CN101505784B

CN101505784B - 环状利尿钠肽构建体

Info

Publication number: CN101505784B
Application number: CN200780019541.7A
Authority: CN
Inventors: S·D·沙拉马; M·巴斯托斯; 杨炜; 蔡慧芝
Original assignee: Palatin Technologies Inc
Current assignee: Palatin Technologies Inc
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2027-03-30
Also published as: ZA200809190B; CN101505784A

Abstract

本发明涉及具有氨基端和羧基端的环状构建体，其与利尿钠肽受体结合，并且包括多个氨基酸残基、至少一个式I的氨基酸替代物(其中R、R′、Q、Y、W、Z、J、x及n如本说明书中所定义)、和任选至少一个辅基；包括所述环状构建体的药物组合物；以及治疗充血性心力衰竭或需要产生抗高血压、心血管、肾脏或内分泌作用的其它状况、综合征或疾病的方法。

Description

环状利尿钠肽构建体

相关申请的交叉引用

本申请要求2006年3月30日提交的名为“环状利尿钠肽构建体”的美国临时专利申请系列号60/743,960以及2006年3月30日提交的名为“具有辅基的环状利尿钠肽构建体”的美国临时专利申请系列号60/743,961的提交内容的优先权和权益，并且所述各篇专利文献的说明书及权利要求书通过引用的方式并入本文中。

名为“用于肽构建体的氨基酸替代物”的相关申请在此与代理人案号0307-043-PCT的国际专利申请PCT/US07/65632一起同时提交，并且其说明书和权利要求书通过引用的方式并入本文中。

发明背景

发明领域(技术领域)：

本发明涉及环状利尿钠肽构建体，其包含多个氨基酸残基、一个或多个环约束性氨基酸替代物和任选一个或多个辅基，所述构建体结合利尿钠肽受体并且可以用于治疗目的。

背景技术：

自1984年鉴定人心房钠尿肽(ANP)序列和基因结构以来，已深入研究了利尿钠肽系统。ANP有时候也称作“ANF”或心钠素。ANP是利尿钠肽系统的部分，它包括在人类中因翻译后加工上的差异而产生ANP和尿舒张肽的ANP基因、产生BNP或脑钠肽的基因以及产生CNP或c-型利尿钠肽的基因。ANP、尿舒张肽、BNP和CNP分别是环结构，具有由半胱氨酸-半胱氨酸二硫键形成的一个17氨基酸环。人ANP(hANP)的氨基酸序列及结构在图1中显示。ANP、尿舒张肽、BNP和CNP是密切相关的，因所述环中某5个或6个氨基酸不同，尽管氨基端尾和羧基端尾基本上是不同的。

ANP、BNP和CNP分别针对不同的受体利尿钠肽受体A、B和C(NPRA、NPRB和NPRC)具有特异性。NPRA和NPRB与鸟苷酸环化酶连接，而NPRC是G蛋白偶联的清除受体。ANP、BNP和CNP是迄今鉴定的主要内源性哺乳动物利尿钠肽。然而，存在已经鉴定并可以在哺乳动物中具有治疗性用途的众多非哺乳动物利尿钠肽。这些非哺乳动物利尿钠肽包括鲑利尿钠肽或心脏肽(sCP)、心室利尿钠肽(VNP)(在鳗鱼和多种鱼中鉴定到的一种心利尿钠肽)、树眼镜蛇利尿钠肽(DNP)(在树眼镜蛇蛇毒中鉴定到的一种利尿钠肽)和三种从太攀蛇蛇毒中分离的利尿钠样肽(TNP-a、TNP-b和TNP-c)。通常参见：Tervonen V，Ruskoaho H，Lecklin T，Ilves M，Vuolteenaho O.Salmon cardiac natriuretic peptide is a volume-regulating hormone.Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.283：E353-61(2002)；Takei Y，Fukuzawa A，ltaharaY，Watanabe TX，Yoshizawa Kumagaye K，Nakajima K，Yasuda A，Smith MP，Duff DW，Olson KR.A new natriuretic peptide isolated from cardiac atria oftrout，Oncorhynchus mykiss.FEBS Lett.414：377-80(1997)；Schweitz H，VigneP，Moinier D，Frelin C，Lazdunski M.A new member of the natriuretic peptidefamily is present in the venom of the green mamba(Dendroaspis angusticeps).J.Biol.Chem.267：13928-32(1992)；Lisy O，Jougasaki M，Heublein DM，SchirgerJA，Chen HH，Wennberg PW，Burnett JC.Renal actions of syntheticdendroaspis natriuretic peptide.Kidney Int.56：502-8(1999)和Fry BG，Wickramaratana JC，Lemme S，Beuve A，Garbers D，Hodgson WC，Alewood P.Novel natriuretic peptides from the venom of the inland(Oxyuranusmicrolepidotus)：isolation，chemical和biological characterization.Biochem.Biophys.Res.Comm.327：1011-1015(2005)。

ANP主要在应答于增加的心房压时内源性地分泌，但是其它因素(包括细胞因子受体刺激)可以促进内源性分泌。一旦释放，则ANP是血压、钠和流体稳态的激素性调节物，提供血管舒张效应，影响心血管重塑等。因此，ANP(包括内源性ANP)有效用于充血性心力衰竭和其它心血管病中，其部分原因在于提供针对慢性活化的肾素-血管紧张素-醛固酮系统的防御。循环性ANP通过两种机制，即与利尿钠肽受体结合和酶降解，而从循环中迅速地除去。

人ANP也称作野生型人ANP、hANP、ANP(1-28)和ANP(99-126)(后者指前ANP(1-126)中的相关序列，其中所述的前ANP通常在分泌期间在羧基端区域内在Arg⁹⁸-Ser⁹⁹处被切割)。下文中，人ANP有时候称作“hANP”。

通常，认为利尿钠肽及其变体用于治疗充血性心力衰竭、肾性高血压、急性肾衰竭及相关状况以及对其而言利尿反应、促钠尿排泄反应和/或血管扩张反应将具有治疗或预防效果的任何状况、疾病或综合征中。一篇描述利尿钠肽(包括ANP)及利尿钠肽系统在心力衰竭中用途的综述是SchmittM.，Cockcroft J.R.和Frenneaux M.P.Modulation of the natriuretic peptidesystem in heart failure：from bench to bedside？Clinical Science105：141-160(2003)。

已经产生为数众多的ANP模拟物和变体，其中的一些模拟物和变体在尺寸上比ANP大幅度缩小。一种尺寸上缩小但仍有生物学活性的ANP形式是如Li B，Tom JY，Oare D，Yen R，Fairbrother WJ，Wells JA，CunninghamBC.Minimization of a polypeptide hormone。Science 270：1657-60(1995)中所述的15聚二硫化环状肽H-Met-环(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH₂(SEQ ID NO：1)。这种15聚肽常称作“mini-ANP”。

众多专利和专利申请提交了利尿钠肽的不同合成性模拟物，声称基于一种或多种因素而优于野生型利尿钠肽。这些模拟物包括在下列美国专利：4,496,544；4,609,725；4,656,158；4,673,732；4,716,147；4,757,048；4,764,504；4,804,650；4,816,443；4,824,937；4,861,755；4,904,763；4,935,492；4,952,561；5,047,397；5,057,495；5,057,603；5,091,366；5,095,004；5,106,834；5,114,923；5,159,061；5,204,328；5,212,286；5,352,587；5,376,635；5,418,219；5,665,704；5,846,932；5,583,108；5,965,533；6,028,055；6,083,982；6,124,430；6,150,402；6,407,211；6,525,022；6,586,396和6,818,619中和在下列美国专利申请公开：2004/0002458；2004/0063630；2004/0077537；2005/0113286；2005/0176641；2006/0030004中公开的构建体。此外，多个非美国专利和专利申请公开了构建体，它们包括：WO 85/04870；WO 85/04872；WO 88/03537；WO88/06596；WO 89/10935；WO 89/05654；WO 90/01940；WO 90/14362；WO 92/06998；WO 95/13296；WO 99/08510；WO 99/12576；WO 01/016295；WO 2004/047871；WO 2005/072055；EPO 0 291 999；EPO 0 323 740；EPO0 341 603；EPO 0 350 318；EPO 0 356 124；EPO 0 385 476；EPO 0 497 368；和EPO 0 542 863。如在公开树眼镜蛇属(dendroaspis)嵌合肽的美国专利5,583,108或在美国专利6,407,211和6,818,619中描述了嵌合型利尿钠肽，如称作“血管利尿钠肽”并描述为ANP与CNP的嵌合体的肽。每篇前述专利和专利申请的教导如完整描述那样通过引用的方式并入。

有一种利尿钠肽产品由美国食品药品管理局(Food and DrugAdministration)批准以类属名称nestiritide和商品名Natrecor

(Scios Inc.)出售。这是使用重组DNA技术从大肠杆菌中制造的人B-型利尿钠肽。该产品经批准仅用于静脉内输注以治疗在休息和最小活动情况下发生呼吸困难的急性代偿失调性充血性心力衰竭患者。尽管有效，然而nestiritide的药物代谢动力学和半寿期为如此情况，以至于该产品仅可以通过静脉内输注而使用，这使该药物的使用限于医院或有经验的医疗中心环境。

尽管已经开发的化合物为数众多，然而几乎没有一种得到商业化或处于积极临床开发阶段。对如此产物存在巨大需求，其具有改善特征，包括改善的效力、半寿期、施用模式、生物利用度和延长的作用持续时间，该产物有效用于一种或多种治疗适应症并且优选地可以基于门诊患者而施用。

发明简述

在一个方面，本发明提供一种环状构建体，其与利尿钠肽的受体结合，所述受体包括但不限于针对ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-b或TNP-c的受体，其中所述构建体包括多个氨基酸残基、至少一个通式I的氨基酸替代物：

其中R和R′各自独立地是H或天然或非天然的氨基酸侧链部分或氨基酸侧链部分的衍生物；x是1或2；Y是CH₂或C＝O；W是CH₂、NH或NR＂′；Z是H或CH₃；n是0、1或2；J是-C(＝O)-，除非该替代物位于构建体的羧基端位置，否则在此情况下J是-H、-OH、-C(＝O)-OH、-C(＝O)-NH₂或羧基端封端基团；Q是一个键，除非替代物位于构建体的氨基端位置处，否则在此情况下Q是-H或胺封端基团；R＂′是酰基、C₁-C₁₇直链或支链的烷基链、C₂-C₁₉直链或支链的烷基酰基链、C₁-C₁₇直链或支链的Ω氨基脂族酰基或C₁-C₁₇直链或支链的Ω氨基脂族酰基；任选地包括至少一个辅基，其与至少一个氨基酸残基的侧链内的反应基共价连接、当替代物位于构建体的氨基端位置处时与胺封端基团共价连接、或者当替代物位于构建体的羧基端位置处时与羧基端封端基团共价连接；并且用星号标记的碳原子可以具有任何立体化学构型。该构建体是环状构建体，通过两个氨基酸残基的侧链之间、氨基酸残基侧链与氨基酸替代物的R或R′基团之间、两个氨基酸替代物的R或R′基团之间、构建体的端基与氨基酸残基侧链之间或构建体的端基与氨基酸替代物的R或R’基团之间的键而环化。优选地，在其侧链之间形成键的两个氨基酸残基由约8个-10个氨基酸残基并且任选地由零个、一个或两个氨基酸替代物分隔。多个氨基酸残基可以包括选自天然或非天然的α-氨基酸、β-氨基酸、α，α-双取代氨基酸和N-取代氨基酸中的任何氨基酸残基，包括任何前述基团的全部(R)或(S)构型。

辅基可以包括包含重复单元的聚合物基团，其中所述的重复单元包括一个或多个碳原子和氢原子和任选地其它原子，包括氧。此类聚合物基团优选地是水溶性聚合物，并且优选地是聚醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉或聚(丙烯酰吗啉)。优选的聚醚是聚乙二醇(PEG)，任选地以连接基团衍生化。

在一个方面，J是选自下列基团的羧基端封端基团：

-(CH₂)_m-OH、

-C(＝O)-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂)、

-C(＝O)-O-(CH₂)_m-CH₃、

-O-(CH₂)_m-CH₃、

-O-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂)、

-O-(CH₂)_m-OH、

-C(＝O)-NH-(CH₂)_m-S(v₁)、

-C(＝O)-NH-(CH₂)_m-CH₃、

-C(＝O)-NH-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂)、

-C(＝O)-NH-((CH₂)_m-N(v₁)(v₂))₂、

-C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-OH)-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂)、

C(＝O)-NH-(CH₂)_m-NH-C(＝O)-CH(N(v₁)(v₂))((CH₂)_m-N(v₁)(v₂))或

-C(＝O)-NH-CH((-C(＝O)-N(v₁)(v₂))-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂)，

包括所有前述基团的(R)或(S)构型，其中v₁和v₂各自独立地是H或C₁-C₁₇直链或支链的烷基链并且m在每种情况下独立地是0-17。

在其中氨基酸替代物位于构建体的羧基端位置处的另一个方面，J是由Ω氨基脂族基、末端芳基或芳烷基或任何的单个天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸、α，α-双取代氨基酸或N-取代氨基酸构成的羧基端封端基团，其包括其中取代基不同的α，α-双取代氨基酸的全部(R)或(S)构型，任选地与如上所定义的羧基端封端基团组合。

在另一方面，Q是选自下列的胺封端基团：

-(CH₂)_m-N(v₃)(v₄)、

-(CH₂)_m-CH₃、

-(CH₂)_m-O(v₃)、

-(CH₂)_m-C(＝O)-(v₃)、

-(CH₂)_m-C(＝O)-O-(v₃)、

-(CH₂)_m-S(v₃)、

-C(＝O)-(CH₂)_m-CH₃、

-C(＝O)-(CH₂)_m-N(v₃)(v₄)、

-C(＝O)-(CH₂)_m-C(＝O)-(v₃)、

-C(＝O)-(CH₂)_m-O(v₃)或

-C(＝O)-(CH₂)_m-S(v₃)；

其中v₃和v₄各自独立地是H、C₁-C₁₇直链或支链的烷基链或C₂-C₁₉直链或支链的烷基酰基链，前提是若v₃或v₄之一是烷基酰基链，则v₃或v₄的另一个是H，并且m是0-17。

在相关的方面，式I的氨基酸替代物位于构建体的羧基端位置处，并且R和R′中的至少一个是天然或非天然氨基酸的侧链部分、或带有包含至少一个氮原子的杂原子基团的氨基酸侧链部分的衍生物，并且R和R′中的另一个是H或者天然或非天然氨基酸的侧链部分或氨基酸侧链部分的衍生物。

在相关的实施方案中，本发明提供一种构建体，其与利尿钠肽的受体结合，所述受体包括但不限于针对ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-b或TNP-c的受体，其中所述构建体包括多个氨基酸残基、位于除羧基端位置或氨基端位置之外的任何位置并通过两个肽键而共价连接的至少一种氨基酸替代物，并且所述氨基酸替代物具有式II：

其中R和R′各自独立地是H、或者天然或非天然氨基酸侧链部分、或者氨基酸侧链部分的衍生物；x是1或2；Y是CH₂或C＝O；W是CH₂、NH或NR＂′；Z是H或CH₃；R＂′是酰基、C₁-C₁₇直链或支链的烷基链、C₂-C₁₉直链或支链的烷基酰基链、C₁-C₁₇直链或支链的Ω氨基脂族基团或者C₁-C₁₇直链或支链的Ω氨基脂族酰基；n是0、1或2；用星号标记的碳原子可以具有任何的立体化学构型；并且虚线表示形成肽键的键。

其中式I的替代物位于构建体的羧基端处时，该替代物通过单一肽键与该构建体的羧基端共价地连接，从而该替代物具有下式：

其中虚线表示形成肽键的键。其中替代物位于构建体的氨基端处时，替代物优选地具有式I，并且通过单一肽键而与该构建体的氨基端共价连接，从而该替代物具有下式：

其中虚线表示形成肽键的键。然而，其中替代物处于除构建体的氨基端或羧基端之外的其它位置时，替代物优选地具有式II并且通过两个肽键而与该构建体共价地连接。

在本发明的不同实施方案中，可以在本发明的构建体中使用一个氨基酸替代物，可以在本发明的构建体中使用两个氨基酸替代物或可以在本发明的构建体中使用多于两个氨基酸替代物。

在另一个优选实施方案中，本发明提供其中以非肽键取代氨基酸残基间一个或多个肽键的构建体。

本发明的主要目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体。

本发明的另一个目的是提供其中一个或多个氨基酸残基由环约束性氨基酸替代物取代的利尿钠肽受体特异性构建体。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中该构建体在施用至哺乳动物时表现出相对于不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列的一个或多个优势，其中所述的优势选自增加的抗酶降解性、增加的循环半寿期、增加的生物利用度、增加的效力、延长的作用持续时间及其前述的组合。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中构建体具有如相同浓度的不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列的至少10％最大cGMP刺激活性。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中构建体具有如相同浓度的不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列的至少50％最大cGMP刺激活性。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中构建体具有如相同浓度的不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列的至少100％最大cGMP刺激活性。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中构建体具有如相同浓度的不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列的大于100％的最大cGMP刺激活性。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中构建体具有由Ki(nM)值确定的平衡受体结合亲和力，其比不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列的Ki(nM)值高出不大于两个对数数量级。

本发明的另一个目的是利尿钠肽受体特异性构建体，其中构建体具有由Ki(nM)值确定的平衡受体结合亲和力，其比不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列的Ki(nM)值高出不大于3倍。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中构建体具有由Ki(nM)值确定的平衡受体结合亲和力，其与不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列的Ki(nM)值相等或较之更小。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中构建体具有由Ki(nM)值确定的平衡受体结合亲和力，其小于不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列的Ki(nM)值。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中构建体具有针对利尿钠肽受体的受体结合亲和力，其大于不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列的受体结合亲和力。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中构建体具有由随时间的血压降低或尿排出量增加所确定的生物学效力，该构建体至少如同等剂量的不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列那样有效或较之更有效。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中构建体具有由随时间的血压降低或尿排出量增加所确定的生物学效力，该构建体比同等剂量的不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列更有效。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列与利尿钠肽的序列具有至少约60％的同源性。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列与利尿钠肽的序列具有至少约80％的同源性。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列与肽的序列具有至少约60％的同源性，其中所述的肽与ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-b或TNP-c的受体结合。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列与肽的序列具有至少约80％的同源性，其中所述的肽与ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-b或TNP-c的受体结合。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列与序列H-Met-环(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH₂(SEQIDNO：1)具有至少约60％的同源性。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列与序列H-Met-环(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH₂(SEQIDNO：1)具有至少约80％的同源性。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列与序列H-Met-环(Xaa-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Xaa)-Tyr-Arg-NH₂(SEQ IDNO：2)具有至少约60％的同源性，其中Xaa各自独立地是共同形成环状肽的任何氨基酸残基。

本发明的另一个目的是提供利尿钠肽受体特异性构建体，其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列与序列H-Met-环(Xaa-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Xaa)-Tyr-Arg-NH₂(SEQ IDNO：2)具有至少约80％的同源性，其中Xaa各自独立地是共同形成环状肽的任何氨基酸残基。

本发明的另一个目的是提供包括如本文中所定义替代物的利尿钠肽受体特异性构建体，其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列是与ANP的受体结合的肽。

本发明的另一个目的是提供包括如本文中所定义替代物的利尿钠肽受体特异性构建体，其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列是与BNP的受体结合的肽。

本发明的另一个目的是提供比ANP或BNP的天然形式或重组形式具有更大生物利用度和半寿期的利尿钠肽受体特异性构建体。

本发明的另一个目的是提供可以施用至充血性心力衰竭患者的利尿钠肽受体特异性构建体。

本发明的另一个目的是提供可以通过除静脉内施用之外的至少一种施用途径而施用的利尿钠肽受体特异性构建体。

本发明的另一个目的是提供可以通过皮下注射或肌内注射施用至患者的利尿钠肽受体特异性构建体。

本发明的另一个目的是提供具有增加的抗降解性不过对其受体具有显著高的结合亲和力的利尿钠肽受体特异性构建体。

本发明的另一个目的是提供在持续释放制剂中的利尿钠肽受体特异性构建体。

本发明的其它目的、优势和新特性和可用性的其它范围将部分地在以下详细叙述中结合附图进行描述，并且部分地在检验下文时对于本领域的技术人员而言变得显而易见，或可以通过实施本发明而习得。本发明的目的和优势可以通过所附权利要求书中具体指出的手段和组合而实现和达到。

附图若干方面的简述

以下附图说明了本发明的一个或多个实施方案，连同说明书一起，起到解释本发明原理的作用。附图仅用于说明了本发明的一个或多个实施方案并且不视为限制本发明。在图中；

图1是野生型内源性人ANP(hANP)的序列；

图2是构建体1-18以5mg/kg通过皮下方式或以2mg/kg通过静脉内方式施用时在大鼠内随时间的浓度曲线图；

图3是一组4只大鼠在通过静脉内途径施用构建体1-18和1-63时经三十分钟的总尿排出量曲线图；和

图4是一组4只大鼠在通过皮下途径以不同剂量施用构建体1-18时经四十五分钟的总尿排出量曲线图。

发明详述

本发明提供由多个氨基酸残基、至少一种环约束性氨基酸替代物和任选至少一种辅基组成的利尿钠肽受体特异性构建体。本发明中所用的环约束性氨基酸替代物优选地是这样的，以至于它们可以用常规的氨基受保护的氨基端(使用保护基团(如Fmoc))和活性羧基的羧基端产生，并且可以因此用于常规的肽合成方法学中，理解的是若氨基酸替代物位于构建体的羧基端位置处，则除羧基端之外的位置可以在此种替代物中上使用。因此，在优选的实施方案中，本发明提供合成产生的构建体，其使用根据需要加以改进的肽合成方法学合成，并且包含多个氨基酸残基和至少一个环约束性氨基酸替代物。在相关的优选实施方案中，该构建体还包括至少一个辅基。

优选的辅基包括包含重复单元的聚合物基团，其中所述的重复单元包括一个或多个碳原子和氢原子，以及任选地其它原子，包括氧。此类聚合物基团优选地是水溶性聚合物，并且优选地是聚醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉或聚(丙烯酰吗啉)。优选的聚醚是聚乙二醇(PEG)，任选地以连接基团衍生化。

在一个方面，本发明提供这样的构建体，其具有作为已知利尿钠肽如ANP或BNP的同系物或作为利尿钠肽的任何已知肽变体的同系物的氨基酸序列，其中该构建体包括式I或II的至少一个氨基酸替代物。不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列可以与已知利尿钠肽或已知肽变体相同或可以与之同源，如至少60％同源或更优选地至少约80％同源的对应氨基酸序列。如本文中所用，短语“不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列”意指这样的氨基酸序列，其包括与利尿钠肽的受体结合并且不包括替代物的已知氨基酸序列。若氨基酸序列除一个或多个氨基酸替代物的置换或添加之外是相同的，则这种已知氨基酸序列与所述构建体相同。类似地，除一个或多个氨基酸替代物的置换或添加之外，参考这种已知的氨基酸序列与该构建体的同一性而确定同源性。

在另一方面，本发明提供基于已知肽而建模的构建体，其中所述的已知肽与利尿钠肽受体结合，但包括一个或多个氨基酸替代物，此类替代物取代了已知肽中含有的一个或多个氨基酸残基，或添加至包含已知肽的序列。已知肽可以是本领域已知的任何利尿钠肽，包括但不限于在本文中援引的任何出版物、专利、申请或参考文献中公开的那些利尿钠肽，包括但不限于在美国专利4,496,544；4,609,725；4,656,158；4,673,732；4,716,147；4,757,048；4,764,504；4,804,650；4,816,443；4,824,937；4,861,755；4,904,763；4,935,492；4,952,561；5,047,397；5,057,495；5,057,603；5,091,366；5,095,004；5,106,834；5,114,923；5,159,061；5,204,328；5,212,286；5,352,587；5,376,635；5,418,219；5,665,704；5,846,932；5,583,108；5,965,533；6,028,055；6,083,982；6,124,430；6,150,402；6,407,211；6,525,022；6,586,396或6,818,619；在美国专利申请公开2004/0002458；2004/0063630；2004/0077537；2005/0113286；2005/0176641；或2006/0030004；或在多种非美国专利和专利申请，包括WO 85/04870；WO 85/04872；WO 88/03537；WO 88/06596；WO 89/10935；WO 89/05654；WO 90/01940；WO 90/14362；WO 92/06998；WO 95/13296；WO 99/08510；WO 99/12576；WO 01/016295；WO 2004/047871；WO2005/072055；EPO 0 291 999；EPO 0 323 740；EPO 0 341 603；EPO 0 350318；EPO 0 356 124；EPO 0 385 476；EPO 0 497 368；或EPO 0 542 863中公开的利尿钠肽。在一个方面，已知肽是在美国专利4,656,158、4,824,937、4,935,492、5,159,061、5,204,328、5,376,635、5,665,704、5,846,932、6,028,055、6,407,211、6,525,022、6,586,396或6,818,619，美国专利申请公开2004/0002458、2004/0063630或2005/0176641或国际专利申请公开WO2004/047871或WO 2005/072055中公开的肽或其同系物。每篇前述专利和专利申请的教导通过引用的方式而如同完整所述那样并入。

