CN101056886A - 促进血细胞生成的分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及EPO模拟肽和用于生产多价和/或超价肽的特殊合成方法。

Description

促进血细胞生成的分子

本发明涉及肽类(例如红细胞生成素受体的结合分子)、其制备方法、包含这些肽的药物和它们在选择的适应证(优选在治疗各种类型的贫血症和中风)中的用途。

激素红细胞生成素(EPO)是由165个氨基酸组成的糖蛋白，并具有四个糖基化位点。四个复杂的糖侧链占约35KD的整个分子量的40％。EPO在肾中形成，并从那里迁移到刺激红血球产生的脾和骨髓中。在慢性肾病中，EPO产生的减少导致红细胞减少型贫血症。使用通过基因工程制备的重组EPO，可有效地治疗贫血症。EPO可改善透析患者的生活质量。使用重组EPO不仅可改善肾贫血症，而且可改善早产新生儿中的贫血症、炎症和肿瘤相关的贫血症。利用EPO，在肿瘤患者中可以更成功地进行高剂量的化学疗法。类似地，如果在放射疗法疗的范围内进行给药，EPO可促进癌症患者的康复。

在使用EPO的治疗中，问题在于所需的剂量方案是以频繁的或连续的静脉内或皮下应用为基础，因为蛋白质在体内被较快地分解。因此，重组EPO衍生的分子的发展趋向于选择性修饰该糖蛋白，例如，通过额外的糖基化或聚乙二醇化，以便增加稳定性并因此增加生物学半寿期。

与使用重组EPO治疗有关的另一个重要问题是在治疗期间患者对重组EPO产生抗体的危险。这是由于重组EPO与内源性EPO不完全相同。一旦诱导抗体生成，它可产生抗体，该抗体还损害内源性EPO的活性。这常常增加治疗所需的重组EPO的剂量。特别是如果该抗体损害内源性EPO的活性，这种作用可被解释为治疗诱导的自身免疫性疾病。在经历肾移植的透析患者在EPO治疗数月或数年的情况下，这是特别不期望的。然后抗体可损害由移植物产生的内源性EPO的活性，并因此损害移植物器官的红细胞生成活性。目前，为了增加生物学半寿期而在重组EPO中引入的修饰将是否恶化或改善这个难题，还是未解决的问题。通常，人们预计大量的修饰和更长的半寿期将恶化这个难题的性质。

一个可替代的策略是由与红细胞生成素不共有序列同源性或结构关系的氨基酸制备合成肽。据表明，显著小于红细胞生成素的与EPO序列不相关的肽可起激动剂的作用(Wrighton等人，1996)。相同的作者报道，可将这类肽截短成具有10个氨基酸长度的仍然有活性的最小肽。

模拟EPO活性的合成肽是国际主张公开WO 96/40749的主题。它公开了明显共有序列的10至40个氨基酸的模拟肽，该共有序列优选在通常被称为10和17位上包含两个脯氨酸，其中之一被认为是必需的。

因此迄今为止，EPO受体的所有基于小肽的激动剂都具有一个结构，该结构包含至少一个脯氨酸，经常是在所定义位置上的两个脯氨酸残基，参照它们在非常有活性的红细胞生成素模拟肽EMP1中的位置，其通常被编号为10和17位(国际主张公开WO 96/40749；Wrighton等人，1996，Johnson等人，1997)：

             GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG。

这些脯氨酸对肽的有效性来说被认为是不可缺少的。对于17位上的脯氨酸，已经通过与受体的相互作用证实了这一点，而10位上的脯氨酸被认为是分子的正确折叠所必需的(同样参见Wrighton等人，1996，1997)。由脯氨酸的特殊立体化学性质支持的正确折叠，通常是生物学活性的必要预先调节。通常，脯氨酸是形成结构的氨基酸，其经常参与-例如在这种情况下-发夹结构和β转角的形成。由于这种性质，尤其是，其是分解含脯氨酸的肽/蛋白质的后-脯氨酸-特异性内肽酶的常见攻击点。通过所述的“单个-打击”后脯氨酸切割，许多内源性肽激素(血管紧张肽I和血管紧张肽II、硬骨鱼紧张肽、促甲状腺素释放素(thyreoliberin)、其它的释放素，等等)被灭活。因此，通过这些常见的和有活性的酶的活性，缩短了含脯氨酸的EPO模拟肽的半寿期。

可化学制备这类肽，并且不需要重组生产，重组生产在控制和产生具有规定质量和同一性的产品方面更困难得多。该小尺寸的肽的化学生产在生产成本方面是有竞争力的。而且，化学生产允许分子变异，例如糖基化、聚乙二醇化或任何其它规定修饰的规定引入，它们可具有增加生物学半寿期的已知效力。然而，迄今为止一直没有批准使用现有的EPO模拟肽的任何疗法。

因此，本发明的目的在于提供表现出天然EPO的至少基本部分的生物学活性的可替代性合成肽，并因此提供用于有效治疗策略(特别是用于治疗贫血症或中风)的可替代性方法。

根据本发明的一个方面，提供长度为至少10个氨基酸的肽，其能结合EPO受体并包含激动剂活性。因此，该肽描述了EPO模拟性质。根据本发明的EPO模拟肽在通常被称为EPO模拟肽10位的位置上不包含脯氨酸，但包含带正电荷的氨基酸(关于编号，请参见如Johnson等人1997描述的EMP 1祖先序列)。

在10位上的所述脯氨酸位于氨基酸基序中，该基序对于特定的折叠结构来说是特征性的，即β-转角基序(请参见Johnson，1997)。在受体结合时形成所述的β-转角结构。因此，根据本发明的EPO模拟肽在10位上不包含β-转角基序中的脯氨酸，但包含带正电荷的氨基酸。实例是K、R、H或各自的非天然的氨基酸，例如高精氨酸。

而且，提供了包含以下氨基酸序列的肽：

             X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅

其中每个氨基酸选自天然的或非天然的氨基酸，并且

X₆是C、A、E、α-氨基-γ-溴代丁酸或高半胱氨酸(hoc)；

X₇是R、H、L、W或Y或S；

X₈是M、F、I、高丝氨酸甲基醚(hsm)或去甲异亮氨酸(norisoleucine)；

X₉是G或G的保守性交换；

X₁₀是脯氨酸的非保守性交换；

或X₉和X₁₀被单个氨基酸替代；

X₁₁独立地选自任意氨基酸；

X₁₂是T或A；

X₁₃是W、1-nal、2-nal、A或F；

X₁₄是D、E、I、L或V；

X₁₅是C、A、K、α-氨基-γ-溴代丁酸或高半胱氨酸(hoc)；

条件是X₆或X₁₅是C或hoc。

所述肽的共有序列的长度优选在十至四十或五十或六十个氨基酸之间。长度超过六十个氨基酸的肽，即使技术上是适宜的，也不一定是优选的，因为随着肽长度的不断增加，合成通常变得更加复杂并因此成本更高。在优选的实施方案中，肽共有序列具有至少10、15、18或20个氨基酸的长度。当然，它们可分别地被更长的序列包含。所述的肽序列可被看成是EPO受体的结合结构域。作为EPO模拟肽，它们能够结合EPO受体。

非常令人意外的是，尽管一个或—根据一些实施方案—甚至两个脯氨酸都被其它的天然的或非天然的氨基酸替代，根据本发明的肽确实表现出EPO模拟活性。事实上，根据本发明的肽具有与含脯氨酸的肽相当的活性。然而，值得注意的是，替代脯氨酸残基的氨基酸不代表保守性交换，而是非保守性交换。优选地，使用带正电荷的氨基酸，例如碱性氨基酸例如K、R和H并且特别是K用于替代。用于替代的非保守性氨基酸还可是非天然的氨基酸，并优选是具有带正电荷侧链的氨基酸。也包括所提到的氨基酸各自的类似物。非天然氨基酸的适宜实例是高精氨酸。根据一个实施方案，除了天然的氨基酸精氨酸之外，肽在10位上具有带正电荷的氨基酸。因此根据该实施方案，脯氨酸10被选自K、H或非天然的带正电荷的氨基酸，例如高精氨酸的氨基酸替代。优选的是，肽在10位上具有赖氨酸或高精氨酸。如上所述，在17位上的脯氨酸也可被非保守性氨基酸替代。在这一方面还优选的是：所述的非保守性氨基酸是具有带正电荷侧链的氨基酸，例如K、R、H，或者各自的非天然氨基酸，例如高精氨酸。根据该实施方案的子实施方案，除了天然的氨基酸精氨酸之外，肽在17位上具有带正电荷的氨基酸。因此根据该实施方案，脯氨酸17被选自K、H或非天然的带正电荷的氨基酸例如高精氨酸的氨基酸替代。优选的是，该肽在17位上具有赖氨酸或高精氨酸。

而且，所述序列可具有N末端的和/或C末端的乙酰化和酰胺化。一些氨基酸还可以是磷酸化的。

根据本发明，还提供结合红细胞生成素受体并包含下列氨基酸序列的肽：

               X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅

其中用标准字母缩写表示每个氨基酸，并且

X₆是C；

X₇是R、H、L或W；

X₈是M、F或I；

X₉是G或G的保守性交换；

X₁₀是脯氨酸的非保守性交换；

X₁₁独立地选自任意氨基酸；

X₁₂是T；

X₁₃是W；

X₁₄是D、E、I、L或V；

X₁₅是C。

而且，X₇可以是丝氨酸，X₈可以是hsm或去甲异亮氨酸，以及X₁₃也可是1-nal、2-nal、A或F。肽共有序列的长度优选在十至四十或五十或六十个氨基酸之间。在优选的实施方案中，肽共有序列包含至少10、15、18或20个氨基酸。

根据本发明的肽，除了L-氨基酸或立体异构D-氨基酸之外，还可包含非天然/非常规的氨基酸，例如α，α-二替代的氨基酸、N-烷基氨基酸或乳酸，例如1-萘丙氨酸、2-萘丙氨酸、高丝氨酸-甲基醚、β-丙氨酸、3-吡啶丙氨酸、4-羟脯氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、高精氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-乙酰甘氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、正-赖氨酸、5-氨基乙酰丙酸或氨基戊酸。特别优选使用N-甲基甘氨酸(MeG)和N-乙酰甘氨酸(AcG)，特别是在末端位置。同样在本发明范围内的是，为所定义肽的逆肽(retropeptide)、反向肽(inverso peptide)和逆/反向肽，以及全部由D-氨基酸组成的那些肽。

本发明还涉及肽的衍生物，如甲硫氨酸的氧化产物、或脱酰氨基的谷氨酰胺、精氨酸以及C末端酰胺。

根据本发明的一个实施方案，肽确实具有替代氨基酸残基X₉和X₁₀的单个氨基酸。在这个实施方案中，同样两个残基都可以被一个非天然的氨基酸，如5-氨基乙酰丙酸或氨基戊酸替代。

