KR101434612B1

KR101434612B1 - 사이클릭 나트륨 이뇨 펩타이드 구조물

Info

Publication number: KR101434612B1
Application number: KR1020087026715A
Authority: KR
Inventors: 셔브 디. 샤라마; 마가리타 바스토스; 웨이 양; 후이-지 카이
Original assignee: 팔라틴 테크놀로지스 인코포레이티드
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2014-08-26
Also published as: WO2007115175A2; US7622440B2; CO6140040A2; US20070265206A1; DK2001518T3; EA200802059A1; JP2009532384A; HK1134022A1; ES2430323T3; US20100075895A1; MX2008012663A; EP2001518A4; JP5355383B2; EP2001518B1; IL194262A; AU2007233116B2; EA016804B1; BRPI0709427A2; US8580747B2; AU2007233116A1

Abstract

N-말단과 C-말단을 가지며 나트륨 이뇨 펩타이드 수용체에 결합하고 복수개의 아미노산 잔기와 적어도 하나의 다음 화학식 (I)의 아미노산 대체물 및 적어도 하나의 보결분자단을 포함하여 이루어지는 사이클릭 구조물, 이러한 사이클릭 구조물을 포함하는 약학적 조성물, 및 울혈성 심부전증이나 기타 질환, 항고혈압, 심장혈관계, 신장 또는 내분비적 효능이 요구되는 증상이나 질환을 치료하기 위한 방법이 제공된다.

식 중, R, R', Q, Y, W, Z, J, x 및 n은 명세서에서 정의된 바와 같다.

나트륨 이뇨 펩타이드, 수용체, 아미노산 대체물

Description

사이클릭 나트륨 이뇨 펩타이드 구조물{CYCLIC NATRIURETIC PEPTIDE CONSTRUCTS}

관련출원에 대한 상호참조 사항

본 출원은 2006년 3월 30일 출원된 "고리형 나트륨 이뇨 펩타이드 구조물"이라는 명칭의 미국 가특허출원 60/743,960호 및 2006년 3월 30일 출원된 "보결분자단을 갖는 고리형 나트륨 이뇨 펩타이드 구조물"이라는 명칭의 미국 가특허출원 60/743,961호의 우선권 주장 출원으로서 상기 기초 출원의 명세서와 특허청구범위는 본 발명에 참조 통합되어 있다.

관련출원으로서 국제특허출원 PCT/US07/65632호 "펩타이드 구조물의 아미노산 대체물" (대리인 참조번호: 0307-043-PCT)이 계류 중이며 이 출원의 명세서와 특허청구범위 역시 본 발명에 참조 통합되어 있다.

발명의 분야 (기술분야):

본 발명은 복수개의 아미노산 잔기들과 하나 이상의 고리-구속형 아미노산 대체물 및 임의로 하나 이상의 보결분자단(prosthetic group)을 포함하는 시클릭 나트륨 이뇨 펩타이드 구조물에 관한 것으로, 이 구조물은 나트륨 이뇨 펩타이드 수용체에 결합하며 치료 목적으로 사용될 수 있다.

배경 기술:

1984년 인간의 심방 나트륨 이뇨 펩타이드 (ANP: atrial natriuretic peptide) 서열과 유전자 구조가 동정된 이래로 나트륨 이뇨 펩타이드 시스템은 집중적으로 탐구되어왔다. ANP는 때때로, "ANF", 또는 심방 나트륨 이뇨 인자라고도 불린다. ANP는 나트륨 이뇨 펩타이드 시스템의 일부로서, 이것은 사람에 있어서 ANP 유전자와 관련되는데, 이 유전자는 후번역 프로세싱에서 분화를 통해 ANP와 유로딜라틴을 모두 결과시키며 이 유로딜라틴은 BNP 또는 뇌 나트륨 이뇨 펩타이드를 생산하고 이 유전자는 다시 CNP 또는 c형 나트륨 이뇨 펩타이드를 생산한다. ANP, 유로딜라틴, BNP 및 CNP는 각각 시스테인-시스테인 디설파이드 결합에 의해 형성된 17 아미노산 루프를 갖는 고리 구조로 되어 있다. 인간의 ANP(hANP)의 아미노산 서열과 구조를 도 1에 도시하였다. ANP, 유로딜라틴, BNP 및 CNP는 밀접하게 연관되어 있고, 고리 구조 내의 5 또는 6개 아미노산이 다르며, N- 및 C-말단 꼬리는 실질적으로 다르다.

ANP, BNP 및 CNP는 각각 서로 다른 수용체인 나트륨 이뇨 펩타이드 수용체 A, B 및 C (NPRA, NPRB 및 NPRC)에 대해 특이적이다. NPRA 및 NPRB는 구아닐릴 사이클라제에 결합되는 반면, NPRC는 G-단백질 연결된 소거 수용체이다. ANP, BNP 및 CNP는 이제까지 동정된 일차적인 내인성 포유류 나트륨 이뇨 펩타이드들이다. 그러나, 동정된 것들 중에는 비포유류성 나트륨 이뇨 펩타이드들이 몇가지 있으며 이들은 포유류에서도 치료 효과를 갖는 것일 수 있다. 여기에는 연어의 나트륨 이뇨 또는 심장 펩타이드(sCP), 심실 나트륨 이뇨 펩타이드 (VNP), 도마뱀과 여러가지 물고기에서 동정된 심장 나트륨 이뇨 펩타이드 및 맘바뱀의 뱀독에서 동정된 나트륨이뇨 펩타이드, 덴드로아스피스의 나트륨이뇨 펩타이드 (DNP), 대만 뱀독에서 분리된 3가지 나트륨 이뇨-유사 펩타이드(TNP-a, TNP-b, 및 TNP-c)가 포함된다. 일반적으로 Tervonen V, Ruskoaho H, Lecklin T, Ilves M, Vuolteenaho O 참조. 연어의 심장 나트륨 이뇨 펩타이드는 부피를 조절하는 호르몬이다. 　Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 283:E353-61 (2002); Takei Y, Fukuzawa A, Itahara Y, Watanabe TX, Yoshizawa Kumagaye K, Nakajima K, Yasuda A, Smith MP, Duff DW, Olson KR. 새로운 나트륨 이뇨 펩타이드가 송어의 심방으로부터 분리된 바 있다. Oncorhynchus mykiss. FEBS Lett. 414:377-80 (1997); 　Schweitz H, Vigne P, Moinier D, Frelin C, Lazdunski M. 또한 녹색 바 (Dendroaspis angusticeps)의 독에도 나트륨 이뇨 펩타이드 패밀리의 새로운 멤버가 존재한다. J. Biol. Chem. 267:13928-32 (1992); Lisy O, Jougasaki M, Heublein DM, Schirger JA, Chen HH, Wennberg PW, Burnett JC. Renal actions of synthetic dendroaspis natriuretic peptide.　 Kidney Int. 56:502-8 (1999); 및 Fry BG, Wickramaratana JC, Lemme S, Beuve A, Garbers D, Hodgson WC, Alewood P. 인랜드(Oxyuranus microlepidotus)의 뱀독으로부터 새로운 나트륨 이뇨 펩타이드가 분리되었다: 분리, 화학적 및 생물학적 특징화. Biochem. Biophys. Res. Comm. 327:1011-1015 (2005).

ANP는 주로 심방 압력의 증가에 반응하여 내인적으로 분비되지만, 다른 원인, 예컨대 시토카인 수용체의 자극도 이러한 내인성 분비의 원인이 될 수 있다. 일단 분비되면, ANP는 혈압, 나트륨 및 플루이드 항상성의 호르몬 조절자로서, 혈관확장 효과를 부여하며, 심장혈관 리모델링 등에 영향을 미친다. 따라서, 내인성 ANP를 비롯하여 ANP는 만성적으로 활성화된 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템에 대한 방어능을 부분적으로 제공함으로써 울혈성 심부전증 및 기타 심장혈관 질환에 대해 효과적이다. 순환 ANP는 두가지 메카니즘, 즉 나트륨 이뇨 펩타이드 수용체에 대한 결합과 효소적 분해에 의해 순환계로부터 신속히 제거된다.

인간의 ANP는 또한 야생형 인간 ANP, hANP, ANP(1-28) 및 ANP(99-126) (후자는 분비 중 C-말단 대역의 Arg⁹⁸ - Ser⁹⁹에서 일반적으로 절단되는, proANP(1-126) 내의 해당 서열을 칭한다)으로도 칭해진다. 이하에서 인간의 ANP는 때로 "hANP"로 칭하기로 한다.

일반적으로, 나트륨 이뇨 펩타이드 및 이의 변형체는 울혈성 심부전증, 신장 고혈압, 급성 신부전 및 관련 질환 뿐만 아니라, 이뇨, 나트륨 이뇨 및/또는 혈관확장 반응이 치료 또는 예방 효과를 갖는 여하한 질병이나 증상을 치료하는데 유용한 것으로 믿어지고 있다. ANP를 비롯한 나트륨 이뇨 펩타이드, 및 심부전증에 있어서 나트륨 이뇨 펩타이드 시스템의 용도를 설명한 논문 중 하나는 Schmitt M., Cockcroft J.R., and Frenneaux M.P. Modulation of the natriuretic peptide system in heart failure: from bench to bedside Clinical Science 105:141-160 (2003)이다.

대단히 많은 수의 ANP 모방물질(mimetics)과 변형체가 만들어져 왔고, 이들 중 몇몇은 실제로 ANP로부터 크기가 감소된 것이다. ANP 버젼에서 크기는 감소되었 으나 생물학적으로 활성적인 것으로 H-Met-cyclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH₂ (SEQ ID NO:1)를 들 수 있는데 이것은 Li B, Tom JY, Oare D, Yen R, Fairbrother WJ, Wells JA, Cunningham BC. Minimization of a polypeptide hormone. Science 270:1657-60 (1995)에 기재되어 있다. 이 15-mer 펩타이드는 흔히 "mini-ANP"로 칭해진다.

