CN109328237A - 用于治疗乙型肝炎感染的papd5和papd7抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定预防、改善和/或抑制乙型肝炎病毒(HBV)感染的化合物的方法，其中(i)降低PAP相关结构域5(PAPD5)和/或PAP相关结构域7(PAPD7)的表达和/或活性的化合物；和/或(ii)结合PAPD5和/或PAPD7并抑制HBV的增殖的化合物；被鉴定为预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物。本发明还提供用于治疗和/或预防HBV感染的PAPD5或PAPD7的抑制剂；以及包含PAPD5抑制剂和PAPD7抑制剂的组合制剂，用于同时或依次用于治疗或预防HBV感染。本发明还包括用于治疗和/或预防HBV感染的药物组合物、以及监测治疗HBV感染期间的治疗成功的方法。

Description

用于治疗乙型肝炎感染的PAPD5和PAPD7抑制剂
发明领域
本发明涉及鉴定预防、改善和/或抑制乙型肝炎病毒(HBV)感染的化合物的方法，其中(i)降低PAP相关结构域5(PAP associated domain containing 5，PAPD5)和/或PAP相关结构域7(PAP associated domain containing 7，PAPD7)的表达和/或活性的化合物；和/或(ii)结合PAPD5和/或PAPD7并抑制HBV的增殖的化合物；被鉴定为预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物。本发明还提供了用于治疗和/或预防HBV感染的PAPD5和/或PAPD7的抑制剂；以及包含PAPD5抑制剂和PAPD7抑制剂的组合制剂，用于同时或依次用于治疗或预防HBV感染。本发明还包括用于治疗和/或预防HBV感染的药物组合物，以及监测HBV感染治疗期间治疗成功的方法。
背景
乙型肝炎病毒(HBV)是包膜的、部分双链的DNA病毒。紧凑的3.2kb HBV基因组由四个重叠的开放阅读框(ORF)组成，其编码核心、聚合酶(Pol)、包膜和X蛋白。Pol ORF最长，包膜ORF位于其中，而X和核心ORF与Pol ORF重叠。HBV的生命周期具有两个主要事件：1)从松弛环状(RC DNA)生成闭合环状DNA(cccDNA)，和2)前基因组RNA(pgRNA)逆转录产生RC DNA。在宿主细胞感染之前，HBV基因组作为RC DNA存在于病毒体内。已经确定HBV病毒体能够通过非特异性结合存在于人肝细胞表面上的带负电荷的蛋白聚糖(Schulze,Hepatology,46,(2007),1759-68)以及通过HBV表面抗原(HBsAg)与肝细胞牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)受体的特异性结合(Yan,J Virol,87,(2013),7977-91)而进入宿主细胞。病毒感染的控制需要对宿主先天免疫系统进行严密监视，该先天免疫系统可以在感染后数分钟到数小时内应答，以影响病毒的初始生长并限制发展成慢性和持续性感染。尽管目前可获得基于IFN和核苷(酸)类似物的治疗，但HBV感染仍然是世界范围内的主要健康问题，其涉及估计3.5亿具有较高肝硬化和肝细胞癌风险的慢性携带者。
肝细胞和/或肝内免疫细胞响应HBV感染分泌的抗病毒细胞因子在感染肝脏的病毒清除中起重要作用。
然而，由于病毒采取多种逃逸策略来抵抗宿主细胞识别系统和随后的抗病毒应答，慢性感染的患者仅显示出弱的免疫应答。
许多观察表明，几种HBV病毒蛋白可以通过干扰病毒识别信号系统和随后的干扰素(IFN)抗病毒活性来抵抗最初的宿主细胞应答。其中，HBV空亚病毒颗粒(SVP，HBsAg)的过度分泌被认为参与维持慢性感染患者(CHB)中观察到的免疫耐受状态。持续暴露于HBsAg和其他病毒抗原可导致HBV-特异性T-细胞缺失或进行性功能损伤(Kondo,Journal ofImmunology(1993),150,4659–4671；Kondo,Journal of Medical Virology(2004),74,425–433；Fisicaro,Gastroenterology,(2010),138,682-93)。此外，据报道HBsAg通过直接相互作用抑制免疫细胞如单核细胞、树突细胞(DC)和自然杀伤(NK)细胞的功能(Op denBrouw,Immunology,(2009b),126,280-9；Woltman,PLoS One,(2011),6,e15324；Shi,JViral Hepat.(2012),19,e26-33；Kondo,ISRN Gasteroenterology,(2013),Article ID935295)。
HBsAg定量是慢性乙型肝炎预后和治疗反应的重要生物标志物。然而，在慢性感染患者中很少观察到HBsAg减少和血清转换的实现，但这仍然是治疗的最终目标之一。目前的疗法如核苷(酸)类似物是抑制HBV DNA合成但不针对降低HBsAg水平的分子。即使长期使用核苷(酸)类似物治疗，也只表现出与天然观察到的HBsAg清除相当的弱的HBsAg清除(在-1％-2％之间)(Janssen,Lancet,(2005),365,123-9；Marcellin,N.Engl.J.Med.,(2004),351,1206-17；Buster,Hepatology,(2007),46,388-94)。
乙型肝炎e抗原(也称为HBV包膜抗原或HBeAg)是由乙型肝炎感染的细胞分泌的病毒蛋白。HBeAg与慢性乙型肝炎感染有关，并被用作活动性病毒性疾病和患者传染程度的标志物。
乙型肝炎病毒前核心或HBeAg的功能尚不完全清楚。然而，众所周知，HBeAg在病毒持续感染中起关键作用。HBeAg被认为通过作为免疫调节蛋白发挥功能来促进HBV慢性化。特别地，HBeAg是分泌的辅助蛋白，呈现减弱宿主对细胞内核衣壳蛋白的免疫应答(Walsh,Virology,2011,411(1):132-141)。HBeAg作为促进HBV持续感染的免疫耐受原发挥作用，并且考虑到可溶性HBeAg穿过胎盘，其可能在子宫内发挥功能(Walsh,Virology,2011,411(1):132-141)。此外，HBeAg下调：i)控制细胞内信号传导的细胞基因；和ii)Toll-样受体2(TLR-2)，以抑制对病毒感染的先天免疫应答(Walsh,Virology,2011,411(1):132-141)。在没有HBeAg的情况下，HBV复制与TLR2通路的上调相关(Walsh,Virology,2011,411(1):132-141)。因此，HBeAg在调节病毒/宿主相互作，以影响宿主免疫应答中具有显著作用(Walsh,Virology,2011,411(1):132-141)。因此，降低HBeAg阳性患者群中的HBeAg可导致HBV特异性免疫功能障碍的逆转(Milich,1997,J.Viral.Hep.4:48–59；Milich,1998,J.Immunol.160:2013–2021)。此外，分泌的HBeAg在引发T-细胞耐受方面比细胞内肝炎核心抗原(HBcAg)显著更有效，HBeAg和HBcAg之间分别的(split)T细胞耐受以及HBc/HBeAg特异性T-细胞耐受的克隆异质性可能对天然HBV感染、特别是对于前核心阴性慢性肝炎具有重要意义(Chen,2005,Journal of Virology,79:3016-3027)。
因此，与单独抑制HBsAg的分泌相比，降低HBeAg以及HBsAg的分泌将导致改善对慢性HBV感染出现或发展的抑制。此外，已报道在HBeAg阳性母亲的母胎和新生儿HBV增殖病例中，急性感染转变为慢性(>80％)的比例最高(Liaw,Lancet,2009,373:582-592；Liaw,Dig.Dis.Sci.,2010,55:2727-2734；和Hadziyannis,2011,Journal of hepatology,55:183-191)。因此，降低孕妇的HBeAg不仅可以降低患者的感染程度，还可以抑制其孩子慢性HBV感染的出现或发展。
因此，在HBV治疗中，存在抑制病毒表达、特别是抑制HBsAg和HBeAg分泌的未被满足的医疗需求(Wieland,S.F.&F.V.Chisari.J Virol,(2005),79,9369-80；Kumar等人JVirol,(2011),85,987-95；Woltman等人PLoS One,(2011),6,e15324；Op den Brouw等人Immunology,(2009b),126,280-9)。
例如，WO03/022987在表7A中公开了1298个基因，其在丙型肝炎阳性组织中上调。提到的基因之一是拓扑异构酶相关功能蛋白4(TRF4，AF089897)。AF089897也称为TRF4-2，其非常类似于本文SEQ ID NO：4的880至2340位。PAPD5片段在丙型肝炎阳性细胞中轻微上调的观察结果并未提供任何抑制PAPD5代表有效疗法的迹象。WO 03/022987A2没有公开任何关于PAPD5片段在丙型肝炎感染期间起任何关键作用的暗示。此外，HCV和HBV是两种完全不同的病毒，导致具有不同病因、不同进展和不同药物治疗的两种完全不同的疾病。这符合本发明人的观察，即PAPD5和PAPD7抑制剂DHQ和THP对丙型肝炎病毒(HCV)或HBV外的其他病毒无活性(数据未显示)。
在WO2010/040571中，在代谢和肿瘤疾病的细胞增殖中具有潜在作用的一长串其他基因的列表中提及了PAPD5，然而没有提供任何实际证据。
在WO2013/166264中，在增加病毒复制中具有潜在作用的一长串其他基因的列表中提及了PAPD5，然而没有提供任何实际证据。
在WO2017/066712中，描述了与端粒疾病的治疗和诊断相关的PAPD5的下调。已经描述了用于该目的的五种shRNA结构。
据我们所知，PAPD5或PAPD7的表达从未与HBV感染相关联。
发明目的
因此，本发明所基于的技术问题是鉴定和提供改善的用于治疗和/或预防HBV感染的手段和方法。
通过提供本文描述的并在权利要求中表征的实施方案，解决了该技术问题。
发明概述
本发明的一个方面涉及筛选方法，特别是鉴定预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物的方法，其包括:
(a)使试验化合物与以下接触
(a1)PAPD5多肽和/或PAPD7多肽；或
(a2)表达PAPD5和/或PAPD7的细胞；
(b)在存在和不存在所述测试化合物的情况下测定PAPD5和/或PAPD7的表达和/或活性；和
(c)鉴定降低PAPD5和/或PAPD7的表达和/或活性的化合物，作为预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物。
本发明的另一个方面是鉴定预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物的方法，其包括:
(a)使试验化合物与以下接触
(i)PAPD5和/或PAPD7多肽；或
(ii)表达PAPD5和/或PAPD7的细胞；
(b)测定试验化合物是否与PAPD5和/或PAPD7多肽结合；
(c)测定试验化合物是否抑制HBV的增殖；和
(d)鉴定结合PAPD5和/或PAPD7多肽和抑制HBV的增殖的化合物，作为预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物。
本发明的另一方面是PAPD5和/或PAPD7的抑制剂，其用于治疗和/或预防HBV感染，其中所述抑制剂是
(a)与PAPD5和/或PAPD7结合的小分子；或
(b)特异性结合PAPD5和/或PAPD7的抗体。
用于治疗或预防HBV的抑制剂可选自式(I)或(II)的化合物。特别地式(III)和(IV)的抑制剂可用于本发明。
附图简述
图1：使用HBX129653/HBX129654化学探针和3个猎物片段的1×1实验的图片。
图2：使用HBX129653/HBX129654化学探针和PAPD5/7全长蛋白的1×1实验的图片。
图3：使用HBX129653(DHQ)和MOL653/654进行竞争的竞争测定法的图片。
图4：使用HBX129654(THP)和MOL653/654进行竞争的竞争测定法的图片。
图5：使用HBX129653(DHQ)和INACT653/INACT654进行竞争的竞争测定法的图片。包括MOL653作为阳性对照。
图6：使用HBX129654(THP)和INACT653/INACT654进行竞争的竞争测定法的图片。包括MOL653作为阳性对照。
图7：(A)HBV感染的dHepaRG中SiRNA敲低(KD)PAPD5和PAPD7导致HBV表达降低。用HBV感染分化的HepaRG细胞，并在HBV感染前一天和感染后第4天用针对PAPD5、PAPD7或针对两者的siRNA(各25nM)处理。在第11天收获上清液，通过ELISA测定上清液中分泌的HBsAg和HBeAg的水平，并归一化至未处理的对照。随后测定细胞毒性和基因表达的抑制，并且也归一化至未处理的对照。(B)进行与(A)中所述相同的实验，除了仅测定上清液中分泌的HBsAg水平。
发明详述
PAPD5和PAPD7是属于聚合酶β-样核苷酸转移酶超家族的非经典聚腺苷酸-聚合酶。在本发明的上下文中，令人惊讶地显示，通过分析测试化合物是否抑制PAPD5和/或PAPD7，可以成功地鉴定可用于治疗性干预HBV感染的化合物。或者，换句话说，在所附实施例中将抑制PAPD5和/或PAPD7鉴定为抑制HBV感染的化合物的功效的指标。所附实施例证明，如下文所示的具有式(III)的二氢喹嗪酮化合物(本文称为DHQ)和如如下文所示的具有式(IV)的四氢吡啶并嘧啶化合物(本文称为THP)结合PAPD5和PAPD7多肽。这些化合物具有在HBV感染期间抑制HBV表面抗原(HBsAg)的产生和HBV RNA表达的能力(WO2015/113990A1和WO2016/177655)。另外，所附实施例显示通过使用siRNA抑制PAPD5和/或PAPD7导致抑制病毒表达，特别是抑制HBsAg和HBeAg的分泌以及细胞内HBV mRNA的产生。这些结果直接表明，通过降低PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性(例如量)，可以预防或治疗(即改善和/或抑制)HBV感染(例如慢性HBV感染)。因此，本发明涉及筛选方法，其中降低PAPD5和/或PAPD7(例如PAPD5和PAPD7)的表达和/或活性(例如表达)的化合物被鉴定为预防和/或治疗(即改善和/或抑制)HBV感染的化合物。
在本发明的上下文中发现，化合物拮抗(即抑制)PAPD5和/或PAPD7导致HBV基因表达和复制的抑制；并因此，预防、改善和/或抑制HBV感染。这样的化合物可导致PAPD5和/或PAPD7表达和/或活性降低10-100％，优选20-100％，更优选30-100％，甚至更优选40-100％，甚至更优选50-100％，甚至更优选60-100％，甚至更优选70-100％，甚至更优选80-100％，最优选90-100％。
在本文提供的筛选方法中，计划通过在步骤(a)中使用表达PAPD5和/或PAPD7的细胞，即(ai)，来测定(即分析/确定)PAPD5和/或PAPD7的表达。通过在步骤(a)使用(ai)PAPD5和/或PAPD7多肽，例如在无细胞制备物中；或(aii)表达PAPD5和/或PAPD7的细胞来测定(即分析/测定)PAPD5和/或PAPD7的活性。
在本发明的一个方面，降低PAPD5和/或PAPD7(例如PAPD5，优选PAPD5和PAPD7)的表达的化合物被鉴定为预防、改善和/或抑制(即治疗)HBV感染的化合物。在本发明的另一个方面降低PAPD5和/或PAPD7(例如PAPD5，优选PAPD5和PAPD7)的活性的化合物被鉴定为预防、改善和/或抑制(即治疗)HBV感染的化合物。优选将降低PAPD5或两种分子PAPD5和PAPD7的表达和/或活性的化合物鉴定为预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物。最优选地，将降低两种分子PAPD5和PAPD7的表达和/或活性的化合物鉴定为预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物。
根据本发明，可以通过进行第一预选步骤，以鉴定结合PAPD5和/或PAPD7的化合物，来鉴定(即选择)预防和/或治疗(即改善和/或抑制)HBV感染的化合物。随后，在第二步中，可以评估已经鉴定为与PAPD5和/或PAPD7结合的化合物是否抑制HBV的增殖。因此，本发明涉及进一步的筛选方法，其中结合PAPD5和/或PAPD7(例如PAPD5和PAPD7)和抑制HBV增殖的化合物被鉴定为预防、改善和/或抑制(即治疗)HBV感染的化合物。
因此，本发明涉及鉴定预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物的方法，其包括:
(a)使试验化合物与以下接触
(ai)PAPD5多肽和/或PAPD7多肽；或
(aii)表达PAPD5和/或PAPD7的细胞；
(b)测定试验化合物是否与PAPD5和/或PAPD7结合；
(c)测定试验化合物是否抑制HBV的增殖；和
(d)鉴定结合PAPD5和/或PAPD7和抑制HBV增殖的化合物，作为预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物。
因此，根据本发明与PAPD5和/或PAPD7(例如与PAPD5、优选与PAPD5和PAPD7)结合和抑制HBV的增殖的化合物被鉴定为预防、改善和/或抑制(即治疗)HBV感染的化合物。优选将(i)与PAPD5结合或与两种分子PAPD5和PAPD7结合的和(ii)抑制HBV的增殖的化合物，鉴定为预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物。最优选地，将与两种分子PAPD5和PAPD7结合和抑制HBV的增殖的化合物鉴定为预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物。
上述筛选方法实现预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物的鉴定。优选所述化合物改善和/或抑制(即治疗)HBV的感染。因此，本文提供的筛选方法可用于鉴定治疗HBV感染的化合物。
在本发明的上下文中，PAPD5可以是PAPD5多肽或PAPD5mRNA。在本文提供的筛选方法的背景下优选PAPD5是PAPD5多肽。本发明的一个方面涉及本文提供的筛选方法，其中PAPD5多肽是包含或由以下组成的多肽：
(a)SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列；
(b)与(a)的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％同一性的氨基酸序列，其中多肽具有聚腺苷酸聚合酶功能；
(c)SEQ ID NO:1或2的酶活性片段的氨基酸序列；或
