JPS59138958A - 抗血清 - Google Patents
抗血清Info
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- JPS59138958A JPS59138958A JP1388383A JP1388383A JPS59138958A JP S59138958 A JPS59138958 A JP S59138958A JP 1388383 A JP1388383 A JP 1388383A JP 1388383 A JP1388383 A JP 1388383A JP S59138958 A JPS59138958 A JP S59138958A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は抗血清に関する。
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇ
ａｙ−Ｌｅｕで示されるペプチドは、最近見出されたオ
ピオイドペプチドであり、ウシ副腎髄質由来のブリゲロ
ニンケファリン（Ａ）に、メチオニンエンケファリン、
ロイシン−エンケファリン等とともに含まれることが明
らかにされている（ Ｎｕｍａ ｅｔ ａｉ、 。
ａｙ−Ｌｅｕで示されるペプチドは、最近見出されたオ
ピオイドペプチドであり、ウシ副腎髄質由来のブリゲロ
ニンケファリン（Ａ）に、メチオニンエンケファリン、
ロイシン−エンケファリン等とともに含まれることが明
らかにされている（ Ｎｕｍａ ｅｔ ａｉ、 。
本発明の目的は、上記オピオイドペプチドに特異的な抗
血清を提供するものであり、この抗血清はラジオイムノ
アセイ（ＲＩＡ）によシこのペプチドが関与する刺激−
分泌機構の研究に役立ち、またこのペプチドの組織内分
布を明らかにすること、さらには血中及び組織中の微量
ペプチドの測定、検出に有効な手段となり得る。
血清を提供するものであり、この抗血清はラジオイムノ
アセイ（ＲＩＡ）によシこのペプチドが関与する刺激−
分泌機構の研究に役立ち、またこのペプチドの組織内分
布を明らかにすること、さらには血中及び組織中の微量
ペプチドの測定、検出に有効な手段となり得る。
また、ＲＩＡと同様に、螢光抗体法又は酵素抗体法など
による完投組織化学的な検討にも有用である。
による完投組織化学的な検討にも有用である。
すなわち本発明に係る抗血清は、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇ’１ｙ−Ｌｅｕで示さ
れるペプチドを抗原、とじてこれを温血動物に免疫する
ことによりその血液より取得され、このペプチドに特異
的な反応性を有する。
ｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇ’１ｙ−Ｌｅｕで示さ
れるペプチドを抗原、とじてこれを温血動物に免疫する
ことによりその血液より取得され、このペプチドに特異
的な反応性を有する。
このよう々本発明の抗血清は、たとえば次のような方法
により得られる。
により得られる。
まず、Ｔｙｒ−（）ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕで示されるペプチドを常法（たと
えば液相法）により合成し、常法（たとえば薄層クロマ
トグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ろ紙電気
泳動等）によって精製する。
ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕで示されるペプチドを常法（たと
えば液相法）により合成し、常法（たとえば薄層クロマ
トグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ろ紙電気
泳動等）によって精製する。
このペプチドを抗原とし、抗血清を調製する。
この場合、ｉ）水浴性カルボジイミド、たとえば／−エ
チル−３−（３−ジメチルアミンプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩（ＥＯＤ工）、のような縮合剤の作用でペプ
チドを血清蛋白などの担体に結合させて、と、れを抗原
として使用する方法、１１）グルタルアルデヒド、ビス
−ジアゾ化ベンジジン、又はＰ−ジアゾニウムフェニル
酢酸のよりな二官能性試薬によりペプチドと担体の間に
橋かけを形成して高分子の抗原とする方法、又は１１１
）炭末文はポリビニルピロリドンのような不活性ポリマ
ー微粒子にペプチドを吸着させて抗原として使用する方
法、等が採用される。
チル−３−（３−ジメチルアミンプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩（ＥＯＤ工）、のような縮合剤の作用でペプ
