CN1213058C - Fap活化的抗肿瘤化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种能通过人类成纤维细胞活化蛋白质(FAPα)的催化作用而转化成药物的药物前体，该药物前体具有能被FAPα识别的裂解部位，以及该药物于生理条件下具有细胞毒性或细胞抑制性。

Description

FAP活化的抗肿瘤化合物
                        发明领域
本发明是关于通过在肿瘤部位投与可转化成药物的药物前体而治疗肿瘤的领域。更具体而言，本发明是关于一种通过FAPα的催化作用而可转化成药物的药物前体，以及其制法及药物用途。
                      背景及现有技术
人类成纤维细胞活化蛋白质(FAPα)是原先用单克隆抗体(mAb)F19鉴定的Mr95,000细胞表面分子(Rettig等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，3110-3114；Rettig等人(1993)Cancer Res.53，3327-3335)。FAPαcDNA编码具有大型细胞外区域、跨膜片段及短胞质内尾部的II型整膜蛋白质(Scanlan等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5657-5661；WO 97/34927)。FAPα显示有48％氨基酸序列类似于T-细胞活化抗原CD26，CD26已知被称为二肽基肽酶IV(DPPIV；EC3.4.14.5)，一种具有二肽基肽酶活性的膜-结合性蛋白质(Scanlan等人，同上)。FAPα具有酶活性并为丝氨酸蛋白酶族的成员，具有对酶功能极为重要的丝氨酸624(WO97/34927)。使用膜加叠测定的研究显示FAPα二聚物能裂解Ala-Pro-7-氨基-4-三氟甲基香豆素、Gly-Pro-7-氨基-4-三氟甲基香豆素及Lys-Pro-7-氨基-4-三氟甲基香豆素二肽(WO97/34927)。
FAPα在许多组织类型的人的上皮癌的反应性基质成纤维细胞、愈合伤口的颗粒性组织以及某些骨及软组织肉瘤的恶性细胞中选择性表达。正常成人组织通常没有可检测的FAPα，但一些胎儿间充质组织会暂时表达该分子。相反，大部分一般类型的上皮癌，包括＞90％的乳腺癌、非小细胞肺癌及结肠直肠癌，含有FAPα-反应性基质成纤维细胞(Scanlan等人，loc.cit)。这些FAPα+成纤维细胞伴生新形成的肿瘤血管，而在肿瘤微血管内皮与恶性上皮细胞壁的基底间形成明显的细胞区间(Welt et al.(1994)J.Clin.Oncol.12(6)，1193-1203))。虽然FAPα+基质成纤维细胞在原发性及转移性癌中都被发现，但受测试的良性及癌前期上皮损害(Welt et al.，loc.cit.)诸如乳房的纤维腺瘤及结肠直肠腺瘤，仅很少含有FAPα+基质细胞。基于FAPα在正常组织中的受限分布模式以及其在许多恶性肿瘤的支持基质中的均匀表达，因此曾对转移性结肠癌患者启动使用131I-标记的mAb F19进行临床试验(Welt等人，同上)。
对于基于细胞毒性或细胞抑制性药物的新颖癌症治疗而言，主要考虑是通过改善细胞毒性剂或细胞抑制剂对癌性组织杀死有效及/或降低对正常组织的毒性而增加治疗指数。为增加杀死肿瘤组织的特异性及降低对正常组织的毒性，可以设计一种激发机制以使合成在药物前体或失活形式中的毒性剂，在需要时及需要之处(尤其是癌性组织)，变成具有活性(Panchal(1998)Biochem.Pharmacol.55，247-252)。激发机制包括或外源因子诸如光或化学品，或包括内源细胞因子，诸如在癌组织中限制表达的酶。另一被进一步详述的观念为所谓的“抗体-指引的酶药物前体疗法”(ADEPT)或“抗体指引的催化作用”(ADC)(Huennekens(1994)Trends Biotechnol.12，234-239；Bagshawe(1994)Clin.Pharmacokinet.27，368-376；Wang等人(1992)CancerRes.52，4484-4491；Sperker等人(1997)Clin.Pharmacokinet.33(1)，18-31)。在ADEPT中，针对肿瘤-相关的抗原的抗体用于使特异性酶瞄准肿瘤部位。该被定位于肿瘤的酶将接着投与的药物前体转变成活性细胞毒性剂。抗体-酶共轭体(AEC)与在细胞膜上的标的抗原或在细胞外液(ECF)中的游离抗原结合。投与AEC及药物前体间的时间间隔允许AEC从正常组织中清除，以致使药物前体在正常组织或血液中不会被活化。但是，ADEPT的一些缺点与AEC的性质有关(Bagshawe，同上)。例如，在人类中，寻靶AEC的投与剂量中只有一小部分与肿瘤组织结合，其余通过体液分布，从体液中清除要有相当的时间延迟。即使未结合的酶浓度极低，也能催化足够的药物前体产生毒性效应，因为血浆及正常ECF体积比肿瘤ECF的体积大得多。在许多情况下，AEC也可以是具有免疫原性的，因而防止反覆给药。
国际专利申请WO 97/12624及WO 97/14416公开了一种寡肽，它包括下列5-及6-肽(SEQ.ID.No：151及177：hArg-Tyr-Gln-Ser-Ser-Pro；hArg-Tyr-Gln-Ser-Pro)，它含有能被游离前列腺特异性抗原(PSA)识别及蛋白质性裂解的氨基酸序列，以及公开一种包含该寡肽与已知治疗或细胞毒性剂的共轭物的治疗剂。这些包含至少谷氨酰胺-丝胺酸部分的寡肽共轭物只在前列腺癌的治疗中有用。
本发明要解决的问题为提供一种改善正常组织对已知具抗广范围肿瘤组织有效的细胞毒性剂或细胞抑制剂的耐受性。
                        发明的公开
本发明是关于酶-活化的抗肿瘤化合物。特别是，本发明提供一种通过在人类癌组织中存在的内源性成纤维细胞活化蛋白质(FAPα)的催化作用能转变成药物的药物前体。本发明的药物前体优选能通过FAPα的催化作用而转化成药物，该药物前体具有能被FAPα识别的裂解部位，以及该药物是在生理条件下能对抗癌细胞的细胞毒性剂或细胞抑制剂。
在本发明的内容中，“药物”是指可投与人类或动物以帮助疾病治疗的化合物。特别是，药物为具有药理活性的物质。
术语“细胞毒性化合物”是指对活细胞有毒性的化合物，尤其是能破坏或杀死细胞的药物。术语“细胞抑制性化合物”是指抑制细胞生长及增殖的化合物，因此能抑制细胞的增生。适用于本发明的细胞毒性化合物或细胞抑制性化合物为蒽环类衍生物诸如阿霉素(doxorubicin)，氨甲喋呤类似物诸如甲氨喋呤(methotrexate)、普利曲西(pritrexime)、三甲曲沙(trimetrexate)或DDMP，苯丙氨酸氮芥(melphalan)，顺氯氨铂的类似物诸如顺氯氨铂(cisplatin)、JM216、JM335、二(铂)(bis(platinum))或羰铂(carboplatin)，嘌呤及嘧啶的类似物诸如阿糖胞苷(cytarbine)、吉西他平(gemcitabine)、氮胞苷(azacitidine)、6-硫胍、氟阿糖胞苷(flurdarabine)或2-去氧肋间型霉素，以及其他化学治疗剂的类似物诸如9-氨基喜树碱、D，L-氨基苯乙哌啶酮、甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)、丝裂霉素C、米托蒽醌(mitoxantrone)、环磷酰胺(cyclophosphanamide)、5-氟尿嘧啶、extramustine、鬼臼脂素(podophyllotoxin)、博来霉素(bleomycin)或紫杉醇。
“药物前体”是指投与时，在变成药理活性剂之前必须通过代谢过程而进行化学转化。特别是，药物前体为药物的前身。在本发明的内容中，药物前体与其通过FAPα的催化作用转化成的药物相比较，其细胞毒性或细胞抑制作用要低得多。专业人员已知测定化合物的细胞毒性的方法，例如见本文的实施例6，或Mosmann((1983)J.Immun.Meth.65，55-63)。在试管测定中，药物前体的细胞毒性与药物相比较，至少低3倍。
“在生理条件下为细胞抑制性或细胞毒性的药物”是指在人类或动物活体中为细胞抑制性或细胞毒性的化合物，尤其是在人类或动物活体中会杀死细胞或抑制细胞增殖的化合物。
“具有会被FAPα识别的裂解部位的药物前体”是指能作为FAPα的酶活性的基质的药物前体。特别是，FAPα的酶活性于生理条件下能催化药物前体的共价键进行裂解。通过该共价键的裂解，药物前体被直接或间接转化成药物。间接活化是指被FAPα催化的步骤的裂解产物本身非为药理活性剂，但再进行另一反应步骤例如水解后，变成具有活性。更优选的是，该药物前体的裂解部位能被FAPα特异性地识别，但不会被人类或动物体中存在的蛋白分解酶识别。也优选的是，裂解位点能被FAPα特异性地识别但不会被存在于人或动物体液尤其是血浆中的蛋白分解霉所识别。在特优选的实施例中，药物前体在血浆、其他体液或组织中是稳定的，在其中不存在或检测不到生物活性的FAPα。优选地，如本实施例7中进行的体外测定时，超过50％，更佳超过80％，最佳超过90％的药物前体在37℃下8小时后仍存在于含10％(v/v)人类血浆的溶液中。裂解部位最佳是具有FAPα特异性。在优选实施方案中，裂解部位包含L-脯氨酸残基，其通过酰氨键与细胞毒性剂或细胞抑制剂连接。该类之一的实例为阿霉素-肽共轭物。FAPα可催化肽的C-端氨基酸残基(优选为L-脯氨酸)与细胞毒性或细胞抑制性化合物间的肽键断裂。
优选化合物表示在下述标准条件下至少有10％转化成游离药物。更佳的为在标准条件下有至少20％转化成游离药物的化合物。甚至更佳的为显示至少50％转化成游离药物的化合物。在本文中，标准条件被定义如下：将各化合物溶于50mM Hepes缓冲液，150mM NaCl，pH7.2，并使最终浓度为5μM，然后与100ng CD8 FAPα于37℃一起培育24小时(见实例4)。游离药物通过CD8 FAPα的释放如实施例5所述测定。
本发明优选关于式(I)的化合物或其医药上允许的盐：
Figure C0080753800121
R1代表氨烷酰基或寡肽酰基(尤其是二-或三-肽酰基)，其N-端氨基官能基可与封端基相接；
Ra及Rb与在其间的N-C基共同形成3-至7-员饱和或不饱和杂环，它可任选地被取代或者可任选地与苯环或环己烷稠合，杂环中一或二个CH2也可被NH、O或S取代；
R4代表H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、芳基或杂芳基；以及Cyt’代表细胞毒性或细胞抑制性化合物的基；
