KR940001711B1 - 심방성 나트륨이뇨성 펩티드의 동족체 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

심방성 나트륨이뇨성 펩티드의 동족체

[도면의 간단한 설명]

제1도는 소의 대동맥 평활근(BASM) 세포를 배양하여 본 발명의 화합물의 경쟁적 치환 수용체 결합을 도식화한 그래프이고,

제2도는 마취된 래트에 있어서, 본 발명의 선택된 화합물의 생체내 시험에 있어서의 이뇨활성을 설명한 도면으로,

제2a도는 AP25로 동정된 동족체 펩티드의 이뇨활성을 나타내고,

제2b도는 AP20으로 동정된 동족체 펩티드의 이뇨활성을 나타내며,

제2c도는 AP21로 동정된 동족체 펩티드의 이뇨활성을 나타내고,

제2d도는 AP37로 동정된 동족체 펩티드의 이뇨활성을 나타내며,

제2e도는 AP101로 동정된 동족체 펩티드의 이뇨활성을 나타내고,

제2f도는 AP319로 동정된 동족체 펩티드의 이뇨활성을 나타내며,

제2g도는 AP324로 동정된 동족체 펩티드의 이뇨활성을 나타내고,

제2h도는 AP54로 동정된 동족체 펩티드의 이뇨활성을 나타낸다.

[발명의 상세한 설명]

[기술 영역]

본 발명은 통상적으로 심방성 펩티드의 합성 동족체 및 보다 특히는 이뇨제, 나트륨이뇨제 및/또는 혈관 확장제로서 사용되는 합성 펩티드 화합물 또는 이러한 유용한 화합물의 중간체 또는 조절제 및, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

[배경 분야]

대부분의 다-세포 유기체는 특별한 기능을 발휘하는 조직 및 기관으로 구성되어 있다. 따라서, 이들 사이에서 물질을 수송 및 순환시킬 수 있도록 하는 계가 발달되어 왔다. 포유동물을 포함하는 고등동물에 있어서, 이들 순환계는 수송의 효능을 증대시키기 위해서 폐쇄되어 있다. 이들 폐쇄된 심장혈관계를 통한 혈액의 유동은 혈액이 압력하에 유지되는 것을 요구하며, 전신계 동맥혈압의 조절은, 예를 들어, 혈액용량 및 혈관의 탄력성 및 직경을 포함한 수많은 인자의 복잡한 상호작용을 요구한다.

정상 세포외액 용량의 유지는 우선 신장에 의한 나트륨 및 물의 분비(나트륨이뇨작용 및 이뇨작용)에 기인한다. 이러한 것은 (1) 혈장이 사구체에서 여과되는 비율(사구체여과율 또는 GFR) 및 (2) 나트륨이 능동적으로 신장세관을 통해 재흡수되는 정도(수동적으로 흡수되는 물과 함께)에 의해서 결정된다. 후자의 과정은 부신 스테로이드 호르몬 알도스테론에 의해서 부분적으로 조절된다. GFR 및 알도스테론 이외에, 나트륨 재흡수를 또한 조절하는 "제3의 인자"가 틀림없이 있다고 오랫동안 믿어져 왔다. 오늘날에 이르러 "제3의 인자"의 가정에 필요한 수많은 현상들이 나트륨 재흡수에 대한 물리적 힘(예를 들면, 혈압, 적혈구 농도 및 혈장점도)의 효과에 의해 설명될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 세관 재흡수를 조절할 수 있는 "나트륨 이뇨성 호르몬"에 대한 연구는 계속하고 있다.

나트륨 이뇨 효과는 래트의 심실 조직이 아닌 심방 조직의 조 추출물에 의해 입증되었다[참조 : De Bold, A. J. et al., Life science 28 : 89-94(1981), Garcia, R., Experientia, 38 : 1071-73(1982), Currie, M. G. et al., Science 221 : 71-73(1983)]. 이뇨 및 나트륨 이뇨성 특성을 갖는 많은 펩티드가 심방 조직으로부터 분리되어 서열분석 되었다[참조 : Flynn, T. G. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 117 : 859-865(1983), Currie, M. G. et al., Science 223 : 67-69(1984), Kangawa, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 118 : 131-139(1984)].

최근에 많은 외관상 관련된 펩티드가 분리되어, 서열분석 되었으며 다양한 정도의 나트륨 이뇨성, 이뇨성 및 혈관이완활성을 갖는 것으로 나타났다[참조 : 미합중국 특허 제4,496,544호; 미합중국 특허 제4,508,712호; Kangawa, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 121(2) : 585-591(1984); Kangawa, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 119(3) : 993-940; Garcia R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 126(1) : 178-184(1985); Katsube, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 128(1) : 325-330(1985)].

이들 심방성 나트륨 이뇨인자의 존재는 심장이, 신장 관류에 대한 명백한 영향은 차치하더라도 신장의 나트륨 및 물 분비를 조절하는데에 중요한 역할을 한다는 오랫동안 제기되어온 의심을 강화한다.

임상적으로 중요한 많은 질환 상태는 비정상적 체액 용량의 보유로 특징지워진다. 울혈성 심부전증. 간의 경변증 및 신장증은 각각 순환의 정맥부위에 과량의 체액의 축적을 초래하여, 예상되는 통상의 기전이 신장의 관류 저하에 있게 되어 GFR의 저하를 야기시킨다. 또한 감소된 신장 관류는 순환계에서 안지오텐신을 생성하는 작용을 하는 단백질 분해요소인 레닌의 과량분비를 촉진한다. 안지오텐신은 동맥의 강력한 수축제이며(동맥혈압을 유지시키는) 또한 부신선에 의한 나트륨-유지 호르몬 알도스테론의 방출을(체액 보유를 더 악화시킨다) 자극한다. 그러나 이러한 기전은 소위 "부종성 상태"의 체액 보유에 대한 완전한 설명이 안되며, 추가 인자가 관련되는 것 같다.

체외액용량에서의 증가는 많은 예에서 고혈압을 일으키는 원인으로 교시되어 왔다. 고혈압 또는 만성적인 혈압증가는 세계적인 질환 및 사망의 주원인중 하나이다. 2천만 이상의 미국인들이 심장부전증, 심장마비, 발작 및 신부전증을 포함한 이의 합병증을 앓는 것으로 추정된다. 만성고혈압에 있어서 주로 관측되는 혈액 동력학적 비정상은 동맥을 통한 혈류의 증가된 저항 때문이다. 그러나 이같이 증가된 "말초적 저항"을 야기시키는 기전은 불완전하게 이해되어 있다. 몇몇 경우에 있어서, 레닌-안지오텐신계 또는 교감신경계의 부적합한 활성이 동맥의 과도한 수축을 일으키는데, 여기서, 용어 "부적합한"은 이러한 활성을 일으키는 알려지지 않은 시그날(S)이 유기체의 생리학적 요구에 기초하지 않음으로써 혈압상승을 일으킴을 의미한다. 하지만, 고혈압의 실질적 부분에 있어서, 신장에 의한 부적합한 나트륨 및 용량보유는 혈압상승을 개시하거나 일으키는 것으로 간주된다. 체액보유가 말초저항을 증가시키는 신장 작용 및 기전에 있어서의 중요한 단점은 알려지지 않았다. 나트륨 이뇨호르몬의 상대적 결함이 특히 만일 동일한 물질이 정상적으로 동맥의 이완을 일으킨다면 이러한 관찰에 대한 책임이 있을 수 있다.

이뇨 치료는 고혈압, 신부전증 및 많은 부종 상태(심장부전증)의 치료에서 현재 가장 중요한 인자이다. 하지만, 현재 이용가능한 약물학적 제제는 몇몇의 중요한 한계 및 바람직하지 못한 효과를 갖는다. 특이한 비정상상태(예를 들면, 용량 팽창)에 이들을 바로 사용할 수 있지만, 이들의 복합적 작용은 의심할 바없이 칼륨고갈을 일으키고 요산의 보유를 증진시키고 비정상적 글루코스 및 지질 대사를 일으켜 생리학적이지 못하다. 또한 모든 공지된 이뇨제는 레닌-안지오텐신-알도스테론계를 자극하여 이들의 용량-고갈 및 혈압 저하효과에 역작용하는 바람직하지 못한 그밖의 효과를 일으킨다. 생리적 반응에 완전하고 조절된 범위를 제공함으로써 혈압을 조절할 수 있는 약물학적으로 효과적인 화합물을 제공하는 것이 바람직하다.

그러나 이러한 화합물을 심방조직으로부터 분리하는 것은 통상 성가신 공정이며, 소량의 화합물을 제공하기 위해 실질 기질조직을 필요로 한다.

또한 명확한 생물학적 활성에 책임이 있는 펩티드 영역 또는 펩티드의 대사 및 정리에 중요한 영역을 분리하기 위해서 이들 심방의 나트륨이뇨성 인자에 대하여 보고된 천연 구조를 변형하는 것이 바람직한 것으로 간주된다. 적절한 활성 단위가 결정되므로, 혈관이완활성을 감소시키거나 제거하는 동안에 나트륨 이뇨활성 또는 이뇨활성을 보존하는 구조적 동족체를 생성시킬 수 있다. 또한 짧아진 펩티드 서열은 천연 조성물의 치료적 이점을 제공하는 경구 또는 비강 투여될 수 있는 활성 합성 동족체를 제시한다.

짧아지고 변형된 펩티드 서열은 또한 직접 또는 간접적 생물학적 활성, 분해에 대한 저항성, 생물학적 반감기를 향상시키고, 임상적 용도에 있어 비용 효율적 방식으로 이들 화합물의 화학합성적 생산을 가능하게 하도록 제조하는 것이 바람직하다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명에 따라 제조되는 천연의 심방성 나트륨 이뇨성 펩티드(ANP)의 합성 동족체의 계열이 생체내 시험에 있어서 포유동물에서의 천연 펩티드의 나트륨이뇨성, 이뇨성 및/또는 혈관이완활성을 나타내거나 조절시킬 수 있음이 최근 밝혀졌다.

본 발명의 합성 동족체 화합물은 아미노-말단 아르기닌 잔기가 1위치인 문헌[Atlas, S. et al., Nature 309-717-719(1984)]의 동정시스템을 사용하여 천연 ANP의 AA₈-AA₁₂서열에 정의된 방식에 의존되는 아미노산 잔기의 핵 펜타펩티드 서열을 보유한다. 공지된 천연 ANPs에 있어서, 이 핵 서열은 래트에 있어서 RIDRI 및 인간에 있어서 RMDRI이다. 이러한 서열의 제한된 특정 순열은 생체내 시험에 있어서 활성을 보유하며, 핵펩티드 구조가 펩티드의 생물학적 활성에 있어서 중요한 인자임을 시사한다.

따라서, 하나의 양태에 있어서, 본 발명은 포유동물에서, 나트륨이뇨성, 이뇨성 및/또는 혈관이완활성을 갖는 하기 일반식으로 동정되는 동족체 펩티드 화합물에 관한 것이다.

Z₁-AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂-Z₂

상기식에서, AA₈및 AA₁₁은 각각 독립적으로 염기성 비-사이클릭(nonocyclic) 또는 중성/비극성/소형(small) 또는 중성/극성/비-사이클릭 아미노산 잔기이고; AA₉및 AA₁₂는 각각 독립적으로 D- 또는 L-배위의 중성/비극성/비-사이클릭 아미노산 잔기이고; AA₁₀은 산성 아미노산 잔기이고; 1) Z₁은 식 Y₁-Y₂[여기서, Y₁은 카복시-말단 잔기로서 소수성 아미노산 잔기를 갖는 1 내지 125개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 또는 이의 desHN₂형태이거나 식

- (여기서, R₁은 아미도, 티오 또는 옥시로서 질소, 산소 또는 황원자의 치환체를 갖는 그룹을 포함하는, C₆내지 C₂₀의 소수성 지방족, 방향족 또는 혼합된 지방족/방향족 유기 그룹이다)의 소수성 치환체 그룹이고, Y₂는 아미노산 또는 디펩티드 그룹이거나 식

(여기서, n은 3 내지 6이다)의 화합물을 포함하는 스페이서(spacer) 그룹이다]이고, Z₂는 NH₂, NHR' 또는 NR'R"(여기서, R' 또는 R"는 각각 독립적으로 C₁내지 C₆의 직쇄 또는 측쇄 알킬그룹이다)이거나 1 내지 20개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 잔기 또는 이의 아미드 또는 알킬 아미드이거나; 2) Z₁및 Z₂가 함께 브릿지를 형성하며, Z₁은 식 X₁-AA₄-X₂이고, Z₂는 식 X₃-AA₂₀-X₄이며, 여기서, X₁은 0 내지 125개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 또는 이의 desNH₂형태이고, X₂는 결합, 아미노산 또는 10개 이하의 잔기로 이루어진 올리고 펩티드이고, X₃는 결합, 아미노산 또는 10개 이하의 잔기로 이루어진 올리고 펩티드이고, X₄는 결합 또는 아미노산이거나, 카복시-말단 아미드 또는 알킬아미드 형태를 포함하며, 20개 이하의 잔기로 이루어진 올리고 펩티드이고, AA₄및 AA₂₀은 함께 디설파이드 결합, 메틸렌 결합 및 설파이드/메틸렌 결합으로 이루어진 그룹중에서 선택된 브릿지 결합을 형성하는 아미노산이다)이며, 단, X₂가 트리펩티드인 경우 X₃는 헵타펩티드가 아니며, X₂이 트리펩티드 미만인 경우 X₃는 펜타펩티드 이상이고, X₁이 [D-S]-S 또는 S-S이고 X₃가 아미노-말단에 G-A-Q-S 또는 A-Q-S를 갖는 올리고 펩티드인 경우 X₄는 아미노-말단에 N-S를 갖는 6개 미만의 아미노산 잔기로 이루어진 올리고 펩티드가 될 수 없다.

