉴클레오티드에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 접합체 모이어티를 포함하는 접합체.
  20. (a) PAPD5의 발현 및/또는 활성을 억제하는 핵산 분자; 및
    (b) PAPD7의 발현 및/또는 활성을 억제하는 핵산 분자
    를 포함하는 조합 제제.
  21. 제20항에 있어서,
    핵산 분자가 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자, 및 제19항에 따른 접합체로부터 선택되는, 조합 제제.
  22. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자, 제19항에 따른 접합체, 또는 제20항 또는 제21항에 따른 조합 제제를 포함하는 약학 조성물.
KR1020227013525A 2016-06-17 2017-06-19 B형 간염 감염을 치료하기 위해 PAPD5 또는 PAPD7 mRNA를 감소시키기 위한 핵산 분자 KR20220056252A (ko)

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