在另一个实施方案中，根据本发明的肽包含下列共有序列：

               X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅

其中X₆至X₁₅具有上述含义，并且其中

X₄是Y；

X₅独立地选自任何氨基酸，并优选是A、H、K、L、M、S、T或I。

根据本发明的肽可延长，并可包含下列共有序列：

         X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈

其中X₄至X₁₅具有上述含义，并且其中

X₃独立地选自任何氨基酸，优选D、E、L、N、S、T或V；

X₁₆独立地选自任何氨基酸，优选G、K、L、Q、R、S或T，更优选K、R、S或T；

X₁₇独立地选自任何氨基酸，优选A、G、P、R、K、Y或具有带正电荷侧链的非天然氨基酸，更优选K或Har；

X₁₈独立地选自任意氨基酸。

在本发明的另一个实施方案中，肽包含X₆，其为C、E、A或hoc，优选C，和/或包含X₇，其为R、H或Y或S，和/或包含X₈，其为F或M，和/或包含X₉，其为G或A，优选G，和/或包含X₁₀，其为K或Har，和/或包含X₁₁，其为V、L、I、M、E、A、T或去甲异亮氨酸，和/或包含为T的X₁₂，和/或包含为W的X₁₃，和/或包含X₁₄，其为D或V，和/或包含X₁₅，其为C或hoc，优选C，和/或包含X₁₇，其为P、Y或A或碱性的天然或非天然氨基酸。然而，还优选的是，X₁₇是K或具有带正电荷侧链的非天然氨基酸，例如高精氨酸。

图19公开具有EPO模拟活性的其它新的和适宜的肽序列。其它的肽具有下列序列：

GGTYSCHFGALTWVCKKQGG

GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG

GGTYSCHFGPLTWVCKKQGG

GGTYSCHFGKLTWVCKPQGG

GGTYSCHF-(ALS)-LTWVCKPQGG

GGTYSCHF-(ALS)-LTWVCKKQGG

具有5-氨基乙酰丙酸(5-Als)：

还公开了具有与激素红细胞生成素的受体结合能力并显示激动剂活性的肽，其特征在于该肽不含有脯氨酸。如上所述，这些肽优选在通常被称为10和17位的位置上不包含脯氨酸，但包含不同的天然氨基酸或5-氨基乙酰丙酸。它们优选在17位上具有赖氨酸。还公开了编码各自肽的核酸。

在根据本发明的多肽的氨基酸序列中，可以进行一个或多个保守性氨基酸的替代，其中该替代发生在具有非极性侧链的氨基酸、具有极性侧链的天然的或非天然的不带电D-或L-氨基酸、具有芳香族侧链的氨基酸、天然的或非天然的带正电荷的D-或L-氨基酸、天然的或非天然的带负电荷的D-或L-氨基酸以及相似大小和分子量的任何氨基酸中，其中原始氨基酸的分子量不应与原始氨基酸的分子量偏差超过大约+/-25％，并保持对激素红细胞生成素受体的结合能力，具有激动效应。优选地，替代不超过1、2或3个氨基酸。优选在10和17位上未引入脯氨酸的序列变体。

本文中所述的肽序列可被用作适宜的单体肽单元，其构成EPO受体的结合结构域。在那里它们可以单体形式被使用，因为它们结合EPO受体。如本文中所述的，它们优选被用作二聚体，因为显示了诱导EPO受体二聚化的能力，并因此通过单体结合单元的二聚化增强生物学活性。

因此，显然许多不同的肽都在本发明的范围之内。然而，已经发现序列Ac-VLPLYRCRMGRETWECMRAAGVTK-NH₂具有一定的缺点，并因此根据本发明不是优选的。

在所述单个肽序列的起点(N未端)和终点(C未端)，可除去和/或加入至多五个氨基酸。不言而喻，只要保存了肽功能，大小并不相关。此外，请注意，可能太短以至作为单体不能表现其的活性的单独肽序列通常在二聚化后起激动剂的作用。因此，优选以它们的二聚体形式使用这类肽。因此，本发明的精神也包括各自截短和或延长的实施方案。

在本发明中，大写字母形式的单字母代码的缩写是标准多肽命名法的那些缩写，其通过添加非天然氨基酸而被扩展。

代码        氨基酸

A           L-丙氨酸

V           L-缬氨酸

L           L-亮氨酸

I           L-异亮氨酸

M           L-蛋氨酸

F           L-苯丙氨酸

Y           L-酪氨酸

W           L-色氨酸

H           L-组氨酸

S           L-丝氨酸

T           L-苏氨酸

C           L-半胱氨酸

N           L-天冬酰胺

Q           L-谷氨酰胺

D           L-天冬氨酸

E           L-谷氨酸

K           L-赖氨酸

R           L-精氨酸

P           L-脯氨酸

G           甘氨酸

Ava，5-Ava  5-氨基戊酸

Als，5-Als  5-氨基乙酰丙酸

MeG         N-甲基甘氨酸

AcG         N-乙酰甘氨酸

Hsm         高丝氨酸甲基醚

Har     高精氨酸

1nal    1-萘丙氨酸

2nal    2-萘丙氨酸

βAla   β-丙氨酸

hoc     高半胱氨酸

如上所述，本发明还包括通过单个氨基酸的保守性交换而进行的所述肽和所定义的肽共有序列的修饰。这类交换改变结合分子的结构和功能，但在大多数情况下只是轻微地改变。在保守性交换中，一个氨基酸被具有相似性质的一组中的另一个氨基酸替代。

相应组的实例是：

-具有非极性侧链的氨基酸：A、G、V、L、I、P、F、W、M

-具有极性侧链的不带电荷的氨基酸：S、T、G、C、Y、N、Q

-具有芳香族侧链的氨基酸：F、Y、W

-带正电荷的氨基酸：K、R、H

-带负电荷的氨基酸：D、E

-相似大小或分子量的氨基酸，其中替代氨基酸的分子量与原始氨基酸的分子量偏差最大为+/-25％(或+/-20％、+/-15％、+/-10％)。

不言而喻，在具有带正电荷的侧链的组的情况下，该组还包括具有各自侧链特性的非天然氨基酸，例如高精氨酸。如果不能明确将替代脯氨酸10的分子例如非天然氨基酸分配到以它们的侧链性质为特征的上述组中，通常应将其看成是根据本发明的脯氨酸的非保守性替代。关于对这些稀有氨基酸分类，根据分子量的分类辅助可能是有帮助的。

更具体地说，Wrighton等人(美国专利5,773,569，以及相关专利)使用噬菌体展示技术进行了详细考查，其氨基酸可被替代，同时保持活性。他们还研究和公开了关于可能截短型，即给定EPO模拟肽的最小长度的数据。然而，靠近中心甘氨酸残基的脯氨酸似乎是获得活性肽的唯一可能性。

根据本发明的一个实施方案，提供选自由如下给出SEQ ID NOS2、4-9组成的组的肽。特别优选的是如在SEQ ID NO2中所示的在10位上具有K和在17位上具有K的肽。

SEQ ID NO 2：GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG

SEQ ID NO 4：GGTYSCHFGKLTWVCKPQGG

SEQ ID NO 5：GGTYSCHFGRLTWVCKPQGG

SEQ ID NO 6：GGTYSCHFGRLTWVCKKQGG

掺入5-氨基乙酰丙酸(Als)：

SEQ ID NO 7：GGTYSCHF-(Als)-LTWVCKPQGG

SEQ ID NO 8：GGTYSCHF-(Als)-LTWVCKKQGG

SEQ ID NO 9：GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG

根据一个实施方案，在根据上文给出的SEQ ID NO 2和4至9的单体或其修饰型的基础上，形成肽二聚体或多聚体。还可以例如通过单个氨基酸的保守性交换来修饰本文中所述的肽，其中优选地，交换不超过1、2或3个氨基酸。

优选这些肽在N末端被修饰成AcG，和在C末端修饰成MeG。

如上所述，本发明所述的肽被认为是识别红细胞生成素受体的结合位点的单体结合结构域。然而，如Wrighton等人(Wrighton 1997)所指出的，通常需要这些结合结构域中的两个以便使所述受体均二聚化，并诱导信号转导。因此，并不非常令人意外的是，这些结合结构域的两个的组合在一个单分子中，大大地提高了活性，带来结果的是：具有一个单结合结构域的肽显示相同的活性定性模式，而连接在一起的两个结合结构域显示了低得多的ED50(有效剂量50％，活性的度量)。在本说明书的上下文中包埋两个结合结构域的肽被特别说明为二价或二聚体肽并且是特别优选的。

用于组合两个单体结合结构域的一种熟知技术方案是二聚化。迄今为止所有遵循该方法的方案的特征在于：

a)首先将结合结构域分别合成为单价或单体肽，其可通过连接步骤b制备中的活性基团进行修饰；

b)在第二步反应步骤中，在单独的二聚化反应中两个(大多数情况下是相同的)结合结构域连接在一起，其中所述的结合结构域还可包含通常被插入两个二聚化的结构域之间的连接体分子。

这类二聚体是二价肽的实例，并表现出基本上与单体相同的生物学功能。通常，在EPO模拟肽的情况下它们显示出增强的生物学活性。

一些使单体二聚化或寡聚化的技术是本领域技术人员所知的，其中根据本发明的教导还可进行应用。例如通过共价连接于连接体，可使单体二聚化。连接体是在本发明的多肽单元之间产生共价键的连接分子。可以促进结合EPO受体的方式，通过连接体来组合多肽单元(Johnson等人，1997；Wrighton等人，1997)。此外，本发明还涉及由Wrighton等人描述的通过与蛋白载体分子过非共价相互作用(Wrighton，1997)，单体生物素化的多聚化作用。还可能使用生物素/链霉亲和素系统，即将肽的C末端进行生物素化并随后使用链霉亲和素培育生物素化的肽。或者，众所周知通过形成二酮哌嗪结构来完成二聚化。例如Cavelier等人详细描述了为技术人员所知的这种方法(在：Peptides：The wave of the Future；Michal Lebl and Richard A.Houghten(eds)；American Peptide Society，2001)。与二聚化和非共价多聚化有关的这些文件的公开内容引入本文来作为参考。现有技术中已知的另一种可替代的获得肽二聚体的方法是使用作为后面连接体部分(其与N末端氨基起反应)的反应前体的双功能活化的二羧酸衍生物，从而形成最终的二聚体肽(Johnson等人，1997)。通过共价连接于连接体，还可使单体二聚化。优选连接体包含NH-R-NH，其中R是用能结合另一种分子部分的官能团(例如羧基或氨基)取代的低级亚烷基。连接体可包含赖氨酸残基或赖氨酸酰胺。同样PEG可用作连接体。连接体可以是含有两个羧酸的分子，并任选在一个或多个原子上被官能团(例如能结合一个或多个PEG分子的胺)取替代。在WO2004/101606中也公开了用于肽与连接部分寡聚化和二聚化的可能步骤的详细说明。

和二聚化/多聚化有关的这些文件的公开内容引入本文作为参考。

肽单体或二聚体还可包含至少一个间隔子部分。优选所述的间隔子将单体或二聚体的连接体连接至水溶性聚合物部分或保护基团上，其例如可以是PEG。PEG优选的分子量为至少3KD，优选在20和60KD之间。间隔子可以是末端具有-NH-键或COOH-基团的C1-12部分，并任选在一个或多个可利用的碳原子上被低级烷基取代基取代。在WO 2004/100997中公开了特别优选的间隔子。所有文件-WO2004/100997和WO 2004/101606-被引入本文来作为参考。在WO2004/101600中公开了PEG修饰的肽，其同样被引入本文作为参考。

