CN108883147A

CN108883147A - 用于治疗异常Wnt信号传送的稳定化BCL9肽

Info

Publication number: CN108883147A
Application number: CN201680069831.1A
Authority: CN
Inventors: 朱棣
Original assignee: Winters Rex Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Beijing Jiacheng Biomedical Technology Development Co ltd; Hangzhou Weiyintai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-10-05
Filing date: 2016-10-05
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2036-10-05
Also published as: US10961290B2; US11498947B2; CA3000866A1; EP3359180A1; US20190023754A1; CN117304295A; CN108883147B; WO2017062518A1; JP2018537120A; JP7101118B2; AU2016336349A1; US20230265138A1; US20210292385A1; EP3359180B1

Abstract

涵盖了用稳定化BCL9肽治疗癌症的方法，其中所述稳定化肽包含BCL9蛋白的HD2结构域的一部分，其包含使用α,α‑二取代氨基酸生成的烃交联剂。

Description

用于治疗异常Wnt信号传送的稳定化BCL9肽

技术领域

本国际申请要求2015年10月5日提交的美国临时申请第62/237,489号的优先权，其全部内容通过引用合并于此。

本文公开了来源于人B细胞CLL/淋巴瘤9(BCL9)蛋白质及其变体的HD2结构域的多肽，以及它们在诊断、预防和/或治疗疾病或病症中的用途。还公开了生成这种多肽及其变体的方法。

背景技术

β-连环蛋白是一种多功能蛋白质，对胚胎发育、上皮细胞生长和器官再生等细胞稳态和过程至关重要。然而，异常β-连环蛋白信号传送可以导致转录激活的变化，这可以允许肿瘤生长和发育。β-连环蛋白通常被磷酸化并被靶向以被轴抑制蛋白复合物降解，但是如果存在Wnt信号通路的刺激，则未磷酸化的β-连环蛋白可以积聚。在Wnt信号通路被激活的条件下，β-连环蛋白结合至淋巴增强因子/T细胞因子(LEF/TCF)并被转移到细胞核中以刺激Wnt靶基因的转录(参见Clevers和Nusse，《细胞(Cell)》149：1192-1205(2012))，例如在肿瘤发生中起作用的c-myc和CD44。

Wnt/β-连环蛋白通路的异常激活已经显示在多种人类癌症中(参见Thakur和Mishra，《细胞与分子医学杂志(J Cell Mol Med)》17(4)：449-456(2013))。过度活化的β-连环蛋白信号传送可导致肿瘤内不受控制的细胞增殖，并影响癌细胞的存活。此外，β-连环蛋白可通过增加癌细胞的迁移和侵袭能力来支持肿瘤转移。高达90％的散发性结肠直肠癌病例与Wnt信号传送的组成型激活相关联。

BCL9是已知的在哺乳动物细胞中有效的β-连环蛋白介导的转录所需的蛋白质(参见Roche等人，《BMC癌症(BMC Cancer)》8：199(2008))。BCL9通过其HD2结构域与β-连环蛋白结合，并且HD2结构域中的突变破坏了BCL9与β-连环蛋白的结合。

选择性靶向β-连环蛋白而不影响其他Wnt信号通路的药剂是治疗癌症患者的有吸引力的靶标。已应用了许多抑制β-连环蛋白活性的药剂的开发方法(参见Thakur和Mishra2013)。靶向抑制β-连环蛋白的许多小分子化合物在动物模型中显示出很好的疗效，但需要更多个体化化的和选择性的方法来抑制β-连环蛋白活化。

一种选择性调节β-连环蛋白活性的方法是使用包含已知与β-连环蛋白相互作用并调节其功能的蛋白质部分的稳定化肽。作为潜在的治疗剂，稳定化肽与野生型肽相比具有许多优点，包括增加的螺旋含量、蛋白水解稳定性和增加的对靶受体的结合亲和力(参见Kim等人，《自然·实验手册(Nat Protocols)》6(6)：761-771(2011)))。一种已对其稳定化肽进行了研究的β-连环蛋白相互作用体是BCL9，其通过其HD2结构域与β-连环蛋白结合。然而，由于合成费用和低收率，试图使用烃连接基团(即，“烃钉”)来生成包含BCL9的HD2结构域的部分的稳定化肽已受到阻碍(参见Kawamoto，药物化学博士论文，密歇根大学(2010))。其他研究人员已开发了稳定化BCL9肽，其中BCL9蛋白的HD2结构域的α-螺旋经由通过闭环复分解(RCM)生成的烃交联剂稳定化(参见US20140113857)。

尽管这些稳定化肽在本领域已经取得了一些成功，但仍然需要更能够调节免疫响应并因此在治疗肿瘤中具有改善的体内疗效的稳定化肽。

发明内容

本文公开了来源于人B细胞CLL/淋巴瘤9(BCL9)蛋白的HD2结构域的多肽。在一些实施例中，所述多肽具有7-14个氨基酸长度。在各个实施例中，多肽通过一种或多种烃交联剂稳定化，产生可互换地称为“稳定化多肽”或“钉合多肽”的构建体。在各个实施例中，来源于HD2结构域的多肽能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂，并被称为“未钉合多肽”。

在一些实施例中，能够经历反应以形成一种或多种烃的多肽包含选自表1的任何序列或其变体。在一些实施例中，表1中列出的Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和/或Xaa₄各自是α,α-二取代氨基酸。在一些实施例中，烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在一些实施例中，烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在一些实施例中，烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间，烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。

在一些实施例中，多肽包含一种或多种烃，其包含选自表1的任何序列或其变体。在一些实施例中，Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和/或Xaa₄各自是丙氨酸或α,α-二取代丙氨酸，第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间，和/或第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。

在一些实施例中，多肽能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂并且包含LQTLRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)或其变体或由其组成。在一些实施例中，Xaa₁和Xaa₂各自是α,α-二取代氨基酸。

在一些实施例中，多肽能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂并且包含Xaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:X)或其变体或由其组成。在一些实施例中，Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是α,α-二取代氨基酸。在一些实施例中，Xaa₁和Xaa₂各自是α,α-二取代氨基酸，且烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在一些实施例中，Xaa₃和Xaa₄各自是α,α-二取代氨基酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。

在一些实施例中，多肽包含烃交联剂并且包含LQTLRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)或其变体或由其组成。在一些实施例中，Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。

在一些其他实施例中，多肽包含烃交联剂并且包含Xaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:X)或其变体或由其组成。在某些实施例中，Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸，并且第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间，第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。

在一些实施例中，α,α-二取代氨基酸是α-甲基,α-烯基氨基酸。在一些实施例中，α-甲基,α-烯基氨基酸选自(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸、(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸、(S)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸和(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，烃连接基团选自-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-和-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-。在一些实施例中，烃交联剂在至少一个末端或两个末端上具有S构型。在一些实施例中，烃交联剂在至少一个末端或两个末端上具有R-构型。在一些实施例中，烃交联剂在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型。

在其他实施例中，多肽或变体的N末端和/或C末端被进一步修饰。在一些实施例中，N末端用乙酰基修饰。在一些实施例中，C末端用一个、两个或多个β-丙氨酸单元、2-萘基丙氨酸和/或任选地连接至一个、两个或多个β-丙氨酸单元的2-萘基丙氨酸修饰，并且其中C末端修饰的羧基任选地用NH₂基团进一步修饰。在一些实施例中，N末端和/或C末端修饰进一步包含芴基甲氧基羰基(Fmoc)。

在一些实施例中，与未钉合野生型人BLC9HD2结构域或野生型人BLC9HD2结构域的片段相比，本文所述的钉合多肽或变体具有一种或多种改善的生物学功能。当将钉合多肽或变体给予受试者和/或与靶细胞接触时，所述多肽或变体可能能够表现出一种或多种选自以下的改善的生物学功能：抑制BCL9与β-连环蛋白的结合，抑制经典Wnt/β连环蛋白信号传送，减少调节性T细胞存活，降低VEGF在肿瘤中的表达，增加CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞向肿瘤中的浸润，增加辅助性T细胞17(Th17)向肿瘤中的浸润，减少肿瘤中半衰期(T_1/2)大于至少2小时的树突状细胞，诱导有利于免疫反应的肿瘤微环境，以及抑制肿瘤生长、癌症干细胞增殖和/或肿瘤转移。

本文还公开了药物组合物，其包含来源于人BLC9蛋白的HD2结构域的钉合多肽或变体和药学上可接受的载体。在一些实施例中，药物组合物包含至少一种其他药剂，例如检查点抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、VEGFR抑制剂或抗癌药物。

本文还公开了制备和使用所要求保护的钉合多肽或变体(例如，在抑制、减少、预防和/或治疗受试者中的癌症中)的方法。在一些实施例中，使用所要求保护的多肽或变体的方法包括抑制受试者中BCL9与β-连环蛋白的结合，以及抑制受试者中的经典Wnt/β-连环蛋白信号传送。

本文还公开了用于监测治疗功效和/或选择需要用所要求保护的钉合多肽或变体治疗的受试者的生物标志物。在一些实施例中，被给予所要求保护的多肽或变体的受试者也用其他治疗剂、放射疗法和/或化学疗法治疗。还公开了一种用于制备和使用所要求保护的钉合多肽或变体的试剂盒。

附图说明

图1A和图1B示出了来源于BCL9蛋白的HD2结构域的稳定化肽的结构，分别对应于SEQ ID NO:X和SEQ ID NO:X。SEQ ID NO:X的稳定化多肽在本申请中被称为“WX-024”。SEQID NO:X的稳定化多肽本申请中称为“WX-035”。这些肽具有在α-甲基,α-烯基氨基酸之间生成的烯基连接基团以稳定BCL9蛋白的HD2结构域的α-螺旋。

图2A描绘了系统地穿过人BCL9蛋白的HD2结构域的结构域定位策略。图2B示出了使用递增量的基于图2A中描绘的结构域定位策略生成的每个结构域片段的细胞活力测定的结果。ICG001是一种已知的经典Wnt/β-连环蛋白信号传送的小分子抑制剂，被用作阳性对照。使用CellTiterGlo测定(Promega)和Colo320DM细胞进行细胞活力测定。图2C示出了使用递增量的图2A中生成的每个结构域片段的Wnt转录测定的结果。ICG001被用作阳性对照。使用GeneBlazer Wnt报告基因测定(Invitrogen)和HCT116细胞进行Wnt转录测定。

图3描绘了比较WX-020(SEQ ID NO:X)和SAH-BCL9#1(SEQ ID NO:X)的细胞活力测定的结果。使用CellTiterGlo测定(Promega)和Colo320DM细胞进行细胞活力测定。

图4A描绘了比较WX-020和来源于WX-020(包括WX-024)的四种不同稳定化多肽的细胞活力测定的结果。使用CellTiterGlo测定(Promega)和HCT116细胞进行细胞活力测定。ICG001被用作阳性对照。图4B描绘了在基于细胞的Wnt转录抑制测定中测试的WX-024的乙酸盐形式的结果(IC₅₀＝292nM)。图4C示出了同样在相同的Wnt转录抑制测定中测试的盐酸盐的作用(IC₅₀＝313nM)。

图5A、5B、5C和5D示出了测试WX-021、WX-024和ICG001的GeneBlazer Wnt报告基因测定(Invitrogen)的结果。图5A提供了报告基因测定的示意图，其中BCL9与β-连环蛋白的结合驱动β-内酰胺酶(BLA)报告基因在CellSensor^TM LEF/TCF-bla HCT-116细胞(Invitrogen)中的表达(缩写：β-cat，β-连环蛋白；TF，转录因子)。对应于HD2结构域中的氨基酸的肽，例如WX-024，可以抑制BCL9与β-连环蛋白的结合。图5B、5C和5D分别描绘了使用WX-021、WX-024和ICG001的报告基因测定的结果。由该测定结果计算的WX-021、WX-024和ICG001的IC₅₀值分别为764nM、191nM和1060nM。

图6A和图6B示出了测量与β-连环蛋白结合的WX-024(与生物素缀合)的均相时间分辨荧光(HTRF)测定(Cisbio)的结果。图6A提供HTRF测定的示意图，示出所述测定通过评估荧光共振能量转移(FRET)测量生物素化的BCL9肽(例如，生物素化的WX-024)与β-连环蛋白的结合(缩写：ab，抗体；SA，链霉抗生物素蛋白)。图6B示出了基于HTRF确定(K_D＝4.21nM)的WX-024与β-连环蛋白结合的K_D测定。

图7示出了在HCT116细胞中使用CellTiterGlo测定(Promega)比较WX-024与ICG001(Wnt/β-连环蛋白通路抑制剂)的细胞活力数据。基于该测定计算的WX-024和ICG001的IC₅₀值分别为1.92μM和2.17μM。

图8A示出了测试WX-024、ICG001和LGK-974(*P<0.05，WX-024对ICG001，LGK-974)的细胞活力测定的结果。Colo320DM细胞用于该细胞活力测定中。图8B示出了测试WX-024和厄洛替尼的相同的细胞活力测定的结果。图8C示出了比较单独的5-FU治疗和5-FU和WX-024的组合(*P<0.05)的相同的细胞活力测定的结果。

图9A和图9B示出了WX-024以1mg/kg或5mg/kg静脉(i.v.)给药和以5mg/kg腹腔(i.p.)给药至雄性ICR小鼠(远亲杂交品系)的药代动力学(PK)数据。如图9A所示，在给药后15分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时收集血液样品并通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析。根据图9A所示的血浆浓度数据，计算最大观察浓度(C_max)、终末半衰期(T_1/2)、总体清除率(CL)、分布体积(V_z)、从给药时间至最后可测量浓度的曲线下面积(AUC_0-t)、从给药时间外推至无穷大的曲线下面积(AUC_0-inf)和生物利用度。这些药代动力学参数总结在图9B中。

图10A示出了雌性Balb/c小鼠中测量的WX-024的PK数据。每个数据点表示N＝2。小鼠以5mg/kg、10mg/kg或15mg/kg静脉给药，以5mg/kg肌肉内给药，以10mg/kg腹腔给药或以10mg/kg皮下给药。在给药后15分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时(对于肌肉内、皮下和腹腔途径，在给药后36小时和48小时)收集血液样品，并通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析。图10B和图10C总结了由该实验计算的平均药代动力学参数。

图11示出了接种Colo320DM肿瘤细胞并用媒剂或WX-024治疗的6-8周龄的雌性Balb/c裸小鼠的体重数据。给小鼠接种Colo320DM肿瘤细胞(5x 10⁶)，使肿瘤发育14天，之后实施治疗。在整个研究期间，媒剂和5mg/kg治疗组通过静脉注射给药，体重在研究中没有明显变化。在WX-024以15mg/kg静脉给药3天之后，该组中的小鼠表现出体重减轻。因此，在第7天，将10mg/kg组和15mg/kg组在治疗期的剩余时间内转换为腹腔给药。在切换到腹腔给药之后，15mg/kg组的体重在研究的剩余时间内稳定。

图12A和图12B描绘了在对图11所述的实验期间由媒剂或WX-024引起的肿瘤生长变化。如图12A所示，在治疗期的第0、3、5、7、9、11和14天使用卡尺测量肿瘤体积(以mm³表示)(*P<0.05，与Kruskal-Wallis分析的媒剂组相比)。图12B示出了研究结束时每个治疗组的平均肿瘤质量(第22天；*P<0.05，与媒剂组相比)。

图13A示出了如图11所述的在治疗22天后Colo320DM异种移植物模型结束时的BALB/c裸小鼠的肠组织学。描绘了媒剂、10mg/kg和15mg/kg WX-024治疗组的样品。图13B示出了在图13A中收集的肠样品的轴抑制蛋白2染色。

图14A示出了从图11所述实验收集的肿瘤样品的CD44染色的40倍放大倍数。每个样品的免疫化学评分显示在每个图像的右上角。图14B总结了每个治疗组的平均免疫化学评分。

图15A示出了从图11所述实验收集的肿瘤样品的VEGFA染色。每个样品的免疫化学评分显示在每个图像的右上角。图15B总结了每个治疗组的平均免疫化学评分。

图16A、16B、16C和16D描绘了当用WX-024或多柔比星治疗时，体外测量CT26细胞(ATCC)生长的CellTiterGlo测定(Promega)的结果。图16A示出了从第1天(D1)到第5天(D5)的未经治疗的细胞的生长速率。图16B和图16C分别示出了在该测定中测量的WX-024或多柔比星治疗的细胞中的生长抑制率。图16D总结了产生50％生长抑制率的药剂浓度(IC₅₀)、最小抑制率、最大抑制率和相对IC₅₀，相对IC₅₀是基于图16B和图16C中描绘的每条曲线计算的中值。

图17A示出了用媒剂或20mg/kg WX-024治疗的两组小鼠的平均肿瘤生长。每只小鼠每天接受其指定治疗的腹腔注射，持续14天。本实验中使用携带CT26结肠癌细胞的Balb/c同品系小鼠模型。每个数据点表示每组平均8只小鼠。图17B示出了WX-024治疗的平均肿瘤生长抑制(TGI)率。第3天的TGI为89.2％，而第12天的TGI为70.0％。

图18A和图18B示出了在图17所述的实验中监测的个体动物的肿瘤生长。图18A表示用媒剂治疗的每只小鼠的肿瘤生长，而图18B表示用WX-024治疗的每只小鼠的肿瘤生长。

图19A和19B示出了从图17所描绘的小鼠收集的血液样品中的CD4⁺T细胞计数。实验结束时(第14天)收集血液样品。图19A示出了以每个血液样品中总细胞的百分比表示的CD4⁺T细胞计数。图19B示出了依照每个血液样品中的总细胞的相对T细胞计数。

图20A和图20B示出了从图17所描绘的小鼠收集的血液样品中的CD8⁺T细胞计数。实验结束时(第14天)收集血液样品。图20A示出了以每个血液样品中总细胞的百分比表示的CD8⁺T细胞计数。图20B示出了依照每个血液样品中的总细胞的相对T细胞计数。

图21A描绘了从图17所述实验收集的肿瘤样品中CD4⁺T细胞群体中调节性T细胞的百分比。图21B描绘了相同肿瘤样品中CD8⁺T细胞和调节性T细胞之间的比例。图21C和图21D示出了在该实验中测试的分别从血液和肿瘤获得的样品的代表性FACS分析。

图22A示出了从图17所述实验收集的肿瘤样品的活化β-连环蛋白染色。上面的四幅图示出了从媒剂治疗组收集的四个样品的染色图像，而下面的四幅图示出了从WX-024治疗组收集的四个样品的染色图像。图22B表示每个治疗组的平均免疫组织化学评分。图22C示出了从相同实验收集的肿瘤样品中CD44的代表性染色。

图23A示出了从图17所述实验收集的肿瘤样品的PD-L1染色。上面的四幅图示出了从媒剂治疗组收集的四个样品的染色图像，而下面的四幅图示出了从WX-024治疗组收集的四个样品的染色图像。图23B表示每个治疗组的平均免疫组织化学评分。

图24示出了接种B16细胞(1X 10³)的C57BL/6小鼠中由媒剂或WX-024引起的肿瘤生长变化。小鼠每天腹腔给予媒剂或25mg/kg WX-024，持续连续14天(每组n＝6)。

图25A、25B和25C描绘了由WX-024治疗引起的T细胞向肿瘤中的浸润。雌性5周龄的C57BL/6小鼠接种B16细胞(1X 10³)。当接种的小鼠的平均肿瘤体积达到100mm³时，将小鼠分成两组，并腹腔给予媒剂或25mg/kg WX-024，持续连续12天。实验结束时，收集肿瘤样品并用CD4或CD8染色。图25A示出了以总肿瘤细胞的百分比表示的CD4⁺T细胞计数。图25B示出了以总肿瘤细胞的百分比表示的CD8⁺T细胞计数。图25C表示以总肿瘤细胞的百分比表示的CD4⁺或CD8⁺T细胞计数。

图26A和图26B描绘了WX-024和WX-039对在肿瘤中存在的树突状细胞的作用。给C57BL/6小鼠接种B16细胞。当接种小鼠的平均肿瘤体积达到100mm³时，将小鼠分成两组，并腹腔给予媒剂、20mg/kg WX-024或60mg/kg WX-039，持续连续12天。实验结束时，收集肿瘤样品并对树突状细胞标志物和辅助性T细胞标志物进行染色。图26A示出了髓样树突状细胞(mDC)计数，而图26B示出了塑性树突状细胞(pDC)计数。(*P<0.05；***P<0.0001，与媒剂对照组相比；单向方差分析)。图26C示出了以总肿瘤细胞的百分比表示的CD194+或CD196+T细胞。图26D示出了该实验中测试的肿瘤样品的代表性FACS分析。

图27A描绘了用媒剂或15mg/kg WX-024治疗的原位小鼠的平均总通量。给Balb/c雌性裸小鼠注射NCI-H1299-Luc细胞(5X 10⁶，50μL，于PBS中)，并用媒剂或WX-024静脉治疗，持续连续10天。每组3只小鼠进行测试。总通量表示由小鼠中肿瘤细胞生成的发光光子通量信号。图27B描绘了在相同实验中监测的每只小鼠的总通量。图27C示出了该实验中监测的每只小鼠的生物发光图像。

图28A示出了来源于结肠直肠癌患者的四个样品中选择性生物标志物的免疫组织化学染色(比例尺：100μm)。每个样品用H&E(苏木精和伊红)、IgG、β-连环蛋白、BCL9、c-Myc和CD44染色。选择#8结肠直肠癌样品进行进一步检查。图28B示出了WX-024对用来源于#8患者的细胞接种的患者源异种移植物NOD/SCID小鼠的作用。在接种两周后，将小鼠分成两组(每组N＝8)，并用媒剂或15mg/kg WX-024静脉治疗，持续接下来的四周。WX-024在第31天的平均肿瘤生长抑制为75.6％。

图29A描绘了从图28所述实验收集的肿瘤样品的β-连环蛋白和BCL9染色。每个图像的免疫组织化学评分显示在图像的右上角。图29B描绘了从图28所述实验收集的肿瘤样品的CD44染色。

图30A、30B和30C描绘了在雌性balb/c小鼠中评估的WX-024的安全特性。用媒剂、10mg/kg、15mg/kg或20mg/kg WX-024静脉治疗小鼠，持续连续14天(n＝6)。图30A示出了实验结束时(第14天)从用媒剂或10mg/kg WX-024治疗的小鼠收获的主要器官的H&E染色。图30B示出了整个实验中每个治疗组的平均体重。图30C示出了媒剂治疗组和20mg/kg WX-024治疗组的全血细胞计数特性。

图31A和图31B示出了连续14天用媒剂、10mg/kg、15mg/kg或20mg/kg WX-024腹腔治疗的雌性balb/c小鼠的毒代动力学分析。图31A示出了第1天给药后全血中的平均WX-024浓度。图31B示出了第14天给药后全血中的平均WX-024浓度。

