JP2022036182A - Ｂ型肝炎感染症治療用のＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７のｍＲＮＡ減少用核酸分子 - Google Patents

Ｂ型肝炎感染症治療用のＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７のｍＲＮＡ減少用核酸分子 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物を特定するための方法の提供を目的とする。【解決手段】本発明はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物を特定するための方法であって、ＨＢＶ感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物としてＰＡＰ関連ドメイン含有タンパク質５（ＰＡＰＤ５）及び／又はＰＡＰ関連ドメイン含有タンパク質７（ＰＡＰＤ７）の発現及び／又は活性を低下させる化合物が特定される前記方法に関する。本発明はＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に使用するためのＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の阻害剤、並びにＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に同時又は順次使用するためのＰＡＰＤ５の阻害剤とＰＡＰＤ７の阻害剤を含む混合製剤も提供する。ＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に使用するための医薬組成物、並びにＨＢＶ感染症の治療中に治療成果を監視するための方法も本発明に含まれる。【選択図】図７

Description

本発明はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物を特定するための方法であって、ＨＢＶ感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物としてＰＡＰ関連ドメイン含有タンパク質５（ＰＡＰＤ５）又はＰＡＰ関連ドメイン含有タンパク質７（ＰＡＰＤ７）の発現及び／又は活性を低下させる化合物が特定される前記方法に関する。本発明はＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に使用するためのＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の阻害剤も提供する。具体的には本発明はＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の阻害剤としてのアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ剤などの核酸分子、並びにＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に同時又は順次使用するためのＰＡＰＤ５の阻害剤とＰＡＰＤ７の阻害剤を含むこれらの混合製剤を特定する。ＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に使用するための医薬組成物、並びにＨＢＶ感染症の治療中に治療成果を監視するための方法も本発明に含まれる。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はエンベロープ型部分二本鎖ＤＮＡウイルスである。小さな３．２ｋｂのＨＢＶゲノムは４つの重複性オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）から構成され、それらのオープン・リーディング・フレームはコア、ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、エンベロープ、及びＸタンパク質をコードする。Ｐｏｌ ＯＲＦが最長であり、エンベロープＯＲＦがその内側に位置する一方でＸ ＯＲＦとコアＯＲＦはＰｏｌ ＯＲＦと重複する。ＨＢＶのライフサイクルには２つの主要な現象、すなわち（１）弛緩環型ＤＮＡ（ＲＣ ＤＮＡ）からの閉環型ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の生成と（２）ＲＣ ＤＮＡを生産するためのプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）の逆転写がある。宿主細胞の感染の前ではＨＢＶゲノムはＲＣ ＤＮＡとしてビリオン内に存在する。ヒト肝細胞の表面上に存在する負に帯電したプロテオグリカンへの非特異的結合（Ｓｃｈｕｌｚｅ， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ４６， （２００７）， １７５９－６８）と肝細胞 ナトリウム／タウロコール酸 共輸送 ポリペプチド （ＮＴＣＰ） 受容体へのＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の特異的結合（Ｙａｎ， Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ８７， （２０１３）， ７９７７－９１）によってＨＢＶビリオンは宿主細胞に侵入することができるとされている。ウイルス感染症の抑制は、感染後数分以内から数時間までに応答してそのウイルスの初期増殖に打撃を与え、そして慢性、且つ、持続性の感染症の発症を限定することが可能である宿主自然免疫系による厳重な監視を必要とする。ＩＦＮとヌクレオシド／ヌクレオチド類似体に基づく現行の治療法が利用可能であるにもかかわらず、ＨＢＶ感染症は肝硬変及び肝細胞癌のリスクが比較的に高い推計３億５０００万人の慢性保因者に関わる世界的な健康上の大問題のままである。
ＨＢＶ感染に応じた肝細胞及び／又は肝内免疫細胞による抗ウイルス性サイトカインの分泌は感染した肝臓によるウイルス除去において中心的な役割を果たす。しかしながら慢性感染患者は宿主細胞の認識系と後続の抗ウイルス応答に対抗するためにウイルスが採用した様々な回避戦略のせいで弱い免疫応答しか示せない。
幾つかのＨＢＶウイルスタンパク質がウイルス認識シグナル伝達系に干渉し、後にインターフェロン（ＩＦＮ）抗ウイルス活性を妨害することにより初期の宿主細胞応答に対抗可能であることが多数の観察により示された。これらの中でもＨＢＶ空サブウイルス粒子（ＳＶＰ、ＨＢｓＡｇ）の過剰分泌が慢性感染患者（ＣＨＢ）に観察される免疫寛容状態の維持に関与すると考えられている。ＨＢｓＡｇ及び他のウイルス抗原への持続的曝露はＨＢＶ特異的なＴ細胞の欠損又は漸進的機能障害を引き起こし得る（Ｋｏｎｄｏ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９９３）， １５０， ４６５９－４６７１； Ｋｏｎｄｏ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （２００４）， ７４， ４２５－４３３； Ｆｉｓｉｃａｒｏ， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， （２０１０）， １３８， ６８２－９３）。また、ＨＢｓＡｇは直接的な相互作用によって単球、樹状細胞（ＤＣ）、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞の機能を抑制することが報告されている（Ｏｐ ｄｅｎ Ｂｒｏｕｗ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， （２００９ｂ）， １２６， ２８０－９； Ｗｏｌｔｍａｎ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， （２０１１）， ６， ｅ１５３２４； Ｓｈｉ， Ｊ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ． （２０１２）， １９， ｅ２６－３３； Ｋｏｎｄｏ， ＩＳＲＮ Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， （２０１３）， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９３５２９５）。
ＨＢｓＡｇの定量は慢性Ｂ型肝炎における予後と治療応答についての重要なバイオマーカーである。しかしながらＨＢｓＡｇの消失とセロコンバージョンの達成が慢性感染患者において観察されることは稀であり、最終的な治療目標のうちの１つであり続ける。ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体などの現行の治療法はＨＢＶのＤＮＡ合成を阻害する分子であり、ＨＢｓＡｇレベルを低下させることを目的としていない。長期の治療であってもヌクレオシド／ヌクレオチド類似体では自然に観察されるクリアランス（約１％～２％の間）と同等の弱いＨＢｓＡｇクリアランスしか示されない（Ｊａｎｓｓｅｎ， Ｌａｎｃｅｔ， （２００５）， ３６５， １２３－９； Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， （２００４）， ３５１， １２０６－１７； Ｂｕｓｔｅｒ， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， （２００７）， ４６， ３８８－９４）。
Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢＶエンベロープ抗原又はＨＢｅＡｇとも呼ばれる）はＢ型肝炎ウイルス感染細胞が分泌するウイルスタンパク質である。ＨＢｅＡｇは慢性Ｂ型肝炎感染症に関連し、活性型ウイルス疾患と患者の感染性の程度のマーカーとして使用される。
Ｂ型肝炎ウイルスのプレコア又はＨＢｅＡｇの機能は完全には分かっていない。しかしながらＨＢｅＡｇはウイルスの持続に重要な役割を果たすことがよく知られている。ＨＢｅＡｇは免疫調節性タンパク質として機能することによりＨＢＶの慢性化を促進すると考えられている。具体的にはＨＢｅＡｇは分泌型補助タンパク質であり、細胞内ヌクレオカプシドタンパク質に対する宿主免疫応答を減弱するようである（Ｗａｌｓｈ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２０１１， ４１１（１）：１３２－１４１）。ＨＢｅＡｇはＨＢＶの存続に寄与する免疫寛容原として作用し、可溶性ＨＢｅＡｇが胎盤を通過することを考慮するとおそらく子宮内で機能する（Ｗａｌｓｈ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２０１１， ４１１（１）：１３２－１４１）。さらに、ＨＢｅＡｇはウイルス感染に対する自然免疫応答を弱めるために（ｉ）細胞内シグナル伝達を制御する細胞遺伝子、及び（ｉｉ）Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ－２）を下方制御する（Ｗａｌｓｈ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２０１１， ４１１（１）：１３２－１４１）。ＨＢｅＡｇが存在しない状態ではＨＢＶの複製にはＴＬＲ２経路の上方制御が伴う（Ｗａｌｓｈ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２０１１， ４１１（１）：１３２－１４１）。よって、ＨＢｅＡｇは宿主免疫応答に影響を与えるためにウイルス宿主間相互作用の調節に重要な役割を有する（Ｗａｌｓｈ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２０１１， ４１１（１）：１３２－１４１）。したがって、ＨＢｅＡｇ陽性患者集団においてＨＢｅＡｇを減少させることがＨＢＶ特異的免疫機能不全の反転につながる場合がある（Ｍｉｌｉｃｈ， １９９７， Ｊ． Ｖｉｒａｌ． Ｈｅｐ． ４： ４８－５９； Ｍｉｌｉｃｈ， １９９８， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０： ２０１３－２０２１）。加えて、分泌されたＨＢｅＡｇはＴ細胞寛容の誘発、及びＨＢｅＡｇと細胞内肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）との間での解離Ｔ細胞寛容の誘発の点でＨＢｃＡｇよりも著しく有能であり、ＨＢｃ／ＨＢｅＡｇ特異的Ｔ細胞寛容のクローン間での不均一性が自然的ＨＢＶ感染に対して、特にプレコア陰性慢性肝炎に対して重大な意味を持つ可能性がある（Ｃｈｅｎ， ２００５， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ７９： ３０１６－３０２７）。
したがって、ＨＢｓＡｇの分泌に加えてＨＢｅＡｇの分泌を減少させることでＨＢｓＡｇの分泌の阻害だけと比べて慢性ＨＢＶ感染症の発症の抑制が改善されることになる。加えて、ＨＢｅＡｇ陽性の母親に由来する母胎間ＨＢＶ伝播及び新生児ＨＢＶ伝播の場合に最も高い率の急性から慢性の感染症の伝播（８０％超）が報告されている（Ｌｉａｗ， Ｌａｎｃｅｔ， ２００９， ３７３： ５８２－５９２； Ｌｉａｗ， Ｄｉｇ． Ｄｉｓ． Ｓｃｉ．， ２０１０， ５５： ２７２７－２７３４；及びＨａｄｚｉｙａｎｎｉｓ， ２０１１， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ５５： １８３－１９１）。したがって、母親になる女性においてＨＢｅＡｇを減少させることがその患者の感染性を低下させるだけではなく、その女性の子供での慢性ＨＢＶ感染症の発症も抑制する可能性がある。
したがって、ＨＢＶの治療にはウイルスの発現、特にＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌を阻害するという実現されていない医学上の要求が存在する（Ｗｉｅｌａｎｄ， Ｓ． Ｆ． ＆ Ｆ． Ｖ． Ｃｈｉｓａｒｉ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ， （２００５）， ７９， ９３６９－８０； Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ， （２０１１）， ８５， ９８７－９５； Ｗｏｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， （２０１１）， ６， ｅ１５３２４； Ｏｐ ｄｅｎ Ｂｒｏｕｗ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， （２００９ｂ）， １２６， ２８０－９）。
国際公開第０３／０２２９８７号パンフレットはＣ型肝炎陽性組織において上方制御される１２９８種類の遺伝子を例えば表７Ａにおいて開示している。前述の遺伝子のうちの１つはトポイソメラーゼ関連機能タンパク質４（ＴＲＦ４、ＡＦ０８９８９７）である。ＡＦ０８９８９７はＴＲＦ４－２とも呼ばれ、本明細書中の配列番号４の位置８８０～２３４０に極めてよく似ている。Ｃ型肝炎陽性細胞ではＰＡＰＤ５の断片はわずかにしか上方制御されないという観察結果はＰＡＰＤ５の阻害が有効な治療法であるということをいくらかでも示すものではない。国際公開第０３／０２２９８７（Ａ２）号パンフレットはＣ型肝炎の感染にＰＡＰＤ５の断片が何らかの重要な役割を果たすというどんな示唆も全く開示していない。加えて、ＨＣＶ及びＨＢＶは、異なる病因、異なる進行、及び異なる薬物治療を伴う２つの完全に異なる疾患を引き起こす２種類の完全に異なるウイルスである。このことは、ＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７の阻害剤であるＤＨＱとＴＨＰがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、又はＨＢＶ以外の他のウイルスに対しては不活性である（データを示さず）という本発明者らの観察結果と一致する。
国際公開第２０１０／０４０５７１号パンフレットでは何らかの実際の証拠が提供されているわけではないが代謝性疾患及び腫瘍状疾患において潜在的な役割を細胞増殖に有する他の遺伝子の長いリストの中にＰＡＰＤ５が示唆されている。
国際公開第２０１３／１６６２６４号パンフレットでは何らかの実際の証拠が提供されているわけではないが代謝性疾患及び腫瘍状疾患において潜在的な役割をウイルス複製の増加に有する他の遺伝子の長いリストの中にＰＡＰＤ５が示唆されている。
国際公開第２０１７／０６６７１２号パンフレットにはテロメア疾患の治療と診断に関してＰＡＰＤ５の下方制御のことが記載されている。この目的のために５種類のｓｈＲＮＡ構造体が説明されている。
我々の知る限り、ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の発現はこれまでにＨＢＶの感染と関連付けられてもいなければ、これらの標的に対して修飾型一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが作製されてもいない。
したがって、本発明の根底にある技術的課題はＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防のために改善された手段と方法を特定し、且つ、提供することである。
その技術的課題は本明細書に記載され、且つ、特許請求の範囲において特徴が述べられる実施形態の提示によって解決される。
ＨＢＸ１２９６５３／ＨＢＸ１２９６５４化学プローブと３種類のプレイ断片を使用する１対１実験の図である。 ＨＢＸ１２９６５３／ＨＢＸ１２９６５４化学プローブとＰＡＰＤ５／７全長タンパク質を使用する１対１実験の図である。 競合のためにＨＢＸ１２９６５３（ＤＨＱ）とＭＯＬ６５３／６５４を使用する競合アッセイの図である。 競合のためにＨＢＸ１２９６５４（ＴＨＰ）とＭＯＬ６５３／６５４を使用する競合アッセイの図である。 競合のためにＨＢＸ１２９６５３（ＤＨＱ）とＩＮＡＣＴ６５３／ＩＮＡＣＴ６５４を使用する競合アッセイの図である。ＭＯＬ６５３を陽性対照として含めた。 競合のためにＨＢＸ１２９６５４（ＴＨＰ）とＩＮＡＣＴ６５３／ＩＮＡＣＴ６５４を使用する競合アッセイの図である。ＭＯＬ６５３を陽性対照として含めた。 （Ａ）ＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧにおけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７のｓｉＲＮＡノックダウン（ＫＤ）によってＨＢＶ発現が低下することを示す図である。ＨｅｐａＲＧ分化細胞にＨＢＶを感染させ、ＨＢＶの感染１日前と感染４日後にＰＡＰＤ５、ＰＡＰＤ７、又はそれらの両方の何れかに対するｓｉＲＮＡ（２５ｎＭずつ）で処理した。上清を１１日目に採取し、上清中に分泌されたＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇのレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、そして非処理対照に対して正規化した。その後、細胞毒性及び遺伝子発現の阻害を測定し、これらも非処理対照に対して正規化した。（Ｂ）上清中に分泌されたＨＢｓＡｇのレベルだけを測定したことを除いて（Ａ）において説明された実験と同じ実験を実施したことを示す図である。 ＨｅＬａ細胞培養物においてＰＡＰＤ５の発現を低下させるための実施例４において試験されたオリゴヌクレオチドの能力を表す図である。各オリゴヌクレオチドは染色体上の位置としてＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ上のその位置を示すドットによって表されている。各プロットの右側に示されるようにオリゴヌクレオチド濃度は５μＭと２５μＭであった。 ＨｅＬａ細胞培養物においてＰＡＰＤ７の発現を低下させるための実施例５において試験されたオリゴヌクレオチドの能力を表す図である。各オリゴヌクレオチドは染色体上の位置としてＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ上のその位置を示すドットによって表されている。各プロットの右側に示されるようにオリゴヌクレオチド濃度は５μＭと２５μＭであった。 ＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７を標的とするオリゴヌクレオチド混合物（２０μＭずつ）を使用するＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞におけるＨＢｓＡｇの抑制を、その混合物中に存在する単一のオリゴヌクレオチド（２０μＭ）を使用して得られる抑制と比較して表す図である。ジムノシスでこのアッセイを実施した。 ＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７を標的とするオリゴヌクレオチド混合物（５００ｎＭずつ）を使用するＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞におけるＨＢｓＡｇの抑制を、その混合物中に存在する単一のオリゴヌクレオチド（５００ｎＭ）を使用して得られる抑制と比較して表す図である。形質移入でこのアッセイを実施した。
本発明の１つの態様はＢ型肝炎ウイルス感染症の治療及び／又は予防に使用するための核酸分子であって、ＰＡＰＤ５の発現及び／又は活性を阻害する前記核酸分子を含む組成物に関する。具体的にはＢ型肝炎ウイルス感染症の治療及び／又は予防に使用するためにある核酸分子の混合製剤を含む組成物がＰＡＰＤ５の発現及び／又は活性を阻害し、別の核酸分子がＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を阻害する。
本発明の追加の態様はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を阻害する核酸分子に関する。具体的には一本鎖アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡ分子に関する。
本発明の追加の態様はＰＡＰＤ５の発現及び／又は活性を阻害する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。具体的には２’糖修飾オリゴヌクレオチドとホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
本発明のその他の態様は本発明の核酸分子の複合体、ＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７の両方の発現及び／又は活性を阻害することが可能な核酸分子の混合製剤、及び本発明のそれらの分子を含む医薬組成物である。
本発明の追加の態様はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物又は組成物を特定するための方法であって、
（ａ）ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７を発現する細胞と被験化合物又は被験組成物を接触させること、
（ｂ）前記被験化合物又は被験組成物が存在する状態と存在しない状態でＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を測定すること、及び
（ｃ）ＨＢＶ感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物としてＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を低下させる化合物又は組成物を特定すること
を含む前記方法である。
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７はポリメラーゼβ様ヌクレオチジルトランスフェラーゼスーパーファミリーに属する非標準型ポリ（Ａ）ポリメラーゼである。本発明の背景において、被験化合物がＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７を阻害するかどうか分析することによりＨＢＶ感染症の治療介入に有用な化合物の特定に成功し得ることが驚くべきことに示されている。また、換言するとＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の阻害、又はそれらの両方の阻害がＨＢＶ感染症を抑制する化合物の効力についての指標であると添付実施例において確認された。それらの添付実施例は本明細書においてＤＨＱと呼ばれる材料と方法の節に示される式（ＩＩＩ）を有するジヒドロキノリジノン化合物と本明細書においてＴＨＰと呼ばれる材料と方法の節に示される式（ＩＶ）を有するテトラヒドロピリドピリミジン化合物がＰＡＰＤ５ポリペプチドとＰＡＰＤ７ポリペプチド（それぞれ配列番号１と２）に結合することを実証している。これらの化合物はＨＢＶ感染中にＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の生産とＨＢＶ ＲＮＡの発現を阻害する能力を有する（国際公開第２０１５／１１３９９０（Ａ１）号パンフレット及び国際公開第２０１６／１７７６５５号パンフレット）。加えて、それらの添付実施例はｓｉＲＮＡプールの使用によるＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７又はそれらの両方の阻害によってウイルス発現の阻害、特にＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌の阻害、並びに細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡ生産の阻害が引き起こされることを示している。これらの結果はＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性（例えば量）を減少させることによってＨＢＶ感染症（例えば慢性ＨＢＶ感染症）が予防又は治療（すなわち、改善及び／又は抑制）され得ることを直接的に示している。
本発明のスクリーニング方法
したがって、本発明はＨＢＶ感染症を予防及び／又は治療（すなわち、改善及び／又は抑制）する化合物としてＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性（例えば発現）を低下させる化合物（又はＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７を減少させる化合物の混合物）が特定されるスクリーニング方法に関する。本発明の好ましい実施形態ではその化合物はＲＮＡｉ分子、特にｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子である。本発明のスクリーニング方法を用いてＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ又はＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡのどちらかを標的とする２４０種類のＬＮＡ修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドがＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の発現、又は両方の発現を低下させる能力について混合化合物を使用してスクリーニングされている。これらの化合物の中には単独で、又は混合物としてＨＢＶ感染症を改善及び／又は抑制する能力を確認するためにさらに試験されたものもある。
本発明の１つの態様はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物又は組成物を特定するための方法であって、
（ａ）ＰＡＰ関連ドメイン含有タンパク質５（ＰＡＰＤ５）及び／又はＰＡＰ関連ドメイン含有タンパク質７（ＰＡＰＤ７）を発現する細胞と被験化合物を接触させること、
（ｂ）前記被験化合物又は被験組成物が存在する状態と存在しない状態でＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を測定すること、及び
（ｃ）ＨＢＶ感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物又は組成物としてＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を低下させる化合物を特定すること
を含み、所望により
（ｄ）ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を低下させる混合化合物を試験すること
を含む前記方法である。
ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７を減少させる化合物（又は組成物）、又はＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を共に減少させる混合化合物によってＨＢＶの遺伝子発現と複製が阻害され、そうしてＨＢＶ感染症が予防、改善、及び／又は抑制されることが本発明の背景において分かっている。そのような化合物はＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７発現及び／又は活性の１０～１００％、好ましくは２０～１００％、より好ましくは３０～１００％、さらにより好ましくは４０～１００％、さらにより好ましくは５０～１００％、さらにより好ましくは６０～１００％、さらにより好ましくは７０～１００％、さらにより好ましくは８０～１００％、及び最も好ましくは９０～１００％の低下を引き起こし得る。
本明細書において提供されるスクリーニング方法では工程（ａ）においてＨｅＬａ細胞株又はＨｅｐａＲＧ細胞株などのＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７を発現する細胞を使用することによりＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の発現を測定（すなわち分析／決定）することを企図している。ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性は、（ｉ）ＰＡＰＤ５ポリペプチド及び／又はＰＡＰＤ７ポリペプチドを定量するか、又は（ｉｉ）ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７を発現する細胞内での転写物レベルを定量するかのどちらかによって測定（すなわち、分析／決定）され得る。
本発明の１つの態様ではＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の発現を低下させる化合物（例えばＰＡＰＤ５の発現を低下させる化合物、又は好ましくはＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７の両方を減少させる混合化合物）がＨＢＶ感染症を予防、改善、及び／又は抑制（すなわち治療）する化合物として特定される。本発明の別の態様ではＰＡＰＤ５ポリペプチド又はＰＡＰＤ７ポリペプチドの活性を低下させる化合物（例えばＰＡＰＤ５の活性を低下させる化合物、又は好ましくはＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７の両方を減少させる混合化合物）がＨＢＶ感染症を予防、改善、及び／又は抑制（すなわち治療）する化合物として特定される。ＰＡＰＤ５の発現及び／又は活性、又は両方の分子、すなわちＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を減少させる混合化合物がＨＢＶ感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物として特定されることを優先する。両方の分子、すなわちＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を低下させる混合化合物がＨＢＶ感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物として特定されることが最も好ましい。
上記のスクリーニング方法によってＨＢＶ感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物又は混合化合物が特定される。前記化合物によってＨＢＶ感染症が改善及び／又は抑制（すなわち治療）されることを優先する。したがって、本明細書において提供されるスクリーニング方法はＨＢＶ感染症を治療する化合物の特定に有用である。
本発明の背景ではＰＡＰＤ５はＰＡＰＤ５ポリペプチド又はＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡであり得る。ＰＡＰＤ５がＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡであることが本明細書において提供されるスクリーニング方法の背景では優先される。
本発明の１つの態様は本明細書において提供されるスクリーニング方法であって、ＰＡＰＤ５を発現する前記細胞が
（ｉ）配列番号１又は２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号４、５、又は１０のヌクレオチド配列、又はその天然変異体、
（ｉｉｉ）少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性を配列番号１又は２に対して有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、ポリＡポリメラーゼ機能を有するポリペプチドがそのポリヌクレオチドによってコードされる前記ヌクレオチド配列、
（ｉｖ）少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性を（ｉｉ）のヌクレオチド配列に対して有するヌクレオチド配列であって、ポリＡポリメラーゼ機能を有するポリペプチドを発現する前記ヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号７又は８をコードするヌクレオチド配列など、配列番号１又は２の酵素活性断片をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉ）少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性を配列番号７又は８など、配列番号１又は２の酵素活性断片のアミノ酸配列に対して有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、ポリＡポリメラーゼ機能を有するポリペプチドがそのポリヌクレオチドによってコードされる前記ヌクレオチド配列、又は
（ｖｉｉ）配列番号４、５、又は１０を含む、又は前記配列番号から成るヌクレオチド配列
を含む、又は前記ヌクレオチド配列から成るＰＡＰＤ５標的核酸を含有する前記方法に関する。
好ましい実施形態では前記ＰＡＰＤ５標的核酸はプレｍＲＮＡ又は成熟ｍＲＮＡなどのｍＲＮＡである。その他の実施形態では前記ＰＡＰＤ５標的核酸は配列番号４、５、又は１０のヌクレオチド配列、又はその天然変異体を含む、又は前記ヌクレオチド配列若しくはその天然変異体から成るポリヌクレオチドである。しかしながら前記ＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性を配列番号４、５又は１０に対して有するヌクレオチド配列含む、又は前記ヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドであって、ポリＡポリメラーゼ機能を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドであってもよい。
本発明の背景ではＰＡＰＤ７はＰＡＰＤ７ポリペプチド又はＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡであり得る。ＰＡＰＤ７がＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡであることが本明細書において提供されるスクリーニング方法の背景では優先される。
本発明の１つの態様は本明細書において提供されるスクリーニング方法であって、ＰＡＰＤ７を発現する細胞が
（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号６又は１１のヌクレオチド配列、又はその天然変異体、
（ｉｉｉ）少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性を配列番号３に対して有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、ポリＡポリメラーゼ機能を有するポリペプチドがそのポリヌクレオチドによってコードされる前記ヌクレオチド配列、
（ｉｖ）少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性を（ｉｉ）の核酸配列に対して有するヌクレオチド配列であって、ポリＡポリメラーゼ機能を有するポリペプチドを発現する前記核酸配列、
（ｖ）配列番号９をコードするヌクレオチド配列など、配列番号３の酵素活性断片をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｖｉ）少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性を配列番号９など、配列番号３の酵素活性断片のアミノ酸配列に対して有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、ポリＡポリメラーゼ機能を有するポリペプチドがそのポリヌクレオチドによってコードされる前記ヌクレオチド配列、又は
（ｖｉｉ）配列番号６又は１１を含む、又は前記配列番号から成るヌクレオチド配列
を含む、又は前記ヌクレオチド配列から成るＰＡＰＤ７標的核酸を含有する前記スクリーニング方法に関する。
好ましい実施形態では前記ＰＡＰＤ７標的核酸はプレｍＲＮＡ又は成熟ｍＲＮＡなどのｍＲＮＡである。その他の実施形態では前記ＰＡＰＤ７標的核酸は配列番号６又は１１のヌクレオチド配列、又はその天然変異体を含む、又は前記ヌクレオチド配列若しくはその天然変異体から成るポリヌクレオチドである。しかしながら前記ＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性を配列番号６又は１１に対して有するヌクレオチド配列を含む、又は前記ヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドであって、ポリＡポリメラーゼ機能を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドであってもよい。