또한 본 발명은, 이들의 아미드 및 에스테르를 포함한 상기에서 인용된 동족체 펩티드 화합물 및 이의 무독성 부가염을 약제학적으로 허용되는 액체, 겔 또는 고형담체를 함유하는, 나트륨이뇨제, 이뇨제, 혈관이완제 및/또는 레닌-안지오텐신-알도스테론계의 조절제로서 유효한 약제학적 조성물을 제공한다. 치료적 유효량의 이들 조성물을 투여하여 포유동물 숙주에게 상기 언급된 생물학적 특성의 효율적 전달을 제공할 수 있다.

본 발명의 추가적인 양태는 이러한 화합물 및 조성물을 제조하는 방법, 및 이러한 화합물 및 조성물을 치료제로서 사용하는 방법을 제공하는데 있다.

[본 발명을 수행하는 방법]

본 발명에 따라 천연의 심방성 나트륨 이뇨성 펩티드(ANP) 화합물의 신규한 동족체 계열이 제공되어 생체내 시험에 있어서 포유동물에서 천연 펩티드의 나트륨이뇨성, 이뇨성 및/또는 혈관이완활성을 나타내거나 조절할 수 있다.

본 발명의 합성 동족체 화합물의 아미노산 잔기의 서열, 핵 펜타펩티드 및 이의 바람직한 양태는 특정한 아계열의 특이성질의 아미노산으로 정의된다.

아미노산 잔기는 통상 하기와 같은 4개의 주요 아계열로 세분될 수 있다 :

산성, 즉, 잔기가 생리적 pH에서 H이온의 상실로 음전하를 가지며, 잔기는 펩티드가 수성 매질에 있을때 함유되는 펩티드 형태중 표면위치를 구하기 위해서 수용액을 유인한다.

염기성, 즉 잔기가 생리적 pH에서 H이온과 결합되어 양전하를 가지며, 잔기는 펩티드가 수성 매질에 있을때 함유되는 펩티드 형태중 표면위치를 구하기 위해서 수용액을 유인한다.

중성/비-극성, 즉 잔기는 생리적 pH에서 전하를 갖지 않으며, 잔기는 펩티드가 수성 매질에 있을때 함유되는 펩티드 형태중 내부 위치를 구하기 위해서 수용액으로부터 반발한다.

중성/극성, 즉 잔기는 생리적 pH에서 전하를 갖지 않으며, 잔기는 펩티드가 수성 매질에 있을때 함유되는 펩티드 형태중 외부 위치를 구하기 위해서 수용액을 유인한다.

물론, 각각의 잔기 분자의 통계학적 수집에 있어서, 몇몇의 분자는 하전되고, 몇몇은 비하전됨을 이해할 수 있다. 하전된 분자의 정의에 부합하기 위해 상당량 퍼센트(적어도 25%)의 각각의 분자가 생리적 pH에서 하전된다.

아미노산 잔기는 또한 잔기의 측쇄 치환그룹에 대하여 자기-설명적인 분류로서, 사이클릭 또는 비-사이클릭, 또는 소형(small) 또는 대형(large)으로 세분할 수 있다. 총 3개 이하의 탄소원자를 함유할 경우 소형으로 간주한다. 소형 잔기는 물론 항상 비-사이클릭이다.

천연적으로 생성된 아미노산에 대하여 다음과 같은 구조에 따라 세분한다 :

산성 : 아스파르트산 및 글루탐산 ;

염기성/비-사이클릭 : 아르기닌 및 리신 ;

염기성/사이클릭 : 히스티딘 ;

중성/극성/소형 : 글리신, 세린 및 시스테인 ;

중성/극성/대형/비-사이클릭 : 트레오닌, 아스파라긴 및 글루타민 ;

중성/극성/대형/사이클릭 : 티로신 ;

중성/비극성/소형 : 알라닌 ;

중성/비극성/대형/비-사이클릭 : 발린, 이소루이신, 루이신 및 메티오닌 ;

중성/비극성/대형/사이클릭 : 페닐 알라닌 및 트립토판.

분류시 중성/비극성/대형/환상인 단백질 아미노산 프롤린은 펩티드 쇄의 2번째 구조에 공지된 영향을 주므로 선택적으로 포함시키지 않았다.

특정의 통상적인 비-단백질 아미노산, 즉 α-아미노이소부틸산(Aib) 및 사르코신(Sar)은 편리하게 특정 범주내에 포함시킨다. 상기 정의를 기초로 할때, Sar은 중성/비극성/소형이고 Aib는 중성/비극성/비-사이클릭이다.

본 발명의 ANP 동족체 화합물을 기술하는데 사용되는 명명법은, 각각의 아미노산 잔기에 대하여 아미노산 그룹이 왼쪽에 위치하고, 카복시 그룹이 오른쪽에 위치하는 통상적인 실례에 따른다. 본 발명의 선택된 특정 화합물 나타내는 일반식에서, 특별히 나타내지는 않더라도 아미노-및 카복시-말단 그룹은 달리 언급되지 않는한 생리적 pH 값을 취하는 형태로 존재하는 것으로 이해될 수 있다. 아미노산 구조 일반식에 있어서, 각각의 잔기는 통상 다음 도식에 따라 아미노산의 평범한 이름에 상응하여 하나의 문자로 표시한다 :

비-단백질 아미노산 아미노이소부티르산 및 사르코신은 각각 Aib 및 Sar의 3-문자 표시로 나타낸다.

본 발명에 있어서 광학적 이성체를 갖는 아미노산 잔기의 L-형은 특별히 지정하지 않는한 "[D-AAn]"으로 표시한다.

본 발명의 범위내의 화합물은 많은 방법으로, 기술된 일반식의 화합물을 변형시켜 수득할 수 있고 이와 같이 수득된 ANP 동족체 화합물의 활성은 보존된다. 예를 들면 이들 화합물의 아미노산이 정상적으로 천연 L 광학적 이성체 형태이나, 하나 이상, 통상 2개 이하 및 바람직하게는 하나의 아미노산은 광학적 이성체 D형으로 치환될 수 있거나 D, L-라세믹 혼합물은 펩티드 화합물을 포함하는 분자중에 제공될 수 있다.

화합물내에 함유된, 특히 카복시- 또는 아미노 말단 위치에서의 아미노산 잔기는 또한 그들의 활성에 영향을 끼치지 않으면서 예를 들면 화합물의 용해도를 변화시킬 수 있는 다른 화학적 그룹으로 아미드화, 아세틸화 또는 치환으로 변경될 수 있다.

특히 심방성 나트륨이뇨성 펩티드의 아미드 변형된 동족체는 특히 강력하고, 따라서 본 발명의 바람직한 화합물임이 발견되었다. 예를 들어 카복시-말단 잔기는 아미노 그룹으로 치환되어 카복시-말단 아미도 그룹을 생성하는 카보닐 탄소를 가진다. 통상 카보닐 탄소에 공유결합된 아미도 그룹의 질소원자는 일반식 NR'R"이며, 여기서, R' 및 R"는 치환체 그룹이다. 각각의 치환체 그룹은 독립적으로 수소이거나 아미도, 티오 또는 옥시로서 3개 이하의 질소, 산소 또는 황원자를 갖는 치환체 그룹을 포함하여 탄소수 1 내지 10, 통상 1 내지 6의 직쇄 또는 측쇄의 알킬 또는 벤질 그룹(치환되거나 비치환된)과 같은 유기 그룹일 수 있으며 이중 하나는 하이드라지드와 같은 질소 함유 잔기를 포함하는 질소일 수 있고, 다른 하나가 수소일 수 있거나, 두 그룹중 하나가 염기성 또는 중성 디펩티드이고 다른 하나가 수소 또는 알킬 그룹일 수 있다. 이들 아미도 그룹의 대표적인 것은 -NH₂, -NHCH₃, -N(CH₃)₂및 -NHCH₂CH₃등이다.

본 발명의 아미드화된 동족체의 생성에 있어서, 동족체 화합물은 BOC-AAx-pMBHA- 수지 또는 Boc-AAx-BHA- 수지를 사용하여 직접 합성할 수 있는데, 여기서 AAx는 다음에 기술하는 바와 같은 바람직한 동족체 화합물의 선택된 카복시-말단 아미노산이다. 또한 본 발명의 동족체 화합물은 본 분야에서 널리 공지된 방법으로 펩티드 합성에 이어 화학적으로 또는 효소적으로 아미드화시킬 수 있다.

또한 기술된 화합물내에, 특히 아미노-말단에서 함유된 특정 아미노산 잔기는 탈아민화 반응으로 변화시켜 내인성 펩티다제 효소절단에 의한 숙주내 분해를 저항할 수 있다. 이와 같은 탈아민화 반응은 예를 들어, 시판되어 수득가능한 L 아미노산 산화제[EC 1, 4, 3, 2, 크로라투스 아트록스(Crolatus atrox)의 독액으로부터 유도됨] 또는 D 아미노산 산화제(EC 1, 4, 3, 3, 예를 들어 돼지의 신장에서 유도됨)를 사용하여 합성 화합물중에서 이루어질 수 있다(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

바람직하게 탈 아민화반응은 아미노-말단 아미노산 잔개 대신으로서 적당한 α-케톤산을 선택하여 효과적으로 실시할 수 있다. 예를 들어 아미노산 잔기 아르기닌, 세린, 루이신, 시스테인, 알라닌, 페닐알라닌 및 글리신은 선택적 α-케토산 5-구아니디노 펜타노산, 3-하이드록시 프로피온산, 4-메틸펜타노산, 3-머캅토 프로피온산, 프로피온산, 하이드로신남산 및 아세트산 각각으로 치환될 수 있다. 본 발명에 사용된, 아미노산 잔기에 상응하는 대부분의 α-케토산은 시판되어 수득가능하다(Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI.), 바람직한 α-케토산은 또한 화학합성 분야에 있어서 통상의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 합성할 수 있다.

Z₁이 Y₁-Y₂이고, Y₁이 탄소수 6 내지 20의 대형, 소수성 비-아미노산 관련기일 수 있는 본 발명의 화합물들은 지방족 또는 방향족일 수 있다. 이러한 치환체 그룹은 펩티드에 프로테아제에 의한 공격에 대한 저항성을 부여하여 펩티드의 안전성을 향상시킬 수 있다. 탄소쇄 또는 환은 N, O 또는 S와 같은 헤테로 원자에 의해 치환될 수 있고/있거나 이들을 포함할 수 있다.

[바람직한 양태]

본 발명의 화합물은 모두 다음 핵서열을 함유한다 :

AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂

상기식에서, 각각의 AA₈및 AA₁₁은 독립적으로 염기성/비-사이클릭 또는 중성/비극성/소형 또는 중성/극성/비-사이클릭 아미노산 잔기이며; 각각의 AA₉및 AA₁₂는 독립적으로 D 또는 L 광학적 이성체 배위의 중성/비극성/비-사이클릭 아미노산잔기이고; AA₁₀은 산성 아미노산 잔기이다.

이 핵의 가장 바람직한 서열은 R(I/M)DRI이며, 여기서 모든 잔기는 L배위이고, 괄호안에 함유된 아미노산 잔기는 선택적이다. 다음에 R(I/M)DRI 잔기중 단지 하나가 상기에서 정의한 선택적 잔기로 치환된 서열이 선택된다. 바람직한 치환체는 다음과 같다.

AA₈또는 AA₁₁의 경우 R 대신 A, Q, N, 또는 K; AA₉의 경우 I 또는 M 대신 V, [D-V], L, [D-L], [D-I] 또는 [D-M]; AA₁₂의 경우 I 대신 M, [D-M], V, [D-V], L, [D-L], 또는 [D-I]; 및 AA₁₀의 경우 D 대신 E.

이들 서열은 다음으로 구성된 그룹에서 선택하는 것이 특히 바람직하다 :

A(I/M)DRI, K(I/M)DRI, Q(I/M)DRI,

RVDRI, RLDRI, R[D-I]DRI,

R[D-M]DRI, R(I/M)ERI , R(I/M)DQI.

R(I/M)DKI, R(I/M)DRM, R(I/M)DRV,

R(I/M)DRL, R(I/M)DR[D-I], R(I/M)DR[D-M].

천연적으로 생성된 RIDRI 또는 RMDRI 서열에서 나타나는 하나 또는 그 이상의 변형은 본 발명의 범위내에 있지만, 덜 바람직하다. 이들 그룹의 특히 바람직한 부분집합은 AA₁₀의 D가 그밖의 치환체 뿐아니라 E로 치환되는 그룹을 포함한다.

