EA005204B1 - Противоопухолевые соединения, активируемые протеином активации фибробластов (fap) - Google Patents

Abstract

В изобретении описано пролекарство, которое способно превращаться в лекарство в результате каталитического действия протеина активации фибробластов человека (FAPα), где пролекарство имеет сайт расщепления, распознаваемый FAPα, и лекарство является цитотоксическим или цитостатическим в физиологических условиях.

Description

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к лечению опухолей путем введения пролекарства, которое превращается в лекарство при попадании в опухоль. В частности, изобретение относится к пролекарствам, которые могут быть превращены в лекарства в результате каталитического действия ЕАРа, к их получению и применению в фармацевтике.

Предпосылки создания изобретения

Протеин активации фибробластов человека (ЕАРа) представляет собой молекулу, расположенную на поверхности клетки, с молекулярной массой М_г 95000, которая первоначально была идентифицирована с помощью моноклонального антитела (МАт) Е19 (Вейд и др. Ргос. N311. Асаб. Зск ИЗА 85, 3110-3114 (1988); Вейд и др. Сапсег Век. 53, 3327-3335 (1993)). кДНК ΕΑΡα кодирует интегральный мембранный протеин типа II, имеющий большой внеклеточный домен, трансмембранный сегмент и короткий цитоплазматический концевой сегмент (Зсап1ап и др. Ргос. №11. Асаб. Зск ИЗА 91, 5657-5661 (1994); АО 97/34927). Аминокислотная последовательность ЕАРа на 48% идентична аминокислотной последовательности антигена СБ26 Т-клеточной активации, также известного как дипептидилпептидаза IV (ΌΡΡΙΥ; КФ 3.4.14.5), представляющего собой связанный с мембраной протеин, обладающий дипептидилпептидазной активностью (Зсап1ап и др., в указанном месте). ЕАРа обладает ферментативной активностью и является представителем семейства серинпротеаз, для ферментативной активности которых решающее значение имеет наличие серина в положении 624 (АО 97/34927). Исследование, включающее анализ внешней поверхности мембраны, позволило установить, что димеры ЕАРа обладают способностью расщеплять дипептиды А1а-Рго-7-амино-4-трифторметилкумарин, С1 уРго-7-амино-4-трифторметилкумарин и Ьук-Рто7-амино-4-трифторметилкумарин (АО

97/34927).

ЕАРа избирательно экспрессируется в реактивных стромальных фибробластах многих гистологических типов эпителиального рака человека, грануляционной ткани заживляющихся ран и злокачественных клетках определенных типов сарком костной ткани и мягких тканей. В нормальных тканях взрослого человека обычно отсутствуют обнаруживаемые количества ЕАРа, однако, в некоторых эмбриональных мезенхимных тканях происходит кратковременная экспрессия этой молекулы. В противоположность этому большинство распространенных типов эпителиального рака, в том числе >90% типов рака молочной железы, немелкоклеточного рака легкого и колоректальных карцином содержат ЕАРа-реактивные стромальные фибробласты (Зсап1ап и др., в указанном месте). Эти ЕАРа⁺-фибробласты возникают при формиро вании новых кровеносных сосудов опухоли, образуя отдельный клеточный компартмент, расположенный между эндотелием капилляров опухоли и базальной частью кластеров злокачественных эпителиальных клеток (Ае11 и др. 1. Сйп. Опсо1. 12(6), 1193-1203 (1994)). В то время как ЕАРа⁺-стромальные фибробласты присутствуют как в первичных, так и в метастатических карциномах, исследования позволили установить, что в доброкачественных и предраковых повреждениях эпителия (Ае11 и др., в указанном месте), таких как фиброаденомы молочной железы и колоректальные аденомы, ЕАРа⁺стромальные клетки присутствуют очень редко. На основе данных, свидетельствующих об ограниченном характере распределения ЕАРа в нормальных тканях и его постоянной экспрессии в поддерживающей строме многих злокачественных опухолей были начаты клинические испытания на пациентах, страдающих метастатическими карциномами ободочной кишки, с использованием Мат Е19, меченного с помощью ¹³¹Ι (Ае11 и др., в указанном месте).

Для новых противораковых терапий, основанных на применении цитотоксических или цитостатических лекарств, основной целью является увеличение терапевтического индекса за счет повышения эффективности уничтожения канцерогенной ткани и/или уменьшения токсичности цитотоксических или цитостатических агентов в отношении нормальной ткани. Для того, чтобы повысить специфичность действия в отношении уничтожения опухолевой ткани и уменьшить токсичность в отношении нормальных тканей, могут быть созданы пусковые механизмы, сущность которых состоит в том, что токсичные агенты, синтезированные в виде их пролекарств или в неактивных формах, становятся активными только тогда и в том месте, где это требуется, прежде всего в канцерогенных тканях (Рапсйак Вюсйеш. РйагтасоР 55, 247-252 (1998)). Пусковые механизмы могут включать как экзогенные факторы, такие как свет или химические вещества, так и эндогенные клеточные факторы, такие как ферменты, экспрессия которых происходит только в раковых тканях. Другая разработанная концепция называется «терапия, основанная на применении пролекарств, с использованием фермента, направляемого антителом» (АБЕРТ) или «катализ, направляемый антителом» (АБС) (Ниепиекепк, Тгепбк Вю1есйпо1. 12, 234-239 (1994); Вадкйатее, Сйп. Рйаттасокшек 27, 368-376 (1994); Аапд и др., Сапсег Век. 52, 4484-4491 (1992); Зрегкег и др., Сйп. Рйаттасокшек 33(1), 18-31 (1997)). Согласно АБЕРТ для направленного переноса определенного фермента в область опухоли используют антитело к связанному с опухолью антигену. Присутствующий в опухоли фермент превращает введенное после этого пролекарство в активный цитотоксический агент. Конъюгат антите ло-фермент (АЕС) связывается с антигеноммишенью на клеточных мембранах или со свободным антигеном во внеклеточной жидкости (ЕСЕ). Промежуток времени между введением АЕС и пролекарства является достаточным для выведения АЕС из нормальных тканей, так что пролекарство не активируется в нормальных тканях или крови. Однако у АЭЕРТ имеются некоторые недостатки, связанные со свойствами АЕС (Вадейате, в указанном месте). Например, в организме людей лишь небольшая часть введенной дозы направляемого АЕС связывается с опухолевой тканью, тогда как остальная часть распределяется в общей воде организма, из которой она выводится с большой задержкой по времени. Даже в небольших концентрациях несвязанный фермент может катализировать достаточно большое для проявления токсических действий количество пролекарства, поскольку объемы плазмы и нормальной ЕСЕ намного больше, чем объемы ЕСЕ опухоли. АЕС может также оказаться иммуногенным, что во многих случаях препятствует его повторному введению.

В Международных заявках на патент XV О 97/12624 и XVО 97/14416 описаны олигопептиды, включая следующие пента- и гексапептиды (ЗЕр.ГО.ЫО: 151 и ЗЕр.ГО.ЫО: 177: йАгд-ТугС1п-8ег-8ег-Рго; йАгд-Туг-01п-8ег-Рго), имеющие аминокислотные последовательности, которые распознаются и протеолитически расщепляются свободным простатическим антигеном (Р8А), и терапевтические агенты, которые включают конъюгаты таких олигопептидов и известных терапевтических или цитотоксических агентов. Такие олигопептидные конъюгаты, которые содержат по крайней мере один глутамин-сериновый фрагмент, могут применяться только для лечения рака предстательной железы.

Задачей настоящего изобретения является разработка методов и средств улучшения переносимости нормальными тканями цитотоксических или цитостатических агентов, обладающих известной эффективностью в отношении широкого спектра опухолевых тканей.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к противоопухолевым соединениям, активируемым ферментами. В изобретении предложены пролекарства, обладающие способностью превращаться в лекарства в результате каталитического действия эндогенного протеина альфа активации фибробласта (ЕАРа), который, как было установлено, присутствует в раковых тканях человека. Предпочтительно пролекарство по настоящему изобретению обладает способностью превращаться в лекарство в результате каталитического действия ЕАРа, при этом пролекарство имеет сайт расщепления, распознаваемый ЕАРа, и лекарство обладает цитотоксическим или цитостатическим действием в отношении раковых клеток в физиологических условиях.

В контексте настоящего изобретения понятие «лекарство» обозначает химическое соединение, которое может вводиться людям или животным с целью лечения болезни. В частности, лекарство представляет собой агент, обладающий фармакологической активностью.

Понятие «цитотоксическое соединение» обозначает химическое соединение, которое является токсичным в отношении живых клеток, в частности лекарство, которое разрушает или убивает клетки. Понятие «цитостатическое соединение» обозначает соединение, которое подавляет рост клеток и размножение и таким образом ингибирует пролиферацию клеток. Примерами цитотоксических или цитостатических соединений, которые могут применяться согласно настоящему изобретению, являются антрациклиновые производные, такие как доксорубицин, аналоги метотрексата, такие как метотрексат, притрексим, триметрексат или ЭЭМР, мелфалан, аналоги цисплатина, такие как цисплатин, 1М216, 1М335, бис(платина) или карбоплатин, аналоги пуринов и пиримидинов, такие как цитарбин, гемцитабин, азацитидин, 6тиогуанин, флурдарабин или 2-дезоксикоформицин, и аналоги других химиотерапевтических агентов, такие как 9-аминокамптотецин, Ό,Εаминоглутетимид, триметоприм, пириметамин, митомицин С, митоксантрон, циклофосфанамид, 5-фторурацил, экстрамустин, подофиллотоксин, блеомицин или таксол.

Понятие «пролекарство» обозначает соединение, которое после введения должно подвергнуться химическому превращению в результате процессов метаболизма прежде, чем оно станет фармакологически активным. В частности, пролекарство является предшественником лекарства. В контексте настоящего изобретения пролекарство обладает существенно меньшей цитотоксической или цитостатической активностью, чем лекарство, в которое оно превращается в результате каталитического действия ЕАРа. Специалисту известны методы определения цитотоксичности соединения, см., например, пример 6 настоящего описания или у Моетапп, 1. 1ттип. Ме1й. 65, 55-63 (1983). Предпочтительно пролекарство при анализе ш уйго должно обладать по крайней мере в три раза меньшим цитотоксическим действием по сравнению с лекарством.

«Лекарство, которое обладает цитостатическим или цитотоксическим действием в физиологических условиях» обозначает химическое соединение, которое обладает цитостатическим или цитотоксическим действием в организме живого человека или животного, в частности, соединение, которое убивает клетки или ингибирует пролиферацию клеток в организме живого человека или животного.

«Пролекарство, которое имеет сайт расщепления, распознаваемый ΓΑΡα», обозначает пролекарство, которое может выступать в качестве субстрата для ферментативной активности ΓΑΡα. В частности, ферментативная активность ΓΑΡα может катализировать в физиологических условиях расщепление ковалентной связи, присутствующей в пролекарстве. В результате расщепления этой ковалентной связи пролекарство непосредственно или косвенным образом превращается в лекарство. Косвенная активация может иметь место в том случае, если продукт расщепления, образующийся на стадии, катализируемой ΓΑΡα, сам по себе не обладает фармакологической активностью, но приобретает активность после прохождения следующей стадии реакции, например гидролиза. Более предпочтительно сайт расщепления пролекарства специфически распознается ΓΑΡα, но не другими протеолитическими ферментами, присутствующими в организме человека или животного. Также предпочтительно, чтобы сайт расщепления специфически распознавался ΓΑΡα, но не протеолитическими ферментами, присутствующими в общей воде организма человека или животного, прежде всего в плазме. В наиболее предпочтительном варианте осуществления пролекарство является стабильным в плазме, других составляющих общей воды организма или тканях, в которых отсутствует или не может быть обнаружен обладающий биологической активностью ΓΑΡα. По данным анализа ίη νίΐΐΌ, который осуществляют согласно методу, изложенному в примере 7 настоящего описания, после выдерживания в течение 8 ч при 37°С в растворе, содержащем 10 об.% человеческой плазмы, предпочтительно еще присутствует более чем 50%, более предпочтительно более чем 80%, еще более предпочтительно более чем 90% пролекарства. Наиболее предпочтительно сайт расщепления должен обладать специфичностью в отношении ΓΑΡα. В предпочтительном варианте осуществления сайт расщепления содержит остаток Ь-пролина, связанный с цитотоксическим или цитостатическим лекарством с помощью амидной связи. Примером соединения, относящегося к этому классу, является конъюгат доксорубицин-пептид. ΓΑΡα может катализировать расщепление пептидной связи между остатком С-концевой аминокислоты пептида, предпочтительно представляющей собой Ьпролин, и цитотоксическим или цитостатическим соединением.

Для предпочтительных соединений степень превращения в свободное лекарство составляет по меньшей мере 10% в указанных ниже стандартных условиях. Для более предпочтительных соединений степень превращения в свободное лекарство в стандартных условиях составляет по меньшей мере 20%. Для еще более предпочтительных соединений степень пре вращения в свободное лекарство в стандартных условиях составляет по меньшей мере 50%. В контексте настоящего описания стандартные условия определяются следующим образом: каждое соединение растворяют в 50мМ Нерезбуфера, 150мМ КаС1, рН 7,2, в конечной концентрации 5мкМ и инкубируют с 100 нг С^8ΓΑΡα (см. пример 4) в течение 24 ч при 37°С. Высвобождение свободного лекарства под действием С^8ΓΑΡα определяют согласно методу, описанному в примере 5.