在一个特别优选的实施方案中，本发明提供构建体，包含与利尿钠肽受体结合的氨基酸序列，其中与利尿钠肽受体结合的这种氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基用式I的氨基酸替代物置换。在一个方面，与利尿钠肽受体结合的氨基酸序列在置换之前是H-Met-环(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH₂(SEQ IDNO：1)。

在又一个方面，本发明提供与利尿钠肽受体(包括ANP或BNP的受体)结合并且包括至少一个式I或II的氨基酸替代物的构建体，但是该构建体同结合利尿钠肽受体的任何已知肽不同源。

在一个实施方案中，本发明提供式III的环状构建体：

其中

Aaa¹是α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体或从α-氨基酸衍生的α，α-双取代氨基酸，包括其中Aaa¹是包括Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Arg、Phe、Lys、Tyr、Asp、Nva、Met、Met(O)或Met(O₂)的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体或是从Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Arg、Phe、Lys、Tyr、Asp、Nva、Met、Met(O)或Met(O₂)衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体，或是从Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Arg、Phe、Lys、Tyr、Asp、Nva、Met、Met(O)或Met(O₂)衍生的α，α-双取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-双取代氨基酸的全部(R)或(S)构型，或Aaa¹是包含C₂-C₁₈直链烷基、C₃-C₁₇支链烷基、C₂-C₁₈直链链烯基或炔基或C₃-C₁₈支链链烯基或炔基的酰基，或Aaa¹是结构如下的氨基酸替代物：

其中虚线表示肽键；R和R′独立地是H、直链或支链的C₁-C₆脂族链、-(CH₂)_y-S-CH₃、-(CH₂)_y-S(＝O)-CH₃、-(CH₂)_y-S(O₂)-CH₃、键和环丙烷、环丁烷、环戊烷或环己烷环，或C₁-C₃脂族链和环丙烷、环丁烷、环戊烷或环己烷环；x是1或2；Y是CH₂或C＝O；W是CH₂、NH或NR＂′；Z是H或CH₃；Q是-H、-(CH₂)_m-N(v₃)(v₄)、-(CH₂)_m-CH₃、-(CH₂)_m-O(v₃)、-(CH₂)_m-C(＝O)-(v₃)、-(CH₂)_m-C(＝O)-O-(v₃)、-(CH₂)_m-S(v₃)、-C(＝O)-(CH₂)_m-CH₃、-C(＝O)-(CH₂)_m-N(v₃)(v₄)、-C(＝O)-(CH₂)_m-C(＝O)-(v₃)、-C(＝O)-(CH₂)_m-O(v₃)或-C(＝O)-(CH₂)_m-S(v₃)；R＂′是酰基、C₁-C₁₇直链或支链的烷基链、C₂-C-₁₉直链或支链的烷基酰基链、C₁-C₁₇直链或支链的Ω氨基脂族基团或C₁-C₁₇直链或支链的Ω氨基脂族酰基；n是0、1或2；m是0-17；y是1-5；v₃和v₄各自独立地是H、C₁-C₁₇直链或支链的烷基链或C₂-C₁₉直链或支链的烷基酰基链，前提是若v₃或v₄之一是烷基酰基链，则另一个v₃或v₄是H；并且用星号标记的碳原子可以具有任何立体化学构型；

Aaa²和Aaa¹³是相同或不同的，并且分别是经过Aaa²和Aaa¹³的各自侧链而形成环桥的L-或D-异构体氨基酸残基，其中该环桥的连接基团是-S-S-、-S-CH₂-S-、-S-CH₂-、-CH₂-S-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-CH₂-NH-、-NH-CH₂-、-CH₂-S(O)_n-其中n是1或2、-S(O)_n-CH₂-其中n是1或2、-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-(E或Z)、-C≡C-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-CH₂-、-CH₂-C(＝O)-、-O-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-O-或-NH-C(＝O)-NH-；

Aaa³是包括His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体或是从His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体，或是从His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab衍生的α，α-双取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-双取代氨基酸的全部(R)或(S)构型，或Aaa³是结构如下的氨基酸替代物：

其中R和R′独立地是H或者His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab的氨基酸侧链部分或者His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab的氨基酸侧链部分的衍生物；x是1或2；Y是CH₂或C＝O；W是CH₂、NH或NR＂′；Z是H或CH₃；R＂′是酰基、C₁-C₁₇直链或支链的烷基链、C₂-C₁₉直链或支链的烷基酰基链、C₁-C₁₇直链或支链的Ω氨基脂族基团或C₁-C₁₇直链或支链的Ω氨基脂族酰基；并且n是0、1或2；

Aaa⁴是包括取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体或是从取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体，或从取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle衍生的α，α-双取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-双取代氨基酸的全部(R)或(S)构型，或Aaa⁴是如对Aaa³所述的氨基酸替代物，其中R和R′独立地是H或者取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle的氨基酸侧链部分，或者取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle的氨基酸侧链部分的衍生物；

Aaa⁵是Gly、Sar、包括Ala的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体或是从Ala衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体，或Aib(其是从Ala衍生的α，α-双取代氨基酸)，或Aaa⁵是如对Aaa³所述的氨基酸替代物，其中R和R′独立地是H或-CH₃；

Aaa⁶是Gly、Sar、包括从Ala的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体或是从Ala衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体，或Aib，或Aaa⁶是如对Aaa³所述的氨基酸替代物，其中R和R′独立地是H或-CH₃；

Aaa⁷是包括Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Cit、Abu、Dap或Dab的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体或从Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Cit、Abu、Dap或Dab衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体或从Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Cit、Abu、Dap或Dab衍生的α，α-双取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-双取代氨基酸的全部(R)或(S)构型，或Aaa⁷是如对Aaa³所述的氨基酸替代物，其中R和R′独立地是H或者Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Abu、Dap或Dab的氨基酸侧链部分或者Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Abu、Dap或Dab的氨基酸侧链部分的衍生物；

Aaa⁸是Gly、包括Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O₂)或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体或从Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O₂)或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体，或是从Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O₂)或Tle衍生的α，α-双取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-双取代氨基酸的全部(R)或(S)构型，或Aaa⁸是如对Aaa³所述的氨基酸替代物，其中R和R′独立地是H或Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O₂)或Tle的氨基酸侧链部分或者Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O₂)或Tle的氨基酸侧链部分的衍生物；

Aaa⁹是包括Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O₂)、Orn、Dap或Dab的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体或从Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O₂)、Orn、Dap或Dab衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体，或是从Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O₂)、Orn、Dap或Dab衍生的α，α-双取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-双取代氨基酸的全部(R)或(S)构型，或Aaa⁹是如对Aaa³所述的氨基酸替代物，其中R和R′独立地是H或Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O₂)、Orn、Dap或Dab的氨基酸侧链部分或者Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O₂)、Orn、Dap或Dab的氨基酸侧链部分的衍生物；

Aaa¹⁰是包括Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap或Dab的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体或从Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap或Dab衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体，或是从Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap或Dab衍生的α，α-双取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-双取代氨基酸的全部(R)或(S)构型，或Aaa¹⁰是如对Aaa³所述的氨基酸替代物，其中R和R′独立地是H或者Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Orn、Dap或Dab的氨基酸侧链部分或者Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Orn、Dap或Dab的氨基酸侧链部分的衍生物；

Aaa¹¹是Gly或包括Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的D-或L-异构体或从Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的D-或L-异构体，或是从Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle衍生的α，α-双取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-双取代氨基酸的全部(R)或(S)构型，或Aaa¹¹是如对Aaa³所述的氨基酸替代物，其中R和R′独立地是H或Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle的氨基酸侧链部分或者Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle的氨基酸侧链部分的衍生物；

Aaa¹²是Gly、包括Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体或从Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体，或是从Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle衍生的α，α-双取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-双取代氨基酸的全部(R)或(S)构型，或Aaa¹²是如对Aaa³所述的氨基酸替代物，其中R和R′独立地是H或Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle的氨基酸侧链部分或Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle的氨基酸侧链部分的衍生物；

Aaa¹⁴是包括取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体或从取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-异构体，或是从取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle衍生的α，α-双取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-双取代氨基酸的全部(R)或(S)构型，或Aaa¹⁴是如对Aaa³所述的具有式II结构的氨基酸替代物，其中R和R′独立地是H或者取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle的氨基酸侧链部分或者取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle的氨基酸侧链部分的衍生物；并且

Aaa¹⁵是包括Ala、Arg、Orn、Lys、Ala、Dap、Dab、HArg或HLys的α-氨基酸或β-氨基酸的D-或L-异构体或从Ala、Arg、Orn、Lys、Ala、Dap、Dab、HArg或HLys衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的D-或L-异构体，或是从Ala、Arg、Orn、Lys、Ala、Dap、Dab、HArg或HLys衍生的α，α-双取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-双取代氨基酸的全部(R)或(S)构型，或Aaa¹⁵是结构如下的氨基酸替代物：

其中虚线表示肽键；R和R′的至少之一是(CH₂)_y-R＂，并且若一个具有此式，则R和R′中另一个是H，其中R＂是：

-NH₂、

-NH-C(＝NH)-NH₂、

-NH-(CH₂)_y-NH₂、

-NH-C(＝O)-NH₂、

-C(＝O)-NH₂、

-C(＝O)-NH-CH₃、

-C(＝O)-NH-(CH₂)_y-NH₂、

-NH-C(＝NH)-NH-Me、

-NH-C(＝NH)-NH-Et、

-NH-C(＝NH)-NH-Pr、

-NH-C(＝NH)-NH-Pr-i、

-NH-C(＝O)-CH₃、

-NH-C(＝O)-CH₂-CH₃、

-NH-C(＝O)-CH-(CH₃)₂、

-NH-C(＝O)-O-CH₃、

-NH-C(＝O)-O-CH₂-CH₃、

-NH-C(＝O)-O-C-(CH₃)₃、

-NH-C(＝O)-NH-CH₃、

-NH-C(＝N-C(＝O)-O-C-(CH₃)₃)-NH-C(＝O)-O-C-(CH₃)₃、

-N(C(＝O)-O-C-(CH₃)₃)-C(＝NH)-NH-C(＝O)-O-C-(CH₃)₃、

或

x是1或2；Y是CH₂或C＝O；W是CH₂、NH或NR＂′，Z是H或CH₃；J是-H、-(CH₂)_m-OH、-C(＝O)-CH₂)_m-OH、-C(＝O)-CH₂)_m-N(_v1)(v₂)、-C(＝O)-O-(CH₂)_m-CH₃、-O-(CH₂)_m-CH₃、-O-(CH₂)_m-N(_v1)(v₂)、-O-(CH₂)_m-OH、-C(＝O)-NH-(CH₂)_m-CH₃、-C(＝O)-NH-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂)、-C(＝O)-NH-(CH₂)_m-S(v₁)、-C(＝O)-N-((CH₂)_m-N(v₁)(v₂))₂、-C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-OH)-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂)、-C(＝O)-NH-(CH₂)_m-NH-C(＝O)-CH(N(v₁)(v₂))((CH₂)_m-N(v₁)(v₂))、-C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-N(v₁)(v₂))-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂)、Ω氨基脂族基团、末端芳基或芳烷基、与定义J的前述组中的一项组合的任何的单个天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸或α，α-双取代氨基酸或任何的单个天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸或α，α-双取代氨基酸，包括任何前述项的全部(R)和(S)构型；R＂′是酰基、C₁-C₁₇直链或支链的烷基链、C₂-C₁₉直链或支链的烷基酰基链、C₁-C₁₇直链或支链的Ω氨基脂族基团或C₁-C₁₇直链或支链的Ω氨基脂族酰基；v₁和v₂各自独立地是H或C₁-C₁₇直链或支链的烷基链；n是0、1或2；m是0-17；y是1-5；并且用星号标记的碳原子可以具有任何的立体化学构型；

前提是Aaa¹、Aaa³至Aaa¹²、Aaa¹⁴或Aaa¹⁵中至少之一是氨基酸替代物。

式III的相关实施方案提供这样的构建体，其中Aaa¹、Aaa³至Aaa¹²、Aaa¹⁴或Aaa¹⁵的一个或多个是如上所定义的氨基酸替代物，并且如下文定义的辅基在Aaa¹、Aaa³至Aaa¹²、Aaa¹⁴或Aaa¹⁵中的一个或多个Aaa处连接至氨基酸残基侧链的反应基、在Aaa³至Aaa¹²或Aaa¹⁴处连接至氨基酸替代物的活性R或R’基团、在Aaa³至Aaa¹²或Aaa¹⁴处连接至氨基酸替代物的活性R或R’基团、在Aaa¹处直接或通过Q基团连接至氨基酸替代物的末端胺、在Aaa¹⁵处连接至氨基酸替代物的活性末端羧基、或在Aaa¹⁵处连接至基酸替代物中形成J的一部分的反应基。与一个或多个辅基共价连接的反应基可以是伯胺、仲胺、羧基、硫氢基或羟基。在一个方面，辅基可以在位置Aaa¹、Aaa³、Aaa⁷、Aaa¹⁰、Aaa¹²或Aaa¹⁵或前述位置组合与活性胺共价连接。在另一方面，辅基可以在位置Aaa⁹或Aaa¹⁵或这两个位置与活性羧基共价连接。在另一方面，辅基可以在位置Aaa³、Aaa⁷、Aaa⁹、Aaa¹⁰、Aaa¹¹或Aaa¹²或前述位置组合与活性硫氢基共价连接。

在式III构建体的优选方面中，Aaa¹至Aaa¹⁵(排除Aaa²和Aaa¹³)中的一个、两个或三个Aaa是前述式之一的氨基酸替代物。在第一特别优选方面，Aaa¹、Aaa⁵和Aaa¹⁵之一是氨基酸替代物。在第二特别优选方面，Aaa¹、Aaa⁵和Aaa¹⁵中的两个Aaa是氨基酸替代物。在第三特别优选方面，Aaa¹、Aaa⁵和Aaa¹⁵均是氨基酸替代物。在另一个特别优选方面，Aaa¹、Aaa⁵和Aaa¹⁵中的一个、两个或三个Aaa是氨基酸替代物，并且构建体是经Aaa²和Aaa¹³的侧链通过二硫键形成作用所形成的环状构建体。在其中Aaa¹至Aaa¹⁵中的两个或多个Aaa是氨基酸替代物的另一个特别优选方面，氨基酸替代物不是连续的，也就是说每个氨基酸替代物由一级序列中至少一个在氨基酸替代物之间插入的氨基酸残基而与其它氨基酸替代物隔开。

在又一个优选实施方案中，式III构建体中的Aaa³、Aaa⁵、Aaa⁶、Aaa⁷、Aaa⁹、Aaa¹⁰或Aaa¹²至少之一是Ala的L-或D-异构体、优选地是Ala的L-异构体。

在又一个优选实施方案中，本发明提供还包含一个或多个非肽键的式III构建体。非肽键可以是用来降低本发明构建体对降解的易感性，如通过用非肽键如酰胺、取代酰胺或肽模拟键(peptidmminetic linkage)的电子等排物替换在每个Lys或Arg残基之前的天然肽键，而改善构建体对胰蛋白酶样蛋白酶的体内稳定性。在一个具体实施方案中，天然肽键用具有倒转极性的肽键替换。通常，可以利用并且可以在任何两个残基之间利用任何非肽键。非肽键包括其中参与两个残基之间键的碳原子从羰基碳被还原成亚甲基碳的键，如非肽键-CH₂-NH-或其电子等排物-NH-CH₂-，或使用其它键如-CH₂-S-、-CH₂-O-或-C(＝O)-CH₂-，或任何前述项的电子等排物，或-CH₂-CH₂-或-CH＝CH-。通常，非肽键包括亚氨基键、酯键、肼键、氨基脲键、肟键或偶氮键。

上文定义的构建体可以包括一个或多个辅基。辅基可以用来调整在循环中的停留时间、调整生物利用度、调整构建体的免疫原性等。通常根据具体情况，辅基通过增加停留时间、生物利用度等而“调整”，不过辅基可以任选地减少停留时间、生物利用度等。“辅基”因此包括如通过共价键缀合至任何式的构建体，以改善该构建体的药物代谢动力学或药物动力学特性的任何化合物。优选的辅基包括包含重复单元的聚合物基团，其中所述的重复单元又包含一个或多个碳原子和氢原子和任选地其它原子，包括氧原子。此类聚合物基团优选地是水溶性聚合物，并且优选地是聚醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉或聚(丙烯酰吗啉)。优选的聚醚是聚乙二醇(PEG)。除了PEG之外，可以使用其它聚醚聚合物，如聚丙二醇和聚丁二醇。

在一个实施方案中，辅基是与构建体的反应基共价结合的一种或多种PEG聚合物。PEG聚合物或其它辅基可以共价结合至一个或多个氨基酸残基的侧链上的反应基，或可以共价结合至氨基酸替代物上的反应基。氨基酸替代物的此类反应基可以包括直接或经过一个或多个中间体而共价结合至Q或J的基团，或可以包括形成R或R′的部分的反应基。

若PEG用作辅基，则PEG聚合物可以具有约200MW至约50000MW的分子量。PEG聚合物可以是直链的，并且若是直链，则可以是单官能性的，即在一个末端带反应基而在另一末端带非反应基，可以是同双官能性的，即在每个末端带相同反应基，或可以是异双官能性的，即在即每个末端带不同反应基。或者，PEG聚合物可以是支化的，一般具有“Y”形结构、多臂结构如具有两条、三条、四条或八条臂或本领域已知的其它结构。PEG聚合物优选地具有至少一个衍生化反应基以便连接、优选通过共价键连接至式III至式XIII的任何构建体上的一个或多个定义的基团。衍生化的反应基可以连接至例如构建体上的(包括在氨基酸残基的端基上的、氨基酸残基的侧链上的、在替代物的Q基团上的、或在替代物的J基团上的、在替代物的R或R′基团上的)胺基、羟基、硫氢基或羧基。

PEG聚合物优选地具有在一个末端处的封端基团，如羟基、烷氧基、取代的烷氧基、链烯氧基(aleknoxy)、取代的链烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基或取代的芳氧基。PEG聚合物还优选地具有在至少一个其它末端处的衍生化反应基。在一个实施方案中，PEG聚合物是具有用连接基团如胺、马来酰亚胺或羧酸加以衍生化的末端羟基的线形或支化的聚醚，如单甲氧基PEG。构建体的可用的反应基决定了在PEG聚合物上使用的衍生化连接基团。因此，在一个实施方案中，使用羧酸衍生化的PEG利用构建体的氨基端胺。在另一个实施方案中，再次使用羧酸衍生化的PEG利用构建体的羧基端胺。在又一个实施方案中，若构建体中存在Lys残基或其同系物，则可以再次使用羧酸衍生化的PEG而利用其α或ε氨基。马来酰亚胺衍生化的PEG可以与构建体上的活性硫氢基或羟基一起使用。类似地，胺衍生化的PEG可以与在氨基酸残基的任何端基或侧链上的、在替代物的Q基团上、在替代物的J基团上、在替代物的R或R’基团上的活性羧基一起使用。

因此，在一个方面，PEG以一个或多个亲电子基团加以活化，并且可以用于偶联至构建体的氨基，包括偶联至侧链的ε氨基或氨基端或羧基端胺。代表性的亲电子反应基包括琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯和其它α-甲基丁酸酯，如美国专利5,672,662和6,737,505中所公开，并且可以与蛋白质一起使用，如美国专利申请公开2004/0235734中所公开。或者，琥珀酰亚胺丙酸酯可以用作反应基，如美国专利5,567,662中所公开，或N-羟基琥珀酰亚胺可以与支化的PEG一起使用，如美国专利5,932,462中所公开。前述每篇专利和专利申请的教导通过引用的方式而如完整所述那样并入。

在另一方面，PEG聚合物具有一个或多个活性醛基，并用于偶联至末端伯胺，如氨基端或羧基端胺。在另一方面，PEG聚合物具有一个或多个硫氢基反应基(如马来酰亚胺、二硫化正吡啶或硫氢基)，并用于偶联至式III至式XIII的任何构建体中的活性硫氢基，如半胱氨酸侧链中的活性硫氢基或构建体的Q基团内的活性硫氢基。

在一个方面，如国际专利公开号WO 2004/047871中公开的任何方法、缀合物或方案或其中援引的任何参考文献可以用于本发明的构建体。前述专利申请的教导通过引用的方式而如完整所述那样并入。

通常，某种形式的化学修饰可以用来产生带反应基的活性PEG衍生物。反应基可以是活性碳酸酯、活性酯、醛或三氟乙磺酸酯。PEG的反应基部分地决定与PEG衍生物结合的氨基酸端基或侧链部分。通常，优选位点特异性PEG化，其部分原因在于得到的构建体是均一的，使生物学活性损失最小化并降低免疫原性。

在一个实施方案中，PEG具有约200MW至约50,000MW、更优选约2,000MW至约20,000MW的分子量。在另一个实施方案中，使用单甲氧基PEG，如式CH₃-O(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂-CH₂-OH或CH₃-O(CH₂-CH₂-O)_n-H，其中n是从2至约1200的任何整数，其优选地用胺、马来酰亚胺或羧酸连接基团进行衍生化。

在另一个实施方案中，辅基如PEG通过如Veronese FM和Pasut G.Pegylation，successful approach to drug delivery.Drug Discovery Today10：1451-1458(2005)中描述的酶不稳定性接头与构建体缀合，并且在其中公开的方法通过引用的方式并入本文。

在另一个实施方案中，所用的辅基是如美国专利5,359,030和5,681,811中公开的具有亲脂部分和亲水聚合物部分的聚合物。在相关的实施方案中，所用的辅基是由可水解键(如酯键)连接的具有亲水构件(如PEG聚合物)和亲脂构件(如支链脂肪酸或烷基链)的寡聚缀合物，如美国专利6,309,633中公开。在另一个相关实施方案中，所用的辅基是包括聚(丙二醇)和优选地至少2个聚(丙二醇)亚单位的寡聚物，如美国专利6,858,580中公开。前述每篇专利和专利申请的教导通过引用的方式而如完整所述那样并入。

在又一个实施方案中，美国公开专利申请2004/0203081的教导通过引用的方式并入本文，其中该专利申请具体地包括涉及与多种促钠尿排泄性化合物连接的辅基(在本申请中称作“修饰部分”)和尤其具有多种长度及构造的寡聚体结构的教导。在相关的实施方案中，国际专利申请WO2004/047871的教导通过引用的方式并入，其中该专利申请包括涉及“修饰部分”的教导，其中所述的“修饰部分”通过“修饰部分缀合位点”而与结合NPRA的促钠尿排泄分子连接，可理解相似的方法可以用于与其它利尿钠肽受体结合的促钠尿排泄分子。

在本说明书及权利要求书通篇范围内使用的某些术语定义如下。

本发明的“构建体”和“氨基酸残基序列”可以是a)天然存在的、b)由化学合成法产生、c)通过重组DNA技术产生、d)通过较大分子的生物化学片段化法或酶的片段化法而产生、e)通过以上所列a至d方法的组合而生成的方法所产生，或f)通过用于产生肽或氨基酸序列的任何其它方法产生。

通过使用优选的产生方法即化学合成法，有可能向构建体内导入非天然存在的多种氨基酸、修饰的氨基端或羧基端等，因而提供改善的稳定性和组成、抗蛋白酶降解性等，并有可能向构建体内导入一个或多个氨基酸替代物。

术语“肽”如本说明书及权利要求书通篇范围中所用，意图包括由两个或多个氨基酸(包括氨基酸的化学变型和衍生物)构成的任何结构。形成肽的全部或部分的氨基酸可以是天然存在的氨基酸、此类氨基酸的立体异构体和变型、非蛋白质氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶修饰的氨基酸等。术语“肽”也包括肽的二聚体或多聚体。“制造的”肽包括通过化学合成法、重组DNA技术、较大分子的生物化学片段化法或酶的片段化法、前述方法组合而产生的肽，或通常由任何其它方法制造的肽。

用于本发明中(包括如用于说明书和权利要求书中)的术语“氨基酸侧链部分”包括如本文中术语“氨基酸”所定义任何氨基酸的任何侧链。该术语因此包括在天然存在的氨基酸中出现的侧链部分。它还包括在修饰的天然存在的氨基酸(如糖基化氨基酸)中的侧链部分。它还包括在天然存在的蛋白质氨基酸的立体异构体和变型、非蛋白质氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶合成的氨基酸、衍生化氨基酸、为模拟氨基酸所设计的构建体或结构等中的侧链部分。例如，在该定义的范围内包含本文中所公开任何氨基酸的侧链部分。在氨基酸侧链部分的定义范围内包含如本文以下所定义的“氨基酸侧链部分的衍生物”。

