JPS62500383A - シクロスポリン類に対するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 シクロスポリン類に対するモノクローナル抗体本発明は、シクロスポリン類に対 するモノクローナル抗体、特にシクロスポリン類とその代謝産物とを識別でき、 診断／アツセイキ、ソト中での使用に好適なモノクローナル抗体、ならびに該モ ノクローナル抗体の製造に使用する新規ハイブリドーマセルライン、および該モ ノクローナル抗体を含む診断／アッセイキットに関する。さらに本発明は、上記 モノクローナル抗体の産生に有用であり、かつ診断／アッセイキットの使用に好 適な通常のポリクローナル抗血清の産生にも有用である、新規シクロスポリン類 およびこれを含む免疫原性コンジュゲート、ならびに生成物の抗血清および抗体 、およびこれらを含む診断／アッセイキットに関するらのである。さらに本発明 は、該新規シクロスポリン類の標識化誘導体、診断／アッセイキットの用途に好 適な同誘導体、ならびにこれらを含む診断／アッセイキットに６関するものであ る。

シクロスポリン類は、共通して、薬理活性、特に免疫抑制、抗炎症および抗寄生 虫活性を有する、構造が特有の環状ポリ−Ｎ−メチル化つンデカペプヂドの一群 を包含する。最初に単離されたツクロスボリン類は、シクロスポリンＡとしても 知られる、天然に存在する真菌の代謝産物としての「シクロスポリン」であり、 式（Ａ）：［式中、−ＭｅＢｍｔ−は、式（Ｂ）：Ｈ３ ［式中、−ｘ−ｙ−は−ＣＨ＝　ＣＩ■−（１−ランス）である」で示されるＮ −メチル−（４Ｒ）−４−ブタ−２Ｅ−エン−１−イル−４−メチル−（Ｌ）ス レオニル基であるコで示される。

最初の「シクロスポリン」の発見以来、非常に様々な天然に存在するシクロスポ リン類がｍ離かつ同定され、さらに、多くの非天然シクロスポリン類が、完全な らしくは半合成的手段により、または改良した培養技術の応用により、製造され てきた。したがって、シクロスポリン類によって包含される群は現在数多くあり 、これには例えば天然に存在するシクロスポリンΔ〜Ｚ［コーベル等のヨーロピ アン・ジャーナル・オン・アプライド・ミクロバイオロジー・アンド・バイオテ クノロジーＺａ２３７〜２４０頁（１９８２）およびトウニンティ・フォース・ インターサイエンス・カンファランス・オン・アンチミクロバイアル・エイノエ ンツ・アンド・ケモセラピー（ワシントン、１９８４年１０月８日〜ＩＯ日）に おいてトレーバー等により、掲示されたポスターを参照されたいコ、ならびに、 ジヒドロシクロスポリンｍ（これにおいては−ＭｅＢｍｔ−基の−ｘ−ｙ−基の （上記（ｒ３）参照）が飽和している。例えば米国特許第４１０８９８５号、４ ２１０５８１号および４２２０６４１号に開示のとおり。）、−ＭｅＢｍＬ−基 が異性体形またはＮ−デスメチル形で存在しているシクロスポリン類［欧州特許 第００３４５６７号および「ツクロスボリンＡｊ（プロシージャー・オン・イン ターナショナル・カンファランス・オン・シクロスポリンＡ１ケンブリツジ（英 国）、１９８１年９月、Ｄ、Ｊ、Ｇ、ホワイト編、エルセヴイーア・プレス（１ ９８２））を参照されたい。両省共にＲ，ウェンガーにより開発されたシクロス ポリン類の製造のための全合成法を記載している。］およびペプチド配列内の特 別な位置に種々のアミノ酸が組み込まれたシクロスポリン類を含む、種々の非天 然または人工的シクロスポリン類が包含される。上記の参考文献に開示されてい るこのようなシクロスポリン類の例には、例えば［Ｔｈｒ］′−１［Ｖａｌ］” −１［Ｎｖａ］’−および［Ｎｖａ］’　−［Ｎｖａ］５−シクロスポリン（各 々シクロスポリンＣ，ＤＳＧおよびＭとしてら知られている）ならびにジヒドロ −［Ｖａｌｌ’−シクロスポリン（ジヒドロシクロスポリンＤとしても知られる ）が包含される。

［現在慣例となっているシクロスポリン類の命名法に従い、本明細書および請求 の範囲を通じてこれらを「シクロスポリン」（即ちシクロスポリンＡ）の構造を 参考にしてここに定義する。これは、まず「シクロスポリン」に存在するのとは 異なる分子中の残堰を示し、次に「シクロスポリン」に存在するのと同一のその 他の残店を特徴付けるために”シクロスポリン”という、悟を適用することによ って行なう。同時に、−Ｍ　ｅ　１１　ｍ　ｌ　−Ｗが水素化されている（−ジ ヒドａ−！ｖ１ｅｒ３ｍＬ　）、叩ら式（１１）の−ｘ−ｙ−が−ＣＩＩ　２− 　ＣＩ　２−であるシクロスポリン類を表すために、接頭辞“ジヒドロ”を使用 する。したがって、［Ｔ　ｈｒ］　”−シクロスポリンは、２位の一αＡｂｕ− が−Ｔｈｒ−に置き換わっている外は式（Ａ）で示される配列を宵するシクロス ポリンであり、ジヒドロ−［Ｖａｌ］’−シクロスポリンは、１位の−ＭｅＢｍ ｔ−が水素化されており、２位の−αＡｂｕ−が−Ｖａｔ−に置き換わっている 外は式（Ａ）で示される配列を存するシクロスポリンである。

さらに、略語、例えば−Ａｌａ−１−Ｍｅｖａｌ−等・・・によって示されるア ミノ酸残基は、慣用的用法に従い、別途指示のない限り（Ｌ）配置を汀するしの と理解すべきである。ｒ　Ｍ　ｅ　Ｊを冠した残基の略語は、−Ｍ　ｅ　Ｌｅｕ −の場合のようにＮ−メチル化残基を表わす。シクロスポリン分子の個々の残基 は、先行文献にしたがって、右回りに、かつ１位の−ＭｅＢ　ｍｌ−（または− ジヒドローＭｅＢｍｔ−基から出発して番号を付す。同じ番号順序を本明細書全 編にわたって使用する。］その独特な免疫抑制活性の故に、シクロスポリン類は 、医学および学界のみならず専門外の雑誌においてらかなりの注目を集めてきた 。「シクロスポリン」自身は現在市販品を人手でき、同種器官、例えば心臓、心 肺、腎臓および骨髄の移植後の拒絶防止のために、そしてより最近では種々の自 己免疫および関連疾患および病聾の処置に広く使用されている。ジヒドロ−［Ｖ 　ａｌ］　”−シクロスポリンおよび［Ｎ　ｖａ］　”−シクロスポリンの両者 は、「シクロスポリン」に次ぐ可能性ある後継物質として、目下詳細な臨床的研 究下にある。

しかしながら、シクロスポリン類、例えば「シクロスポリン」の投薬は著しい困 難を示す。代謝上の変換速度がｒオ者に特異的であり、また治療範囲が狭いため 、有効用量は対象に極めて特異的であって、適当な個々の血清レベルの確立を必 要とする。したがって、シクロスポリンの血漿中濃度の日常的監視は、有効な処 置に必須の先行条件である。この目的のために数多くの高速液体クロマトグラフ ィー（ＨＰＬＣ）、ラジオイムノアッセイＯｔ　ｒ　Ａ）およびフルオロイムノ アッセイ（Ｆ’ｌＡ）系が開発された。しかしながら、ＨＰ　Ｌ　Ｃ法は極めて 特異的ではあるものの実際の使用は困難で煩わしく、また現在市販されており入 手可能な羊のポリクローナル抗血清に基づ＜ｒｔｌＡ系は、その特異性の欠如の 故に批判を受けている。したがって、人間に治療のため投与したシクロスポリン 類とその代謝産物とを識別することのできるシクロスポリン（例えば［シクロス ポリンＪ）特異性モノクローナル抗体の開発は、長い間純化学的目標であると共 に緊急の実用上の目標であった。何故ならばこれは、ＨＰ■７Ｃ法と同じ可能性 のある特異性を与えるという利点を有し、一方常套の免疫アッセイ系により提供 される適用の簡便さという利点を保持しているからである。加えてこのようなシ クロスポリン特異性モノクローナル抗体の供給は、例えばシクロスポリンの配置 の比較研究およびシクロスポリンレセプターの必要条件の定義付は等を可能にす る重要な新しい研究手段を提供することになる。

「シクロスポリン」の最初の発見以来、シクロスポリン類に反応するモスボリン 類、例えば「シクロスポリン」は、自身殆んど免疫原性が無いため、通常の研究 は、例えばハブテン・蛋白のような免疫原性コンジュゲート（例えば、縮合剤と してＥＤＣＩ［Ｎ−エチル−Ｎ’　−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ イミド・２８Ｃ１２］またはＭＯＤＩ［Ｎ−シクロへキシル−Ｎ′−［β−（Ｎ −メチルモルホリノ）エチル］−カルボジイミド・　ｐ−トルエンスルホナート コを使用する常套の結合技術を用いて、［Ｔｈｒ］”−シクロスポリン中の−Ｔ 　ｈｒ”−の位置で利用できるヒドロキシ基を介した免疫グロブリンの結合によ って誘導される）を使用して進められてきた。この方法による試みはしかしなが ら失敗し、モノクローナル抗体が得られると、これは、「シクロスポリン」に対 し比較的低い特異性を有し、または「シクロスポリン」ではなく担体の蛋白質も しくは使用された縮合試薬について特異的であり、または縮合試薬と高度に交差 反応性であることがわかった。例えば「シクロスポリン」とその代謝産物（例え ば、後に個別的に記載する代謝産物シクロスポリン１７およびシクロスポリン１ ８）間を識別するものとして同定され得るモノクローナル抗体を産生ずることが 可能であると判明した例は全くない。さらに、このような試みは、１ｇＭ型の「 シクロスポリン」に対するモノクローナル抗体のみの生産を導いた訳であり、よ っていずれにせよ、通常の、例えば臨床用のアッセイキットのとの形においてら 本質的に使用が不適当であった。したがって、シクロスポリン類との特異的反応 性を有し、個々のシクロスポリン類とその代謝産物、例えば「シクロスポリン」 と人間におけるその代謝産物とを識別することができ、アッセイ系での使用に好 適なモノクローナル抗体の生産は、今なお大きな目標のままである。

この度驚くべきことに、本発明に従うことにより、もしコンジュゲートが活性化 結合基を妹分として担体とシクロスポリンの結合によって製造されるならば（例 えばコンツユゲート合成が、出発物質として活性化結合基を有するシクロスポリ ンを用いて行なわれるならば）、最初の免疫処置の段階でハプテンとしてシクロ スポリンを含む免疫原性コンジュゲートを使用する、本質的に慣用的な免疫処置 ／融合／クローニング技術を介して、シクロスポリン類に反応性で、かつ上記で 論じた種々の目的に合致し、特にシクロスポリン類とその代謝産物との識別が可 能である、モノクローナル抗体が生産できることがわかった。特に、この免疫原 性コンジュゲートを使用するならば、例えば「シクロスポリン」の場合、「シク ロスポリン」とは反応性であるが、例えばその代謝産物であるシクロスポリン１ ７および／またはシクロスポリンＩ８とは低い交差反応を示す、というように、 ツクロスボリン類と個々の残基上に用異する基り月個しかない代謝産物との間の 細かな区別ができるモノクローナル抗体を得ることができる。

例えば臨床上の使用のための簡便なモノクローナルアッセイ系の開発手段を遂に 提供できたことに加えて、本発明はさらに、ツクロスボリン代謝産物のさらに進 んだ精製手段、および、本発明に係る一般的方法の適用によってモノクローナル 抗体（これはレセプター部位と類銀し得る）が得られるであろうことが予想され ることから、可能性ある内性シクロスポリン様分子の性格決定手段をも提供する 。このように、実用的および純科学的見地の両方から本発明の重要性は容易に明 らかであろう。

上記に指摘するように、本発明の実施に必要な免疫原性コンジュゲートは、活性 化結合基を介して、担体、例えば蛋白質分子とシクロスポリンとを直接結合させ ることによって製造する。これは、活性化結合基を有する担体と、適当な相互反 応性置換基、例えばヒドロキシまたはアミノ基を有するシクロスポリン（例えば 後述する［Ｔ　ｈｒ］　’−シクロスポリンまたは［（Ｄ）Ｌｙｓｌ’−シクロ スポリンの場合のように）との反応、または、担体と、活性化結合基を有するシ クロスポリン（例えばシクロスポリン分子中に存在するアミノ基残基の１個が、 α炭素原子上に活性化結合基を含むまたは有する側鎖を持っているシクロスポリ ン）との反応のいずれかによって行なうことができる。したがって、例えば通常 のポリクローナル抗血清の生産のためにかって当分野で用いられた、シクロスポ リンをハブテンとして含む免疫原性コンジュゲートの場合のように、該コンジュ ゲートは、介在する結合剤の基を介してではなく直接担体基に結合するハプテン 基、シクロスポリンを含むものである。