尽管根据本发明的教导，合成二聚物分子的现有技术方法在功能上是足够的并因此是可用的，但其具有一些缺点。

感觉到一个潜在的缺点在于必须首先分别合成被连接的单体。由于在分别进行二聚化和多聚化反应期间，单体肽的随机匹配，通过该方法特别难于(有选择地和有意地)获得异二聚体二价/多价肽。至少这将在特殊的、计划的异二聚体的生产中带来重大损失。两个或更多个略微不同的单体结合结构域的二价或多价肽是非常合乎需要的，因为由于它们的异二聚体特性，可在两个结构域之间引入特殊的相互作用，所述的结构域能在最终的二价肽中稳定它们的相互作用。然而，由于在与现有技术“随机二聚化反应”有关的生产中的高损失，这通常是经济上没有吸引力的方法。

因此应用现有技术二聚化方法-即使技术上是适宜的-对于提供这些具有所述的异质结合结构域的肽而言，也具有一些经济上的缺点。然而有利的是，本发明也教导了获得高活性的多价-或二价肽的更有效得多的策略，所述的肽甚至包含异质结合结构域。

这种策略的核心概念避免在二聚化或多聚化前的单独反应中合成形成多价-或二价肽一部分的单体肽，但可在一个步骤中合成作为单肽的最终的二价或多价肽，如在一个单固相反应中。因此不再需要单独的二聚化或多聚化步骤。这个方面提供了很大的优点，即在最终的肽单元中对各个序列位点的全面和独立控制。由于对各个序列位置的独立控制，该方法容许在肽单元中易于包埋至少两个不同的受体特异结合结构域。

根据该实施方案，在结合结构域(即“连接体区”)之间的最终肽序列仅仅由氨基酸组成，因此产生一个单一的、连续的二价-或多价EPO模拟肽。在本发明的优选实施方案中，连接体由符合高度构象柔性要求的天然或非天然的氨基酸组成。在这方面，有利的是使用它们在扭转方面的高度柔性已知的甘氨酸残基作为连接氨基酸。然而，也可使用其它的氨基酸，例如丙氨酸或β-丙氨酸、或其混合物。所用氨基酸的数量和选择取决于各自的空间情况。本发明的这个实施方案容许通过分子建模定制设计适宜的连接体，以便避免生物活性构象的扭转。特别优选由3至5个氨基酸组成的连接体。

值得注意的是：在最终的二价或多价肽的功能域(或单体单元)之间的连接体可以是肽的独特部分，或是完全或部分地由属于单体功能域一部分的氨基酸组成。例如在氨基酸1和2和19和20位上的甘氨酸残基可以形成连接体的一部分。实例参见Seq.11至14。因此，术语“连接体”更应在功能上进行定义而不是在结构上进行定义，因为氨基酸可形成连接体单元以及单体亚单元的一部分。

由于如上所述，在合成二价/多价肽的期间，最终肽之中的各个序列位置是受控制的并因此可被精确确定，有可能定做或定制包含连接体的肽或其特异区域或结构域。这具有特殊的优点，因为它可避免由于不利的分子内相互作用而扭曲最终二价肽的生物活性构象。在合成前，通过分子建模可评价扭曲的风险。这可特别应用于设计在单体结构域之间的连接体。

根据本发明的连续二价/多价肽，显示出比相应单体肽高得多的活性，并因而证实从其它二聚体肽已知的观测结果，即功效的增加与二价肽概念有关。

至于单体肽和二聚体肽，通过如乙酰化或酰胺化连续的二价/多价肽可被修饰或者可在C末端或N末端位置延长。用于上述单体肽(单体)的现有技术修饰，包括连接可溶性部分(例如PEG、淀粉或葡聚糖)，也可应用于根据本发明的多价肽或二价肽。

所有可能的修饰也都可用来修饰连接体。具体地说，将可溶性聚合物部分连接于连接体例如PEG、淀粉或葡聚糖可能是有利的。

根据本发明的最终多价或二价肽的合成，有利地还可包括在每个结合结构域中两次连续的和独立的形成二硫键或其它分子内的键。从而还可使肽环化。

在本文中所报道的肽单体基础上，可有利地形成根据本发明的二价结构。

随后列出一些用于二聚化EPO受体的适当肽单元的实例。结合结构域上方的线条代表可选择的但优选的分子内二硫桥：

SEQ ID NO 10(基于SEQ ID NO 2)：

SEQ ID NO 11

通过分子建模定制这些二价结构中的连接体，以便避免生物活性构象的扭曲。

SEQ ID NO 12

连接体序列可截短一个甘氨酸残基。这条序列也是由同时形成结合结构域一部分的甘氨酸残基组成的连接体的实例(见SEQ ID NO2)。

结合结构域还可用作单体序列(SEQ ID NO 13)

GGTYSCHFGKLTWVCKKQG

SEQ ID NO 14：

这条序列提供了包埋两个稍微不同(异质的)结合结构域的根据本发明的连续二价肽。用现有技术二聚化方法的(参见上文)所述的二价肽是不可经济地获得的。这些结合结构域还可应用作如下序列的单体：

SEQ ID NO 15：

GGTYSCHFGKLTWVCKKKKGG.

SEQ ID NO 15a：

GGTYSCHFGKLTWVCKKKDGG.

另一个实例是：

GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG

根据另一个实施方案，肽任选具有额外的氨基酸，优选具有反应性侧链的氨基酸，例如在如下序列的N末端的半胱氨酸：

C-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG

C-GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG

其它肽实例具有下列氨基酸序列：

GGTYSCSFGKLTWVCK-Har-QGG

GGTYSCHFG-Har-LTWVCK-Har-QGG

第一条序列在X₇位上具有丝氨酸。发现：当该序列被掺入二聚体中时，通过引入羟基，产生新的氢桥。因此，X₇位上的丝氨酸的使用特别有利于二聚体，因为它稳定了生物活性构象。

具有非天然的氨基酸高精氨酸第二条序列特别适用于兽医目的的药物组合物。通常发现：携带具有长的带正电荷侧链的氨基酸(例如10位上和/或17位上的高精氨酸)的肽序列，对EPO受体(例如小鼠/狗受体)具有强结合能力。因此，它们特别适合用于兽医产品，但其用途并不仅限于此。

例如，反应性侧链可用作用于另外修饰的连接带。此外，肽任选包含在第一个和第二个和/或第三个和第四个半胱氨酸之间的分子内二硫桥。

重要的是注意：将由SEQ ID 2、4-9和12、13和15、15a举例说明的单体肽有利地组合成根据本发明的连续二价肽。然而，也可应用用于这些单体的二聚化的现有技术方法。落在本发明范围中的被应用于单体肽的这些现有技术方法的实例包括(但不限于)：

1.通过C末端至C末端的连接进行的二聚化，其中所述单体肽之一的C末端共价结合于另一个肽的C末端。在单体之间的连接体/间隔子可包含二酮哌嗪单元。通过活化C末端的甘氨酸单体，可获得优选的Gly-Gly二酮哌嗪构架。该原理还可用来形成C末端的二聚化。

下列式和实例代表四个通过分子建模优化的定制实例：

(a)以SEQ ID NO 2为基础的二聚体(图2中显示了二聚体构象)：

(b)以具有被截短一个甘氨酸的连接体的SEQ ID NO 2为基础的二聚体；图3中显示了其构象。

(c)以甘氨酸被β-丙氨酸替代的SEQ ID NO 2为基础的二聚体(图4)。单体(SEQ ID NO 16)也可用作EPO模拟肽。

(d)以可替代的甘氨酸被β-丙氨酸替代的SEQ ID NO 2为基础的二聚体(图5)。单体(SEQ ID NO 17)还可用作EPO模拟肽。

2.通过N末端至N末端的连接进行的二聚化，其中所述单体肽之一的N末端共价结合于另一个肽的N末端，由此间隔单元优选含有二羧酸结构单元。

(a)在一个实施方案中，得到的以在N末端延长一个甘氨酸残基的SEQ ID NO 2为基础的二聚体(SEQ ID NO 18)，包含作为连接体/间隔子的己二酰单元(图6)：

(b)在可替代的实施方案中，通过使用作为连接体/间隔子的辛二酰单元(图7)，来实施二聚化。

3.通过侧链进行的二聚化，其中用包含连接两个肽单体的合适间隔子分子，所述单体肽之一的氨基酸侧链共价结合于另一个肽的氨基酸侧链。这可包括：

(a)通过酰胺键的连接。

(b)或通过二硫桥的连接：

X代表参与形成各自连接键的各自氨基酸的主链核。

如上所述的各自装配方法还可用于制备多聚体。

应当指出：本文中所述的各种肽的所有结合结构域单独或作为二价肽/多价肽的一部分还可以单体形式使用，和/或与一个或多个其它相同的或不同的肽结构域一起进行组合，以便形成各自同质或异质二价肽或多价肽。

所述肽可以通过如乙酰化或酰胺化进行修饰或者在C末端或N末端位置延长。使用一个或多个氨基酸在两个末端中的一个末端进行延伸反应，如制备聚合物的连接位点，经常产生可最好被制成连续肽的异二聚体二价肽单元。

本发明的化合物可有利地用于制备人和/或兽用的药物组合物。作为EPO模拟物，它们显出与红细胞生成素基本上相同的定性活性模式。因此，它们通常适于与红细胞生成素适合的相同的适应证。

红细胞生成素是细胞因子超家族中的成员。除了在引言中所述的刺激效应之外，还发现红细胞生成素可刺激干细胞。因此，本文中所述的EPO模拟物适合于由干细胞相关作用所引起的所有适应证。非限制性实例是预防和/或治疗与神经系统相关的疾病。实例是神经损伤、疾病或紊乱，例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、戈谢病、Tay-Sachs病、神经病、周围神经损伤、脑肿瘤、脑损伤、脊髓损伤或中风损伤。根据本发明的EPO模拟肽还适合于遭受心脏衰竭或处于遭受心脏衰竭危险中的患者的预防和/或治愈性治疗。实例是心肌梗塞、冠状动脉病、心肌炎、化学疗法治疗、酒精中毒、心肌病、高血压、瓣膜心脏病包括二尖瓣关闭不全或主动脉瓣狭窄和甲状腺紊乱、慢性和/或急性冠脉综合征。

此外，EPO模拟物可用于刺激生理动员、内皮前体细胞的增殖和分化，用于刺激血管发生，用于治疗与内皮前体细胞的功能障碍相关的疾病，并用于生产治疗所述疾病的药物组合物和包含所述肽和其它适合于刺激内皮前体细胞的药剂的药物组合物。所述疾病的实例是高胆固醇血症、糖尿病、内皮介导的慢性炎性疾病、内皮增生包括网状内皮增生、动脉粥样硬化症、冠心病、心肌缺血、心绞痛、年龄相关的心血管疾病、雷诺病、妊娠诱导的压力过高、慢性或急性肾衰竭、心力衰竭、创伤愈合以及继发性病。

