JPH0224838B2 - - Google Patents

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JPH0224838B2
JPH0224838B2 JP55153943A JP15394380A JPH0224838B2 JP H0224838 B2 JPH0224838 B2 JP H0224838B2 JP 55153943 A JP55153943 A JP 55153943A JP 15394380 A JP15394380 A JP 15394380A JP H0224838 B2 JPH0224838 B2 JP H0224838B2
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opioid
leu
enkephalin
arg
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ADEIKUSHON RISAACHI FUANDEESHON
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

【発明の詳細な説明】
鎮痛薬が痛みを軽減せしめる機序を理解しそし
てより有効であり且つ副作用のより少ない新規な
鎮痛薬を開発しようとする要望から、β−エンド
ルフイン並びに比較的小さいポリペプチド類であ
るロイ−エンケフアリン及びメトーエンケフアリ
ンが発見された。β−エンドルフインの最初の５
個のアミノ酸はメト−エンケフアリンの５個のア
ミノ酸である。比較的小さいポリペプチド類の活
性は実質的にβ−エンドルフインより低いため、
ロイ−エンケフアリン及びメト−エンケフアリン
を改良してそれらの活性を高めようとする試みが
活発に行われた。 ポリペプチドの減成を抑制するための種々の技
術は、アミノ酸の１種の人工的立体異性体の使用
を包含している。また、活性を強化又は変性する
ためにカルボキシ末端はアミド化され、そして
種々のアミノ酸が鎖の末端に加えられた。 新規なポリペプチド鎮痛薬の開発においては、
多数の重要な考慮点がある。望ましい鎮痛薬は比
較的少ないアミノ酸を有しており、その結果良好
な収率で容易にそして経済的に合成される。さら
にポリペプチド鎮痛薬は容易に投与され、その本
来の結合部位に移行することが望ましい。さら
に、ポリペプチドは鎮痛効果を得るための結合部
位に隣接して又はその部位に導入されねばならな
い。望ましくは、効力は市販の鎮痛薬より実質的
に高くあるべきであるが、同時に少ない投与量の
ため又はそれの特別の構造のため、鎮痛薬は望ま
しくない副作用をできるだけ有すべきでない。 市販の多数のアミノ酸並びに例えばアセチル化
及びアミド化の如き可能な修正法を用いることに
より、オピオイド効力を得るためにアミノ酸を結
合させる可能性は天文学的数字になる。ロイ−エ
ンケフアリン及びメト−エンケフアリンはモルヒ
ネ及び同族体オピオイド類の小さい寸法という観
点ではモルヒネのフエノール基と同様であるチロ
シン基を有するが、エンケフアリンをどのように
して延ばすか及び延ばされたときにβ−エンドル
フイン順序以外はどのようにしてそれらの効力を
強化しもしくは活性を改良するかについての指針
はない。従つて、ポリペプチド鎮痛薬が有する可
能性はそれ自体存在するが、適当な構造を決定す
る能力は依然として困難である。 Coxらの（1975）Life Sci.16、1777及び
Lowneyらの（1979）Life Sci.24、2377は２種の
下垂体オピオイド（opioid）ペプチド類を報告し
ている。 Kangawaらの（1979）Biochem，Biophys.