(d)与(d)的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％同一性的氨基酸序列，其中多肽具有聚腺苷酸聚合酶功能。
SEQ ID NO:1或2(即PAPD5)的酶活性片段的实例为SEQ ID NO:1或2的145-256位的核苷酸转移酶结构域或SEQ ID NO:1或2的308-368位的Cid1聚腺苷酸聚合酶。
本发明的另一个方面涉及本文提供的筛选方法，其中表达PAPD5的细胞包含PAPD5mRNA，即包含或由以下组成的多核苷酸：
(i)编码SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的核苷酸序列；
(ii)编码与SEQ ID NO:1或2具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中多核苷酸编码具有聚腺苷酸聚合酶功能的多肽；
(iii)编码SEQ ID NO:1或2的酶活性片段的核苷酸序列；
(iv)编码与SEQ ID NO:1或2的酶活性片段的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中多核苷酸编码具有聚腺苷酸聚合酶功能的多肽；
(v)包含或由SEQ ID NO:4或5组成的核苷酸序列；或
(vi)与SEQ ID NO:4或5具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％同一性的核苷酸序列，其中由该序列表达的多肽具有聚腺苷酸聚合酶功能；或
(vii)前mRNA，其经加工(即拼接)得到(v)或(vi)多核苷酸。
在优选的实施方案中，PAPD5mRNA可以是包含或由SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列组成的多核苷酸。然而，PAPD5mRNA还可以是包含与SEQ ID NO:4或5具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％同一性的核苷酸序列或由其组成的多核苷酸，其中多核苷酸编码具有聚腺苷酸聚合酶功能的多肽。
在本发明的上下文中，PAPD7可以是PAPD7多肽或PAPD7mRNA。在本文提供的筛选方法的背景下优选PAPD7是PAPD7多肽。本发明的一个方面涉及本文提供的筛选方法，其中PAPD7多肽是包含或由以下组成的多肽：
(a)SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)与(a)的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％同一性的氨基酸序列，其中多肽具有聚腺苷酸聚合酶功能；
(c)SEQ ID NO:3的酶活性片段的氨基酸序列；或
(d)与(c)的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％同一性的氨基酸序列，其中多肽具有聚腺苷酸聚合酶功能。
SEQ ID NO:3的酶活性片段(即PAPD7)的实例是SEQ ID NO:3的15-125位的核苷酸转移酶结构域；或SEQ ID NO:3的178-238位的Cid1家族聚腺苷酸聚合酶。
本发明的另一个方面涉及本文提供的筛选方法，其中表达PAPD7的细胞包含PAPD7mRNA，即包含或由以下组成的多核苷酸：
(i)编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的核苷酸序列；
(ii)编码与SEQ ID NO:3具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中多核苷酸编码具有聚腺苷酸聚合酶功能的多肽；
(iii)编码SEQ ID NO:3的酶活性片段的核苷酸序列；或
(iv)编码与SEQ ID NO:3的酶活性片段的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中多核苷酸编码具有聚腺苷酸聚合酶功能的多肽；或
(v)包含SEQ ID NO:6或由其组成的核苷酸序列；或
(vi)与SEQ ID NO:6具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％同一性的核苷酸序列，其中从该序列表达的多肽具有聚腺苷酸聚合酶功能；或
(vii)前mRNA，其经加工(即拼接)得到(v)或(vi)多核苷酸。
在优选的实施方案中，PAPD7mRNA可以是包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列或由其组成的多核苷酸。然而，PAPD7mRNA还可以是包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％同一性的核苷酸序列或由其组成的多核苷酸，其中多核苷酸编码具有聚腺苷酸聚合酶功能的多肽。
在本发明的上下文中，所述细胞可以是真核细胞。例如，所述细胞可以是酵母细胞或脊椎动物细胞。脊椎动物细胞包括鱼、禽类、爬行动物、两栖动物、有袋动物和哺乳动物细胞。优选地，细胞是哺乳动物细胞，最优选是人细胞。哺乳动物细胞还包括猫科动物(feline)、犬科动物(canine)、牛科动物(bovine)、马科动物(equine)、山羊(caprine)、绵羊(ovine)、猪(porcine)、鼠科动物(murine)，如小鼠和大鼠，以及兔细胞。在本文提供的筛选方法中，“细胞”可以内源性表达PAPD5和/或PAPD7或过表达PAPD5和/或PAPD7。对于过表达PAPD5和/或PAPD7，细胞可以包含表达载体内的编码PAPD5多肽和/或PAPD7多肽的核苷酸序列。在优选的实施方案中，细胞包含编码PAPD5多肽的核苷酸序列和编码PAPD7多肽的核苷酸序列。本文提供的筛选方法的细胞可以包含在非人动物中，例如，小鼠、大鼠、兔或雪貂(ferret)。
在上述其中测定与PAPD5和/或PAPD7结合的筛选方法中，如果化合物对PAPD5和/或PAPD7具有特异性结合亲和力，则可以将其鉴定为结合PAPD5多肽和/或PAPD7多肽的化合物。例如，结合PAPD5和/或PAPD7的化合物可具有微摩尔浓度范围内的解离常数(Kd)；或者，优选地，在100nM至1pM的范围内。
在本发明的上下文中，可以测定(即分析)测试化合物是否特异性结合PAPD5多肽和/或PAPD7多肽，即测试化合物是否仅或主要结合PAPAD5和/或PAPD7。例如，可以测定测试化合物是否特异性结合PAPD7。优选地，测定测试化合物是否特异性结合PAPD5。更优选地，测定测试化合物是否结合PAPD5和PAPD7二者。例如，可以测定测试化合物是否特异性结合PAPD5和PAPD7。
例如，在本文提供的筛选方法中，可以通过进行酵母3杂交筛选来测定测试化合物与PAPD5和/或PAPD7的结合。Y3H系统是适用于检测药物-蛋白质相互作用的酵母双杂交(Y2H)系统的修饰形式。它需要将目标药物与可以锚定在酵母细胞内的DNA结合蛋白上的配体偶联。然后检测锚定药物与靶蛋白的相互作用，其是通过将它们的结合与报道基因的转录激活联系起来进行的。参见，例如Johnsson,Nature Chem Bio,2011,7:375-383；和Licitra,Proc Natl Acad Sci U S A,1996,12；93(23):12817-21。在这种酵母3杂交筛选中，无活性化合物可用于与标记的测试化合物竞争。
还可以通过使用Biacore,ChemoProteomics或Microscale Thermophoresis测定测试化合物与PAPD5和/或PAPD7的结合。
抑制HBV增殖的化合物可以是降低病毒RNA表达、降低病毒RNA(HBV RNA)衍生的病毒DNA(HBV DNA)的产生、降低新病毒颗粒(HBV颗粒)的产生和/或引起HBsAg和/或HBeAg产生和/或分泌的化合物。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的筛选方法，其中抑制HBV增殖的化合物抑制HBsAg的分泌、抑制HBeAg的分泌、和/或抑制细胞内HBV mRNA或HBV DNA的产生。优选地，抑制HBV增殖的化合物是抑制HBsAg分泌、HBeAg分泌和细胞内HBV mRNA产生的化合物。
例如，当与未处理的细胞或动物或用适当的对照处理的细胞或动物比较时，抑制HBV增殖的化合物可以使病毒RNA(HBV RNA)的表达、病毒RNA衍生的病毒DNA(HBV DNA)的产生、新病毒颗粒(HBV颗粒)的产生、HBsAg和/或HBeAg的产生和/或分泌降低10-100％，优选20-100％，更优选30-100％，甚至更优选40-100％，甚至更优选50-100％，甚至更优选60-100％，甚至更优选70-100％，甚至更优选80-100％，最优选90-100％。
本文提供的筛选方法可另外包括比较测试化合物与对照的步骤。所述对照可以是无活性的测试化合物，其中所述无活性的测试化合物是以下化合物:
(i)不降低PAPD5和/或PAPD7的表达和/或活性；和/或
(ii)不与PAPD5和/或PAPD7结合并且不抑制HBV的增殖。
该无活性的试验化合物对HBV没有活性，例如它不导致HBsAg和HBeAg的分泌的抑制和细胞内HBV mRNA的产生的抑制。例如，无活性测试化合物可具有超过3μM的HBsAg抑制的IC50值。在本文提供的筛选方法中，无活性试验化合物可以是如所附实施例中所定义的化合物“DHQ化合物-无活性”或化合物“THP化合物-无活性”。在其中测定PAPD5和/或PAPD7的表达和/或活性的筛选方法中，可以使用如上(i)中定义的试验化合物。或者，在其中测定与PAPD5和/或PAPD7结合的筛选方法中，可以使用如上(ii)中定义的试验化合物。可以从活性化合物设计无活性化合物，例如通过化学修饰和/或手性分离。
在本文提供的筛选方法中，可以测定在测试化合物存在和不存在的情况下的PAPD5和/或PAPD7的活性，例如，通过监测mRNA的体外多聚腺苷酸化，例如，如Rammelt,RNA,2011,17:1737–1746中所述。简而言之，分别在ATP(A)、CTP(C)、GTP(G)、UTP(U)或所有四种dNTP的混合物存在下，核糖寡核苷酸A15可与在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的重组PAPD5蛋白一起孵育。
可以测定在测试化合物存在和不存在的情况下PAPD5和/或PAPD7的表达，例如，通过使用(q)PCR、蛋白质印迹或MassSpec。
可以测定对HBV增殖的抑制，例如通过测定试验化合物是否具有抑制HBsAg和/或HBeAg的分泌和/或抑制细胞内HBV mRNA的产生的活性。HBsAg和/或HBeAg分泌的抑制可以通过ELISA测定，例如，根据制造商的说明使用CLIA ELISA试剂盒(Autobio Diagnostic)。细胞内HBV mRNA的产生的抑制可以通过实时PCR测定，例如，如所附实施例中所述。用于评估试验化合物是否抑制HBV的增殖的其他方法为通过RT-qPCR测定HBV DNA的分泌；例如WO2015/173208中所述，Northern印迹；原位杂交或免疫荧光。
为了进行本文提供的筛选方法，可以使用公开的或市售的分子文库。因此，在本发明的上下文中，所述试验化合物可以是
(i)筛选文库的小分子；或
(ii)噬菌体展示文库的肽，抗体片段文库的肽，或衍生自cDNA文库的肽。
例如，可以使用Hybrigenics Services SAS的cDHA人肝(HLV)文库或cDNA人胎盘(PLA)文库。
在其中测定PAPD5多肽和/或PAPD7多肽的活性的本文提供的筛选方法中，所述PAPD5和PAPD7的活性优选为聚腺苷酸聚合酶功能(即聚腺苷酸聚合酶活性)。可以测定多肽(例如PAPD5或PAPD7)的聚腺苷酸聚合酶功能/活性，例如，通过监测mRNA的体外多腺苷酸化，例如如Rammelt,RNA,2011,17:1737–1746中所述。该方法还可用于在存在和不存在试验化合物的情况下测定PAPD5和/或PAPD7的聚腺苷酸聚合酶功能。
所附实施例证明，通过抑制PAPD5和/或PDPD7多肽，可有效抑制HBsAg和HBeAg的分泌以及细胞内HBV mRNA的产生。这些数据表明PAPD5和/或PAPD7的抑制剂可用于预防和/或治疗HBV感染。
本领域已经描述了几种在治疗HBV感染中具有一定功效的化合物(参见例如WO2015/113990A1和WO 2016/177655)。然而，在本发明的上下文中，令人惊讶地发现，结构完全不同的抗HBV剂(例如DHQ和THP)令人惊讶且特异性地结合PAPD5和PAPD7。此外，现有技术还包括在抑制HBsAg产生方面活性较低的药剂。在所附实施例中已显示这些试剂对PAPD5和PAPD7具有较低的结合亲和力(参见，例如，“DHQ-无活性”)。实际上，所附实施例证明了化合物对HBV感染的活性与对PAPD5和PAPD7的结合亲和力之间的明确相关性。因此，选择性地使用结合PAPD5和/或PAPD7的抗HBV剂导致特别高的抗HBV功效。此外，本发明首次显示，抑制PAPD5、PAPD7或特别是PAPD5和PAPD7的化合物在抑制HBsAg和HBeAg的分泌以及细胞内HBVmRNA的产生方面具有超乎寻常高的活性。与单独HBsAg分泌降低相比，HBsAg和HBeAg分泌的降低更有效地抑制慢性HBV感染的出现或发展。此外，抑制HBsAg和HBeAg的分泌会降低HBV感染者的感染性。此外，降低孕妇的HBeAg也可能抑制其孩子的慢性HBV感染的出现或发展。因此，本发明出乎意料地证明，选择性地使用抑制PAPD5和/或PAPD7的化合物可以在显著更有效降低HBsAg和HBeAg方面改善治疗HBV感染的治疗成功率。
因此，本发明的一个方面是PAPD5和/或PAPD7抑制剂在治疗HBV感染、特别是慢性HBV感染中的用途。在另一个实施方案中，本发明涉及PAPD5和/或PAPD7的抑制剂在降低病毒抗原HBsAg和HBeAg中的用途。
因此，本发明涉及用于治疗和/或预防HBV感染的PAPD5和/或PAPD7的抑制剂，其中所述抑制剂是
(i)与PAPD5和/或PAPD7结合的小分子；
(ii)针对PAPD5和/或PAPD7的RNA干扰(RNAi)分子；
(iii)特异性结合PAPD5和/或PAPD7的抗体；或
(iv)基因组编辑器，包括：
(a)位点特异性DNA核酸酶或编码位点特异性DNA核酸酶的多核苷酸；和
(b)向导RNA或编码向导RNA的多核苷酸。
本发明的抑制剂还可以是PAPD5和/或PAPD7特异性锁核酸(LNA)分子。
本文涉及的是，本发明的抑制剂用于治疗(例如改善)HBV感染。
抑制剂可以是特异性抑制PAPD7的分子。优选地，抑制剂是特异性抑制PAPD5的分子。更优选地，抑制剂抑制PAPD5和PAPD7两者。因此，优选本发明的抑制剂抑制PAPD5或PAPD5和PAPD7两者。最优选地，本发明的抑制剂抑制PAPD5和PAPD7。在本发明的一个方面，与无药物对照相比，本发明的抑制剂抑制PAPD5和PAPD7两者并导致HBsAg和/或HBeAg分泌降低至少50％(即与没有施用药物的细胞或受试者相比)。
本发明的抑制剂抑制HBsAg和HBeAg可以具有3μM以下、优选2μM以下、更优选1μM以下、更优选0.1μM以下、且最优选0.01μM以下的IC50值。
通过使用位点特异性DNA核酸酶(例如Cas9或Cpf1)和向导RNA进行的基因组编辑是本领域公知的，并且描述于例如“CRISPR-Cas:A Laboratory Manual”,2016,由JenniferDoudna编辑,ISBN978-1-621821-31-1中。
例如，如果所述位点特异性DNA核酸酶是Cas9核酸酶，那么基因组编辑器优选地还包括：
(i)至少一种向导RNA，其由至少一种靶序列特异性CRISPR RNA(crRNA)分子和至少一种反式激活crRNA(tracrRNA)分子组成；
(ii)编码(i)的RNA分子的多核苷酸；
(iii)至少一种向导RNA，其是包含至少一种靶序列特异性crRNA和至少一种tracrRNA的嵌合RNA分子；或者
(iv)编码(iii)的嵌合RNA的多核苷酸。
在一个替代的实施例中，位点特异性DNA核酸酶是Cpf1核酸酶，基因组编辑器优选地还包含：
(i)至少一种包含靶序列特异性CRISPR RNA(crRNA)分子的向导RNA；或者
(ii)编码(i)的RNA分子的多核苷酸。
本文提供的PAPD5和/或PAPD7抑制剂也可以是基因组编辑器，其包含至少一种预组装的Cas9蛋白质-向导RNA核糖核蛋白复合物(RNP)。
在本文中，向导RNA被设计为靶向基因组PAPD5或PAPD7DNA。或者，使用几种向导RNA，从而可以靶向PAPD5和PAPD7的基因组DNA。可以通过非同源末端连接(NHEJ)将移码敲除突变引入基因组PAPD5和/或PAPD7DNA，或通过同源定向修复(HDR)修饰基因组PAPD5和/或PAPD7DNA来实现PAPD5和/或PAPD7的抑制。如何诱导这些机制在本领域中是公知的，并且描述于例如Heidenreich,2016,Nat Rev Neurosci 17 36-44中。
本发明的抑制剂可以是天然存在的分子，例如，天然存在的抗体或天然存在的RNAi分子。然而，本发明的抑制剂也可以是非天然存在的分子。例如，本发明的抑制剂可以是具有与天然存在的抗体不同的氨基酸序列的抗体，或者可以是包含至少一个非天然存在的氨基酸残基(例如提供相似侧链官能团的合成氨基酸)的抗体。例如，芳族氨基酸可以被以下氨基酸替代：D-或L-萘基丙氨酸、D-或L-苯基甘氨酸、D-或L-2-噻吩基丙氨酸、D-或L-1-、2-、3-或4-芘基丙氨酸、D-或L-3-噻吩基丙氨酸、D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸、D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯基丙氨酸、D-对氟苯基丙氨酸、D-或L-对联苯丙氨酸、D-或L-对甲氧基联苯丙氨酸、D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸和D-或L烷基丙氨酸，其中烷基选自取代的或被取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基和异戊基。可以使非羧酸化氨基酸具有负电荷，如膦酰基或硫酸化氨基酸所提供的，其被认为是非限制性实例。其他非天然氨基酸是烷基化氨基酸，其通过将烷基与任何天然氨基酸组合来制备。碱性天然氨基酸如赖氨酸和精氨酸可以在胺(NH2)官能团处被烷基取代。非天然氨基酸的其他取代包括天冬酰胺或谷氨酰胺的腈衍生物(例如，含有CN部分代替CONH2官能团)和甲硫氨酸的亚砜衍生物。
类似地，本发明的抑制剂可以是具有与天然存在的RNAi分子不同的核苷酸序列的RNAi分子，或者可以是包含至少一种非天然存在的核苷酸的RNAi分子，如寡核苷酸硫代磷酸酯、取代的核糖寡核苷酸、LNA分子、PNA分子、GNA(乙二醇核酸)分子、TNA(苏糖核酸)分子、吗啉代多核苷酸或具有修饰骨架的核酸，如聚硅氧烷、2'-O-(2-甲氧基)乙基-硫代磷酸酯，或具有取代基的核酸，如甲基、硫代-、硫酸酯、苯甲酰基-、苯基-、氨基-、丙基-、氯-和亚甲基carbo核苷(methanocarbanucleoside)，或促进其检测的报告分子。本发明的抑制剂也可以是天然存在的或非天然存在的小分子或基因组编辑器。