한가지 이상의 인자에 기초해서 야생형 나트륨 이뇨 펩타이드에 비해 우수하다고 주장되는, 나트륨 이뇨 펩타이드의 여러가지 합성 모방체에 대해 많은 특허가 허여되고 특허출원되었다. 여기에는 다음이 포함된다. 미국특허: 4,496,544; 4,609,725; 4,656,158; 4,673,732; 4,716,147; 4,757,048; 4,764,504; 4,804,650; 4,816,443; 4,824,937; 4,861,755; 4,904,763; 4,935,492; 4,952,561; 5,047,397; 5,057,495; 5,057,603; 5,091,366; 5,095,004; 5,106,834; 5,114,923; 5,159,061; 5,204,328; 5,212,286; 5,352,587; 5,376,635; 5,418,219; 5,665,704; 5,846,932; 5,583,108; 5,965,533; 6,028,055; 6,083,982; 6,124,430; 6,150,402; 6,407,211; 6,525,022; 6,586,396 및 6,818,619; 및 미국특허출원 공개: 2004/0002458; 2004/0063630; 2004/0077537; 2005/0113286; 2005/0176641; 2006/0030004. 또한, 다음과 같은 여러개의 미국 외의 다른 나라의 특허 및 특허출원들도 관련 구조물을 개시하고 있다: WO 85/04870; WO 85/04872; WO 88/03537; WO 88/06596; WO 89/10935; WO 89/05654; WO 90/01940; WO 90/14362; WO 92/06998; WO 95/13296; WO 99/08510; WO 99/12576; WO 01/016295; WO 2004/047871; WO 2005/072055; EPO 0 291 999; EPO 0 323 740; EPO 0 341 603; EPO 0 350 318; EPO 0 356 124; EPO 0 385 476; EPO 0 497 368; 및 EPO 0 542 863. "바소나트린(vasonatrin) 펩타이드"와 같은 펩타이드 및 ANP와 CNP의 키메라로 설명되는 것과 같은 키메라 나트륨 이뇨 펩타이드가 미국특허 5,583,108에 설명되어 있고, 미국특허 6,407,211 및 6,818,619에는 덴드로아스피스의 키메라 펩타이드가 기재되어 있다. 전술한 특허나 특허출원 각각의 개시 내용은 본 명세서에 모두 참고로 통합되어 있다.

미국에서 식품의약관리국(FDA)에 의해 승인된 나트륨 이뇨 펩타이드 제품이 하나 있는데 이 제품은 일반명칭 네스트리타이드(nestritide) 및 상표명 Natrecor

(Scios Inc.)로서 시판되고 있다. 이 제품은 재조합 DNA 기술을 이용하여 E. coli로부터 제조된 인간의 B형 나트륨 이뇨 펩타이드이다. 이 제품은 휴식중 또는 최소한의 활동 중에도 호흡곤란을 일으키는 급성 대상부전형 울혈성 심부전증을 앓는 환자들의 치료를 위한 정맥 주입 형태로만 승인되었다. 네스트리타이드는 효과적이긴 하지만, 그의 약동학과 반감기의 특성상 오직 정맥 주입으로만 사용이 가능할 뿐이기 때문에, 병원이나 숙련된 의료 센터 세팅하에서만 이 약물을 사용할 수 있다는 한계가 있다.

이제까지 다수의 화합물이 개발되었음에도 불구하고, 실제로 어느 것도 상업화에 성공하거나 활발하게 임상 개발되고 있는 것은 없다. 따라서 효능, 반감기, 투여 경로, 생체이용성 측면에서 개선되거나 또는 효능 지속기간이 연장되는 등 여러가지 특징이 개선되고, 한가지 이상의 치료적 증상에 대해서도 효과적이면서 외래 환자들에게도 투여가능한 제품이 실질적으로 필요하다.

발명의 간단한 개요

한가지 측면에서 본 발명은 비한정적인 예로서 ANP, BNP, CNP, sCP, DNP, TNP-a, TNP-b 또는 TNP-c에 대한 수용체를 비롯한 나트륨 이뇨 펩타이드에 대한 수용체에 결합하는 사이클릭 구조물에 대한 것으로, 여기서 이 구조물은 복수개의 아미노산 잔기, 다음 화학식 I을 갖는 적어도 하나의 아미노산 대체물:

식 중, R 및 R'는 각각 독립적으로 H 또는 천연 또는 비천연 아미노산 측쇄 모이어티 또는 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체이고; x는 1 또는 2; Y는 CH₂ 또는 C=O; W는 CH₂, NH 또는 NR'"; Z는 H 또는 CH₃; n은 0, 1 또는 2; J는 대체물이 구조물의 C-말단 위치에 있지 않는 경우 -C(=O)-이며, C-말단 위치에 있는 경우 J는 -H, -OH, -C(=O)-OH, -C(=O)-NH₂ 또는 a C-말단 캡핑기(capping group)이며; Q는 대체물이 구조물의 N-말단 위치에 있지 않는 경우 결합을 나타내고, N-말단 위치에 있는 경우 Q는 -H 또는 아민 캡핑기이고; R'"은 아실, C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 알킬쇄, C₂ 내지 C₁₉ 직쇄 또는 분지상 알킬 아실쇄, C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 오메가 아미노 지방족, 또는 C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 오메가 아미노 지방족 아실이다; 적어도 하나의 아미노산 잔기의 측쇄 중의 반응성 기에 공유적으로 결합되거나, 대체물이 구조물의 N-말단 위치에 있는 경우 아민 캡핑기에 공유적으로 결합되거나, 또는 대체물의 구조물의 C-말단 위치에 있는 경우 C-말단 캡핑기에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 보결분자단을 임의로 포함할 수 있고; 별표 표시된 탄소 원자는 어떠한 입체화학적 배치로도 있을 수 있다. 상기 구조물은 두개의 아미노산 잔기 사이의 측쇄들 사이, 아미노산 잔기 측쇄와 아미노산 대체물의 R 또는 R'기 사이, 두개의 아미노산 대체물의 R 또는 R'기 사이, 구조물의 말단기와 아미노산 잔기 측쇄 사이, 또는 구조물의 말단기와 아미노산 대체물의 R 또는 R'기 사이의 결합에 의해 고리화된 사이클릭 구조물이다. 바람직하게는 측쇄 사이에 결합을 형성하는 두개의 아미노산 잔기들은 약 8 내지 10개의 아미노산 잔기와 임의로 0, 1 또는 2개의 아미노산 대체물 사이에 의해 분리되는 것이 좋다. 복수개의 아미노산 잔기들은 천연 또는 비천연 α-아미노산, β-아미노산, α,α-이치환 아미노산 및 N치환 아미노산 중에서 선택된 여하한 아미노산 잔기를 포함하며, 전술한 것들에는 (R) 또는 (S) 입체배열이 모두 포함된다.

보결분자단(들)은 하나 이상의 탄소 및 수소 원자와, 임의로 산소를 비롯한 다른 원자를 포함하는 반복 단위를 포함하는 폴리머기(polymeric group)를 포함할 수 있다. 이러한 폴리머기는 수용성 폴리머인 것이 좋고, 바람직하게는 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린 또는 폴리(아크릴로일모르폴린)인 것이 좋다. 바람직한 폴리(알킬렌 옥사이드)는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)로서, 필요에 따라 연결기를 갖도록 변형될 수 있다.

한가지 측면에서, J는 다음에서 선택된 C-말단 캡핑기로서 하기 나열된 것에는 (R) 또는 (S) 입체배열이 모두 포함된다:

-(CH₂)_m-OH,

-C(=O)-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂),

-C(=O)-O-(CH₂)_m-CH₃,

-O-(CH₂)_m-CH₃,

-O-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂),

-O-(CH₂)_m-OH,

-C(=O)-NH-(CH₂)_m-S(v₁),

-C(=O)-NH-(CH₂)_m-CH₃,

-C(=O)-NH-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂),

-C(=O)-N-((CH₂)_m-N(v₁)(v₂))₂,

-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-OH)-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂),

-C(=O)-NH-(CH₂)_m-NH-C(=O)-CH(N(v₁)(v₂))((CH₂)_m-N(v₁)(v₂)), 또는

-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-N(v₁)(v₂))-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂);

상기 식 중, v₁ 및 v₂는 각각 독립적으로 H 또는 C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지 상 알킬쇄이고 m은 각각의 경우 독립적으로 0 내지 17이다.

또 다른 측면에서, 아미노산 대체물이 구조물의 C-말단 위치에 있는 경우, J는 오메가 아미노 지방족, 말단 아릴 또는 아르알킬기 또는 여하한 단일의 천연 또는 비천연 α-아미노산, β-아미노산, α,α-이치환 아미노산 또는 N-치환 아미노산으로 된 C-말단 캡핑기이며, α,α-이치환 아미노산의 경우 치환기들이 서로 다를 경우 (R) 또는 (S) 입체배열이 모두 포함되고, 필요에 따라, 상기 정의한 바와 같은 C-말단 캡핑기와 조합된다.

또 다른 측면에서, Q는 다음 중에서 선택된 아민 캡핑기이다:

-(CH₂)_m-N(v₃)(v₄),

-(CH₂)_m-CH₃,

-(CH₂)_m-O(v₃),

-(CH₂)_m-C(=O)-(v₃),

-(CH₂)_m-C(=O)-O-(v₃),

-(CH₂)_m-S(v₃),

-C(=O)-(CH₂)_m-CH₃,

-C(=O)-(CH₂)_m-N(v₃)(v₄),

-C(=O)-(CH₂)_m-C(=O)-(v₃),

-C(=O)-(CH₂)_m-O(v₃), or

-C(=O)-(CH₂)_m-S(v₃);

식 중, v₃ 및 v₄는 각각 독립적으로 H, C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 알킬쇄 또는 C₂ 내지 C₁₉ 직쇄 또는 분지상 알킬 아실쇄이고, v₃ 또는 v₄ 중 하나가 알킬 아실쇄이면 v₃ 또는 v₄ 중 다른 하나는 H이며, m은 0 내지 17이다.

관련 측면에서, 화학식 I의 아미노산 대체물은 구조물의 C-말단 위치에 있으며, R과 R'중 적어도 하나는 천연 또는 비천연 아미노산 측쇄 모미어티이거나 적어도 하나의 질소 원자를 포함하는 헤테로원자기를 갖는 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체이며 R과 R' 중 나머지 하나는 H 또는 천연 또는 비천연 아미노산 측쇄 모이어티이거나 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체이다.

관련 구체예에서, 본 발명은 비제한적인 예로서 ANP, BNP, CNP, sCP, DNP, TNP-a, TNP-b 또는 TNP-c를 비롯한 나트륨 이뇨 펩타이드에 대한 수용체에 결합하는 구조물을 제공하며, 여기서 상기 구조물은 복수개의 아미노산 잔기 및, C-말단 위치나 N-말단 위치를 제외한 위치에 위치하며 두개의 펩타이드 결합에 의해 공유 결합되고 다음 화학식 II를 갖는 적어도 하나의 아미노산 대체물을 포함한다:

식 중, R과 R'은 각각 독립적으로 H 또는 천연 또는 비천연 아미노산 측쇄 모이어티 또는 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체; x는 1 또는 2; Y는 CH₂ 또는 C=O; W는 CH₂,NH 또는 NR'"; Z는 H 또는 CH₃; R'"은 아실, C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 알킬쇄, C₂ 내지 C₁₉ 직쇄 또는 분지상 알킬 아실쇄, C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 오메가 아미노 지방족, 또는 C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 오메가 아미노 지방족 아실; n은 0, 1 또는 2이며; 별표로 표시된 탄소 원자들은 여하한 입체화학 입체배열을 가질 수 있고; 파선은 펩타이드 결합을 형성하는 결합을 나타낸다.