图32示出了测试WX-024和WX-035的细胞活力测定的结果。在这个实验中使用Colo320DM细胞。

图33A和图33B示出了给予雄性ICR小鼠(远亲杂交品系)的WX-035的PK数据。用1mg/kg或5mg/kg WX-035静脉治疗或5mg/kg WX-035腹腔治疗小鼠。在给药后15分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时收集来自每只小鼠的血液样品。图33A示出了通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析的样品中WX-035的浓度。根据浓度数据，计算最大观察浓度(C_max)、终末半衰期(T_1/2)、总体清除率(CL)、分布体积(V_z)、从给药时间至最后可测量浓度的曲线下面积(AUC_0-t)、从给药时间外推至无穷大的曲线下面积(AUC_0-inf)和生物利用度，如图33B所示。

图34A和图34B示出了给予雌性balb/c小鼠(n＝3)的WX-035的PK数据。向小鼠静脉或腹腔给予30mg/kg WX-035。在给药后5分钟、15分钟、30分钟，1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时和72小时收集来自每只小鼠的血液样品。图34A示出了通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析的样品中WX-035的浓度。根据浓度数据，计算达到最大浓度的时间(T_max)、最大观察浓度(C_max)、终末半衰期(T_1/2)、从给药时间至最后可测量浓度的曲线下面积(AUC_last)、从给药时间外推至无穷大的曲线下面积(AUC_INF)和生物利用度(F)，如图34B所示。

图35A示出了在雄性balb/c同品系动物模型中测试的WX-035对肿瘤生长抑制的作用。给小鼠接种CT26细胞(1X 10³)。当平均肿瘤体积达到100mm³时，将小鼠分成三组，并用媒剂、20mg/kg WX-035或1mg/kg曲美替尼腹腔治疗，持续连续7天(n＝7)。图35B比较了本实验中WX-035和曲美替尼的平均肿瘤生长抑制。在第7天，WX-035的平均肿瘤生长抑制为88.44％。

图36A、36B、36C和36D示出了WX-035对调节性T细胞和其他类型的T细胞群体的体内作用。图35所示的实验结束时，从媒剂治疗组和WX-035治疗组收集肿瘤样品。图36A示出了总CD45⁺T细胞占总肿瘤细胞的百分比。图36B示出了总CD4⁺或CD8⁺T细胞占总肿瘤细胞的百分比。图36C示出了总CD25⁺/Foxp3⁺T细胞。图36D描述了两个治疗组中CD8⁺T细胞和CD25^+/Foxp3⁺T细胞之间的比例。图36E示出了在该实验中收集的肠样品的LGR5染色。

图37描绘了从连续7天用媒剂、30mg/kg或40mg/kg WX-035静脉治疗的雌性6周龄balb/c裸小鼠收获的主要器官的H&E染色(比例尺：100μm)。

图38A和图38B示出了在使用CT26.WT细胞的细胞活力测定中WX-035和WX-037的作用。图38C总结了每个多肽的体外特性。Ab IC₅₀表示细胞活力降低一半的抑制剂的绝对浓度。

图39A和图39B示出了给予雌性balb/c裸小鼠(N＝2)的WX-029的PK数据。向每只小鼠静脉给予1mg/kg WX-029。图39A示出了在给药15分钟、1小时、2小时或4小时之后测量的血浆浓度。图39B总结了使用图39A所示的血浆浓度结果计算的药代动力学特性。

图40A和图40B示出了给予雌性balb/c裸小鼠(N＝2)的WX-036的PK数据。向每只小鼠静脉给予1mg/kg WX-036。图40A示出了在给药15分钟、1小时、2小时或4小时之后测量的血浆浓度。图40B总结了使用图40A所示的血浆浓度结果计算的药代动力学特性。

图41A和图41B示出了给予雌性balb/c裸小鼠(N＝2)的WX-039的PK数据。将WX-039以5mg/kg静脉、5mg/kg腹腔或10mg/kg皮下给予每只小鼠。图41A示出了在给药15分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、36小时、48小时和72小时之后测量的血浆浓度。图41B总结了使用图41A所示的血浆浓度结果计算的药代动力学特性。

图42A和图42B示出了给予雌性balb/c裸小鼠(N＝2)的WX-036的PK数据。将WX-040以30mg/kg静脉或40mg/kg腹腔给予每只小鼠。图42A示出了在给药15分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、36小时、48小时和72小时之后测量的血浆浓度。图42B总结了使用图42A所示的血浆浓度结果计算的药代动力学特性。

图43A示出了接种B16F10细胞(N＝3)的5周龄雌性C57BL/6小鼠中测试的WX-039对肿瘤生长抑制的作用。在实验期间评估的肿瘤生长抑制率示出在图43B中。图43C示出了图43A所描述的实验中的体重变化。

具体实施方式

A.BCL-9，β-连环蛋白和Wnt信号传送

Wnt信号传送的异常激活涉及多种癌症，因为肿瘤可能依赖Wnt信号传送来生长和存活(参见Grossmann等人，《美国国家科学院院刊(PNAS.)》109(44)：17942-17947(2012))。高达90％的散发性结肠直肠癌病例与Wnt信号传送的组成型激活相关联。

β-连环蛋白是可以参与蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质，其刺激Wnt信号传送导致转录激活的改变，其可以允许肿瘤生长和发育。β-连环蛋白通常被磷酸化并被靶向以被轴抑制蛋白复合物降解。如果存在Wnt信号通路的刺激，则未磷酸化的β-连环蛋白积聚，与淋巴增强因子/T细胞因子(LEF/TCF)结合并转移到细胞核中以刺激Wnt靶基因的转录(参见Thakur 2013)。Wnt靶基因包括作为肿瘤模型中的上调基因的c-myc和CD44。BCL9是在哺乳动物细胞中有效的β-连环蛋白介导的转录所需的蛋白质(参见de la Roche等人，《BMC癌症(BMC Cancer)》8：199(2008))。

“经典”Wnt/β-连环蛋白信号传送是Wnt配体与卷曲(Frizzled)家族细胞表面受体结合而激活的通路，其然后调节β-连环蛋白的表达和细胞内定位。在不存在Wnt配体的情况下，β-连环蛋白在由腺瘤性结肠息肉病(APC)、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、酪蛋白激酶-1(CK1)和轴抑制蛋白组成的破坏复合体内被磷酸化并泛素化，并被靶向用于以蛋白酶体依赖性方式降解。在存在Wnt配体的情况下，复合物中β-连环蛋白的泛素化被抑制，导致磷酸化的β-连环蛋白饱和，然后其被稳定化并转移到细胞核。在那里，磷酸化的β-连环蛋白参与核T细胞因子(TCF)转录因子，如淋巴增强因子/3(LEF/TCF)，以诱导促进细胞增殖、迁移和存活的基因(包括c-Myc28和细胞周期蛋白D)的表达。

包括BCL9及其同源物B细胞淋巴瘤9样(B9L)的几种分子已显示为Wnt/β-连环蛋白转录的共激活剂。由TCF、β-连环蛋白和BCL9(或B9L)组成的复合物的形成增强了β-连环蛋白依赖性Wnt转录活性。在正常细胞中，当Wnt配体与其受体解偶联时，该转录通路被关闭。然而，APC和轴抑制蛋白中的多种功能缺失突变以及β-连环蛋白本身的激活突变使β-连环蛋白逃脱了破坏复合物并积聚在细胞核中。β-连环蛋白的这种不适当的持久性促进广泛的常见人类上皮癌(包括肝细胞癌，乳腺癌，结肠直肠癌和血液学恶性肿瘤(如多发性骨髓瘤))中的肿瘤发生。另外，活化β-连环蛋白信号传送导致T细胞排斥，特别是CD8⁺T细胞，这导致治疗耐药性和更短的患者存活时间。因此，通过靶向β-连环蛋白来阻断Wnt信号传送可以提供治疗CRC的有效方式，可能阻止肿瘤启动和转移。参见Spranger等人，《自然(Nature)》523：231-235(2015)。

与其他转录因子类似，由于β-连环蛋白通过相同的结合表面与大多数蛋白质配偶体相互作用，所以开发选择性无毒β-连环蛋白抑制剂以及将移用至临床已被证明是相当大的挑战。因此，靶向这种常见结合表面的Wnt通路抑制剂已经在动物和临床试验中表现出显著的副作用。在临床试验中，只有少数药物靶向β-连环蛋白，包括PRI-724(EisaiPharmaceuticals；II期)，LGK974(Novartis；I期)和OMP-54F28和OMP-18R5(OncoMed/Bayer；I期)。此外，通过β-连环蛋白的小分子和肽抑制剂破坏LEF/TCF相互作用可产生严重的副作用，包括经治疗的小鼠的严重骨髓发育不良、贫血和全身性消瘦——可能是由于破坏了正常造血和肠道干细胞中的稳态Wnt信号传送。这种治疗限制可能源自β-连环蛋白-TCF和β-连环蛋白-E-钙黏蛋白相互作用的破坏，其可影响上皮组织完整性。此外，靶向卷曲受体(OMP-54F28和OMP-18R5)的生物药剂在临床试验中显示出显著的骨髓毒性。Wnt配体对于Wnt/β-连环蛋白激活是必不可少的，但癌细胞中的APC和β-连环蛋白突变可在没有Wnt配体激活的情况下诱导下游转录，因此阻断Wnt分泌不能抑制由APC和β-连环蛋白突变诱导下游基因转录引起的内源致癌Wnt活性。LGK974仅靶向一小部分患者群体，如某些生物标志物所标识。PRI-724是一种小分子抑制剂，正在进行II期试验，每日输注，但每周静脉(IV)给药超过一次表现出临床开发不可取和不可行的特征。

传统上，Wnt信号通路包括三种不同类型的信号传送：经典Wnt信号通路，其中Wnt通过β-连环蛋白依赖性方式调节各种转录靶基因；主要涉及平面细胞极性的非经典Wnt信号通路，其中Wnt可独立于β-连环蛋白发挥功能；以及调节细胞内钙水平的非经典Wnt/钙通路。在本申请中，“经典Wnt信号传送”可互换地称为“经典Wnt/β-连环蛋白信号传送”或“Wnt信号传送”。如本文所述，经典Wnt/β-连环蛋白信号传送可指通路组分，其例如通过调节β-连环蛋白的稳定性来控制患者或样品中的β-连环蛋白的量。在一些实施例中，经典Wnt/β-连环蛋白信号传送包括转录调节一种或多种基因(例如，c-myc、ccnd1、cd44、LGR5、VEGFA、轴抑制蛋白2和LEF1)的通路组分。在一些实施例中，经典Wnt/β-连环蛋白信号传送包括通过β-连环蛋白和BCL9之间的相互作用调节的通路组分。在一些实施例中，经典Wnt/β-连环蛋白信号传送包含一种或多种由β-连环蛋白与BCL9之间的相互作用进行转录控制的基因。由β-连环蛋白和BCL9之间的相互作用控制的一种或多种基因可以包括c-myc、ccnd1、cd44、LGR5、VEGFA、轴抑制蛋白2和LEF1。在一些实施例中，经典Wnt/β-连环蛋白信号传送包含一种或多种蛋白质，其转录表达通过β-连环蛋白和BCL9之间的相互作用进行调节。这些组分可以包括例如c-Myc、细胞周期蛋白D1、CD44、LGR5、VEGFA、轴抑制蛋白2和LEF1。

B.稳定化BCL-9肽

已显示稳定化肽具有诸多优点，例如螺旋含量的增加、蛋白水解稳定性和对靶受体的结合亲和力的增加(参见Kim 2011)。特别是，已知α-螺旋结构域可以稳定化。

1.来源于BCL9HD2结构域的多肽

BCL9的HD2结构域介导BCL9与β-连环蛋白的结合，到目前为止，HD2结构域是显示为在细胞中与β-连环蛋白结合的BLC9的唯一结构域(参见de la Roche 2008)。HD2结构域形成α-螺旋，因此来源于BCL9的HD2结构域的多肽(其中α-螺旋已经稳定化)可能适合于抑制BCL9与β-连环蛋白的相互作用(Sampietro等人，《分子细胞(Molecular Cell)》，24，293-300(2006))。

在一个实施例中，对BCL9蛋白的HD2结构域部分的活性进行定位以确定活性区域(可互换地称为核心功能结构域)。在一个实施例中，包含BCL9的一部分HD2结构域的肽在结构上受到限制。在某些实施例中，该结构约束稳定BCL9肽的α-螺旋。

在一些实施例中，本文所述的多肽来源于人BCL9蛋白的HD2结构域。如本文所使用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指包含两个或多个结合在一起以形成链的氨基酸的聚合物。术语“来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的多肽”包括人BCL9蛋白的全长HD2结构域和此HD2结构域的片段。此处还包括全长HD2结构域或片段的变体。人BCL9蛋白的全长HD2结构域(SEQ ID NO:X)的序列显示于表1中。来源于人BCL9蛋白的HD2结构域或其变体的多肽可如本文所公开的那样钉合或稳定化。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含人BCL9蛋白的全长HD2结构域。在一些实施例中，本文所述的多肽包含人BCL9蛋白的HD2结构域的片段和/或变体。在某个实施例中，来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的多肽包含人BCL9蛋白的HD2结构域的片段，其通过用其它天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸取代一个或多个氨基酸而进一步修饰。在一些实施例中，来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的多肽能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂。如本文所使用，能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂的多肽可以称为“未钉合多肽”。在一些实施例中，本文所述的多肽包含一种或多种非天然存在的氨基酸。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸是正亮氨酸。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸是α,α-二取代氨基酸。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸是α-甲基,α-烯基氨基酸。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸是手性分子，其包含具有S-或R-构型的手性中心。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸选自(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸、(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸、(S)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸和(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸。

如本文所使用，来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的多肽也包括已经经历反应以形成一种或多种烃交联剂并因此包含一种或多种烃交联剂的多肽。如本文所使用，包含一种或多种烃交联剂的多肽可以被称为“稳定化多肽”或“钉合多肽”。在一些实施例中，烃交联剂具有2-15个碳的长度。在一些实施例中，烃交联剂具有5-11个碳的长度。在一些实施例中，烃交联剂具有7-11个碳的长度。在一些实施例中，烃交联剂具有7-15个碳的长度。在一些实施例中，烃交联剂具有8-11个碳的长度。在一些实施例中，烃交联剂具有7或8或9或10或11个碳或更大的长度。在一些实施例中，烃交联剂选自-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-和-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-。

在一些实施例中，本文所述的钉合多肽能够在体外和/或体内抑制BCL9与β-连环蛋白的结合。在一些实施例中，与人BCL9蛋白的未钉合野生型HD2结构域相比或与未钉合野生型HD2结构域的片段相比，来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的多肽具有一种或多种改善的生物学功能。一种或多种生物学功能可以选自以下中的一种或多种：(1)抑制BCL9与β-连环蛋白的结合；(2)抑制经典Wnt/β-连环蛋白信号传送；(3)减少调节性T细胞存活；(4)降低VEGF在肿瘤中的表达；(5)增加CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞向肿瘤中的浸润；(6)增加肿瘤中的辅助性T细胞17(Th17)；(7)减少肿瘤中的树突状细胞；(8)当向受试者给药时，具有大于至少2小时的半衰期(T_1/2)；(9)诱导有利于免疫反应的肿瘤微环境；和(10)抑制肿瘤生长、癌症干细胞增殖和/或肿瘤转移。

本公开涵盖包含人BCL9蛋白的野生型HD2结构域的变体或未钉合野生型HD2结构域的片段的变体的钉合肽，其保留了野生型多肽的一种或多种生物学功能。本文所使用的与本文所述多肽有关的“变体”是指与给定多肽在氨基酸序列和/或化学结构方面不同，但保留了给定多肽(即，本文所述的多肽)的一种或多种生物学功能的多肽。例如，所述变体可保留来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的多肽的一种或多种生物学功能，例如结合β-连环蛋白的能力、抑制经典Wnt/β-连环蛋白信号传送、和/或抑制BCL9与β-连环蛋白的结合。

相较于给定多肽，本文所述的变体多肽可具有一个或多个氨基酸添加(例如，插入)、缺失和/或取代，只要其保留上述功能性质即可。在一些实施例中，相较于野生型多肽，本文所述的变体多肽可具有1-30个，1-20个，1-10个，1-8个，1-5个，1-4个，1-3个或1-2个，或1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，15个，20个，25个或30个氨基酸添加(例如，插入)、缺失和/或取代，包括这些范围之间的所有整数。

在一些实施例中，变体包含给定多肽的一个或多个氨基酸的保守取代。氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如，亲水性，带电区域的程度和分布)的不同氨基酸取代氨基酸通常涉及微小变化，因此不会显著改变多肽的生物活性。这些微小的变化可以通过考虑氨基酸的疏水性和电荷而考虑氨基酸的亲疏水性指数来标识。具有类似亲疏水性指数和亲水性值的氨基酸可以被取代，并且仍然保留蛋白质功能。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受所述氨基酸的特定侧链影响。与该观察相一致，与生物学功能相容的氨基酸取代取决于氨基酸的相对相似性，特别是那些氨基酸的侧链，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其他性质所示。

在一些实施例中，变体包含野生型多肽或片段的一个或多个氨基酸被非天然存在的氨基酸取代。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸是正亮氨酸。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸是α,α-二取代氨基酸。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸是α-甲基,α-烯基氨基酸。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸是手性分子，其包含具有S-或R-构型的手性中心。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸选自(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸、(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸、(S)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸和(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸。

术语“变体”还包括与野生型多肽或片段具有一定同源性百分比(例如，至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％(或其间的任何百分比))的多肽。如本文所使用，术语同源性百分比(％)定义了在比对序列和其他间隔后(例如，使用BLAST比对软件)，变体和给定多肽的氨基酸序列中的相同残基的百分比。

在一些实施例中，变体包含以不同于野生型多肽或片段的方式化学和/或翻译后修饰的多肽，但保留如上所述的一种或多种生物学功能。例如，所述变体可包含一个或多个翻译后修饰的氨基酸(通过例如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、SUMO化或本领域已知的其他翻译后修饰)。所述变体还可以包含一个或多个化学修饰，例如经不同化学部分修饰或取代的一个或多个氨基酸侧链。如本文所使用，术语“变体”还包括与给定多肽在氨基酸序列方面相同但具有不同烃交联剂的多肽。术语“变体”还可以指与给定多肽在氨基酸序列和化学结构方面相同但具有不同手性的多肽。

2.来源于BCL9HD2结构域的多肽的结构

在一些实施例中，来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的多肽具有7-22个氨基酸长度。在一些实施例中，所述多肽具有7-14个氨基酸长度。在一些实施例中，多肽具有7或8个氨基酸长度。在一些实施例中，多肽具有10-14个氨基酸长度。在一些实施例中，多肽具有11或12个氨基酸长度。

在一些实施例中，来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的多肽具有7-14个氨基酸长度并且包含选自表1的任何序列。在一些实施例中，来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的多肽具有7或8个氨基酸长度且包含选自表1的任何序列。在一些实施例中，来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的多肽具有10-14个氨基酸长度并且包含选自表1的任何序列。在在一些实施例中，来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的多肽具有10或11个氨基酸长度并且包含选自表1的任何序列。本文所述的多肽还包括选自表1的多肽的变体，其保留了多肽的一个或多个生物学功能。在各个实施例中，所选多肽是稳定化的，例如通过包含一种或多种烃交联剂。在表1中，B表示正亮氨酸。

表1.来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的多肽

在某个实施例中，本文所述的多肽能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂。在一些实施例中，多肽包含选自表1的任何序列或其变体，其中Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是α,α-二取代氨基酸。在一些实施例中，本文所述的多肽包含选自表1的任何序列，其中Xaa₁和Xaa₂各自是α,α-二取代氨基酸，且烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在一些实施例中，本文所述的多肽包含选自表1的任何序列，其中Xaa₃和Xaa₄各自是α,α-二取代氨基酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在一些实施例中，α,α-二取代氨基酸是α-甲基,α-烯基氨基酸。在一些实施例中，α-甲基,α-烯基氨基酸是α-甲基,α-烯基丙氨酸。在一些实施例中，α-甲基,α-烯基丙氨酸选自(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸、(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸、(S)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸和(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸。

在某个实施例中，本文所述的多肽或其变体是包含一种或多种烃交联剂的钉合多肽，并且包含选自表1的任何序列或其变体。在一些实施例中，多肽是包含一种烃交联剂的钉合多肽，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在其他实施例中，多肽是包含两种烃交联剂的钉合多肽，其中(1)Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸，(2)第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间，和(3)第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在一些实施例中，烃交联剂在两端具有S-构型。在一些实施例中，烃交联剂在两端具有R-构型。在一些实施例中，烃交联剂在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LXaa₁QEQXaa₂E(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含SXaa₁EQLXaa₂H(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含QXaa₁QLEXaa₂R(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含EXaa₁LEHXaa₂E(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含QXaa₁EHRXaa₂R(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LXaa₁HREXaa₂S(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含EXaa₁RERXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含HXaa₁ERSXaa₂Q(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含RXaa₁RSLXaa₂T(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含EXaa₁SLQXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含RXaa₁LQTXaa₂R(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含SXaa₁QTLXaa₂D(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LXaa₁TLRXaa₂I(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含QXaa₁LRDXaa₂Q(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含TXaa₁RDIXaa₂R(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LXaa₁DIQXaa₂B(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含RXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含DXaa₁QRBXaa₂F(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LQTLRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含Xaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，而Xaa₁为(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含Xaa₁DQXaa₂DRXaa₃DQRXaa₄DH(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，而Xaa₁是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含Xaa₁LEXaa₂LRXaa₃IERXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，而Xaa₁为(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含RXaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，而Xaa₁是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LQXaa₁LRDIQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸且Xaa₂是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LXaa₁QEQXaa₂E(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含SXaa₁EQLXaa₂H(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含QXaa₁QLEXaa₂R(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含EXaa₁LEHXaa₂E(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含QXaa₁EHRXaa₂R(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LXaa₁HREXaa₂S(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含EXaa₁RERXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含HXaa₁ERSXaa₂Q(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含RXaa₁RSLXaa₂T(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含EXaa₁SLQXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含RXaa₁LQTXaa₂R(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含SXaa₁QTLXaa₂D(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LXaa₁TLRXaa₂I(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含QXaa₁LRDXaa₂Q(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含TXaa₁RDIXaa₂R(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LXaa₁DIQXaa₂B(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含RXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含DXaa₁QRBXaa₂F(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LQTLRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列和/或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含Xaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中(1)Xaa₃和Xaa₄各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，(2)Xaa₁和Xaa₂是丙氨酸，和(3)烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含Xaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中(1)Xaa₁是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，Xaa₂是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，(2)Xaa₃和Xaa₄是丙氨酸，和(3)烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含Xaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸，并且第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间，第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在这些实施例中，第一烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型，而第二烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含Xaa₁DQXaa₂DRXaa₃DQRXaa₄DH(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中(1)Xaa₃和Xaa₄各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，2)Xaa₁和Xaa₂是丙氨酸，和(3)烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含Xaa₁DQXaa₂DRXaa₃DQRXaa₄DH(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中(1)Xaa₁是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，Xaa₂是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，(2)Xaa₃和Xaa₄是丙氨酸，和(3)烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型的。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含Xaa₁DQXaa₂DRXaa₃DQRXaa₄DH(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸，并且第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间，第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在这些实施例中，第一烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型，而第二烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含或由Xaa₁LEXaa₂LRXaa₃IERXaa₄L(SEQ IDNO:X)的氨基酸序列组成，其中(1)Xaa₃和Xaa₄各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，2)Xaa₁和Xaa₂是丙氨酸，和(3)烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含Xaa₁LEXaa₂LRXaa₃IERXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中(1)Xaa₁是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，Xaa₂是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，(2)Xaa₃和Xaa₄是丙氨酸，和(3)烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含Xaa₁LEXaa₂LRXaa₃IERXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸，并且第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间，第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在这些实施例中，第一烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型，而第二烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含RXaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中(1)Xaa₃和Xaa₄各自是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，2)Xaa₁和Xaa₂是丙氨酸，和(3)烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含RXaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中(1)Xaa₁是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，Xaa₂是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，(2)Xaa₃和Xaa₄是丙氨酸，和(3)烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型的。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含RXaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸，并且第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间，第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在这些实施例中，第一烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型，而第二烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LQXaa₁LRDIQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-，在一端具有R-构型而在另一端具有S-构型。在一些实施例中，本文所述的多肽或变体进一步包含在N末端和/或C末端的化学修饰。在一些实施例中，本文所述的多肽或变体的N末端被进一步修饰。在一些实施例中，本文所述的多肽或变体的N末端被修饰为乙酰基。在一些实施例中，本文所述的多肽或变体的C末端被进一步修饰。在一些实施例中，本文所述的多肽或变体的C末端用NH₂修饰。在一些实施例中，本文所述的多肽或变体的C末端用一个、两个或多个β-丙氨酸单元、2-萘基丙氨酸和/或任选地连接至一个、两个或多个β-丙氨酸单元的2-萘基丙氨酸修饰，其中C末端修饰的羧基任选地用NH₂进一步修饰。在一些实施例中，本文所述的多肽或变体的N末端和/或C末端进一步被芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护。在一些实施例中，多肽或变体进一步与一个或多个化学部分缀合，所述化学部分改善例如多肽的细胞渗透性、溶解性和稳定性。在一些实施例中，多肽或变体与TAT多肽(GRKKRRQRRRPQ)缀合。