在本发明的上下文中，本文提供的抑制剂可以
(i)与PAPD5和/或PAPD7多肽结合；和/或
(ii)抑制PAPD5和/或PAPD7的表达和/或活性。
例如，本发明的抑制剂可结合PAPD5多肽，并抑制PAPD5多肽的活性。在另一个实施例中，本发明的抑制剂结合PAPD7多肽，并抑制PAPD7多肽的活性。本文优选抑制剂结合PAPD5和PAPD7多肽两者，并抑制PAPD5和PAPD7两者多肽的活性。本发明的抑制剂可以抑制PAPD5或PAPD7的表达；或可以抑制PAPD5和PAPD7二者的表达。
如上所述，在本发明的上下文中，已经显示抑制PAPD5和/或PAPD7的化合物在抑制HBsAg和HBeAg的分泌以及细胞内HBV mRNA的产生方面具有高活性。因此，本发明的抑制剂降低了HBsAg和HBeAg的分泌。由于HBsAg分泌降低，本发明的抑制剂抑制慢性HBV感染的出现或发展。特别地，由于抑制HBeAg分泌，与仅降低HBsAg分泌的化合物相比，本发明的抑制剂更有效地抑制慢性HBV感染的出现或发展。此外，降低孕妇的HBeAg也可以抑制其孩子慢性HBV感染的出现或发展。因此，由于HBeAg分泌的降低，本发明的抑制剂抑制慢性HBV感染的出现或发展(如在HBV感染的母亲的后代中慢性HBV感染的出现或发展)并降低HBV感染者的传染性。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的抑制剂，其中所述抑制剂降低HBsAg和HBeAg的分泌。与此一致，本发明的另一方面涉及本文提供的抑制剂，其中所述抑制剂抑制慢性HBV感染的出现或发展并降低HBV感染者的传染性。在本发明的一个具体方面，本文提供的抑制剂抑制HBV感染的母亲的后代中慢性HBV感染的出现或发展。该母亲优选是HBeAg阳性。
用本发明的抑制剂治疗(或预防性接受本发明的抑制剂)的受试者优选是人，更优选HBsAg阳性和/或HBeAg阳性的人类患者，甚至更优选HBsAg阳性和HBeAg阳性的人类患者。所述人类患者可以是孕妇，例如，HBeAg阳性和/或HBsAg阳性的孕妇，更优选HBeAg阳性和HBsAg阳性的孕妇。
本发明的化合物
如上所述，本发明的抑制剂可以是小分子。例如，本发明的抑制剂可以是式(I)或(II)的化合物:
其中
R1是氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基氨基或C1-6烷氧基；
R2是氢；卤素；C1-6烷基，其未被取代或被氟取代一次、两次或三次；C1-6烷氧基，其未被取代或被氟取代一次、两次或三次；氰基；C3-7环烷基；羟基或苯基-CxH2x-O-；
R3是氢；
卤素；
C1-6烷基，其未被取代或被氟取代一次、两次或三次；
氰基；
吡咯烷基；
氨基；
苯基-CxH2x-N(C1-6烷基)-；
C1-6烷氧基羰基哌嗪基；
或R7-O-，其中R7是氢；C1-6烷基，其未被取代或被1至3个独立地选自以下的取代基取代：氟、羟基和C2-6链烯基；C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷氧基C1-6烷氧基C1-6烷基；氨基C1-8烷基；C1-6烷基羰基氨基C1-8烷基；C1-6烷基磺酰基氨基C1-8烷基；C1-6烷基硫烷基C1-6烷基；C1-6烷基磺酰基C1-6烷基；氰基C1-6烷基；C3-7环烷基C1-6烷基；氰基C3-7环烷基C1-6烷基；苯基C1-6烷基；吡咯烷基羰基C1-6烷基；C2-6炔基；羟基C1-6烷基C2-6炔基；氨基C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷基氨基C1-6烷氧基C1-6烷基；二C1-6烷基氨基C1-6烷氧基C1-6烷基；羧基C1-6烷基；或C1-6烷氧基羰基氨基C1-8烷基；杂芳基C1-6烷基，其中杂芳基是含N单环杂芳基；或杂环烷基C1-6烷基，其中杂环烷基是单环杂环烷基；
R4是氢、卤素、C1-6烷基、氰基或C1-6烷氧基；
条件是R1、R2、R3和R4不同时是氢；
R5是氢或C1-6烷基；
R6是氢；C1-6烷基，其未被取代或被氟取代一次、两次或三次；C3-7环烷基，其未被取代或者被氟或C1-6烷基取代一次、两次或三次；或苯基-CxH2x-；
x是1-6；
或其可药用盐或对映异构体或其非对映异构体；
其中
R1是C1-6烷基、C3-7环烷基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、硝基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基C1-6烷基、羧基C1-6烷基、二(C1-6烷氧基羰基)亚甲基(di(C1-6alkoxycarbonyl)methylenyl)、氰基C1-6烷基、C3-7环烷基C1-6烷基、苯基C1-6烷基、C1-6烷基硫烷基C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基氨基C1-6烷基、氨基羰基C1-6烷基、二C1-6烷基氨基羰基C1-6烷基、单环杂环烷基C1-6烷基或咪唑基C1-6烷基；
R2是芳基或杂芳基，所述芳基或杂芳基未被取代或被1、2、3或4个独立地选自以下的取代基取代：C1-6烷基、C3-7环烷基、卤素、卤代C1-6烷基、氰基、硝基、羟基、卤代C1-6烷氧基、-O-CxH2x-R3、-O-CyH2y-NHR6、-NR9R10、-SO2-R11、-SO2-NR12R13、羧基、C1-6烷氧基羰基、-C(＝O)-NR12R13、芳基、杂芳基、单环杂环烷基和-O-单环杂环烷基；其中
单环杂环烷基未被取代或被C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基或C1-6烷氧基羰基取代；
R3是氢；C3-7环烷基；卤代C3-7环烷基；羟基；羟基C1-6烷基C3-7环烷基；C1-6烷氧基；单环杂环烷基；单环杂环烷基，其被C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基、C3-7环烷基或C1-6烷氧基羰基取代；-C(＝O)-R4；C1-6烷基亚磺酰基；-SO2-R5；-C(NHR7)-C(＝O)-R8；羧基C1-6烷氧基或氨基羰基C1-6烷氧基；其中
R4是羟基、C1-6烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、二C1-6烷基氨基、四氢呋喃基氨基、吡咯烷基或吗啉基；
R5是C1-6烷基、C3-7环烷基、羟基、氨基、C1-6烷基氨基或二C1-6烷基氨基；
R7是氢或C1-6烷氧基羰基；
R8是羟基或C1-6烷氧基；
R6是氢、C1-6烷基羰基、卤代C1-6烷基羰基、C1-6烷氧基羰基、
C1-6烷基磺酰基、C3-7环烷基磺酰基或C1-6烷氧基C1-6烷基磺酰基；
R9和R10独立地选自氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基、C3-7环烷基羰基和C3-7环烷基磺酰基；或
R9和R10与它们所连接的氮一起形成单环杂环烷基；
R11是C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-7环烷基、卤代C3-7环烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、卤代C1-6烷氧基C1-6烷基、C3-7环烷基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷基氨基C1-6烷基、二C1-6烷基氨基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基氨基C1-6烷基、C1-6烷基亚磺酰基C1-6烷基、C1-6烷基硫烷基C1-6烷基或C1-6烷基磺酰基C1-6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-7环烷基和卤代C3-7环烷基；或
R12和R13与它们所连接的氮一起形成单环杂环烷基；
x是1、2、3、4、5、6、7或8；
y是1、2、3、4、5、6、7或8；
U、W和Z独立地选自CH和N；
X和Y之一是N，另一个是CH或N；
或其可药用盐或对映异构体或其非对映异构体。
在本发明的一个方面，6-甲基-2-氧代-9-吡咯烷-1-基-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸、9-氟-6-甲基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸和9,10-二氟-6-甲基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸从式(I)的化合物中排除。
在本发明的一个特定的实施方案中，式(I)和(II)的化合物从本发明的抑制剂中排除。因此，本发明的一个实施方案涉及本发明的抑制剂，其中所述抑制剂不是式(I)或(II)的化合物。
如上所述，所附实施例证明抗HBV活性剂DHQ(即式(III)的化合物)和THP(即式(IV)的化合物)有效结合PAPD5和PAPD7。因此，在本发明的上下文中，优选本发明的抑制剂是式(III)或(IV)的化合物：
在所附实施例中，还显示具有连接基和锚定配体的式(III)和(IV)的化合物的衍生物对PAPD5和PAPD7具有结合亲和力。这些衍生物分别如下式(V)和(VI)所示。因此，在本发明的一个方面，本发明的抑制剂是式(V)或(VI)的化合物：
在本发明的上下文中，本发明的抑制剂可以是式(I)的化合物，其中抑制剂是如项目(1)-(19)中所定义的任一种化合物:
1.根据式(I)的化合物，其中
R1是氢、氟、氯、溴、甲基、甲基氨基、甲氧基或乙氧基；
R2是氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、三氟甲氧基、氰基、环丙基、羟基或苯基甲基-O-；
R3是氢、溴、甲基、丙基、三氟甲基、氰基、苯基甲基-N(甲基)-、叔丁氧羰基哌嗪基、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、二氟甲基甲基-O-、二氟甲基乙基-O-、三氟甲氧基、三氟甲基甲基-O-、三氟甲基乙基-O-、乙基二氟甲基-O-、乙烯基二氟甲基-O-、炔丙基-O-、羟基甲基炔丙基-O-、甲氧基乙基-O-、甲氧基丙基-O-、甲氧基丁基-O-、乙氧基乙基-O-、甲氧基乙基-O-乙基-O-、氨基乙基-O-、氨基戊基-O-、氨基己基-O-、氨基辛基-O-、叔丁氧羰基氨基戊基-O-、叔丁氧羰基氨基己基-O-、叔丁氧羰基氨基辛基-O-、甲基羰基氨基乙基-O-、甲基羰基氨基戊基-O-、甲基磺酰基氨基乙基-O-、甲基磺酰基氨基戊基-O-、甲基磺酰基乙基-O-、甲基磺酰基丙基-O-、甲基硫烷基丙基-O-、氰基丙基-O-、氰基环丙基甲基-O-、环丙基甲基-O-、环己基乙基-O-、羟基乙基-O-、羟基丙基-O-、羟基-二甲基丙基-O-、羟基-二氟丙基-O-、羟基丁基-O-、羟基戊基-O-、羟基己基-O-、氨基乙基-O-丙基-O-、乙基氨基-乙基-O-丙基-O-、咪唑基乙基-O-、吡唑基丙基-O-、三唑基丙基-O-、吗啉基乙基-O-、吗啉基丙基-O-、(2-氧代-吡咯烷基)乙基-O-、(2-氧代-吡咯烷基)丙基-O-、苯基甲基-O-、苯基乙基-O-、吡咯烷基乙基-O-、吡咯烷基丙基-O-、吡咯烷基羰基甲基-O-、四氢吡喃基甲基-O-或羧基丙基-O-；
R4是氢、氟、氯、溴、甲基或氰基；
条件是R1、R2、R3和R4不同时是氢；
R5是氢或甲基；
R6是氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基、三氟甲基、三氟甲基甲基、环丙基、环丁基、甲基环丙基或苯基甲基；
或其可药用盐或对映异构体或其非对映异构体。
2.根据式(I)的化合物，其中
R1是氢、卤素、C1-6烷基氨基或C1-6烷氧基；
R2是氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-7环烷基、羟基或苯基-CxH2x-O-；
R3是氢；
卤素；
C1-6烷基；
氰基；
苯基-CxH2x-N(C1-6烷基)-；
C1-6烷氧基羰基哌嗪基；
或R7-O-，其中R7是氢；C1-6烷基，其未被取代或被1至3个独立地选自以下的取代基取代：氟、羟基和C2-6链烯基；C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷氧基C1-6烷氧基C1-6烷基；氨基C1-8烷基；C1-6烷基羰基氨基C1-8烷基；C1-6烷基磺酰基氨基C1-8烷基；C1-6烷基硫烷基C1-6烷基；C1-6烷基磺酰基C1-6烷基；氰基C1-6烷基；C3-7环烷基C1-6烷基；氰基C3-7环烷基C1-6烷基；苯基C1-6烷基；吡咯烷基羰基C1-6烷基；C2-6炔基；羟基C1-6烷基C2-6炔基；氨基C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷基氨基C1-6烷氧基C1-6烷基；羧基C1-6烷基；C1-6烷氧基羰基氨基C1-8烷基；杂芳基C1-6烷基，其中杂芳基是含N单环杂芳基；或杂环烷基C1-6烷基，其中杂环烷基是单环杂环烷基；
R4是氢、卤素、C1-6烷基或氰基；
条件是R1、R2、R3和R4不同时是氢；
R5是氢或C1-6烷基；
R6是氢；C1-6烷基，其未被取代或被氟取代一次、两次或三次；C3-7环烷基；C1-6烷基C3-7环烷基；或苯基-CxH2x-；
x是1-6；
或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体。
3.根据式(I)或根据项目1或2的化合物，
其中
R1是氢、氟、氯、溴、甲基氨基、甲氧基或乙氧基；
R2是氢、氟、氯、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、环丙基、羟基或苯基甲基-O-；
R3是氢、溴、甲基、丙基、氰基、苯基甲基-N(甲基)-、叔丁氧羰基哌嗪基、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、二氟甲基甲基-O-、二氟甲基乙基-O-、三氟甲基甲基-O-、乙基二氟甲基-O-、乙烯基二氟甲基-O-、炔丙基-O-、羟基甲基炔丙基-O-、甲氧基乙基-O-、甲氧基丙基-O-、甲氧基丁基-O-、乙氧基乙基-O-、甲氧基乙基-O-乙基-O-、氨基乙基-O-、氨基戊基-O-、氨基己基-O-、氨基辛基-O-、叔丁氧羰基氨基戊基-O-、叔丁氧羰基氨基己基-O-、叔丁氧羰基氨基辛基-O-、甲基羰基氨基乙基-O-、甲基羰基氨基戊基-O-、甲基磺酰基氨基乙基-O-、甲基磺酰基氨基戊基-O-、甲基磺酰基乙基-O-、甲基磺酰基丙基-O-、甲基硫烷基丙基-O-、氰基丙基-O-、氰基环丙基甲基-O-、环丙基甲基-O-、环己基乙基-O-、羟基乙基-O-、羟基丙基-O-、羟基-二甲基丙基-O-、羟基-二氟丙基-O-、羟基丁基-O-、羟基戊基-O-、羟基己基-O-、氨基乙基-O-丙基-O-、乙基氨基-乙基-O-丙基-O-、咪唑基乙基-O-、吡唑基丙基-O-、三唑基丙基-O-、吗啉基乙基-O-、吗啉基丙基-O-、(2-氧代-吡咯烷基)乙基-O-、(2-氧代-吡咯烷基)丙基-O-、苯基甲基-O-、苯基乙基-O-、吡咯烷基乙基-O-、吡咯烷基丙基-O-、吡咯烷基羰基甲基-O-、四氢吡喃基甲基-O-或羧基丙基-O-；
R4是氢、氯、溴、甲基或氰基；
条件是R1、R2、R3和R4不同时是氢；
R5是氢或甲基；
R6是氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基、三氟甲基、三氟甲基甲基、环丙基、环丁基、甲基环丙基或苯基甲基；
或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体。
4.根据式(I)或项目2的化合物，其中化合物是式(IA)的化合物:
其中
R1是氢、卤素或C1-6烷氧基；
R2是氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-7环烷基、羟基或苯基-CxH2x-O-；
R4是氢或卤素；
R5是氢或C1-6烷基；
R6是氢；C1-6烷基，其未被取代或被氟取代一次、两次或三次；C3-7环烷基；C1-6烷基C3-7环烷基；或苯基-CxH2x-；
R7是氢；C1-6烷基，其未被取代或被1至3个独立地选自以下的取代基取代：氟、羟基和乙烯基；C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷氧基C1-6烷氧基C1-6烷基；氨基C1-8烷基；C1-6烷基羰基氨基C1-8烷基；C1-6烷基磺酰基氨基C1-8烷基；C1-6烷基硫烷基C1-6烷基；C1-6烷基磺酰基C1-6烷基；氰基C1-6烷基；C3-7环烷基C1-6烷基；氰基C3-7环烷基C1-6烷基；苯基C1-6烷基；吡咯烷基羰基C1-6烷基；C2-6炔基；羟基C1-6烷基C2-6炔基；氨基C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷基氨基C1-6烷氧基C1-6烷基；羧基C1-6烷基；C1-6烷氧基羰基氨基C1-8烷基；杂芳基C1-6烷基，其中杂芳基是含N单环杂芳基；或杂环烷基C1-6烷基，其中杂环烷基是单环杂环烷基；
x是1-6；
或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体。
5.根据项目4的化合物，其中
R1是氢、氟、氯或甲氧基；
R2是氢、氟、氯、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、环丙基、羟基或苯基甲基-O-；
R4是氢或氯；
R5是氢或甲基；
R6是氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基、三氟甲基、三氟甲基甲基、环丙基、环丁基、甲基环丙基或苯基甲基；
R7是氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、二氟甲基甲基、二氟甲基乙基、三氟甲基甲基、乙基二氟甲基、乙烯基二氟甲基、炔丙基、羟基甲基炔丙基、甲氧基乙基、甲氧基丙基、甲氧基丁基、乙氧基乙基、甲氧基乙基-O-乙基、氨基乙基、氨基戊基、氨基己基、氨基辛基、叔丁氧羰基氨基戊基、叔丁氧羰基氨基己基、叔丁氧羰基氨基辛基、甲基羰基氨基乙基、甲基羰基氨基戊基、甲基磺酰基氨基乙基、甲基磺酰基氨基戊基、甲基磺酰基乙基、甲基磺酰基丙基、甲基硫烷基丙基、氰基丙基、氰基环丙基甲基、环丙基甲基、环己基乙基、羟基乙基、羟基丙基、羟基-二甲基丙基、羟基-二氟丙基、羟基丁基、羟基戊基、羟基己基、氨基乙基-O-丙基、乙基氨基-乙基-O-丙基-、咪唑基乙基、吡唑基丙基、三唑基丙基、吗啉基乙基、吗啉基丙基、(2-氧代-吡咯烷基)乙基、(2-氧代-吡咯烷基)丙基、苯基甲基、苯基乙基、吡咯烷基乙基、吡咯烷基丙基、吡咯烷基羰基甲基、四氢吡喃基甲基或羧基丙基；