Предпочтительно настоящее изобретение относится к соединению формулы (I)

или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ обозначает аминоалканоил, олигопептидоил, прежде всего ди- или трипептидоильную группу, Ν-концевая аминофункция которой может быть присоединена к блокирующей группе;

К^а и К^ь вместе с промежуточной Ν-Сгруппой образуют необязательное замещенное, необязательно сконденсированное с бензо- или циклогексаногруппой 3-7-членное насыщенное или ненасыщенное гетероциклическое кольцо, в котором одна или две СН₂-группы также могут быть замещены ΝΗ, О или 8,

К⁴ обозначает Н, С₁-С₆алкил, С₃-С₈циклоалкил, арил или гетероарил; и

Су1' обозначает фрагмент цитотоксического или цитостатического соединения, при условии, что исключаются

N2-ацетил-^-гомоаргинил-^-тирозил-^глутаминил-Ь-серил-Ы-[2,3,6-тридезокси-1-О[(18,38)-1,2,3,4,6,11-гексагидро-3,5,12-тригидрокси-3-(гидроксиацетил)-10-метокси-6,11-диоксо-1 -нафтаценил ]-α-^-ликсогексопираноз-3ил]-Ь-пролинамид и

N2-ацетил-^-гомоаргинил-^-тирозил-^глутаминил-й-серил-й-серил-+-[2,3,6-тридезокси-1 -О-[(18,3 8)-1,2,3,4,6,11 -гексагидро-3,5,12тригидрокси-3 -(гидроксиацетил)-10-метокси6,11 -диоксо-1-нафтаценил]-α-^-ликсогексопираноз-3-ил]-Ь-пролинамид.

Особенно предпочтительными являются соединения формулы I, в которых К¹ обозначает фрагмент формулы Сд-Α, Сд-Β-Α или Сд-(Э)_тВ-А, где

Сд обозначает атом водорода или блокирующую группу, выбранную из ряда, включающего К⁵-СО, К⁵-О-СО-, Κ^ΝΗ-СО, К⁵-8О2или К⁵ -, где К⁵ обозначает необязательно замещенную С1-С6алкильную, С₃-С₈циклоалкильную, арильную, аралкильную или гетероарильную группу;

предпочтительно Сд обозначает ацетил, бензоил, Ό-аланил, (К)-Н^СН(СН₃)- или

Н₂НСОСН₂СН2-заместитель или другую блокирующую группу для защиты Ν-концевой аминофункции;

А, В и Ό, каждый независимо друг от друга, обозначает фрагменты, являющиеся производными аминокарбоновых кислот формулы -[ΝΚ⁶-(Χ)ρ-ΟΘ]-, где X обозначает СК⁷К⁸ и где К⁶, К⁷ и К⁸, каждый независимо друг от друга, обозначает атом водорода, необязательно замещенный С1-С₆алкильной, С₃-С₈циклоалкильной, арильной или гетероарильной группой, и р обозначает 1, 2, 3, 4, 5; или А, В и Ό, каждый независимо друг от друга, обозначает фрагменты, являющиеся производными циклических аминокарбоновых кислот формулы

где К⁹ обозначает С₁-С₆алкил, ОН или ΝΗ₂, т обозначает целое число от 1 до 10;

ς обозначает 0, 1 или 2 и г обозначает 0, 1 или 2.

Кроме того, предпочтительными являются соединения формулы I, в которых К⁶, К⁷ и К⁸, каждый независимо друг от друга, обозначает атом водорода или СН3-, СН3СН2-, СН3СН2СН2-, (СН3)2СН-, СН3СН2СН2СН2-, (СН3)2СНСН2-, СН3СН2СН(СН3)-, (СН3)3С-, НОСН2-, СН3СН(ОН)-, СН3СН(ОН)СН2СН2-, НОСН2СН2СН2СН2-,

ЩЛСН₂СН₂СН₂-, ЩЛСН₂СН₂СН₂СН₂-, ЩЛСН₂ СН(ОН)СН2СН2-, ^N^=N^N№^^2^2-,

Н8СН₂-, СН₃8СН₂СН₂-, НООССН₂-, НООССН₂СН₂-, НЖ(=О)СН2-, НЖ(=О)СН2СН2-, бензил, парагидроксибензил,

циклогексил, фенил, р обозначает 1, и где конфигурация СК⁷К⁸ может представлять собой К- или 8-конфигурацию; причем, если К⁷ не обозначает Н, то К⁸ предпочтительно обозначает Н; К⁶ предпочтительно обозначает Н; если р больше 1, К⁷ и К⁸ предпочтительно обозначают Н.

Другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения являются соединения формулы I, где гетероциклическое кольцо, образованное К^а, К^ь и промежуточной Ν-Сгруппой, замещено К² и К³, где К² и К³, каждый независимо друг от друга, обозначает атом водорода или атом галогена или С₁-С₆алкил, С₁-С₆ алкиламино, диС₁-С₆алкиламино, С₁-С₆алкокси, тиол, С₁-С₆алкилтио, оксо, имино, формил, С₁С6алкоксикарбонил, аминокарбонил, С3-С8циклоалкил, арил или гетероарил.

Если не указано иное, отдельные стереоизомеры, а также смеси или рацематы стереоизомеров подпадают под объем изобретения.

«С₁-С₆алкил» обычно представляет собой углеводородный радикал с прямой или разветвленной цепью, содержащий 1-6 атомов углерода.

Понятие «необязательно замещенный», употребляемое выше и ниже в настоящем описании по отношению к группе или фрагменту, обозначает группу или фрагмент, которые могут быть необязательно замещены одним или несколькими атомами галогена, гидроксилом, амино-, С₁-С₆алкиламино-, диС₁-С₆алкиламино-, С₁-С₆алкилоксигруппой, тиолом, С₁-С₆алкилтиогруппой, =О, =ПН, -СНО, -СООН, -СОЫН2, -ЛНС(=КН)ПН₂, С₃-С₈циклоалкилом, арилом или гетероарилом, при этом указанные заместители могут быть одинаковыми или различными.

В качестве примеров могут служить следующие радикалы: метил, этил, пропил, 1метилэтил (изопропил), бутил, 1-метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, н-пентил, 1метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, 1,1диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, гексил, 1-метилпентил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил,

1,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 3,3-диметилбутил, 1-этилбутил, 2этилбутил, 1,1,2-триметипропил, 1,2,2-триметилпропил, 1-этил-1-метилпропил и 1-этил-2метилпропил, НОСН2-, СН3СН(ОН)-,

СН3СН(ОН)СН2СН2-, НОСН2СН2СН2СН2-,

Н2ЖН2СН2СН2-, Н2ЖН2СН2СН2СН2-, Н2ЖН2 СН(ОН)СН₂СН₂-, Н^С(=ПН)КНСН₂СН₂СН₂-, Н8СН2-, СН38СН2СН2-, НООССН2-,

НООССН2СН2-, НЖ(=О)СН2-, НЖ(=О) СН₂СН₂-, бензил, парагидроксибензил,

Если С₁-С₆алкильная группа является замещенной, то заместителями предпочтительно являются гидроксил, амино, диметиламино, диэтиламино, тиол, метилтиол, метокси, этокси, =О, =ЫН, -СНО, -СООН, -СООСН3,

-СООСН₂СН₃, -СОПН₂, -ПНС(=КН)ПН₂, циклогексил, фенил, бензил, парагидроксибензил,

Если С₁-С₆алкил замещен арилом или гетероарилом, то С₁-С₆алкил предпочтительно представляет собой С1, более предпочтительно метиленовую группу.

Понятия «аминоалканоил» или «олигопептидоил», включая «ди- или трипептидоил», ис пользуемое выше и ниже в настоящем описании по отношению к радикалу К¹, обозначают радикал, в котором аминокислота или олигомер, содержащий до 12, предпочтительно 2 или 3 аминокислотных фрагмента, присоединен с помощью амидной связи С-концом к атому азота гетероциклического кольца.

Специалисту в области химии аминокислот и олигопептидов должно быть очевидно, что определенные аминокислоты могут быть заменены другими гомологичными, изостерическими и/или изоэлектронными аминокислотами, при этом биологическая активность исходной аминокислоты или олигопептида сохраняется после такой модификации. Для замены соответствующих аминокислот, встречающихся в естественных условиях, могут применяться определенные не встречающиеся в естественных условиях и модифицированные встречающиеся в естественных условиях аминокислоты. Так, например, тирозин может быть заменен 3йодтирозином, 2- или 3-метилтирозином, 3фтортирозином.

Понятие «блокирующая группа», используемое выше или ниже в настоящем описании применительно к группе, присоединенной к Νконцевому атому азота аминоалканоильной или олигопептидоильной группы радикала К¹, обозначает группу или фрагмент, который уменьшает или устраняет ферментативное расщепление соединений по настоящему изобретению под действием аминопептидаз, присутствующих в плазме крови теплокровных животных. Пригодные блокирующие группы включают С₁С₁₀алканоил, С₆-С₁₈арил-С₁-С₁₀алканоил, С₆-С₁₈ арил-С₁-С₁₀алкилсульфонил. Такие блокирующие группы также включают гидрофильные блокирующие группы, которые выбирают при наличии гидрофильных функциональных групп. Такие блокирующие группы увеличивают гидрофильность соединений по настоящему изобретению и таким образом повышают их растворимость в водных средах. Такие повышающие гидрофильность блокирующие группы предпочтительно выбирают из ряда, включающего гидроксилированный алканол, полигидроксилированный алканоил, гидроксилированный ароил, гидроксилированный арил-алканоил, полигидроксилированный ароил, полигидроксилированный арилалканоил, полиэтиленгликоль, гликозилаты, сахара и простые краунэфиры.

«С₃-С₈циклоалкил» обычно представляет собой циклический углеводородный радикал, содержащий 3-8 атомов углерода, который необязательно может быть замещен одним или несколькими заместителями, выбранными из ряда, включающего гидроксил, амино, С1С6алкиламино, диС1-С6алкиламино, С1-С6алкил, С₁-С₆алкокси, тиол, С₁-С₆алкилтио, =О, =ΝΗ, -СНО, -СООН, -СООСН₃, -СООСН2СН₃, -ί.ΌΝΗ₂. -ΝΗί.’(=ΝΗ)ΝΗ₂ или галоген, при этом указанные заместители могут быть одинаковыми или различными.

Понятие «гетероциклическое кольцо», используемое выше и ниже в настоящем описании применительно к группе, образованной К^а и К^ь в сочетании с промежуточной Ν-С-группой, обычно обозначает 3-7-членную, предпочтительно 4-, 5- или 6-членную неароматическую гетероциклическую кольцевую систему, содержащую один атом азота и необязательно 1 или 2 дополнительных гетероатома, выбранных из группы, включающей азот, кислород и серу, которая может быть замещена одним или несколькими атомами галогена или С₁-С₆алкилом, С₁-С₆алкиламино-, диС₁-С₆алкиламино-, С₁-С₆ алкоксигруппой, тиолом, С₁-С₆алкилтио-, оксо-, иминогруппой, формилом, С₁-С₆алкоксикарбонилом, аминокарбонилом, С3-С8циклоалкилом, арилом или гетероарилом, при этом указанные заместители могут быть одинаковыми или различными, и которая необязательно может быть сконденсирована с бензо- или циклогексаногруппой. Такие гетероциклические кольца предпочтительно представляют собой азетидин или производные полностью или частично гидрогенизированного пиррола, пиридина, тиазола, изоксазола, пиразола, имидазола, индола, бензимидазола, индазола, пиридазина, пиримидина, пиразина. Наиболее предпочтительными являются азетидин, пирролидин, 3,4дегидропирролидин, пиперидин, гексагидро-1Назепин, октагидроиндол, имидазолидин, тиазолидин.

Если такое гетероциклическое кольцо является замещенным, то заместители предпочтительно представляют собой метил, этил, пропил, 1-метилэтил (изопропил), бутил, 1-метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, гидроксил, амино, диметиламино, диэтиламино, тиол, метилтиол, метокси, этокси, -СНО,

-СООН, -СООСН₃, -СООСН₂СН₃ или -ί.ΌΝΗ₂.

«Арил» обычно представляет собой ароматическую кольцевую систему, содержащую 610, предпочтительно 6 атомов углерода, которая необязательно может быть замещена одним или несколькими заместителями, выбранными из ряда, включающего гидроксил, амино, С₁-С₆алкиламино, диС₁-С₆алкиламино, С₁-С₆алкил, С₁С₆алкокси, тиол, С₁-С₆алкилтио, -СНО, -СООН, -СООСН₃, -СООСН₂СН₃, -ί.ΌΝΗ_; или галоген, при этом указанные заместители могут быть одинаковыми или различными, и которая необязательно может быть сконденсирована с бензогруппой. Заместители для арила предпочтительно могут быть выбраны из производных бензола, предпочтительными примерами являются фенил, 2-гидроксифенил, 3-гидроксифенил, 4гидроксифенил, 4-аминофенил, 2-аминофенил, 3-аминофенил.