チドを血清蛋白などの担体に結合させて、と、れを抗原
として使用する方法、１１）グルタルアルデヒド、ビス
−ジアゾ化ベンジジン、又はＰ−ジアゾニウムフェニル
酢酸のよりな二官能性試薬によりペプチドと担体の間に
橋かけを形成して高分子の抗原とする方法、又は１１１
）炭末文はポリビニルピロリドンのような不活性ポリマ
ー微粒子にペプチドを吸着させて抗原として使用する方
法、等が採用される。
得られる抗原を用いて、通常、フロイントの完全アジュ
バントとともに温血動物（たとえばウサギまたはモルモ
ット）に複数回の免疫を行なうことにより抗血清を産生
させ、その血液を採取し常法により、抗血清を取得する
。
バントとともに温血動物（たとえばウサギまたはモルモ
ット）に複数回の免疫を行なうことにより抗血清を産生
させ、その血液を採取し常法により、抗血清を取得する
。
このようにして得られる本発明に係る抗血清は、Ｔｙｒ
−（ｌｙ−Ｇａｙ−Ｐｈ ｅ−Ｍｅ ｔ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕで示されるペプチドに特異的であり、メチオ
ニン−エンケファリン、ロイシン−エンケファリン、メ
チオニン−エンケファリン−Ａｒｇ’−Ｐｈｅ’ 、α
−ネオエンドルフィン、Ｉ−ネオ−エンドルフィン、タ
イツルフィン、α−エンドルフィン、β−エンドルフィ
ン、ＡＣｉＴＨ等との交差反応を実質的に示さないので
、これを用いることにより高感度でＲ工Ａ等による測定
、検出系に有用である。
−（ｌｙ−Ｇａｙ−Ｐｈ ｅ−Ｍｅ ｔ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕで示されるペプチドに特異的であり、メチオ
ニン−エンケファリン、ロイシン−エンケファリン、メ
チオニン−エンケファリン−Ａｒｇ’−Ｐｈｅ’ 、α
−ネオエンドルフィン、Ｉ−ネオ−エンドルフィン、タ
イツルフィン、α−エンドルフィン、β−エンドルフィ
ン、ＡＣｉＴＨ等との交差反応を実質的に示さないので
、これを用いることにより高感度でＲ工Ａ等による測定
、検出系に有用である。
以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はその要旨を超えない限りこれらの実施例に限定
されない。
本発明はその要旨を超えない限りこれらの実施例に限定
されない。
なお、参考例中、特に記載のない限り、アミノ酸残基の
立体配置はＬ一体を示し、薄層クロマトグラフィーは下
記の溶媒系を用いた。
立体配置はＬ一体を示し、薄層クロマトグラフィーは下
記の溶媒系を用いた。
Ｒｆ 、 １−ＢｕＯＨ＝ＡｃＯＩ（−Ｈ２Ｏ（！Ｉ
： ／ ： ｊ ）Ｒｆ、１−ＢｕＯＨ−ピリジン−Ａ
ｃＯＨ−）（２０（３０：２θ：ｘ：、ｚ＜ｚ）参考例
／ Ｈ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅ ｔ−Ａｒ
ｇ−Ｇ］、ｙ−１’、ｅｕ−ＯＨの製造 １） Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｈ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｊ、／ ２ ｇ） （０，０２ｍ０
１）とトリエチルアミン（ＴＥＡ）（！ｒ−θＡ ｄ
）の水（３０ｍｇ）水冷溶液に、Ｚ−Ｇ’１ｙ−Ｏ５ｕ
（１／ ３ ｇ ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）
（ｊ ０ｔｄ）氷冷浴液を添加した。この混合物を、室
温で／ｇ時間撹拌した。ＴＨＦを留去後、水性層を１Ｍ
クエン酸で酸性化した。生じた沈殿物をろ過で集め、水
洗した。Ａｃ０Ｋｔ−石油エーテルによる再沈殿により
目的とする保護されたジペプチド！ｒ、２ ｇ Ｉを得
だ（収率ｇ７．９饅）。
： ／ ： ｊ ）Ｒｆ、１−ＢｕＯＨ−ピリジン−Ａ
ｃＯＨ−）（２０（３０：２θ：ｘ：、ｚ＜ｚ）参考例
／ Ｈ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅ ｔ−Ａｒ
ｇ−Ｇ］、ｙ−１’、ｅｕ−ＯＨの製造 １） Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｈ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｊ、／ ２ ｇ） （０，０２ｍ０
１）とトリエチルアミン（ＴＥＡ）（！ｒ−θＡ ｄ
）の水（３０ｍｇ）水冷溶液に、Ｚ−Ｇ’１ｙ−Ｏ５ｕ
（１／ ３ ｇ ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）
（ｊ ０ｔｄ）氷冷浴液を添加した。この混合物を、室
温で／ｇ時間撹拌した。ＴＨＦを留去後、水性層を１Ｍ