“氨基酸侧链部分的衍生物”是针对任何氨基酸侧链部分的修饰或在其中的变异，包括针对天然存在或非天然氨基酸侧链部分的修饰或在其中的变异，其中修饰或变异包括：(a)向现有的烷基、芳基或芳烷基链添加一个或多个饱和或不饱和碳原子；(b)用另一种原子，优选氧或氮取代侧链中的碳；(c)向侧链的碳原子添加端基，所述的端基包括甲基(-CH₃)、甲氧基(-OCH₃)、硝基(-NO₂)、羟基(-OH)或氰基(-C≡N)；(d)对于包括羟基、硫氢基或氨基的侧链部分，添加合适的羟基、硫氢基或氨基保护基团；或(e)对于包括环结构的侧链部分，添加一个取代基或环状取代基，包括直接连接或通过醚键连接的羟基、卤素、烷基或芳基。对于氨基，合适的氨基保护基团包括，但不限于Z、Fmoc、Boc、Pbf、Pmc等。

在本发明实施方案中所用的“氨基酸”和如用于说明书和权利要求书中的此术语包括已知的天然存在的蛋白质氨基酸，所述氨基酸由其常用的三字母缩写和单字母缩写提及。通常参见Synthetic Peptides：A User’s Guide，编者G.A.Grant，W.H.Freeman & Co.，New York(1992)，其教导通过引用的方式并入本文中，包括在第11至24页中所述的文本内容及表格。“氨基酸”包括常规的α-氨基酸，并且还包括其中至少一个侧链是如本文中所定义的氨基酸侧链部分的β-氨基酸、α，α-双取代氨基酸和N-取代氨基酸。“氨基酸”还包括N-烷基α-氨基酸，其中氨基端氨基具有C₁-C₆直链或支链的烷基取代基。因此可以看出术语“氨基酸”包括天然存在的蛋白质氨基酸的立体异构体和变型、非蛋白质氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶合成的氨基酸、衍生化氨基酸、为模拟氨基酸所设计的构建体或结构等。修饰及非天然氨基酸通常在上文援引的Synthetic Peptides：A User’s Guide；Hruby V.J.，Al-obeidi F.，Kazmierski W.，Biochem.J.268：249-262(1990)；和Toniolo C，Int.J.Peptide Protein Res.35：287-300(1990)中描述；全部文献的教导通过引用的方式并入本文中。此外，下列缩写(包括氨基酸及其保护基团和修饰基团)具有给出的意思：

Abu — γ-氨基丁酸

12-Ado — 12-氨基十二烷酸

Aib — α-氨基异丁酸

6-Ahx — 6-氨基己酸

Amc — 4-(氨甲基)-环己烷羧酸

8-Aoc — 8-氨基辛酸

Bip — 联苯胺

Boc — 叔丁氧羰基

Bzl — 苄基

Bz — 苯甲酰

Cit — 瓜氨酸

Dab — 二氨基丁酸

Dap — 二氨基丙酸

Dip — 3，3-二苯基丙氨酸

Disc — 1，3-二氢-2H-异吲哚羧酸

Et — 乙基

Fmoc — 芴甲氧羰基

Hept — 庚酰基(CH₃-(CH₂)₅-C(＝O)-)

Hex — 己酰基(CH₃-(CH₂)₄-C(＝O)-)

HArg — 高精氨酸

HCys — 高半胱氨酸

HLys — 高赖氨酸

HPhe — 高苯丙氨酸

HSer — 高丝氨酸

Me — 甲基

Met(O) — 甲硫氨酸亚砜

Met(O₂) — 甲硫氨酸砜

Nva — 正缬氨酸

Pgl — 苯基甘氨酸

Pr — 丙基

Pr-i — 异丙基

Sar — 肌氨酸

Tle — 叔丁基丙氨酸

Z — 苄氧羰基

在本发明构建体的列表中，常规氨基酸残基具有如《专利审查程序手册》(Manual of Patent Examing Procedure)第8版第2400章中给出的常规含义。因此，“Nle”是正亮氨酸；“Asp”是天冬氨酸；“His”是组氨酸；“Arg”是精氨酸；“Trp”是色氨酸；“Lys”是赖氨酸；“Gly”是甘氨酸；“Pro”是脯氨酸；“Tyr”是酪氨酸；“Ser”是丝氨酸等。全部残基处于L-异构体构型，除非指明D-异构体，如“D-Ala”表示D-丙氨酸。

单个氨基酸，包括天然存在的蛋白质氨基酸的立体异构体和变型、非蛋白质氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶合成的氨基酸、衍生化氨基酸、从任何前述项衍生的α，α-双取代氨基酸(即这样的α，α-双取代氨基酸，其中至少一个侧链与从中衍生该α，α-双取代氨基酸的残基的侧链相同)、从任何前述项衍生的β-氨基酸(即这样的β-氨基酸，其除存在β-碳之外与从中衍生所述β-氨基酸的残基相同)和包括前述各项的其它情况，有时在本文中称作“残基”。

“α，α-双取代氨基酸”包括在α-位置具有其它取代基的任何α-氨基酸，其中取代基可以与α-氨基酸的侧链部分相同或不同。除了α-氨基酸的侧链部分之外，合适的取代基还包括C₁-C₆直链或支链的烷基。Aib是α，α-双取代氨基酸的实例。在可以使用常规的L-和D-异构体称谓提及α，α-双取代氨基酸时，将理解的是这些称谓旨在便利，并且其中在α-位置上的取代基不同的情况下，此类氨基酸根据需要可以可互换地称作从具有所指明氨基酸侧链部分的残基的L-或D-异构体衍生的α，α-双取代氨基酸。因此(S)-2-氨基-2-甲基-己酸可以称作从L-Nle衍生或称作从D-Ala衍生的α，α-双取代氨基酸。无论何时提供α，α-双取代氨基酸，将理解为包括其全部(R)和(S)构型。

“N-取代氨基酸”包括其中氨基酸侧链部分与主链氨基共价连接的任何氨基酸，任选其中在α-碳位置内除H之外没有取代基。肌氨酸是N-取代氨基酸的实例。例如，肌氨酸可以称作Ala的N-取代氨基酸衍生物，因为肌氨酸与Ala的氨基酸侧链部分是相同的，即均为甲基。

术语“氨基酸替代物”包括本文中公开的作为残基的模拟物的分子，所述的残基包括但不限于哌嗪核心分子、酮-哌嗪核心分子和二氮杂卓核心分子。除非另外说明，将氨基酸替代物理解为包括羧基和氨基，以及对应于氨基酸侧链的基团，或在甘氨酸的氨基酸替代物的例子中，除氢之外无侧链。因此，氨基酸替代物包括以上给出的式I或I1通式的分子。氨基酸替代物还包括具有以下任一结构的分子，可理解为方便起见，此类结构作为孤立的替代物给出，不包括任何保护基团，并且没有通过一个或两个肽键与形成本发明构建体的部分的一个或两个氨基酸残基连接：

其中R、R′、x和星号如对式I的替代物所定义。氨基酸替代物还包括具有以下任一结构的分子，再次可理解为方便起见，此类结构作为孤立的替代物给出，不包括任何保护基团，并且没有通过一个或两个肽键与形成本发明构建体的部分的一个或两个氨基酸残基连接：

其中R、R′、x和星号如对式I的替代物所定义。为了合成，任何氨基酸替代物的羧基或氨基优选地由保护基团保护，使得它在保护基团存在时没有反应性，并且类似地，形成R或R′的部分的任何反应基可以类似地由保护基团保护。将理解的是本发明的替代物具有多于一个的非对称中心，并且因而能够以多于一种立体异构体形式存在。化合物中的某一些也可以作为几何异构体和旋转异构体存在。另外，本发明的一些化合物也可以具有产生阻转异构体的构象轴手性。本发明分别延伸至这些形式中的每一种并延伸至其混合物，包括消旋物。在一个方面，替代物异构体可以通过色谱方法或通过使用拆分剂而常规地分离。在另一方面，各种替代物的异构体或对映体纯的替代物通过合成方案(如本文中公开的那些方案)或此类方案的变型，采用非对称合成法，使用手性中间体、试剂或催化剂加以合成。

术语“羧基端封端基团”包括经构建体的羧基端的末端环碳原子或(若提供)末端羧基连接的任何端基。末端环碳原子或(若提供)末端羧基可以形成残基的一部分或可以形成氨基酸替代物的一部分。在优选的方面，羧基端封端基团形成在构建体的羧基端位置处的氨基酸替代物的一部分。羧基端封端基团包括，但不限于-(CH₂)_n-OH、-(CH₂)_n-C(＝O)-OH、-(CH₂)_m-OH、-(CH₂)_n-C(＝O)-N(v₁)(v₂)、-(CH₂)_n-C(＝O)-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂)、-(CH₂)_n-O-(CH₂)_m-CH₃、-(CH₂)_n-C(＝O)-NH-(CH₂)_m-CH₃、-(CH₂)_n-C(＝O)-NH-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂)))₂、-(CH₂)_n-C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-OH)-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂)、-C(＝O)-NH-(CH₂)_m-NH-C(＝O)-CH(N(v₁)(v₂))((CH₂)_m-N(v₁)(v₂))或-(CH₂)_n-C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-NH₂)-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂)，包括前述基团的全部(R)或(S)构型，其中v₁和v₂各自独立地是H、C₁-C₁₇直链或支链的烷基链，m是0-17和n是0-2；或任何Ω氨基脂族基团、末端芳基或芳烷基，包括下列基团，如甲基、二甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、己基、烯丙基、环丙烷甲基、己酰基、庚酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、苯乙酰基、环己基乙酰基、萘乙酰基、肉桂酰基、苯基、苄基、苯甲酰、12-Ado、7′-氨基庚酰基、6-Ahx、Amc或8-Aoc或任何单个天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸或α，α-双取代氨基酸，包括前述基团的全部(R)或(S)构型，任选地与任何的前述非氨基酸封端基团的组合。在前述基团中，例如将理解-C(＝O)-NH-(CH₂)_m-NH-C(＝O)-CH(N(v₁)(v₂))((CH₂)_m-N(v₁)(v₂))是：

术语“氨基端封端基团”包括经构建体的氨基端的末端胺连接的任何端基。该末端胺可以形成残基的一部分或可以形成氨基酸替代物的一部分。在优选的方面，氨基端封端基团形成在构建体的氨基端位置处的氨基酸替代物的一部分。氨基端封端基团包括，但不限于任何Ω氨基脂族基团、酰基团或末端芳基或芳烷基，包括下列基团，如甲基、二甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、己基、烯丙基、环丙烷甲基、己酰基、庚酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、苯乙酰基、环己基乙酰基、萘乙酰基、肉桂酰基、苯基、苄基、苯甲酰、12-Ado、7′-氨基庚酰基、6-Ahx、Amc或8-Aoc，或者，氨基端封端基团是-(CH₂)_m-NH(v₃)、-(CH₂)_m-CH₃、-C(＝O)-(CH₂)_m-CH₃、-C(＝O)-(CH₂)_m-NH(v₃)、-C(＝O)-(CH₂)_m-C(＝O)-OH、-C(＝O)-(CH₂)_m-C(＝O)-(v₄)、-(CH₂)_m-C(＝O)-OH、-(CH₂)_m-C(＝O)-(v₄)、C(＝O)-(CH₂)_m-O(v₃)、-(CH₂)_m-O(v₃)、C(＝O)-(CH₂)_m-S(v₃)或-(CH₂)_m-S(v₃)，其中v₃是H或C₁-C₁₇直链或支链的烷基链，并且v₄是C₁-C₁₇直链或支链的烷基链及m是0-17。

当苯基环包括一个或多个取代基时，苯基环是“取代的”，其中所述的取代基独立地包含直接连接或通过醚键连接的羟基、卤素、烷基或芳基。当苯基环是如此取代的情况下，氨基酸残基可以称作取代的，如在取代的Phe、取代的HPhe或取代的Pgl中。

术语“烯”包括含有一个或多个碳-碳双键的不饱和烃。烯基的实例包括乙烯、丙烯等。

术语“链烯基”包括含有至少一个双键的2-6个碳原子的直链单价烃基或3-6个碳原子的支链单价烃基；其实例包括乙烯基、2-丙烯基等。

本文中所述的“烷基”包括具有所指明长度的处于直链或支链构型的那些烷基。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基等。

术语“炔基”包括含有至少一个三键的2-6个碳原子的直链单价烃基或3-6个碳原子的支链单价烃基；其实例包括乙炔基、丙炔基、丁炔基等。

术语“芳基”包括具有6-12环原子的并且任选用一个或多个取代基进行独立取代的单环或双环芳烃基，所述的取代基选自烷基、卤烷基、环烷基、烷氧基、烷基硫代、卤素、硝基、酰基、氰基、氨基、单取代氨基、双取代氨基、羟基、羧基或烷氧基-羰基。芳基的实例包括苯基、联苯基、萘基、1-萘基和2-萘基、其衍生物等。

术语“芳烷基”包括原子团-R^aR^b，其中R^a是烯基(双价烷基)，并且R^b是如上所定义的芳基。芳烷基的实例包括苄基、苯乙基、3-(3-氯苯基)-2-甲基戊基等。

术语“脂族的”包括具有烃链例如烷烃、烯烃、炔烃及其衍生物的化合物。

术语“酰基”包括基团R-C(＝O)-，其中R是有机基团。实例是乙酰基CH₃-C(＝O)-，在本文中称作“Ac”。

当如上所定义的芳基、烷基或取代烷基经一个或多个羰基{-(C＝O)-}连接时，肽或脂族部分受到“酰化”。肽最常见地在氨基端处酰化。

“Ω氨基脂族基团”包括带末端氨基的脂族部分。Ω氨基脂族基团的实例包括7′-氨基-庚酰基以及鸟氨酸和赖氨酸的氨基酸侧链部分。

术语“杂芳基”包括含有1-4个选自氮、氧和硫的杂原子的单环和双环芳环。5-元或6-元杂芳基是单环杂芳环；其实例包括噻唑、噁唑、噻吩、呋喃、吡咯、咪唑、异噁唑、吡唑、三唑、噻二唑、四唑、噁二唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪等。双环杂芳环包括，但不限于苯并噻二唑、吲哚、苯并噻吩、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并异噁唑、苯并噻唑、喹啉、苯并三唑、苯并噁唑、异喹啉、嘌呤、呋喃并吡啶和噻吩并吡啶。

“酰胺”包括具有与羰基连接的三价氮(-C(＝O)-NH₂)的化合物，例如甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺等。

“酰亚胺”包括含有亚胺基(-C(＝O)-NH-C(＝O)-)的化合物。

“胺”包括含有氨基(-NH₂)的化合物。

“腈”包括作为羧酸衍生物并含有与有机基团连接的(-CN)基的化合物。

术语“卤素”意图包括卤原子氟、氯、溴和碘，以及包括一个或多个卤原子的基团，如-CF₃等。

术语“组合物”，如在药物组合物中，意图包括包含活性成分和充当载体的惰性成分的产物，以及直接或间接地因任何两种或多种成分的组合、复合或聚集、因一种或多种成分的解离或因一种或多种成分的其它类型反应或相互作用而产生的任何产物。因此，本发明的药物组合物包括通过将本发明构建体与可药用的载体混合而制造的任何组合物。

术语“EC₅₀”意图包括激动剂的摩尔浓度，该摩尔浓度产生50％针对激动剂的最大可能反应。例如，构建体在浓度72nM上产生如cGMP测定法中所测定针对构建体的最大可能反应的50％，则该构建体具有72nM的EC₅₀。除非另外说明，与EC₅₀测定有关的摩尔浓度以纳摩尔(nM)为单位。

术语“Ki(nM)”意图包括平衡受体结合亲和力，其代表平衡时在竞争剂不存在下与半数的受体结合部位相结合的竞争性化合物的摩尔浓度。通常，Ki与化合物对受体的亲和力成反比，从而当Ki低时，则亲和力高。Ki可以使用Cheng和Prusoff(Cheng Y.，Prusoff W.H.，Biochem.Pharmacol.22：3099-3108，1973)等式测定：

其中“配体”是配体的浓度，所述配体可以是放射性配体，并且K_d是产生50％受体占据的受体亲和力的倒数量值。除非另外说明，与Ki测定有关的摩尔浓度是nM。

本文中所用的化学命名方案和结构简图采用并依赖如(可从Cambridgesoft Corp.，Cambridge，Mass.获得的)ChemDraw程序所用的化学命名特征。尤其，某些化合物名称使用Autonom程序从如Chemdraw Ultra或ISISbase(MDL Corp.)所用的结构中衍生。通常，结构简图不描绘与碳原子连接的氢原子除非在端基内和在其它特定环境下。

本文中的某些结构简图和附图如在表1和2中包括的那些图，描绘了由氨基酸替代物和氨基酸残基组成的构建体，其中替代物由结构简图确定，并且氨基酸残基由三字母缩写确定。除非另外说明，可理解的是在所述替代物和残基之间、或者所述残基和替代物之间、或者一个替代物和其氨基端和羧基端侧上的残基之间的键是常规肽键-C(＝O)-NH-，或在其中肽键与替代物的氨基端上环氮连接的情况下，是-C(＝O)-N-。通常，在此类键的图中，绘出氨基酸替代物的原子(例如-C(＝O)-或-N)，但是不绘出氨基酸残基的原子。

制剂和用途

本文中公开的构建体既可以用于医学应用，也可以用于畜牧业或兽医应用。一般，所述构建体或包括该构建体的药物组合物在人类中使用，不过也可以用在其它哺乳动物中使用。术语“患者”意图指哺乳动物个体，并且在本说明书通篇范围内和在权利要求书中如此使用。本发明的主要应用涉及人类患者，不过本发明可以应用至实验动物、农场动物、动物园动物、野生动物、宠物、体育动物或其它动物。

本文中公开的构建体可以用于治疗需要对其诱导抗高血压、抗心血管作用、抗肾脏作用和/或抗内分泌作用的任何状况、综合征或疾病。这具体包括可以对其使用天然利尿钠肽的任何状况、综合征或疾病。因此，本文中公开的构建体可以用来引起患者中所需的钠尿排泄、利尿和/或血管舒张。

在一个方面，本文中公开的构建体在治疗早期如1级充血性心力衰竭中使用。在另一方面，本文中公开的构建体用于慢性或代偿失调性充血性心力衰竭的治疗中。在另一方面，本文中公开的构建体用于急性充血性心力衰竭(包括在休息及最小活动情况下呼吸困难的患者的急性代偿失调性充血性心力衰竭)的治疗中。

构建体的盐形式。本发明的构建体可以处于任何可药用盐形式。术语“可药用盐”指从可药用的无毒碱或无毒酸(包括无机碱或有机碱和无机酸或有机酸)制备的盐。从无机碱衍生的盐包括铝、铵、钙、铜、高铁、亚铁、锂、镁、锰、亚锰、钾、钠、锌等的盐。特别优选铵、钙、锂、镁、钾和钠盐。从可药用的有机无毒碱中衍生的盐包括伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环状胺和碱性离子交换树脂如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N，N′-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基-吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡糖、组氨酸、哈胺、异丙基胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙基胺、氨丁三醇等的盐。

当本发明的构建体呈碱性时，酸加成盐可以从可药用的无毒酸(包括无机酸和有机酸)制备。此类酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、羧酸、柠檬酸、羧酸、柠檬酸、乙磺酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、氢氯酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、丙二酸、粘酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸等。本发明的构建体的酸加成盐在合适的溶剂中从该构建体和过量的酸如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、琥珀酸或甲磺酸制备。乙酸盐形式尤其是有用的。在本发明实施方案的构建体包括酸性部分的情况下，合适的可药用盐可以包括碱金属盐，如钠或钾盐，或碱土金属盐，如钙或镁盐。

此外，申请人已经有利地发现相对于对应的乙酸盐盐形式，本发明的肽构建体的某些盐形式，包括双羟萘酸盐、辛酸盐、癸酸盐、油酸盐、硬脂酸盐、鞣酸钠和棕榈酸盐形式，具有增加的循环半寿期，在一些情况下加倍。这些盐形式特别适用于通过皮下注射或肌内注射施用，尤其适用于长期治疗，其原因在于可以因较长半寿期而实现的给药频率减少。尽管不受理论限制，然而认为与乙酸盐盐形式相比，增加的半寿期涉及溶解度下降。本发明肽构建体的半寿期增加的盐形式可以通过任何方法制造，包括例如离子交换法，将构建体的乙酸盐形式的溶液双羟萘酸二钠以形成双羟萘酸盐混悬液，或在构建体的制造中在终末纯化步骤期间使用所需的盐。

药物组合物。本发明的另一实施方案提供包括本发明的构建体和可药用载体的药物组合物。载体可以是液体制剂，并且优选地是缓冲、等张的水溶液。可药用载体也包括赋形剂如稀释剂、载体等，以及添加剂，如稳定剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂等，如下文所述。

本发明数个实施方案的构建体可以配制成或复合成包括至少一种本发明构建体连同一种或多种可药用载体的药物组合物，其中所述的可药用载体可以根据需要包括赋形剂如稀释剂、载体等和添加剂如稳定剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂等。制剂用赋形剂可以包括聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、阿拉伯胶、聚乙二醇、甘露醇、氯化钠和柠檬酸钠。对于注射剂或其它液体施用制剂，优选含有至少一种或多种缓冲组分的水，并且也可以使用稳定剂、防腐剂和增溶剂。对于固体施用制剂，可以使用多种增稠剂、填料、填充剂和载体添加剂中的任一种，如淀粉、糖、脂肪酸等。对于局部施用制剂，可以使用多种乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、洗剂等中的任一种。对于绝大多数药物制剂，按照重量或体积，非活性成分将构成制剂的主要部分。对于药物制剂，也构思可以使用多种定量释放的、缓释的或定时释放的制剂和添加剂中的任一种，从而可以配制出这样的剂量，以实现在一段时间内送递本发明的构建体。例如可以包括明胶、羧甲基纤维素钠和/或其它纤维素类赋形剂以提供定时释放制剂或缓释制剂，尤其对于通过皮下和肌内注射施用。

通常，施用至患者的构建体的实际量将在相当宽泛的范围内变化，这取决于施用模式、使用的制剂和想要的反应。

在实际使用中，构建体可以根据常规药学复合技术作为掺合剂中的活性成分与药用载体组合。载体可以采取种类繁多的形式，这取决于施用(例如口服、胃肠道外(包括静脉内)、尿道、阴道、鼻、皮肤、经皮、肺、肺深部、吸入、口颊、舌下等)所需要的制剂形式。在制备用于口服剂量形式的组合物中，可以使用任何常见的药用介质，例如在口服液体制剂例如混悬剂、酏剂和溶液剂的情况下，使用水、二醇、油、醇、增香剂、防腐剂、着色剂等；或如在口服固体制剂例如粉剂、硬胶囊剂和软胶囊剂和片剂的情况下，使用载体，如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。

因为其易于施用，片剂和胶囊剂代表有利的口服剂量单位形式。若需要，包括本发明构建体的组合物可以通过标准的含水或不含水技术加以包衣。此类治疗用组合物中的活性构建体的量是这样的，以至于将获得有效剂量。在另一种有利的剂量单位形式中，可以使用舌下药物组合物，如薄片(sheet)、糯米纸囊剂、片剂等。活性构建体也可以作为例如液态滴剂或喷雾剂作鼻内施用。

片剂、丸剂、胶囊剂等也可以含有粘合剂如黄芪树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸氢二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉或藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；和甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式是胶囊剂时，除以上类型的材料之外，它还可以含有液态载体如动物油.

