CZ389398A3 - Proléčiva thalidomidu a jejich použití pro modulaci funkce T-buněk - Google Patents

Description

Proléčiva thalidomidu a jejich použití pro modulaci funkce T-buněk

Oblast techniky:

Předložený vynález se týká nové, bezpečné a účinné formy thalidomidu ( [H-ftalimido]-glutar: imidu) a způsobů jeho použití. Přesněji se vynález týká proléčiva thalidomidu a proléčiv některých analogů thalidomidu, které zahrnují thalidomid nebo analogickou složku, která má vazbu na sekvenci dipeptidu X-pro, kde X je jedna z široké řady aminokyselin, a pro označuje prolin iminokyse1 iny.

Dosavadn í_stav technikyHodně pozornosti vyvolala zjištění týkající se vynikajících účinků thalidomidu při léčbě řady nemocí včetně malomocenství, HIV-infekce a revmatické artritidy. Thalidomid byl poprvé popsán v 1953 firmou Ciba, a následně byl prodáván firmou Chemie Grunenthal jako protikřečová látka pro léčení epilepsie. Léčivo se ukázalo pro tyto účely neúčinné; nicméně vyvolávalo dobrý spánek. V Evropě dosáhlo širokého použití jako bezpečná alternativa barbiturátů, a později bylo používáno jako látka působící proti zvracení u těhotných žen. Sloučenina se zdála být pro modelové hlodavce netoxická, takže LD50 nemohlo být stanoveno. V roce 1961 však byly popsány defekty končetin u dětí matek, které používaly v těhotenství thalidomid. Thalidomid se prokázal jako potentni teratogen a byl stažen z obchodu vzhledem k extrémnímu znepokojení nad hrozbou poškození nových lidských generací svými teratogenními vedlejšími účinky.

Krátce potom však Sheskin a kol. použili thalidomid jako sedativum u mužských pacientů s leprou, trpících leprozním nodosním erytémem (ENL). Sheskin a kol., (1965), Thalidomid • · • · · · • · · · • · · in the treatment of lepra reacbions. Clin Pharmacol. Ther. 6 :303. K jeho překvapení klinické známky a příznaky ENL byly zmírněny během 48 hodin. Účinnost thalidomidu vůči NHL byla stanovena mimo veškerou pochybnost ve zdvojených slepých klinických testech.

Nedávno byl také thalidomid používán na revmatický, sarkoidozní, systémový lupus erythematodes, Behcetovu chorobu, v akutním a chronickém štěpu vs. hostitelská choroba (GVHD) následující transplantaci kostní dřeně, a jako imunosupresivní látka při a1 o implantátu. Léčivo se prevenci odmítnutí srdečního také později stalo předmětem rozsáhlého výzkumu pro svůj předpokládaný význam při léčení řady stavů týkajících se AIDS, zahrnujících aftozní vředy, pokles sil, tuberkulózu, stejně jako pro léčení HIV infekcí samotných a ztráty funkčních CD4 T-buněk.

má určité jeví jako

Použ i t í odůvodněn í.

tohoto léčiva při HIV chorobě Poměrně paradoxně se thalidomid pacifikující nebo snižující část imunitní odezvy, vlastnosti, která se nezdála být podporující nemocí popsanou v imunitní nedostatečnosti. Nadměrné hladiny TNF nalezené u HIV infekcí podporují rozvoj aftozních vředů, demence, horečky, únavy a chřadnutí. Jak thalidomid reguluje zvýšení IL-2 a jak reguluje snížení INT není známo, ale byla navržena interakce thalidomidu se souborem receptoru cytokinu. Nedávno Shannon a kol. uvedli, že thalidomid může stimulovat syntézu IL-2 in vitro. Shannon a kol., (1995), Thalidomide enhanced the production of IL-2 in cultures of human mononuclear cells stimulated with concanavalin-A, Streptococca1 enterotoxin A and purified protein deri vat i ves. Immunopharm. V této studii byly mononukleární buňky ze sedmi zdravých donorů vystaveny působení thalidomidu a potom stimulovány concavana1 inem-A (Con-A), který uvolňoval 187 %

IL-2 než kontrolní kultury stimulované s Con-A + 32 % ví ce

Thalidomid také výrazně zvyšuje množství intrace1ulárního IL-2 v buňkách st i mul ováných