在一些实施例中，多肽或变体由选自表1的氨基酸序列组成，其中多肽或变体的N末端用乙酰基进一步修饰，并且多肽或变体的C末端用NH₂修饰。

在一些实施例中，多肽或变体由LRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。在这些实施例中，多肽或变体的N末端可以用乙酰基进一步修饰。在这些实施例中，所述多肽或变体的C末端可以用连接至两个β-丙氨酸单元的2-萘基丙氨酸进一步修饰，其中第二β-丙氨酸单元的羧基用NH₂(2-Nal-β-ALA-β-ALA-NH₂)修饰。该多肽在本申请中可以被称为“WX-021”。

在一些实施例中，多肽或变体由LRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。在这些实施例中，多肽或变体的N末端可以用乙酰基进一步修饰。在这些实施例中，多肽或变体的C末端可以用两个β-丙氨酸单元进一步修饰，其中第二β-丙氨酸单元的羧基用NH₂(β-Ala-β-Ala-NH₂)修饰。该多肽在本申请中可以被称为“WX-022”。

在一些实施例中，多肽或变体由LRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。在这些实施例中，多肽或变体的N末端可以用乙酰基进一步修饰。在这些实施例中，多肽或变体的C末端可以用2-萘基丙氨酸进一步修饰，其中2-萘基丙氨酸的羧基用NH₂(2-Nal-NH₂)修饰。该多肽在本申请中可以被称为“WX-023”。

在一些实施例中，所述多肽或变体由LQTLRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。在这些实施例中，多肽或变体的N末端可以用乙酰基进一步修饰。在这些实施例中，多肽或变体的C末端可以用连接至两个β-丙氨酸单元的2-萘基丙氨酸进一步修饰。在这些实施例中，多肽可以进一步与TAT肽(GRKKRRQRRRPQ)缀合。该多肽在本申请中可以被称为“WX-029”。

在一些实施例中，所述多肽或变体由Xaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列组成，其中Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸，并且第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间，第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在这些实施例中，第一烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型，而第二烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。在这些实施例中，多肽或变体的N末端可以用乙酰基进一步修饰。在这些实施例中，多肽或变体的C末端可以用连接至两个β-丙氨酸单元的2-萘基丙氨酸进一步修饰。在这些实施例中，多肽可以进一步与TAT肽(GRKKRRQRRRPQ)缀合。该多肽在本申请中可以被称为“WX-036”。

在一些实施例中，本文所述的多肽由Xaa₁DQXaa₂DRXaa₃DQRXaa₄DH(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列组成，其中Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸，并且第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间，第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在这些实施例中，第一烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型，而第二烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。在这些实施例中，多肽或变体的N末端可以用乙酰基进一步修饰。在这些实施例中，多肽或变体的C末端可以用两个β-丙氨酸单元进一步修饰，其中第二β-丙氨酸单元的羧基用NH₂(β-Ala-β-Ala-NH₂)修饰。该多肽在本申请中可以被称为“WX-037”。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含Xaa₁LEXaa₂LRXaa₃IERXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸，并且第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间，第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在这些实施例中，第一烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型，而第二烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。在这些实施例中，多肽或变体的N末端可以用乙酰基进一步修饰。在这些实施例中，所述多肽或变体的C末端可以用连接至两个β-丙氨酸单元的2-萘基丙氨酸进一步修饰，其中第二β-丙氨酸单元的羧基用NH₂(2-Nal-β-ALA-β-ALA-NH₂)修饰。该多肽在本申请中可以被称为“WX-038”。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含RXaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸，并且第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间，第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在这些实施例中，第一烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型，而第二烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。在这些实施例中，多肽或变体的N末端可以用乙酰基进一步修饰。在这些实施例中，所述多肽或变体的C末端可以用连接至两个β-丙氨酸单元的2-萘基丙氨酸进一步修饰，其中第二β-丙氨酸单元的羧基用NH₂(2-Nal-β-ALA-β-ALA-NH₂)修饰。该多肽在本申请中可以被称为“WX-039”。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含LQXaa₁LRDIQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-，在一端具有R-构型而在另一端具有S-构型。在这些实施例中，多肽或变体的N末端可以用乙酰基进一步修饰。在这些实施例中，所述多肽或变体的C末端可以用连接至两个β-丙氨酸单元的2-萘基丙氨酸进一步修饰，其中第二β-丙氨酸单元的羧基用NH₂(2-Nal-β-ALA-β-ALA-NH₂)修饰。该多肽在本申请中可以被称为“WX-040”。

在一些实施例中，所述多肽或变体由LQTLRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列组成，其中Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在这些实施例中，烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。在这些实施例中，多肽或变体的N末端可以用乙酰基进一步修饰。在这些实施例中，多肽或变体的C末端可以用2-萘基丙氨酸进一步修饰，其中2-萘基丙氨酸的羧基用NH₂(2-Nal-NH₂)修饰。该多肽在本申请中可以被称为“WX-024”。WX-024的化学结构如图1A所示。

在一些实施例中，所述多肽或变体由Xaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:X)的氨基酸序列组成，其中Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸，并且第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间，第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。在这些实施例中，第一烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型，而第二烃交联剂是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-，在两端具有S-构型。在这些实施例中，多肽或变体的N末端可以用乙酰基进一步修饰。在这些实施例中，所述多肽或变体的C末端可以用连接至两个β-丙氨酸单元的2-萘基丙氨酸进一步修饰，其中第二β-丙氨酸单元的羧基用NH₂(2-Nal-β-ALA-β-ALA-NH₂)修饰。该多肽在本申请中可以被称为“WX-035”。WX-035的化学结构如图1B所示。

3.烃交联剂

本文所述的多肽可以包括具有一种或多种烃交联剂的稳定化多肽。烃交联剂可具有来源于BCL9的HD2结构域的多肽的α-螺旋的结构约束。在一个实施例中，来源于BCL9肽的HD2结构域的多肽的α-螺旋由一种或多种烃交联剂稳定化。如本文所使用，术语“烃交联剂”和“交联剂”(也称为烃钉、烃连接基团或易位交联剂)可互换使用，并且指两个氨基酸之间的化学连接基团，其中连接基团显著加强和/或增强给定多肽的二级结构。本文所述的烃交联剂可基于掺入与野生型(即，非交联)肽相比限制多肽的结构柔性的天然或非天然氨基酸。

例如，本文使用的烃交联剂可以增强来源于人BCL9的HD2结构域的多肽的α-螺旋结构的稳定性。烃交联剂可以延伸穿过一个或多个α-螺旋转角的长度。由于一般理解的是一个α-螺旋转角包含约3至4个氨基酸，因此还应理解位于例如i和i+3，i和i+4，或i和i+7的氨基酸将是引入烃交联剂的理想位置。例如，具有X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀序列的多肽可以通过烃交联剂例如在X₁和X₄之间，在X₁和X₅之间或在X₁和X₈之间交联。然而，其他位置也可以考虑用可选择的间隔来增强α-螺旋结构或其他已知结构(例如，β-折叠结构)的稳定性和/或通过例如改变每个螺旋转角的氨基酸的数目来引入二级结构的变化。因此，如本文所讨论，来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的任何多肽可以在任何合适的位置交联。

在一些实施例中，本文所述的稳定化多肽包含在位置i和i+3，i和i+4或i和i+7的烃交联。在某些实施例中，交联连接了第一氨基酸(i)和第一氨基酸下游3个氨基酸处存在的第二氨基酸(i+3)。在某些实施例中，交联连接了第一氨基酸(i)和第一氨基酸下游4个氨基酸处存在的第二氨基酸(i+4)。在某些实施例中，交联连接第一氨基酸(i)和第一氨基酸下游7个氨基酸处存在的第二氨基酸(i+7)。

在一些实施例中，本文所述的多肽包含两种或多种烃交联剂。在一些实施例中，所述肽用两种烃交联剂稳定化。在一些实施例中，所述肽用三种交联剂稳定化。例如，三种交联剂可以用于更长的结构，例如具有24个氨基酸的那些。与不包含烃交联剂或包含一种烃交联剂的多肽相比，使用两种或多种烃交联剂可有利于加强和/或增强给定多肽的二级结构。单个肽内的多种烃交联可赋予α螺旋额外的稳定性，例如更好的稳定性和改善的药代动力学特性。在一些实施例中，多种交联存在于单个多肽内。在某些实施例中，这些交联可以以交联的氨基酸之间的相同距离连续。在一个实施例中，两种交联存在于位置i和i+3以及位置i'和i'+3。位置i'可以位于i和i+3之间，或者位于位置i+3之后。在一个实施例中，两种交联位于位置i和i+4以及位置i'和i'+4位置。位置i'可以位于i和i+4之间，或者位于位置i+4之后。在一个实施例中，两种交联位于位置i和i+7位置以及位置i'和i'+7。位置i'可以位于i和i+7之间，或者位于位置i+7之后。

在某些实施例中，单个肽内的两种交联位于混合位置，其中一种交联位于位置i和i+3，i和i+4，或i和i+7；而另一种交联在连接的氨基酸之间具有不同的间距。在一些实施例中，本文所述的多肽具有两种烃交联剂，其中一种交联剂位于位置i和i+3，且另一种交联剂位于位置i'和i'+4。在一些实施例中，位置i'可以位于i与i+3之间或位于位置i+3之后。在一些实施例中，位置i可以位于i'与i'+4之间或位于位置i'+4之后。

各种烃交联剂在本领域中是已知的。(Azzarito等人，《自然化学(NatureChemistry)》5：161-173(2013))。在一些实施例中，本文公开的烃交联剂通过连接两个掺入单个多肽中的α,α-二取代氨基酸而生成。在一些实施例中，烃交联剂通过连接两个α,α-二取代氨基酸的闭环复分解反应生成。闭环复分解(也称为闭环烯烃复分解)在本领域中是已知的(Kim等人，《自然·实验手册(Nature Protocols)》6：761-771(2011))。

如本文所述的烃交联剂的长度可以根据α,α-二取代氨基酸的取代基的长度而变化。例如，通过使用合适的α,α-二取代氨基酸，通过闭环复分解反应所生成的烃交联剂可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个碳的长度。在一些实施例中，烃交联剂具有8-12个碳的长度。在一些实施例中，烃交联剂具有8或11个碳的长度。在某些实施例中，烃连接基团的长度为8个碳。在某些实施例中，烃连接基团的长度为11个碳。可以根据烃交联剂是否延伸超过一个、两个、三个或多个螺旋转角来调节烃交联剂的长度。例如，具有8个碳的长度的烃交联剂可用于连接位置i和i+3或i和i+4。具有11个碳的长度的烃交联剂可以用于连接位置i和i+7。

在一些实施例中，烃交联剂是烯基交联剂。在一些实施例中，本文所述的烃交联剂通过连接两个α-烷基,α-烯基氨基酸而生成。在一些实施例中，α-烷基,α-烯基氨基酸是α-甲基,α-烯基氨基酸。在一些实施例中，α-甲基,α-烯基氨基酸是α-甲基,α-烯基丙氨酸。在一些实施例中，α-甲基,α-烯基丙氨酸选自(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸、(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸、(S)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸和(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸。在一些实施例中，烃交联剂是-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-。在一些实施例中，烃交联剂是-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-。

在一些实施例中，本文所述的烃交联剂可以在交联剂的任一端具有手性。在一些实施例中，烃交联剂在两端具有S-构型。在一些实施例中，烃交联剂在两端具有R-构型。在一些实施例中，烃交联剂在一端具有S-构型并且在另一端具有-R构型。在一些实施例中，烃交联剂是-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-，在两端具有S-构型。在一些实施例中，烃交联剂是-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-，在两端具有R-构型。在一些实施例中，烃交联剂是-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型。在一些实施例中，烃交联剂是-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-，在两端具有S-构型。在一些实施例中，烃交联剂是-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-，在两端具有R-构型。在一些实施例中，烃交联剂是-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-，在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型。

文献中已知各种非烃连接基团(参见Azzarito等人，《自然化学(Nat Chem)》5：161-173(2013))。在一些实施例中，肽通过交联剂来稳定化，所述交联剂为二硫桥、内酰胺桥、氢键替代物或三唑钉。

4.具有烃交联剂的肽的制备和纯化

本公开还提供了制备本文所述多肽的方法。此类方法可以包括生成能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂的多肽，其中所述多肽包含选自表1的任何序列或其变体。在一些实施例中，所述方法包括生成包含LQTLRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:X)、Xaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:X)或其变体的多肽。在一些实施例中，Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是α,α-二取代氨基酸；Xaa₁和Xaa₂各自是α,α-二取代氨基酸，且烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间；或者Xaa₃和Xaa₄各自是α,α-二取代氨基酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。在一些实施例中，α,α-二取代氨基酸是α-甲基,α-烯基氨基酸。

在一些实施例中，一种用于制备本文所述多肽的方法包括进行本领域技术人员已知的和本文所述的一种或多种化学合成方法。参见，例如，Fields等人，《合成肽：用户指南(Synthetic Peptides：A User's Guide)》第3章，编辑：格兰特，W.H.Freeman&Co.,NewYork,N.Y.,1992,p.77；和Bird,G.H.等人，《酶学方法(Methods Enzymol)》446,369-86(2008)。在一些实施例中，一种用于制备本文所述多肽的方法包括使用固相合成来生成多肽。例如，本文所述的多肽可以通过固相合成的自动化梅里菲尔德(Merrifield)技术制备，其中在例如Applied Biosystems 430A或431型肽合成仪或AAPPTEC多通道合成仪APEX 396上使用侧链保护的氨基酸通过t-Boc或Fmoc化学保护α-NH₂。

在一些实施例中，本文所述的多肽还可以以高通量组合方式制备，例如使用高通量多通道组合合成仪。其他合成肽的方法在本领域中是已知的。

制备本文所述多肽的方法可以进一步包括形成一种或多种烃交联剂。所述一种或多种烃交联剂可以通过使本文所述的多肽经历金属介导的闭环烯烃复分解而形成。例如，基于修饰的Ala残基(α-甲基,α-烯基氨基酸)生成烃交联剂的合成策略对于本领域普通技术人员而言是已知的。烃交联剂连接α-螺旋的相邻转角，每一端各有一个α-甲基。生成这种烃交联剂的化学基础是在肽合成期间掺入两种α-甲基,α-烯基氨基酸(参见Kim2011)。然后通过使用钌介导的闭环烯烃复分解生成这些经修饰的氨基酸之间的烃交联剂。闭环之后，多肽可以被去保护并从这种反应中释放，从而产生包含一种或多种烃交联剂的多肽。

本公开还涵盖纯化根据本文所述方法制备的多肽的方法。在一些实施例中，通过高效液相色谱(HPLC)纯化多肽。在一些实施例中，纯化的多肽基本上不含金属。如本文所使用，术语“基本上不含金属”是指包含本文所述多肽和浓度低于约0.5、1、2.5、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100ppm的金属的组合物。在一些实施例中，纯化的多肽基本上不含金属，包含小于约0.5ppm。在一些实施例中，纯化的多肽包含小于约5ppm。在一些实施例中，纯化的多肽包含小于约20ppm。

根据本文公开的方法制备的多肽可以在存在或不存在溶剂的情况下以各种形式存在。例如，多肽可以以粉末、盐、液体、晶体或冻干组合物的形式存在。在一些实施例中，本文所述的多肽作为盐形式或晶体存在。合适的盐形式的实例包括乙酸盐、三氟乙酸盐、己二酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、甲酸盐、富马酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、棕榈酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。术语“晶体”和“结晶的”是指以晶体形式存在的多肽。晶体是物质固态的一种形式，与其他形式(如非晶固态或液晶态)不同。本文所述多肽的盐形式或晶体保留了以不同形式(例如，粉末形式)制备的多肽的一种或多种生物学功能。在一些实施例中，盐形式是三氟乙酸盐、乙酸盐或盐酸盐。在一些实施例中，本文所述的多肽以盐形式存在并且在室温下稳定至少一个月。在一些实施例中，本文所述的多肽在2-8℃下稳定至少一个月。

本文所述的多肽可以与一个或多个化学部分缀合，所述化学部分已知可改善例如给定多肽的细胞渗透性、溶解性和稳定性。术语“缀合物”是指与第二化学部分化学连接的多肽。在一些实施例中，多肽与一个或多个修饰缀合，例如细胞渗透性增加部分和细胞靶向部分。这些类别中的各种修饰在本领域中是已知的。例如，本文所述的多肽可以是聚乙二醇化的，是一种已知有助于细胞摄取，增加生物利用度，增加血液循环和半衰期，改变药代动力学，降低免疫原性和/或降低所需的给药频率的修饰。在一些实施例中，本文所述的多肽与Ant8(触角足8聚体肽)、TAT肽(GRKKRRQRRRPQ)或一个或多个β-丙氨酸单元缀合。

在各个实施例中，本文所述的多肽也可以与药剂缀合。在一些实施例中，所述药剂是免疫粘附分子、成像剂、治疗剂或细胞毒性剂。在一个实施例中，成像剂是放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记或生物素。在另一个实施例中，放射性标记是³H、¹⁴C、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho或¹⁵³Sm。在又一个实施例中，治疗剂或细胞毒性剂是抗代谢剂、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环霉素、毒素或细胞凋亡药剂、抗癌剂、免疫抑制剂或免疫反应刺激剂。

在各个实施例中，还提供了一种编码本文公开的多肽的分离核酸。还提供了一种包含本文公开的分离核酸的载体(例如，表达载体)。

另一方面，用本文公开的载体转化宿主细胞。在一个实施例中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在另一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，例如原生细胞、动物细胞、植物细胞或真菌细胞。在一个实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于CHO、COS、NS0、SP2、PER.C6或真菌细胞(如酿酒酵母)或昆虫细胞(如Sf9)。

在各个实施例中，可以通过在足以产生多肽的条件下在培养基中培养本文公开的任何一种宿主细胞来制备本文公开的多肽。

5.药物组合物

在各个实施例中，提供了包含一种或多种本文公开的多肽的药物组合物，其单独或与其他预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合。在一些实施例中，药物组合物可以包含本文所述的一个、两个、三个或多个多肽。包含本文提供的多肽的药物组合物用于但不限于诊断、检测或监测病症，预防、治疗、控制或改善病症或其一种或多种症状，和/或研究。

“药学上可接受的载体”是指例如任何和所有溶剂、固体、半固体、液体填充剂、稀释剂、包封材料、制剂助剂、介质、等渗剂和吸收延迟剂，其与本文所述的多肽一起使用以包含适合给予受试者的“药物组合物”。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。补充活性化合物也可以掺入组合物中。药学上可接受的载体可基于组合物的使用和/或给药途径来选择。

药物组合物可以配制成许多可能剂型中的任何一种，例如片剂、胶囊、凝胶胶囊、粉末或颗粒。药物组合物也可以配制成溶液、混悬剂、乳剂或混合介质。在一些实施例中，药物组合物可以配制成冻干制剂或水溶液。

在一些实施例中，药物组合物可以配制成溶液。例如，本文所述的多肽可以在非缓冲溶液中给予，例如在盐水中，在水中或在二甲亚砜(DMSO)中。在一些实施例中，多肽还可以在合适的缓冲溶液中给予。例如，缓冲溶液可包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合。在一些实施例中，缓冲溶液可以是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以调节包含多肽的缓冲溶液的pH和摩尔渗透压浓度以适合给予受试者。

在一些实施例中，药物组合物可以配制成水性介质、非水性介质或混合介质中的混悬剂。在一些实施例中，药物组合物配制在包含水和DMSO的混合介质中。水性混悬剂可以进一步包含增加混悬剂粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。混悬剂也可以包含稳定剂。

在一些实施例中，药物组合物用于体内给药，并且可以是无菌的。无菌性可以容易地实现，例如通过无菌滤膜过滤。

在各个实施例中，包含本文所述多肽的药物组合物可以进一步包含至少一种另外的药剂。在一些实施例中，所述至少一种另外的药剂选自检查点抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、VEGFR抑制剂和抗癌药物中的一种或多种。

在一些实施例中，本文所述的药物组合物包含检查点抑制剂。在一个实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA4抗体。在一个实施例中，检查点抑制剂靶向刺激检查点分子，例如CD27、CD40、OX40、GITR或CD138。在另一个实施例中，检查点抑制剂靶向抑制性检查点分子，例如A2AR、B7-H3、B7-H4、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM-3)、VISTA(C10orf54)或T细胞活化的V结构域Ig抑制子。