此外，根据本发明的肽是用于输送药剂穿过血脑屏障的合适载体，并可用于相应的目的和/或生产能通过血脑屏障的相应的治疗缀合剂。

本文中所述的肽特别适合于治疗以红细胞生成素缺乏或红细胞数目低或有缺陷为特征的障碍，并特别适合于治疗任何类型的贫血症或中风。该肽还适合于提高和/或维持哺乳动物中的血细胞比容。所述的药物组合物可任选包含药学上可接受的载体，以便采取用于预定给药过程的组合物。例如在WO 2004/101611和WO 2004/100997中描述了合适的输送方法和载体以及添加剂。

如上所述，与相应的单体肽相比，单体肽二聚化成二聚体或甚至多聚体通常提高EPO模拟物激动剂的活性。然而，期望进一步提高活性。例如，关于细胞机理活化，甚至二聚体EPO模拟肽的作用不如EPO强。

现有技术中建立了几种方法以便提高肽的活性，例如通过变异氨基酸序列以便鉴别更有效的候选物。然而，迄今为止仍然期望进一步提高肽的活性，特别是EPO模拟肽的活性，以便改进生物学活性。

本发明的另一个实施方案提供该问题的解决方法。其中提供了结合靶分子的化合物，并且该化合物包含：

i)至少两个肽单元，其中每个肽单元包含至少两个具有结合靶的能力的结构域；

ii)至少一个聚合物载体元件；

其中所述的肽单元结合所述的聚合物载体元件。

令人意外地是，已经发现：根据本发明的两个或更多二价肽或多价肽在聚合物支持体上的组合，正在大大地增加二价(或甚至多价体)肽对其结合受体的效力，这不仅仅是加和的，而且是超过加和的。因此，观测到协同效应。

将用于本发明目的的术语“二价”定义为包含两个具有结合靶能力的结构域的肽，其中所述的靶特别是EPO受体。它与术语“二聚体”交换使用。因此，“多价”或“多聚”EPO模拟肽具有一些EPO受体的相应结合结构域。不言而喻，术语“肽”和“肽单元”不包含与大小有关的任何限制，并包含寡肽和多肽以及蛋白质。

包含两个或更多个连接于聚合物载体单元的二价或多价肽单元的化合物，在该实施方案的上下文中被称为“超价物(supravalent)”。这些超价分子非常不同于现有技术中已知的二聚体或多聚体分子。本技术的状态仅仅组合成单体EPO模拟肽，以便产生二聚体。相反，通过已经(起码)将二价肽单元连接至聚合物载体单元从而产生超价分子(图13至图15给出了实例)，来生成超价物分子。因此，大大地提高肽的全部活性和效力，并因此减少EC50剂量。

迄今为止，还没有完全了解与现有技术中已知的分子相比，超价分子具有重大效价的原因。可能是由于：现有技术中已知的二聚体分子每个二聚体分别仅仅提供一个靶受体结合单元。因此，在二聚体化合物的结合时，仅仅生成一个受体复合物，从而仅仅诱导一个信号转导过程。例如，通过PEG连接两个单体EPO模拟肽来形成肽二聚体，从而促进为信号转导所需的受体单体的二聚化(Johnson等人，1997)。与此相反，根据本发明的超价化合物包含一些已是二价或多聚的相应的受体结合单元。这可使得每个化合物分子在细胞表面上生成多个受体复合物，从而诱导多个信号转导并因此超加和性地加强肽单元的活性。超价化合物的结合可引起受体复合物在细胞表面上的成簇。

这个实施方案中所用的EPO模拟肽单元可以是同质或异质的，这意谓着使用相同的或不同的肽单元。这同样适用于也可以是同质或异质的肽单元的结合结构域(如上所述的单体肽)。结合于载体单元的二价或多价肽单元，结合相同的受体靶。然而，当然它们仍然能够在其氨基酸序列上有差异。二价或多价肽单元的单体结合结构域可以是线状的或环状的。例如，通过形成分子内半胱氨酸桥(参见上文)，可产生环状分子。

聚合物载体单元包含至少一个天然的或合成的分支的、线状的或树枝状的聚合物。聚合物载体单元优选可溶于水和体液，并优选是药学上可接受的聚合物。水溶性聚合物部分包括但不限于，如聚亚烷基二醇及其衍生物，包括PEG、PEG均聚物、mPEG、聚丙二醇均聚物、乙二醇和丙二醇的共聚物，其中所述的均聚物和共聚物是未被取代的，或在一端被下列所取代：酰基；甘油聚合物或聚唾液酸；纤维素和纤维素衍生物，包括甲纤维素和羧甲基纤维素；淀粉(如羟烷基淀粉(HAS))，特别是羟乙基淀粉(HES)和糊精，及其衍生物；葡聚糖和葡聚糖衍生物，包括硫酸葡聚糖，交联糊精和羧甲基糊精；肝素及其片段；聚乙烯醇和聚乙烯基乙基醚；聚乙烯吡咯烷酮；a，b-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺；和聚氧乙烯多羟基化合物。当然可使用其它生物学惰性的水溶性聚合物。简单、但仍然优选的合适载体单元的实例是例如聚乙二醇(二-马来酰亚胺，二-羧基，二-氨基等等)的同质双功能聚合物。

由于适合与本发明结合的不同聚合物的不同性质，聚合物的载体单元具有大范围的分子量。因此没有大小限制。然而，优选分子量为至少3KD，优选至少10KD和约20至500KD，更优选约30至150或约60或80KD。载体单元的大小取决于所选择的聚合物，并因此可发生变化。例如，特别当使用淀粉(例如羟乙基淀粉)时，分子量可相当地高。然后平均分子量可位于约100至4.000KD或甚至更高。优选选择载体单元的大小，使得各种肽单元最适于结合它们各自的受体分子。为了有利于这一点，本发明的一个实施方案使用包含分支单元的载体单元。根据该实施方案，将聚合物(例如PEG)连接于分支单元，因此得到允许掺入许多肽单元的大载体分子。合适分支单元的实例是甘油或聚甘油。根据Haag(2000，在本文中被引入以作为参考)的教导，例如还可使用树枝状分支单元。

优选地，在通过组合单体(头连接头、头连接尾或尾连接尾)而产生肽单元后，将聚合物载体单元连接到肽单元。通过共价的或非共价的(如配位)键，将聚合物载体单元连接到肽单元。然而，优选使用共价键。例如可通过肽单元的下列反应性氨基酸进行连接：如赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或N末端氨基以及C末端羧酸。

如果聚合物载体单元不具有合适偶联基团，可使用一些偶联物质以便适当地修饰聚合物，以便它能与肽单元上的至少一个反应性基团起反应。例如如下是可用于修饰聚合物的适宜化学基团：

与蛋白质的氨基起反应的酰化基，例如酸酐基、N-酰咪唑基、叠氮化物基、N-羧基酐基、双乙烯酮基、二烷基焦性碳酸酯基、亚氨酸酯基以及碳二亚胺活化的羧基。已知所有上述基团都与蛋白质/肽上的氨基起反应，形成共价键，包括酰基键或相似的键；

与肽单元氨基上的巯基(氢硫基)、硫代甲基、咪唑并基或氨基起反应的烷基化基团，例如卤-羧基、马来酰亚胺基、活化的乙烯基、乙撑亚胺基、芳卤基、2-羟基5-硝基-苄基溴基团；以及连同还原剂一起与肽的氨基反应的脂族醛基和酮基；

与蛋白质的羧基起反应的酯和酰胺形成基，例如重氮羧酸酯基，以及碳二亚胺基和胺基一起；

与蛋白质上的巯基起反应的二硫化物形成基，例如5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸酯)基和烷基硫醇基(在氧化剂例如碘的存在下，其与蛋白质的巯基起反应)；

与肽的胍部分起反应的二羰基，例如环己二酮基，和其它1，2-二酮基；

与肽上的酚基起反应的重氮基；

与肽上的氨基起反应的反应基，其来自溴化氰与多糖的反应。

因此，总的来说，通过(任选的)首先化学修饰聚合物来生成其上具有至少一个化学基团的聚合物(其中所述的化学基团能够与肽单元上可利用的或被引入的化学基团起反应)，然后(任选的)将修饰的聚合物与肽单元一起反应，来形成可利用修饰聚合物的化学基团(如果必要)的共价结合的复合物，从而制备根据本发明的化合物。

如果通过肽的游离SH基(如半胱氨酸基团的游离SH基)发生偶联，优选使用聚合物中的马来酰亚胺基。

为了生成所限定的分子，优选使用将肽单元连接于聚合物载体单元的靶向方法。在期望的连接位点不存在合适的氨基酸时，可将合适的氨基酸掺入二聚的EPO模拟肽单元。对于位点特异的聚合物连接，优选独特反应基，如在肽单元末端的特异氨基酸，以便避免会产生并质混合物的整个肽上无控制的偶联反应，其中异质混合物包含多个不同聚乙二醇分子的群体。

主要使用本领域技术人员已知的反应，进行肽单元偶联到聚合物载体单元例如PEG或HES上。例如，已有许多本领域技术人员可利用的PEG和HES连接方法(参见例如给出其它参考文献的WO2004/100997，罗伯特等人，2002；US 4,064,118；EP 1398322；EP1398327；EP1398328；WO 2004/024761；它们全部在此被引入作为参考)。

重要的是应当理解：本文中所述的“超价性(supravalency)”的概念不同于已知的聚乙二醇化或HES化的概念。在现有技术中，例如仅仅使用聚乙二醇化，以便生产任何一种肽二聚体或以便改进药物动力学参数。然而如上所述，将两个或更多个至少是二价肽单元连接到例如作为聚合物载体单元的PEG上，也可大大提高效力(因此减少了EC50的剂量)。因此，本发明的该概念不仅如现有技术中已知的PEG化那样，对药物动力学参数有影响，而且对药效学参数具有强烈影响。然而，例如作为聚合物载体单元的PEG的掺入，当然也具有与药物动力学有关的已知的优点。

通常进行聚乙二醇化来改善肽的生物药物性质。在PEG缀合后，蛋白质分子的最相关的变化是尺寸扩大、蛋白质表面和糖基化功能屏蔽、电荷改变以及表位遮蔽。具体地说，通过被动式增强渗透和滞留机理，尺寸扩大使得肾超滤变慢，并促进渗透性组织中的蓄积。蛋白质遮蔽降低属于重要的清除路径的蛋白质水解和免疫系统识别。通过蛋白质和聚合物性质以及通过采用的聚乙二醇化策略，严格测定聚乙二醇化对蛋白质的物理化学及生物学性质的特异性作用。

然而，使用PEG或其它的非生物降解的聚合物来作为超价分子的支持单元，可导致新的问题。

在体内应用期间，药物作用的丧失引发在临床环境中的剂量间隔。常规的剂量和剂量间隔是适合的，使得在剂量间隔期间不会失去作用。由于连接于非生物可降解的大聚合物单元(如PEG部分)的肽的降解比身体可能消除支持分子更快，因此可产生载体单元蓄积的风险。所述的蓄积风险总是发生，因为药物的效应-半衰期短于药物本身或其组分/代谢物之一的消除半衰期。因此，应避免载体分子的蓄积，因为肽通常用非常大的PEG部分(～20-40KD)进行聚乙二醇化，其因此显示缓慢的肾消除。肽部分本身经历了酶促降解，甚至部分裂解足以使肽失活。