クエン酸で酸性化した。生じた沈殿物をろ過で集め、水
洗した。Ａｃ０Ｋｔ−石油エーテルによる再沈殿により
目的とする保護されたジペプチド！ｒ、２ ｇ Ｉを得
だ（収率ｇ７．９饅）。
ＲｆＯ，ｇ２、ｍ、ｐ、１０？−１０ｇ℃（ｉｉ）
Ｚ−Ａｒｇ（Ｎｏ２）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＭＷ！
：１３．ＡＯ）Ｚ−Ｇａｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｊ、２２ｇ
）（θ、０／ｍｏｌ）をＡａＯＨ（／、ｔｍ７り中に溶
解し、ｕ、ｔ％ＨＢｒ／Ａｃ０Ｈ（二〇−）を添加した
。溶液は室温で７時間放置された。無水エーテル及び石
油エーテルを加えて油状物質を生成させ、これを真空下
１にＫＯＨで乾燥した。
Ｚ−Ａｒｇ（Ｎｏ２）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＭＷ！
：１３．ＡＯ）Ｚ−Ｇａｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｊ、２２ｇ
）（θ、０／ｍｏｌ）をＡａＯＨ（／、ｔｍ７り中に溶
解し、ｕ、ｔ％ＨＢｒ／Ａｃ０Ｈ（二〇−）を添加した
。溶液は室温で７時間放置された。無水エーテル及び石
油エーテルを加えて油状物質を生成させ、これを真空下
１にＫＯＨで乾燥した。
Ｚ−Ａｒｇ（Ｎｏ２）−ＯＨの混合無水物が、Ｚ−Ａｒ
ｇ（Ｎｏ２） −０Ｈ（３，！； ３１９ ） 、Ｎ−
メチルモルホリン（／、Ｏλ−）及びインプチルクロロ
ホーメー）（／、、？、２ｄ） の ＤＭＦ−ＴＨＦ
（／ ： ２ ）（、？ θｔｄ）溶液を
用いて−ｌθ℃で調製された。
ｇ（Ｎｏ２） −０Ｈ（３，！； ３１９ ） 、Ｎ−
メチルモルホリン（／、Ｏλ−）及びインプチルクロロ
ホーメー）（／、、？、２ｄ） の ＤＭＦ−ＴＨＦ
（／ ： ２ ）（、？ θｔｄ）溶液を
用いて−ｌθ℃で調製された。
得られる混合無水清液を、上記Ｈ−Ｇ４ｙ−Ｌｅｕ−Ｏ
Ｈ、ＨＢｒ及びトリエチルアミン（ユ、ざｔｄ）のＤＭ
Ｆ（／ｊｔｎｌ）＠液に＝１０℃で冷加した。
Ｈ、ＨＢｒ及びトリエチルアミン（ユ、ざｔｄ）のＤＭ
Ｆ（／ｊｔｎｌ）＠液に＝１０℃で冷加した。
混合物をダ℃で３０分間、室温で７時間攪拌した。溶媒
を留去後、残留物をＡｃ０Ｅｔで３回抽出し、１Ｎクエ
ン酸で３回、飽和食塩水で３回洗浄し、ついでＮａ２５
ｏ４で乾燥した。溶媒を留去し、残留物をＫｔ２０の添
加により固体化した。ＭｅＯＨ−Ｅｔ、○による再沈殿
で保護されたトリペプチド３．７ ／ ＩＩが得られた
（収率り ｏ、ｑ ％ ） 。
を留去後、残留物をＡｃ０Ｅｔで３回抽出し、１Ｎクエ
ン酸で３回、飽和食塩水で３回洗浄し、ついでＮａ２５
ｏ４で乾燥した。溶媒を留去し、残留物をＫｔ２０の添
加により固体化した。ＭｅＯＨ−Ｅｔ、○による再沈殿
で保護されたトリペプチド３．７ ／ ＩＩが得られた
（収率り ｏ、ｑ ％ ） 。
Ｒｆ Ｏ，７！ 、 Ｒｆ” ０
．クツｍ、ｐ ／、２．？−／、２！；℃ １ｊｊ） Ｂｏａ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−ＯＭｅＢｏｃ−
Ｐｈｅ−ＯＨＣ左、３ ／ ＆ ） （０，０２ｍｏ］
−）とＮ−メチルモルホリン（２，０グー）のＴＨＦ
（２０ｍｌ ）溶液に、インブチルクロロホーメート（
，２，Ａ ４ｔづ）を−１０℃で添加した。
．クツｍ、ｐ ／、２．？−／、２！；℃ １ｊｊ） Ｂｏａ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−ＯＭｅＢｏｃ−
Ｐｈｅ−ＯＨＣ左、３ ／ ＆ ） （０，０２ｍｏ］
−）とＮ−メチルモルホリン（２，０グー）のＴＨＦ
（２０ｍｌ ）溶液に、インブチルクロロホーメート（
，２，Ａ ４ｔづ）を−１０℃で添加した。
３０秒後に、Ｈ−Ｍｅｔ−ＯＭｅＨＣｌ（’Ｉ 、 ０
０ 、！ｉ’ ）とトリエチルアミン（５，Ａθｔｎ！
、）のＤＭＦ（１０ｍｇ）冷溶液を、上記混合無水溶液
と混合した。混合物は一７０℃でＳ分間、０℃でＳ分間
、室温で３０分間攪拌された。溶媒を留去し、残留物を
飽オＤ ＮａＨＣＯ３を添加し固体化した。
０ 、！ｉ’ ）とトリエチルアミン（５，Ａθｔｎ！
、）のＤＭＦ（１０ｍｇ）冷溶液を、上記混合無水溶液
と混合した。混合物は一７０℃でＳ分間、０℃でＳ分間
、室温で３０分間攪拌された。溶媒を留去し、残留物を
飽オＤ ＮａＨＣＯ３を添加し固体化した。
沈殿物をろ過で集め、水洗した。Ａｃ０Ｅｔ−石油エー
テルによる沈殿で、所望の物質１７ ／ ９が得られた
（収率ｆｆ ／、７ ％ ）。
テルによる沈殿で、所望の物質１７ ／ ９が得られた
（収率ｆｆ ／、７ ％ ）。
Ｒｆ Ｏ，ｇ７、Ｒｆ θ、ざＳ
ｍ、ｐ、 Ａ ９−９０℃