多种其它材料可以用作包衣层或用来修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂可以用紫胶、糖或这两者加以包衣。糖浆剂或酏剂除活性成分外可以含有蔗糖作为甜味剂、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯作为防腐剂、染料和香料如樱桃或橙味。构建体也可以作胃肠道外施用。这些活性肽的溶液剂或混悬剂可以在水中与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适度混合而制备。也可以在甘油、液态聚乙二醇及其在油内的混合物中制备分散体。这些制剂可以任选地含有防止微生物生长的防腐剂。也可以使用冻干的单个单位剂量，如其在紧邻施用前用盐水重构，并且因此不需要防腐剂。

适于可注射用途的药物形式包括，例如，用于临时制备无菌可注射溶液剂或分散体的无菌水溶液或分散体和无菌粉末，如冻干制剂。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须具有流动性，使得其可以通过注射器施用。该形式必须在制造和储存条件下是稳定的，并且必须保存避免微生物(如细菌和真菌)污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇)或液态聚乙二醇、其合适混合物及植物油的溶剂或分散体介质。

如本文中公开的构建体可以通过鼻施用方式治疗性地应用。“鼻施用”意指鼻内施用本发明的任何构建体的任何形式。构建体可以存在于水溶液(如包含盐、柠檬酸盐或其它常见赋形剂或防腐剂的溶液)中。构建体也可以存在于干燥制剂或粉末制剂中。

在备选实施方案中，构建体可以直接施用至肺内。肺内施用可以通过定量剂量吸入器(当患者在呼吸期间开动时允许自行施用本发明构建体的定量大丸剂的一种装置)而进行。可以使用干粉吸入气雾剂和喷洒气雾剂。

根据本发明的另一种实施方案，本发明的构建体可以与增加药物(包括肽药物)的有效鼻吸收效果的多种药剂中的任一药剂一起配制。这些药剂应当增加鼻吸收效果，而不对粘膜造成不可接受的损伤。美国专利5,693,608、5,977,070和5,908,825及其它美国专利教授了可以使用的包含吸收增强剂的众多药物组合物，并且前述每篇专利的教导及其中援引的全部参考文献和专利通过引用的方式并入。

若在水溶液中，本发明的某些构建体可以通过可以处于任何生理可接受性pH(一般约pH 4-约pH 7)的盐水、乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐或其它缓冲剂而适度得到缓冲。也可以使用缓冲剂的组合，如磷酸盐缓冲盐水、盐水和乙酸盐缓冲剂等。在盐水的情况下，可以使用0.9％盐水溶液。在乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等的情况下，可以使用50rmM溶液。除了缓冲剂之外，还可以使用防止或限制细菌和其它微生物生长的合适防腐剂。一种可以使用的如此防腐剂是0.05％苯扎氯铵。

也可以并构思的是构建体可以是干燥颗粒形式。在优选的实施方案中，颗粒大小为约0.5μm至6.0μm，从而所述颗粒具有足够质量以停留在肺表面上并且不被呼出，然而是足够小的以至于它们在抵达肺之前不沉积在气道表面上。多种不同技术均可以用来产生干粉微粒，包括但不限于微碾磨法、喷雾干燥法和气雾剂快速冷冻随后冻干法。利用微粒子，构建体可以沉积至肺深部，因而提供迅速及高效的进入血流的吸收。此外，采用这种方法，则不需要渗透增强剂，正如有时在经皮、鼻或口粘膜送递途径的情况。多种吸入器均可以使用，包括基于推进剂的气雾剂、雾化吸入器、单次剂量干粉吸入器和多剂量干粉吸入器。当前使用的常见装置包括定量剂量吸入器，其用来送递用于治疗哮喘、慢性闭塞性肺病等的药物。优选的装置包括干粉吸入器，其设计旨在形成具有总是小于约6.0μm粒度的细微粉末的云雾或气雾剂。

可以通过制造方法控制微粒大小，包括平均大小分布。对于微碾磨法，碾磨头的尺寸、转子速度、加工时间等控制微粒大小。对于喷雾干燥法，喷嘴尺寸、流速、干燥器热度等控制微粒大小。对于通过气雾剂快速冷冻随后冻干法的产生而言，喷嘴尺寸、流速、气雾化溶液的浓度等控制微粒大小。这些参数和其它参数可以用来控制微粒大小。

本发明的构建体可以通过注射定时释放的可注射制剂而治疗性地施用，其中所述的注射一般是深部肌内注射，如在臀肌或三角肌中。在一个实施方案中，本发明的构建体与PEG如聚乙二醇3350和任选一种或多种其它赋形剂和防腐剂(包括但不限于赋形剂如盐、聚山梨醇酯80、调节pH的氢氧化钠或氢氯酸等)一起配制。在另一个实施方案中，本发明的构建体与聚(原酸酯)和任选地一种或多种其它赋形剂一起配制，其中所述的聚(原酸酯)可以是在聚合物主链中具有任何可变百分含量乳酸的自催化性聚(原酸酯)。在一个实施方案中，使用聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物(PLGA聚合物)，优选地使用具有亲水端基的PLGA聚合物，如来自BoehringerIngelheim，Inc.(Ingelheim，Germany)的PLGA RG502H。此类制剂可以例如通过将合适溶剂(如甲醇)中的本发明构建体与PLGA的二氯甲烷溶液合并，并在反应器中于适宜混合条件下向其添加聚乙烯醇的连续相溶液而产生。通常，众多可注射及生物可降解的聚合物均可以在定时释放的可注射制剂中使用，所述的聚合物优选地也是粘性聚合物。美国专利4,938,763、6,432,438和6,673,767的教导及其中公开的生物可降解聚合物及配制方法通过引用的方式并入本文。制剂可以是这样的，以至需要基于周、月或其它周期基础提供注射，这取决于构建体的浓度和量、聚合物的生物降解速率和本领域技术人员已知的其它因素。

施用途径。如果通过注射施用，则注射可以是静脉内、皮下、肌内、腹膜内或本领域已知的其它方式。本发明的构建体可以通过本领域已知的任何方法配制为，包括但不限于以下的制剂，如片剂、胶囊剂、小胶囊、混悬剂、粉剂、冻干制剂、栓剂、滴眼剂、皮肤贴剂、口服可溶性制剂、喷雾剂、气雾剂等，并可以与缓冲剂、粘合剂、赋形剂、稳定剂、抗氧化剂和本领域已知的其它添加剂混合及配制。通常，可以使用经表皮细胞层导入本发明构建体的任何施用途径。施用方法可以因此包括经粘膜施用、口颊施用、口服施用、皮肤施用、吸入施用、肺施用、鼻施用、尿道施用、阴道施用等。

在一个方面，本发明的构建体通过定时释放的可注射制剂(如与PEG、聚(原酸酯)或PLGA聚合物一起配制的本发明构建体)而施用。在另一方面，本发明的构建体通过提供连续或间歇式皮下送递的自动送递装置而施用。任何前述方法和制剂特别适用于治疗慢性病症或综合征，包括慢性充血性心力衰竭并且特别是慢性代偿失调性充血性心力衰竭。

在一个方面，本发明的构建体均可以通过皮下施用(包括在美国专利6,586,396中公开的全部方法)。在另一方面，患者，尤其相对得到补偿或作为门诊患者环境下充血性心力衰竭患者的患者，可以通过如美国专利申请公开2004/0077537和国际专利申请公开WO 2003/079979中公开的方法、并以其中公开的剂量而施用本发明的构建体。在另一方面，患者可以通过如美国专利申请公开2005/0113286中公开的方法施用本发明的构建体。在又一方面，可以通过如美国专利申请公开2006/0019890中公开的方法为心脏重塑而治疗已经遭受心肌损伤的患者。

本发明的构建体也可以经皮施用，包括通过如美国专利申请公开2006/0034903中公开的装置和方法的送递系统。类似地，在其中公开的水凝胶制剂和固态制剂可以改进以与本发明的构建体一起使用。

治疗有效量。通常，施用至患者的本发明构建体的实际量将在相当宽泛的范围内变化，这取决于施用模式、使用的制剂和想要的反应。通过前述任何方法或本领域已知的任何其它方法而施用治疗用剂量，即足以产生想要的治疗作用的量。因此，治疗有效量包括足以诱导预期效果(具体包括抗高血压、抗心血管效果、抗肾脏效果和/或抗内分泌效果)的本发明构建体或药物组合物的量。在一个方面，治疗有效量是产生想要的钠尿排泄、利尿和/或血管舒张的量。

通常，本发明的构建体具有高度活性。例如，构建体可以按照约0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10或100μg/kg体重施用，这取决于所选的具体构建体、想要的治疗反应、施用途径、制剂和本领域技术人员已知的其它因素。

联合疗法

也可以和构思根据本发明数个实施方案的构建体与其它药物或药剂组合地使用，尤其在充血性心力衰竭的治疗中。

根据本发明的另一方面，提供用于治疗充血性心力衰竭的方法。所述方法包括向患有充血性心力衰竭的患者施用与治疗有效量的另一种化合物组合的治疗有效量的如本文中所公开的构建体，其中所述的化合物用于治疗充血性心力衰竭，或备选地用于延长本发明构建体在患者中的生物利用度。在一个方面，可以向患者施用与利尿药组合的本发明构建体，如借助美国专利申请公开2004/0063630中公开的方法和利尿药。可以组合使用的利尿药包括噻嗪类、髓袢利尿药和留钾利尿药，包括而不限于下列利尿药如氢氯噻嗪(Hydrodiuril

)、氯噻酮、呋塞米(Lasix

)、螺内酯(Aldactone

)和氨苯蝶啶(triamterine)。

在本发明的另一方面，通过施用与治疗有效量的抗高血压药而非利尿药组合的治疗有效量的如本文中所公开构建体，提供用于治疗充血性心力衰竭的方法。此类抗高血压药一般包括钙通道阻滞剂(包括二氢吡啶类和非二氢吡啶类)、抗交感神经药、非特异性肾上腺素能阻滞剂、α-肾上腺素能拮抗剂(包括非选择性和选择性α1-阻滞药)、β-阻滞剂(包括非选择性以及选择性阻滞剂和具有内在拟交感活性的那些阻滞剂)、血管扩张剂(用于治疗顽固性高血压和急症高血压)、血管紧张素转化酶抑制物和血管紧张素II拮抗剂。可以组合使用的抗高血压药包括混合的α和β拮抗剂如拉贝洛尔(Normodyne)；血管扩张剂如肼屈嗪(Apresoline

)、米诺地尔(Loniten)、硝普盐(Nipride

)或二氮嗪(Hyperstat IV

)；钙阻滞剂如硝苯地平(Adalat

)、地尔硫卓(Cardizem

)或维拉帕米(Calan)；交感神经阻滞药如可乐定(Catapres

)、甲基多巴(Aldomet

)、利血平(Serpasil

)或胍乙啶(Ismelin)；ACE抑制剂如卡托普利(Capoten

)、恩纳普利(Vasotec

)或赖诺普利(Prinivil

)；α-肾上腺素能拮抗剂如酚妥拉明(Regitine

)或哌唑嗪(Minipress

)；血管紧张素II拮抗剂如氯沙坦(Cozaar)；或β-肾上腺素能拮抗剂如普萘洛尔(Inderal

)、纳多洛尔(Corgard)、甲氧乙心安(Lopressor

)或吲哚洛尔。

其它说明

尽管本发明构建体的主要用途是治疗和改善充血性心力衰竭、急性肾衰竭及肾高血压的症状，然而本发明的构建体可以用于促钠尿排泄性化合物、利尿化合物和/或血管扩张化合物提供治疗益处的任何治疗方案或形式中。因此，在一个方面，本发明的构建体可以作为添加剂用于腹膜透析溶液，如美国专利5,965,533中公开。在另一方面，本发明的构建体可以用于眼科应用，如国际专利申请WO 00/18422中公开。

氨基酸替代物的合成方法

合成本发明氨基酸替代物的以下方法实例意图是示例性的，并将理解本领域技术人员可以对所述方法进行变化，并且这样的意图包括在本文中。

合成模拟无官能化R侧链的氨基酸的哌嗪酮支架(方法A和B)

构建体通过如方法A和B中描述的多种方法制备。

方法A：二肽(3)通过混合酐法，使用Boc-丝氨酸(OBn)-OH(1)和α-氨基酯(2)形成。该二肽以高产率获得并且通常无需纯化。使用乙硼烷-四氢呋喃还原甲基酯和酰胺基团，其中保护仲胺以产生二-Boc保护的氨基醇中间体(4)。用重铬酸吡啶鎓(PDC)氧化该醇并伴随环化而在一个步骤中产生哌嗪-2-酮(5)。通过氢化除去二苄醚，随后交换保护基团，产生Fmoc保护的哌嗪-2-酮(6)。最后，将伯醇通过众多不同方法(PDC、Jones氧化法、氯化钌-高碘酸钠法、2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧自由基(TEMPO)氧化法)中的任一种氧化成酸以产生终产物(7)。

方法A

2-(3-苄氧基-2-叔丁氧羰基氨基-丙酰氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(3)的合成：向保持在-20℃于氮气下的在30mL无水四氢呋喃中的10mmol Boc丝氨酸二苄醚(1)溶液添加22mmol三乙胺，随后缓慢添加11.4mmol氯甲酸异丁酯。白色固体析出。浆液搅拌15分钟，并且随后以一个份额添加11.1mmol α-氨基酯(2)。浆液在-20℃搅拌30分钟，并随后升温至室温，搅拌2小时，并随后浓缩至干燥。混合物随后在50mL乙酸乙酯/30mL 1N氢氯酸溶液之间分配。使各层分离，并且有机层用1×20mL 1N氢氯酸和1×20mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。化合物(3)通常以高于90％的产率获得，并且无需纯化。

双-Boc-2-取代-(2-氨基-3-苄氧基-丙基-氨基)-乙醇(4)的合成：向保持在室温于氮气下的在50mL无水四氢呋喃中的35mmol(3)溶液添加在四氢呋喃中的200mL 1N乙硼烷溶液。溶液在室温搅拌过夜，并且随后缓慢倾倒在200mL 1N氢氯酸的冰冷溶液上。双相溶液随后用固体氢氧化钠中和。添加140mL饱和碳酸氢钠溶液，随后添加70mmol二-叔丁基-二碳酸酯，并且将混合物在室温搅拌2日，用200mL乙酸乙酯稀释并使各层分离。有机层经硫酸镁干燥并浓缩。产物(4)通过硅胶柱层析法纯化。

1，4-二-Boc-6-苄氧基甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(5)的合成：70mmol(4)和在300mL无水二甲基甲酰胺中的400mmol重铬酸吡啶鎓的溶液在48℃于氮气下搅拌6小时，冷却至室温，倾倒至1500mL水中，并用4×500mL乙醚提取。将醚层合并、经硫酸镁干燥并浓缩。产物(5)通过硅胶柱层析法纯化。

4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成：19mmol(5)和在200mL乙醇中的2g 10％钯碳的混悬液在室温及常压下氢化过夜。混悬液经硅藻土过滤并浓缩。残余物重溶解在二氯甲烷中的40mL 50％三氟乙酸中。溶液在室温搅拌2小时，并且随后浓缩。残余物重溶解在60mL四氢呋喃/40mL水中，并用固体碳酸氢钠中和，随后添加40mmol固体碳酸氢钠以及20mmol芴甲氧羰酰氯。混合物随后在室温搅拌2小时，用300mL乙酸乙酯稀释，并使各层分离。有机层经硫酸镁干燥、浓缩并通过硅胶柱层析法纯化。

4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成：通过几种方法制备化合物(7)。

(a)向冷却至0℃的在180mL乙腈中的10mmol(6)、180mL四氯化碳和240mL水的双相溶液添加112mmol固体高碘酸钠，随后添加340mg氯化钌。使反应升温至室温，搅拌2小时并且随后经硅藻土过滤。使各层分离，并且水层用2×75mL乙酸乙酯再提取。将有机层合并，经硫酸镁干燥并浓缩。

(b)在48℃于氮气下搅拌在60mL无水二甲基甲酰胺中的12mmol(6)和59mmol PDC的溶液约5小时，冷却至室温并且倾倒在600mL水上，并用3×200mL二氯甲烷提取。将有机层合并，经硫酸镁干燥并浓缩。

(c)向在室温保持的在350mL丙酮中的17mmol(6)的溶液添加(从8.0g铬酸、17.4mL水和6.9mL浓硫酸中制备的)25mL Jones试剂。混合物搅拌1小时，添加150mL异丙醇并将混合物经硅藻土过滤。硅藻土用乙酸乙酯洗涤。将有机层合并及浓缩。残余物溶解在250mL乙酸乙酯中并用2×50mL水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。

(d)向在室温保持的在810mL乙腈中的81mmol醇(6)的溶液添加磷酸盐缓冲液(用7.2g磷酸二氢钠和14.3g磷酸氢二钠在295mL水中制备)，随后添加3.3g(20.7mmol)TEMPO和18.6g(164.4mmol)亚氯酸钠，并将双相溶液置于维持在43℃的油浴中，并且随后缓慢添加(通过混合19.3mL10-13％次氯酸钠溶液与24mL水所制备的)43.3mL(25.9mmol)次氯酸钠溶液。反应在43℃搅拌4小时。溶液冷却至室温，并添加200mL10％亚硫酸氢钠溶液，搅拌10分钟，用500mL乙酸乙酯稀释，并使各层分离。有机层用1×100mL盐水、1×160mL 1N氢氯酸溶液洗涤，经硫酸钠干燥，并浓缩。

产物(7)通过硅胶柱层析法纯化。

方法B：使用TEMPO/异氰尿酸试剂，将如方法A中所述而制备的中间体双-Boc-2-取代-(2-氨基-3-苄氧基-丙基-氨基)-乙醇(4)氧化成酸，并且随后用碘甲烷酯化以产生完全受保护的还原二肽类似物(8)。Boc基团和二苄醚的脱保护产生3-取代的5-羟甲基-哌嗪-2-酮，其被保护为Fmoc衍生物以产生(6)，后者被氧化成如方法A中所述的终产物。

方法B

二-Boc-(2-氨基-3-苄氧基-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(8)的合成：向保持在0℃的在680mL丙酮中的76mmol(4)和210mL饱和碳酸氢钠溶液的混悬液添加21mmol固体溴化钠和2.9mmol TEMPO，随后缓慢添加156mmol三氯异氰尿酸。反应在0℃搅拌30分钟，并且随后在室温过夜，用1N氢氯酸溶液酸化，并用2×300mL乙酸乙酯萃取。有机层用3x50mL的1N氢氯酸洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。残余物重溶解在40mL无水二甲基甲酰胺和95mmol固体碳酸氢钠中，并添加112mmol碘甲烷，并将混合物在室温于氮气下搅拌直至HPLC显示反应结束；溶液随后用200mL乙醚稀释，并用2×100mL水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。产物(8)通过硅胶柱层析法纯化。

4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成：将二氯甲烷中的40mL50％三氟乙酸中36mmol(8)的溶液在室温搅拌2小时，并且随后倾倒在200mL饱和碳酸氢钠溶液内。使各层分离，并且将有机层浓缩。残余物重溶解在100mL乙酸乙酯中，并用2×50mL水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。残余物溶解在100mL乙醇中，并且添加5g的10％钯碳和35mL的1N氢氯酸溶液，并将混合物在室温及常压下氢化直至HPLC显示反应结束；溶液随后经硅藻土过滤并浓缩。残余物重溶解在80mL乙酸乙酯中，添加在30mL水中的70mmol碳酸氢钠，并且混合物在室温搅拌过夜。除去乙酸乙酯并添加100mL四氢呋喃，随后添加178mmol固体碳酸氢钠和43mmol芴甲氧羰酰氯，并且将混合物搅拌直至HPLC显示反应结束，用300mL乙酸乙酯稀释，并使各层分离。有机层用2×50mL水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。产物(6)通过硅胶柱层析法纯化。

4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成：化合物(7)如方法A中所述那样制备。

用于制备适用于具有或没有官能化R侧链的化合物的哌嗪酮支架的一般常见合成方案(方法C、E、F)

方法C：(2-Fmoc-氨基-3-R′-O-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(10)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂，以α-氨基酯(2)使Fmoc O-保护的丝氨醛(9)还原氨化而制备。还原氨化所需要的Fmoc O-保护的丝氨醛(9)根据方法D通过用二-异丁基氢化铝还原酯(12)，通过用Dess-Martin高价碘化合物(periodinane)氧化Fmoc O-保护的丝氨醇(13)或通过用氢化锂铝还原Fmoc O-保护的丝氨酸Weinreb酰胺(14)而制备。用于制备Fmoc O-保护的丝氨醛(9)的优选方法是Weinreb酰胺类似物还原法。(2-Fmoc-氨基-3-R′-O-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(10)随后进行N和O脱保护、环化和Fmoc保护，以产生3-取代的6-羟甲基-哌嗪-2-酮(6)，后者随后氧化成如方法A中所述的终产物。

合成中所用在Fmoc-O-保护的丝氨醛(9)的羟基上的保护基团(R′)取决于氨基酯的侧链R的性质。当R不含官能团时，将Fmoc丝氨酸的侧链保护为^tBu醚。当R含有官能团时，将Fmoc丝氨酸的侧链保护为三苯甲基醚。

方法C

方法D

方法D：多种Fmoc-O-保护的丝氨醛(9)的合成。Fmoc-O-R′丝氨酸甲基酯(12)的合成：将保持在氮气下的在80mL无水二甲基甲酰胺中的80mmol Fmoc O-R′丝氨酸(11)、10.0g(120mmol)固体碳酸氢钠和10.0mL(160mmol)碘甲烷的轻度混悬液在室温搅拌过夜。反应混合物随后倾倒在500mL水上，并滤出固体。将该固体重溶解在800mL乙酸乙酯中，并用1×200mL水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。无需纯化.

R′	化合物(12)的分析数据
		^tBu	¹H NMR δ(CDCl₃)：1.14(s，9H，^tBu)，3.57-3.70(m，1H，CH₂-O)，3.75(s，3H，O-CH₃)，3.79-3.83(m，1H，CH₂-O)，4.01-4.50(一系列多重峰，4H)，5.64-5.68(d，1H，NH)，7.28-7.78(8H，富烯)，产率＝93％t_R＝7.8min.
Trt	¹H NMR δ(CDCl₃)：3.42-3.48(m，1H，CH₂-O)，3.59-3.66(m，1H，CH₂-O)，3.81(s，3H，CH₃-O)，4.10-4.18(m，1H，CH)，4.36-4.42(m，2H，CH₂-O)，4.50-4.57(m，1H，CH-N)，5.73-5.78(d，1H，NH)，7.22-7.82(8H，富烯)，产率＝定量，t_R＝9.04min.

Fmoc-O-R′丝氨醇(13)的合成：向保持在-20℃于氮气下的在50mL无水四氢呋喃中10.0mmol Fmoc O-R′丝氨酸(11)的溶液添加1.77mL(12.7mmol)三乙胺，随后缓慢添加1.57mL(12.0mmol)氯甲酸异丁酯。混合物搅拌30分钟，并且随后缓慢地倾倒在10mL水中的3.77g(99.6mmol)硼氢化钠的冰冷溶液上，维持温度低于5℃。反应在0℃搅拌15分钟，并且随后用1N氢氯酸溶液猝灭。反应混合物用100mL乙酸乙酯稀释，并使各层分离。有机层用2×25mL 1N氢氯酸溶液，2×25mL水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。化合物通过硅胶柱层析法纯化。

R′	化合物(13)的分析数据
		^tBu	¹H NMR δ(CDCl₃)：1.14(s，9H，^tBu)，2.90-2.95(d，1/2H，CH₂-O)，3.63(d，2H，CH₂-O)，3.65-3.93(m，3H，CH₂-O)，4.20-4.35(t，1H，CH)，4.35-4.45(d，2H，CH₂)，5.50-5.57(d，1H，NH)，7.26-7.8(8H，富烯)，产率＝85％，t_R＝6.42min.
Trt	¹H NMR δ(CDCl₃)：3.24-3.32(br.d，1H，CH₂-O)，3.30-3.45(br.m，1H，CH₂-O)，3.60-3.987(br.m，3H，CH₂-O，和CH-N)，4.13-4.22(br.m，1H，CH)，4.32-4.40(br.d，2H，CH₂)，5.24-5.32(br.d，1H，NH)，7.16-7.76(23H，富烯，和Trt)，产率＝92％，t_R＝8.39min.

Fmoc-O-R′丝氨酸Weinreb酰胺(14)的合成：80mL无水二氯甲烷中的20.2mmol Fmoc O-R′丝氨酸(11)、6.98g(21.6mmol)2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和2.5mL(22.7mmol)N-甲基-吗啉的混悬液在室温于氮气下搅拌20分钟，并且随后添加3.02g(31mmol)N，O-二-甲基-羟胺盐酸盐和3.3mL(30mmol)N-甲基-吗啉，并且该混悬液在室温搅拌过夜。将形成的溶液随后浓缩至干燥，在200mL乙酸乙酯与100mL水之间再分配，用2×40mL 1N氢氯酸溶液并且随后用2×40mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。无需纯化。

R′	化合物(14)的分析数据
		^tBu	¹H NMR δ(CDCl₃)：1.45(s，9H，^tBu)，3.30(s，3H，CH₃-N)，3.55-3.7(m，2H，CH₂-O)，3.76(s，3H，CH₃-O)，4.19-4.26(m，1H，CH)，4.30-4.38(m，2H，CH₂-O)，4.82-4.91(宽m，1H，CHN)，5.68-5.75(d，1H，NH)，7.2-7.8(8H，富烯)，产率＝定量，t_R＝6.59min.
Trt	¹H NMR δ(CDCl₃)：3.24(s，3H，CH₃N)，3.34-3.46(m 2H，CH₂O)，3.62(s，3H，CH₃O)，4.15-4.37(两个m，CH₂，CH)，4.86-4.98(m 1H，CHN)，5.80-5.86(d，1H，NH)，7.18-7.8(一系列m，23H，Trt和富烯)，产率＝定量，t_R＝8.0min.