或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体。
6.根据项目4的化合物，其中
R1是氢或卤素；
R2是C1-6烷基、卤素或C3-7环烷基；
R4是氢；
R5是氢或C1-6烷基；
R6是C1-6烷基或C1-6烷基C3-7环烷基；
R7是C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基；或苯基C1-6烷基；
或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体。
7.根据项目6的化合物，其中
R1是氢、氟或氯；
R2是甲基、乙基、氟、氯或环丙基；
R4是氢；
R5是氢或甲基；
R6是甲基、乙基、异丙基、异丁基、叔丁基或甲基环丙基；
R7是甲基、乙基、甲氧基乙基、甲氧基丙基或苯基甲基；
或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体。
8.根据项目4的化合物，其中其中
R1是氢；
R2是C1-6烷氧基；
R4是氢或卤素；
R5是氢或C1-6烷基；
R6是氢；C1-6烷基，其未被取代或被氟取代一次、两次或三次；C3-7环烷基；C1-6烷基C3-7环烷基；或苯基-CxH2x-；
R7是氢；C1-6烷基，其未被取代或被1至3个独立地选自以下的取代基取代：氟、羟基和C2-6链烯基；C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷氧基C1-6烷氧基C1-6烷基；氨基C1-8烷基；C1-6烷基羰基氨基C1-8烷基；C1-6烷基磺酰基氨基C1-8烷基；C1-6烷基硫烷基C1-6烷基；C1-6烷基磺酰基C1-6烷基；氰基C1-6烷基；氰基C3-7环烷基C1-6烷基；C3-7环烷基C1-6烷基；苯基C1-6烷基；吡咯烷基羰基C1-6烷基；C2-6炔基；羟基C1-6烷基C2-6炔基；氨基C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷基氨基C1-6烷氧基C1-6烷基；羧基C1-6烷基；C1-6烷氧基羰基氨基C1-8烷基；咪唑基C1-6烷基；吡唑基C1-6烷基；三唑基C1-6烷基；吗啉基C1-6烷基；(2-氧代-吡咯烷基)C1-6烷基；吡咯烷基C1-6烷基；或四氢吡喃基C1-6烷基；
x是1-6；
或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体。
9.根据项目8的化合物，其中
R1是氢；
R2是甲氧基、乙氧基或丙氧基；
R4是氢或氯；
R5是氢或甲基；
R6是氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基、三氟甲基、三氟甲基甲基、环丙基、环丁基、甲基环丙基或苯基甲基；
R7是氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、二氟甲基甲基、二氟甲基乙基、三氟甲基甲基、乙基二氟甲基、乙烯基二氟甲基、炔丙基、羟基甲基炔丙基、甲氧基乙基、甲氧基丙基、甲氧基丁基、乙氧基乙基、甲氧基乙基-O-乙基、氨基乙基、氨基戊基、氨基己基、氨基辛基、叔丁氧羰基氨基戊基、叔丁氧羰基氨基己基、叔丁氧羰基氨基辛基、甲基羰基氨基乙基、甲基羰基氨基戊基、甲基磺酰基氨基乙基、甲基磺酰基氨基戊基、甲基磺酰基乙基、甲基磺酰基丙基、甲基硫烷基丙基、氰基丙基、氰基环丙基甲基、环丙基甲基、环己基乙基、羟基乙基、羟基丙基、羟基-二甲基丙基、羟基-二氟丙基、羟基丁基、羟基戊基、羟基己基、氨基乙基-O-丙基、乙基氨基-乙基-O-丙基-、咪唑基乙基、吡唑基丙基、三唑基丙基、吗啉基乙基、吗啉基丙基、(2-氧代-吡咯烷基)乙基、(2-氧代-吡咯烷基)丙基、苯基甲基、苯基乙基、吡咯烷基乙基、吡咯烷基丙基、吡咯烷基羰基甲基、四氢吡喃基甲基或羧基丙基；
或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体。
10.根据项目4的化合物，其中
R1是氢或卤素；
R2是卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C3-7环烷基；
R4是氢；
R5是氢或C1-6烷基；
R6是C1-6烷基，其未被取代或被氟取代一次、两次或三次；C3-7环烷基或C1-6烷基C3-7环烷基；
R7是C1-6烷基，其未被取代或被1至3个独立地选自以下的取代基取代：氟和羟基；C1-6烷氧基C1-6烷基；氨基C1-8烷基；C1-6烷基羰基氨基C1-8烷基；C1-6烷基磺酰基氨基C1-8烷基；C1-6烷基硫烷基C1-6烷基；C1-6烷基磺酰基C1-6烷基；C3-7环烷基C1-6烷基；苯基C1-6烷基；C1-6烷基氨基C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷氧基羰基氨基C1-8烷基；吗啉基C1-6烷基或四氢吡喃基C1-6烷基；
或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体。
11.根据项目10的化合物，其中
R1是氢、氟或氯；
R2是氟、氯、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或环丙基；
R4是氢；
R5是氢或甲基；
R6是甲基、乙基、异丙基、异丁基、叔丁基、三氟甲基甲基、环丁基或甲基环丙基；
R7是甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、环丙基甲基、二氟甲基甲基、二氟乙基甲基、二氟甲基乙基、三氟甲基甲基、乙基二氟甲基、甲氧基乙基、甲氧基丙基、乙氧基乙基、氨基己基、氨基辛基、叔丁氧羰基氨基戊基、叔丁氧羰基氨基辛基、甲基羰基氨基戊基、甲基磺酰基氨基戊基、甲基磺酰基丙基、甲基硫烷基丙基、羟基丙基、羟基-二甲基丙基、羟基-二氟丙基、羟基丁基、羟基戊基、羟基己基、乙基氨基-乙基-O-丙基-、吗啉基乙基、吗啉基丙基、苯基甲基或四氢吡喃基甲基；
或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体。
12.根据式(I)、项目1或项目2的化合物或其可药用盐或对映异构体，其中R1是氢。
13.根据式(I)、项目1或项目2的化合物或其可药用盐或对映异构体，其中R2是卤素或C1-6烷氧基。
14.根据式(I)、项目1或项目2的化合物或其可药用盐或对映异构体，其中R2是氯或甲氧基。
15.根据式(I)、项目1或项目2的化合物或其可药用盐或对映异构体，其中R5是氢。
16.根据式(I)、项目1或项目2的化合物或其可药用盐或对映异构体，其中R6是C1-6烷基或C1-6烷基C3-7环烷基。
17.根据式(I)、项目1或项目2的化合物或其可药用盐或对映异构体，其中R6是乙基、异丙基、叔丁基或甲基环丙基。
18.根据式(I)、项目1或项目2的化合物或其可药用盐或对映异构体，其中R7是C1-6烷氧基C1-6烷基、羟基C1-6烷基或氨基C1-6烷基。
19.根据式(I)、项目1或项目2的化合物或其可药用盐或对映异构体，其中R7是甲氧基乙基、甲氧基丙基、羟基二甲基丙基、羟基丁基、羟基戊基、羟基己基、氨基丁基、氨基戊基或氨基己基。
在本发明的上下文中，本发明的抑制剂还可以是根据式(II)的化合物，其中抑制剂是下文如项目(1)-(20)中所定义的任一个化合物:
1.根据式(II)的化合物，其中
R1是C1-6烷基、C3-7环烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基C1-6烷基或羧基C1-6烷基；
R2是苯基，其被1、2、3或4个独立地选自以下的基团取代：C1-6烷基、C3-7环烷基、卤素、卤代C1-6烷基、氰基、硝基、羟基、卤代C1-6烷氧基、四氢呋喃基氧基、-O-CxH2x-R3、-O-CyH2y-NHR6、-SO2-R11、-SO2-NR12R13、羧基、C1-6烷氧基羰基和-C(＝O)-NR12R13；吡啶基，其被1、2或3个独立地选自以下的基团取代：卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷氧基、四氢吡喃基氧基、-O-CxH2x-R3和NR9R10；或嘧啶基，其被C1-6烷基和二C1-6烷基氨基取代；其中
R3是氢、C3-7环烷基、卤代C3-7环烷基、羟基、羟基C1-6烷基C3-7环烷基、C1-6烷氧基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、硫杂环丁烷基、1,1-二氧代硫杂环丁烷基、1,1-二氧代噻戊环基、吗啉基、氧代吡咯烷基、氧代吗啉基、氧代哌嗪基、C1-6烷氧基羰基氧代哌嗪基、氧代咪唑烷基、C1-6烷基哌嗪基、C1-6烷基羰基哌嗪基、C1-6烷基磺酰基哌嗪基、C1-6烷氧基羰基哌嗪基、氮杂环丁烷基、C1-6烷基羰基氮杂环丁烷基、C1-6烷基磺酰基氮杂环丁烷基、C1-6烷氧基羰基氮杂环丁烷基、-C(＝O)-R4、C1-6烷基亚磺酰基、-SO2-R5、-C(NHR7)-C(＝O)-R8、羧基C1-6烷氧基或氨基羰基C1-6烷氧基；其中
R4是羟基、C1-6烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、二C1-6烷基氨基、四氢呋喃基氨基、吡咯烷基或吗啉基；
R5是C1-6烷基、羟基或氨基；
R7是氢或C1-6烷氧基羰基；
R8是羟基或C1-6烷氧基；
R6是氢、C1-6烷基羰基、卤代C1-6烷基羰基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷基磺酰基、C3-7环烷基磺酰基或C1-6烷氧基C1-6烷基磺酰基；
R9和R10独立地选自氢、C1-6烷基和C1-6烷基磺酰基；或
R9和R10与它们所连接的氮一起形成吡咯烷基、吗啉基、哌啶基、哌嗪基和氧代哌嗪基；
R11是C1-6烷基或C1-6烷氧基C1-6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-6烷基和C1-6烷氧基C1-6烷基；
x是1、2、3、4、5、6、7或8；
y是1、2、3、4、5、6、7或8；
U是CH；
W是CH；
Z是CH或N；
X是N；
Y是N；
或其可药用盐或对映异构体或其非对映异构体。
2.根据式(II)或项目1的化合物，其中
R1是C1-6烷基；
R2是苯基，其被1、2、3或4个独立地选自以下的基团取代：C1-6烷基、C3-7环烷基、卤素、卤代C1-6烷基、氰基、羟基、卤代C1-6烷氧基、四氢呋喃基氧基、-O-CxH2x-R3、-O-CyH2y-NHR6、-SO2-R11、-SO2-NR12R13、羧基、C1-6烷氧基羰基和-C(＝O)-NR12R13；吡啶基，其被1、2或3个独立地选自以下的基团取代：卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷氧基、四氢吡喃基氧基、-O-CxH2x-R3和NR9R10；或嘧啶基，其被C1-6烷基和二C1-6烷基氨基取代；其中
R3是氢、C3-7环烷基、卤代C3-7环烷基、羟基C1-6烷基C3-7环烷基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、硫杂环丁烷基、1,1-二氧代硫杂环丁烷基、1,1-二氧代噻戊环基、氧代吡咯烷基、氧代吗啉基、氧代哌嗪基、C1-6烷氧基羰基氧代哌嗪基、氧代咪唑烷基、C1-6烷基哌嗪基、C1-6烷基羰基哌嗪基、C1-6烷基磺酰基哌嗪基、C1-6烷氧基羰基哌嗪基、氮杂环丁烷基、C1-6烷基羰基氮杂环丁烷基、C1-6烷基磺酰基氮杂环丁烷基、C1-6烷氧基羰基氮杂环丁烷基、-C(＝O)-R4、C1-6烷基亚磺酰基、-SO2-R5、-C(NHR7)-C(＝O)-R8、羧基C1-6烷氧基或氨基羰基C1-6烷氧基；其中
R4是羟基、C1-6烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、四氢呋喃基氨基或吗啉基；
R5是C1-6烷基、羟基或氨基；
R7是氢或C1-6烷氧基羰基；
R8是羟基或C1-6烷氧基；
R6是氢、C1-6烷基羰基、卤代C1-6烷基羰基、C1-6烷氧基羰基、C3-7环烷基磺酰基或C1-6烷氧基C1-6烷基磺酰基；
R9和R10独立地选自氢、C1-6烷基和C1-6烷基磺酰基；或
R9和R10与它们所连接的氮一起形成吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基和氧代哌嗪基；
R11是C1-6烷氧基C1-6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-6烷基和C1-6烷氧基C1-6烷基；
x是1、2、3、4、5、6、7或8；
y是1、2、3、4、5、6、7或8；
U是CH；
W是CH；
Z是N；
X是N；
Y是N；
或其可药用盐或对映异构体或其非对映异构体。
3.根据式(II)、项目1或项目2的化合物或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体，其中R1是甲基。
4.根据式(II)、项目1或项目2的化合物，其中
R1是C1-6烷基；
R2是苯基，其被1、2、3或4个独立地选自以下的基团取代：C1-6烷基、C3-7环烷基、卤素、卤代C1-6烷基、氰基、羟基、卤代C1-6烷氧基、四氢呋喃基氧基、-O-CxH2x-R3、-O-CyH2y-NHR6、-SO2-R11、-SO2-NR12R13、羧基、C1-6烷氧基羰基和-C(＝O)-NR12R13；
R3是氢、C3-7环烷基、卤代C3-7环烷基、羟基C1-6烷基C3-7环烷基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、硫杂环丁烷基、1,1-二氧代硫杂环丁烷基、1,1-二氧代噻戊环基、氧代吡咯烷基、氧代吗啉基、氧代哌嗪基、C1-6烷氧基羰基氧代哌嗪基、氧代咪唑烷基、C1-6烷基哌嗪基、C1-6烷基羰基哌嗪基、C1-6烷基磺酰基哌嗪基、C1-6烷氧基羰基哌嗪基、氮杂环丁烷基、C1-6烷基羰基氮杂环丁烷基、C1-6烷基磺酰基氮杂环丁烷基、C1-6烷氧基羰基氮杂环丁烷基、-C(＝O)-R4、C1-6烷基亚磺酰基、-SO2-R5或-C(NHR7)-C(＝O)-R8；其中
R4是羟基、C1-6烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、四氢呋喃基氨基或吗啉基；
R5是C1-6烷基、羟基或氨基；
R7是氢或C1-6烷氧基羰基；
R8是羟基或C1-6烷氧基；
R6是氢、C1-6烷基羰基、卤代C1-6烷基羰基、C1-6烷氧基羰基、C3-7环烷基磺酰基或C1-6烷氧基C1-6烷基磺酰基；
R11是C1-6烷氧基C1-6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-6烷基和C1-6烷氧基C1-6烷基；
x是1、2、3、4、5或6；
y是1、2、3、4、5、6、7或8；
U是CH；
W是CH；
Z是N；
X是N；
Y是N；
或其可药用盐或对映异构体或其非对映异构体。
5.根据式(II)或项目1至4中任一项的化合物，其中
R1是甲基；
R2是苯基，其被1、2、3或4个独立地选自以下的基团取代：甲基、环丙基、氟、氯、碘、三氟甲基、氰基、羟基、甲氧基、二氟乙氧基、二氟甲氧基、三氟乙氧基、三氟甲氧基、环丙基甲氧基、二氟环丙基甲氧基、羟基甲基环丙基甲氧基、氧杂环丁基乙氧基、氧杂环丁基甲氧基、四氢呋喃基乙氧基、四氢呋喃基甲氧基、四氢吡喃基甲氧基、硫杂环丁烷基甲氧基、(1,1-二氧代硫杂环丁烷基)甲氧基、(1,1-二氧代噻戊环基)甲氧基、氧代吡咯烷基丙氧基、氧代吗啉基丙氧基、氧代哌嗪基丙氧基、(叔丁氧羰基氧代哌嗪基)丙氧基、氧代咪唑烷基丙氧基、甲基哌嗪基丙氧基、乙酰基哌嗪基丙氧基、甲基磺酰基哌嗪基丙氧基、(叔丁氧羰基哌嗪基)丙氧基、氮杂环丁烷基乙氧基、乙酰基氮杂环丁烷基乙氧基、甲基磺酰基氮杂环丁烷基乙氧基、(叔丁氧羰基氮杂环丁烷基)乙氧基、(叔丁氧羰基氮杂环丁烷基)甲氧基、羧基丁氧基、羧基乙氧基、羧基己基氧基、羧基甲氧基、羧基丙氧基、甲氧基羰基丁氧基、乙氧基羰基己基氧基、氨基羰基丁氧基、氨基羰基己基氧基、氨基羰基甲氧基、氨基羰基丙氧基、甲基氨基羰基丙氧基、四氢呋喃基氨基羰基甲氧基、吗啉基羰基甲氧基、甲基亚磺酰基丙氧基、甲基磺酰基丙氧基、磺基丙氧基、氨基磺酰基丙氧基、氨基-羧基-丙氧基、(叔丁氧羰基氨基)-羧基-丙氧基、(叔丁氧羰基氨基)-(甲氧基羰基)-丙氧基、氨基丙氧基、氨基戊氧基、氨基己基氧基、氨基辛基氧基、甲基羰基氨基丙氧基、氯丙基羰基氨基丙氧基、(叔丁氧羰基氨基)己基氧基、(叔丁氧羰基氨基)辛基氧基、(叔丁氧羰基氨基)戊氧基、(叔丁氧羰基氨基)丙氧基、环丙基磺酰基氨基丙氧基、甲氧基乙基磺酰基氨基丙氧基、甲氧基丙基磺酰基、甲氧基丙基氨基磺酰基、N-甲氧基丙基-N-甲基-氨基磺酰基、羧基、甲氧基羰基、甲氧基丙基氨基羰基、N-甲氧基丙基-N-甲基-氨基羰基和四氢呋喃基氧基；
U是CH；
W是CH；
Z是N；
X是N；
Y是N；
或其可药用盐或对映异构体或其非对映异构体。
6.根据式(II)或项目1至4中任一项的化合物或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体，其中R2是苯基，其被1、2或3个独立地选自以下的基团取代：卤素、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、C3-7环烷基C1-6烷氧基和卤代C3-7环烷基C1-6烷氧基。
7.根据式(II)或项目1至6中任一项的化合物或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体，其中R2是苯基，其被1、2或3个独立地选自以下的基团取代：氟、氯、甲氧基、二氟乙氧基、三氟乙氧基、环丙基甲氧基和二氟环丙基甲氧基。
8.根据式(II)或项目1、2和4中任一项的化合物，其中
R1是C1-6烷基；
R2是苯基，其被2或3个独立地选自以下的基团取代：卤素、氰基、卤代C1-6烷氧基、-O-C xH2x-R3和-O-C yH2y-NHR6；
R3是氢、C3-7环烷基、卤代C3-7环烷基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、C1-6烷基磺酰基氮杂环丁烷基、氨基羰基或C1-6烷基磺酰基；
R6是氢或C1-6烷氧基羰基；
x是1、2、3、4、5或6；
y是1、2、3、4、5或6；
U是CH；
W是CH；
Z是N；
X是N；
Y是N；
或其可药用盐或对映异构体或其非对映异构体。
9.根据式(II)或项目1至5和8中任一项的化合物，其中