在一些实施例中，本文所述的药物组合物包含EGFR抑制剂。在一个实施例中，EGFR抑制剂是厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、帕尼单抗、凡德他尼或西妥昔单抗。

在一些实施例中，本文所述的药物组合物包含VEGF或VEGFR抑制剂。在一个实施例中，VEGF或VEGFR抑制剂是帕唑帕尼、贝伐单抗、索拉非尼、舒尼替尼、阿西替尼、普纳替尼、瑞格非尼、凡德他尼、卡博替尼、雷莫芦单抗、乐伐替尼或阿柏西普。

在一些实施例中，本文所述的药物组合物包含抗癌药物。抗癌药物可以选自：环磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、多柔比星、氮芥、长春新碱、甲基苄肼、泼尼松龙、达卡巴嗪、博来霉素、依托泊苷、顺铂、表柔比星、卡培他滨、亚叶酸、放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、硼替佐米、卡铂、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊立替康、二氯甲基二乙胺、巯嘌呤、米托蒽醌、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、戊柔比星、长春碱、长春地辛、长春瑞滨和奥沙利铂。

C.来源于BCL9的HD2结构域的多肽的生物学功能

本公开涵盖来源于人BCL9蛋白或其变体的HD2结构域的多肽(包括稳定化肽)，其中所述多肽在一个或多个以下类别中表现出有利的生物学功能：(a)多肽与BCL9的结合动力学(结合速率、解离速率和亲和力)；(b)多种生物化学和细胞生物测定的效力；(c)相关肿瘤模型中的体内疗效；(d)药代动力学和药效学性质；和(e)毒理学性质。

在一些实施例中，本文所述的多肽在上文列出的一些或每个类别中表现出有利的生物学功能，例如在包括基于细胞的Wnt和/或β-连环蛋白转录测定的各种生物化学和细胞生物测定中的效力。术语“生物学功能”是指测量的本文所述多肽的体外或体内作用。在一些实施例中，与未钉合野生型人BCL9HD2结构域或野生型片段相比，本文所述的多肽具有一种或多种改善的生物学功能，所述生物学功能选自：(1)抑制BCL9与β-连环蛋白的结合；(2)抑制经典Wnt/β-连环蛋白信号传送；(3)减少调节性T细胞存活；(4)降低VEGF在肿瘤中的表达；(5)增加CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞向肿瘤中的浸润；(6)增加肿瘤中的辅助性T细胞17(Th17)数量；(7)调节肿瘤中的树突状细胞；(8)当给予受试者时，具有大于至少2小时的半衰期(T_1/2)；(9)诱导有利于免疫反应的肿瘤微环境；和(10)抑制肿瘤生长、癌症干细胞增殖和/或肿瘤转移。各种测定在本领域已知用于测量这些性质，并且可以在本文使用。

在一些实施例中，与另一钉合肽、未钉合野生型人BCL9HD2结构域或野生型片段相比，WX-024具有一种或多种改善的生物学功能，其中生物学功能选自本文所述的生物学功能。在一些实施例中，改善的生物学功能是活性(例如，如体外和/或体内测量的)和药代动力学中的一种或多种。在一些实施例中，与另一钉合肽、未钉合野生型人BCL9HD2结构域或野生型片段相比，WX-035具有一种或多种改善的生物学功能，其中生物学功能选自本文所述的生物学功能。在一些实施例中，改善的生物学功能是活性(例如，如体外和/或体内测量的)和药代动力学中的一种或多种。

本公开还涵盖所述多肽的变体，其中所述变体在氨基酸序列和/或化学结构方面不同于野生型多肽，但保留了所述多肽的一种或多种生物学功能。

如本文所使用，术语“改善”、“增加”、“增强”、“提高”、“上调”和“促进”一种或多种生物学功能全部可互换使用，并且表示一种或多种生物学功能的水平或活性或者根据体外和/或体内测定的功能的读数增加至高于在不存在本文所述多肽的情况下观察到的水平或活性和/或高于媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型人BCL9HD2结构域，不包含介导BCL9和β-连环蛋白之间的相互作用的核心功能结构域的多肽，或包含不来源于人BCL9的HD2结构域的序列的对照多肽等)。例如，不受任何理论的束缚，如在各种体外测定中所评估，例如在均相时间分辨荧光(HTRF)测定中所评估，与对照多肽相比(例如，未钉合野生型人BCL9HD2结构域)，本文所述的多肽在抑制BCL9与β-连环蛋白的结合方面可具有改善的生物学功能。在本文中，与对照多肽相比，本文所述的多肽可以具有改善的K_D值，或者本文所述的多肽可以在存在对照多肽的情况下与β-连环蛋白结合，表明与对照多肽相比，本文所述的多肽具有改善的抑制BCL9与β-连环蛋白的结合的能力。

在一些实施例中，用于评估本文所述多肽的生物学功能的测定提供了定量读数，并且与用媒剂对照多肽(例如，未钉合野生型人BCL9HD2结构域)观察到的读数相比，用所公开的多肽观察到的读数改变/改善了至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或更多。

各种测定在本领域已知用于测量生物活性/功能，其中几种在本文中被描述为非限制性实例，仅用作说明性目的。

1.BCL9与β-连环蛋白的结合

在一些实施例中，本文所述的多肽或变体在体外和/或体内抑制BCL9与β-连环蛋白的结合。在一些实施例中，本文公开的多肽或变体抑制Pygo和BCL9之间的相互作用或Pygo/BCL9/β-连环蛋白复合物的形成。在果蝇中发现Pygopus(Pygo)和Legless(Lgs)作为在正常发育期间对于犰狳(Armadillo)介导的转录必不可少的新的Wnt信号传送组分(Belenkaya等人，《发育(Development)》(2002)129(17)：4089-4101)。Pygo和BCL9/Legless通过促进正常细胞和恶性细胞中β-连环蛋白/犰狳的转录活性来转导Wnt信号。可以在本领域已知的各种测定中评估多肽抑制BCL9与β-连环蛋白的结合的能力。在一些实施例中，当在均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定中评估时，本文所述的多肽抑制了BCL9与β-连环蛋白的结合。在该测定中，多肽缀合至可识别与其靶蛋白(即，β-连环蛋白)连接的另一标签的标签。当多肽与靶蛋白结合并因此两个标签接近时，生成信号并且可以定量读取信号以计算多肽的结合亲和力。在一些实施例中，将该测定中多肽的结合亲和力与对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)的结合亲和力进行比较，以检测与对照多肽相比改善的结合亲和力，表明所述多肽可能比对照多肽更有效地抑制BCL9与β-连环蛋白的结合。所述测定可以在存在或不存在未标记对照多肽的情况下进行。所述测定还可以通过在存在或不存在本文所述的未标记多肽(例如，WX-024)的情况下标记对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)来进行。

在一些实施例中，当在放大发光接近均相测定(ALPHA)中评估时，本文所述的多肽抑制了BCL9与β-连环蛋白的结合。在该测定中，多肽与供体珠缀合并且其靶蛋白(即，β-连环蛋白)连接至受体珠。当由于多肽与靶蛋白的结合而使两个珠接近时，生成信号并且可以定量计算多肽的结合亲和力。在一些实施例中，将该测定中的多肽的结合亲和力与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)的结合亲和力进行比较，以检测与媒剂或对照多肽相比改善的结合亲和力，表明所述多肽可能比对照多肽更有效地抑制BCL9与β-连环蛋白的结合。所述测定可以在存在或不存在未缀合对照多肽的情况下进行。所述测定还可以通过在存在或不存在本文所述的未缀合多肽(例如，WX-024)的情况下缀合对照多肽来进行。

在各个实施例中，当在Wnt转录测定中评估时，本文所述的多肽抑制了BLC9与β-连环蛋白的结合。在一些实施例中，Wnt转录测定是基于细胞的测定。在一些实施例中，基于细胞的Wnt转录测定是β-内酰胺酶(bla)报告基因测定。在该测定中可以使用来源于健康受试者或患病受试者的各种细胞系、转化细胞系或原代细胞。也可使用已知依赖经典Wnt/β-连环蛋白信号传送以维持其存活的细胞系。在一些实施例中，在该报告基因测定中使用CellSensor^TM LEF/TCF-bla HCT-116细胞。这些细胞在稳定整合到HCT-116细胞中的β-连环蛋白/LEF/TCF响应元件的控制下包含β-内酰胺酶(BLA)报告基因。由于细胞组成型表达β-内酰胺酶，所以在该测定中加入抑制BCL9与β-连环蛋白的结合的多肽减少了β-内酰胺酶的产生。因此在该测定中可以定量计算多肽在抑制Wnt转录中的效率。在一些实施例中，如在β-内酰胺酶(bla)报告基因测定中所测量，本文所述的多肽抑制了Wnt转录，其指示多肽抑制BCL9与β-连环蛋白的结合的能力。在一些实施例中，在该测定中测试的多肽显示出与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)相比改善的在抑制Wnt转录中的IC₅₀，表明所公开的多肽可能比媒剂或对照多肽更有效地抑制BCL9与β-连环蛋白的结合。

在一些实施例中，当在细胞活力测定中评估时，本文所述的多肽抑制了BLC9与β-连环蛋白的结合。在一些实施例中，细胞活力测定是CellTiterGlo发光测定，其中定量测量细胞的活力。在该测定中可以使用来源于健康受试者或患病受试者的各种细胞系、转化细胞系或原代细胞。在一些实施例中，本文所述的多肽在该测定中比媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)更有效地抑制细胞生长，表明所公开的多肽可能比媒剂或对照多肽更有效地抑制BCL9与β-连环蛋白的结合。

2.经典Wnt/β-连环蛋白信号传送

在某些实施例中，本文所述的多肽可以抑制经典的Wnt/β-连环蛋白信号传送。可以在各种体外和/或体内测定中评估经典Wnt/β-连环蛋白信号传送。在一些实施例中，本文所述的多肽对经典Wnt/β-连环蛋白信号传送的作用在基于细胞的Wnt转录测定中进行评估，例如β-内酰胺酶(bla)报告基因测定。β-内酰胺酶(bla)报告基因测定通过其控制β-连环蛋白/LEF/TCF响应元件的能力来测量经典Wnt/β-连环蛋白信号传送的强度，并因此可以用来评估测试药剂是否可以减弱或增加其转录靶标的经典Wnt/β-连环蛋白信号传送控制的强度。在一些实施例中，如在β-内酰胺酶(bla)报告基因测定中所测量，本文所述的多肽抑制Wnt转录，表明所述多肽可抑制经典Wnt/β-连环蛋白信号传送。在一些实施例中，该测定中的多肽显示出与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)相比改善的在抑制Wnt转录中的IC₅₀，表明本文所述的多肽具有与媒剂或对照多肽相比改善的抑制经典Wnt/β-连环蛋白信号传送的能力。

本文所述的多肽抑制经典Wnt/β-连环蛋白信号传送的能力还可以通过测量由经典Wnt/β-连环蛋白信号传送转录控制的靶基因的基因表达和/或蛋白表达来评估。靶基因的表达可以在与本文所述多肽接触的转化细胞或被给予所述多肽的受试者中进行评估。靶基因包括例如c-myc、ccnd1、cd44、LGR5、VEGFA、轴抑制蛋白2和LEF1。可以使用本领域已知的方法(例如，细胞染色、流式细胞术，免疫印迹和/或实时定量PCR(rt-qPCR))来分析与经典Wnt/β-连环蛋白信号通路相关联的一种或多种靶基因的表达水平。在一些实施例中，本文所述的多肽降低了细胞中一种或多种靶基因的表达。在一些实施例中，本文所述的多肽比媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)更有效地降低一种或多种靶基因的表达。

3.调节性T细胞存活

在一些实施例中，本文所述的多肽减少调节性T细胞存活。在一些实施例中，当给予受试者时，所述多肽局部(例如，在肿瘤中)和/或全身性(例如，在血液中)减少调节性T细胞存活。在一些实施例中，当给予受试者时，与对照多肽相比，所述多肽减少调节性T细胞存活。已知各种标志物，例如CD4、FOXP3和CD25，在调节性T细胞上表达。本文公开的多肽减少调节性T细胞存活的能力可通过对在血液和/或特定组织(如肿瘤)中存在的调节性T细胞的总数进行计数来评估。例如，从与本文所述的多肽接触的受试者获得的样品可以用检测与调节性T细胞相关联的标志物的抗体染色。样品也可以用检测这些标志物的抗体加工和标记，并通过流式细胞术分析。这种标志物的基因和/或蛋白表达可以在样品中确定并通过例如免疫印迹和/或rt-qPCR分析。

在一些实施例中，当给予受试者时，本文所述的多肽减少血液和/或肿瘤中调节性T细胞的数量。在一些实施例中，所述多肽降低从被给予所述多肽的受试者获得的一个或多个样品中与调节性T细胞相关联的一种或多种标志物的表达。在一些实施例中，在体内评估时，所述多肽与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)相比进一步降低所述一种或多种标志物的表达。

4.VEGF在肿瘤中的表达

在某些实施例中，当给予携带肿瘤的受试者时，本文所述的多肽降低VEGF在肿瘤中的表达。可以使用各种测定来测量肿瘤样品中VEGF的基因表达和/或蛋白表达。例如，在受试者与多肽接触后，可收集肿瘤细胞并用抗VEGF抗体染色以检测VEGF蛋白。也可以通过例如rt-qPCR分析细胞以确定VEGF的基因表达。可以使用指示VEGF表达的改变的其他测定。例如，可以分析来自与本文所述的多肽接触的受试者的肿瘤样品以检测由VEGF控制的各种血管生成标志物。在一些实施例中，本文所述的多肽比媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)更有效地降低VEGF的表达。

5.CD4⁺和/或CD8⁺T细胞向肿瘤中的浸润

在一些实施例中，当给予携带肿瘤的受试者时，本文所述的多肽增加CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞向肿瘤中的浸润。CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞向肿瘤中的浸润可以通过对在肿瘤或来自肿瘤的样品(例如，活体组织)中存在的CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞的总数进行计数来评估。在一些实施例中，当给予携带肿瘤的受试者时，本文所述的多肽与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)相比更有效地增加了CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞向肿瘤中的浸润。已知各种标志物，例如CD4和CD45，在CD4⁺T细胞上表达，也称为辅助性T细胞。已知各种标志物，例如CD8和CD45，在CD8⁺T细胞上表达，也称为细胞毒性T细胞。通过向具有肿瘤的受试者给予多肽，可以体内评估多肽增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞向肿瘤中的浸润的能力。可从受试者收集肿瘤样品并用检测与CD4⁺/CD8⁺T细胞相关联的标志物的抗体染色。样品也可以用例如检测这些标志物的抗体加工和标记，并通过例如流式细胞术分析。这种标志物的基因和/或蛋白表达也可以在样品中确定并通过例如免疫印迹和/或rt-qPCR分析。在一些实施例中，与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)相比，本文所述多肽增加了肿瘤中CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞的总量。

在一些实施例中，当给予受试者时，本文所述的多肽增加血液中CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞的总数。CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞的全身性增加可能表明CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞同时向特定组织(例如，肿瘤)中浸润的增加。在一些实施例中，与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)相比，本文所述的多肽在体内增加了循环CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞的量。

6.辅助性T细胞向肿瘤中的浸润

在一些实施例中，当给予携带肿瘤的受试者时，本文所述的多肽增加辅助性T细胞17向肿瘤中的浸润。可以通过对肿瘤中存在的辅助性T细胞17的总数进行计数来评估辅助性T细胞17向肿瘤中的浸润。在一些实施例中，当给予携带肿瘤的受试者时，本文所述的多肽与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)相比增加了辅助性T细胞17向肿瘤中的浸润。已知各种标志物，例如IL-17在辅助性T细胞17上表达。通过向具有肿瘤的受试者给予多肽，可以体内评估多肽增加辅助性T细胞17向肿瘤中的浸润的能力。可从受试者收集肿瘤样品并用例如检测与辅助性T细胞17相关联的标志物的抗体染色。样品也可以用检测这些标志物的抗体加工和标记，并通过流式细胞术分析。这种标志物的基因和/或蛋白表达也可以在样品中测定并通过例如免疫印迹和/或rt-qPCR分析。可以分析样品以检测样品中存在的IL-17的量。

在一些实施例中，当给予受试者时，本文所述的多肽增加血液中辅助性T细胞17的总量。辅助性T细胞17的全身性增加可能表明辅助性T细胞17向特定组织(例如，肿瘤)中浸润的增加。可以通过测量从受试者收集的血液样品中存在的IL-17的量来评估辅助性T细胞17的全身性增加。在一些实施例中，与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)相比，所述多肽增加了循环辅助性T细胞17的量。在一些实施例中，与对照多肽相比，本文所述的多肽增加了受试者中循环IL-17的量。

7.肿瘤中的树突状细胞

在一些实施例中，当给予携带肿瘤的受试者时，本文所述的多肽调节在肿瘤中存在的树突状细胞。可以评估肿瘤中存在的树突状细胞的数量，例如通过用识别与树突状细胞相关联的一种或多种标志物的抗体对肿瘤染色。在一些实施例中，当给予携带肿瘤的受试者时，本文所述的多肽与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)相比更有效地减少了在肿瘤中存在的树突状细胞。在一些实施例中，当给予携带肿瘤的受试者时，本文所述的多肽与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)相比更有效地增加了在肿瘤中存在的树突状细胞。已知各种标志物，例如CD11c，在树突状细胞上表达。通过向受试者给予多肽，可以体内评估多肽减少肿瘤中的树突状细胞的能力。可以从受试者收集肿瘤样品并用检测与树突状细胞相关联的标志物的抗体染色。样品也可以用例如检测这些标志物的抗体加工和标记，并通过例如流式细胞术分析。这种标志物的基因和/或蛋白表达，并通过例如免疫印迹和rt-qPCR分析。

在一些实施例中，当给予受试者时，本文所述的多肽减少血液中树突状细胞的总量。在一些实施例中，当给予受试者时，本文所述的多肽增加血液中树突状细胞的总量。树突状细胞的全身性减少可能表明特定组织(例如，肿瘤)中的树突状细胞的量也减少。在一些实施例中，与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)相比，本文所述的多肽降低了受试者中循环树突状细胞的量。在一些实施例中，与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)相比，本文所述的多肽增加了受试者中循环树突状细胞的量。

8.受试者中的半衰期

在各个实施例中，与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)相比，本文所述的多肽具有一个或多个改善的药代动力学参数。这种药代动力学参数可以包括例如最大观察浓度(C_max)、达到最大浓度的时间(T_max)、终末半衰期(T_1/2)、总体清除率(CL)、分布体积(V_z)、从给药时间至最后可测量浓度的曲线下面积(AUC_0-t)、从给药时间外推至无穷大的曲线下面积(AUC_0-inf)和生物利用度。

用于评估药剂的药代动力学的方法是本领域已知的。例如，来自被给予本文所述多肽的受试者的血液样品可以在给药后5分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时获得。血液样品中多肽的浓度可以通过各种分析工具，例如LC/MS来分析。基于多肽在每个时间点的浓度，计算药代动力学参数。如本文所使用，术语“最大观察浓度(C_max)”是指多肽在给药后达到的最大血清浓度。与C_max的概念相关，达到最大浓度的时间(T_max)是多肽达到最大血清浓度所需的时间。术语“终末半衰期(T_1/2)”和“半衰期(T_1/2)”可互换使用，是指多肽失去其一半血清浓度所花费的时间。总体清除率(CL)表示每单位时间多肽的完全清除血液的体积。术语“分布体积(V_z)”是指包含以血液中观察到的相同浓度给予受试者的多肽的总量所需的理论计算体积。术语“生物利用度”是指药物被吸收进生命系统或在生理活性部位可用的程度和速率。生物利用度可以是前述特性(包括稳定性、溶解度、免疫原性和药代动力学)中的几个的函数，并且可以使用本领域技术人员已知的方法评估。

在一些实施例中，与对照多肽相比，本文所述的多肽在受试者中具有改善的半衰期。在一些实施例中，当给予受试者时，所述多肽具有大于至少0.5小时、1小时、2小时、3小时、5小时或8小时或之间的任何时间的半衰期。在一些实施例中，当给予受试者时，本文所述的多肽具有大于至少2小时的半衰期。可以在哺乳动物(包括例如小鼠、大鼠或人)中评估多肽的药代动力学参数。还可以使用各种给药途径(例如，静脉给药途径、腹腔给药途径、皮下给药途径和肌肉内给药途径)评估参数。在一些实施例中，本文所述的多肽的药代动力学参数在小鼠中评估。在一些实施例中，本文所述多肽的药代动力学参数在皮下给予多肽的小鼠中评估。在一些实施例中，本文所述多肽的药代动力学参数在人体内评估。在一些实施例中，本文所述多肽的药代动力学参数在皮下给药之后在人体内评估。

9.有利于免疫反应的肿瘤微环境

在各个实施例中，本文所述的多肽诱导有利于免疫反应的肿瘤微环境。在各个实施例中，本文所述的多肽诱导比媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)更有利于免疫反应的肿瘤微环境。

如本文所使用，术语“肿瘤微环境”是指肿瘤中和/或肿瘤周围的细胞微环境，包括聚集到肿瘤、血管、免疫细胞、信号传送分子和细胞外基质的各种细胞。参见例如Balkwill等人，《细胞学杂质(J Cell Sci)》(2012)125：5591-5596。本文所述的多肽可改变肿瘤中和/或肿瘤周围的免疫细胞和/或信号传送分子的组成，从而引发肿瘤周围微环境中的免疫反应。

可以使用各种参数来评估肿瘤微环境。例如，肿瘤组织中和/或肿瘤组织周围细胞毒性T细胞和调节性T细胞之间的比例增加可能表明肿瘤微环境有利于免疫反应。肿瘤组织中和/或肿瘤组织周围的树突状细胞和/或调节性T细胞数量减少也可能表明肿瘤微环境有利于免疫反应。其他参数包括外周血中的循环T细胞增加以及肿瘤组织中和/或肿瘤周围的辅助性T细胞17和调节性T细胞之间的比例增加。这些参数可能表明肿瘤微环境有利于免疫反应。

在一些实施例中，本文所述的多肽可增加肿瘤微环境中细胞毒性T细胞的量与调节性T细胞的量之间的比例。在一些实施例中，由多肽引起的比例变化大于由媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)引起的比例变化。

在一些实施例中，本文所述的多肽可以增加肿瘤微环境中辅助性T细胞17与调节性T细胞之间的比例。在某些实施例中，由多肽引起的比例变化大于由媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)引起的比例变化。