핵 펜타 펩티드 AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂(여기에서 각각의 번호붙인 AA는 상기에서 정의한 바와 같다)를 함유한, 본 발명의 펩티드는 일반적으로 2계열로 나뉜다 : 선형 펩티드 및 펩티드 유도체; 디설파이드와 같은 브릿지 결합 또는 메틸렌 브릿지에 의한 환을 함유한 사이클릭 펩티드(예를 들면 "사이클릭 디설파이드")사이클릭 디설파이드는 디설파이드 결합 형성을 위한 설프하이드릴 그룹을 제공하는 2개의 탄소잔기를 포함하여 17개의 아미노산 잔기-디설파이드환을 함유하는 천연적으로 생성된 ANP와 가장 유사하다. 그러나 본 발명의 사이클릭 디설파이드 화합물 모두는 사이클릭 구조에 있어서 17개의 아미노산 잔기보다 많거나 또는 바람직하게는 적게 함유한다.

지적한 바와같이 본 발명의 특정 사이클릭 동족체는 또한 시스테인 잔기 또는 등가의 잔기를 등가의 결합 또는 예를들어 -CH₂-와 같은 연결 그룹과 함께 결합하여 제공할 수 있다. 시스테인 잔기에 있어서, 그밖의 그룹으로 설프하이드릴 그룹을 치환하는 것은 시스테인 잔기를 그밖의 아미노산으로 효과적으로 대체시킨다. 예를 들어 설프하이드릴 그룹의 -CH₂- 그룹으로의 치환은 잔기를 α-아미노 부티르산의 작용 당량으로 전환시킨다. 이들 사이클릭 동족체 펩티드는 예를 들면 문헌[참조 : Lebl, M. and V. J. Hruby. Tetrahedron Lett. 25(20); 2067-2068(1984)]에 따라 미합중국 특허 제 4,161,521호에 기술된 제조방법을 사용하여 생성할 수 있다.

펜타펩티드 핵의 외부의 본 발명의 펩티드를 형성하는 아미노산 잔기는 활성을 보유하면서 D 또는 L 광학적 이성체 형태로 존재할 수 있다. 이것은 핵 펜타펩티드 외의 환 원자 및 사이클릭 디설파이드에 있는 환 바깥 부분의 잔기 뿐만 아니라 사이클릭 구조의 형성에 책임이 있는 C잔기 및 선형의 핵 펜타펩티드 외의 부가적 펩티드 서열을 포함한다. 따라서 이들 펩티드의 바람직한 양태를 특정화하는데 사용되는 아미노산 명칭은 달리 명시하지 않는한 L형을 지적하는 경향이 있는 반면, D형으로 편리하게 치환될 수 있음을 의미함을 숙지해야만 한다. 펜티펩티드 서열의 특정 부분은 다른 것에서보다 아미노산 배위에서 덜 민감함을 나타내나, 이 핵 서열에 있어 지정된 아미노산 잔기는 달리 언급하지 않는한 L배위이다.

따라서 본 발명의 사이클릭 펩티드는 다음 일반식을 갖는다 :

Z₁-AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂-Z₂

상기식에서, Z₁및 Z₂가 함께 브릿지를 형성하며, Z₁은 식 X₁-AA₄-X₂이고, Z₂는 식 X₃-AA₂₀-X₄이며, 여기서, X₁은 0 내지 125개 아미노산 잔기의 펩티드 또는 이의 desNH₂형태이고, X₂는 결합, 아미노산 또는 10개 이하의 잔기, 통상적으로 4 및 바람직하게는 3 또는 그 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 올리고펩티드이고, X₃는 결합, 아미노산 또는 10개 이하의 잔기, 통상적으로 7 및 바람직하게는 5 또는 그 이하의 아미노산 잔기의 올리고펩티드이고, X₄는 아미노산 또는 20개 이하의 잔기, 통상적으로 10 및 바람직하게는 5 또는 그 이하의 아미노산 잔기의 올리고펩티드이며, 이의 카복시-말단아미드 또는 알킬아미드형태를 포함하며, AA₄및 AA₂₀은 함께 디설파이드 결합, 메틸렌 결합 및 설파이드/메틸렌 결합으로 이루어진 그룹중에서 선택된 브릿지 결합을 생성하는 아미노산이고, 단, X²가 트리펩티드인 경우 X³은 헵타펩티드가 아니며, X²가 트리펩티드 미만인 경우 X³는 펜타펩티드 이상이고, X¹이 [D-S]-S 또는 S-S이고 X³가 아미노-말단에서 G-A-Q-S 또는 A-Q-S를 갖는 올리고펩티드인 경우 X⁴는 아미노 말단에서 N-S를 갖는 6개 이하의 아미노산 잔기의 올리고펩티드가 될 수 없다.

Z¹의 바람직한 양태는 X¹이 0 내지 6개 아미노산 잔기, 통상적으로 AA_-3-AA_-2-AA_-1-AA₁-AA₂-AA₃(여기에서, AA_-3및 AA₂는 중성/극성/소형 또는 중성/비극성/소형이며, AA₃는 중성/극성/소형, 중성/극성/사이클릭 또는 중성/비극성/소형이고, AA_-2는 중성/비극성/비-사이클릭이며, AA_-1및 AA₁은 염기성/비-사이클릭이다) 형태 및 이의 절단된 형태의 펩티드이다.

특히 X₁의 바람직한 양태는 하기로 이루어진 그룹에서 선택된 펩티드 화합물이다 : S-L-R-R-S-S, L-R-R-S-S, R-R-S-S, R-S-S, S-S, S, R, L 및 desX₁.

Z₁의 바람직한 양태는 X₂가 일반식 AA₅-AA₆-AA₇의 0 내지 3의 아미노산 잔기의 펩티드 및 이의 절단된 형태이며, 여기에서 AA₅는 중성/비극성/대형/사이클릭, 중성/비극성/소형 또는 중성/극성/소형이고, AA₆및 AA₇은 중성/극성/소형, 중성/비극성/대형/비-사이클릭, 염기성/비-사이클릭 또는 중성/비극성/소형이다. 특히 X₂의 바람직한 화합물은 아미노산 잔기가 G, F, A, S, L, V, Sar 및 Aib로 구성된 그룹에서 선택된 펩티드이고, 펩티드는 다음으로 구성된 그룹에서 선택한다 :

F-G-G, (desNH₂-F)-G-G, [D-F]-G-G, F-G-A, F-A-G, F-[D-A]-G, F-[D-S]-G, F-[D-L]-G, F-[D-V]-G, [D-F]-G-G, [D-A]-G-G, F-G-[D-A], F-Aib-G, A-G-G, F-G, G-G, [D-A]-G, [D-S]-G, G-[D-A], G-[Aib], G-[Sar], G 및 desX₂.

본 발명의 펩티드의 사이클릭 형태에 있어서 바람직한 Z₂는 0 내지 7의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드, 통상

AA₁₃-AA₁₄-AA₁₅-AA₁₆-AA₁₇-AA₁₈-AA¹⁹

(여기서, AA₁₃, AA₁₆, AA₁₇및 AA₁₉는 중성/극성/소형이고; AA₁₄는 중성/비극성/소형이며; AA₁₅는 중성/극성/대형/비-사이클릭이고; AA₁₈은 중성/비극성/비-사이클릭이다)형태의 펩티드 또는 이의 절단된 형태이다.

특히 바람직하게 아미노산 잔기는 G, A, Q, S 및 L에서 선택하며, 더 바람직하게는 펩티드를 다음의 그룹에서 선택한다 :

G-A-Q-S-G-L-G, G-A-Q-S-G-L-, A-Q-S-G-L-G, G-A-Q-S-G, Q-S-G-L-G, G-A-Q-S, S-G-L-G, G-A-Q, G-A-A, G-L-G, L-G, G-A-G desX₃.

또한 바람직한 Z₂는 X₄가 NH₂또는 0 내지 5개 아미노산 잔기의 펩티드 및 이의 아미드 또는 알킬아미드 형태이며, 여기에서 아미노산은 N, S, F, R 및 Y에서 선택되고, 특히 바람직하게 펩티드는 N-S-F-R-Y, N-S-F-R, N-S-F, N-S, N 또는 desX₄및 이의 아미드로부터 선택된다.

본 발명의 펩티드의 선형 형태에 있어 Z₁은 식 Y₁-Y₂을 가지며, 여기서 Y₁은 카복시-말단 잔기로서 소수성 아미노산 잔기를 갖는 1 내지 125개의 아미노산 펩티드 또는 이의 desNH4 형태이거나, 식

의 소수성 치환체 그룹이며, 여기에서, R₁은 탄소수 6 내지 20의 소수성 지방족, 방향족 또는 혼합된 지방족/방향족 유기 그룹이고, 아미도, 티오 또는 옥시로서 질소, 산소 또는 황 원자의 치환체를 갖는 그룹을 포함하며; Y₂는 아미노산 또는 디펩티드의 스페이서 그룹, 또는 식

의 화합물을 포함하며, Y₃는 바람직하게 탄소수 3 내지 6의 포화된 알킬탄소쇄[예를 들면(CH₂)_n(n은 3 내지 6이다)]인 스페이서 그룹이고, Z₂는 NH₂, NHR' 또는 NR'R"이며, 여기에서 R' 또는 R"는 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 1 내지 20의 아미노산 잔기의 펩티드 잔기, 또는 이의 아미드 또는 알킬 아미드이다.

Y₁의 바람직한 양태는 1 내지 5, 통상은 1 내지 3의 아미노산의 펩티드 또는 이의 desNH₂형태를 포함하며, 여기에서 C-말단 아미노산은 중성/비극성/사이클릭이며, 가장 특별히 F 또는 desNH₂-F이다. AA₃-AA₄-AA₅형태의 Y₁에 대하여 바람직한 AA₃및 AA₄는 중성/극성 아미노산 및 중성/비극성/소형 아미노산을 포함한다. 가장 바람직하게는 YAF, RCF, SCF, AF, CF 및 F 또는 desNH₂-F이다.

Y₁의 바람직한 비-펩티드 유도된 형태는 유기 치환체 그룹을 포함하며, 이는 통상적으로 아미노산 잔기와 함께 발견되는 치환체 그룹과 비교시 무독성의 소수성 및 비교적 대형 또는 거대형이다.

바람직한 유기 치환체 그룹은 식

으로 표시될 수 있으며, 여기에서 R₁은 적어도 3개의 탄소원자를 함유하는 유기 그룹이다. 여기에는 2-치환된 아세틸 및 3-치환된 프로피오닐 그룹 및 4-치환된 부티릴 그룹을 포함하며, 이때 이들 그룹에 대한 치환체는 중성의 소수성 모노- 및 폴리사이클릭 방향족 또는 포화된 환 시스템의 일반적 계열을 포함한다. 바람직한 치환체 그룹의 대표적인 예(본 펩티드에 결합된 경우와 같이 나타낸)는 다음을 포함한다:

플루오레닐메틸옥시카보닐(FMOC)

벤질옥시카보닐(CBZ)

디페닐프로피오닐

트리페닐프로피오닐

3-인돌프로피오닐

4-인돌부티릴

1-아다만틸아세틸

1-나프틸아세틸

2-나프틸아세틸

1-나프톡시아세틸

및 2-나프톡시아세틸

그룹.

Y₂가

(여기서, n은 3 내지 6이다)인 양태 이외에 바람직한 형태는 디펩티드 AA₆-AA₇을 포함하고, 여기에서 AA₆및 AA₇은 동일하거나 상이하며, 바람직하게는 중성/극성/소형, 가장 바람직하게는 G이다.

Z₂의 바람직한 형태는 X₃-AA₂₀-X₄형태이며, 여기에서 X₃및 X₄는 상기에서 정의한 바와같이 동일하고, 여기에서 AA₂₀은 중성/비극성/소형 또는 중성/극성/소형, 바람직하게는 C 또는 A이다. 또한 특히 바람직한 Z₂의 형태는 상기에서 정의한 바와같이 -NH₂및 -NHR'이다.

본 발명의 범위내의 화합물은 본 분야에서는 공지된 방법, 예를 들면 고상 펩티드 합성과 같은 방법으로 화학적으로 합성할 수 있다. 합성은 알파-아미노 보호된 아미노산을 사용하여 펩티드의 카복시-말단의 말단에서 개시된다. t-부톡시 카보닐(Boc) 보호 그룹은 그밖의 보호성 그룹이 적당하더라도 모든 아미노 그룹에서 사용할 수 있다. 예를 들면 Boc-N-OH, Boc-S-OH, Boc-F-OH, Boc-R-OH 또는 Boc-Y-OH (예를 들면 선택된 ANP 동족체 카복시-말단의 아미노산)는 클로로메틸화된 폴리스티렌 수지 지지체로 에스테르화할 수 있다. 폴리스티렌 수지 지지체는 바람직하게는 폴리스티렌 중합체가 특정 유기용매중에서 완전히 불용성이 되도록 하고 가교-결합제로서 약 0.5 내지 2% 디비닐 벤젠과의 스티렌 공중합체이다[참조; Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco(1969) and merrifiled, J. Am. Chem. Soc. 85 : 2149-2154(1963)]. 이들 및 그밖의 펩티드 합성 방법은 또한 미합중국 특허 제3,862,925호, 제3,842,067호, 제3,972,859호 및 제4,105,602호로 예증된다.