Con-A nebo

SEA (Staphylococcal • · · · • · enterotoxi η-A) (Shannon a Smith (Studie prováděné v říjnu 1995, Baton Rouge, Louisiana)). Pokud je thalidomid schopný úspěšné syntézy IL-2 in vivo, zejména vzhledem ke sklonu jedinců být deficienty v IL-2 (např. imunosuprese indukovaná HIV), může to být nejvýhodnějším účinkem léčiva. Nicméně extrémní vedlejší účinky spojené s tha1 idomidem, včetně výše popsaných teratogenních vedlejších účinků nevratného vedlejšího účinku periferální pokračují ve zdrcování širokého rozvoje léčení tha1 idomidem, využívajícího jeho prokázaných výhodných atributů.

a možného neuropatie,

S ohledem na stav techniky uvedený výše poskytuje předložený vynález proléčiva thalidomidu ( a proléčiva některých analogů thalidomidu), který přednostně obsahuje thalidomidovou složku, která má vazbu na odstupující skupinu dipeptidu. Dipeptid vybraný podle vynálezu má přednostně sekvence X-pro, kde X je jednou z širokého výběru aminokyselin a pro označuje prolin iminokyse1 iny. Vynalezená tha1 idomidová proléčiva jsou neaktivní pokud jsou metabolický měněna, například místně specifickým enzymem, který aktivuje tha1 idomidovou složku odebráním dipeptidu z ní. Také jsou popsány způsoby přípravy inventivních proléčiv a způsob jejich použití pro léčení pacientů trpících například aftozními vředy, chřadnutím, tuberkulózou, demencí, horečkou, únavou, HIV infekcí a ztrátou funkčních CD4 T-buněk.

Podstata vynálezu^

K překonání problémů týkajících se extremních vedlejších účinků způsobených systematickým podáváním thalidomidu pacientovi, poskytuje předložený vynález proléčiva thalidomidu a způsoby jejich přípravy a jejich použití. Proléčiva podle vynálezu mohou být podávána pacientovi; tak se podává inaktivní forma thalidomidu, která může být postupně aktivována místně specifickým způsobem. Výhodné léčivé aktivity je tudíž dosaženo v cílovém místě bez ·· · · · · «· ··«· • · * · » · • » · · · · • · · · · · · « ·· · · · * » systematického podávání aktivního léčiva.

V jednom předmětu vynálezu se popisuje způsob léčení pacienta, zahrnující poskytnutí kompozice, která obsahuje thalidomidové proléčivo, a podávání tha1 idomidového proléčiva pacientovi. Proléčivo přednostně obsahuje thalidomidovou složku, která je vázaná na dipeptid obsahující sekvenci X-pro; kde X je jednou z široké řady aminokyselin a -pro označuje imonokyse1 i nový prolin. V jednom výhodném provedení vynálezu obsahuje kompozice thalidomidové proléčivo a farmaceuticky přijatelný nosič.

V dalším předmětu vynálezu se popisuje kompozice vhodná pro selektivní léčení aftozních vředů, chřadnutí, tuberkulózy, demence, horečky, únavy, HIV infekce a ztráty funkčních CD 4 T buněk, obsahujících tha1 idomidovou komponentu, která má dipeptid vybraný v souladu s předloženým vynálezem, vázaný na něj. Také jsou popsány způsoby přípravy těchto proléčiv thaI idomidu.

Předmětem předloženého vynálezu je poskytnout způsob podávání prokázaného prospěšného léčiva thalidomidu ve formě proléčiva vyrobeného nebo vybraného v souladu s vynálezem, pro snížení systémového osídlení účinného léčiva a v souladu rizika extrémně nepřijatelných s tím sn í žen í úč i nků.

vedlejších

Dále je předmětem pro1éč i vo tha1 i dom i du odstupující skupinu, předposlední poloze.

předloženého vynálezu poskytnout zahrnující v sobě dipeptidovou která má prolin iminokyse1 inu na

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout způsob přípravy nalezených proléčiv thalidomidu navázáním dvou aminokyselin vybraných v souladu s vynálezem na molekulu thalidomidu.

Další předměty, výhody a znaky předloženého vynálezu budou • · • · · · * « · · patrné 2 podrobného popisu dále a z připojených obrázků.