Если арил является замещенным, то заместителями предпочтительно являются метил, этил, пропил, 1-метилэтил (изопропил), бутил,

1-метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, гидроксил, амино, диметиламино, диэтиламино, тиол, метилтиол, метокси, этокси, -СНО, -СООН, -СООСНз, -СООСН2СН3 или -ΟΟΝΗ2.

«Гетероарил» обычно представляет собой 5-10-членную ароматическую гетероциклическую кольцевую систему, содержащую 1-5 гетероатомов, выбранных из азота, кислорода или серы, которая необязательно может быть замещена одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, включающей гидроксил, амино, С₁-С₆алкиламино, диС₁-С₆алкиламино, С₁-С₆алкил, С₁-С₆алкилокси, тиол, С₁-С₆алкилтио, -СНО, -СООН, -СООСН₃, -СООСН₂СН₃, -СОМ 1₂ или галоген, при этом указанные заместители могут быть одинаковыми или различными, и которая необязательно может быть сконденсирована с бензогруппой. Заместители для гетероарила предпочтительно могут являться производными фурана, пиррола, тиофена, пиридина, тиазола, изоксазола, пиразола, имидазола, бензофурана, тианафтена, индола, бензимидазола, индазола, хинолина, пиридазина, пиримидина, пиразина, хиназолина, пирана, пурина, аденина, гуанина, тимина, цитозина, урацила.

Если гетероарил является замещенным, то заместители предпочтительно представляют собой метил, этил, пропил, 1-метилэтил (изопропил), бутил, 1-метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, гидроксил, амино, диметиламино, диэтиламино, тиол, метилтиол, метокси, этокси, -СНО, -СООН, -СООСН3, -СООСН2СН3 или -СОМН₂.

«Фрагмент цитотоксического или цитостатического соединения» обозначает, что соединение ΗΝ-Су!', которое высвобождается после расщепления амидной связи, присутствующей в формуле (I), либо само является цитотоксическим или цитостатическим, либо может быть превращено в цитотоксическое или цитостатическое соединение на следующей стадии.

В последнем случае -Су!' может представлять собой фрагмент формулы Ф-СуГ, где к обозначает связующий фрагмент, полученный из бифункциональной молекулы, например диамина Η₂ΝΦ'-ΝΗ₂, аминоспирта 1 кМк'-О11, например парааминобензилового спирта (РАВОН), аминокарбоната, например

ОН или не встречающейся в естественных условиях аминокарбоновой кислоты. Если -Су!' является фрагментом формулы -Ь-Су!, то соединение ΗΝΦ'-Су! получают путем ферментативного расщепления амидной связи, присутствующей в формуле (I). Соединение Η₂Ν-ΕСу! может быть цитотоксическим или цитостатическим само по себе или связующий фрагмент отщепляют от Су!'' на следующей стадии, высвобождая цитотоксический или цитостатический агент. Например, соединение ΗΝ-Ε-Су! может быть гидролизовано в физиологических условиях с получением соединения Η₂ΝΦ'-ΟΗ и цитотоксического или цитостатического соединения Η-Су!, представляющего собой агент, обладающий терапевтической активностью (в дальнейшем для простоты как для Су!', так и для Су! используется только одно обозначение Су!, и только одно обозначение к используется как для ^, так и для ^').

Фармацевтически приемлемые соли соединений по настоящему изобретению включают обычные нетоксичные соли, образованные с нетоксичными неорганическими или органическими кислотами. Например, такие обычные нетоксичные соли включают соли неорганических кислот, таких как соляная, бромистоводородная, серная, сульфаминовая, фосфорная, азотная кислота и т.п.; и соли, полученные из органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, стеариновая, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, малеиновая, фенилуксусная, глутаминовая, бензойная, салициловая, сульфаниловая, щавелевая, трифторуксусная кислота и т.п.

Предпочтительными соединениями формулы I являются соединения формулы ΙΑ

где В², В³, В⁴, Су!' имеют указанные выше значения, В¹ обозначает аминоалканоильную или олигопептидоильную группу и Х-Υ обозначает ΟΗΒ²-ΟΗ2, СВ²=ОТ, ΝΗ-С^ ΟΗζ-ΝΗ, -СВ²-, СΗ2-СΗВ²-СΗ2; при условии, что когда Х-Υ обозначает группу СН₂-СН₂, то В¹ обозначает аминоалканоильную, ди- или трипептидоильную группу или В¹ обозначает олигопептидоил, имеющий более трех аминокислотных фрагментов, которые не содержат аминокислотную последовательность С1п-8ег.

Предпочтительно атом углерода в αположении циклического фрагмента аминокислоты является рацемическим, т.е. находится в (В/8)-конфигурации, наиболее предпочтительно в (8)-конфигурации; в наиболее предпочтительном варианте осуществления атом углерода в αположении находится в (8)-конфигурации и В² обозначает Н. В том случае, когда В обозначает ОН, он предпочтительно находится в трансориентации.

В², В³ предпочтительно обозначают атом водорода или метил, этил, пропил, изопропил, фенил, метокси-, этокси- или гидроксигруппу, наиболее предпочтительно атом водорода. В⁴ предпочтительно обозначает атом водорода или метил, этил, пропил, изопропил или фенил, наиболее предпочтительно атом водорода.

Наиболее предпочтительными являются соединения формулы ΙΑ, выбранные из соединений формул ΙΑ1, ΙΑ2, ΙΑ3, ΙΑ4 и ΙΑ5

(ΙΑ1) (ΙΑ2) (ΙΑ3) (ΙΑ4) (ΙΑ5) обозначает анН₂Ы-Су1' предпочтительно трациклиновое производное формулы ΙΙ о он о

где К^с обозначает С₁-С₆алкил, С₁-С₆гидроксиалкил или С₁-С₆алканоилокси-С₁-С₆алкил, в частности метил, гидроксиметил, диэтоксиацетоксиметил или бутирилоксиметил;

Ρ^ά обозначает водород, гидрокси или С₁-С₆ алкокси, в частности метокси;

один из радикалов Р^е и И¹' обозначает атом водорода, а другой обозначает атом водорода или гидрокси- или тетрагидропиран-2-илокси(ОТНР)- группу.

Наиболее предпочтительными являются следующие . соединения формулы ΙΙ:

кс		ке	к!	Су!
СН2ОН	ОСН3	Н	ОН	доксорубицин
СН3	ОСН3	Н	ОН	даунорубицин
СН2ОН	ОСН3	ОН	Н	эпирубицин
СН3	Н	Н	ОН	идарубицин
СН2ОН	ОСН3	Н	ОТНР	ТНР
СН2ОН	ОСН3	Н	Н	эзорубицин
СН2ОСОСН (ОС2Н3)2	ОСН3	Н	ОН	деторубицин
СН2ОН	Н	Н	ОН	карминоруби цин
СН2ОСОС4Н9	ОСН3	Н	ОН

Наиболее предпочтительным является доксорубицин (ϋοχ). Другие цитотоксические или цитостатические фрагменты Су!' могут быть получены, например, на основе метотрексата, триметрексата, пиритрексима, 5,10-дидеазатетрагидрофолатпириметамина, триметоприма, 10-пропаргил-5,8-дидеазафолат-2,4-диамино-5(3',4'-дихлорофенил)-6-метилпиримидина, аминоглутетимида, горесерелина, мелфалана, хлорамбуцила, аналогов других химиотерапевтических агентов, таких как 9-аминокамтотецин (см., например, Вигпз Н. Α, г. ά. и 8. М. Р1е1бз, Торо1зотегазе ПпЫЬйогз. Αη отетем о! !Ье сатр!о!йес1п апа1одз [обзор], Нета!о1. Опсо1 С1т. Ыог!й Лт. 8(2): 333-355 (1994); Туег, Ь. и М. I. Ка!ат, СНшса1 рйагтасо1о§у о! сатр!о!йестз [обзор] [ 137 ссылок], Сапсег СЬетоФег. РЬагтасо1. 42 приложение: 831-843 (1998)).

В формуле (Ι), Су!' может также обозначать биологическую эффекторную молекулу, которая прямо или косвенно оказывает разрушающее воздействие на опухолевые клетки типа, например, ΤΝΡα.

Предпочтительными примерами аминокарбоновых кислот, на основе которых могут быть получены фрагменты А, В и I), являются глицин (О1у), или Ώ- или более предпочтительно Ь-формы аланина (А1а), валин (Уа1), лейцин (Ьеи), изолейцин (Не), фенилаланин (РЬе), тирозин (Туг), триптофан (Тгр), цистеин (Суз), метионин (Ме!), серии (8ег), треонин (ТЬг), лизин (Ьуз), аргинин (Дгц), гистидин (Н1з), аспарагиновая кислота ^зр), глутаминовая кислота (О1и), аспарагин (Α3η), глутамин (О1п), пролин (Рго), транс-4-гидроксипролин (Нур), 5-гидроксилизин (Ну1), норлейцин (Ме), 5-гидроксинорлейцин, 6-гидроксинорлейцин (Нуп), орнитин (Огп), циклогексилглицин (СЬд), фенилглицин (РЬд), глутамин (О1п), циклогексилаланин (СЬа), метионин-8-оксид (Ме!), β-циклопропилаланин (Сра), трет-лейцин (Т1е) или гомосерин (Нзе).

Предпочтительными соединениями являются соединения общей формулы (Ι), где фрагмент А получен на основе аланина, валина (Уа1), лейцина (Ьеи), изолейцина (Не), фенилаланина (РЬе), тирозина (Туг), триптофана (Тгр), цистеина (Суз), метионина (Ме!), серина (8ег), треонина (ТЬг), лизина (Ьуз), аргинина (Дгц), гистидина (Н1з), аспарагиновой кислоты ^зр), глутаминовой кислоты (О1и), аспарагина ^зп), глутамина (О1п), пролина (Рго), транс-4гидроксипролина (Нур), 5-гидроксилизина (Ну1), норлейцина (Ме), 5-гидроксинорлейцина, 6-гидроксинорлейцина (Нуп), орнитина (Огп) или циклогексилглицина (СЬд), фенилглицина (РЬд), глутамина (От), циклогексилаланина (СЬа), метионин-8-оксида (Ме!(О)), β-циклопропилаланина (β-Сра), трет-лейцина (Т1е) или гомосерина (Нзе).

Наиболее предпочтительными являются соединения формулы (I), где В¹ представляет собой группу, выбранную из формул (1) - (34):

Н-Сйд	(1)	Н-Т1е	(18)
Н-Ьук	(2)	Н-Ну1	(19)
Н-Ы1е	(3)	Н-Нке	(20)
Н-А1а	(4)	Сд-61у	(21)
Н-Нуп	(5)	Сд-Ы1е	(22)
Н-Рго	(6)	Сд-Уа1	(23)
Н-Рйд	(7)	Сд-Ме!	(24)
Н-С1п	(8)	Н-Ххх-Ьук	(25)
Н-транс-Нур	(9)	Н-Ххх-Нуп	(26)
Н-Уа1	(10)	Н-Ххх-Рго	(27)
Н-Сйа	(11)	Н-Ххх-Н18	(28)
Н-Ме!	(12)	Н-Ххх-Ме!	(29)
Н-Ыуа	(13)	Н-Ххх-А1а	(30)
Н-Ме!(О)	(14)	Сд-Ххх-Нуп (31)
Н-р-Сра	(15)	Сд-Ххх-А1а-61у (32)
Н-Пе	(16)	Сд-(Ххх)т-Ххх-А1а-61у (33)
Н-8ет	(17)	Сд-(Хаа)т-Хаа-61у (34)

где Сд обозначает атом водорода или блокирующую группу, выбранную из бензоилоксикарбонила, фенилацетила, фенилметилсульфонила и бензиламинокарбонила; Хаа обозначает фрагмент, полученный из аминокарбоновой кислоты, предпочтительно выбранной из группы встречающихся в естественных условиях аминокислот, прежде всего из группы, включающей А1а, Рго, Туг, Р11С. Н18, 8ет, ТНг, Нур и Ьук; и т обозначает целое число от 1 до 6.

Предпочтительными блокирующими группами Сд являются ацетил (Ас), сукцинимидил (8ис), Ό-аланил, бензилоксикарбонил (СЬх или Ζ) или макромолекулы, такие как полиэтиленгликоль.

Предпочтительными антрациклиновыми пролекарствами являются соединения формулы III о ОН о

где В^а, В^ь, В^с, В^а, В^е, В^г и В¹ имеют указанные выше значения.

Наиболее предпочтительными соединениями по изобретению являются производные доксорубицина формул (III А) - (ШР):

о он о

ОМе О ОН О

О

формулы (I) включает два или более атомов серы, то соединение по изобретению может содержать одну или более дисульфидных связей.