Res.Comm.86、153は豚の視床下部からのオピオ
イドペプチドを報告している。 本発明は、式 Ｈ−tyr−gly−gly−phe−leu−arg−arg−ile
−arg−pro−lys−leu−lys−W3 ［式中、W3はヒドロキシル又はアミノである］
で表わされる新規のポリペプチド化合物を提供す
るものであるが、このオリゴペプチドはオピオイ
ド化合物、特にポリペプチドオピオイド、と複合
化する（conjugate）ための前駆体として使用さ
れる。該オリゴペプチドは短かい鎖によりフエノ
ール基に結合され、このフエノール基はチロシル
単位又はモルフインアルカロイド又はそれの合成
の模倣性類似体の一部であることができる。 特に興味あるものは、Ｎ−末端に、５個のアミ
ノ酸順序のロイ−エンケフアリンを有するトリデ
カペプチド及び交互順序を含むオクタペプチドを
有するポリペプチドである。 主題の化合物は鎮痛薬用の前駆体として、鎮痛
薬として、オピオイド作動薬（agonist）として、
そしてオピオイド結合部位の構造の研究における
用途が見出された。最後に、主題のポリペプチド
を逆のアミノ酸を有する酸性ポリペプチドと一緒
にして実質的に中性の塩を与えることもできる。 本発明に従えば、塩基性親水性側鎖及び疎水性
側鎖又は水素が交互に存在するオリゴペプチドを
５組、普通６組、含有する、哺乳動物のオピオイ
ド受容体に結合させる際に使用するための化合物
が提供される。オリゴペプチドは望ましくは比較
的短かい鎖によりフエノール基に結合されてお
り、ここでアミノ酸鎖は一般的に少なくとも１個
のアミノ酸、普通は約３〜６個のアミノ酸、を有
しており、又は少なくとも３個のそして18個を越
えない原子により結合されており、ここで該鎖中
の原子はＣ及びＮであり、一方結合基は鎖とそれ
に結合しているＣ，Ｈ，Ｎ及びＯからなる原子か
ら構成されており、ここでＯはオキシ又は非オキ
ソーカルボニルであり、Ｎはアミノ又はアミドで
あり、そしてＣは脂肪族（脂環式を含む）であ
る。オリゴペプチドは、例えばモルヒネ、ロイ−
エンケフアリン又はメト−エンケフアリンの如き
公知のオピオイド活性を有する化合物に、エノー
ル基から離れた部位で結合される。オピオイド化
合物は少なくとも約1200、普通は1500、そして約
2500を越えない、分子量を有する。それらは一般
に約４〜６個、普通は５個の塩基性アミノ酸基を
有しており、他の塩基性アミノ酸に結合している
全体で４個より多くない塩基性アミノ酸を有して
いる。 オピオイド活性により、働筋（agonist）、拮抗
筋（autagonist）及び部分的働筋活性が意図され
る。オピオイド活性は例えばモルモツトの回腸の
如き一般的試験及び以下に記載されている輸精管
試験での有効性により認識される。拮抗筋はその
ような試験で有効性ではないが有効である化合物
と遮断できる化合物である。部分的働筋は、両方
の効果を示し、試験である効果を有するが他の有
効化合物を遮断できるような化合物である。事実
上、それらの化合物の全てはオピオイド受容体用
の配位子（ligand）である。 主題の化合物は一般的技術により、例えば樹脂
支持体上で実施される固体状態技術により容易に
製造することができる。Steward及びYoung，
Solid−Phase Peptide Synthesis，W.H.
Freeman Co.SanFrancisco（1969）及び
Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85．2149〜2154
（1963）参照。簡便には、オリゴペプチド類は、
Beckman Instruments，Inc.のSpinco Division
から入手できる、1972年12月のInstruction
Manual No. SY−IM−２中に記載されている
Beckman Model 990 Peptide Synthesizerを用
いて自動的に合成することができる。 本発明の化合物、特にトリデカー及び高級オリ
ゴペプチド類は、ラベルされたオリゴペプチドを
用いる免疫検定で使用するための抗血清の製造の
ために使用することができる。簡便には、オリゴ
ペプチドは抗原と、ジアルデヒド、特に炭素原子
数４〜６個の脂肪族のものにより複合化すること
ができる。オリゴペプチドは文献中で一般的に使
用されている種々のラベルを付けることができ
る。患者中で観察される代表的ラベルは、放射性
の札（tag）、例えば125Iもしくは3H、酵素、螢光
などである。例えば米国特許第3766162，3817837
及び3998943号を参照のこと。ラベル付け及び免
疫検定についてを記載しているそれらの文献の適
当な部分をここに参照として記載しておく。 下記の実施例は本発明をさらに説明するための
ものであり、本発明を限定するためのものではな
い。 実 験 （温度はすべて他に指示しない限り摂氏温度で
ある。％及び部数はすべて、液体の混合物が容量
による以外、他の指示しない限り重量によるもの
である。）下記の組成物が以下の如くして単離さ
れた。 Ｈ−tyr−gly−gly−phe−leu−arg−arg−ile
−arg−pro−lys−leu−lys−OH 該化合物はダイノルフイン（dynorhin）と称
せられる。 豚のダイノルフインの精製及び部分的順列化 出発物質は、豚の下垂体からの商業的ACTH
製造における第二のオキシセルロース吸着物
（adsobate）である100ｇのMSH濃縮物である
〔Schallyら（1962）、Endocrinology71、164〕。
25ｇのバツチを用いる最初の段階はLowneyら
（1979）Life Sci.24、2377中に記載されている：
ブタノールを用いる抽出及び逆抽出；Bio−Gel
P6上のβ−エンドルフインからの分離；最初は
トリフルオロ酢酸（TFA）中のメタノール勾配
を用いて、次に中性におけるトリス緩衝液中のア
セトニトリル勾配を用いての、C18カラム上の予
備的逆転相HPLC、及びその後のTFAを用いて
の活性物質の溶出。各段階は、モルモツトの回腸
の腸筋の集網−縦筋（plexus−longitudinal
muscle）調製物上での試験により監視された。
Kosterlitz及びWaberfled（1975）、Ann.Rev.