화학식 I의 대체물이 구조물의 C-말단에 위치하는 경우, 단일 펩타이드 결합에 의해 공유적으로 결합됨으로서, 이 대체물은 다음 화학식을 갖는다:

식 중, 파선은 펩타이드 결합을 형성하는 결합을 나타낸다. 대체물이 구조물의 N-말단에 있는 경우, 화학식 I인 것이 좋고, 대체물이 다음 구조를 가지도록 단일의 펩타이드 결합에 의해 공유적으로 결합되는 것이 좋다:

식 중, 파선은 펩타이드 결합을 형성하는 결합을 나타낸다. 그러나, 대체물이 구조물의 N-말단이나 C-말단 이외의 위치에 있는 경우에는, 화학식 II인 것이 좋고 두개의 펩타이드 결합에 의해 공유적으로 결합되는 것이 좋다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는, 본 발명의 구조물에 하나의 아미노산 대체물을 사용할 수도 있고, 두개의 아미노산 대체물을 사용할 수도 있으며, 또는 두개보다 많은 아미노산 대체물을 본 발명의 구조물에 사용할 수도 있다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 아미노산 잔기들 사이의 하나 이상의 펩타이드 결합이 비펩타이드 결합에 의해 치환된 구조물을 제공한다.

본 발명의 주목적은 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 하나 이상의 아미노산 잔기들이 고리-구속형 아미노산 대체물에 의해 치환된 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 포유류에게 투여될 경우 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열에 비해 한가지 이상의 장점을 나타내는 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것으로, 상기 장점이란 효소 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 순환 반감기, 증가된 생체이용성, 증가된 효능, 연장된 효능 기간 및 이들의 조합 중에서 선택된다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열과 동일한 농도에서 최대 cGMP 자극 활성의 적어도 10%의 자극 활성을 갖는 것인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열과 동일한 농도에서 최대 cGMP 자극 활성의 적어도 50%의 자극 활성을 갖는 것인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열과 동일한 농도에서 최대 cGMP 자극 활성의 적어도 100%의 자극 활성을 갖는 것인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열과 동일한 농도에서 최대 cGMP 자극 활성의 100%를 초과하는 자극 활성을 갖는 것인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 평형 수용체 결합 친화도가, Ki(nM)값으로 측정시 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열의 Ki(nM) 값의 3배까지 높은 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 평형 수용체 결합 친화도가, Ki(nM)값으로 측정시 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열의 Ki(nM) 값과 같거나 그보다 낮은 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 평형 수용체 결합 친화도가, Ki(nM)값으로 측정시 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열의 Ki(nM) 값보다 낮은 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 나트륨 이뇨 펩타이드 수용체에 대한 수용체 결합 친화도가 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열의 수용체 결합 친화도보다 더 큰 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 효능이, 혈압 저하 또는 소변 배출량의 경시적 증가에 의해 측정될 때, 동일 투여량에서 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열의 생물학적 효능과 같은 정도이거나 더 효과적인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 효능이, 혈압 저하 또는 소변 배출량의 경시적 증가에 의해 측정될 때, 동일 투여량에서 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열의 생물학적 효능보다 더 효과적인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 나트륨 이뇨 펩타이드의 서열에 대해 적어도 약 60%의 상동성을 갖는 것인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 나트륨 이뇨 펩타이드의 서열에 대해 적어도 약 80%의 상동성을 갖는 것인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 ANP, BNP, CNP, sCP, DNP, TNP-a, TNP-b 또는 TNP-c에 대한 수용체와 결합하는 펩타이드 서열에 대해 적어도 약 60%의 상동성을 갖는 것인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 ANP, BNP, CNP, sCP, DNP, TNP-a, TNP-b 또는 TNP-c에 대한 수용체와 결합하는 펩타이드 서열에 대해 적어도 약 80%의 상동성을 갖는 것인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 H-Met-cyclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH₂ (SEQ ID NO:1) 서열에 대해 적어도 약 60%의 상동성을 갖는 것인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 H-Met-cyclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH₂ (SEQ ID NO:1) 서열에 대해 적어도 약 80%의 상동성을 갖는 것인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 sequence H-Met-cyclo(Xaa-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Xaa)-Tyr-Arg-NH₂ (SEQ ID NO:2) 서열에 대해 적어도 약 60%의 상동성을 갖는 것인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 sequence H-Met-cyclo(Xaa-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Xaa)-Tyr-Arg-NH₂ (SEQ ID NO:2) 서열에 대해 적어도 약 80%의 상동성을 갖는 것인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 ANP에 대한 수용체에 결합하는 것인, 본 명세서에 정의된 바와 같은 대체물을 포함하는 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 BNP에 대한 수용체에 결합하는 것인, 본 명세서에 정의된 바와 같은 대체물을 포함하는 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 ANP 또는 BNP의 천연 또는 재조합 형태에 비해 생체이용성과 반감기가 더 높은 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 묵적은 울혈성 심부전 증상을 앓는 환자에게 투여될 수 있는 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 정맥 투여에 더해 적어도 한가지 이상의 투여 경로에 의해 투여될 수 있는 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 피하 또는 근육 주사에 의해 환자에게 투여될 수 있는 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 분해 내성은 증가된 한편 그의 수용체에 대해 유의적으로 높은 결합 친화도를 갖는 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서방형 배합물 형태로 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 기타의 목적, 장점 및 신규한 특징과 추가적인 응용 범위의 일부는 이하의 첨부된 도면을 참조로 명세서 설명 중에 제시될 것이며, 일부분은 다음 명세서를 시험할 경우 당업자에게 자명하거나, 또는 본 발명의 실시예 의해 명백히 드러날 것이다. 본 발명의 목적과 장점들은 특히 특허청구범위에 구체적으로 지적된 수단과 조합에 의해 실현 및 달성될 수 있다.

본 발명은 복수개의 아미노산 잔기, 적어도 하나의 고리-구속형(ring-constrained) 아미노산 대체물 및 임의로 적어도 하나의 보결분자단으로 만들어진 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공한다. 본 발명에 사용된 고리-구속형 아미노산 대체물은 바람직하게는 Fmoc과 같은 보호기 및, 반응성 카르복실 C-말단을 이용하여 통상적인 아미노 보호된 N-말단을 갖도록 만들어질 수 있는 것이고 따라서 통상적인 펩타이드 합성 방법학에서 사용될 수 있는 것이 좋으며, 상기 아미노산 대체물이 구조물의 C-말단 위치에 있는 경우, 카르복실 말단 이외의 것이 그러한 대체물 상에 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 적절히 변형된 펩타이드 합성 기술을 이용하여 합성되며, 복수개의 아미노산 잔기와 적어도 하나의 고리-구속형 아미노산 대체물을 포함하는 합성적으로 제조된 구조물을 제공한다. 바람직한 관련 구체예에서, 이러한 구조물은 적어도 하나의 보결분자단을 추가로 포함한다.

바람직한 보결분자단은 하나 이상의 탄소 및 수소 원자 및 임의로 산소를 비롯한 다른 원자를 포함하는 반복 단위를 포함하여 이루어지는 폴리머기를 포함한다. 이러한 폴리머기는 바람직하게는 수용성 폴리머인 것이 좋으며, 바람직하게는 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린 또는 폴리(아크릴로일모르폴린)인 것이 좋다. 바람직한 폴리(알킬렌 옥사이드)는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)로서, 필요에 따라 연결기를 갖도록 변형될 수 있다.

한가지 측면에서, 본 발명은 ANP나 BNP와 같은 공지의 나트륨 이뇨 펩타이드의 상동체이거나, 또는 나트륨 이뇨 펩타이드의 여하한 공지의 펩타이드 변형체의 상동체인 아미노산 서열을 갖는 구조물을 제공하며, 여기서 상기 구조물은 화학식 I 또는 II의 아미노산 대체물을 적어도 하나 포함하는 것이다. 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열은 공지의 나트륨 이뇨 펩타이드 또는 공지의 펩타이드 변형체와 동일하거나, 또는 이에 상동적일 수 있으며, 예컨대, 적어도 60% 상동적이거나 또는 더욱 바람직하게는 적어도 약 80% 상동적일 수 있다. 본 명세서에서, "아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열"이라는 표현은 대체물을 포함하지 않는 나트륨 이뇨 펩타이드에 대한 수용체에 결합하는, 공지의 아미노산 서열을 비롯한 아미노산 서열을 의미하는 것이다. 이러한 공지의 아미노산 서열은 만일 그 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산 대체물의 치환이나 부가를 제외하고 동일하다면 그 구조물과 동일하다. 마찬가지로, 상동성은 하나 이상의 아미노산 대체물의 치환 또는 부가를 제외하고 그 구조물에 대한 공지 아미노산 서열의 아이덴터티를 참조로 결정된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 나트륨 이뇨 펩타이드에 대한 수용체에 결합하는 공지 펩타이드를 모델로 한, 그러나 하나 이상의 아미노산 대용체를 포함하는 구조물을 제공하며, 여기서 상기 대용체는 공지 펩타이드에 함유된 아미노산 잔기를 하나 이상 대체는 것이거나, 공지 펩타이드를 포함하는 서열에 부가적인 것이다. 공지의 펩타이드는 해당 기술분야에 알려진 여하한 나트륨 이뇨 펩타이드일 수 있으며, 본 명세서에 언급된 모든 공개문헌, 특허, 특허출원, 예를 들어, 미국특허 4,496,544; 4,609,725; 4,656,158; 4,673,732; 4,716,147; 4,757,048; 4,764,504; 4,804,650; 4,816,443; 4,824,937; 4,861,755; 4,904,763; 4,935,492; 4,952,561; 5,047,397; 5,057,495; 5,057,603; 5,091,366; 5,095,004; 5,106,834; 5,114,923; 5,159,061; 5,204,328; 5,212,286; 5,352,587; 5,376,635; 5,418,219; 5,665,704; 5,846,932; 5,583,108; 5,965,533; 6,028,055; 6,083,982; 6,124,430; 6,150,402; 6,407,211; 6,525,022; 6,586,396 또는 6,818,619; 미국특허출원 공개 2004/0002458; 2004/0063630; 2004/0077537; 2005/0113286; 2005/0176641; 또는 2006/0030004; 또는 여러가지 미국 이외의 특허 및 특허출원, 예컨대, WO 85/04870; WO 85/04872; WO 88/03537; WO 88/06596; WO 89/10935; WO 89/05654; WO 90/01940; WO 90/14362; WO 92/06998; WO 95/13296; WO 99/08510; WO 99/12576; WO 01/016295; WO 2004/047871; WO 2005/072055; EPO 0 291 999; EPO 0 323 740; EPO 0 341 603; EPO 0 350 318; EPO 0 356 124; EPO 0 385 476; EPO 0 497 368; 또는 EPO 0 542 863에 기재된 것을 포함하나 이들 문헌에 한정되지 않는다. 한가지 측면에서 공지의 펩타이드는 미국특허 4,656,158, 4,824,937, 4,935,492, 5,159,061, 5,204,328, 5,376,635, 5,665,704, 5,846,932, 6,028,055, 6,407,211, 6,525,022, 6,586,396, 또는 6,818,619, 미국 특허출원 공개 2004/0002458, 2004/0063630, 또는 2005/0176641, 또는 국제특허출원 공개 WO 2004/047871 또는 WO 2005/072055에 기재된 펩타이드이거나 그의 상동체이다. 전술한 각각의 특허 및 특허출원의 기재 내용은 본 명세서에 그 전체 내용이 참조 통합되어 있다.