Один из классов цитотоксических или цитостатических соединений, которые могут применяться согласно настоящему изобретению, содержит первичную аминофункцию, которая может образовывать амидную связь, показанную на структурной формуле (I), например доксорубицин. В этом случае наличие связующей молекулы Ь не является обязательным. Если цитотостатическое или цитотоксическое соединение не содержит такую аминофункцию, то такая функция может быть введена в это соединение посредством химической модификации, например, путем введения или преобразования функциональной группы или присоединения к соединению связующей молекулы. Связующая молекула может быть также встроена между олигомерным фрагментом (т.е. фрагментом, содержащим остатки аминокарбоновых кислот) и цитостатическим или цитотоксическим фрагментом соединения по изобретению для того, чтобы обеспечить или оптимизировать расщепление амидной связи между олигомерным фрагментом и цитотоксическим или цитостатическим фрагментом. Если присутствует связующая молекула, например, в соединениях, включающих структуру б-СуС то связь между Ь и Су4' предпочтительно представляет собой амидную или сложноэфирную связь. В предпочтительном варианте осуществления в физиологических условиях после ферментативного расщепления такая связующая молекула подвергается гидролизу с отщеплением цитостатического или цитотоксического соединения, в результате чего образуется цитостатическое или цитотоксическое соединение. В любом случае соединение по изобретению должно обладать способностью расщепляться в условиях каталитического действия ΕΑΡα и в результате непосредственного или косвенного воздействия такого расщепления высвобождать в физиологических условиях цитостатическое или цитотоксическое соединение. Еще одним объектом настоящего изобретения является пролекарство, которое может превращаться в лекарство в результате каталитического действия ΕΑΡα, при этом пролекарство имеет сайт расщепления, распознаваемый ΕΆΡα, и пролекарство является цитотоксическим или цитостатическим в физиологических условиях. Такое пролекарство предпочтительно содержит олигомерный фрагмент, включающий два или более аминокарбоновых остатков и цитотоксический или цитостатический фрагмент, где С-концевой аминокарбоновый остаток олигомерного фрагмента представляет собой встречающуюся в естественных условиях или синтетическую 3-7-членную циклическую аминокислоту, предпочтительно Όили Ь-пролин или Ό- или Ь-гидроксипролин, а С-концевая карбоксифункция связана с цитотоксическим или цитостатическим фрагментом посредством амидной связи, которая может быть расщеплена в результате каталитического действия ΕΆΡα. Олигомерный фрагмент предпочтительно представляет собой пептид. Предпочтительно олигомерный фрагмент содержит два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать остатков аминокарбоновой кислоты, более предпочтительно два, три или четыре остатка аминокарбоновой кислоты. Предпочтительно Νконцевую аминофункцию защищают с помощью блокирующей группы.

Соединения по изобретению могут быть синтезированы методами, известными в данной области (см. у Е. ^ииксб, 8уп111С5С νοη Рерббеи, в Мебюбеп бет отдаищсбеи Сбеш1е, НоиЬеи\Уеу1 (под редакцией Е. Ми11ег, О. Вауег), том XV, части 1 и 2, издательство Оеотд ТЫеше, Штуттгарт, 1974). Например, соединения могут быть синтезированы методом блочного синтеза путем конденсации концевой карбоксифункции олигомерного фрагмента, где X может обозначать ОН или активирующую уходящую группу, с аминогруппой цитотоксической или цитостатической молекулы НЧ-СуС приводя к образованию амида.

Если между олигомерным фрагментом и цитотоксическим или цитостатическим агентом должен присутствовать связующий фрагмент (Ь), то блочный синтез может быть осуществлен таким же образом.

Если цитотоксический или цитостатический фрагмент содержит карбоксифункцию, необходимую для присоединения к олигомерному фрагменту, то связующая молекула может представлять собой имин или аминоспирт и блочный синтез таких соединений может быть осуществлен аналогичным образом путем взаимодействия активированного фрагмента ХОССу1' либо с гидрокси-, либо с аминогруппой.

Если цитотоксический или цитостатический реагент содержит гидроксильную функцию, которая может применяться для сочетания с олигомерным фрагментом, то связующий остаток может представлять собой аминокарбоновую кислоту и блочный синтез может быть проведен аналогичным образом.

При необходимости с помощью соответствующих защитных групп в радикалах Су!', Ь, гидроксипролин, А, В и Ό могут быть защищены другие функциональные группы, которые не должны вступать в реакцию в процессе образования молекул-мишеней. Пригодные защитные группы широко известны в данной области (Р.С.М. \νιιΐ5. Рто!ее!1уе дтоирк ίη отдаше §уи111С515. ίοΐιη νί1ο\· аиб 8ои5 1ие., №\ν Уогк, 1991). Эти защитные группы удаляют после завершения синтеза.

С целью иллюстрации можно отметить, что пригодные аминозащитные группы могут включать, например, С₁-С₁₀алканоильные группы, такие как формил, ацетилдихлорацетил, пропионил, 3,3-диэтилгексаноил и т.п., С₁-С₁₀ алкоксикарбонил и С₆-С₁₇аралкилоксикарбонил, например трет-бутоксикарбонил, бензилоксикарбонил (ВОС), флуоренилметоксикарбонил и т.п. Наиболее предпочтительным является флуоренилметоксикарбонил (РМОС).

Пригодные карбоксизащитные группы могут включать, например, С1-С10алкильные группы, такие как метил, трет-бутил, децил; С₆С₁₇аралкил, такой как бензил, 4-метоксибензил, дифенилметил, трифенилметил, флуоренил; три(С1-С10алкил)силил или (С1-С10алкил)диарилсилил, такой как триметилсилил, диметилтрет-бутилсилил, дифенил-трет-бутилсилил и родственные группы.

Для образования такого сложного эфира или амида может оказаться необходимым активировать карбонильную группу карбоновой кислоты для нуклеофильного взаимодействия с амином или спиртом, т.е. X должен представлять собой активирующую группу или уходящую группу, которая может быть замещена аминогруппой. Такая активация может быть осуществлена путем превращения карбоновой кислоты в хлорангидрид или фторангидрид или путем превращения карбоновой кислоты в активированный эфир, например, Νгидроксисукцинимидиловый эфир или пентафторфениловый эфир. Другой метод активации представляет собой трансформацию в симметричный или несимметричный ангидрид. В альтернативном варианте образование амидных или эфирных связей может быть достигнуто путем использования ίη 81!и реагентов для реакции сочетания, таких как гексафторфосфат бензотриазол-1-илокситриспирролидинфосфония (РуВОР) (Е. Егего! и др., Те!тайебтои, 47, 259270, 1991), 1,1'-карбонилдиимидазол (СЭ1) (К. Акар и др., ТНЬ, 35, 3315-3318, 1994), тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3тетраметилурония (ТВТИ) (В. Киогг и др., ТНЬ, 30, 1927-1930, 1989), 1-(мезитилен-2-сульфонил)-3-нитро-1Н-1,2,4-триазол (М8ЭТ) (В. В1аηкеηтеуе^-Меиде и др., ТНЬ, 31, 1701-1704, 1990).

В качестве альтернативы методу блочного синтеза создание молекул общей формулы (I) может быть осуществлено постадийно в направлении справа налево путем последовательных реакций конденсации соответствующих мономеров Су!', Ь, циклической аминогруппы, образованной В^а, В^Ь и промежуточной Ν-С-группой, прежде всего пролина или гидроксипролина, А, В и Ό. Для осуществления реакции конденсации могут быть использованы те же методы сочетания, которые указаны выше. Поскольку элементы Ь, пролин/гидроксипролин, А, В и Ό представляют собой по меньшей мере бифункциональные молекулы, содержащие амино- и (по меньшей мере фрагменты А, В, Ό и циклическая аминогруппа, образованная Ва, ВЬ промежуточной Ν-С-группой, прежде всего пролин/гидроксипролин) карбоксигруппу, то аминогруппа должна быть блокирована защитной группой (РС) перед активацией карбоксильной функции. Для защиты аминогрупп могут использоваться группа ВОС или предпочтительно группа ЕМОС. После осуществления реакции сочетания аминозащитная группа должна быть удалена и может быть осуществлено сочетание со следующим фрагментом, защищенным группой Етое- или Вое. При необходимости с помощью пригодных защитных групп могут быть защищены другие функциональные группы, присутствующие в фрагментах Су!', Ь, циклической аминокислотной группе, образованной Ва, ВЬ и промежуточной Ν-С-группой, прежде всего в гидроксипролине, А, В и Ό, которые не должны вступать в реакцию в процессе синтеза молекул-мишеней. Эти защитные группы должны быть удалены после окончания синтеза.

Блокирующие группы, как они определены для формулы (I), могут также служить в качестве защитных групп, прежде всего при добавлении последнего (Ν-концевого) остатка аминокарбоновой кислоты. В этом последнем случае защитную группу не удаляют, поскольку она является частью молекулы-мишени. В альтернативном варианте блокирующая группа может быть присоединена после проведения сочетания с последним остатком аминокарбоновой кислоты и затем удалена.

Постадийный синтез описан на приведенных ниже схемах. На второй схеме показан пример того, что связующий фрагмент, а также фрагмент Су!' могут содержать другие функциональные группы, показанные на этой схеме (см. выше):

Таким образом, следующим объектом изобретения является способ получения соединения формулы (I), отличающийся тем, что соединение общей формулы (V)

где К¹, К^а и К^ь имеют указанные выше значения, X¹ обозначает ОН или уходящую группу, которая может быть замещена аминогруппой, подвергают взаимодействию с соединением НЫ(К⁴)-Су1', где Су!' обозначает фрагмент цитотоксического или цитостатического соединения и К⁴ имеет указанные выше значения.

Предпочтительно X¹ в формуле (V) обозначает уходящую группу, например -С1, -Г, Νгидроксисукцинимидил, пентафторфенил или карбоксилат. В альтернативном варианте X¹ может обозначать ОН и конденсация может быть осуществлена с использованием ίη м!и реагента для реакции сочетания, например, гексафторфосфата бензотриазол-1-илокситриспирролидинфосфония (РуВОР), 1,1'-карбонилдиимидазол (СЭ1), тетрафторбората 2-(1Нбензотриазол-1 -ил)- 1,1,3,3-тетраметилурония (ТВТи) или 1-(мезитилен-2-сульфонил)-3нитро-1Н-1,2,4-триазола (Μ8ΝΤ).

Следующим объектом изобретения является способ получения соединения формулы (I), отличающийся тем, что соединение общей формулы (VI)

где К¹, К^а и К^ь имеют значения, указанные в п.1 формулы изобретения, Υ¹ обозначает Ь-СОХ², где Ь обозначает связующий фрагмент и X² обозначает ОН или уходящую группу, которая может быть замещена аминогруппой или гидроксигруппой, подвергают взаимодействию с соединением Н₂Ы-Су1' или с соединением НО-Су!', где Су!' обозначает фрагмент цитотоксического или цитостатического соединения.

Предпочтительно X² в формуле (VI) обозначает уходящую группу, например, -С1, -Г, Νгидроксисукцинимидил, пентафторфенил или карбоксилат.

В альтернативном варианте X¹ может обозначать ОН и конденсация может быть осуществлена с использованием ίη м!и реагента для реакции сочетания, например гексафторфосфата бензотриазол-1-илокситриспирролидинфосфония (РуВОР), 1,1’-карбонилдиимидазол (СЭ^, тетрафторбората 2-(1 Н-бензотриазол-1-ил)1,1,3,3-тетраметилурония (ТВТИ) или 1(мезитилен-2-сульфонил)-3-нитро-1Н-1,2,4триазола (М8ЭТ).

Еще одним объектом изобретения является способ получения соединения формулы (I), отличающийся тем, что соединение общей формулы (VII)

К¹ о _Κ ^Β/^Ν^ν (VII) где К¹, К^а и К^ь имеют указанные выше значения, Υ² обозначает Ь-ОН или Ε-ΝΗ₂, где Ь обозначает связующий фрагмент, подвергают взаимодействию с соединением X³ОС-Су!', где X может обозначать ОН или уходящую группу, которая может быть замещена аминогруппой или гидроксигруппой и где Су!' обозначает фрагмент цитотоксического или цитостатического соединения.

Предпочтительно X³ в соединении X³ОССу!' обозначает уходящую группу, например -С1, -Г, Ν-гидроксисукцинимидил, пентафторфенил или карбоксилат. В альтернативном варианте X может обозначать ОН, а конденсацию осуществляют с использованием ίη м!и реагента для реакции сочетания, например, гексафторфосфата бензотриазол-1-илокситриспирролидинфосфония (РуВОР), тетрафторбората 1,1'карбонилдиимидазола (СОЦ тетрафторбората

2- (1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (ТВТИ) или 1-(мезитилен-2-сульфонил)-

3- нитро-1Н-1,2,4-триазола (М8ЭТ).

Следующим объектом изобретения является способ получения соединения формулы (I), отличающийся тем, что соединение формулы I ΕΝ-Су!' подвергают постадийной конденсации с фрагментами, образующими соединение формулы (I). Перед каждой стадией сочетания может оказаться необходимым удалить защитную группу ΡΘ, если она присутствует.