POPIS VÝHODNÉHO PROVEDENI principů tohoto vynálezu na specifická provedení

Za účelem zlepšení pochopení budou nyní prováděny odkazy a k jejich popisu bude používán specifický jazyk. Nicméně musí být zřejmé, že tím není míněno žádné omezení rozsahu vynálezu, alternativ a další modifikace vynálezu, a taková další využití principů vynálezu jsou odborníkem ze stavu techniky, které se vynález týká, považovány jako běžné.

Předložený vynález poskytuje bezpečné a účinné prostředky obsahující deriváty thalidomidu nebo deriváty molekuly v podstatě podobné thalidomidu, a mající funkčnost v podstatě podobnou thalidomidu. Specifickými typy derivátů uvažovanými v předloženém vynálezu jsou deriváty označované jako proléčiva, tento termín je zde používán k označení inaktvní formy léčiva, která může být enzymaticky nebo fyziologicky přeměněna na aktivní formu. Ve výhodných provedeních vynálezu je inventivním derivátem thalidomidu proléčivo obsahující navázanou odstupující skupinou, nebo oligopeptid, který je tha1 idomidovou složku s která obsahuje dipeptid hydro1yzován enzymu.

thalidomidové složky specifickou aktivitou

Obecný koncept přítomnosti léčiva v proformě (jako proléčiva) není nový. Ve skutečnosti jsou endogenní léčiva skladována jako proléčiva, dokud nejsou potřeba. Objeveni Dr. Donaldem Stinerem v letech 1960, že inzulín byl syntetizován a uložen v ostrůvku b-buněk jako proinsulin a zpracován na aktivní hormon (aktivní léčivo) specifickou proteázou, bylo prvním příkladem tohoto jevu. Předložený novým použitím konceptu proléčiv, který vynález je však nalézá maximálně výhodné ušití při poskytnutí místně specifické účinnosti thalidomidu pacientovi.

• φ • · · φ φφφφ φφφ φφφ φφφφ φ φ Φφφ φ φ « φφφ φφφ φφφφ φφφφ · φ

Vynález také poskytuje způsoby použití těchto thalidomidových proléčiv k léčení řady stavů spojených s AIDS, včetně aftozních vředů, chřadnutí, tuberkulózy, stejně jako pro léčeni HIV infekce samotné a ztráty funkčních CD4 T-buněk. Pro účely popsání vynálezu je termínem thalidomid míněno, še označuje thalidomid stejně jako v podstatě podobné molekuly, které mají v podstatě podobnou funkčnost. Z tohoto pohledu je velmi dobře známo, še mnoho léčiv a jiných molekul má neaktivní místa, která mohou být chemicky přeměněna bez podstatné změny funkčnosti jejich aktivních míst. Předpokládá se, še předlošený vynález zahrnuje proléčiva takových analogů thalidomidu, která se nepodstatně liší od thalidomidu vzhledem ke struktuře a funkčnosti.

Ve výhodném provedení se vynález týká vysoce místně specifické aktivace proléčiva na jeho aktivní formu, přičemž je tato aktivace omezena na specifické typy buněk, kde je léčivo vyžadováno k poskytnutí farmako1ogické aktivity. Ve výhodném provedení vynálezu jsou získány deriváty proléčiva thalidomidu, které obsahují thalidomidovou složku vázanou na odstupující skupinu dipeptidu, která může být odebrána hydro1ytickou reakcí katalyzovanou enzymem specifickým ke konkrétnímu typu buňky. V jednom výhodném provedení vynálezu je enzymem, který aktivuje proléčivo thalidomidu, DPP-IV. DPP-IV je substrát velice specifický ve svém účinku (např. hydro1yzovaná peptidová vazba), a je jediným enzymem, známým, který hydro lyžuje peptidickou vazbu prolinu v předposlední pozici k N-terminálηí uvolňující volný dipeptid. Biologická funkce v současnosti nejblišší k am i nokyselíně,

DPP-IV byla dobře stanovena, še je pracovní proteaza: jejím účinkem na proteiny je sestřihnout 90stupňový úhel dipeptidu doprava nebo doleva, deaktivaci substrátu.

aby bud aktivoval, nebo zahájil Podle tohoto vynálezu je tento biochemický mechanismus využíván pro aktivaci proléčivých forem thalidomidu in šitu.