Pharmacol.15、29；Schulz及びGoldstein（1973）
Brit.J.Pharmacol.48、655。 上記の如くして得られた４個のバツチからの貯
蔵された物質を、PH8.7の0.1M（NH4）2CO3中の
Bio−Gelカラム（商標名Ｐ−６及びＰ−４、
４：１；1.5×90cm）上においた。一部分（1.7
ml、15分）を生物検査で活性に関して試験した。
遅延逆転活性のピーク（Lowney、前記）（部分
65〜75）を凍結乾燥し、次にPH11.0の12.5ミリモ
ルほう酸ナトリウム緩衝液で平衡化されたCM−
Sephadex（商標名：0.9×30cm）上でさらに精製
した。物質を出発緩衝液からPH12.0の0.1Mりん
酸塩緩衝液までの106mlの線上勾配を用いて溶出
した。留分（2.0ml）、15分を集めそして検査し
た。遅延逆転活性が94〜106mlの間で発生した。
活性の50％を含有している２個のピーク管をプー
ルし、そしてブタノール：酢酸：水（２：１：
４）中でBio−Gel Ｐ−２（1.5×90cm）上で脱塩
した。 最後に、脱塩された物質をHPLC（C18カラム）
上で５ミリモルのTFA中の10〜50％アセトニト
リル勾配を用いて逆転相クロマトグラフイにかけ
た。生物学的活性のピークは280nmにおいて測定
可能な吸収を有していなかつた。225及び215nm
における吸収からの概略推定量は、２〜３マイク
ログラムだけのペプチドの存在を示すが、生物検
定における活性は334nモルのノルモルヒネに相
当していた（４個の組織片では189〜525の範囲）。 その物質の1/3をダンシル化し（dansylate）、
シリカゲル60H（メルク）TLC板に適用し、そし
て酢酸メチル：ピリジン：メタノール（９：７：
４）中で展開した。２個の螢光帯がRf＝０（帯
１）及びRf＝0.20（帯２）でみられた。 各帯をメタノール：ピリジン：酢酸（１：１：
１）を用いて抽出すると、Rf＝0.33（帯１）及び
Rf＝0.51（帯２）を用いてのｎ−ブタノール：酢
酸：水（４：１：５、上相）中でのTLCにより
物質であることが示された。加水分解（6NHCl、
16時間、105℃）後に、各帯からの物質をダンシ
ル化されたＮ−末端残基に関して、逆転相HPLC
（C18カラム、45分間の線状勾配、10ミリモルトリ
ス中の５〜50％アセトニトリル、PH7.0、Varian
螢光計検出器）を用いて試験した。根跡量のε−
DYN−lys及びジ−DNS−tyrが帯１からの加水
分解物中で検出された。帯２の加水分解物はε−
DNS−lysだけを表わした。 ペプチドの顕微鏡追跡はスピニングカツプ方法
により行なわれた。Hunkapiller及びHood
（1978）Biochemistry17、2124。全物質の1/3を
用いて、13個の残基に対して明白な順序が得られ
た。最初の２〜３サイクルから推定されるペプチ
ドの量は約400Pモルであり、従つて生物検定に
おける性能は334／0.400の約1/3であり、すなわ
ちノルモルヒネの267倍であつた。遮断された不
純物の存在は組成物のデータで確認され、それら
は明らかに非整数比を与えた。 トリデカペプチドは豚のダイノルフイン−（１
−13）：Ｈ−tyr−gly−gly−phe−leu−arg−arg
−ile−arg−pro−lys−leu−lys−OHに相当する
順序で合成された。純度は下記のシステムで98％
より高いことが示された：(a)ｎ−ブタノール：ピ
リジン：酢酸：水（42：24：４：30）、セルロー
ス板、Rf＝0.54；(b)ｎ−ブタノール−酢酸−水
（４：１：５上相）、シリカゲル板、Rf＝0.05；(c)
蟻酸−酢酸、PH1.9、電気泳動、22V／cm、１時
間、Whatman ３ MM、Rf＝1.40、ピクリン酸
に相当。組成はアミノ酸分析により確認された。
合成トリデカペプチドの順序もスピニングカツプ
順序検査器上での分析により確認された。 ２種の関連ペプチド〔ここでは“記録−移行ペ