특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 나트륨 이뇨 펩타이드 수용체에 결합하는 아미노산 서열을 포함하는 구조물을 제공하며, 여기서, 나트륨 이뇨 펩타이드 수용체에 결합하는 이러한 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기는 화학식 I의 아미노산 대용체에 의해 치환되어 있는 것이다. 한가지 측면에서, 나트륨 이뇨 펩타이드 수용체에 결합하는 아미노산 서열은, 치환 전에는, H-Met-cyclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH₂ (SEQ ID NO:1)이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라 ANP 또는 BNP에 대한 수용체를 비롯하여 나트륨 이뇨 펩타이드에 대한 수용체에 결합하는 한편, 화학식 I 또는 II의 아미노산 대체물을 적어도 하나 포함하는 구조물이 제공되는데, 단, 상기 구조물은 나트륨 이뇨 펩타이드에 대한 수용체에 결합하는 여하한 공지의 펩타이드와는 상동적이지 않은 것이다.

한가지 구체예에서, 본 발명은 다음 화학식 III의 사이클릭 구조물을 제공한다:

식 중, Aaa¹은 α-아미노산 또는 β-아미노산 또는 α-아미노산으로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산의 L- 또는 D-이성질체이며, 구체적으로, Aaa¹은 Nle, Ala, Leu, Ile, Val, Arg, Phe, Lys, Tyr, Asp, Nva, Met, Met(O), 또는 Met(O₂)를 포함하거나 이로부터 유도된 α-아미노산 또는 β-아미노산, 또는 Nle, Ala, Leu, Ile, Val, Arg, Phe, Lys, Tyr, Asp, Nva, Met, Met(O), 또는 Met(O₂)로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산의 L- 또는 D-이성질체로서, 치환기가 서로 다른 경우 α,α-이치환 아미노산의 모든 (R) 또는 (S) 입체배열이 이에 포함되며, 또는 Aaa¹은 C₂ 내지 C₁₈ 직쇄 알킬, C₃ 내지 C₁₇ 분지상 알킬, C₂ 내지 C₁₈ 직쇄 알케닐 또는 알키닐 또는 C₃ 내지 C₁₈ 분지상 알케닐 또는 알키닐을 포함하는 아실이거나, 또는 Aaa¹은 다음 구조를 갖는 아미노산 대체물이다:

식 중, 파선은 펩타이드 결합; R 및 R'은 독립적으로 H, 직쇄 또는 분지상 C₁ 내지 C₆ 지방족쇄, -(CH₂)_y-S-CH₃, -(CH₂)_y-S(=O)-CH₃, -(CH₂)_y-S(O₂)-CH₃, 결합 및 시클로프로판, 시클로부탄, 사이클펜탄, 또는 사이클헥산 고리, 또는 C₁ 내지 C₃ 지방족쇄 및 시클로프로판, 시클로부탄, 사이클펜탄, 또는 사이클헥산 고리; x는 1 또는 2; Y는 CH₂ 또는 C=O; W는 CH₂, NH 또는 NR'"; Z는 H 또는 CH₃; Q는 -H, -(CH₂)_m-N(v₃)(v₄), -(CH₂)_m-CH₃, -(CH₂)_m-O(v₃), -(CH₂)_m-C(=O)-(v₃), -(CH₂)_m-C(=O)-O-(v₃), -(CH₂)_m-S(v₃), -C(=O)-(CH₂)_m-CH₃, -C(=O)-(CH₂)_m-N(v₃)(v₄), -C(=O)-(CH₂)_m-C(=O)-(v₃), -C(=O)-(CH₂)_m-O(v₃), 또는 -C(=O)-(CH₂)_m-S(v₃); R'"은 아실, C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 알킬쇄, C₂ 내지 C₁₉ 직쇄 또는 분지상 알킬 아실쇄, C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 오메가 아미노 지방족, 또는 C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 오메가 아미노 지방족 아실; n은 0, 1 또는 2; m은 0 내지 17; y는 1 내지 5; v₃ 및 v₄ 는 각각 독립적으로 H, C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 알킬쇄 또는 C₂ 내지 C₁₉ 직쇄 또는 분지상 알킬 아실쇄이고, 단, v₃ 또는 v₄ 중 하나가 알킬 아실쇄이면, v₃ 또는 v₄ 중 다른 하나는 H이며; 별표 표시된 탄소 원자들은 여하한 입체화학적 입체배열을 가질 수 있다;

Aaa² 및 Aaa¹³은 같거나 다르고, 각각 Aaa²와 Aaa¹³각각의 측쇄를 통해 환형 다리를 형성하는 L- 또는 D-이성질체 아미노산 잔기들이며, 이 때 상기 환형 다리의 연결기는 -S-S-, -S-CH₂-S-, -S-CH₂-, -CH₂-S-, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-, -CH₂-NH-, -NH-CH₂-, -CH₂-S(O)_n-이고, 여기서 n은 1 또는 2, -S(O)_n-CH₂-, 여기서 n은 1 또는 2, -CH₂-CH₂-, -CH=CH- (E 또는 Z), -C=C-, -C(=O)-O-, -O-C(=O)-, -C(=O)-CH₂-, -CH₂-C(=O)-, -O-C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-O-, 또는 -NH-C(=O)-NH-이다;

Aaa³은 His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Dap, 또는 Dab을 포함하거나 이들로부터 유도된 α-아미노산 또는 β-아미노산, 또는 His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Dap, 또는 Dab으로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산의 L- 또는 D-이성질체로서, 치환기들이 서로 다른 경우 α,α-이치환 아미노산의 모든 (R) 또는 (S) 입체배열이 이에 포함되며, 또는 Aaa³는 다음 구조를 갖는 아미노산 대체물이다:

식 중, R 및 R'은 독립적으로 H 또는 His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Dap, 또는 Dab의 아미노산 측쇄 모이어티이거나 또는 His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Dap, 또는 Dab의 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체이며; x는 1 또는 2; Y는 CH₂ 또는 C=O; W는 CH₂, NH 또는 NR'"; Z는 H 또는 CH₃; R'"는 아실, C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 알킬쇄, C₂ 내지 C₁₉ 직쇄 또는 분지상 알킬 아실쇄, C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 오메가 아미노 지방족, 또는 C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 오메가 아미노 지방족 아실이고; n은 0, 1 또는 2이다;

Aaa⁴는 치환 또는 비치환 Phe, HPhe 또는 Pgl, 또는 Tyr, Leu, Ile, Val, Ala, Nle, Nva 또는 Tle을 포함하거나 이들로부터 유도된 α-아미노산 또는 β-아미노산, 또는 치환 또는 비치환 Phe, HPhe 또는 Pgl, 또는 Tyr, Leu, Ile, Val, Ala, Nle, Nva 또는 Tle로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산의 L- 또는 D-이성질체로서, 치환기가 서로 다를 경우 α,α-이치환 아미노산의 모든 (R) 또는 (S)입체배열이 포함되며, 또는 Aaa⁴은 Aaa³ 에서처럼 아미노산 대체물로서, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 치환 또는 비치환 Phe, HPhe 또는 Pgl, 또는 Tyr, Leu, Ile, Val, Ala, Nle, Nva 또는 Tle의 아미노산 측쇄 모이어티이거나 또는 치환 또는 비치환 Phe, HPhe 또는 Pgl, 또는 Tyr, Leu, Ile, Val, Ala, Nle, Nva 또는 Tle의 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체이다;

Aaa⁵는 Gly, Sar; Ala, 또는 Aib를 포함하거나 이들로부터 유도된 α-아미노산 또는 β-아미노산, Ala로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산의 L- 또는 D-이성질체이거나, 또는 Aaa⁵는 Aaa³ 에서처럼 아미노산 대체물로서, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 -CH₃이다;

Aaa⁶는 Gly, Sar; Ala, 또는 Aib를 포함하거나 이들로부터 유도된 α-아미노산 또는 β-아미노산의 L- 또는 D-이성질체이거나, 또는 Aaa⁶는 Aaa³ 에서처럼 아미노산 대체물로서, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 -CH₃이다;

Aaa⁷은 L- Arg, His, Ala, Ser, HSer, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Cit, Abu, Dap, 또는 Dab를 포함하거나 이들로부터 유도된 α-아미노산 또는 β-아미노산, 또는 Arg, His, Ala, Ser, HSer, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Cit, Abu, Dap, 또는 Dab로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산의 L- 또는 D-이성질체로서, α,α-이치환 아미노산에서 치환기들이 서로 다른 경우 모든 (R) 또는 (S) 입체배열이 이에 포함되며, 또는 Aaa⁷은 아미노산 대체물 Aaa³ 에서처럼 아미노산 대체물로서, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 Arg, His, Ala, Ser, HSer, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Abu, Dap, 또는 Dab의 아미노산 측쇄 모이어티 또는 Arg, His, Ala, Ser, HSer, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Abu, Dap, 또는 Dab의 아미노산측쇄 모이어티의 유도체이다;

Aaa⁸은 Gly이거나, Nle, Ile, Leu, Val, Phe, Ala, Nva, Met(O), Met(O₂), 또는 Tle Nle, Ile, Leu, Val, Phe, Ala, Nva, Met(O), Met(O₂), 또는 Tle로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산의 L- 또는 D-이성질체로서, α,α-이치환 아미노산에서 치환기들이 서로 다른 경우 모든 (R) 또는 (S) 입체배열이 이에 포함되며, 또는 Aaa⁸은 Aaa³ 에서처럼 아미노산 대체물로서 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 Nle, Ile, Leu, Val, Phe, Ala, Nva, Met(O), Met(O₂), 또는 Tlean의 아미노산 측쇄 모이어티이거나, 또는 of Nle, Ile, Leu, Val, Phe, Ala, Nva, Met(O), Met(O₂), 또는 Tle의 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체이다 ;