附带条件为要排除：
N2-乙酰基-L-高精氨酰基-L-酪氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-丝氨酰基-N-[2，3，6-三去氧-1-O-[(1 S，3S)-1，2，3，4，6，11-六氢-3，5，12-三羟基-3-(羟基乙酰基)-10-甲氧基-6，11-二氧基-1-并四苯基]-α-L-来苏-己哌喃糖(L-lyxo-hexopyranos)-3-基]-L-脯氨酰胺；以及
N2-乙酰基-L-高精氨酰-L-酪氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-丝氨酰基-L-丝氨酰基-N-[2，3，6-三去氧基-1-O-[(1S，3S)-1，2，3，4，6，11-六氢-3，5，12-三羟基-3-(羟乙酰基)-10-甲氧基-6，11-二氧基-1-并四苯基]-α-L-来苏-己哌喃糖-3-基]-L-脯氨酰胺。
特别优选的为式I中其R1是式Cg-A、Cg-B-A或Cg-(D)m-B-A的基的化合物：其中：
Cg代表氢原子或选自R5-CO、R5-O-CO-、R5-NH-CO-、R5-SO2-或R5- 中的封端基，其中R5可任选地被C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、芳基、芳烷基或杂芳基取代；Cg优选为乙酰基、苄酰基、D-丙氨酰基、(R)-H2NCH(CH3)-或H2NCOCH2CH2-取代基，或另一供保护N-端氨基官能的封端基；
A，B及D各独立代表由式-[NR6-(X)p-CO]-的氨基羧酸衍生的部分，其中X代表CR7R8以及R6，R7及R8各独立代表氢原子、可任选地取代的C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、芳基或杂芳基，以及p为1，2，3，4或5；或者A，B及D各独立代表由下式的环氨基羧酸衍生的部分：
其中
R9代表C1-C6-烷基、OH或NH2，
m为整数1至10；
q为0，1或2；以及
r为0，1或2。
更优选的为式I中的R6，R7及R8各独立代表下列的化合物：氢原子或CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、(CH3)2CH-、CH3CH2CH2CH2-、(CH3)2CHCH2-、CH3CH2CH(CH3)-、(CH3)3C-、HOCH2-、CH3CH(OH)-、CH3CH(OH)CH2CH2-、HOCH2CH2CH2CH2-、H2NCH2CH2CH2-、H2NCH2CH2CH2CH2-、H2NCH2CH(OH)CH2CH2-、H2NC(＝NH)NHCH2CH2CH2-、HSCH2-、CH3SCH2CH2-、HOOCCH2-、HOOCCH2CH2-、H2NC(＝O)CH2-、H2NC(＝O)CH2CH2-、苄基、对-羟基-苄基、
或
环己基或苯基；
p为1，并其中在CR7R8的构型可为R或S；若R7不是氢，则R8优选为H；
R6优选为氢；若p大于1，则R7及R8优选为H。
本发明的另一优选实施方案为式I化合物，其中，由Ra及Rb与在其间的N-C共同形成的杂环可被R2及R3取代，其中R2及R3各独立代表氢或卤素原子，或者C1-C6-烷基、C1-C6-烷基氨基、二-C1-C6-烷基氨基、C1-C6-烷氧基、硫醇基、C1-C6-烷硫基、氧基、亚氨基、甲酰基、C1-C6-烷氧羰基、氨羰基、C3-C8-环烷基、芳基或杂芳基。
除非另有指定，单一的立体异构物以及立体异构物的混合物或外消旋物都包括在本发明中。
“C1-C6-烷基”通常代表具有1至6个碳原子的直链或支链烃基。
术语“可任选地取代”在上文或下文中是指一基或部分视需要可被一个或数个选自卤原子、羟基、氨基、C1-C6-烷氨基、二-C1-C6-烷氨基、C1-C6-烷氧基、硫醇基、C1-C6-烷硫基、＝O、＝NH、-CHO、-COOH、-CONH2、-NHC(＝NH)NH2、C3-C8-环烷基、芳基或杂芳基的取代基取代，这些取代基可彼此相同或不同。
下列基列举以作实例：
甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基(异丙基)、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、正-戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基及1-乙基-2-甲基-丙基、HOCH2-、CH3CH(OH)-、CH3CH(OH)CH2CH2-、HOCH2CH2CH2CH2-、H2NCH2CH2CH2-、H2NCH2CH2CH2CH2-、H2NCH2CH(OH)CH2CH2-、H2NC(＝NH)NHCH2CH2CH2-、HSCH2-、CH3SCH2CH2-、HOOCCH2-、HOOCCH2CH2-、H2NC(＝O)CH2-、H2NC(＝O)CH2CH2-、苄基、对羟基-苄基、
Figure C0080753800141
或
Figure C0080753800142
若C1-C6烷基被取代，则取代基优选为羟基、氨基、二甲氨基、二乙氨基、硫醇基、甲硫醇基、甲氧基、乙氧基、＝O、＝NH、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3、-CONH2、-NHC(＝NH)NH2、环己基、苯基、苄基、对羟基苄基、
Figure C0080753800151
或
若C1-C6烷基被芳基或杂芳基取代，则C1-C6烷基优选为C1，更佳为亚甲基。
在上述或下述的有关R1基中的“氨烷酰基”及包括“二-或三-肽酰基”的“寡肽酰基”是指其中的氨基酸或包含至多12个(优选2或3个)氨基酸部分的寡聚物以C-端通过酰氨键与杂环的氮原子连接。
熟习有机酸及寡肽化学的一般人士易于了解某些氨基酸可被其他类似的、等排的及/或等电性氨基酸取代，其中原始氨基酸或寡肽的生物活性在修饰时被保留。某些非天然及经修饰的氨基酸可被用于置换相应的天然氨基酸。因此，例如，酪氨酸可被3-碘酪氨酸、2-或3-甲基酪氨酸、或者3-氟酪氨酸置换。
上文或下文所述的有关与R1的氨基烷酰基或寡肽酰基的N-端氮原子相接的“封端基”是指能使通过存在于温血动物血浆中的氨基肽酶的作用而降低或消除本发明化合物的酶降解的基或部分。适当的封端基包括C1-C10烷酰基、C6-C18-芳基-C1-C10烷酰基、C6-C18-芳基-C1-C10-烷磺酰基。这种封端基也包括亲水性封阻基，其根据亲水性官能度的存在而选择。这种封端基增加本发明化合物的亲水性并因而增加其在水性介质中的溶解度。这些增进亲水性的封端基优选选自羟基化烷醇、多羟基化烷酰基、羟基化芳酰基、羟基化芳烷酰基、多羟基化芳酰基、多羟基化芳烷酰基、聚乙二醇、糖基化物、糖及冠醚。
“C3-C8-环烷基”一般代表具有3至8个碳原子的环形烃基，其可任选地被一至数个选自羟基、氨基、C1-C6-烷氨基、二C1-C6-烷基氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、硫醇基、C1-C6-烷硫基、＝O、＝NH、-CHO、-COOH、-COOCH3-、-COOCH2CH3、-CONH2、-NHC(＝NH)NH2或卤素的取代基取代，这些取代基可彼此相同或相异。
上文或下文所述的有关由Ra及Rb与在其间的N-C共同形成的基中的“杂环”通常代表3至7员(优选4-，5-或6-员非芳族杂环系统)，它含有1个氮原子和任选地含有1或2个选自氮、氧及硫中的另外杂原子，它可被一个或数个选自卤原子、C1-C6-烷基、C1-C6-烷基氨基、二-C1-C6-烷基氨基、C1-C6-烷氧基、硫醇基、C1-C6-烷硫基、氧基、亚氨基、甲酰基、C1-C6-烷氧羰基、氨羰基、C3-C8环烷基、芳基或杂芳基的取代基取代，这些取代基可彼此相同或不同；以及其可任选地与苯环或环己环稠合。这种杂环系环优选为氮杂环丁烷或由被完全或部分氢化的吡咯、吡啶、噻唑、异噁唑、吡唑、咪唑、吲哚、苯并咪唑、吲唑、哒嗪、嘧啶或吡嗪基中衍生的。最优选的为氮杂环丁烷、吡咯烷、3，4-去氢吡咯烷、哌啶、六氢-1H-氮杂、八氢吲哚、咪唑烷或噻唑烷。
若该杂环被取代，则取代基优选为甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基(异丙基)、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、羟基、氨基、二甲氨基、二乙氨基、硫醇基、甲硫醇基、甲氧基、乙氧基、-CHO、-COOH、-COOCH3-、-COOCH2CH3或-CONH2。
“芳基”通常代表具有6至10个碳原子(优选6个碳原子)的芳族环系统，其可任选地被一至数个选自羟基、氨基、C1-C6-烷氨基、二-C1-C6-烷基氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、硫醇基、C1-C6-烷硫基、-CHO、-COOH、-COOCH3-、-COOCH2CH3、-CONH2或卤素的取代基取代，这些取代基可彼此相同或相异；以及其可任选地与苯环稠合。芳基取代基可优选地由苯衍生，优选的实例为苯基、2-羟基-苯基、3-羟基-苯基、4-羟基-苯基、4-氨基-苯基、2-氨基-苯基、3-氨基苯基。
若芳基被取代，该取代基优选为甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基(异丙基)、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、羟基、氨基、二甲氨基、二乙氨基、硫醇基、甲硫醇基、甲氧基、乙氧基、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3或-CONH2。
“杂芳基”通常代表5至10-员的芳族杂环系统，其含有1至5个选自选自氮、氧或硫的杂原子，其可任选地被一个或数个选自羟基、氨基、C1-C6-烷基氨基、二-C1-C6-烷基氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、硫醇基、C1-C6-烷硫基、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3、-CONH2或卤素的取代基取代，这些取代基可彼此相同或不同；以及其可任选地与苯环稠合。杂芳基取代基优选由呋喃、吡咯、噻吩、吡啶、噻唑、异噁唑、吡唑、咪唑、苯并呋喃、硫茚、吲哚、苯并咪唑、吲唑、喹啉、哒嗪、嘧啶、吡嗪、喹唑啉、吡喃、嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶。