１１Ｖ）Ｂｃｃ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｎ２Ｈ。
Ｂｏｃ Ｐｈｅ Ｍｅｔ ＯＭｅ（’１．７ ｇ ）
（０，０／ ｍｏｌ）のＭｅＯＨ（３θｍｌ ）水冷溶
液に９０ ％ Ｎ、Ｈ４・Ｈ２０を加え、９℃で１時間
、ついで室温で１１時間放置する。水を除却すると、沈
殿が生成した。
（０，０／ ｍｏｌ）のＭｅＯＨ（３θｍｌ ）水冷溶
液に９０ ％ Ｎ、Ｈ４・Ｈ２０を加え、９℃で１時間
、ついで室温で１１時間放置する。水を除却すると、沈
殿が生成した。
これをろ取し、真空下にＨ２ＳＯ４−Ｐ２Ｏ３で乾燥し
た。生成物はＭｅＯＨ−Ｅｔ、○で再沈殿させた。収量
３．３ｇ＆（ｇコ、４％）。
た。生成物はＭｅＯＨ−Ｅｔ、○で再沈殿させた。収量
３．３ｇ＆（ｇコ、４％）。
Ｒｆ ｏ、ｇ／ 、 Ｒｆ Ｏ，ｇ’１ｍ、
ｐ、／ Ｊダー／、３！ｉ℃ （Ｖ） Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎ、Ｈ，
（’Ｉ ０９ 、’ｌ ９ ）ジシクロへキシルジイミ
ド（ＤＯＯ） （ｌＩｕθ■、２ｍｍｏ１）を、Ｂｏａ
−Ｔｙｒ−ＯＢ（Ａ ３θ■）とＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（コ３θｒｎｙ ）のＴＨＦ（１０ｍｇ）氷冷
溶液に添加した。
ｐ、／ Ｊダー／、３！ｉ℃ （Ｖ） Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎ、Ｈ，
（’Ｉ ０９ 、’ｌ ９ ）ジシクロへキシルジイミ
ド（ＤＯＯ） （ｌＩｕθ■、２ｍｍｏ１）を、Ｂｏａ
−Ｔｙｒ−ＯＢ（Ａ ３θ■）とＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（コ３θｒｎｙ ）のＴＨＦ（１０ｍｇ）氷冷
溶液に添加した。
混合物を０℃で７時間、グ℃で７３時間攪拌し、ついで
ろ過した。ろ液を蒸留し、残留物を石油エーテルで細か
くずりつぶし、真空中で乾燥した。
ろ過した。ろ液を蒸留し、残留物を石油エーテルで細か
くずりつぶし、真空中で乾燥した。
このようにして粗Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−Ｏ８ｕが得られた。
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＭｅＨＣｌ［Ｇ’：Ｌｙ−Ｇｌ
ｙ−ＯＭｅ （ｊｒ Ａ ＯＨ２，２ｍｍｏ１）の水素
化によシ調製される〕とトリエチルアミン（０，２ｇｄ
） のＤＭＦ（、ｔ−）水冷溶液に上記ＢＯｃ−Ｔｙｒ
−０≦ＵのＤＭＦ（ｊ＋＋＋ｊｌり溶液を加えた。混合
物は室温で７３時間攪拌され、溶媒は留去された。
ｙ−ＯＭｅ （ｊｒ Ａ ＯＨ２，２ｍｍｏ１）の水素
化によシ調製される〕とトリエチルアミン（０，２ｇｄ
） のＤＭＦ（、ｔ−）水冷溶液に上記ＢＯｃ−Ｔｙｒ
−０≦ＵのＤＭＦ（ｊ＋＋＋ｊｌり溶液を加えた。混合
物は室温で７３時間攪拌され、溶媒は留去された。
残留物はＡｃ０Ｅｔで３回抽出され、引続いて１Ｎクエ
ン酸で３回、飽和ＮａＨＯＯ，で３回、そして飽和食塩
水で３回洗浄し、Ｎａ、８０．で乾燥した。
ン酸で３回、飽和ＮａＨＯＯ，で３回、そして飽和食塩
水で３回洗浄し、Ｎａ、８０．で乾燥した。
溶媒は真空中で留去し、油状残留物をＭｅＯＨ（３θ−
）中に溶解し、ＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２０（ｉ、θｒｎｌ
）を添加した。この溶液を０℃で７時間、室温で／ｇ時
間放置した。溶媒を留去し、残留物を１−ＢｕＯＨ（３
回）及び水で抽出した。Ｉ ＢｕＯＨ層を集め、蒸留し
た。
）中に溶解し、ＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２０（ｉ、θｒｎｌ
）を添加した。この溶液を０℃で７時間、室温で／ｇ時
間放置した。溶媒を留去し、残留物を１−ＢｕＯＨ（３
回）及び水で抽出した。Ｉ ＢｕＯＨ層を集め、蒸留し
た。
残留物はＥｔ２０を加えて固体化した。収量ダダＯ■（
５３，７チ） Ｒｆ Ｏ，ｂＯ，Ｒｆ θ、７ｊｍ、ｐ、 ９
’Ｉ−９！ｒ’ｃ Ｍ ＢＯＣ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−ｈｒｇ−ａｌｙ−Ｌｅ
ｕ−ＯＨ（ＭＷ７．２２．９Ａ）Ｚ−Ａｒｇ（ＮＯ，）
−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ（／、、ｔ７ｇ）（０，００３
ｍ０１）をＭｅＯＨ（３（ｈｎｌ） と３０ ％ ＡＣ
ＯＨ（２θ−）中、Ｐｄでグに時間、水素化した。
５３，７チ） Ｒｆ Ｏ，ｂＯ，Ｒｆ θ、７ｊｍ、ｐ、 ９