プチド（register−shift peptide）”と称されて
いる〕も合成された。これらはダイノルフイン−
（１−13）から６番目のargが欠落したペプチド
（以下これを“RS−１”と略称する）及び５番目
のleuと６番目のargの間にglyが挿入されたペプ
チド（以下これを“RS−２”と略称する）であ
る。純度の基準はトリデカペプチドに関して上記
されているものと同じである。 生物学的活性。全ての生物検定に関してはメタ
ノール：0.1NHCl（１：１、容量／容量）中で希
釈を行ない、放射性免疫検定に関しては50ミリモ
ルのNaCl、0.1％牛血清アルブミン及び0.5％のト
リトンＸ−100を含有しているPH7.4の50ミリモル
りん酸塩緩衝液中で希釈した。 上記のKosterlitzら並びに上記のSchulz及び
Goldstein中に記載されている如くして、モルモ
ツトの回腸の腸筋の集網−縦筋調製物を使用し
た。IC50の測定は、電気刺激をうけた攣縮の50
％抑制より多い抑制を与える少なくとも１種の濃
度及び50％より少ない抑制を与える濃度を用いて
一まとめにしそして対数濃度−％抑制図表上に書
きこむことにより行なわれた。５〜６個の筋肉片
からIC50値の幾何平均が得られ、対数単位の標
準的語差を伴なつていた。拮抗筋としてのナロキ
ソンに対するKd値は、一定のナロキソン濃度の
存在及び不存在下でIC50値の比から測定された。
はつかねずみの下垂体をHughesらの（1975）
Brit.J.Pharmacol.53、371中に記載されている如
くして使用した。IC50及びナロキソンKd値は上
記の如くして測定した。両方の生成検定におい
て、５mlの組織浴中での20μまでのメタノール
−HCl溶媒の量は影響を与えなかつた。 放射性受容体結合検定は、30分間にわたつて
37゜で培養されてあり100ミリモルのNaClで良く
洗浄されて結合されていた固有の配位子を除かれ
たラツトの脳膜を使用した。Blume（1978）の
Proc・Natl.Acad.Sci.75、1713。５〜６個の放射
性配位子（1nM最終的濃度）及び匹敵する配位
子を試験した。匹敵する配位子をPH7.4の23゜のト
リス緩衝液中の膜懸濁液に加え、その直後に放射
性配位子を加えた。評価量は500μであつた。
培養後（１時間、23゜）、混合物を急冷し、濾過
し、２回洗浄し、そして計測した。レバロルフア
ン（1μM最終的濃度）による放射性配位子の置
換は立体特性の飽和可能な結合の測定値とみなさ
れ、これは普通全結合の約70％である。（＋）異
性体デキストラロルフアンはこれらの条件下では
影響を与えなかつた。全ての培養管中に50μの
量で存在しているメタノール−HCl溶媒は対照結
合に影響しなかつた。 125I−ダイノルフイン−（１〜13）は、Hunter
及びGreenwood（1962）、Nature194、495の方法
の変法により製造され、そしてSephadex Ｇ−15
カラム上で0.25モル酢酸中の0.1％牛血清アルブ
ミンを用いて未反応のヨウ素から分離された。生
体中でのラツト脳膜によるペプチドの減成は、
Bio−Ge1 Ｐ−２カラム（1.2×41cm）上でのｎ
−ブタノール：酢酸：水（２：１：４）を用いて
の放射活性ピークの移行により推定された。 ラジオイム／アツセイ用には、うさぎ中のロイ
シン−エンケフアリンに高められた、２種の抗血
清が使用された。Watsonらの（1979）、
Endorphin in Mental Research eds.Usdin、
Bunney及びKline（オクスフオード大学出版、ニ
ユーヨーク）を参照のこと。抗血清は、匹敵する
配位子の不存在下で125I−ロイシン−エンケフア
リンの約30％を結合させるのに必要な最終的希釈
度で使用された。この放射性配位子はクロルアミ
ン−Ｔ方法〔Hunter及びGreenwood（1962）、
Nature194、495〕により製造されそしてDEAE
−Sephadex上で精製された。各管中で、検査し