Aaa⁹은 Asp, Glu, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met(O), Met(O₂), Orn, Dap, 또는 Dab을 포함하거나 이들로부터 유도된 α-아미노산 또는 β-아미노산, 또는 Asp, Glu, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met(O), Met(O₂), Orn, Dap, 또는 Dab으로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산의 L- 또는 D-이성질체로서, α,α-이치환 아미노산에서 치환기들이 서로 다른 경우 모든 (R) 또는 (S) 입체배열이 이에 포함되며, 또는 Aaa⁹은 Aaa³ 에서처럼 아미노산 대체물로서, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 Asp, Glu, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met(O), Met(O₂), Orn, Dap, 또는 Dab의 아미노산 측쇄 모이어티이거나 또는 Asp, Glu, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met(O), Met(O₂), Orn, Dap, 또는 Dab의 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체이다;

Aaa¹⁰은 Arg, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Cit, Met(O), Orn, Dap, 또는 Dab을 포함하거나 이들로부터 유도된 α-아미노산 또는 β-아미노산, 또는 Arg, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Cit, Met(O), Orn, Dap, 또는 Dab으로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산의 L- 또는 D-이성질체로서, α,α-이치환 아미노산에서 치환기들이 서로 다른 경우 모든 (R) 또는 (S) 입체배열이 이에 포함되며, 또는 Aaa¹⁰은 Aaa³ 에서처럼 아미노산 대체물로서, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 Arg, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met(O), Orn, Dap, 또는 Dab의 아미노산 측쇄 모이어티 또는 Arg, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met(O), Orn, Dap, 또는 Dab의 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체이다;

Aaa¹¹은 Gly이거나 또는 Nle, Ile, Leu, Val, Phe, Ala, Nva, Cys, HCys, Abu 또는 Tle을 포함하거나 이들로부터 유도된 α-아미노산 또는 β-아미노산, 또는 Nle, Ile, Leu, Val, Phe, Ala, Nva, Cys, HCys, Abu 또는 Tle로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산의 L- 또는 D-이성질체로서, α,α-이치환 아미노산에서 치환기들이 서로 다른 경우 모든 (R) 또는 (S) 입체배열이 이에 포함되고, 또는 Aaa¹¹은 Aaa³ 에서처럼 아미노산 대체물로서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 Nle, Ile, Leu, Val, Phe, Ala, Nva, Cys, HCys, Abu 또는 Tle의 아미노산 측쇄 모이어티이거나 Nle, Ile, Leu, Val, Phe, Ala, Nva, Cys, HCys, Abu 또는 Tle의 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체이다;

Aaa¹²는 Gly이거나, Ser, Nle, Ile, Leu, Val, Phe, Ala, Nva, Arg, Lys, Orn, Cys, HCys, Abu 또는 Tle를 포함하거나 이들로부터 유도된 α-아미노산 또는 β-아미노산, 또는 Ser, Nle, Ile, Leu, Val, Phe, Ala, Nva, Arg, Lys, Orn, Cys, HCys, Abu 또는 Tle로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산의 L- 또는 D-이성질체로서, α,α-이치환 아미노산에서 치환기들이 서로 다른 경우 모든 (R) 또는 (S) 입체배열이 이에 포함되고, 또는 Aaa¹²는 Aaa³ 에서처럼 아미노산 대체물로서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 Ser, Nle, Ile, Leu, Val, Phe, Ala, Nva, Arg, Lys, Orn, Cys, HCys, Abu 또는 Tle의 아미노산 측쇄 모이어티 또는 Ser, Nle, Ile, Leu, Val, Phe, Ala, Nva, Arg, Lys, Orn, Cys, HCys, Abu 또는 Tle의 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체이다;

Aaa¹⁴은 치환 또는 비치환 Phe, HPhe 또는 Pgl, 또는 Tyr, Leu, Ile, Val, Ala, Lys, Orn, Nle, Nva 또는 Tle을 포함하거나 이들로부터 유도된 α-아미노산 또는 β-아미노산, 또는 치환 또는 비치환 Phe, HPhe 또는 Pgl, 또는 Tyr, Leu, Ile, Val, Ala, Lys, Orn, Nle, Nva 또는 Tle로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산의 L- 또는 D-이성질체로서, α,α-이치환 아미노산에서 치환기들이 서로 다른 경우 모든 (R) 또는 (S) 입체배열이 이에 포함되고, 또는 Aaa¹⁴은 Aaa³에서 화학식 II의 아미노산 대체물로서, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 치환 또는 비치환 Phe, HPhe 또는 Pgl, 또는 Tyr, Leu, Ile, Val, Ala, Lys, Orn, Nle, Nva 또는 Tle의 아미노산 측쇄 모이어티 또는 치환 또는 비치환 Phe, HPhe 또는 Pgl, 또는 Tyr, Leu, Ile, Val, Ala, Lys, Orn, Nle, Nva 또는 Tle의 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체이다;

Aaa¹⁵은 Ala, Arg, Orn, Lys, Ala, Dap, Dab, HArg, 또는 HLys을 포함하거나 이들로부터 유도된 α-아미노산 또는 β-아미노산, 또는 Ala, Arg, Orn, Lys, Ala, Dap, Dab, HArg, 또는 HLys로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산의 L- 또는 D-이성질체로서, α,α-이치환 아미노산에서 치환기들이 서로 다른 경우 모든 (R) 또는 (S) 입체배열이 이에 포함되고, 또는 Aaa¹⁵은 다음 구조를 갖는 아미노산 대체물이다:

식 중, 파선은 펩타이드 결합을 나타내고; R과 R' 중 적어도 하나는 -(CH₂)_y-R"이고 R 및 R'의 나머지 하나는 H이며 여기서 R"은 다음과 같다:

-NH₂,

-NH-C(=NH)-NH₂,

-NH-(CH₂)_y-NH₂,

-NH-C(=O)-NH₂,

-C(=O)-NH₂,

-C(=O)-NH-CH₃,

-C(=O)-NH-(CH₂)_y-NH_2,

-NH-C(=NH)-NH-Me,

-NH-C(=NH)-NH-Et,

-NH-C(=NH)-NH-Pr,

-NH-C(=NH)-NH-Pr-i,

-NH-C(=O)-CH₃,

-NH-C(=O)-CH₂-CH₃,

-NH-C(=O)-CH-(CH₃)₂,

-NH-C(=O)-O-CH₃,

-NH-C(=O)-O-CH₂-CH₃,

-NH-C(=O)-O-C-(CH₃)₃,

-NH-C(=O)-NH-CH₃,

-NH-C(=N-C(=O)-O-C-(CH₃)₃)-NH-C(=O)-O-C-(CH₃)₃,

-N(C(=O)-O-C-(CH₃)₃)-C(=NH)-NH-C(=O)-O-C-(CH₃)₃,

식 중, x는 1 또는 2; Y는 CH₂ 또는 C=O; W는 CH₂, NH 또는 NR'"; Z는 H 또는 CH₃; J는 -H, -(CH₂)_m-OH, -C(=O)-CH₂)_m-OH, -C(=O)-CH₂)_m-N(v₁)(v₂), -C(=O)-O-(CH₂)_m-CH₃, -O-(CH₂)_m-CH₃, -O-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂), -O-(CH₂)_m-OH, -C(=O)-NH-(CH₂)_m-CH₃, -C(=O)-NH-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂), -C(=O)-NH-(CH₂)_m-S(v₁), -C(=O)-N-((CH₂)_m-N(v₁)(v₂))₂, -C(=O)-NH-CH(-C(=O)-OH)-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂), -C(=O)-NH-(CH₂)_m-NH-C(=O)-CH(N(v₁)(v₂))((CH₂)_m-N(v₁)(v₂)), -C(=O)-NH-CH(-C(=O)-N(v₁)(v₂))-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂), 오메가 아미노 지방족, 말단 아릴 또는 아르알킬기, 여하한 단일의 천연 또는 비천연 α-아미노산, β-아미노산 또는 α,α-이치환 아미노산 (J를 정의하는 전술한 기들 중 하나와 조합됨), 또는 여하한 단일의 천연 또는 비천연 α-아미노산, β-아미노산 또는 α,α-이치환 아미노산으로서, 전술한 것들의 모든 (R) 및 (S) 입체배열이 포함되며; R'"은 아실, C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 알킬쇄, C₂ 내지 C₁₉ 직쇄 또는 분지상 알킬 아실쇄, C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 오메가 아미노 지방족, 또는 C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 오메가 아미노 지방족 아실; v₁ 및 v₂는 각각 독립적으로 H 또는 C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 알킬쇄; n은 0, 1 또는 2; m은 0 내지 17; y는 1 내지 5이며; 별표 표시된 탄소 원자들은 여하한 입체화학적 입체배열을 가질 수 있고;

이 때 Aaa¹, Aaa³ 내지 Aaa¹², Aaa¹⁴ 또는 Aaa¹⁵ 중 적어도 하나는 아미노산 대체물임을 조건으로 한다.

화학식 III의 관련 구체예에 따라 Aaa¹, Aaa³ 내지 Aaa¹², Aaa¹⁴ 또는 Aaa¹⁵ 중 하나 이상이 상기 정의된 바와 같은 아미노산 대체물이고, 상기 정의된 바와 같은 보결분자단이 Aaa¹, Aaa³ 내지 Aaa¹², Aaa¹⁴ 또는 Aaa¹⁵중 하나 이상의 아미노산 잔기의 측쇄의 반응성 기에 부착되거나, Aaa³ 내지 Aaa¹² 또는 Aaa¹⁴에서의 아미노산 대체물의 반응성 R 또는 R'기에 부착되거나, 직접 또는 Q기를 통해 Aaa¹에서의 아미노산 대체물의 말단 아민에 부착되거나, Aaa¹⁵에서의 아미노산 대체물의 반응성 말단 카르복실에 부착되거나, 또는 Aaa¹⁵에서의 아미노산 대체물의 J의 일부를 구성하는 반응성기에 부착되어 있는 구조물이 제공된다. 하나 이상의 보결분자단이 공유적으로 결합되어 있는 반응성 기는 일차 아민, 이차 아민, 카르복실기, 티올기, 또는 히드록실기일 수 있다. 한 측면에서 보결분자단은 Aaa¹, Aaa³, Aaa⁷, Aaa¹⁰, Aaa¹², 또는 Aaa¹⁵위치 또는 이들의 조합에서의 반응성 아민에 공유결합될 수 있다. 또 다른 측면에서, 보결분자단은 Aaa⁹ 또는 Aaa¹⁵, 또는 두가지 모두의 위치에 있는 반응성 카르복실기에 공유결합될 수 있다. 또 다른 측면에서, 보결분자단은 Aaa³, Aaa⁷, Aaa⁹, Aaa¹⁰, Aaa¹¹, 또는 Aaa¹², 또는 이들의 조합에서의 반응성 티올에 공유적으로 결합될 수 있다.