Таким образом, еще одним объектом изобретения является способ получения соединения формулы (I), отличающийся тем, что соединение общей формулы (VIII)

где ΡΘ¹ обозначает защитную группу, а другие заместители имеют указанные выше значения, подвергают взаимодействию с соединением НЫ(К⁴)-Су1', где Су!' обозначает фрагмент цито токсического или цитостатического соединения; затем удаляют защитную группу ΡΘ¹, после чего образовавшееся соединение (УША)

подвергают взаимодействию с соединением ΡΟ²-Λ-Χ⁴, где ΡΘ² обозначает защитную группу и X⁴ обозначает ОН или уходящую группу, которая может быть замещена аминогруппой;

и затем при необходимости осуществляют дополнительные стадии сочетания до получения конечного соединения.

Группы ΡΘ¹ и ΡΘ² могут представлять собой, например, ВОС или предпочтительно ГМОС.

Таким образом, еще одним объектом изобретения является способ получения соединения формулы (I), отличающийся тем, что соединение формулы Ρ(.ι^:-\(ΙΓ)-Ι.-СОХ/ где ΡΘ³ обозначает защитную группу, а другие заместители имеют указанные выше значения, подвергают взаимодействию с соединением формулы Υ⁴Су!', где Су!' обозначает фрагмент цитотоксиче4 ского или цитостатического соединения; и Υ обозначает Η₂Ν или НО; затем удаляют защитную группу Ρ( ³ и образовавшееся соединение НН(К⁴)-Г^⁴-Су!' подвергают взаимодействию с соединением формулы (VIII)

после чего удаляют защитную группу Ρ(¹ и образовавшееся соединение формулы

подвергают взаимодействию с соединением ΡΟ⁴-Λ-Χ⁴, где ΡΘ⁴ обозначает защитную группу и X⁴ может обозначать ОН или уходящую группу, которая может быть замещена аминогруппой; и затем при необходимости осуществляют дополнительные стадии сочета ния до получения конечного соединения.

Следующим объектом изобретения является способ получения соединения формулы (I), отличающийся тем, что соединение формулы ΡΘ⁵-Ν(Κ⁴)-Γ-Υ⁵, где ΡΘ⁵ обозначает защитную группу, Υ⁵ обозначает ОН или ΝΗ₂ и заместите ли имеют указанные выше значения, подверга ют взаимодействию с соединением формулы Х⁵ОС-Су!', где Су!' обозначает фрагмент цитотоксического или цитостатического соединения и X⁵ обозначает ОН или приемлемую уходящую группу; затем удаляют защитную группу Ρ( ⁵ и образовавшееся соединение ΗΝ(Κ⁴)-Ε-Υ⁵^ΟСу!' подвергают взаимодействию с соединением формулы (VIII)

после чего удаляют защитную группу и образовавшееся соединение

подвергают взаимодействию с соединением ΡΘ²-Α-Χ⁴, где ΡΘ² обозначает защитную группу и X⁴ обозначает ОН или уходящую группу, которая может быть замещена аминогруппой.

И затем при необходимости осуществляют дополнительные стадии сочетания до получения конечного соединения.

Еще одним объектом изобретения являются новые промежуточные соединения формулы УША

где К^а, К^ь, К⁴ и Су!' имеют указанные выше значения.

Соединения по изобретению предназначены для применения в медицине. В частности, эти соединения могут применяться для лечения опухолей, связанных со стромальными фибробластами, экспрессирующими ΓΑΡα, лечение которых с помощью существующих цитотоксических и/или цитостатических агентов не является оптимальным. Опухолями такого типа являются, например, различные виды эпителиаль ных карцином, такие как карциномы легкого, молочной железы и ободочной кишки. С помощью этих соединений можно лечить также такие опухоли как саркомы костной ткани и мягких тканей, которые экспрессируют ΓΑΡα.

Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения являются фармацевтиче ские композиции, содержащие соединение по настоящему изобретению и необязательно один или несколько пригодных и фармацевтически приемлемых эксципиентов, примеры которых приведены в ИеттЩоп: Изе 8С1епсе апб ргасйсе о Г рйагтасу, 19-е изд. Еаз!оп: Маск ΡπΜ, 1995. Фармацевтические композиции могут быть при готовлены в виде твердых продуктов или растворов. Твердые композиции могут использоваться для получения растворов для инъекций. Предпочтительно фармацевтические композиции представляют собой растворы для инъек ций. Они могут вводиться системно, например путем внутривенной инъекции, или местно, например путем инъекции непосредственно в область опухоли. Доза должна быть выбрана с учетом таких факторов, как вес тела и состояние здоровья пациента, природа подлежащей лечению болезни, спектр терапевтической активности применяемого соединения, растворимость и т.п. Соответствующая регулировка дозы находится в компетенции специалиста в данной области. Например, для конъюгатов доксорубицина доза предпочтительно должна составлять от 10 до 1350 мг/м², однако, могут применяться также более высокие и более низкие дозы.

Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является применение соединения по изобретению для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения рака. Кроме того, объектом изобретения является способ лечения рака, предусматривающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению. Композиции могут применяться для лечения различных типов рака, а именно:

1) эпителиальных карцином, включая карциномы молочной железы, легкого, колоректальную карциному, карциному головы и шеи, поджелудочной железы, яичника, мочевого пузыря, желудка, кожи, эндометрия, яичек, пищевода, предстательной железы и почек;

2) карцином костной ткани и мягких тканей: остеосаркомы, хондросаркомы, фибросаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы (МЕН), лейомиосаркомы;

3) гематопоэтических злокачественных опухолей: лимфомы Ходжкина и неходжкинской лимфомы;

4) нейроэктодермальных опухолей: опухолей периферической нервной системы, астроцитом, меланом;

5) мезотелиом.

Композиции могут также применяться для лечения хронических воспалительных состояний, таких как ревматоидный артрит, остеоартрит, цирроз печени, фиброз легкого, артериосклероз и аномальное заживление раны.

Еще одним объектом изобретения является способ лечения рака, предусматривающий введение пациенту пролекарства, где пролекарство может быть превращено в цитотоксическое или цитостатическое лекарство в результате ферментативной активности, при этом ферментативная активность обусловливается продуктом, который экспрессируется клетками, связанными с опухолевой тканью. Предпочтительно ферментативная активность представляет собой протеолитическую активность ЕАРа.

Одним из методов введения соединений является внутривенная инфузия. Другие возможные пути введения включают внутрибрюшинную (посредством болюса или инфузии), внутримышечную или внутриопухолевую инъекцию. При необходимости также можно использовать непосредственное введение (например, в случае фиброза легкого).

Описание чертежей

Фиг. 1 - расщепление конъюгатов доксорубицин-пептид с помощью ЕАРа. Приведены хроматограммы 2СР-Эох (2-61у-(Ь)-Ргодоксорубицин) после инкубации с очищенным слитым протеином ЕАРтСЭ8 (А) или с буфером (Б) (см. пример 5).

Фиг. 2 - уменьшение цитотоксичности доксорубицина в результате конъюгации доксорубицина с пептидами, которые могут быть расщеплены с помощью ЕАРа (см. пример 6).

Фиг. 3 - демонстрация цитотоксического действия доксорубицина, высвобожденного из конъюгатов доксорубицин-пептид, которые могут расщепляться с помощью ЕАРа, в результате экспрессии ЕАРа клетками клона НТ 1080 33 по сравнению с родительскими клетками линии НТ1080 (см. пример 8).

Фиг. 4 - стабильность Х-С.’Ьх-С.’1у-(Ъ)-Ргодоксорубицина и Х-СЬх-(Ъ)-Рго-(Ъ)-А1а-С1у-(Ъ)Рго-доксорубицина в плазме мыши и человека (см. пример 9).

Фиг. 5 - демонстрация ферментативной активности ЕАРа и определение его средней молекулярной массы в образцах опухолевых тканей человека (см. пример 12).

Специалисту в данной области должно быть очевидно, что несмотря на то, что в приведенных ниже примерах описаны конкретные реагенты и условия реакций, могут использоваться их модификации, которые следует рассматривать как подпадающие под объем изобретения. Таким образом, приведенные ниже примеры предназначены для более подробного пояснения изобретения, но не направлены на ограничение его объема.

Примеры

Пример 1. Процессы синтеза конъюгатов доксорубицина.

Ν-€Ί')ζ-ΟΙν-ΡΐΌ-;ιοκτο|)ν6ιιιιιιιι: взвешивали Х-СЬх-С1у-Рго (116,1 мг, 0,37 ммоля) и Νгидроксисукцинимид (44 мг, 0,37 ммоля) и вносили в двугорлую круглодонную колбу в атмосфере Ν₂. Добавляли безводный Ν,Νдиметилформамид (20 мл) и колбу охлаждали до 0°С в ледяной бане. Добавляли дициклогексилкарбодиимид (78 мг, 0,37 ммоля) в виде раствора в Ν,Ν-диметилформамиде объемом 1 мл. Раствор перемешивали в течение 40 мин при 0°С.

Взвешивали доксорубицин · НС1 (100 мг, ммоля), вносили в сосуд, снабженный небольшой мешалкой и помещали в атмосферу Ν₂. В сосуд добавляли при перемешивании Ν,Νдиметилформамид (3 мл) и Ν,Ν-диизопропилэтиламин (33,1 мкл, 0,19 ммоля). Раствор доксорубицина с помощью шприца добавляли к раствору пептида и сосуд дополнительно про мывали 2 мл Ν,Ν-диметилформамида. Ледяную баню удаляли и реакционную смесь перемешивали в течение приблизительно 48 ч при комнатной температуре.

Реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (500 мл). Этилацетатный слой промывали последовательно 10%-ным раствором лимонной кислоты (250 мл), насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (250 мл) и соляным раствором (250 мл). Органический экстракт сушили над безводным МдЗО₄ и растворитель удаляли с помощью роторного испарителя. Продукт, содержащий большое количество примеси в виде ДМФ, подвергали экспресс-хроматографии с обращеной фазой на колонке типа С-18, используя в качестве элюента смесь метанол:вода (8:2). Выделяли одно пятно оранжевого цвета, время удерживания (г!) которого составляло ~0,3, флуоресцировавшее при освещении длинноволновым УФ-светом. Метанол удаляли с помощью роторного испарителя, а последние следовые количества растворителя удаляли в течение ночи с помощью высоковакуумного насоса.

^СЬх-Рго-А1а-С1у-Рго: ^СЬх-Рго-А1а (5 г, 15 ммолей) и карбонилдиимидазол (2,43 г, 15 ммолей) вносили в атмосфере аргона в трехгорлую круглодонную колбу объемом 250 мл. Добавляли безводный тетрагидрофуран (50 мл) и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение приблизительно 45 мин. При этом происходило интенсивное выделение газа (СО2).

Взвешивали С1у-Рго-ОСН₃-НС1 (2,9 г, 15 ммолей) и вносили отдельную колбу. Добавляли тетрагидрофуран (5 мл) и Ν,Ν-диизопропилэтиламин (5,23 мл, 30 ммолей) и раствор перемешивали в течение нескольких минут. Растворенный продукт добавляли с помощью шприца к активированному пептиду, оставшийся продукт растворяли в минимальном количестве СН2С12 и также добавляли с помощью шприца к активированному пептиду.

Реакционный раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре (15 ч) и к утру образовывалось значительное количество осадка белого цвета. Реакционную смесь промывали 10%-ным водным раствором лимонной кислоты (300 мл) и экстрагировали этилацетатом (500 мл). Этилацетатный экстракт промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (300 мл) и сушили в присутствии соляного раствора (300 мл) и безводного МдЗО4. Этилацетат удаляли с помощью роторного испарителя, получая 5 г бесцветного масла, обладавшего удовлетворительными характеристиками.

Неочищенное масло, представляющее собой ^СЬ/-Рго-А1а-С1у-Рго-ОСН₃ (5 г, 12 ммолей), растворяли в метаноле (20 мл) в круглодонной колбе. Колбу помещали в водяную баню при температуре окружающей среды. Осторож но добавляли 1н. раствор гидроксида натрия (12 мл). Раствор перемешивали в течение 3,5 ч, после чего добавляли 1н. раствор НС1 (12 мл). Раствор концентрировали на роторном испарителе и добавляли еще несколько капель 1 н. раствора НС1 до достижения значения рН приблизительно 1,5, которое определяли с помощью лакмусовой бумаги. Воду удаляли с помощью вакуумного насоса, получая продукт в виде масла, который медленно перекристаллизовывали из этанола.

^С1)/-Р|'о-А1а-С1у-Рго-доксо|)уб||Ц11и: ΝСЬх-Рго-А1а-С1у-Рго (180 мг, 0,38 ммоля) растворяли в безводном Ν,Ν-диметилформамиде (15 мл). 1-Гидроксибензотриазол (51,3 мг, 38 ммолей) и дициклогексилкарбодиимид (78 мг, 38 ммолей) каждый растворяли в 1 мл Ν,Νдиметилформамида и добавляли в виде растворов к пептиду. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 45 мин.