为了寻找该问题的解决方法，本发明的一个实施方案教导了使用由至少两个亚单元组成的聚合物载体单元。通过生物可降解的共价连接体结构来键接聚合物亚单元。根据该实施方案，由通过生物可降解的连接体连接的多个小亚单元或中等大小的亚单元(例如每个亚单元具有5至10KD的分子量)，产生大载体分子的分子量(例如40KD)。把模块亚单元的分子量加起来，从而生成载体分子的期望分子量。然而，可在体内裂解生物可降解的连接体结构，从而释放更小的载体亚单元(如5至10KD)。与具有总分子量(如40KD)的聚合物分子相比，小载体亚单元显示更好的肾脏清除。在图16中提供了实例。

根据在体液中已知的降解性和降解时间尺度，选择连接体结构。例如，易碎的结构包含可裂解的基团如羧酸衍生物，如可被水解的酰胺/肽键或酯(参见如Roberts，2002，被本文引入以作为参考)。使用PEG主链中各种酯键，还可合成PEG琥珀酰亚胺酯，来调控在生理性pH中的降解速率(Zhao，1997，被本文引入以作为参考)。在温和还原环境下可裂解苯甲基尿烷二硫化物等易碎结构，例如在细胞的内体隔室中(Zalipsky，1999)，因此这些结构也是适宜的。用于选择合适连接体的其它标准，是快(通常是酶催化的)降解或慢(通常是非酶催化裂解)降解的选择。在体液中这两种机理的组合也是可行的。显然这种高度有利的概念并不限于所述的或本文中所涉及的特殊肽单元，而且可应用于其中出现了相同蓄积问题的其它连接于大聚合物单元(例如PEG分子)的药物分子。

根据一个实施方案，羟烷基淀粉和优选HES可用作聚合物载体单元。HES具有一些重要的优点。首先，HES是生物可降解的。而且，通过乙基比例可调控并因此影响HES的生物可降解性。30至50％乙基充分适合于本发明目的。由于生物可降解性，通常不会出现与PEG相关的上述的蓄积问题。而且，HES已经长期用于医疗中，如以血浆容量扩张剂的形式。因此它的无毒性得到承认。

此外，通过气相色谱法可检测HES水解产物的衍生物。在肽单元仍然稳定的条件下可水解HES-肽缀合物。这可允许量化和监测降解产物，并可允许评价和标准化活性肽。

根据另一个实施方案，使用并与肽单元一起装填第一种类型的聚合物载体单元。优选该第一载体是容易生物降解的，例如是HES。然而，并不是第一载体的所有连接点都被肽单元占据，例如仅仅约20至50％。根据所用聚合物的大小，几百个肽单元可被偶联到载体分子上。第一载体的其余连接点被不同的载体占据，如具有比第一载体的分子量低的分子量的小PEG单元。这个实施方案优点在于由于第一载体而产生了超价组分，然而由于优选由3至5或10KD的PEG单元而组成的第二载体的存在，第一载体是非常耐久的。然而，整个实体都是非常易降解的，因为第一载体(如HES)和肽单元是可生物降解的，第二载体(如PEG)是小到足以容易从身体中被清除。

组成肽单元的结合结构域的单体可识别同源二聚体红细胞生成素受体。同源二聚体受体的后一性质使EPO受体不同于许多其它细胞因子受体。包含至少上述两个EPO模拟单体结合结构域的肽单元可结合EPO受体，并优选能够分别二聚化多聚化它们的靶和/或稳定它，因此从而产生了信号转导诱导复合物。

本发明还包括相应的将肽单元连接到各自载体单元上的化合物生产方法。本发明进一步包括相应的将肽单元连接到各自聚合物载体单元上的化合物生产方法。本发明的化合物可有利地用于制备人和/或兽用的药物组合物。它们特别适合于治疗以红细胞生成素缺乏或红细胞数目低或有缺陷为特征的障碍，并特别适合于治疗任何类型的贫血症或中风。它们还可用于上述的所有适应征。所述的药物组合物可任选包含药学上可接受的载体，以便采取用于预定给药过程的组合物。例如在WO 2004/101611和WO 2004/100997中(被本文引入以作为参考)描述了合适的输送方法和载体以及添加剂。

                    实施例

超价分子的概念应通过实施例进行解释。图13显示根据本发明的简单超价分子的实例。通过具有马来酰亚胺基的双功能PEG部分，将两个连续的二价EPO模拟肽进行N末端连接。选择半胱氨酸作为PEG载体单元的反应连接位点。

然而，超价分子可包含超过两个的连续二价或多价肽单元。图14显示的实例是以具有作为分支单元的中心甘油单元的载体单元为基础，并包括三个连续的二价肽。将半胱氨酸再次用于连接。图20显示使用HES作为聚合物载体单元的实例。修饰HES，使得它具有与肽单元的SH基起反应的马来酰亚胺基。根据该实例，将所有的连接位点结合于肽单元。然而，小的PEG单元(如3至10KD)也可占据一些连接位点。

如上解释的，超价物概念还可以扩展为多价的树枝状聚合物，其中树枝状的和/或聚合物载体单元连接于大量连续的二价肽。例如，树枝状分支单元可以聚甘油为基础(请参见Haag2000，在此被引入以作为参考)。

在图15中显示的实例是基于具有树枝状分支单元的载体单元的超价分子，其中所述的分支单元含有六个连续的二价肽。

超价分子的其它实例包含具有淀粉或葡聚糖的载体单元，其中使用如高碘酸来氧化载体单元，以包埋大量醛功能。在第二步骤中，许多二价肽连接于载体单元，并一起形式最终分子。请注意可将甚至几百个(如50至1000个、优选150至800个、更优选250至700个)肽单元偶联至载体分子，如HES。

图16证实了简单的生物可降解的超价分子的概念。通过两个双功能的PEG部分，将两个连续的二价EPO模拟肽进行N末端连接，其中所述的PEG部分通过具有中间裂解位点的生物可降解的连接体进行连接。连接体允许大PEG单元在亚单元中被裂解，从而促进肾脏清除。

I.单体的肽合成

手工合成

通过使用Discover微波系统(CEM)和使用PL-Rink-Amide-Resin(置换率0.4mmol/g)或者通过预装填0.4mmol量的Wang-Resins，进行合成。通过添加30ml哌啶/DMF(1∶3)，并用100W照射3×30秒，完成芴甲氧羰基(Fmoc-group)的去除。通过在作为偶联添加剂的DMFPyBOP/HOBT/DIPEA中添加5倍过量的氨基酸，并用50W照射5×30秒，完成氨基酸的偶联。在所有照射周期之间，借助于冰浴来手工冷却溶液。在脱保护和偶联后，用30ml DMF将树脂洗涤6次。在最后的氨基酸脱保护后，通过用1.268ml加帽溶液(100ml DMSO中，4.73ml乙酸酐和8.73mlDIEA)温育5分钟，将一些肽乙酰化。在裂解之前，用30ml DMF将树脂洗涤6次，并用30ml DCM洗涤6次。通过用5ml的TFA/TIS/EDT/H₂O(94/1/2.5/2.5)在惰性气体中处理120分钟，完成粗肽的裂解。将该溶液过滤到40ml冷乙醚中。沉淀物溶解于乙腈/水(1/1)，并通过RP-HPLC(Kromasil 100 C18 10μm，250×4.6mm)纯化肽。

自动合成

通过使用Odyssey微波系统(CEM)和使用PL-Rink-Amide-Resin(置换率0.4mmol/g)或者通过预装填0.25mmol量的Wang-Resins，进行合成。通过添加10ml哌啶/DMF(1∶3)，并用100W照射10×10秒，完成芴甲氧羰基的除去。通过在作为偶联添加剂DMFPyBOP/HOBT/DIPEA中添加5倍过量的氨基酸，并用50W照射5×30秒，完成氨基酸的偶联。在所有照射周期之间，通过将氮气吹泡穿过反应混合液，冷却溶液。在脱保护和偶联后，用10ml DMF将树脂洗涤6次。在最后的氨基酸脱保护后，通过用0.793ml加帽溶液(100mlDMSO中，4.73ml乙酸酐和8.73ml DIEA)温育5分钟，将一些肽乙酰化。在裂解之前，用10ml DMF将树脂洗涤6次，并用10ml DCM洗涤6次。通过用5ml的TFA/TIS/EDT/H₂O(94/1/2.5/2.5)在惰性气体中处理120分钟，完成粗肽的裂解。将该溶液过滤到40ml冷乙醚中，并将沉淀物溶解于乙腈/水(1/1)，并通过RP-HPLC(Kromasil 100 C1810μm，250×4.6mm)纯化肽。

纯化

使用Nebula-LCMS系统(Gilson)，纯化所有肽。将所有肽的粗料溶解于乙腈/水(1/1)，并通过RP-HPLC(Kromasil 100 C18 10μm，250×4.6mm)纯化肽。流速是20ml/min，并且LCMS分流比是1/1000。

II.分子内二硫桥的形成

用K₃[(FeCN₆)的环化

溶液1：将10mg肽溶于0.1％的TFA/乙腈，并用水稀释直至达到0.5mg/ml的浓度。加入固态碳酸氢铵，直至达到约pH8。

溶液2：在第二个小管中，用10ml水稀释10ml的0.1％TFA/乙腈。加入固态碳酸氢铵，直至达到pH8，并加入1滴0.1M的K₃[(FeCN₆)]溶液。

在3小时中，将溶液1和溶液2逐滴地加入乙腈/水(1/1；pH＝8)的混合液中。在室温下过夜温育混合液，并浓缩混合物和通过LCMS纯化。

用CLEAR-OX^TM-树脂的环化

将固态碳酸氢铵加入100ml乙腈/水(1/1；0.1％TFA)中，直至达到pH8。通过氩气吹泡30分钟，来除去该溶液的气体。立刻加入100mg的CLEAR-OX_TM-树脂。10分钟后，加入10mg固态的肽。温育2小时后，过滤溶液、浓缩以及通过LCMS纯化。

环肽的纯化：

使用Nebula-LCMS系统(Gilson)，纯化所有肽。将所有肽的粗原料溶解于乙腈/水(1/1)或DMSO中，并通过RP-HPLC(Kromasil 100C18或C8 10μm，250×4.6mm)纯化肽。流速是20ml/min，并且LCMS分流比是1/1000。