화학식 III의 구조물의 바람직한 측면에서, Aaa¹ 내지 Aaa¹⁵ (Aaa² 및 Aaa¹³을 제외한다) 중 하나, 둘 또는 세개는 전술한 화학식을 갖는 아미노산 대체물이다. 특히 바람직한 첫번째 측면에서는 Aaa¹, Aaa⁵ 및 Aaa¹⁵ 중 하나가 아미노산 대체물이다. 특히 바람직한 두번째 측면에서는 Aaa¹, Aaa⁵ 및 Aaa¹⁵ 중 두개가 아미노산 대체물들이다. 특히 바람직한 세번째 측면에서는, Aaa¹, Aaa⁵ 및 Aaa¹⁵ 각각이 아미노산 대체물들이다. 또 다른 특히 바람직한 측면에서는 Aaa¹, Aaa⁵ 및 Aaa¹⁵ 중 하나, 두개, 세개가 아미노산 대체물이며, 구조물은 Aaa²와 Aaa¹³의 측쇄를 통한 디설파이드 결합 형성에 의해 형성된 사이클릭 구조물이다. 또 다른 특히 바람직한 측면에서는, Aaa¹ 내지 Aaa¹⁵ 중 두개 이상이 아미노산 대체물이고, 이들 아미노산 대체물은 인접하지 않는다. 즉, 각각의 이들 아미노산 대체물은 일차 서열 중에 개재되어 있는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 아미노산 대체물 상호로부터 분리되어 있다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 화학식 III의 구조물에서, Aaa³, Aaa⁵, Aaa⁶, Aaa⁷, Aaa⁹, Aaa¹⁰, 또는 Aaa¹² 중 적어도 하나는 Ala의 L- 또는 D-이성질체, 바람직하게는 Ala의 L-이성질체이다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 비펩타이드 결합을 추가로 포함하는 화학식 III의 구조물을 제공한다. 비펩타이드 결합은 본 발명의 구조물의 분해에 대한 민감성을 감소시키기 위해 사용되며, 각각 Lys 또는 Arg 잔기 앞의 천연 펩타이드 결합을 아미드의 동배체(isostere), 치환 아미드 또는 펩티도미메틱 결합과 같은 비펩타이드 결합으로 대체시킴으로써 트립틱 유사 프로테아제에 대한 구조물의 생체내 안정성을 증진시켜준다. 한가지 특정 구체예에서, 천연 펩타이드 결합은 역전된 극성을 갖는 펩타이드 결합에 의해 대체된다. 일반적으로, 어떠한 비펩타이드 결합을 사용해도 무방하며, 어떠한 두개의 잔기 사이에 사용되어도 무방하다. 비펩타이드 결합은 두개의 잔기 사이의 결합에 참여하는 탄소 원자가 카르보닐 탄소로부터 메틸렌 탄소로 환원된 결합, 예컨대, 비펩타이드 결합인 -CH₂-NH- 또는 그의 동배체 -NH-CH₂-를 포함하거나, 또는 예컨대 -CH₂-S-, -CH₂-O-, 또는 -C(=O)-CH₂- 또는 전술한 것들의 동배체, 또는 -CH₂-CH₂- 또는 -CH=CH-와 같은 기타의 결합을 사용하는 것도 포함한다. 일반적으로, 비펩타이드 결합에는 이미노, 에스테르, 히드라진, 세미카르바지드, 옥심 또는 아조 결합이 포함된다.

상기 정의된 구조물은 하나 이상의 보결분자단을 포함할 수 있다. 보결분자단은 순환 중 체류시간을 조절하거나, 생체이용성의 조절을 위해, 또는 구조물의 면역원성을 조절하기 위한 목적 등으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 보결분자단은 체류 시간, 생체이용성 등을 증가시킴으로써 "조절"을 수행하지만, 보결분자단은 필요에 따라 체류 시간, 생체이용성 등을 감소시킬 수도 있다. "보결분자단"은 따라서 당해 구조물의 약동학 또는 약력학을 증가시킬 목적에서, 여하한 화학식을 갖는 구조물에 예컨대 공유 결합에 의해, 컨쥬게이션된 여하한 화합물을 모두 포함한다. 바람직한 보결분자단에는 하나 이상의 탄소 및 수소 원자와 필요에 따라 산소 원자와 같은 여타 분자를 포함하는 반복 단위를 포함하는 폴리머기가 포함된다. 이러한 폴리머기는 바람직하게는 수용성 폴리머인 것이 좋고, 바람직하게는폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린 또는 폴리(아크릴로일포르폴린)인 것이 좋다. 바람직한 폴리(알킬렌 옥사이드)는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)이다. PEG에 더해, 다른 폴리(알킬렌 글리콜) 폴리머들, 예컨대폴리(프로필렌 글리콜) 및 폴리(부틸렌 글리콜)도 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 보결분자단은 구조물의 반응성 기에 공유 결합된 하나 이상의 PEG 폴리머이다. 이러한 PEG 폴리머 또는 기타 보결분자단은 하나 이상의 아미노산 잔기의 측쇄 상의 반응성기에 공유적으로 결합되거나, 아미노산 대체물 상의 반응성 기에 공유결합될 수 있다. 이러한 아미노산 대체물의 반응성기에는 하나 이상의 중간체를 경유하거나 직접, Q 또는 J에 공유결합되는 기가 포함될 수 있으며, 또는 R이나 R'의 일부를 형성하는 반응성기가 포함될 수 있다.

보결분자단으로서 PEG가 사용되는 경우, PEG 폴리머의 분자량은 약 200 MW 내지 약 50000 MW일 수 있다. PEGE 폴리머는 선형일 수 있으며, 선형일 경우, 반응성기가 한쪽 말단에 있고 다른쪽 말단에는 비반응성기가 있는 단관능기, 각각의 말단에 동일한 반응성기가 있는 동종이관능기, 또는 각각의 말단에 서로 다른 반응성기가 있는 이종이관능기일 수 있다. 또는 PEG 폴리머는 일반적으로, "Y"-형 입체배열을 갖는 분지상으로, 2, 3, 4 또는 8개의 팔과 같이 팔을 여러개 가질 수 있고, 또는 당해 기술 분야에 알려진 다른 입체배열을 가질 수 있다. PEG 폴리머는 바람직하게는 화학식 III 내지 XIII 중 여하한 구조물 상의 하나 이상의 정의된 기에, 바람직하게는 공유 결합에 의해 연결되기 위한 유도형 반응성기를 하나 이상 갖는 것이 좋다. 유도형 반응성기는 예컨대, 아미노산 잔기의 말단기 상, 아미노산 잔기의 측쇄 상, 대체물의 Q기 상, 대체물의 J기 상, 또는 대체물의 R 또는 R'기 상을 비롯, 예컨대 구조물 상의 아민, 히드록실, 티올 또는 카르복실기에 연결될 수 있다.

PEG 폴리머는 바람직하게는 한쪽 끝에 히드록실, 알콕시, 치환 알콕시, 알켄옥시, 치환 알켄옥시, 알킨옥시, 치환 알킨옥시, 아릴옥시 또는 치환 아릴옥시와 같은 말단-캡기(end-cap group)을 갖는 것이 좋다. PEG 폴리머는 더욱 바람직하게는 적어도 다른 한쪽 끝에, 유도형 반응성 기를 갖는 것이 좋다. 일 구체예에서, PEG 폴리머는 아민, 말레이미드 또는 카르복실산과 같은 연결기로 유도화된 모노메톡시 PEG와 같이, 말단 히드록실기를 갖는 직쇄 또는 분지상 폴리에스테르이다. 구조물의 이용가능한 반응성기로는 PEG 폴리머 상에 사용되는 유도형 연결기를 들 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 카르복실산 유도형 PEG를 이용하여 구조물의 N-말단 아민이 사용된다. 또 다른 구체예에서는, 역시 카르복실산 유도형 PEG를 사용하여 구조물의 C-말단 아민이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 구조물 내에 Lys잔기 또는 그의 상동체가 존재할 경우, 역시 카르복실산 유도형 PEG를 이용하여, 그의 α 또는 ε아미노기가 이용된다. 말레이미드 유도형 PEG는 구조물 상의 반응성 티올 또는 히드록실기에 사용가능하다. 마찬가지로, 아민 유도형 PEG는 아미노산 잔기의 여하한 말단기 또는 측쇄 상의 반응성 카르복실기, 대체물의 Q기, 대체물의 J기, 또는 대체물의 R 또는 R'기에 사용가능하다.

따라서, 한가지 측면에서, PEG는 하나 이상의 친전자성기에 의해 활성화되며, N-말단 또는 C-말단 아민 또는 측쇄의 ε 아미노기에 대한 커플링을 비롯, 구조물의 아미노기에 대한 커플링에 이용될 수 있다. 대표적인 친전자성 반응성기에는 미국 특허 5,672,662 및 6,737,505에 기재된 바와 같은 숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 및 기타 α-메틸부티르산 에스테르가 포함되며, 미국 특허출원 공개 2004/0235734에 기재된 바와 같이, 단백질과 함께 사용될 수 있다. 또는 미국특서 5,567,662에 기재된 바와 같이 반응성기로서 숙신이미딜 프로피오네이트를 사용하거나, N-히드록시숙신이미드를 분지상 PEG와 함께 미국특허 5,932,462에 기재된 바와 같이 사용가능하다. 전술한 특허 및 특허출원 문헌 각각의 개시내용은 본 명세서에 그 전체 내용이 참조 통합되어 있다.

또 다른 측면에서, PEG 폴리머에는 하나 이상의 반응성 알데히드기가 제공되어, N-말단 또는 C-말단 아민과 같은 말단 일차 아민에 커플링되는데 이용된다. 또 다른 측면에서, PEG 폴리머에는 예컨대 말레이미드, 오르토-피리딜디설파이드 또는 티올기와 같은 하나 이상의 티올-반응성기가 제공되며, 구조물의 Q기 중의 반응성 티올이나 시스테인 측쇄 중의 반응성 티올과 같이 여하한 화학식 III 내지 XIII을 갖는 구조물 중 반응성 티올에 커플링되는데 이용된다.