Prolin, i in i nokyse 1 i na pouze savců, propůjčuje jedinečná «· · · » · ··> «·· ··· ···· · · Λ · · * omezení v uspořádání peptidového řetězce, a mnoho biologicky důležitých peptidových sekvencí obsahuje proliny s konzervovanou místní lokací. Na rozdíl od jiných aminokyselin je a-dusíkový atom prolinu částí rigidního pyrolidinového kruhu, a současně je kovalentně vázán pomocí sekundární aminové vazby na předchozí aminokyse1 i nu. Pokud je uvnitř přítomna a-šroubovice, brání rovněž stericky prolin dusíku amidu svého C-term inálηího souseda ve tvoření vodíkové vazby s karboxylem v předchozím ohybu šroubovice, a takto zavádí zauzlení 20 stupňů nebo více v a 1fa-šroubovici, Dále na rozdíl od jiných aminokyselin prolin a hydroxyprolin mohou snadněji zavádět strukturální heterogeni tu, neboť aminokyselina předchozího prolinu adaptuje bud stereoisomer cis, nebo trans konformaci, vzhledem k prolinu.

Konformační omezení, vložená motivy prolinu do peptidového řetězce, se zdají být, že obsahují důležité strukturální nebo biologické funkce, jak může být dedukováno z jejich často významně vysokého stupně konzervace v mnoha proteinech a peptidech, zejména cytokinech, růstových faktorech a receptorech vázaných na G-protein. Významný počet cytokinů sdílí X-pro sekvenci na jejich aminozakončenί (X je jednou z široké řady aminokyselin). N-terminální X-pro sekvence nepřispívají pouze k biologické aktivitě, jak bylo demonstrováno u IL-1 a IL-2, ale slouží také jako strukturální ochrana proti nespecifické proteolytické degradaci analogické C-term inálηí amidaci, acetylaci, nebo N-terminální cyklizaci na pyrog1utamovou kyselinu. Předpokládá se, že pouze ser i nová proteáza DPP-IV může štěpit Pro-Z peptidovou vazbu (vazba mezi prolinem a některou aminokyse1 inou s výjimkou prolinu na straně karboxy zakončení prolinu). Rychlost hydrolýzy je dále ovlivněna tím, zda je prolin v cis nebo trans stavu, a která aminokyselina je umístěna napravo (Z); vazba pro-pro nemůže být štěpena. Rovněž se předpokládalo, že prolyl izomerace může být zahrnuta do regulačního přesmyku. S ohledem na výše uvedené bylo zjištěno, že X-pro dipeptid je vynikající odstupující « « * · • · • · · · « · · • · · · · « ««· ··· 9 9-9 9 9 9 9 skupinou pro účely předloženého vynálezu, protože je selektivně odstraňován z proléčiva, čímž aktivuje thalidomid ve specifických anatomických místech, kde je enzym DPP-IV přítomen. Výše uvedené charakteristika, kterou přináší prolin do peptidů, je významná vzhledem k nedávným výhodám vyplývajícím z pochopení subtypů T buněk a funkční integrity jejich cytokinních systémů.

DPP je velmi místě specifická, takto poskytuje vynikající farmakoki netický profil vzhledem k thalidomidovým proléčivům podle předloženého vynálezu. Proteáza DPP-IV je ektopeptidáza vnitřní transmembrány, serinové třídy, s katalytickou částí na extracelulární straně. Je to si a1og1ykoprotein; homodimer zakotvený hydrofobní doménou

T lymfocytů krátkým aminokyselin. To je membránu ze šesti pomocným i/paměťovým i upravující proteáza s di pept i dům X - pro na je schopný vázat substráty ( jako na plazmovou intracytopíazmovým koncem výhodně znázorněno na buňkách s CD4* (CDx29^x) determinantami. DPP-IV je vysokou specifitou k substrátu vůči N-zakončení. Enzym a hydrolyzovat extracelulární cytokinní 11-2, 11-6 11-8, IFN, TNFa). DPP-IV je indukován v CL fázi následující mitogenní aktivaci T-buňky a je základem pro přechod z Cl do S fáze buněčného cyklu. V průběhu stimulace T-buněk in vitro se aktivita DPP-IV zvyšuje faktorem 4 až pikem aktivity povrchem produkovat

Exprese s buněčným kapacitě T-buňky k aktivnímu místu ve 3. nebo 4. dni spojených DPP-IV odpovídá 11-2. Látky specifické k inhibici enzymu ukázaly, že membránová vazba DPP-IV hraje klíčovou roli imunitní odpovědi zprostředkované T-buňkami.