本発明の背景ではスクリーニングに使用される前記細胞は真核細胞であり得る。例えば、前記細胞は酵母細胞又は脊椎動物細胞であり得る。脊椎動物細胞には魚類、鳥類、爬虫類、両生類、有袋類、及び哺乳類の細胞が含まれ得る。前記細胞は哺乳類細胞であることが好ましく、ヒト細胞であることが最も好ましい。哺乳類細胞にはネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、マウス及びラットなどのネズミ、及びウサギの細胞も含まれる。本明細書において提供されるスクリーニング方法では前記「細胞」はＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７を内因的に発現するか、ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７を過剰に発現する場合がある。ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の過剰発現のために前記細胞は発現ベクター内にＰＡＰＤ５ポリペプチド及び／又はＰＡＰＤ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでよい。好ましい実施形態では前記細胞はＰＡＰＤ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とＰＡＰＤ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。本明細書において提供されるスクリーニング方法の細胞は非ヒト動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、又はフェレットに含まれる場合がある。本明細書に記載されるスクリーニング方法に提供される細胞は標的細胞と呼ばれる場合もある。
ＰＡＰＤ５ポリペプチド及び／又はＰＡＰＤ７ポリペプチドの活性が測定される本明細書において提供されるスクリーニング方法ではＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の前記活性はポリＡポリメラーゼ機能（すなわちポリＡポリメラーゼ活性）であることが好ましい。ポリペプチド（例えばＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７）のポリＡポリメラーゼ機能／活性は、例えばＲａｍｍｅｌｔ， ＲＮＡ， ２０１１， １７：１７３７－１７４６等に記載されるようにｍＲＮＡのインビトロポリアデニル化をモニターすることにより測定され得る。この方法は、被験化合物が存在する状態と存在しない状態でＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７のポリＡポリメラーゼ機能を測定するためにも使用可能である。簡単に説明すると、ＡＴＰ（Ａ）、ＣＴＰ（Ｃ）、ＧＴＰ（Ｇ）、ＵＴＰ（Ｕ）、又は４種類全てのｄＮＴＰの混合物が存在する状態でリボオリゴヌクレオチドＡ15を大腸菌内で発現した組換えＰＡＰＤ５タンパク質とインキュベートしてよい。
前記被験化合物が存在する状態と存在しない状態での細胞内におけるＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の発現は例えば（ｑ）ＰＣＲ、ウエスタンブロット、又は質量分析を用いて測定可能である。
ＨＢＶの増殖を阻害する化合物はウイルスＲＮＡの発現を低下させ、ウイルスＲＮＡ（ＨＢＶ ＲＮＡ）に由来するウイルスＤＮＡ（ＨＢＶ ＤＮＡ）の生産を減少させ、新しいウイルス粒子（ＨＢＶ粒子）の生産を減少させ、且つ／又はＨＢｓＡｇ及び／若しくはＨＢｅＡｇの生産及び／若しくは分泌をもたらす化合物であり得る。したがって、本発明の１つの態様は本明細書において提供されるスクリーニング方法であって、ＨＢＶの増殖を阻害する前記化合物によってＨＢｓＡｇの分泌が阻害され、ＨＢｅＡｇの分泌が阻害され、且つ／又は細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡ若しくはＨＢＶ ＤＮＡの生産が阻害される前記スクリーニング方法に関する。ＨＢＶの増殖を阻害する化合物はＨＢｓＡｇの分泌、ＨＢｅＡｇの分泌、及び細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡ又はＨＢＶ ＤＮＡの生産を阻害する化合物であることが好ましい。
例えば、ＨＢＶの増殖を阻害する化合物は未処理の細胞若しくは動物、又は適切な対照で処理された細胞若しくは動物を比較したときにウイルスＲＮＡ（ＨＢＶ ＲＮＡ）の発現、ウイルスＲＮＡに由来するウイルスＤＮＡ（ＨＢＶ ＤＮＡ）の生産、新しいウイルス粒子（ＨＢＶ粒子）の生産、ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの生産、及び／又はＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの分泌を１０～１００％、好ましくは２０～１００％、より好ましくは３０～１００％、さらにより好ましくは４０～１００％、さらにより好ましくは５０～１００％、さらにより好ましくは６０～１００％、さらにより好ましくは７０～１００％、さらにより好ましくは８０～１００％、及び最も好ましくは９０～１００％減少させ得る。
ＨＢＶの増殖の阻害は、例えば、ＨＢｓＡｇの分泌及び／又はＨＢｅＡｇの分泌を阻害し、且つ／又は細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡ又はＨＢＶ ＤＮＡの生産を阻害する活性を前記被験化合物が持つか測定することにより測定可能である。ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの分泌の阻害はＥＬＩＳＡにより、例えばＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社）を製造業者の指示に従って使用することにより測定可能である。細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡの生産の阻害は例えば添付実施例に記載されるようにリアルタイムＰＣＲによって測定可能である。被験化合物がＨＢＶの増殖を阻害するか評価するためのその他の方法は、例えば国際公開第２０１５／１７３２０８号パンフレット又は添付実施例に記載されるようなＲＴ－ｑＰＣＲによるＨＢＶ ＤＮＡの分泌の測定、ノーザンブロットによる測定、インサイチュハイブリダイゼーションによる測定、又は免疫蛍光による測定である。
本明細書において提供されるスクリーニング方法は前記被験化合物を対照と比較する工程をさらに含んでよい。前記対照は不活性被験化合物であってよく、その不活性被験化合物はＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を低下させない化合物である。
この不活性被験化合物はＨＢＶに対して何の活性も持たず、例えばＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇの分泌を阻害しなければ、細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡの生産も阻害しない。例えば、その不活性被験化合物はＨＢｓＡｇの阻害について６μＭを超えるＩＣ50値を有する場合がある。本明細書において提供されるスクリーニング方法では前記不活性被験化合物は非ターゲティングアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡであってよい。ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性が測定される前記スクリーニング方法では上の（ｉ）において規定される被験化合物を使用してよい。不活性型化合物は例えば化学的修飾及び／又は機能妨害によって活性型の化合物から設計可能である。
本明細書において提供されるスクリーニング方法を実施するために公開又は市販されている分子ライブラリーが使用可能である。したがって、本発明の背景では前記被験化合物は
（ｉ）少なくとも１個の２’修飾ヌクレオシドを含むことが好ましい一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は
（ｉｉ）ｓｉＲＮＡ分子、又は
（ｉｉｉ）ｓｈＲＮＡ分子
から選択される核酸分子より成るスクリーニングライブラリーであり得る。
ＰＡＰＤ５及び／又はＰＤＰＤ７のポリペプチド又はｍＲＮＡを抑制することによりＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌、並びに細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡの生産が効果的に阻害され得ることが添付実施例によって実証されている。これらのデータはＨＢＶ感染症を予防及び／又は治療するためにＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の阻害剤が使用可能であることを実証している。
ＨＢＶ感染症の治療にある一定の効力を有する幾つかの小分子化合物が当技術分野において説明されている（例えば国際公開第２０１５／１１３９９０（Ａ１）号パンフレット及び国際公開第２０１６／１７７６５５号パンフレットを参照されたい）。前記小分子化合物のＨＢＶ感染症に対する活性とＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７に対する結合親和性との間の明確な相関が添付実施例によって初めて実証されている。この認識により、ＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ又はＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡを標的とする核酸分子であって、特に高い抗ＨＢＶ効力を生じる前記核酸分子を設計することが可能になった。アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）に結合可能な複合体を使用して前記核酸分子を肝臓に直接的に指向させることができる。全身投与された小分子と比較すると前記核酸分子は異なるＰＫ／ＰＤプロファイルと毒性プロファイルを有することになる。さらに、ＰＡＰＤ５、ＰＡＰＤ７、又は特にＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７を阻害する化合物がＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌の阻害、並びに細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡの生産の阻害に関して非常に高い活性を有することが本発明によって初めて示されている。ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌を減少させることでＨＢｓＡｇの分泌の減少だけと比べて慢性ＨＢＶ感染症の発症がより効果的に抑制される。加えて、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌を阻害することによってＨＢＶ感染者の感染性が低下する。さらに、母親になる女性においてＨＢｅＡｇを減少させることによってその女性の子供での慢性ＨＢＶ感染症の発症も抑制可能である。したがって、ＰＡＰＤ５標的核酸又はＰＡＰＤ７標的核酸を阻害する化合物、又はＰＡＰＤ５標的核酸とＰＡＰＤ７標的核酸の両方を阻害する混合化合物を選択的に使用することによってＨＢＶ感染症の治療においてＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのかなり効果的な減少に関して改善された治療成果が生じることが本発明によって予期せず実証されている。
したがって、本発明の一態様はＰＡＰＤ５標的核酸又はＰＡＰＤ７標的核酸を減少させることが可能な１種類以上の阻害剤、又はＰＡＰＤ５標的核酸とＰＡＰＤ７標的核酸の両方の発現を阻害する混合化合物をＨＢＶ感染症、特に慢性ＨＢＶ感染症の治療において使用することである。追加の実施形態では本発明はＰＡＰＤ５標的核酸及び／又はＰＡＰＤ７標的核酸を減少させることが可能な少なくとも２種類の阻害剤をウイルス抗原であるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの減少に使用することに関する。
したがって、本発明はＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に使用するためのＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の阻害剤又は混合阻害剤であって、
（ａ）ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７に対する１種類以上のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子、
（ｂ）次のものを含むゲノム編集装置
（ｉ）部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼ、又は部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ガイドＲＮＡ、又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
からなる群より独立して選択される前記阻害剤に関する。
前記ＲＮＡｉ分子は
（ａ）一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｂ）ｓｉＲＮＡ分子、及び
（ｃ）ｓｈＲＮＡ分子
からなる群より独立して選択され得る。
本発明の阻害剤はＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７に特異的なロックド核酸（ＬＮＡ）分子であってもよい。
ＨＢＶ感染症を治療（例えば改善）するために本発明の阻害剤を使用することを企図している。
前記阻害剤はＰＡＰＤ７を特異的に阻害する分子であり得る。前記阻害剤はＰＡＰＤ５を特異的に阻害する分子であることが好ましい。前記阻害剤はＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７の両方を阻害するように組み合わせられることがより好ましい。したがって、本発明の阻害剤がＰＡＰＤ５を阻害するか、又はＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７の両方を阻害するようにそれらの阻害剤が混合されるかのどちらかであることが優先される。本発明の阻害剤がＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７を阻害するようにそれらの阻害剤が混合されることが最も好ましい。本発明の１つの態様では本発明の阻害剤によってＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７の両方が阻害され、且つ、無薬品対照と比較して（すなわち薬品が投与されなかった細胞又は対象と比較して）少なくとも５０％のＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの分泌の減少が生じるようにそれらの阻害剤が混合される。
本発明の阻害剤はＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの阻害に関して６μＭ未満、好ましくは５μＭ未満、好ましくは４μＭ未満、好ましくは３μＭ未満、好ましくは２μＭ未満、より好ましくは１μＭ、より好ましくは０．５μＭ未満、及び最も好ましくは０．１μＭ未満のＩＣ50値を有してよい。
部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９又はＣｐｆ１等）及びガイドＲＮＡを使用することによるゲノム編集は当技術分野において一般的に知られており、且つ、例えば「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、２０１６年、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｄｏｕｄｎａ編、ＩＳＢＮ ９７８－１－６２１８２１－３１－１に記載されている。
例えば、前記部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである場合、前記ゲノム編集装置は
（ｉ）少なくとも１種類の標的配列特異的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子と少なくとも１種類のトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子から成る少なくとも１種類のガイドＲＮＡ、
（ｉｉ）前記（ｉ）のＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）少なくとも１種類の標的配列特異的ｃｒＲＮＡと少なくとも１種類のｔｒａｃｒＲＮＡを含むキメラＲＮＡ分子である少なくとも１種類のガイドＲＮＡ、又は
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）のキメラＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
をさらに含むことが好ましい。
代わりの例では前記部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼはＣｐｆ１ヌクレアーゼであり、前記ゲノム編集装置は
（ｉ）標的配列特異的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子を含む少なくとも１種類のガイドＲＮＡ、又は
（ｉｉ）前記（ｉ）のＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド
をさらに含むことが好ましい。
本明細書において提供されるＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の阻害剤は少なくとも１種類の組立て済みのＣａｓ９タンパク質－ガイドＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を含むゲノム編集装置であってもよい。
本明細書では前記ガイドＲＮＡはＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７のゲノムＤＮＡを標的とするように設計される。あるいは、ＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７のゲノムＤＮＡを標的とすることができるように幾つかのガイドＲＮＡが使用される。ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の阻害は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介してＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７のゲノムＤＮＡにフレームシフトノックアウト突然変異を導入することにより、又は相同組換え修復（ＨＤＲ）を介してＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７のゲノムＤＮＡを改変することにより達成可能である。どのようにこれらの機構を誘導することができるかは当技術分野において一般的に知られており、且つ、例えばＨｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ， ２０１６， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７ ３６－４４に記載されている。
本発明の阻害剤は非天然分子であることが好ましい。本発明の阻害剤はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、Ｃｒｉｓｐｅｒ ＲＮＡ、及び一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドをはじめとするＲＮＡｉ剤から選択される核酸分子であってよい。前記ＲＮＡｉ分子は少なくとも１つの非天然ヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチドチオホスフェート、置換リボオリゴヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオシド、ＬＮＡヌクレオシド、ＰＮＡヌクレオシド、ＧＮＡ（グリコール核酸）分子、ＴＮＡ（トレオース核酸）分子、モルホリノヌクレオチドを含み、又はポリシロキサン、２’－Ｏ－（２－メトキシ）エチル－ホスホロチオエートなどの修飾型骨格を有する核酸を含み、又はメチルヌクレオシド、チオヌクレオシド、サルフェートヌクレオシド、ベンゾイルヌクレオシド、フェニルヌクレオシド、アミノヌクレオシド、プロピルヌクレオシド、クロロヌクレオシド、及びメタノカルバヌクレオシドなどの置換基を有する核酸を含み、又は検出を容易にするためのレポーター分子を含むことが好ましい。本発明の阻害剤は天然又は非天然の小分子又はゲノム編集装置であってもよい。
本発明の背景では本明細書において提供される阻害剤はＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を阻害する。
例えば、本発明の阻害剤はＰＡＰＤ５標的核酸に結合し、ＰＡＰＤ５ポリペプチドの活性を阻害してよい。別の例では本発明の阻害剤はＰＡＰＤ７標的核酸に結合し、ＰＡＰＤ７ポリペプチドの活性を阻害する。前記阻害剤がＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡとＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの両方を標的とするように混合され、ＰＡＰＤ５ポリペプチドとＰＡＰＤ７ポリペプチドの両方の活性を阻害することが本明細書においては優先される。本発明の阻害剤がＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の発現を阻害してもよく、混合阻害剤がＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７の両方の発現を阻害してもよい。
本発明の化合物
上で説明したように本発明の阻害剤は核酸分子であり得る。
本発明の１つの態様では本発明の阻害剤はＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７に対するＲＮＡｉ分子である。前記ＲＮＡｉ分子はｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであり得る。
例えば、本発明の阻害剤はＰＡＰＤ５向けのｓｉＲＮＡであってよく、その場合に前記ｓｉＲＮＡは以下のｓｉＲＮＡのうちの何れか１つ、又はそれらの組合せである。
ＰＡＰＤ５ ｓｉＲＮＡプール（Ｌ－０１００１１－００－００１０；ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓヒトＰＡＰＤ５）：
ｓｉＲＮＡ－１‐Ｊ－０１００１１－０５－標的配列：ＣＡＵＣＡＡＵＧＣＵＵＵＡＵＡＵＣＧＡ（配列番号２５２）
ｓｉＲＮＡ－２‐Ｊ－０１００１１－０６－標的配列：ＧＧＡＣＧＡＣＡＣＵＵＣＡＡＵＵＡＵＵ（配列番号２５３）
ｓｉＲＮＡ－３‐Ｊ－０１００１１－０７－標的配列：ＧＡＵＡＡＡＧＧＡＵＧＧＵＧＧＵＵＣＡ（配列番号２５４）
ｓｉＲＮＡ－４‐Ｊ－０１００１１－０８－標的配列：ＧＡＡＵＡＧＡＣＣＵＧＡＧＣＣＵＵＣＡ（配列番号２５５）
本発明の阻害剤はＰＡＰＤ７向けのｓｉＲＮＡであってもよく、その場合に前記ｓｉＲＮＡは以下のｓｉＲＮＡのうちの何れか１つ、又はそれらの組合せである。
ＰＡＰＤ７ ｓｉＲＮＡプール（Ｌ－００９８０７－００－０００５；ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓヒトＰＡＰＤ７）：
ｓｉＲＮＡ－１‐Ｊ－００９８０７－０５－標的配列：ＧＧＡＧＵＧＡＣＧＵＵＧＡＵＵＣＡＧＡ（配列番号２５６）
ｓｉＲＮＡ－２‐Ｊ－００９８０７－０６－標的配列：ＣＧＧＡＧＵＵＣＡＵＣＡＡＧＡＡＵＵＡ（配列番号２５７）
ｓｉＲＮＡ－３‐Ｊ－００９８０７－０７－標的配列：ＣＧＧＡＧＵＵＣＡＵＣＡＡＧＡＡＵＵＡ（配列番号２５８）
ｓｉＲＮＡ－４‐Ｊ－００９８０７－０８－標的配列：ＧＣＧＡＡＵＡＧＣＣＡＣＡＵＧＣＡＡＵ（配列番号２５９）
適切なｓｉＲＮＡの標的配列が上に示されている。対応するｓｉＲＮＡの配列はこれらの標的配列に対して全く相補的である。
本発明の背景ではＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７の両方の発現を阻害するために混合製剤が（ｂ）ＰＡＰＤ７向けのｓｉＲＮＡと組み合わされた（ａ）ＰＡＰＤ５向けのｓｉＲＮＡを含み得ると想定している。
本発明の背景ではＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７の両方の発現を阻害するために混合製剤が（ｂ）ＰＡＰＤ７向けのｓｈＲＮＡと組み合わされた（ａ）ＰＡＰＤ５向けのｓｈＲＮＡを含み得るとも想定している。この背景では（ａ）のｓｈＲＮＡ分子は以下のｓｈＲＮＡ分子のうちの１つ以上であり得る。
ＣＣＧＧＧＣＣＡＣＡＴＡＴＡＧＡＧＡＴＴＧＧＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＡＴＡＴＧＴＧＧＣＴＴＴＴＴＧ（配列番号２６０）
ＣＣＧＧＣＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＧＡＧＡＴＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号２６１）
ＣＣＧＧＣＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号２６２）
ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＧ（配列番号２６３）
ＣＣＧＧＣＧＡＴＧＴＴＧＧＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号２６４）
本発明の追加の態様では前記ＲＮＡｉ分子はＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の発現を阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７をコードする標的核酸にハイブリダイズすることによって調整が達成される。標的核酸は配列番号４、５、及び１０からなる群より選択される配列又はその天然変異体などの哺乳類ＰＡＰＤ５であり得る。
標的核酸は配列番号６又は１１から選択される配列又はその天然変異体などの哺乳類ＰＡＰＤ７であり得る。
本発明のオリゴヌクレオチドはＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
幾つかの実施形態では本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは標的の発現を阻害又は下方制御することによりその発現を調整することが可能である。そのような調整によって標的の正常発現レベルと比較して少なくとも２０％の発現抑制、より好ましくは標的の正常発現レベルと比較して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の抑制が生じることが好ましい。幾つかの実施形態ではＨｅＬａ細胞又はＨｅｐａＲＧ細胞を使用すると本発明のオリゴヌクレオチドによってＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ又はＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの発現レベルをインビトロで少なくとも６０％又は７０％抑制することが可能である場合がある。幾つかの実施形態ではＨｅＬａ細胞又はＨｅｐａＲＧ細胞を使用すると本発明の化合物によってＰＡＰＤ５タンパク質又はＰＡＰＤ７タンパク質の発現レベルをインビトロで少なくとも５０％抑制することが可能である場合がある。ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７のＲＮＡ又はタンパク質の抑制を測定するために使用可能な適切なアッセイが上のスクリーニング方法節に記載されている。前記オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって標的の調整が引き起こされる。
本発明の態様はＰＡＰＤ５に対して少なくとも９０％相補的である１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドはＰＡＰＤ５の発現を低下させることが可能である。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１個の２’糖修飾ヌクレオシドを含むことが好ましい。
本発明の別の態様はＰＡＰＤ７に対して少なくとも９０％相補的である１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドはＰＡＰＤ７の発現を低下させることが可能である。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１個の２’糖修飾ヌクレオシドを含むことが好ましい。
幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチドは前記標的核酸のある領域又は標的配列と少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は１００％相補的である連続配列を含む。
本発明のオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は好ましい実施形態では前記標的核酸のある領域に対して完全に相補的（１００％相補的）であり、幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチドと前記標的核酸との間に１、２のミスマッチを含む場合がある。
幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチドは配列番号４、５、又は１０内に存在する標的針列などの標的核酸領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に（又は１００％）相補的である１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチド配列は配列番号１０内に存在する対応する標的核酸領域に対して１００％相補的である。幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチド配列は配列番号４、５、又は１０内に存在する対応する標的核酸領域に対して１００％相補的である。
幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチドは配列番号６又は１１内に存在する標的針列などの標的核酸領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に（又は１００％）相補的である１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチド配列は配列番号１１内に存在する対応する標的核酸領域に対して１００％相補的である。幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチド配列は配列番号６又は１１内に存在する対応する標的核酸領域に対して１００％相補的である。
幾つかの実施形態では本発明のオリゴヌクレオチドは１０～３５ヌクレオチド長、例えば１０～３０ヌクレオチド長、例えば１１～２２ヌクレオチド長、例えば１２～２０ヌクレオチド長、例えば１４～２０ヌクレオチド長、例えば１４～１８ヌクレオチド長、例えば１４～１６ヌクレオチド長、例えば１６～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチドを含む、又は前記連続ヌクレオチドから成る。
幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は２２個以下のヌクレオチド、例えば２０個以下のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成る。本明細書において提示されるあらゆる範囲はその範囲の末端点を含むことを理解されたい。したがって、オリゴヌクレオチドが１０～３０個までのヌクレオチドを含むと書いてある場合、１０個のヌクレオチドと３０個のヌクレオチドの両方が含まれる。
幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチド又は前記連続ヌクレオチド配列は材料と方法の節内の表３に記載されている配列からなる群より選択される配列を含む、又は前記配列から成る。
幾つかの実施形態では前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又は前記連続ヌクレオチド配列は配列番号１２～１３１からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成る（表３に記載されているモチーフ配列を参照されたい）。
幾つかの実施形態では前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又は前記連続ヌクレオチド配列は配列番号１５、１８、２３、２５、２６、３０、３２、３９、５４、５６、５８、６５、８０、８８、９２、９３、１１１、１１５、１１６、及び１１８（表３に記載されているモチーフ配列を参照されたい）からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成る。
幾つかの実施形態では前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又は前記連続ヌクレオチド配列は配列番号２３、２６、５４、５６、８０、９３、及び１１５からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成る。
幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチド又は前記連続ヌクレオチド配列は材料と方法の節内の表４に記載されている配列からなる群より選択される配列を含む、又は前記配列から成る。
幾つかの実施形態では前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又は前記連続ヌクレオチド配列は配列番号１３２～２５１（表４に記載されているモチーフ配列を参照されたい）からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成る。
幾つかの実施形態では前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又は前記連続ヌクレオチド配列は配列番号１５３、１５５、１６８、１７１、１７２、１７４、１８３、１８４、１８８、１９０、１９１、１９４、１９５、１９７、２２１、２２４、２２９、２３２、２３９、及び２４４（表４に記載されているモチーフ配列を参照されたい）からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成る。
幾つかの実施形態では前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又は前記連続ヌクレオチド配列は配列番号１７２、１８８、１９０、２２９、及び２３９からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成る。