R1是甲基；
R2是苯基，其被2或3个独立地选自以下的基团取代：氟、氯、氰基、甲氧基、二氟乙氧基、三氟乙氧基、环丙基甲氧基、二氟环丙基甲氧基、甲基磺酰基丙氧基、氨基羰基甲氧基、氧杂环丁基甲氧基、氧杂环丁基乙氧基、四氢呋喃基甲氧基、四氢吡喃基甲氧基、甲基磺酰基氮杂环丁烷基乙氧基、氨基己基氧基和(叔丁氧羰基氨基)丙氧基；
U是CH；
W是CH；
Z是N；
X是N；
Y是N；
或其可药用盐或对映异构体或其非对映异构体。
10.根据式(II)或项目1或项目2的化合物，其中
R1是C1-6烷基；
R2是吡啶基，其被1、2或3个独立地选自以下的基团取代：卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷氧基、四氢吡喃基氧基、-O-CxH2x-R3和NR9R10；
R3是氢、C3-7环烷基、硫杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氧代吗啉基、1,1-二氧代-硫杂环丁烷基、C1-6烷基羰基氮杂环丁烷基、C1-6烷基磺酰基氮杂环丁烷基、-C(＝O)-R4、羧基C1-6烷氧基或氨基羰基C1-6烷氧基；其中
R4是羟基、C1-6烷氧基或氨基；
R9和R10独立地选自氢、C1-6烷基和C1-6烷基磺酰基；或
R9和R10与它们所连接的氮一起形成吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基和氧代哌嗪基；
x是1、2、3、4、5、6、7或8；
U是CH；
W是CH；
Z是N；
X是N；
Y是N；
或其可药用盐或对映异构体或其非对映异构体。
11.根据式(II)或项目1至3和10中任一项的化合物，其中
R1是甲基；
R2是吡啶基，其被1、2或3个独立地选自以下的基团取代：氟、氯、碘、甲氧基、甲基、二氟乙氧基、四氢吡喃基氧基、环丙基甲氧基、硫杂环丁烷基甲氧基、四氢呋喃基甲氧基、四氢吡喃基甲氧基、氧代吗啉基丙氧基、(1,1-二氧代-硫杂环丁烷基)甲氧基、乙酰基氮杂环丁烷基甲氧基、甲基磺酰基氮杂环丁烷基甲氧基、羧基丁氧基、羧基庚基氧基、羧基己基氧基、羧基戊基氧基、羧基丙氧基、甲氧基羰基庚基氧基、氨基羰基丁氧基、氨基羰基庚基氧基、氨基羰基己基氧基、氨基羰基甲氧基、氨基羰基戊基氧基、氨基羰基丙氧基、羧基甲氧基丙氧基、氨基羰基甲氧基丙氧基、氨基、甲基氨基、二甲基氨基、甲基磺酰基氨基、吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基和氧代哌嗪基；
U是CH；
W是CH；
Z是N；
X是N；
Y是N；
或其可药用盐或对映异构体或其非对映异构体。
12.根据式(II)或项目1至3和10中任一项的化合物或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体，其中R2是吡啶基，其被1、2或3个独立地选自以下的基团取代：卤素、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、二C1-6烷基氨基、吡咯烷基和氧代哌嗪基。
13.根据式(II)或项目1至3、10和11中任一项的化合物或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体，其中R2是吡啶基，其被1、2或3个独立地选自以下的基团取代：氟、氯、甲氧基、二氟乙氧基、甲基氨基、二甲基氨基、吡咯烷基和氧代哌嗪基。
14.根据式(II)或项目1、2和10中任一项的化合物，其中
R1是C1-6烷基；
R2是吡啶基，其被2或3个独立地选自以下的基团取代：卤素、卤代C1-6烷氧基、-O-CxH2x-R3和NR9R10；
R3是氢、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氧代吗啉基或氨基羰基；
R9和R10独立地选自氢和C1-6烷基；或
R9和R10与它们所连接的氮一起形成吡咯烷基和氧代哌嗪基；
x是1、2、3、4、5或6；
U是CH；
W是CH；
Z是N；
X是N；
Y是N；
或其可药用盐或对映异构体或其非对映异构体。
15.根据式(II)或项目1或项目6的化合物，其中
R1是甲基；
R2是吡啶基，其被2或3个独立地选自以下的基团取代：氟、氯、甲氧基、二氟乙氧基、四氢呋喃基甲氧基、四氢吡喃基甲氧基、氧代吗啉基丙氧基、氨基羰基己基氧基、甲基氨基、二甲基氨基、吡咯烷基和氧代哌嗪基；
U是CH；
W是CH；
Z是N；
X是N；
Y是N；
或其可药用盐或对映异构体或其非对映异构体。
16.根据式(II)或项目1的化合物，其中
R1是C1-6烷基、C3-7环烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基C1-6烷基或羧基C1-6烷基；
R2是苯基，其被1、2或3个独立地选自以下的基团取代：卤素、硝基、C1-6烷基磺酰基、-O-CxH2x-R3和-O-CyH2y-NHR6；或吡啶基，其被2个独立地选自以下的基团取代：卤素、卤代C1-6烷氧基、-O-CxH2x-R3和NR9R10；其中
R3是氢、C3-7环烷基、羟基、C1-6烷氧基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、吗啉基、-C(＝O)-R4、-SO2-R5或氨基羰基C1-6烷氧基；其中
R4是羟基、C1-6烷氧基、氨基、二C1-6烷基氨基或吡咯烷基；
R5是C1-6烷基；
R6是氢或C1-6烷基磺酰基；
R9和R10是C1-6烷基；或
R9和R10与它们所连接的氮一起形成吡咯烷基、吗啉基、哌啶基和氧代哌嗪基；
x是1、2、3、4、5或6；
y是1、2、3、4、5或6；
U是CH；
W是CH；
Z是CH；
X是N；
Y是N；
或其可药用盐或对映异构体或其非对映异构体。
17.根据式(II)或项目1或项目16的化合物或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体，其中R1是C1-6烷基。
18.根据式(II)或项目1、16和17中任一项的化合物或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体，其中R1是甲基。
19.根据式(II)或项目1和16至18中任一项的化合物或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体，其中R2是苯基，其被1、2或3个独立地选自以下的基团取代：卤素和C1-6烷氧基；或吡啶基，其被2个独立地选自以下的基团取代：卤素、二C1-6烷基氨基、吡咯烷基和氧代哌嗪基。
20.根据式(II)或项目1和16至19中任一项的化合物或其可药用盐或对映异构体或非对映异构体，其中R2是苯基，其被1、2或3个独立地选自以下的基团取代：氟和甲氧基；或吡啶基，其被2个独立地选自以下的基团取代：氟、二甲基氨基、吡咯烷基和氧代哌嗪基。
如上所述，本发明的抑制剂还可以是针对PAPD5和/或PAPD7的RNAi分子。所述RNAi分子可以是siRNA或shRNA。
例如，本发明的抑制剂可以是针对PAPD5的siRNA，其中所述siRNA是以下siRNA中的任何一种：
PAPD5 siRNA池(L-010011-00-0010；ON-TARGETplus人PAPD5):
siRNA–1–J-010011-05–靶序列:CAUCAAUGCUUUAUAUCGA(SEQ ID NO:10)
siRNA–2–J-010011-06–靶序列:GGACGACACUUCAAUUAUU(SEQ ID NO:11)
siRNA–3–J-010011-07–靶序列:GAUAAAGGAUGGUGGUUCA(SEQ ID NO:12)
siRNA–4–J-010011-08–靶序列:GAAUAGACCUGAGCCUUCA(SEQ ID NO:13)
本发明的抑制剂还可以是针对PAPD7的siRNA，其中所述siRNA是以下siRNA中的任意一种:
PAPD7 siRNA池(L-009807-00-0005；ON-TARGETplus人PAPD7):
siRNA–1–J-009807-05–靶序列:GGAGUGACGUUGAUUCAGA(SEQ ID NO:14)
siRNA–2–J-009807-06–靶序列:CGGAGUUCAUCAAGAAUUA(SEQ ID NO:15)
siRNA–3–J-009807-07–靶序列:CGGAGUUCAUCAAGAAUUA(SEQ ID NO:16)
siRNA–4–J-009807-08–靶序列:GCGAAUAGCCACAUGCAAU(SEQ ID NO:17)
以上显示了合适的siRNA的靶序列。相应siRNA的序列与这些靶序列直接互补。
在本发明的上下文中涉及的是，将(a)针对PAPD5的siRNA与(a)针对PAPD7的siRNA组合，以抑制PAPD5和PAPD7两者的表达。
所附实施例令人惊讶地证明，两种结构完全不同的抗HBV剂(即DHQ和THP)具有对PAPD5和PAPD7的共有结合位点或至少在彼此非常邻近的位置结合。特别地，已经鉴定了PAPD5和PAPD7内的选定的相互作用结构域(SID)。SID是匹配相同参照蛋白的所有猎物片段共有的氨基酸序列。因此，SID对应于抗HBV剂DHQ和THP与PAPD5和PAPD7结合的氨基酸区域。因此，与这些区域的结合导致PAPD5和PAPD7活性的抑制，这导致抑制HBV的增殖。因此，本发明的抑制剂可以是特异性结合PAPD5和/或PAPD7的至少一个SID的抗体。因此，本发明的抑制剂可以是特异性结合SEQ ID NO:7-9中任一个的氨基酸段的抗体。本发明的抑制剂还可以是特异性结合SEQ ID NO:7-9的多于一个的氨基酸段的抗体。
应用
在本发明的上下文中，令人惊讶地显示PAPD5和PAPD7的组合抑制导致HBV增殖抑制的协同效应。所附实施例表明单独降低PAPD5的表达导致HBsAg和HBeAg分泌降低约50％。单独降低PAPD7的表达导致HBsAg和HBeAg的分泌降低不超过15％。同时敲低PAPD5和PAPD7导致HBsAg和HBeAg分泌降低的协同效应，其高于各单次敲低的总和。不受理论束缚，这种协同效应可能是由于PAPD5和PAPD7的补偿作用，因为两种蛋白质具有高度序列同源性和相同的酶功能。
因此，本发明的一个实施方案涉及包含PAPD5抑制剂和PAPD7抑制剂的组合制剂，其用于治疗和/或预防HBV感染。因此，本发明涉及组合制剂，其包含PAPD5抑制剂和PAPD7抑制剂，用于同时或依次用于治疗和/或预防HBV感染。在本发明的上下文中涉及的是，所述组合制剂用于治疗(例如改善)HBV感染。本文公开的与本发明的抑制剂有关的定义经必要的变更，适用于本发明的组合制剂。组合制剂可包含作为PAPD5抑制剂的分子和作为PAPD7抑制剂的单独的分子(例如两个单独的siRNA分子，或两个单独的小分子)。这两个单独的抑制剂可以配制在一个单元内，例如在一个丸剂或小瓶内。或者，这两个单独的抑制剂可以以单独的单元(例如，单独的丸剂或小瓶)单独配制。两种单独的抑制剂可以一起施用(即同时)或分开施用(即依次)，只要达到两种抑制剂的协同作用即可。在本发明的一个方面，与无药物对照相比(即与未施用药物的细胞或受试者相比)，组合制剂导致HBsAg和HBeAg分泌降低至少50％。
本发明还涉及用于治疗和/或预防HBV感染的药物组合物，其中所述药物组合物包含
(i)本发明的抑制剂；或本发明的组合制剂；和
(ii)任选的可药用载体。
因此，本发明涉及治疗和/或预防HBV感染的方法，其中该方法包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的本发明的抑制剂、本发明的药物组合物，或本发明的组合制剂。
本发明的抑制剂、本发明的组合制剂或本发明的药物组合物可以用于组合疗法。例如，本发明的抑制剂、本发明的组合制剂或本发明的药物组合物可以与其他抗HBV剂组合，如干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1(聚乙二醇化和非聚乙二醇化)、利巴韦林(ribavirin,)、拉米夫定(lamivudine，3TC)、恩替卡韦(entecavir)、替诺福韦(tenofovir)、替比夫定(telbivudine，LdT)、阿德福韦(adefovir)或其他新兴抗HBV剂，如HBV RNA复制抑制剂、HBsAg分泌抑制剂、HBV衣壳抑制剂、反义寡聚物(例如，如WO2012/145697和WO2014/179629中所述)、siRNA(例如，如WO 2005/014806、WO 2012/024170、WO2012/2055362、WO 2013/003520、WO 2013/159109、WO 2017/027350和WO2017/015175中所述)、HBV治疗性疫苗、HBV预防性疫苗、HBV抗体疗法(单克隆或多克隆)，或用于治疗和/或预防HBV的TLR 2、3、7、8或9种激动剂。
所附实施例证明，PAPD5和/或PAPD7的下调伴随着HBsAg和HBeAg以及HBV感染细胞中细胞内HBV mRNA产生的降低。这些结果表明，例如，如果用PAPD5和/或PAPD7抑制剂的治疗正在进行或已经进行，那么PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性可用于监测治疗HBV感染期间的治疗成功。因此，本发明涉及一种用于监测治疗HBV感染期间治疗成功的方法，其中该方法包括：
(a)分析从测试受试者获得的样品中PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性；
(b)将所述量和/或活性与相应于至少一个参考受试者的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性的参考数据进行比较；和
(c)基于比较步骤(b)预测治疗成功。
在本发明的监测方法中，测试受试者可以是接受HBV感染药物或已经接受HBV感染药物的人。药物可包含如上所述的抗HBV剂。药物还可包含PAPD5和/或PAPD的抑制剂。
在本发明的监测方法中，参考数据可以对应于至少一个参考受试者样品中的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性。所述样品可以是血液或肝脏活检物。
本发明的一个方面涉及本发明的监测方法，其中所述至少一个参考受试者患有HBV感染但未接受HBV感染的药物；并且其中在步骤(c)中，与参考数据相比，测试受试者中降低的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性表明在治疗HBV感染中治疗成功。例如，所述降低的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性可以意味着在测试受试者的样品中PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性是所述至少一个参考受试者的样品中的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性的0至90％。例如，所述降低的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性可以是所述至少一个参考受试者的样品中的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性的0至80％，优选为0至70％，更优选0至60％，甚至更优选0至50％，甚至更优选0至40％，甚至更优选0至30％，甚至更优选0至20％，最优选0至10％。
本发明的另一方面涉及本发明的监测方法，其中所述至少一个参考受试者患有HBV感染并且已接受用于HBV感染的药物；并且其中在步骤(c)中，与参考数据相比测试受试者中相同或相似的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性表明在治疗HBV感染中治疗成功。本发明的另一方面涉及本发明的监测方法，其中所述至少一个参考受试者不具有HBV感染；并且其中在步骤(c)中，与参考数据相比测试受试者中相同或相似的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性表明在治疗HBV感染中治疗成功。相同或相似的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性可以意味着测试受试者样品中PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性是所述至少一个参考受试者样品中的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性的90-110％。例如，所述相同或相似的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性可以是所述至少一个参考受试者样品中的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性的95-105％。
本发明还包括具有增加、降低或缺失的PAPD5和/或PAPD7表达的细胞或非人动物(例如小鼠、大鼠、雪貂或兔)，其可用于鉴定和/或表征预防和/或治疗(例如改善)HBV感染的化合物。例如，所述细胞或非人动物可包含编码PAPD5和/或PAPD7的外源核苷酸序列，例如，克隆到表达载体中并有效连接外源启动子。所述细胞或非人动物可过表达PAPD5和/或PAPD7，优选PAPD5和PAPD7。或者，所述细胞或非人动物可具有敲低的PAPD5和/或PAPD7，优选敲低的PAPD5和PAPD7。
本发明的实施方案
因此，本发明涉及以下项目:
1.鉴定预防、改善和/或抑制乙型肝炎病毒(HBV)感染的化合物的方法，其包括:
(a)使试验化合物与以下接触
(a1)PAP相关结构域5(PAP associated domain containing 5，PAPD5)和/或PAP相关结构域7(PAP associated domain containing 7，PAPD7)；或(a2)表达PAPD5和/或PAPD7的细胞；
(b)在存在和不存在所述试验化合物的情况下测定PAPD5和/或PAPD7的表达和/或活性；和
(c)将降低PAPD5或PAPD7的表达和/或活性的化合物鉴定为预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物。
2.鉴定预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物的方法，其包括:
(a)使试验化合物与以下接触
(a1)PAPD5和/或PAPD7；或
(a2)表达PAPD5和/或PAPD7的细胞；
(b)测定试验化合物是否与PAPD5和/或PAPD7结合；
(c)测定试验化合物是否抑制HBV的增殖；和
(d)将结合PAPD5和/或PAPD7和抑制HBV的增殖的化合物鉴定为预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物.