Jak bylo popsáno výše s ohledem na předmět vynálezu, připraví se léčivo vyrobené a použité podle vynálezu tak, aby bylo v inaktivním stavu, dokud není odstupující skupina odštěpena z léčiva, čímž se stane aktivním. Ve výhodném provedení tohoto vynálezu enzym DPP-IV specifický pro tkáň vyvolává lokalizovanou odezvu, jako je například taková odezva cytokinu, že může být léčebná proti infekci HIV.

• · • » · · • · · · »» ·· β · · · · · * · «·· *·· ···· · * · · · ·

Áčko1 i v omezován dosahuj e akt i vac i se nepředpokládá. Se by byl předložený vynález ustanoveními týkajícími se mechanismů, kterými se jeho výhodných výsledku, je taková odezva vyvolána inventivního proléčiva thalidomidu.

Podle výhodného provedení předloženého vynálezu je proléčivo thalidomidu syntetizováno tak, že obsahuje thalidomidovou složku vázanou na sekvenci dipeptidu X-pro, kde X je jednou za široké řady aminokyselin a pro označuje prolin iminokyse1 iny. Syntézy thalidomidových proléčiv přípravou a navázáním dvou aminokyselin může být dosaženo použitím postupů známých ze stavu techniky. Výhodně zahrnuje proléčivo dipeptid vybraný ze skupiny sestávající z ala-pro (alanin, prolin): lys-pro (lysin, prolin) a gly-pro (glycin, prolin). Jak bylo uvedeno výše, jsou tyto deriváty dipeptidu (proléčiva) zvláštně aktivovány ektoenzymem T-buněk, DPP-IV (dipeptidy1peptidasa-1V a složka CD26).

Vynalezené proléčivo se výhodně užívá podáváním proléčiva pacientovi. Z jednoho hlediska vynález poskytuje kompozici, která obsahuje proléčivo thalidomidu podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič, a kompozice je podávána pacientovi například orálně nebo prostřednictvím injekce.

podle vynálezu je bezpečná nová a účinná která může být použita jako léčivý výrobek pro modulované zánětlivými stavy nemocemi: konkrétně HIV. Podle výhodného provedení vynálezu během podávání pacientovi se X-pro dipeptidová odstupující skupina thalidomidového proléčiva běžně odstraňuje hydrolýzou ektoenzymem DPP-IV na plazmatické membráně aktivovaných monocytů a T-buněk, čímž se uvolňuje aktivní forma thalidomidu nejblíže k místu působení. Thalidomid je tedy v podstatě nedostupný systematicky, je že bude rychle degradován, je méně pravděpodobnost i

Pro1éč i vem kompoz i ce, léčení lidské imunity a infekčními parazitickými méně pravděpodobné, sedat ivni, s menší vedlejší účinky, a bude mít teratogenní může být mnohem selektivněji cílen na »· ·«·· · · * · «·· ♦*· modulaci různých typů buněk a cytokinů, hlavně TNFa a FNFb,

IL-1, IL-2 a IL-6.

Ačkoliv byl vynález podrobně popsán v předchozím popisu, který má být považován za ilustrující jeho podstatu, a nikoliv ji omezující, je zřejmé, še byla ukázána a popsána pouze výhodná provedení, a še všechny změny a modifikace, které mohou nastat v rozsahu vynálezu, se považují za chráněné. Vynález bude dále popsán s odkazem na následující konkrétní příklady. Je zřejmé, še tyto příklady jsou rovněž ilustrativní a neomezující podstatu vynálezu.

Př i k 1ady provedeni··

PŘIKLAD 1

Experimentální projekt a metody

Syntéza

Komerčně dostupný amino-X synton se zpracuje s vhodným blokačním činidlem k zavedení blokující skupiny, která bude podporovat následnou cyklizaci amino-X synton se zpracuje na pětičlenný kruh. Blokovaný substituovaným ftalanhydridem.