’Ｉ−９！ｒ’ｃ Ｍ ＢＯＣ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−ｈｒｇ−ａｌｙ−Ｌｅ
ｕ−ＯＨ（ＭＷ７．２２．９Ａ）Ｚ−Ａｒｇ（ＮＯ，）
−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ（／、、ｔ７ｇ）（０，００３
ｍ０１）をＭｅＯＨ（３（ｈｎｌ） と３０ ％ ＡＣ
ＯＨ（２θ−）中、Ｐｄでグに時間、水素化した。
Ｒｆ Ｏ，１ｇ
亜硝酸インアミル（θ、りづ）を、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｍ
ｅｔ−Ｎ２Ｈ，（ハ、２３ｇ）、６Ｎ塩酸／ジオキサン
ｉ、ｓ−のＤＭＦ （／ ！ｒｒｎｌ）溶液に−／＆℃
で添加し、ＭｅＯＨ−ＡｃＯＥｔで沈殿させた。収量ハ
３ざ９（ｂ３．１．チ）。
ｅｔ−Ｎ２Ｈ，（ハ、２３ｇ）、６Ｎ塩酸／ジオキサン
ｉ、ｓ−のＤＭＦ （／ ！ｒｒｎｌ）溶液に−／＆℃
で添加し、ＭｅＯＨ−ＡｃＯＥｔで沈殿させた。収量ハ
３ざ９（ｂ３．１．チ）。
工
Ｒｆ Ｏ，Ｓｌ！； 、 Ｒｆ Ｏ，’ｌ’１
ｍ、ｐ、／２コー／２ダ℃ （Ｖｌｌ） Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈ
ｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＭＷｌｏ
ｏｏ、コ？） ＢＯＣ−ＰＭ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇ’１ｙ−Ｌｅｕ−Ｏ
Ｈ（ＪＡθｒｎｙ、 ｏ、ｏｏｏｒｍｏｌ ） ｋ、エ
タンジチオールの存在下に、トリフルオロ酢酸（３−）
で７５分間処理した。
ｍ、ｐ、／２コー／２ダ℃ （Ｖｌｌ） Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈ
ｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＭＷｌｏ
ｏｏ、コ？） ＢＯＣ−ＰＭ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇ’１ｙ−Ｌｅｕ−Ｏ
Ｈ（ＪＡθｒｎｙ、 ｏ、ｏｏｏｒｍｏｌ ） ｋ、エ
タンジチオールの存在下に、トリフルオロ酢酸（３−）
で７５分間処理した。
Ｒｆ Ｏ，３３、
亜硝酸イソアミル（０，θＡ ？ ｗｄｌ ） ｆ 、
Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎ、Ｈ，（２／ ０
〜）、Ａ ＮＨ（Ｅｌのジオキサン（Ｏ，ユ５−）浴液
に、−７５℃で撹拌下に添加した。−公債に、トリエチ
ルアミン（ハ！Ａｍｊりを加えて、ＰＨをりに調整した
。得られるアジド浴液を、上記トリペプチドとトリエチ
ルアミン（ハ２６−）のＤＭＦＬ２θ−）及び水（，１
１ｎｌ）溶液に＝７θ℃で添加した。
Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎ、Ｈ，（２／ ０
〜）、Ａ ＮＨ（Ｅｌのジオキサン（Ｏ，ユ５−）浴液
に、−７５℃で撹拌下に添加した。−公債に、トリエチ
ルアミン（ハ！Ａｍｊりを加えて、ＰＨをりに調整した
。得られるアジド浴液を、上記トリペプチドとトリエチ
ルアミン（ハ２６−）のＤＭＦＬ２θ−）及び水（，１
１ｎｌ）溶液に＝７θ℃で添加した。
混合物をダ℃で２０時間攪拌し、溶媒を留去した。残留
物は／ −ＢｕＯＨ−Ｈ２Ｏで抽出した。
物は／ −ＢｕＯＨ−Ｈ２Ｏで抽出した。
／ −ＢｕＯＨ層を集め、蒸留した。
残留物はＡｃ０Ｅ；ｔを添加して固体化された。
この生成物は精製された。２分後に、溶液は、トリエチ
ルアミン（０，２／ｍｅ）を加えて中オロされた。得ら
れるアジド溶液は保護基を脱離されたペンタペプチドＴ
ＦＡとトリエチルアミン（０，Ａ３ｙ）のＤＭＦ （５
ｍｌ）溶液と一緒にされた。混合物はグ℃で２０時間攪
拌され、浴媒は留去された。
ルアミン（０，２／ｍｅ）を加えて中オロされた。得ら
れるアジド溶液は保護基を脱離されたペンタペプチドＴ
ＦＡとトリエチルアミン（０，Ａ３ｙ）のＤＭＦ （５
ｍｌ）溶液と一緒にされた。混合物はグ℃で２０時間攪
拌され、浴媒は留去された。
残留物は／−ＢｕＯＨとＨ２Ｏで抽出された。
／−ＢＬＩＯＨ層は蒸留され、残留物はＥｔ２０を加え
て固体化された。
て固体化された。
ＭｅＯＨ、！： Ａｃ０Ｆｔからの再沈殿により所望の
物質ｙ１０ｒｎｇが得られた（収率ｇｘ％）。
物質ｙ１０ｒｎｇが得られた（収率ｇｘ％）。
Ｒｆ Ｏ，乙コ 、
（ｖｉｊ［） ＨＴｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ｍｅｔ ＡｒｇＧｌｙ Ｌｅｕ ＯＨ上記のＢｏｃ−オ
クタペプチドを、トリフルオロ酢酸（２−）に溶解し、