本明細書および特許請求の範囲全編にわたって使用する「活性化結合基」という 語は、反応の実施または促進を可能にする縮合剤の使用を必要とせずに、適当な 相互反応性基、例えばアミノ、ヒドロキシ、チオ堰等と直接反応して共有結合を 提供することのできる任意の基である、と解するべきである。したがって「活性 化結合基」を有するシクロスポリン類の場合、これは、担体分子との反応または 結合を起こすまたは促進することのできる結合試薬の使用を必要とせずに、担体 分子、例えば蛋白質分子と直接反応して当該担体分子と共有結合したコンジュゲ ートを供給することのできる任意の基、ということになる。

活性化結合基として適当な基は当分野でよく知られており、例えばｉ）活性化エ ステルまたは活性化カルボキシ基、即ち式ニーｃｏ−ｏｚｃ式中、Ｚは、０−ま たはｐ−ニトロフェニル、ｌ−ベンズトリアゾール、ペンタフルオロフェニルま たはＮ−スクシンイミドのようなカルボキシ活性化基である］で示される基；１ １）活性化ジチオ基、即ち式：　−Ｓ−−Ｘ ［式中、Ｘは２−ピリジルのようなジチオ活性化基である］で示される基；およ び１ｉｉ）エポキシ基が含まれる。

活性化結合基、例えば前記のようなエポキシ基を有する適切な免疫原性コンジュ ゲートの担体分子は、当分野で既知の技術、例えばラウメン等によりテトラヘド ロン・レターズ２６巻（４）、４０７〜４１０頁（１９８５）に記載された技術 に従って製造することがである。しかしながら本発明に係る一般的方法に従う場 合、活性化結合基は担体に結合すべきシクロスポリン上に配されるのが好ましく 、その逆ではない。

原１１すとして、活性化結合基はツクロスボリン分子のどの位置に１７　（１： していてもよい。シクロスポリンの代謝において１位での変換か特に重要であり 、または主たるシクロスポリン代謝産物（例えば「シクロスポリン」の場合に関 してはシクロスポリン１７およびシクロスポリン＋８）が下記のように１位にお ける構造上の変化を示すので、活性化結合基は２〜ＩＩ（１（両端の数を含む） のうちの１箇所または１箇所以外に存在ケるのが好ましく、その結果、続いて得 られる免疫原性コンジュゲートにおいて、１位の括は、好ましくは担体により「 マスクされずに」そのまま残り、したがって特異的抗体応答の導出がで３る。一 般に活性化結合基は２位または３．５〜８もしくは１０位のいずれか、特に５〜 ８位（両端の数を含む）にある時適当てあり、したがって２および８位が特に好 ましい。

「ツクロスボリン」の場合、人間に起こる主要な代謝上の変換は、１、−ＭｅＬ ｅｕ９−が末端のヒドロキシ化によって式で示される括となること。

Ｉｌ、　−Ｍａｒ３ｍｌ’−が末端のヒト〔ｌキシ化によって式て示される基と なること。

ｍ、−ＭｅＬｅｕ’−がデス−Ｎ−メチル化によって−Ｌｅｕ−となることＩＶ 　、　−ＭｃＬ　ｅｕ’−が末端のヒドロキシ化によって上記（Ｅ）で示される 基となること。

Ｖ、−ＭｅＬｅｕ’−か末端のヒドロキシ化によって上記（Ｅ）で示される基と なること： Ｖｌ、　−Ｍｅ１３ｍｔ’−が末端のヒドロキシ化および閉環によって式（Ｇ） ：ツクロスボリン８等々と称される）は、以下のような代謝上の変化を示す。

シクロスポリンＩ：［０シクロスポリン８：［＋ＩＩ、シクロスポリン９：Ｉ＋ ｍ＋Ｖ、シクロスポリン１０・Ｉ＋ＩＶ。シクロスポリン１６：ｌ＋■。シクロ スポリン１７：ＩＩ。シクロスポリン１８：ＶＩ。シクロスポリン２１；■。

［Ｇ、モーラ−等、「ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスボッジョン」１ ２巻、１２０〜！２６頁（１９８４）を参照されたい。コしたがって、「シクロ スポリン」と人間におけるその代謝産物とを識別できるモノクローナル抗体を製 造するためには、免疫原性コンジュゲートの形成に使用するシクロスポリン中の 活性結合基を１．４．６または９位以外の位置に定めるのが適当であり、またシ クロスポリンＩ７およびＩ８が主たる代謝産物である場合は、少なくとも１位以 外であるのが適昂である。さらに特定のシクロスポリンの場合には２および８位 が特上記のような活性化結合基を有するシクロスポリン類は、例えば、１）既に 存在する適当な前駆基（即ち非活性形の結合基）の活性化、例えばカルボキシ置 換α−アミノ酸残基（即ち、α−炭素原子の位置にカルボキシ基を含むまたは有 する側鎖を有するα−アミノ酸残基）を例えば２または８位に有するシクロスポ リンのカルボキシ基を、カルボキシ活性化剤との反応によって活性カルボキシ基 に変換すること；または、 ｉｉ）アミノまたはヒドロキシ置換α−アミノ酸残基（即ち、α−炭素原子の位 置にヒドロキシまたはアミノ基を含むまたは有する側鎖を有するα−アミノ酸残 基）、例えば２位のヒドロキシ置換α−アミノ酸残基、または８位のアミノらし くはヒドロキシ置換α−アミノ酸残基を有するシクロスポリンを、活性化結合基 を有するアシル化またはアルキル化剤によってアシル化またはエーテル化するこ と、のいずれかによって製造できる。

上記工程１）は、例えばカルボキシ基の活性化のために、０−もしくはｐ−ニト ロフェノール、１−ヒドロキシ−ベンズトリアゾール、ペンタフルオロフェノー ルまたはＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドのような通常のカルボキシ活性化剤と 反応させるといったような、当分野で知られている標準的技術に従って実施する ことができる。反応（よ、ＥＤＣ［のごとき縮合剤の存在下に行なうのが適当で ある。

工程１１）らまたは本質的に常套の技術に従って実施することができる。

例えば、アミノまたはヒドロキシ語は、カルボキン基が活性化されており、それ に加えて、例えばＮ［（２−ピリジル）ジチオ−プロピオン−■−イルコースク シンイミドの場合のように［（２−ピリジル）ジチオ基が活性化結合基（この例 ではアミノおよびヒドロキシ基の両者と非反応性）を与え、−０００−スクシン イミド基がアシル化の実現のための活性化カルボキシ基を与える］、アミノまた はヒドロキシと非反応性の活性化結合基を何しているカルボン酸の誘導体との反 応によって適切にアシル化され得る。反応は、ジクロロメタンのような不活性溶 媒または希釈剤中で、例えば周囲温度で適切に実施される。別法として、例えば ラウメン等の上記引用文献に記載されている概括的方法に従って、エピクロルヒ ドリンまたはエビブロムヒドリンのような当分野で知られているこの目的のため の種々の試薬のうちいずれかを使用して、ヒドロキシするエポキシを導くことが できる［このエポキシ基が活性化結合基を提供する］。

上記工程１）のためのンクロスボリン出発物質は、例えば２または８位にカルボ キシ置換α−アミノ酸残基をｒＴするシクロスポリンの生成のための工程１１） の方法と同様にして、１１１）アミノまたはヒドロキシ置換α−アミノ酸残基、 例えば２位のヒドロキシ置換α−アミノ酸残基または８位のアミノもしくはヒド ロキシ置換α−アミノ酸残基、を有するシクロスポリンを、ａ）存在するカルボ キン基の一方が保護形であるノカルボン酸、またはｂ）例えば無水コハク酸のよ うな無水ンカルボン酸のいずれかと反応させる（ただしａ）の反応の場合、引き 続き生成物シクロスポリン中のカルボキシ基の脱保護を行なう）ことにより、 製造することができる。

反応工程ｉｉｉ　）もまた、本質的に常套の方法を用いて、例えば、４−ジメヂ ルアミピリジンのような酸結合剤の存在下に、不活性有機溶媒または希釈剤中で 、周囲温度またはわずかな昇温下で実施することができる。

カルボキシ保護基を方法ａ）のように使用する場合、これは全く常法であって、 かつ全く常套の技術によって除去することができる。

ヒドロキシ置換α−アミノ酸残基を有する工程！ｉ）およびｉｉｉ　）のための ンクロスボリン出発物質には既知のシクロスポリン類：　［Ｔｈｒ］’−シクロ スポリンおよび［（Ｄ）Ｓｅｒ］”−シクロスポリンが含まれ、後者は、上記の ツクロスボリン生成のための全合成法の一般的技術に従った、または発酵技術に よるその製造法と共に、例えば欧州特許第００５６７８２号に開示および特許請 求されている。ヒドロキシ置換α−アミノ酸残基を例えば８位に有する他のシク ロスポリン類は同様に製造または取得でき、［（Ｄ）Ｔｈｒ］”−シクロスポリ ン、［Ｍｖａ］’　−［（Ｄ）Ｓｅｒ］’−シクロスポリン、および［Ｔｈｒｌ ’−［（Ｄ）Ｓｅｒ］＠−シクロスポリンを含むその他の様々なこうしたシクロ スポリンは米国特許出願第７１３２５９号（１９８５年３月１９日出願）−四ド イツ出願第Ｐ３５０９８０９．Ｏ号（１９８５年３月１９日出願）−フランス出 願第８４０４１７２号（１９８５年３月１９日出願唐オーストラリア出願第４０ ２７２／８５号（１９８５年３月２２日出願）ミ英国出願第８５０７２７０号（ １９８５年３月２０日出＠）′Ｅ−ニューシーラント出願第２１１５２６号（１ ９８５年３月２１日出願）三重アフリカ出願第８５／２１９５号（１９８５年３ 月２２日出願）に記載かつ特許請求されている。

アミノ置換α−アミノ酸残基を存する好ましいシクロスポリン類は、該アミノ酸 残基が８位にあるものであり、８位の残基が−（Ｄ）ｌｙｓ−であるシクロスポ リンる類が特に好ましい。このようなシクロスポリン類もやはり、シクロスポリ ンの生成のためにＲ・ウェンガーによって開発された全合成法の一般的技術に従 って、例えば、１ｖ）８位にアミノ置換α−アミノ酸残基を有するシクロスポリ ン（このシクロスポリンは保護形である）の脱保護、例えば８位の残基がＮ−ε −保護形の−（Ｄ）Ｌｙｓ−であるシクロスポリンの脱保護または ■）生成物シクロスポリンの配列を有する直鎖ウンデカペプチド（このウンデカ ペプチドは遊離または保護形である）、例えば生成物シクロスポリンの８位に相 当ケる位１斤にａ離またはＮ−ε−保護形の−（Ｄ）Ｌｙｓ−残基を含むウンデ カペプチド、を環化し、必要ならば工程１髪）を実施する、 ことによって製造できる。

工程ｉｖ）およびＶ）は特に、後述する実施例１に例示される一般的方法に従っ て実施できる。

」二足工程ｉ）、ｉｉ）および！１１）の記載から理解されるように工程ｌ）ま たは１１）の生成物は通例、アシルアミノ−、アシルオキシ−またはアルコキン −またはアルコキノ−置換α−アミノ酸残基（即ち、α−炭素原子の位置にアン ルアミノ、アシルオキシまたはアルコキシ基を含むまたは（Ｔする側鎖を有する α−アミノ酸残基）を有するシクロスポリン類、例えば、２位のアシルオキシら しくはアルコキン置換α−アミノ酸残基、または８位のアシルアミノ、アシルオ キシらしくはアルコキシ置換α−アミノ酸残基を有するシクロスポリン（ここで 活性化結合基はアシル／アルキル基上に存在する）を包含する。

この事は、上記工程ｉ）〜Ｖ）の一般的方法による特定の群のシクロスポリン類 の生成を例示する以下の反応式を参照することによって、より容易に理解するこ とができる。

以下の式（Ｉ　ａ）〜（１（１）、（ＩＩ　ａ）〜（ＩＩ　ｄ）および（［１） において、Ｃ配列−−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−を表わず。

１０　ＩＩ 〈反応工程１）〉 Ａ’＝−ＭｅＢｍｔ−であり、 Ｂａ’＝−（０−アシル）−Ｔｈｒ−［ここでアシル基は、非活性化形の結合基 、例えば遊離のカルボキシ基を有する］、例えば−（０−ヒドロキシスクシニル ）−Ｔｈｒ−であり、 Ｄ’＝−（Ｄ）Ａｌａ−である］ ［式中、 Ａ１およびＤＩは」二足に示される意義を何し、＋（ｂ’＝−（０−アシル）− Ｔｈｒ−［ここでアシル基は、活性化結合基、例えば活性化力ルボギノ基を有す る］、例えば−（０−アシル）−Ｔｈｒ−［ごこてアシルＪＪ＞は式：　ＺＯ− Ｃｏ−（ＣＩ（２）２−Ｇｏ−［式中、Ｚはカルボキノ活性化括てめろ］をイイ オろ］てある。