아미노산 잔기의 서열에 결합된 아미노-말단 α-케토산을 포함하는 이들 화합물의 합성에 있어서, 적당한 α-케토산은 통상 아미노산 잔기와 함께 통상 사용되는 보호 그룹을 사용하지 않고 가할 수 있다. 그러나 숙신산 및 글루타르산(각각 아스파르트산 및 글루탐산에 상응하는 α-케토산)은 통상 α-케토산 1/2벤질 유도체를 사용하여 결합된다.

화합물은 예를 들어 펩티드 합성기[Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer (Foster City, California) 또는 Biosearch SAM Ⅱ automatic peptide synthesize (Biosearch, Inc. San Rafael, California)]로 제조업자가 제공한 설명서의 설명에 따라 수동적 또는 자동적 방법으로 편리하게 합성할 수 있다.

본 동족체 화합물의 합성하는 도중 본 발명의 기술에 따라 제조된 중간체가 그 자체로서 신규하고 유용한 화합물이며, 따라서 본 발명의 범위내에 속한다는 것은 펩티드 합성 분야의 통상의 숙련가들에 의해 쉽게 인지될 것이다.

또한 본 발명의 선택적 화합물은 공지된 방법에 따라 제조된 재조합 DNA 작제물의 발현에 의해 제조될 수 있다. 이러한 제조는 대량 생산 또는 그러한 화합물의 선택적 생산에 바람직할 수 있다.

본 발명의 화합물은 포유동물에 있어서 나트륨 이뇨성, 이뇨성 및 저혈압 활성을 가짐에 나타낸다. 또한 합성 화합물을 포함한 본 발명의 화합물은 혈관 이완 활성을 나타낼 수 있거나, 알도스테론의 방출을 억제할 수 있다.

상기에서 인용한 생리적 효과를 나타내는 선형 또는 사이클릭 환 형태의 본 발명의 화합물은 예를 들어 나트륨 이뇨, 이뇨 및 혈관확장을 유도하는 많은 치료적 적용에 사용할 수 있다. 따라서 이들 화합물 및 이들을 함유한 조성물은 예를 들어 불충분한 신장 관류 또는 사구체 여과율의 감소로 인한 신부전증 및 고혈압 이외에 울형성 심부전증, 신증 및 간경변증과 같은 다양한 부종 상태의 치료에 대한 치료제로서 사용됨을 발견할 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 단독으로 상기에서 요약한 치료효과를 나타낼 수 있는 유효량의 본 발명의 화합물 및 이의 무독성 부가염, 아미드 및 에스테르를 함유한 조성물을 제공할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 생리적으로 허용되는 액체, 겔 또는 고형희석제, 보조제 및 부형제와 함께 사용할 수 있다.

이들 화합물 및 조성물은 가축과 같은 수의 용도 및 그밖의 치료제와 유사한 방법으로 인체에 있어서 임상적 용도로 포유동물에 투여할 수 있다. 통상적으로 치료 효능에 필요한 용량은 숙주 체중의 약 0.01 내지 1000㎍/㎏, 보다 통상적으로는 0.1 내지 1000㎍/㎏의 범위이다. 또한 이들 범위내의 용량을 통상 24시간을 초과하는 연장 기간동안, 목적하는 치료효과가 수득될때까지 일정하게 주입시켜 투여할 수 있다.

통상 이러한 조성물은 액상 용제 또는 현탁제와 같은 주사 형태로 제조할 수 있고, 용제 또는 현탁제 중에 적당한 고체 형태는 주사하기 전에 액체로 제조할 수 있다. 제형은 또한 유화시킬 수 있다. 활성성분은 통상 생리적으로 허용되며 활성성분과 친화성인 희석제 또는 부형제와 혼합된다. 적합한 희석제 및 부형제는 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 이의 혼합물이다. 또한 경우에 따라 조성물은 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제 등과 같은 보조물질의 소량을 함유할 수 있다.

조성물은 피하주사 또는 정맥주사와 같은 주사로 비경구 투여한다. 또한, 그밖의 투여 형태에 적당한 제형으로는 좌제, 비강용 에어로졸 및 몇몇의 경우에서는 경구용 제제를 포함한다. 좌제용 통상적 결합제 및 부형제는 예를 들어 폴리알킬렌글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함할 수 있고, 이러한 좌제는 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1% 내지 2% 범위의 활성 성분을 함유한 혼합물에서 제조할 수 있다. 경구용 제형은 예를 들어 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 정상적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 액제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 서방형제 또는 산제의 형태이며, 활성성분의 10% 내지 95%, 바람직하게는 25% 내지 70%를 함유한다.

펩티드 화합물은 중성 또는 염의 형태로서 조성물로 제형화할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 무독성 염은 산 부가염(유리 아미노 그룹과 함께 생성된)을 포함하며, 이들은 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 함께 생성된다. 유리 카복실 그룹과 함께 생성된 염은 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도할 수 있다.

나트륨 이뇨성, 이뇨성 또는 혈관 이완활성을 나타내는 본 발명의 화합물 뿐 아니라, 본 발명의 화합물은 이러한 유용한 화합물의 합성에 있어서 중간체로서 또한 사용할 수 있다. 또다른 적절한 선택에 의해, 그의 활성 수준이 감소되거나 제거된 본 발명의 화합물은, 예를 들어 대체 수용체(alternate receptor)에 결합하며, 수용체 턴오버(turnover)를 자극하거나 분해 효소 또는 수용체 활성에 대한 대체 기질을 제공하여 이들 효소 또는 수용체를 억제함으로써, 본 발명의 범위와의 화합물을 포함하여 다른 이뇨성, 나트륨 이뇨성 또는 혈관이완성 화합물의 활성을 조절하는데 기여할 수 있다. 이러한 방식으로 사용된 경우, 이러한 화합물은 그밖의 활성 화합물과의 혼합물로서 사용될 수 있거나 예를 들어 그들 자신의 담체 내에서 분리적으로 운반될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 표지한 시약, 통상적으로 항체를 사용하여 면역 검정중 사용하기 위한 항 혈청제조에 사용될 수 있다. 통상 폴리펩티드를 디알데하이드, 특히 탄소수 4 내지 6의 지방족 또는 카보디이미드를 사용하여 항원에 결합시킬 수 있다. 이들 화합물 및 면역 시약은 예를 들면 플루오레신 또는 로다민과 같은 발색체, 형광체,¹²⁵I,³⁵S,¹⁴C 또는³H와 같은 방사선 동위체 또는 자기입자와 같은 다양한 표지로 공지된 방법을 사용하여 표지할 수 있다.

이들 표지된 화합물 및 시약 또는 이들을 인지하고 특이적으로 이에 결합할 수 있는 표지된 시약은 예를 들어 진단성 시약과 같은 용도로 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 생물학적 표본으로부터 유도된 샘플은 본 발명의 화합물로 통상적 항원성 결정소를 갖는 물질의 유무 또는 양을 검정할 수 있다. 또한 모노클로날 항체가 본 분야의 공지된 방법으로 제조될 수 있으며, 이 항체는 예를 들어 생체내에서 면역학적으로 관련된 화합물의 과잉생산을 중성화시키는 치료적 용도를 발견할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위하여 제시된 것이지, 이것으로 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

[실험적 실시예]

하기 실험 실시예에서 화학적으로 합성된 ANP 동족체 화합물의 아미노산 서열은 문헌[참조 : Atlas, s. et al., Nature 309 : 717-719(1984)]에 기술된 천연 래트-유도된 심방성 나트륨 이뇨성 펩티드 서열중 1 위치에 있는 아르기닌 잔기에 상응하는 아미노-말단 아르기닌 잔기로부터 번호를 매긴다.

Ⅰ. 심방성 나트륨 이뇨성 펩티드 동족체 화합물의 화학적 합성

A. 합성 공정

본 발명을 상술하기 위해서 하기 일반식의 본 발명 화합물 및 이의 D 또는 L광학적 이성체를 제조한다.

Z₁-AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂-Z₂

상기식에서, AA₈및 AA₁₁은 각각 독립적으로 염기성/비-사이클릭 또는 중성/비극성/소형 또는 중성/극성/비-사이클릭 아미노산 잔기이고; AA₉및 AA₁₂는 각각 독립적으로 중성/비극성/대형/비-사이클릭 아미노산 잔기이며; AA₁₀은 산성 아미노산 잔기이고; Z₁및 Z₂는 상술한 바와 같다.

본 발명 화합물은 수동적으로 또는 제조업자의 지시에 따라 Applied Biosystems 430A 펩티드 합성기(Fostor City, California) 또는 바이오서치 SAM Ⅱ 자동화 펩티드 합성기(Biosearch, San Rafael, California) 상에서 t-Boc 아미노산을 사용하여 고상법으로 제조한다.

상술한 바에 따라 하기 공정을 이용하여 신규의 동족체 ANP 화합물을 화학 합성한다.

[공정 A]

[Boc-AA₁… AA_n-₁-AA_n-수지 하이드록시메틸 폴리스티렌 에스테르의 제조]

Boc-AA_n-₁-OH의 혼입을 위하여 1g의 Boc-AA_n-O-폴리스티렌-수지(0.2 내지 0.6밀리몰/g 수지, 예; Peninsula Labs, Inc. 제품)를 조작 A에 따라 처리한다.

[조작 A]

1) 디클로로메탄(CH₂Cl₂)으로 3회 세척한다.

2) 1분간 용적비 45 : 50 : 5의 TFA : CH₂Cl₂: 에탄디티올(EDT)로 처리한다.

3) 20분간 용적비 45 : 50 : 5의 TFA : CH₂Cl₂: EDT로 처리한다.

4) CH₂Cl₂로 3회 세척한다.

5) 10%(용적/용적) 디이소프로필에틸아민(DIPEA)/CH₂Cl₂로 1분간 2회 처리한다.

6) CH₂Cl₂로 2회 세척한다.

7) 메탄올(MeOH)로 2회 세척한다.

8) 5) 내지 7) 단계를 1회 더 반복한다.

9) CH₂Cl₂로 3회 세척한다.

10) 미리 CH₂Cl₂또는 50 : 50 용적비의 디메틸포름아미드(DMF)/CH₂Cl₂에 용해시킨 적절히 보호된 Boc-아미노산의 대칭 무수물 1 내지 6당량을 가한다(Boc-N-OH, Boc-Q-OH 및 Boc-R(TOS)-OH는 N-하이드록시벤조트리아졸을 사용하여 활성에스테르로 커플링시킨다).

11) CH₂Cl₂로 2회 세척한다.

12) 10% DIPEA로 2회 세척한다.

13) CH₂Cl₂로 2회 세척한다.

14) MeOH로 2회 세척한다.

15) CH₂Cl₂로 2회 세척한다.

16) 11) 내지 15) 단계를 1회 더 반복한다.

17) 카이제르 등의 방법[Kaiser et al., Anal. Biochem. 34 : 595(1970)]에 따라 닌히드린 반응으로 시험한다. 커플링 반응이 불완전하면 10) 내지 16) 단계를 반복하거나 DMF중 0.30M의 N-아세틸 이미다졸 또는 CH₂Cl₂중 과량의 아세트산 무수물을 사용하여 캡 합성법(cap synthesis)을 반복한다.

[공정 B]

[Boc-AAn-p-메틸벤즈히드릴아민 수지의 제조]

후술되는 바와 같이 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드를 통해 p-메틸벤즈히드릴아민(pMBHA)에 선택된 Boc-AAn-OH를 부착시킨다.

[조작 B]

1) pMBHA HCl 수지를 세척한다.

2) 상기 수지를 10%(용적/용적) DIPEA/CH₂Cl₂로 2회 세척한다.

3) CH₂Cl₂로 2회 세척한다.

4) MeOH로 2회 세척한다.

5) CH₂Cl₂로 2회 세척한다.

6) 미리 형성된, CH₂Cl₂에 용해시킨 적절히 보호된 Boc-아미노산의 대칭 무수물 1 내지 6당량을 0.5 내지 24시간동안 가하여 반응시킨다.

비처리 아미노 그룹은 0.30M N-아세틸이미다졸 : DMF 또는 아세트산 무수물 : CH₂Cl₂로 아세틸화시킨다. 본 발명의 특정 양상을 설명해주는 대표적인 ANP 동족체 화합물(AP#로 표시)의 화학 합성법은 하기 실시예에서 상세히 설명된다.

[실시예 1]

[* AP1 R-S-S-C-F-G-G-R-I-D-R-I-G-A-Q-S-G-C-N-S-F-R-Y]

1g의 Boc-Y(2Brz)-O-수지(0.54meq/gm, Peninsula Labs Inc., Belmont, CA)를 필요한 서열의 아미노산과 공정 A에 따라 반응시킨다(Boc-R(Tos)-OH, Boc-F-OH, Boc-S(Bzl)-OH, Boc-N-OH, Boc-C(4-CH₃Bzl)-OH, Boc-G-OH, Boc-S(Bzl)-OH, Boc-Q-OH, Boc-A-OH, Boc-G-OH, Boc-I-OH.1/2H₂O, Boc-R(Tos)-OH, Boc-D-(OBzl)-OH, Boc-I-OH.1/2H₂O, Boc-R(Tos)-OH, Boc-G-OH, Boc-G-OH, Boc-F-OH, Boc-C(4-CH₃Bzl)-OH, Boc-S-(Bzl)-OH, Boc-S-(Bzl)-OH, Boc-R(Tos)-OH의 순으로 도입한다). 보호된 펩티딜 수지를 1분간 TFA : CH₂Cl₂: EDT(45 : 50 : 5 용적비)로 처리하고 20분후 CH₂Cl₂로 3회, 이어서 MeOH로 2회 세척하여 펩티딜 수지의 TFA 염을 수득하고 진공하에 건조시킨다.