한가지 측면에서, WO 2004/047871, 또는 거기에 인용된 여하한 문헌에 기재된 바와 같은 컨쥬게이트 또는 반응식을 본 발명의 구조물에 대해 사용할 수 있다. 전술한 특허출원들의 개시 내용은 그 전체로서 본 발명에 참조 통합되어 있다. 일반적으로, 화학적 변형의 어떤 형태를 이용하여 반응성 기를 갖는 활성 PEG 유도체를 만들 수 있다. 반응성 기는 활성 카보네이트, 활성 에스테르, 알데히드 또는 트레실레이트일 수 있다. 부분적으로, PEG의 반응성 기는 PEG 유도체가 결합되는 측쇄 모이어티 또는 아미노산 말단기를 결정한다. 일반적으로, 위치 특이적인 PEG화(PEGylation)가 바람직한데, 이는 부분적으로는 결과적인 구조물이 균질하고, 생물학적 활성이 최소한도로 손실되며, 면역원성이 감소되기 때문이다.

일 구체예에서, PEG는 분자량이 약 200 MW 내지 약 50,000 MW, 더욱 바람직하게는 약 2,000 MW 내지 약 20,000 MW인 것이 좋다. 또 다른 구체예에서, 예컨대, 화학식 CH₃-O(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂-CH₂-OH 또는 CH₃-O(CH₂-CH₂-O)_n-H (식 중 n은 2 내지 1200의 정수임)과 같은 모노메톡시 PEG가 사용되며, 바람직하게는, 아민, 말레이미드 또는 카르복실산 연결기에 의해 유도화된 것이 좋다.

또 다른 구체에에서, PEG와 같은 보결분자단은 Veronese FM 및 Pasut G. Pegylation, successful approach to drug delivery. Drug Discovery Today 10:1451-1458 (2005)에 설명된 바와 같이 효소적으로 불안정한 링커 수단에 의해 구조물에 컨쥬게이션되며, 상기 문헌에 기재된 방법은 본 발명 명세서에 참조 통합된다.

또 다른 구체예에서, 사용되는 보결분자단은 미국특허 5,359,030 및 5,681,811에 개시된 바와 같이 친지성 모이어티와 친수성 폴리머 모이어티를 모두 갖는 폴리머이다. 관련 구체예에서, 사용된 보결분자단은 미국특허 6,309,633에 개시된 바와 같이, 에스테르 결합과 같은 가수분해성 결합에 의해 연결되어 있고, PEG 폴리머와 같은 친수성 성분 및 분지상 지방산이나 알킬쇄와 같은 친지성 성분을 갖는 올리고머 컨쥬게이트이다. 또 다른 관련 구체예에서, 사용되는 보결분자단은 미국특허 6,858,580에 개시된 바와 같이, 폴리(프로필렌 글리콜)을, 바람직하게는 2개 이상의 폴리(프로필렌 글리콜) 서브유닛을 포함하는 올리고머이다. 전술한 각각의 특허 및 특허출원의 개시내용은 그 전체로서 본 발명 명세서에 참조 통합된다.

또 다른 구체에에서, 미국특허출원 공개 2004/0203081의 개시 내용이 참조로 통합되며, 여기에는 상기 문헌에서 여러가지 나트륨 이뇨 화합물에 부착되는 "변형 모이어티(modifying moieties)"로서 칭해지는 보결분자단, 및 다양한 길이와 입체배열을 갖는 특정 올리고머 구조에 대한 설명이 포함된다. 관련 구체예에서는, 국제특허공개WO 2004/047871가 참조 통합되며, 여기에는 NPRA에 결합하는 나트륨 이뇨 분자에 "변형 모이어티 컨쥬게이션 부위" 수단에 의해 부착된 "변형 모이어티"와 관련된 개시내용이 포함되며, 다른 나트륨 이뇨 수용체에 대한 나트륨 이뇨 분자 결합에 대해서도 유사한 방식이 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

본 명세서와 청구범위에서 사용되는 특정 용어들은 다음과 같이 정의된다.

본 발명에서 "구조물(construct)" 및 "아미노산 잔기 서열"은 a) 천연발생적이거나, b) 화학합성에 의해 제조될 수 있고, c) 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있으며, d) 보다 큰 분자의 생화학적 또는 효소적 단편화에 의해 생산될 수도 있고, e) 전술한 a 내지 d의 방법을 조합시켜서 되는 방법으로 생산될 수도 있으며, 또는 f) 펩타이드 또는 아미노산 서열을 생산하는 여타의 다른 수단에 의해 생산될 수도 있다.

화학 합성을 이용함으로써, 자연적으로는 발생되지 않는 다양한 아미노산을 구조물 내로 도입하는 것이 가능하며, N- 또는 C-말단 등을 변형할 수 있고, 따라서, 안정성을 증가시키며, 프로테아제 분해에 대한 내성 등도 증가되며, 구조물 내로 하나 이상의 아미노산 대체물을 도입하는 것이 가능하다.

"펩타이드"라는 용어는 본 명세서와 특허청구범위를 통해 두개 이상의 아미노산으로 된 여하한 구조를 모두 포함하는 것으로 의도되며, 아미노산의 화학적 변형과 유도체도 포함된다. 펩타이드 전체 또는 일부를 형성하는 아미노산들은 자연 발생적인 아미노산, 이러한 아미노산의 입체이성질체 및 변형물, 후번역적으로 변형된 아미노산, 효소적으로 변형된 아미노산 등일 수 있다. "펩타이드"라는 용어에는 또한 펩타이드의 이량체와 다량체도 포함된다. "제조된(manufactured)" 펩타이드에는 화학 합성, 재조합 DNA 기술, 보다 큰 분자의 생화학적 또는 효소적 단편화, 이들의 조합, 또는 일반적으로 여타 방법에 의해 제조된 펩타이드가 포함된다.

명세서와 특허청구범위를 비롯, 본 발명에서 사용되는 "아미노산 측쇄 모이어티"라는 용어에는 본 명세서에서 정의된 대로의 여하한 "아미노산"의 측쇄가 모두 포함된다. 따라서, 이 용어에는 자연발생적인 아미노산에 존재하는 측쇄 모이어티도 포함된다. 이 용어는 또한 글리코실화된 아미노산과 같이 변형된 자연발생적 아미노산 중의 측쇄 모이어티도 포함한다. 이 용어는 또한 자연 발생적인 단백질 아미노산, 비단백질 아미노산, 후번역적으로 변형된 아미노산, 효소적으로 합성된 아미노산, 유도된 아미노산, 아미노산을 모방하기 위해 고안된 구조물이나 구조체 등의 입체이성질체 및 변형물 중의 측쇄 모이어티를 포함한다. 예컨대, 본 발명에 개시된 여하한 아미노산의 측쇄 모이어티가 모두 이 정의에 포괄된다. 이하에서 정의되는 "아미노산 측쇄 모이어티의 유도체"는 아미노산 측쇄 모이어티의 정의 중에 포함된다.

"아미노산 측쇄 모이어티의 유도체"는 자연발생적이거나 자연발생적이지 않은 아미노산 측쇄 모이어티 중의 변형 또는 변이를 비롯하여, 여하한 아미노산측쇄 부분에서의 변형 또는 변이를 가리키는 것으로, 이러한 변형이나 변이에는 다음이 포함된다: (a) 하나 이상의 포화 또는 불포화 탄소 원자를 기존의 알킬, 아릴 또는 아르알킬쇄에 부가하는 것; (b) 측쇄 중의 탄소를 다른 원자, 바람직하게는 산소나 질소로 치환하는 것; (c) 메틸 (-CH₃), 메톡시 (-OCH₃), 니트로 (-NO₂), 히드록실 (-OH), 또는 시아노 (-C≡N)를 비롯하여, 측쇄의 탄소 원자에 말단기를 부가하는 것; (d) 히드록시, 티올 또는 아미노기를 포함하는 측쇄 모이어티에 대해, 적절한 히드록시, 티올 또는 아미노 보호기를 부가하는 것; 또는 (e) 고리 구조를 포함하는 측쇄 모이어티에 대해, 직접 또는 에테르 결합을 통해 부착된 아릴기, 히드록실, 할로겐, 또는 알킬을 비롯하여 하나 또는 고리 치환기를 부가하는 것. 아미노기의 경우, 적절한 보호기로는 Z, Fmoc, Boc, Pbf, Pmc 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

명세서와 특허청구범위에서 사용되는 것을 비롯, 본 발명의 구체예에서 사용되는 "아미노산"에는 자연 발생적인 단백질 아미노산이 포함되며, 이들은 흔히 사용되는 3문자 약어와 1문자 약어 모두에 의해 칭해진다. Synthetic Peptides: A User's Guide, G. A. Grant, editor, W.H. Freeman & Co., New York (1992)를 참조할 수 있으며, 이 문헌의 개시 내용은 11 내지 24쪽의 텍스트와 표의 내용을 포함하여 모두 본 명세서에 참조로 통합되어 있다. "아미노산"은 통상적인 α-아미노산을 포함하며 추가로 β-아미노산, α,α-이치환 아미노산 및 N-치환 아미노산을 포함하는데, 여기서 적어도 하나의 측쇄는 본 명세서에 정의된 바와 같은 아미노산 측쇄 모이어티이다. 아미노산"은 또한 N-알킬 α-아미노산을 포함하여, 여기서 N-말단 아미노기는 C₁ 내지 C₆ 직쇄 또는 분지상 알킬 치환기를 갖는다. 따라서 "아미노산"이라는 용어는 자연발생적인 단백질 아미노산, 비단백질 아미노산, 후번역적으로 변형된 아미노산, 효소적으로 합성된 아미노산, 유도된 아미노산, 아미노산을 모방하도록 고안된 구조물 또는 구조체 등의 입체이성질체 및 변형체를 모두 포함하는 것이다. 변형된 특이한 아미노산을 대체로 상기 언급한 바 있는 Synthetic Peptides: A User's Guide; Hruby V. J., Al-obeidi　F., Kazmierski W., Biochem. J. 268:249-262 (1990); 및 Toniolo C., Int. J. Peptide Protein Res. 35:287-300 (1990)에 설명되어 있으며; 이 문헌들의 개시 내용은 본 명세서에 참고로 통합되어 있다. 이에 더해, 아미노산과 그의 보호기 및 변형기를 포함하여, 다음의 약어들은 아래에 주어진 의미를 갖는다.:

Abu - 감마-아미노 부티르산

12-Ado - 12-아미노 도데칸산

Aib - alpha-아미노이소부티르산

6-Ahx - 6-아미노 헥산산

Amc - 4-(아미노메틸)-사이클헥산 카르복실산

8-Aoc - 8-아미노 옥탄산

Bip - 바이페닐알라닌

Boc - t-부톡시카르보닐

Bzl - 벤질

Bz - 벤조일

Cit - 시트룰린

Dab - 디아미노부티르산

Dap - 디아미노프로피온산

Dip - 3,3-디페닐알라닌

Disc - 1,3-디히드로-2H-이소인돌카르복실산

Et - 에틸

Fmoc - 플루오레닐메톡시카르보닐

Hept - 헵타노일 (CH₃-(CH₂)₅-C(=O)-)