III.使用单体进行体外分析

使用TF-1细胞，通过掺入BrdU进行增殖分析

将对数生长期中的TF-1细胞(～2.10⁵-1.10⁶细胞/ml；RPMI培养基；20％胎牛血清；补充了青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺；0.5ng/ml白细胞介素3)进行洗涤(以1500rpm离心5分钟，并以500.000细胞/ml的浓度重悬浮于无IL3的RPMI完全培养基中)，并在分析开始之前不使用IL-3进行预培养24小时。第二天，将细胞接种在24孔或96孔平板中，其中所述的平板通常每个待测试剂使用至少6个浓度和每个浓度4个孔，含至少10.000细胞。实验包含对照，其中包括作为阳性对照试剂的重组EPO和作为阴性对照试剂的无添加细胞因子的孔。将肽和EPO对照在培养基中预稀释至期望的浓度，并加入细胞中，在标准培养条件(37℃、5％二氧化碳的气相、水饱和的环境)下开始3天的培养期。在3天的培养期中，浓度一直指的是培养孔中试剂的终浓度。在该培养期的结束时，加入FdU直至终浓度8ng/ml培养基，并继续培养6小时。然后，加入BrdU(溴脱氧尿苷)和dCd(2-脱氧胞苷)直至它们的终浓度(在培养基中，BrdU的终浓度为10ng/ml，dCd的终浓度为8ng/ml)，并继续另外培养2小时。

在该温育和培养期的结束时，在含1.5％BSA的磷酸盐缓冲盐水中洗涤细胞一次，并以最低液体量进行重悬浮。从该悬浮液中，将细胞逐滴地加入-20℃的70％乙醇中。或将细胞在冰上培养10分钟并然后直接进行分析，或在分析之前将其保存于4℃。

在分析之前，通过离心沉淀细胞，弃去上清液，并将细胞重悬浮在最小量的剩余液体中。然后悬浮细胞，并将其在0.5ml的2MHCl/0.5％triton X-100中温育10分钟。然后，再次沉淀它们，并重悬浮在最小量的剩余液体中，其中在立即重沉淀细胞之前，用0.5ml的0.1N Na₂B₄O₇(pH8.5)稀释细胞。最后，将细胞重悬浮在40μl磷酸盐缓冲盐水(1.5％BSA)中，并分装入两个各含20μl细胞悬浮液的反应管中。将2μl抗-BrdU-FITC(DAKO，克隆Bu20a)加入一个管中，并将2μl对照mIgG1-FITC(Sigma)加入第二管中，室温下开始30分钟的温育期。然后，加入0.4ml磷酸盐缓冲盐水和10μg/ml碘化丙锭(终浓度)。在流式细胞仪中的分析，涉及4C细胞或具有高倍数性的细胞的部分，和涉及BrdU-阳性细胞的部分，因此测定在细胞周期的相关阶段中细胞的部分。

使用TF-1细胞，通过MTT进行增殖分析

将对数生长期中的TF-1细胞(～2.10⁵-1.10⁶细胞/ml；RPMI培养基；20％胎牛血清；补充了青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺；0.5ng/ml白细胞介素3)进行洗涤(以1500rpm离心5分钟，并以500.000细胞/ml的浓度重悬浮于无IL3的RPMI完全培养基中)，并在分析开始之前不使用IL-3进行预培养24小时。第二天，将细胞接种在24孔或96孔平板中，其中所述的平板每个待测试剂通常使用至少6个浓度和每个浓度4个孔，含至少10.000细胞/孔。每个实验包括对照，其中包含作为阳性对照试剂的重组EPO和作为阴性对照试剂的无添加细胞因子的培养孔。将肽和EPO对照在培养基中预稀释至期望的浓度，并加入细胞中，在标准培养条件(37℃、5％二氧化碳的气相、水饱和的环境)下开始3天的培养期。在4天的培养期中，浓度一直指的是培养孔中试剂的终浓度。

在第4天，在分析开始之前，在已知数量孔中制备TF-1细胞的稀释系列(在100μl培养基中0/2500/5000/10000/20000/50000的细胞/孔)。这些孔以与测试孔相同的方式进行处理，而后者提供来自所测定的细胞数的校正曲线。在设定这些参照孔后，将来自MTT增殖试剂盒(Promega，CellTiter 96含水非放射性细胞增殖分析)的MTS和PMS在37℃的水浴中解冻，并将100μl PMS溶液加入2ml MTS溶液。将20μl该混合液加入分析板的各个孔中，并在37℃下温育3-4小时。在酶联免疫检测仪中进行测量E492之前，将25μl的10％的十二烷基磺酸钠水溶液加入各个孔中。

使用基于计算剂量-效应关系的如图17和图18所示的图解评价，和使用程序GraphPad，基于MTT-分析数据测定下列EC50值：

下表显示一些例证性肽的EC50值：

SEQ ID NO 2：GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG        3284nmol/l

SEQ ID NO 4：GGTYSCHFGKLTWVCKPQGG        4657nmol/l

SEQ ID NO 5：GGTYSCHFGRLTWVCKPQGG        5158nmol/l

SEQ ID NO 6：GGTYSCHFGRLTWVCKKQGG        4969nmol/l

SEQ ID NO 7：GGTYSCHF-(Als)-LTWVCKPQGG   5264nmol/l

SEQ ID NO 8：GGTYSCHF-(Als)-LTWVCKKQGG   4996nmol/l

             GGTYSCHFGPLTWVCKKQGG        2518nmol/l

             GGTYSCHFAKLTWVCKKQGG        5045nmol/l

             GGTYSCHFGGLTWVCKPQGG        未检测到活性

IV.二价EPO模拟肽的合成

线性SEQ ID NO 11(AGEM11)的自动合成

通过使用Liberty微波系统(CEM)和使用Rink-Amide-Resin(置换率0.19mmol/g)，以0.25mmol量进行合成。通过用10ml哌啶/DMF(1∶3)加倍处理、并用500W照射10×10秒，完成芴甲氧羰基的除去。通过用作为偶联添加剂DMF PyBOP/HOBT/DIPEA中的4倍过量的氨基酸进行加倍处理，并用50W照射5×30秒，完成氨基酸的偶联。在所有照射周期之间，通过将氮气吹泡穿过反应混合液，冷却溶液。在脱保护和偶联后，用10ml DMF将树脂洗涤6次。在加倍偶联周期后，通过用10倍过量的N-(2-氯苄基氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(0.2M的DMF溶液)处理并用50W照射3×30秒，来封闭所有未反应的氨基。在最后的氨基酸脱保护后，通过用0.793ml加帽溶液(100mlDMSO中，4.73ml乙酸酐和8.73ml DIEA)温育5分钟，将肽进行乙酰化。在裂解之前，用10ml DMF将树脂洗涤6次，并用10ml DCM洗涤6次。通过用5ml的TFA/TIS/EDT/H₂O(94/1/2.5/2.5)在惰性气体中处理120分钟，完成粗肽的裂解。将该溶液过滤到40ml冷乙醚中，并将沉淀物溶解于乙腈/水(1/1)，并通过RP-HPLC(Kromasil 100 C1810μm，250×4.6mm)纯化肽。

图8和图9中描述了线性AGEM11的纯化示意图、Kromasil 100C18 10μm(250×4.6mm)以及和因此所用的50分钟内5％乙腈至50％乙腈(0.1％TFA)的梯度。

线性AGEM11的环化

将30mg线性肽溶于60ml溶液A中。将该溶液和60ml DMSO逐滴地加入60ml溶液A(加入总时间：3小时)中。48小时后，蒸发除去溶剂，并将残余物溶于30ml DMSO/水(1/1)。加入30ml乙酸和17mg碘(溶于DMSO/水(1/1))，并在室温下将溶液混合90分钟。然后加入20mg抗坏血酸，并蒸发除去溶剂。将粗的混合液溶于乙腈/水(2/1)，并通过RP-HPLC(Kromasil 100 C18 10μm，250×4.6mm)纯化肽。

溶液A：含0.1％TFA的乙腈/水(1/1)。通过加入碳酸氢铵，调节pH至8.0。

在图10和图11中显示了环状AGEM11的纯化参数(环状AGEM11的纯化示意图：Kromasil 100 C18 10μm，250×4.6mm，梯度为50分钟内5％乙腈至35％乙腈(0.1％TFA))。

V.用于测定EPO活性的体外增殖试验

对对数生长期中的TF1细胞(在具有20％胎牛血清(FCS)和0.5ng/mlIL-3的RPMI培养基中生长的～2.10⁵-1.10⁶细胞/ml)的进行计数，并对进行分析所需数量的细胞进行离心(5分钟，1500rpm)，然后以300000细胞/ml的浓度重悬浮于具有5％FCS无IL-3的RPMI中。将细胞在这种没有IL-3的培养基中预培养48小时。在开始分析之前，再次统计细胞数量。

在开始分析之前，立即制备肽和EPO的储液。将肽称重，并溶于直至浓度为1mM、467μM或200μM的具有5％FCS的RPMI。EPO储液是10nM或20nM。将这些储液的292μl吸移至96孔培养平板的一个孔中，每种待测的物质采用一块板。吸取200μl具有5％FCS的RPMI到各个平板的十七个其它孔中。吸取92μl储液到含200μl培养基的孔中。混合内含物，并将来自该孔的92μl转入下一个孔中，等等。这种方式制备每种物质的稀释系列(18个稀释浓度)，使得各个连续孔中的浓度是其前一孔中的浓度的1/10。将来自各个孔的3×50μl转入三个空孔中。以一工四份测量物质的如此各个浓度。舍去各个平板的最上行孔和最下行孔。

离心预处理的(饥饿的)细胞(5分钟，1500rpm)，并以200,000细胞/ml的浓度重悬浮于具有5％FCS的RPMI中。将50μl细胞悬浮液(含10,000细胞)加入各孔中。注意的是：由于加入细胞，孔中物质的终浓度是起始稀释浓度的一半。将平板在37℃、5％CO₂下温育72小时。

开始评价之前，已知量的TF-1细胞的稀释幅度制备如下：一式四份吸取0/2500/5000/10000/20000/50000细胞/孔(在100μl的RPMI+5％FCS中)。

为了测量每孔的活细胞的数目，将现成可用的MTT试剂(Promega，Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay)在37℃水浴中解冻。每孔加  20μl的MTT试剂，并将平板在37℃、5％CO₂中另外温育1-2小时。加入25μl的10％SDS溶液，并在酶联免疫读数仪(Genios，Tecan)中测量平板。在电子数据表(Excel)中加工数据，并在Graphpad软件中制图。

在图12中总结了所述数据。

                         ED50(nM)：

EPO                      0.0158

BB49(单体，SEQ.ID NO 2)  4113

AGEM11(二价)             36.73

VI.扩展的肽试验

在扩展试验中，对约200条肽序列测试了它们的EPO模拟活性。

在LIPS-Vario合成仪系统上，合成作为肽酰胺的肽。在专门的MTP合成平板中进行合成，规模是每种肽2μmol。合成使用作为活化剂试剂的HOBT，遵循标准的Fmoc方案。偶联步骤分4次偶联进行。每个偶联步骤耗时25分钟，并且每个步骤的过量氨基酸是2.8。用含90％TFA、5％TIPS、2％H₂O以及2.5％DDT的裂解液进行肽的裂解和脱保护。将含有连接于树脂的成品肽的合成平板保存在96深孔板的顶部。每孔加入50μl裂解液并进行裂解10分钟，重复该过程三次。用200μl裂解液通过重力流入深孔平板中，来洗脱裂解肽。在深孔平板中，对侧链官能团进行另外2.5小时的脱保护。然后，用冰冷的乙醚/己烷来沉淀肽，并进行离心。肽溶于中性水溶液中，并在4℃下过夜温育环化物。冷冻干燥肽。