3.项目1或2的方法，其中PAPD5是PAPD5多肽或PAPD5mRNA。
4.项目3的方法，其中PAPD5多肽是包含或由以下组成的多肽：
(i)SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列；
(ii)与(i)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有聚腺苷酸聚合酶功能；
(iii)SEQ ID NO:1或2的酶活性片段的氨基酸序列；或
(iv)与(iii)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有聚腺苷酸聚合酶功能。
5.项目3的方法，其中PAPD5mRNA是多核苷酸，其包含或由以下组成：
(i)编码SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的核苷酸序列；
(ii)编码与SEQ ID NO:1或2具有至少80％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中多核苷酸编码具有聚腺苷酸聚合酶功能的多肽；
(iii)编码SEQ ID NO:1或2的酶活性片段的核苷酸序列；或
(iv)编码与SEQ ID NO:1或2的酶活性片段的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中多核苷酸编码具有聚腺苷酸聚合酶功能的多肽。
6.项目1或2的方法，其中PAPD7是PAPD7多肽或PAPD7mRNA。
7.项目6的方法，其中PAPD7多肽是包含或由以下组成的多肽：
(i)SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(ii)与(i)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中多肽具有聚腺苷酸聚合酶功能；
(iii)SEQ ID NO:3的酶活性片段的氨基酸序列；或
(iv)与(iii)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中多肽具有聚腺苷酸聚合酶功能。
8.项目6的方法，其中PAPD7mRNA是包含或由以下组成的多核苷酸：
(i)编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的核苷酸序列；
(ii)编码与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中多核苷酸编码具有聚腺苷酸聚合酶功能的多肽；
(iii)编码SEQ ID NO:3的酶活性片段的核苷酸序列；或
(iv)编码与SEQ ID NO:3的酶活性片段的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中多核苷酸编码具有聚腺苷酸聚合酶功能的多肽。
9.项目1至8中任一项的方法，其中所述细胞是真核细胞。
10.项目2至9中任一项的方法，其中抑制HBV的增殖的化合物抑制HBV表面抗原(HBsAg)的分泌，抑制HBV包膜抗原(HBeAg)的分泌，和/或抑制细胞内HBV mRNA或HBV DNA的产生。
11.项目1至10中任一项的方法，其另外包括将试验化合物与对照物进行比较的步骤。
12.项目11的方法，其中在所述对照中使用无活性试验化合物，其中所述无活性试验化合物是以下化合物:
(i)不降低PAPD5和/或PAPD7的表达和/或活性；和/或
(ii)不结合PAPD5和/或PAPD7且不抑制HBV的增殖。
13.项目1至12中任一项的方法，其中所述试验化合物是
(i)筛选文库的小分子；或
(ii)噬菌体展示文库的肽、抗体片段文库的肽或源自cDNA文库的肽。
14.项目1和3至13中任一项的方法，其中PAPD5和PAPD7的活性是聚腺苷酸聚合酶功能。
15.用于治疗和/或预防HBV感染的PAPD5和/或PAPD7的抑制剂，其中所述抑制剂是
(i)与PAPD5和/或PAPD7结合的小分子；
(ii)针对PAPD5和/或PAPD7的RNA干扰(RNAi)分子；
(iii)特异性结合PAPD5和/或PAPD7的抗体；或
(iv)基因组编辑器，其包含：
(a)位点特异性DNA核酸酶或编码位点特异性DNA核酸酶的多核苷酸；和
(b)向导RNA或编码向导RNA的多核苷酸。。
16.根据项目15的用途的抑制剂，其
(i)结合PAPD5和/或PAPD7；和/或
(ii)抑制PAPD5和/或PAPD7的表达和/或活性。
17.根据项目15或16的用途的抑制剂，其中抑制剂降低HBsAg和HBeAg的分泌。
18.根据项目15至17中任一项的用途的抑制剂，其中抑制剂抑制慢性HBV感染的出现或发展和/或降低HBV感染者的感染性。
19.根据项目15至18中任一项的用途的抑制剂，其中抑制剂是式(III)或(IV)的化合物:
20.根据项目15至18中任一项的用途的抑制剂，其中抑制剂是RNAi分子如siRNA或shRNA。
21.根据项目15至18中任一项的用途的抑制剂，其中抑制剂是特异性结合SEQ IDNO:7-9中任一个的氨基酸段的抗体。
22.包含PAPD5抑制剂和PAPD7抑制剂的组合制剂，用于同时或依次用于治疗和/或预防HBV感染。
23.用于治疗和/或预防HBV感染的药物组合物，其中药物组合物包含(i)根据项目15至21中任一项的用途的抑制剂；或项目22的组合制剂；和
(ii)任选的可药用载体。
24.监测治疗HBV感染期间治疗成功的方法，其中该方法包括：
(a)分析从测试受试者获得的样品中PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性；
(b)将所述量和/或活性与相应于至少一个参考受试者的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性的参考数据进行比较；和
(c)基于比较步骤(b)预测治疗成功。
25.项目24的监测方法，其中所述测试受试者是接受HBV感染药物或已经接受HBV感染药物的人。
26.项目24或25的监测方法，其中参考数据对应于至少一个参考受试者的样品中PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性。
27.项目24至26中任一项的监测方法，其中所述至少一个参考受试者患有HBV感染但未接受HBV感染的药物；并且其中在步骤(c)中，与参考数据相比测试受试者中降低的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性表明在治疗HBV感染中治疗成功。
28.项目27的监测方法，其中所述降低的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性意味着在测试受试者的样品中PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性是所述至少一个参考受试者的样品中的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性的0至90％。
29.项目24至26中任一项的监测方法，其中所述至少一个参考受试者患有HBV感染并且已接受用于HBV感染的药物；并且其中在步骤(c)中，与参考数据相比测试受试者中相同或相似的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性表明在治疗HBV感染中治疗成功。
30.项目24至26中任一项的监测方法，其中所述至少一个参考受试者不具有HBV感染；并且其中在步骤(c)中，与参考数据相比测试受试者中相同或相似的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性表明在治疗HBV感染中治疗成功。
31.项目29或30的监测方法，其中所述相同或相似的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性意味着测试受试者样品中PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性是所述至少一个参考受试者样品中的PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性的90-110％。
制备
式(I)的化合物(即根据式(I)的二氢喹嗪酮化合物)可如WO 2015/113990A1中所述合成。简而言之，式(I)化合物可通过包括以下步骤的方法制备:
(a)式(A)的化合物的水解
(b)式(B)的化合物的水解
其中R1至R7和R9如上文关于式(I)所定义，除非另有说明。
在步骤(a)和步骤(b)中，例如，可以使用如氢氧化锂或氢氧化钠的碱。
式(II)的化合物(即根据式(II)的四氢吡啶并嘧啶化合物)可如WO2016/177655中所述合成。简而言之，式(II)的化合物可通过包括以下步骤之一的方法制备：
(a)在路易斯酸的存在下将式(A)的化合物
与式(B)的化合物偶联
R1M(B)；
(b)在碱的存在下将式(C)的化合物
与式(D)的化合物偶联
NHR9R10(D)；
(c)将式(E)的化合物
与式(F)的化合物偶联
R2-L2(F)；
其中R1、R2、U、W、X、Y和Z如上相对于式(II)所定义；M是H、Mg、Zn或Na；L1是F、Cl或Br；且L2是F、Cl或Br。
在步骤(a)中，路易斯酸可以是例如BF3·Et2O或Sc(OTf)3；
在步骤(b)中，碱可以是例如K2CO3或DIEA；
在步骤(c)中，反应可在碱的存在下进行，碱可以是例如K2CO3或DIEA。该反应也可在不存在碱的情况下进行。
组合物
如上所述，本发明涉及用于治疗和/或预防HBV感染的PAPD5和/或PAPD7的抑制剂；用于治疗和/或预防HBV感染的组合制剂，其包含PAPD5抑制剂和PAPD7抑制剂；和包含所述抑制剂或所述组合制剂的药物组合物。所述药物组合物(即药物)任选地包含可药用载体。所述药物组合物可进一步包含可治疗用稀释剂或赋形剂。
通过将PAPD5抑制剂和/或PAPD7抑制剂与载体或赋形剂混合来制备典型的药物组合物。合适的载体和赋形剂是本领域技术人员熟知的，并且在例如Ansel,Ansel’sPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Philadelphia:Lippincott,Williams&Wilkins,2004；Gennaro,Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,Philadelphia:Lippincott,Williams&Wilkins,2000；和Rowe,Handbook ofPharmaceutical Excipients,Chicago,Pharmaceutical Press,2005中详细描述。该制剂还可包括一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂、抗氧化剂、不透明剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、矫味剂、稀释剂和其他已知的添加剂，以改善药物的外观或有助于制造药物产品(即药物)。例如，可以通过如下方式配制本发明的药物组合物：将具有所需纯度的PAPD5抑制剂和/或PAPD7抑制剂在环境温度下在合适的pH下与生理学上可接受的载体混合，即，该载体在合适的施用形式中采用的剂量和浓度对接受者是无毒的。本发明的药物组合物可以是无菌的。
根据本发明的化合物可以以其可药用盐的形式存在。术语“可药用盐”是指常规的酸加成盐或碱加成盐，其保留本发明化合物的生物有效性和性质，并且由合适的无毒有机酸或无机酸或有机或无机碱形成。例如酸加成盐包括衍生自无机酸的那些，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸；以及衍生自有机酸的那些，所述有机酸例如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等。碱加成盐包括衍生自铵、钾、钠和季铵氢氧化物的那些，如，例如氢氧化四甲基铵。将药物化合物化学修饰成盐以获得改善的化合物的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和溶解性，是药物化学家熟知的技术。例如，描述于Bastin,Organic Process Research&Development 2000,4,427-435或Ansel,In:Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第6版(1995),第196和1456-1457页中。例如，本文提供的化合物的可药用盐可以是钠盐。
含有一个或几个手性中心的化合物可以外消旋体、非对映体混合物或旋光性单一异构体存在。可以根据已知方法将外消旋体分离成各对映体。特别是，可以通过结晶分离的非对映体盐是由外消旋混合物通过与旋光性酸(例如D-或L-酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸或樟脑磺酸)反应而形成的。
本发明的药物组合物以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、药剂的递送部位、施用方法、施用计划、患者的年龄和性别以及执业医师已知的其他因素。本文中，“有效量”(也称为“(治疗)有效剂量”)是指将引起医师或其他临床医生正在寻求的受试者生物或医学反应的化合物的量。本发明的抑制剂、本发明的组合制剂或本发明的药物组合物的“有效量”将取决于这些考虑因素，并且是抑制HBsAg和/或HBeAg所需的最小量。例如，这样的量可低于对受体细胞或整个哺乳动物有毒的量。
例如，如果PAPD5抑制剂和/或PAPD7抑制剂是(a)根据式(I)或(II)的化合物，则每剂量胃肠外施用的药学有效量可以在约0.01至100mg/kg、或者0.01至100mg/kg患者体重/天的范围内，所用化合物的典型初始范围为0.3至15mg/kg/天。在另一个实例中，如果PAPD5抑制剂和/或PAPD7抑制剂是(a)根据式(I)或(II)的化合物，则口服单位剂型、如片剂和胶囊，优选含有约0.1至约1000毫克。
本发明的抑制剂、本发明的组合制剂或本发明的药物组合物可以通过任何合适的方式施用，包括口服、局部(包括颊和舌下)、直肠、阴道、透皮、肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、皮内、鞘内和硬膜外和鼻内，且如果需要用于局部治疗，包括病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
本发明的抑制剂、本发明的组合制剂或本发明的药物组合物可以任何方便的施用形式施用，例如片剂，粉末，胶囊剂，溶液剂，分散剂，混悬剂，糖浆剂，喷雾剂，栓剂，凝胶剂、乳剂、贴剂等。这些组合物可含有药物制剂中常用的组分，例如稀释剂、载体、pH调节剂、甜味剂、填充剂和其它活性剂。
本发明的抑制剂、本发明的组合制剂或本发明的药物组合物可用于预防和/或治疗HBV感染。其优选抑制HBsAg和/或HBeAg的分泌，最优选抑制HBsAg和HBeAg的分泌。
定义
本文使用的术语“治疗”等通常意指获得所需的药理学和/或生理学效果。在部分或完全治愈疾病和/或归因于疾病的副作用方面，该效果是治疗性的。本文所用的术语“治疗”涵盖对受试者疾病的任何治疗，包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展，如抑制HBsAg和/或HBeAg的增加；或(b)改善(即缓解)疾病，即引起疾病消退，如抑制HBsAg和/或HBeAg产生。因此，改善和/或抑制HBV感染的化合物是治疗HBV感染的化合物。优选地，如本文所用的术语“治疗”涉及对已显现病症的医学干预，如治疗已经明确定义和表现的HBV感染。本文中术语“预防”或“防止”涉及预防性治疗，即涉及其目的是预防而不是治愈疾病的措施或方法。预防意味着获得所需的药理学和/或生理学效果，其在完全或部分预防疾病或其症状方面是预防性的。因此，本文中“预防HBV感染”包括预防受试者中发生HBV感染，以及预防HBV感染症状的发生。
出于本发明的目的，“受试者”(或“患者”)可以是脊椎动物。在本发明的上下文中，术语“受试者”包括人和其他动物，特别是哺乳动物和其他生物。因此，本文提供的手段和方法适用于人类治疗和兽医应用。因此，本文的受试者可以是动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、雪貂、猫、狗、鸡、绵羊、牛物种、马、骆驼或灵长类动物。优选地，受试者是哺乳动物。更优选地，受试者是人。
术语“乙型肝炎病毒感染”或“HBV感染”在本领域中是公知的，并且是指由乙型肝炎病毒(HBV)引起并影响肝脏的传染病。HBV感染可以是急性或慢性感染。一些感染者在感染初期没有任何症状，有些患者出现呕吐、皮肤发黄、疲倦、尿色深、腹痛等疾病的快速发作(“Hepatitis B Fact sheet N°204”.who.int.2014年7月，2014年11月4日检索)。这些症状通常持续数周，可能导致死亡。症状开始可能需要30到180天。在那些在出生时被感染的人中，90％发展为慢性乙型肝炎感染，而在5岁以后感染的人中只有不到10％发展为慢性乙型肝炎感染(“Hepatitis B FAQs for the Public-Transmission”,美国疾病控制和预防中心(CDC),2011-11-29检索)。大多数慢性病患者没有症状；然而，最终可能发展为肝硬化和肝癌(Chang,2007,Semin Fetal Neonatal Med,12:160-167)。这些并发症导致15％至25％的慢性病患者死亡(“Hepatitis B Fact sheet N°204”.who.int.2014年7月,2014年11月4检索)。本文中，术语“HBV感染”包括急性和慢性乙型肝炎感染。术语“HBV感染”还包括初始感染的渐近阶段、症状阶段、以及HBV感染的渐近慢性阶段。
本文中，SEQ ID NO：1或2(即PAPD5)的酶活性片段涉及包含SEQ ID NO：1或2(即PAPD5)的一段连续氨基酸残基且保留PAPD5的生物学活性(即功能)的那些多肽，特别是保留聚腺苷酸聚合酶功能。与此一致，本文中，SEQ ID NO：3(即PAPD7)的酶活性片段涉及包含SEQ ID NO：3(即PAPD7)的一段连续氨基酸残基且保留PAPD7的生物学活性(即功能)的多肽，特别是保留聚腺苷酸聚合酶功能。PAPD5和PAPD7的酶活性片段的实例是核苷酸转移酶结构域和Cid1聚腺苷酸聚合酶。
本文中，术语“多肽”包括包含或由通过肽(酰胺)键连接的氨基酸单体组成的所有分子。因此，术语“多肽”包括所有氨基酸序列，如肽、寡肽、多肽和蛋白质。本文描述的“多肽”可以是天然存在的多肽或非天然存在的多肽。与天然存在的对应物相比，非天然存在的多肽可包含至少一个突变(例如氨基酸取代、氨基酸缺失或氨基酸添加)。非天然存在的多肽也可以克隆到载体中和/或有效连接至启动子，该启动子不是所述多肽的天然启动子。所述启动子可以是组成型活性启动子。本文所用的术语“氨基酸”或“残基”包括天然存在的氨基酸以及其他氨基酸(例如，非天然存在的氨基酸、不是由核酸序列编码的氨基酸、合成氨基酸等)的L-和D-异构体。天然存在的氨基酸的实例是丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、缬氨酸(Val；V)。翻译后修饰的天然存在的氨基酸是脱氢酪氨酸(dehydrobutyrine，Dhb)和labionin(Lab)。以上描述了非天然存在的氨基酸的实例。与天然形式存在的多肽的氨基酸序列相比，非天然存在的多肽可包含一个或多个非氨基酸取代或异源氨基酸取代，例如报告分子或其他配体，其与氨基酸序列共价或非共价结合。
术语“核苷酸序列”或“多核苷酸”是本领域公知的，其包括包含或由以下组成的分子：天然存在的分子(如DNA和RNA)以及核酸类似物(例如寡核苷酸硫代磷酸酯、取代的核糖寡核苷酸、LNA分子、PNA分子、GNA(乙二醇核酸)分子、TNA(苏糖核酸)分子、吗啉代多核苷酸或具有修饰骨架(如聚硅氧烷和2’-O-(2-甲氧基)乙基-硫代磷酸酯)的核酸，或具有取代基(如甲基-、硫代-、硫酸酯、苯甲酰基-、苯基-、氨基-、丙基-、氯-和亚甲基carba核苷)的核酸，或促进其检测的报告分子。此外，术语“核苷酸序列”在本发明的上下文中与术语“核酸分子”等同地解释，并且尤其可以指DNA、RNA、PNA或LNA或其杂合体或任何本领域已知的其修饰(修饰的实例参见例如US 5,525,711、US 4,711,955、US 5,792,608或EP 302175)。本文描述和提供的核酸序列包含的核酸残基可以是天然存在的核酸残基或人工产生的核酸残基。核酸残基的实例是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、黄嘌呤(X)和次黄嘌呤(HX)。如本领域技术人员所理解的，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以根据多核苷酸的相应类型互换使用。例如，如技术人员所知，作为DNA一部分的胸腺嘧啶(T)对应于作为相应转录的mRNA的一部分的尿嘧啶(U)。本文描述和提供的多核苷酸可以是单链或双链、线性或环状、天然或合成的。
可以将本文提供的核苷酸序列克隆到载体中。本文所用的术语“载体”包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和常用于基因工程的其他载体。在优选的实施方案中，这些载体适用于转化细胞，如哺乳动物细胞或酵母细胞。文中载体可以是表达载体。通常，表达载体已在文献中广泛描述。它们可包含选择性标记基因和确保在宿主中复制的复制起点、启动子和用于转录的终止信号。在启动子和终止信号之间可以存在至少一个限制性位点或多接头，其能够实现希望表达的核酸序列的插入。可以将本文提供的核苷酸序列克隆入其中的载体的非限制性实例是腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒、基于HIV的慢病毒、非病毒小环载体，或用于细菌和真核表达系统的其他载体。