从酯(12)合成Fmoc-O-R′丝氨醛(9)：向保持在-78℃于氮气下的在5mL四氢呋喃中的3.5mmol(12)的溶液缓慢添加10mL 1N二异丁基氢化铝(DIBAL)溶液，搅拌15分钟并通过缓慢添加酒石酸钾钠饱和溶液被猝灭。将反应升温至室温，用50mL乙酸乙酯稀释，并且添加50mL酒石酸钾钠饱和溶液。使各层分离，并且水层用1×50mL乙酸乙酯再萃取。将有机层合并，经硫酸镁干燥并浓缩。化合物(9)用于以下步骤中，无需进一步纯化。

R′	化合物(9)的分析数据
		^tBu	¹H NMR δ(CDCl₃)：1.16(s，9H，^tBu)，3.59-3.66(dd，1H，CH₂O)，3.90-3.98(dd，1H，CH₂O)，4.20-4.27(t，1H，CH)，4.32-4.45(两个m，3H，CHN，和CH₂O)，5.64-5.74(br.d，1H，NH)，7.28-7.35(m，2H，富烯)，7.36-7.44(m，2H，富烯)，7.58-7.65(d，2H，富烯)，7.73-7.78(d，2H，富烯)，9.62(s，1H，CHO).
Trt	¹H NMR δ(CDCl₃)：3.53-3.61(dd，1H，CH₂O)，3.66-3.75(dd，1H，CH₂O)，4.33-4.47(两个m，4H，CHN，CH，和CH₂)，5.66-5.75(d，1H，NH)，7.20-7.81(一系列m，23H，Trt，和富烯)，9.6(s，1H，CHO).

从醇(13)合成Fmoc-O-R′丝氨醛(9)：向保持在室温于氮气下的在200mL无水二氯甲烷中的80mmol Fmoc-O-R’丝氨醇(13)的溶液添加88mmolDess-Martin高价碘化合物，并且反应搅拌2.5小时并通过添加400mL 10％硫代硫酸钠水溶液被猝灭。使各层分离，并且将有机层浓缩，用300mL乙醚稀释并用含有10％硫代硫酸钠的饱和碳酸氢盐水溶液洗涤三次，经硫酸镁干燥并浓缩。

从Weinreb酰胺(14)合成Fmoc-O-R′丝氨醛(9)：向冷却至-78℃于氮气下的在60mL无水四氢呋喃中的8.8g(20.2mmol)粗制Fmoc-O-R′丝氨酸Weinreb酰胺中间体(14)的溶液添加四氢呋喃中的30mL 1N氢化锂铝溶液。将溶液搅拌15分钟并且随后通过缓慢添加30mL 1.4N硫酸氢钾溶液被猝灭。升温至室温后，滤除固体并浓缩滤液至干燥。残余物在50mL乙酸乙酯与25mL 1N氢氯酸溶液之间再分配。使各层分离，并且将有机层经硫酸镁干燥、过滤并浓缩。

(2-Fmoc-氨基-3-R′-O-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(10)的合成：化合物(10)使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂，通过还原氨化法制备。

氰基硼氢化钠法：向保持在室温于氮气下的在20mL甲醇中的8.5mmol(2)氢氯酸盐的溶液添加2.3mmol固体氢氧化钾，并将混合物搅拌25分钟。将10mL甲醇中的Fmoc-O-R′丝氨醛(9)溶液添加至上述混悬液中，并且将反应混合物搅拌1小时。缓慢添加在四氢呋喃中的8.5mL 1N氰基硼氢化钠溶液，并将反应搅拌另外1小时，过滤并浓缩。残余物在水与乙酸乙酯之间分配，并且有机层用1×20mL饱和碳酸氢钠洗涤，经硫酸钠干燥，并浓缩。

三乙酰氧基硼氢化钠法：21mmol(2)氢氯酸盐与在50mL无水四氢呋喃中的2.9mL(21mmol)三乙胺的混悬液在室温搅拌45分钟，并且随后添加在30mL四氢呋喃中的约20mmol粗制Fmoc-(O-R′)-丝氨醛(9)的溶液，随后添加1.7g的4A粉末状分子筛，并将此混悬液搅拌另外2小时。添加6.4g(30mmol)固体三乙酰氧基硼氢化钠并将此混悬液在室温搅拌过夜。混悬液用甲醇稀释，用分子筛过滤，并浓缩滤液。残余物在100mL乙酸乙酯与50mL水之间分配。有机层经硫酸钠干燥、过滤并浓缩。

化合物(10)通过硅胶柱层析法纯化。

4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成：为制备化合物(6)，需要三个步骤：(a)伴随环化的Fmoc脱保护、(b)Fmoc保护和(c)羟基脱保护。

除去Fmoc基团及环化：将乙酸乙酯溶液中30mL 30％二乙胺中的10mmol环状化合物的溶液在室温搅拌过夜并随后浓缩至干燥。

(a)Fmoc保护：向在20mL四氢呋喃和10mL水中的10mmol化合物的双相溶液添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠，随后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl。混合物搅拌3小时，用乙酸乙酯稀释，使各层分离，并且有机层用水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。

(b)羟基脱保护：对于含有^tBu醚保护基团的化合物：化合物用在二氯甲烷中的90％三氟乙酸的溶液脱保护1-2小时，并随后浓缩至干燥。残余物溶解在乙酸乙酯中并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥并随后浓缩。对于含有Trt醚保护基团的化合物：化合物通过添加在含有2-10％三异丙基硅烷的二氯甲烷中的1-10％三氟乙酸的溶液加以脱保护。反应是瞬时作用的。溶液随后通过倾入饱和碳酸氢钠溶液进行中和。使各层分离，经硫酸钠干燥，并浓缩。

化合物(6)通过硅胶柱层析法纯化。

4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成：化合物(7)如方法A中所述那样制备。化合物(7)通过硅胶柱层析法纯化。

方法E：(2-Fmoc-氨基-3-羟丙基-Cbz-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(15)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂，以α氨基酯(2)使Fmoc丝氨醛(OR′)(9)还原氨化而制备。仲胺用氯甲酸苄酯保护，并且随后羟基用三氟乙酸溶液脱保护。化合物(15)随后进行Fmoc脱保护。氨基酯中间体立即环化以形成4-Cbz-3-取代的6-羟甲基-哌嗪-2-酮(16)。Fmoc 3-取代的6-羟甲基-哌嗪-2-酮(6)通过保护基团交换而制备，并且随后被氧化成如方法A中所述的预期产物(7)。

方法E

(2-Fmoc-氨基-3-羟丙基-Cbz-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(15)的合成：67mmol氢氯酸氨基酯(2)和在80mL甲醇中的20.9mmol固体氢氧化钾的混悬液在室温搅拌25分钟，并且随后添加至在250mL甲醇中的(9)的混悬液内。反应混合物搅拌1.5小时，随后缓慢添加在四氢呋喃中的70mL 1N氰基硼氢化钠的溶液。反应搅拌过夜并且随后浓缩。残余物在300mL四氢呋喃与50mL 1N氢氯酸溶液之间分配。使各层分离，并且有机层用在50mL水中的239mmol碳酸氢钠的溶液中和，并且随后缓慢添加66mmol氯甲酸苄酯，并且将反应搅拌3小时，用200mL乙酸乙酯稀释并使各层分离。有机层经硫酸镁干燥并浓缩。残余物溶解在二氯甲烷中的三氟乙酸的溶液中并在室温搅拌2小时。将溶液倾倒在200mL饱和碳酸氢钠溶液上。使各层分离，并且有机层经硫酸镁干燥并浓缩。化合物(15)通过硅胶柱层析法纯化。

4-Cbz-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(16)的合成：在乙酸乙酯中的100mL30％二乙胺中的24mmol(15)的溶液在室温搅拌过夜，并随后浓缩至干燥。化合物通过硅胶柱层析法纯化。

4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成：将50mL乙醇中的15mmol(16)和1.8g 10％钯碳的混悬液在室温及常压下氢化，直至HPLC显示反应结束。混合物随后经硅藻土过滤，浓缩并且残余物溶解在35mL四氢呋喃和10mL水中，并且随后添加62mmol固体碳酸氢钠，随后添加16mmol Fmoc-Cl，并且将混合物搅拌3小时，用100mL乙酸乙酯和10mL水稀释。使各层分离，并且将有机层经硫酸镁干燥及浓缩。化合物(6)通过硅胶柱层析法纯化。

4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成：化合物(7)如方法A中所述那样制备并通过硅胶柱层析法纯化。

方法F：(2-Cbz-氨基-3-苄氧基-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(20)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂，以α-氨基酯(2)使Cbz丝氨醛(OBn)(19)还原氨化而制备。对于还原氨化所需要的Cbz O-苄基丝氨醛(19)通过用Dess-Martin高价碘化合物氧化Cbz丝氨醇(OBn)(18)而制备。(20)的氢化及随后环化产生了3-取代的6-羟甲基-哌嗪-2-酮，后者随后经Fmoc保护成为4-Fmoc-3-取代的6-羟甲基-哌嗪-2-酮(6)。终产物(7)如方法A中所述而获得。

方法F

Cbz-丝氨醇(OBn)(18)的合成：化合物(18)如对化合物(13)所述那样制备。化合物(18)在硅胶柱层析纯化后以79％产率获得。¹H NMR δ(CDCl₃)：3.57-3.74(两个m，3H，CHN，和CH₂O)，3.76-3.96(两个m，2H，CH₂O)，4.50(s，2H，CH₂O)，5.10(s，2H，CH₂O)，5.40-5.50((br.d，1H，NH)，7.22-7.38(m，10H，Ph)；HPLC t_R＝5.33min，(M⁺+Na⁺)＝337.64.

Cbz丝氨醛(OBn)(19)的合成：化合物(19)如对化合物(9)所述那样制备。向保持在室温于氮气下的在200mL无水二氯甲烷中的80mmol Cbz-O-Bn丝氨醇(18)的溶液添加88mmol Dess-Martin高价碘化合物，并且反应搅拌2.5小时，并随后通过添加400mL 10％硫代硫酸钠水溶液被猝灭。使各层分离，并且将有机层浓缩，用300mL乙稀释并用含有10％硫代硫酸钠的饱和碳酸氢盐水溶液洗涤三次，经硫酸镁干燥并浓缩。化合物(19)以99％粗产率获得并且无需进一步纯化即可使用。¹H NMR δ(CDCl₃)：3.69-3.78(dd，1H，CH₂O)，3.99-4.06(dd，1H，CH₂O)，4.37-4.46(m，1H，CHN)，4.47-4.52(d，2H，CH₂O)，5.14(s，2H，CH₂O)，5.65-5.75((间断的d，1H，NH)，7.14-7.48(一连串m，9H，Ph)，7.98-8.08(dd，1H，Ph)，9.63(s，1H，CHO)。

(2-Cbz-氨基-3-苄氧基-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(20)的合成：化合物(20)如对化合物(10)所述那样制备，不过使用Cbz丝氨醛(19)作为醛。化合物(20)通过硅胶柱层析法纯化。

4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成：将160mL乙醇中的38mmol(20)、38mL 1 N氢氯酸和20g10％钯碳的混悬液在室温及常压下氢化直至HPLC显示反应结束。混合物随后经硅藻土过滤并浓缩至干燥。残余物用75mL四氢呋喃稀释并用饱和碳酸氢钠溶液中和。添加106mmol固体碳酸氢钠和53mmol芴甲氧羰酰氯，并且反应在室温搅拌直至HPLC显示反应结束，用300mL乙酸乙酯和300mL盐水稀释。使各层分离，并且有机层用盐水洗涤两次，经硫酸镁干燥并浓缩。产物(6)通过硅胶柱层析法纯化。

模拟无官能化侧链的氨基酸的2，2-双取代哌嗪酮支架的合成(方法G)

使用方法G实施模拟无官能化侧链的氨基酸的4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸支架的合成。2-Boc-氨基-3-甲氧羰基-1-取代-甲基氨基-2-甲基-丙酸叔丁基酯(23)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂，以α-氨基酯(2)使2-Boc-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸甲基酯(22)还原氨化而制备。对于还原氨化所需要的化合物(22)通过用Dess-Martin高价碘化合物氧化α-甲基-Boc丝氨酸叔丁基酯(21)而获得。用二噁烷中的2N氯化氢除去(23)的Boc基团，并且将氨基酯环化成非保护的5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸叔丁基酯(24)，后者用芴甲氧羰酰氯保护以产生4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸叔丁基酯，其用三氟乙酸脱保护以产生终产物(25)。

方法G

2-Boc-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸叔丁基酯(22)的合成：Boc α-甲基丝氨酸叔丁基酯(21)的氧化使用如前所述的Dess-Martin高价碘化合物进行，以96％粗产率产生目的产物(22)。化合物用于以下步骤中，无需进一步纯化。¹H NMR δ(CDCl₃)：1.44(s，18H，^tBu)，1.46(s，3H，CH₃)，5.63-5.70(br.s，1H，NH)，9.5(s，1H，CHO)

2-Boc-氨基-3-甲氧羰基-1-取代-甲基氨基-2-甲基-丙酸叔丁基酯(23)的合成：使用与对化合物(10)所述方法相似的方法制备化合物(23)，不过使用化合物(22)作为醛。化合物(23)通过硅胶柱层析法纯化。

2-甲基-6-氧代-5-取代-哌嗪-2-羧酸(25)的合成：8mL二噁烷中的2N氯化氢的4mmol(23)的溶液在室温搅拌5小时，并随后浓缩至干燥。残余物在20mL四氢呋喃中悬浮，用10mmol三乙胺中和，并在60℃搅拌2日。随后将残余物浓缩至干燥，在20mL四氢呋喃和10mL水中重悬，添加固体碳酸氢钠以调节pH至碱性，随后添加5.6mmol固体芴甲氧羰酰氯，并将反应混合物在室温搅拌过夜，用1N氢氯酸溶液调节pH，用100mL乙酸乙酯稀释，并使各层分离。有机层用2×100mL盐水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。残余物溶解在二氯甲烷中的10mL50％三氟乙酸中，并且将溶液在室温搅拌3小时。浓缩溶剂并且产物(25)通过硅胶柱层析法纯化。

模拟具有官能化侧链的氨基酸的2，2-双取代哌嗪酮支架的合成(方法H)

使用方法H实施模拟具有官能化侧链的氨基酸的4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸支架的合成。2-烯丙氧羰基-氨基-3-甲氧羰基-1-取代-甲基氨基-2-甲基-丙酸甲基酯(30)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂，以α-氨基烯丙基酯(29)使2-烯丙氧羰基-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸甲基酯(28)还原氨化，随后用氯甲酸苄酯保护仲胺而制备。对于还原氨化所需要的化合物(28)通过用Dess-Martin高价碘化合物氧化(27)而获得。类似物(30)的烯丙基酯和烯丙氧羰基使用四(三苯膦)钯(0)予以除去，并且氨基酸通过与肽偶联试剂反应被环化以产生5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸甲基酯(31)。4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸(25)通过使甲基酯皂化，随后交换保护基团而获得。

方法H

烯丙氧羰基α-甲基丝氨酸甲基酯(27)的合成：将保持于氮气下的在8mL无水二甲基甲酰胺中的8mmol Boc α-甲基丝氨酸(26)、1.0g(12mmol)固体碳酸氢钠和1.0mL(16mmol)碘甲烷的溶液搅拌过夜。反应混合物随后倾倒在50mL水上并用50mL二乙醚萃取，并用1×20mL水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。残余物溶解在20mL二氯甲烷中的90％三氟乙酸中，并且溶液在室温搅拌3小时，并随后浓缩至干燥。残余物溶解在35mL四氢呋喃和10mL水中，随后添加30mmol固体碳酸氢钠，并且缓慢添加12mmol氯甲酸烯丙酯。混合物在室温搅拌2小时，用50mL乙酸乙酯稀释，并使各层分离。有机层随后用1×10mL饱和碳酸氢钠和1×10ml的1N氢氯酸和1×10mL水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。化合物(27)通过硅胶柱层析法纯化。

2-烯丙氧羰基-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸甲基酯(28)的合成：用如上所述的Dess-Martin高价碘化合物进行烯丙氧羰基α-甲基丝氨酸甲基酯(27)的氧化以产生目的产物(28)。

2-烯丙氧羰基-氨基-3-甲氧羰基-1-取代-甲基-Cbz-氨基-2-甲基-丙酸烯丙基酯(30)的合成：化合物(30)使用与对化合物(15)所述方法相似的方法而制备，不过使用化合物(28)作为醛。

4-Cbz-2-甲基-6-氧代-5-取代-哌嗪-2-羧酸甲基酯(31)的合成：向保持在室温于氮气下的在30mL二氯甲烷中的10mmol化合物(30)的溶液添加2当量苯基硅烷和0.3当量四(三苯基膦)钯(0)，并且溶液搅拌2小时，并随后添加11mmol TBTU和14mmol N-甲基-吗啉，并且溶液在室温搅拌2小时，并随后浓缩至干燥。

4-Fmoc-2-甲基-6-氧代-5-取代-哌嗪-2-羧酸(25)的合成：向保持在室温于氮气下的在25mL甲醇中的10mmol化合物(31)的溶液缓慢添加11mmol1N氢氧化钠溶液，并且反应在室温搅拌过夜，用21mL 1N氢氯酸溶液中和，添加1g 10％钯碳，并且混悬液在室温及常压下氢化3小时。混悬液经硅藻土过滤并浓缩。残余物重溶解在25mL四氢呋喃和10mL水中，随后添加30mmol固体碳酸氢钠和10mmol芴甲氧羰酰氯，并且反应在室温于氮气下搅拌2小时。随后将反应用50mL乙酸乙酯稀释并用1N氢氯酸溶液酸化。随后使各层分离并且有机层用1×20mL水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。化合物(25)通过硅胶柱层析法纯化。

(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸支架的合成(方法I、J、K)

通过几种方法实施(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸支架的合成

方法I：(叔丁基3-保护-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(35)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂，以α-氨基酯(2)使叔丁基3-保护-氨基-4-氧代-丁酸酯(34)还原氨化而制备。对于还原氨化所需要的叔丁基3-保护-氨基-4-氧代-丁酸酯(34)通过氢化锂铝(LAH)使Weinreb酰胺衍生物(33)还原而制备。叔丁基(3-保护-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯类似物(35)随后进行脱保护、环化和Fmoc保护以产生叔丁基(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸酯(36)，后者随后经脱保护以产生终产物(37)。

方法I

氨基保护的Asp-(O^tBu)Weinreb酰胺(33)的合成：化合物(33)使用与对化合物(14)所述方法相似的方法而制备。

R₂	化合物(33)的分析数据
		Cbz	¹H NMR δ(CDCl₃)：1.40(s，9H，^tBu)，2.47-2.59(dd，1H，CH₂CO)，3.20(s，3H，CH₂N)，3.77(s，3H，CH₃O)，4.96-5.05(br.m，1H，CHN)，5.05-5.12(br.d，2H，CH₂O)，5.58-5.66(br.d，1H，NH)，7.30-7.36(br.m，5H，Ph)，产率＝90％
Fmoc	¹H NMR δ(CDCl₃)：1.45(s，9H，^tBu)，2.55-2.64(dd，1H，CH₂CO)，2.69-2.80(dd，1H，CH₂O)，3.60(s，3H，CH₃N)，3.79(s，3H，CH₃O)，4.18-4.26(t，1H，CH)，4.32-4.40(d，2H，CH₂O)，4.98-5.19(m，1H，CHN)，5.70-5.76(br.d，1H，NH)，7.35-7.80(一系列m，8H，富烯)，产率＝定量

叔丁基3-氨基保护的-氨基-4-氧代-丁酸酯(34)的合成：化合物(34)使用与对化合物(9)所述方法相似的方法而制备。

R₂	化合物(34)的分析数据
		Cbz	¹H NMR δ(CDCl₃)：1.40(s，9H，^tBu)，2.69-2.81(dd，1H，CH₂CO)，2.89-3.01(dd，1H，CH₂CO)，4.33-4.42(m1H，CHN)，5.12(s，2H，CH₂O)，5.83-5.88(br.d，1H，NH)，7.31-7.39(br.m，5H，Ph)，9.64(s，1H，CHO)
Fmoc	¹H NMR δ(CDCl₃)：1.45(s，9H，^tBu)，2.58-3.02(一系列m，2H，CH₂CO)，4.20-4.28(t，1H，CH)，4.35-4.49(m，3H，CH₂O，和CHN)，5.85-5.92(br.d，1H，NH)，7.27-7.80(一系列m，8H，富烯)，9.65(s，1H，CHO)

叔丁基3-保护-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(35)的合成：化合物(35)使用与对化合物(10)所述方法相似的方法而制备，不过使用化合物(34)作为醛。

叔丁基(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸酯(36)的合成：对于含有Fmoc氨基保护基团的化合物，将乙酸乙酯溶液中的在30mL30％二乙胺中的10mmol化合物(35)的溶液在室温搅拌过夜，并随后浓缩至干燥。对于含有Cbz氨基保护基团的化合物，将30mL乙醇中的10mmol化合物(35)的溶液在室温及常压下氢化2小时，经硅藻土过滤并浓缩至干燥。为进行Fmoc保护，残余物溶解在20mL四氢呋喃中和10mL水中并添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠，随后添加3.3g(13mmol)Fmoc-Cl。将混合物搅拌3小时并用乙酸乙酯稀释。使各层分离并且有机层用水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。化合物(36)通过硅胶柱层析法纯化。

(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸酯(37)的合成：对化合物(36)用二氯甲烷中的90％三氟乙酸溶液脱保护持续3小时，并随后浓缩至干燥。终产物(37)通过硅胶柱层析法纯化。

方法J：二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(41)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂，以α-氨基酯(2)使二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-氧代-丁酸酯(40)还原氨化而制备。对于还原氨化所需要的二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-氧代-丁酸酯(40)通过氢化锂铝还原Weinreb酰胺衍生物(39)而制备，其中Weinreb酰胺衍生物(39)通过在Mitsunobu条件下保护β-酯而从市售的Fmoc-天冬氨酸α-烯丙基酯衍生物(38)形成。使用钯(0)催化剂除去烯丙基酯，随后使用TBTU作为偶联剂形成Weinreb酰胺。随后二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(41)经Fmoc脱保护、环化、通过氢化除去二苯基甲基酯，随后进行Fmoc保护以产生终产物(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸(37)。

方法J

Fmoc-Asp-(OCHPh₂)Weinreb酰胺(39)的合成：向保持在0℃于氮气下的30mL无水四氢呋喃中的5.1g(13.0mmol)Fmoc-天冬氨酸α-烯丙基酯(38)的溶液缓慢添加2.6mL(13.4mmol)偶氮二甲酸二异丙酯，其中所述的溶液含有3.4g(13mmol)三苯基膦和2.41g(13.1mmol)二苯基甲醇。撤去冰浴，并且反应在室温搅拌过夜，浓缩至干燥并且随后通过硅胶柱层析法纯化。¹H NMR δ(CDCl₃)：2.96-3.06(dd，1H，CH₂CO)，3.15-3.26(dd，1H，CH₂CO)，4.18-4.76(一系列m，3H，CH，CH₂)，5.14-5.32(m，1H，CHN)，5.76-5.86(m，1H，CHO)，7.20-7.80(一系列m，18H，富烯，和Ph)；HPLC t_R＝7.68min，(M⁺+Na⁺)＝583.90。

该产物(9.8mmol)随后溶解在含有1.5g(1.3mmol)四(三苯基膦)钯(0)的40mL二氯甲烷:乙酸:N-甲基吗啉37:2:1的溶液中，并且溶液在室温搅拌过夜，浓缩至干燥并在100mL乙酸乙酯和30mL水之间分配。使各层分离，并且有机层用1×50mL水洗涤，经硫酸钠干燥，并浓缩。残余物悬浮在20mL无水二氯甲烷中，并添加1.65mL(15mmol)N-甲基吗啉和4.07g(12.7mmol)TBTU，并且混悬液在室温搅拌20分钟，随后添加1.65mL(15mmol)N-甲基吗啉和1.52g(15.6mmol)N，O-二甲基羟胺氢氯酸盐。混悬液在室温搅拌2小时，浓缩，在100mL乙酸乙酯与50mL水之间分配。有机层用1×30mL水、1×30mL饱和碳酸氢钠溶液和1×30mL1N氢氯酸溶液洗涤，经硫酸钠干燥，并浓缩。产物通过硅胶柱层析法纯化。¹H NMR δ(CDCl₃)：2.76-2.88(dd，1H，CH₂CO)，2.89-3.00(dd，1H，CH₂CO)，3.16(s，3H，CH₃N)，3.70(s，3H，CH₃O)，4.14-4.22(dd，1H，CH)，4.28-4.40(t，2H，CH₂)，5.07-5.16(dd，1H，CHN)，5.69-5.76(d，1H，CHO)，7.24-7.8(一系列m，18H，富烯，和Ph)；HPLC t_R＝7.08，(M⁺+Na⁺)＝587.03。

二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-氧代-丁酸酯(40)的合成：化合物(40)使用与对化合物(9)所述方法相似的方法而制备。

二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(41)的合成：化合物(41)使用与对化合物(10)所述方法相似的方法而制备，不过使用化合物(40)作为醛.