「式中、 Ａ２−＝−〜ｂ！Ｂｍｔ−かつＢ’＝−αＡｂｕ−または−Ｎｖａ−であけるか 、まには、 ・＼２＝−ノヒトｌ：ｌ−〜Ｉｃ１３ｍｔ−かっＢ’−−Ｖａｌ−であり、１〕 ３２−アノルアミノ置換（Ｄ）α−アミノ酸残基、例えば−（Ｎ−ε−ヒｌ：’ 　ｃｌキツスクツニル）　（１））Ｌｙｓ−のごとき−（Ｎ−ε−アシル）−（ １））キシ基ををするコである］ ［式中、 Ａ２およびＢ２は上記に示される意義を有し、Ｄｂ”−アンルアミノ置換（Ｄ） α−アミノ酸残基、例えば−（Ｎ−ε−アシル）−（Ｄ）ＬｙＳ−［ここでアシ ル基は式：　ＺＯ−Ｃｏ　（ＣＨｔ）ｔ　ＣＯ−［式中、Ｚは上記に示される意 義を有する］を有する］のごとき−（Ｎ−ε−アシル）−（Ｄ）Ｌｙｓ−［式中 、アシル基は、活性化結合基、例えば活性化カルボキン基を有する］である］く 反応工程ｉｉ＞ ＡＩおよび■）Ｉは上記に示されるＱ義を有し、ｒ３　ａ’　＝　−Ｔ　ｂｒ− である］Ｅ式中、 Ａ１およびＤｌは上記に示される意義を有し、ｒ３ｂ’−（０−アルキル）’ｌ ’ｂｒ−［ここでアルキルは、基は、活性化結合基、例えばエポキシ基を有する ］、例えば−（０−エポキシメチル）−ＴＡ２およびＢ２は−に記に示される図 表を有し、Ｄａ３＝アミノ置換（Ｄ）α−アミノ酸残基、例えば−（Ｄ）Ｌｙｓ −であるコ［式中、Ａ２およびＢ２は上記に示されろ意義を有し、Ｄｂ’−アソ ルアミノ置換（Ｄ）α−アミノ酸残基、例えば−［Ｎ−ε−（３−（２−ピリジ ル）ジヂオープロビオンーｌ−イル）］−（Ｄ）Ｌｙｓ−のような−（Ｎ−ε− アシル）（Ｄ）Ｌｙｓ−［式中、アシル基は活性化結合基を何する］であるコ 〈反応工程出）〉 ａ）上記に定義される式（ｌ　ｃ）のシクロスポリン上記に定義される式（Ｉａ ）のシクロスポリンｂ）上記に定義される式（Ｉ　ｄ）のシクロスポリン上記に 定義される式（Ｉ　ｂ）のシクロスポリンく反応工程１ｖ）〉 Ａ！およびＢ２は上記に示される意義を有し、Ｄａ’＝アミノ置換（Ｄ）α−ア ミノ酸残基、例えば−（Ｄ）Ｌｙｓ−の保護形上記に定義される式（Ｉ　ｄ）の シクロスポリン〈反応工程ｖ）＞ １ｌ−Ｄａ’−Ｅ−Ａ”−Ｉ３’−Ｃ−ＯＨ（ＩＩＩ）［式中、 Ａ２およびＢ″は上記に示される意義を有し、Ｄａ’−アミノ置換（Ｄ）α−ア ミノ酸残基、例えば−（Ｄ）Ｌｙｓ−の遊離または−Ｎ−ε−保護形であるコ ↓ 上記に定義される式（Ｉｄ）または（Ｉｅ）のシクロスポリンこの時点で、−Ｍ ｅＢｍｔ−および−ジヒドａ−ＭｅＢｍｔ−の３′位のヒドロキシ基は比較的反 応性が低いことに留意されたい。その結果、上記の工程が、２〜１１位のいずれ か１箇所にヒドロキシ置換α−アミノ酸残基を汀する（例えば２位に−Ｔｈｒ− 有する）シクロスポリン類の反応を含んでいる場合、当該残基のヒドロキシ法と の反応は、−ＭｅＢｍｔ−または−ジヒドローＭｃＢｍｔ−のヒドロキシ基との 反応に優先し、したがって、望ましくない後者との副反応が容易に回避され得る 。

上記の式（Ｉｂ）、（Ｉ［ｂ）、（［ｄ）、（Ｉｌｄ）、（ｌ　ｅ）および（Ｉ ＩＩ）において、Ａ雪およびＢ″は好ましくはそれぞれ−ＭｅＢｍｔ−および− αＡｂｕ−を表わす。

以上の全記載を通じて、シクロスポリン類が８位に特定の基を存するものとして 示され、かつその基の配置が明記されていない場合、（Ｄ）配置が好ましい。

上記の活性化結合法を有するシクロスポリン類および８位にアミノ置換α−アミ ノ酸残基を有するシクロスポリン類［ここてアミノ置換基は１ｔＩｌ離らしくは 保護形、まｒこはその他の誘導体の形、例えばアノル化されている］は新規てあ って、本発明の一部に含まれる。したがって本発明は、 １．１活性化結合基を打するα−アミノ酸残基を有するシクロスポリン、 １．２該α−アミノ酸残基が２〜１１位（両端の数を含む）のいずれか１箇所に 存在する、１．１に記載のシクロスポリン、１．３該α−アミノ酸残基かアシル アミノ−、アシルオキシ−またはアルコキシ−置換α−アミノ酸残基［ここで活 性化結合基はアシルアミノ−、アシルオキシーまたはアルコキシ−置換基上に存 在する］を包含する、１．２に記載のシクロスポリン、１．４活性化結合堪が活 性化エステル、活性化ジヂオ、またはエポキシ基である、１．１〜１．３のいず れか１項に記載のシクロスポリン、１．５該α−アミノ酸残基が、アシルアミノ 置換α−アミノ酸残基［ここでアシルアミノ置換基はそのアシル基が活性化カル ボキシまたは活性化ジヂオ基により置換されているコニアシルオキシ置換α−ア ミノ酸残基［ここでアシルオキシ置換括はそのア／ル基が活性化カルボキシ基に より置換されている］；またはアルコキン置換α−アミノ酸残基［ここでアルコ キン置換基はエポキシ基により置換されている］を包含する、１．３に記載のシ クロスポリン、 １．６該α−アミノ酸残基が２位の（０−アシル）−スレオニル残基である、１ ．３〜１．５のいずれかに記載のシクロスポリン、１．７アシル基が式：　ｚｏ −ｃｏ−ｃＨ２−ｃ■］２−ｃｏ−［式中、Ｚはカルボキシ活性化基である］を 有する、１．６に記載のシクロスポリン、１．８該α−アミノ酸残基が５．６． ７または８位に存在する、１．２に記載のシクロスポリン、 １．９該α−アミノ酸残基が８位の−（Ｄ）α−アミノ酸残基である、１゜８に 記載のシクロスポリン、 １４１０　該α−アミノ酸残基がアシルアミノ置換（Ｄ）α−アミノ酸残基にこ で活性化結合基はアシルアミノ置換基上に存在する］である、１゜９に記載のシ クロスポリン、 １．１０に記載のツクロスボリン、 １．１２　８位にアミノ置換（Ｄ）α−アミノ酸残基を有し、このアミノ置換基 が遊離または保護形であるシクロスポリン、１．１３　８位にアシルアミノ置換 （Ｄ）α−アミノ酸残基にこでアシルアミノ置換基はそのアシル基が遊離のカル ボキシ基により置換されてぃろ］を有するシクロスポリン、 （Ｄ） ［式中、Ｘは水素、アミノ保護基、または遊離カルボキシ基もしくは活性化結合 基（例えば活性化カルボキシもしくはジヂオ基）により置換されているアシル基 、例えば式； ］ で示されるアシル基である］ で示される１、１０〜１．１３のいずれかに１項に記載のシクロスポリン、１． １５　上記に定義される式（Ｉｌａ）、（Ｉ　ｂ）、（Ｉｌｂ）、（Ｉｌｃ）、 （Ｉｄ）、（■ｄ）または（Ｉ　ｅ）で示されるシクロスポリン、を提供する。

以上論じたように、本発明によって、この度驚くべきことに、特に上記のような 活性化結合基を有するシクロスポリン類、例えば１．１〜１゜＋１，１．１４ま たは１．１５に定義されるようなシクロスポリン類を使用して得られる、活性化 結合基の働きにより結合したシクロスポリンおよび担体からなる免疫原性コンジ ュゲートが、シクロスポリン類とその代謝産物とを識別し得るモノクロナール抗 体の生成を初めて可能にする、という事が見出された。したがって、ハブテン成 分として前述のごときシクロスポリンの反応生成物を含む免疫原性コンジュゲー トは、チャレンジされた（例えばこれを接種された）動物中において抗体反応を 誘発することができ、その結果、その後ここから回収可能な抗体産生細胞、例え ば婢臓またはリンパ節細胞を、治療目的で投与されたシクロスポリン類（例えば 「シクロスポリン」）とその代謝産物、特に人間におけるその代謝産物（例えば シクロスポリン１７およびシクロスポリン＋８）を識別できるモノクロナール抗 体を生成するハイブリドーマラインの製造のために使用することを可能に４−る 。このような抗原性コンジュゲ−１・はこれまで未知であり、本発明はさらに、 ２．１　活性化結合基の働きによりシクロスポリンに結合した担体を含む、例え ば前述のごとき活性化結合基を有するα−アミノ酸残基を有するシクロスポリン 、特に上記１．１〜１．＋　１．１．１４またはＩ、１５のいずれか１項に定義 されるシクロスポリン（式（Ｉｌａ）、（Ｉｌｂ）、（［Ｉｃ）または （ｎ　ｄ））に結合した担体を含む、免疫原性コンジュゲート、２．２例えば前 述のような、活性化結合基を存するα−アミノ酸残基を有するシクロスポリン、 特に上記１．１〜１．＋　１，１．１４またはｌ。

Ｉ５のいずれか１項に定義されるシクロスポリン（式（Ｈａ）、（Ｔｕｂ）、（ ［Ｉｃ）またはＣＩＩ　ｄ））に結合によって得られたまたは得られ得る、免疫 原性コンツユゲート、 ２．３　シクロスポリンおよびその代謝産物間を識別できるモノクロナール抗体 、例えば後述の、そして特に下記３．１〜３．ＩＯのいずれか１項に定義される モノクロナール抗体の産生に使用し得る、例えば２１または２２に定義される免 疫原性コンノユヶ−１・、を提供する。

本発明の免疫原性コンツユゲートのために適当な担体は、当分野で既知のそして 普通に使用されろ任怠の担体を含み、特に高分子はポリペプチド、とりわけ蛋白 質、例えば血ｔｌｌｔアルブミン類（例えば牛血清アルブミンおよび鶏の卵白ア ルブミン）、免疫グロブリン類、特に鶏またはモルモットの ＩｇＧのようなＩｇＧクラスのもの、およびポリグルタミン酸のような合成ポリ マーを包含する。

さらに、本発明は上記に定義される免疫原性コンジュゲートの生成方法を提供し 、この方法は、　ｖｉ）例えば上述のような活性化結合基を存する担体を、適当 な相互反応性基（例えばヒドロキシまたはアミノ基）ををするα−アミノ酸残基 を有するシクロスポリン、例えば［Ｔｈｒ］”−シクロスポリンまたは［（Ｄ） Ｌｙｓ］８−シクロスポリンと結合させ、または、例えば上述のような担体を、 例えば前述のような、活性化結合基を有するα−アミノ酸残基を有するシクロス ポリン、特に上記１．１〜１．１１、【、１４または■、（５のいずれか１項に 定義されるシクロスポリン（式（Ｈａ）、（ｎｂ）、（Ｉｌｃ）または（ＩＩ　 ｄ））に結合させる、ことからなる。

」１記の反応工程は、シクロスポリン成分の直接反応によって、即ち結合剤を使 用せずに実施される。反応は、好適には、ジメヂルホルムアミドのような適当な 不活性希釈剤または担体に溶解したシクロスポリン成分を、周囲温度で、担体、 例えば担体蛋白質の緩衝化製剤、例えば重炭酸塩緩衝液中の溶液または懸局液に 添加することによって行なう。得られた免疫原性コンジュゲートは、例えばリン 酸塩緩衝化食塩水に対して透析することにより、好適に精製される。

上記の（例えば２．１〜２．３に定義される）免疫原性フンジコゲートは、本質 上標桑的な技術によって、例えばａ）適当な動物種に、例えば上記２１〜２．３ のいずれかに定義されるような免疫原性コンジュゲートを投与し、ｂ）免疫原性 コンジュゲートに対し感作された、例えば肺臓またはリンパ節のような抗体産生 細胞を回収し、Ｃ）回収した細胞を、例えば適当な骨髄腫セルラインと融合する ことにより、不死化してハイブリドーマセルラインを生成し、そしてｄ）必要な 場合にはモノクロナール抗体を生産する、例えばハイブリドーマセルラインのよ うな不死化された細胞を、選択することからなる段階的方法によって、モノクロ ナール抗体を生成するために使用することができる。