图19显示了对合成的和测试的肽单体的概述。

在体外增殖试验中，测试了肽的EPO模拟活性。如下列步骤V所示实施该试验。在每个分析日中，制备用于平行测量38条待测肽和、1个参照实例和EPO的体外活性的40块微量滴定板。EPO储液是20nM。

结果如图19所示。从结果可知，不具有本发明的共有序列的测试肽，并不显示EPO模拟活性。

VII.肽HES-缀合物的合成

在图21中显示了反应原理示意图。

所述方法的目的是生产根据该实施例HES的淀粉衍生物，其中所述的HES可在温和的水性反应条件下与硫醇基选择性反应。通过马来酰亚胺基来实现这种选择性。

首先用氨基对HES进行官能化，然后将其转变成相应的马来酰亚胺衍生物。反应批次没有可通过超滤膜的低分子反应。产物、中间产物以及离析物全部是多分散性的。

氨基-HES(AHES)的合成

通过渗滤获得羟乙基淀粉(Voluven)，并随后进行冻干。平均摩尔重量是约130KDa，具有置换度40％。

根据在JacobPiehler的论文″Modifizierung von Oberflchen fürdie thermodynamische und kinetische Charakterisierungbiomolekularer Erkennung mit optischen Transducern ″，1997，在此被引入以作为参考中所述的用于氨基葡聚糖的合成法，进行合成。通过使用如Floor等人(1989)所述的高碘酸钠，将二酚(diolic)羟基部分地、选择性氧化成醛基，来活化HES。在氨的存在下，通过使用氰基硼氢化钠(NaCNBH₃)的还原性氨化，将醛基转变成氨基(Yalpani和Brooks，1995)。

过碘酸盐开孔(opening)：高碘酸盐的用量代表葡萄糖结构单元数量的20％(使用180g/mol、DS＝0.4的葡萄糖结构单元块)。通过超滤和冻干，进行后处理。

用NH₄Cl/Na[BH₃CN](过量)还原性氨化。

通过沉淀产物和渗滤，进行操作。

分析

定性：茚三酮反应(Kaiser式验)

定量：与氨基葡聚糖相比，使用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)。

达到的置换度约2.8％。这产生一个具有摩尔量约6400g/mol的结构单元，其中所述的结构单元具有一个氨基。

Synthesis of maleimidopropionyl-amino-hydroxyethylstarch(“MaIPA-HES”)马来酰亚氨基丙酰-氨基-羟乙基淀粉(“MaIPA-HES”)的合成

合成

过量(10倍)使用3-马来酰氨基丙亚酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MaIPA-OSu)(50mM磷酸盐缓冲液，pH7，20％DMF，过夜)，通过超滤和冻干进行后处理。

分析

使用茚三酮和TNBS来验证氨基的反应。

通过谷胱甘肽(GSH)的反应，和用Ellmans试剂(DNTB)以及通过700MHz-¹HNMR-光谱进行检测过量的硫醇基，来证明所引入的马来酰亚胺基数目。

完成的置换度大约是2％，相当于每个马来酰亚胺结构单元8500g/mol(180g/mol葡萄糖结构单元块，DS＝0.4)。

Peptide-hydroxyethylstarch-conjugate(Pep-AHES)肽-羟乙基淀粉-缀物(肽-AHES)

合成

使用含半胱氨酸的肽，该肽含游离的N末端(肽-IA)或生物素化N-末端(肽-IB)。整夜过度转化4∶1的肽-IA/1B混合液(约6当量的MaIPA-HES的磷酸盐缓冲液，50mM，pH6.5/DMF 80∶20)；通过超滤和冻干进行后处理。

分析

在280nm测定UV吸光度，并用GSH/DNTB测定马来酰亚胺基的残余量。

肽产量几乎是定量的。几乎检测不到游离的马来酰亚胺基。

VIII.抗体交叉反应性分析

如本申请的引言中所述，病人有时会产生抗rhuEPO的抗体。这导致如引言中所述的严重后果。

为了进一步研究根据本发明的肽性质，分析该肽实际上是否与抗EPO抗体交叉反应。

使用含抗EPO抗体的兔血清和人血清来用于测试。用EPO或下列EPO模拟肽来预处理这些血清：

Ac-C-GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG-Am(试验肽1)

Ac-GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG-Am(试验肽2)

Ac＝乙酰化N末端

Am＝酰胺化C末端

1nal＝1-萘丙氨酸

在分析中使用不同浓度的红细胞生成素和EPO模拟肽。为了吸附存在于血清中的抗EPO抗体而用测试物质预处理血清后，用放射性标记的红细胞生成素处理血清。预吸附步骤后，通过红细胞生成素和再一次的免疫沉淀来结合血清中剩余的抗体。Tacey等人(2003)描述了用于这种测试的方案，在此被引入以作为参考。

在图22中，公开了用含抗EPO抗体的血清，使用EPO或根据本发明的EPO模拟肽进行预吸附的结果。

用EPO模拟肽预处理血清时，后来在与放射性标记的红细胞生成素接触时，测试血清为阳性。因此，虽然进行了预处理，但还是在血清中检测出抗EPO抗体。这意味着在预处理期间，EPO模拟肽不能结合抗EPO抗体。在缺少结合活性时，不能从具有EPO模拟肽的血清中消除抗EPO抗体，因此血清中留有抗EPO抗体。因此，抗EPO抗体不能识别和因此结合EPO模拟肽。

重组人EPO(rhuEPO)作为对照。当用红细胞生成素预处理血清时，在随后掺入放射性标记的红细胞生成素的测定中几乎检测不出抗体，因为抗体已被结合并通过用红细胞生成素预处理而被除去。

图22中显示的数值表示在IP中所用的总计数的％cpm。当％cpm值大于0.9时，判定血清是阳性。100％cpm表示所用的所有计数的量(放射性示踪剂)，当前的放射性标记的EPO。

该分析表明根据本发明的EPO模拟肽有利地显示对抗EPO抗体无交叉反应性。因此，本文所述的EPO模拟肽即使在产生抗rhuEPO抗体患者中也应具有治疗效果。此外，预计抗EPO模拟肽的抗体应不会结合红细胞生成素。因此，根据本发明的EPO模拟肽还优选特征还在于它们显示与抗EPO抗体没有明显的交叉反应。

参考文献：

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Wrighton NC，Farrell FX，Chang R，Kashyap AK，Barbone FP，Mulcahy LS，Johnson DL，Barrett RW，Jolliffe LK，Dower WJ(1996)Small Peptides as PotentMimetics of the Protein Hormone Erythropoietin.Science 273：458-463

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Zalipsky S，Qazen，S，Walker II JA，Mullah N，Quinn YP，(1999)“New detachablepoly(ethylene glycol)conjugates：Cysteine-cleavable lipopolymers regeneratingnatural phospholipid，diacyl phosphatidylethanolamine，Bioconjug.Chem.10：703-707.

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Claims (55)

1.一种长度至少10个氨基酸的肽，其能结合EPO受体，包含激动剂活性，特征在于所述的EPO模拟肽在被称为EPO模拟肽的10位的位置上不包含脯氨酸，但包含带正电荷的氨基酸。

2.根据权利要求1的肽，其特征在于所述的EPO模拟肽具有折叠结构特征的氨基酸基序(β-转角基序)，其中所述的肽在10位上在β-转角基序中不包含脯氨酸，但包含带电正荷的氨基酸，优选K。

3.根据权利要求1的肽，其特征在于5-氨基乙酰丙酸(5-Als)占据了9和10位

4.根据权利要求1至3中任何一项的肽，其特征在于所述的肽在17位上具有带正电荷的氨基酸，优选K或Har。

5.一种肽，特别是能结合EPO受体的肽，其包含下列氨基酸序列：

             X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅

其中每个氨基酸选自天然的或非天然的氨基酸，并且

X₆是C、A、E、α-氨基-γ-溴代丁酸或高半胱氨酸(hoc)；

X₇是R、H、L、W或Y或S；

X₈是M、F、I、高丝氨酸甲基醚或去甲异亮氨酸；

X₉是G或G的保守性交换；

X₁₀是脯氨酸的非保守性交换；

或者X₉和X₁₀被单个氨基酸替代；

X₁₁选自任意氨基酸；

X₁₂是T或A；

X₁₃是W、1-nal、2-nal、A或F；

X₁₄是D、E、I、L或V；

X₁₅是C、A、K、α-氨基-γ-溴代丁酸或高半胱氨酸(hoc)；

条件是X₆或X₁₅是C或hoc。

6.根据权利要求5的肽，其特征在于下列氨基酸序列：

            X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅

其中用标准字母缩写表示每个氨基酸，并且

X₆是C；

X₇是R、H、L或W；

X₈是M、F或I；

X₉是G或G的保守性交换；

X₁₀是脯氨酸的非保守性交换；

X₁₁独立地选自任意氨基酸；

X₁₂是T；

X₁₃是W；

X₁₄是D、E、I、L或V；

X₁₅是C；

或X₉和X₁₀被单个氨基酸替代；

或者，其中所述的肽的特征在于下列氨基酸序列：

                 X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅

X₆是C；

X₇是R、H、L或W；

X₈是M、F、I或hsm(高丝氨酸甲基醚)；

X₉是G或G的保守性交换；

X₁₀是脯氨酸的非保守性交换；

X₁₁独立地选自任意氨基酸；

X₁₂是T；

X₁₃是W；

X₁₄是D、E、I、L或V、1-nal(1-萘丙氨酸)或2-nal(2-萘丙氨酸)；

X₁₅是C。

7.根据权利要求5或6中任何一项的肽，其特征在于X₁₀是具有带正电荷的侧链的氨基酸，优选R、K或各自非天然的氨基酸，优选Har，或者X₉和X₁₀被单个氨基酸替代，优选被5-氨基乙酰丙酸(Als)或氨基戊酸替代。

8.根据上述权利要求中任何一项的肽，其包含下列氨基酸序列：

            X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅

其中X₆至X₁₅具有上述含义，并且其中

X₄是Y；

X₅独立地选自任意氨基酸，优选A、H、K、L、M、S、T或I。

9.根据权利要求8的肽，其包含下列氨基酸序列：

X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈

其中X₄至X₁₅具有上述含义，并且其中

X₃独立地选自任意氨基酸，优选D、E、L、N、S、T或V；

X₁₆独立地选自任意氨基酸，优选G、K、L、Q、R、S或T；

X₁₇独立地选自任意氨基酸，优选A、G、P、R、K、Y或具有带正电荷的侧链的非天然氨基酸，优选高精氨酸；

X₁₈独立地选自任意氨基酸。

10.根据上述权利要求中任何一项的肽，其中X₆是C、E、A或hoc，优选C；和/或X₇是R、S、H或Y；和/或X₈是F或M；和/或X₉是G或A，优选G；和/或X₁₀是K或Har；和/或X₁₁是V、L、I、M、E、A、T或去甲异亮氨酸；和/或X₁₂是T；和/或X₁₃是W；和/或X₁₄是D或V；和/或X₁₅是C或hoc，优选C；和/或X₁₇是P、Y、A或K或Har。