(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸(37)的合成：将30mL乙酸乙酯中的30％二乙胺中的10mmol化合物(41)的溶液在室温搅拌3小时。该溶液随后浓缩至干燥，重溶解在2×30mL乙酸乙酯中并再浓缩。残余物溶解在50mL乙醇和20mL 1N氢氯酸溶液中，并且在室温及常压下氢化过夜，经硅藻土过滤并浓缩至干燥。残余物溶解在20mL四氢呋喃和10mL水中，并添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠，随后添加3.3g(13mmol)Fmoc-Cl。混合物搅拌3小时，用100mL乙酸乙酯稀释，使层分离并且有机层用2×50mL水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。产物通过硅胶柱层析法纯化。

方法K：从市售Fmoc-天冬氨酸α叔丁基酯(42)开始进行(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸支架的合成。Fmoc-天冬氨酸α叔丁基酯通过混合酐用硼氢化钠还原成Fmoc-高丝氨酸α叔丁基酯，随后用溴化苄保护醇，以产生Fmoc-高丝氨酸二苄醚α叔丁基酯(43)。随后用三氟乙酸除去叔丁基酯，并且将酸用硼氢化钠通过混合酐法还原成醇，以产生2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-1-丁醇(44)。醇(44)随后使用如前所述的Dess-Martin高价碘化合物转化成2-Fmoc-氨基-4-苄氧基丁醛(45)。2-Fmoc-氨基-4-苄氧基丁醛(45)和α-氨基酯(2)的还原氨化产生了(2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-丁基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(46)。用二乙胺的Fmoc脱保护产生了自发环化成6-苄氧乙基-3-取代-哌嗪-2-酮的游离伯胺。通过氢化作用除去二苄醚，并且将仲胺作为其Fmoc衍生物加以保护，以产生4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(47)。最后，将伯醇氧化成酸，以如方法A中所述产生终产物(48)。

方法K

Fmoc-高丝氨酸(OBn)α叔丁基酯(43)的合成：向保持在-20℃于氮气下的在50mL无水四氢呋喃中的10.0mmol Fmoc Asp-O^tBu(42)的溶液添加1.77mL(12.7mmol)三乙胺，随后缓慢添加1.57mL(12.0mmol)氯甲酸异丁酯。将混合物搅拌30分钟并且随后缓慢倾倒在10mL水中的3.77g(99.6mmol)硼氢化钠的冰冷溶液上，维持温度低于5℃。反应在0℃搅拌15分钟，并且随后用1N氢氯酸溶液猝灭。反应混合物用100mL乙酸乙酯稀释并使各层分离。有机层用2×25mL 1N氢氯酸溶液，2×25mL水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩，并且通过硅胶柱层析法纯化。纯化的化合物随后溶解在30mL四氢呋喃中，并添加在矿物油中的12mmol 60％氢化钠分散体，随后添加0.2mmol四丁基碘化铵和12mmol溴化苄，并且混合物搅拌过夜，用50mL饱和碳酸氢钠水溶液猝灭，并用100mL乙酸乙酯萃取。化合物随后通过硅胶柱层析法纯化。

2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-1-丁醇(44)的合成：如对方法I中化合物(37)所述，使用90％三氟乙酸对叔丁基酯脱保护，随后将酸如对化合物(13)所述通过混合酐中间体用硼氢化钠还原成所述醇。

2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-丁醛(45)的合成：如对(9)合成所述，使用Dess-Martin高价碘化合物将2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-1-丁醇(44)氧化成所述醛。

(2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-丁基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(46)的合成：如对(10)合成所述，使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂，以α-氨基酯(2)使2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-丁醛(45)还原氨化。

4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(47)的合成：以伴随环化对(2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-丁基氨基)-2-取代乙酸甲基酯(46)进行Fmoc脱保护，随后如对方法J中化合物(37)所述进行去苄化作用和Fmoc再保护。

4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基-乙酸(37)的合成：如方法A中所述将4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(47)氧化成所述的酸。所用酸的选择基于5-位的基团的性质。

2-取代的3-氧代-[1，4]-二氮杂卓-5-羧酸支架的合成(方法L、M、N)

使用几种方法进行2-取代的3-氧代-[1，4]-二氮杂卓-5-羧酸支架的合成。

方法L：叔丁基2-Cbz-氨基-4-(苄氧羰基-取代-甲基-Boc氨基)-丁酸酯(52)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂，以氨基酯(51)使叔丁基Cbz-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(50)还原氨化，随后进行仲胺的Boc保护而制备。对于还原氨化所需要的叔丁基Cbz-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(50)通过氢化锂铝还原Weinreb酰胺衍生物(49)而制备。二氮杂卓环通过除去保护基团形成，随后与肽形成试剂环化以产生(53)。最后，4-Fmoc-2-取代的3-氧代-[1，4]-二氮杂卓-5-羧酸(54)通过保护基团交换而形成。

方法L

Cbz-Asp-(Weinreb酰胺)-O^tBu(49)的合成：化合物(49)使用与对化合物(14)所述方法相似的方法而制备。

叔丁基3-Cbz-氨基-4-氧代-丁酸酯(50)的合成：化合物(50)使用与对化合物(9)所述方法相似的方法而制备。

叔丁基2-Cbz-氨基-4-(苄氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(52)的合成：还原氨化用与对化合物(10)所述方法相似的方法进行。仲胺通过粗制混合物与在四氢呋喃中的2当量Boc二碳酸酯反应而得以保护。

叔丁基1-Boc2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮杂卓-5-羧酸酯(53)的合成：30mL乙醇中的10mmol化合物(52)的溶液在室温及常压下氢化2小时，经硅藻土过滤并浓缩至干燥。残余物溶解在100mL二氯甲烷和1.2当量TBTU中并且添加2.6当量N-甲基-吗啉。溶液在室温搅拌过夜，并且随后浓缩。残余物在50mL乙酸乙酯与25mL 1N氢氯酸溶液之间分配，用1×20mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。

1-Fmoc 2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮杂卓-5-羧酸(54)的合成：在二氯甲烷中的10mL90％三氟乙酸中的10mmol化合物(53)的溶液在室温搅拌2小时，并且随后将溶液浓缩至干燥。残余物溶解在20mL四氢呋喃和10mL水中，并且添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠，随后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl。将混合物搅拌3小时并且随后用乙酸乙酯稀释。使各层分离，并且有机层用2×50mL水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。

方法M：还原的二肽类似物(60)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂，以氨基酯(29)使二苯基甲基烯丙氧羰基-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(59)还原氨化，随后进行仲胺的Cbz保护而制备。对于还原氨化所需要的二苯基甲基烯丙氧羰基-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(59)通过氢化锂铝还原Weinreb酰胺衍生物(58)而制备，其中Weinreb酰胺衍生物(58)通过Weinreb酰胺衍生物(57)的保护基团交换而制备。二氮杂卓环随后通过除去烯丙基和烯丙氧羰基，随后在肽形成试剂存在下的环闭合而形成。2-取代的3-氧代-[1，4]-二氮杂卓-5-羧酸支架(54)通过保护基团交换而形成。

方法M

Fmoc-Asp-(Weinreb酰胺)-CHPh₂(57)的合成：化合物(57)使用与对化合物(39)所述方法相似的方法而制备。

烯丙氧羰基-Asp-(Weinreb酰胺)-OCHPh₂(58)的合成：将乙酸乙酯中的20mL 30％二乙胺中的10mmol化合物(56)的溶液搅拌2小时并浓缩至干燥。残余物溶解在20mL四氢呋喃和10mL水中，并添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠，随后添加13mmol烯丙氧羰基-Cl。混合物搅拌3小时，并且随后用乙酸乙酯稀释。使各层分离，并且有机层用水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。化合物(58)通过硅胶柱层析法纯化。

二苯基甲基3-烯丙氧羰基-氨基-4-氧代-丁酸酯(59)的合成：化合物(59)使用与对化合物(9)所述方法相似的方法而制备。

二苯基甲基2-烯丙氧羰基-氨基-4-(烯丙氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(60)的合成：化合物(60)通过还原氨化，使用与对化合物(15)所述方法相似的方法而制备，不过使用化合物(59)作为醛。产物通过硅胶柱层析法纯化。

二苯基甲基1-Cbz 2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮杂卓-5-羧酸酯(61)的合成：向保持在室温于氮气下的在30mL二氯甲烷中的10mmol化合物(60)的溶液添加2当量苯基硅烷和0.3当量四(三苯基膦)钯(0)，并且溶液搅拌2小时，并且随后添加1.2当量TBTU和1.3当量N-甲基-吗啉。溶液在室温搅拌过夜并浓缩。残余物在50mL乙酸乙酯与25mL 1N氢氯酸溶液之间分配，用1×20mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。

1-Fmoc 2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮杂卓-5-羧酸(54)的合成：30mL乙醇中的10mmol化合物(61)的溶液在室温氢化2小时，经硅藻土过滤，并随后将溶液浓缩至干燥。残余物溶解在20mL四氢呋喃和10mL水中，并添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠，随后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl。混合物搅拌3小时并随后用乙酸乙酯稀释。使各层分离并且有机层用水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。

方法N：Fmoc-天冬氨酸β叔丁基酯通过混合酐用硼氢化钠还原成Fmoc-天冬氨醇(Aspartanol)β叔丁基酯(63)，随后用烯丙基溴保护该醇以产生Fmoc-天冬氨醇烯丙基醚β叔丁基酯(64)。随后用三氟乙酸除去叔丁基酯，并将该酸用硼氢化钠通过混合酐法还原成醇以产生3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-1-丁醇(65)。醇(65)随后使用如前所述的Dess-Martin高价碘化合物转化成3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基丁醛(66)。将3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基丁醛(66)和α氨基酯(51)还原氨化，随后在仲胺上进行烯丙氧羰基保护，产生(3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁基-烯丙氧羰基-氨基)-2-取代的乙酸苄基酯(67)。烯丙氧羰基7-烯丙氧基甲基-3-取代-[1，4]-二氮杂卓-2-酮(68)通过苄基酯的皂化，随后用二乙胺进行Fmoc脱保护以产生游离伯胺而形成，其中所述的游离伯胺使用肽形成试剂如TBTU而环化。终产物(54)通过保护基团交换而形成：通过钯(0)除去烯丙基醚和烯丙氧羰基并且将仲胺作为其Fmoc衍生物加以保护，以产生4-Fmoc-7-苄氧基甲基-3-取代-[1，4]-二氮杂卓-2-酮，随后使伯醇氧化成酸以产生终产物(54)。所用氧化剂的选择基于2-位的基团的性质。

方法N

Fmoc-天冬氨醇β叔丁基酯(63)的合成：使用Fmoc-天冬氨酸β叔丁基酯(62)作为起始材料，如对化合物(13)的合成所述而制备化合物(63)。

3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁酸叔丁基酯(64)的合成：向保持在室温于氮气下的在30mL四氢呋喃中的10mmol(63)的溶液添加在矿物油中的12mmol60％氢化钠分散体、2mmol四丁基碘化铵和13mmol烯丙基溴，并且混合物搅拌过夜，用10mL饱和碳酸氢钠水溶液猝灭并用50mL乙酸乙酯萃取。

3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-1-丁醇(65)的合成：化合物(65)如对化合物(44)的合成所述而制备。

3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁醛(66)的合成：如对(9)的合成所述，使用Dess-Martin高价碘化合物将3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-1-丁醇(65)氧化成醛。

(3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁基-烯丙氧羰基-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(67)的合成：如对化合物(15)所述，使用如对化合物(10)所述的氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂，以α-氨基酯(51)使3-Fmoc-氨基-4-苄氧基-丁醛(66)还原氨化，随后将仲胺保护为烯丙氧羰基衍生物，不过使用氯甲酸烯丙酯代替氯甲酸苄酯。

4-烯丙氧羰基-7-烯丙氧基甲基-3-取代-[1，4]-二氮杂卓-2-酮(68)的合成：将10mmol(3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁基-烯丙氧羰基-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(67)、在20mL甲醇中的20mmol碳酸钾和10mL水的溶液在室温搅拌3小时，用21mL 1N氢氯酸溶液中和，并随后浓缩至干燥。残余物溶解在乙酸乙酯中的20mL 30％二乙胺中并搅拌3小时，并且随后浓缩至干燥。残余物溶解在100mL二氯甲烷中，并且添加12mmol TBTU和24mmol N-甲基吗啉，并且溶液在室温搅拌过夜，并随后浓缩至干燥。残余物在30mL乙酸乙酯与30mL 1N氢氯酸溶液之间分配，并且随后使层分离。有机层用30mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥并通过硅胶柱层析法纯化。

4-Fmoc-2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮杂卓-5-羧酸(54)的合成：向保持在室温于氮气下的在30mL二氯甲烷中的10mmol化合物(68)的溶液添加2当量苯基硅烷和0.3当量四(三苯基膦)钯(0)，并且溶液随后搅拌2小时，并浓缩至干燥。仲胺溶解在20mL四氢呋喃和10mL水中，随后添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠和1.2当量Fmoc-Cl，并且双相溶液在室温搅拌2小时，用30mL乙酸乙酯稀释，并使各层分离。将4-Fmoc-7-羟甲基-3-取代-[1，4]-二氮杂卓-2-酮如方法A中所述氧化成终产物(54)。所用氧化剂的选择基于2-位的基团的性质，如方法A中对(6)转化成(7)那样。

6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸支架的合成(方法O)

如方法O中概述，合成含有6-位非官能化侧链的6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸支架，从使用Dess-Martin高价碘化合物氧化成酮(70)的市售3-Fmoc-氨基-1，2-丙二醇1-氯-三苯甲基树脂(69)开始而进行。以氨基酯(2)对酮(70)的还原氨化产生了结合树脂的(1-氨基甲基-2-氯-三苯甲基氧-乙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(71)，后者在胺的脱保护后环化成5-氯三苯甲基氧甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(72)。仲胺受到再保护，随后从树脂上切下，产生Fmoc-5-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(73)，后者使用方法A中所述的两种方法之一而氧化成6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸(74)。

方法O

1-氨基-3-氯三苯甲基氧-2-丙酮(70)的合成：结合树脂的醇(69)的氧化通过三氧化硫氧化、NMO/TPAP(N-甲基吗啉-N-氧化物/高铼酸四丙基铵)氧化或PDC氧化而进行。对于三氧化硫氧化，使用与Parikh，J.R.和Doering，W.V.，J.Am.Chem.Soc.89：5505-5507(1967)中所述方法相似的方法。对于NMO/TPAP氧化，向0.3mmol结合树脂的醇添加在10mL无水二甲基甲酰胺中的3mmol N-甲基吗啉N-氧化物的溶液，并且随后将0.06mmol高铼酸四丙基铵(TPAP)添加至树脂混悬液中。反应振摇80分钟。排干溶剂，将树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤并且随后在真空下干燥。对于PDC氧化，将二甲基甲酰胺中的0.2M重铬酸吡啶鎓中的结合树脂的醇的混悬液在37℃振摇4小时，排干溶剂并且将树脂用二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二氯甲烷洗涤。

(1-氨基甲基-2-氯-三苯甲基氧-乙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(71)的合成：用氨基酯对结合树脂的酮(70)的还原氨化通过两种不同方法之一进行。在一种方法中，向二甲基甲酰胺中的20mL1％乙酸中的2.6mmol α氨基酯(2)的溶液添加2.6mmol三乙酰氧基硼氢化钠，随后立即添加0.5mmol酮衍生化树脂(70)，并且混合物振摇60分钟，用甲醇、10％二异丙基乙胺、二甲基甲酰胺和甲醇漂洗。在第二种方法中，将含有0.05M氰基硼氢化钠的甲醇中的0.05mmol酮衍生化树脂(70)和2.0M氢氯酸α氨基酯(2)的混悬液在室温振摇5小时，排干并洗涤。

5-氯三苯甲基氧甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(72)的合成：将二甲基甲酰胺中的10mL 20％哌啶中的0.05mmol树脂的混悬液在室温振摇2小时。

Fmoc-5-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(73)的合成：将含有0.25mmolFmoc-Cl和0.25mmol三乙胺的10mL二氯甲烷中的0.05mmol(72)的混悬液在室温搅拌6小时，排干并用二氯甲烷洗涤。树脂重悬在二氯甲烷中的10mL 95％三氟乙酸中，并将混悬液振摇2小时过滤，并浓缩滤液。

Fmoc-6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸(74)的合成：将(73)氧化成目的产物通过对方法A所述的任何方法进行。

α，α-双取代氨基酸的合成(方法P和Q)

在某些本发明的构建体中，可以并构思利用双取代氨基酸残基，如其中取代基相同或不同的α，α-双取代氨基酸。在一个方面，在Aaa¹或Aaa⁸位置利用α，α-双取代氨基酸，其中α，α-双取代氨基酸的至少一个侧链是Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Nva、Met(O)或Met(O₂)的侧链。以下合成方法P和Q描述α，α-二-正丁基甘氨酸(2-氨基-2-丁基-己酸)的产生，其中每个侧链是-(CH₂)₃-CH₃，并且因此每个侧链与Nle的侧链相同。然而，将理解的是相似方法和方案可以用于其中取代基相同或不同的其它α，α-双取代氨基酸的产生中。此外，产生α，α-双取代氨基酸的任何方法可以用于本发明的实施中，并且本发明的实施不限于以下合成方案的方法。因此，用于合成α，α-双取代氨基酸的本领域已知任何方法可以用于本发明的实施中。下文教授用于产生α，α-双取代氨基酸的替代方法：Clark J.S.和Middleton M.D.：Synthesis of novel alpha-substituted and alpha，alpha-disubstituted amino acidsby rearrangement of ammonium ylides generated from metal carbenoids.Org.Lett.4(5)：765-8(2002)；Guino M.，Hii K.K.：Wang-aldehyde resin as arecyclable support for the synthesis of alpha，alpha-disubstituted amino acidderivatives.Org Biomol.Chem.3(17)：3188-93(2005)和Kotha S.，Behera M.：Synthesis and modification of dibenzylglycine derivatives via theSuzuki-Miyaura cross-coupling reaction.J.Pept.Res.64(2)72-85(2004)。

方法P

苯甲酰二-正丁基甘氨酸(80)的合成：向保持在0℃于氮气下的在20mL二氯甲烷中的10mmol苯甲酰甘氨酸(75)的溶液缓慢添加12mmol N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)，并且反应搅拌2小时以产生化合物(76)。滤除固体并浓缩滤液。残余物溶解在15mL四氢呋喃中，冷却至0℃，并且随后添加24mmol氢化钠，随后添加30mmol正丁基溴。混悬液在0℃搅拌2小时，并且随后升温至室温，并将溶液浓缩至干燥以产生化合物(77)。或者，除使用12mmol氢化钠和15mmol正丁基溴之外，化合物(77)也可以按照相似方式从苯甲酰正亮氨酸(78)制备。化合物(77)溶解在甲醇中，添加50mL 1N氢氯酸溶液，并且将此溶液搅拌2小时并浓缩。化合物(80)通过硅胶柱层析法纯化。

Fmoc二-正丁基甘氨酸(81)的合成：10mmol化合物(80)溶解在30mL二噁烷中，并添加10mL 6N氢氯酸溶液，并使溶液回流过夜。将反应冷却至室温、浓缩至干燥，重溶解在30mL四氢呋喃中，并添加10mL水和30mmol碳酸氢钠，随后添加15mmol Fmoc-Cl。搅拌双相溶液1小时并且在真空下除去四氢呋喃。水溶液用1×50mL二乙醚提取，用1N氢氯酸溶液酸化，并用2×50mL乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯层合并，经硫酸钠干燥，并浓缩。化合物(81)通过硅胶柱层析法纯化。

相似的方法可以通过始自(与化合物78相似的)任何适宜的氨基酸衍生物而使用，并且通过使用适宜的烷基丁基、芳基丁基或芳烷基丁基试剂，该方案将产生其中R和R′不同的多种双取代(R，R′)氨基酸替代物。

方法Q

Fmoc-α，α二-正丁基甘氨酸(87)的合成：向室温下保持的40mL无水四氢呋喃中的20mmol甘氨酸甲基酯氢氯化物(82)和2g粉末状分子筛的混悬液添加24mmol氢氧化钾，随后添加22mmol苯甲醛。混悬液搅拌2小时，过滤，并浓缩滤液。残余物重溶解在40mL无水甲苯中，并且随后添加至在甲苯中的60mmol氢化钠的混悬液内，随后添加60mmol正丁基溴。混悬液搅拌12小时，随后添加30mL 6N氢氯酸溶液，在室温搅拌2小时，并且随后使层分离。因此获得的(84)的氢氯酸盐原位地用于制备(87)。为分离作为氢氯酸盐的(84)，将水层浓缩至干燥，并使产物从无水甲醇-醚中结晶。

或者，化合物(84)可以使用相似的合成方法从正亮氨酸甲基酯氢氯化物制备，除了30mmol氢化钠和30mmol正丁基溴用于将(86)转化成(84)。

将如上文获得的化合物(84)的氢氯酸化物形式的水性混合物加热至回流1小时并且随后冷却至室温。该混合物用固体氢氧化钠中和，并且随后用30mL四氢呋喃稀释。添加碳酸氢钠(30mmol)，随后添加15mmolFmoc-Cl。将双相溶液搅拌1小时，并将四氢呋喃在真空下除去。水溶液用1×50mL二乙醚提取，用1N氢氯酸溶液酸化，并用2×50mL乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯层合并，经硫酸钠干燥，并浓缩。化合物(87)通过硅胶柱层析法纯化。

相似的方法可以通过始自(与化合物85相似的)任何适宜的氨基酸衍生物而使用，并且通过使用适宜的烷基丁基、芳基丁基或芳烷基丁基试剂，该方案将产生其中R和R′不同的多种双取代(R，R′)氨基酸替代物。

双取代(R，R′)支架的合成(方法R)

本发明还提供其中使用具有两种R基团即R和R′的氨基酸替代物的构建体。以下方法描述Fmoc保护的(R)-5，5-二丁基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸的合成，其中R和R′分别是对应于正亮氨酸侧链部分的基团。可以明白下文方法可以部分基于前述方法加以调整以产生相似的双取代(R，R′)氨基酸替代物。相似的方法可以通过始自(与化合物84相似的)任何适宜的氨基酸衍生物而使用，该方案将产生其中R和R′不同的多种双取代(R，R′)氨基酸替代物。

方法R

(2-Fmoc-氨基-3-叔丁氧基-丙基氨基)-2，2，二-正丁基乙酸甲基酯(88)的合成：21mmol(84，方案Q)和50mL无水四氢呋喃中的2.9mL(21mmol)三乙胺的混悬液在室温搅拌45分钟，并且随后添加30mL四氢呋喃中的约20mmol粗制Fmoc-(O-叔丁基)-丝氨醛(9，方案D)的溶液，随后添加1.7g的4

粉末状分子筛，并且混悬液搅拌额外2小时。添加6.4g(30mmol)固态三乙酰氧基硼氢化钠，并且混悬液在室温搅拌过夜。混悬液用甲醇稀释，滤除分子筛，并浓缩滤液。残余物在100mL乙酸乙酯与50mL水之间分配。有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。化合物(88)通过硅胶柱层析法纯化。

4-Fmoc-6-羟甲基-3，3-二-正丁基-哌嗪-2-酮(89)的合成：在乙酸乙酯中的30mL30％二乙胺内的10mmol化合物(88)的溶液在室温搅拌过夜，并随后浓缩至干燥。残余物溶解在20mL四氢呋喃和10mL水中，添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠，随后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl。将混合物搅拌3小时，用50mL乙酸乙酯稀释，使各层分离，并且有机层用30mL水洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。粗制混合物溶解在二氯甲烷中的10mL 90％三氟乙酸溶液中，搅拌2小时，并随后浓缩至干燥。残余物在乙酸乙酯溶解中并用50mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。化合物(89)通过硅胶柱层析法纯化。

4-Fmoc-5，5-二-正丁基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(90)的合成：向在室温保持的在81mL乙腈中的8mmol醇(89)的溶液添加磷酸盐缓冲液(用0.72g磷酸二氢钠和1.43g磷酸氢二钠在29.5mL水中制备)，随后添加0.33g(2.1mmol)TEMPO及1.86g(16.5mmol)亚氯酸钠，并将双相溶液置于维持在43℃的油浴中。缓慢添加(通过混合1.9mL 10-13％次氯酸钠溶液与2.4mL水而制备的)4.3mL(2.6mmol)次氯酸钠溶液。反应在43℃搅拌4小时，冷却至室温，添加20mL 10％亚硫酸氢钠，搅拌10分钟，用50mL乙酸乙酯稀释，并使各层分离。有机层用1×10mL盐水、1×10mL 1N氢氯酸溶液洗涤，经硫酸钠干燥，并浓缩。化合物(90)通过硅胶柱层析法纯化。

本发明构建体的合成

如本发明几个实施方案中公开的构建体可以通过用于形成氨基酸之间肽键的任何已知常规方法而容易地合成。此类常规方法包括例如任何液相方法，其中所述的液相方法允许其羧基或其它反应基受保护的氨基酸残基的游离α氨基与其羧基或其它反应基受保护的另一种氨基酸残基的游离伯羧基之间缩合。在优选的常规方法中，本发明的构建体可以通过固相合成法合成并根据本领域的已知方法纯化。本发明的氨基酸替代物可以通过与对于残基所用方法基本上相似或相同的方法而掺入本发明的构建体。利用多种树脂和试剂的众多熟知方法均可以用来制备本发明的构建体。