工程ａ）は、好適には受容体としてラットまたはマウス、例えば雌のＢａ１ｂ／ ｃマウスを使用し、免疫原性コンジュゲートを約５０〜２００、例えば約１００ μ９の量でｓ、ｃ、またはｉ、ｐ、注射し、その１４〜２１日後にｉ。

ｐ４、Ｓ、Ｃ，またはｉ、ｍ、でブースター注射して投与することによって実施 する。例えば通常のＲＩＡおよび／またはＥＬＩ　ＳＡ技術により測定される適 当なアイソタイプ分布の高力価抗血清を示すマウスに、例えば後の実施例９に記 載した個別的方法に従い、さらにブースター注射を行ない、例えば肺臓細胞のよ うな抗体産生細胞を集める［工程ｂ）］。工程Ｃ）は、文献中で実施されている 技術のいずれかに従って、例えばＳ　ファゼカス等、「ジャーナル・オン・イム ノロジカル・メソツズ」３５巻、１〜３２頁（＋９８０）に記載の方法を用いて 実施でき、好ましい骨髄腫ラインはマウス（Ｂａｌｂ、／ｃ）ラインてある。工 ｆｆｆｄ）においては、放射標識誘導体を用いる通常のｆｌｌＡ系または通常の ＥＬＩＳＡ系により（例えば後の実施例９に記載するように）、増殖しつつある 刊動程ラインをシクロスポリンに対する抗体の産生についてスクリーニングする 。

本発明に係る特定の免疫原性コンジュゲートを用いる上記の方法を適用すること により、互いにわずかな構造要素においてしか相違しない、例えば水素原子の代 わりに１個のヒドロキシ基が存在するような、個々のシクロスポリンを識別でき るはとの特異性を示すモノクロナール抗体を得ることが可能である。より重要な ことに、本発明は、シクロスポリン類、例えば「シクロスポリン」とその代謝産 物、特に人間における代謝産物との間の識別ができるモノクロナール抗体の取得 を初めて可能にするものである。即ち、本発明方法に従って得られるモノクロナ ール抗体は、ツクロスボリン類、例えば「シクロスポリン」とは反応性であるが 、一方、その代謝産物とは相対的に低い交差反応性を示すことが見出されている 。そのうえ、シクロスポリンハプテン成分が、選択された「標的」シクロスポリ ンである、本発明に係る免疫原性コンジュゲート、例えば上記２．１〜２３に定 義されろ免疫原性フンツユゲートを使用すれば、本発明は、「し−６的」シクロ スポリンおよび構造と極めて間通性のあるその代謝産物、例えば人間の代謝産物 の間の識別かできるモノクロナール抗体の取得を可能に可能にする。即ち、抗体 を、２位に活性化結合基を有しく例えば−上記１．６に定義されるように）、残 りの１位および３〜１１位のα−アミノ酸残基が［ツクロスボリン、１のものと 同一であるシクロスポリンと結合させることによって得られる免疫原性コンジュ ゲートから出発すれば、人間における代謝産物（例えばシクロスポリン１，８． ９、＋０．１６．１７．１８および／または２１、特に１７および／または１８ 、とりわ１月７）に優先して「標的」シクロスポリンとしての「シクロスポリン 」と反応するモノクロナール抗体を製造することができる。同様に、担体を、５ ．６．７または８位に（例えば上記１．８に定義されるように」、特に８位に（ 例えば上記１．１−１．１１，１．１４または１．１５のいずれかに１項に定義 されるように（式（ｌｌｂ）または（ｌｌｄ））活性化結合基を有し、残りの位 置、例えば１〜７および９〜１１位の残基が「シクロスポリン」、ジヒドロ−、 ［Ｖａｌ］　”−シクロスポリンまたは［Ｎｖａ］”−シクロスポリンの残基に 対応しているシクロスポリンと結合させることによって得られろ免疫原性コンジ ュゲートから出発すれば、代謝産物、例えば「シクロスポリン」の場合ならば直 前に列挙したような、人間におけろ代謝産物に優先して、「標的」シクロスポリ ンとしての「シクロスポリン」、ノヒトロー ［Ｖａｌ］”−シクロスポリンまたは［Ｎ　ｖａ］　’−シクロスポリンと反応 するモノクロナール抗体か製造できる。

本発明方法によって得られるモノクロナール抗体は、特に、「標的」シクロスポ リンと、１位のα−アミノ酸残基の構造変換を示しているその代謝産物、例えば １位の−ＭｅＩ３ｍＬ−もしくは−ジヒドローＭｅＢｍｔ−残基の置換、または 池の化学的修飾の点で代謝産物か誘導される元となった非代謝シクロスポリンと は相異している代謝産物、特に例えば本明細書に付記の実施例９に記載されるモ ノクロナール抗体（これは「シクロスポリン」とは反応性を有するが、その代謝 産物であるシクロスポリンＩ７とは相対的に低い交差反応性を有する）の場合の ように、末端（Ｃ’）−ＭｅＢｍｔ−メチル基のヒドロキシ化を含む、１位の残 基中の末端位における構造変換を示している代謝産物とを、識別することができ る。このようなシクロスポリンの代謝上の変換が、例えばシクロスポリンＩ７お よび１８の場合のように人間における主要な代謝産物に特有であるといったよう な、特別の意義を有している限り、シクロスポリン類と、かかる変換を示すその 代謝産物とを識別する、本発明方法によって得られるモノクロナール抗体の能力 は、特に注目されろべきものである。

例えば上に述べたような代謝産物との交差反応性は、ＲＩＡまたはＥＩ、ＩＳＡ 、例えば競合的ＩＥＬ　Ｉ　ＳＡ技術での測定値として、好ましくは非代謝シク ロスポリンとの反応性の約５％またはこれ以下、より好ましくは約３％またはこ れ以下、さらに好ましくは約２％またはこれ以下であり、この競合的ＥＬＩＳＡ において好適には、例えばｐ　Ｈ約６〜８、とりわけ７〜８の緩衝剤であって、 かつ、さらにトウイーンのような非イオン性界面活性剤または表面活性剤を少１ ′１１、例えば０゜０１〜Ｏ，１％、例工ｌｆ　０　、０１〜０　、０５　％含 ’ｆＷ’４°ルｍ？Ｊｒ　ｉ？Ｉ　ヲ使’１１　十ルのが適当であって、その例 としては、ｐｉ−Ｉ　７　、５で界面活性剤（例えばｌ・ウィーン２０）０．０ ３％を含有するリン酸塩緩衝化食塩水がある。例えば、本発明方法に従って得ら れろ「 ツクロスボリン」と反応性のモノクロナール抗体は、「ツクロスボリン」と比較 したシクロスポリン１７に対するＩｃｓ。比において、上記に開示される条件下 での競合的ＥＬＩＳＡ技術により測定した場合、３５倍またはこれ以上のオーダ ーの識別を示す。

本発明方法に従って得ることのできるモノクロナール抗体は、さらに、「標的」 ツクロスボリン、例えば「シクロスポリン」に対する高度の親和性という特徴を 存する。例えば、本発明に係る好ましいモノクロナール抗体は、標学的方法、例 えばミューラー等、メソッズ・イン・エンザイモロノー、９２巻、５８９〜６０ １頁（１９８３）に記載の方法に従って測定した場合、例えば通常のＲＩＡ温度 （約４〜３７°Ｃ）において、「標的」ツクロスボリン、例えば「シクロスポリ ン」に関してＩＯ”ｍｏｌ／Ｌまたはこれ以下、好ましくはＩ　Ｏ”ｍｏｌ／Ｌ またはこれ以下のオーダーの親和定数［平衡解離定数］を示す。

本発明はさらに、ＩｇＧクラス、例えばｔｇｃ、サブクラスのモノクロナール抗 体の容易な取得を可能にする。このような抗体は、例えば下記のような診断、／ アッセイキットにお喜よる使用に特？こ適合する限り、好ましい。

上記のモノクロナール抗体およびこれらを産生ずるハイブリドーマセルラインは 全く新規であり、かっ、それらの一般的および個別的性質についての以上の記述 から理解できるように、診ｌＦｒ／アッセイキット系（例えばシクロスポリン治 療を受けている患者における医薬ツクロスボリンの血漿−血液レベルのモニター のための）での使用に良く適合する。したがって本発明はさらに、 ３、Ｉ　ツクロスボリン、例えば予め決められているツクロスボリンと、その代 謝産物、特に人間における少なくとも１種の代謝産物、とりわけ人間における少 なくとも１種の主要な代謝産物とを識別できる、モノクロナール抗体、 ３．２　シクロスポリン、例えば予め決められているシクロスポリンと反応性で あり、かつその代謝産物、特に人間における少なくとも１種の代謝産物、とりわ け人間における少なくとも１種の主要な代謝産物と相対的に低い交差反応性を示 す、３１に記載のモノクロナール抗体、３３該シクロスポリンが、［シクロスポ リン」、ジヒドロ−［Ｖａｌ］’−ツクロスボリンまたは ［Ｎｖａ］２−ツクロスボリン、特に「シクロスポリン」である、３．１または ３２に記載のモノクロナール抗体、 ３．４該代謝産物が、１位のα−アミノ酸残基特に１位の残基の末端位における 措造変換を示している、例えば１位のα−アミノ酸残基−ＭｅＢｍｔ−の末端ヒ ドロキシ化を示している代謝産物である、３．１〜３゜３のいずれか１項に記載 のモノクロナール抗体、３．５該シクａスポリンか「シクロスポリン」であり、 該代謝産物がシクロスポリン１，８．９．１０，１６．１７．１８または２１． 特にツクロスボリン１７または１８、最も特別にはシクロスポリン１７である、 ３．４に記載のモノクロナール抗体、 ３．６例えば前記にｌｆ５示れるような条件下で、例えば［ＡまたはＥＬＩＳＡ 技術によって測定した場合、代謝産物との交差反応性が約５％またはこれ以下、 好ましくは３％またはこれ以下、より好ましくは２％またはこれ以下のオーダー である、３．２〜３．５のいずれか１項に記載のモノクロナール抗体、 ３．７例えば前記に開示されるような条件下で測定した場合、（予め決められた ）シクロスポリン、例えば「シクロスポリン」に関する親和定数が１０９ｍｏｌ ／Ｑまたはこれ以下、好ましくは１０　”ｍｏｌｌｏ、またはこれ以下のオーダ ーである、３１〜３．６のいずれか１項に記１戦のモノクロナール抗体、 ３．８　１ｇＧクラスのものである。３．１〜３．７のいずれか１項に記載のモ ノクロナール抗体、３．９ａ）例えば前記のような、特に上記１゜１−１．１１ ，１．１４または１．！５のいずれかに１項に定義される（式（ｌｌａ）、（［ ｌｂ）、（Ｕｃ）または（［ｆｄ））のような、活性化結合基を有するα−アミ ノ酸残基を有するシクロスポリンを、担体と結合させて、免疫原性コンジュゲー トを得ること、 ｂ）該免疫原性コンジュゲートを適当な動物種に投与して免疫原性チャレンジを 遂行し、該コンジュゲートに感作された抗体産生細胞を回収すること、 Ｃ）例えば適当な骨髄腫セルラインとの融合により、該抗体産生細胞を不死化ず ろこと、そして、 ｄ）このようにして確立された、選択された不死化セルライン、例えばハイブリ ドーマセルラインからモノクロナール抗体を回収すること、によって得られたま たは得ることのできる、例えば３．１〜３．８のいずれか１項に記載のモノクロ ナール抗体、３．１Ｏａ）上記２．１〜２３のいずれか１項に記載の免疫原性コ ンシュ、ゲートに感作された抗体産生細胞を回収すること、ｂ）例えば適当な骨 髄腫セルラインとの融合により、該抗体産生細胞を不死化すること、そして、 Ｃ）このようにして確立された、選択された不死化セルライン、例えばハイブリ ドーマセルラインから、必要なモノクロナール抗体を回収すること、 によって得られたまたは得ることのできる、例えば３．１〜３．８のいずれか１ 項に記載のモノクロナール抗体、４．１　上記３．１〜３．８のいずれか１項に 記載のモノクロナール抗体を産生ずるハイブリドーマセルライン１．４．２　上 記３．９の工程ａ）−ｃ）または上記３．ＩＯの工程ａ）およびｂ）に従って得 られたま１こは得ることのできるハイブリドーマセルライン、を提供する。

理解されるように、本発明に係るモノクロナール抗体は、与えられた任怠のシク ロスポリン、例えばシクロスポリンと、多数のその代謝産物とを識別でき、例え ばその代謝産物の１種以上に関して低い交差反応性を示し得る。

以上の事に加えて本発明はさらに、 ｖｉｉ　）上記３．１〜３．１３のいずれか１項に定義されるモノクロナール抗 体の産生方法であって、かかる抗体を産生ずるハイブリドーマセルラインを培養 し、その結果産生される抗体を回収することからなる方法、ｖｉ）上記３．１〜 ３．８のいずれか１項に定義されるモノクロナール抗体を産生ずるハイブリドー マセルラインの生成方法であって、抗体産生細胞、例えば肺臓またはリンパ節細 胞を不死化し、例えば適当な骨髄腫セルラインとの融合により、かかる抗体を産 生ずることからなる方法、を提供する。