追加の態様では本発明は（ａ）ＰＡＰＤ５の発現及び／又は活性を阻害する核酸分子と（ｂ）ＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を阻害する核酸分子を含む混合製剤に関する。特定の実施形態ではそれらの核酸分子は本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドから独立して選択される。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号２５２、２５３、２５４、及び２５５のうちの１つ以上から選択されるＰＡＰＤ５標的配列を標的とするより多くのｓｉＲＮＡ分子のうちの１つと（ｂ）配列番号２５６、２５７、２５８、及び２５９のうちの１つ以上から選択されるＰＡＰＤ７標的配列を標的とするより多くのｓｉＲＮＡ分子のうちの１つを含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号２５２、２５３、２５４、及び２５５のうちの１つ以上から選択されるＰＡＰＤ５標的配列を標的とするより多くのｓｉＲＮＡ分子のうちの１つと（ｂ）及び（ｂ）配列番号１５３、１５５、１６８、１７１、１７２、１７４、１８３、１８４、１８８、１９０、１９１、１９４、１９５、１９７、２２１、２２４、２２９、２３２、２３９、及び２４４からなる群より選択されるＰＡＰＤ７標的配列を標的とするより多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちの１つを含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号１５、１８、２３、２５、２６、３０、３２、３９、５４、５６、５８、６５、８０、８８、９２、９３、１１１、１１５、１１６、及び１１８からなる群より選択されるＰＡＰＤ５標的配列を標的とするより多くのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子のうちの１つと（ｂ）配列番号２５６、２５７、２５８、及び２５９のうちの１つ以上から選択されるＰＡＰＤ７標的配列を標的とするより多くのｓｉＲＮＡ分子のうちの１つを含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号２６０、２６１、２６２、２６３、及び２６４のうちの１つ以上から選択されるＰＡＰＤ５標的配列を標的とするより多くのｓｈＲＮＡ分子のうちの１つと（ｂ）配列番号２５６、２５７、２５８、及び２５９のうちの１つ以上から選択されるＰＡＰＤ７標的配列を標的とするより多くのｓｉＲＮＡ分子のうちの１つを含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号２６０、２６１、２６２、２６３、及び２６４のうちの１つ以上から選択されるＰＡＰＤ５標的配列を標的とするより多くのｓｈＲＮＡ分子のうちの１つと（ｂ）配列番号１５３、１５５、１６８、１７１、１７２、１７４、１８３、１８４、１８８、１９０、１９１、１９４、１９５、１９７、２２１、２２４、２２９、２３２、２３９、及び２４４からなる群より選択されるＰＡＰＤ７標的配列を標的とするより多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちの１つを含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号１５、１８、２３、２５、２６、３０、３２、３９、５４、５６、５８、６５、８０、８８、９２、９３、１１１、１１５、１１６、及び１１８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列と（ｂ）配列番号１５３、１５５、１６８、１７１、１７２、１７４、１８３、１８４、１８８、１９０、１９１、１９４、１９５、１９７、２２１、２２４、２２９、２３２、２３９、及び２４４からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号１８、２３、２５、２６、３２、３９、５４、５６、８０、９２、９３、１１６、及び１１８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列と（ｂ）配列番号１５３、１５５、１７２、１７４、１８３、１８８、１９０、１９５、１９７、２２１、２２４、２２９、２３２、及び２４４からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号１８の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列と（ｂ）配列番号２２１の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号２３の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列と（ｂ）配列番号１７２又は１８８の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号２５の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列と（ｂ）配列番号１７４又は１８３の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号２６の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列と（ｂ）配列番号１８３の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号３９の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列と（ｂ）配列番号２２９の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号５４の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列と（ｂ）配列番号１９０又は２３２の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号５６の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列と（ｂ）配列番号１５３又は２４４の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号８０の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列と（ｂ）配列番号１５３又は２４４の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号９２の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列と（ｂ）配列番号１９０又は２３２の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態では前記混合製剤は（ａ）配列番号１１６の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列と（ｂ）配列番号１５５又は１９５の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列を含む。
オリゴヌクレオチドのデザイン
オリゴヌクレオチドデザインとは前記オリゴヌクレオチド配列におけるヌクレオシド糖修飾のパターンのことをいう。本発明のオリゴヌクレオチドは糖修飾ヌクレオシドを含み、ＤＮＡヌクレオシドを含んでもＲＮＡヌクレオシドを含んでもよい。幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチドは糖修飾ヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドを含む。本発明のオリゴヌクレオチドへ修飾ヌクレオシドを組み込むことによって前記標的核酸への前記オリゴヌクレオチドの親和性が増大する場合がある。その場合、それらの修飾ヌクレオシドを親和性増大性修飾ヌクレオチドと呼ぶことができる。それらの修飾ヌクレオシドを単位と呼ぶ場合もある。
一実施形態では前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１個の修飾ヌクレオシド、例えば１～８個の修飾ヌクレオシド、例えば２～８個の修飾ヌクレオシド、例えば３～７個の修飾ヌクレオシド、例えば４～６個の修飾ヌクレオシドを含む。
一実施形態では前記オリゴヌクレオチドは１個以上の糖修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含む。本発明のオリゴヌクレオチドが２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アルコキシ－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アミノ－ＤＮＡヌクレオシド、２’－フルオロ－ＤＮＡヌクレオシド、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ヌクレオシド、２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシド、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立して選択される１個以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含むことが好ましい。それらの１個以上の修飾ヌクレオシドがロックド核酸（ＬＮＡ）であることがさらにより好ましい。
追加の実施形態では前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。好ましい実施形態では前記連続ヌクレオチド配列内の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合又はボラノホスフェートヌクレオシド間結合である。幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチドの連続配列内の全てのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である。
幾つかの実施形態では本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシド、例えば１～８個のＬＮＡヌクレオシド、例えば２～８個のＬＮＡヌクレオシド、例えば３～７個のＬＮＡヌクレオシド、例えば４～６個のＬＮＡヌクレオシドを含む。
幾つかの実施形態では本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシドと少なくとも１個の２’置換修飾ヌクレオシドを含む。
本発明の一実施形態では本発明のオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ Ｈを動員することが可能である。
ギャップマーのデザイン
好ましい実施形態では本発明のオリゴヌクレオチドは本明細書において単に「ギャップマー」とも呼ばれるギャップマーデザイン又はギャップマー構造を有する。ギャップマー構造では前記オリゴヌクレオチドは５’から３’の方向に少なくとも３つの異なる構造領域である５’フランク、ギャップ、及び３’フランク、すなわちＦ－Ｇ－Ｆ’を含む。このデザインではＦ隣接領域とＦ’隣接領域（ウイング領域とも呼ばれる）はＰＡＰＤ５標的核酸又はＰＡＰＤ７標的核酸に対して相補的である修飾ヌクレオシドの連続伸長物を含み、一方でギャップ領域であるＧ領域は前記オリゴヌクレオチドが前記標的核酸と二重鎖になっているときにヌクレアーゼ、好ましくはＲＮａｓｅなどのエンドヌクレアーゼ、例えばＲＮａｓｅ Ｈを動員することが可能であるヌクレオチドの連続伸長物を含む。好ましい実施形態ではそのギャップ領域はＤＮＡヌクレオシドから成る。Ｇ領域の５’末端と３’末端に隣接するＦ領域とＦ’領域は非ヌクレアーゼ動員性ヌクレオシド（３’エンド構造を有するヌクレオシド）を含むことが好ましく、１個以上の親和性増大性修飾ヌクレオシドを含むことがより好ましい。幾つかの実施形態では前記３’フランクは少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシド、好ましくは少なくとも２個のＬＮＡヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態では前記５’フランクは少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態では前記５’隣接領域と前記３’隣接領域の両方がＬＮＡヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態では前記隣接領域内の全てのヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。他の実施形態では前記隣接領域はＬＮＡヌクレオシドと他のヌクレオシドの両方を含んでよく（混合フランク）、例えばＤＮＡヌクレオシド及び／又は２’置換ヌクレオシドなどの非ＬＮＡ修飾ヌクレオシドを含んでよい。この場合、前記ギャップ領域は親和性増大性修飾ヌクレオシド、好ましくはβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡなどのＬＮＡが５’末端と３’末端に隣接した少なくとも５個のＲＮａｓｅ Ｈ動員性ヌクレオシドからなる連続配列（２’エンド構造を有するヌクレオシド、好ましくはＤＮＡ）として規定される。その結果、前記ギャップ領域に隣接する５’隣接領域と３’隣接領域のヌクレオシドは修飾ヌクレオシド、好ましくは非ヌクレアーゼ動員性ヌクレオシド又は高親和性ヌクレオシドである。
Ｆ領域
Ｆ領域（５’フランク又は５’ウイング）はＧ領域の５’末端に取り付けられており、少なくとも１個の修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、又は少なくとも４個の修飾ヌクレオシドを含む、前記修飾ヌクレオシドを含有する、又は前記修飾ヌクレオシドから成る。一実施形態ではＦ領域は１～４個の修飾ヌクレオシド、例えば２～４個の修飾ヌクレオシド、例えば１～３個の修飾ヌクレオシド、例えば１個、２個、３個、又は４個の修飾ヌクレオシドを含む、又は前記修飾ヌクレオシドから成る。そのＦ領域はその領域の５’末端と３’末端に少なくとも１個の修飾ヌクレオシドを有すると規定される。
幾つかの実施形態ではＦ領域内の修飾ヌクレオシドは３’エンド構造を有する。
一実施形態ではＦ領域内の修飾ヌクレオシドのうちの１つ以上が２’修飾ヌクレオシドである。１つの実施形態ではＦ領域内の全てのヌクレオシドが２’修飾ヌクレオシドである。
別の実施形態ではＦ領域は前記２’修飾ヌクレオシドに加えてＤＮＡヌクレオシド及び／又はＲＮＡヌクレオシドを含む。ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むフランクは前記Ｆ領域の５’末端と（Ｇ領域に隣接する）３’末端に２’修飾ヌクレオシドを有することを特徴とする。それらのフランク内のＤＮＡヌクレオシドはＲＮａｓｅ Ｈの動員が可能であってはならない。それらのフランクのうちのＤＮＡヌクレオチド及び／又はＲＮＡヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド内の５’フランク（Ｆ領域）の長さは比較的に長くてもよく、その一方で上記のように２’修飾ヌクレオチドの数を１～４個に維持する。追加の実施形態ではＦ領域内の２’修飾ヌクレオシドのうちの１つ以上が２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ単位、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ単位、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から選択される。
幾つかの実施形態では前記Ｆ領域はＬＮＡと２’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む。これらは混合ウイングオリゴヌクレオチド又は混合フランクオリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い。
本発明の１つの実施形態ではＦ領域内の全ての修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。追加の実施形態ではＦ領域内の全てのヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。追加の実施形態ではＦ領域内のそれらのＬＮＡヌクレオシドはβ－Ｄ－立体配置かα－Ｌ－立体配置のどちらか、又はそれらの組合せのオキシ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、ｃＥＴ、及び／又はＥＮＡからなる群より独立して選択される。好ましい実施形態ではＦ領域は少なくとも１個のβ－Ｄ－オキシＬＮＡ単位をその連続配列の５’末端に含む。追加の好ましい実施形態ではＦ領域はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドから成る。
Ｇ領域
Ｇ領域（ギャップ領域）はＲＮａｓｅ Ｈヌクレアーゼを動員することが可能な４～１８個、又は５～１７個、又は６～１６個、又は８～１２個の連続ヌクレオチド単位を含む、前記連続ヌクレオチド単位を含有する、又は前記連続ヌクレオチド単位から成ることが好ましい。
一実施形態ではヌクレアーゼの動員が可能であるＧ領域内の前記ヌクレオシド単位はＤＮＡ、α－Ｌ－ＬＮＡ、（参照により両方とも本明細書に援用される国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９号明細書及びＶｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １８ （２００８） ２２９６－２３００に記載されるような）Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ、ＡＮＡ及び２’Ｆ－ＡＮＡのようなアラビノース誘導体ヌクレオシド（Ｍａｎｇｏｓ ｅｔ ａｌ． ２００３ Ｊ． ＡＭ． ＣＨＥＭ． ＳＯＣ． １２５， ６５４－６６１）、（参照により本明細書に援用されるＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｓｙｓｔ．， ２００９， １０， １０３９に記載されるような）ＵＮＡ（アンロックド核酸）からなる群より選択される。ＵＮＡはアンロックド核酸であり、典型的にはリボースのＣ２とＣ３との間の結合が取り除かれて非ロック型「糖」残基を形成する。
幾つかの実施形態ではＧ領域は１００％ＤＮＡ単位から成る。
その他の実施形態では前記Ｇ領域はＲＮａｓｅ Ｈ切断を仲介することが可能なＤＮＡと他のヌクレオシドの混合物から成ってよい。
幾つかの実施形態ではＧ領域内のヌクレオシドは２’エンド構造を有する。
Ｆ’領域
Ｆ’領域（３’フランク又は３’ウイング）はＧ領域の３’末端に取り付けられており、少なくとも１個の修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、又は少なくとも４個の修飾ヌクレオシドを含む、前記修飾ヌクレオシドを含有する、又は前記修飾ヌクレオシドから成る。一実施形態ではＦ’領域は１～４個の修飾ヌクレオシド、例えば２～４個の修飾ヌクレオシド、例えば１～３個の修飾ヌクレオシド、例えば１個、２個、３個、又は４個の修飾ヌクレオシドを含む、又は前記修飾ヌクレオシドから成る。そのＦ’領域はその領域の５’末端と３’末端に少なくとも１個の修飾ヌクレオシドを有すると規定される。
幾つかの実施形態ではＦ’領域内の修飾ヌクレオシドは３’エンド構造を有する。
一実施形態ではＦ’領域内の修飾ヌクレオシドのうちの１つ以上が２’修飾ヌクレオシドである。１つの実施形態ではＦ’領域内の全てのヌクレオシドが２’修飾ヌクレオシドである。
別の実施形態ではＦ’領域は前記２’修飾ヌクレオシドに加えてＤＮＡヌクレオシド及び／又はＲＮＡヌクレオシドを含む。ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むフランクは前記Ｆ’領域の５’末端と（Ｇ領域に隣接する）３’末端に２’修飾ヌクレオシドを有することを特徴とする。それらのフランク内のＤＮＡヌクレオシドはＲＮａｓｅ Ｈの動員が可能であってはならない。それらのフランクのうちのＤＮＡヌクレオチド及び／又はＲＮＡヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド内の３’フランク（Ｆ’領域）の長さは比較的に長くてもよく、その一方で上記のように２’修飾ヌクレオチドの数を１～４個に維持する。追加の実施形態ではＦ’領域内の２’修飾ヌクレオシドのうちの１つ以上が２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ単位、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ単位、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から選択される。
幾つかの実施形態では前記Ｆ’領域はＬＮＡと２’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む。これらは混合ウイングオリゴヌクレオチド又は混合フランクオリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い。
本発明の１つの実施形態では全てのＦ’領域内の修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。追加の実施形態ではＦ’領域内の全てのヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。追加の実施形態ではＦ’領域内のそれらのＬＮＡヌクレオシドはβ－Ｄ－立体配置かα－Ｌ－立体配置のどちらか、又はそれらの組合せのオキシ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、ｃＥＴ、及び／又はＥＮＡからなる群より独立して選択される。好ましい実施形態ではＦ’領域は少なくとも２個のβ－Ｄ－オキシＬＮＡ単位をその連続配列の３’末端に含む。追加の好ましい実施形態ではＦ’領域はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドから成る。
Ｄ’領域とＤ”領域
Ｄ’領域とＤ”領域をそれぞれＦ領域の５’末端又はＦ’領域の３’末端に取り付けることが可能である。
Ｄ’領域又はＤ”領域は１個、２個、３個、４個、又は５個の追加のヌクレオチドを独立して含んでよく、それらのヌクレオチドは前記標的核酸に対して相補的でも相補的でなくてもよい。これに関し、幾つかの実施形態では本発明のオリゴヌクレオチドは前記標的の調節が可能であり、追加のヌクレオチドが５’末端及び／又は３’末端に付加されている連続ヌクレオチド配列を含んでよい。そのような追加のヌクレオチドはヌクレアーゼ感受性生物切断性ンカー（リンカーの定義を参照されたい）として機能する場合がある。幾つかの実施形態ではそれらの追加の５’末端及び／又は３’末端ヌクレオチドはホスホジエステル結合で連結されており、それらのヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。別の実施形態ではそれらの追加の５’末端及び／又は３’末端ヌクレオチドはヌクレアーゼ安定性を高めるために、又は合成しやすくするために含まれる場合がある修飾ヌクレオチドである。１つの実施形態では本発明のオリゴヌクレオチドは前記連続ヌクレオチド配列に加えてＤ’領域及び／又はＤ”領域を含む。
本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドを以下の式によって表すことが可能である。
Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＦ1~7－Ｇ4~12－Ｆ’1~7
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’1~3－Ｆ1~7－Ｇ4~12－Ｆ’1~7
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”、特にＦ1~7－Ｇ4~12－Ｆ’1~7－Ｄ”1~3
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”、特にＤ’1~3－Ｆ1~7－Ｇ4~12－Ｆ’1~7－Ｄ”1~3
Ｆ領域、Ｇ領域、Ｆ’領域、Ｄ’領域、及びＤ”領域内のヌクレオシドの好ましい数と種類は上に記載されている。
幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチドは、Ｆ領域とＦ’領域のそれぞれが独立して１単位、２単位、３単位、又は４単位の修飾ヌクレオシド単位から成り、且つ、Ｇ領域は前記オリゴヌクレオチドがＰＡＰＤ５標的核酸又はＰＡＰＤ７標的核酸と二重鎖になっているときにヌクレアーゼを動員することが可能な６～１７ヌクレオシド単位から成り、且つ、ＰＡＰＤ５標的核酸又はＰＡＰＤ７標的核酸に対して相補的である１４～２０ヌクレオチド長のヌクレオチドから成るギャップマーである。
全ての例において前記Ｆ－Ｇ－Ｆ’デザインは、１単位、２単位、又は３単位のＤＮＡ単位などのヌクレオシド単位を含んでよいＤ’領域及び／又はＤ”領域をさらに含んでよい。Ｆ領域とＦ’領域内のヌクレオシドが修飾ヌクレオシドである一方でＧ領域内のヌクレオチドが非修飾ヌクレオシドであることが好ましい。
各デザインにおいて好ましい修飾ヌクレオシドはＬＮＡである。
別の実施形態ではギャップマー中のギャップ内の全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合及び／又はボラノホスフェート結合である。別の実施形態ではギャップマー中のフランク（Ｆ領域とＦ’領域）内の全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合及び／又はボラノホスフェート結合である。別の好ましい実施形態ではギャップマー中のＤ’領域とＤ”領域内の全てのヌクレオシド間結合はホスホジエステル結合である。
本明細書において開示される特定のギャップマーについて、様々な実施形態においてシトシン（Ｃ）残基が５－メチルシトシンであると注釈がつけられているとき、前記オリゴヌクレオチド内に存在するＣのうちの１つ以上が非修飾Ｃ残基であってよい。
本発明のある特定の実施形態について、前記オリゴヌクレオチドはＣＭＰ番号１２＿１～１３１＿１（表３に記載されているオリゴヌクレオチドを参照されたい）を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群より選択される。
本発明のある特定の実施形態について、前記オリゴヌクレオチドはＣＭＰ番号１５＿１、１８＿１、２３＿１、２５＿１、２６＿１、３０＿、３２＿１、３９＿１、５４＿１、５６＿１、５８＿１、６５＿１、８０＿１、８８＿１、９２＿１、９３＿１、１１１＿１、１１５＿１、１１６＿１、及び１１８＿１（表３に記載されているオリゴヌクレオチドを参照されたい）を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群より選択される。
本発明のある特定の実施形態について、前記オリゴヌクレオチドはＣＭＰ番号２３＿１、２６＿１、５４＿１、５６＿１、８０＿１、９３＿１、及び１１５＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群より選択される。
本発明のある特定の実施形態について、前記オリゴヌクレオチドはＣＭＰ番号１３２＿～２５１＿１（表４に記載されているオリゴヌクレオチドを参照されたい）を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群より選択される。
本発明のある特定の実施形態について、前記オリゴヌクレオチドはＣＭＰ番号１５３＿１、１５５＿１、１６８＿１、１７１＿１、１７２＿１、１７４＿１、１８３＿１、１８４＿１、１８８＿１、１９０＿１、１９１＿１、１９４＿１、１９５＿１、１９７＿１、２２１＿１、２２４＿１、２２９＿１、２３２＿１、２３９＿１、及び２４４＿１（表４に記載されているオリゴヌクレオチドを参照されたい）を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群より選択される。
本発明のある特定の実施形態について、前記オリゴヌクレオチドはＣＭＰ番号１７２＿１、１８８＿１、１９０＿１、２２９＿１、及び２３７＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群より選択される。
本発明の一実施形態は（ａ）ＣＭＰ番号１８＿１、２５＿１、２６＿１、３２＿１、３９＿１、５４＿１、５６＿１、８０＿１、９２＿１、９３＿１、１１６＿１、及び１１８＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドと（ｂ）ＣＭＰ番号１５３＿１、１５５＿１、１６８＿１、１７１＿１、１７２＿１、１７４＿１、１８３＿１、１８４＿１、１８８＿１、１９０＿１、１９１＿１、１９４＿１、１９５＿１、１９７＿１、２２１＿１、２２４＿１、２２９＿１、２３２＿１、２３＿１９、及び２４４＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む混合製剤である。
本発明の一実施形態は（ａ）ＣＭＰ番号１８＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物と（ｂ）ＣＭＰ番号２２１＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物を含む混合製剤である。
本発明の一実施形態は（ａ）ＣＭＰ番号２３＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物と（ｂ）ＣＭＰ番号１７２＿１又は１８８＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物を含む混合製剤である。
本発明の一実施形態は（ａ）ＣＭＰ番号２５＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物と（ｂ）ＣＭＰ番号１７４＿１又は１８３＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物を含む混合製剤である。
本発明の一実施形態は（ａ）ＣＭＰ番号２６＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物と（ｂ）ＣＭＰ番号１８３＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物を含む混合製剤である。
本発明の一実施形態は（ａ）ＣＭＰ番号３９＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物と（ｂ）ＣＭＰ番号２２９＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物を含む混合製剤である。
本発明の一実施形態は（ａ）ＣＭＰ番号５４＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物と（ｂ）ＣＭＰ番号１９０＿１又は２３２＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物を含む混合製剤である。
本発明の一実施形態は（ａ）ＣＭＰ番号５６＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物と（ｂ）ＣＭＰ番号１５３＿１又は２４４＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物を含む混合製剤である。
本発明の一実施形態は（ａ）ＣＭＰ番号８０＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物と（ｂ）ＣＭＰ番号１５３＿１又は２４４＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物を含む混合製剤である。
本発明の一実施形態は（ａ）ＣＭＰ番号１１６＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物と（ｂ）ＣＭＰ番号１５５＿１又は１９５＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物を含む混合製剤である。
用途
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の同時阻害によって相乗的効果がＨＢＶ増殖の阻害について生じることが本発明の背景において驚くべきことに示されている。ＰＡＰＤ５の発現だけを低下させると約５０％のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌が減少することが添付実施例によって示されており、同様にＰＡＰＤ５阻害剤を使用して細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡが減少した。ＰＡＰＤ７の発現だけを低下させると１５％以下のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌が減少する。ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の同時ノックダウンによって単一ノックダウンの合計よりも上の相乗的効果がＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌の減少について生じる。理論に捉われるものではないが、理論に捉われるものではないが、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の両タンパク質は高い配列相同性と同じ酵素的機能を有しているのでこの相乗効果は両タンパク質の補正効果に起因する可能性がある。本発明の阻害剤はＨＢｓＡｇ分泌の減少によって慢性ＨＢＶ感染症の発症を抑制する。特に、本発明の阻害剤はＨＢｅＡｇ分泌の阻害により、ＨＢｓＡｇ分泌だけを減少させる化合物と比較してより効率的に慢性ＨＢＶ感染症の発症を抑制する。加えて、母親になる女性においてＨＢｅＡｇを減少させることによってその女性の子供での慢性ＨＢＶ感染症の発症も抑制可能である。したがって、本発明の阻害剤はＨＢｅＡｇ分泌の減少によって慢性ＨＢＶ感染症の発症（例えば、ＨＢＶに感染した母親の子供における慢性ＨＢＶ感染症の発症）を抑制し、且つ、ＨＢＶ感染者の感染性を低下させる。したがって、本発明の１つの態様はＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌を減少させる本明細書において提供される阻害剤に関した。これと一致して本発明の追加の態様は慢性ＨＢＶ感染症の発症を抑制し、且つ、ＨＢＶ感染者の感染性を低下させる本明細書において提供される阻害剤、特に核酸分子又は混合核酸分子に関する。本発明の特定の態様では本明細書において提供される阻害剤はＨＢＶに感染した母親の子供における慢性ＨＢＶ感染症の発症を抑制する。この母親はＨＢｅＡｇ陽性であることが好ましい。
本発明の阻害剤で治療される対象（又は本発明の阻害剤を予防目的で受容する対象）はヒトであることが好ましく、ＨＢｓＡｇ陽性及び／又はＨＢｅＡｇ陽性のヒト患者であることがより好ましく、ＨＢｓＡｇ陽性及びＨＢｅＡｇ陽性のヒト患者であることがさらにより好ましい。前記ヒト患者は母親になる女性、例えばＨＢｅＡｇ陽性及び／又はＨＢｓＡｇ陽性である母親になる女性であってよく、より好ましくはＨＢｅＡｇ陽性及びＨＢｓＡｇ陽性である母親になる女性であってよい。
本発明の１つの実施形態はＨＢＶ感染症、特に慢性ＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に使用するためのＰＡＰＤ５阻害剤、特にＰＡＰＤ５の発現及び／又は活性を阻害する核酸分子に関する。本発明の追加の実施形態はＨＢＶ感染症、特に慢性ＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に使用するためのＰＡＰＤ５の阻害剤とＰＡＰＤ７の阻害剤を含む混合製剤に関する。好ましい実施形態ではＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に使用するための前記混合組成物は（ａ）ＰＡＰＤ５の発現及び／又は活性を阻害する核酸分子と（ｂ）ＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を阻害する核酸分子を含む。したがって、本発明はＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に同時又は順次使用するためのＰＡＰＤ５の阻害剤とＰＡＰＤ７の阻害剤を含む混合製剤に関する。
本発明は（ａ）ＰＡＰＤ５の発現及び／又は活性を阻害する核酸分子と（ｂ）ＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を阻害する核酸分子を含む混合製剤にも関する。本発明の背景ではＨＢＶ感染症を治療（例えば改善）するために前記混合製剤を使用することを企図している。本発明の阻害剤に関連して本明細書において開示される定義は必要な変更が加えられて本発明の混合製剤に適用される。前記混合製剤はＰＡＰＤ５阻害剤である分子とＰＡＰＤ７阻害剤である別の分子（例えば、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの２種類の別個のＲＮＡｉ分子、又は２種類の別個の小分子）を含んでよい。これらの２種類の別個の阻害剤は１つの単位内に、例えば１つの丸剤又はバイアル瓶内に製剤されてよい。あるいは、これらの２種類の別個の阻害剤は別々の単位内に、例えば別々の丸剤又はバイアル瓶内に個別に製剤されてよい。それらの２種類の阻害剤の相乗効果が達成されることを条件としてそれらの２種類の別個の阻害剤は一緒に（すなわち同時に）投与されても別々に（すなわち順次に）投与されてもよい。本発明の１つの態様では無薬品対照と比較して（すなわち薬品が投与されていない細胞又は対象と比較して）前記混合製剤によって少なくとも５０％のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌の減少が生じる。
本発明はＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に使用するための医薬組成物にも関し、その場合に前記医薬組成物は
（ｉ）本発明の阻害剤又は本発明の混合製剤、及び
（ｉｉ）所望により薬学的に許容可能な担体
を含む。
したがって、本発明はＨＢＶ感染症を治療及び／又は予防する方法であって、そのような処置を必要とする対象に本発明の阻害剤、特に核酸分子、前記阻害剤の複合体、本発明の医薬組成物、又は本発明の混合製剤の有効量を投与することを含む前記方法に関する。
本発明は医薬品を製造するために本発明の阻害剤、特に核酸分子を使用すること、前記阻害剤の複合体を使用すること、本発明の医薬組成物を使用すること、又は本発明の混合製剤を使用することも提供する。好ましい実施形態ではその医薬品は皮下投与用の剤形で製造され、混合製剤のためにＰＡＰＤ５阻害剤とＰＡＰＤ７阻害剤の比率は重量比で１：１である。
本発明は、静脈内投与用の剤形であり、且つ、混合製剤のためにＰＡＰＤ５阻害剤とＰＡＰＤ７阻害剤の比率が重量比で１：１である医薬品の製造について記載されるように本発明の阻害剤、特に核酸分子を使用すること、前記阻害剤の複合体を使用すること、本発明の医薬組成物を使用すること、又は本発明の混合製剤を使用することも提供する。
本発明の阻害剤、本発明の混合製剤、又は本発明の医薬組成物は混合療法に使用可能である。例えば、本発明の阻害剤、本発明の混合製剤、又は本発明の医薬組成物はインターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンアルファ－２ａ、及びインターフェロンアルファコン－１（ＰＥＧ化型及び非ＰＥＧ化型）、リバビリン、ラミブジン（３ＴＣ）、エンテカビル、テノホビル、テルビブジン（ＬｄＴ）、アデホビルなどの他のＨＢＶ剤、又はＨＢＶ ＲＮＡ複製阻害剤、ＨＢｓＡｇ分泌阻害剤、ＨＢＶカプシド阻害剤、アンチセンスオリゴマー（例えば国際公開第２０１２／１４５６９７号パンフレット及び国際公開第２０１４／１７９６２９号パンフレットに記載されている）、ｓｉＲＮＡ（例えば国際公開第２００５／０１４８０６号パンフレット、国際公開第２０１２／０２４１７０号パンフレット、国際公開第２０１２／２０５５３６２号パンフレット、国際公開第２０１３／００３５２０号パンフレット、国際公開第２０１３／１５９１０９号パンフレット、国際公開第２０１７／０２７３５０号パンフレット、及び国際公開第２０１７／０１５１７５号パンフレットに記載される）、ＨＢＶ治療ワクチン、ＨＢＶ予防ワクチン、ＨＢＶ抗体療法（モノクローナル又はポリクローナル）、若しくはＨＢＶの治療及び／若しくは予防用のＴＬＲ２、３、７、８、若しくは９のアゴニストなどの他の新興抗ＨＢＶ剤と混合可能である。
ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の下方制御にはＨＢＶ感染細胞におけるＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇ並びに細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡの生産の減少が付随することが添付実施例によって実証されている。これらの結果は、例えばＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の阻害剤を用いる治療が進行中であるか、又は実施された場合にＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性がＨＢＶ感染症の治療中の治療成果の監視に使用可能であることを示している。したがって、本発明はＨＢＶ感染症の治療中に治療成果を監視するための方法であって、
（ａ）検査対象から得られた試料においてＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性を分析すること、
（ｂ）少なくとも１人の基準対象のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性に対応する基準データと前記量及び／又は活性を比較すること、及び
（ｃ）工程（ｂ）の比較に基づいて治療成果を予測すること