다음에 -10℃에서 10% 아니솔, 2% 에틸 메틸 설파이드를 함유하는 무수 플루오르화 수소(HF)중에 30분간 펩티딜 수지를 현탁시킨 후 0℃에서 30분간 같은 방법으로 현탁시킨다. 진공하에서 HF를 증발제거하고 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르중에 현탁시킨다. 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르로 2회, 클로로포름으로 1회, 디에틸 에테르로 1회, 클로로포름으로 1회 세척한 다음 디에틸 에테르로 1회 세척한다. 펩티드를 2.0M 아세트산을 사용하여 반응 혼합물로부터 추출하고 H₂O로 희석한 다음 동결건조시켜 비산화된 설프히드릴 펩티드를 수득한다.

생성된 조 펩티드를 pH 7.9에서 탈산소화 0.01M 암모늄 아세테이트(NH₄OAc)에 0.5㎎/㎖로 용해시킨 후 약간 과량의 0.01M 페리시안화 칼륨(KCN)액을 적가하여 산화시키고 20분간 교반시킨 다음 아세트산을 가하여 pH 5로 조절한다. 수득된 펩티드 용액을 DOWEX AG 3×4 음이온 교환 수지로 처리하여 여과하고, H₂O로 희석한 후 동결건조시켜 조 폐환 펩티드를 수득한다.

Sephodex

G-25F[Pharmacia Fine Chemicals]상에서 0.5M AcOH를 용출제로 사용하여 탈염시키고 CM-Sepharose

[Pharmacia Fine Chemicals] 또는CM-셀룰로스(Whatman)상에서 pH 6.5의 300mM NH₄OAc를 pH 4.5의 10mM NH₄OAc액에 가하여 생성된 용출 구배를 사용하여 이온 교환 크로마토그라피시켜 펩티드를 정제한다. 역상 HPLC에 의해 순도 97% 이상으로 판정된 분획을 모아서 H₂O로부터 수회 동결건조시켜 정제된 AP1 아세테이트 염을 수득한다.

[실시예 2]

[* AP2 R-S-S-C-G-R-I-D-R-I-G-A-Q-S-G-C-N-S-F-R-Y]

1g의 Boc-Y(2Brz)-O-수지(0.54meq/gm, Peninsula Labs Ine., Belmont, CA)를 필요한 서열의 아미노산과 공정 A에 따라 반응시킨다(Boc-R(Tos)-OH, Boc-F-OH, Boc-S(Bzl)-OH, Boc-N-OH, Boc-C(4-CH₃Bzl)-OH, Boc-G-OH, Boc-S(Bzl)-OH, Boc-Q-OH, Boc-A-OH, Boc-G-OH, Boc-I-OH.1/2H₂O, Boc-R(Tos)-OH, Boc-D-(OBzl)-OH, Boc-I-OH.1/2H₂O, Boc-R(Tos)-OH, Boc-G-OH, Boc-C(4CH₃Bzl)-OH, Boc-S-(Bzl)-OH, Boc-S-(Bzl)-OH, Boc-R(Tos)-OH의 순으로 도입한다). 보호된 펩티딜 수지를 1분간 TFA : CH₂Cl₂: EDT(45 : 50 : 5 용적비)로 처리하고 20분후 CH₂Cl₂로 3회, 이어서 MeOH로 2회 세척한 후 진공시켜 펩티딜 수지의 TFA 염을 수득한다.

다음에 -10℃에서 10% 아니솔, 2% 에틸 메틸 설파이드를 함유하는 무수 HF중에 30분간 펩티딜 수지를 현탁시킨 후 0℃에서 30분간 같은 방법으로 현탁시킨다. 진공하에서 HF를 증발제거하고 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르중에 현탁시킨다. 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르로 2회, 클로로포름으로 2회 세척한 다음 디에틸 에테르로 2회 세척한다. 수득된 펩티드를 2.0M 아세트산을 사용하여 추출하고 동결건조시켜 비산화된 설프히드릴 펩티드를 수득한다.

생성된 조 펩티드를 pH 7.9에서 탈산소화 0.01M NH₄OAc에 0.5㎎/㎖로 용해시킨 후 약간 과량의 0.1M KCN 용액을 적가하여 산화시키고 20분간 교반시킨 다음 아세트산을 가하여 pH 5로 조절한다. 수득된 펩티드 용액을 DOWEX AG 3×4 음이온 교환 수지로 처리하여 여과하고, H₂O로 희석한 후 동결건조시켜 조 폐환 펩티드를 수득한다.

Sephadex

G-25F상에서 0.5M AcOH를 용출제로 사용하여 탈염시킨후 CM-Sepharose

또는 CM-셀룰로스(Whatman)상에서 pH 6.5의 300mM NH₄OAc를 pH 4.5의 10mM NH₄OAc 용액에 가하여 생성된 용출 구배를 사용하여 이온 교환 크로마토그라피하여 펩티드를 정제한다. 역상 HPLC에 의해 순도 97% 이상으로 판정된 분획을 모아서 H₂O로부터 수회 동결건조시켜 정제된 AP₂아세테이트 염을 수득한다.

[실시예 3]

[* AP3 R-S-S-C-F-G-G-R-I-D-R-I-G-A-Q-S-C-N-S-F-R-Y]

1g의 Boc-Y(2Brz)-O-수지(0.54meq/gm, Peninsula Labs Inc., Belmont, CA)를 필요한 서열의 아미노산과 공정 A에 따라 반응시킨다(Boc-R(Tos)-OH, Boc-F-OH, Boc-S(Bzl)-OH, Boc-N-OH, Boc-C(4-CH₃Bzl)-OH, Boc-S(Bzl)-OH, Boc-Q-OH, Boc-A-OH, Boc-G-OH, Boc-I-OH.1/2H₂O, Boc-R(Tos)-OH, Boc-D(OBzl)-OH, Boc-I-OH.1/2H₂O, Boc-R(Tos)-OH, Boc-G-OH, Boc-G-OH, Boc-F-OH, Boc-C(4CH₃Bzl)-OH, Boc-S(Bzl)-OH, Boc-S(Bzl)-OH, Boc-R(Tos)-OH의 순으로 도입한다). 보호된 펩티딜 수지를 1분간 TFA : CH₂Cl₂: EDT(45 : 50 : 5 용적비)로 처리하고 20분후 CH₂Cl₂로 3회, 이어서 MeOH로 2회 세척하여 펩티딜 수지의 TFA 염을 수득하고 진공하에 건조시킨다.

다음에 -10℃에서 10% 아니솔, 2% 에틸 메틸 설파이드를 함유하는 무수 HF중에 30분간 펩티딜 수지를 현탁시킨 후 0℃에서 30분간 같은 방법으로 현탁시킨다. 진공하에서 HF를 증발제거하고 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르중에 현탁시킨다. 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르로 2회, 클로로포름으로 1회, 디에틸 에테르로 1회, 클로로포름으로 1회 세척한 다음 디에틸 에테르로 1회 세척한다. 수득된 펩티드를 2.0M 아세트산을 사용하여 반응 혼합물로부터 설프히드릴 펩티드를 수득한다.

생성된 조 펩티드를 pH 8에서 탈산소화 0.01M NH₄OAc에 0.5㎎/㎖로 용해시킨 후 약간 과량의 0.01M KCN 액을 적가하여 산화시키고 20분간 교반시킨 다음 아세트산을 가하여 pH 5로 조절한다. 수득된 펩티드 용액을 DOWEX AG 3×4 음이온 교환 수지로 처리하고 여과하여, H₂O로 희석한 후 동결건조시켜 조 폐환 펩티드를 수득한다.

Sephadex

G-25F상에서 0.5M AcOH를 용출제로 사용하여 탈염시킨 후 CM-Sepharose

또는CM-셀룰로스(Whatman)상에서 300mM NH₄OAc를 pH 4.5의 10mM NH₄OAc 용액에 가하여 생성된 용출 구배를 사용하여 이온 교환 크로마토그라피시켜 펩티드를 정제한다. 역상 HPLC에 의해 순도 97% 이상으로 판정된 분획을 모아서 H₂O로부터 수회 동결건조시켜 정제된 AP3 아세테이트 염을 수득한다.

[실시예 4]

[* AP4 R-S-S-C-F-G-G-R-I-D-R-I-G-A-C-N-S-F-NH₂]

조직 B를 이용하여 수득한 1g의 Boc-F-pMBHA 수지를 필요한 서열의 아미노산과 공정A에 따라 반응시킨다(Boc-S(Bzl)-OH, Boc-N-OH, Boc-C(4-CH₃Bzl)-OH, Boc-A-OH, Boc-G-OH, Boc-I-OH.1/2H₂O, Boc-R(Tos)-OH, Boc-D(OBzl)-OH, Boc-I-OH.1/2H₂O, Boc-R(Tos)-OH, Boc-G-OH, Boc-G-OH, Boc-F-OH, Boc-C(4-CH₃Bzl)-OH, Boc-S(Bzl)-OH, Boc-S-(Bzl)-OH, Boc-R(Tos)-OH의 순으로 도입한다).

다음에 -10℃에서 10% 아니솔, 2% 에틸 메틸 설파이드를 함유하는 무수 HF중에 30분간 펩티딜 수지를 현탁시킨후 0℃에서 30분간 같은 방법으로 현탁시킨다. 진공하에서 HF를 증발제거하고 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르중에 현탁시킨다. 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르로 2회, 클로로포름으로 1회, 디에틸 에테르로 1회, 클로로포름으로 1회 세척한 다음 디에틸 에테르로 1회 세척한다. 수득된 펩티드를 2.0M 아세트산을 사용하여 반응 혼합물로부터 추출하고 H₂O로 희석한 다음 동결건조시켜 비산화된 설프히드릴 펩티드를 수득한다.

생성된 조 펩티드를 pH8의 탈산소화 0.01M NH₄OAc에 0.5㎎/㎖로 용해시킨 후 약간 과량의 0.01M KCN을 적가하여 산화시키고 20분간 교반시킨 다음 아세트산을 가하여 pH 5로 조절한다. 수득된 펩티드 용액을 DOWEX AG 3×4 음이온 교환 수지로 처리하고 여과하여, H₂O로 희석한 후 동결건조시켜 조 폐환 펩티드를 수득한다.

Sephadex

G-25F상에서 0.5M AcOH를 용출제로 사용하여 탈염시킨 후 CM-Sepharose

또는CM-셀룰로스(Whatman) 상에서 300mM NH₄OAc를 pH 4.5의 10mM NH₄OAc 용액에 가하여 생성된 용출 구배를 사용하여 이온 교환 크로마토그라피시켜 펩티드를 정제한다. 역상 HPLC에 의해 순도 97% 이상으로 판정된 분획을 모아 H₂O로부터 수회 동결건조시켜 정제된 AP4 아세테이트 염을 수득한다.

실시예 1 내지 4(동족체 펩티드 AP1 내지 4의 제조)에 요약된 공정에 적절히 변형을 가하여 하기 ANP동족체를 합성한다(디설파이드 결합은 나타내지 않음) :

상기 실시예에서, "*"는 아미노산 분석 결과 펩티드의 적절한 아미노산 서열이 수득되었음을 나타낸다.

하기 실시예는 본 발명의 양상을 설명하는 유기 치환 그룹이 변형된 대표적 동족체 펩티드 화합물(AP#로 표시)의 화학합성을 설명하는 것이다.

[실시예 306]

[* AP306[2-나프틸아세틸]-G-G-R-I-D-R-G-A-NH₂]

조직 B를 이용하여 수득한 1g의 Boc-pMBHA 수지(0.4meq/gm)를 필요한 서열의 아미노산 및 아미노-말단 치환 그룹과 공정 A에 따라 반응시킨다(Boc-G-OH, Boc-I-OH·1/2H₂O, Boc-R(Tos)-OH, Boc-D(OBzl)-OH, Boc-I-OH·1/2H₂O, Boc-R(Tos)-OH, Boc-G-OH, Boc-G-OH, 2-나프틸아세트산의 순으로 도입한다). 보호된 펩티딜 수지를 CH₂Cl₂로 3회, 이어서 MeOH로 3회 세척하여 진공하에 건조시킨다.

다음에 -10℃에서 10% 아니솔, 2% 에틸 메틸 설파이드를 함유하는 무수 HF중에 30분간 펩티딜 수지를 현탁시킨후 0℃에서 30분간 같은 방법으로 현탁시킨다. 진공하에서 HF를 증발제거하고 펩티드/수지 혼합물을 에틸 에테르중에 현탁시킨다. 펩티드/수지 혼합물을 유리 깔대기에 옮기고 에틸 에테르로 2회, 클로로포름으로 1회, 에틸 에테르로 1회 및 클로로포름 및 에틸 에테르로 다시 1회씩 세척한다. 수득된 펩티드를 2.0M 아세트산을 사용하여 반응 혼합물로부터 추출하고 H₂O로 희석한 다음 동결건조시킨다.