用于合成构建体的过程可以通过其中所需序列内每个氨基酸或氨基酸替代物一次一个连续地向另一种氨基酸残基或氨基酸替代物添加的方法，或通过首先常规地合成具有所需氨基酸序列的肽片段(其可以包括一个或多个氨基酸替代物)并随后缩合以提供所需构建体的方法而实施。使产生的构建体环化，以产生本发明的环状构建体。

固相肽合成方法是众所周知的并在本领域中实施。在此类方法中，本发明构建体的合成可以根据固相方法的一般原理，通过将想要的氨基酸残基或氨基酸替代物一次一个依次并入增长的肽链而实施。这些方法在众多参考文献中公开，所述文献包括Merrifield R.B.，Solid phase synthesis(Nobellecture).Angew.Chem.24：799-810(1985)和Barany等，The Peptides，Analysis， Synthesis and Biology，第2卷，Gross E.和Meienhofer J.编辑.Academic Press，1-284(1980)。

在构建体的化学合成中，用合适的保护基团保护多种氨基酸残基或氨基酸替代物的活性侧链基团，其中所述的保护基团防止化学反应在该位点上发生直至除去该保护基团为止。还常见是保护氨基酸残基或氨基酸替代物的α氨基，同时该实体在羧基处发生反应，随后选择性地除去α氨基保护基团以允许后续反应在该位点上发生。具体的保护基团已经公开并且在固相合成法和溶液相合成法中是已知的。

α氨基可以由合适的保护基团保护，包括氨基甲酸乙酯型保护基团如苄氧羰基(Z)和取代的苄氧羰基如对氯苄氧羰基、对硝基苄氧羰基、对溴苄氧羰基、对联苯基-异丙氧羰基、9-芴甲氧羰基(Fmoc)和对甲氧基苄氧羰基(Moz)；脂族氨基甲酸乙酯型保护基团，如叔丁氧羰基(Boc)、二异丙基甲氧羰基、异丙氧羰基和烯丙氧羰基。Fmoc优选用于α氨基保护。

胍基可以由合适的保护基团保护，如硝基、对甲苯磺酰基(Tos)、Z、五甲基色烷磺酰基(Pmc)、金刚烷氧羰基、五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、Fmoc和Boc。Pbf是用于Arg的一种优选保护基团。其它优选的保护基团包括Z、Fmoc和Boc。尤其将理解的是胍基保护基团可以在合成过程期间被切除并除去，或可以备选地不被切除或除去，此时带保护基团的侧链形成如本文中所定义的氨基酸侧链部分的衍生物。特别在保护基团是不稳定的以及可能在施用至患者时因某种机制而被除去的情况下，构建体变成“前药”，也就是说作为药物前体的构建体，其中所述的药物前体在施用至患者后通过某些化学或生理过程在体内转化成所需药物形式(例如前药在接触于生理pH时或因酶作用而转化成想要的药物形式)。

本文中所述的本发明构建体可以使用固相合成法，手工地或通过自动肽合成仪(使用如由制造商提供的编程模块并遵循由制造商描述的方案)，或通过改良制造商的方案以改善苛刻偶联的产率而制备。

固相合成通过受保护的α-氨基酸、α-氨基酸替代物或α-氨基醇模拟物偶联至合适树脂而始自构建体的羧基端。通过如下方式如此制备这种起始材料，即通过酯键将α-氨基-受保护氨基酸或α-氨基-受保护氨基酸替代物连接至对苄氧基苄醇(Wang)树脂或2-氯三苯甲基氯树脂，通过Fmoc-接头如对-[(R，S)-α-[1-(9H-芴-9-基)-甲氧基甲酰氨基]-2，4-二甲氧基苄基]-苯氧乙酸(Rink接头)之间的酰胺键连接至二苯甲基胺(BHA)树脂，或通过本领域众所周知的其它方法，如通过将α-氨基-保护的醇模拟物连接至与氯甲基聚苯乙烯树脂连接的3，4-二氢-2H-吡喃-2基-甲醇接头。Fmoc-接头-BHA树脂支持物是市售的并且通常在可行时使用。根据需要在整个重复循环期间携带这些树脂以依次添加氨基酸。在碱性条件下除去α氨基Fmoc保护基团。为此目的可以使用在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的哌啶、哌嗪、二乙胺或吗啉(20-40％ v/v)。

在除去α氨基保护基团后，后继保护的氨基酸或氨基酸替代物以想要的次序逐步偶联以获得中间态的保护的肽-树脂。用于肽固相合成中偶联氨基酸的活化试剂是本领域众所周知的。在合成构建体后，根据需要，可以使用本领域众所周知的方法除去正交保护的侧链保护基团，以便将构建体进一步衍生化。

构建体中的反应基团可以在固相合成期间或从树脂除去后选择性地加以修饰。例如，构建体可以在树脂上时进行修饰以获得氨基端修饰，如乙酰化，或可以通过使用切除试剂从树脂除去并且随后加以修饰。用于氨基端修饰(如乙酰化)或羧基端修饰(如酰胺化)或导入N-乙酰基的方法是本领域已知的。类似地，用于修饰氨基酸侧链的方法是肽合成领域技术人员众所周知的。对构建体上存在的反应基修饰的选择部分地由构建体中想要的特征决定。

在一个实施方案中，构建体在从树脂切割之前被环化。对于通过活性侧链部分的环化，使想要的侧链脱保护，并将构建体悬浮在合适的溶剂中并添加环化偶联剂。合适的溶剂包括例如DMF、二氯甲烷(DCM)或1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。合适的环化偶联试剂包括例如2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸盐(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TATU)、2-(2-氧代-1(2H)-吡啶基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TPTU)或N，N′-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DCCl/HOBt)。偶联常规通过使用合适的碱如N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、均三甲基吡啶(sym-collidine)或N-甲基吗啉(NMM)而启动。

合成后，从固相切下构建体之后，构建体可以通过任何数目的方法如反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，使用合适的柱(如C₁₈柱)纯化。也可以使用其它的分离或纯化方法，如基于构建体大小或电荷的方法。一旦纯化，则构建体可以通过任何数目的方法如高效液相色谱(HPLC)、氨基酸分析法、质谱法等表征。

具有取代的酰胺衍生物羧基端(一般是N-烷基)的本发明构建体通过固相合成法制备，其中所述的固相合成法通过将保护的α氨基酸或氨基酸替代物偶联至合适树脂而始自化合物的羧基端。此类用于固相制备取代的酰胺衍生物的方法已经在本领域中描述。见，例如Barn D.R.，Morphy J.R.，Rees D.C.Synthesis of an array of amides by aluminum chloride assistedcleavage of resin-bound esters.Tetrahedron Lett.37，3213-3216(1996)；DeGrado W.F.Kaiser E.T.Solid-phase synthesis of protected peptides on apolymer bound oxime：Preparation of segments comprising the sequences of acytotoxic 26-peptide analogue.J.Org.Chem.47：3258-3261(1982)。此类起始材料可以通过熟知方法，将α氨基受保护的氨基酸或氨基酸替代物经酯键连接至对苄氧基苄醇(Wang)树脂而制备。按照想要的氨基酸或氨基酸替代物序列增长肽链，使产物环化并用二氯甲烷中的适宜胺和氯化铝(如甲胺、二甲胺、乙胺等)的溶液处理树脂。产生的酰胺衍生物构建体从树脂中释放在溶液内。滤除树脂，并将酰胺衍生物构建体通过浓缩溶剂随后用醚沉淀进行回收。将粗制构建体干燥并使用三氟乙酸(TFA)在水和三异丙基硅烷(TIS)存在下切除仍存在的氨基酸侧链保护基团。终产物通过添加冷醚进行沉淀并通过过滤收集。通过RP-HPLC，使用C₁₈柱开展最终纯化。

在一个优选的方法中，实施例1的构建体通过以下方法合成。每种构建体具有一个或两个基于酮-哌嗪结构的氨基酸替代物。该氨基酸替代物如上文所述合成。构建体使用Fmoc化学合成。使用手工合成方法以在掺入酮-哌嗪氨基酸替代物之前和之后立即偶联。

以下方案用来将氨基酸替代物连接至树脂，例如氨基酸替代物位于末端位置。Rink酰胺树脂(以0.3mmol/g载量，Advanced ChemTech)在DMF中溶胀30分钟。使用20％哌啶/DMF持续20分钟实现树脂的Fmoc脱保护。该树脂与所选Fmoc-保护的酮-哌嗪氨基酸替代物(2当量)的偶联通过在DMF中与PyBop(2当量)和DIEA(4当量)过夜温育而实现。若Kaiser检验后，获得阳性结果，则进行第二次偶联反应。使用DMF中的Ac₂O(10当量)和吡啶(20当量)实施乙酰化。

以下方案用来连接酮-哌嗪氨基酸替代物至肽-树脂。偶联通过混合在DMF中的Fmoc-保护的酮哌嗪氨基酸替代物(2当量)，TBTU(2当量)和DIEA(4当量)并使其温育过夜而实施，若Kaiser检验后获得阳性结果，则再次进行偶联反应。使用DMF中的Ac₂O(10当量)和吡啶(20当量)实施乙酰化。

以下方案用来将Fmoc-保护的氨基酸偶联至固相上的酮-哌嗪氨基酸替代物。在大多数情况下，需要至少两个偶联循环，并且往往使用三个循环。在常见循环中，Fmoc-保护的氨基酸(4当量)与DMF中的HOAt(4当量)和DIC(4当量)混合。产生的混合物随后在SPE管中与酮-哌嗪氨基酸替代物混合过夜，所述替代物与树脂直接连接或经中间体连接。

使用固相肽合成的标准方案实施序列中与酮-哌嗪氨基酸替代物不直接相邻的氨基酸之间的偶联。使用以下保护基团：Boc用于Lys和Om，叔丁基用于Tyr和Ser，三苯甲基用于Cys和His，O-叔丁基用于Asp和Pbf用于Arg。

使用TFA/苯甲硫醚/苯酚/H₂O/DTT/TIS(87.5/2.5/2.5/5/2.5/11)的混合物(5mL)3小时而从树脂上切下构建体。产生的材料经过滤并在冷冻条件下持续1小时而从冷醚中析出。析出的半胱氨酰肽在用于氧化步骤中之前用冷醚洗涤至少三次。

为通过空气氧化而环化以形成二硫键，将粗制半胱氨酰构建体溶解在乙腈与水的混合物中。使用5％NH₄OH调节反应混合物的pH至7-8。将得到的溶液随150mg粒状活性碳一起缓慢搅拌2日。环化的完成在进入下个加工步骤之前由LC-MS分析证实。在环化后，从溶液中滤去固体碳。将滤液冻干或在speed-vac中干燥以获得粗制环状构建体。

可以通过以下方案合成本发明的某些构建体，其中替代物与树脂或其它肽固体支持物结合并且位于羧基端位置。以下方案由构建体1-132的合成例示，但是将理解的是基本上相似的方法可以用于其中替代物与树脂或其它肽固体支持物结合的任何构建体。

替代物(7)通过上文方法A的方案或任何替代方法而制备。Fmoc保护的Sieber酰胺树脂通过23.8g(0.63mmol/g置换，15mmol)该树脂在二甲基甲酰胺和二氯甲烷1:1的200mL混合物中溶胀45分钟，随后滤出并用2×125mL二甲基甲酰胺洗涤进行处理。洗涤的树脂随后用二甲基甲酰胺中的2×125mL 20％哌啶脱保护15分钟，滤出并用4×125mL二甲基甲酰胺洗涤。

将160mL二甲基甲酰胺中21.5g(分子量＝717，30mmol)Fmoc-保护的替代物(7)的溶液添加至如上所制备脱保护的Sieber酰胺树脂，随后添加15.6g(分子量＝520.3，30mmol)固体PyBop和10.4mL(分子量＝129.25，d＝0.742，60mmol)二异丙基乙胺，随后又添加40mL二甲基甲酰胺。将混合物搅动过夜并吹氮。将树脂滤出并用4×130mL二甲基甲酰胺洗涤，用由二甲基甲酰胺:乙酸酐:吡啶的3:2:1溶液构成的150mL封端溶液封端30分钟，过滤并用4×130mL二甲基甲酰胺洗涤以提供与树脂复合的替代物(7)。

所得的与树脂复合的Fmoc-保护的替代物(7)用二甲基甲酰胺中的2×130mL 20％哌啶脱保护15分钟，滤出并用4×130mL二甲基甲酰胺洗涤以产生与树脂复合的替代物(7)。二甲基甲酰胺中的27.6gFmoc-Tyr-(^tBu)-OH(60mmol，4当量)的溶液(200mL)添加至与树脂复合的替代物(7)，随后添加DMF中的24.8g HCTU(60mmol，4当量)和20.8mL二异丙基乙胺(120mmol，8当量)的溶液至终体积200mL并偶联过夜，同时吹氮。产生的Fmoc-Tyr-(^tBu)-替代物(7)-树脂经过滤分离并用2×130mL二甲基甲酰胺洗涤。为确保完全偶联，产物再次用二甲基甲酰胺中的27.6gFmoc-Tyr-(^tBu)-OH(分子量＝459.6，60mmol，4当量)的溶液至终体积200mL处理，随后用DMF中的24.8g HCTU(60mmol，4当量)和二异丙基乙胺(20.8mL，120mmol，8当量)的溶液至终体积200mL处理，并且偶联过夜，同时吹氮。滤出树脂并且用2×130mL二甲基甲酰胺洗涤。HPLC和LC/MS显示在替代物(7)-树脂与Fmoc-Tyr-(^tBu)-OH之间的偶联完成。

产生的Fmoc-Tyr-(^tBu)-替代物(7)-树脂随后用如上文的150mL封端溶液封端30分钟。随后滤出树脂，用4×130mL二甲基甲酰胺、4×130mL二氯甲烷、2×130mL MeOH、2×130mL二乙醚洗涤，并在真空下干燥以产生36.7g。

此后可以偶联后继的每种氨基酸。在偶联第一种氨基酸之前，将产生的Fmoc-Tyr-(^tBu)-替代物(7)-树脂用二甲基甲酰胺:二氯甲烷1:1的200mL溶液溶胀45分钟。通过重复以下循环来偶联每种氨基酸(Fmoc-AA-OH)。末端氨基酸残基用二甲基甲酰胺中的2×125mL 20％哌啶脱保护15分钟，过滤并用4×125mL二甲基甲酰胺洗涤。珠用茚三酮试验检验。将终体积200mL在二甲基甲酰胺中的Fmoc-AA-OH(60mmol，4当量)的溶液添加至树脂，随后添加在DMF中的HBTU(60mmol，4当量)和(120mmol，8当量)N-甲基吗啉的溶液至终体积200mL[Fmoc-AA-OH的浓度＝150mM溶液]并偶联30分钟，同时吹氮(偶联反应通过茚三酮试验检验)。当茚三酮试验呈阴性时，滤出树脂并用4×130mL二甲基甲酰胺洗涤。

在已经偶联全部氨基酸后，树脂用4×130mL二氯甲烷、4×130mL甲醇、4×130mL二乙醚洗涤，并在真空下干燥以产生产物。重量增加是定量性的。

将由三氟乙酸:苯酚:苯甲硫醚:水:DDT:三异丙基硅烷的81.5:5:5:5:2.5:1溶液构成的100mL切除试剂添加至32g(～6.4mmol)以下的线形构建体：

混悬液在室温静置5分钟并且随后过滤。向树脂添加另一份100mL切除试剂，静置5分钟并过滤。重复这个过程。

产生的树脂随后用2×40mL三氟乙酸洗涤。合并滤液并将其在室温搅拌2.5小时，并且随后在减压下浓缩至约100mL体积。添加冷的二乙醚(1.5L，预冷至-20℃)至滤液中，并且随后置于冷冻器内(-20℃)1小时，经垂熔玻璃漏斗过滤，并且固体用3×200mL冷的二乙醚洗涤，并且随后在真空下干燥1小时，同时每隔15分钟搅散固体以确保高效地除去溶剂。获得以下构建体(15.4g)(103％整体粗产率)：

以上构建体(15.4g，6.4mmol)溶解于在水中的16L30％乙腈内。使用5％氢氧化铵溶液调节pH至8.4。添加粉碎的活性碳(15.4g)，并将混悬液搅拌过夜。通过硅藻土过滤而除去碳。硅藻土用在水中的3 x 100mL 50％乙腈洗涤。滤液合并，用水稀释至10％乙腈终浓度，并装载于柱内以纯化。在下列条件下实施对所得构建体的三氟乙酸盐的纯化：

柱：Luna C₁₈，10μ，50 x 33mm

流速：70mL/分钟

溶剂A：含有0.1％三氟乙酸的水

溶剂B：含有0.1％三氟乙酸的乙腈

梯度：5％溶剂B，5分钟

26％ B至52％B，30分钟内

将纯级分合并并冻干，以产生纯化的构建体三氟乙酸盐。Dowex SBR，LCNG-OH树脂(450g)悬浮在2L水中，并温和搅拌15分钟，静置15分钟，并且随后滗析。重复该过程，并且随后添加0.5L水，并且将浆液转移至6x60cm柱。排干水，用4L水洗涤，并且将离子与6.5L 20％乙酸溶液交换。树脂在室温静置过夜，并且随后用水洗涤直至滤液的pH是约4(使用8L水)。如上制备的以上构建体的三氟乙酸盐(11.1g)溶解在80mL水中，并装载至离子交换树脂上，并用水洗脱。合并含有79-1的级分，并添加20％乙酸溶液以调节终浓度至5％乙酸，并且随后冻干。获得以下的构建体1-132(10.4g)：

相似方法可以用于其中替代物与树脂或其它肽固体支持物结合并且位于羧基端位置的任何构建体。

可以按照任何方式(如下文所述的那些方式)实行本发明肽构建体的任选PEG化。

通过在2mL二甲基亚砜中溶解0.005mmol纯化的构建体，随后添加55.5mg(0.011mmol，2当量)PEG-5K-OSu(带琥珀酰亚胺丙酸酯反应基的分子量5,000Da的甲氧基-PEG)，随后添加17.7μL(0.13mmol，20当量)三乙胺，并将略微浑浊的溶液在室温搅拌3小时，而实现活性胺基(如赖氨酸或鸟氨酸侧链、Aaa¹位置的Ω氨基脂族基团或在Aaa¹⁵处氨基酸替代物J中胺基)的PEG化。过量的PEG-5K-OSu通过添加7μL(0.111mmol，10当量)乙醇胺被猝灭，并将反应搅拌过夜。

通过将PEG-NH₂(PEG-胺)偶联至在Asp或Glu的侧链中或在羧基端处含有羧基的化合物上，而实现活性羧基(如Asp或Glu侧链或在残基或替代物上Aaa¹⁵处的末端羧基)的PEG化。肽构建体(0.005mmol)溶解在DMSO(2mL)中，随后添加55.5mg(0.011mmol，2当量)PEG-NH₂和HOBt(0.01mmol)。通过添加0.0055mM偶联试剂N-乙基-N’-(3-二甲胺基丙基)-碳二亚胺(EDAC)启动偶联。将略微浑浊的溶液在室温搅拌过夜。PEG化的肽构建体随后通过HPLC纯化。

活性硫氢基(如Cys或Hcys侧链)或在Aaa¹处氨基酸替代物Q中硫氢基的PEG化通过在DMSO中用PEG-甲基-马来酰亚胺试剂(SunBio，Orinda，California)处理肽构建体过夜而实现。PEG化的肽构建体随后通过HPLC纯化。

PEG化后，产生的粗制混合物随后通过HPLC纯化，产生包括一个或多个氨基酸替代物的PEG衍生化构建体。

体外和体内检验系统

所选的构建体在测定法中检验以确定结合状态和功能状态。使用了以下的测定法。

细胞培养。从Bio S&T Inc.(Montreal，Quebec)购买编码人利尿钠肽受体A(NPRA)的cDNA克隆。将该cDNA克隆插入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)并转染至HEK-293细胞。通过在硫酸G418存在下培养细胞而选择稳定的克隆。通过将[¹²⁵1]-心房钠尿肽([¹²⁵I]-ANP)结合至从克隆细胞系制备的膜匀浆物而检验NPRA的表达。HEK-hNPRA细胞维持在37℃于5％CO₂在补充有10％FBS、硫酸G418(300μg/mL)、谷氨酸钠(0.29mg/mL)、青霉素(100单位s/mL)和链霉素(100ug/mL)的Dulbecco改良Eagle氏培养基(DMEM)中培养。

竞争性结合测定法。使用从HEK-hNPRA细胞制备的粗制膜匀浆物实施竞争性抑制结合测定法。为制备膜匀浆物，细胞用磷酸盐缓冲盐水漂洗，并在4℃在低渗裂解缓冲液(10mM Tris，pH 7.4+5mM EDTA)中温育15分钟。将细胞从平板中转移至聚丙烯管内并均化。匀浆物在25,000×g离心20分钟。沉淀重悬在由50mM Tris(pH 7.4)和1mM EDTA组成的缓冲液中，均化，并在25,000×g离心20分钟。沉淀重悬在由100mM Tris(pH 7.4)和10mM MgCl₂组成的缓冲液中，并在-80℃贮存直至需要时。在分析当日，将匀浆物融化并均化。在含有25mM Hepes(pH 7.4)、100mM NaCl、2mMCaCl₂、5mM MgCl₂、0.1％ BSA和1mM1，10-菲咯啉的缓冲液中实施[¹²⁵I]-ANP的结合。匀浆(1-10μg蛋白质/孔)在4℃与Millipore滤盘的[¹²⁵I]-ANP(25-30pM)和递增浓度的竞争性配体温育120分钟。测定通过添加冷的洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐水)而终止，随后使用真空多歧管过滤。使用γ计数器测定结合的放射活性。非特异性结合由[I¹²⁵]-hANP与非转染的HEK293膜结合而定义。使用GraphPad 曲线拟合软件分析数据。

用于测定EC₅₀的通用方法。构建体的功能性评价通过测量胞内cGMP在表达重组hNPR-A的HEK-293细胞中的聚积而实行。HEK-NPRA细胞通过在细胞解离缓冲液(Gibco，Life Technologies)中洗涤和离心而收获。沉淀的细胞在含有10mM Hepes(pH 7.4)、5mM MgCl₂、200mM L-谷氨酰胺、1mM1，10-菲咯啉和BSA(0.5mg/mL)的Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中重悬。在离心后，将细胞重悬在补充有0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)的以上缓冲液中。将细胞(约2×10⁵/孔)添加至96孔平板的各孔中并在37℃温育15分钟。在预温育时间后，将细胞在递增浓度的构建体存在下温育额外15分钟。反应通过用温度休克法裂解细胞而终止。反应平板在干冰/乙醇浴中温育15分钟，随后在90℃温育10分钟。使用cGMP FlashplateRIA(Perkin-Elmer)测量cGMP的聚积。通过使用非线性回归分析用GraphPad

软件确定数据分析和EC₅₀值。

质量测定和核磁共振分析。使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)作为基质，通过MALDI-TOF质谱法(正离子模式)分析PEG-缀合构建体的质量值。甲醇用于以构建体对基质比率分别是1:10、1:20和1:30的样品制备。或者，其它基质如芥子酸(SA)和2，5-二羟基苯甲酸(DHB)和溶剂如乙腈-0.1％水性TFA可以用于样品制备。使用Waters MicroMass ZQ装置，利用阳性模式进行质量值的其它测定。对于没有PEG化的构建体，将质量测定值与计算值比较，并以质量(mass weight)加二除以二((M+2)/2)的形式表述，除非另外说明。

使用Bruker 300MHz分光计获得质子NMR数据。谱在构建体于氘化溶剂如氯仿、DMSO或(如适合)甲醇中溶解后获得。

使用带YMC Pack Pro C₁₈柱(4.6 x 50mm，3μ)的Waters Alliance HT进行HPLC测量，其中所述的柱以逐步方法以1mL/分钟进行洗脱。使用溶剂A(含有0.1％三氟乙酸v/v的水)和溶剂B(含有0.1％三氟乙酸v/v的乙腈)作为流动相。对于酮哌嗪中间体的分析，柱用10％ B平衡并且随后在8分钟期间增加B至90％。对于肽的分析，柱用2％ B平衡并且随后在8分钟期间增加B至90％。

动物模型-血压传感器植入。大鼠用异氟烷诱导至麻醉的外科平面(surgical plane)并维持在热垫上。剔除腹部毛发并用70％醇和聚维酮碘溶液擦洗。使用无菌技术，行正中线剖腹术以便暴露降主动脉和腔静脉。使用湿的无菌纱布和牵引器温和地牵出腹部内容物。根据制造商说明书(在DataSciences International′s MultiplusTLSeries Device Surgical Manual 2000：第3.1-3.10页中描述)，将腹主动脉小心地从周围的脂肪和结缔组织中剥离并插入血压传感器的导管。使用外科胶将该传感器的导管固定就位，并且传感器的本体通过缝合(4-0缝合丝线)至腹壁加以稳定。小心确保在该操作期间保持止血并且血流不是有害的(例如主动脉每次不被闭塞超过3分钟)。使用无线电遥测信号验证传感器的放置。在放置传感器后，除去纱布海绵并且用无菌盐水冲洗腹腔。随后用不吸收性缝线(4-0缝合丝线)以单纯间断缝合方式缝合封闭腹部切口。使用吸收性缝线(4-0薇乔(vicryl))闭合皮肤。最后，从异氟烷移走动物并置于温暖环境中，同时进行监测，直至动物完全清醒。