Kruh je uzavřen použitím jakéhokoliv použitelného dehydratačního činidla za podmínek, kdy se neštěpí blokující skupina. Požadované transformace substituentů, které probíhají na aromatickém jádře, jsou standardní postupy, které zajišťují, aby nebyla předčasně odebrána blokující skupina. Blokující skupina se odstraní jedním ze standardních deblokačních postupů vybraných tak, aby zabránily nežádoucímu působení na ftaloylskupí nu nebo její substituenty. Peptid je vázán bud postupně nebo jako jednotka využívající konvenčních metod syntéz peptidů. Blokující skupina na peptidu, nezbytná pro své zavedení, se odebere.

Biotinylované deriváty pro determinaci vazebnosti buněčného povrchu jsou produkovány:

1

9 ·999 · «·· 99 9

Β · ·

a) vhodnou modifikací aromatického substituentu na ftaloylové části pro příjem spaceru,

b) napojením, standardními metodami peptidových syntéz čtvrtého na dvanáctý atom spaceru obsahujícího blokované terminální aminoskupiny,

c) odblokováním spaceru bez deblokace X části,

d) biotinylaci standardními postupy, a

e) deblokací na X a provedením všech dalších nezbytných reakcí.

Kultivace a příprava buněk

Leukemické buněčné linie K562 a HL 60 jsou kultivovány v mediu RPMI 1640 obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra, 0,5 % HEPES, 2 % glutaminu, a 1 % streptomyci nu /penicilinu GIBCO (Grand Island, NY). Buňky jsou kultivovány na hustotu

10⁵ buněk/ml a postupně sklízeny. Pro kultivaci periferních krevních lymfocytů (PBL) je 20 ml krve odebráno ze zdravých kontrolních vzorků do vakuovaných kontejnerů obsahujících 5 ml 1% NaFl (Becton/Dickinson). Krev se zředí Hanksovým rovnovážným solným roztokem (GIBCO) a navrství na 50% Ficoll (GIBCO). Trubky jsou sedimentovány při teplotě místnosti po 30 minut při 400 X g. Vrstva leukocytů je nasáta za sterilních podmínek po odstranění supernatantu. Leukocyty jsou promyty 10 ml Hanksova rovnovážného solného roztoku a vloženy do RPMI media s 10 % fetálního telecího séra, Hepes, glutaminem, a P/S (GIBCO) při koncentraci 10⁶ buněk/ml. Potom se přidá fytohemaglutinin (GIBCO) na finální koncentraci 1%. Buňky jsou uchovávány v kultivaci ve zvlhčovaném inkubátoru s 5% CO2 po 48 hodin při 37 °C a potom jsou sklízeny. Potom jsou buňky inkubovány různými proléčivými formami thalidomidu.

Testováni účinnosti proléčiv derivátů thalidomidu

Je známo, že ektoenzym DPP-IV na povrchu T-buněk hydrolyzuje z N-zakončení peptidových zbytků obsahujících • fe • · · ·

ala-pro. Byla produkována řada syntetických f1uorogenních substrátů, které jsou účinně hydroIyzovány DPP-IV a mohou být použity k potvrzení aktivity enzymu na T lymfocytech a různých buněčných liniích použitých pro in vitro testy. Účinnost T-buněčného DPP-IV při odstraňování zbytku ala-pro ze základní části léčiva, thalidomidu, se testuje následujícím postupem. Ve zkratce, pufrovaná suspenze dipeptidy1ových derivátů thalidomidu se inkubuje intaktem životaschopných buněk v HEPES pufrovaném ( pH 7,0) isotonickém mediu při 37 °C po dobu do 30 minut. Potom jsou buňky sed imentovány při 500 X g po 5 minut při teplotě místnosti. Supernatant se extrahuje methy1endichloridem, aby se extrahoval volný thalidomid. Methy1endichloridové extrakty jsou odpařeny a odebrány v 50 ml methanolu pro HPLC analýzu.