10.肿瘤生长、癌症干细胞增殖和/或肿瘤转移

由于Wnt信号传送是肿瘤生长调节因子，因此可以在动物模型中评估影响BCL9与β-连环蛋白的结合的治疗的疗效，例如本文所述的BCL9肽的HD2结构域的稳定化肽。

可以使用例如BALB/c裸小鼠在人癌模型中评估稳定化BCL9肽的体内疗效，因为人癌细胞的异种移植物将在这些小鼠中生长成肿瘤。例如，可以通过使用Colo320DM肿瘤细胞(市售的来源于人结肠癌组织的细胞系)皮下接种以在BALB/c裸小鼠中形成肿瘤。其他体内模型也可用于评估本文公开的多肽的体内疗效。例如，可将人DLD-1结肠癌细胞植入裸小鼠以评估肿瘤生长。结肠癌的CT26同品系小鼠模型也可以使用，因为它允许评估完整免疫系统背景下的肿瘤生长。其他类型的癌细胞，例如B16黑素瘤、4T1乳腺癌、Renca肾癌和Lewis肺癌细胞也可以用于这些已知的动物模型中以评估本文公开的多肽的体内疗效。

通过向一种或多种动物模型给予本文所述的多肽，可以评估多肽在体内降低肿瘤生长的作用。在一些实施例中，所述多肽比媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)更有效地在体内抑制肿瘤生长。在一些实施例中，被给予本文所述多肽的受试者的肿瘤质量/体积比被给予对照多肽的受试者小至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。根据使用稳定化BCL9肽的治疗的动物数据，所述肽抑制Wnt信号传送的能力可以通过例如用Wnt信号传送标志物对组织样品染色来评估。这些Wnt信号传送的下游标志物包括例如轴抑制蛋白2和CD44。

原位小鼠模型可用于评估本文所述多肽对肿瘤转移的作用。例如，可以将原位动物模型注射携带荧光素酶构建体的细胞，然后给予其指定的治疗。注射细胞的存在可以通过向每只经治疗的动物给予荧光素底物来检测。生物发光信号的强度可以定量测量并用作细胞生长的指标。在一些实施例中，当在原位小鼠模型中评估时，本文所述的多肽比对照多肽更有效地抑制肿瘤转移。在一些实施例中，与媒剂或对照多肽(例如，未钉合野生型HD2结构域人BCL9)相比，所述多肽使原位小鼠模型中的肿瘤生长减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。

在一些实施例中，本文所述的多肽对癌症干细胞增殖的作用可以通过测量各种癌症干细胞的生物标志物来评估。例如，CD44和/或LGR5的表达水平可以指示样品中存在的癌症干细胞的量。可以从受试者收集肿瘤样品并用检测与癌症干细胞相关联的标志物的抗体染色。样品也可以用例如检测这些标志物的抗体加工和标记，并通过例如流式细胞术分析。这种标志物的基因和/或蛋白表达可以通过例如免疫印迹和rt-qPCR来检测和分析。在一些实施例中，当给予携带肿瘤的受试者时，本文所述的多肽降低CD44和/或LGR5在肿瘤中的表达水平。在一些实施例中，本文所述的多肽比媒剂或对照多肽(例如，人BCL9蛋白的未钉合野生型HD2结构域)更有效地降低CD44和/或LGR5的表达水平。

D.用稳定化BCL9肽治疗的方法

1.具有异常Wnt/β-连环蛋白信号传送的疾病

异常Wnt/β-连环蛋白信号传送与正常细胞恶性转化为癌细胞有关(参见Thakur2013)。Wnt信号传送和β-连环蛋白核定位的激活已经与多种模型中的肿瘤表型相关联。

本公开涵盖供使用的组合物和通过将多肽或包含所述多肽的药物组合物给予受试者而使用本文公开的钉合多肽以抑制BCL9与β-连环蛋白的结合的方法。本公开还涵盖通过给予本文公开的多肽或药物组合物来抑制受试者的经典Wnt/β-连环蛋白信号传送。本公开进一步涵盖通过向受试者给予本文所述的多肽或药物组合物来治疗受试者的疾病的方法。所述疾病可能是与异常经典Wnt/β-连环蛋白信号传送相关联的癌症或其他肿瘤性疾病。

如本文所使用，“患者”和“受试者”可互换地指在有发展成疾病、病症或病状或具有或患有疾病、病症或病状的风险的情况下针对所述疾病、病症或病状而治疗或评估的动物，例如哺乳动物或人类。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是人。

在一些实施例中，此类疾病、病症或病状可以是与异常经典Wnt/β-连环蛋白信号传送相关联的疾病，和/或可受益于抑制经典Wnt/β-连环蛋白信号传送。在一些实施例中，此类疾病、病症或病状是癌症。在一些实施例中，癌症是BCL9和/或β-连环蛋白高度表达的癌症。在一些实施例中，癌症是其中BCL9和β-连环蛋白共定位于癌细胞的细胞核中的癌症。在一些实施例中，癌症选自：家族性腺瘤性息肉病(FAP)、眼癌、直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、口腔癌、良性和恶性肿瘤、胃癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、子宫体癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肾癌、脑/CNS癌、喉癌、多发性骨髓瘤、皮肤黑素瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、尤因氏肉瘤、卡波西肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌、小细胞肺癌、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、血管内皮瘤、维尔姆斯瘤、成神经细胞瘤、口咽癌、食管癌、喉癌、淋巴瘤、神经纤维瘤病、结节性硬化症、血管瘤、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌和淋巴管生成。在一些实施例中，癌症是结肠直肠癌。在一些实施例中，癌症是胃癌。在一些实施例中，癌症是卵巢癌。在一些实施例中，癌症是肝细胞癌。在一些实施例中，癌症是乳腺癌。在一些实施例中，癌症是前列腺癌。在一些实施例中，癌症是皮肤黑素瘤。在一些实施例中，癌症是肺癌。

在一些实施例中，本文公开的任何多肽或变体或包含此类多肽的药物组合物可用于治疗上文列出的疾病，例如癌症。在一些实施例中，多肽或变体是WX-024。在一些实施例中，多肽或变体是WX-035。

在一些实施例中，在给予一个或多个剂量的本文所述的多肽或包含多肽的药物组合物之后，受试者的肿瘤体积与用媒剂或未缀合肽治疗的受试者相比减小超过10％、20％、30％、40％或50％(或之间的任何百分比)。在某些实施例中，在给药1周、2周、3周或更多周(或之间的任何时间)之后实现减小。在一些实施例中，在给药2周之后，受试者的肿瘤体积与用媒剂或未缀合肽治疗的受试者相比减小超过50％。本领域技术人员可以确定用于给予受试者的药物组合物的合适剂量和/或剂型，因为各种给药方法所需的材料和技术是本领域可用且已知的。参见例如《肽和蛋白质的制备和递送(Formulation and delivery ofpeptides and proteins)》，第1版，Washington，ACS，pp.22-45和《肽和蛋白质药物递送(Peptide and protein drug delivery)》，第1版，New York，Marcel Dekker，Inc.，pp.247-301。在一些实施例中，在给药2周之后，被给予WX-024或包含所述多肽的药物组合物的受试者的肿瘤体积与用媒剂或未钉合多肽治疗的受试者相比减小超过50％。在一些实施例中，在给药2周之后，被给予WX-035或包含所述多肽的药物组合物的受试者的肿瘤体积与用媒剂或未钉合多肽治疗的受试者相比减小超过10％-50％。

在各个实施例中，术语“治疗”包括改变受试者或细胞的当前进程的对受试者(例如，哺乳动物，诸如人)或细胞的治疗。治疗包括改变一种或多种疾病参数，例如减小肿瘤体积或本领域技术人员已知的任何其他肿瘤学测量。治疗包括例如给予本文所述的多肽或包含所述多肽的药物组合物，并且可以预防性地或在引发病理性事件或与病原体接触之后进行。还包括“预防性”治疗，其可以涉及降低所治疗的疾病或病症的进展速度，延迟疾病或病症的发作，或者降低其发作的严重性。“治疗”或“预防”并不一定表示疾病或病症或相关症状的完全根除、治愈或预防。在各个实施例中，术语“治疗”可包括缓解、减缓或逆转患癌受试者的病理过程或症状。在一些实施例中，术语“治疗”可以包括降低患癌受试者的肿瘤负荷。在一些实施例中，术语“治疗”可以包括改善癌症的至少一种症状或可测量参数。对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以使用生物学和/或生理学参数来获取恶性疾病的病理过程。

可以在多肽或药物组合物单独给药或与一种或多种另外的治疗剂组合给药(例如，单次大剂量给药或间隔顺序给药)之后评估治疗和测量的治疗参数。另外的药剂可以是本文提及的或本领域技术人员已知的任何其他治疗剂。取决于所选择的方案，所述多肽、包含所述多肽的药物组合物和/或所述另外的药剂可以被给予一次或多次。

本公开还涵盖用于治疗受试者中的疾病的本文公开的多肽或药物组合物。在一些实施例中，疾病可受益于抑制经典Wnt/β-连环蛋白信号传送。在一些实施例中，所述疾病是癌症。

本公开进一步涵盖本文公开的多肽或药物组合物在制备用于治疗受试者中的疾病的药物中的用途。在一些实施例中，疾病可受益于抑制经典Wnt/β-连环蛋白信号传送。在一些实施例中，所述疾病是癌症。

在另一个实施例中，所治疗的疾病不是癌症。在某些实施例中，所述疾病是骨密度缺陷、眼睛血管缺陷、家族性渗出性玻璃体视网膜病变、早发冠心病、阿尔茨海默病、常染色体显性少牙畸形、视网膜血管生成、成骨不全、先天性四肢切断综合症、缪勒氏管退化及男性化、SERKAL综合征、II型糖尿病、Fuhrmann综合征、牙-指甲-皮肤发育不良、肥胖、手/足畸形、尾侧重复、牙发育不全、骨骼发育不良、局灶性皮肤发育不全、常染色体隐性甲缺、神经管缺陷或硬化性骨化病和Van Buchem病。

2.稳定化BCL9肽的给药

由于非交联(即，野生型)肽通常在体内非常迅速地代谢，所以当给予受试者时，肽稳定化可以改善这些肽的药代动力学特性。如本文所使用，术语“给药”或“给予”包括通过局部给药或全身性给药将本文所述多肽递送至受试者。可以通过局部(包括眼内和粘膜，包括阴道和直肠递送)、肺部(例如，通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过雾化器、气管内、鼻内)、表皮、透皮、口服或肠胃外给药。肠胃外给药包括静脉、皮下、腹腔或肌肉内注射或输注；或颅内，例如鞘内或心室内给药。也可考虑给药途径的组合。钉合肽可以以治疗有效量给予。

在一些实施例中，本文所述的多肽或药物组合物是静脉给药的。在一些实施例中，本文所述的多肽或药物组合物是腹腔给药的。在一些实施例中，本文所述的多肽或药物组合物每日、每周、每月或以可用于治疗受试者中的疾病的任何合适的间隔给予。

在一些实施例中，稳定化肽的给予抑制受试者中的Wnt信号传送。在一些实施例中，稳定化BCL9肽的给予抑制BCL9与β-连环蛋白的结合。在一些实施例中，稳定化BCL9肽的给予抑制经典Wnt/β-连环蛋白信号传送。在一些实施例中，稳定化BCL9肽的给予治疗受试者中的疾病。

3.使用稳定化BCL9肽的联合疗法

在某些实施例中，本文公开的多肽或药物组合物与至少一种另外的药剂一起给予。在一些实施例中，所述至少一种另外的药剂选自检查点抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、VEGFR抑制剂、抗癌药物。另外的药剂可以在与钉合肽相同的药物组合物中给予，或者它们可以顺序给予。钉合肽和另外的药剂可以以治疗有效量给予。

在某些实施例中，另外的药剂是检查点抑制剂。检查点抑制剂(例如，检查点阻断抗体)阻断T细胞免疫的正常负调节因子，从而增加免疫系统在一些患者中控制癌症的能力(参见Kyi和Postow，《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)》588：368-376(2013))。在某些实施例中，与本文所述的多肽或药物组合物一起给予的检查点抑制剂抑制PD1、PDL-1和/或CTLA-4。在一个实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA4抗体。在某些实施例中，检查点抑制剂是检查点阻断抗体，例如伊匹单抗、纳武单抗或MK-3475。在一个实施例中，检查点抑制剂靶向刺激检查点分子，例如CD27、CD40、OX40、GITR或CD138。在又一个实施例中，检查点抑制剂靶向抑制性检查点分子，例如A2AR、B7-H3、B7-H4、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM-3)、VISTA(C10orf54)或T细胞活化的V结构域Ig抑制子。

表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂在非小细胞肺癌以及其他类型的癌症，特别是在EGFR或ALK(间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶)基因突变的患者中，显示出疗效。在某些实施例中，与本文所述的多肽或药物组合物一起给予的另外的治疗剂是EGFR抑制剂。在某些实施例中，EGFR抑制剂是厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、帕尼单抗、凡德他尼或西妥昔单抗。在某些实施例中，将本文所述的多肽或药物组合物与EGFR抑制剂一起给予已经确定在EGFR或ALK基因中具有分子异常的患者。

在一个实施例中，VEGF和/或VEGFR抑制剂作为第二药剂给予。在一些实施例中，VEGF和/或VEGFR抑制剂是帕唑帕尼、贝伐单抗、索拉非尼、舒尼替尼、阿西替尼、普纳替尼、瑞格非尼、凡德他尼、卡博替尼、雷莫芦单抗、乐伐替尼或阿柏西普中的一种或多种。

在一些实施例中，抗癌药物作为第二药剂给予。在一些实施例中，抗癌药物选自以下中的一种或多种：环磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、多柔比星、氮芥、长春新碱、甲基苄肼、泼尼松龙、达卡巴嗪、博来霉素、依托泊苷、顺铂、表柔比星、卡培他滨、亚叶酸、放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、硼替佐米、卡铂、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊立替康、二氯甲基二乙胺、巯嘌呤、米托蒽醌、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、戊柔比星、长春碱、长春地辛、长春瑞滨和奥沙利铂。

在某些实施例中，被给予本文公开的多肽或药物组合物的受试者还在给予多肽或药物组合物之前、之后或同时用放射疗法和/或化学疗法治疗。还考虑了使用本文公开的其他药剂的进一步联合疗法。

4.生物标志物

本公开还涵盖测量至少一种生物标志物以监测本文所述的多肽或药物组合物的治疗功效或选择用这种多肽或药物组合物治疗的受试者的方法。在一些实施例中，生物标志物是BCL9、CD44、轴抑制蛋白2、cMyc、LGR5、VEGFA、Sox2、Oct4、Nanog和/或活性β-连环蛋白中的一种或多种。如本文所使用，活性β-连环蛋白是指非磷酸化形式的β-连环蛋白。

可以使用各种已知的方法来测量此类生物标志物的基因表达水平和/或蛋白水平。例如，可以获得来自用多肽或药物组合物治疗的受试者的样品，例如肿瘤活体组织、血液、血浆、血清、尿、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结或脾脏。在一些实施例中，样品是受试者中的肿瘤活体组织。从受试者获得的样品可以用检测这些生物标志物的一种或多种抗体或其他检测剂染色。还可以或可选地加工样品以经由例如rt-qPCR方法检测编码生物标志物的核酸(例如，mRNA)的存在。

在一些实施例中，降低的BCL9、CD44、轴抑制蛋白2、cMyc、LGR5、VEGFA、Sox2、Oct4、Nanog和/或活性β-连环蛋白的基因表达水平和/或蛋白水平指示本文所述的多肽或药物组合物的治疗功效。此类生物标志物的表达水平可以在例如给予多肽或药物组合物1天、2天、3天、4天、5天、1周或2周或之间的任何时间之后测量。在一些实施例中，公开了一种方法，其包括在一轮或多轮给予本文所述的多肽或药物组合物后测量一种或多种生物标志物的水平。在一些实施例中，所述方法进一步包括：如果生物标志物水平降低，则继续给予多肽或药物组合物。在一些实施例中，所述方法进一步包括：如果生物标志物水平未降低，则给予增加剂量的本文所述的多肽或药物组合物，或增加后续给药的频率。在一些实施例中，如果生物标志物水平在初次给药后没有降低，则停止治疗。在各个实施例中，还在第一次给予本文所述的多肽或药物组合物之前测量生物标志物水平，并且与一轮或多轮给药后的水平相比较，其中基于生物标志物水平相较于给药前水平的变化来确定疗效和继续的治疗步骤。

在一些实施例中，与不具有增加的基因表达水平和/或蛋白水平的受试者相比，增加的BCL9、CD44、轴抑制蛋白2、cMyc、LGR5、VEGFA、Sox2、Oct4、Nanog和/或活性β-连环蛋白的基因表达水平和/或蛋白水平表明受试者将受益于使用本文所述多肽或药物组合物的治疗。在一些实施例中，公开了治疗方法，包括选择具有增加的生物标志物水平的患者和给予本文所述的多肽或药物组合物。

在某些实施例中，为使用本文所述多肽或药物组合物的治疗选择具有升高的BCL9、CD44、轴抑制蛋白2、cMyc、LGR5、VEGFA、Sox2、Oct4、Nanog和/或活性β-连环蛋白的基因和/或蛋白表达水平的受试者。在一些实施例中，在从受试者获得肿瘤样品并标识出升高的BCL9、CD44、轴抑制蛋白2、cMyc、LGR5、VEGFA、Sox2、Oct4、Nanog和/或活性β-连环蛋白的基因和/或蛋白表达之后，选择该患有肿瘤的受试者进行治疗。在一些实施例中，在从受试者获得肿瘤样品并标识出升高的BCL9的基因和/或蛋白水平之后，选择该患有肿瘤的受试者进行治疗。在一些实施例中，在从受试者获得肿瘤样品并标识出升高的CD44基因和/或蛋白水平之后，选择该患有肿瘤的受试者进行治疗。在一些实施例中，在从受试者获得肿瘤样品并标识出升高的活性β-连环蛋白的基因和/或蛋白水平之后，选择该患有肿瘤的受试者进行治疗。

5.剂量

可以调整剂量方案以提供最佳的期望响应(例如，治疗性或预防性响应)。例如，可以施用单次大剂量，可以随时间推移给予几次分剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度指示按比例减少或增加剂量。特别有利的是，以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便制剂的给予和均匀性。

术语“剂量单位形式”是指适合作为待治疗的哺乳动物受试者的单位剂量的物理离散单元；每个单位包含预定量的活性化合物，所述预定量的活性化合物经计算可与所需的药物载体组合产生期望的治疗效果。本文提供的剂量单位形式的规格取决于并且直接依赖于(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗或预防效果，以及(b)化合物配制技术(例如，配制用于治疗个体敏感的活性化合物)中的固有限制。本文提供的治疗或预防有效量的结合蛋白的示例性非限制性范围是0.1-20mg/kg，例如1-10mg/kg。值得注意的是，剂量值可能随待缓解病症的类型和严重程度而变化。应当进一步理解，对于任何特定受试者，可以根据个体需要和给予组合物或监督组合物给予的人员的专业判断随时间调整具体的剂量方案，并且本文阐述的剂量范围仅是示例性的且并不旨在限制所要求保护的组合物的范围或实践。

6.试剂盒

本文还公开了用于执行本文所述方法的试剂盒。在各个实施例中，提供了一种用于制备本文所述多肽的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包含能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂的多肽。在一些实施例中，试剂盒包含用于进行金属介导的闭环烯烃复分解的金属催化剂。

在各个实施例中，还提供了一种用于治疗受试者疾病的试剂盒。在一些实施例中，所述试剂盒用于治疗受试者中的癌症。在一些实施例中，试剂盒包含本文公开的多肽或药物组合物。在一些实施例中，试剂盒中的多肽能够经历来反应以形成一种或多种烃交联剂。在一些实施例中，试剂盒中的多肽具有一种或多种烃交联剂。在一些实施例中，试剂盒进一步包含至少一种可以给予受试者的其他药剂。

在各个实施例中，提供了一种用于检测和/或治疗具有肿瘤的受试者的试剂盒，其显示出受试者中升高的BCL9、CD44、轴抑制蛋白2、cMyc、LGR5、VEGFA、Sox2、Oct4、Nanog和/或活性β连环蛋白的基因和/或蛋白表达。在一些实施例中，试剂盒包含用于检测BCL9、CD44、轴抑制蛋白2、cMyc、LGR5、VEGFA、Sox2、Oct4、Nanog和/或活性β-连环蛋白的基因和/或蛋白表达的药剂。在一些实施例中，试剂盒进一步包含本文公开的多肽或药物组合物。在一些实施例中，试剂盒中的多肽能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂。在一些实施例中，试剂盒中的多肽具有一种或多种烃交联剂。在一些实施例中，试剂盒进一步包含至少一种可以给予受试者的其他药剂。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

冠词“一(a/an)”是指一个或多于一个(即，至少一个)的冠词的语法对象。例如，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。

除非上下文另有明确说明，否则术语“或”是指术语“和/或”，与术语“和/或”可互换使用。在本申请中，除非另有特别说明，否则单数的使用包括复数。此外，术语“包括(including)”以及其他形式(诸如“includes”和“included”)的使用不是限制性的。本文中所描述的任何范围将被理解为包括端点和端点之间的所有值。

就本公开或权利要求中使用的术语“包含(contain)”、“包括(include)”、“具有(have)”或此类术语的语法变体而言，此类术语以与术语“包含(comprising)”类似的方式为包括性的，如包含(comprising)在用作权利要求中的过渡词时所解释。术语“包括(including)”或其语法变体是指短语“包括但不限于”，与短语“包括但不限于”可互换使用。

术语“约”是指相较于参照数目、水平、数值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化了多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数目、水平、数值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展在所述数值之上和之下的边界来修改该范围。一般而言，术语“约”旨在以≤10％的方差修改数值以高于和低于所述值。

对于本领域技术人员来说显然的是，本文描述的方法的其它合适的修改和改变是显而易见的，并且可以使用合适的等同来做出而不背离本文公开的实施例的范围。现在已经详细描述了某些实施例，通过参考以下实例将更清楚地理解这些实施例，这些实例仅仅是为了说明的目的而被包括，而不旨在为限制性的。

实例

实例1.稳定化BCL9肽的生成

使用修饰的Ala残基(α,α-二取代氨基酸，例如α-甲基,α-烯基氨基酸)合成烃交联剂的方法是本领域已知的。参见例如US20140113857和Kim 2011。在以下实例中使用的每种稳定化肽通过一种树脂上合成方法生成。在树脂上进行肽延伸以生成每种多肽，然后进行闭环复分解。

具有不同长度的烃交联剂，如8-碳交联剂和11-碳交联剂，可以使用具有合适长度的烯基链的α-甲基,α-烯基氨基酸生成。例如，将(S)2-(4'戊烯基)Ala掺入多肽以构建具有两端具有S-构型的8-碳交联剂的稳定化多肽。将(R)2-(4'-戊烯基)Ala掺入多肽以构建具有两端具有R-构型的8-碳交联剂的稳定化多肽。对于具有在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型的8-碳交联剂的稳定化多肽，分别使用(S)2-(4'-戊烯基)Ala和(R)2-(4'-戊烯基)Ala。为了构建具有在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型的11-碳交联剂的稳定化多肽，分别使用(R)2-(7'-辛烯基)Ala和(S)2-(4'-戊烯基)Ala。