11.根据如权利要求1或5的肽，其包含选自下列序列的氨基酸序列：

SEQ ID NO 2：GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG

SEQ ID NO 4：GGTYSCHFGKLTWVCKPQGG

SEQ ID NO 7：GGTYSCHF-(Als)-LTWVCKPQGG

SEQ ID NO 8：GGTYSCHF-(Als)-LTWVCKKQGG，

具有5-氨基乙酰丙酸(Als)：

12.根据权利要求1至11中至少一项的肽，其所述的肽包含选自下列序列的氨基酸序列：

GGTYSCHFGRLTWVCKPQGG

GGTYSCHFGRLTWVCKKQGG

GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG

GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG

GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG

CGGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG

CGGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG

GGTYSCSFGKLTWVCK-Har-QGG

GGTYSCHFG-Har-LTWVCK-Har-QGG

GGTYSCHMGKLTXVCKKQGG

GGTYTCHFGKLTXVCKKLGG

GGLYSCHFGKITXVCKKQGG

GGLYSCHMGKLTWVCRKQGG

GGLYSCHFGKLTXVCQKQGG

GGTYSCHFGKLTWVCQKQRG

GGTYSCHFGKLTXVCKKQRG

GGLYACHFGKLTWDCQKQGG

GGTYTCHFGKLTUVCKKQGG

GGTYSCHFGKLTUVCKKLGG

GGTYSCHFGKITXVCKKQGG

GGLYSCHFGKLTUVCKKLGG

GGLYACHFGKLTUVCKKQGG

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GGTYSCRFGKLTWVCKKQGG

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其中X是1-萘丙氨酸并且U是2-萘丙氨酸。

13.根据上述权利要求1至12中至少一项的肽，其特征在于所述的肽是通过单个氨基酸的保守性交换进行修饰的，其中，优选地，不超过1、2或3个氨基酸被交换。

14.根据权利要求1至13中任何一项的肽，其特征在于所述的肽与抗EPO抗体不交叉反应。

15.根据权利要求1至14中至少一项的肽，其中所述的肽是被修饰的，其中所述的修饰优选选自N末端和/或C末端的乙酰化(Ac)；和/或酰胺化(Am)，优选经由分子内二硫桥的分子内环化；和/或磷酸化；其中特别优选C末端甘氨酸的修饰为N-甲基甘氨酸(meG)和N末端甘氨酸的修饰为N乙酰甘氨酸(AcG)；和/或其中所述的肽与聚合部分连接，优选所述的部分选自聚乙二醇、葡聚糖和淀粉。

16.根据上述权利要求中至少一项的肽，其中所述的肽形成上面定义的肽序列的单体、二聚体或多聚体。

17.根据权利要求16的肽，其中所述的二聚体或多聚体是具有分支或非分支结构的同聚体或异聚体，并且其中所述的单体肽单元彼此N末端与N末端、C末端与C末端或N末端与C末端连接。

18.根据权利要求15或17之一的肽，其所述的肽包含连接体和/或间隔单元。

19.一种具有连续肽链的合成肽，其包含至少两个具有结合受体能力的结构域，其中所述的结构域包含权利要求1至14和权利要求55中所定义的氨基酸序列。

20.根据权利要求19的合成肽，其包含至少两个异质的结合结构域。

21.根据权利要求19或20的合成肽，其包含天然或非天然氨基酸残基的连接部分(连接体)。

22.根据权利要求19至21中任何一项的合成肽，其中所述的连接部分包含3至5个甘氨酸残基和/或丙氨酸残基或其衍生物。

23.根据权利要求19至22中任何一项的合成肽，其中所述的连接体由形成结合结构域一部分的氨基酸提供。

24.根据权利要求19的合成肽，其所述的肽包含选自下列的肽序列：

GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG

GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG

或者权利要求1至14中定义的肽序列之一，其中所述的肽任选具有额外的氨基酸，优选具有反应侧链的氨基酸，例如N末端的半胱氨酸，并且其中如果存在于各自的序列中，所述的肽任选在第一个和第二个和/或第三个和第四个半胱氨酸之间包含分子内二硫桥。

25.一种肽二聚体或多聚体，它至少包含：

a.第一条肽；

b.第二条肽，以及

c.优选包含连接所述第一条肽和第二条肽的连接部分(连接体)，

其中所述肽中的至少一条包含肽单元，该肽单元包含权利要求1至14、24或55之一中所定义的氨基酸序列。

26.根据权利要求25的肽二聚体或多聚体，其中所述第一条肽的C末端共价结合于所述的第二条肽的N末端，或所述肽的C末端共价结合于所述第二条肽的C末端，或所述第一条肽的N末端共价结合于所述第二条肽的N末端。

27.根据权利要求25或26的肽二聚体或多聚体，其中所述的连接体包含天然和/或非天然氨基酸的序列，优选甘氨酸、丙氨酸或其衍生物的序列。

28.根据权利要求25至权利要求27的肽二聚体或多聚体，其中所述的连接体/间隔单元包含二酮哌嗪单元。

29.根据权利要求26的肽二聚体或多聚体，其中所述的连接体是二价二酰基结构单元，优选为来源于脂肪族二羧酸的二酰基结构单元。

30.根据权利要求25的肽二聚体或多聚体，其中所述第一条肽的氨基酸侧链共价结合于所述第二条肽的氨基酸侧链。

31.根据上述权利要求1至30中任何一项的肽，其还包含共价结合于所述肽的水溶性聚合物，优选包含选自聚乙二醇、葡聚糖或淀粉的水溶性聚合物。

32.根据权利要求31的肽，其中所述的水溶性部分是PEG，优选是分子量为至少10KD的PEG，最优选是分子量在20和60KD之间的PEG。

33.一种结合靶分子的化合物，它包含

(i)至少两个肽单元，其中每个肽单元包含至少两个具有结合靶能力的结构域，并且其中所述的结合结构域包含权利要求1至14或55中任何一项所定义的氨基酸序列；

(ii)至少一个聚合物载体单元；

其所述的肽单元与所述的聚合物载体单元连接。

34.根据权利要求33的化合物，其中所述的载体单元是或者包含至少一个天然的或合成的分支、树枝状或线性的聚合物，并优选选自甘油聚合物、聚唾液酸、葡聚糖、淀粉或聚乙二醇，或选自其它生物学惰性的水溶性聚合物。

35.根据权利要求33或34的化合物，其中所述的载体单元包含分支单元。

36.根据权利要求35的化合物，其中所述的分支单元包含甘油或聚甘油。

37.根据上述权利要求33至36中至少一项的化合物，其中所述的载体分子具有至少5KD的分子量，优选具有20至200或4000KD的分子量，并且如果使用更小的载体例如聚乙二醇，则优选具有20至80KD的分子量。

38.根据上述权利要求33至37中至少一项的化合物，其中所述的载体单元包含至少两个聚合物亚单元，其中所述的聚合物亚单元彼此通过至少一个生物可降解的共价连接体结构连接。

39.根据上述权利要求33至38中至少一项的化合物，其包含第一生物可降解的载体单元，其中肽单元和第二聚合物载体单元与所述的第一聚合物载体单元连接。

40.根据权利要求39的化合物，其中所述的第二载体单元的分子量小于所述的第一载体单元的分子量，其中所述的第二载体单元占据所述的第一载体单元的约20至50％的连接位点，所述的第一载体单元优选是羟烷基淀粉例如HES，所述的第二载体单元优选是分子量约3至10KD的聚乙二醇。

41.根据上述权利要求33至40中至少一项的化合物，其中使用修饰的聚合物载体单元。

42.根据权利要求41的化合物，其所述的肽单元通过共价键与所述的聚合物载体单元连接，并且通过所述肽单元的反应性氨基酸、N末端氨基和/或C末端羧酸发生连接，其中所述的反应性氨基酸优选选自赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸；以及

其中如果聚合物不具有合适的反应性偶联基团，则使用偶联物质修饰聚合物载体单元；

其中所述的偶联物质优选选自与肽单元的氨基起反应的酰化基团；与肽单元上的巯基、硫代甲基、咪唑并或氨基起反应的烷基化基团，最优选马来酰亚胺基团；与肽单元的羧基起反应的酯和酰胺形成基团；与肽单元上的巯基起反应的二硫化物形成基团，例如5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸酯)基团和烷基硫醇基团、二羰基基团，例如环己二酮基团；以及与肽单元的胍部分起反应的其它1，2-二酮基团；与肽上的酚基团起反应的重氮基团；由溴化氰和聚合物反应形成的反应性基团，其与肽单元上的氨基起反应。

43.根据权利要求42的化合物，其中所述的反应性氨基酸是半胱氨酸，并且偶联基团是马来酰亚胺。

44.根据上述权利要求33至43中至少一项的化合物，其中通过连接体结构内部连接所述肽单元的所述结合结构域。

45.根据权利要求44的化合物，其中所述的连接体是连续的肽连接体。

46.根据权利要求1至45中至少一项或权利要求55的肽和/或化合物在制备药物组合物中的用途。

47.根据权利要求1至45中至少一项或权利要求55的肽和/或化合物在制备用于预防或治疗障碍，尤其是用于治疗任何类型的贫血症或中风的药物组合物中的用途，该障碍的特征在于红细胞生成素缺乏或红细胞数低或有缺陷，或通过施用红细胞生成素是可治疗的。

48.根据权利要求1至45中至少一项或权利要求55的肽和/或化合物用于预防或治疗障碍，尤其是用于治疗任何类型的贫血症或中风的用途，该障碍的特征在于红细胞生成素缺乏或红细胞数低或有缺陷，或通过施用红细胞生成素是可治疗的。

49.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至45中至少一项或权利要求55的化合物和任选包含药学上可接受的载体。

50.根据权利要求49的药物组合物，其用于预防或治疗障碍，尤其是用于治疗任何类型的贫血症或中风，该障碍的特征在于红细胞生成素缺乏或红细胞数低或有缺陷，或通过施用红细胞生成素是可治疗的。

51.制备根据权利要求33至45中至少一项的化合物的方法，它包括：

(i)产生至少两个肽单元，其中每个肽单元包含至少两个具有结合受体能力的结构域；

(ii)产生至少一个聚合物载体单元；

(iii)将所述的肽单元连接到所述的聚合物载体单元上。

52.根据权利要求51的方法，其中以连续肽链的形式合成所述的肽单元。

53.根据权利要求51或52的方法，其中使用聚合物载体单元，该聚合物载体单元上具有至少一个化学基团，该化学基团能与肽单元上的可利用化学基团起反应，然后利用聚合物载体单元的该化学基团，使反应性聚合物载体单元和肽单元一起反应，形成其共价结合的复合物。

54.编码根据权利要求1至14和16中任何一项的肽的核酸。

55.一种肽，其特征在于它是根据权利要求1至14中至少一项的肽的反向肽和/或逆肽/反向肽，或者是全部由D-氨基酸组成的相应肽。

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