DM-Sepharose

(Pharmacia)상에서 pH 6.5의 100mM NH₄OAc를 pH 4.5의 10mM NH₄OAc 용액에 가하여 생성된 용출 구배를 사용하여 이온 교환 크로마토그라피시켜 펩티드를 정제한다. 254㎚에서 분획을 모니터하고 역상 HPLC에 의해 분석한다. 역상 HPLC에 의해 순도 97% 이상으로 판정된 분획을 합쳐서 H₂O로부터 수회 동결건조시켜 정제된 AP306 아세테이트 염을 수득한다.

[실시예 307]

[* AP307[2-나프톡시아세틸]-

]

조직 B에 따라 수득한 1g의 Boc-I-pMBHA 수지(0.4meq/gm)를 필요한 서열의 아미노산 및 아미노-말단 치환 그룹과 공정 A에 따라 반응시킨다(Boc-R(Tos)-OH, Boc-D(OBzl)-OH, Boc-I-OH·1/2H₂O, Boc-R(Tos)-OH, Boc-NH(CH₂)₄COOH, 2-나프톡시 아세트산의 순으로 도입한다). 보호된 펩티딜 수지를 CH₂Cl₂로 3회, 이어서 MeOH로 3회 세척하여 진공하에 건조시킨다.

다음에 -10℃에서 10% 아니솔, 2% 에틸 메틸 설파이드를 함유하는 무수 HF중에 30분간 펩티딜 수지를 현탁시킨 후 0℃에서 30분간 같은 방법으로 현탁시킨다. 진공하에서 HF를 증발제거하고 펩티드/수지 혼합물을 에틸 에테르중에 현탁시킨다. 펩티드/수지 혼합물을 유리 깔대기에 옮기고 에틸 에테르로 2회, 클로로포름으로 1회, 에틸 에테르로 1회, 클로로포름으로 1회 세척한 다음 에틸 에테르로 1회 세척한다. 수득된 펩티드를 2.0M 아세트산을 사용하여 반응 혼합물로부터 추출하고 H₂O로 희석한 다음 동결건조시킨다.

CM-Sepharose

(Pharmacia)상에서 pH 6.5의 100mM NH₄OAc를 pH 4.5의 10mM NH₄OAc 용액에 가하여 생성된 용출 구배를 사용하여 이온교환크로마토그라피시켜, 수득된 펩티드를 정제한다. 254㎚에서 분획을 모니터하고 역상 HPLC에 의해 분석한다. 역상 HPLC에 의해 순도 97% 이상으로 판정된 분획을 모아 H₂O로부터 수회 동결건조시켜 정제된 AP307 아세테이트염을 수득한다.

실시예 306 및 307(동족체 펩티드 AP306 및 AP307의 제조)에 요약된 공정에 적절한 변형을 가하여 하기 ANP 동족체 펩티드를 제조한다 :

상기 실시예에서, "*"는 아미노산 분석 결과 펩티드의 적절한 아미노산 서열이 수득되었음을 나타낸다.

Ⅱ. 생물학적 시험

상술한 바에 따라 합성된 선택된 동족체 심방성 나트륨 이뇨성 펩티드(ANP)에 대한 생물학적 활성 데이타는 후술하는 바와 같이 생화학적 분리 조직 및 전체 포유동물 생물검정용으로 제시된다.

어떠한 이론과 결부시키지 않고서도, 본 발명의 ANP 동족체 화합물의 활성은 신장 수용체 및 내인성 ANP의 순수성에 영향을 미치는 다른 부위에 대한 친화성에 기인한다. 하기 시험관내 생물학적 실험 데이타에서 본 발명의 동족체 화합물이 배양시킨 소의 대동맥 평활근(BASM) 세포 및 소의 내피(BAE) 세포 수용체에의 결합하기 위해 요오드화 천연 ANP 분자와 경쟁함을 알 수 있다. 이와같은 경쟁은 관련된 순수 수용체에 대한 결합을 위해 명백히 진단적이다. 또한 이러한 상호관계는 경쟁적 결합 검정(단락 A)에서 활성인 동족체가 마취시킨 래트 및 개에 있어서 이뇨작용 및 나트륨 이뇨를 야기시킬 수 있으며, 마취시킨 래트에 있어서 혈압 강하 작용을 할 수 있다(단락 B)는 사실을 나타내는 시험관내 실험 데이타에 의해 확인된다. 하지만, 동족체는 분리된 신장에 있어서 이뇨 또는 나트륨 이뇨를 야기하지는 않지만, 분리된 조직에 있어서 "천연" ANP의 작용을 강화시킨다(단락 C). 또한 본 발명의 선형 또는 축소된-원 사이클릭 동족체는 사이클릭 GMP 활성을 감소시키는데 이 활성은 ANP의 직접적인 생물학적 작용을 증명하는 것이다.

따라서 하기 기술되는 분석 결과에서 본 발명의 범위내에 포함되는 광범위한 범위의 펩티드는 시험관내 검정에 있어서 양성작용을 갖는 것으로 평가되는데, 이와 같은 사실은 대표적인 펩티드를 사용하여 생체내 나트륨 이뇨/이뇨 및 혈관 확장 활성의 모델로 확인된다.

A. 수용체 결합 검정

신장, 부신, 혈관 및 배양세포와 같은 표적 세포상에서 특히 ANP 수용체 부위가 확인되었다[Napier, M. A., et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA 81 : 5946-5940(1984); DeLean, A., et al., Endocrinology 115; 1636-1638(1984); Schenk, D. B., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 127 : 433-442(1985) 참조]. 상기 기술된 특히 수용체 부위에 대한 ANP 또는 ANP 동족체의 결합이 생물학적 활성은 나타내게 하는 필요조건이기 때문에 이와같은 수용체에 대한 ANP 동족체의 결합은 생물학적 활성을 암시하는 것으로 간주된다.

배양된 BASM 및 BAE 세포에 결합하기 위해 표지된 천연 ANP와 경쟁하는 ANP 동족체의 능력을 평가하는 검정법이 하기 참조문헌에 기술된 바와 같이 개발되었다[Schenk, Supra, and Scarborough, R. M. et al., J, Biol. Chem. 261 : 12960-12964(1986) 참조]. R-S-S-C-F-G-G-R-I-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y의 아미노산을 갖는 천연 ANP를 카복시-말단 Y잔기 상에서 요오드화시키고 [¹²⁵I]-rANP(126-150)로 동정한다. 유사한 "경쟁적 치환" 수용체 결합 검정을 이용하는 것은 특정한 리간드-수용체 상호작용을 시험하기 위한 당해 분야에 있어서 통상적인 사실로 간주된다. 이와 같은 ANP-수용체 결합 검정의 결과가 제1도에 기술된다.

상기 검정에 있어서, 0.5nM[¹²⁵I]-rANP(126 내지 150)를 변화량의 비표지된 rANP (126 내지 150) 또는 하기 서열식의 아미노산을 갖는 본 발명 화합물 존재하에 BASM 세포 각각의 개별 샘플중에 배양시킨다.

AP25 R-S-S-C-R-I-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y

AP37 C-F-G-G-R-I-D-R-I-G-A-C-NH₂

AP101 A-F-G-G-R-I-D-R-I-G-A-NH₂또는

AP132 (desNH₂-F)-G-G-R-I-D-R-I-NH₂

제1도에 나타난 바와 같이 농도가 증가된 rANP(126 내지 150) 또는 동족체 펩티드 AP25, AP37, AP101 또는 AP132는 [¹²⁵I]-rANP(126 내지 150)의 BASM 세포-관련 수용체에의 결합을 효과적으로 방해한다. 최대 50%[¹²⁵I]-rANP(126 내지 150) 결합이 치환된 비표지된 펩티드의 농도를 Ki(app)로 명명하고, 이는 수용체-결합 친화도를 나타낸다. 그러므로 Ki(app)=100nM인 가상의 펩티드 A는 Ki(app)=10nM인 가상의 펩티드 B보다 수용체에 대한 상호작용이 약함을 나타낸다.

1개 이상의 ANP 수용체 부위에 상기 ANP 동족체가 작용한다고 가정할때 수용체 친화도가 증가하면 생물학적 효력을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.

표 IA, IB, IC, ID 및 IE는 본 발명의 동족체 화합물이 BASM 또는 BAE 세포상의 특이 수용체 부위에 대한 [¹²⁵I]-rANP(126 내지 150) 결합을 치환시키는 농도를 비교해 주는 것이다. 하기에서 나타난 바와 같이 이 데이타는 천연 ANP의 생체내 활성과의 상호관계를 나타낸다.

[표 IA]

표 IA에서는 rANP(126 내지 150)의 수용체 결합 친화도 (Ki(app))와 AP 23 내지 25으로 표시된 본 발명의 동족체 펩티드 화합물의 Ki(app)를 비교하고 있는데, 본 발명화합물의 펜타펩티드 핵은 RIDRI이고 Z₁및 Z₂는 각각 X₁-C-X₂및 X₃-C-X₄(이때, X₁은 R-S-S이고 X₃는 G-A-Q-S-G-L-G이며 X₄는 N-S-F-R-Y이고 X₂는 G-G, G 및 desX₂중에서 선택된다) 그룹이다. 또한 음성 대조 화합물로 필수 펜타펩티드 잔기가 없는 AP 54도 포함시켰다.

X₂가 G인 동족체 펩티드 AP 24가 친화도가 낮은 것으로 보이나, X₂가 G-G인 동족체 펩티드 AP 23 및 X₂가 desX₂인 동족체 펩티드 AP 25는 rANP(126 내지 150)와 동등한 수용체 친화도를 나타낸다. 그러나 AP 54의 수용체 결합력은 훨씬 낮다. 따라서 Ki(app)가 활성과 상호 관계가 있다면 AP 54의 생물학적 활성은 보다 낮을 것이 확실하다.

표 IA에 나타난 데이타에서 본 발명 화합물은 대조 화합물인 AP 54와 비교할때 수용체 결합면에 있어 보다 유효함을 알 수 있다. 하기 단락 B에서 확인되는 바와 같이, 표 IA에 제시된 본 발명 화합물은 생체내 활성을 나타내는 반면, 음성 대조 화합물인 AP 54는 생체내 활성을 나타내지 않는다.

[표 IB]

상기 표 IB는 rANP(126 내지 150)의 Ki(app)와, X₁이 R-S-S이고 X₂가 F-G-G이며 X₄가 N-S-F-R-Y 또는 N-S-F-NH₂이고 X₃가 G-A-Q-S-G, G-A-Q-S, G-A-Q, G-A, G 및 desX₃로 이루어진 그룹중에서 선택된 표 IA에 제시한 화합물과 유사한 동족체 펩티드의 Ki(app)를 비교한 것이다. 이들 동족체는 고도의 수용체-결합 친화도를 나타내는 반면 AP 22의 친화도는 아주 낮다.

[표 IC]

표 IC는 펜타펩티드 핵 R(I/M)DRI는 변함이 없고 전술한 바와 같이 다른 치환기가 바람직한 것들로 치환된 화합물에 대한 추가의 데이타를 나타낸 것이다. 표 IC에는 C잔기가 D형인 화합물(AP 96)을 포함하여 Z₁이 X₁-C-X₂이고 Z₂가 X₃-C-X₄인 화합물의 추가적 양태가 제공된다. 다수의 상기 화합물은 탁월한 수용체 결합 활성을 나타낸다. 그러나, 덜 바람직한 형태의 화합물인 AP 114의 감소된 결합 친화도는 현재 연구중에 있다. 또한 R(I/M)DRI 펜타펩티드 핵이 변형된 몇몇 경우에 있어 친화도가 현저히 감소된다.

이와 같이 핵의 제안된 변형은 일련의 AP 113, AP 89, AP 90 및 AP 92에 나타나 있다. AP 113에 있어서 AA9으로서 D-M인 경우를 제외하고 모든 경우에 L-아미노산을 D-이성체로 치환하면 활성이 감소됨을 알 수 있다. Z₁및 Z₂를 다양하게 변형시킨 잔여 화합물도 수용체에 대한 친화도가 높다.

상기 표에서 AP 36의 경우 X₁및 X₄는 제로 아미노산 잔기의 펩티드일 수 있으며 AP 112 및 AP 36의 경우 X₂및 X₃가 함께 5개 이상의 아미노산을 나타낼 수 있음에 주의해야 한다.

[표 ID]

표 ID에 나타난 데이타는 Z₁이 Y₁-Y₂이고 Z₂가 NH₂, NHR' 또는 1 내지 20개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드인 본 발명 화합물 또는 그의 아미드 또는 알킬아미드의 선형 형태에 대한 수용체 결합 활성을 표시하는 것이다.