エタンジチオールの存在下、室温で、２０分間放置した
。
Ｍｅｔ ＡｒｇＧｌｙ Ｌｅｕ ＯＨ上記のＢｏｃ−オ
クタペプチドを、トリフルオロ酢酸（２−）に溶解し、
エタンジチオールの存在下、室温で、２０分間放置した
。
Ｒｆ Ｏ，’ＩＯ、
無水Ｅｔ、、Ｏを該溶液に添加した。生成する沈殿を集
め、乾燥した。得られる粉末を、ｏ、ｏコ％ｘタンｆ
オール（／ ００ｍ１ ）を含む０．０／ＭＡ、ｃＯＮ
Ｈ，に溶解し、ＣＭ−’５ｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−ｒｓ’
のカラムで処理しついで、島速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）を行なった。
め、乾燥した。得られる粉末を、ｏ、ｏコ％ｘタンｆ
オール（／ ００ｍ１ ）を含む０．０／ＭＡ、ｃＯＮ
Ｈ，に溶解し、ＣＭ−’５ｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−ｒｓ’
のカラムで処理しついで、島速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）を行なった。
Ｒｆ Ｏ，，３；ＸＲｆ θ、乙７〔α〕■＋ ハ
／” （ｃｏ、／デ、 ］、ＭＡｃＯＨ）〔α）：
＋ ／３．．３６（００，２１１、ＭｅＯＨ）Ｃ４１
Ｈ６１ＮｌｌＯＩＬＩＳｌ、 ０ａｌｃｄ、： Ｃ，３０，３；ｌ：Ｈ，７，０’ｌ：
Ｎ、／’１．３’ＩＦｏｕｎｄ ： Ｏ，左０．２／：
Ｈ，Ａ、９／：Ｎ、＃、／＋２酸加水分解におけるアミ
ノ酸比 Ａｒｇ Ｏ，９，２（１）、 Ｇ１７３．＃ （３）、
Ｍｅｔ ０．９Ａ （１）、 Ｌｅｕ θ、ｑり
（１）、Ｔｙｒ ／、００ （１）、 Ｐｈ、ｅ
Ｏ，デｑ（１）、Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ９３．／
％ 実施例／ （免疫用抗原の調製） 参考例／で得られたペプチドＴｙｒ−０１７Ｇ１７−Ｐ
ｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ、−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ（、？
りと、ウシ血清アルプミ７ （ＢＳＡ） （／、２ｍ９
）を０．／ Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７゜Ｏ）（，７
ｍｇ）中に溶解する。
／” （ｃｏ、／デ、 ］、ＭＡｃＯＨ）〔α）：
＋ ／３．．３６（００，２１１、ＭｅＯＨ）Ｃ４１
Ｈ６１ＮｌｌＯＩＬＩＳｌ、 ０ａｌｃｄ、： Ｃ，３０，３；ｌ：Ｈ，７，０’ｌ：
Ｎ、／’１．３’ＩＦｏｕｎｄ ： Ｏ，左０．２／：
Ｈ，Ａ、９／：Ｎ、＃、／＋２酸加水分解におけるアミ
ノ酸比 Ａｒｇ Ｏ，９，２（１）、 Ｇ１７３．＃ （３）、
Ｍｅｔ ０．９Ａ （１）、 Ｌｅｕ θ、ｑり
（１）、Ｔｙｒ ／、００ （１）、 Ｐｈ、ｅ
Ｏ，デｑ（１）、Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ９３．／
％ 実施例／ （免疫用抗原の調製） 参考例／で得られたペプチドＴｙｒ−０１７Ｇ１７−Ｐ
ｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ、−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ（、？
りと、ウシ血清アルプミ７ （ＢＳＡ） （／、２ｍ９
）を０．／ Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７゜Ｏ）（，７
ｍｇ）中に溶解する。
この溶液をグ℃に冷却し、θ、０．２ Ｍグルタルアル
デヒド（３−）を滴下により添加し、混合物を室温で５
時間保持し、精製水（，２ｔ）により弘℃でｌＩｇ時間
透析し、真空乾燥し、コンジュゲート（／ １１．Ａ■
）を得た。
デヒド（３−）を滴下により添加し、混合物を室温で５
時間保持し、精製水（，２ｔ）により弘℃でｌＩｇ時間
透析し、真空乾燥し、コンジュゲート（／ １１．Ａ■
）を得た。
（免疫）
このペプチド−蛋白コンジュゲート（３■）をフロイン
）（Ｆｒθｕｎｄ ）の完全アジュバント（Ｌ＆ｍｇ）
及び生理食塩水（／、！；ｍｌ）で懸濁し、懸濁液（／
ｍｌ ）を３匹の家兎（ｕ、５−３．θに９）に皮肉
注射した。注射は、最初の注射の弓の量で一週間毎にく
り返しだ。
）（Ｆｒθｕｎｄ ）の完全アジュバント（Ｌ＆ｍｇ）
及び生理食塩水（／、！；ｍｌ）で懸濁し、懸濁液（／
ｍｌ ）を３匹の家兎（ｕ、５−３．θに９）に皮肉
注射した。注射は、最初の注射の弓の量で一週間毎にく
り返しだ。
（標識抗原）
参考例／で得られたペプチドＴｙｒ−Ｇａｙ−Ｇｌｙ−