使用标准高效液相色谱(HPLC)方案纯化每种多肽。使用Zorbax C18反相柱，9.4×250mm(Agilent，孔径粒径3.5μm)。所用溶剂为A：水，0.1％(体积/体积)TFA；B：乙腈，0.1％(体积/体积)TFA。流速为4ml/min。30分钟内梯度为10-100％(体积/体积)B；5分钟内100％B；4分钟内100-10％(体积/体积)B；1分钟内10％(体积/体积)B。进样体积为100-400μl。波长(nm)为280(对于含Fmoc-，Trp-或Tyr的肽)或220(对于其他)。

实例2.BCL9的HD2结构域的功能结构域的定位

由于Wnt信号通路影响癌症和其他疾病中的信号传送，所以研究了包含BCL9肽的HD2结构域的稳定化肽。BLAST搜索表明人BCL9蛋白的HD2结构域是独特的，因此来源于该结构域的肽应该对抑制BCL9的作用具有特异性。

为了进一步标识结合至β-连环蛋白的BCL9蛋白的HD2结构域的核心功能结构域，以一系列三个步骤进行多重铅优化研究：(i)人BCL9蛋白的全长HD2结构域的结构域定位；(ii)潜在核心功能结构域内的点突变；和(iii)末端修饰和钉合位点优化。开发了两种用于检测多肽与β-连环蛋白之间的结合的生物化学测定。第一种测定是均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定(Cisco)，其中生物素化多肽与链霉抗生物素蛋白-XL655荧光缀合，并且β-连环蛋白的组氨酸标签与Eu-标记的单克隆抗体(mAb)缀合。第二种测定是放大发光接近均相测定(ALPHA)筛选测定(Perkin Elmer)，其中生物素化多肽与链霉抗生物素蛋白包被供体珠缀合，并且β-连环蛋白通过抗-β-连环蛋白抗体与蛋白A包被受体珠缀合。在该结合测定中，使用PEG连接基团将生物素化肽缀合至珠，从而为BCL9源多肽结合至β-连环蛋白提供更多空间。如在ALPHA筛选测定中所评估，人BCL9蛋白的全长HD2结构域与β-连环蛋白的K_D是20nM，具有180倍信背比，从而产生了相比于其他已知的结合亲和力检测方法的显著改善。参见例如Zhang等人，《分析生物化学(Analytical Biochemistry)》469：43-53(2015)和Kawamoto等人，《生物化学(Biochemistry)》48(40)：9534-9541(2009)。

通过构建跨越人BCL9的HD2结构域的二十个重叠的钉合多肽(7或8聚体)来进行结构域定位。具有8-20个氨基酸长度的多肽通常用作蛋白质相互作用的抑制剂，因为它们具有低成本的附加优点。如图2A所示，该过程涉及小稳定化多肽的生成和使用HD2结构域的选定氨基酸的点突变来验证HD2结构域的最小功能结构域。由于七个氨基酸是形成单个i,i+4钉(staple)的最短序列，因此用人BCL9蛋白的氨基酸351至374生成具有七或八个氨基酸长度的连续稳定化肽。下面的表2总结了为结构域定位生成的每种多肽，并表明哪些氨基酸残基被(S)2-(4'戊烯基)Ala取代以进一步生成8-碳交联剂。表2中的Xaa₁和Xaa₂表示(S)2-(4'戊烯基)Ala。根据实例1构建表2中列出的每种多肽并使其交联。所有多肽具有在两端具有S-构型的8-碳交联剂(-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-)。每种多肽的N末端用乙酰基修饰，而多肽的C末端用NH₂基修饰。表2中的B表示正亮氨酸。

表2.为结构域定位生成的多肽

如图2B所示，在细胞活力测定中同时测试表2中列出的所有稳定化多肽。选择Colo320DM细胞用于此测定，因为此特定细胞系的增殖依赖于BCL9和β-连环蛋白。使用已知的Wnt/β-连环蛋白小分子抑制剂ICG001作为阳性对照。根据制造商的方案，使用CellTiterGlo发光细胞活力测定(Promega)分析每种治疗条件下的细胞活力。

如图2B所示，ICG001能够以剂量依赖性方式诱导细胞死亡。包含HD2结构域的远端部分的WX-020在抑制细胞生长方面也是有效的，与ICG001相当。该测定中WX-020的IC₅₀值为12.4μM。WX-020(包含LRDIQRBL)的作用优于WX-018(包含RDIQRBL)，其在N末端不具有Leu，这表明与β-连环蛋白结合的核心功能结构域涉及WX-020包含的8个氨基酸残基的拉伸。此外，WX-020的这种提高的效力表明来源于HD2结构域的远端部分的短稳定化多肽足以保留结合β-连环蛋白的能力并因此阻断BCL9和β-连环蛋白之间的相互作用。如实例4.1中所述，还使用β-内酰胺酶(bla)报告基因测定(invitrogen)在基于细胞的Wnt转录抑制测定中测试多肽。在该测定中，选择HCT116细胞是因为已知细胞由于存在β-连环蛋白突变而具有异常Wnt信号传送激活。与来自细胞活力测定的结果相一致，WX-020是抑制Wnt转录的最有效的多肽(图2C)。

此外，如图3所示，当在相同的细胞活力测定中测试时，WX-020的作用超过全长HD2结构域(WX-001；“SAH-BCL9#1”)的作用，表明并非所有包含核心功能结构域的多肽对于阻断BCL9和β-连环蛋白之间的相互作用同等有效，取决于其他序列元件或链修饰的存在。还在如上所述的ALPHA筛选中测试WX-020，并显示K_D值为80nM。按照实例4.1中描述的程序在Wnt转录测定中测试WX-020，并显示IC₅₀值为1580nM。

改变HD2结构域的远端部分的氨基酸的点突变也降低了稳定化肽的疗效，表明HD2结构域的远端区域包含涉及与β-连环蛋白的结合的BCL9基序。特别是，WX多肽的结构活性关系(SAR)评估表明WX多肽上的疏水性氨基酸介导与β-连环蛋白的结合。

实例3.包含核心功能结构域的稳定化多肽

生成了具有不同氨基酸长度的其他四个钉合多肽，其包含实例2中标识的核心功能结构域。通过加入已知的肽标签或末端修饰以改进渗透性和溶解度，例如Ant8、TAT、(βAla)-(βAla)，以进一步修饰所述钉合多肽。使用实例1中列出的标准肽合成方案(表3；也参见表1)生成对应于SEQ ID NO:XX-XX的其他四个稳定化多肽。也参见Kim2011。例如，为了构建如图1A所示的WX-024，使用钌介导的闭环烯烃复分解，在SEQ ID NO:X的两个Xaa氨基酸之间生成烃交联剂。在闭环复分解之后，多肽被去保护并释放。所得到的稳定化多肽包含两端具有S-构型的-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-烃交联剂。WX-024在N末端包含乙酰基，在C末端包含2-萘基丙氨酸。C末端的2-萘基丙氨酸的羧基用NH₂进一步修饰。WX-021、WX-022和WX-023与WX-020具有相同的序列，但在C末端用不同的化学部分修饰(分别在C末端用NH₂修饰2-萘基丙氨酸和两个β-丙氨酸单元，在C末端用NH₂修饰两个β-丙氨酸单元以及在C末端用NH₂修饰2-萘基丙氨酸)。所有多肽根据实例1中描述的方案进一步纯化。

表3总结了包含核心功能结构域的四种多肽，并表明哪些氨基酸残基被(S)2-(4'戊烯基)Ala取代以进一步生成8-碳交联剂(Xaa₁和Xaa₂＝(S)2-(4'戊烯基)Ala。

表3.来源于BCL9蛋白的HD结构域的其他稳定化多肽

在CellTiterGlo发光细胞活力测定(Promega)中测试其他多肽。在该测定中使用ICG001作为阳性对照。如图4A所示，尽管包括WX-020的所有测试多肽都能够以剂量依赖性方式抑制细胞生长，但WX-024(和WX-021)在该测定中特别有效。特别是，与WX-020相比，该测定法中WX-024的IC₅₀值得到很大改善，表明包含核心功能结构域的WX-024与其他包含相同核酸功能结构域的多肽相比在抑制细胞活力和Wnt转录方面特别有效。

用WX-024与ChemPartner合作进行了一些关于溶解度、稳定性和盐选择的初步研究。如图4B所示，WX-024的乙酸盐形式在基于细胞的Wnt转录抑制测定中测试，并有效抑制Wnt转录(IC₅₀＝292nM)。类似地，图4C示出了盐酸盐在相同测定中也有效抑制Wnt转录(IC₅₀＝313nM)。WX-024以1mg/mL溶于水、DMSO和PBS中，并且WX-024的三氟乙酸盐形式在2-8℃和在室温下稳定至少一个月。此外，WX-024的盐形式在各种体外细胞活力测定中有活性。

实例4.稳定化多肽的体外特性

已知BCL9与β-连环蛋白的结合激活Wnt信号传送。因为Wnt/β-连环蛋白活性调节大范围的细胞信号，所以可以使用多种测定来测量该通路的活性。WX-021和WX-024在多种细胞测定中评估以评估其体外调节Wnt/β-连环蛋白信号传送的能力。

实例4.1.稳定化多肽的细胞活性

通过β-内酰胺酶(bla)报告基因测定(invitrogen)测量WX-021和WX-024的细胞活性。使用ICG001作为比较。GeneBLAzer使用CellSensor^TM LEF/TCF-blaHCT-116细胞，所述细胞在稳定整合到HCT-116细胞中的β-连环蛋白/LEF/TCF响应元件的控制下包含β-内酰胺酶(BLA)报告基因，如图5A。这些细胞组成型表达β-内酰胺酶，可用于检测Wnt/β-连环蛋白信号通路的激动剂和拮抗剂。GeneBLAzer测定提供了一种比例式报告基因响应，涉及刺激和未刺激细胞的双色(蓝色/绿色)读数。

将LEF/TCF-bla HCT-116细胞置于透明底板上的测定培养基(Invitrogen)中并在37℃温育过夜。然后用媒剂对照(0.05％DMSO水溶液)或一定剂量的WX-021、WX-024或ICG001(多至10μM)治疗细胞，持续5小时。接下来用Wnt激动剂mWnt3a(在GeneBLAzer试剂盒中提供)将细胞在37℃温育5小时。将底物混合物(包含使用β-内酰胺酶FRET底物CCF4-AM的LiveBLAzer^TM B/G底物)加入到孔中，并将平板在室温下避光温育2.5小时。使用黑色壁、透明底的384孔板(Corning Costar)，并用Spectramax M2进行扫描。首先用激发滤光片409/20nm和发射滤光片460/40nm扫描平板(蓝色通道中扫描1)。然后用激发滤光片409/20nm和发射滤光片530/30nm扫描平板(在绿色通道中扫描2)。获得460nm和530nm的荧光发射值，并且使用460/530比率的抑制来使用制造商(Life Technologies)的数据分析方案确定WX-024对Wnt/β-连环蛋白信号传送的抑制百分比(抑制％)。

如图5B-5D所示，与ICG001相比，递增浓度的WX-021和WX-024在该报道分子测定中产生更大的Wnt信号传送抑制。由该测定计算的WX-021和WX-024的IC₅₀分别为764nM和191nM。与已知的Wnt抑制剂ICG001(IC₅₀＝1060nM)相比，这些稳定化多肽是更有效的Wnt/β-连环蛋白信号传送抑制剂。另一种Wnt抑制剂LGK-974(也称为Porcupine抑制剂)在相同的测定中进行了测试。LGK-974抑制Porcupine，一种介导Wnt家族蛋白棕榈酰化的膜结合O-酰基转移酶，它是Wnt蛋白分泌和功能激活所必需的。Liu等人，《美国科学院院报(Proc NatlAcad Sci USA)》(2013)110：20224-20229。由于LGK-974靶向细胞外Wnt信号传送并且不直接抑制β-连环蛋白转录，因此WX-024也显示出比LGK-974(IC₅₀>10μM)更好的靶向Wnt/β-连环蛋白转录的体外效力(图5E)。

总体而言，虽然WX-021和WX-024均有效抑制Wnt信号通路，但相比于WX-021，WX-024的作用在细胞活力测定(图4)和Wnt转录测定(图5)中均显示出改善的功能性。因此，在随后的体外和体内研究中选择WX-024用于进一步表征。

实例4.2.WX-024与β-连环蛋白的结合亲和力

在均相时间分辨荧光(HTRF)测定(Cisbio)中评估WX-024与β-连环蛋白结合的能力。HTRF测定提供了以高通量形式测定蛋白质-蛋白质相互作用的手段，如Degorce等人，《现代化学基因组学(Curr Chemical Genom.)》3，22-32(2009)中所讨论。在测量蛋白质-蛋白质相互作用的HTRF测定中，2种蛋白质的结合使HTRF供体和受体荧光团紧密接近并生成荧光能量转移(FRET)信号。相互作用的每种蛋白质都通过抗体反应与供体或受体相关联。

图6A提供了描绘HTRF测定的基础的示意图。在β-连环蛋白(Cisbio)的HTRF测定中，β-连环蛋白与抗β-连环蛋白的XL665偶联抗体(ab)结合。参见Degorce(2009)。与XL665偶联抗体结合的β-连环蛋白可以与其结合配偶体(例如，BCL9或BCL9肽)相互作用。

对于HTRF测定，将β-连环蛋白结合配偶体WX-024偶联至生物素。在β-连环蛋白和WX-024温育后，反应产物与结合至铕穴合物的链霉抗生物素蛋白(SA)(SA-铕穴合物)一起温育。SA是生物素的高亲和力结合配偶体，并将SA-铕穴合物与生物素化的稳定化多肽紧密结合。铕穴合物是HTRF反应的能量供体。当不紧密结合时，铕穴合物与XL665之间不存在能量转移。然而，当铕穴合物和XL-66紧密接近时，例如当生物素化的WX-024与由XL665抗体结合的β-连环蛋白成功结合时，存在可以测量的能量转移。

在HTRF测定中使用组氨酸标记的β-连环蛋白、用生物素标记的BCL9肽、用于组氨酸标签的铕(Eu)标记单克隆抗体和SA-XL665。测定缓冲液包含50mM MES pH 6.5，150mMNaCl；0.1％BSA，1mM DTT和0.1％吐温20。将5μLHis-标签蛋白加入平板中。将5μL不同浓度的生物素标记的肽加入到相同的孔中。加入10μLEu标记的单克隆抗体和SA-XL644检测混合物。反应产物在室温下温育1小时，然后读板。

从WX-024获得的结果显示在图6B中。由结果计算的WX-024的K_D值为4.21nM。

实例4.3.WX-024和ICG001在细胞活力测定中的比较

图7显示了使用标准制造商程序，利用CellTiterGlo发光细胞活力测定(Promega)，用递增浓度的WX-024或ICG001治疗的HCT116细胞的活力数据。如通过活力测定所测量，WX-024和ICG001都能够抑制细胞生长。特别是，由该测定计算的WX-024的IC₅₀值为1.92μM，低于ICG001的IC₅₀值(IC₅₀＝2.17μM)。

总体而言，数据表明WX-024具有与抑制Wnt信号通路相一致的稳定的体外特性。

实例4.4.WX-024和其他已知化疗剂的比较

还在Colo320DM细胞活力测定中测试WX-024，并与其他化疗剂进行比较。WX-024比ICG001、LGK-974(图8A)或厄洛替尼(图8B)更有效地抑制BCL9/β-连环蛋白依赖性细胞系的细胞生长约12倍。

WX-024在与其他已知化疗剂组合使用时也有益处和改进。特别是，如图8C所示，WX-024与在结肠直肠癌中广泛使用的化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)组合测试，并且显示联合疗法显示出与单独的5-FU治疗相比(IC₅₀＝12.1μM)，显著改善的抑制细胞生长的能力(IC₅₀＝1μM)。

实例4.5.WX-024的特异性

如实例4.1所讨论，WX-024在基于细胞的测定中抑制Wnt转录。然而，WX-024在其他转录测定中不产生任何显著的抑制，如JAK/STAT(SIE-bla ME-180细胞系)、PI3K/AKT/FOXO(TREx FOXO3-DBE-bla HeLa细胞系)、TGF-β(SBE-bla HEK 293T细胞系)或TNF-α/JNK(AP1-bla ME-180细胞系)通路(Life Technologies)，显示在所有这些转录测定中IC₅₀值大于10μM。在这些测定中，使用WX-024的三氟乙酸盐形式。在以下表4中总结的数据表明WX-024是特异性靶向Wnt/β-连环蛋白通路的抑制剂。

表4.在其他通路中对WX-024的评估

实例5.稳定化多肽的体内特性

基于WX-024的稳健体外特性，在小鼠中进行实验以确定血浆药代动力学参数。另外，在小鼠异种移植物模型中评估WX-024以测试抑制肿瘤生长的疗效。

实例5.1.WX-024在小鼠体内的药代动力学特性

WX-024的药代动力学(PK)特性在向雄性ICR小鼠(远亲杂交品系)静脉(i.v.)和腹腔(i.p.)注射之后评估。i.v.注射使用尾静脉。用1mg/kg(i.v.)和5mg/kg(i.p.和i.v.)评估WX-024的剂量。注射之后，在给药后5分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时通过眼眶后静脉获得血液样品。在与肝素钠混合并离心后从血液样品中获得血浆。

使用LC/MS确定WX-024的浓度(ng/ml)。LC分析使用Agilent 100HPLC进行。MS分析使用AB Sciex API 4000进行。通过系列稀释制备校准标准品。在图9A中显示WX-024随时间变化的浓度(ng/ml)。

最大观察浓度(C_max)、终末半衰期(T_1/2)、总体清除率(CL)、分布体积(V_z)、从给药时间至最后可测量浓度的曲线下面积(AUC_0-t)、从给药时间外推至无穷大的曲线下面积(AUC_0-inf)和生物利用度使用FDA认证的药代动力学程序WinNonlin Professional v5.2(Pharsight)中的非分区分析模块计算。这些值在图9B中总结。值得注意的是，5mg/kg静脉给药产生WX-024的最大C_max，其值为47354ng/ml。这相当于大于30μM，其比实例4中计算的体外IC₅₀大15倍，表明可以在血浆中实现WX-024的生理相关浓度。

所有给药方案的WX-024的T_1/2在2.4-2.5小时之间，这表明有相当长的一段时间，血浆中是有活性WX-024存在的。WX-024在i.p.给药后的生物利用度是73.6％。该值不是为i.v.给药提供的，因为所有化合物都进入血浆中，因此生物利用度为100％。C_max、Cl、V_z、AUC_0-t和AUC_0-inf的值也都与表明在i.p.和i.v.给药之后与WX-024充分暴露接触以潜在调节Wnt信号传送的特性相一致。

用不同的小鼠品系(雌性balb/c小鼠，每治疗n＝2)和其他给药途径(包括肌肉内途径和皮下途径)进行类似的WX-024的药代动力学研究。简言之，使用10％DMSO和90％去离子水的混合溶剂来溶解WX-024。以0.5mg/ml的固定浓度制备肽溶液，然后根据剂量给予适量。使用相同的混合溶剂作为媒剂治疗。在给药后0.25小时、1小时、2小时、4小时、6小时、7小时、12小时和24小时(对于肌肉内、皮下和腹腔途径，在给药后36小时和48小时)，从眼眶后静脉收集血液样品(300μL)，然后通过LC-MS/MS进行血浆分离以用于稍后的生物分析。通过WinNonlin Professional(v5.2，Pharsight，FDA认证)中的非分区分析模块计算标准PK参数。如图10A所示，WX-024的血浆浓度遵循与图9A所示相似的趋势。由该实验计算的平均药代动力学参数显示在图10B和图10C中。观察到WX-024有良好的生物利用度和较长的半衰期，表明WX-024的每日给予是可行的。值得注意的是，当通过腹腔、肌肉内、皮下途径给予时，WX-024的血浆浓度长时间保持稳定，表明当以各种途径给予时，WX-024可在体内达到生理相关浓度。

总体而言，这些数据表明WX-024具有适合于研究抑制BCL9和β-连环蛋白的相互作用的体内效果的PK特性。

实例5.2.WX-024在小鼠异种移植物癌模型中的疗效

基于WX-024在小鼠中的良好PK特性，如上所述，在小鼠异种移植物结肠癌模型中研究了WX-024的疗效。使用BALB/c裸小鼠中的Colo320DM结肠癌模型，其中将Colo320DM细胞皮下注射到BALB/c裸小鼠中。由Colo320DM细胞形成肿瘤，因为裸小鼠不具有足够的免疫响应来清除这些肿瘤。

将Colo320DM肿瘤细胞(ATCC)在补充有10％热灭活的胎牛血清的RPMI1640培养基(GIBCO，目录号31800022)中于37℃培养。当细胞在指数生长期生长时，进行Colo320DM细胞的收获。雌性BALB/c裸小鼠(上海实验动物中心)用于6-8周龄的研究。整个研究期间，动物可以自由饮用水和辐照灭菌食物。每只小鼠(n＝16)在右侧腹部皮下接种在0.1mL PBS中的5x 10⁶Colo320DM肿瘤细胞。接种后允许肿瘤发育14天，此时平均肿瘤大小为156.78mm³。在研究期间，动物的照料和使用是根据实验动物评估和认可委员会(AAALAC)进行的。接种肿瘤细胞后，每天检查动物的发病率和死亡率。在整个研究过程中监测每只动物的体重。

在肿瘤发育14天后，将小鼠分成4个治疗组：5、10和15mg/kg WX-024和媒剂对照组。使用4％乙醇+8％吐温80+88％10mM PBS作为媒剂。所有治疗每天给予一次。将WX-024溶液溶于纯DMSO中，然后用无菌水稀释。针对体重调整给药体积，使得每只动物的给药体积为静脉给药0.05mL/10g体重。治疗期为14天。

所有治疗均以每日i.v.给药开始。在研究中发现，15mg/kg WX-024的i.v.给予导致体重减轻，与治疗3天后的媒剂治疗组相比，平均体重减轻约11％。对于10mg/kg和15mg/kg组，注射方法在第7天更改为i.p.注射。对于10和15mg/kg组，从治疗期的第7天起，保持通过i.p.注射的给药(给药体积调整为0.1ml/10g)，并且这些动物的体重稳定。在整个研究中，用媒剂对照或5mg/kg WX-024治疗的小鼠接受i.v.注射，对体重没有明显的影响。治疗期间小鼠的体重变化如图11所示。

在治疗期的第0、3、5、7、9、11、14天(所有的给药都在肿瘤发育14天后开始)，使用卡尺以二维方式测量肿瘤体积。使用以下等式测量肿瘤的体积：V＝0.5a x b²，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。肿瘤体积以mm³表示。研究结束时(即，在治疗22天后)，测量肿瘤块重量。