若杂芳基被取代，该取代基优选为甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基(异丙基)、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、羟基、氨基、二甲氨基、二乙氨基、硫醇基、甲硫醇基、甲氧基、乙氧基、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3或-CONH2。
“细胞毒性或细胞抑制性化合物的残基”意指化合物H2N-Cyt′，其于式(I)中所示的酰胺键断裂时被释出，其本身或是细胞毒性或是细胞抑制性，或在下一步骤中可被转化成细胞毒性或细胞抑制性化合物。
在后一情况中，-Cyt′可为式-L-Cyt″的残基，其中L为衍生于二官能分子的连接子残基，例如二胺H2N-L′-NH2，氨基醇H2N-L′-OH，例如对-氨基-苄醇(PABOH)，氨基碳酸酯例如：
Figure C0080753800171
或非天然的氨基羧酸。若-Cyt′为式-L-Cyt″，则化合物H2N-L-Cyt″通过式(I)所示的酰胺键的酶裂解而产生。化合物H2N-L′-Cyt″本身可以是细胞毒性或细胞抑制性，或者在下一步骤中从Cyt″断离连接子残基而释出细胞毒性或细胞抑制剂。例如，化合物H2N-L′-Cyt″可于生理条件下水解而形成化合物H2N-L′-OH及细胞毒性或细胞抑制性化合物H-Cyt″，它为活性的治疗剂(在下文中，为了简化，Cyt′被用于表示Cyt′及Cyt″二者，以及L被用于表示L及L′二者)。
本发明化合物的药物上允许的盐包括从无毒性无机酸或有机酸形成的习用无毒盐。例如，这种习用无毒盐包括从无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、胺磺酸、磷酸及硝酸等形成的；以及从有机酸诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、羟乙酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苄酸、水杨酸、磺胺酸及草酰三氟乙酸等制备的盐。
优选的式I化合物为具式IA的：
Figure C0080753800172
其中R2、R3、R4、Cyt′如上文所限定，
R1代表氨烷酰基或寡肽酰基，以及
X-Y代表CHR2-CH2、CR2＝CH、NH-CH2、CH2-NH、-CR2-、CH2-CHR2-CH2；其条件为当X-Y代表CH2-CH2基时，R1代表氨烷酰基、二-或三-肽酰基，或者R1代表具有三个以上氨基酸部分但不含Gln-Ser氨基酸序列的寡肽酰基。
环形氨基酸残基的α碳原子优选为外消旋性，即(R/S)构形；最优选为(S)构形；在特佳实施方案中，α碳原子为(S)构形以及R2为H。若R2为OH，其优选是在反式位置。
R2及R3优选代表氢原子或甲基、乙基、丙基、异丙基、苯基、甲氧基、乙氧基或羟基，以及最佳为氢原子。R4优选为氢原子或甲基、乙基、丙基、异丙基或苯基，最佳为氢原子。
特佳的式IA化合物选自式IA1、IA2、IA3、IA4及IA5：
Figure C0080753800181
H2N-Cyt′优选为式II的蒽环素衍生物：
Figure C0080753800191
其中：
Rc代表C1-C6烷基、C1-C6羟烷基或C1-C6烷酰氧基C1-C6烷基，尤其是甲基、羟甲基、二乙氧基乙酰氧甲基或丁酰氧甲基；
Rd代表氢、羟基或C1-C6烷氧基，尤其是甲氧基；
Re及Rf中的一代表氢原子；而另一代表氢原子或羟基或四氢吡喃-2-基氧(OTHP)。
下列式II的化合物特别优选：
Rc                   Rd        Re     Rf             Cyt
CH2OH                OCH3      H       OH             阿霉素(doxorubicin)
CH3                  OCH3      H       OH             柔红毒素(daunorubicin)
CH2OH                OCH3      OH      H              表阿霉素(epirubicin)
CH3                  H          H       OH             去甲氧正定霉素(idarubicin)
CH2OH                OCH3      H       OTHP           THP
CH2OH                OCH3      H       H              去羟阿霉素(esorubicin)
CH2OCOCH(OC2H5)2 OCH3      H       OH             阿霉素双乙氧乙酸酯
                                                        (detorubicin)
CH2OH                H          H       OH             卡米诺柔红霉素
                                                        (carminorubicin)
CH2OCOC4H9        OCH3      H       OH
最优选的为阿霉素(Dox)。其他细胞毒性或细胞抑制性残基Cyt′例如可衍于甲氨喋呤、三甲曲沙(trimetrexate)、普利曲西(pyritrexim)、5，10-二去氮四氢叶酸酯嘧啶甲胺、甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)、10-炔丙基-5，8-二去氮叶酸酯2，4-二氨基-5-(3′，4′-二氯苯基)-6-甲基嘧啶、氨基乙哌啶酮、高莱丝来林(goreserelin)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、其他化学治疗剂的类似物诸如9-氨基喜树碱(例如见Burris HA，r.d.and S.M.Fields(1994)，“拓扑异构酶I抑制剂，喜树碱类似物的综述，[评论]”，Hematol.Oncol.Clin.North Am.8(2)：333-355；Iyer，L and M.J.Ratatin(1998)，“喜树碱的临床药理[评论][137参考文献]”，Cancer Chemother.Pharmacol.42Suppl：S31-S43)。
在式(I)中，Cyt′也可以是直接或间接破坏肿瘤细胞的生物效应子分子，例如TNFα。
A，B及D单元衍生的氨基羧酸的优选实例为甘氨酸(Gly)，或者D-或L-形式(较佳)的丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro)、反式-4-羟基-脯氨酸(Hyp)、5-羟基赖氨酸(Hyl)、正亮氨酸(Nle)、5-羟基正亮氨酸、6-羟基正亮氨酸(Hyn)、鸟氨酸(Orn)、环己基甘氨酸(Chg)、苯基甘氨酸(Phg)、谷氨酰胺(Gln)、环己丙氨酸(Cha)、蛋氨酸-S-氧化物(Met)、β-环丙基丙氨酸(Cpa)、叔-亮氨酸(Tle)或高丝氨酸(Hse)。
优选的化合物具有通式(I)，其中A单位衍生于丙氨酸、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro)、反式-4-羟基-脯氨酸(Hyp)、5-羟基赖氨酸(Hyl)、正亮氨酸(Nle)、5-羟基正亮氨酸、6-羟基正亮氨酸(Hyn)、鸟氨酸(Orn)或环己基甘氨酸(Chg)、苯基甘氨酸(Phg)、谷氨酰胺(Gln)、环己丙氨酸(Cha)、蛋氨酸-S-氧化物(Met(O))、β-环丙基丙氨酸(β-Cpa)、叔-亮氨酸(Tle)或高丝氨酸(Hse)。
特佳者为式(I)化合物中R1为选自式(1)至(34)的基：
H-Chg          (1)          H-Tle           (18)
H-Lys          (2)          H-Hyl           (19)
H-Nle          (3)          H-Hse           (20)
H-Ala          (4)          Cg-Gly          (21)
H-Hyn          (5)         Cg-Nle                    (22)
H-Pro          (6)         Cg-Val                    (23)
H-Phg          (7)         Cg-Met                    (24)
H-Gln          (8)         H-Xxx-Lys                 (25)
H-反式-Hyp     (9)         H-Xxx-Hyn                 (26)
H-Val          (10)        H-Xxx-Pro                 (27)
H-Cha          (11)        H-Xxx-His                 (28)
H-Met          (12)        H-Xxx-Met                 (29)
H-Nva          (13)        H-Xxx-Ala                 (30)
H-Met(O)       (14)        Cg-Xxx-Hyn                (31)
H-β-Cpa       (15)        Cg-Xxx-Ala-Gly            (32)
H-Ile          (16)        Cg-(Xxx)m-Xxx-Ala-Gly    (33)
H-Ser          (17)        Cg-(Xaa)m-Xaa-Gly        (34)