上記の工程は、例えば前記で述べたような、またはここに付記する実施例に述べ るような、現在標帛的な技術に従って遂行することがてき、方法側）における使 用のために好ましい骨髄腫セルラインは、マウスＢａ１ｂ／Ｃ）骨髄腫セルライ ンである。

本発明に係るさらに別の聾様によれば、驚くべきことに、８位に−（Ｄ）　［、 ｙｓ−残基を有するシクロスポリン類、即ち、上記１．１４または１゜１５（式 （Ｉｄ）に定義されるシクロスポリン類、およびそのＮ−ε一原子がさらに修飾 されている誘導体は、驚くへきかつ著しい度合で、対応する「母体」シクロスポ リン（例えば８位に−（Ｄ）Ａｌａ−を有する対応シクロスポリン）に匹敵する 、例えば細胞結合特性を示すということが見出された。この発見は、−（Ｄ）Ｌ ｙｓ−のＮ−ε−窒素原子が、標識化が行なわれる（例えば標識またはトレーサ ー基か導入される）理想的な位置を提供するため、特別な色義を有する。このよ うな標識化シクロスポリン類は、「母体」シクロスポリン類（例えばシクロスポ リンのＣ（Ｄ）Ｌｙｓ１８−シクロスポリンの場合）の作用機作の研究および／ または、例えばインビトロ組織培養物における、「母体」シクロスポリンの結合 部位の同定のための重要なもう１つの手段を提供する。従って、放射性標識化誘 導体、例えばＩＩＪ標識化誘導体は、組織の迅速なオートラジオグラフィー、例 えば腎臓のミクロオートラジオグラフィーに有用である。

さらに、８位に−（Ｄ）Ｌｙｓ−残基を有するシクロスポリン類から得ろことの できろ標識化（例えば放射性または蛍光標識化）誘導体は、例えばＲＩＡお上び ＦＩＡ診断キット中での使用に理想的な構成因子を提供する。従って、［（Ｄ） Ｌｙｓ］”−シクロスポリン類は、例えば本発明に従って得られる、または上記 に定義されるような、例えば母体シクロスポリンに対するモノクロナール抗体に 関して、同等の結合特性を何し、それ故、診断／アッセイキットの構成因子また は副構成因子として極めて有用な、「母体」シクロスポリンの標識化類似体の容 易な取得手段を与える。

従って、本発明はさらに、 ５．１８位の残基が−（Ｄ）１．、ｙｓ−であるシクロスポリンの標識化誘導体 、特に、 ５．２上記定義される式（Ｉｄ）のシクロスポリンの標識化誘導体、を提供する 。

本明細書中で使用される「七：！識化誘導体」という用語は、例えば当該誘導体 の定量的アッセイまたは位置決定を可能にする、または容易にする、トレーサー またはマーカー原子または基を有する誘導体を意味する。このような誘導体には 、例えば、−（１））Ｌｙｓ−残基中の１またはそれ以上の原子がトレーサーま たはマーカー原子（例えば放射性原子）として機能ずろ誘導体、および、トレー サーまたはマーカー原子が、トレーサーまたはマーカー基と該Ｎ−ε−原子との 直接結合によって、または介在する結合基を経たトレーサーまたはマーカー基と 該Ｎ−ε−原子との結合によって、− （Ｄ）Ｌｙｓ−残基のＮ−ε一原子に結合している誘導体が含まれている。

標識化誘導体の例には、放射性標識化誘導体、蛍光および化学ルミネセンス誘導 体、ならびに光親和標識化に適当な誘導体（即ら、照射時に、そのシクロスポリ ンが結合している蛋白質と反応する置換基を備えている）が包含される。上記の 放射性標識化誘導体には、８位の−（Ｄ）Ｌｙｓ−残基のＮ−ε一原子が、例え ば１２５１！ｉ＋１ｉ識化ｐ−０１１−フェニル−プロピオニル基と結合してい る誘導体が含まれる。上記の蛍光および化学ルミネセンス誘導体には、８位の− （Ｄ）Ｌｙｓ−残基のｉ”Ｊ−ε一原子が、ダンツルもしくはローダンミン基の ような蛍光基、またはアクリノニウムエステル基のような化学ルミネセンス基（ 例えばクニカル・ケミストリー２９ｙ８．８．１４７４〜１４７９頁（＋９８３ ）に記載されるような基）に結合している誘導体が含まれる。したがって、上記 ５．１および５．２に定義されるシクロスポリン類の特別の群は、 ５．３８位の残基が式： ％式％ ［式中、Ｑは、トレーサーまたはマーカー基（特に例えば上記で個別に記載され るような、放射性標識化、蛍光または化学ルミネセンス基）であるか、またはこ れらを含んでいる］ で示させる基であるシクロスポリン、 である。

上記のような標識化誘導体は、例えば８位の−（Ｄ）Ｌｙｓ−残基を予め標識化 した出発物質を使用して、上記工程ｉｖ）およびＶ）と同様に製造できる。別法 として、これらは、例えば８位の−（Ｄ）Ｌｙｓ−残基のＮ−ε一原子に、適当 な標識置換基を導入することによって製造できる。例えば蛍光標識化誘導体は、 蛍光基を、例えばＮ−ε−ダンシル化によりＮ〜ε一原子に結合させることによ って製造できる。同様に、放射性標識化誘導体は、放射性標識化置換基、例えば ｌ！Ｊ標識化ｐ−０Ｈ−フェニル−プロピオニルを、Ｎ−ε一原子に結合そせる ことによって製造できる。後音の場合、置換基は、導入前に標識化した形であっ てもよく、また、導入後に標識化してもよい。例えば、８位のリノン基のＮ−ε 一原子は、＋５！標識化ｐ−Ｏｔ［−フェニル−プロピオン酸と直接反応させて よく、または非標識化ｐ−０ｌ−１−フェニル−プロピオン酸と反応させ、得ら れたＮ−ε−アミドをその後ｐ−０Ｈ−フエニル基において１２Ｊで標識化して もよい。結合は当分野で知られろ標阜的技術に従って、例えばＮ−ヒドロキシ− スクシンイミドエステルの形のｐ−ｏｒ−ｒ−フェニルーブ〔Ｊピオン酸（標識 化または非標識化）との反応によって実施できる。

１！！標識化ｐ−０Ｈ−フェニル−プロピオン酸はこれ自身クロラミンＴ法［ハ ンターおよびグリーンウッド、ネーヂャー、１９４巻、４９５頁（１９６２）］ によって製造することができる。標識化が結合の後に行なわれる場合、これはク ロラミン′ｒ法またはヨードケン法［グツド、ジャーナル・才ブ・クリニカル・ ケミストリー・アンド・クリニカル・バイオケミストリー、１９巻、１０５１頁 （１９８１）］を用いて実施できろ。

例えば上記のように、標識化できる本発明のシクロスポリンの誘導体、例えば８ 位の−（Ｄ）Ｌｙｓ−残基のＮ−ε一原子かＩ）−０１−ｒ−フェニル−プロピ オニルのようなｌｚ５ヨウ素化できる基によって置換されている誘導体は、本発 明に係る標識化誘導体の直接の面駆体であって、これもまた本発明の範囲内にあ るものと理解すべきである。

上記の事に鑑み、本発明はさらに、 ｉｘ）上記５．１〜５．３のいずれか１項に定義される遊離または保護形の標識 化誘導体の製造方法であって、対応する非標識化遊離または保護シクロスポリン を標識化、例えば上記のにうな標識置換基を、８位の−（Ｄ）Ｌｙｓ−のＮ−ε 一原子に導入し、必要ならば上記工程ｉｖ）を実施することからなる方法、 を提供する。

さらにこの時点で、上記の１．１２に定義されるような遊離のアミノ基を有する シクロスポリン類、例えば化合物［（Ｄ）Ｌｙｓ］”−シクロスポリンは、標準 的なインビボおよびインビトロ試験、例えば欧州特許第００５６７８２号に記載 の種々の試験方法で立証されるように、薬学的活性、特に免疫抑制、抗炎症およ び抗寄生虫（例えば抗マラリアおよび抗コクシジオイデス）活性をら有するとい う事が注目される。本発明に係るさらに別の態様によれば、担体分子が、５．６ ．７または８位、特に８位の残基を介してハンプテンとしてのシクロスポリンと 結合している免疫原性コンジュゲート（上記２．１〜２，３に定義されるコンジ ュゲートを含む）、および、活性化結合基以外の位置のうちいずれか１箇所に反 応基を何するアミノ酸を存しているシクロスポリンを、結合剤によって担体に結 合させることにより得られるコンジュゲートは、従来、例えば担体を［Ｔｈｒ］ ″−シクロスポリン中の−［Ｔｈｒ３’−と結合させることによって取得できる コンジュゲートを使用して得られたものよりも高い特穴性を有する通常のポリク ローナル抗血清を産生ずることができる、ということかイつかった。

（上記で用いる「反応基」という用語は、担体、例えばポリペプチドまたはその 他の適当な巨大分子との結合を許す、または可能にする、任意の店である、と理 解ずべきである。したかって一般にはこの語は、上記に定義されるような活性化 結合基、および反応し得ろその他の基、例えば、遊離のアミノ、カルボキシまた はヒドロキシ基を包含する。）このように、５．６．７または８位のα−アミノ 酸残基を介して担体に結合した、ハプテンとしてのシクロスポリンを含む免疫原 性コンジュゲートは、新規なものである。このようなコンジュゲートのハンプテ ン部分を提供する好ましいシクロスポリン類は、特に上記１．８〜１．１１゜１ ．１４および１．１５を（ＩＴｂ）および（１’Ｊｄ）に定義される活性化結合 基を有するものである。

したがって、本発明はさらに、 ２．４　シクロスポリンの５．６．７または８位のα−アミノ酸残基を介して該 シクロスポリンに結合した担体を含む免疫原性コンジュゲート、２．５上記１． ８〜１．１１，１．１４または１．１５Ｃ敷き（■ｂ）および（ＩＩ　（１）の いずれか１項に定義されるような活性化結合基を有するシクロスポリンと結合し た担体を含む免疫原性コンジュゲート、２．６上記１．１２〜１．１４および１ ．１５（式（Ｉ　ｂ）および（、ｌ　ｄ））のいずれか１項に定義されるような 遊離のアミノまたはカルボキシ基を有するシクロスポリン、特に上記１．１４に 定義される、または上記に定義される式（ｌｄ）を汀するシクロスポリンと結合 した担体を含む、免疫原性コンジュゲート、 ３．１１工程ａ）で使用されろツクロスボリンが上記２．５に定義されるシクロ スポリンであるという特徴を有する、上記３．９に記載のモノクロナール抗体、 ６．１　上記２．４〜２．６のいずれか１項に定義される免疫原性コンジュゲー トに応答して産生されろ、シクロスポリンと反応性の抗体（シクロスポリンと反 応性の抗体を含ｆ了するポリクローナル抗血清を含む）、６．２　シクロスポリ ン、ジヒドロ−［Ｖａｌ］’−シクロスポリンまたは［Ｎｖａ］　’−シクロス ポリン、特にシクロスポリンと反応性である、６．１に記載の抗体、 をら提供する。

２．５に定義される免疫原性コンジュゲートは、上記工程ｖｉ）の方法に従って 製造することができる。例えば２．６に定義される免疫原性コンツユゲートは、 上に述べた方法または、Ｘ）担体を、反応基を存するα−アミノ酸残基（即ち、 α炭素原子の位置に反応基を含むまたは有する側鎖を有するα−アミノ酸残基） を有しているシクロスポリン、例えば上記１．１２〜ｌ、１４および１．１５（ 式（ｌ　ｂ）および（、Ｉ　ｄ））のいずれか１項に定義されるような遊離のア ミノまたはカルボキシ基を有するシクロスポリンと結合させること、からなる方 法によって製造することができる。

上記の工程は当分野で既知の技術に従って、結合試薬の媒介を経る担体とシクロ スポリンとの結合によって実施することができる。例えば８位に−（Ｄ）Ｌｙｓ −残基を存するシクロスポリンの場合、カルボジイミド法［ケリー等、「ステロ イド・イムノロジー」、キヤメロン等編、アルファ・オメガ、カーディフ。＋　 ９７５］を用いて、または結合試薬としてホルムアルデヒドを使用するマンニッ ヒ反応によって、担体、例えばポリペプチド（例えば免疫グロブリン）を−（Ｄ ）Ｌｙｓ−Ｎ−ε一原子に結合させることにより、コンジュゲートを取得するこ とができる。

好適な担体は、モノクロナール抗体の産生のためのコンジュゲートの製造に関連 して既に述べた型の担体、特に高分子量ポリペプチド、とりわけ血清アルブミン 、免疫グロブリンのような蛋白質、およびポリグルタミン酸のような合成ポリマ ーを包含する。