を含む前記方法に関する。
本発明の監視方法では検査対象はＨＢＶ感染症向けの薬物治療を受けている人間、又はＨＢＶ感染症向けの薬物治療を受けた人間であり得る。その薬物治療は上記の抗ＨＢＶ剤を含んでよい。その薬物治療はＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の阻害剤を含んでもよい。
本発明の監視方法では基準データは少なくとも１人の基準対象の試料におけるＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性に相当してよい。前記試料は血液又は肝臓生検試料であってよい。
本発明の１つの態様は、前記少なくとも１人の基準対象がＨＢＶ感染症であるがＨＢＶ感染症向けの薬物治療を受けたことが無く、且つ、前記基準データと比較して減少した前記検査対象のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性が工程（ｃ）においてＨＢＶ感染症の治療における治療成果を表す本発明の監視方法に関する。例えば、前記減少したＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性は、前記検査対象の試料中のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性が前記少なくとも１人の基準対象の試料中のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性の０～９０％であることを意味し得る。例えば、前記減少したＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性は前記少なくとも１人の基準対象の試料中のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性の０～８０％、好ましくは０～７０％、より好ましくは０～６０％、さらにより好ましくは０～５０％、さらにより好ましくは０～４０％、さらにより好ましくは０～３０、さらにより好ましくは０～２０％、及び最も好ましくは０～１０％であり得る。
本発明の別の態様は、前記少なくとも１人の基準対象がＨＢＶ感染症であってＨＢＶ感染症向けの薬物治療を受けたことがあり、且つ、前記基準データと比較して同一又は類似の前記検査対象のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性が工程（ｃ）においてＨＢＶ感染症の治療における治療成果を表す本発明の監視方法に関する。本発明の追加の態様は、前記少なくとも１人の基準対象がＨＢＶ感染症ではなく、且つ、前記基準データと比較して同一又は類似の前記検査対象のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性が工程（ｃ）においてＨＢＶ感染症の治療における治療成果を表す本発明の監視方法に関する。同一又は類似のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性は、前記検査対象の試料中のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性が前記少なくとも１人の基準対象の試料中のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性の９０～１１０％であることを意味し得る。例えば、前記同一又は類似のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性は前記少なくとも１人の基準対象の試料中のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性の９５～１０５％であり得る。
本発明は、ＨＢＶ感染症を予防及び／又は治療（例えば改善）する化合物の特定及び／又は特徴解析のために使用可能である、ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の発現が上昇した、低下した、又は存在しない細胞又は非ヒト動物（例えばマウス、ラット、フェレット、又はウサギ）も包含する。例えば、前記細胞又は非ヒト動物は、例えば発現ベクター内にクローン化されており、且つ、外来性プロモーターに機能可能であるように結合された、ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７をコードする外来性ヌクレオチド配列を含んでよい。前記細胞又は非ヒト動物はＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７、好ましくはＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を過剰発現してよい。あるいは、前記細胞又は非ヒト動物はＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７のノックダウン、好ましくはＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７のノックダウンを有してよい。
本発明の実施形態
したがって、本発明は以下の項目に関する。
１．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物を特定するための方法であって、
（ａ）ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７を発現する細胞と被験化合物を接触させること、
（ｂ）前記被験化合物が存在する状態と存在しない状態でＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を測定すること、及び
（ｃ）ＨＢＶ感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物としてＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を低下させる化合物を特定すること
を含む前記方法。
２．（ｃ）において特定された混合化合物のＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を低下させる能力を検査する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
３．ＰＡＰＤ５がＰＡＰＤ５標的核酸である、項目１又は２に記載の方法。
４．前記ＰＡＰＤ５標的核酸が
（ａ）配列番号４、５、又は１０のヌクレオチド配列、又はその天然変異体、
（ｂ）少なくとも８０％の同一性を（ａ）のヌクレオチド配列に対して有するヌクレオチド配列であって、ポリＡポリメラーゼ機能を有するポリペプチドを発現する前記核酸配列、
（ｃ）配列番号４、５、又は１０を含む、又は前記配列番号から成るヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１又は２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｅ）少なくとも８０％の同一性を配列番号１又は２に対して有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、ポリＡポリメラーゼ機能を有するポリペプチドがそのポリヌクレオチドによってコードされる前記ヌクレオチド配列、
（ｆ）配列番号７又は８など、配列番号１又は２の酵素活性断片をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｇ）少なくとも８０％の同一性を配列番号７又は８など、配列番号１又は２の酵素活性断片のアミノ酸配列に対して有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、ポリＡポリメラーゼ機能を有するポリペプチドがそのポリヌクレオチドによってコードされる前記ヌクレオチド配列
を含む、又は前記ヌクレオチド配列から成る、項目３に記載の方法。
５．ＰＡＰＤ７がＰＡＰＤ７標的核酸である、項目１又は２に記載の方法。
６．前記ＰＡＰＤ７標的核酸が
（ａ）配列番号６又は１１のヌクレオチド配列、又はその天然変異体、
（ｂ）少なくとも８０％の同一性を（ａ）のヌクレオチド配列に対して有するヌクレオチド配列であって、ポリＡポリメラーゼ機能を有するポリペプチドを発現する前記核酸配列、
（ｃ）配列番号６又は１１を含む、又は前記配列番号から成るヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｅ）少なくとも８０％の同一性を配列番号３に対して有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、ポリＡポリメラーゼ機能を有するポリペプチドがそのポリヌクレオチドによってコードされる前記ヌクレオチド配列、
（ｆ）配列番号９など、配列番号３の酵素活性断片をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｇ）少なくとも８０％の同一性を配列番号９など、配列番号３の酵素活性断片のアミノ酸配列に対して有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、ポリＡポリメラーゼ機能を有するポリペプチドがそのポリヌクレオチドによってコードされる前記ヌクレオチド配列
を含む、又は前記ヌクレオチド配列から成る、項目５に記載の方法。
７．前記細胞が真核細胞である、項目１～６の何れか一項に記載の方法。
８．ＨＢＶの増殖を阻害する前記化合物がＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の分泌を阻害し、ＨＢＶエンベロープ抗原（ＨＢｅＡｇ）の分泌を阻害し、且つ／又は細胞内ＨＢＶｍＲＮＡ若しくはＨＢＶ ＤＮＡの生産を阻害する、項目１～７の何れか一項に記載の方法。
９．前記被験化合物が
（ａ）一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は
（ｂ）ｓｉＲＮＡ分子、及び
（ｃ）ｓｈＲＮＡ分子
から選択される核酸分子より成るスクリーニングライブラリーである、項目１～８の何れか一項に記載の方法。
１０．項目１の工程（ｃ）において特定された化合物によってＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ又はＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの発現が少なくとも５０％減少する、項目１～９の何れか一項に記載の方法。
１１．前記被験化合物がＰＡＰＤ５を減少させることが可能な核酸分子とＰＡＰＤ７を減少させることが可能な核酸分子の混合製剤である、項目１～１０の何れか一項に記載の方法。
１２．前記混合製剤によってＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ抗原（ＨＢｅＡｇ）、及び／又は細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡ若しくはＨＢＶ ＤＮＡが少なくとも７０％減少する、項目１１に記載の方法。
１３．前記被験化合物を対照に対して比較する工程がさらに含まれる、項目１～１２の何れか一項に記載の方法。
１４．前記対照がＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を低下させない不活性被験化合物である、項目１３に記載の方法。
１５．ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の活性がポリＡポリメラーゼ機能である、項目１～１４の何れか一項に記載の方法。
１６．ＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に使用するためのＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の阻害剤であって、
（ａ）ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子、又は
（ｂ）次のものを含むゲノム編集装置
（ｉ）部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼ、又は部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ガイドＲＮＡ、又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
である前記阻害剤。
１７．前記阻害剤が
（ａ）一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｂ）ｓｉＲＮＡ分子、及び
（ｃ）ｓｈＲＮＡ分子
からなる群より選択されるＲＮＡｉ分子である、項目１６に記載の使用のための阻害剤。
１８．前記阻害剤が、を含む混合製剤である、項目１６又は１７に記載の使用のための阻害剤。
（ａ）ＰＡＰＤ５の発現及び／又は活性を阻害するＲＮＡｉ分子、及び
（ｂ）ＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を阻害するＲＮＡｉ分子
１９．前記阻害剤によってＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌が減少する、項目１６～１８の何れか一項に記載の使用のための阻害剤。
２０．前記阻害剤によって細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡ又はＨＢＶ ＤＮＡの生産が減少する、項目１６～１８の何れか一項に記載の使用のための阻害剤。
２１．前記阻害剤によって慢性ＨＢＶ感染症の発症が抑制され、且つ／又はＨＢＶ感染者の感染性が低下する、項目１６～２０の何れか一項に記載の使用のための阻害剤。
２２．１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列であって、ＰＡＰＤ５標的核酸に対して少なくとも８０％相補的である前記連続ヌクレオチド配列を含み、又は前記連続ヌクレオチド配列から成り、且つ、ＰＡＰＤ５の発現を低下させることが可能であるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡ分子。
２３．１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列であって、ＰＡＰＤ７標的核酸に対して少なくとも８０％相補的である前記連続ヌクレオチド配列を含み、又は前記連続ヌクレオチド配列から成り、且つ、ＰＡＰＤ７の発現を低下させることが可能である核酸分子。
２４．前記核酸分子が一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目２３に記載の核酸分子。
２５．前記オリゴヌクレオチドが配列番号４、５、及び１０からなる群より選択される標的核酸に対して－１０ｋｃａｌ未満のΔＧ°でハイブリダイズ可能である、項目２２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２６．前記オリゴヌクレオチドが配列番号６又は１１からなる群より選択される標的核酸に対して－１０ｋｃａｌ未満のΔＧ°でハイブリダイズ可能である、項目２３又は２４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２７．前記標的核酸がＲＮＡである、項目２２～２６の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２８．前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、項目２７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２９．前記ｍＲＮＡがプレｍＲＮＡ又は成熟ｍＲＮＡである、項目２８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３０．前記連続ヌクレオチド配列が１２～２２個のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成る、項目２２～２９の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３１．前記連続ヌクレオチド配列が１４～２０個のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成る、項目３０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３２．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが１２～２５ヌクレオチド長のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成る、項目２２～３１の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３３．前記オリゴヌクレオチド又は前記連続ヌクレオチド配列が一本鎖である、項目２２～３２の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３４．前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡでも自己相補性でもない、項目２２～３３の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３５．前記連続ヌクレオチド配列が配列番号１２～１３１から選択される配列を含む、又は前記配列から成る、項目２２又は２５の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３６．前記連続ヌクレオチド配列が配列番号１５、１８、２３、２５、２６、３０、３２、３９、５４、５６、５８、６５、８０、８８、９２、９３、１１１、１１５、１１６、及び１１８から選択される配列を含む、又は前記配列から成る、項目３５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３７．前記連続ヌクレオチド配列が配列番号１３２～１５１から選択される配列を含む、又は前記配列から成る、項目２３、２４、又は２６の何れか一項に記載の核酸分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３８．前記連続ヌクレオチド配列が配列番号１５３、１５５、１６８、１７１、１７２、１７４、１８３、１８４、１８８、１９０、１９１、１９４、１９５、１９７、２２１、２２４、２２９、２３２、２３９、及び２４４から選択される配列を含む、又は前記配列から成る、項目３７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３９．前記連続ヌクレオチド配列が相補的である前記標的核酸と比較して前記連続ヌクレオチド配列が０～３のミスマッチを有する、項目２２～３８の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子。
４０．前記連続ヌクレオチド配列が前記標的核酸と比較して１ミスマッチを有する、項目３９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４１．前記連続ヌクレオチド配列が前記標的核酸配列に対して完全に相補的である、項目３９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４２．１個以上の修飾ヌクレオシドを含む、項目２２～４１の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４３．前記１個以上の修飾ヌクレオシドが高親和性修飾ヌクレオシドである、項目４２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４４．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、項目２２～４３の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４５．前記修飾ヌクレオシド間結合がヌクレアーゼ耐性である、項目４４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４６．前記連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％がホスホロチオエートヌクレオシド間結合又はボラノホスフェートヌクレオシド間結合である、項目４４又は４５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４７．前記連続ヌクレオチド配列内の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、項目４４又は４５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４８．前記オリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ Ｈの動員が可能である、項目２２～４７の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４９．前記オリゴヌクレオチドがギャップマーである、項目４８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５０．前記オリゴヌクレオチドが式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーであり、Ｆ領域とＦ’領域は独立して１～４個の修飾ヌクレオシドを含み、又は前記修飾ヌクレオシドから成り、Ｇ領域はＲＮａｓｅ Ｈの動員が可能な６ヌクレオシドと１７ヌクレオシドの間の領域である、項目４８又は４９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５１．前記修飾ヌクレオシドが２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アルコキシ－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アミノ－ＤＮＡヌクレオシド、２’－フルオロ－ＤＮＡヌクレオシド、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ヌクレオシド、２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシド、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立して選択される２’糖修飾ヌクレオシドである、項目４２～４４又は項目５０の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５２．Ｆ領域内とＦ’領域内の修飾ヌクレオシドのうちの１つ以上がＬＮＡヌクレオシドである、項目５０又は５１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５３．Ｆ領域内とＦ’領域内の全ての修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、項目５２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５４．Ｆ領域とＦ’領域がＬＮＡヌクレオシドから成る、項目５３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５５．前記ＬＮＡヌクレオシドがβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、α－Ｌ－オキシ－ＬＮＡ、β－Ｄ－アミノ－ＬＮＡ、α－Ｌ－アミノ－ＬＮＡ、β－Ｄ－チオ－ＬＮＡ、α－Ｌ－チオ－ＬＮＡ、（Ｓ）ｃＥＴ、（Ｒ）ｃＥＴβ－Ｄ－ＥＮＡ、及びα－Ｌ－ＥＮＡから選択される、項目５１～５４の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５６．前記ＬＮＡヌクレオシドがオキシ－ＬＮＡである、項目５１～５４の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
５７．前記ＬＮＡヌクレオシドがβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである、項目５１～５６の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５８．前記ＬＮＡヌクレオシドがチオ－ＬＮＡである、項目５１～５４の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５９．前記ＬＮＡヌクレオシドがアミノ－ＬＮＡである、項目５１～５４の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６０．前記ＬＮＡヌクレオシドがｃＥＴである、項目５１～５４の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６１．前記ＬＮＡヌクレオシドがＥＮＡである、項目５１～５４の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６２．Ｆ領域とＦ’領域のうちの少なくとも一方が２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、及び２’－フルオロ－ＤＮＡからなる群より独立して選択される少なくとも１個の２’置換修飾ヌクレオシドをさらに含む、項目５２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６３．Ｇ領域内のＲＮａｓｅ Ｈ動員性ヌクレオシドがＤＮＡ、α－Ｌ－ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ、ＡＮＡと２’Ｆ－ＡＮＡ、及びＵＮＡから独立して選択される、項目５２～６２の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６４．Ｇ領域内の前記ヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドである、項目５０又は６３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６５．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＭＰ番号１２＿１～１３１＿１から選択される、項目２２又は２５の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６６．前記アンチセンス化合物がＣＭＰ番号１５＿１、１８＿１、２３＿１、２５＿１、２６＿１、３０＿、３２＿１、３９＿１、５４＿１、５６＿１、５８＿１、６５＿１、８０＿１、８８＿１、９２＿１、９３＿１、１１１＿１、１１５＿１、１１６＿１、及び１１８＿１から選択される、項目６５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６７．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＭＰ番号１３２＿～１５１＿１から選択される、項目２４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６８．前記アンチセンス化合物がＣＭＰ番号１５３＿１、１５５＿１、１６８＿１、１７１＿１、１７２＿１、１７４＿１、１８３＿１、１８４＿１、１８８＿１、１９０＿１、１９１＿１、１９４＿１、１９５＿１、１９７＿１、２２１＿１、２２４＿１、２２９＿１、２３２＿１、２３９＿１、及び２４４＿１から選択される、項目６７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６９．前記ｓｉＲＮＡ分子が配列番号２５２、２５３、２５４、及び２５５のうちの１つ以上から選択されるＰＡＰＤ５標的配列を標的とする、項目２２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
７０．前記核酸分子が配列番号２５６、２５７、２５８、及び２５９のうちの１つ以上から選択されるＰＡＰＤ７標的配列を標的とするｓｉＲＮＡ分子である、項目２３に記載の核酸分子。
７１．請求項２２～７０の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡ、及び前記オリゴヌクレオチドに共有結合している少なくとも１つの結合部分を含む複合体。
７２．前記結合部分が炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、高分子物質、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウイルスタンパク質、又はそれらの組合せから選択される、項目７１に記載の複合体。
７３．前記結合部分がアシアロ糖タンパク質受容体に結合可能である、項目７１又は７２に記載の複合体。
７４．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと前記結合部分との間に配置されているリンカーを含む、項目７１～７３の何れか一項に記載の複合体。
７５．前記リンカーが生理学的に不安定なリンカーである、項目７４に記載の複合体。
７６．前記生理学的に不安定なリンカーがヌクレアーゼ感受性リンカーである、項目７５に記載の複合体。
７７．前記オリゴヌクレオチドが式Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’又は式Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”を有し、Ｆ、Ｆ’及びＧが項目５２～６５の何れか一項において規定されている通りであり、且つ、Ｄ’又はＤ”が１個、２個、又は３個のＤＮＡヌクレオシドをホスホロチオエートヌクレオシド間結合と共に含む、項目７５又は７６に記載の複合体。
７８．混合製剤であって、
（ａ）ＰＡＰＤ５の発現及び／又は活性を阻害するＲＮＡｉ分子、及び
（ｂ）ＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を阻害するＲＮＡｉ分子
を含む前記混合製剤。
７９．前記ＲＮＡｉ分子が項目２２～７０から、又は項目７１～７７の何れか一項に記載の複合体から選択される、項目７８に記載の混合製剤。
８０．前記（ａ）のＲＮＡｉ分子が項目３６又は６６に記載のアンチセンス化合物であり、前記（ｂ）のＲＮＡｉ分子が項目３８又は６８に記載のアンチセンス化合物である、項目７８に記載の混合製剤。
８１．項目２２～７０の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはｓｉＲＮＡ分子又は項目７１～７７の何れか一項に記載の複合体又は項目７８～８０に記載の混合製剤と所望により薬学的に許容可能な希釈剤、担体、塩、及び／又はアジュバントを含む医薬製剤。
８２．ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７を発現している標的細胞におけるＰＡＰＤ５発現及び／又はＰＡＰＤ７発現を調節するためのインビボ又はインビトロの方法であって、項目２２～７０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはｓｉＲＮＡ分子又は項目７１～７７に記載の複合体又は項目７８若しくは７９に記載の混合製剤又は項目８１に記載の医薬製剤の有効量を前記細胞に投与することを含む前記方法。
８３．疾患を治療又は予防するための方法であって、前記疾患にかかっている、又はかかりやすい対象に項目２２～７０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはｓｉＲＮＡ分子又は項目７１～７７に記載の複合体又は項目７８～８０に記載の混合製剤又は項目８１に記載の医薬製剤の治療有効量又は予防有効量を投与することを含む前記方法。
８４．対象において疾患を治療又は予防するための医薬品として使用される項目２２～７０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはｓｉＲＮＡ分子、又は項目７１～７７に記載の複合体、又は項目７８～８０に記載の混合製剤、又は項目８１に記載の医薬製剤。
８５．対象において疾患を治療又は予防するための医薬品を調製するための項目２２～７０に記載のオリゴヌクレオチド若しくはｓｉＲＮＡ分子又は項目７１～７７に記載の複合体又は項目７８～８０に記載の混合製剤の使用。
８６．項目２２～７０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはｓｉＲＮＡ分子又は項目７１～７７に記載の複合体又は項目７８～８０に記載の混合製剤を使用しない場合の発現と比較してＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７が少なくとも３０％、又は少なくとも又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少する、項目８３～８５の何れか一項に記載の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は使用。
８７．前記疾患がＨＢＶ感染症、特に慢性ＨＢＶ感染症から選択される、項目８３～８５に記載の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は使用。
８８．ＨＢＶ感染症の治療中に治療成果を監視するための方法であって、
（ａ）検査対象から得られた試料においてＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性を分析すること、
（ｂ）少なくとも１人の基準対象のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性に対応する基準データと前記量及び／又は活性を比較すること、及び
（ｃ）工程（ｂ）の比較に基づいて治療成果を予測すること
を含む前記方法。
８９．前記検査対象がＨＢＶ感染症向けの薬物治療を受けている、又はＨＢＶ感染症向けの薬物治療を受けたことがある人間である、項目８８に記載の監視方法。
９０．前記基準データが少なくとも１人の基準対象の試料におけるＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性に相当する、項目８８又は８９に記載の監視方法。
９１．前記少なくとも１人の基準対象がＨＢＶ感染症であるがＨＢＶ感染症向けの薬物治療を受けたことが無く、且つ、前記基準データと比較して減少した前記検査対象のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性が工程（ｃ）においてＨＢＶ感染症の治療における治療成果を表す、項目８８～９０の何れか一項に記載の監視方法。
９２．前記ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性の減少とは、前記検査対象の試料中のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性が前記少なくとも１人の基準対象の試料中のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性の０～９０％であるという意味である、項目９１に記載の監視方法。
９３．前記少なくとも１人の基準対象がＨＢＶ感染症であってＨＢＶ感染症向けの薬物治療を受けたことがあり、且つ、前記基準データと比較して同一又は類似の前記検査対象のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性が工程（ｃ）においてＨＢＶ感染症の治療における治療成果を表す、項目８８～９０の何れか一項に記載の監視方法。
９４．前記少なくとも１人の基準対象がＨＢＶ感染症ではなく、且つ、前記基準データと比較して同一又は類似の前記検査対象のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性が工程（ｃ）においてＨＢＶ感染症の治療における治療成果を表す、項目８８～９０の何れか一項に記載の監視方法。
９５．前記同一又は類似のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性とは、前記検査対象の試料中のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性が前記少なくとも１人の基準対象の試料中のＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の量及び／又は活性の９０～１１０％であるという意味である、項目９３又は９４に記載の監視方法。
医薬組成物
上で説明したように、本発明はＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に使用するためのＰＡＰＤ５の阻害剤を単独で、又はＰＡＰＤ７阻害剤と組み合わせて含む組成物に関する。その阻害剤は本明細書において規定される核酸分子であることが好ましい。具体的にはＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に使用するためのＰＡＰＤ５の阻害剤とＰＡＰＤ７の阻害剤を含む混合製剤が企図されており、前記阻害剤組成物又は前記混合製剤を含む医薬組成物が企図されている。前記医薬組成物（すなわち医薬品）は薬学的に許容可能な担体を所望により含む。前記医薬組成物は治療上許容可能な希釈剤、塩、賦形剤及び／又はアジュバントをさらに含んでよい。
典型的な医薬組成物はＰＡＰＤ５阻害剤だけを担体若しくは賦形剤と、又はＰＡＰＤ７阻害剤と共に混合して調製される。適切な担体及び賦形剤は当業者によく知られており、例えばＡｎｓｅｌ， Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ： Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２００４、Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ： Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２０００、及びＲｏｗｅ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ， Ｃｈｉｃａｇｏ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ， ２００５において詳細に記載されている。それらの製剤は１種類以上の緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、滑沢剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、抗酸化剤、不透明化剤、滑材、加工助剤、着色料、甘味料、芳香剤、香味剤、希釈剤、及び薬品の外観の改善又は医薬品（すなわち医薬）の製造の補助のための他の公知の添加物を含んでもよい。例えば、本発明の医薬組成物は、生理学的に許容可能な担体、すなわち適切な投与形態に用いられる投薬量と濃度では受容者にとって無毒である担体とＰＡＰＤ５の阻害剤及び／又はＰＡＰＤ７の阻害剤を外界温度、適切なｐＨ、及び所望の純度で混合することで製剤可能である。本発明の医薬組成物は無菌であってよい。