其中
Cg代表氢原子或选自苄酰氧羰基、苯乙酰基、苯甲磺酰基及苄氨羰基的封端基；Xaa代表衍生于氨基羧酸的部分，优选选自天然氨基酸，尤其是选自Ala、Pro、Tyr、Phe、His、Ser、Thr、Hyp及Lys中的基；以及m为1至6的整数。
优选的封端基Cg为乙酰基(Ac)、琥珀酰亚氨基(Suc)、D-丙氨酰基、苄氧羰基(Cbz或Z)、或者巨分子诸如聚乙二醇。
优选的蒽环类药物前体为式III的化合物：
Figure C0080753800211
其中Ra，Rb，Rc，Rd，Re，Rf及R1如上文定义。
本发明的最佳化合物为式(IIIA)及(IIIF)的阿霉素衍生物：
Figure C0080753800221
Figure C0080753800231
若式(I)的部分Cg-B-A或Cg-(D)m-B-A含有二个或多个硫原子，本发明的化合物可含有一或多个二硫键。
本发明可使用的细胞毒性或细胞抑制性化合物中有一类具有可用于形成式(I)所示的酰胺键的伯氨基官能，例如阿霉素。在该例中，连接子分子L不需要。若细胞抑制性或细胞毒性化合物没有氨基官能，这种官能可通过化学修饰而在该化合物中创建，例如通过引进一官能基或转化一官能基，或将一连接子分子连接到该化合物上。连接子分子也可被插在本发明化合物的寡聚物部分(即包含氨基羧酸残基的部分)与细胞抑制性或细胞毒性部分之间，以确保寡聚物部分与细胞毒性或细胞抑制性部分间的酰氨键的裂解或达到最佳。若存在连接子分子，即在含有I-Cyt′结构的化合物中，L与Cyt′间的键优选为酰氨键或酯键。在优选的实施方案中，该连接子分子于生理条件下于酶裂解后被水解而放出细胞抑制性或细胞毒性化合物，因此产生游离的细胞抑制性或细胞毒性化合物。在任一情况，本发明的化合物必须具有于FAPα的催化作用下可被裂解的性质，而该裂解的直接或间接结果为于生理条件下释放出细胞抑制性或细胞毒性化合物。
在另一方面，本发明关于能通过FAPα的催化作用转化成药物的药物前体，该药物前体具有能被FAPα识别的裂解部位，以及该药物于生理条件下为细胞抑制性或细胞毒性化合物。该药物前体优选包含具有2个或以上氨基羧酸残基的寡聚物部分以及细胞抑制性或细胞毒性部分，其中寡聚物部分的C-端氨基羧酸残基为3-至7-员天然或非天然环形氨基酸，优选为D-或L-脯氨酸、或D-或L-羟基脯氨酸，以及C-端羧基官能通过酰氨键与细胞抑制性或细胞毒性部分连接，该酰胺键可通过FAPα的催化作用而裂解。寡聚物部分优选为肽。寡聚物部分优选包含2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个氨基羧酸残基，更优选包含2，3或4个氨基酸残基。N-端氨基官能优选通过封端基保护。
本发明的化合物可通过本技术已知的方法而合成(E.Wunsch，在“有机化学的合成”一书中的肽的合成，Houben-Weyl(Eds.E.Muller，O.Bayer)，Vol.XV，Part 1 and 2，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1974)。例如，本发明的化合物可以按嵌段合成方式通过寡聚物部分的终端羧基官能(其中X可为OH或活化离去基)与细胞毒性或细胞抑制性分子H2N-Cyt′的氨基缩合，而导致形成酰胺。
Figure C0080753800251
若在寡聚物部分与细胞毒性剂或细胞抑制剂之间需要连接子残基(L)，可以按相同方式进行嵌段合成。
Figure C0080753800252
若细胞毒剂或细胞抑制剂携带供连接于寡聚物部分的羧基官能，连接子分子可以是亚胺或氨基醇以及该化合物的嵌段合成可以相似方式通过活化的XOC-Cyt′与羟基或氨基成分反应而进行。
若细胞毒性剂或细胞抑制剂具有适于与寡聚物部分偶合的羟基官能，则连接子残基可以是氨基羧酸以及可以按相同方式进行嵌段合成。
若需要，在单位Cyt′，L，羟基脯氨酸，A，B及D中，于标的分子组合期间不反应的其他官能基可通过适当的保护基而保护。适当的保护基为本技术所熟知的(P.G.M.Wuts，“有机合成中的保护基”，John Wiley and SonsInc.，New York 1991)。这些保护基于合成终结时被除去。
仅作为实例，有用的氨基保护基例如可包括C1-C10烷酰基诸如甲酰基、乙酰基、二氯乙酰基、丙酰基、3，3-二乙基己酰基等，C1-C10烷氧羰基及C6-C17芳烷氧羰基诸如叔丁氧羰基、苄氧羰基(BOC)及芴甲氧羰基等。最佳者为芴甲氧羰基(FMOC)。
适当的羧基-保护基可包括例如C1-C10烷基诸如甲基、叔丁基、癸基；C6-C17芳烷基诸如苄基、4-甲氧苄基、二苯甲基、三苯甲基、芴基；三-(C1-C10烷基)硅烷基或(C1-C10烷基)-二芳基硅烷基诸如三甲基硅烷基、二甲基-叔丁基硅烷基、二苯基-叔丁基硅烷基及相关的基。
为形成该酯-或酰胺，可能需要活化羧酸的羰基，以亲核性攻击胺或醇，即X为适于被氨基取代的活化基或离去基。该活化可通过羧酸转化成酰基氯或酰基氟，或者通过羧酸转化成活化酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯或五氟苯酯而进行。活化的另一方法为转化成对称或不对称酐。或者，酰胺-或酯键的形成可通过使用就地偶合试剂诸如苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷鏻六氟磷酸盐(PyBOP)(E.Frerot等人，Tetrahedron，1991，47，259-70)、1，1′-羰基二咪唑(CDI)(K.Akaji等人，THL，35，1994，3315-18)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3，-四甲基尿鎓四氟硼酸(TBTU)(R.Knorr等人，THL，30，1989，1927-30)、1-(1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑(MSNT)(B.Blankenmeyer-Menge等人，THL，31，1990，1701-04)而达成。
嵌段合成的另一方法是为通式(I)中的分子，可从右手侧开始，通过个别单体Cyt′，L，Ra、Rb与其间的N-C-基所形成的环形氨基酸基(尤其是脯氨酸或羟基脯氨酸)，A，B及D的逐步缩合反应而以逐步方式组合而成。就缩合反应而言，可以应用与上述相同的偶合方法。由于单位L，脯氨酸/羟基脯氨酸，A，B及D为至少含有氨基-及(至少单位A，B及D，以及Ra、Rb与其间的N-C基所形成的环形氨基酸基，尤其是脯氨酸/羟基脯氨酸)羧基的二官能分子，在将羧基官能活化前，氨基需要被保护基(PG)封阻。为了保护氨基，可应用BOC基，优选FMOC基。偶合反应之后，氨基保护基必须除去并与下一个经FMOC-或BOC-保护的单元进行偶合。若需要，在单位Cyt′，L，Ra、Rb与其间的N-C基所形成的环形氨基酸基(尤其是羟基脯氨酸)，A，B及D中，于标的分子的组合期间不应反应的其他官能基可被适当官能基保护。这些保护基于合成终结时被除去。
在式(I)的内容中所界定的封端基也可作为保护基，尤其是当加入最后的(N-端)氨基羧酸时。在后一情况下，由于保护基为标的分子的一部分，所以不需除去。另一选择为封端基可于最后一氨基羧酸单元被偶合及去保护后面加入。
逐步合成列于以下流程图中。第二流程例示连接子残基以及Cyt′残基可含有如该流程所示的其他官能基(见下文)。
Figure C0080753800271
所以，本发明的再一方面为提供一种式(I)化合物的制法，其特征为将通式(V)化合物与化合物HN(R4)-Cyt′(其中Cyt′为细胞毒性或细胞抑制性化合物的残基，以及R4如前文界定)反应
Figure C0080753800272
式(V)中R1，Ra及Rb如前文限定，X1代表OH或适于被氨基取代的离去基。
式(V)中的X1优选为离去基，例如-Cl、-F、N-羟基琥珀酰亚胺基、五氟苯基或羧酸根。或者X1可为OH，以及通过使用就地偶合试剂例如苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷鏻-六氟磷酸盐(PyBOP)、1，1′-羰基二咪唑(CDI)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓四氟硼酸盐(TBTU)或1-(1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑(MSNT)进行缩合而进行。
本发明的再一方面为提供一种式(I)化合物的制法，
其特征为将式(VI)化合物与化合物H2N-Cyt′或化合物HO-Cyt′(其中Cyt′为细胞毒性或细胞抑制性化合物的残基)反应：
式(VI)中R1，Ra及Rb如权利要求1所定义，Y1代表L-COX2，其中L为连接子残基，以及X2代表OH或适于被氨基或羟基取代的离去基。
式(VI)中的X2优选为离去基，例如-Cl、-F、N-羟基琥珀酰亚胺基、五氟苯基或羧酸根。或者，X2可为OH，以及缩合通过用就地偶合试剂例如苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷-六氟磷酸盐(PyBOP)、1，1′-羰基二咪唑(CDI)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基春阳离子四氟硼酸盐(TBTU)或1-(1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑(MSNT)进行缩合而进行。
本发明的再一方面为提供一种式(I)化合物的制法，其特征为将式(VII)化合物与化合物X3OC-Cyt′(其中X3为OH或适于被氨基或羟基取代的离去基，以及Cyt′为细胞毒性或细胞抑制性化合物的残基)反应。
Figure C0080753800282
其中R1，Ra及Rb如上文界定，Y2为式L-OH或L-NH2(其中L为连接子残基)。
化合物X3OC-Cyt′的X3优选为离去基，例如-Cl、-F、N-羟基琥珀酰亚胺基、五氟苯基或羧酸根。或者，X可为OH，以及通过使用就地偶合试剂例如苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷鏻-六氟磷酸盐(PyBOP)、1，1′-羰基二咪唑(CDI)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓四氟硼酸盐(TBTU)或1-(1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑(MSNT)进行缩合而进行。