Alia lýzxi_JHPLC._derj_vátů_ t_h a 1 _i d o m i d u

Pufry obsahující ala-pro-thalidomid jsou inkubovány za přítomnosti T-buněk (nebo jiných buněčných linií) s měřitelnou DPP-IV aktivitou. Hydrolýzy dipeptidových derivátů jsou monitorovány analytickou HPLC. HPLC separace se provádí podle postupu Gross a Grutrer (1992), na TSK gelové koloně ODSSOTM (TosoHaas, Montgomeryvi 11e (sp PA) 250 x 4,6 mm i.d.) s mobilní fází tríethylaminofosfatu, 0,01 M, pH 3,6 (rozpouštědlo A) a acetonitrilu (rozpouštědlo B).

sloučeniny jsou urychleně degradovány na ale ne na pH 3,6. Separace je dosaženo třemi

Di karboxylové neutrální pH, stupni lineárních gradientů rozpouštědla B; 5% - 15% od 1 do minut, 15% - 25% od 10 - 20 minut, a minut, všechny při průtokové rychlosti

25%-55% od 20 do 30 1 ml za min. Vzorky jsou analyzovány na Millinium 2010 HPLC systému (Millipore

Corp. Mi 1ford, uspořádáním a Hewlett-Packard

Ma) s detektorem s 996 fotodiodovým programovatelným fluorescenčním detektorem

1046A. Identita sloučenin je potvrzena srovnáním UV absorpčného spektra s knihovnou thalidomidových der i vátu.

·· ·*··

9 9 9 9 9 9 9 999 999

9 9 9 9 · 9 9 9 ·

Zkouška DPP-IV účinnosti na T buňkách a jiných buněčných linií ch

Jelikož bylo prokázáno, že thalidomid moduluje úroveň

CD26 na T-buňkách (23), je syntetickými fluorogenními Products, Dublin, CA), Tyto ala-pro navázaný na tr i f1uormethy1kumar i n.

DPP-IV aktivita monitorována substráty (Enzyme Systems substráty obsahuj í odstupuj í c í di pept i d skupinu, analyzován

500 x g po 5 min a analýzu. Aktivita DPP-IV korelována s nalezenými thalidomidových derivátů

Trif1uormethy1kumarin je spektrof1uori metrem Fischer 4000. 2 x 10® buněk je inkubováno mM a1 a-pro-trif1uoromethy1kumarinem v isotonickém HEPES, pufru o pH 7,8 po 2 až 30 minut. Buňky jsou šedimentovány při supernatant nasát pro fluorescenční na T-buňkách je kvantifikovány a výsledky uvolňování volných z dipeptidylového proléčiva lymfocyty obsahujícími DPP-IV. Použitím monoklonálních protilátek při kvantifikaci DPP-IV hladin na Τ-1ymfocytech je stanovena korelace mezi hladinami tohoto enzymu s hladinou vazebnosti a absorpcí derivátů thalidomidu.

Vazebná spécifi ta proléčiva_nebo uvolňovaného léčiva

Deriváty thalidomidu jsou konjugovány s biotinem přes R -aminoskupinu ftalimidové části. Bíotínové konjugáty Lha 1 idomidového derivátu jednou navázány na, nebo odebrány, cílovou buňkou, jsou kuplovány s přidaným FITC-konjugovaným avidinem a následně kvantifikovány průtokovou cytometrií. Stanovení množství avidinu-FITC je použito ke stanovení vazebnosti thal idomidových derivátů na cílové buňky a analýze CD4 a/nebo jiného povrchového markéru fluorescence (např. CD26) použitím PE-kupí ováných monoklonálních protilátek. Takto je kvantifikována vazebnost/absorpce thalidomidových derivátů na specifických T-buněčných subsetech. Konkrétně, 2 χ 10*⁵ PHA-st i mul ováných PBL ve 100 ml PBL, pH 7,2, je inkubováno s 10 ml avidinu-FITC, 10 ml CD-4-PE (phcoerythr i nu) a/nebo CD8-tricoloru (Bectin Dickinson) flfl »··· • flflfl • fl flfl • fl · flfl · flflfl· • flfl flflfl flflfl· • fl flfl·· flfl flflfl flflfl • flflfl fl··· · · (Dolbeare a kol. 1996). Vzorky jsou promyty 5 ml PBL a sedimentovány při 500 x g po 5 min. Potom jsou vzorky odebrány v 1 ml PBL pro analýzu v průtokovém cytometru.