本文中，术语“化合物”是指任何分子，包括有机分子如小分子、多核苷酸如RNAi分子、多肽如抗体以及无机化合物。术语“化合物”还包括脂质、激素类似物、多肽配体、酶、受体、通道和抗体缀合物。例如，本文化合物可以是针对PAPD5和/或PAPD7的RNAi分子、特异性结合PAPD5和/或PAPD7的抗体或结合PAPD5和/或PAPD7的小分子。
术语“抑制剂”是本领域已知的并且涉及能够完全或部分地预防或降低(a)一种或多种特定蛋白质(例如PAPD5和/或PAPD7)的生理功能(即活性)的化合物/物质。抑制剂也称为“拮抗剂”。在本发明的上下文中，PAPD5和/或PAPD7的抑制剂可分别预防或降低或抑制或灭活PAPD5和/或PAPD7的生理活性，例如，在所述化合物/物质与PAPD5和/或PAPD7分别结合后。抑制剂/拮抗剂与PAPD5和/或PAPD7的结合可降低PAPD5和/或PAPD7的酶功能(即聚腺苷酸聚合酶功能)或可阻止内源活化分子与PAPD5和/或PAPD7的结合，从而抑制这些蛋白质的活性(即功能)。在本发明的上下文中，PAPD5和/或PAPD7的“抑制剂”可以能够通过预防或降低PAPD5和/或PAPD7基因的表达分别预防PAPD5和/或PAPD7的活性/功能。因此，PAPD5和/或PAPD7的抑制剂可导致PAPD5和/或PAPD7的表达水平降低(例如PAPD5和/或PAPD7mRNA或PAPD5和/或PAPD7蛋白的水平降低)，其反映在PAPD5和/或PAPD7降低的功能性(即活性)上，其中所述功能包括聚腺苷酸聚合酶功能。因此，在本发明的上下文中，PAPD5和/或PAPD7的抑制剂还可以包括能够降低PAPD5和/或PAPD7水平的PAPD5和/或PAPD7表达的转录抑制因子。因此，导致PAPD5和/或PAPD7的活性降低(可能是较低表达的结果)的所有手段和方法将用作根据本发明的PAPD5和/或PAPD7的抑制剂。
本文中，术语“RNA干扰(RNAi)分子”是指抑制RNA表达或翻译的任何分子。小分子干扰RNA(siRNA)是双链RNA分子，其通过在转录后结合互补mRNA导致其降解和翻译损失。小发夹RNA(shRNA)是具有发夹结构的人工RNA分子，其在表达后能够通过DICER和RNA诱导沉默复合物(RISC)来减少mRNA。可以在目标基因的RNA序列的基础上设计RNAi分子。然后可以化学合成或通过体外转录合成相应的RNAi，或者从载体或PCR产物表达RNAi。
术语“小分子”是指具有低分子量(<900道尔顿)的有机化合物。小分子可以有助于调节生物过程，并且通常具有大约10-9m的尺寸。许多药物都是小分子。
本文中术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性(即特异性结合PAPD5和/或PAPD7)。还包含人、人源化、骆驼化(camelized)或CDR-移植抗体。“抗体片段”包含完整抗体的一部分。术语“抗体片段”包括抗原结合部分，即保留结合抗原(例如PAPD5和/或PAPD7)的能力的“抗原结合位点”(例如，片段、亚序列、互补决定区(CDR))，其例如包括或可选地由以下组成：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段((Ward；1989；Nature 341；544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。抗体片段或衍生物还包含F(ab')2、Fv或scFv片段或单链抗体。
当提及结合分子时，短语“特异性结合”是指唯一地或主要对靶分子、优选PAPD5和/或PAPD7具有中等或高结合亲和力的结合分子(例如抗体)。短语“特异性结合”是指在蛋白质和其他生物制品异质群体的存在下决定靶标(优选PAPD5和/或PAPD7蛋白质)存在的结合反应。因此，在指定的测定条件下，特定的结合分子优先结合特定的靶点(优选PAPD5和/或PAPD7蛋白)，并且不会以显著的量结合测试样品中存在的其他组分。在这样的条件下与靶蛋白的特异性结合可能需要以对特定靶蛋白的特异性来选择结合分子。可以使用多种测定形式来选择与特定靶蛋白特异性反应的结合分子。例如，固相ELISA免疫测定、免疫沉淀、Biacore和Western印迹可用于鉴定与PAPD5和/或PAPD7蛋白特异性反应的结合分子。PAPD5蛋白最优选为具有SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列的多肽。然而，PAPD5蛋白还可以是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％同一性且是功能性的多肽，其中所述功能是聚腺苷酸聚合酶功能。PAPD7蛋白最优选为具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽。然而，PAPD7蛋白还可以是与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％同一性并具有功能性的多肽，其中所述功能是聚腺苷酸聚合酶功能。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，更通常是背景的10倍以上。或者，换句话说，短语“特异性结合”是指结合反应，其决定蛋白质和其他生物制品的异质群体中靶蛋白(优选PAPD5和/或PAPD7)的存在。通常，特异性结合特定靶标(优选PAPD5和/或PAPD7)的抗体与所述靶标结合，结合常数(Ka)为至少约1x 106M-1或107M-1或优选约108M-1至109M-1或更优选约1010M-1至1011M-1或更高。此外，特异性结合特定靶标(优选PAPD5和/或PAPD7)的抗体，优选以与其与除了预定靶标或密切相关的靶标之外的非特异性靶标(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力相比至少两倍的亲和力，结合该靶标。
在本发明的上下文中，术语“同一性”或“同一性百分比”是指氨基酸或核苷酸序列与本文所示的序列、例如SEQ ID NO:1、2或3具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％且甚至更优选至少99％的同一性，其中更高的同一性值相对较低的值是优选的。根据本发明，在两个或更多个核酸或氨基酸序列的语境中的术语“同一性”或“同一性百分比”是指在比较窗口或指定区域上进行最大对应性的比较和比对时(如使用本领域已知的序列比较算法或通过手动比对和目视检查所测定)，两个或更多个序列相同，或两个或更多个序列具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(例如，与例如SEQID NO:1,2或3的氨基酸序列或与例如SEQ ID NO:4,5或6的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性)。
优选地，所描述的同一性存在于至少约50个氨基酸、优选至少100个氨基酸、更优选至少400个氨基酸、更优选至少500个氨基酸、更优选至少600个氨基酸和最优选所有氨基酸长度的区域上。在核苷酸序列的情况下，所描述的同一性最优选存在于至少100个核苷酸、优选至少1,000个核苷酸、更优选至少2,000个核苷酸、最优选所有核苷酸长度的区域上。
如本领域中已知的，本领域技术人员将知道如何使用例如基于CLUSTALW计算机程序(Thompson,1994,Nucl Acids Res,2:4673-4680)或FASTDB(Brutlag,1990,Comp AppBiosci,6:237-245)的算法确定序列之间的同一性百分比。对于本领域技术人员而言也可使用BLAST和BLAST 2.0算法(Altschul,1997,Nucl Acids Res 25:3389-3402；Altschul,1993,J Mol Evol,36:290-300；Altschul,1990,J Mol Biol 215:403-410)。例如，代表Basic Local Alignment Search Tool BLAST的BLAST 2.0(Altschul,1997,loc.cit.；Altschul,1993,loc.cit.；Altschul,1990,loc.cit.)可用于搜索局部序列比对。如上所述，BLAST产生核苷酸和氨基酸序列的比对以确定序列相似性。由于比对的局部性质，BLAST在确定精确匹配或在鉴定相似序列中特别有用。使用BLAST的类似计算机技术(Altschul,1997,loc.cit.；Altschul,1993,loc.cit.；Altschul,1990,loc.cit.)用于在核苷酸数据库(如GenBank或EMBL)中搜索相同或相关的分子。
本文中，术语“测定”还表示“分析”或“确定”(即检测和/或定量)。例如，术语“测定PAPD5和/或PAPD7的表达和/或活性”意指测定PAPD5和/或PAPD7表达和/或活性的量，例如，确定PAPD5和/或PAPD7多肽(即蛋白质)的量。测定(即确定)PAPD5和/或PAPD7蛋白质的量和/或活性的方法是本领域已知的并且在上文中描述。类似地，术语“测定试验化合物是否结合PAPD5和/或PAPD7”意指分析或确定(即检测)试验化合物是否结合PAPD5和/或PAPD7，例如，是否结合PAPD5多肽(即蛋白质)和/或PAPD7多肽(即蛋白质)。与此一致，术语“测定测试化合物是否抑制HBV的增殖”是指分析或确定(即检测和/或定量)测试化合物或组合物是否抑制HBV的增殖。
如本文所用，术语“C1-6烷基”单独或组合表示包含1至6、特别是1至4个碳原子的饱和的、直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、1-丁基、2-丁基、叔丁基等。具体的“C1-6烷基”是甲基、乙基、异丙基和叔丁基。
术语“C3-7环烷基”单独或在组合中是指含有3至7个碳原子、特别是3至6个碳原子的饱和碳环，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等。具体的“C3-7环烷基”是环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
术语“C2-6链烯基”是指含有2至6个、特别是2至4个碳原子的不饱和直链或支链链烯基，例如乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基等。具体的“C2-6链烯基”基团是烯丙基和乙烯基。
术语“C2-6炔基”是指含有2至6个、特别是2至4个碳原子的不饱和直链或支链炔基，例如乙炔基、1-丙炔基、炔丙基、丁炔基等。具体的“C2-6炔基”是乙炔基和1-丙炔基。
术语“CxH2x”单独或组合表示含有1至6个、特别是1至4个碳原子的饱和的、直链或支链烷基。术语“C1-6烷氧基”单独或组合表示C1-6烷基-O-基团，其中“C1-6烷基”如上文所定义；例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、2-丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己基氧基等。基团的“C1-6烷氧基”是甲氧基、乙氧基和丙氧基。
术语“卤素”意指氟、氯、溴或碘。
术语“卤代C1-6烷基”是指C1-6烷基，其中至C1-6烷基的至少一个氢原子已被相同或不同的卤素原子，特别是氟原子取代。卤代C1-6烷基的实例包括单氟-、二氟-或三氟-甲基、-乙基或-丙基、例如3,3,3-三氟丙基、3,3-二氟丙基、2-氟乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。具体的“卤代C1-6烷基”是二氟甲基或三氟甲基。
术语“卤代C1-6烷氧基”是指C1-6烷氧基，其中至少C1-6烷氧基的至少一个氢原子已被相同或不同的卤素原子，特别是氟原子取代。卤代C1-6烷氧基的实例包括单氟-、二氟-或三氟-甲氧基、-乙氧基或-丙氧基、例如氟丙氧基、二氟丙氧基、三氟丙氧基、氟乙氧基、二氟乙氧基、三氟乙氧基、氟甲氧基、二氟甲氧基或三氟甲氧基。具体的“卤代C1-6烷氧基”是3-氟丙氧基、3,3-二氟丙氧基、3,3,3-三氟丙氧基、2-氟乙氧基、2,2-二氟乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基、氟甲氧基、二氟甲氧基或三氟甲氧基。
术语“C3-7环烷基”单独或在组合中是指含有3至7个碳原子、特别是3至6个碳原子的饱和碳环，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等。具体的“C3-7环烷基”是环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
术语“C1-6烷氧基”单独或组合表示C1-6烷基-O-基团，其中“C1-6烷基”如上文所定义；例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、2-丁氧基、叔丁氧基等。具体的“C1-6烷氧基”是甲氧基和乙氧基，且更具体地是甲氧基。
术语“卤代C3-7环烷基”是指C3-7环烷基，其中C3-7环烷基的至少一个氢原子已被相同或不同的卤素原子，特别是氟原子取代。卤代C3-7环烷基的实例包括单氟-或二氟-环丙基、-环丁基、-环戊基或-环己基、例如氟环丙基、二氟环丙基、氟环丁基、二氟环丁基、氟环戊基、二氟环戊基、氟环己基或二氟环己基。具体的“卤代C1-6烷基”是二氟环丙基。
就式(I)而言，术语“氨基”单独或在组合中是指伯(-NH2)、仲(-NH-)或叔氨基
就式(II)而言，术语“氨基”是指式-NR’R”的基团，其中R’和R”独立地是氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-7环烷基、杂C3-7环烷基、芳基或杂芳基。或者，R’和R”与它们所连接的氮一起可形成杂C3-7环烷基。
术语“羰基”单独或在组合中是指基团-C(O)-。
术语“氰基”单独或在组合中是指基团-CN。
术语“C1-6烷基亚磺酰基”是指基团-SO-C1-6烷基，其中C1-6烷基如上文所定义。C1-6烷基亚磺酰基的实例包括甲基亚磺酰基和乙基亚磺酰基。
术语“C1-6烷基磺酰基”是指基团-SO2-C1-6烷基，其中C1-6烷基如上文所定义。C1-6烷基磺酰基的实例包括甲基磺酰基和乙基磺酰基。
术语“单环杂芳基”是指具有5-8个环原子的单价芳族杂环单环体系，其包含1、2、3或4个选自N、O和S的杂原子，其余的环原子是碳。单环杂芳基部分的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、氮杂基、二氮杂基、异噁唑基、异噻唑基等。
就式(I)而言，术语“单环杂环烷基”是指3至7个环原子的单价饱和或部分不饱和单环环系，其包含1、2或3个选自N、O和S的环杂原子，其余环原子是碳。单环杂环烷基的实例为吖丙啶基、氧杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁基、吡咯烷基、2-氧代-吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢-噻吩基、吡唑烷基、咪唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉-4-基、氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、高哌嗪基或氧杂氮杂环庚烷基。具体的“单环杂环烷基”是吗啉基、2-氧代-吡咯烷基、吡咯烷基、四氢吡喃基，且更具体地是吡咯烷-1-基、2-氧代-吡咯烷-1-基、四氢吡喃-4-基和吗啉-1-基。
就式(II)而言，术语“单环杂环烷基”是4至7个环原子的单价饱和或部分不饱和单环环系，其包含1、2或3个选自N，O和S的环杂原子，其余环原子是碳。单环杂环烷基的实例为吖丙啶基、氧杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁基、吡咯烷基、2-氧代-吡咯烷基、四氢呋喃基、硫杂环丁烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌嗪基、吗啉基、2-氧代-吗啉基、2-氧代-哌嗪基、硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉-4-基、1,1-二氧代噻戊环基、1,1-二氧代硫杂环丁烷基、氧代咪唑烷基、氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、高哌嗪基或氧杂氮杂环庚烷基。具体的“单环杂环烷基”是氮杂环丁烷基、氧杂环丁基、硫杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、1,1-二氧代硫杂环丁烷基、1,1-二氧代噻戊环基、吗啉基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、氧代咪唑烷基、2-氧代-吡咯烷基、2-氧代-吗啉基和2-氧代-哌嗪基。更具体地，“单环杂环烷基”是氮杂环丁烷基、吡咯烷基、吗啉基、氧代吗啉基、哌啶基、哌嗪基和氧代哌嗪基。
术语“芳基”是指包含6至10个碳环原子的单价芳族碳环单环或双环环系。芳基部分的实例包括苯基和萘基，具体的“芳基”是苯基。
术语“杂芳基”是指5至12个环原子的单价芳族杂环单环或双环系统，其包含1、2、3或4个选自N、O和S的杂原子，剩余环原子是碳。杂芳基部分的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、氮杂基、二氮杂基、异噁唑基、苯并呋喃基、异噻唑基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、异苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基或喹喔啉基。具体的“杂芳基”是吡啶基和嘧啶基。
术语“含N单环杂芳基”是指其中至少一个杂原子是N的单环杂芳基。含N单环杂芳基的实例是吡咯基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、氮杂基、二氮杂基、异噁唑基、异噻唑基等。具体的“含N单环杂芳基”是咪唑基、吡唑基和三唑基，且更具体地是咪唑-1-基、吡唑-1-基和1,2,4-三唑1-基。
术语“卤素”表示氟、氯、溴或碘。卤素特别是氟、氯或溴。
术语“羟基”单独或在组合中是指基团-OH。
术语“2-氧代-吡咯烷基”单独或在组合中是指基团
术语“磺酰基”单独或在组合中是指基团-S(O)2-。
术语“C1-6烷基氨基”是指如上文定义的氨基，其中氨基的至少一个氢原子被C1-6烷基替代。
术语“C1-6烷基磺酰基”是指C1-6烷基-S(O)2-基团，其中“C1-6烷基”如上文所定义。
术语“氨基羰基”是指氨基-C(O)-基团，其中“氨基”如上文所定义。
术语“氰基C3-7环烷基”是指如上文定义的C3-7环烷基，其中C3-7环烷基的至少一个氢原子被氰基替代。
术语“吡咯烷基羰基”是指吡咯烷基-C(O)-基团。
术语“对映异构体”表示化合物的两种立体异构体，它们是彼此不可重叠的镜像。
术语“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心并且其分子不是彼此的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，例如、熔点、沸点、波谱性质和反应性。
通过参考非限制性的附图和实施例进一步描述本发明。
实施例
实施例说明了本发明。
材料与方法
化合物化学
合成来自两个化学系列DHQ和THP的每种化合物，以适合通过HYBRIGENICSSERVICES SAS进行Y3H筛选。两种化合物都包括PEG5接头，并用甲氧苄氨嘧啶(TMP)锚定配体进行标记(表1)。
表1：TMP标记的化合物ID
Y3H ULTImate YChemHTM筛选
这两种化合物由Roche提供给HYBRIGENICS SERVICES SAS并测试其渗透性和毒性。然后针对HYBRIGENICS的cDNA人胎盘文库(PLA)筛选化合物。使用不同的化合物浓度、根据针对Hybrigenics ULTImate Y2HTM开发的优化细胞-至-细胞配对方案进行筛选(表2)。
表2：YChemH筛选ID
Y3H ULTImate YChemHTM依赖性测定法
在96孔格式中挑选从筛选中获得的克隆，并且使用斑点测定在依赖性测定法中评估选择条件下(HIS+)生长的阳性克隆。只挑选在存在标记化合物的选择培养基中能够生长的克隆、加工(细胞裂解、PCR、基因测序)并使用Blast分析绘制蛋白比对。
Y3H ULTImate YChemHTM1×1验证实验-猎物片段
在该验证步骤中，在1×1实验中测试每个鉴定的片段猎物和一个化学探针(HBX129653，HBX129654)。从酵母细胞中提取来自筛选文库的3个选择的猎物的质粒，在大肠杆菌中扩增并重新转化到YHGX13酵母细胞中。对于每次相互作用，将表达钓钩和猎物构建体的二倍体酵母培养物的DO1、1/10、1/100和1/1000在不含色氨酸、亮氨酸和组氨酸，并补充有化学探针和FK506的选择培养基上点样。一式两份测试相互作用。每种化学化合物和浓度(DMSO；5、10和20μM的HBX129653；5、10和20μM的HBX129654；5μM的HBX24786甲氧苄胺(Trimethoprim，TMP)和5μM的HBX129634(TMP-PEG5-OH))使用一个板。将板在30℃下孵育3天。
Y3H ULTImate YChemHTM1×1验证实验-全长蛋白质