本发明的再一方面为提供一种式(I)化合物的制法，其特征为将化合物H2N-Cyt′与组成式(I)化合物的单位逐步进行缩合。在每一偶合步骤之前，需要除去保护基PG(若存在)。
本发明的再一方面为提供一种式(I)化合物的制法，其特征为将式(VIII)化合物与化合物HN(R4)-Cyt′(其中Cyt′为细胞毒性或细胞抑制性化合物的残基)反应：
Figure C0080753800291
式(VIII)中PG1为保护基，以及其他取代基具有如上文所述的意义。
然后将保护基PG1除去以及继而将生成的式(VIIIA)化合物：
Figure C0080753800292
与化合物PG2-A-X4(其中PG2为保护基以及X4代表OH或适于被氨基取代的离去基)反应；
以及若需要可再进行偶合步骤，直至得到完全的化合物为止。
PG1及PG2例如可为BOC，或优选为FMOC。
所以，本发明的再一方面为提供一种式(I)化合物的制法，其特征为将式PG3-N(R4)-L-COX3化合物(其中PG3为保护基以及其他取代基具有上文所述的意义)与式Y4-Cyt′化合物(其中Cyt′为细胞毒性或细胞抑制性化合物的残基；以及Y4代表H2N或HO)反应；
然后除去保护基PG3；以及将生成的式HN(R4)-L-Y4-Cyt′化合物与式(VIII)化合物反应：
然后除去保护基PG1；以及将生成的下式化合物：
Figure C0080753800302
与化合物PG4-A-X4(其中PG4为保护基，以及X4为OH或适于被氨基取代的离去基)反应；
以及若需要可再进行偶合步骤，直至得到完全的分子为止。
本发明的再一方面为提供一种式(I)化合物的制法，其特征为将式PG5-N(R4)-L-Y5化合物(其中PG5代表保护基，Y5代表OH或NH2以及具有上文所述意义的取代基)与式X5OC-Cyt′的化合物(其中Cyt′为细胞毒性或细胞抑制性化合物的残基以及X5为OH或适当离去基)反应；
然后除去保护基PG5；以及将生成的式HN(R4)-L-Y5-CO-Cyt′化合物与下述式(VIII)化合物反应：
Figure C0080753800303
然后除去保护基；以及将生成的下式化合物：
Figure C0080753800304
与式PG2-A-X4的化合物(其中PG2为保护基，以及X4为OH或适于被氨基取代的离去基)反应；
以及若需要可再进行偶合步骤，直至得到完全的分子为止。
本发明的再一方面为提供一种式VIIIA的新颖中间物：
Figure C0080753800311
[其中Ra，Rb，R4及Cyt′如上文所定义]。
本发明化合物是供医疗使用。特别是，这些化合物可用于治疗与表达FAPα的基质成纤维细胞相关且用现有细胞毒剂及/或细胞抑制剂一般无法合适治疗的肿瘤。具有该性质的肿瘤例如为上皮癌诸如肺癌、乳腺癌及结肠癌。肿瘤诸如表达FAPα的骨及软组织肉瘤也可用这些化合物治疗。
所以本发明的另一方面为提供一种药物组合物，其包含本发明的化合物以及可任选地包含一种或以上医药允许的赋形剂，如在Remington：thescience and practice of pharmacy.19th ed.Easton：Mack Publ.，1995中所示的。药物组合物可被调配成固体溶液。固体制剂可在注射前调配成溶液。本发明药物组合物优选的为溶液或注射液。其可被全身性投给(例如通过静脉注射)或局部投与(例如通过直接注射入肿瘤部位)。剂量根据体重、病人的健康状态、所患疾病的性质、被投与的化合物的治疗口(window)及溶解度等因素而调整。其在专家适当调整剂量的知识范围内。就阿霉素而言，该剂量优选在10mg/m2至1350mg/m2的范围内，但更高或更低的剂量也适当。
所以，本发明的再一方面为本发明化合物在制备治疗癌症的药物组合物中的用途。再者，本发明提供一种治疗癌症的方法，其包含将有效量的本发明药物组合物投给病人。适应症包括治疗癌症，尤其是
1)上皮癌，包括乳房、肺、结肠直肠、头部及颈部、胰脏、卵巢、膀胱、胃、皮肤、子宫内膜、卵巢、睾丸、食道、前列腺及肾的源)的治疗；
2)骨及软组织肉瘤：骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、平滑肌肉瘤；
3)造血系统恶性肿瘤：何杰金氏及非何杰金氏淋巴瘤；
4)神经外胚层肿瘤：周围神经肿瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤；
5)间皮瘤。
也包括慢性发炎病症诸如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝硬化、肺纤维化、动脉粥样硬化以及异常的伤口愈合的治疗。
本发明的再一方面为提供一种癌症的治疗方法，其中将药物前体投给病人，该药物前体能被酶活性转化成细胞毒性或细胞抑制性药物，该酶活性为与肿瘤组织相关的细胞的表达产物。该酶活性优选为FAPα的蛋白分解活性。
化合物以静脉输注投与的方法。其他可能的投与途径包括腹膜腔内(浓缩药团或输注)、肌内或肿瘤内注射。若适当，直接应用也可能(例如肺纤维化)。
                            附图说明
图1：阿霉素-肽共轭物通过FAPα而裂解。ZGP-Dox(Z-Gly-(L)-Pro-阿霉素)与纯化的FAPmCD8融合蛋白质(A)或与缓冲液(B)一起培育后的色层图。见实施例5。
图2：藉阿霉素与FAPα可裂解肽的结合而减少阿霉素的细胞毒性。见实施例6。
图3：通过在FAPα-表达HT1080克隆33细胞中和在亲代HT1080细胞中，比较从FAPα可裂解的阿霉素-肽共轭物释出的阿霉素的细胞毒性。见实施例8。
图4：N-Cbz-Gly-(L)-Pro-阿霉素及N-Cbz-(L)-Pro(L)-Ala-Gly-(L)-Pro-阿霉素在小鼠及人类血浆中的血浆稳定性。见实施例9。
图5：在人类肿瘤组织样品中，FAPα酶活性的证明及其表观分子量的确认。见实施例12。
熟习本技术的应当了解虽然在下列实施例中列出特定试剂及反应条件，但可在本发明范围内进行修改。所以，下列实施例是为了说明本发明而并非限制本发明。
                              实施例
实施例1：阿霉素共轭物的合成方法
N-Cbz-Gly-Pro-阿霉素：将N-Cbz-Gly-Pro(116.1毫克，0.37毫摩尔)及N-羟基琥珀酰亚胺(44毫克，0.37毫摩尔)称重及于氮气下放置在2颈-圆底烧瓶中。加入无水N，N-二甲基甲酰胺(20毫升)并将烧瓶在冰浴中冷却至0℃。加入二环己基碳化二酰亚胺(78毫克，0.37毫摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺中的溶液1毫升。将该溶液于0℃搅拌40分钟。
称量阿霉素(100毫克，毫摩尔)并置入设有小搅棒的小瓶中及置于氮气下。将N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)及N，N-二异丙基乙胺(33.1微升，0.19毫摩尔)于搅拌下加到小瓶中。将阿霉素溶液通过注射器加到肽溶液中并将小瓶用另外2毫升的N，N-二甲基甲酰胺清洗。将冰浴移去及将反应混合物于室温搅拌约48小时。
将反应溶液用乙酸乙酯(500毫升)萃取。将乙酸乙酯用10％柠檬酸水溶液(250毫升)、饱和碳酸氢钠水溶液(250毫升)及食盐水(250毫升)依次清洗。将有机萃取液用无水硫酸镁干燥并将溶剂用旋转蒸发器除去。将富于DMF污染物的产物在C-18反相急骤色层柱中用8∶2甲醇∶水作为洗脱剂而进行层析。分离出一橙色点(rf～0.3)，其于长波UV光下会发出萤光。用旋转蒸发器除去甲醇以及用高真空泵过夜以除去最后微量的溶剂。
N-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro：将N-Cbz-Pro-Ala(5克，15毫摩尔)及羰基二咪唑(2.43克，15毫摩尔)于氩气氛下置于250毫升3颈圆底烧瓶中。加入无水四氢呋喃(50毫升)并于室温下搅拌该溶液约45分钟。观察到有气体(CO2)剧烈冒出。
称量Gly-Pro-OCH3·HCl(2.9克，15毫摩尔)并置入另一烧瓶中。加入四氢呋喃(5毫升)及N，N-二异丙基乙胺(5.23毫升，30毫摩尔)并将该溶液搅拌数分钟。将溶解的物质通过注射器加到活化的肽中，将剩余的物质溶于最少量的CH2Cl2中并再次通过注射器加到活化的肽中。
将反应溶液于室温下搅拌过夜(15小时)，于早晨时有大量白色沉淀。将反应混合物用10％柠檬酸水溶液(300毫升)冲洗及用乙酸乙酯(500毫升)萃取。将乙酸乙酯萃取液用饱和碳酸氢钠水溶液(300毫升)冲洗以及用盐水(300毫升)及无水硫酸镁干燥。将乙酸乙酯用旋转蒸发器除去，得到5克无色油，其表示令人满意的特征数据。
将N-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro-OCH3(5克，12毫摩尔)的粗制油溶于在圆底烧瓶内的甲醇(20毫升)中。将该烧瓶置于室温水浴中。小心加入1N氢氧化钠溶液(12毫升)。将该溶液搅拌3.5小时，之后加入1N HCl溶液(12毫升)。将该溶液在旋转蒸发器上浓缩以及加入数滴1N HCl，直至用pH纸测量时，pH为约1.5。将水用真空泵除去得到油，将其从乙醇中缓慢结晶。
N-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro-阿霉素：将N-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro(180毫克，0.38毫摩尔)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(15毫升)。将1-羟基苯并三唑(51.3毫克，38毫摩尔)及二环己基碳化二亚胺(78毫克，38毫摩尔)各溶于1毫升N，N-二甲基甲酰胺中并以溶液形式加到肽中。将该溶液混合物于室温搅拌45分钟。
称量阿霉素·HCl(116毫克，20毫摩尔)并置入另一小瓶中并溶于N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)中。将N，N-二异丙基乙胺(34.8微升，20毫摩尔)通过注射器加到含阿霉素的小瓶中并将内容物搅拌数分钟以确保完全溶解。将阿霉素溶液通过注射器加到活化肽中。将该溶液于室温搅拌48小时。