６．１に定義される通常のポリクローナル抗血清は、上記に述べられかつ定義さ れるモノクロナール抗体の優れた特異性は欠くものの、文献から知られる抗血清 に比ベシクロスボリンに関して改善されたその特異性を特に考慮すると、これら また例えば診断／アッセイキットの構成因子として有用である。これは本質上常 套の技術を用いて製造でき、例えば、 ｘｉ）上記２４〜２．６のいずれか１項に定義される免疫原性コンジュゲートの 投与により適当な動物種に免疫応答を誘起し、その結果産生される抗血清を回収 すること、 からなる工程によって製造できろ。

上記に定義される工程χ１）は、例えば注射により、例えばマウス、羊または鶏 に免疫原性コンノコ、ゲートを投与することによって実施できる。

適当なインキュヘーンヨン期間の後に抗血清を回収し、例えば後にキット中で使 用するために、例えば後述のごとく、適切に凍結乾燥する。インキュベーション 期間は、例えば通常のＲＩＡで、Ｉ：２０００より大きな、例えば約１＋７００ ０〜約１＋１００００の範囲の抗血清力価を与えるよう、適当に選択する。

既に指摘したように、本発明に係るモノクロナール抗体およびポリクローナル抗 血清ならびに標識化シクロスポリン類は、全て診断／アッセイキット系、例えば 免疫アッセイキットの構成因子として、特別の用途を有する。

したがって、さらに別の態様によれば本発明は、７．シクロスポリン（例えば「 シクロスポリン」）療法を受ける対象において、シクロスポリンアッセイ、例え ばシクロスポリンの１種（例えば「シクロスポリン」）アッセイするための、免 疫アブセイキットまたはシステム、例えばＲＩＡまたはＦＩＡキットまたはシス テムであって、Ａ）上記３．１〜３．１１または６．１〜６．２のいずれか１項 に定義される抗体または抗血清、特に上記３．１〜３．１１のいずれか１項に定 義されるモノクロナール抗体、および／または、Ｂ）上記５．１〜５．３のいず れか１項に定義されるシクロスポリンの標識化誘導体、 を該キットまたは系の構成因子として含むキットまたはシステムを提供する。

７に定義されるキットは、診断の目的、例えばシクロスポリン療法を受けるΦ者 にとって適切な投薬方法を確立する手段として、例えば血液、血漿または尿中に 存在するシクロスポリンの量を測定するために有用である。このようなキットは 、従来感受性が適合しなかったシクロスポリン類、例えば「シクロスポリン」の ためのアッセイ手段を提供する。

本発明に係るキット、例えばＲＩＡおよびＦ’ｌＡキットは、常套のＲＩＡおよ びＦＩＡアッセイ技術に従う使用のための、全く常套の型のものである。即ち、 ＲＩＡキットは好適には、抗血清または抗体、例えば上記Ａ）に加えて、適当な 標識化シクロスポリン誘導体、例えば上記Ｂ）、およびＣ）シクロスポリン標準 を含んでいる。標識化シクロスポリン誘導体は、アッセイすべきシクロスポリン に対し相捕的である。

これは好適には上記Ｂ）に定義される標識化誘導体であって、例えば「シクロス ポリン」がアッセイされる場合には、これは（（Ｄ）Ｌｙｓ　）　”−シクロス ポリンの標識化誘導体であるのが適当である。しかしながらこれはたの相補的標 識化シクロスポリンであってらよく、例えば「シクロスポリン」がアッセイされ る場合にはトリチウム化「シクロスポリン」であってよい。シクロスポリン標Ｉ Ｃ）は一般に、既知の量のアッセイすべきシクロスポリンを含む溶液等である。

使用にあたって、例えば凍結乾燥した抗血清／抗体を溶解し、例えば構成因子Ｂ ）およびアッセイすべき試料または（１４成因子Ｃ）のいずれかと共にインキュ ベートする。インキュベーションは、好ましくは例えば４℃に冷却しながら行な う。インキュベート混合物の叶ｌは、好ましくはクエン酸塩またはトリス緩衝剤 のような緩衝化剤の助けを借りて、好ましくは約５〜８の範囲、例えば約ｐｌ− １７または８に維持する。

インキユベーシヨンは少なくしら２時間、例えば約６〜約１２時間続（」るのが 好都合である。インキュヘーンヨン後、例えば抗体に結合した構成因子Ｂ）の分 画を、例えばデキストラン被覆活性炭のような活性炭の使用により、非結合分画 から分離する。非結合分画は活性炭上に吸着するので、その後濾過または遠心分 離によって分離することができる。

次いで１つの分画中の放射活性のＨｋを、標準的技術により、例えば第２の溶質 の添加後に液体シンチレーションカウントすることにより測定する。抗体に結合 した構成因子Ｂ）の割合は、未知の血漿試料中のシクロスポリンの虫に反比例す る。定量分析のためには、既知濃度のシクロスポリンの溶液を分析することによ り標準の検債線を作成するのが普通である。

本発明に係るＦＩＡキットは、例えば抗体が光捕捉剤に結合し、これか蛍光シク ロスポリン（例えば本発明に係る蛍光標識化誘導体）と抗体との間の競合に依存 するような種類のものであってよい。

上記７に定義される別のアブセイキット／系は、当分野で知られる常套のＥＬＩ 　ＳＡ系のいずれかに基づいていてよい。

以丁の実施例は本発明を例示するものである。

実施例１　：　１（１））Ｌｙｓ）８−シクロスポリンの製造ａ）　Ｃ１１２Ｃ （！２　（２００ｍｆりおよびＩ−［、Ｏ（１００ｍＱ）中のＩ−１−ＭｅＬｅ ｕ　−ＭｅＬｅｕ−ＭｃＶａｌ−ＯＢｚｌマレイナート６．４ｇの溶液をＫ　ｔ 　ＣＯｓ固体を用てい［）Ｈ８に調節する。各回毎にＣＨ−ＣＣｔ（２００ｍ＋ りを用いて２回抽出した後、有機相をＮａ＝ＳＯ，て乾燥し、濾過および蒸発乾 固して、遊離のＩ−Ｉ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＯＢｚｌを結晶 性残留物として得る。

ｂ）　（Ｎ−ε−ＢＯＣ）　−ＦＭＯＣ−（Ｄ）Ｌｙｓ　（６，２５ｇ）をＣＨ ＣＱ、（１００ｍのに溶解し、Ｎ−メチルモルホリン（２，９５ｇ）を攪拌しな がら加える。溶液を一２０°に冷却後、塩化ピバロイル（１，７５ｇ）を滴下し 、反応混合物を一２０°で６時間攪拌する。ＣＨＣＱ３（２０ｍＮり中の１−１ −ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ　−Ｏｌ３ｚｌ　（６、３４ｇ）の溶液 をこの無水物溶液に滴下し、−２０’で１７時間攪拌して反応を完結させる。

追加のＣＨＣＴｏ　（２００ｍ１２）により、このＣＨＣｌ２５溶液を希釈した 後、混合物を飽和Ｎ　ａＨＣＯ３溶液（１００ｍ１２）と共に振とうする。有機 相をＮ　ａ　ｔ　Ｓ　Ｏｉて乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発乾固する。

得られた油状残留物を、２５倍量のシリカゲル（粒子サイズ０．０６３〜０．２ ０ｍｍ）および溶離液として３％メタノールを添加した塩化メチレンを使用する クロマトグラフィーによって精製する。〔α）”＝−１１４，２°（ＣＨＣ乙中 Ｃ＝１．Ｏ）。

Ｃ）無水エタノール（４００ｍＱ）に溶解した（Ｎ−ｓ−ＢＯＣ）−ＦＭＱＣ− （Ｄ）Ｌｙｓ−ＭｅＬｃｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＯＢｚｌ　（８，８ｇ） を、１０％パラジウム／炭素触媒（０，６ｇ）により、ガスター水素添加装置中 て、理論Ｍのｔ［＊（２１４ｍｆ２）か取り込まれるまで水素添加する。溶媒を 留去した後、残留物を５０倍量のシリカゲル（０，０６３〜０．２０＋ｎｍ）お よび溶離液として塩化メチレン＋７％メタノールを使用するクロマトグラフィー によって精製する。〔α〕６°−−１２９．１０（ＣＩ−１ｃｆ２ｓ中Ｃ＝１． ０）。

ｄ）　（Ｎ−ε−Ｉ３０Ｃ）−’ＦＭＯＣ−（Ｄ）Ｌｙｓ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬ ｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＯＮ　（７，Ｉｇ）およびＴ−ｒ−ＭｅＢｍｔ　−ａ　Ａｂ ｕ　−Ｓ　ａｒ−ＭｃＬｅｕ　−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ　（７ ，４ｇ）を塩化メチレン（１００ｍＣ）に溶解し、Ｎ−メチルモルホリン（１， ７２ｇ）およびカスドロ試薬（Ｂｔ−ＯＰ（Ｎ。

Ｍｅｚ）３ｐ　ｐ　ｅつ（５，６ｇ）を室温（２５°）で加える。反応混合物を 室温で３日ｒｕ’ＩＭ１拌し、次いでこの溶液を塩化メチレン（２００ｍｆｆ） で希釈し、飽和ＮａＬＴ　ＣＯ３溶液（ｌｏｏｍｇ）と共に振とうする。有機相 をＮａｔＳＯｔで乾燥し、濾過し、蒸発乾固する。得られた油状残留物を、溶離 液として塩化メチレン＋３％メタノールを用いるシリカゲル（５００ｇＸ０　。

０６〜０．２０ｍｍ）クロマトグラフィーによって精製する。〔α〕６°−−１ ４３．８°（ＣＩ−ＩＣ１２ｓ中Ｃ＝１．０）。

ｅ）（Ｎ−ε−Ｉ３０Ｃ）−ＦＭＯＣ−（Ｄ）Ｌｙｓ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｃｕ −ＭｅＶａｌ−ＭｅＩ３ｍｔ　−αＡｂｕ　−Ｓａｒ−ＭｅＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｍ ｅＬｅｕ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ　（５，５４ｇ）を塩化メチレン（５０ｍ１２）お よびピペリジン（１０ｍ１２）の溶液中で計４時間、室温で攪拌する。溶媒を蒸 発させ、得られた油状物を、塩化メチレン＋３％メタノールを溶離液とするセフ ァデックスＬ　Ｉ（２０（３００ｇ）のクロマトグラフィーに付ず。〔α）’、 ５’＝−１６５，２°（ＣＩ−ＩＣ（！ａ中Ｃ＝１．Ｏ）。

ｆ）エタノール（７５ｍのに一溶解した（Ｎ−ｒ、−ＢＯＣ）−Ｈ−（Ｄ）Ｌｙ ｓ−ＭｅＬｅｕ−ＭｃＬｃｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ−ａΔｂｕ−９ａｒ−Ｍ ｃＬｃｕ　−Ｖａｔ−ＭｃＬｃｕ−Ａｌａ−Ｏｎｚｌ　（６，４８ｇ）に０．２ ＮＮａＯ＋（（２４ｍのを加える。７時間後、冷却しながら２ＮＨＣ＆を滴下す ることにより、この溶液を１１１１４に調節する。溶媒を蒸発後、得られた残留 物をＣＩ’１２ＣＬ（２００ｍ１２）および飽和ＮａｔｌＣＯ３（２００ｍ＆） 溶液中で振とうする。それぞれ塩化メチレン（２００ｍｌｌりを用いて水層を２ 回抽出した後、有機相をＮａ＝ＳＯ４で乾燥し、濾別し、蒸発させる。生成物を 、塩化メチレン＋２０％メタノールを溶離液として用いるシリカゲル（３００ｇ ）　（０，０６〜０．　２０ｍｍ）クロマトグラフィーで精製する。（ａ　）　 ｏ’−１６９。

９°（ｃＨｃｆ２ｚ中Ｃ＝１．Ｏ）。。

ｇ）　（工程ｖ）： 塩化メチレン（２０００ｍ（りに溶解した（Ｎ−ｅ−１３０Ｇ）　−Ｈ−（Ｄ） Ｌ　ｙｓ　−ＭｅＬ　ｃｕ　−ＭｅＬ　ｅｕ−ＭｅＶ　ａｌ　−ＭｅＢｍｔ　− ａ　Ａｂｕ　−Ｓ　ａｒ　−ＭｅＬｅｕ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ　−ＯＨ （４１３ｍｇ）に、ジメチルアミノピリジン（１４７ｍｇ）を攪拌しながら加え る。無水プロパンホスホン酸（（０，１９ｇ）ｃＨｚｃＬ中５０％溶液〕を加え 、反応混合物を２５°で２４時間攪拌する。得られた溶液を飽和Ｎａ■■Ｃ０３ 溶液（２００ｍ１２）で洗浄し、Ｈ様相をＮａ、Ｓｏ、で乾燥し、濾別し、ｆ発 さけ、溶離液として塩化メチレン１５％メタノールを用いるシリカゲル（３００ ｇＸ０．ｏ　ｆｌ＋　２〜０２０）クロマトグラフィー て精製する。〔α〕ら’＝＋９８．３°（Ｃ、ｉｌ　ＣＱ＊中Ｃ＝１．０）。