Взвешивали доксорубицин -НС1 (116 мг, 20 ммолей), вносили в отдельный сосуд и растворяли в Ν,Ν-диметилформамиде (3 мл). В сосуд, содержащий доксорубицин, вносили с помощью шприца Ν,Ν-диизопропилэтиламин (34,8 мкл, 20 ммолей) и содержимое перемешивали в течение нескольких минут для обеспечения полного растворения. Раствор доксорубицина добавляли с помощью шприца к активированному пептиду. Раствор перемешивали в течение 48 ч при комнатной температуре.

Продукт экстрагировали этилацетатом (2 л) и промывали 10%-ным водным раствором лимонной кислоты (500 мл). Этилацетатный слой отделяли, сушили над МдЗО₄ и концентрировали на роторном испарителе, получая продукт в виде масла. Масло подвергали хроматографии с обращенной фазой на колонке типа С-18 на силикагеле, получая пятно оранжевого цвета г! = 0,25, которое флуоресцировало при освещении длинноволновым УФ-светом. Конечный продукт обладал удовлетворительными характеристиками.

Пример 2. Получение линий клеток, экспрессирующих ЕАРа.

Получали линии клеток млекопитающих, экспрессирующие рекомбинантный ЕАРа. Хорошо известные клетки фибросаркомы НТ1080, которые могут быть получены от БЗМ2 (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Брауншвейг, Германия) под регистрационным номером БЗМ2 АСС 315, поддерживали в смеси ΌΜΕΜ/Ρ12 (50:50), включающей 10% фетальной бычьей сыворотки, в атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% СО2. Клетки линии НТ1080 трансфектировали вектором ЕАР.38 (АО 97/34927, Зсап1ап и др., в указанном месте) с помощью метода с использованием липофектина согласно инструкциям производителя (фирма С1Ьсо/ВВЬ). Подвергнутые трансфекции клетки отбирали по признаку устойчивости к антибиотикам (200 мкг/мл генетрицина) и затем поддерживали в среде, содержащей генетрицин. Отбирали отдельные колонии устойчивых клеток, выращивали до конфлуенции на чашках Петри для культур тканей диаметром 10 см и анализировали в отношении экспрессии РАРа с помощью иммунофлуоресцентного анализа с использованием РАРаспецифического моноклонального антитела Р19 согласно описанному в литературе методу (Оапп-Сйека и др. Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск И8А 87(18), 7235-7239 (1990)). С помощью иммунофлуоресцентного анализа для родительской линии клеток НТ 1080 не было обнаружено заметной экспрессии РАРа, тогда как один клон, обозначенный далее как клон НТ1080 33, оказался позитивным в отношении экспрессии РАРа.

Аналогично этому клетки почки эмбриона человека линии 293, которые являются хорошо известными и могут быть получены от Американской коллекции тканевых культур (Роквилл, штат Мэриленд), выращивали в среде ЭМЕМ, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, в атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% СО₂. Клетки трансфектировали вектором, экспрессирующим РАРа, т.е. рРАР.38, путем трансфекции с использованием фосфата кальция согласно описанному в литературе методу (Рагк 1. Е., Скеп Н. Н., \Утег 1., Ноиск К. А. и Реггага Ν., Р1асеп!а дгоМк ГасЮг. Ро!еп!1а!юп оГ уакси1аг епбо!кека1 дгоМк ГасЮг Ьюаскуйу, ш укго апб ш У1уо, апб к1дк аГПпйу Ыпбтд !о ЕН-1 Ьи! по! !о Р1к-1/КЭВ. 1. Бю1. Скет. 269(41), 25646-25654 (1994)). Отбор и анализ трансфектантов осуществляли согласно методу, описанному выше применительно к экспрессии РАРа. Для родительской линии клеток 293 не было обнаружено заметной экспрессии РАРа. Один клон, обозначаемый далее как 2934/2, оказался позитивным в отношении РАРа.

Пример 3. Исследование экспрессии РАРа в трансфектированных линиях клеток.

Экспрессию РАРа исследовали в клетках линии НТ1080 и клона НТ1080 33. Метаболическое мечение, иммунопреципитацию и флуорографию осуществляли в основном следуя описанному в литературе методу (Рагк и др., 8отайс Се11 Мо1. Оепе!. 17(2), 137-150 (1991)). Клетки линии НТ1080 и клона 33 линии НТ1080 метаболически метили с помощью ³⁵8метионина. Экстракты, полученные с помощью детергентов, подвергали иммунопреципитации с помощью моноклонального антитела Р19 или мышиного антитела !дС1 в качестве отрицательного контроля. Осадки кипятили в буфере для образцов и разделяли с помощью гельэлектрофореза с использованием додецилсульфата натрия (согласно методу, описанному у ЬаеттН, МПиге 227(259), 680-685 (1970)).

Флуорографический анализ полученного геля показал, что клетки клона 33 линии НТ1080 продуцируют протеин РАРа. Ни в экстрактах родительских клеток линии НТ1080, ни в образцах, подвергнутых иммунопреципитации, полученных с помощью мышиного ^С!, протеин РАРа не был обнаружен.

Пример 4. Растворимый рекомбинантный РАРа.

Растворимую рекомбинантную форму протеина РАРа получали следующим образом. кДНК, кодирующую внеклеточный домен (ЕСИ) мышиного СЭ8а (СепЬапк М12825), включающий 189 Ν-концевых аминокислот СЭ8а, лигировали с кДНК, кодирующей внеклеточный домен РАРа (аминокислоты 27-760), получая конструкцию слитого протеина, а именно, РАРтСИ8, аналогичную по структуре лиганду слитого протеина ί.Ό8;·ι-ί.Ό40, согласно описанному ранее методу (Ъаие и др. 1. Ехр. Меб. 177(4), 1209-1213 (1993)). кДНК проверяли путем секвенирования и встраивали в вектор рУЪ1393. Трансфекцию клеток линии 8Г9 и амплификацию полученного рекомбинантного бакуловируса осуществляли согласно описанному в литературе методу (О'ВеШу, Васи1оу1ги8 Ехргеккюп Уес!огк: А ЬаЬога!огу Мапиа1, ОхГогб Ишуегкйу Ргекк, Νονν Уогк (1994)). Супернатант культуры Н1дк Р1уе-клеток, зараженных рекомбинантным бакуловирусом РАРтСЭ8 и выращенных в течение 4 дней, собирали и очищали путем ультрацентрифугирования. Слитый протеин РАРтСЭ8 очищали из этих супернатантов с использованием моноклонального антитела к РАРа, иммобилизованного на активированных агарозных шариках (фирма Р1егсе Скетюа1, Индианополис, штат Индиана, США). Супернатант культуры пропускали через колонку с высокой аффинностью к антителу и элюировали с помощью сдвига значения рН с использованием 0,1М цитратного буфера, рН 3. Образцы сразу же нейтрализовали с помощью насыщенного раствора Трис (фирма 81дта Скетюак, Сент-Луис, штат Миссури) и объединяли содержащие протеин фракции.

Пример 5. Оценка расщепления конъюгатов доксорубицин-пептид.

Образцы разделяли с помощью метода жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР) с обращенной фазой, адаптированного для измерения расщепления конъюгатов доксорубицин-пептид. ЖХВР-система включала автоматический аппликатор образцов типа \¥а!егк 717, снабженный 100-микролитровой (мкл) петлей, и два насоса типа ^а!егк модель 510 для введения растворителей. Разделения осуществляли в изократических условиях при скорости потока 0,7 мл/мин на колонке типа №1с1ео8б С18, длиной 100 мм, внутренним диаметром 4 мм, с размером частиц носителя 5 мкм (фирма Иг. !пд. Н. Кпаиег СтЬН, Берлин). Подвижная фаза представляла собой смесь метанол:вода (70:30, об./об.), содержащую 0,2М ацетат аммония, значение рН которой доводили до 3,2. Свободный доксорубицин и конъюгаты доксорубицин-пептид обнаруживали с помощью флуоресценции (длина волны возбуждения 475 нм; длина волны испускания 585 нм) с использованием флуоресцентного детектора типа Аа1егк 474. Инъекцию, введение растворителя, сбор данных и анализ данных осуществляли с использованием программного обеспечения для хроматографии типа МШеппшт 2010 (фирма Аа1егк Согр., Милфорд, штат Миннесота, США). Вещества, подлежащие тестированию, сначала растворяли в диметилсульфоксиде до получения концентрации 5мМ, а затем разводили в водном растворе перед внесением в колонку для ЖХВР.

Исследовали способность растворимого рекомбинантного фермента РАРа высвобождать свободный доксорубицин из конъюгатов доксорубицин-пептид. Маточные растворы конъюгатов доксорубицин-пептид (5мМ) разбавляли забуференным Нерек физиологическим раствором, рН 7,4, до получения конечной концентрации 50-100 мкМ. 20 мкл образовавшегося раствора смешивали с 50 мкл описанного выше очищенного слитого протеина РАРтСИ8 (приблизительно 20 нг) и 30 мкл забуференного Нерек физиологического раствора, рН 7,4. Смесь инкубировали при 37°С в течение 1 дня и высвобождение свободного доксорубицина оценивали путем указанного выше анализа с помощью ЖХВР. Площади под каждым пиком оценивали количественно с помощью указанного выше программного обеспечения, при этом исходное значение принимали за 100%. Скорость высвобождения свободного доксорубицина оценивали по появлению пика с таким же временем удерживания, что и у свободного доксорубицина в рассматриваемых условиях для ЖХВР. Величины площадей под каждым пиком использовали для вычисления отношений количества свободного доксорубицина к количеству конъюгата доксорубицин-пептид. Интегрирование площадей пиков для определения процента расщепления осуществляли с помощью указанного выше программного обеспечения для хроматографии типа МШеппшт 2010. Как видно на хроматограммах для ΖΟΡ-Όοχ (4-СЬ/-С1у-Ргодоксорубицин), представленных на фиг. 1, конъюгат доксорубицин-пептид может быть превращен в свободный доксорубицин после инкубации с очищенным слитым протеином РЛРтСИ8, но время удерживания конъюгата не изменялось в результате инкубации с буфером.

Пример 6. Уменьшение цитотоксичности доксорубицина путем конъюгации с пептидами, которые могут расщепляться с помощью РАРа.

Определяли способность пептидов, которые могут расщепляться с помощью РАРа, блокировать цитотоксическое действие доксоруби цина в отношении РАРа-негативных чувствительных к доксорубицину клеток. Клетки линии К562, которые могут быть получены от Американской коллекции типовых культур, Роквилл, штат Мэриленд, США (АТСС-номер: ССЬ-243), высевали в 96-луночные планшеты (фирма бгешег 8с1епЫлс) с плотностью 1000 клеток/лунку. К клеткам добавляли бессывороточную среду для культуры клеток, содержащую различные концентрации свободного доксорубицина или эквивалентные молярные концентрации конъюгатов доксорубицин-пептид.

Через 4 дня определяли количество клеток с использованием автоматического счетчика клеток типа СА8У™ (фирма 8сйагГе 8ук!ет СтЬН, Реутлинген, Германия). Результаты представлены на фиг. 2.

Пример 7. Высвобождение свободного доксорубицина с помощью связанного с клетками РАРа.

Исследовали способность связанного с клетками фермента РАРа высвобождать свободный доксорубицин из конъюгатов доксорубицин-пептид. Каждый конъюгат растворяли в бессывороточной среде для культуры клеток до конечной концентрации 1мкМ. 10 мл этого раствора добавляли к конфлуэнтным монослоям клеток линии НТ1080 или клона 33 линии НТ1080, находящимся в планшетах для культуры ткани диаметром 10 см, и выдерживали в течение 19 ч при 37°С. Среду удаляли и высвобождение доксорубицина оценивали согласно методу, описанному в примере 5. Линия клеток, экспрессирующих РАР, т.е. клон НТ1080 33, превращала в свободный доксорубицин 81% и 43% конъюгатов ΖСΡ-^οx (4-СЬ/-С1у-Ргодоксорубицин) и ΖΡАСΡ-^οx (4-СЬх-Рго-А1а61у-Рго-доксорубицин) соответственно. Родительская линия клеток НТ1080 в таких же условиях превращала в свободный доксорубицин только 9% ΖСΡ-^οx. В этих же условиях родительская линия НТ1080 превращала в свободный доксорубицин лишь незначительное количество ΖΡАСΡ-^οx или это количество не могло быть обнаружено.

Пример 8. Уничтожение чувствительных клеток высвобождаемым с помощью РАРа доксорубицином.

Оценивали способность РАРа образовывать свободный доксорубицин, обладающий способностью уничтожать чувствительные к доксорубицину клетки. Клетки линии К562, которые могут быть получены от Американской коллекции типовых культур, Роквилл, штат Мэриленд, США (АТСС-номер: ССЬ-243), высевали на 96-луночные планшеты (фирма Сгетег 8с1епййс) с плотностью 1000 клеток/лунку. Бессывороточную среду, содержащую 1мкМ конъюгата доксорубицин-пептид добавляли к клеткам линии НТ1080 или клона 33 линии НТ1080, находящимся в планшетах для культуры ткани диаметром 10 см, и выдерживали в течение 19 ч при 37°С. Среду удаляли и высвобождение доксорубицина оценивали согласно методу, описанному в примере 5. Затем 66 мкл этой среды добавляли в каждую лунку к клеткам линии К562. Через 4 дня определяли количество клеток с использованием автоматического счетчика клеток типа САЗУ™. Результаты представлены на фиг. 3.