将产物用乙酸乙酯(2升)萃取及用10％柠檬酸水溶液(500毫升)冲洗。将乙酸乙酯层分离出，用硫酸镁干燥及在旋转蒸发器上浓缩成油。将该油在C-18反相硅胶上层析，于rf＝0.25得到橙色、长波UV萤光点。终产物表示令人满意的特征数据。
实施例2：FAPα-表达细胞系的制备
制备表达重组体FAPα的哺乳动物细胞系。将HT1080纤维瘤细胞{广为人知及由DSMZ(德国布朗史威格的微生物及细胞培养物的德国收集所)供应，寄存编号为DSMZ ACC315}保持在含10％牛胎血清的DMEM/F12 50∶50混合物中并置于95％空气及5％CO2组成的气氛中。将HT1080细胞，按照制造商的说明(Gibco/BRL)，使用脂转染试剂(Lipofectin)方法，以FAP.38载体(WO 97/34927，Scanlan等人，同上)转染。根据选择转染子以抵抗抗生素(200微克/毫升遗传霉素(Geneticin))，以及随后将其保持在含有遗传霉素的培养基中。选取抗性细胞的个别菌落，使其在10cm的组织培养皿中生长并汇合，以及如Garin-Chesa等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(18)，7235-7239所述，在免疫萤光测定中用FAPα-特异性单克隆抗体F19测试FAPα表达。亲代HT1080细胞系显示在该免疫萤光测定中没有可检测出的FAPα表达，而在下文中被称为HT1080克隆33的克隆中显示FAPα阳性。
同样地，将人类胚胎肾293细胞(广为人知且由美国组织类型收集所(马利兰州洛克斐勒市)供应)保持在含10％牛胎血清的DMEM中并在95％空气及5％CO2组成的气氛下。将细胞按照现有技术[Park，J.E.，Chen，H.H.，Winer，J.，Houck，K.A.& Ferrara，N.(1994)，胚胎生长因子，在试管中及在活体内血管内皮生长因子生物活性的强化以及与Flt-1以高亲和性结合，但不与Flk-1/KDR结合，J.Biol.Chem.269(41)，25646-25654]所述的磷酸钙转染法，用FAPα表达载体pFAP.38转染。如上述在FAPα表达一节所述，选择及分析转染子。亲代293细胞表示没有可被检测的FAPα表达。在下文中被称为293-I/2)的克隆表示FAPα阳性。
实施例3：在被转染细胞系中检测FAPα的表达
在HT1080及HT1080克隆33细胞中检测FAPα的表达。代谢性标记，免疫沉淀及萤光显影术主要按照Park et al.(1991)Somatic Cell Mol.Genet.17(2)，137-150所述进行。HT1080及HT1080克隆33细胞用35S-甲硫氨酸进行代谢性标记。这些细胞的洗涤剂萃取液用单克隆抗体F19免疫沉淀或用小鼠igG1抗体作为阴性对照组。将沉淀物在样品缓冲液中煮沸并通过十二烷基硫酸钠凝胶电泳而分离(如Laemmli(1970)Nature 227(259)，680-685所述)。生成凝胶的萤光显影术分析确证HT1080克隆33细胞产生FAPα蛋白质。在亲代HT1080细胞的萃取液中及在与小鼠IgG1的免疫沉淀物中都未检测到FAPα蛋白质。
实施例4：可溶性重组体FAPα
FAPα蛋白质的可溶性重组体形式如下述制备。将编码小鼠CD8α的细胞外区域(ECD)(由CD8α的N-端189个氨基酸组成)的cDNA(GenbankM12825)与编码FAPα的细胞外区域(胺基酸27至760)的cDNA相接，产生融合蛋白质构建FAPmCD8，其在结构上与上述的CD8α-CD40配体融合蛋白质(Lane等人(1993)J.Exp.Med.177(4)，1209-1213)相似。cDNA通过定序及插入pVL1393载体而确证。Sf9细胞的转染及所生成的重组体杆状病毒的扩增如O′Reilly(1994)在杆状病毒表达载体：实验室手册(纽约牛津大学出版社出版)中所述进行。将用重组体FAPmCD8杆状病毒感染4天的High Five细胞的培养上清液进行收集并通过超离心澄清。将FAPmCD8融合蛋白质用固定在活化琼脂糖珠粒(美国印第安那州印第安那波里市皮尔斯化学公司)上的抗-FAPα单克隆抗体，从该上清液中纯化。将培养基上清液通过抗体亲和柱及用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH3)通过pH移位进行洗脱。将该试样用饱和Tris溶液(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)立即中和并汇集含蛋白质的部分。
实施例5：阿霉素-肽共轭物的裂解的测量
样品通过反相高效液相色谱(HPLC)分离，以测量阿霉素-肽共轭物的裂解。HPLC系统由Waters 717自动取样器组成，该自动取样器上设有100微升环(loop)及二个Water 510型泵以输送溶剂。分离是在Nucleosil C-18柱上(100mm长×4mm I.D.，粒径：5微米)(Dr.Ing.H.Knauer GmbH，Berlin)，于等度洗脱(isocratic)条件下以0.7毫升/分钟的流速下进行分离。移动相由甲醇∶含0.2M乙酸铵(被调节成pH3.2)的水(70∶30，v/v)组成。游离阿霉素及阿霉素-肽共轭物通过使用Waters 474萤光检测器，以萤光(激发，475nm；放出，585nm)检测。注射，溶剂输送，数据获得及数据分析都用Millennium2010层析软件设备(Waters Corp.Milford，MA，USA)进行。首先将待测试的物质溶于二甲基亚砜并使其浓度为5mM，继而在被施加至HPLC柱中之前以水溶液稀释。
检测可溶性重组体FAPα酶使阿霉素-肽共轭物释出游离阿霉素的能力。将阿霉素-肽共轭物贮存溶液(5mM)用Hepes-缓冲食盐水(pH7.4)稀释至最终浓度为50至100μM。将20微升所得的溶液与50微升上述的纯化FAPmCD8融合蛋白质(约20微微克)及30微升Hepes-缓冲的食盐水(pH7.4)混合。让该混合物于37℃培育1天并以上述HPLC测定法测量游离阿霉素的释出。用上述软件装置定量各峰下的面积并以初值设定为100％。游离阿霉素的释出速率，在这些HPLC条件下通过具有与游离阿霉素相同的滞留时间的峰的出现而测量。各峰下的面积被用于计算游离阿霉素对于阿霉素-肽共轭物的相对量。用上述Millennium 2010层析软件装置积分峰面积，以测定裂解的百分率。如在图1所示的ZGP-Dox(N-Cbz-Gly-Pro-阿霉素)的层析图中所见，阿霉素-肽共轭物在与纯化FAPmCD8融合蛋白质一起培育后，转化成游离阿霉素，但该共轭物的滞留时间不会因与缓冲液一起培育而改变。
实施倒6：阿霉素的细胞毒性通过其与FAPα-可裂解性肽共轭而减少
在FAPα-阴性、阿霉素-敏感性细胞上，测定FAPα-可裂解性肽封阻阿霉素的细胞毒性作用的能力。将K562细胞[由American Type Tissue CultureCollection，Rockville，MD，USA供应(ATCC编号：CCL-243)]接种在96孔平皿(Greiner科学公司)中，密度为1000细胞/孔。将含有各种浓度的游离阿霉素或等摩尔浓度的阿霉素-肽共轭物但未含血清的细胞培养基加到细胞中。4天后，用自动CASYTM细胞计数器(Scharfe System GmbH，Reutlingen，Germany)测定细胞数目。结果示于图2中。
实施例7：通过细胞结合的FAPα释出游离阿霉素
检测与细胞结合的FAPα酶使阿霉素-肽共轭物释出游离阿霉素的能力。将各共轭物溶于不含血清的细胞培养基中，并使其终浓度为1μM。将10毫升该溶液加到在10cm组织培养皿内汇合成单层的HT1080细胞或HT1080克隆33细胞中，并于37℃培育19小时。将培养基除去并如实施例5所述测量阿霉素的释出。FAP-表达性细胞系HT1080克隆33，分别将81％的ZGP-Dox(N-Cbz-Gly-Pro-阿霉素)共轭物及43％的ZPAGP-Dox(N-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro-阿霉素)共轭物转化成游离阿霉素。亲代HT1080细胞系于相同条件下仅9％ZGP-Dox转化成游离阿霉素。在这些条件下极少观察到或未观察到通过亲代HT1080细胞系将ZPAGP-Dox转化成游离的阿霉素。
实施例8：通过FAPα-释放的阿霉素杀死敏感性细胞
测定FAPα产生能杀死阿霉素-敏感性细胞的游离阿霉素的能力。将K562细胞[American Type Tissue Cultare Collecion，Rockville，MD.USA(ATCC编号：CCL-243)]接种在96孔平皿(Greiner科学公司)中，密度为1000细胞/孔。将含有1μM阿霉素-肽共轭物但未含血清的细胞培养基加到含HT1080细胞或HT1080克隆33细胞的皿中，并于37℃培育19小时。将培养基移出并如实例5所述确证阿霉素的释出。然后在每孔的K562细胞内，加入66微升该培养基。4天后，用自动CASYTM细胞计数器测定细胞数目。结果示于图3中。
实施例9：阿霉素-肽共轭物的血浆稳定性
用实施例5所述的方法测量阿霉素-肽共轭物的血浆稳定性。含有阿霉素-肽共轭物的试样(浓度为1μM)在存在有10％(v/v)小鼠或人类血浆下，于37℃培育所指出的时间。ZGP-Dox和ZPAGP-Dox在小鼠及人类血浆中的稳定性结果示于图4中。
实施例10：选择性的4-甲氧基-β-萘酰胺-肽共轭物在FAPα催化下的裂解
为了鉴定优选的FAPα肽基质，用本技术已知的方法[E.Wunsch，Synthese von Petiden，in Methoden der organischen Chemie，Houben-Weyl(Eds.E.Muller，O.Bayer)，Vol.XV，Part 1 and 2，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1974]合成由天然及/或非天然氨基酸组成的寡聚物，并与脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺(Pro-MNA)偶合。
Pro-Pro-4-甲氧基-β-萘胺的合成：