ｈ）　（工程１ｖ）） （（Ｎ−ｅ−ＢＯＣ）−（Ｄ）Ｌｙｓ）Ｉ′−シクロスポリン（８４２ｍｇ）を トリフルオロ酢酸（２５ｍのと共に一２０°に冷却し、−２０°で共に４時間攪 拌する。反応溶液を氷、飽和に、Ｃｏ３（Ｉ　Ｏｍのと混合し、塩化メチレン（ ２００ｍｇ））で３回抽出する。有機相をＮａｔＳＯ，で乾燥し、濾過し、溶媒 を蒸発させる。得られた粗生成物を、溶離液として塩化メチレン＋１％メタノー ルを用いるセファデックスＬＨ２０（２００ｇ）のクロマトグラフィーに付すと 、標記化合物Ｃ（Ｄ）Ｌｙｓ）”−シクロスポリンが得られる。〔α）　５０． ＝−２０４，３°（ＣＯＣｌ２．中Ｃ＝１．０）。

生成化合物は標準的技術に従って塩の形に変換することもできる。典型的な塩に は、［（Ｄ）Ｌｙｓ’、８ −ツクロスポリン塩酸塩：〔α）３’＝−２０３°（ＣＩ（ＣＬ中Ｃ＝１．０） 、および（（Ｄ）Ｌｙｓ）　６−シクロスポリントリフルオロ酢酸塩：〔α〕６ °−−２０３°（ＣＩ■ＣＱ３中Ｃ−１，０）が包含される。

実施例２：（（Ｎ−ε−ヒドロキシスクシニル）−（Ｄ）Ｌｙｓ　）　’−ンク ロスボリンの製造・〔工程１ｉ）） 実施例１に従って製造した（　（Ｄ）Ｌｙｓ　）　’−シクロスポリン２５５ｍ ｇをピリジン２０ｍ（！に溶解し、無水コハク酸３６ｍｇを加える。得られた溶 液を室温で約１４時間造拌し、減圧下に最高４０℃でピリジンを完全にｆ発さけ る。得られた油状残留物を、塩化メチレン→−２％メタノールを用いる５５ｇセ ファデックスＬｌ−１２０のクロマトグラフィーに付し、ｌＯｍＱの分画てあつ める。分画１５〜２３から純粋な標記化合物が得られる。

ＮＭｎスペクトルは、２．５０および２．７０ｐｐｍ（幅広いシグナル）にスク シニルプロトンを、そして３．２５ｐｐｍに−Ｃｒ−１、−Ｎ　Ｈ−ＣＯＣＨ、 Ｃ■１　、　ＣＯＯｔｌに相当するシグナルを示す。

実施例３：　（（０−ヒドロキシスクシニル）−Ｔｈｒ）’−シクロスポリンの 製造：　〔工程ｉｉｉ　）　： （Ｔｈｒ）”−シクロスポリン６．０５ｇをピリジン２０ｍ＋！に溶解し、４− ツメチルアミノ−ピリジン３．６６ｇおよび無水コハク酸１．５ｇを７５℃で添 加する。反応混合物を７５°Ｃで４時間攪拌し、次いでｃｏ、ｃＱ２５００ｍｌ ｌで希釈し、２ＮＨＣ１２５０ｍｆ！：ｆツで５回、ＨｙＯＩ　５０ｍ１２で１ 回洗浄する。有機相を抽出し、ＮａｔＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、酢酸を溶離液 としてシリカゲル（０，０４０〜０．０６２ｍｍ）２５０ｇを用いろクロマトグ ラフィーによって精製する。

実施例４：Ｃ（Ｎ−ε−スクシンイミドオキシスクシニル）−（Ｄ）Ｌｙｓ）８ −シクロスポリンの製造：〔工程ｉ〕〕実施例２に従って製造される（（Ｎ−ε −ヒドロキシスクシニル）−（Ｄ）Ｌｙｓ）”−シクロスポリン５０ｍｇ、Ｎ− エチル−Ｎ′＝（ツメチルアミノプロピル）−カルボジイミド１１　Ｃσ１４ｍ ｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２３．８ｍｇおよびトリエチルアミン２４． ６ｍｇを塩化メチレン２ｍ１２中で２時間室温下に攪拌して透明な無色の溶液を 得る。得られた溶液を塩化メチレン５０ｍＱおよびＨ７ＯＩ　Ｏｍ（！て希釈し 、ＩＮＨｃｃを叶Ｉ６になるまて滴下する。二相性混合物が生成し、これをＨＣ Ｃを添加するたびによく振とうする。最後に有機相を希ＮａＨＣＯ３溶液１０ｍ Ｑと共に振とうし、Ｎａ、ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を留去すると標記化合 物か得られる。

ＮＭＲスペクトルは、２．５０および２　、７５　ｐｐｍ（Ｊ　＝　５　ｃｐｓ ）にスクシニルプロトン、そして２．１８および２　、１９　ｐｐｍ（２Ｓ）に Ｎ−スクシンイミドプロトンを示す。８位の残基は以下の構造を有する。

実施例５：（（０−スクシンイミドオキシスクシニル）−Ｔｈｒ）”−シクロス ポリンの製造、（工程１）： ］・］リエヂルアミン５４ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド９８ｍおよび製 −エチル−Ｎ’−（３−ジメヂルアミノプロビル）−カルボジイミド１０２ｍｇ を、実施例３に従って製造した〔（０−ヒドロキシスクシニル）−Ｔｈｒ）’− ツクロスボリン２００ｎ＋ｇの塩化メチレンＩ〇−中溶液に添加するが、添加は 水分を厳密に排除して２０℃で行う。反応混合物を室温で６時間攪拌し、塩化メ チレン２００ｍりで希釈し、ＨｔＯ５０ｍりと共に振とうする。水相をＩＮＨＣ ｆ！の滴下によりｐｒ−ｉ５〜６に調節し、Ｎ　ａ　ＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ、 ＳＯ，で乾燥し、濾過し、蒸発させる。残留物を、シリカゲル１１０ｇを使用し 、酢酸エチルを溶Ｍ液とするクロマトグラフィーにより精製すると、標記化合物 が得られる。〔α〕２０＝−■７８°（ＣＩ−ｉｃ１２ａ中Ｃ＝１．０）。ＣＤ Ｃ（２３中の１１（−ＮＭＲは、２．８０において一重線としてスクシンイミド プロトンを、２．６０ｐｐｍにおいて多重線としてスクシニルプロトンを示す。

２位の残基は以下の構造実施例６：　ＣＣＮ−（３−（２−ピリジル）ジチオ） プロピオン−１−イル）−ＣＤ）Ｌｙｓ）”−シクロスポリンの製造、〔工程１ ｉ））塩化メチレンｌ０ｍ５に入れた（　（Ｄ）Ｌｙｓ　）　’−シクロスポリ ン１２６ｍｇのの溶液に、２０℃で水分を厳密に排除しつつ、スクシニル−３− （（２−ピリジル）ジチオ〕プロピオナート３５ｍｇを加える。反応混合物を室 温で６時間攪拌し、塩化メチレン２００吋で希釈し、飽和Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ　５ ０ｍＣと共に振とうする。水相を塩化メチレン１５０ｍｆ２で抽出し、有機相を ＨｌＯで洗浄し、ＮａｔＳＯ，で乾燥し、濾過し、蒸発させる。無晶形の残留物 を、シリカゲル１００ｇを用いて塩化メチレン／メタノール（９５：５）を溶離 液とするクロマトグラフィーによって精製すると、純粋な襟足化合 物が得られる。〔α）６’＝　１６５°（ｃ＋１ｃｇａ中Ｃ＝１．Ｏ）。

８位の残基は式： 実施例７二上記２．１に定義される型の免疫原性ンクロスボリンー担体コンジュ ゲートの製造：（工程ｖ１）〕７．１８のγ−グロブリンとのコンジュゲート　 ツメデルホルムアミド０　、２　ｍＱにいれた、実施例４の方法に従って製造さ れる（（Ｎ−ε−スクシンイミドオキシスクシニル）−（Ｄ）Ｌｙｓ）Ｂ−シク ロスポリン１０ｍｇをＮａＨＣＯｓ（＋　、５ｗ／ｖ％、ｐｌ■８．１）４ｍＣ 中の鶏γ−グロブリン１００ｍｇにくわえる。反応混合物を室温で約２時間攪拌 し、得られたコンジュゲートをリン酸塩緩衝化食塩水に対して透析することによ り精製する。

７．２鶏の卵白アルブミンとのコンジュゲートジメチルホルムアミドｌＯＯμσ に入れた、実施例５に従って製造され、さらに１０％のジトリチウム化物質（１ 〜２μＣｉ／ｍｇ、出発物資としてトリチウム化（Ｔｈｒ）２−シクロスポリン を使用する外は実施例５と同様にして取得）を含有する（（０−スクシンイミド オキシスクシニル）−Ｔｈｒ）”−シクロスポリン１０．７ｍｇを、１．５％Ｎ ａＨＣＯ＊緩衝液２ｍｇ中の鶏卵白アルブミン３０．４５ｍｇに、激しく攪拌し ながら添加する（シクロスポリン／卵白アルブミンのモル過剰＝　Ｉ　Ｏ，６８ ）。反応混合物を周囲温度で２時間攪拌し、得られたコンジュゲートを４℃で１ ８時間リン酸塩緩衝化食塩水にたいして３回透析することにより精製する。生成 物のコンジュゲートに対して、投入した放射活性の５５．７％か卵白アルブミン に結合していることがわかり、これはシクロスポリン／卵白アルブミンの結合比 ５゜９５を示すものである。

卵白アルブミンに対するシクロスポリンの共有結合の数を、３個のコンジュゲー ト試料のアセトン沈澱によって調べた。非共有結合シクロスポリンに相当する３ ９．５％の放射活性がアセトン上清中に測定され、これははンクロスボリン／ラ ンパ　卵白アルブミンの最終的共有結合比３．６を示すものである。得られたコ ンジュゲートは分割して一２０℃に維持した。

シクロスポリン出発物資として実施例６の生成物を使用する外は上記７　ｌおよ び７．２と同様にして、類似のコンジュゲートが製造できる。

実施例８：上記２．４／２．６に定義される型の免疫原性シクロスポリン−担体 コンジュゲートの製造：　〔工程Ｘ〕８．１モルモットＩｇＧ　とのコンジュゲ ートモルモットのＩｇＧ　（３０ｍｇ）をＯ，１Ｍ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，０ ゜５Ｍのに溶解し、同じ緩衝液（０，５ｍの中の、実施例１の方法にしたがって 製造される（（Ｄ）Ｌｙｓ）”−シクロスポリン（１ｍｇ）の溶液に添加し、１ ％酢酸数滴を加える。続いてＮ−エチルＮ’　−（３−ジメチルアミノプロピル ）カルボジイミド塩酸塩を２回に分けて添加（各添加＝ｌＯＯｍｇ）することに より結合をさせる。２４時間後、水に対して複数回透析し、その後凍結乾燥する ことにより、反応生成物を製造する。

８．２ウサギＩｇＧとのコンジュゲート実施例１の方法に従って製造される（　 （Ｄ）Ｌｙｓ　）　”−シクロスポリン（ｌｏｍｇ）を、トリチウム化（（Ｄ） Ｌｙｓ　）　”−シクロスポリン６．９μｇ（０、１ｍＣｉ）のエタノール溶液 ０　、１　ｍｆ２に溶解する。ピリジン０．１ｍ１２および３５％ホルムアルデ ヒドＯ，ＩｍＣを加え、全体を３０分間室温に維持する。ついで０．０２Ｍリン 酸塩緩衝化食塩水（１ｍＯ中のウサギＩｇＧ２０ｍｇおよびピリジン０　、３　 ｍ（！を加え、反応を室温で焼く１４時間保持する。

得られたコンジュゲートを、３０％ピリジン、１０％ピリジンおよび最後に０． ００５Ｍリン酸塩緩衝化食塩水に対して透析する。コンジュゲートの結合比率は Ｉ：１１．４である。

実施例９：「シクロスポリン」反応性のモノクローナル抵抗を産生ずるハイブリ ドホマセルラインの生成：　〔工程ｖｉ））９．１実施例７．１のコンジュゲー トの使用ａ）免疫処置 ｉ、　り、注射で投与することにより、フロイント完全アジュバント０゜２ｍＱ に入れた実施例７．！の免疫原性コンジュゲート生成物１００μＧを、雌のＢ’ ａｌｌ＋／ｃマウス（２０〜２５ｇ）に各々与える。２週間後に、フロイント完 全アジュバント０　、２　ｍ（！に乳濁させた実施例７．１の生成物５０μｇを 含む２回目のブースター注射を、やはりｉ、　ｐ、注射によって行う。処置した マウスの血清中における、「シクロスポリン」に対して反応性を有する抗体の存 在を、トレーサとしてトリチウム化識「シクロスポリン」を用いる通常のＲＩＡ アッセイによって確認する。