ようとする100μのペプチドを100μの希釈さ
れた抗血清に加え、そして混合物を4゜で48時間培
養した。次に100μの放射性配位子（約
5000cpm）を加え、そして培養をさらに24時間続
けた。100mlの正常のうさぎ血漿及び1.5mlの15.8
％ポリエチレングリコールを加えることにより培
養を終らせた。氷上での10分後に、混合物を4000
×ｇにおいて15分間遠心し、上澄み溶液を吸引
し、そして沈殿を含有している管をガンマ計数器
中にいれた。 表 １ ２種の生成検査におけるダイノルフイン−（１
〜13）の効果。IC50値は、対数投与量−％抑制
図表上に書きこまれた50％抑制応答を目測する検
査から得られた。ナロキソンKdは、匹敵する拮
抗筋用の質量法則から誘導された式Kd＝Ｄ／
（D.R.−１）から計算された、拮抗筋の明白な解
離定数であり、ここでＣ＝ナロキサンの濃度（こ
こでは100nM）、及びD.R.＝働筋の投与比、すな
わち拮抗筋の存在下及び不存在下でのIC50投与
量の比、である。同じ工程をマウスの下垂体を用
いて行なつた。IC50値は幾何学的平均であり、
対数単位の標準誤差を有しており、かつこ内は組
織調製物の数である。 Kd測定値は４種の組織調製物を基にしている。
RS−１は前記ダイノルフイン−（１−13）に対し
６番目のargが欠落したペプチドであり、RS−２
は５番目のleuと６番目のargとの間にglyが挿入
されたペプチドである。
【表】 リン
【表】
【表】
【表】
【表】 エンケフア
リン
【表】 イン
a これらの傾斜は異常に浅く、全ての他の
傾斜は質量法則式から予測される理論的傾
斜に適合している。
天然及び合成ダイノルフインはモルモツトの回
腸試験では、エンケフアリン及びβ−エンドルフ
インより実質的に活性であることが見出された。
ダイノルフインはロイ−エンケフアリンより約
1000倍、ノルモルフインより約350倍そしてβ−
エンドルフインより約30倍大きい性能を有するこ
とが見出された。この化合物はβ−エンドルフイ
ンとは異なり、臭化シアンを用いる処理に対して
比較的抵抗性でありそしてモルモツトの回腸試験
で長い持続性を有する。分子量は約1750であるこ
とが見出された。 主題の鎮痛薬組成物はそれらのオピオイド受容
体部位との相互作用のために、例えば気分転換効
果、鎮痛作用、筋肉弛緩及び血液流調整の如き広
い範囲の生理学的効果を与えることができる。主
題の試験管試験に関する生体内鎮痛効果は、
WalkerらのScience196、85（1977）中に報告され
ている研究により示されている如くしてよく実施
できる。本発明の組成物は、哺乳動物宿主、例え
ば家畜及び人間、に他のオピオイド作動薬が投与
されるのと同じ方法で投与できる。多くの場合、
投与量は70Kgの体重当り約0.05〜40mg、より普通
には約0.5〜20mg、の範囲内である。 薬品は、生理学的に許容できる粉末と混合され
て、又は普通は約60容量％以下のエタノールを有
する生理学的に許容しうる液体、例えば水又は水
性エタノール、中に溶解されて、適当に投与でき
る。薬品は経口的に、吸入により、又は非経口的
に、例えば皮下に、腹腔内にもしくは筋肉内に、
投与できる。混合物又は溶液中の濃度は一般に約
0.5〜50重量％であり、普通は約１〜30重量％で
ある。 主題の薬品は個別的に又は薬品と組み合わせて
使用され、通常は鎮痛薬と共に用いられる。これ
らの薬品にはアスピリン及びＬ−ドーパが含まれ
る。 固体状で投与されるときには、主題の薬品は丸
薬、カプセル、粉剤などの形で投与できる。 主題のダイノルフインは、特にラジオイムノア
ツセイにより代表される免疫検定の展開用に使用
される。免疫検定を行なうためには、オリゴペプ
チドを特異的に認識する抗原、この場合にはダイ
ノルフイン、を製造することが必要である。抗原
複合体を製造するために、チログロブリンを合成
ダイノルフイン（１〜13）に複合化させる。抗原
配合物を製造し、抗原複合体動物に注射し、そし