核酸分子について適切な製剤がＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、第１７版、１９８５年内に見られる。薬品送達のための方法についての簡単な概説については例えばＬａｎｇｅｒの著作（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３， １９９０）を参照されたい。国際公開第２００７／０３１０９１号パンフレット（参照により本明細書に援用）は薬学的に許容可能な希釈剤、担体、及びアジュバントについてのさらに適切で好ましい例を提供する。適切な投薬量、製剤、投与経路、組成、剤形、他の治療薬との組合せ、プロドラッグ製剤も国際公開第２００７／０３１０９１号パンフレット内に提示されている。
本発明による化合物は薬学的に許容可能なそれらの塩の形態で存在し得る。「薬学的に許容可能な塩」という言葉は、本発明の化合物の生物学的有効性と特性を保持し、且つ、適切な無毒の有機酸又は無機酸又は有機塩基又は無機塩基から形成される従来の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。酸付加塩には例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、及び硝酸などの無機酸に由来する酸付加塩、及びｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸等のような有機酸に由来する酸付加塩が含まれる。塩基付加塩には、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、及び例えば水酸化テトラメチルアンモニウムなどの第四級アンモニウムヒドロキシドに由来する塩基付加塩が含まれる。医薬化合物の塩への化学修飾は化合物の改善された物理的及び化学的安定性、吸湿性、流動性、及び溶解性を得るために製薬化学者によく知られている技術である。その技術は例えばＢａｓｔｉｎ著、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０００年、第４巻、４２７～４３５頁、又はＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第６版（１９９５年）内のＡｎｓｅｌ著、１９６頁及び１４５６～１４５７頁に記載されている。例えば、本明細書において提供される化合物の薬学的に許容可能な塩はナトリウム塩であり得る。
本発明の医薬組成物は適正医療実施規範に合致するように製剤化され、調剤され、投与される。この状況で考慮される因子には治療を受ける特定の哺乳類動物、個々の患者の臨床状態、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、患者の年齢と性別、及び医療従事者に公知の他の因子が含まれる。本明細書において、「有効量」（「（治療）有効用量」としても知られる）は医師又は他の臨床家によって求められている対象の生物学的又は医学的応答を誘発することになる化合物の量を意味する。本発明の阻害剤、本発明の混合製剤、又は本発明の医薬組成物の「有効量」はそのような考慮事項によって左右されることになり、ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇを阻害するために必要な最小量である。例えば、そのような量は受容者の細胞にとって有毒であるか、又はその哺乳類動物全体にとって有毒である量よりも少ない量であってよい。
例えば、ＰＡＰＤ５阻害剤又はＰＡＰＤ７阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである場合、投与される薬学的有効量は０．１～１５ｍｇ／ｋｇの用量、例えば０．２～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５～５ｍｇ／ｋｇの用量である。その投与は週に一回、２週に一回、３週に一回、又は月に一回であり得る。
本発明の核酸分子又は医薬組成物は局所投与（皮膚投与、吸入、点眼、又は点耳等）可能であり、又は腸内投与（経口投与又は胃腸管を通過する投与等）可能であり、又は非経口投与（静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、脳内投与、脳室内投与、又は髄腔内投与等）可能である。
好ましい実施形態では本発明の核酸分子又は医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内の注射又は注入、髄腔内投与、又は頭蓋内投与、例えば脳内投与、脳室内投与、若しくは硝子体内投与をはじめとする非経口経路によって投与される。１つの実施形態では前記活性オリゴヌクレオチド又は前記オリゴヌクレオチド複合体は静脈内投与される。別の実施形態では前記活性核酸分子又は前記核酸分子複合体は皮下投与される。
本発明の阻害剤、本発明の混合製剤、又は本発明の医薬組成物はＨＢＶ発明の予防及び／又は治療に有用である。それらはＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの分泌を阻害することが好ましく、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌を阻害することが最も好ましい。
定義
ヌクレオチド配列
「ヌクレオチド配列」又は「ポリヌクレオチド」という用語は当技術分野において一般的に知られており、その用語はＤＮＡ及びＲＮＡなどの天然分子を含む、又はそれらから成る分子、並びに例えばオリゴヌクレオチドチオホスフェート、置換リボオリゴヌクレオチド、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＧＮＡ（グリコール核酸）分子、ＴＮＡ（トレオース核酸）分子、モルホリノポリヌクレオチドなどの核酸類似体、又はポリシロキサン及び２’－Ｏ－（２－メトキシ）エチル－ホスホロチオエートなどの修飾型骨格を有する核酸、又はメチルヌクレオシド、チオヌクレオシド、サルフェートヌクレオシド、ベンゾイルヌクレオシド、フェニルヌクレオシド、アミノヌクレオシド、プロピルヌクレオシド、クロロヌクレオシド、及びメタノカルバヌクレオシドなどの置換基を有する核酸、又は検出を容易にするためのレポーター分子を含む、又はそれらから成る分子を含む。さらに、「ヌクレオチド配列」という用語は本発明の背景では「核酸分子」という用語と同等に解釈されるものとされ、その用語は具体的にＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、又はＬＮＡ、又はそれらのハイブリッド、又は当技術分野において知られているそれらのあらゆる修飾物を指すことができる（例えば修飾物について例えば米国特許第５５２５７１１号明細書、米国特許第４７１１９５５号明細書、米国特許第５７９２６０８号明細書、欧州特許第３０２１７５号明細書を参照されたい）。本明細書において記載され、提供される核酸配列に含まれる核酸残基は天然核酸残基でも人工核酸残基でもよい。核酸残基の例はアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、キサンチン（Ｘ）、及びヒポキサンチン（ＨＸ）である。当業者が理解するように、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は各種のポリヌクレオチドに応じて互換的に使用され得る。例えば、当業者が理解するようにＤＮＡの部分としてのチミン（Ｔ）は転写された対応するｍＲＮＡの部分としてのウラシル（Ｕ）に対応する。本明細書において記載され、提供されるポリヌクレオチドは一本鎖でも二本鎖でもよく、直鎖状でも環状でもよく、天然でも人工でもよい。
本明細書において提供されるヌクレオチド配列はベクター内にクローン化され得る。本明細書において使用される「ベクター」という用語にはプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び遺伝子操作に一般的に使用される他のベクターが含まれる。好ましい実施形態ではこれらのベクターは哺乳類細胞又は酵母細胞のような細胞の形質転換に適切である。本明細書では前記ベクターは発現ベクターであってよい。一般的に発現ベクターは文献中に広範に記載されている。発現ベクターは選択マーカー遺伝子と宿主内での複製を確実にする複製起点、プロモーター、及び転写終結シグナルを含んでよい。発現することが望まれる核酸配列の挿入を可能にする少なくとも１つの制限部位又はポリリンカーがそのプロモーターと終結シグナルとの間に存在してよい。本明細書において提供されるヌクレオチド配列をクローン化することが可能なベクターの非限定的な例はアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、ＨＩＶベースレンチウイルスベクター、非ウイルス性ミニサークルベクター、又は細菌発現系及び真核生物発現系用の他のベクターである。
核酸分子
本明細書において使用される「核酸分子」又は「治療用核酸分子」という用語は２個以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子（すなわちヌクレオチド配列）として当業者によって一般的に理解されるものとして定義される。本発明の方法の中で言及される核酸分子は概して５０ヌクレオチド長い未満の治療用オリゴヌクレオチドである。それらの核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよく、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでよく、又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、又はリボザイムなどの別のオリゴマー核酸分子であってよい。核酸分子は一般的に固相化学合成と後続の精製によって実験室において作製される組成物である。核酸分子の配列に言及するときは共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの配列、又はその核酸塩基部分の順序、又はその核酸塩基部分の修飾に対して言及している。本発明の核酸分子は人工的であり、化学合成されており、典型的には精製又は単離されている。本発明の核酸分子は１個以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含んでよい。
幾つかの実施形態では本発明の核酸分子は８～４０ヌクレオチド長、例えば９～３５ヌクレオチド長、例えば１０～３０ヌクレオチド長、例えば１１～２２ヌクレオチド長、例えば１２～２０ヌクレオチド長、例えば１３～１８ヌクレオチド長、又は１４～１６ヌクレオチド長の連続ヌクレオチドを含む、又は前記連続ヌクレオチドから成る。
幾つかの実施形態では前記核酸分子又はその連続ヌクレオチド配列は２２個以下のヌクレオチド、例えば２０個以下のヌクレオチド、例えば１８個以下のヌクレオチド、例えば１４個、１５個、１６個、又は１７個のヌクレオチドを含む、又は前記ヌクレオチドから成る。本明細書において提示されるあらゆる範囲はその範囲の末端点を含むことを理解されたい。したがって、核酸分子が１０～３０個までのヌクレオチドを含むと書いてある場合、１０個のヌクレオチドと３０個のヌクレオチドの両方が含まれる。
幾つかの実施形態では前記連続ヌクレオチド配列は８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長、又は３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチドを含む、又は前記連続ヌクレオチドから成る。
前記核酸分子は哺乳類動物において標的核酸の発現を調整するためのものであることが典型的である。幾つかの実施形態では前記核酸分子、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸分子は標的核酸の発現を阻害するためのものであることが典型的である。したがって、前記核酸分子は混合されると哺乳類動物における１つ以上の標的核酸の発現の調整に有効である場合がある。
本発明の１つの実施形態では前記核酸分子はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのＲＮＡｉ剤から選択される。好ましい実施形態では前記核酸分子は高親和性修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
幾つかの実施形態では前記核酸分子っはホスホロチオエート核酸分子である。幾つかの実施形態では前記核酸分子はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
幾つかの実施形態では前記核酸分子は非ヌクレオシド部分（結合部分）に複合体化される場合がある。
核酸分子ライブラリーは異形核酸分子のコレクションとして理解されるものとする。その核酸分子ライブラリーの目的は様々であり得る。幾つかの実施形態ではその核酸分子ライブラリーは様々な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから構成され、例えばその核酸分子ライブラリーは標的核酸（例えばＲＮＡ配列）にわたって設計されている核酸分子のライブラリーであってよく、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡ分子のライブラリーは核酸分子によってその標的核酸が効率的に調節されるその標的核酸上の領域を特定することを目的とするｍＲＮＡジーンウォークにより作製されることがある。幾つかの実施形態ではその核酸分子ライブラリーはその核酸分子ライブラリー内の最も強力な配列を特定することを目的とした、前記標的核酸上の特定の領域を標的とする重複性核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから構成される。幾つかの実施形態ではその核酸分子ライブラリーは、親核酸分子又は祖先核酸分子の核酸分子デザイン変異体（子核酸分子）であって、その親核酸分子のコア核酸塩基配列を保持する核酸分子デザイン変異体からなるライブラリーである。
オリゴヌクレオチド
本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は２個以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者によって一般的に理解されるものとして定義される。そのような共有結合したヌクレオシドは核酸分子又はオリゴマーと呼ばれる場合もある。オリゴヌクレオチドは一般的に固相化学合成と後続の精製によって実験室において作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及するときは共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの配列、又はその核酸塩基部分の順序、又はその核酸塩基部分の修飾に対して言及している。本発明のオリゴヌクレオチドは人工的であり、化学合成されており、典型的には精製又は単離されている。本発明のオリゴヌクレオチドは１個以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含んでよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは内部二重鎖の形成が最低限であるか、又は全く無い一本鎖オリゴヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡ分子は一般的に二重鎖分子を形成する２本の相補性オリゴヌクレオチド鎖（センス鎖とアンチセンス鎖）から成る。ｓｈＲＮＡ分子は一般的にアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも長く、且つ、分子内に内部二重鎖（ヘアピン）構造を形成するオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書において使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることにより標的遺伝子の発現を調整することが可能なオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは必ずしも二重鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖であることが好ましい。
ＲＮＡｉ
本明細書では「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子」という用語はＲＮＡの発現又は翻訳を阻害する、本明細書において定義される核酸分子を含むあらゆる分子を指す。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は転写後の相補性ｍＲＮＡに結合することによりそれらの分解と翻訳機会の喪失を引き起こす二本鎖ＲＮＡである。短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は発現するとＤＩＣＥＲとＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介してｍＲＮＡを減少させることが可能なヘアピン構造を有する人工ＲＮＡ分子である。ＲＮＡｉ分子は目的の遺伝子のＲＮＡ配列に基づいて設計可能である。その後で対応するＲＮＡｉ分子を化学的に、又はインビトロ転写によって合成することができ、又はベクター若しくはＰＣＲ産物から発現することができる。
ｓｉＲＮＡ分子とｓｈＲＮＡ分子は長さが一般的に２０ヌクレオチドと５０ヌクレオチドの間、例えば２５ヌクレオチドと３５ヌクレオチドの間であり、それらは後にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短鎖干渉ＲＮＡにｄｓＲＮＡを処理すると考えられているＤｉｃｅｒとして知られるエンドヌクレアーゼと相互作用する。有効な拡張型のＤｉｃｅｒ基質が参照により本明細書に援用される米国特許第８３４９８０９号明細書及び米国特許第８５１３２０７号明細書に記載されている。適切な標的ｍＲＮＡへの結合が起こるとＲＩＳＣ内の１種類以上のエンドヌクレアーゼがその標的を切断してサイレンシングを誘導する。ＲＮＡｉ剤は修飾ヌクレオチド間結合、並びにＬＮＡ及びｃＥＴを含む２’－４’二環式リボース修飾ヌクレオシドなどの高親和性ヌクレオシドを使用して化学的に修飾されてもよい。
連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は前記標的核酸に対して相補的である前記オリゴヌクレオチドの領域を指す。その用語は本明細書において「連続核酸塩基配列」という用語及び「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に使用される。幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが前記連続ヌクレオチド配列を構成する。幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチドは前記連続ヌクレオチド配列を含み、所望によりその他のヌクレオチド、例えば機能団を前記連続ヌクレオチド配列に結合するために使用される場合があるヌクレオチドリンカー領域を含んでよい。そのヌクレオチドリンカー領域は前記標的核酸に対して相補的であっても相補的でなくてもよい。
ヌクレオチド
ヌクレオチドはオリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドの基礎的要素であり、天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチドの両方が本発明の目的のためにヌクレオチドに含まれる。本質的にＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドはリボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドは「単位」又は「単量体」と互換的に呼ばれる場合もある。
修飾ヌクレオシド
本明細書において使用される「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」という用語は同等のＤＮＡヌクレオシド又はＲＮＡヌクレオシドと比較して糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって修飾されているヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語は本明細書において「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」又は修飾「単量体」という用語と互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡ糖部分又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは本明細書においてＤＮＡヌクレオシド又はＲＮＡヌクレオシドと呼ばれる。ＤＮＡヌクレオシド又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドはそれらの修飾がワトソン・クリック対合を許容する場合はそれでも一般的にＤＮＡ又はＲＮＡと呼ばれる。
修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は２個のヌクレオシドを共有結合で連結するホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者によって一般的に理解されるように定義される。修飾ヌクレオシド間結合を有するヌクレオチドは「修飾ヌクレオチド」とも呼ばれる。幾つかの実施形態では修飾ヌクレオシド間結合はホスホジエステル結合と比較して本発明の核酸分子のヌクレアーゼ耐性を強化する。天然オリゴヌクレオチドではヌクレオシド間結合は隣接するヌクレオシド間でホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合はインビボで使用されるオリゴヌクレオチド並びにｓｉＲＮＡの安定化に特に有用であり、修飾ヌクレオシド間結合は本発明のオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡ内、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内のＤＮＡヌクレオシド領域又はＲＮＡヌクレオシド領域、並びに修飾ヌクレオシド領域でのヌクレアーゼ切断に対して防御するように機能する場合がある。
一実施形態では前記核酸分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡは天然ホスホジエステルから例えばヌクレアーゼの攻撃に対して抵抗性が高い結合に改変されている１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は血清中で前記オリゴヌクレオチドをインキュベートすることにより、又はヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えば蛇毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を使用することにより決定可能であり、両方とも当技術分野においてよく知られている。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を強化することが可能なヌクレオシド間結合はヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と呼ばれる。幾つかの実施形態では前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％が修飾されており、前記オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０又は例えば少なくとも９０％が修飾されている。幾つかの実施形態では前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てが修飾されている。幾つかの実施形態では複合体などの非ヌクレオチド機能団に本発明のオリゴヌクレオチドを結合するヌクレオシドがホスホジエステルであり得ることが理解される。幾つかの実施形態では前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てがヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。
修飾ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、及びボラノホスフェートを含む群より選択され得る。幾つかの実施形態ではそれらの修飾ヌクレオシド間結合、例えばホスホロチオエート、ジホスホロチオエート又はボラノホスフェートは本発明のオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ動員に適合する。
幾つかの実施形態ではヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合のようにイオウ（Ｓ）を含む。
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合はヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、及び製造しやすさのために特に有用である。幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％がホスホロチオエートであり、前記オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０又は例えば少なくとも９０％がホスホロチオエートである。幾つかの実施形態では前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエートである。
幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチドは１つ以上の中性ヌクレオシド間結合、具体的にはホスホトリエステル、メチルホスホネート、ＭＭＩ、アミド－３、ホルムアセタール、又はチオホルムアセタールから選択されるヌクレオシド間結合を含む。
その他のヌクレオシド間結合は国際公開第２００９／１２４２３８号パンフレット（参照により本明細書に援用）に開示されている。一実施形態ではヌクレオシド間結合は国際公開第２００７／０３１０９１号パンフレット（参照により本明細書に援用）に開示されているリンカーから選択される。具体的にはヌクレオシド間結合は－Ｏ－Ｐ（Ｏ）2－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）2－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）2－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）2－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）2－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）2－Ｓ－、－Ｏ－ＰＯ（ＲH）－Ｏ－、Ｏ－ＰＯ（ＯＣＨ3）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＮＲH）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＯＣＨ2ＣＨ2Ｓ－Ｒ）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＢＨ3）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＮＨＲH）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）2－ＮＲH－、－ＮＲH－Ｐ（Ｏ）2－Ｏ－、－ＮＲH－ＣＯ－Ｏ－、－ＮＲH－ＣＯ－ＮＲH－から選択されてよく、且つ／又はヌクレオシド間リンカーは－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－ＮＲH－、－ＮＲH－ＣＯ－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＯ－ＮＲH－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＮＲH－、－ＣＯ－ＮＲH－ＣＨ2－、－ＣＨ2－ＮＲHＣＯ－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ2－ＣＨ2－Ｏ－、－Ｓ－ＣＨ2－ＣＨ2－Ｓ－、－ＣＨ2－ＳＯ2－ＣＨ2－、－ＣＨ2－ＣＯ－ＮＲH－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＮＲH－ＣＯ－、－ＣＨ2－ＮＣＨ3－Ｏ－ＣＨ2－からなる群より選択されてよく、ＲHは水素及びＣ1~4アルキルから選択される。
ホスホチオエート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、ギャップマーのＧ領域又はヘッドマー及びテールマーの非修飾ヌクレオシド領域など、前記標的核酸との二重鎖が形成されるとヌクレアーゼを動員することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド領域において特に有用である。しかしながらホスホロチオエート結合はギャップマーのＦ領域とＦ’領域又はヘッドマー及びテールマーの修飾ヌクレオシド領域などの非ヌクレアーゼ動員性領域及び／又は親和性増大性領域において有用であることもある。
しかしながら前記デザイン領域のそれぞれがホスホジエステル結合など、ホスホロチオエート以外のヌクレオシド間結合を特にＬＮＡなどの修飾ヌクレオシドによってヌクレアーゼ分解に対して結合が保護されている領域に含んでよい。特に（典型的には非ヌクレアーゼ動員性領域において）修飾ヌクレオシド単位間又は修飾ヌクレオシド単位に隣接して例えば１、２のホスホジエステル結合を含むことでオリゴヌクレオチドの生物学的利用率及び／又は生体内分布を改変することができる。参照により本明細書に援用される国際公開第２００８／１１３８３２号パンフレットを参照されたい。
一実施形態では前記アンチセンスオリゴヌクレオチド内の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合及び／又はボラノホスフェート結合である。前記オリゴヌクレオチド内の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であることが好ましい。
核酸塩基
核酸塩基という用語は核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニン及びグアニン）部分及びピリミジン（例えばウラシル、チミン及びシトシン）部分を含む。本発明の背景では核酸塩基という用語は、天然核酸塩基と異なる場合があるが、核酸ハイブリダイゼーション時に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この状況では「核酸塩基」はアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンなどの天然核酸塩基、並びに非天然変異体の両方を指す。そのような変異体は例えばＨｉｒａｏ ｅｔ ａｌ （２０１２） Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ （２００９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ． ３７ １．４．１に記載されている。
幾つかの実施形態では核酸塩基部分はプリン又はピリミジンを置換プリン又は置換ピリミジンなどの修飾プリン又はピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チオゾロシトシン、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５‐ブロモウラシル、５－チアゾロウラシル、２－チオウラシル、２’チオチミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６‐ジアミノプリン、及び２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基に変更することによって修飾される。
核酸塩基部分はそれぞれ対応する核酸塩基に対する文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵによって表される場合があり、それぞれの文字は等しい機能を有する修飾核酸塩基を所望により含む場合がある。例えば、例となるオリゴヌクレオチドでは核酸塩基部分はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５－メチルシトシンから選択される。ＬＮＡギャップマーについては所望により５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用可能である。
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチド又は修飾核酸分子という用語は１つ以上の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド又は核酸分子を説明する。「キメラ」という用語は修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチド又は核酸分子、具体的にはギャップマーオリゴヌクレオチドを説明するために文献中に使用されている用語である。
相補性
「相補性」という用語はヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対合能力を説明する。ワトソン・クリック塩基対はグアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）とアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含む場合があり、例えばシトシンの代わりに５－メチルシトシンが使用されることが多く、したがって相補性という用語は非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対合を包含する（例えばＨｉｒａｏ ｅｔ ａｌ （２０１２） Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ． ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ （２００９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ． ３７ １．４．１を参照されたい）ことが理解される。
本明細書において使用される「％相補的」という用語は、ある核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドであって、所与の位置において別の核酸分子（例えば前記標的核酸）の連続ヌクレオチド配列に対して所与の位置で相補的である（すなわち、連続ヌクレオチド配列とワトソン・クリック塩基対を形成する）前記ヌクレオチドの数をパーセント表示したものを指す。そのパーセンテージは、（５’－３’の方向の前記標的配列及び３’－５’の方向の前記オリゴヌクレオチド配列とアラインメントを形成したときに）それらの２つの配列の間で対を形成する整列した塩基の数を数え、前記オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドの総数で割り、そして１００を掛けることによって計算される。そのような比較ではアラインメント形成（塩基対形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドはミスマッチと呼ばれる。連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算では挿入及び欠失を許さないことが好ましい。
「完全に相補的」という用語は１００％相補的を指す。
次のものは標的核酸（配列番号１０）の領域に対して完全に相補的であるオリゴヌクレオチド（配列番号１２）の例である。
Figure 2022036182000002
同一性
本発明の背景では「同一性」又は「パーセント同一性」という用語はアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が本明細書において示される配列、例えば配列番号１、２、又は３の配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性を有していることを意味しており、同一性の値が高い方が低い値よりも好ましい。本発明に従うと核酸配列又はアミノ酸配列が２つ以上存在する状況での「同一性」又は「パーセント同一性」は、当技術分野において知られている配列比較アルゴリズムを使用して、又は手作業の整列と目視検査によって測定する場合のように比較ウインドウ又は指定領域にわたって最大の一致度になるように比較及び整列したときに同一である２つ以上の配列、又は同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドを指定パーセンテージ（例えば、配列番号１、２、３、７、８、若しくは９のアミノ酸配列、又は例えば、配列番号４、５、６、１０、若しくは１１のヌクレオチド配列との例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性）で有する２つ以上の配列を指す。
アミノ酸配列について、記載される同一性が好ましくは少なくとも約５０アミノ酸長の領域、好ましくは少なくとも１００アミノ酸長の領域、より好ましくは少なくとも４００アミノ酸長の領域、より好ましくは少なくとも５００アミノ酸長の領域、より好ましくは少なくとも６００アミノ酸長の領域、最も好ましくはアミノ酸全長の領域にわたって存在する。
ヌクレオチド配列の場合では、記載される同一性が少なくとも１００ヌクレオチド長の領域、好ましくは少なくとも１，０００ヌクレオチド長の領域、より好ましくは少なくとも２，０００ヌクレオチド長の領域、最も好ましくはヌクレオチド全長の領域にわたって存在することが最も好ましい。しかしながら、概ね５０ヌクレオチド未満である核酸分子については非常に短い領域にわたって同一性を評価することができる。一般的に核酸分子のパーセンテージ同一性はそれらの２つの配列の間で同一である整列した塩基の数を数え、前記核酸分子内のヌクレオチドの総数で割り、そして１００を掛けることによって計算される。パーセント同一性＝（マッチ数×１００）／整列した領域の長さである。核酸分子内の連続ヌクレオチド配列の％同一性の計算では挿入及び欠失を許さないことが好ましい。