Пример 9. Стабильность конъюгатов доксорубицин-пептид в плазме.

Стабильность конъюгатов доксорубицинпептид в плазме оценивали с помощью методов, описанных в примере 5. Образцы, содержащие конъюгаты доксорубицин-пептид (в концентрации 1 мкМ) инкубировали в присутствии 10 об.% мышиной или человеческой плазмы при 37°С в течение указанных периодов времени. Результаты для ΖΟΡ-Όοχ и ΖΡΑΟΡ-Όοχ после инкубации в мышиной или человеческой плазме представлены на фиг. 4.

Пример 10. Катализируемое ЕЛРа расщепление определенных конъюгатов 4-метокси-внафтиламид-пептид.

Для выявления предпочтительных для ЕАРа пептидных субстратов синтезировали олигомеры, состоящие из встречающихся в естественных условиях и/или не встречающихся в естественных условиях аминокарбоновых кислот и подвергали их сочетанию с пролин-4метокси-в-нафталинамином (Рго-ΜΝΑ) с использованием методов, известных в данной области (Е. ЭДипксй, ЗупШеке νοη Рерббеп, в Мебюбеп бег огдашксйеп Сйеш1е, НоиЬеп-ЭДеу1 (ред-ры Е. Ми11ег, О. Вауег), том XV, части 1 и 2, изд-во Сеогд ТЫете, Штутгарт, 1974).

Синтез Рго-Рго-4 -метокси-β -нафтиламида.

Вос-Рго (32 мг, 0,15 ммоля), тетрафторборат 2-( 1Н-бензотриазол-1 -ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (53 мг, 0,15 ммоля) и гидрохлорид Рго-4-метокси-в-нафтиламида (46 мг, 0,15 ммоля) растворяли в смеси безводный Ν,Νдиметилформамид/тетрагидрофуран 1:1 (4 мл). Добавляли Ν-этилдиизопропиламин (0,26 мл, 0,44 ммоля), растворенный в Ν-метилпирролидоне (1,7 мол.) и смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре.

Растворитель удаляли с помощью роторного испарителя и остаток растворяли в этилацетате (10 мл) и трижды экстрагировали водой. Органический слой сушили над безводным №₂8О₄ и растворитель удаляли с помощью роторного испарителя. Остаток растворяли в смеси трифторуксусная кислота/дихлорметан (1:4, 25 мл) и давали прореагировать в течение 1 ч. Растворитель удаляли с помощью роторного испарителя и полученное масло сушили в потоке азота. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ЖХВР с обращенной фазой с использованием градиента ацетонитрила/воды. Продукт имел удовлетворительные аналитические характеристики (ЯМР и массспектры).

Затем с помощью флуориметра типа Су1оГ1иог (фирма РегЗер1п'е Вюкуйетк, 1пс.) оценивали высвобождение свободного ΜΝΑ из пептидов, используя набор фильтров для длины волны возбуждения 355 нм/длины волны испускания 405 нм. Кинетические параметры фермента (значения константы Михаэлиса-Ментен К_т и к_са1) рассчитывали с помощью методов, известных в данной области (см., например, Унп, З. Ь. и ЗиеНег, С. Н. А щтр1е шебюб Гог са1си1а!шд Кт апб V Ггот а 8тд1е епхуте геасбоп ргодгекк сигуе. ВюсЫт. Вюрйук. Аба 480(1), 1-13 (1977)), для фермента ЕАРа, выделенного из экстрактов мембран трансфектированных 293ί/2-клеток, описанных в примере 2.

Таблица 1. Значения К_т и к_са1 для катализируемого ЕАРа расщепления определенных конъюгатов 4-метокси-в-нафтиламид (ΜΝΛ)пептид.

Субстраты	Км	КсаГ	Кса1/Кш
[мк М]	[с-1]	χ104 [М-1 с-1]
Сйд-Рго-МКА	75	53,7	71,6
Нуп-Рго-МКА	69	27,4	39,7
Рго-Рго-МКА	154	49,5	32,1
Vа1-Ρ^ο-ΜNΑ	95	27,7	29,2
Ме1-Рго-МЫА	127	27,9	22,0
Агд-Рго-МКА	278	50,6	18,2
Транс-Нур-РгоЖА	254	37,9	14,9
ОШ-Рго-МИА	273	40,5	14,8
А1а-Рго-МЫА	267	35,7	13,4
Еук-Рго-МЫА	530	57,1	10,8
Пе-Рго-МЫА	43	12,6	8,8
Ме1(О)-Рго-МЫА	378	26,9	7,1
Зег-Рго-МЫА	872	28,3	3,3

Сйд = циклогексилглицин, Нуп = 6гидроксинорлейцин, транс-Нур = транс-4гидроксипролин, Ме1(О) = метионин-З-оксид

Пример 11. Специфичность ΜNΑсвязанных пептидов в отношении ЕАРа в сравнении с ЭРР-ίν.

Среди известных представителей семейства серинолигопептидаз, обладающих специфичностью в отношении пролила, наиболее близким к ЕАРа ферментом является ЭРР-ίν. Поскольку активный ЭРР-ίν обнаружен в плазме и во многих различных типах клеток, то необходима оптимизация относительной (необязательно) избирательности пептидных пролекарств для ЕАРа по сравнению с ЭРР-ίν для того, чтобы уменьшить нежелательное превращение пролекарства в областях, отличных от опухоли (например, в плазме). Для выявления пептидов, обладающих специфичностью в отношении ЕАРа, способность ЕАРа расщеплять ΜNΑсвязанные пептиды сравнивали со способностью ЭРР-ΙV расщеплять те же самые пептид ные конъюгаты. Высобождение свободного ΜΝΑ оценивали согласно методу, описанному в примере 9. Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2. Сравнение избирательной способности ΕΑΡα и ΌΡΡ-ΐν в отношении расщепления конъюгатов ΜΝΑ-пептид.

	Специфичность расщепления
ΕΑΡ	ΌΡΡ IV
Α1а-Ρ^ο-ΜNΑ	+	+
Ζ-61γ-ΡΐΌ-ΜΝΑ	+	-
Ζ-Ρ^ο-Α1а-61у-Ρ^ο-ΜNΑ	+	-

+ обозначает фермент, обладающий способностью расщеплять субстрат;

- обозначает отсутствие расщепления.

Пример 12. Активность ΕΑΡα в образцах опухоли.

Ферментативную активность ΕΑΡα измеряли в образцах опухоли человека. 96-луночные планшеты для ЕЫ8Л (твердофазный иммуноферментный анализ) (фирма Сокйг, Корнинг, штат Нью-Джерси) сенсибилизировали в течение ночи при 4°С с использованием 1 мкг/мл антитела Ε19 или контрольного антитела в забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,4. Затем лунки промывали буфером для отмывки (ЗФР, 0,1% Ттеееи 20, рН 7,4) и избыток сайтов связывания блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре блокирующим буфером (5% бычий сывороточный альбумин в ЗФР, рН 7,4). Измеряли активность ΕΑΡα в опухолевой ткани (закрашенные символы) или в соответствующей нормальной контрольной ткани (соответствующие незакрашенные символы) из экстрактов мембран, обогащенных конкавалином А (фиг. 5а). Образцы опухолей включали рак молочной железы (Н,9), ободочной кишки (·), метастазы опухоли ободочной кишки в печень (♦) и рак легкого (σ,τ). Экстракты вносили на сенсибилизированные с помощью Ε19 планшеты и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Несвязанный продукт удаляли, лунки трижды промывали буфером для отмывки и ферментативную активность ΕΑΡα анализировали в течение 1 ч при 37°С с использованием 100 мкл ΑΕι-ΡγοΑΕС согласно методу, описанному в XV О 97/34927. Для каждого экстракта оценивали первые две конкавалин А-фракции и результаты каждого измерения по отдельности наносили на график. Из каждого значения вычитали фоновую флуоресценцию (измеренную для планшетов, сенсибилизированных с помощью контрольного антитела).

Независимое биохимические данные о ферментативной активности ΕΑΡα и его средней молекулярной массе в экстрактах опухолевых тканей получали путем мечения вышеуказанных экстрактов ткани с использованием Сдиизопропилфторфосфата (ΌΡΡ; фирма ΝΕΝΌΗΡοηΐ, Со1одие, Германия). Известно, что ΌΡΡ ковалентно и необратимо связывается с активными сайтами серина многих серинпротеаз, препятствуя тем самым дальнейшему катализу (Науакб1 В., Ва1 Υ. и На!а Т., ЕийНег сойлтабои оГ сагЬохурерббаке Υ ак а те(а1-Ггее еихуте баν^ид а геасЧе кепие геыбие. 1. Вюсбет. 77(6), 1313-1318 (1975); №аб1Ьу 8. и Еидйгот Ь., 81иб1ек ои 8(гер(отусек дпкеик рго!еаке. II. Тбе атто ас1б кедиеисе агоииб (бе геасЧе кепие геббие оГ ^ΕΡ-кеикб^νе сотроиейк тебб ек(егаке аййбу. Вюсб1т. Вюрбук. Α^ 151(2), 402-408 (1968)). Результаты мечения с использованием 'Χ-ΌΕΡ ΕΑΡα, выделенного с помощью иммунопреципитации из опухоли (Т), соответствующей образцу опухоли ободочной кишки, обозначенному символом · на фиг. 5. Анализ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Ьаеттб и. К., С1еаνаде оГ к(гис(ига1 рго1ешк бипид (бе аккетЬ1у оГ (бе беаб оГ Ьайепорбаде Т4. №(иге 227(259), 680-685 (1970)) и последующей авторадиографии (Тагк 1. Е., Эгарег В. К. и Вготеи V. 1., Вюкуйбекй оГ 1укокота1 еихутек 1и се11к оГ (бе Еиб3 сотрктеийбои дгоир соиббюиабу беГес(б^ге ш еибокота1 ашбШсабои. 8отабс Се11 Мо1. Сеие!. 17(2), 137-150 (1991)) этих образцов позволил выявить присутствие меченого протеина с молекулярной массой 95 кДа в образце раковой ткани ободочной кишки. Ни для соответствующего контрольного образца, полученного иммунопреципитацией (Ν), ни для контрольного антитела не было выявлено полос, несущих радиоактивную метку. Величина средней молекулярной массы меченного с помощью С протеина, полученного путем иммунопреципитации, которая представлена на фиг. 5, согласуется с опубликованными ранее данными для ΕΑΡα (Вебзд V. 1., 8и 8. Ь., Εο^(ииа(о 8. В., 8саи1аи Μ. 1., Мобаи Ва.) В. К., СапиСбека Ρ., Неа1еу 1. Н. и О1б Ь. 1., ΕΦιπΠη^ асб\'а(юг1 рго!еш: Ργιγι ПсаНои, ерборе тарршд аиб тбисбои Ьу дготе1б Гас(огк. 1й. 1. Саисег 58(3), 385-392 (1994); №О 97/34927).

Пример 13. Получение защищенных олигопептидов.

Защищенные олигопептиды получали либо в растворе согласно протоколам, известным из существующего уровня техники (см., например, у М. Вобаикхку и Α. Вобаикхку, “Тбе ргасбсе оГ Ρер(^бе 8уйбек1к”, 2-е изд., изд-во 8рпидег, Нью-Йорк, 1994), либо с помощью твердофазного синтеза с использованием автоматического синтезатора пептидов типа Αрр1^еб Вюкук(етк модель 430А. Удаление защитных групп и отделение олигопептида от смоляной подложки осуществляли путем обработки смесями трифторуксусной кислоты и широко используемых акцепторных добавок. Очистку осуществляли с помощью жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой на колонках типа С18 на силикагеле с использованием градиента

0,1%-ного водного раствора трифторуксусной кислоты/ацетонитрила. Идентичность и гомогенность пептидов подтверждали с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и масс-спектрометрического анализа. Олигопептиды, полученные таким методом, представлены в табл. 3.