图12A使出了不同治疗组中随时间变化的肿瘤体积。在第14天，媒剂对照治疗小鼠的肿瘤体积(平均值±平均值标准误差)为2575±382.86mm³。对于5、10和15mg/kg治疗组，WX-024治疗小鼠的肿瘤体积分别为2039±373.29，1370±114.39和1157.6±99.04mm³。与媒剂治疗动物相比，用10mg/kg或15mg/kg WX-024治疗的小鼠的肿瘤体积在治疗的第14天显著更小(P<0.05，Kruskal-Wallis分析)。与媒剂治疗组相比，在治疗期的第14天，15mg/kgWX-024组的肿瘤体积减小了53.2％，而10mg/kg WX-024组的肿瘤体积减小了44.9％。在治疗第11天也观察到10mg/kg和15mg/kg组的与媒剂对照组相比显著较小的肿瘤体积。WX-024与预测肿瘤大小的初步剂量-响应关联使IC₅₀值为12.69mg/kg。

图12B示出了在用媒剂或WX-024治疗22天后研究结束时的肿瘤块重量(以克为单位测量)。用10或15mg/kg WX-024(使用上述i.v./i.p.方案)治疗的小鼠的肿瘤质量显著小于媒剂治疗小鼠的肿瘤质量。这些数据证实，在BALB/c裸小鼠中，使用10或15mg/kg的治疗抑制Colo320DM结肠癌模型中的肿瘤生长。

Colo320DM模型结束时，收集肿瘤和肠样品，在福尔马林中固定，并用标准技术将其包埋在石蜡中。准备4μm厚的组织切片用于免疫组织化学(IHC)染色。通过依次用二甲苯、梯度乙醇和磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，将组织切片脱石蜡并再水化。在脱石蜡和再水化之后，将组织切片在靶标修复液(10mM柠檬酸盐缓冲液；pH 6.0)中进行高温诱导表位修复。

按照制造商的说明使用UltraVision Quanto检测系统(Thermo，目录号TL-060-QHD)试剂盒检测抗体结合。将切片用过氧化氢阻断剂和超V阻断剂(在试剂盒中提供)处理，然后在4℃下与第一抗体一起温育过夜：CD44(Abcam，目录号ab157107以1:500稀释)、轴抑制蛋白(LSBio，兔IgG，目录号LS-B7029，批号51907，物料浓度：1000μg/ml)或VEGFA(VEGFA：LS Bio，兔IgG，目录号LS-B10263，批号65323，物料浓度：1000μg/ml)。兔IgG替代阴性对照中的第一抗体。所有切片均用苏木精复染，脱水并封固。使用Olympus CKX31SF倒置显微镜拍摄IHC图像。

图13A示出了在用媒剂、10mg/kg或15mg/kg WX-024治疗22天的小鼠中维持肠形态。图13B示出了轴抑制蛋白2(Wnt信号通路中下游蛋白)的染色，表明与媒剂治疗相比，用15mg/kg WX-024治疗22天减少了轴抑制蛋白2染色。

图14A示出了在媒剂或15mg/kg WX-024治疗22天后，CD44(Wnt信号通路中另一个下游蛋白)的染色。每个CD44图像的右上角标出免疫组织化学评分。图14B示出了从CD44染色图像计算的平均染色评分的定量比较。这些数据表明用WX-024治疗后CD44染色也有所减少。

同样，将肿瘤样品针对VEGFA染色并证实WX-024能够抑制肿瘤中的VEGFA表达。图15A示出了来自两种媒剂治疗动物和两种WX-024治疗动物的代表性图像。在15B中总结了从染色图像计算的平均免疫组织化学评分。

因此，来自Colo320DM模型的数据表明，与媒剂治疗相比，WX-024能够抑制肿瘤生长并抑制Wnt/β-连环蛋白信号传送。WX-024对VEGFA的作用还表明WX-024可通过降低肿瘤中的VEGF表达来调节免疫响应。

实例5.3.WX-024在小鼠同品系癌模型(CT26)中的疗效

结肠癌的CT26模型被用作用于在具有完整免疫系统的小鼠中研究肿瘤生长的模型。

WX-024对CT26细胞生长的作用首先在体外进行研究。使CT26细胞在5天内于F底板中生长。如图16A所示，如发光细胞活力测定所测量，从第1天(D1)至第5天(D5)，CT26细胞大量生长。CellTiterGlo(Promega)细胞活力测定。测量了WX-024(图16B)和多柔比星(图16C)抑制CT26细胞生长的能力。多柔比星是已知的细胞生长抑制剂，并被包括作为对照。图16D总结了CT26细胞中的体外数据，显示WX-024和多柔比星都能够抑制CT26细胞的生长，其中WX-024显示更有效的活性。WX-024的IC₅₀值为1.753μM，远低于多柔比星的IC₅₀值(7.520μM)。EGFR受体拮抗剂厄洛替尼的IC₅₀大于2μM。

然后评估使用CT26的同品系小鼠结肠癌模型。雄性Balb/c小鼠在右侧腹部皮下注射5X 10⁴个CT26细胞，每只大约5周龄。然后每日向小鼠i.p.给予媒剂或20mg/kgWX-024。每个治疗组包括8只小鼠。然后如图17A所示在给药14天内评估肿瘤生长。与媒剂相比，用WX-024治疗的小鼠的随时间变化的肿瘤体积显著较小(P<0.001)。图17B总结了整个实验中WX-024的平均肿瘤生长抑制率。给药3天后TGI为89.2％，而给药12天后TGI为70.0％。图18A示出了用媒剂给药14天内的个体动物的肿瘤生长速率。图18B示出了用20mg/kg WX-024给药14天内的个体动物的肿瘤生长速率。这些数据表明CT26模型中观察到的肿瘤生长抑制在动物间是一致的。

还评估了在用媒剂或20mg/kg WX-024每日给药2周后血液中的CD4⁺T细胞计数。从每只小鼠取全血。通过Ficoll从血液样品中纯化淋巴细胞，并用荧光抗-CD4抗体对细胞染色。数据通过流式细胞术测量。图19A示出了以总细胞百分比表示的CD4⁺T细胞计数，表明随WX-024给药的增加。图19B示出了依照一个样本的血液样品中的总细胞的相对T细胞计数，表明随WX-024给药的增加。这些数据表明用WX-024治疗后辅助性T细胞的增加和免疫系统的激活。这些数据还表明WX-024与免疫疗法的联合疗法可能适用于对仅免疫疗法无响应的癌症，例如使用抗PD-1或CTLA-4抗体的治疗。

还评估了用媒剂或20mg/kg WX-024每日给药2周后血液中的CD8⁺T细胞计数。如上所述，从每只小鼠取全血。通过Ficoll从血液中纯化淋巴细胞，并用荧光抗-CD8抗体对细胞染色。数据通过流式细胞术测量。图20A示出了以总细胞百分比表示的CD8⁺T细胞计数，表明随WX-024给药的增加。图20B示出了依照血液样品中的总细胞的相对T细胞计数，表明随WX-024给药的增加。这些数据表明用WX-024治疗后细胞毒性T细胞的增加和免疫系统的激活，并进一步支持WX-024与免疫疗法一起使用。

为了进一步评估WX-024是否能够调节肿瘤微环境，研究结束时，将肿瘤和血液样品收集在抗凝血管中。进行单细胞分离，然后对细胞进行染色以用于FACS分析。对于细胞表面染色，使用CD45-PerCP-Cy5、CD4-FITC、CD8-PE-Cy7和CD25-PE。对于核内染色，将细胞透化过夜，然后用Foxp3-APC染色60分钟。如图21A所示，肿瘤样品中CD4⁺T细胞群体中的调节性T细胞显著减少，而CD8⁺细胞毒性T细胞与调节性T细胞之间的比例显著增加(图21B)。图21C和图21D示出了该实验中肿瘤样品的代表性FACS分析。

图22A示出了用媒剂或20mg/kg WX-024治疗14天后对活性β-连环蛋白的染色。根据染色图像计算平均免疫组织化学评分。图22B示出了媒剂治疗组和WX-024治疗组之间平均染色评分的定量比较。图22C示出了用媒剂或20mg/kg WX-024治疗14天后对CD44的染色。这些数据表明WX-024能够抑制肿瘤中的活性β-连环蛋白表达。

也对肿瘤样品进行PD-L1染色，并且在图23A中示出了来自四只媒剂治疗小鼠和四只WX-024治疗小鼠的代表性图像。图23B示出了每个治疗组的平均免疫组织化学评分的定量比较。

总体而言，这些数据表明WX-024刺激T细胞浸润到肿瘤中并刺激针对肿瘤的免疫反应。这些数据还表明WX-024调节肿瘤微环境以有利于这种免疫反应。因此，WX-024和检查点阻断剂的联合疗法可通过减少肿瘤中存在的调节性T细胞或树突状细胞来在刺激针对肿瘤的免疫反应产生协同效应。此外，由于WX-024能够增加血液中的CD8⁺T细胞，这进一步表明WX-024可能增加T细胞向肿瘤中的浸润以及针对肿瘤的免疫原性。

实例5.4.WX-024在小鼠同品系癌模型(B16F10)中的疗效

还评估了WX-024抑制其他类型肿瘤的能力。给C57BL/6小鼠接种B16F10细胞。4-5周龄雌性C57BL/6小鼠在右侧腹部接种B16F10细胞(2X 10⁵个细胞，每只小鼠0.05ml)。当小鼠的平均肿瘤大小达到100mm³时，将小鼠分成两组(N＝6)。第一组被给予25mg/kg WX-024，而第二组用媒剂治疗。每天腹腔给予治疗，持续连续14天。如图24所示，与媒剂治疗相比，WX-024有效地减少肿瘤生长，再次证实WX-024在体内抑制肿瘤生长方面具有强大的疗效。

为了进一步评估WX-024是否能够诱导T细胞浸润到肿瘤中并调节肿瘤微环境，给C57BL/6小鼠接种B16F10细胞。当小鼠的平均肿瘤大小达到100mm³时，将小鼠分成两组(N＝3)并用媒剂或25mg/kg WX-024治疗。每天腹腔给予治疗，持续连续12天。治疗结束时，将小鼠处死，并将肿瘤和血液样品收集在抗凝血管中。对每个样品进行单细胞分离，然后染色进行FACS分析。对于细胞表面染色，使用CD45-PerCP-Cy5、CD4-FITC、CD8-PE-Cy7和CD25-PE。然后将肿瘤样品用抗CD4抗体或抗CD8抗体染色以评估肿瘤样品中T细胞的存在。肿瘤样品还用抗CD194抗体和抗CD196抗体染色以评估肿瘤样品中辅助性T细胞17的存在。

如图25A所示，与媒剂相比，WX-024增加了在肿瘤样品中存在的CD4⁺阳性细胞，表明WX-024诱导辅助性T细胞向肿瘤中的浸润。同样，图25B证明WX-024增加了在肿瘤样品中存在的CD8⁺阳性细胞，表明WX-024诱导细胞毒性T细胞向肿瘤中的浸润。如图25C中所总结，这些结果表明总体而言，WX-024能够诱导T细胞向肿瘤中的浸润，从而进一步引发特异性靶向肿瘤块的有益免疫反应。总体而言，数据显示WX-024增加肿瘤中CD8⁺和CD4⁺淋巴细胞浸润的趋势，表明WX-024通过改变肿瘤中和/或肿瘤周围的T细胞组成来诱导有利于免疫反应的肿瘤微环境。

将WX-024对肿瘤微环境的作用与WX-039(WX-024的变体)对肿瘤微环境的作用进行比较。实例10中描述了构建WX-039的过程。给C57BL/6小鼠接种B16F10细胞。当小鼠的平均肿瘤大小达到100mm³时，将小鼠分成三组(N＝3)并用媒剂、20mg/kg WX-024或60mg/kgWX-039治疗。每天腹腔给予治疗，持续连续12天。治疗结束时，将小鼠处死，并将肿瘤和血液样品收集在抗凝血管中。如上所述对从实验收集的肿瘤细胞进行染色，并且还使用抗CD205抗体来评估WX化合物是否能够调节树突状细胞。如图26A和26B所示，WX-024显著减少CD205+细胞，证实WX-024能够抑制肿瘤内的树突状细胞。虽然WX-039也能够抑制肿瘤中存在的树突状细胞，但WX-024的作用比WX-039更显著。图26C还示出了，尽管WX-039增加了肿瘤中的辅助性T细胞17，但WX-024似乎比WX-039更有效。与CT26动物模型研究相一致，这些数据表明WX-024能够刺激针对肿瘤的免疫反应并调节肿瘤微环境以有利于这种免疫反应。图26D中示出了该实验中肿瘤样品的代表性FACS分析。

与其他免疫治疗剂(例如，抗PD-L1抗体或能够调节T细胞活化的其他抗体)组合时，WX-024可调节调节性T细胞并增加CD8⁺细胞毒性T细胞与调节性T细胞之间的比例。与这些免疫治疗剂组合的WX-024还可以进一步协同地减少肿瘤中的髓样树突状细胞，从而诱导有利于针对肿瘤的免疫反应的肿瘤微环境。

实例5.5.WX-024在小鼠原位癌模型中的疗效

原位小鼠模型可用于显现抗肿瘤化合物对植入小鼠的肿瘤的作用并评估化合物对肿瘤转移的作用。选择使用NCI-H1299-Luc细胞系(表达荧光素酶的非小细胞肺癌细胞系)的原位模型用于该实验。摄取荧光素底物后，这些细胞能够产生生物发光。NCI-H1299细胞系的增殖依赖于Pygopus(Pygo)2/β-连环蛋白转录活性，其中TCF-1转录因子(BCL9，β-连环蛋白和Pygo)形成转录复合物以启动转录。

为了评估WX-024在原位动物肿瘤模型中的作用，给雌性balb/c裸小鼠注射NCI-H1299-Luc细胞。小鼠约5周龄。用注射器将在PBS中的50μL的NCI-H1299-Luc细胞(5X 10⁶)注射到每只小鼠的肺中。将细胞给予小鼠后，将小鼠分成两组(每组n＝3)，并且每天静脉给予媒剂或15mg/kg WX-024，持续连续10天。

根据制造商方案(Xenogen ivis成像系统，PerkinElmer)，在整个研究期间定期测量每只小鼠的生物发光强度(总通量[p/s])。图27A中描绘的平均总通量表示由用媒剂或WX-024治疗的小鼠中的肿瘤细胞生成的平均生物发光光子通量信号。如图27A所示，WX-024在体内几乎完全阻断肿瘤形成和生长，证明了WX-024的体内疗效。图27B示出了在该实验中监测的每只小鼠的总通量。数据表明WX-024对肿瘤形成和生长的抑制作用在小鼠中是一致的。数据还表明WX-024能够抑制肿瘤转移。图27C示出了整个研究过程中所取的各只小鼠的生物发光图像。#1-3小鼠来自媒剂治疗组，而#4-6小鼠来自WX-024治疗组。

实例5.5.WX-024在患者源异种移植物(PDX)动物模型中的疗效

为了评估WX-024是否也适用于来源于人类患者的肿瘤，将接种患者源结肠癌细胞的异种移植物动物模型与WX-024暴露接触。筛选来源于四个不同结肠癌患者的样品，以选出指示升高的经典Wnt/β-连环蛋白信号传送水平的生物标志物。如图28A所示，对样品(#5-#8)进行β-连环蛋白、BCL9、c-Myc和CD44表达染色，并进行IgG染色作为对照。还对样品进行BCL9和β-连环蛋白的核共定位的染色。来源于#8患者的样品显示出该实验中测试的所有生物标志物水平升高，因此选择所述样品用于患者源异种移植物动物研究。

约5周龄的雄性NOD/SCID小鼠静脉注射来源于#8患者的结肠癌细胞。简言之，将来自图28A的选定CRC肿瘤样品切成3mm³片段，并皮下植入NOD/SCID小鼠的右侧腹部。当平均肿瘤大小达到约135mm³时(移植后约18天)，将小鼠分成两组(每组n＝8)并给予媒剂或15mg/kg WX-024。每天向每只小鼠静脉给药，持续超过31天。

如图28B所示，与媒剂相比，WX-024有效地抑制肿瘤生长。WX-024的平均肿瘤生长抑制率在给药31天后为75.6％。研究结束时，将小鼠处死并收集肿瘤样品。将组织样品用10％福尔马林固定并转移至70％乙醇中，然后在脱石蜡、抗原修复(190℃，5分钟)、内源性过氧化物酶淬灭(3％H2O2，RT，5分钟)、室温下用5％FBS封闭15分钟、第一抗体温育(室温，1h)、第二抗体温育(室温，30min)、DAB显色(室温，5min)和脱水及封固后加工。对每个肿瘤样品进行BCL9、β-连环蛋白和CD44表达染色，结果显示在图29A和29B中。值得注意的是，WX-024能够降低那些肿瘤样品中的CD44表达，证实WX-024能够抑制Wnt/β-连环蛋白信号传送。

这些数据表明WX-024对于人类患者是有效的疗法。数据还表明，各种生物标志物(例如，β-连环蛋白、BCL9、c-Myc和CD44)，可用于确定给定患者是否特别适合于WX-024治疗。

实例5.6.WX-024的毒理学研究

为了评估WX-024的毒性作用，将约5周龄的雌性balb/c小鼠用WX-024治疗，持续连续14天。将小鼠分成4组(每组n＝6)，以每日剂量的媒剂或10mg/kg、15mg/kg或20mg/kg WX-024静脉治疗。研究结束时，将小鼠处死并收集各种主要器官。如实例5.5中所述处理和加工组织样品。将包埋的组织样品切片并用H&E染色。图30A示出了来自媒剂治疗组和10mg/kgWX-024治疗组的代表性H&E染色图像。在整个研究过程中监测每只小鼠的体重，并且每个治疗组的平均体重显示在图30B中。虽然研究开始时略有下降，但是在整个研究期间，所有三个WX-024治疗组的平均体重稳定并保持不变。同样，虽然在研究开始时所有WX-024治疗组的食物消耗略有下降，但在继续治疗后其恢复至接近基线水平。研究结束时，还收集来自每只小鼠的血液用于血清化学和血液学分析(全血细胞计数分析)。图30C示出了媒剂治疗组和20mg/kg WX-024治疗组的血细胞计数特性。这两组的特性没有显著差异，表明WX-024在该实验条件下没有诱导显著的毒性。

在约5周龄的雌性balb/c小鼠中分析WX-024的毒代动力学。用10mg/kg、15mg/kg或20mg/kg WX-024腹腔治疗小鼠，持续连续14天。每天向小鼠给予WX-024。图31A示出了在第1天实验第一次给药后24小时内的血浆浓度变化(每组n＝2)。下面的表5总结了在第1天计算的平均毒代动力学参数。

表5.第一次给药后WX-024的平均毒代动力学参数

图31B示出了在第14天在实验最后一次给药后24小时内的血浆浓度变化。表6总结了在第14天计算的平均毒代动力学参数。使用IP给药(15和20mg/kg)的毒代动力学研究显示出在第1天(分别为118,033和162,333hr*ng/mL)和第14天(分别为107,420和159,976hr*ng/m)之间的可比AUC值，表明WX-024不可能引起药物诱导免疫原性。

表6.最后一次给药后WX-024的平均毒代动力学参数

实例6.WX-024临床前研究总结

总体而言，与其他已知的Wnt抑制剂相比，WX-024显示出改善的体外疗效。例如，当在使用HCT166细胞的基于细胞的Wnt转录测定中进行测试时，WX-024表现出约200nM的IC₅₀值。WX-024还特异性抑制Wnt转录，其中钉合多肽在其他转录测定(例如，JAK/STAT、TGF-β、PI3K/AKT/FOXO3和TNF-α/JNK报告基因测定)中显示出大于100μM的IC₅₀值。

WX-024的总体药代动力学特性对于在体内产生生理相关的血浆浓度也是可接受的。例如，当通过皮下给药途径以10mg/kg进行测试时，生物利用度为约70％。在这种情况下，T_max为8小时，T_1/2为13小时，而C_max为7.7μM。

WX-024的体内疗效在多种动物模型中得到证实。例如，当给药3-6周时，那些动物模型中WX-024的平均肿瘤生长抑制率为约70-80％。当动物长期被给予WX-024时，未观察到特定的药物相关毒性。

实例7.包含核心功能结构域的其他稳定化多肽

包含核心HD2功能结构域的WX-035根据实例1中描述的方案构建。简言之，在SEQID NO:X的Xaa₁和Xaa₂氨基酸之间生成第一烃交联剂，并且使用钌介导的闭环烯烃复分解(如Kim 2011中概述)在SEQ ID NO:X的Xaa₃和Xaa₄生成第二烃交联剂。在闭环复分解后，将多肽去保护并释放。所得到的稳定化多肽包含在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型的-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-的第一烃交联剂，以及在两端具有S-构型的-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-的第二烃交联剂。WX-035的化学结构如图1B所示。根据实例1中描述的方案进一步纯化多肽。

实例8.稳定化多肽的体外特性

按照实例2中描述的程序，在使用Colo320DM细胞的细胞活力测定中测试WX-035抑制细胞生长的能力。如图32所示，与WX-024相比，WX-035表现出改善的IC₅₀值。

实例9.稳定化多肽的体内特性

实例9.1.WX-035在小鼠体内的药代动力学特性

按照实例5.1中描述的程序评估WX-035的药代动力学特性。简言之，向小鼠静脉给予1mg/kg或5mg/kg，或腹腔给予5mg/kg。在给药后15分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、8小时、12小时和24小时收集血液样品。图33A示出了雄性ICR小鼠中WX-035的血浆浓度。最大观察浓度(C_max)、终末半衰期(T_1/2)、总体清除率(CL)、分布体积(V_z)、从给药时间至最后可测量浓度的曲线下面积(AUC_0-t)、从给药时间外推至无穷大的曲线下面积(AUC_0-inf)和生物利用度在图33B中确定并总结。值得注意的是，WX-035的半衰期测量表明血液中改善的稳定性，其中T_1/2值大于4小时。

如使用WX-024所进行的那样，同样在雌性balb/c小鼠中对WX-035的药物动力学特性进行分析(每治疗n＝3)。使用30mg/kg WX-035比较两种不同的给药途径(静脉给药途径或腹腔给药途径)。如图34A所示，WX-035的药代动力学特性与用雄性ICR小鼠所观察到的药代动力学特性相似。按照实例5.1中的程序计算平均药代动力学参数并并将其在图34B中总结。如用雄性ICR小鼠所观察，该实验中WX-035的半衰期大于9小时。

这些数据与用多种交联剂稳定BCL9肽可以改善PK参数的假设相一致。

实例9.2.WX-035在小鼠同品系癌模型中的疗效

按照实例5.3中描述的程序，在同品系小鼠模型中评估WX-035在治疗癌症中的体内疗效。使用已知的MEK抑制剂曲美替尼作为比较。简言之，给balb/c小鼠接种CT26，当肿瘤体积达到约100mm³时开始治疗。然后将小鼠分成三组，并开始给予媒剂、40mg/kg WX-035或1mg/kg曲美替尼，持续连续7天。