Barvení PBL stimulovaných PHA pro povrchové antigeny

PHA-stimulované PBL jsou sedimentovány při 500 x G po 5 min při teplotě místnosti. Kultivační medium supernatantu je vylito a pelety se ponechají sušit. Potom jsou buňky promyty 5 ml PBL (0,15 M NaCl, 0,02 M fosforečnanem sodným, pH 7,2), a potom sedimentovány při 500 x g nebo 5 min při teplotě místnosti. Supernatant se vylije a přidá se 100 ml PBL, buňky se resuspenduj! a inkubují s 10 ml CD3-phcoerytbri nu, (Dako, Burlingham, CA) a CDS-phcoerytbrin/kyaninu 5 , (Caltag Laboratories, South San Francisco, CA) po 15 min při redukovaném osvětlení při teplotě místnosti. Přidá se 5 ml PBL a buňky jsou resedimentovány, jak je popsáno výše. Buněčná peleta je sušena a resuspendována v 1 ml PBL pro analýzu průtokovou cytometrií.

Analýza průtokovou___cytometri í

Získání dat se provádí průtokovým cytometrem FACSort (Becton/Dickínson, San Jose, CA) vybaveným 15mW aronovým iontovým laserem a dvojitým diskriminačním modulem s použitím softwaru LYDYD II (Becton/Dickínson). Zařízení je kalibrováno před datem získávání dat použitím nebarvených PBL. Kompenzace fluorescence se provádí elektronicky použitím CD4-FITC/CD8-PE a CD8-PE/Cy5 barvených periferních krevních lymfocytů. Pro každé měření je spojeno alespoň 20 000 případů a informace o nich jsou uloženy. Pro analytická data jsou použity softwar PAINT-A-GATE PRO a ATTRACTORS (Becton/Dickínson) po konvertování souborů dat Consort32 na systém Apple 7,1 přes software CONSORT FILÉ EXCHANGE (Becton/Dickínson).

4444 44 4444 44 44

4 44 4 4444

444 444 4444

4444 44 444 444 > 4 4 4 4444 4 4

Test TNF-a

Nový důkaz předpokládá, že thalidomid může potlačit produkci TNF-a monocytů, a ěe IL-2 produkce je zvýšena v normálních monocytech z individuí ošetřených tha1 idomidem. Pro testování účinků derivátů thalidomidu na TPA-indukovanou TNF-a se použije kit od Amersham pro ELISA testování lidského TNFa v buňkách HL60 . Do buněčných kultur jsou přidávány různé koncentrace testovaných derivátů thalidomidu (0,1 - 10 nM). TNF-a je stanovena testem ELISA, jak je doporučeno dodavatelem.

Stanoveni produkce IL-2

Produkce IL-2 v lidských periferních krevních lymfocytech (HPBL) je monitorována Elísa testem použitím monoklonální anti-IL-2 protilátky z DKO. 2 až 4 x 10⁶ HPBL stimulovaných s PHA po 48 hod je inkubováno roztokem monoklonální protilátky (10 ml) po 20 min v ELISA testu, podle pokynů dodavatele.

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kompozice vhodná pro selektivní léčení aftozních vředů, chřadnutí, tuberkulózy, demence, horečnatých onemocnění, únavy, HIV infekce a ztráty funkčních CD4 T buněk, vyznačující se tím, že obsahuje thalidomidovou složku, k níž je připojen dipeptid vybraný ze skupiny sestávající z ala-pro, gly-pro a lys-pro.
2. 2. Kompozice podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že uvedený dipeptid obsahuje sekvenci X-pro; kde X znamená aminokyselinu.
3. 3. Kompozice podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že uvedený dipeptid obsahuje sekvenci ala-pro.
4. 4. Způsob přípravy proléčiva thalidomidu, vyzná čující se tím, že zahrnuje připojení prolinu a druhé aminokyseliny k thalidomidu tak, že druhá aminokyselina je N-terminální aminokyselinou a prolin je v předposlední pozici k N-terminální aminokyselině.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačuj ící se t i m, že druhou aminokyselinou je alanin.
6. 6. Způsob podle nároku 4, vyznačuj ící se t í m, že druhou aminokyselinou je glycin.
7. 7. Způsob podle nároku 4, vyznačuj ící se t í m, že druhou aminokyselinou je lysin.