手术诱导充血性心力衰竭(容量超负荷)。在这个操作中，降主动脉和腔静脉按照与遥测装置植入操作中相同的方式进行暴露。一旦接近肾脏和髂骨分叉之间的血管，用1.8mm针头(外径)穿刺降主动脉。将该针头推进至下腔静脉并回撤。用组织粘合剂密封降主动脉内的腹侧穿刺部位。通过腔静脉肿胀和静脉血与动脉血混合以肉眼方式证实旁路在主动脉和腔静脉之间的持续存在。在也植入压力传感器的情况下，同时进行这两个操作。在Flaim，S.F.、W.J.Minteer、S.H.Nellis和DP.Clark：Chronic arteriovenousshunt：evaluation of a model for heart failure in rat.Am.J.Physiol.236：H698-H704(1979)以及Garcia，R.和S.Diebold：Simple，rapid and effectivemethod of producing aortocaval shunts in the rat.Cardiovasc.Res.24：430-432(1990)中描述的一般方法通过引用的方式并入本文。

血压监测。使用Dataquest A.R.T.Gold软件3.0版(Data SciencesInternational)收集和分析来自血压传感器(型号TA11PA-C40，Data SciencesInternational，St Paul，MN)的遥测信号。大鼠每日在大体相同的时间上观察。居住笼内的每只大鼠置于观察室中的接收器上并允许其对位置改变作出调整30分钟。进行基线记录30分钟，随后立即进行投药，IV投药后立即进行治疗记录135分钟，SC投药后进行治疗记录210分钟。将数据与给予盐水后的结果以如此方式进行比较，其中所述的方式与先前在Clemens，L.E.，R.G.Almirez，K.A.Baudouin，E.B.Grossbard和A.A.Protter：Humanbrain natriuretic peptide reduces blood pressure in normotensive and acutenorepinephrine-induced hypertensive rabbits.Am.J.Hypertens.10：654-661(1997)中发表的方法相似，该文献通过引用的方式并入本文。

利尿和钠尿排泄。大鼠用戊巴比妥钠诱导至麻醉的外科平面并维持在热垫上。剔除腹部毛发并用70％醇和聚维酮碘溶液擦洗。使用无菌技术，行正中线剖腹术以便暴露膀胱。向膀胱的腹表面引入荷包缝合并且在缝合区内行细小切口。将导管的扩口端插入该切口并且将荷包缝合在导管周围收紧以确保导管就位。尿液在多个时间间隔上在投药之前或之后以如此方式收集至预先称重的微量离心管内，其中所述的方式与Abassi，Z.A.、J.R.Powell、E.Golomb和H.R.Keiser：Renal and systemic effects of urodilatin inrats with high-output heart failure.Am.J.Physiol.262：F615-F621(1992)中发表的方法相似，该文献通过引用的方式并入本文。尿量通过重量确定。

实施例1

以下构建体使用一种或多种前述方法的氨基酸替代物而合成，纯化并确定质量，结果如下所示：

表1

实施例2

使用一种或多种前述方法的氨基酸替代物合成表2的以下构建体，纯化并确定质量：

表2

实施例3

如上所述测试具有以下结构的构建体1-1。

在受体结合研究中，该构建体在测定系统中的平均Ki为0.3nM，其中hANP的Ki为0.05nM，mini-ANP的Ki为0.6nM。构建体1-1在测定系统中的EC₅₀为2nM，其中hANP的EC₅₀为0.6nM，mini-ANP的EC₅₀为3.3nM。

实施例4

如上所述测试具有以下结构的构建体1-9。

在受体结合研究中，该构建体在测定系统中的平均Ki为0.9nM，其中hANP的Ki为0.05nM，mini-ANP的Ki为0.6nM。构建体1-9在测定系统中的EC₅₀为3.5nM，其中hANP的EC₅₀为0.6nM，mini-ANP的EC₅₀为3.3nM。

实施例5

如上所述测试具有以下结构的构建体1-8。

在受体结合研究中，该构建体在测定系统中的平均Ki为0.2nM，其中hANP的Ki为0.05nM，mini-ANP的Ki为0.6nM。构建体1-8在测定系统中的EC₅₀为2nM，其中图1的构建体的EC₅₀为0.6nM，mini-ANP的EC₅₀为3.3nM。

实施例6

如上所述测试具有以下结构的构建体1-18。

在受体结合研究中，该构建体在测定系统中的平均Ki为0.027nM，其中hANP的Ki为0.05nM，mini-ANP的Ki为0.6nM。构建体1-18在测定系统中的EC₅₀为0.2nM，其中hANP的EC₅₀为0.6nM，mini-ANP的EC₅₀为3.3nM。

构建体1-18在大鼠和人血浆内均稳定，在37℃的T_1/2约为2小时。当IV施用时，在大鼠中的体内T_1/2是约20分钟。当通过皮下途径施用时，大约25-50％的注射剂量在大鼠中是生物可利用的。图2描述构建体1-18在大鼠中随时间的浓度，单位ng/mL，“SC”的曲线表示以剂量5mg/kg皮下施用，并且“IV”的曲线表示以剂量2mg/kg静脉内施用。

实施例7

将血压传感器如标题“动物模型-血压传感器植入”所述植入大鼠。研究如标题“血压监测”所述实施。研究包括确定与盐水相比，施用本发明构建体后的收缩期血压改变。在一项研究中，通过IV途径以0.03mg/kg体重(n＝4)、0.1mg/kg(n＝7)或0.3mg/kg(n＝8)向大鼠施用构建体1-63。在IV施用之前5分钟并在施用后5、10和15分钟监测血压，并且其后以15分钟为间隔直至施用后135分钟。在对于全部剂量的全部时间点上，测量的收缩期血压一般以剂量依赖方式低于盐水对照，血压降低从最小约5％至最大约19％，并且在施用后10至45分钟见到最大反应。

在第二项研究中，通过皮下途径以0.3mg/kg体重(n＝8)、1.0mg/kg(n＝7)或3.0mg/kg(n＝7)向大鼠施用构建体1-63。在SC施用之前15分钟和5分钟并在施用后5、10和15分钟监测血压，并且其后以15分钟为间隔直至施用后210分钟。在对于全部剂量的全部时间点上，测量的收缩期血压低于盐水对照。在0.3mg/kg SC上，收缩压的降低在施用后2小时是2％的范围内，这属于误差范围。然而在对于0.3mg/kg SC的其它时间点上，以及在对于1.0和3.0mg/kg的全部时间点上，降低具有统计学差异，并且低于盐水对照。在3.0mg/kg上，在施用后45至120分钟见到大约20％-23％的收缩压最大降低，而在1.0mg/kg上，在相同时间段上见到17％-19％的收缩压最大降低。

在第三项研究中，通过IV途径以0.3mg/kg体重(n＝8)向大鼠施用构建体1-18。在IV施用之前5分钟并在施用后5、10和15分钟监测血压，并且其后以15分钟为间隔直至施用后135分钟。在对于全部剂量的全部时间点上，测量的收缩期血压低于盐水对照，血压降低从最小约5％至最大约13％，并且在施用后15分钟时见到最大反应。

在第四项研究中，通过皮下途径以0.1mg/kg体重(n＝4)、0.3mg/kg(n＝7)或1.0mg/kg(n＝8)向大鼠施用构建体1-18。在SC施用之前15分钟和5分钟并在施用后5、10和15分钟监测血压，并且其后以15分钟为间隔直至施用后225分钟。在对于全部剂量的全部时间点上，测量的收缩期血压低于盐水对照。在0.1mg/kg SC上，收缩压的降低在约2小时至1.5小时后不是统计学相关的。然而，在对于0.1mg/kg SC的全部其它时间点上，及在对于0.3的小于2小时至1.5小时的全部时间点上，以及在对于1.0mg/kg的全部时间点上，降低具有统计学差异并且低于盐水对照。在1.0mg/kg上，在施用后45至120分钟见到大约9％-13％的收缩压最大降低。

实施例8

大鼠中的总尿排出量如标题“利尿和钠尿排泄”所述而测量。含四只动物的组通过IV途径施用构建体1-18和1-63，动物接受0.03mg/kg体重、0.1mg/kg和0.3mg/kg的构建体1-18，以及接受0.1mg/kg体重、0.3mg/kg和1.0mg/kg的构建体1-63。测量投药后经30分钟的总尿排出量，结果如图3中所示。

在独立的研究中，类似地测量含四只动物的组中的总尿量，其中所述的动物通过SC途径接受构建体1-63的0.3、1.0和3.0mg/kg体重的剂量，以盐水用作对照。测量投药后45分钟期间的总尿排出量。结果如图4中所示。

实施例9

所选的本发明构建体的药物代谢动力学在雄性Sprague-Dawley大鼠中在静脉内(IV)或皮下(SC)施用后加以研究。测定所选的构建体在大鼠中的药物代谢动力学参数并将它们在表3和表4中汇总。

将如表4和表5中所示的本发明构建体制备为TFA盐并溶解在盐水中，以1mL/kg用于IV和SC投药途径。通过股动脉插管以靶剂量0.3mg/kg和2mg/kg施用IV剂量。以靶剂量1mg/kg和5mg/kg施用SC剂量。动物在投药前不作过夜禁食。血液在预定时间间隔上从颈静脉中先前植入的插管内收集到含有EDTA二钾的容器中。血浆通过对血液离心而获得并贮存在-70℃直至分析。

数据分析利用LC-MS/MS系统，该系统包括配备100μL进样环(injection loop)、两台Shimadzu泵和一台Sciex API 4000质谱仪的LeapTechnologies HTS-PAL自动进样器。分析物的色谱分离以逐步方法在以1mL/分钟洗脱的Luna C₁₈柱(4.6x100mm；3μ)上实现。使用溶剂A(含有0.1％甲酸v/v的水)和溶剂B(含有0.1％甲酸v/v的乙腈)作为流动相。最初，该柱用5％ B平衡，并且在进样2分钟后，B在0.5分钟期间增加至60％并在该浓度上保持1.1分钟。B的组成在1.4分钟内增加至80％并维持0.3分钟。B的组成在0.2分钟内返回至5％。总运行时间是6分钟。使用在正离子模式下操作的Turbo Ionspray界面实现分析物的质谱检测。分析物应答通过质子化前体离子转变至所选产物离子的多重反应监测(MRM)进行测量。

血浆等分试样(100μL)与内标物(IS)混合并以96孔模式，使用C₈柱体(cartridage)进行固相提取。用在水中的1mL甲醇和1mL 2％氢氧化铵预处理C₈柱体后，将血浆样品加载至柱体上。在用40％甲醇中的2％氢氧化铵洗涤柱体后，用1mL 60％甲醇中的2％乙酸将构建体从柱体洗脱。将洗脱液转移至清洁平板，在N₂气流下蒸发并将残余物在LC-MS/MS分析之前重悬于100μL的20mM乙酸铵和乙腈(6:4，v:v)中。校正标准(2-1000ng/mL)以相同方式通过添加多种浓度的构建体及其相应IS至100μL未处理的大鼠血浆中而制备。类似地，质控样品通过以3个不同构建体浓度(3.5、75和750ng/mL)添加构建体和内标物至100μL对照血浆而制备。

通过Sciex Analyst 1.4.1软件获取并处理数据。将构建体对内标物(IS)的峰面积比标注为构建体的标称浓度的函数。使用加权系数1/x的线性回归来计算血浆样品中构建体的浓度。本测定法的定量下限(LLOQ)一般是2ng/mL或5ng/mL。

通过已建立的非房室方法(non-compartmental method)(Win-Nonlin版本2.1；Consulting Inc.，Palo Alto，CA)计算药物代谢动力学参数。使用上升斜率内的线性梯形内插法和下降斜率内的对数梯形内插法而确定血浆浓度对时间曲线下的面积(AUC)。从等式Ct/kel中估计出从最后的可测量浓度至无限大的AUC的部分，其中Ct代表最后的可测量浓度并且kel是消除速率常数。后者通过在半对数曲线图的末端相处的线性回归从浓度对时间的曲线中测定。

表3

IV施用后构建体在SD大鼠中的药物代谢动力学参数汇总

构建体	PK参数剂量 AUC Vdss Cl T_1/2(mg/kg) (nM.小时) (L/kg) (mL/min/kg) (小时)
		1-181-181-631-631-551-551-541-351-391-421-451-281-691-100	2 263 0.7 72 0.20.3 61 0.4 43 0.22 67 4.6 290 0.30.3 33 5.8 546 0.32 828 0.3 21 0.30.3 116 0.2 15 0.22 277 1.0 66 0.22 10 57 1857 0.42 142 2.8 134 0.32 369 0.7 50 0.32 850 0.3 23 0.32 351 1.1 51 0.42 113 0.8 168 0.12 42 0.8 456 0.1

1-681-431-441-51

2 478 0.5 40 0.32 1247 0.6 14 0.72 1539 0.4 15 0.52 190 1.0 94 0.2

表4

SC施用后构建体在SD大鼠中的药物代谢动力学

实施例10

制备用于药学用途的1-132的制剂。1-132以乙酸盐形式使用。将该制剂置于加塞并密封的1mL小药瓶内，每只小药瓶含有：

0.1mg 1-132乙酸盐，基于乙酸盐的肽净重

1.181mg琥珀酸，NF

47.0甘露醇，USP

1N NaOH，USP，根据需要调节pH

1N HCl，USP，根据需要调节pH

注射用水，至1mL体积

终产物的pH根据需要用1N NAOH或1N HCl调节至pH 4.00±0.05。产生的溶液在装瓶前经无菌0.22微米滤器过滤并贮存在5℃直至使用。

产生用于药学用途的1-132的备选制剂，与上文的制剂相似，不过还包括约0.02mg与0.06mg之间的双羟萘酸二钠，以至于产生的溶液是双羟萘酸盐混悬剂。

实施例11

使用一种或多种前述方法的氨基酸替代物合成以下构建体，纯化并使其与PEG-5K-OSu缀合，并确定质量，结果如下表5中所示：

表5

实施例12

使用一种或多种前述方法的氨基酸替代物合成表6的以下构建体，纯化并使其与PEG-5K-OSu或另一种活性PEG缀合，并确定质量：

表6

实施例13

如上所述测试具有以下结构的构建体5-1。

在受体结合研究中，该构建体在测定系统中的平均Ki为70nM，其中hANP的Ki为0.05nM，mini-ANP的Ki为0.6nM。

实施例14

如上所述测试具有以下结构的构建体5-9。

在受体结合研究中，该构建体在测定系统中的平均Ki为大约2nM，其中hANP的Ki为0.05nM，mini-ANP的Ki为0.6nM。构建体5-9在测定系统中的EC₅₀为大约9.5nM，其中hANP的EC₅₀为0.6nM，mini-ANP的EC₅₀为3.3nM。

实施例15

将本发明的任何构建体，包括而不限于构建体1-1至1-248，2-1至2-21，5-1至5-18和6-1至6-12配制成定时释放注射剂。将所述构建体中的任一种与PEG如聚乙二醇3350和任选地一种或多种额外的赋形剂和防腐剂一起配制，其中所述的赋形剂和防腐剂包括但不限于赋形剂如盐、聚山梨醇酯80、调节pH的氢氧化钠或氢氯酸等。或者，将所述构建体中的任一种与聚(原酸酯)和任选地一种或多种额外的赋形剂一起配制，其中所述的聚(原酸酯)包括在聚合主链中具有任何可变乳酸百分含量的自催化性聚(原酸酯)。可以使用聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物(PLGA聚合物)，优选具有亲水端的PLGA聚合物。

实施例16

患有充血性心力衰竭如伴有休息或最小活动时呼吸困难的急性代偿失调性充血性心力衰竭的患者通过皮下注射施用包括构建体1-1至1-248、2-1至2-21、5-1至5-18和6-1至6-12中的任何一种或多种构建体的制剂，包括如通过实施例10的任何方法所得的制剂。

实施例17

患有慢性充血性心力衰竭的患者通过例如在臀肌或三角肌内注射如深部肌内注射而施用实施例15的定时释放的可注射制剂。

实施例18

申请人也发现本发明构建体的抗中性内肽酶消化抗性与其药物代谢动力学清除率(CL)之间的反关联性，如下表7中所示。中性内肽酶(“NEP”)是活化并清除全部三种人利尿钠肽的内源性酶。NEP存在于肾小管细胞和血管细胞内。NEP是在哺乳动物之间高度同源的。在大鼠与小鼠之间的NEP同一性百分数是98.5％，在人与小鼠之间的NEP同一性百分数是93.6％，而在人与大鼠之间的NEP同一性百分数是93.7％。

使用以下实验方法评估本发明各种构建体的NEP抗性。全部构建体在0.1M Tris-HCL缓冲液(pH 7.4)中稀释至100μM。将40μL稀释的构建体添加至各管并将全部管保持在冰上。将40μL稀释的NEP(8ng/μL的人重组NEP(R&D Systems，Minneapolis，MN，目录号1182-ZN)或2.5ng/μL的小鼠NEP(R&D Systems，目录号1126-ZN))添加至各管。将管温和地混合并转动。随后将全部管在37℃温育0、0.5、1、1.5和2小时。在温育时间结束时，通过添加5μL 10％TFA而终止反应。构建体用TCEP(三[2-羧乙基]膦线性化。随后通过HPLC和/或LC/MS分析NEP对构建体的活性程度。数据分析包括测定剩余起始材料(即未消化的肽构建体)的百分数和各蛋白酶裂解片段的百分数和序列。

表7

因此，本发明的一个实施方案提供根据本发明任一式的构建体，其在所述的hNEP抗性测定条件下1小时后留下至少80％的起始材料。本发明的相关实施方案提供根据本发明任一式的构建体，其在所述的hNEP抗性测定条件下1小时后留下至少90％的起始材料。本发明的又一相关实施方案提供根据本发明任一式的构建体，其在所述的hNEP抗性测定条件下1小时后留下至少95％的起始材料。在任一这些实施方案的变型中，构建体还显示在测定条件下2小时后留下至少80％的起始材料。在相关的变型中，构建体还显示在测定条件下2小时后留下至少90％的起始材料。

本发明的另一个实施方案提供根据本发明任一式的构建体，其在所述的hNEP抗性测定条件下1小时后留下不超过90％的起始材料。本发明的相关实施方案提供根据本发明任一式的构建体，其在所述的hNEP抗性测定条件下1小时后留下不超过80％的起始材料。本发明的又一相关实施方案提供根据本发明任一式的构建体，其在所述的hNEP抗性测定条件下1小时后留下不超过95％的起始材料。在这两种实施方案之一的变型中，构建体还显示在测定条件下2小时后留下不超过90％的起始材料。在相关的变型中，构建体还显示在测定条件下2小时后留下不超过80％的起始材料。

因此，本发明的构建体可以基于它们显示的NEP抗性程度而针对药代动力学特征进行选择。

前述实施例可以通过用本发明一般描述或具体描述的反应物和/或操作条件替代先前实施例中使用的那些反应物和/或操作条件而重复，获得相似的成功。

尽管本发明已经参考那些优选的实施方案进行详细说明，然而其它实施方案可以达到相同的结果。本发明的变体和变型对本领域技术人员而言是显而易见的并且本发明意图覆盖全部此类变型和等效物。上文援引和/或附件中的所有参考文献、申请、专利和出版物的全部公开内容和相应申请的全部公开内容因而通过引用的方式并入。

Claims

1.式III的环状构建体：

其中：

Aaa¹是选自Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Phe和Tyr的α-氨基酸的L-或D-异构体，或Aaa¹是被C₂-C₁₈直链烷基、C₃-C₁₇支链烷基、C₂-C₁₈直链链烯基或炔基、或C₃-C₁₈支链链烯基或炔基取代的酰基，或Aaa¹是结构如下的氨基酸替代物：

其中虚线表示肽键；R和R'独立地是H、直链或支链的C₁-C₆脂族链；x是1；Y是C=O；W是NH，Z是H；Q是-H或-C(=O)-(CH₂)_m-N(v₃)(v₄)；n是0或1；m是0-17；v₃和v₄各自独立地是H并且用星号标记的碳原子具有任何立体化学构型；

Aaa²和Aaa¹³是相同或不同的，并且分别是经过Aaa²和Aaa¹³的各自侧链而形成环桥的Cys的L-或D-异构体氨基酸残基，其中该环桥的连接基团是-S-S-；

Aaa³是选自His、Ala、Lys和Orn的α-氨基酸的L-或D-异构体，或Aaa³是结构如下的氨基酸替代物：

其中虚线表示肽键；R和R'独立地是H、或者His的氨基酸侧链部分；x是1；Y是CH₂；W是NH；Z是H；并且n是0；

Aaa⁴是选自Phe、Leu和Ala的α-氨基酸的L-或D-异构体，或Aaa⁴是结构如下的氨基酸替代物：

其中虚线表示肽键；R和R'独立地是H或是非取代的Phe的氨基酸侧链部分，x是1；Y是CH₂；W是NH；Z是H或CH₃；并且n是0或1；

Aaa⁵是Gly、Ala的α-氨基酸L-或D-异构体，或Aib，或Aaa⁵是结构如下的氨基酸替代物：

其中虚线表示肽键；R和R'独立地是H或-CH₃；x是1；Y是CH₂；W是NH；Z是H；并且n是0或1；

Aaa⁶是Gly、Ala的α-氨基酸L-或D-异构体，或Aib，或Aaa⁶是结构如下的氨基酸替代物：

Aaa⁷是选自Arg、Ala、Lys和Orn的α-氨基酸的L-或D-异构体，或Aaa⁷是结构如下的氨基酸替代物：

其中虚线表示肽键；R和R'独立地是H或者Arg的氨基酸侧链部分；x是1；Y是CH₂；W是NH；Z是H；并且n是0或1；

Aaa⁸是选自Nle、Ile、Leu和Val的α-氨基酸的L-或D-异构体；

Aaa⁹是选自Asp和Ala的α-氨基酸的L-或D-异构体，或Aaa⁹是结构如下的氨基酸替代物：

其中虚线表示肽键；R和R'独立地是H或者Asp的氨基酸侧链部分；x是1；Y是CH₂；W是NH；Z是H；并且n是0；

Aaa¹⁰是选自Arg、Ala、Lys和Orn的α-氨基酸的L-或D-异构体，或Aaa¹⁰是结构如下的氨基酸替代物：

其中虚线表示肽键；R和R'独立地是H或者Arg的氨基酸侧链部分；x是1；Y是CH₂；W是NH；Z是H；并且n是0；

Aaa¹¹是选自Ile、Leu和Val的α-氨基酸的D-或L-异构体；

Aaa¹²是选自Lys和Orn的α-氨基酸的L-或D-异构体；

Aaa¹⁴是选自Phe、Tyr、Ala和Lys的α-氨基酸的L-或D-异构体，或Aaa¹⁴是结构如下的氨基酸替代物：

其中虚线表示肽键；R和R'独立地是H或者Tyr的氨基酸侧链部分；x是1；Y是CH₂；W是NH；Z是H；并且n是0；

Aaa¹⁵是Arg的D-或L-异构体或Aaa¹⁵是结构如下的氨基酸替代物：

其中虚线表示肽键；R和R'中的一个是(CH₂)_y-R''，并且若一个具有此式，则R和R'中另一个是H，其中R''是

-NH₂或

-NH-C(=NH)-NH₂；

x是1；Y是C=O；W是NH；Z是H；J是-H、-(CH₂)_m-OH、-C(=O)-OH、-C(=O)-NH-(CH₂)_m-N(_Vl)(v₂)；v1和v2各自独立地是H；n是0；m是0-17；y是1-5；并且用星号标记的碳原子具有任何立体化学构型；

前提是Aaa¹、Aaa³至Aaa⁷、Aaa⁹、Aaa¹⁰、Aaa¹⁴或Aaa1⁵中的一或两个是相应的对Aaa¹、Aaa³至Aaa⁷、Aaa⁹、Aaa¹⁰、Aaa¹⁴或Aaa¹⁵所定义的氨基酸替代物。

2.权利要求1所述的环状构建体，其中Aaa³、Aaa⁵、Aaa⁶、Aaa⁷、Aaa⁹或Aaa¹⁰中的至少一个是Ala的L-或D-异构体。

3.权利要求1所述的环状构建体，其是式V的环状构建体：

其中Aaa²至Aaa¹⁴中的每一个如权利要求1中所定义，x是1，并且R₄是OH或NH₂。

4.权利要求3所述的环状构建体，其是式VI的环状构建体：

5.式VII、VIII、IX、X、XI或XII的环状构建体：

6.权利要求1的环状构建体，其中Aaa¹⁵是氨基酸替代物。