从N-末端密码子优化的基因片段(以除去高GC含量)和商业上可获得的蛋白质C-末端区的克隆重构全长PAPD5var1(NM_001040284.2)和PAPD7varX1(XM_005248234.2)的编码序列，并将其与Gal4激活结构域(AD)符合读框地克隆到质粒pP7(AD-Prey)中，该质粒衍生自原始pGADGH(Bartel等人,1993，在Cellular interactions in development:Apractical approach.Hartley,D.A.编辑,牛津大学出版社,牛津,第153-179页)。通过对整个插入物进行测序来检查构建体。对于每个猎物，进行用猎物质粒转化的YHGX13(Y187ade2-101::loxP-kanMX-loxP,matα)和用DHFR钓钩(二氢叶酸还原酶)转化的YPT6AT酵母细胞(mata)之间的小配对，以产生二倍体酵母培养物。对于每次相互作用，将表达钓钩和猎物构建体的二倍体酵母培养物的DO1、1/10、1/100和1/1000点样在不含色氨酸、亮氨酸和组氨酸，并补充有化学探针和FK506的选择培养基上。一式两份测试相互作用。每种化学化合物和浓度(DMSO；5、10和20μM的HBX129653；5、10和20μM的HBX129654；5μM的HBX24786甲氧苄胺(TMP)和5μM的HBX129634(TMP-PEG5-OH))使用一个板。将板在30℃下孵育3天。
Y3H ULTImate YChemHTM-与游离化合物竞争
竞争测定法基于之前描述的1×1验证，其中化学探针(HBX129653，HBX 129654)的浓度恒定，化学探针的母体化合物(MOL653，MOL654)或其无活性对映体(INACT653，INACT654)的浓度递增(表3)。竞争测定法在选择培养基上，在游离化合物的8个浓度(0、0.25、0.5、1、2、5、10和20μM)下进行，并且标记的Y3H-化合物具有恒定的浓度(1μM)。
表3：YChemH竞争ID
HepaRG细胞培养
在37℃在具有5％CO2的潮湿气氛中在完全HepaRG生长培养基中培养HepaRG细胞(Biopredics International,Rennes,法国,目录号HPR101)2周，所述完全HepaRG生长培养基由William’s E培养基(GIBCO)、生长培养基补充物(Biopredics,目录号ADD710)和1％(v/v)GlutaMAX-I(Gibco#32551)和1x Pen/Strep(Gibco,#15140)组成。为了启动分化，将0.9％(v/v)DMSO(Sigma-Aldrich，D2650)加入到铺满(培养)细胞的生长培养基中。一周后，将培养基用完全分化培养基(补充有1.8％(v/v)DMSO的HepaRG生长培养基)代替，其中细胞维持约4周，每7天更新分化培养基。分化的HepaRG细胞(dHepaRG)呈现由单层胆管样细胞围绕的肝细胞样细胞岛。在HBV感染和化合物处理之前，将dHepaRG细胞以每孔60,000个细胞接种到胶原蛋白I包被的96孔板(Gibco，Cat#A11428-03)中的100μL完全分化培养基中。在HBV感染之前，允许细胞在铺板后在96孔板中恢复其分化型约1周。
dHepaRG的HBV感染
用HBV颗粒以MOI 30感染dHepaRG细胞。由产生HBV的HepG2.2.15细胞产生HBV颗粒(Sells等人1987Proc Natl Acad Sci U S A 84,1005–1009)。先前已经描述了dHepaRG培养条件、分化和HBV感染(Hantz,2009,J.Gen.Virol.,2009,90:127-135)。简言之，加入含有4％PEG-8000和病毒原液(20至30GE/细胞)的完全分化培养基(120μL/孔)。感染后一天，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，并在实验期间每两天更换培养基(完全分化培养基)。
siRNA治疗HBV感染的HepaRG
从GE Dharmacon(ON TARGETplus)获得四种不同siRNA池(表4)。
表4：siRNA概述
用针对PAPD5、PAPD7、PAPD5和PAPD7两者的siRNA池或作为对照的非靶向siRNA处理用HBV感染前一天的细胞和感染后4天的细胞。根据制造商的方案，使用DharmaFect 4(GEDharmacon；目录号T-2004-01)和OPTI-MEM(Thermo Scientific；目录号51985034)转染siRNA。将细胞处理11天。
HBV抗原测定
为了评估对HBV抗原表达和分泌的影响，在第11天收集上清液。根据制造商的方案，使用CLIA ELISA试剂盒(Autobio Diagnostic#CL0310-2,#CL0312-2)测定HBV HBsAg和HBeAg水平。简言之，将每孔25μL上清液转移到相应的抗体包被的微量滴定板中，并加入25μL酶缀合试剂。将板在室温下在摇床上孵育60分钟，然后使用自动洗涤器用洗涤缓冲液洗涤孔5次。向每个孔中加入25μL底物A和B。将板在摇床上在室温下孵育10分钟，然后使用Envision发光读数器(Perkin Elmer)测定发光。
细胞活力
从HBV感染的dHepaRG细胞中除去上清液介质后，将细胞与CellTiterGlo OneSolution(Promega)一起孵育以测定细胞活力。
细胞内mRNA的实时PCR
对于细胞内mRNA分离，用PBS(Gibco)洗涤dHepaRG一次，并使用MagNA Pure“96细胞RNA大体积试剂盒”(Roche#05467535001)裂解。可以在-80℃下储存裂解物。对于实时qPCR反应，使用AB7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)，基因表达主混合物(ThermoFisher Scientific)。就检测HBV mRNA的HBV核心特异性引物(整合的DNA技术)(表5)而言以及为了测定在siRNA存在时PAPD5和PAPD7降低，使用基因特异性表达分析探针(ThermoFisher Scientific；PAPD5目录号4331182；PAPD7目录号4331182)。使用针对b-肌动蛋白的表达分析探针(ThermoFisher Scientific；PAPD5目录号4331182)对样品进行归一化。
表5：HBV核心特异性TaqMan探针
实施例1：DHQ和THP结合PAPD5和PAPD7
在Y3H Ultimate YChemH筛选中PAPD5/7被鉴定为DHQ和THP的共同的相互作用配 偶体
如材料和方法部分中所述，对于两种化合物(DHQ和THP)，通过Y3H筛选中的大量片段鉴定了两种蛋白质PAPD5(变体1：NP_001035374；变体2：NP_001035375)和PAPD7(XP_005248291)。通过HYBRIGENICS将鉴定的蛋白质根据A的置信度得分(标度A-D)排序(表6)。
表6：PAPD5/7的YChemH筛选结果
可以使用鉴定的猎物片段的Y3H ULTImate YChemH 1×1验证和进一步的全长蛋 白质来确认PAPD5/7与DHQ和THP的相互作用
在第一验证步骤中，选择在第一筛选中鉴定的三个片段用于1×1验证测定法(如材料和方法部分中所述)并在三种不同浓度(5、10和20μM)下测试(表7)。
表7：选择用于验证测定法的相互作用片段
相互作用# 猎物片段ID 猎物蛋白质
A PLA_RP6_hgx4240v1_pB409_A-15 PAPD7
B PLA_RP6_hgx4241v1_pB409_A-112 PAPD5变体1
C PLA_RP6_hgx4240v1_pB409_A-24 PAPD5变体2
在最低测试浓度下所有三个片段都被验证可作为DHQ和THP的特异性结合物(图1)。
在第二验证步骤中，合成PAPD5和PAPD7的全长蛋白质，并用于DHQ和THP的1×1验证(如材料和方法部分中所述)(表8)。
表8：在1×1验证测定法中使用的全长猎物蛋白质的参考ID
相互作用# HYBRIGENICS参考 猎物蛋白质
A hgx4386v1_pP7 PAPD5变体1全长
B hgx4388v2_pP7 PAPD7变体1全长
在最低测试浓度下证实了这些全长蛋白质与DHQ和THP化合物之间的相互作用，并显示对化学探针的特异性(图2)。
在Y3H中PAPD5/7与DHQ和THP的相互作用可以被这两种游离活性化合物竞争，但不 被无活性对映体竞争
在验证DHQ和THP与蛋白质片段和全长PAPD5和PAPD7结合后，使用无活性或活性游离化合物在Y3H ULTImate YChenH竞争实验(如材料和方法部分中所述)中确认结合(表9)。在母体活性化合物存在下，而不是在无活性对映体存在下，酵母生长损失减少，这意味着母体化合物与化学探针竞争并与蛋白质靶标相互作用。
针对所有测试的化合物，根据制造商的方案，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法(Promega)测试在最高浓度(20μM)下，非选择培养基上的毒性。对于任何化合物，在该浓度下未观察到毒性，因为酵母生长未受影响(数据未显示)。对于二者的活性游离母体化合物(DHQ和THP分别为MOL653和MOL654)可以观察到竞争，其中竞争结合全长蛋白质所需的浓度低于片段相互作用所需的浓度(图3+4)。成功的交叉竞争表明DHQ和THP对PAPD5/7具有共同的结合位点，或者至少在彼此靠近处结合。
表9：竞争测定法中使用的猎物蛋白质的参考ID
实施例2：用siRNA抑制PAPD5和/或PAPD7导致有效治疗HBV感染
为了将DHQ和THP与PAPD5/7的结合以及这两种蛋白质对HBV基因表达的影响关联起来，我们使用RNAi技术降低天然HBV感染的dHepaRG中的这些蛋白质并监测这种降低对病毒参数的影响。为此，如在材料和方法部分中所述，我们在HBV感染的dHepaRG细胞中使用针对PAPD5和PAPD7的siRNA池(参见表4)。
PAPD5的降低导致病毒表达(通过测定分泌的HBsAg和HBeAg以及细胞内HBV mRNA)的抑制(使用如材料和方法部分中所述的CLIA ELISA和实时PCR测定)。虽然PAPD5mRNA的降低显著降低了HBV基因表达，但PAPD7的抑制对HBV表达具有适度的作用(图7)。然而，当组合针对PAPD7和PAPD5的siRNA时，观察到增强的协同抗HBV活性(图7)，表明不存在PAPD5时PAPD7具有补偿作用。
实施例3：DHQ和THP有效降低HBsAg和HBeAg
使用HBsAg和HBeAg作为读数，在HepG2.2.15细胞中测定DHQ和THP及其变体针对HBV感染的功效。
将HepG2.2.15细胞(Sells等人1987Proc Natl Acad Sci U S A 84,1005–1009)在96孔板(15.000细胞/孔，100uL)中在DMEM+GluTaMax-1(GiBCO目录号10569)、1％PenStrep(Gibco Cat.15140)、10％FBS(Clontech Cat.No.631106)、遗传霉素0.25ug/ml(Invitrogen 10131035)中培养。使用DMSO中的三倍系列稀释液测试化合物，最高浓度为100μM，系列稀释9次。每个化合物一式四份(in quadricate)测试。将细胞培养3天，收集上清液，如材料和方法部分所述测定HBsAg和HBeAg。
测试化合物在降低HBsAg和HBeAg分泌中的IC50值如下所示：
HBX129653(DHQ–TMP):IC50HBsAg 1.181uM
HBX129654(THP–TMP):IC50HBsAg 0.299uM
MOL653(DHQ–游离-活性):IC50HBsAg 0.003uM；IC50HBeAg0.007uM
MOL654(THP–游离-活性):IC50HBsAg 0.003uM
INACT653(DHQ–游离-无活性):IC50HBsAg 3.15uM
INACT654(THP–游离-无活性):IC50HBsAg>25uM

Claims (16)

1.鉴定预防、改善和/或抑制乙型肝炎病毒(HBV)感染的化合物的方法，其包括：
a.使试验化合物与以下接触
i.PAP相关结构域5(PAPD5)多肽和/或PAP相关结构域7(PAPD7)多肽；或
ii.表达PAPD5和/或PAPD7的细胞；
b.在存在和不存在所述试验化合物的情况下测定PAPD5和/或PAPD7的表达和/或活性；和
c.鉴定降低PAPD5和/或PAPD7的表达和/或活性的化合物，作为预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物。
2.鉴定预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物的方法，其包括:
a.使试验化合物与以下接触
i.PAPD5和/或PAPD7多肽；或
ii.表达PAPD5和/或PAPD7的细胞；
b.测定试验化合物是否与PAPD5和/或PAPD7多肽结合；
c.测定试验化合物是否抑制HBV的增殖；和
d.鉴定结合PAPD5和/或PAPD7多肽和抑制HBV的增殖的化合物，作为预防、改善和/或抑制HBV感染的化合物。
3.权利要求1或2的的方法，其中PAPD5多肽是包含或由以下组成的多肽：
a.SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列；
b.与(a)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中多肽具有聚腺苷酸聚合酶功能；
c.SEQ ID NO:1或2的酶活性片段的氨基酸序列；或
d.与(c)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中多肽具有聚腺苷酸聚合酶功能。
4.权利要求1或2的方法，其中PAPD7多肽包含或由以下组成：
a.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
b.与(a)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中多肽具有聚腺苷酸聚合酶功能；
c.SEQ ID NO:3的酶活性片段的氨基酸序列；或
d.与(c)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中多肽具有聚腺苷酸聚合酶功能。
5.权利要求2至4中任一项的方法，其中抑制HBV的增殖的化合物抑制HBV表面抗原(HBsAg)的分泌、和/或抑制HBV包膜抗原(HBeAg)的分泌、和/或抑制细胞内HBV mRNA或HBVDNA的产生。
6.权利要求1和3至5中任一项的方法，其中PAPD5和PAPD7的活性是聚腺苷酸聚合酶功能。
7.PAPD5和/或PAPD7的抑制剂，其用于治疗和/或预防HBV感染，其中所述抑制剂是
a.与PAPD5和/或PAPD7结合的小分子；或
b.特异性结合PAPD5和/或PAPD7的抗体。
8.根据权利要求7使用的抑制剂，其
a.结合PAPD5和/或PAPD7多肽；和/或
b.抑制PAPD5和/或PAPD7的表达和/或活性。
9.根据权利要求7或8使用的抑制剂，其中抑制剂降低HBsAg和HBeAg的分泌。
10.根据权利要求7至9中任一项所述使用的抑制剂，其中抑制剂抑制慢性HBV感染的出现或发展和/或降低HBV感染者的感染性。
11.根据权利要求7至10中任一项使用的抑制剂，其中抑制剂是式(I)的化合物:
其中
R1是氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基氨基或C1-6烷氧基；
R2是氢；卤素；C1-6烷基，其未被取代或被氟取代一次、两次或三次；C1-6烷氧基，其未被取代或被氟取代一次、两次或三次；氰基；C3-7环烷基；羟基或苯基-CxH2x-O-；
R3是氢；卤素；C1-6烷基，其未被取代或被氟取代一次、两次或三次；氰基；吡咯烷基；氨基；苯基-CxH2x-N(C1-6烷基)-；C1-6烷氧基羰基-哌嗪基；或R7-O-，其中R7是氢；C1-6烷基，其未被取代或被1至3个独立地选自以下的取代基取代：氟、羟基和C2-6链烯基；C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷氧基C1-6烷氧基C1-6烷基；氨基C1-8烷基；C1-6烷基羰基氨基C1-8烷基；C1-6烷基磺酰基氨基C1-8烷基；C1-6烷基硫烷基C1-6烷基；C1-6烷基磺酰基C1-6烷基；氰基C1-6烷基；C3-7环烷基C1-6烷基；氰基C3-7环烷基C1-6烷基；苯基C1-6烷基；吡咯烷基-羰基C1-6烷基；C2-6炔基；羟基C1-6烷基C2-6炔基；氨基C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷基氨基C1-6烷氧基C1-6烷基；二C1-6烷基氨基C1-6烷氧基C1-6烷基；羧基C1-6烷基；或C1-6烷氧基羰基氨基C1-8烷基；杂芳基C1-6烷基，其中杂芳基是含N单环杂芳基；或杂环烷基C1-6烷基，其中杂环烷基是单环杂环烷基；
R4是氢、卤素、C1-6烷基、氰基或C1-6烷氧基；
条件是R1、R2、R3和R4不同时是氢；
R5是氢或C1-6烷基；
R6是氢；C1-6烷基，其未被取代或被氟取代一次、两次或三次；C3-7环烷基，其未被取代或被氟或C1-6烷基取代一次、两次或三次；或苯基-CxH2x-；x是1-6；
12.根据权利要求7至10中任一项使用的抑制剂，其中抑制剂是式(II)的化合物:
其中
R1是C1-6烷基、C3-7环烷基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、硝基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基C1-6烷基、羧基C1-6烷基、二(C1-6烷氧基羰基)亚甲基、氰基C1-6烷基、C3-7环烷基C1-6烷基、苯基C1-6烷基、C1-6烷基硫烷基C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基氨基C1-6烷基、氨基羰基C1-6烷基、二C1-6烷基氨基羰基C1-6烷基、单环杂环烷基C1-6烷基或咪唑基C1-6烷基；
R2是芳基或杂芳基，所述芳基或杂芳基未被取代或被1、2、3或4个独立地选自以下的取代基取代：C1-6烷基、C3-7环烷基、卤素、卤代C1-6烷基、氰基、硝基、羟基、卤代C1-6烷氧基、-O-CxH2x-R3、-O-C yH2y-NHR6、-NR9R10、-SO2-R11、-SO2-NR12R13、羧基、C1-6烷氧基羰基、-C(＝O)-NR12R13、芳基、杂芳基、单环杂环烷基和-O-单环杂环烷基；其中
单环杂环烷基未被取代或被C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基或C1-6烷氧基羰基取代；
R3是氢；C3-7环烷基；卤代C3-7环烷基；羟基；羟基C1-6烷基C3-7环烷基；C1-6烷氧基；单环杂环烷基；单环杂环烷基，其被C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基、C3-7环烷基或C1-6烷氧基羰基取代；-C(＝O)-R4；C1-6烷基亚磺酰基；-SO2-R5；-C(NHR7)-C(＝O)-R8；羧基C1-6烷氧基或氨基羰基C1-6烷氧基；其中
R4是羟基、C1-6烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、二C1-6烷基氨基、四氢呋喃基氨基、吡咯烷基或吗啉基；
R5是C1-6烷基、C3-7环烷基、羟基、氨基、C1-6烷基氨基或二C1-6烷基氨基；
R7是氢或C1-6烷氧基羰基；
R8是羟基或C1-6烷氧基；
R6是氢、C1-6烷基羰基、卤代C1-6烷基羰基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷基磺酰基、C3-7环烷基磺酰基或C1-6烷氧基C1-6烷基磺酰基；
R9和R10独立地选自氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基、C3-7环烷基羰基和C3-7环烷基磺酰基；或
R9和R10与它们所连接的氮一起形成单环杂环烷基；
R11是C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-7环烷基、卤代C3-7环烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、卤代C1-6烷氧基C1-6烷基、C3-7环烷基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷基氨基C1-6烷基、二C1-6烷基氨基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基氨基C1-6烷基、C1-6烷基亚磺酰基C1-6烷基、C1-6烷基硫烷基C1-6烷基或C1-6烷基磺酰基C1-6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-7环烷基和卤代C3-7环烷基；或
R12和R13与它们所连接的氮一起形成单环杂环烷基；
x是1、2、3、4、5、6、7或8；
y是1、2、3、4、5、6、7或8；
U、W和Z独立地选自CH和N；
X和Y之一是N，另一个是CH或N。
13.根据权利要求7至10中任一项使用的抑制剂，其中抑制剂是特异性结合SEQ ID NO:7、8或9中任一个的氨基酸段的抗体。
14.组合制剂，其包含PAPD5抑制剂和PAPD7抑制剂，用于同时或依次用于治疗和/或预防HBV感染。
15.用于治疗和/或预防HBV感染的药物组合物，其中所述药物组合物包含
a.根据权利要求7至13中任一项使用的抑制剂；或权利要求14的组合制剂；和
b.可药用载体。
16.用于监测治疗HBV感染期间治疗成功的方法，其中该方法包括:
a.分析从测试受试者获得的样品中PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性；
b.将所述量和/或活性与相应于至少一个参考受试者PAPD5和/或PAPD7的量和/或活性的参考数据进行比较；和
c.基于比较步骤(b)预测治疗成功。
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