ｂ）ハイブリド−マの産生 「シクロスポリン」反応性抗体価の最大値を示す工程ａ）で得られるマウスに、 食塩水（０゜８５ｗ／ｖ％）に入れた実施例３．２の生成物２０μｇを含むブー スター注射をｔ、　Ｖ、によって施す。このマウスを４日目に殺し、Ｓ、ファゼ カス等によりジャーナル・オン・イムノロジカル・メソッズ、３５巻、１〜２１ 頁（１９８０）に記載の方法に従って、胛臓細胞を分離しマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ ）骨髄腫細胞と融合させる。

トレーサーとしてトリチウム標識化「シクロスポリン」を用いる通常のＲＩＡア ヅセイ技術によって「シクロスポリン」に対し反応性の抗体であって、そしてさ らに、トリチウム標識化「シクロスポリン」をトレーサーとし、シクロスポリン １７を競合リガンドとする通常のＲＩＡアッセイ技術を用いて、シクロスポリン １７との低い交差反応性を示す抗体の産生について、増殖しつつあるハイブリド ーマをスクリーニングする。

「シクロスポリン」と反応し、かつシクロスポリン１７とは低い交差反応性を有 するモノクローナル抗体を産生ずる、１つの選択されたハイブリドーマラインを 見出す。この抗体は、ＩｇＧクラス、ＩｇＧ、サブクラスに属するものと性格付 けられる。ＲＩＡにおいて得られた「シクロスポリン」との反応性についてのＩ Ｃ５゜値は、シクロスポリン１７についての２８０　ｎｇ／ｍＯに比べて６．７ ｎｇ／ｍＱである。したがってシクロスポリン！７との交差反応性は、わずか２ ％のオーダーを有する。「シクロスポリン」に関してめられた親和定数は、Ｉ　 Ｏ−９ｍｏｌ／ｌ！のオーダーを有する。

本明細占に概括的に教示された本発明に係る技術を適用することにより、特に、 免疫原性コンジュゲートの製造のために例えば上記１１〜ｉ　Ｉｔ、！、１４ま たは［、＋５（式（ｌｌａ）、（ＩＴｂ）、（Ｉｌｃ）、または（Ｉｌｄ）のい ずれか１項に定義される活性化結合基を存するシクロスポリン類を韓用し、例え ば本実施例の一般的方法と同様にして進めることにより、ハイブリドーマライン ／モノクローナル抗体が容易に製造でき、これは、たとえ本実施例に係る特定の ハイブリドーマライン／モノクローナル抗体産物と同一でない場合であっても本 質上同一の基桑を満たずものであり、例えば上記に述へたらのと同等の、または 一層改善された性質を示すものである、という事ができるであろう。この事は、 以下の実施例中に明示される結果から明らかであろう。

９．２実施例７．２のコンジュゲートの使用ａ）免疫処置 各マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ）に、リン酸塩緩衝化食塩水／フロインドアジュバント （１：Ｉ）２００μＱに入れた実施例７．２の免疫原性コンジュゲート産物１０ ０μｇを与える。１回目の投与（フロイント完全アジュバント）はｓ、ｃ　て後 足、尾の近傍および首の近傍に施す。３週間後２回目および３回目の投与（フロ イント不完全アジュバント）を、各々背部にＳ。

Ｃ１て、そして後脚にｊｍ、で行う。血液試料を、２回目および３回目の両投与 のＩａｌｉｆｌ後に採取する。

別途使用のために、以下のｘ＋Ｉ＋定される抗血清基準にしたがってマウスを選 択する： １、液相ＲＩＡおよびＥＬＩ　ＳＡにおける力価；２、見掛けのアイソタイプ分 布（ＥＬＩＳＡにおけるＩｇＧ、のみまたは■ｇＣ，±、ａ　＋、ｂ　） ３、ＥＬＩＳＡにおける相対的結合活性；４、競合的ＥＬＩＳＡにおいてシクロ スポリンおよびシクロスポリン１７およびシクロスポリン１８を識別する能力。

９％ＮａＣＱ２００μｇに入れた実施例７．２の免疫原性コンジュゲート産物１ ００μｇを用いる融合を行うのに先立ち、−３、−２および一１日目に、選択さ れたマウスにブースター注射を行うが、これは−３日目にはｉ、　ｐ、　（５０ ％）およびｉ、　ｖ、　（５０％）注射、−２および−１１回目はｉ、ｐ、（１ ００％）によって行う。

ｂ）ハイブリドーマの生成 各マウス由来の１１１臓細胞２．５ｘｌＯ−’または５ｘｌＯ−’を、ＰＥＧ４ ０００を使用してマウス（［３ａｌｂ／ｃ）骨髄腫細胞５ＸＩＯ’と融合させ、 ２４Ｘ２４のウェルに分配する。

陰性対象としての遊離の牛血清アルブミンに優先して、牛血清アルブミンと結合 した（Ｔｈｒ）”−シクロスポリン（実施例７．２と同様にして製造）および／ または牛面清アルブミンと結合した（　（Ｄ）Ｌｙｓ　）　’−シクロスポリン （実施例７．１と同様にして製造）を識別する抗体の存在について、培養上清を ＥＬ［ＳＡでスクリーニングする。選択したＩｇＧ産生ハイプリドーマラインを クローニングしてモノクローン性を保証する。

得られたハイブリドーマラインによって産生されるモノクローナル抗体の（ａ） 「シクロスポリン」ならびに（ｂ）シクロスポリン１７およびシクロスポリン１ ８を区別／識別する能力を、０．０３％トウイーン２０を含む、および含まない リン酸塩緩衝化食塩水（１）Ｈ７，５）、ならびに００３％トウイーンを含む、 およびＮａＣ（を含まないトリス（ｐＨ７，５）を含む種々の緩衝系中で、クエ スニオー等によりイムノロジー・レターズリ巻９９〜１０４頁（＋９８５）に記 載の間接ＥＬＩ　ＳＡの競合形式によって試験する。識別のための最適条件は、 一般に１４０ｎ＋ＭのＮａＣ（！および０．０３％のトウイーン２０を加えたｐ Ｈ７，５のリン酸塩緩衝化食塩水において観察される。検査した９個のクローン ライン中、７個が（ａ）「シクロスポリン」ならびに（ｂ）シクロスポリン１７ および１８を識別するモノクローナル抗体を生成する。６個については、「シク ロスポリン」と比較したシクロスポリン１７のＩＣ，。比は約３５倍またはこれ 以上である。

実施例１０：ｒシクロスポリン」と反応性の通常のポリクローナル抗血清の生成 〔工程１ｘ）） 約１４日間の間隔で後脚に筋肉内注射を１０回行うことにより、羊を免疫処置す る。注射液は、実施例８．１の免疫原性蛋白コンジュゲート産物の凍結乾燥品（ ３ｍｇ）、アルゲルＳ（０，２ｍのおよびフロインドアジュバント（０，６ｍの からなる。トリチウム化シクロスポリンに対して得られた最終力価は、ＲＩＡて 測定した場合１／１ｏｏＯ’００である。

回収されたポリクローナル抗血’ｈ’ｆは、例えば現行のシクロスポリンＲＩＡ アッセイキット中で使用されているような、当分野で既知の（Ｔｈｒ）２−シク ロスポリン−１ｇＧ　コンジュゲートを使用して得られるポリクローナル抗血清 と比較して、「シクロスポリン」およびその代謝産物ンクロスボリン１７間のよ り良い識別を示すことがわかった。即ち本実施例に従って得られる抗血清につい ては、シクロスポリン１７との交差反応性は、既知のポリクローナル抗血清が約 ４２．０％であるのに比べ、約１８％のオーダーを有する。

実施例１１：上記５．ｌにに定義されるシクロスポリン類の標識化誘導体の製造 ：　〔工程１ｘ）） １１、Ｉ：　（Ｎ　−−ＴＲＩＴＣ−（Ｄ）Ｌｙｓ）’−シクロスポリンの製造 実施例１に従って製造される（　（Ｄ）Ｌｙｓ　）　’−シクロスポリン（１５ ｍｇ）を塩化メチレン（２ｍのに溶解する。イソチオシアン酸ローダミン（ＴＲ ＩＴＣ）（５，３ｍｇ）を加え、反応混合物を一７℃で１７時間放置する。

強い赤色の溶液を、塩化メチレンおよび０５％メタノールを用いて直接セファデ ックスＬＨ２０（２０ｇ）のクロマトグラフィーに付ず。分画をｌｏｍｉ２ずつ 集める。

標記化合物が、分画５〜７およびＩＯ〜１４から油状物として回収される。ＵＶ 吸収：３００ｎｍ／蛍光放出：５４０ｎｍ０８位の残基は、構造（Ｄ） を有する。

１１．２（Ｎ−ε−ダンンルー（１））Ｌｙｓ　）　８−　シクロスポリンの製 造実施例１に従って製造される（（Ｄ）Ｌｙｓ）’−シクロスポリン（２３２ｗ ａｇ）をクロロホルム（１５ｍのに溶解する。エチルジイソプロピルアミン（７ 、３ｍｇ）および塩化ダンシル（９９，５ｍｇ）を加え、反応混合物を２時間攪 拌刷る。生成物を、塩化メチレンおよび０，５％メタノールを用いて直接セファ デックスＬＨ２０（１００ｇ）のクロマトグラフィーに付す。分画はｌｏｍ（！ ずつ集める。

集めた分画を蒸発させ、得られた生成物を、塩化メチレンおよび５％メタノール によりシリカゲル（０，０６〜０．２０＋ｎｍ）（Ｉ　ＯＯｇ）を用いて再度ク ロマトグラフィーに付す。分画は１ｓＩＩＩＱずつ集める。

分画２８〜４４から純粋な生成物を得た。〔α）ｉ、’＝−１８３，８’　、Ｃ ｔｌＣ＆中＝ｃ＝１．０８゜ ＋　１．３：　（（Ｄ）Ｌｙｓ）８−シクロスポリンの１２５ヨウ素化誘導体の 製造 ポルトンおよびハンター〔バイオケミカル・ジャーナル１３３巻５２９頁（＋９ ７３））記載の方法と同様にして、実施例Ｉに従って製造される（（Ｄ）Ｌｙｓ ）”−シクロスポリンの８位の残基のＮ−ε一原子にｐ−０Ｈ−フェニルプロピ オニル基を結合させることにより、標記化合物を製造する。１ｔＳＩ標識は、ｐ −０Ｈ−フェニルプロピオニル基のフェニル環に行う： Ｏ− 直線勾配を用い、かっ液相として１０〜３０％ｎ−プロパツール１５％酢酸中の ０．２％トリフルオロ酢酸、１０．２　）リフルオロ酢酸を使用するＲＰＩ８の ４Ｘ２５０カラムによるＩ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃによって精製をおこなう。

宝淫■査報告 ＋ｍｓ＋ｗｗａｅ＋Ａｓ、＋ｍ＋＋ａ、ＰＣＴ／ＥＰ　１３５１００５０１１ｍ −ｎ県１ｍｎ−＾−ｇｈａａｂ・―師番ＰＣＴ／Ｅコ＞４１５１００５０１１ｎ ｍＭＩｉｏ−＾＊ｍｋｍｌ＠１ＩＨａ　ＰＣＴ／！７　［１５１００５０１ＡＮ ＮＥＸ　Ｔｏ　ＴｄＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲ Ｔ　ＯＮ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．シクロスポリンおよびその代謝産物間を識別することのできるモノクローナ ル抗体。
2. ２．請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマセル ライン。
3. ３．ａ）活性化結合基を有するα−アミノ酸残基を有し；ｂ）アミノ置換基が遊 離または保護形であるアミノ置換（Ｄ）α−アミノ酸残基を８位に有し；または 、 ｃ）アシルアミノ置換（Ｄ）α−アミノ酸残基（ここでアシルアミノ置換基は、 アシル部分が遊離のカルボキシ華により置換されている）を８位に有する、 シクロスポリン。
4. ４．活性化結合基の働きによりシクロスポリンに結合した担体からなる免疫原性 コンジュゲート、例えば、請求の範囲第３項ａ）部に記載のシクロスポリンに結 合した担体からなる免疫原性コンジュゲート。
5. ５．請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体の産生において使用可能な免疫 原性コンジュゲート。
6. ６．シクロスポリンの５．６．７または８位のα−アミノ酸残基を介して該シク ロスポリンに結合した担体からなる免疫原性コンジュゲート。
7. ７．シクロスポリンと反応性のポリクローナル抗血清を包含する、請求の範囲第 ６項記載の免疫原性コンジュゲートに応答して産生されるシクロスポリンと反応 性の抗体。
8. ８．８位の残基が−（Ｄ）Ｌｙｓ−であるシクロスポリンの標識化誘導体。
9. ９．キットまたはシステムの構成因子として、Ａ）請求の範囲第６項記載の抗体 もしくは抗血清；または、Ｂ）請求の範囲第１０項記載のシクロスポリンの標識 化誘導体、を含む、シクロスポリンアシルアッセイのためのイムノアッセイキッ トまたはシステム。
10. １０．以上に記載した各々のそして全ての新規な工程、方法、生成物、製造方法 もしくはその他の態様、またはこれらの任意の組み合わせ。