て抗血清を単離するための方法を以下に記載す
る。 合成ダイノルフイン（１〜13）（3.25μモル、
5.2mg）を２mlの100ミリモルりん酸ナトリウム緩
衝液中に中性において溶解させる。この混合物に
105cpmの125I−ダイノルフインを撹拌しながら加
えてトレーサーとして作用させた。トレーサーの
添加後に、26mgのチログリブリン（牛型１、シグ
マ）を加え、そして混合物をチログリブリンが溶
解した後に氷浴中で冷却した。グルタルアルデヒ
ドの冷水（シグマ、１級、25％水溶液）（１ml）
との１：100希釈物を撹拌しながら４℃の冷たい
室中に滴々添加し、そして撹拌を30分間続け、そ
の後室温に暖めそして撹拌を３時間続けた。 スペクトロポア透析膜（6000〜8000ダルトン．
カツトオフ）を用いて反応混合物を0.45％の
NaClを含有しているPH7.4の0.1Mりん酸ナトリウ
ム緩衝液に対して冷時に透析し、その後0.9％
NaClに対して一夜透析し、次に蒸留水に対して
（３×５時間）透析した。 親液性化後に透析袋残渣のcpmから計算された
カツプリング効率を基にして、１匹のうさぎ当り
50〜100μｇの結合されたオリゴペプチドを与え
るのに充分な複合体を使用した。６匹のうさぎに
対して、乾燥物質を４mlの0.9％NaClに加え、そ
の後４mlのフロインド（Freund）の不完全佐薬
に加えた。混合物を針付き注射器中で30分間上下
させるとにより均一に分散させ、混合物を６部分
に分割し、そして毛を刈りとられたニユージーラ
ンド白色×サンジユアン雑種うさぎに約10〜12回
の皮腐内注射をした。２週間間隔でブースター注
射とし、第４回のブースター注射の10日後に血液
をとり、50mlの血液を耳動脈から採取し、凝固さ
せ、血清をとり出しそして凍結貯蔵した。 125Iを有するトレーサージノルフイン（１〜
13）は下記の如くして製造された。 下記の試薬を製造した：0.1N水酸化ナトリウ
ム中の5μバツチ中のナトリウム125I（17ci／mg
Ｉ）をPH7.4の0.1Mりん酸ナトリウム緩衝液で希
釈して1mCi／25μの溶液を製造し、それは水酸
化ナトリウムを中和するために加えられたHClを
含有していた。 クロルアミン−Ｔ（シグマ）は0.1Mりん酸ナト
リウム緩衝液、PH7.4中で0.5mg／mlにされた。 メタ重亜硫酸ナトリウム、0.1Mりん酸ナトリ
ウム緩衝液PH7.4中１mg／ml。 ほうけい酸塩小管中に25μのダイノルフイン
（Na125Iと等モル量）、50μのNa125I、及び20μ
のクロルアミン−Ｔを加え、そして混合物を室
温で30〜45分間反応させた。100μのメタ重亜
硫酸ナトリウムを加えることにより反応を終了さ
せた。Sephadex Ｇ−15カラム（1.2×35cm）を
0.25M酢酸及び0.1％牛血清アルブミンで洗浄し
た後に、反応混合物を加え、そして溶媒で溶出
し、0.3ml／分の速度で１ml留分を集め、合計50
留分を集めた。留分25の周りの約５本の管がペプ
チドの大部分を含有していた。 ラジオイムアツセイを行なうために、下記の試
薬を製造した。 緩衝液Ａ：0.150Mりん酸ナトリウム、PH7.4。 緩衝液Ｂ：0.1％牛血清アルブミン及び0.1％
Triton×−100（商標名）を含有している緩衝液
Ａ。 メタノール性HCl：メタノール−0.1NHCl
（１：１、容量：容量） 抗血清：50mMのNaClを含有しているPH7.4の
50mMのりん酸ナトリウム緩衝液中の抗血清の
１：10希釈物を緩衝液Ｂで１：104に希釈した。 ダイノルフイン（１〜13）基準物：10μの
10mMストツク溶液を水中にとりそして990μの
メタノール性HClを加えて100mMダイノルフイ
ン溶液を製造しその後１：100希釈して希望する
シリーズを与えることにより基準物を製造した。 125I−ダイノルフイン（１〜13）トレース：0.1
％BSAを含有している0.25M酢酸中に貯蔵されて
いるトレースを緩衝液Ｂで約5000cpm／100μに