のクロラミンＴ法によりヨード化した。すなわち、／、
０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，’ｌ、、２０μｔ）に、ｆ
ｉ！ｌ製氷（／θμｔ）中のペプチド（３μｔｒ）、ｓ
ｏｏμａｉ。
のクロラミンＴ法によりヨード化した。すなわち、／、
０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，’ｌ、、２０μｔ）に、ｆ
ｉ！ｌ製氷（／θμｔ）中のペプチド（３μｔｒ）、ｓ
ｏｏμａｉ。
の〔１２５工）Ｎａ及びＭＪＪ水（１０μｔ）中のクロ
ラミンＴ（２０μｇ）を連続的に添加し、混合物を３０
秒間振とうし、精製水（３０μｔ）中のメタ重亜鎖酸ナ
トリウム（７００μｇ）を加えて反応を停止した。つい
で混合物を、７Ｍ酢酸を溶離液とする“セファデックス
Ｇ１０ ”のカラム（／、θＸ ３０ Ｌ−１ｎ）に付
し、精製した。
ラミンＴ（２０μｇ）を連続的に添加し、混合物を３０
秒間振とうし、精製水（３０μｔ）中のメタ重亜鎖酸ナ
トリウム（７００μｇ）を加えて反応を停止した。つい
で混合物を、７Ｍ酢酸を溶離液とする“セファデックス
Ｇ１０ ”のカラム（／、θＸ ３０ Ｌ−１ｎ）に付
し、精製した。
（ラジオイムノアセイ）
希釈剤として、Ｂ Ｓ Ａ’（０，！；％）、ＫＤＴＡ
（，０，０ｘｓＭ）及びＮａｐｔ（０，／ ｌ１Ｍ）を
含むリン酸緩衝液（０，０／Ｍ、 ｐＨ７，’ｌ ）を
使用した。
（，０，０ｘｓＭ）及びＮａｐｔ（０，／ ｌ１Ｍ）を
含むリン酸緩衝液（０，０／Ｍ、 ｐＨ７，’ｌ ）を
使用した。
希釈剤（ＯｏりｒｒＬｅ）、標準品又は検体（０，／艷
）、希釈（最終：左乙、θＯＯ倍）した本発明に係る抗
血清Ｒ−θ／７／（θ、／ｍｒｔ）及び標識抗原（左、
Ｏθθ−１０，０θＯｃｐｍ ） （０，／ｍｌ）をイ
ンキュベー７ヨンチューブ中で混合した。混合物を１℃
でｑｇ時間インキュベートし、デキストラン（０，０２
５％）被覆炭末（ｏ、、２ｓチ）の懸濁液（／ｍｅ）を
加えた。９℃で３０分間インキュベー ） Ｌ［Ｍ、遠
心分離（＋℃、３，０００ｒｐｒｎ、 ／！ｒ分１…）
シ、上清を分離し、カウントする。第１図は、このよう
にして得られた標準曲線である。
）、希釈（最終：左乙、θＯＯ倍）した本発明に係る抗
血清Ｒ−θ／７／（θ、／ｍｒｔ）及び標識抗原（左、
Ｏθθ−１０，０θＯｃｐｍ ） （０，／ｍｌ）をイ
ンキュベー７ヨンチューブ中で混合した。混合物を１℃
でｑｇ時間インキュベートし、デキストラン（０，０２
５％）被覆炭末（ｏ、、２ｓチ）の懸濁液（／ｍｅ）を
加えた。９℃で３０分間インキュベー ） Ｌ［Ｍ、遠
心分離（＋℃、３，０００ｒｐｒｎ、 ／！ｒ分１…）
シ、上清を分離し、カウントする。第１図は、このよう
にして得られた標準曲線である。
また、第一図は、本発明に係る抗血清の交差反応性を示
すものである。
すものである。
実施例ユ
（免役用抗原の調製）
参考例／で得られたペプチド（３■）と、ウシチログロ
ビン（３Ａ、Ａ■）を精製水（−ｍｅ ）中に溶解する
。この溶液に、／−エチル−、？−（３−ジメチルーア
ミノグロビル）カルボジイミド塩酸塩（，７０７ｎ？
）を蒸留水（／ｍりに溶解して加える。混合物を０．／
ＮＨＯｌでｐ）＋５．Ａに調整する。室温で７３時間
攪拌したのち、混合物を精製水（ｑｚ）により＋℃で２
グ時間透析しく免疫） 得られたコンジュゲート（／θθ−−００μ！りを等量
のフロイントの元金アジュバントで乳化し、ニューシー
ラント白ウサギに皮肉注射した。
ビン（３Ａ、Ａ■）を精製水（−ｍｅ ）中に溶解する
。この溶液に、／−エチル−、？−（３−ジメチルーア
ミノグロビル）カルボジイミド塩酸塩（，７０７ｎ？
）を蒸留水（／ｍりに溶解して加える。混合物を０．／
ＮＨＯｌでｐ）＋５．Ａに調整する。室温で７３時間
攪拌したのち、混合物を精製水（ｑｚ）により＋℃で２
グ時間透析しく免疫） 得られたコンジュゲート（／θθ−−００μ！りを等量
のフロイントの元金アジュバントで乳化し、ニューシー
ラント白ウサギに皮肉注射した。
（標識抗原）
実施例ノにおけるクロラミンＴ法によって°ミード化し
た。反応混合物を、オクタテシルシンセグ バソク ン−０，８を充填した” ５ｅｐ−Ｐａｋ ’ Ｃ，、
カートリッジに付し、酢酸アンモニウム（７０ｍＭ）−
メタノール（、？０％）で浴出させてＮ製した。
た。反応混合物を、オクタテシルシンセグ バソク ン−０，８を充填した” ５ｅｐ−Ｐａｋ ’ Ｃ，、
カートリッジに付し、酢酸アンモニウム（７０ｍＭ）−
メタノール（、？０％）で浴出させてＮ製した。
（ラジオイムノアセイ）
希釈剤としてｏ、ｓ ％ヒト血清アルブミン（フラクシ
ョンｖ）、ｏ、ｉ％６ トリドアＸ−１００’及び０．
０７％“マーチオレート”を含む０．０３； Ｍのリン