当業者は、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， １９９４， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２： ４６７３－４６８０）に基づくアルゴリズム又はＦＡＳＴＤＢ（Ｂｒｕｔｌａｇ， １９９０， Ｃｏｍｐ Ａｐｐ Ｂｉｏｓｃｉ， ６： ２３７－２４５）などのアルゴリズムを当技術分野において知られているように使用して配列間のパーセント同一性を決定する方法を知ることになる。当業者にはＢＬＡＳＴアルゴリズムとＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９７， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５： ３３８９－３４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９３， Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ， ３６： ２９０－３００、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９０， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５： ４０３－４１０）も利用可能である。例えば、ＢＬＡＳＴ２．０はベーシック・ローカルアラインメント・サーチツール（ＢＬＡＳＴ）の代わりになり（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９７、上記引用と同じ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９３、上記引用と同じ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９０、上記引用と同じ）、局所的な配列アラインメントの検索に使用可能である。ＢＬＡＳＴは上で考察したようにヌクレオチド配列とアミノ酸配列の両方のアラインメントを作成して配列の類似性を決定する。それらのアラインメントの局所的性質のため、ＢＬＡＳＴは完全一致の決定又は類似配列の特定に特に有用である。ＢＬＡＳＴを使用する類位のコンピューター手法（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９７、上記引用と同じ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９３、上記引用と同じ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９０、上記引用と同じ）がＧｅｎＢａｎｋ又はＥＭＢＬなどのヌクレオチドデータベース中の同一分子又は関連分子の検索に使用される。
ハイブリダイゼーション
本明細書において使用される「ハイブリダイズすること」又は「ハイブリダイズする」という用語は相対するストランド上の塩基対の間で水素結合を形成することによって二重鎖を形成する２本の核酸ストランド（例えばオリゴヌクレオチド及び標的核酸）として理解されるものとする。２本の核酸ストランド間の結合親和性はハイブリダイゼーションの強度である。ハイブリダイゼーションの強度はそのオリゴヌクレオチドの半数がその標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融点（Ｔm）の面から説明されることが多い。生理的条件ではＴmは厳密には親和性に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ， ２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５-５３７）。標準状態ギブズ自由エネルギーΔＧ°はより正確な結合親和性の表記であり、それはＲが気体定数であり、Ｔが絶対温度である式ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋd）による反応の解離定数（Ｋd）に関連付けられる。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°はそのオリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映する。ΔＧ°は水溶液濃度が１Ｍであり、ｐＨが７であり、且つ、温度が３７℃である場合の反応に付随するエネルギーである。標的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは自然発生的な反応であり、自然発生的な反応についてΔＧ°は０未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９６５，Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ． ３６－３８及びＨｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載される等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）法を使用することで実験的に測定可能である。当業者はΔＧ°の測定に市販の機器が利用可能であることを理解する。Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６及びＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５によって記載される適切に得られた熱力学パラメーターを使用するＳａｎｔａＬｕｃｉａ， １９９８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９５： １４６０－１４６５によって記載される最近傍モデルを用いることでΔＧ°の数値を推定することも可能である。ハイブリダイゼーションによって意図する核酸標的を調節することができるように本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。幾つかの実施形態ではハイブリダイゼーションの程度又は強度は標準状態ギブズ自由エネルギーΔＧ°によって評価される。前記オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌ未満の範囲、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチドは－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０ｋｃａｌ、例えば－１５～－３０ｋｃａｌ又は－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。
標的核酸
本発明によると前記標的核酸は哺乳類ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７をコードする核酸であり、前記標的核酸は例えば遺伝子配列、ＲＮＡ配列、ｍＲＮＡ配列及びプレｍＲＮＡ配列、成熟ｍＲＮＡ配列、又はｃＤＮＡ配列であってよい。したがって前記標的はＰＡＰＤ５標的核酸又はＰＡＰＤ７標的核酸と呼ばれる場合がある。本発明のオリゴヌクレオチド又は核酸分子は例えば哺乳類ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の標的エクソン領域であっても、例えばＰＡＰＤ５プレｍＲＮＡ又はＰＡＰＤ７プレｍＲＮＡ内の標的イントロン領域であってよい。前記標的核酸はＰＡＰＤ５タンパク質又はＰＡＰＤ７タンパク質、特にヒトＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７などの哺乳類ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７をコードする（例えば、ヒト、サル、ラット、及びブタのＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７のｍＲＮＡ配列とプレｍＲＮＡ配列を提供する表１Ａ及びＢ並びに表２Ａ及びＢを参照されたい）ことが適切である。
幾つかの実施形態では前記標的核酸は配列番号４、５、又は１０、又はその天然変異体（例えば哺乳類ＰＡＰＤ５をコードする配列）からなる群より選択される。
幾つかの実施形態では前記標的核酸は配列番号６又は１１、又はその天然変異体（例えば哺乳類ＰＡＰＤ７をコードする配列）からなる群より選択される。
研究又は診断に本発明のオリゴヌクレオチドを使用する場合、前記標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡに由来するｃＤＮＡ又は合成核酸であり得る。
インビボ用途又はインビトロ用途のため、本発明のオリゴヌクレオチドは典型的にはＰＡＰＤ５標的核酸又はＰＡＰＤ７標的核酸を発現している細胞においてＰＡＰＤ５標的核酸又はＰＡＰＤ７標的核酸の発現を阻害することが可能である。１、２のミスマッチを所望により例外とし、且つ、複合体などのオプションの機能団、又は他の非相補性末端ヌクレオチド（例えばＤ’領域又はＤ”領域）に前記オリゴヌクレオチドを結合し得るヌクレオチド系リンカー領域を所望により除外して前記オリゴヌクレオチドの全長にわたって測定すると本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列はＰＡＰＤ５標的核酸又はＰＡＰＤ７標的核酸に対して相補的であることが典型的である。幾つかの実施形態では前記標的核酸はＲＮＡ又はＤＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ、例えば成熟ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡであり得る。幾つかの実施形態では前記標的核酸はヒトＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７などの哺乳類ＰＡＰＤ５タンパク質又はＰＡＰＤ７タンパク質をコードするＲＮＡ又はＤＮＡ、例えばヒトＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ配列、例えば配列番号４、５、又は１０として開示されるｍＲＮＡ配列、又はヒトＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ配列、例えば配列番号６又は１１として開示されるｍＲＮＡ配列である。例となる標的核酸についての追加情報が表１Ａ及びＢ並びに表２Ａ及びＢに提供されている。
Figure 2022036182000003
Figure 2022036182000004
Ｆｗｄ＝フォワード鎖。Ｒｅｖ＝リバース鎖。ゲノム座標はプレｍＲＮＡ配列（ゲノム配列）を提示する。
標的配列
本明細書において使用される「標的配列」という用語は本発明のオリゴヌクレオチド又は核酸分子に対して相補的である核酸塩基配列を含む前記標的核酸内に存在するヌクレオチド配列を指す。幾つかの実施形態ではその標的配列は本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に対して相補的である前記標的核酸上の領域（すなわちサブ配列）から成る。
本発明のオリゴヌクレオチド又は核酸分子は、前記標的核酸上の領域、例えば本明細書に記載される標的配列に対して相補的である、又はハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。
前記オリゴヌクレオチドが相補的である、又はハイブリダイズする標的核酸配列は少なくとも１０ヌクレオチドから成る連続核酸塩基伸長物を全般的に含む。その連続ヌクレオチド配列は１０～５０ヌクレオチドの間、例えば１２～３０ヌクレオチドの間、例えば１３～２５ヌクレオチドの間、例えば１４～２０ヌクレオチドの間、例えば１５～１８ヌクレオチドの間の連続ヌクレオチドである。
天然変異体
「天然変異体」という用語は、前記標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば同じアミノ酸をコードするコドンが多数存在する原因となる遺伝コードの縮重のため、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシング若しくは単一ヌクレオチド多型及びアレル多型などの多型の存在のために異なる場合があるＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の遺伝子又は転写物の変異体を指す。したがって、前記オリゴヌクレオチドに対して充分な相補性配列が存在することに基づくと本発明のオリゴヌクレオチドは前記標的核酸及びその天然変異体を標的とし得る。
幾つかの実施形態では前記天然変異体は少なくとも９８％又は少なくとも９９％など、少なくとも９５％の相同性を哺乳類ＰＡＰＤ５標的核酸、例えば配列番号４、５、又は１０からなる群より選択される標的核酸に対して有する。
幾つかの実施形態では前記天然変異体は少なくとも９８％又は少なくとも９９％など、少なくとも９５％の相同性を哺乳類ＰＡＰＤ５標的核酸、例えば配列番号６又は１１からなる群より選択される標的核酸に対して有する。
多数の単一ヌクレオチド多型、例えば表２Ａ（ヒトプレｍＲＮＡ開始／基準配列は配列番号１０である）及び表２Ｂ（ヒトプレｍＲＮＡ開始／基準配列は配列番号１１である）に開示されている単一ヌクレオチド多型がＰＡＰＤ５遺伝子又はＰＡＰＤ７遺伝子に知られている。
Figure 2022036182000005
Figure 2022036182000006
発現の調整
本明細書において使用される「発現の調整」という用語は、ある核酸分子の投与前のＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の量と比べてＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の量の変更するその核酸分子の能力についての総合的な用途として理解されるべきである。あるいは、発現の調整は対照実験を参照することにより判定可能である。その対照は生理食塩水組成物で処理された個体若しくは標的細胞、又は非ターゲティング若しくは核酸分子（モック）で処理された個体若しくは標的細胞であることが一般的に理解される。しかしながらその対照は標準治療で処置された個体であってもよい。
ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の発現を例えばｍＲＮＡの分解又は転写の妨害により阻害、下方制御、低下、抑制、解除、停止、妨害、阻止、低減、降下、無効化、又は停止する核酸分子の能力が１種の調整である。
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、例えば融点（Ｔm）によって評価される場合、前記オリゴヌクレオチドに組み込まれると前記オリゴヌクレオチドの相補性標的に対するその親和性を高める修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは融点を修飾ヌクレオシド当たり好ましくは＋０．５～＋１２℃の間の温度、より好ましくは＋１．５～＋１０℃の間の温度、最も好ましくは＋３～＋８℃の間の温度だけ高める。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野において知られており、例えば多くの２’置換ヌクレオシド並びにロックド核酸（ＬＮＡ）が高親和性修飾ヌクレオシドに含まれる（例えばＦｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ； Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １９９７， ２５， ４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ； Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ２０００， ３（２）， ２９３－２１３を参照されたい）。
糖修飾
本発明の核酸分子はＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比べて修飾糖部分、すなわち糖部分の修飾を有する１個以上のヌクレオシドを含んでよい。
核酸分子のある特定の特性、例えば親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性を改善することを主な目的としてリボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが作製されている。
そのような修飾には、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）との置き換え、又はリボース環上のＣ２炭素とＣ４炭素との間にビラジクル（ｂｉｒａｄｉｃｌｅ）架橋を有することが典型的である二環式の環（ＬＮＡ）との置き換え、又はＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合が失われていることが典型的である結合解除リボース環（例えばＵＮＡ）との置き換えによってリボース環構造が改変されている修飾が含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには例えば、ビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号パンフレット）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号パンフレット）が含まれる。修飾ヌクレオシドには、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合の糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシドも含まれる。
糖修飾にはリボース環上の置換基をＤＮＡヌクレオシド及びＲＮＡヌクレオシドにもともと見られる水素又は２’－ＯＨ基以外の基に変更することによって作製される修飾も含まれる。例えば２’位、３’位、４’位、又は５’位の位置に置換基を導入することが可能である。修飾糖部分を有するヌクレオシドには２’修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシドも含まれる。実際、２’置換ヌクレオシドの開発が非常に注目されており、多数の２’置換ヌクレオシドがオリゴヌクレオチドに組み込まれると有益な特性、例えば向上したヌクレオシド耐性及び強化された親和性を有することが分かっている。
２’修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは２’位の位置にＨ又は－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）、又は２’架橋ビラジクルを含むヌクレオシドであり、２’糖修飾ヌクレオシドには２’置換ヌクレオシド及びＬＮＡ（２’－４’ビラジクル架橋）ヌクレオシドが含まれる。例えば、前記２’修飾糖は強化された結合親和性及び／又は上昇したヌクレアーゼ耐性を前記オリゴヌクレオチドに提供する場合がある。２’置換修飾ヌクレオシドの例は２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アルコキシ－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、２’－アミノ－ＤＮＡヌクレオシド、２’－フルオロ－ＲＮＡヌクレオシド、及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。その他の例については例えばＦｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ； Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １９９７， ２５， ４４２９－４４４３、及びＵｈｌｍａｎｎ； Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ２０００， ３（２）， ２９３－２１３、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２， １９， ９３７を参照されたい。幾つかの２’置換修飾ヌクレオシドの例を下に示す。
Figure 2022036182000007
Figure 2022036182000008
ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）
ＬＮＡヌクレオシドはヌクレオチドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間にリンカー基（ビラジクル又は架橋と呼ばれる）を含む修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは文献では架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる。
幾つかの実施形態では本発明のオリゴマーの修飾ヌクレオシド又はＬＮＡヌクレオシド式Ｉ又は式ＩＩの一般的構造を有し、
Figure 2022036182000009
式中、Ｗは－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒa）－、－Ｃ（ＲaＲb）－から選択され、例えば幾つかの実施形態では－Ｏ－であり、
Ｂは核酸塩基部分又は修飾核酸塩基部分を示し、
Ｚは隣接するヌクレオシドとのヌクレオシド間結合、又は５’末端基を示し、
Ｚ*は隣接するヌクレオシドとのヌクレオシド間結合、又は３’末端基を示し、
Ｘは－Ｃ（ＲaＲb）－、－Ｃ（Ｒa）＝Ｃ（Ｒb）－、－Ｃ（Ｒa）＝Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓｉ（Ｒa）2－、－Ｓ－、－ＳＯ2－、－Ｎ（Ｒa）－、及び＞Ｃ＝Ｚからなる群より選択される基を示し、
幾つかの実施形態ではＸは－Ｏ－、－Ｓ－、ＮＨ－、ＮＲaＲb、－ＣＨ2－、ＣＲaＲb、－Ｃ（＝ＣＨ2）－、及び－Ｃ（＝ＣＲaＲb）－からなる群より選択され、
幾つかの実施形態ではＸは－Ｏ－であり、
Ｙは－Ｃ（ＲaＲb）－、－Ｃ（Ｒa）＝Ｃ（Ｒb）－、－Ｃ（Ｒa）＝Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓｉ（Ｒa）2－、－Ｓ－、－ＳＯ2－、－Ｎ（Ｒa）－、及び＞Ｃ＝Ｚからなる群より選択される基を示し、
幾つかの実施形態ではＹは－ＣＨ2－、－Ｃ（ＲaＲb）－、－ＣＨ2ＣＨ2－、－Ｃ（ＲaＲb）－Ｃ（ＲaＲb）－、－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－、－Ｃ（ＲaＲb）Ｃ（ＲaＲb）Ｃ（ＲaＲb）－、－Ｃ（Ｒa）＝Ｃ（Ｒb）－、及び－Ｃ（Ｒa）＝Ｎ－からなる群より選択され、
幾つかの実施形態ではＹは－ＣＨ2－、－ＣＨＲa－、－ＣＨＣＨ3－、ＣＲaＲb－からなる群より選択され、
又は－Ｘ－Ｙ－が一緒に－Ｃ（ＲaＲb）－、－Ｃ（Ｒa）＝Ｃ（Ｒb）－、－Ｃ（Ｒa）＝Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓｉ（Ｒa）2－、－Ｓ－、－ＳＯ2－、－Ｎ（Ｒa）－、及び＞Ｃ＝Ｚからなる群より選択される１つ、２つ、３つ、又は４つの基／原子から成る二価のリンカー基（ラジクルとも呼ばれる）を示し、
幾つかの実施形態では－Ｘ－Ｙ－は－Ｘ－ＣＨ2－、－Ｘ－ＣＲaＲb－、－Ｘ－ＣＨＲa-、－Ｘ－Ｃ（ＨＣＨ3）-、－Ｏ－Ｙ－、－Ｏ－ＣＨ2－、－Ｓ－ＣＨ2－、－ＮＨ－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨＣＨ3－、－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ3ＣＨ3）－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－、ＯＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2ＯＣＨ2－、－Ｏ－ＮＣＨ2－、－Ｃ（＝ＣＨ2）－ＣＨ2－、－ＮＲa－ＣＨ2－、Ｎ－Ｏ－ＣＨ2、－Ｓ－ＣＲaＲb－、及び－Ｓ－ＣＨＲa－からなる群より選択されるビラジクルを示す。
幾つかの実施形態では－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ2－又は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ3）－を示し、
Ｚは－Ｏ－、－Ｓ－、及び－Ｎ（Ｒa）－から選択され、且つ、
Ｒa及び存在する場合はＲbのそれぞれが独立して水素、所望により置換されるＣ1~6アルキル、所望により置換されるＣ2~6アルケニル、所望により置換されるＣ2~6アルキニル、ヒドロキシ、所望により置換されるＣ1~6アルコキシ、Ｃ2~6アルコキシアルキル、Ｃ2~6アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ1~6アルコキシカルボニル、Ｃ1~6アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ及びジ（Ｃ1~6アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ1~6アルキル）アミノカルボニル、アミノＣ1~6アルキルアミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ1~6アルキル）アミノＣ1~6アルキルアミノカルボニル、Ｃ1~6アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ1~6アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ1~6アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ1~6アルキルチオ、ハロゲンから選択され、その場合にアリール及びヘテロアリールが所望により置換されてもよく、２つのジェミナルな置換基であるＲaとＲbが一緒に所望により置換されるメチレン（＝ＣＨ2）を示してもよく、全てのキラル中心については非対称性の基がＲ配向又はＳ配向のどちらでも存在していてよく、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は水素、所望により置換されるＣ1~6アルキル、所望により置換されるＣ2~6アルケニル、所望により置換されるＣ2~6アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ1~6アルコキシ、Ｃ2~6アルコキシアルキル、Ｃ2~6アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ1~6アルコキシカルボニル、Ｃ1~6アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ及びジ（Ｃ1~6アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ1~6アルキル）アミノカルボニル、アミノＣ1~6アルキルアミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ1~6アルキル）アミノＣ1~6アルキルアミノカルボニル、Ｃ1~6アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ1~6アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ1~6アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ1~6アルキルチオ、ハロゲンからなる群より独立して選択され、その場合にアリール及びヘテロアリールが所望により置換されてもよく、２つのジェミナルな置換基が一緒にオキソ、チオオキソ、イミノ、又は所望により置換されるメチレンを示してもよい。
幾つかの実施形態ではＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*がＣ1~6アルキル、例えばメチルと水素から独立して選択される。
幾つかの実施形態ではＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全てが水素である。
幾つかの実施形態ではＲ1、Ｒ2、Ｒ3は全てが水素であり、Ｒ5及びＲ5*のどちらかも水素であり、Ｒ5及びＲ5*のうちの他方が水素以外、例えばメチルなどのＣ1~6アルキルである。
幾つかの実施形態ではＲaは水素又はメチルのどちらかである。幾つかの実施形態では存在する場合はＲbが水素又はメチルのどちらかである。
幾つかの実施形態ではＲa及びＲbの一方又は両方が水素である。
幾つかの実施形態ではＲa及びＲbのうちの一方が水素であり、及び他方が水素以外である。
幾つかの実施形態ではＲa及びＲbのうちの一方がメチルであり、他方が水素である。
幾つかの実施形態ではＲa及びＲbの両方がメチルである。
幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－Ｏ－ＣＨ2－であり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*の全てが水素である。全て参照により本明細書に援用される国際公開第９９／０１４２２６号パンフレット、国際公開第００／６６６０４号パンフレット、国際公開第９８／０３９３５２号パンフレット、及び国際公開第２００４／０４６１６０号パンフレットにそのようなＬＮＡヌクレオシドが開示されており、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド及びα－Ｌ－オキシＬＮＡヌクレオシドとして一般的に知られるものがそのようなＬＮＡヌクレオシドに含まれる。
幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－Ｓ－ＣＨ2－であり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*の全てが水素である。参照により本明細書に援用される国際公開第９９／０１４２２６号パンフレット及び国際公開第２００４／０４６１６０号パンフレットにそのようなチオＬＮＡヌクレオシドが開示されている。
幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－ＮＨ－ＣＨ2－であり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*の全てが水素である。参照により本明細書に援用される国際公開第９９／０１４２２６号パンフレット及び国際公開第２００４／０４６１６０号パンフレットにそのようなアミノＬＮＡヌクレオシドが開示されている。
幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－又は－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－であり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*の全てが水素である。参照により本明細書に援用される国際公開第００／０４７５９９号パンフレット及びＭｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １２ ７３－７６にそのようなＬＮＡヌクレオシドが開示されており、２’－Ｏ－４’Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）として一般的に知られるものがそのようなＬＮＡヌクレオシドに含まれる。
幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－Ｏ－ＣＨ2－であり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3の全てとＲ5及びＲ5*のうちの一方が水素であり、Ｒ5及びＲ5*のうちの他方がＣ1~6アルキル、例えばメチルなどの水素以外のものである。参照により本明細書に援用される国際公開第２００７／１３４１８１号パンフレットにそのような５’置換ＬＮＡヌクレオシドが開示されている。
幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－Ｏ－ＣＲaＲb－であり、Ｒa及びＲbの一方又は両方がメチルなどの水素以外のものであり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3の全てとＲ5及びＲ5*のうちの一方が水素であり、Ｒ5及びＲ5*のうちの他方がＣ1~6アルキル、例えばメチルなどの水素以外のものである。参照により本明細書に援用される国際公開第２０１０／０７７５７８号パンフレットにそのようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドが開示されている。
幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－は二価のリンカー基－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ2ＯＣＨ3）－を示す（２’Ｏ－メトキシエチル二環式核酸；Ｓｅｔｈ ａｔ ａｌ．， ２０１０， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ ７５（５） ｐｐ． １５６９－８１）。幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－は二価のリンカー基－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ3）－を示す（２’Ｏ－エチル二環式核酸；Ｓｅｔｈ ａｔ ａｌ．， ２０１０， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ ７５（５） ｐｐ． １５６９－８１）。幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－Ｏ－ＣＨＲa－であり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*の全てが水素である。両方とも参照により本明細書に援用される国際公開第１００３６６９８号パンフレット及び国際公開第０７０９００７１号パンフレットにそのような６’置換ＬＮＡヌクレオシドが開示されている。
幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ2ＯＣＨ3）－であり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*の全てが水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは当技術分野において環状ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）としても知られており、国際公開第０７０９００７１号パンフレットにおいて開示されている。
幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－はＲ配置又はＳ配置のどちらかの二価のリンカー基－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ3）－を示す。幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－は一緒に二価のリンカー基－Ｏ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－を示す（Ｓｅｔｈ ａｔ ａｌ．， ２０１０， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ）。幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ3）－であり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*の全てが水素である。そのような６’メチルＬＮＡヌクレオシドは当技術分野においてｃＥＴヌクレオシドとしても知られており、両方とも参照により本明細書に援用される国際公開第０７０９００７１号パンフレット（β－Ｄ）及び国際公開第２０１０／０３６６９８号パンフレット（α－Ｌ）に記載されているように（Ｓ）ｃＥＴ立体異性体又は（Ｒ）ｃＥＴ立体異性体のどちらかであり得る。
幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－Ｏ－ＣＲaＲb－であり、ＲaもＲbも水素ではなく、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*の全てが水素である。幾つかの実施形態ではＲa及びＲbが両方ともメチルである。参照により本明細書に援用される国際公開第２００９００６４７８号パンフレットにそのような６’ジ置換ＬＮＡヌクレオシドが開示されている。
幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－Ｓ－ＣＨＲa－であり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*の全てが水素である。参照により本明細書に援用される国際公開第１１１５６２０２号パンフレットにそのような６’置換チオＬＮＡヌクレオシドが開示されている。幾つかの６’置換チオＬＮＡ実施形態ではＲaがメチルである。
幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－Ｃ（＝ＣＨ２）－Ｃ（ＲaＲb）－、例えば－Ｃ（＝ＣＨ2）－ＣＨ2－又は－Ｃ（＝ＣＨ2）－ＣＨ（ＣＨ3）－であり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*の全てが水素である。両方とも参照により本明細書に援用される国際公開第０８１５４４０１号パンフレット及び国際公開第０９０６７６４７号パンフレットにそのようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドが開示されている。
幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－Ｎ（－ＯＲa）－であり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*の全てが水素である。幾つかの実施形態ではＲaはメチルなどのＣ1~6アルキルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドはＮ置換ＬＮＡとしても知られており、参照により本明細書に援用される国際公開第２００８／１５０７２９号パンフレットに開示されている。幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－は一緒に二価のリンカー基－Ｏ－ＮＲa－ＣＨ3－を示す（Ｓｅｔｈ ａｔ ａｌ．， ２０１０， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ）。幾つかの実施形態では前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－Ｎ（Ｒa）－であり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*の全てが水素である。幾つかの実施形態ではＲaはメチルなどのＣ1~6アルキルである。