将Boc-Pro(32毫克，0.15毫摩尔)，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓四氟硼酸盐(53毫克，0.15毫摩尔)及Pro-4-甲氧基-β-萘酰胺盐酸盐(46毫克，0.15毫摩尔)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺/四氢呋喃1∶1(4毫升)中。加入溶于N-甲基吡咯烷酮(1.7摩尔)的N-乙基二异丙胺(0.26毫升，0.44毫摩尔)并将该混合物于室温搅拌过夜。
溶剂用旋转蒸发器除去并将残余物溶于乙酸乙酯(10毫升)及用水萃取3次。将有机层用无水硫酸钠干燥并将溶剂用旋转蒸发器除去。将残余物溶于三氟乙酸/二氯甲烷(1∶4，25毫升)并使其反应1小时。将溶剂用旋转蒸发器除去并将生成的油用氮气流干燥。粗制产物通过制备用反相HPLC(使用乙腈/水梯度洗脱)纯化。该产物表示令人满意的分析数据(NMR及质谱)。
从肽释出游离MNA然后在Cytofluor萤光测定计(Per-Septive生物系统公司)中用355nm激发/405nm射出滤器装置测量。酶动力参数(Michaelis-Menten Km及kcat值)，是采用从实例2的293-I/2被转染细胞的膜萃取物衍生的FAPα酶，按照本技术已知的方法(例如参见Yun，S.L.& Suelter，C.H.(1977)，一种由酶反应进行曲线计算Km及V的简便方法，Biochim.Biophys.Acta 480(1)，1-13)进行计算。
表1：选择的4-甲氧基-β-萘酰胺(MNA)-肽共轭物的FAPα催化性裂解的Km及kcat值
  基质   KM     Kcat     Kcat/KM
  [μM]     [s-1]     ×104[M-1s-1]
  Chg-Pro-MNA   75     53.7     71.6
  Hyn-Pro-MNA   69     27.4     39.7
  Pro-Pro-MNA   154     49.5     32.1
  Val-Pro-MNA   95     27.7     29.2
  Met-Pro-MNA   127     27.9     22.0
  Arg-Pro-MNA   278     50.6     18.2
  反式-Hyp-Pro-MNA   254     37.9     14.9
  Gln-Pro-MNA   273     40.5     14.8
  Ala-Pro-MNA   267     35.7     13.4
  Lys-Pro-MNA   530     57.1     10.8
  Ile-Pro-MNA   43     12.6     8.8
  Met(O)-Pro-MNA   378     26.9     7.1
  Ser-Pro-MNA   872     28.3     3.3
Chg＝环己基甘氨酸，Hyn＝6-羟基正亮胺酸，反式-Hyp＝反式-4-羟基脯氨酸，Met(O)＝蛋氨酸-S-氧化物。
实施例11：MNA-偶合肽对FAPα的特异性并与DPP-IV加以比较
在已知的脯氨酰基-特异性丝氨酸寡肽酶族成员中，与FAPα最密切相关的酶为DPP-IV。由于活性DPP-IV是在血浆中及在许多不同细胞类型中发现，与DPP-IV相比药物前体肽对于FAPα选择性必须达到最佳，以使药物前体在肿瘤以外的部位(例如血浆)的不期望转变减少。为鉴别对FAPα具特异性的肽，将FAPα裂解MNA-肽共轭物的能力与DPP-IV裂解相同肽共轭物的能力进行比较。如实施例9所述测量游离MNA的释出。结果示于表2中。
表2：比较MNA-肽共轭物被FAPα裂解及被DPP-IV裂解的选择性
    裂解特异性
    FAP     DPP-IV
Ala-Pro-MNA     +     +
Z-Gly-Pro-MNA     +     -
Z-Pro-Ala-Gly-Pro-MNA     +     -
+表示酶能裂解基质
-表示缺乏裂解能力
实施倒12：在肿瘤样品中的FAPα活性
测量在人肿瘤样品中的FAPα的酶活性。将96-孔ELISA(酶-连接免疫吸着剂测定)平皿(纽约Costar，Corning公司)于4℃下，用在磷酸盐-缓冲食盐水(PBS)(pH7.4)中的F19抗体或对照抗体1微克/毫升涂布过夜。然后将孔用冲洗缓冲液(PBS，0.1％Tween 20，pH7.4)清洗以及过多的结合部位用封阻缓冲液(溶于PBS的5％牛血清白蛋白，pH7.4)在室温下封阻1小时。测量在肿瘤组织(实心符号)或配对的正常对照组织(对应空心符号)中的FAPα活性，样品来自其富含伴刀豆球蛋白的膜萃取物(图5a)。肿瘤样品包括乳腺癌(，■)，结肠癌(●)，被转移至肝的结肠癌(◆)以及肺癌(▲，＋)。将萃取物加到被F19涂布的平皿中并于室温培育1小时。将未结合的物质除去，将孔用冲洗缓冲液冲洗三次以及FAPα酶活性通过使用WO 97/34927所述的Ala-Pro-AFC 100微升于37℃培育1小时而测定。测量各萃取物的最初二个伴刀豆球蛋白A部分以及各值被各别作图。从各值减去背景萤光(用对照抗体涂布的平皿进行测量)。
在肿瘤萃取物中，FAPα酶活性的单独生化确认及其表观分子量是通过上述组织萃取物用14C-标记的氟磷酸二异丙酯(DEP；NEN-DuPont，Cologne，Germany)进行标记而得到。已知DFP与许多丝氨酸蛋白酶的活性部位丝氨酸会不可逆地共价结合，因而防止进一步的催化[Hayashi，R.，Bai，Y.& Hata，T.(1975)：羧基肽酶Y被进一步确认为一种具有反应性丝氨酸残基的不含金属的酶，J.Biochem.77(6)，1313-1318；Wahlby，S & Engstrom，L.(1968)：对灰链霉菌蛋白酶II(streptomyces griseus protease)的研究，在具有酯酶活性的DFP-敏感性成分的反应性丝氨酸残基周围的氨基酸序列，Biochim.Biophys.Acta151(2)，402-408]。从相应于图5a的结肠癌样品●的肿瘤(T)中免疫纯化所得的14C-DFP标记的FAPα示于图5b中。这些样品的十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶电泳[Laemmli，U.K.(1970)：在噬菌体T4的头部组合期间结构蛋白质的裂解，Nature 227(259)，680-685]及接下来的放射自显影术[Park，J.E.，Draper，R.K.& Brown，W.J.(1991)：在核内体酸化的条件性缺陷的End3互补基团的细胞中的溶酶体酶的生物合成，Somatic Cell Mol.Genet.17(2)，137-150]显示在结肠癌样品中存在标记的95kD蛋白质。在正常相应对照免疫沉淀物(N)中或使用对照抗体时皆未观察到放射线标记的带。如图5b所示，被免疫纯化的14C-标记蛋白质的表观分子量与先前对FAPα所报告的相符[Retting，W.J.，Su，S.L.，Fortunato，S.R.，Scanlan，M.J.，Mohan Raj，B.K.，Garin-Chesa，P.，Healey，J.H.& Old，L.J.(1994)：成纤维细胞活化蛋白质：纯化，抗原表位的定位及通过生长因子诱生，Int.J.Cancer 58(3)，385-392；WO97/34927]。
实施例13：经保护寡肽的制备
经保护寡肽或按照本技术的方法(例如M.Bodanszky and A.Bodanszky，“肽合成的实施”，2nd edition，Springer，New York，1994)在溶液中制备，或是在应用生物系统430A型自动肽合成器上通过固相合成法制备。寡肽的去保护及从树脂支持物的除去通过用三氟乙酸与经常使用的清除添加剂的混合物处理而达成。纯化是在反相C18硅胶柱上通过制备用高压液相层析而进行，其中使用0.1％三氟乙酸/乙腈水溶液梯度洗脱。肽的同一性及均匀性通过高压液相层析及质谱分析而确证。通过该法制备的寡肽示于表3中。
表3：寡肽
Z-Gly-Pro-OH
Z-Pro-Ala-Gly-Pro-OH
Fmoc-Pro-Ala-Gly-Pro-OH
Fmoc-Chg-Pro-OH
Fmoc-Nle-Pro-OH
Fmoc-Hyn-Pro-OH
Fmoc-Pro-Pro-OH
Fmoc-Ser-Ala-Hyn-Pro-OH
Fmoc-Ser-Ala-Nle-Pro-OH
Fmoc-Ser-Ala-Chg-Pro-OH
Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH
Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH
Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH
Ser-Glu-Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH
Gly-Tyr-Ser-Arg-Met-Pro-OH
Gln-Gly-Tyr-Ser-Arg-Met-Pro-OH
Gly-Gly-Gly-Trp-Pro-OH
Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH
Glu-Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH
Ser-Glu-Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH
Ala-His-Met-His-Pro-OH
Tyr-Ala-Phe-His-Pro-OH
Ser-Tyr-Ala-Phe-His-Pro-OH
Leu-Asn-Leu-Tyr-Met-Pro-OH
Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH
Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH
Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH
Z为苄基氧羰基
Fmoc为9-芴基甲氧羰基
Chg为L-环己基甘氨酰基
Nle为正亮氨酰基
Hyn为L-6-羟基正亮氨酰基
实施例14：Fmoc-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox的制备