표 ID에 제시된 모든 화합물은 Y₁의 필수 소수 잔기가 없는 AP 125 및 AP 105를 제외하고 본 발명의 범위내에 포함되며, 펜타펩티드 핵을 함유하지 않는 AP 301, AP 303 및 AP 304 또한 본 발명의 범위내에 포함된다. 한편 이들 화합물은 비활성인 것으로 보여진다. 그외 AP 317, AP 322, AP 323, AP 325, AP 329 및 AP 333의 활성은 아주 낮은 것 같다. 그러나 하기 표에 제시한 바와 같이 높은 결합 친화도를 나타내는 AP 306, AP 314, AP 319 및 AP 324와 같은 단쇄 펩티드 화합물이 특별한 관심을 끌며, 이들은 탁월한 생물학적 활성을 나타낸다.

ANP에 대한 수용체 결합 검정이 특이점임을 나타내기 위해 rANP(126 내지 150)와 비관련 펩티드 호르몬인 안지오텐신 Ⅱ, 글루카곤, 부갑상선 호르몬 및 γ-MSH의 ANP-수용체 상호작용을 비교한 데이타를 표 IE에 제시한다.

[표 IE]

표 IE에서 나타난 바와 같이, rANP(126 내지 150)만이 측정할 만한 ANP-수용체 친화도를 나타낸다. 이와 같은 사실은 이 수용체에 대한 관련된 ANP-특이성을 입증하는 것이다.

상기에 제시한 표의 데이타에서 본 발명 화합물의 대표적인 대다수 화합물이 기술한 특이 수용체 결합 검정에 있어서 친화성을 나타냄을 알 수 있다. 하기 기술되는 단락에서는 수용체 결합력을 나타내는 본 발명의 대다수 화합물이 생체내에서도 활성인 반면, 수용체와 결합하지 않는 화합물은 생체내에서도 불활성임을 나타내고자 한다.

B. 전체 포유동물의 생물검정

본 발명의 동족체 화합물의 생물학적 활성은 마취시킨 래트 및 개에서 입증할 수 있다. 수용체 결합 친화도 및 생체내 작용간의 상호관계는 생물학적 활성에 대한 수용체 검정을 예측할 수 있게 한다.

1. 마취시킨 래트에 있어서의 이뇨

마취시킨 래트의 좌우 뇨관 및 대퇴 정맥에 캐뉼러를 삽관하고 뇨관으로부터 뇨를 수거한다. 대퇴 정맥을 통해 본 발명의 동족체 펩티드를 투여한다. 동족체 펩티드를 주입하기 전에 30분간 식염수를 주입하고 5분간의 기저기간동안 6회 뇨를 수거한 다음 뇨량을 비중계로 측정한다.

상기와 같은 기저 수거 기간후 30 또는 60분간 다양한 동족체 펩티드를 주입하고 주입하는 동안 5분 간격으로 및 주입후 60분간 뇨량을 측정한다(이때 래트를 식염수로 돌려보낸다). 주입직전 5분간의 기저 대조기간에 대한 6회의 뇨 유동 속도를 평균하고 기저 대조치의 펩티드를 투여하는 동안 및 투여한 후의 뇨유동 속도를 비교하여 데이타를 분석한다. 따라서 펩티드에 대한 반응이 기저 대조 반응치의 %로 평가되고 플롯화된다. 이에 대한 몇가지 예는 제2a도 내지 제2h도에 나타나 있다. 그래프의 시작부분에 있어서의 오차치는 기저치 ±SD(표준 편차)를 나타낸다. 따라서 기저치 ±SD 보다 실질적으로 높게 나타난 펩티드의 반응도는 통계학적으로 유의성 있게 반응도가 증가했다는 것으로 해석할 수 있다.

제2a도 내지 제2h도에 나타난 바와 같이, 이뇨 반응은 수용체 결합 연구에서의 예측과 상호관계가 있다. 본 발명의 동족체 펩티드 AP 20, AP 21, AP 25, AP 37, AP 101, AP 319 및 AP 324를 각각 5㎍/분, 5㎍/분, 5㎍/분, 10㎍/분, 5㎍/분, 10㎍/분 및 10㎍/분으로 주입했을때 뇨 유동속도(뇨량)가 현저히 증가되었다. 따라서 하기와 같은 본 발명의 동족체 펩티드 모두는 래트에 있어서 이뇨를 현저히 유발시킨다 :

반면, 표 IA에서 수용체 결합 활성이 현저하지 않은 것으로 나타난 본 발명 범위에 포함되지 않는 AP 54는 생체내에서도 비활성으로 나타난다. 그러므로 이들 데이타는 수용체 결합 활성과 생체내 활성간의 적절한 상호관계를 나타내는 것이다.

2. 마취시킨 개에 있어서의 이뇨 및 나트륨 이뇨성

본 발명의 동족체 화합물에 대한 생물학적 활성은 펜토바비탈로 마취시킨 개에서 확인할 수 있다. 예를 들면, 마취시킨 개의 좌우 뇨관 및 대퇴 정맥에 캐뉼러를 삽관하고 뇨관으로부터 뇨를 수거한다. 대퇴 정맥을 통해 동족체 펩티드를 투여한다. 동족체 펩티드를 주입하기 전 30분간 식염수를 주입하고 3회 걸쳐 10분간씩 뇨를 수거한다. 뇨량을 비중계로 측정하고 뇨중 나트륨량은 광도계로 측정한다.

상기 기술된 3회의 기저 수거 기간후 60분간 동족체 펩티드를 주입하고 다시 60분간 뇨유동속도를 측정한다. 주입기간(60분) 및 복원기(60분) 동안 10분간의 수거기간이 수득된다. 식염수만을 주입한 대조동물에 대해 병행시험한다.

식염수만을 주입한 대조동물과 펩티드 AP 101(3㎍/㎏/분), AP 306(3㎍/㎏/분); AP 324(3㎍/㎏/분) 또는 AP 314(1㎍/㎏/분)을 주입한 개의 뇨 유동속도를 비교함으로써 데이타를 조사한다.

[표 Ⅱ]

표 Ⅱ에 나타난 바와 같이, 펩티드에 대한 생체내 최고 반응치는 천연 ANP 화합물의 효과와 비교할때 기저치(*스튜던트의 시험법에 의해 P＜0.05)보다 실질적으로 높으며, 통계학적으로 유의적으로 증가했다고 볼 수 있다.

전술한 바와 같이 펩티드 AP 101, AP 306, Ap 314 및 AP 324의 이뇨 및 나트륨 이뇨 반응은 수용체 결합 검정에서 예측되는 바와 상호관계가 있다. 충분히 높은 Ki(app)를 갖는 소형 선형 동족체 펩티드인 AP 101, AP 306, AP 314 및 AP 324는 각각 3, 3, 1 또는 3㎍/㎏/분으로 주입했을때 뇨유동속도(뇨량) 및 뇨중 나트륨 분배를 현저히 증가시켰다. 따라서 이들 동족체 펩티드는 각각 이뇨 및 나트륨 이뇨를 유발하므로 이뇨 효력에 있어 수용체 결합분석(표 IA 내지 D)의 예측치를 뒷바침해 준다.

3. 마취시킨 래트에 있어서의 혈압에 대한 반응

본 발명 화합물을 마취시킨 래트에 큰 알약으로 투여하거나, 주입했을때 강화되었다. 표 Ⅲ은 주입법으로 투여한후 동족체 펩티드 AP 20 및 AP 37을 포함하는 본 발명의 대표적 화합물의 혈압에 대한 효과와 rANP(126 내지 150)의 효과를 비교한 것이다.

[표 Ⅲ]

상기 표에서 보는 바와 같이, 동족체 펩티드는 현저하게 혈압을 강하시킨다. 동족체 펩티드 AP 37이 상당히 고용량(rANP(126 내지 150)의 40배)에서도 혈압에 대한 약한 효과를 나타내면서도 혈압을 강화시킨다. 또한 동족체 펩티드 AP 40, AP 41 및 AP 57은 AP 37과 유사한 활성을 나타낸다.

또한, 수용체 결합 친화도를 나타내는 화합물은 생체내에서도 활성인 것으로 보인다. 시험관내 수용체 결합 시험과 생체내 결과간의 상호관계는 시험 화합물의 치료 효능을 나타내는 수용체 결합 검정의 유효성을 더욱 지지해 준다.

따라서 포유동물 숙주에 치료적 유효량의 동족체 펩티드 또는 이들 펩티드를 함유하는 약제학적 조성물을 투여하여 나트륨 이뇨 및 이뇨 및/또는 혈관 구경을 증기시킬 수 있다. 또한 본 발명의 범위내에 포함되는 선별된 동족체 펩티드를 투여하여 병원성이 천연 화합물에 의해 제공되는 전반적인 생물학적 활성을 요하지 않는 다양한 부종 상태 또는 고혈압을 치료할 수 있다.

C. 분리된 조직에 대한 샘물 검정

상술한 바와 같이 본 발명의 동족체 펩티드에 대한 생체내 효과는 결합 및 청정작용을 하는 내인성 ANP와 관련된 수용체의 차단을 통한 내인성 ANP의 효과를 강화시키는 능력에 기인하는 것으로 간주된다. 따라서, 특별히 공급해 주지 않는한 ANP가 존재하지 않는 분리 조직에서 본 발명의 동족체의 이뇨 및 나트륨 이뇨 효과는 감소되거나 소실될 것으로 추측할 수 있다. 이와 같은 예측을 지지해주는 결과가 하기에 제시된다. 본 발명의 대표적 펩티드인 AP 57은 생체내에서 활성이나, 분리관류시킨 래트 신장에 대해서는 비활성으로 나타났다. 그러나 동일 모델에 있어, rANP(123 내지 150)의 효과를 강화시킬 수는 있다.

1. 분리 관류시킨 래트 신장에서의 나트륨 이뇨 및 이뇨

ANP 동족체의 생물학적 작용은 참고 문헌에 기술된 바와 같이 분리 관류시킨 래트의 신장에서 확인할 수 있다[참조; Camargo, M. J. F. et al., Am. J. Physiol., 246 : F 447-F 456(1984)]. 특정 예에서, 10^-7M의 15개의 아미노산 펩티드 R-S-S-C-F-G- G-R-I-D-R-I-G-A-C-NH₂(펩티드 AP 57)의 효과를 비처리 신장에서 확인한다. 결과는 표 Ⅳ에 나타낸 바와 같다.

[표 Ⅳ]

[분리 관류시킨 래트 신장에 있어서 rANP(123-150)의 용량-반응곡선에 대한 AP 57의 효과]

GFR=사구체 여과속도; FF=여과 분획; RVR=신장 혈관 저항성; U_NaV=뇨중 나트륨 분비속도; FE_Na=분별 나트륨 분비; V=뇨 유동속도.

각 시험상에서 제시된 수의 신장에 대한 평균 ±SE로 결과를 표시하였다. rANP(123 내지 150)의 용량 반응곡선에 대한 AP 57의 효과를 확인할때에는 증가량의 rANP(123 내지 150)을 가하기 30분 전에 10^-7M의 AP 57을 가하였다.

동족체 펩티드 AP 57은 비처리 래트에 있어서 나트륨 이뇨 및 이뇨 활성을 나타내지만 분리 관류시킨 래트 신장에 대해서는 10^-7M 농도에서 비활성이었다[표 Ⅳ-표 ⅣA와 ⅣB 비교].

다음에 rANP(123 내지 150)으로 지정된 ANP S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-I-D-R-I-G-A-Q-S-G-S-G-L-C-N-S-F-R-Y에 대한 신장 반응을 조절하는 펩티드 AP 57의 능력을 시험한다.

표 Ⅳ에 나타난 바와 같이 rANP(123 내지 150)은 10^-11내지 10^-7H 농도에서 사구체 여과속도, 신장 혈관 저항성, 여과분획, 뇨중 나트륨 분비속도, 분별 나트륨 분비 물뇨 유동 속도를 용량 의존적으로 증가시킨다. 또한 분리된 신장을 10^-7M AP 57로 예비처리하면 보다 저농도에서 rANP(123 내지 150)에 대한 상기 반응을 유발함을 표 Ⅳ에서 알 수 있다.

동족체 펩티드 AP 57은 시험관내에서는 비활성이나 rANP(123 내지 150)의 효력을 증가시킨다. 따라서 AP 57은 rANP(123 내지 150)의 효력을 증가시킨다. 차후의 검정에서 이와 같은 관찰 결과가 확인된다.

표 Ⅴ는 rANP(123 내지 150) 및 AP 57이 신장 피질에 대한 특히 [¹²⁵I]-rANP(123 내지 150)의 결합을 경쟁하는 것을 나타낸다.

[표 Ⅴ]

[결합/유리[¹²⁵I]-rANP(123 내지 150)의 비]

신장 외피질-관련 수용체 부위는 ANP의 청정 및 제거와 관련될 수 있다. 따라서 AP 57은 분리된 시장 모델에서 rANP(123 내지 150)의 청정을 차단할 수 있으며 이와 같은 사실로써 rANP(123 내지 150)의 효과를 강화하는 작용을 설명할 수 있다.

또한 AP 57이 내인성 ANP의 청정을 차단한다면, 시험관내에서 ANP에 대한 AP 57의 나트륨 이뇨, 이뇨 및 혈관확장 반응을 설명할 수 있다. 따라서 AP 57 및 관련 동족체 펩티드 청정성을 변화시킴으로써 내인성 ANP의 활성을 조절할 수 있다.