希釈した。 検定用の工程は下記の如くであつた。：全ての
溶液は最初から氷中にあり、そして全ての操作は
氷中で行なわれた13×100mMほうけい酸塩ガラ
ス管中に以下の順序で100μのメタノール性HCl
中のダイノルフイン（１〜13）基準物又は試験試
料；及び100μのトレースを加え、その後０〜4゜
で24時間培養した。３ｇのNorit Ａ（商標名）0.3
ｇのデキストラン、15mlの馬血清を混合すること
により製造された木炭混合物を用いて培養を終了
させ、そして混合物を緩衝液Ａで100mlとし、そ
して使用前に冷たに室中で10分間混合した。各培
養管に１mlの木炭混合物を加え、混合物を撹拌
し、その後冷たい室中で５分間培養し、次に
Beckman Model Ｊ ６ Ｂ（商標名）中で5000
×ｇにおいて15分間遠心した（4200rpm）。13×
100mmほうけい酸塩ガラス管に850μの上澄み液
を移し、そして管をガンマカウンター中で５分間
計測した。木炭の添加後に、全体量は1300μで
ありそして850μだけが計測されたため、全量
の結合されたダイノルフインを得るためには全計
測数を1300／850倍する。 下表は検査から得られた結果を示す。
【表】 ダイノルフインの一部分がダイノルフインで置
換されたとき、すなわちロイ−エンケフアリン、
ダイノルフイン（６〜13）及びＮ−アセチルダイ
ノルフイン（６〜13）のときには、ダイノルフイ
ンとの逆反応性の証拠はなかつた。 ロイシンエンケフアリンに特別結合するであろ
う抗血清の存在を確立するための努力は、１：10
希釈の如き高い抗血清濃度においてすらヨウ素化
されたもしくは磨砕されたロイシンエンケフアリ
ンが抗血清により結合されていないため、失敗す
るという事実は注目すべきことである。 上記のデータに基くと、抗血清はＮ−末端から
約５〜６個のアミノ酸のところでダイノルフイン
（１〜13）の部分を見分けることも明白である。
従つて、主題の抗血清はダイノルフイン（１〜
13）に対して特定であり、そしてロイ−エンケフ
アリンを特徴づけることができる。 上記の結果から、特定の強く結合した抗血清及
びラベルしたダイノルフイン同族体の製造により
天然の鎮痛薬用の敏感性検査を行なうために使用
できることも明白である。放射活性ラベルを用い
る他に、螢光、酵素又は他の一般的ラベルなどの
他のラベルを使用することもできる。 主題のオピオイド活性含有化合物は、他の薬品
用のオピオイド受容体部位を結合させそしてオピ
オイド受容体結合部分の第二及び第三の構造特性
を研究するための試験における基準物としての使
用も見出された。従つて、主題の生成物は、製薬
学的生成物として、研究及び商業用途の両方で
の、用途が見出された。 さらに、主題の化合物は公知の鎮痛薬化合物の
結合性を可能にするための前駆体として使用する
ことができる。 本発明は、天然生成物又は改質された天然生成
物の使用により鎮痛効果を得る能力を大きく伸ば
す。この方法で苦痛は天然方法に伴なう最少の干
渉を伴ない軽減され、望ましくない副生物の添加
や副作用を伴なわない。さらに、オピオイド結合
部位をさらに理解可能にするために、主題の組成
物は新薬又は他の手段に対する方向を提供し、阿
片剤拮抗薬又は作動薬を提供する。オピオイド化
合物に可能性を与えることにより、より低い濃度
を必要とし、その結果副作用を軽減する。 前記の発明は理解を明白にする目的のために説
明及び例により幾らか詳細に説されてきたが、特
許請求の範囲内であればある程度の改変を行なえ
ることは明白であろう。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 式 Ｈ−tyr−gly−gly−phe−leu−arg−arg−ile
    −arg−pro−lys−leu−lys−W3 ［式中、W3はヒドロキシル又はアミノである］
    の化合物。
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