将Fmoc-Pro-Ala-Gly-Pro-OH(44毫克，0.078毫摩尔)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(10毫升)中以及pH值通过加入N，N-二异丙基乙胺调整至7.5。加入N-羟基琥珀酰亚胺(1M，溶于DMF，78微升，0.078毫摩尔)以及将该混合物在冰浴中冷却。于搅拌下，加入二环己基碳化二亚胺(1M，溶于DMF，87微升，0.087毫摩尔)并将该溶液于0℃搅拌1小时。将阿霉素*HCl(25毫克，0.043毫摩尔)溶于20毫升无水DMF及加入N，N-二异丙基乙胺(8.2微升，0.048毫摩尔)。将该混合物用注射器加到活化肽中。让反应物温热至室温并搅拌48小时。
然后除去溶剂以及产物在C18柱上通过制备用RP-HPLC纯化，其中使用含0.1％三氟乙酸的水/乙腈梯度洗脱。
分析用HPLC＞90％；ES-MS1110.5(M+Na+)；674.4
实施例15：H-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox的制备
将Fmoc-PAGP-Dox(在实施例14中制备，44毫克，0.040毫摩尔)于0℃溶于THF/二乙胺(2∶1，20毫升)并搅拌2小时。将溶剂除去并将产物在C18柱上通过制备用RP-HPLC纯化，使用含0.1％三氟乙酸的水/乙腈梯度洗脱。
分析用HPLC＞90％；ES-MS866.6[M+H]+，452.4
实施例16：H-Chg-Pro-Dox的制备
将Fmoc-Chg-Pro-OH(46毫克，0.096毫摩尔)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(10毫升)以及pH值通过加入N，N-二异丙基乙胺调整至7.5。加入N-羟基琥珀酰亚胺(1M，溶于DMF，96微升，0.096毫摩尔)以及将该混合物在冰浴中冷却。于搅拌下，加入二环己基碳化二亚胺(1M，溶于DMF，107微升，0.107毫摩尔)并将该溶液于0℃搅拌1小时。将阿霉素*HCl(31毫克，0.053毫摩尔)溶于20毫升无水DMF并加入N，N-二异丙基乙胺(10微升，0.059毫摩尔)。将该混合物用注射器加到活化肽中。让反应物温热至室温并搅拌48小时。
然后除去溶剂以及产物在C18柱上通过制备用RP-HPLC纯化，其中使用含0.1％三氟乙酸的水/乙腈梯度洗脱。
将冻干的产物于0℃下溶于THF/二乙胺(2∶1，20毫升)并搅拌2小时。除去溶剂以及产物在C18柱上通过制备用RP-HPLC纯化，其中使用含0.1％三氟乙酸的水/乙腈梯度洗脱。
分析用HPLC＞90％；ES-MS 780.2(M+H+)；366.4
下表列出以类似方法制备的肽-阿霉素共轭物以及包括被FAP裂解的数据(20小时后)。
表4
Figure C0080753800431
R1     被FAP裂解
Z-Gly-     ＞95％
Z-Pro-Ala-Gly-     ＞95％
Fmoc-Pro-Ala-Gly-     ＞95％
H-Pro-Ala-Gly-     约11％
H-Chg-     ＞95％
H-Nle-     ＞95％
H-Hyn-     ＞95％
Z为苄基氧羰基
Fmoc为9-芴基甲氧羰基
Chg为L-环己基甘氨酰基
Nle为正亮氨酰基
Hyn为L-6-羟基正亮氨酰基
实施例17：N-Cbz-Gly-Pro-苯丙氨酸氮芥的制备
将N-Cbz-Gly-Pro-OH(22毫克，0.072毫摩尔)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(8毫升)以及pH值通过加入N，N-二异丙基乙胺调整至7.5。加入N-羟基琥珀酰亚胺(1M，溶于DMF，72微升，0.072毫摩尔)以及将该混合物在冰浴中冷却。在搅拌下，加入二环己基碳化二亚胺(1M，溶于DMF，67微升，0.67毫摩尔)并将该溶液于0℃搅拌2小时。将苯丙氨酸氮芥(14.7毫克，0.048毫摩尔)溶于30毫升无水DMF及加入N，N-二异丙基乙胺(12.3微升，0.072毫摩尔)。将该混合物用注射器加到活化肽中。让反应物温热至室温并搅拌24小时。
然后除去溶剂以及产物在C18柱上通过制备用RP-HPLC纯化，其中使用含0.1％三氟乙酸的水/乙腈梯度洗脱。
分析用HPLC＞90％；ES-MS 593.0([M+H]+)。

Claims (14)

1.一种式(I)化合物或其药物上允许的盐：
Figure C008075380002C1
其中，R1代表式Cg-A、Cg-B-A或Cg(D)m-B-A的残基，其中
Cg代表选自R5-CO、R5-O-CO-、R5-NH-CO-、R5-SO2-或R5-中的封端基，其中R5可任选地被C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、苯基、苯烷基取代；
A衍生于选自L-脯氨酸、甘氨酸、L-正亮氨酸、L-环己基甘氨酸、L-5羟基正亮氨酸、L-6-羟基正亮氨酸、L-5-羟基赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸的氨基羧酸的部分；
B和D分别选自甘氨酸(Gly)，或者D-或L-形式的丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro)、4-羟基-脯氨酸、5-羟基赖氨酸、正亮氨酸、5-羟基正亮氨酸、6-羟基正亮氨酸、鸟氨酸或环己基甘氨酸(Chg)；
Ra和Rb与处于中间的N-C基团一起形成脯氨酸或4-羟基-脯氨酸基团；
R4代表H；
-NH-Cyt′代表选自阿霉素、甲氨喋呤、三甲曲沙、普利曲西、5，10-二去氮四氢叶酸酯嘧啶甲胺、甲氧苄氨嘧啶、10-炔丙基-5，8-二去氮叶酸酯，2，4-二氨基-5-(3′，4′-二氯苯基)-6-甲基嘧啶、氨基乙哌啶酮、高莱丝来林、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、9-氨基喜树碱中的细胞毒性或细胞抑制性化合物的残基。
2.一种式IA1化合物：
Figure C008075380002C2
其中R1和Cyt′如权利要求1中所界定。
3.根据前述权利要求1的化合物，其中R1是选自式(21)、(22)和(23)的基团：
Cg-Gly               (21)
Cg-Nle               (22)
(Cg-Xaa)m-Xaa-Gly    (23)
其中Cg是选自苄酰氧羰基、苯乙酰基、苯甲磺酰基和苄氨羰基的一个封端基；
Xaa是衍生于权利要求1限定的氨基羧酸的部分，并且m是1-6的整数。
4.根据权利要求1的化合物，其中氨基羧酸部分以(L)-构型存在。
5.根据权利要求1的化合物，它选自式(IIIA)、(IIIB)、(IIIE)和(IIIF)：
Figure C008075380004C1
6.一种药物组合物，其包含权利要求1至6中任一项的化合物，以及可任选地包含一种或一种以上医药上可接受的赋形剂。
7.权利要求1至6中任一项的化合物的用途，其用于制备治疗癌症用的药物组合物。
8.权利要求1至6中任一项的化合物的制法，其特征为将式(V)化合物：
Figure C008075380004C2
与化合物HN(R4)-Cyt′反应，
式(V)中R1，Ra及Rb如权利要求1所定义，X1代表OH或适于被氨基取代的离去基团，
HN(R)4-Cyt′中的Cyt′为细胞毒性或细胞抑制性化合物的残基，并且R4如权利要求1定义。
9.权利要求1至6中任一项的化合物的制法，其特征为将式(VI)化合物与化合物H2N-Cyt′或化合物HO-Cyt′反应，其中Cyt′为细胞毒性或细胞抑制性化合物的残基，
Figure C008075380005C1
式(VI)中R1，Ra及Rb如权利要求1所定义，Y1代表L-COX2，其中L为连接子残基，并且X2代表OH或适于被氨基或羟基取代的离去基团。
10.权利要求1至6中任一项的化合物的制备方法，其特征为将式(VII)化合物与化合物X3OC-Cyt′反应，其中X3为OH或适于被氨基或羟基取代的离去基团，并且Cyt′为细胞毒性或细胞抑制性化合物的残基，
Figure C008075380005C2
式(VII)中R1，Ra及Rb如权利要求1所定义，Y2为式L-OH或L-NH2，其中L为连接子残基。
11.权利要求1至6中任一项的化合物的制造方法，其特征为将式(VIII)化合物与化合物NH(R4)-Cyt′反应，其中Cyt′为细胞毒性或细胞抑制性化合物的残基，
式(VIII)中PG1为保护基，Ra及Rb如权利要求1所定义，X1代表OH或适于被氨基取代的离去基团；
然后将保护基PG1除去并将生成的式(VIIIA)化合物：
Figure C008075380006C1
与化合物PG2-A-X4反应，其中PG2为保护基，X4代表OH或适于被氨基取代的离去基团；
以及若需要可再进行一偶合步骤，直至得到完全的化合物为止。
12.权利要求1至6中任一项的化合物的制备方法，其特征为：
将式PG3-N(R4)-L-COX3化合物与式Y4-Cyt′化合物反应，其中PG3为保护基，R4如权利要求1中所定义，L为连接子残基，X3为OH或适于被氨基或羟基取代的离去基团，Cyt′为细胞毒性或细胞抑制性化合物的残基，Y4代表H2N或HO；
然后除去保护基PG3；以及将生成的式HN(R4)-L-Y4-Cyt′化合物与式(VIII)化合物反应：
Figure C008075380006C2
然后除去保护基PG1；并将生成的下式化合物：
Figure C008075380006C3
与化合物PG4-A-X4反应，其中PG4为保护基，X4为OH或适于被氨基取代的离去基团；
以及若需要可再进行一偶合步骤，直至得到完全的分子为止。
13.式(I)化合物的制法，其特征为式PG5-N(R4)-L-Y5化合物与式X5OC-Cyt′的化合物反应，其中PG5代表保护基，Y5代表OH或NH2，R4如权利要求1中所定义，L为连接子残基，Cyt′为细胞毒性或细胞抑制性化合物的残基，X5为OH或适当的离去基团；
然后除去保护基PG5；以及将生成的式HN(R4)-L-Y5-CO-Cyt′化合物与下式(VIII)化合物反应：
Figure C008075380007C1
然后除去保护基；以及将生成的下式化合物：
与式PG2-A-X4的化合物反应，其中PG2为保护基，X4为OH或适于被氨基取代的离去基团；
以及若需要可再进行一偶合步骤，直至得到完全的分子为止。
14.一种式(VIIIA)化合物：
其中Ra，Rb，R4及Cyt′如权利要求1所定义。
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