如图35A和35B所示，与曲美替尼和媒剂治疗相比，WX-035能够稳定地抑制肿瘤生长。研究结束时，WX-035的平均肿瘤生长抑制率为88.44％。

实例9.3.WX-035在T细胞活化中的作用

在实例9.2中描述的研究结束时，收集来自每只小鼠的肿瘤样品以评估WX-035在调节T细胞活化中的作用。按照实例5中描述的程序进行每个肿瘤样品的FACS分析。如图36A所示，使用WX-035治疗减少了CD45⁺细胞的总量。由于血细胞淋巴细胞总量减少，所以CD4⁺或CD8⁺T细胞的总量也减少(图36B)。同样，通过WX-035治疗，Foxp3⁺CD25⁺T细胞减少(图36C)。但是，如图36D所示，与媒剂治疗相比，WX-035增加了细胞毒性T细胞(CD8⁺T细胞)和Foxp3⁺T细胞(调节性T细胞)之间的比例。因此，这些数据表明WX-035能够在同品系动物模型中减少调节性T细胞。此外，通过增加细胞毒性T细胞对调节性T细胞的比例，WX-035可以诱导有利于免疫反应(有益于肿瘤治疗)的微环境。值得注意的是，从该实验收集的样品也进行了LGR5表达评估。如图36E所示，WX-035降低了从该实验收集的肠样品中LGR5的表达，证实WX-035能够在体内抑制Wnt/β-连环蛋白信号传送。

实例9.4.WX-035的毒性作用

为了评估WX-035的毒性作用，按照实例5.6中描述的程序，向balb/c裸小鼠给予媒剂或30mg/kg或40mg/kg WX-035。研究结束时，将小鼠处死，收获主要器官进行H&E染色。如图37所示，使用WX-035治疗未对主要器官造成任何显著的异常，表明WX-035不产生显著的毒性作用。

实例10.其他稳定化多肽

还构建了来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的其他多肽，并且这些多肽的序列显示于下面的表7中。根据实例1中描述的方案构建和纯化多肽。WX-029包含氨基酸Xaa₁和Xaa₂之间的8碳烃交联剂。WX-037、WX-038和WX-039各自包含两种烃交联剂。在每种多肽中，在其各自序列的Xaa₁和Xaa₂氨基酸之间生成第一8-碳交联剂，并且在其各自序列的Xaa₃和Xaa₄氨基酸之间生成第二8-碳交联剂。WX-037是来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的多肽，其中疏水亮氨酸(L)残基已突变为带电天冬氨酸(D)。WX-040包含氨基酸Xaa₁和Xaa₂之间的11-碳交联剂。

表7.来源于BCL9蛋白的HD结构域的其他稳定化多肽

实例11.稳定化多肽的体外特性

一种实例10中生成的稳定化多肽在细胞活力测定中测试，并与WX-035比较。选择WX-037进行该比较研究。按照实例2中描述的程序，用CT26.WT细胞(ATCC)进行细胞活力测定。简言之，每个平板每孔4000个细胞用50μL opti-MEM培养基接种。用包含opti-MEM培养基的2％FBS稀释每种多肽(WX-035或WX-037)，其中在99μL培养基中使用1μL 200X浓度的多肽。稀释每种物料溶液以测试宽范围的浓度。将50μL2X浓度的多肽加入到平板的每个孔中。根据制造商的方案，在加入多肽三天后，使用CellTiterGlo测定测量细胞的活力。

如图38A和38B所示，与WX-037(Ab IC₅₀>32μM)相比，WX-035在这种条件下更有效地抑制细胞活力(Ab IC₅₀＝1.858μM)。数据表明疏水亮氨酸残基进一步增加了来源于人BCL9蛋白的HD2结构域的多肽的疗效。图38C总结了每种多肽的体外特性。

实例12.稳定化多肽的体内特性

实例12.1.稳定化多肽在小鼠体内的药代动力学特性

按照实例5.1中描述的程序，评估实例10中构建的四种其他多肽的药代动力学特性。WX-029和WX-036以1mg/kg静脉给予雌性balb/c裸小鼠。在给药后15分钟、1小时、2小时和4小时收集血液样品。图39A和图39B总结了对于WX-029计算的血浆浓度和药代动力学特性。图40A和图40B总结了对于WX-036计算的血浆浓度和药代动力学特性。

类似地，WX-039和WX-040也在雌性balb/c裸小鼠中进行测试并评估其药代动力学特性。WX-039以5mg/kg静脉给予，5mg/kg腹腔给予或10mg/kg皮下给予。WX-040以30mg/kg静脉给予或30mg/kg腹腔给予。在给药后15分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、36小时、48小时和72小时收集血液样品。图41A和图41B总结了对WX-039计算的血浆浓度和药代动力学特性。图42A和图42B总结了对于WX-040计算的血浆浓度和药代动力学特性。值得注意的是，当皮下给药时，在该实验中计算的WX-039的半衰期为约52小时。

实例12.2.WX-039在小鼠同品系癌模型(B16F10)中的疗效

在实例5.4中描述的动物模型中评估WX-039抑制肿瘤生长的能力。简言之，给C57BL/6小鼠接种B16细胞。5周龄雌性C57BL/6小鼠在右侧腹部接种B16F10细胞(2X 10⁵个细胞，每只小鼠0.05ml)。当小鼠的平均肿瘤大小达到100mm³时，将小鼠分成两组(N＝3)。第一组被给予60mg/kg WX-039，而第二组用媒剂治疗。每天腹腔给予治疗，持续连续12天。如图43A所示，与媒剂治疗相比，WX-039减少了肿瘤生长，证实了WX-039的体内疗效。在实验期间评估的肿瘤生长抑制率显示在图43B中。如图43C所示，在实验期间WX-039没有引起实质的体重变化，表明WX-039具有可耐受的毒性。

并入参考

在本申请中可能引用的所有引用参考(包括参考文献、专利、专利申请和网站)的内容为了任何目的明确地通过引用整体并入本文，如其中引用的参考。如果这些参考与本申请中的任何陈述相矛盾或不一致，以申请的文本为准。除非另有说明，否则本公开将采用本领域众所周知的免疫学、分子生物学和细胞生物学以及病理学的常规技术。

等同内容

在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，可以以其他具体形式来实施本发明。因此，前述实施例在所有方面均被认为是说明性的而不是限制本文所述的发明。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是由前面的描述来指示，并且因此在权利要求的等同内容的含义和范围内的所有改变旨在包含在本文中。

Claims

1.一种具有7-14个氨基酸长度的多肽，其中所述多肽来源于人B细胞CLL/淋巴瘤9(BCL9)的HD2结构域，并且其中：

a)所述多肽能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂并且任选地包含至少一种α,α-二取代氨基酸；和/或

b)所述多肽包含一种或多种烃交联剂。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含一种或多种烃交联剂，其中所述多肽包含选自表1的任何序列或其变体，并且其中：

a)Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸；

b)第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间；和/或

c)第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。

3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂，其中所述多肽包含选自表1的任何序列或其变体，并且其中：

a)Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是α,α-二取代氨基酸；

b)Xaa₁和Xaa₂各自是α,α-二取代氨基酸，并且烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间；或

c)Xaa₃和Xaa₄各自是α,α-二取代氨基酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。

4.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含一种或多种烃交联剂，其中所述多肽包含LQTLRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:3)、Xaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:4)或其变体，并且其中：

a)Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸；

b)第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间；和/或

c)第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。

5.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂，其中所述多肽包含LQTLRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:3)、Xaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQID NO:4)或其变体，并且其中：

a)Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是α,α-二取代氨基酸；

6.根据权利要求1到5中任一项所述的多肽，其中与选自以下的未钉合野生型人BCL9HD2结构域相比，所述多肽具有一种或多种改善的生物学功能：

a)抑制BCL9与β-连环蛋白的结合；

b)抑制经典的Wnt/β-连环蛋白信号传送；

c)减少调节性T细胞存活；

d)降低VEGF在肿瘤中的表达；

e)增加CD4+T细胞和CD8+T细胞向肿瘤中的浸润；

f)增加肿瘤中的辅助性T细胞17(Th17)；

g)减少肿瘤中的树突状细胞；

h)当给予受试者时，具有大于至少2小时的半衰期(T_1/2)；

i)诱导有利于免疫反应的肿瘤微环境；和

j)抑制肿瘤生长、癌症干细胞增殖和/或肿瘤转移。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的多肽，其中所述α,α-二取代氨基酸是α-甲基,α-烯基氨基酸。

8.根据权利要求7所述的多肽，其中所述α-甲基,α-烯基氨基酸选自(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸、(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸、(S)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸和(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸。

9.根据权利要求1到8中任一项所述的多肽，其中所述烃交联剂选自-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-和-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-。

10.根据权利要求9所述的多肽，其中所述烃交联剂在至少一端具有S-构型。

11.根据权利要求9所述的多肽，其中所述烃交联剂在至少一端具有R-构型。

12.根据权利要求9所述的多肽，其中所述烃交联剂在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型。

13.一种包含LQTLRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:3)、Xaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ IDNO:4)或其变体或由其组成的多肽，其任选地具有10-14个氨基酸长度，其中：

a)所述多肽能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂；和/或

b)所述多肽包含一种或多种烃交联剂；和

其中与选自以下的未钉合野生型人BCL9HD2结构域相比，所述多肽或变体具有一种或多种改善的生物学功能：

a)抑制BCL9与β-连环蛋白的结合；

b)抑制经典的Wnt/β-连环蛋白信号传送；

c)减少调节性T细胞存活；

d)降低VEGF在肿瘤中的表达；

e)增加CD4+T细胞和CD8+T细胞向肿瘤中的浸润；

f)将辅助性T细胞17(Th17)增加到肿瘤中；

g)减少肿瘤中的树突状细胞；

h)当给予受试者时，具有大于至少2小时的半衰期(T_1/2)；

i)诱导有利于免疫反应的肿瘤微环境；和

j)抑制肿瘤生长、癌症干细胞增殖和/或肿瘤转移。

14.根据权利要求13所述的多肽，其中所述多肽具有11或12个氨基酸长度。

15.根据权利要求13或14所述的多肽，其中所述多肽包含一个或多个烃连接基团，并且其中：

a)Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸；

b)第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间；和/或

c)第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间。

16.根据权利要求13或14所述的多肽，其中所述多肽能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂，并且其中：

a)Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是α,α-二取代氨基酸；

b)Xaa₁和Xaa₂各自是α,α-二取代氨基酸，且烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间；

或

17.根据权利要求16所述的多肽，其中所述α,α-二取代氨基酸是α-甲基,α-烯基氨基酸。

18.根据权利要求17所述的多肽，其中所述α,α-二取代氨基酸选自(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸、(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸、(S)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸和(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸。

19.根据权利要求13到18中任一项所述的多肽，其中所述烃交联剂选自-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-和-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-。

20.根据权利要求19所述的多肽，其中所述烃交联剂在至少一端具有S-构型。

21.根据权利要求19所述的多肽，其中所述烃交联剂在至少一端具有R-构型。

22.根据权利要求19所述的多肽，其中所述烃交联剂在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型。

23.根据权利要求1到22中任一项所述的多肽，其中：

a)所述多肽由LQTLRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列组成；

b)Xaa₁和Xaa₂各自是丙氨酸；

c)烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间；

d)所述烃交联剂是-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-；和/或

e)所述烃交联剂在两端具有S-构型。

24.根据权利要求1到22中任一项所述的多肽，其中：

a)所述多肽由Xaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列组成；

b)Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是丙氨酸；

c)第一烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间；

d)第二烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间；

e)所述第一烃交联剂是-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-；

f)所述第二烃交联剂是-CH₂-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-；

g)所述第一烃交联剂在一端具有S-构型并且在另一端具有R-构型；和/或

h)所述第二烃交联剂在两端具有S-构型。

25.根据权利要求1到24中任一项所述的多肽，其中所述多肽的N末端和/或C末端被进一步修饰。

26.根据权利要求25所述的多肽，其中所述N末端用乙酰基修饰。

27.根据权利要求25或26所述的多肽，其中所述C末端用两个β-丙氨酸单元、2-萘基丙氨酸或连接至两个β-丙氨酸单元的2-萘基丙氨酸修饰，其中所述C末端修饰的羧基用NH₂进一步修饰。

28.根据权利要求23所述的多肽，其中所述多肽的N末端用乙酰基修饰，并且其中所述多肽的C末端用2-萘基丙氨酸修饰，其中2-萘基丙氨酸的羧基用NH₂进一步修饰。

29.根据权利要求24所述的多肽，其中所述多肽的N末端用乙酰基修饰，并且其中所述多肽的C末端用连接至两个β-丙氨酸单元的2-萘基丙氨酸修饰，其中所述第二β-丙氨酸单元的羧基用NH₂进一步修饰。

30.根据权利要求1到29中任一项所述的多肽，其中所述多肽以盐形式或晶体存在。

31.根据权利要求30所述的多肽，其中所述盐形式为三氟乙酸盐、乙酸盐或盐酸盐。

32.一种组合物，其包含根据权利要求1到31中任一项所述的多肽。

33.一种药物组合物，其包含根据权利要求1到32中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体。

34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含至少一种其他药剂。

35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述至少一种其他药剂选自由以下组成的群组：检查点抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、化疗剂和VEGFR抑制剂。

36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述检查点抑制剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA4抗体。

37.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述检查点抑制剂靶向刺激检查点分子，所述刺激检查点分子选自由以下组成的群组：CD27、CD40、OX40、GITR和CD137。

38.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述检查点抑制剂靶向抑制性检查点分子，所述抑制性检查点分子选自由以下组成的群组：A2AR、B7-H3、B7-H4、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM-3)、VISTA(C10orf54)和T细胞活化的V结构域Ig抑制子。

39.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述EGFR抑制剂是厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、帕尼单抗、凡德他尼或西妥昔单抗。

40.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述VEGF或VEGFR抑制剂是帕唑帕尼、贝伐单抗、索拉非尼、舒尼替尼、阿西替尼、普纳替尼、瑞格非尼、凡德他尼、卡博替尼、雷莫芦单抗、乐伐替尼或阿柏西普。

41.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述化疗剂是环磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素、氮芥、长春新碱、甲基苄肼、泼尼松龙、达卡巴嗪、博来霉素、依托泊苷、顺铂、表柔比星、卡培他滨、亚叶酸、放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、硼替佐米、卡铂、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊立替康、二氯甲基二乙胺、巯嘌呤、米托蒽醌、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、戊柔比星、长春碱、长春地辛、长春瑞滨或奥沙利铂。

42.一种抑制受试者的BCL9与β-连环蛋白的结合的方法，其包括给予根据权利要求1到32中任一项所述的多肽或根据权利要求33到41中任一项所述的药物组合物。

43.一种抑制受试者的经典Wnt/β-连环蛋白信号传送的方法，其包括给予根据权利要求1到32中任一项所述的多肽或根据权利要求33到41中任一项所述的药物组合物。

44.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括给予根据权利要求1到32中任一项所述的多肽或根据权利要求33到41中任一项所述的药物组合物。

45.根据权利要求44所述的方法，其中与用媒剂治疗的受试者相比，所述多肽或药物组合物在给药2周后能够将所述受试者的肿瘤体积减小超过50％。

46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述癌症是家族性腺瘤性息肉病(FAP)、眼癌、直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、口腔癌、良性和恶性肿瘤、胃癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、子宫体癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肾癌、脑/CNS癌、喉癌、多发性骨髓瘤、皮肤黑素瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、尤因氏肉瘤、卡波西肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌、小细胞肺癌、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、血管内皮瘤、维尔姆斯瘤、成神经细胞瘤、口咽癌、食管癌、喉癌、淋巴瘤、神经纤维瘤病、结节性硬化症、血管瘤、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌或淋巴管生成。

47.根据权利要求44到46中任一项所述的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌。

48.根据权利要求44到46中任一项所述的方法，其中所述癌症是胃癌。

49.根据权利要求44到46中任一项所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌。

50.根据权利要求44到46中任一项所述的方法，其中所述癌症是肝细胞癌。

51.根据权利要求44到46中任一项所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。

52.根据权利要求44到46中任一项所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌。

53.根据权利要求44到46中任一项所述的方法，其中所述癌症是皮肤黑素瘤。

54.根据权利要求44到46中任一项所述的方法，其中所述癌症是肺癌。

55.根据权利要求42到54中任一项所述的方法，进一步包括给予至少一种其他药剂。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述至少一种其他药剂选自由以下组成的群组：检查点抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、化疗剂和VEGFR抑制剂。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述检查点抑制剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA4抗体。

58.根据权利要求56所述的方法，其中所述检查点抑制剂靶向刺激检查点分子，所述刺激检查点分子选自由以下组成的群组：CD27、CD40、OX40、GITR和CD137。

59.根据权利要求56所述的方法，其中所述检查点抑制剂靶向抑制性检查点分子，所述抑制性检查点分子选自由以下组成的群组：A2AR、B7-H3、B7-H4、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM-3)、VISTA(C10orf54)和T细胞活化的V结构域Ig抑制子。

60.根据权利要求56所述的方法，其中所述EGFR抑制剂是厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、帕尼单抗、凡德他尼或西妥昔单抗。

61.根据权利要求56所述的方法，其中所述VEGF抑制剂或VEGFR抑制剂是帕唑帕尼、贝伐单抗、索拉非尼、舒尼替尼、阿西替尼、普纳替尼、瑞格非尼、凡德他尼、卡博替尼、雷莫芦单抗、乐伐替尼或阿柏西普。

62.根据权利要求56所述的方法，其中所述化疗剂是环磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素、氮芥、长春新碱、甲基苄肼、泼尼松龙、达卡巴嗪、博来霉素、依托泊苷、顺铂、表柔比星、卡培他滨、亚叶酸、放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、硼替佐米、卡铂、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊立替康、二氯甲基二乙胺、巯嘌呤、米托蒽醌、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、戊柔比星、长春碱、长春地辛、长春瑞滨或奥沙利铂。

63.根据权利要求42到62中任一项所述的方法，进一步包括用放射疗法和/或化学疗法治疗所述受试者。

64.根据权利要求42到62中任一项所述的方法，进一步包括测量至少一种生物标志物以监测治疗功效和/或选择受试者进行治疗。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述生物标志物是BCL9、CD44、轴抑制蛋白2、cMyc、LGR5、VEGFA、Sox2、Oct4、Nanog和/或活性β-连环蛋白中的一种或多种。

66.根据权利要求64或65所述的方法，其中降低的CD44、轴抑制蛋白2、cMyc、LGR5、VEGFA、Sox2、Oct4、Nanog和/或活性β-连环蛋白的基因表达水平和/或蛋白水平指示治疗功效，和/或其中如果CD44、轴抑制蛋白2、cMyc、LGR5、VEGFA、Sox2、Oct4、Nanog和/或活性β-连环蛋白的基因表达水平和/或蛋白水平升高，则选择受试者进行治疗。

67.一种根据权利要求1到41中任一项所述的多肽或药物组合物在制备用于治疗癌症受试者的药物中的用途。

68.根据权利要求67所述的用途，其中所述癌症是家族性腺瘤性息肉病(FAP)、眼癌、直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、口腔癌、良性和恶性肿瘤、胃癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、子宫体癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肾癌、脑/CNS癌、喉癌、多发性骨髓瘤、皮肤黑素瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、尤因氏肉瘤、卡波西肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌、小细胞肺癌、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、血管内皮瘤、维尔姆斯瘤、成神经细胞瘤、口咽癌、食管癌、喉癌、淋巴瘤、神经纤维瘤病、结节性硬化症、血管瘤、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌或淋巴管生成。

69.根据权利要求67或68所述的用途，其中所述受试者通过测量至少一种生物标志物来监测和/或选择，任选地其中所述生物标志物是BCL9、CD44、轴抑制蛋白2、cMyc、LGR5、VEGFA、Sox2、Oct4、Nanog和/或β-连环蛋白中的一种或多种。

70.根据权利要求1到41中任一项所述的多肽或药物组合物，其用于治疗受试者的癌症。

71.根据权利要求70所述的多肽或药物组合物，其中所述癌症是家族性腺瘤性息肉病(FAP)、眼癌、直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、口腔癌、良性和恶性肿瘤、胃癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、子宫体癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肾癌、脑/CNS癌、喉癌、多发性骨髓瘤、皮肤黑素瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、尤因氏肉瘤、卡波西肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌、小细胞肺癌、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、血管内皮瘤、维尔姆斯瘤、成神经细胞瘤、口咽癌、食管癌、喉癌、淋巴瘤、神经纤维瘤病、结节性硬化症、血管瘤、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌或淋巴管生成。

72.根据权利要求70或71所述的多肽或药物组合物，其中所述受试者通过测量至少一种生物标志物来监测和/或选择，任选地其中所述生物标志物是BCL9、CD44、轴抑制蛋白2、cMyc、LGR5、VEGFA、Sox2、Oct4、Nanog和/或β-连环蛋白中的一种或多种。

73.一种制备根据权利要求1到32中任一项所述的多肽的方法，其包括使用固相合成生成能够经历反应以形成一种或多种烃交联剂的多肽，其中所述多肽包含选自表1的任何序列或其变体，并且其中：

(a)Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄各自是α,α-二取代氨基酸；

(b)Xaa₁和Xaa₂各自是α,α-二取代氨基酸，且烃交联剂存在于Xaa₃和Xaa₄之间；或

(c)Xaa₃和Xaa₄各自是α,α-二取代氨基酸，且烃交联剂存在于Xaa₁和Xaa₂之间。

74.根据权利要求73所述的方法，其中所述多肽包含LQTLRXaa₁IQRXaa₂L(SEQ ID NO:3)、Xaa₁LQXaa₂LRXaa₃IQRXaa₄L(SEQ ID NO:4)或其变体。

75.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述α,α-二取代氨基酸是α-甲基,α-烯基氨基酸。

76.根据权利要求73到75中任一项所述的方法，进一步包括通过金属介导的闭环烯烃复分解形成所述一种或多种烃交联剂。

77.根据权利要求73到76中任一项所述的方法，进一步包括通过高效液相色谱(HPLC)纯化所述多肽。

78.根据权利要求77所述的方法，其中所述纯化的多肽基本不含金属。

79.一种用于制备根据权利要求1到32中任一项所述的多肽的试剂盒。

80.根据权利要求79所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于进行金属介导的闭环烯烃复分解的金属催化剂。

81.一种编码根据权利要求1到32中任一项所述的多肽的分离核酸。

82.一种包含根据权利要求81所述的分离核酸的载体。

83.一种包含根据权利要求82所述的载体的宿主细胞。

84.一种产生多肽的方法，其包括在足以产生所述多肽的条件下，在培养基中培养根据权利要求83所述的宿主细胞。

85.一种用于治疗受试者的癌症的试剂盒，其包含根据权利要求1到41中任一项所述的多肽或药物组合物。