그러나 상기와 같은 기작을 밝힐 필요없이, 본 발명은 나트륨 이뇨, 이뇨 및/또는 혈압강하 특성을 갖는 것으로 보여 중요한 치료적 유용성을 가질 수 있는 하기 일반식의 신규한 계열의 동족체 ANP 펩티드 화합물에 관한 것이다.

Z₁-AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂-Z₂

상기식에서, AA₈및 AA₁₁은 각각 독립적으로 염기성/비-사이클릭 또는 중성/비극성/소형 또는 중성/극성/비-사이클릭 아미노산 잔기이고; AA₉및 AA₁₂는 각각 독립적으로 D- 또는 L-광학적 이성체를 포함하는 중성/비극성/대형/비-사이클릭 아미노산 잔기이며; AA₁₀은 산성 아미노산 잔기이고; Z₁및 Z₂는 상술한 바와 같다.

전술한 바에서 이해를 돕고 명확히 밝히기 위해 본 발명을 상세히 기술하였으나, 본 분야의 숙련가들은 본 발명의 특허청구범위 영역내에서 변형이 가능할 것이다.

Claims (28)

1. 포유동물에서, 나트륨 이뇨, 이뇨 또는 혈관확장 활성을 갖는 하기 일반식의 펩티드 화합물.

   Z₁-AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂-Z₂

   상기식에서, AA₈및 AA₁₁은 각각 독립적으로 염기성/비-사이클릭 또는 중성/비극성/소형(small) 또는 중성/극성/비-사이클릭 아미노산 잔기이고; AA₉및 AA₁₂는 각각 독립적으로 D- 또는 L-배위의 중성/비극성/비-사이클릭 아미노산 잔기이고; AA₁₀은 산성 아미노산 잔기이고;

   1) Z₁은 식 Y₁-Y₂[여기서, Y₁은 카복시-말단 잔기로서 소수성 아미노산 잔기를 갖는 1 내지 125개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 또는 이의 desNH₂형태이거나 식

   

   -(여기서, R₁은 아미도, 티오 또는 옥시로서 질소, 산소 또는 황원자의 치환체를 갖는 그룹을 포함하는, C₆내지 C₂₀의 소수성 지방족, 방향족 또는 혼합된 지방족/방향족 유기 그룹이다)의 소수성 치환체 그룹이고, Y₂는 아미노산 또는 디펩티드 그룹이거나 식

   

   - (여기서, n은 3 내지 6이다)의 화합물을 포함하는 스페이서(spacer) 그룹이다]이고, Z₂는 NH₂, NHR' 또는 NR'R" (여기서, R' 또는 R"는 각각 독립적으로 C₁내지 C₆의 직쇄 또는 측쇄 알킬그룹이다)이거나 1 내지 20개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 잔기 또는 이의 아미드 또는 알킬 아미드이거나;

   2) Z₁및 Z₂가 함께 브릿지를 형성하며, Z₁은 식 X₁-AA₄-X₂이고, Z₂는 식 X₃-AA₂₀-X₄이며, 여기서, X₁은 0 내지 125개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 또는 이의 desNH₂형태이고, X₂는 결합, 아미노산 또는 10개 이하의 잔기로 이루어진 올리고펩티드이고, X₃는 결합, 아미노산 또는 10개 이하의 잔기로 이루어진 올리고 펩티드이고, X₄는 결합 또는 아미노산이거나, 카복시-말단 아미드 또는 알킬아미드 형태를 포함하며, 20개 이하의 잔기로 이루어진 올리고펩티드이고, AA₄및 AA₂₀은 함께 디설파이드 결합, 메틸렌 결합 및 설파이드/메틸렌 결합으로 이루어진 그룹중에서 선택된 브릿지 결합을 형성하는 아미노산이며, 단, X₂가 트리펩티드인 경우 X₃는 헵타펩티드가 아니며, X₂가 트리펩티드 미만인 경우 X₃는 펜타펩티드 이상이고, X₁이 [D-S]-S 또는 S-S이고 X₃가 아미노-말단에 G-A-Q-S 또는 A-Q-S를 갖는 올리고 펩티드인 경우 X₄는 아미노-말단에 N-S를 갖는 6개 미만의 아미노산 잔기로 이루어진 올리고 펩티드가 될 수 없다.
2. 제1항에 있어서, AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂가 R(I/M)DRI이고, 이중의 최대 하나의 잔기가, 즉, AA₈또는 AA₁₁의 경우 R이 A, Q, N 또는 K로 치환되거나, AA₉의 경우(I/M)이 V, L, [D-V] 또는 [D-L]로 치환되거나, AA₁₂의 경우 I가 M, V, L, [D-M], [D-V] 또는 [D-L]로 치환되거나, AA₁₀의 경우 D가 E로 치환되어 대체된 화합물.
3. 제2항에 있어서, AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂가 A(I/M)DRI, K(I/M)DRI, Q(I/M)DRI, RVDRI, RLDRI, R[D-I]DRI, R(C-M)DRI, R(I/M)ERI, R(I/M)DQI, R(I/M)DKI, R(I/M)DRM, R(I/M)DRV, R(I/M)DRL, R(I/M)DR[D-I] 및 R(I/M)DR[D-M]로 이루어진 그룹중에서 선택된 화합물.
4. 제1항에 있어서, Z₁이 식 X₁-AA₄-X₂(여기서, X₁은 0 내지 125개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 또는 이의 desNH₂형태이고, X₂는 결합, 아미노산 또는 10개 이하의 잔기로 이루어진 올리고펩티드이다)인 화합물.
5. 제4항에 있어서, X₁이 0 내지 6개의 아미노산잔기로 이루어진 AA_-3-AA_-2-AA_-1-AA₁-AA₂-AA₃(여기서, AA_-3및 AA₂는 중성/극성/소형 또는 중성/비극성/소형 아미노산 잔기이고, AA₃는 중성/극성/소형, 중성/극성/사이클릭 또는 중성/비극성/소형 아미노산 잔기이고, AA_-2는 중성/비극성/비-사이클릭 아미노산 잔기이고, AA_-1및 AA₁은 염기성/비-사이클릭 아미노산 잔기이다)형태의 펩티드 또는 이의 절단형태인 화합물.
6. 제5항에 있어서, X₁이 S-L-R-R-S-S, L-R-R-S-S, R-R-S-S, R-S-S, S-S, S, R, Y 및 desX₁으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물.
7. 제4항에 있어서, X₂가 결합 또는 아미노산이거나, G, F, [D-F], A, [D-A], S, [D-S], L, [D-L], V, [D-V], (desNH₂-F), Sar 및 Aib로 이루어진 그룹중에서 선택된 3개 이하의 잔기로 이루어진 올리고펩티드인 화합물.
8. 제7항에 있어서, X₂가 F-G-G, (desNH₂-F)-G-G, [D-F]-G-G, F-G-A, F-A-G, F-[D-A]-G, F-[D-S]-G, F-L-G, F-[D-L]-G, F-V-G, F-[D-V]-G, [D-F]-G-G, [D-A]-G-G, F-G-[D-A], F-G-S, F-Aib-G, A-G-G, S-G-G, F-G, G-G, [D-A]-G, [D-S]-G, G-[D-A], G-[Aib], G-[Sar], G-G, F-G, A-G, S-G, G 및 desX₂로 이루어진 그룹중에서 선택된 화합물.
9. 제4항에 있어서, Z₂가 식 X₃-AA₂₀-X₄(여기서, X₃는 결합, 아미노산 또는 7개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 올리고펩티드이고, X₄는 아미노산이거나, 카복시-말단 아미드 또는 알킬아미드 형태를 포함하여, 5개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 올리고펩티드이다)인 화합물.
10. 제9항에 있어서, X₃가 AA₁₃-AA₁₄-AA₁₅-AA₁₆-AA₁₇-AA₁₈-AA₁₉(여기서, AA₁₃, AA₁₆, AA₁₇및 AA₁₉는 중성/극성/소형 아미노산 잔기이고, AA₁₄는 중성/비극성/소형 아미노산 잔기이고, AA₁₅는 중성/극성/대형/비-사이클릭 아미노산 잔기이고, AA₁₈은 중성/비극성/대형/비-사이클릭 아미노산 잔기이다)의 형태이거나 이의 절단형태인 화합물.
11. 제10항에 있어서, 아미노산 잔기가 G, A, Q, S 및 L로 이루어진 그룹중에서 선택된 화합물.
12. 제11항에 있어서, X₃가 G-A-Q-S-G-L-G, G-A-Q-S-G-L, A-Q-S-G-L-G, G-A-Q-S-G, Q-S-G-L-G, G-A-Q-S, S-G-L-G, G-A-Q, G-A-A, G-L-G, L-G, G-A, G 및 desX₃로 이루어진 그룹중에서 선택된 화합물.
13. 제9항에 있어서, X₄가 아미노산이거나 카복시-말단 아미드 또는 알킬아미드 형태를 포함하여, 5개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 올리고펩티드인데, 여기서 아미노산은 N, S, F, R 및 Y중에서 선택되는 화합물.
14. 제13항에 있어서, X₄가 N-S-F-R-Y, N-S-F-R, N-S-F, N-S, N 및 desX₄및, 이의 아미드 또는 알킬아미드로 이루어진 그룹중에서 선택된 화합물.
15. 제1항에 있어서, Z₁이 식 Y₁-Y₂(여기서, Y₁은 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 또는 이의 desNH₂형태이고, C-말단 아미노산을 중성/비극성/사이클릭 아미노산 잔기이거나 이의 desNH₂형태인 화합물.
16. 제15항에 있어서, Y₁이 AA₃-AA₄-AA₅(여기서, AA₃및 AA₄는 각각 중성/극성 아미노산 및 중성/비극성/소형아미노산이다) 또는 이의 절단형태인 화합물.
17. 제16항에 있어서, Y₁이 YAF, RCF, SCF, AF, CF, F 및 desNH₂-F로 이루어진 그룹중에서 선택된 화합물.
18. 제15항에 있어서, Y₁이 일반식

    

    - (여기서, R₁은 C₆내지 C₂₀의 소수성 지방족, 방향족 또는 혼합된 지방족/방향족 유기 그룹이다)의 소수성 치환 그룹인 화합물.
19. 제18항에 있어서, Y₁이 플루오레닐메틸옥시카보닐, 벤질옥시카보닐, 디페닐프로피오닐, 트리페닐프로피오닐, 3-인돌프로피오닐, 4-인돌부티릴, 1-아다만틸아세틸, 1-타프틸아세틸, 2-나프틸아세틸, 1-나프톡시아세틸 및 2-나프톡시아세틸 치환그룹중에서 선택된 화합물.
20. 제15항에 있어서, Y₂가 아미노산 또는 디펩티드인 스페이서 그룹인 화합물.
21. 제20항에 있어서, Y₂가 AA₆-AA₇형태 (여기서, AA₆및 AA₇은 동일하거나 상이하며 중성/극성/소형 아미노산 잔기이다) 또는 이의 절단형태인 화합물.
22. 제21항에 있어서, AA₆가 G 또는 desAA₆이고, AA₇이 G인 화합물.
23. 제15항에 있어서, Y₂가 식

    

    - (여기서, n은 3 내지 6이다)의 스페이서 그룹인 화합물.
24. 제1항에 있어서, Z₂가 -NH₂또는 -NHR'이며, 여기서, R'는, 아미도, 티오 또는 옥시로서 3개 이하의 질소, 산소 또는 황 원자의 치환체를 갖는 그룹을 포함한 C₁내지 C₁₀의 직쇄 또는 측쇄 알킬, (치환되거나 비치환된) 벤질 그룹, 하이드라지드와 같은 질소 함유 잔기 및 염기성 또는 중성 디펩티드로 이루어진 그룹중에서 선택된 유기그룹인 화합물.
25. 제24항에 있어서, Z₂가 -NH₂, -NHCH₃, -N(CH₃)₂및 -NHCH₂CH₃로 이루어진 그룹중에서 선택된 화합물.
26. 제1항에 있어서, 하기 그룹중에서 선택된 화합물.

    

    

    

    

    

    

    

    

    

    

    

    

    

    

    

    

    
27. 치료적 유효량의 제1항에서 청구된 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는 나트륨 이뇨, 이뇨 또는 혈관확장제로 유용한 조성물.
28. a. 제1항에 있어서 정의된 아미노산 서열을 함유하며 반응혼합물 중에서 고형 수지 담체에 결합된, 보호된 펩티드를 제조하고, b. 제조된 펩티드로부터 고형 수지 담체를 제거하여 펩티드를 탈보호시키고, c. 생성된 펩티드를 임의로 산화시켜 동정된 시스테인 잔기간에 디설파이드 결합을 형성시키고, d. 제1항에서 정의된 목적하는 유지 치환 그룹을 부가시켜 펩티드를 임의로 변형시킨 다음, e. 반응혼합물로부터 펩티드를 분리시키고, 임의로, 폴리펩티드를 이의 산부가염으로 전환시킴을 특징으로하여, 포유동물에서 나트륨 이뇨, 이뇨 또는 혈관확장 활성을 갖는 제1항에서 청구된 일반식의 펩티드 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법.

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