酸緩衝液（ｐＨ’７．ｌＩ）を用いた。標準ペプチド又
は検体（／θ０μｔ）、最終希釈倍率／：ダ０００の本
発明に係る抗血清（Ｎ］ｂ２−．２０１．）（ｉ ｏ
ｏｔｒｔ ） 、１２５ｘ テａｍ した抗原（ユ×／
θ’ｃｐｍ’）（ｉｏｏμｔ）及び上記水剤（，２００
μｔ）を混合し、ｔ℃でユリ時間インキユーベートシた
０デキストラン被俊炭末の懸濁液／、０づを添加し、実
施例／と同様な方法によりカウントした０このようにし
て得た標準曲線を第３図に示す。
ョンｖ）、ｏ、ｉ％６ トリドアＸ−１００’及び０．
０７％“マーチオレート”を含む０．０３； Ｍのリン
酸緩衝液（ｐＨ’７．ｌＩ）を用いた。標準ペプチド又
は検体（／θ０μｔ）、最終希釈倍率／：ダ０００の本
発明に係る抗血清（Ｎ］ｂ２−．２０１．）（ｉ ｏ
ｏｔｒｔ ） 、１２５ｘ テａｍ した抗原（ユ×／
θ’ｃｐｍ’）（ｉｏｏμｔ）及び上記水剤（，２００
μｔ）を混合し、ｔ℃でユリ時間インキユーベートシた
０デキストラン被俊炭末の懸濁液／、０づを添加し、実
施例／と同様な方法によりカウントした０このようにし
て得た標準曲線を第３図に示す。
第１及び３図は本発明に係る抗血清を用いるＲ工Ａの標
準曲線を示し、第一図は本発明に係る抗血清の交差反応
性を示すものである。 出 願 人 三後化成工菓体式会社 代 理 人 弁理士長香川 − ほか７名 蒸 １ 図 （ｐｌ／ｆｕｂｅ）
準曲線を示し、第一図は本発明に係る抗血清の交差反応
性を示すものである。 出 願 人 三後化成工菓体式会社 代 理 人 弁理士長香川 − ほか７名 蒸 １ 図 （ｐｌ／ｆｕｂｅ）
Claims (1)
- （１） Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−（）１７−ｒｈｏ−Ｍｅｔ
−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕで示されるペプチドを抗原と
してこれを温血動物に免疫することによりその血液より
取得され、このペプチドに特異的な反応性を有する抗血
清０
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1388383A JPS59138958A (ja) | 1983-01-31 | 1983-01-31 | 抗血清 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1388383A JPS59138958A (ja) | 1983-01-31 | 1983-01-31 | 抗血清 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59138958A true JPS59138958A (ja) | 1984-08-09 |
Family
ID=11845596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1388383A Pending JPS59138958A (ja) | 1983-01-31 | 1983-01-31 | 抗血清 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59138958A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999024074A3 (en) * | 1997-11-07 | 1999-08-19 | Conjuchem Inc | Novel conjugates of opioids and endogenous carriers |
| EP1167383A1 (en) * | 1997-11-07 | 2002-01-02 | Conjuchem, Inc. | Novel conjugates of opioids and endogenous carriers |
-
1983
- 1983-01-31 JP JP1388383A patent/JPS59138958A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999024074A3 (en) * | 1997-11-07 | 1999-08-19 | Conjuchem Inc | Novel conjugates of opioids and endogenous carriers |
| EP1167383A1 (en) * | 1997-11-07 | 2002-01-02 | Conjuchem, Inc. | Novel conjugates of opioids and endogenous carriers |
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