Таблица 3. Олигопептиды._____________ /ХИу-Рго-ОН г-Рго-А1а-С1у-Рго-ОН

Ртос-Рго-А1а-О1у-Рго-ОН

Ртос-СЬ§-Рго-ОН

Ртос-18Пе-Рго-ОН

Ртос-Нуп-Рго-ОН

Ртос-Рго-Рго-ОН

Ртос-8ег-А1а-Нуп-Рго-ОН

Ртос-8ег-А1а-18Г1е-Рго-ОН

Ртос-8ег-А1а-СЬ§-Рго-ОН

О1у-8ег-А1а-О1и-Рго-ОН 01у-С1у-8ег-А1а-01и-Рго-ОН 01у-01у-01у-8ег-А1а-01и-Рго-ОН 8ег-О1и-А8п-Аг§-Ьу8-Уа1-Рго-ОН С1у-Туг-8ег-Аг§-Ме1-Рго-ОН С1п-О1у-Туг-8ег-Аг§-Ме1-Рго-ОН О1у-О1у-Сг1у-Тгр-Рго-ОН Азп-Аг§-Ьу8-Уа1-Рго-ОН 01и-Азп-Аг§-Ьу8-Уа1-Рго-ОН 8ег-С1и-А8П-Аг§-Ьу8-Уа1-Рго-ОН А1а-Н18-Ме1-Н18-Рго-ОН

Туг-А1а-РЬе-Н18-Рго-ОН

8ег-Туг-А1а-РЬе-Н18-Рго-ОН

Беи-Азп-Беи-Туг-МеТ-Рго-ОН

01у-8ег-А1а-01и-Рго-ОН 01у-01у-8ег-А1а-01и-Рго-ОН О1у-О1у-Ст1у-8ег-А1а-Ст1и-Рго-ОН

Ζ обозначает бензилоксикарбонил;

Γтοс обозначает 9-флуоренилметоксикарбонил;

СКд обозначает Б-циклогексилглицил;

Ы1е обозначает Б-норлейцинил;

Нуп обозначает Б-6-гидроксинорлейцинил.

Пример 14. Получение 1·Ίιιοο-ΡΐΌ-ΑΙα-6Κ'Ργθ-Όθχ.

Γтοс-Ρ^ο-Α1а-Θ1у-Ρ^ο-ОΗ (44 мг, 0,078 ммоля) растворяли в безводном Ν,Ν-диметилформамиде (10 мл) и значение рН доводили до 7,5 с помощью Ν,Ν-диизопропилэтиламина. Добавляли Ν-гидроксисукцинимид (1М В ТГФ, 78 мкл, 0,078 ммоля) и смесь охлаждали в ледяной бане. Добавляли при перемешивании дициклогексилкарбодиимид (1М в ДМФ, 87 мкл, 0,087 ммоля) и раствор перемешивали в течение 1 ч при 0°С.

Доксорубицин*НС1 (25 мг, 0,043 ммоля) растворяли в 20 мл безводного ДМФ и добавляли Ν,Ν-диизопропилэтиламин (8,2 мкл, 0,048 ммоля). Эту смесь с помощью шприца добавляли к активированному пептиду. Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и ее перемешивали в течение 48 ч.

Затем растворитель удаляли и продукт очищали с помощью препаративной ОФ-ЖХВР на колонках типа С18, используя градиент воды/ацетонитрила с добавлением 0,1%-ной трифторуксусной кислоты.

Выход по данным аналитической ЖХВР >90%; Е8-МС 1110,5 ([Μ+Να]⁺); 674,4.

Пример 15. Получение Η-ΡΓΟ-Α1α-Θ^-ΡΓΟΌοχ.

Γтοс-ΡΑΘΡ-^οx (полученный в примере 14, 44 мг, 0,040 ммоля) растворяли в смеси ТГФ/диэтиламин (2:1, 20 мл) при 0°С и перемешивали в течение 2 ч. Растворитель удаляли и продукт очищали с помощью препаративной ОФ-ЖХВР на колонках типа С18, используя градиент воды/ацетонитрила с добавлением 0,1%-ной трифторуксусной кислоты.

Выход по данным аналитической ЖХВР >90%; Е8-МС 866,6 [М+Н]⁺, 452,4.

Пример 16. Получение Н-Сйд-ΡΓΟ-Όοχ.

Γтοс-Сйд-Ρ^ο-ОΗ (46 мг, 0,096 ммоля) растворяли в безводном Ν,Ν-диметилформамиде (10 мл) и значение рН доводили до 7,5 с помощью Ν,Ν-диизопропилэтиламина. Добавляли Ν-гидроксисукцинимид (1М в ДМФ, 96 мкл, 0,096 ммоля) и смесь охлаждали в ледяной бане. Добавляли при перемешивании дициклогексилкарбодиимид (1М Β ДМФ, 107 мкл, 0,107 ммоля) и раствор перемешивали в течение 1 ч при 0°С.

Доксорубицин*НС1 (31 мг, 0,053 ммоля) растворяли в 20 мл безводного ДМФ и добавляли Ν,Ν-диизопропилэтиламин (10 мкл, 0,059 ммоля). Эту смесь с помощью шприца добавляли к активированному пептиду. Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и ее перемешивали в течение 48 ч.

Затем растворитель удаляли и продукт очищали с помощью препаративной ОФ-ЖХВР на колонках типа С18, используя градиент вода/ацетонитрила с добавлением 0,1%-ной трифторуксусной кислоты.

Лиофилизированный продукт растворяли в смеси ТГФ/диэтиламин (2:1, 20 мл) при 0°С и перемешивали в течение 2 ч. Растворитель удаляли и продукт очищали с помощью препаративной ОФ-ЖХВР на колонках типа С18, используя градиент воды/ацетонитрила с добавлением 0,1%-ной трифторуксусной кислоты.

Выход по данным аналитической ЖХВР >90%; Е8-МС 780,2 ([М+Н]⁺); 366,4.

В приведенной ниже табл. 4 указаны конъюгаты пептид-доксорубицин, которые получали аналогичным методом, а также данные о расщеплении с помощью ΓΑΡ (через 20 ч).

Таблица 4.

п1	Расщепление с помощью РАР
Ζ-СИу-	> 95%
Ζ-Ργο-ΑΗ- О1у-	> 95%
Ртос-Рго- А1а-О1у-	> 95%
Н-Рго-А1а- О1у-	прибл. 11 %
Н-СИё-	> 95%
Η-Ν1ε-	> 95%
Н-Нуп-	> 95%

Ζ обозначает бензилоксикарбонил,

Ртос обозначает 9-флуоренилметоксикарбонил,

Сйд обозначает Ь-циклогексилглицил,

Ме обозначает Т-норлейцинил,

Нуп обозначает Τ-6-гидроксинорлейцинил.

Пример 17. Получение Ν-^ζ-Ο^-Ργοмелфалана.

\-СМ-СЖ'-Рго-О11 (22 мг, 0,072 ммоля) растворяли в безводном Ν,Ν-диметилформамиде (8 мл) и значение рН доводили до 7,5 с помощью Ν,Ν-диизопропилэтиламина. Добавляли Ν-гидроксисукцинимид (1М В ДМФ, 72 мкл, 0,072 ммоля) и смесь охлаждали в ледяной бане. Добавляли при перемешивании дициклогексилкарбодиимид (1М В ДМФ, 67 мкл, 0,67 ммоля) и раствор перемешивали при 0°С в течение 2 ч.

Мелфалан (14,7 мг, 0,048 ммоля) растворяли в 30 мл безводного ДМФ и добавляли Ν,Νдиизопропилэтиламин (12,3 мкл, 0,072 ммоля). Эту смесь с помощью шприца добавляли к активированному пептиду. Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и ее перемешивали в течение 24 ч.

Растворитель удаляли и продукт очищали с помощью препаративной ОФ-ЖХВР на колонках типа С18, используя градиент воды/ацетонитрила с добавлением 0,1%-ной трифторуксусной кислоты.

Выход по данным аналитической ЖХВР >90%; Е8-МС 593,0 ([М+Н]⁺).

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль, где В¹ обозначает фрагмент формулы СдΑ, Сд-В-А или Сд-(Э)_т-В-А, где

   Сд обозначает блокирующую группу, выбранную из ряда, включающего В⁵-СО, В⁵-ОСО-, В^Н^СО-, В⁵-8О₂- или В⁵-, где В⁵ обозначает необязательно замещенную С3С8циклоалкильную, арильную, аралкильную или гетероарильную группу;

   А представляет собой фрагмент, являющийся производным аминокарбоновой кислоты, выбранной из ряда, включающего Ь-пролин, глицин, Ь-норлейцин, Ь-циклогексилглицин, Ь5-гидроксинорлейцин, Τ-6-гидроксинорлейцин, Τ-5-гидроксилизин, Ь-аргинин или Ь-лизин; и

   В и Ό, каждый независимо друг от друга, обозначает фрагменты, являющиеся производными аминокарбоновых кислот формулы -[ΝΚ⁶(Х)Р-СО]-, где X обозначает СВ⁷В⁸ и где В⁶, В⁷ и В⁸, каждый независимо друг от друга, обозначает атом водорода, необязательно замещенную С1-С₆алкильную, Сз-С₈циклоалкильную, арильную или гетероарильную группу, и р обозначает 1, 2, 3, 4, 5; или

   В и Ό, каждый независимо друг от друга, обозначает фрагменты, являющиеся производными циклических аминокарбоновых кислот формулы где В⁹ обозначает С₁-С₆алкил, ОН или ΝΗ₂, т обозначает целое число от 1 до 10;

   ς обозначает 0, 1 или 2 и г обозначает 0, 1 или 2;

   В^а и В^ь вместе с промежуточной Ν-Сгруппой образуют необязательно замещенное, необязательно сконденсированное с бензо- или циклогексаногруппой 3-7-членное насыщенное или ненасыщенное гетероциклическое кольцо, в котором одна или две СН₂-группы также могут быть замещены ΝΗ, О или 8,

   В⁴ обозначает Н и

   Су!' обозначает фрагмент цитотоксического или цитостатического соединения.
2. 2. Соединение формулы I по п.1, где гетероциклическое кольцо, образованное В^а, В^ь и промежуточной Ν-С-группой, замещено В² и В³, при этом В² и В³, каждый независимо друг от друга, обозначает атом водорода или атом гало гена или С₁-С₆алкил, С₁-С₆алкиламино, диС₁С₆алкиламино, С₁-С₆алкокси, тиол, С₁-С₆алкилтио, оксо, имино, формил, С₁-С₆алкоксикарбонил, аминокарбонил, С₃-С₈циклоалкил, арил или гетероарил.
3. 3. Соединение формулы ТА где К¹, К⁴ и Су!' имеют значения, указанные в любом из предыдущих пунктов, К² и К³ имеют значения, определенные в п.2, и X-Υ обозначает СНК²-СН2, СК²=СН, КН-СН2, СН₂-ЛН, -СК²-, СН2-СНК²-СН2.
4. 4. Соединение формулы ГА1 где К¹ и Су!' имеют значения, указанные в п.1.
5. 5. Соединение формулы I где К¹ и Су!' имеют значения, указанные в п.1, К⁴ означает Н, выбранное из соединений формул ГА2, ГА3, ГА4 и ^5 (ΙΑ2) (ΙΑ3) (ΙΑ4) (ΙΑ5)
6. 6. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где К¹ обозначает группу, выбранную из формул (21), (22) и (34)

   Сд-О1у(21)

   Сд-Ме(22) ^-^αα^^αα-Θ^(34), где Сд обозначает атом водорода или блокирующую группу, выбранную из ряда, включающего бензоилоксикарбонил, фенилацетил, фенилметилсульфонил и бензиламинокарбонил; Хаа обозначает фрагмент, полученный из аминокарбоновой кислоты, и т обозначает целое число от 1 до 6.
7. 7. Соединение по п.6, где фрагменты аминоалкановой кислоты находятся в (Ь)конфигурации.
8. 8. Соединение по п.1, где -НЛ-Су!' обозначает антрациклиновое производное.
9. 9. Соединение по п.8, выбранное из соединений формул (ША), (ШВ), (ШЕ) и (ШГ)
10. 10. Применение соединения по любому из предыдущих пунктов в качестве терапевтического агента.
11. 11. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по любому из пп.1-9 и необязательно один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов.
12. 12. Применение соединения по любому из пп.1-9 для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения рака.
13. 13. Способ получения соединения формулы I по п.1, отличающийся тем, что соединение формулы (V) где К¹, К^а и К^ь имеют значения, указанные в п.1, X¹ обозначает ОН или уходящую группу, которая может быть замещена аминогруппой, подвергают взаимодействию с соединением формулы НЫ(К⁴)-Су!', где Су!' обозначает фрагмент цитотоксического или цитостатического соединения и К⁴ имеет значения, указанные в п.1, с последующим выделением целевого продукта.
14. 14. Способ лечения рака, предусматривающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции по п.11 в течение времени и при условиях, эффективных для ингибирования пролиферации клеток опухоли.
15. 15. Способ лечения рака, предусматривающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, соединения по п.1 в количестве, эффективном для ингибирования пролиферации клеток опухоли, в течение времени и при усло виях, эффективных для ингибирования пролиферации клеток опухоли.
16. 16. Способ лечения заболевания, выбранного из ряда, содержащего эпителиальные карциномы, включая карциномы молочной железы, легкого, колоректальную карциному, карциному головы и шеи, поджелудочной железы, яичника, мочевого пузыря, желудка, кожи, эндометрия, яичек, пищевода, предстательной железы и почек;

    саркомы костной ткани и мягких тканей, включая остеосаркомы, хондросаркомы; фибросаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому (МГН) и лейомиосаркому;

    гематопоэтические злокачественные опухоли, включая лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому;

    нейроэктодермальные опухоли, включая опухоли периферической нервной системы, астроцитомы и меланомы; и мезотелиомы, предусматривающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, соединения по п.1 в количестве, эффективном для ингибирования пролиферации клеток опухоли.