幾つかの実施形態ではＲ5及びＲ5*の一方又は両方が水素であり、置換されるときはＲ5及びＲ5*のうちの他方がメチルなどのＣ1~6アルキルである。そのような実施形態ではＲ1、Ｒ2、Ｒ3が全ての水素であってよく、前記ビラジクル－Ｘ－Ｙ－が－Ｏ－ＣＨ2－又は－Ｏ－Ｃ（ＨＣＲa）－、例えば－Ｏ－Ｃ（ＨＣＨ3）－から選択され得る。
幾つかの実施形態では前記ビラジクルが－ＣＲaＲb－Ｏ－ＣＲaＲb－、例えばＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－であり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*の全てが水素である。幾つかの実施形態ではＲaはメチルなどのＣ1~6アルキルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドは立体構造限定ヌクレオチド（ＣＲＮ）としても知られており、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１３０３６８６８号パンフレットに開示されている。
幾つかの実施形態では前記ビラジクルが－Ｏ－ＣＲaＲb－Ｏ－ＣＲaＲb－、例えばＯ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－であり、ＷがＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*の全てが水素である。幾つかの実施形態ではＲaはメチルなどのＣ1~6アルキルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドはＣＯＣヌクレオチドとしても知られており、参照により本明細書に援用されるＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９ ３７（４）， １２２５－１２３８に開示されている。
指定されない限り前記ＬＮＡヌクレオシドはβ－Ｄステレオアイソフォーム又はα－Ｌステレオアイソフォームであり得ることが理解される。
ＬＮＡヌクレオシドの特定の例がスキーム１に提示されている。
スキーム１
Figure 2022036182000010
それらの例に示されているように本発明の幾つかの実施形態では前記オリゴヌクレオチド中のＬＮＡヌクレオシドはβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡヌクレオシドである。
ヌクレアーゼ介在性分解
ヌクレアーゼ介在性分解とはオリゴヌクレオチドが相補性ヌクレオチド配列と二重鎖を形成したときにそのような配列の分解を介在することが可能であることをいう。
幾つかの実施形態では本発明のオリゴヌクレオチドによってヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えばＲＮａｓｅ Ｈの動員が可能である場合に前記オリゴヌクレオチドは前記標的核酸のヌクレアーゼ介在性分解を介して機能し得る。ヌクレアーゼ介在性機構を介して機能するオリゴヌクレオチドのデザイン例は、少なくとも５個又は６個のＤＮＡヌクレオシドから成る領域を含み、且つ、片側又は両側に親和性増大性ヌクレオシドが隣接することが典型的であるオリゴヌクレオチド、例えばギャップマー、ヘッドマー、及びテールマーである。
ＲＮａｓｅ Ｈ活性と動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性は相補性ＲＮＡ分子と二重鎖になっているときにＲＮａｓｅ Ｈを動員するそのアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号パンフレットはＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するためのインビトロ方法を提供しており、それらの方法はＲＮａｓｅ Ｈの動員能力を決定するために使用可能である。典型的には、ｐｍｏｌ／ｌ／分の単位で測定する場合、オリゴヌクレオチドに相補性標的核酸配列が提供されたときにそのオリゴヌクレオチドが、試験を受けるその修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、そのオリゴヌクレオチド中の全てのＤＮＡ単量体とＤＮＡ単量体の間にホスホロチオエート結合を有する単量体だけを含んでいるそのオリゴヌクレオチドを使用し、且つ、国際公開第０１／２３６１３号パンフレット（参照により本明細書に援用される）の実施例９１～９５によって提供される方法を用いたときに決定された初期速度の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％又は２０％超の初期速度を有する場合にそのオリゴヌクレオチドによってＲＮａｓｅ Ｈの動員が可能であると考える。
ギャップマー
本明細書において使用されるギャップマーという用語は１個以上の親和性増大性修飾ヌクレオシドを含む領域（フランク領域又はウイング領域）が５’側と３’側に隣接するＲＮａｓｅ Ｈ動員性オリゴヌクレオチドから成る領域（ギャップ）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。様々なギャップマーデザインが本明細書に記載されている。ヘッドマーとテールマーはＲＮａｓｅ Ｈの動員が可能なオリゴヌクレオチドであって、前記フランクのうちの１つが失われているオリゴヌクレオチド、すなわち前記オリゴヌクレオチドの末端のうちの一方だけしか親和性増大性修飾ヌクレオシドを含んでいないオリゴヌクレオチドである。ヘッドマーについては前記３’隣接領域が失われており（すなわち、前記５’隣接領域が親和性増大性修飾ヌクレオシドを含み）、テールマーについては前記５’隣接領域が失われている（すなわち、前記３’隣接領域が親和性増大性修飾ヌクレオシドを含む）。
ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーという用語は親和性増大性修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも１個がＬＮＡヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドのことである。
混合ウイングギャップマー
混合ウイング領域ギャップマー又は混合フランクギャップマーという用語は前記フランク領域のうちの少なくとも一方が少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシドと少なくとも１個の非ＬＮＡ修飾ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アルコキシ－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、２’－アミノ－ＤＮＡヌクレオシド、２’－フルオロ－ＲＮＡヌクレオシド、及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドなどの少なくとも１個の２’置換修飾ヌクレオシド等を含むＬＮＡギャップマーを指す。幾つかの実施形態では混合ウイング領域ギャップマーは（例えば５’側又は３’側に）ＬＮＡヌクレオシドだけを含む一方のフランクを有し、且つ、（逆の３’側又は５’側に）２’置換修飾ヌクレオシドと所望によりＬＮＡヌクレオシドを含む他方のフランクを有する。
複合体
本明細書において使用される複合体という用語は非ヌクレオチド部分（結合部分又はＣ領域又は第３領域）に共有結合しているオリゴヌクレオチドを指す。
１つ以上の非ヌクレオチド部分への本発明のオリゴヌクレオチドの複合体化は、例えば、そのオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取込、又は安定性に影響を与えることによりそのオリゴヌクレオチドの薬理学を改善する場合がある。幾つかの実施形態ではその結合部分はそのオリゴヌクレオチドの細胞分布、生物学的利用率、代謝、排出、透過性、及び／又は細胞取込を改善することによりそのオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改変又は向上する。具体的にはその複合体は特定の器官、組織、又は細胞種をそのオリゴヌクレオチドの標的とすることによってその器官、組織、又は細胞種における前記オリゴヌクレオチドの有効性を強化する場合がある。同時にその複合体は非標的細胞種、組織、又は器官における前記オリゴヌクレオチドの活性、例えば非標的細胞種、組織、又は器官における非特異的活性又は活性を低下させるように働く場合がある。国際公開第９３／０７８８３号パンフレット及び国際公開第２０１３／０３３２３０号パンフレットは適切な結合部分を提示しており、それらのパンフレットは参照により本明細書に援用される。その他の適切な結合部分はアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）に結合可能な結合部分である。特に三価Ｎ－アセチルガラクトサミン結合部分がＡＳＧＰｒへの結合に適切である。例えば国際公開第２０１４／０７６１９６号パンフレット、国際公開第２０１４／２０７２３２号パンフレット及び国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレット（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
参照によりそれぞれ全体が本明細書に援用されるＡｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｓ．Ｔ． Ｃｒｏｏｋｅ編、第１６章、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社、２００１年内のＭａｎｏｈａｒａｎの著作、及びＭａｎｏｈａｒａｎ， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ２００２， １２， １０３による包括的な概説内にもオリゴヌクレオチド複合体及びそれらの合成が報告されている。
一実施形態では前記非ヌクレオチド部分（結合部分）は炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、高分子物質、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えばカプシド）、又はそれらの組合せからなる群より選択される。
結合リンカー
結合又はリンカーは、１つ以上の共有結合を介して１つの目的の化学基又は化学品を別の目的の化学基又は化学品に結合する２つの原子間の接続である。結合部分を直接的に、又は連結部分（例えばリンカー又はテーザー）を介して前記オリゴヌクレオチドに結合することが可能である。リンカーは第３領域、例えば結合部分をオリゴヌクレオチド（例えばＡ領域又はＣ領域の末端）に共有結合するように機能する。
本発明の幾つかの実施形態では本発明の複合体又はオリゴヌクレオチド複合体はオリゴヌクレオチドと結合部分との間に位置するリンカー領域を所望により含んでもよい。幾つかの実施形態では複合体とオリゴヌクレオチドとの間のそのリンカーは生物切断性である。
哺乳類の体内で通常遭遇する条件、又は哺乳類の体内で遭遇する条件に類似する条件下で切断可能な生理学的に不安定な結合を含む、又はそのような不安定な結合から成る生物切断性リンカー。生理学的に不安定なリンカーが化学的な変換（例えば、切断）を起こす条件には哺乳類細胞において見られる、又は哺乳類細胞において遭遇するものに類似するｐＨ、温度、酸化還元の条件又は薬剤、及び塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳類細胞内の条件にはタンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼ等に由来する哺乳類細胞内に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。１つの実施形態では前記生物切断性リンカーはＳ１ヌクレアーゼ切断に対して感受性である。好ましい実施形態では前記ヌクレアーゼ感受性リンカーは少なくとも２つの連続ホスホジエステル結合、例えば少なくとも３つ又は４つ又は５つの連続ホスホジエステル結合を含む１ヌクレオシドと１０ヌクレオシドの間の、例えば１ヌクレオシド、２ヌクレオシド、３ヌクレオシド、４ヌクレオシド、５ヌクレオシド、６ヌクレオシド、７ヌクレオシド、８ヌクレオシド、９ヌクレオシド、又は１０ヌクレオシドの連結ヌクレオシドを含み、より好ましくは２ヌクレオシドと６ヌクレオシドの間の連結ヌクレオシドを含み、最も好ましくは２ヌクレオシドと４ヌクレオシドの間の連結ヌクレオシドを含む。前記ヌクレオシドはＤＮＡ又はＲＮＡであることが好ましい。生物切断性リンカーを含むホスホジエステルは国際公開第２０１４／０７６１９５号パンフレット（参照により本明細書に援用される）においてさらに詳細に説明されている。
複合体は非生物切断性リンカーを介して前記オリゴヌクレオチドに結合してもよく、幾つかの実施形態ではその複合体は生物切断性リンカーに共有結合している非切断性リンカーを含んでよい。必ずしも生物切断性ではないリンカーは主に結合部分をオリゴヌクレオチド又は生物切断性リンカーに共有結合するように働く。そのようなリンカーはエチレングリコール、アミノ酸単位、又はアミノアルキル基などの反復単位から成る鎖構造又はオリゴマーを含む場合がある。幾つかの実施形態ではそのリンカー（領域Ｙ）は例えばＣ6～Ｃ12アミノアルキル基をはじめとするＣ2～Ｃ36アミノアルキル基などのアミノアルキルである。幾つかの実施形態ではそのリンカー（領域Ｙ）はＣ6アミノアルキル基である。結合リンカー基はアミノ修飾オリゴヌクレオチドとその結合基上の活性化エステル基を使用してオリゴヌクレオチドにルーチン的に結合可能である。
治療
「治療」、「治療すること」、「治療する」、又はそのような用語は所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを全般的に意味するために本明細書において使用される。この効果は疾患及び／又はその疾患が原因の有害作用の部分的治癒又は完全治癒に関して治療的である。本明細書において使用される「治療」という用語は対象における疾患のあらゆる治療に当てはまり、その用語は（ａ）その疾患を抑制すること、すなわちＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの増加の阻害のようにその疾患の発症を止めること、又は（ｂ）その疾患を改善（すなわち軽減）すること、すなわちＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの生産の抑制のようにその疾患の退行を引き起こすことを含む。したがって、ＨＢＶ感染症を改善及び／又は抑制する化合物はＨＢＶ発明を治療する化合物である。本明細書において使用される「治療」という用語は、既に明確になり、且つ、顕在化したＨＢＶ感染症の治療のように既に顕在化した障害の医療介入に関することが好ましい。
予防
本明細書において、「予防すること」、「予防」、又は「予防する」という用語は予防的処置、すなわち疾患を治療することよりもむしろ予防することが目的である手段又は手法に関する。予防は疾患又はその症状の完全予防又は部分的予防に関して予防的である所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。したがって、本明細書において「ＨＢＶ感染症の予防」には対象においてＨＢＶ感染症が生じることを予防すること、及びＨＢＶ感染症の症状が生じることを予防することが含まれる。本発明では特にＨＢＶに感染した母親の子供におけるＨＢＶ感染症の予防が企図されている。
患者
本発明の目的では「対象」（又は「患者」）は脊椎動物であり得る。本発明の背景では「対象」という用語にはヒトも他の動物も含まれ、特に哺乳類動物が含まれ、他の生物も含まれる。したがって、本明細書において提供される手段と方法はヒトの治療と獣医用途の両方に適用可能である。よって、本明細書では対象はマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、又は霊長類動物などの動物であり得る。対象は哺乳類動物であることが好ましい。対象はヒトであることがより好ましい。
ＨＢＶ感染症
「Ｂ型肝炎ウイルス感染症」又は「ＨＢＶ感染症」という用語は当技術分野において一般的に知られおり、その用語はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされ、且つ、肝臓を侵す感染症を指す。ＨＢＶ感染症は急性感染症又は慢性感染症であり得る。感染者の中には初期感染時に何の症状も無い者がおり、中には急に嘔吐、皮膚黄変、疲労感、暗色尿、及び腹部痛を伴う病状が始まる者もいる（「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ Ｎ°２０４」、ｗｈｏ．ｉｎｔ．、２０１４年７月；２０１４年１１月４日に検索）。これらの症状は数週間続くことが多く、これらの症状の結果死亡する場合があり得る。症状が始まるまで３０日～１８０日かかることがある。出生前後に感染した者では９０％の者が慢性Ｂ型肝炎感染症を発症するが、５歳より後に感染した者では１０％未満しか発症しない（「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ＦＡＱｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｂｌｉｃ － Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」、アメリカ疾病予防管理センター（ＣＤＣ）、２０１１年１１月２９日に検索）。慢性患者の大半が症状を持たないが、しかしながらやがて肝硬変や肝臓癌が発症する（Ｃｈａｎｇ， ２００７， Ｓｅｍｉｎ Ｆｅｔａｌ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｅｄ， １２： １６０－１６７）。これらの合併症の結果、慢性患者の１５～２５％が死亡する（「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ Ｎ°２０４」、ｗｈｏ．ｉｎｔ．、２０１４年７月；２０１４年１１月４日に検索）。本明細書では「ＨＢＶ感染症」という用語には急性Ｂ型肝炎感染症と慢性Ｂ型肝炎感染症が含まれる。「ＨＢＶ感染症」という用語には初期感染症の無症状期、有症状期、並びにＨＢＶ感染症の無症状慢性期も含まれる。
酵素活性断片
本明細書では配列番号１又は２（すなわちＰＡＰＤ５）の酵素活性断片は、配列番号１又は２（すなわちＰＡＰＤ５）の連続アミノ酸残基伸長物を含み、且つ、ＰＡＰＤ５の生物活性（すなわち機能性）、特にポリＡポリメラーゼ機能を保持するポリペプチドに関する。これと合致して、本明細書では配列番号３（すなわちＰＡＰＤ７）の酵素活性断片は、配列番号３（すなわちＰＡＰＤ７）の連続アミノ酸残基伸長物を含み、且つ、ＰＡＰＤ７の生物活性（すなわち機能性）、特にポリＡポリメラーゼ機能を保持するポリペプチドに関する。ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の酵素活性断片の例はヌクレオチジルトランスフェラーゼドメイン及びＣｉｄ１ポリＡポリメラーゼである。
ポリペプチド
本明細書では「ポリペプチド」という用語にはペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸単量体を含む、又はそのようなアミノ酸単量体から成る全ての分子が含まれる。したがって、「ポリペプチド」という用語はペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質などの全てのアミノ酸配列を含む。本明細書に記載される「ポリペプチド」は天然ポリペプチドであっても非天然ポリペプチドであってもよい。非天然ポリペプチドはその天然の相対物と比較して少なくとも１つの突然変異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、又はアミノ酸付加）を含む場合がある。非天然ポリペプチドはベクターにクローン化され、且つ／又は前記ポリペプチドの天然プロモーターではないプロモーターに機能可能であるように結合される場合もある。前記プロモーターは構成的活性プロモーターであり得る。本明細書において使用される「アミノ酸」又は「残基」という用語には天然アミノ酸並びに他のアミノ酸（例えば、非天然アミノ酸、核酸配列によってコードされないアミノ酸、合成アミノ酸等）のＬ異性体とＤ異性体が含まれる。天然アミノ酸の例はアラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）である。翻訳後修飾天然アミノ酸はデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）及びラビオニン（Ｌａｂ）である。非天然アミノ酸の例が上に記載されている。非天然ポリペプチドは天然型のポリペプチドのアミノ酸配列と比較してそのアミノ酸配列に共有結合又は非共有結合した１つ以上の非アミノ酸置換基又は異種性アミノ酸置換基、例えばレポーター分子又は他のリガンドを含む場合がある。
化合物
本明細書では「化合物」という用語は本発明によるＲＮＡｉ分子などのあらゆる核酸分子、又はそのような核酸分子を含むあらゆる複合体を意味する。例えば、本明細書では化合物はＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７に対するＲＮＡｉ分子、具体的にはアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡであり得る。
組成物
「組成物」という用語が核酸分子化合物を説明するために使用される場合もある。核酸分子組成物は２０％未満の不純物、好ましくは１５％又は１０％未満の不純物、より好ましくは９％、８％、７％、又は６％未満不純物、最も好ましくは５％未満の不純物を有する。それらの不純物は主要核酸分子成分よりも１ヌクレオチド又は２ヌクレオチド短い（ｎ－１又はｎ－２）核酸分子であることが典型的である。
阻害剤
「阻害剤」という用語は当技術分野において知られており、その用語は特定のタンパク質（例えばＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７）の生理学的機能（すなわち活性）を完全又は部分的に抑制する、又は低下させることが可能な化合物／物質又は組成物に関する。本発明の背景において、ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の「阻害剤」はＰＡＰＤ５遺伝子産物又はＰＡＰＤ７遺伝子産物の発現の抑制又は低下によりそれぞれＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の活性／機能を抑制する、又は低下させることが可能である。したがって、ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の機能性（すなわち活性）であって、ポリＡポリメラーゼ機能を含む前記機能の低下に反映されるＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の発現レベルの低下（例えばＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７のｍＲＮＡレベルの低下、又はＰＡＰＤ５若しくはＰＡＰＤ７のタンパク質レベルの低下）がＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の阻害剤によって引き起こされ得る。よって、本発明の背景ではＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７の阻害剤はＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７のレベルを低下させることが可能であるＰＡＰＤ５発現又はＰＡＰＤ７発現の転写抑制因子も包含し得る。好ましい阻害剤は本発明の核酸分子である。
測定
本明細書では「測定すること」という用語は「分析すること」又は「決定すること」（すなわち検出及び／又は定量すること）も意味する。例えば、「ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を測定すること」という用語はＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性の量を決定すること、例えばＰＡＰＤ５ポリペプチド及び／又はＰＡＰＤ７ポリペプチド（すなわちタンパク質）の量を決定することを意味する。ＰＡＰＤ５タンパク質及び／又はＰＡＰＤ７タンパク質の量及び／又は活性を測定するための方法が当技術分野において知られており、本明細書において上に記載されている。これと合致して、「被験化合物がＨＢＶの増殖を阻害するか測定すること」という用語は被験化合物又は被験組成物がＨＢＶの増殖を阻害するか分析又は決定（すなわち検出及び／又は定量）することを意味する。
非限定的な図と実施例を参照することで本発明をさらに説明する。
実施例によって本発明を例示する。
材料と方法
オリゴヌクレオチドモチーフ配列及びオリゴヌクレオチド化合物
Figure 2022036182000011
Figure 2022036182000012
Figure 2022036182000013
 モチーフ配列は前記オリゴヌクレオチド内に存在する核酸塩基の連続配列を表す。
デザインはギャップマーデザインＦ－Ｇ－Ｆ’を指し、それぞれの数は連続修飾ヌクレオシド、例えば２’修飾ヌクレオシドの数（１番目の数＝５’フランク）、続いてＤＮＡヌクレオシドの数（２番目の数＝ギャップ領域）、続いて修飾ヌクレオシド、例えば２’修飾ヌクレオシドの数（３番目の数＝３’フランク）を表し、必ずしも標的核酸に対して相補的である連続配列の部分というわけではない追加のＤＮＡ及びＬＮＡの反復領域が所望によりその前、又はその後に続いてもよい。
Figure 2022036182000014
Figure 2022036182000015
Figure 2022036182000016
 モチーフ配列は前記オリゴヌクレオチド内に存在する核酸塩基の連続配列を表す。
デザインはギャップマーデザインＦ－Ｇ－Ｆ’を指し、それぞれの数は連続修飾ヌクレオシド、例えば２’修飾ヌクレオシドの数（１番目の数＝５’フランク）、続いてＤＮＡヌクレオシドの数（２番目の数＝ギャップ領域）、続いて修飾ヌクレオシド、例えば２’修飾ヌクレオシドの数（３番目の数＝３’フランク）を表し、必ずしも標的核酸に対して相補的である連続配列の部分というわけではない追加のＤＮＡ及びＬＮＡの反復領域が所望によりその前、又はその後に続いてもよい。
化合物の化学
ハイブリジェニクス・サービス・ＳＡＳによって実施されるＹ３Ｈスクリーニングに適切であるようにＤＨＱとＴＨＰの２種類の化学シリーズの各１種類の化合物を合成した。両化合物はＰＥＧ５リンカーを含み、且つ、トリメトプリム（ＴＭＰ）アンカーリガンドでタグされた（表５）。
Figure 2022036182000017
Ｙ３Ｈ ＵＬＴＩｍａｔｅ ＹＣｈｅｍＨ（商標）スクリーン
前記２種類の化合物はロッシュによってハイブリジェニクス・サービス・ＳＡＳに提供され、透過性と毒性について検査された。その後、化合物をハイブリジェニクスのｃＤＮＡヒト胎盤ライブラリー（ＰＬＡ）に対してスクリーニングした。それらのスクリーニングはハイブリジェニクスＵＬＴＩｍａｔｅ Ｙ２Ｈ（商標）向けに開発された最適化済み細胞間接合プロトコルに従って、異なる化合物濃度を用いて実施された（表６）。
Figure 2022036182000018
Ｙ３Ｈ ＵＬＴＩｍａｔｅ ＹＣｈｅｍＨ（商標）依存性アッセイ
前記スクリーンより得られたクローンを９６ウェルフォーマットで選び取り、スポットアッセイを用いる依存性アッセイにおいて選択条件（ＨＩＳ＋）下での増殖について陽性のクローンを評価した。前記タグ付き化合物が存在するときに選択培地上で増殖可能なクローンだけを選別し、処理（細胞溶解、ＰＣＲ，遺伝子シーケンシング）し、ＢＬＡＳＴ分析を用いてタンパク質アラインメントについてマップした。
Ｙ３Ｈ ＵＬＴＩｍａｔｅ ＹＣｈｅｍＨ（商標）１対１検証実験－プレイ断片
この検証工程ではそれぞれ１種類の特定された断片プレイと１種類の化学プローブ（ＨＢＸ１２９６５３、ＨＢＸ１２９６５４）を１対１実験において検査する。前記スクリーニングライブラリーから選択された３種類のプレイのプラスミドを酵母細胞から抽出し、大腸菌中で増幅し、そして再度ＹＨＧＸ１３酵母細胞に形質転換処理した。それぞれの相互作用について、トリプトファン、ロイシン、及びヒスチジンを含まず、且つ、前記化学プローブとＦＫ５０６を添加された選択培地上にフックコンストラクトとプレイコンストラクトの両方を発現する二倍体酵母培養物の１倍希釈物、１／１０希釈物、１／１００希釈物、及び１／１０００希釈物をスポットした。二回の複製実験で相互作用を検査した。各化合物及び各濃度（ＤＭＳＯ；５μＭ、１０μＭ、及び２０μＭのＨＢＸ１２９６５３；５μＭ、１０μＭ、及び２０μＭのＨＢＸ１２９６５４；５μＭのＨＢＸ２４７８６トリメトプリム（ＴＭＰ）；及び５μＭのＨＢＸ１２９６３４（ＴＭＰ－ＰＥＧ５－ＯＨ））に付き１枚のプレートを使用した。プレートを３０℃で３日間にわたってインキュベートした。
Ｙ３Ｈ ＵＬＴＩｍａｔｅ ＹＣｈｅｍＨ（商標）１対１検証実験－全長タンパク質
全長ＰＡＰＤ５ｖａｒ１のコード配列（ＮＭ＿００１０４０２８４．２）及び全長ＰＡＰＤ７ｖａｒＸ１のコード配列（ＸＭ＿００５２４８２３４．２）をそれらのタンパク質の（高ＧＣ含量を除くための）Ｎ末端側コドン最適化遺伝子断片と市販のＣ末端側領域のクローンから再構成し、元のｐＧＡＤＧＨからの派生物であるプラスミドｐＰ７（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｈａｒｔｌｅｙ， Ｄ．Ａ．編、１９９３年、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード内のＢａｒｔｅｌら著、１５３～１７９頁）内にＧａｌ４活性化ドメイン（ＡＤ）とイン・フレームになるようにクローン化した（ＡＤ－プレイ）。挿入断片全体をシーケンシングすることでそれらのコンストラクトを確認した。それぞれのプレイについて、二倍体酵母培養物を作製するために前記プレイプラスミドで形質転換されたＹＨＧＸ１３酵母細胞（Ｙ１８７ ａｄｅ２－１０１：：ｌｏｘＰ－ｋａｎＭＸ－ｌｏｘＰ， ｍａｔα）とＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）フックで形質転換されたＹＰＴ６ＡＴ酵母細胞（ｍａｔａ）との間でミニ交雑を実施した。それぞれの相互作用について、トリプトファン、ロイシン、及びヒスチジンを含まず、且つ、前記化学プローブとＦＫ５０６を添加された選択培地上にフックコンストラクトとプレイコンストラクトの両方を発現する二倍体酵母培養物の１倍希釈物、１／１０希釈物、１／１００希釈物、及び１／１０００希釈物をスポットした。二回の複製実験で相互作用を検査した。各化合物及び各濃度（ＤＭＳＯ；５μＭ、１０μＭ、及び２０μＭのＨＢＸ１２９６５３；５μＭ、１０μＭ、及び２０μＭのＨＢＸ１２９６５４；５μＭのＨＢＸ２４７８６トリメトプリム（ＴＭＰ）；及び５μＭのＨＢＸ１２９６３４（ＴＭＰ－ＰＥＧ５－ＯＨ））に付き１枚のプレートを使用した。プレートを３０℃で３日間にわたってインキュベートした。
Ｙ３Ｈ ＵＬＴＩｍａｔｅ ＹＣｈｅｍＨ（商標）－遊離化合物との競合
本競合アッセイは一定濃度の化学プローブ（ＨＢＸ１２９６５３、ＨＢＸ１２９６５４）と濃度上昇するその化学プローブの親化合物（ＭＯＬ６５３、ＭＯＬ６５４）又はその不活性型エナンチオマー（ＩＮＡＣＴ６５３、ＩＮＡＣＴ６５４）を使用する前記１対１検証に基づいている（表７）。前記遊離化合物について８種類の濃度（０μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、及び２０μＭ）、及び前記タグ付きＹ３Ｈ化合物について一定濃度（１μＭ）の選択培地上で本競合アッセイを実施した。
Figure 2022036182000019
ＨｅｐａＲＧ細胞培養
ＨｅｐａＲＧ細胞（Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、レンヌ、フランス；カタログ番号ＨＰＲ１０１）をウィリアムのＥ培地（ＧＩＢＣＯ）、培養培地サプリメント（Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃｓ、カタログ番号ＡＤＤ７１０）、及び１％（体積／体積）ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（Ｇｉｂｃｏ番号第３２５５１番）及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ番号第１５１４０番）からなる完全ＨｅｐａＲＧ培養培地の中で５％ＣＯ２含有加湿雰囲気下、３７℃において２週間にわたって培養した。分化を開始させるために集密細胞上の前記培養培地に０．９％（体積／体積）ＤＭＳＯ（シグマ・アルドリッチ、Ｄ２６５０）を添加した。１週間後に培地を完全分化培地（１．８％（体積／体積）ＤＭＳＯを添加したＨｅｐａＲＧ培養培地）に置き換え、７日毎に分化培地を交換しながらその中で細胞を約４週間にわたって維持した。分化したＨｅｐａＲＧ細胞（ｄＨｅｐａＲＧ）は胆管細胞様細胞に囲まれた肝細胞様細胞島を示した。ＨＢＶ感染及び化合物処理の前にｄＨｅｐａＲＧ細胞を１００μＬの完全分化培地中にウェル当たり６０，０００細胞の割合でコラーゲンＩ被覆９６ウェルプレート（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１１４２８－０３）に播種した。ＨＢＶ感染の前に播種後約１週間にわたって９６ウェルプレート中で細胞に分化表現型を回復させた。
ｄＨｅｐａＲＧ細胞のＨＢＶ感染
３０のＭＯＩでＨＢＶ粒子をｄＨｅｐａＲＧ細胞に感染させた。それらのＨＢＶ粒子はＨＢＶ産生ＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ｓｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ １９８７ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８４， １００５－１００９）から生産された。ｄＨｅｐａＲＧの培養条件、分化、及びＨＢＶ感染はこれまでに記載されている（Ｈａｎｔｚ， ２００９， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ２００９， ９０： １２７－１３５）。簡単に説明すると、４％ＰＥＧ－８０００とウイルスストック（２０～３０ＧＥ／細胞）を含む完全分化培地（ウィリアムのＥ培地（ＧＩＢＣＯ）、培養培地サプリメント（Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃｓ、カタログ番号ＡＤＤ７１０）及び１％（体積／体積）ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（Ｇｉｂｃｏ番号第３２５５１番）及び１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ番号第１５１４０番）から成り、１．８％（体積／体積）ＤＭＳＯを添加されたＨｅｐａＲＧ培養培地）を添加した（１２０μＬ／ウェル）。感染から１日後にリン酸緩衝生理食塩水でそれらの細胞を３回洗浄し、その実験中に培地（完全分化培地）を２日毎に交換した。
ＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧのｓｉＲＮＡ処理
４種類の異なるｓｉＲＮＡのプール（ＯＮ ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ）をＧＥ Ｄｈａｒｍａｃｏｎより取得した（表８）。
Figure 2022036182000020
ＨＢＶ細胞を使用する感染の１日前と感染の４日後にＰＡＰＤ５かＰＡＰＤ７のどちらか、又は両方に対するｓｉＲＮＡプール、又は対照としての非ターゲティングｓｉＲＮＡで細胞を処理した。製造業者のプロトコルに従ってＤｈａｒｍａＦｅｃｔ ４（ＧＥ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ；カタログ番号Ｔ－２００４－０１）及びＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号５１９８５０３４）を使用してそれらのｓｉＲＮＡ（それぞれ２５ｎＭ）を形質移入した。その実験を１１日間にわたって行った。
ＨＢＶ抗原の測定
ＨＢＶ抗原の発現と分泌に対する影響を評価するために１１日目に上清を収集した。製造業者のプロトコルに従ってＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ；番号ＣＬ０３１０－２、番号ＣＬ０３１２－２）を使用してＨＢＶのＨＢｓＡｇレベルとＨＢｅＡｇレベルを測定した。簡単に説明すると、ウェル当たり２５μＬの上清を各抗体で被覆されたマイクロタイタープレートに移し、２５μＬの酵素複合体試薬を添加した。そのプレートを振盪器上で６０分間にわたって室温でインキュベートした後に自動洗浄機を使用してウェルを洗浄緩衝液で５回洗浄した。２５μＬの基質Ａと基質Ｂを各ウェルに添加した。それらのプレートを振盪器上で１０分間にわたって室温でインキュベートした後にＥｎｖｉｓｉｏｎ発光リーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して発光を測定した。
細胞生存度
ＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧ細胞から上清培地を取り除いた後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ Ｏｎｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に細胞をインキュベートして細胞生存度を測定した。
ＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧ細胞のＬＮＡオリゴヌクレオチド処理後に製造業者のプロトコルに従ってセルカウンティングキット８（シグマ・アルドリッチ、番号９６９９２）を使用して細胞生存度を測定した。簡単に説明すると、細胞から培地を取り除き、９％のセルカウンティングキット８を含有する１１０μＬの培地と交換した。細胞を３７℃で１時間にわたってインキュベートした。上清を新しい９６ウェルプレートに移し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ発光リーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
細胞内ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ
細胞内ｍＲＮＡを単離するためにｄＨｅｐａＲＧをＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で１回洗浄し、そしてマグナピュア「９６細胞内ＲＮＡラージボリュームキット」（ロッシュ；番号０５４６７５３５００１）を使用して溶解した。それらの溶解物は－８０℃で貯蔵可能である。リアルタイムｑＰＣＲ反応のためにＡＢ７９００ ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現マスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。ＨＢＶ ｍＲＮＡの検出のためにＨＢＶコア特異的プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（表９）を使用し、ｓｉＲＮＡの存在下でのＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の減少の測定のために遺伝子特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）発現アッセイプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＰＡＰＤ５：カタログ番号４３３１１８２；ＰＡＰＤ７：カタログ番号４３３１１８２）を使用した。β－アクチンに対するＴａｑＭａｎ（登録商標）発現アッセイプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＰＡＰＤ５：カタログ番号４３３１１８２）を使用して試料を正規化した。
Figure 2022036182000021
ウイルス調製物からのＨＢＶ ＤＮＡの抽出と定量
以下の最適化を行うと共に製造業者のプロトコルに従ってＱＩＡａｍｐウルトラセンス・ウイルスキット（Ｑｉａｇｅｎ、番号５３７０４）を使用してＨＢＶ ＤＮＡの抽出を実施する。緩衝液ＡＣを添加する前に３０μＬと３μＬのウイルス試料を１ｍＬのＰＢＳに希釈する。１回目の遠心分離工程を最高速度及び４℃で４５分間にわたって行う。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、番号４３６９０１６）、及び１００μＭの濃度にした上記の表９に表示のプライマーとプローブの１：１：０．５の比率のプレミックスを使用するｑＰＣＲによってＨＢＶ ＤＮＡの定量を二回の複製実験で行う。次の設定でそのｑＰＣＲを実施する。ＵＤＧインキュベーション（２分、５０℃）、酵素活性化（１０分、９５℃）、及びｑＰＣＲ（変性のための９５℃で１５秒の処理、及びアニーリングと伸長のための６０℃で１分の処理を含むサイクルを４０回）。ゲノム等量の計算は既知の濃度のＨＢＶ Ｄ遺伝子型プラスミド希釈物から生成された検量線に基づく。
オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチド合成は一般的に当技術分野において知られている。適用可能であるプロトコルを以下に示す。使用する装置、支持体、及び濃度に関して方法を少し変更することにより本発明のオリゴヌクレオチドを作製した可能性がある。
Ｏｌｉｇｏｍａｋｅｒ ４８上でホスホロアミダイトアプローチを用いて１μｍｏｌスケールでオリゴヌクレオチドをウリジンユニバーサル支持体上に合成する。合成の最後に６０℃で５～１６時間にわたってアンモニア水を使用してその固相支持体からオリゴヌクレオチドを切り離す。逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）又は固相抽出によってそれらのオリゴヌクレオチドを精製し、ＵＰＬＣによって特徴を分析し、ＥＳＩ－ＭＳによって分子質量をさらに確認する。
オリゴヌクレオチドの伸長
アセトニトリル中の５’－Ｏ－ＤＭＴ保護アミダイトの０．１Ｍ溶液と活性化剤としてのアセトニトリル中のＤＣＩ（４，５－ジシアノイミダゾール）の溶液（０．２５Ｍ）を使用してβ－シアノエチルホスホロアミダイト（ＤＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ－Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｔ、ＬＮＡ－５－メチル－Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ｇ（ｄｍｆ）、又はＬＮＡ－Ｔ）の結合を実施する。所望の修飾、例えば結合基を結合するためのＣ６リンカー又は結合基それ自体を有するホスホロアミダイトを最後のサイクルに使用することができる。キサンタンヒドリド（９：１アセトニトリル／ピリジン混液中の０．０１Ｍ）を使用することによりホスホルチオエート結合を導入するためのチオール化を実施する。７：２：１のＴＨＦ／ピリジン／水の混液中の０．０２Ｍヨウ素を使用してホスホルジエステル結合を導入することができる。残りの試薬はオリゴヌクレオチド合成に典型的に使用される試薬である。
固相合成後の複合体化のために市販のＣ６アミノリンカーホスホロアミダイトを固相合成の最後のサイクルに使用することができ、脱保護と固相支持体からの切断の後にそのアミノ結合脱保護化オリゴヌクレオチドを単離する。標準的な合成方法を使用して官能基の活性化を経てその複合体が導入される。
ＲＰ－ＨＰＬＣによる精製
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ １０μ １５０ｘ１０ ｍｍカラム上での調製的ＲＰ－ＨＰＬＣにより前記粗製化合物を精製する。０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８とアセトニトリルの混液を緩衝液として５ｍＬ／分の流速で使用する。集めた画分を凍結乾燥して精製した化合物を典型的には白色の固形物として産出する。
略語
ＤＣＩ：４，５－ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’－ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ－ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
Ｔmアッセイ
オリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的（リン酸結合型、ＰＯ）の二重鎖を５００ｍｌのＲＮａｓｅ非含有水中に３ｍＭに希釈し、５００ｍｌの２×Ｔm緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と混合する。その溶液を３分間にわたって９５℃まで加熱し、その後で３０分間にわたって室温でアニーリングさせた。ペルティエ温度プログラマーＰＴＰ６を搭載したＬａｍｂｄａ ４０ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計上でＰＥ Ｔｅｍｐｌａｂソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）をして二重鎖の融点（Ｔm）を測定する。温度を２０℃から９５℃まで徐々に上げ、その後で２５℃まで下げ、２６０ｎｍでの吸光を記録する。１次導関数及び融解とアニーリングの両方の極大を使用して二重鎖のＴmを評価する。
実施例１：ＤＨＱ及びＴＨＰはＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７に結合する
ＰＡＰＤ５／７はＤＨＱ及びＴＨＰの共通の相互作用パートナーとしてＹ３Ｈ ＵＬＴＩｍａｔｅ ＹＣｈｅｍＨスクリーニングにおいて特定された。
材料と方法の節において記載されたような両化合物（ＤＨＱ及びＴＨＰ）についてのＹ３Ｈスクリーニングにおいて多数の断片によってＰＡＰＤ５（変異体１：ＮＰ＿００１０３５３７４；変異体２：ＮＰ＿００１０３５３７５）とＰＡＰＤ７（ＸＰ＿００５２４８２９１）の両方のタンパク質が特定された。それらの特定されたタンパク質はハイブリジェニクスによって（スケールＡ～Ｄのうちの）Ａという信頼スコアを与えられた（表１０）。
Figure 2022036182000022
特定されたプレイ断片のＹ３Ｈ ＵＬＴＩｍａｔｅ ＹＣｈｅｍＨ１対１検証とさらに全長タンパク質での検証を用いてＤＨＱ及びＴＨＰとのＰＡＰＤ５／７の相互作用が確認できた。
第１の検証工程では（材料と方法の節において記載されたような）１対１検証アッセイのために第１のスクリーニングで特定された３種類の断片を選択し、それらの断片を３つの異なる濃度（５μＭ、１０μＭ、及び２０μＭ）で試験した（表１１）。
Figure 2022036182000023
３種類の断片全てが既に最低の試験濃度でＤＨＱとＴＨＰの特異的結合体として検証できた（図１）。
第２の検証工程ではＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の全長タンパク質を合成し、ＤＨＱ及びＴＨＰとの（材料と方法の節において記載されたような）１対１検証に使用した（表１２）。
Figure 2022036182000024
これらの全長タンパク質とＤＨＱ及びＴＨＰとの間の相互作用が最低の試験濃度で確認され、それらの化学プローブに対して特異的であることが示された（図２）。
Ｙ３ＨにおけるＤＨＱ及びＴＨＰとのＰＡＰＤ５／７の相互作用について両方の遊離活性型化合物は競合可能であるが、不活性型エナンチオマーは競合しない。
タンパク質断片並びに全長ＰＡＰＤ５及び全長ＰＡＰＤ７へのＤＨＱとＴＨＰの結合の検証後に不活性型又は活性型の遊離化合物のどちらかを使用する（材料と方法の節において記載されたような）Ｙ３Ｈ ＵＬＴＩｍａｔｅ ＹＣｈｅｎＨ競合実験においてその結合を確認した（表１３）．前記不活性型エナンチオマーが存在するときではなく前記親活性型化合物が存在するときに酵母の増殖低下が減少したことは、前記親化合物が前記化学プローブと競合し、前記タンパク質標的と相互作用することを意味する。
全ての試験化合物について、製造業者のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存度発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて最高の濃度（２０μＭ）での非選択培地上の毒性を検査した。酵母の増殖は影響を受けなかったのでこの濃度ではどの化合物についても毒性が認められなかった（データを示さず）。両方の活性型親化合物（ＤＨＱ及びＴＨＰについてそれぞれＭＯＬ６５３及びＭＯＬ６５４）について競合が観察可能であり、断片との相互作用についての競合に必要な濃度よりも全長タンパク質への結合についての競合に必要な濃度が低かった（図３及び図４）。交差競合の成功はＤＨＱ及びＴＨＰがＰＡＰＤ５／７に対して共通の結合側面を有する、又は少なくとも相互に近接して結合していることを示唆する。
Figure 2022036182000025
実施例２：ｓｉＲＮＡを使用するＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の阻害による効果的なＨＢＶ感染症の治療
ＤＨＱ及びＴＨＰのＰＡＰＤ５／７への結合とこれらの２種類のタンパク質のＨＢＶ遺伝子発現に対する影響を相関づけるため、我々は自然にＨＢＶに感染したｄＨｅｐａＲＧにおいてこれらのタンパク質を減少させ、この減少のウイルスパラメーターに対する影響をモニターするためにＲＮＡｉ技術を使用した。そのために我々は材料と方法の節に記載されているようにＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧ細胞においてＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７に対するｓｉＲＮＡプール（表８参照）を使用した。
ＰＡＰＤ５の減少により、（材料と方法の節に記載されているようなＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡ及びリアルタイムＰＣＲを用いて測定される）分泌されたＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ、並びに細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡによって評価されるウイルス発現の阻害が生じた。ＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡの減少がＨＢＶ遺伝子の発現を劇的に低下させた一方でＰＡＰＤ７の阻害が有するＨＢＶ発現に対する効果は控えめであった（図７）。しかしながらＰＡＰＤ７とＰＡＰＤ５に対するｓｉＲＮＡが混合されると相乗的抗ＨＢＶ活性の増強が観察され（図７）、ＰＡＰＤ５が存在しないときの補正的役割がＰＡＰＤ７について示唆された。
実施例３：ＤＨＱ及びＴＨＰによってＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇが効率的に減少する
ＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇを読みだされた情報として使用してＤＨＱ及びＴＨＰ及びそれらの変異体のＨＢＶ感染症に対する有効性をＨｅｐＧ２．２．１５細胞において測定した。
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ｓｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ １９８７ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８４， １００５－１００９）を９６ウェルプレート（１００ｕＬ中に１５．０００細胞／ウェル）内でＤＭＥＭ＋ＧｌｕＴａＭａｘ－１（ＧｉＢＣＯ；カタログ番号１０５６９）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧｉＢＣＯ；カタログ番号１５１４０）、１０％ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ番号６３１１０６）、０．２５ｕｇ／ｍｌジェネテシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１０１３１０３５）中に培養した。ＤＭＳＯ中に１００μＭが最高濃度の３倍段階希釈物である９段階希釈物を使用して前記化合物を試験した。四回の複製実験で各化合物を試験した。それらの細胞を３日間にわたってインキュベートし、上清を収集し、そして材料と方法の節に記載されているようにＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇを測定した。
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌の減少における試験された化合物のＩＣ50値が下に示されている。
ＨＢＸ１２９６５３（ＤＨＱ－ＴＭＰ）：ＩＣ50 ＨＢｓＡｇ １．１８１ｕＭ
ＨＢＸ１２９６５４（ＴＨＰ－ＴＭＰ）：ＩＣ50 ＨＢｓＡｇ ０．２９９ｕＭ
ＭＯＬ６５３（ＤＨＱ－遊離活性型）：ＩＣ50 ＨＢｓＡｇ ０．００３ｕＭ；ＩＣ50 ＨＢｅＡｇ ０．００７ｕＭ
ＭＯＬ６５４（ＴＨＰ－遊離活性型）：ＩＣ50 ＨＢｓＡｇ ０．００３ｕＭ
ＩＮＡＣＴ６５３（ＤＨＱ－遊離不活性型）：ＩＣ50 ＨＢｓＡｇ ３．１５ｕＭ
ＩＮＡＣＴ６５４（ＴＨＰ－遊離不活性型）：ＩＣ50 ＨＢｓＡｇ ＞２５ｕＭ
実施例４：ＰＡＰＤ５を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ効力についてのスクリーニング
１６～２０ｍｅｒのギャップマーを使用してオリゴヌクレオチドスクリーニングをＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡに対して行った。ＨｅＬａ細胞でのインビトロ実験において効力の試験を実施した。
細胞株
ＨｅＬａ細胞株を欧州培養細胞株系統保存機関より購入し（ＥＣＡＣＣ、番号９３０２１０１３）、供給者が推奨するように３７℃で５％のＣＯ２を含む加湿インキュベーターの中で維持した。アッセイのために１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミンＡＱ、１％ＮＥＡＡ、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むイーグル最小基本培地（シグマ、Ｍ２２７９）の中でウェル当たり２，５００細胞を９６マルチウェルプレートに播種した。
オリゴヌクレオチドの効力
ＰＢＳ中に溶解したオリゴヌクレオチドを添加する前に２４時間にわたって細胞を培養した。オリゴヌクレオチドの終濃度は５μＭと２５μＭであり、最終培養体積はウェル当たり１００μｌであった。オリゴヌクレオチド化合物の添加から３日後にそれらの細胞を収集し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ）を製造業者の指示に従って使用してＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ／ＬＮＡ二重鎖の変性（９０℃、４０秒）の後に供給業者の推奨に従う目的の遺伝子であるＰＡＰＤ５（Ｈｓ００２２３７２７＿ｍ１、ＦＡＭ－ＭＧＢ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とハウスキーピング遺伝子であるＧＵＳＢ（Ｈｕ＿４３２６３２０Ｅ、ＶＩＣ－ＭＧＢ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）向けのＴａｑＭａｎプライマーアッセイを用いる二重鎖設定でワンステッププロトコル（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのｑＳｃｒｉｐｔ（商標） ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）番号９５１３４－５００）でＱＰＣＲを行った。相対的なＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ発現レベルが対照試料（ＰＢＳ処理細胞）の平均の割合（％）として表１４に示されている。図８はＰＡＰＡＤ５コード配列にわたる個々のオリゴヌクレオチド化合物によって達成された標的ノックダウンを提示している。
Figure 2022036182000026
Figure 2022036182000027
Figure 2022036182000028
Figure 2022036182000029
Figure 2022036182000030
Figure 2022036182000031
実施例５：ＰＡＰＤ７を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ効力についてのスクリーニング
目的の遺伝子であるＰＡＰＤ７（Ｈｓ００１７３１５９＿ｍ１、ＦＡＭ－ＭＧＢ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）向けのＴａｑＭａｎプライマーアッセイに置き換えて基本的に実施例４に記載されているようにオリゴヌクレオチドスクリーニングをＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡに対して行った。
相対的なＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ発現レベルが対照試料（ＰＢＳ処理細胞）の平均の割合（％）として表１５に示されている。図９はＰＡＰＡＤ５コード配列にわたる個々のオリゴヌクレオチド化合物によって達成された標的ノックダウンを提示している。
Figure 2022036182000032
Figure 2022036182000033
Figure 2022036182000034
Figure 2022036182000035
Figure 2022036182000036
Figure 2022036182000037
実施例６：ジムノシスにより細胞に送達されたＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７を標的とする選択的アンチセンスオリゴヌクレオチド使用のＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧ細胞に対する効果
実施例４と実施例５より選ばれた最も有効なオリゴヌクレオチドはＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧ細胞におけるＨＢＶ増殖パラメーターに対する効果を検査するために選択された。
ＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧ細胞（材料と方法の節のｄＨｅｐａＲＧ細胞のＨＢＶ感染において説明された）を９６ウェルプレートに培養した。ＨＢＶ感染から１日後に非支援型取込み（ジムノシス）を用いて２０μＭのオリゴヌクレオチドを細胞に送達した。ＰＡＰＤ５を標的とする２０種類とＰＡＰＤ７を標的とする２０種類の合計で４０種類のオリゴヌクレオチドを検査した。ＰＢＳ対照を含めてそれらの実験を三回行った。培地交換を含むオリゴヌクレオチド処理を４日目と７日目に反復した（これは材料と方法の節に記載される２日毎の交換と異なる）。
感染後１１日目に上清を収集し、ＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇのレベルを評価した（材料と方法のＨＢＶ抗原の測定を参照されたい）。材料と方法の節の細胞生存度において記載されたように細胞生存度を測定した。マグナピュアロボットとマグナピュア９６細胞内ＲＮＡラージボリュームキット（ロッシュ，番号０５４６７５３５００１）を製造業者のプロトコルに従って使用して前記細胞からｍＲＮＡを抽出した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴａｑＭａｎ ＲＮＡ－ｔｏ－ＣＴワンステップキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、番号４３９２９３８）、ヒトＡＣＴＢ内在性対照（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、番号４３１０８８１Ｅ）を使用するｑＰＣＲによってＨＢＶ ｍＲＮＡとＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ又はＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの定量を二回の技術的複製実験で行った。Ｔａｑｍａｎ試薬を次の市販のＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃプライマー（ＨＢＶ、Ｐａ０３４５３４０６＿ｓ１；ＰＡＰＤ５、Ｈｓ００９００７９０＿ｍ１；及びＰＡＰＤ７、Ｈｓ００１７３１５９＿ｍ１）と共に使用した。基準遺伝子であるＡＣＴＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃ、４３１０８８１Ｅ）とＰＢＳ処理細胞に対して正規化される比較サイクル閾値２－ΔΔＣｔ法を用いてｍＲＮＡ発現を分析した。
前記オリゴヌクレオチド処理のＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ又はＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡに対する効果並びにＨＢＶ増殖パラメーターＨＢｓＡｇに対する効果が表１６及び表１７に示されている。
Figure 2022036182000038
Figure 2022036182000039
ＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ（表１６）及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ（表１７）の抑制は前記オリゴヌクレオチド化合物の大半について非常に効率的であったことがこれらのデータから理解可能である。
しかしながらＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの減少がＨＢｓＡｇレベルに与える観察された効果はオリゴヌクレオチドの非支援型送達から１１日間にわたって処理された細胞であってもあまり顕著ではない。ここではＣＭＰ番号２３＿１，２６＿１、及び１１５＿１のＰＡＰＤ５標的化合物だけが明確なＨＢｓＡｇ抑制を示し、ＣＰＭ番号２２９＿１のＰＡＰＤ７標的化合物だけが明確なＨＢｓＡｇ阻害を示した。理論に捉われるわけではないが、これは、標的のノックダウンによって引き起こされるＨＢｓＡｇ抑制に対する効果が現れるのが本アッセイでは遅く、したがって幾つかの化合物ではもっと遅い時点でアッセイされなければＨＢｓＡｇ抑制が観察されないことに起因する可能性がある。
実施例７：ジムノシスにより細胞に送達されたＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７標的アンチセンスオリゴヌクレオチド混合製剤使用のＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧ細胞に対する効果
実施例２ではＰＡＰＤ５標的ｓｉＲＮＡプールとＰＡＰＤ７標的ｓｉＲＮＡプールの混合により相乗的な抗ＨＢＶ活性が生じることが観察された。本実施例は１本がＰＡＰＤ５を標的とし、１本がＰＡＰＤ７を標的とする２本の個々の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを混合したときに同様の相乗効果が観察され得るか調査することに着手する。
ＰＡＰＤ５を標的とする１種類のオリゴヌクレオチドの２０μＭがＰＡＰＤ７を標的とする２種類目のオリゴヌクレオチドの２０μＭと共に添加されるように個々のオリゴヌクレオチドを添加する代わりに２種類のオリゴヌクレオチドの混合物を前記細胞に添加するという変更を加えて実施例６において説明されたように実験を実施した。ＨＢｓＡｇだけをその混合物について測定した。
ＨＢＶ増殖パラメーターであるＨＢｓＡｇ抑制に対する結果を含めてオリゴヌクレオチドの組合せを表１８に見ることができる。
Figure 2022036182000040
図１０にも結果が要約されている。ＨＢｓＡｇの抑制について上記の試験した４０種類の混合物のうちの１８種類で明確な相乗効果が生じた。これらの相乗的な混合物のうちの７種類は本アッセイでＨＢｓＡｇの抑制に対して個別では何の効果も無かったオリゴヌクレオチドの混合物である。ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７標的オリゴヌクレオチド混合物はＨＢｓＡｇの抑制に対して相乗的効果をもたらす高い可能性を有することがこの実験から結論することができる。
実施例８：実施例７で選択した混合の反復
表１９に表示されるオリゴヌクレオチド混合物を使用して実施例７の実験を反復した。
Figure 2022036182000041
実施例７において認められた相乗効果が繰り返されることがこれらのデータから理解可能である。
実施例９：形質移入により細胞に送達されたＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７を標的とする選択的アンチセンスオリゴヌクレオチド使用のＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧ細胞に対する効果
非支援型送達の代わりにＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧ細胞への前記オリゴヌクレオチドの形質移入を用いて同様の相乗的な結果が達成され得るか以下の実験において調査した。
ここで説明される形質移入アッセイを用いて１２種類のＰＡＰＤ５標的オリゴヌクレオチド（表２０）と１３種類のＰＡＰＤ７標的オリゴヌクレオチド（表２１）を個別に試験した。ＨＢＶでの感染（材料と方法の節のｄＨｅｐａＲＧ細胞のＨＢＶ感染において説明された）から１日後の分化したＨｅｐａＲＧ細胞にウェル当たり５００ｎＭの終濃度でオリゴヌクレオチドを９６ウェルプレートフォーマットで形質移入した。形質移入の前に培地を１００ｕＬのペニシリン／ストレプトマイシン非含有完全分化培地で置き換えた。一回のオリゴヌクレオチド処理につきオリゴヌクレオチドをＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ－Ｉ血清低減培地（Ｇｉｂｃｏ、番号５１９８５）中に希釈し、製造業者の指示に従って室温で５分間にわたってリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号５６５３２）と１：１の比率でインキュベートした。その後、このＬＮＡ形質移入試薬混合物から２０μｌをそれらの細胞の上に添加した。３日後、培地を完全分化培地で置き換えた。形質移入から５日後に材料と方法の節に記載されているようにＨＢｓＡｇを測定し、実施例６に記載されているようにＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡとＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡを測定した。
さらにＰＡＰＤ５オリゴヌクレオチドとＰＡＰＤ７オリゴヌクレオチドのうちの幾つかを組み合わせて試験した（表２２）。それぞれのオリゴヌクレオチドを５００ｎＭの終濃度で使用して個別処理と同じプロトコルを用いてそれらのオリゴヌクレオチドをＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞に共形質移入した。
Figure 2022036182000042
Figure 2022036182000043
Figure 2022036182000044
形質移入アッセイを用いるとＰＡＰＤ５を標的とする１２種類のオリゴヌクレオチドのうちの６種類がＨＢｓＡｇの抑制に対して明確な効果を有しており、実施例６のジムノシスアッセイでの観察結果よりもかなり多いことがこれらのデータから理解可能である。また、ＨＢｓＡｇの抑制に対して効果を有するＰＡＰＤ７標的化合物の数は形質移入アッセイを用いると増加しており、１２種類の化合物のうちの４種類がＨＢｓＡｇの抑制に対して明確な効果を有している。前記混合物のデータが表２２と図１１に要約されている。試験した１２種類の混合物のうちの９種類によってＨＢｓＡｇの抑制に対して明確な相乗的効果が生じることがこれらのデータから理解可能である。

Claims (22)

  1. Ｂ型肝炎ウイルス感染症の治療及び／又は予防に使用するための核酸分子であって、ＰＡＰ関連ドメイン含有タンパク質５（ＰＡＰＤ５）の発現及び／又は活性を阻害する前記核酸分子を含む組成物。
  2. 前記組成物が
    （ａ）ＰＡＰＤ５の発現及び／又は活性を阻害する核酸分子、及び
    （ｂ）ＰＡＰ関連ドメイン含有タンパク質７（ＰＡＰＤ７）の発現及び／又は活性を阻害する核酸分子
    を含む混合製剤である、請求項１に記載の使用のための組成物。
  3. 前記核酸分子が
    （ａ）一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、
    （ｂ）ｓｉＲＮＡ分子、
    （ｃ）ｓｈＲＮＡ分子、及び
    （ｄ）次のものを含むゲノム編集装置、
    （ｉ）部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼ、又は部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、及び
    （ｉｉ）ガイドＲＮＡ、又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
    からなる群より独立して選択される、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。
  4. 前記核酸分子が
    （ａ）ＰＡＰＤ５標的核酸に対して少なくとも８０％の相補性を有する１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、且つ、ＰＡＰＤ５の発現を低下させることが可能である一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び
    （ｂ）ＰＡＰＤ７標的核酸に対して少なくとも８０％の相補性の相補性を有する１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、且つ、ＰＡＰＤ７の発現を低下させることが可能である一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド
    から選択される、請求項２又は３に記載の使用のための組成物。
  5. 前記組成物によってＨＢｓＡｇの分泌が減少し、ＨＢｅＡｇの分泌が減少し、且つ／又は細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡ若しくはＨＢＶ ＤＮＡの生産が阻害される、請求項１～４の何れか一項に記載の使用のための組成物。
  6. 前記組成物によって慢性ＨＢＶ感染症の発症が抑制され、且つ／又はＨＢＶ感染者の感染性が低下する、請求項１～５の何れか一項に記載の使用のための組成物。
  7. Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物又は組成物を特定するための方法であって、
    （ａ）ＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７を発現する細胞と被験化合物又は被験組成物を接触させること、
    （ｂ）前記被験化合物又は被験組成物が存在する状態と存在しない状態でＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を測定すること、及び
    （ｃ）ＨＢＶ感染症を予防、改善、及び／又は抑制する化合物としてＰＡＰＤ５及び／又はＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を低下させる化合物又は組成物を特定すること
    を含む前記方法。
  8. 前記被験化合物が核酸分子ライブラリーであり、且つ、工程（ｃ）によってＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７のｍＲＮＡ発現を少なくとも６０％低下させる核酸分子が特定される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記被験組成物がＰＡＰＤ５を減少させることが可能な核酸分子とＰＡＰＤ７を減少させることが可能な核酸分子の混合製剤である、請求項７に記載の方法。
  10. ＨＢＶの増殖を阻害する前記化合物がＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の分泌を阻害し、且つ／又はＨＢＶエンベロープ抗原（ＨＢｅＡｇ）の分泌を阻害し、且つ／又は細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡの生産を阻害する、請求項７～９の何れか一項に記載の方法。
  11. １０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列であって、ＰＡＰＤ５標的核酸に対して少なくとも８０％相補的である前記連続ヌクレオチド配列を含み、又は前記連続ヌクレオチド配列から成り、且つ、ＰＡＰＤ５の発現を低下させることが可能である一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  12. １０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列であって、ＰＡＰＤ７標的核酸に対して少なくとも８０％相補的である前記連続ヌクレオチド配列を含み、又は前記連続ヌクレオチド配列から成り、且つ、ＰＡＰＤ７の発現を低下させることが可能である核酸分子。
  13. 前記核酸分子が一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１２に記載の核酸分子。
  14. １個以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む請求項１１～１３の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は核酸分子。
  15. 前記１個以上の２’糖修飾ヌクレオシドが２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アルコキシ－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アミノ－ＤＮＡヌクレオシド、２’－フルオロ－ＤＮＡヌクレオシド、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ヌクレオシド、２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシド、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立して選択される、請求項１４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は核酸分子。
  16. 前記１個以上の２’糖修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、請求項１４又は１５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は核酸分子。
  17. 前記連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１１～１６の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は核酸分子。
  18. 前記オリゴヌクレオチドが式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーであり、Ｆ領域とＦ’領域は独立して１～７個の２’糖修飾ヌクレオシドを含み、Ｇ領域はＲＮａｓｅ Ｈの動員が可能な６ヌクレオシドと１６ヌクレオシドの間の領域である、請求項１１又は請求項１３～１７の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  19. 請求項１１～１８の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は核酸分子、及び前記オリゴヌクレオチドに共有結合している少なくとも１つの結合部分を含む複合体。
  20. （ａ）ＰＡＰＤ５の発現及び／又は活性を阻害する核酸分子、及び
    （ｂ）ＰＡＰＤ７の発現及び／又は活性を阻害する核酸分子
    を含む混合製剤。
  21. 前記核酸分子が請求項１１～１８の何れか一項から選択されるか、又は請求項１９に記載の複合体である、請求項２０に記載の混合製剤。
  22. 請求項１１～１８の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は核酸分子、又は請求項１９に記載の複合体、又は請求項２０又は２１に記載の混合製剤を含む医薬組成物。
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