Hex - 헥사노일 (CH₃-(CH₂)₄-C(=O)-)

HArg - 호모아르기닌

HCys - 호모시스테인

HLys - 호모라이신

HPhe - 호모페닐알라닌

HSer - 호모세린

Me - 메틸

Met(O) - 메티오닌 설폭사이드

Met(O₂) - 메티오닐 설폰

Nva - 노르발린

Pgl - 페닐글리신

Pr - 프로필

Pr-i - 이소프로필

Sar - 사르코신

Tle - 3차-부틸알라닌

Z - 벤질옥시카르보닐

본 발명에 따른 구조물의 목록에서, 통상적인 아미노산 잔기들은 Manual of Patent Examining Procedure, 8^thEd의 챕터 2400에 주어진 통상적인 의미를 갖는다. 따라서, "Nle"는 노르류신; "Asp"는 아스파르트산; "His"는 히스티딘; "Arg"는 아르기닌: "Trp"는 트립토판; "Lys"는 라이신; "Gly"는 글라이신; "Pro"는 프롤린; "Tyr"는 티로신, "Ser"는 세린과 나머지 아미노산도 통상적인 의미를 갖는다. 모든 잔기들은 D-알라닌의 경우 "D-Ala"로 표시되는 것처럼, D-이성질체임을 명기하지 않는 한, L-이성질체 입체배열로 있는 것이다.

자연발생적인 단백질 아미노산, 비단백질 아미노산, 후번역적으로 변형된 아미노산, 효소적으로 합성된 아미노산, 유도된 아미노산, 전술한 것 중 여하한 것으로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산 (즉, 적어도 하나의 측쇄는 그것이 유래된 잔기의 그것과 동일한 것인 α,α-이치환 아미노산), 전술한 것 중 여하한 것으로부터 유도된 β-아미노산 (즉, β-탄소의 존재를 제외하고는 그것이 유래된 잔기와 동일한 β-아미노산)등 전술한 것 모두의 입체이성질체와 변형체를 비롯한 단일 아미노산은 본 명세서에서 때로 "잔기"로 칭한다.

"α,α-이치환 아미노산"은 α-위치에 추가의 치환기를 갖는 여하한 α-아미노산을 모두 포함하며, 이러한 치환기는 α-아미노산의 측쇄 모이어티와는 같거나 다를 수 있다. 적절한 치환기는 α-아미노산의 측쇄 모이어티에 더해, C₁ 내지 C₆ 직쇄 또는 분지상 알킬을 포함한다. α,α- 이치환 아미노산은 통상적인 L- 및 D-이성질체 레퍼런스를 이용하여 호칭할 수 있는 한편, 이러한 레퍼런스는 편의를 위한 것이고, α-위치의 치환기들이 서로 다를 경우, 이러한 아미노산은 적절하다면, 지정된 아미노산 측쇄 모이어티를 갖는 잔기의 L- 또는 D-이성질체로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산으로 호환적으로 호칭될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, (S)-2-아미노-2-메틸-헥산산은 L-Nle로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산 또는 D-Ala로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산으로 칭해질 수 있다. α,α-이치환 아미노산이 제공되는 경우에는 항상 그의 모든 (R) 및 (S) 입체배열이 모두 포함되는 것으로 이해하여야 한다.

"N-치환 아미노산"은 아미노산 측쇄 모이어티가 백본 아미노기에 공유결합된 여하한 아미노산을 모두 포함하며, 필요에 따라 α-탄소 위치에는 H 이외에 다른 치환기는 없다. 사르코신은 N-치환 아미노산의 일례이다. 예시를 위해, 사르코신은 사르코신과 Ala의 아미노산 측쇄 모이어티가 메틸로서 동일한 점에서, Ala의 N-치환 아미노산 유도체로도 칭해질 수 있다.

"아미노산 대체물(amino acid surrogate")이라는 용어에는 비제한적인 예로서 피페라진 코어 분자, 케토-피페라진 코어 분자 및 디아제핀 코어 분자를 포함하여 어떤 잔기의 모방체인, 본 명세서에 개시된 분자가 포함된다. 달리 명시하지 않는 한, 아미노산 대체물은 카르복실기와 아미노기 모두와, 아미노산 측쇄에 대응하는 기를 포괄하는 것으로 이해되어야 하며, 또는 글라이신의 아미노산 대체물의 경우, 수소 이외의 다른 측쇄는 없다. 따라서, 아미노산 대체물은 전술한 화학식 I 또는 II의 분자를 포함한다. 아미노산 대체물은 추가로 다음 구조의 분자들을 포함하며, 편의상 이러한 구조는 분리된 대체물로서 주어진 것이고, 보호기는 포함되어 있지 않으며, 하나 또는 두개의 펩타이드 결합에 의해 본 발명의 구조물의 일부를 형성하는 하나 또는 두개의 아미노산 잔기에 결합되지 않는 것으로 이해된다:

식 중, R, R', x 및 별표는 화학식 I의 대체물에 대해 정의된 바와 같다. 아미노산 대체물은 추가로 다음 중 여하한 구조의 분자를 포함하며, 역시 편의상 이러한 구조들은 분리된 대체물로서 표시되어 있음과, 보호기는 표시하지 않았고, 하나 또는 두개의 펩타이드 결합에 의해, 본 발명의 구조물의 일부를 형성하는 하나 또는 두개의 아미노산 잔기에 결합되어 있는 것이 아님을 이해하여야 한다:

식 중, R, R', x 및 별표는 화학식 I의 대체물에 대해 정의된 바와 같다. 합성 목적을 위해, 여하한 아미노산 대체물의 카르복실기 또는 아미노기는 보호기가 존재하는 동안에는 반응하지 않도록, 보호기에 의해 보호되는 것이 바람직하며, 마찬가지로, R 또는 R'의 일부를 형성하는 여하한 반응성기도 마찬가지로 보호기에 의해 보호될 수 있다. 본 발명의 대체물은 비대칭 중심을 하나보다 많이 가지며, 따라서, 하나 보다 많은 입체이성질체 형태로서 존재할 수 있음을 이해할 수 있다. 몇몇 화합물들은 또한 기하이성질체 및 회전이성질체로서 존재할 수도 있다. 또한, 본 발명의 몇몇 화합물들은 회전장애이성질체를 결과시키는 입체형태적 축 키랄성(conformational axial chirality)를 가질 수 있다. 본 발명은 개별적으로 이러한 형태 각각도 포함하며, 라세미체를 비롯, 이들의 혼합물도 포함한다. 한 측면에서, 대체물 이성질체는 크로마토그래피법을 이용하거나 분할 시약(resolving agent)을 이용함으로써 통상적으로 분리할 수 있다. 또 다른 측면에서, 개별적인 대체물 이성질체들 또는 거울이성질체 측면에서 순수한 대체물은 본 명세서에 개시된 합성 방법이나, 비대칭 중간체, 시약 또는 촉매를 이용한 비대칭 합성법을 이용하는 이러한 방법의 변형법에 의해 제조될 수 있다.

"C-말단 캡핑기(C-terminus capping group)"이라는 용어는 구조물의 C-말단의 말단 고리 탄소 원자를 통해 부착된 여하한 말단기, 또는 제공될 경우, 말단 카르복실기를 포함한다. 말단 고리 탄소 원자, 또는 제공될 경우 말단 카르복실기는 잔기의 일부를 형성하거나, 또는 아미노산 대체물의 일부를 형성할 수 있다. 바람직한 측면에서, C-말단 캡핑기는 구조물의 C-말단 위치에 존재하는 아미노산 대체물의 일부를 형성한다. C-말단 캡핑기는 비제한적인 예로서 -(CH₂)_n-OH, -(CH₂)_n-C(=O)-OH, -(CH₂)_m-OH, -(CH₂)_n-C(=O)-N(v₁)(v₂), -(CH₂)_n-C(=O)-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂), -(CH₂)_n-O-(CH₂)_m-CH₃, -(CH₂)_n-C(=O)-NH-(CH₂)_m-CH₃, -(CH₂)_n-C(=O)-NH-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂), -(CH₂)_n-C(=O)-N-((CH₂)_m-N(v₁)(v₂))₂, -(CH₂)_n-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-OH)-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂), -C(=O)-NH-(CH₂)_m-NH-C(=O)-CH(N(v₁)(v₂))((CH₂)_m-N(v₁)(v₂)), 또는 -(CH₂)_n-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-NH₂)-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂), 이들의 모든 (R) 또는 (S) 입체배열 형태 [상기 중, v₁ 및 v₂는 각각 독립적으로 H, C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 알킬쇄, m은 0 내지 17이고, n은 0 내지 2이다]; 또는 여하한 오메가 아미노 지방족, 말단 아릴 또는 아르알킬, 예컨대, 메틸, 디메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 알릴, 시클로프로판 메틸, 헥사노일, 헵타노일, 아세틸, 프로피오닐, 부타노일, 페닐아세틸, 시클로헥실아세틸, 나프틸아세틸, 신나모일, 페닐, 벤질, 벤조일, 12-Ado, 7'-아미노 헵타노일, 6-Ahx, Amc 또는 8-Aoc, 또는 여하한 단일의 천연 또는 비천연 α-아미노산, β-아미노산 또는 α,α-이치환 아미노산, 이들의 모든 (R) 또는 (S) 입체배열 형태를 포함하며, 필요에 따라 전술한 여하한 비아미노산 캡핑기들과의 조합을 포함할 수도 있다. 상기 내용에서, 예컨대, -C(=O)-NH-(CH₂)_m-NH-C(=O)-CH(N(v₁)(v₂))((CH₂)_m-N(v₁)(v₂))은:

인 것으로 이해되어야 한다.

"N-말단 캡핑기"라는 용어는 구조물의 N-말단의 말단 아민을 통해 부착된 여하한 말단기를 모두 포함한다. 말단 아민은 잔기의 일부를 형성하거나, 또는 아미노산 대체물의 일부를 형성할 수 있다. 바람직한 측면에서, N-말단 캡핑기는 구조물의 N-말단 위치에 존재하는 아미노산 대체물의 일부를 형성한다. N-말단 캡핑기는 비제한적인 예로서, 오메가 아미노 지방족, 아실기 또는 말단 아릴 또는 아르알킬, 예컨대, 메틸, 디메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 알릴, 시클로프로판 메틸, 헥사노일, 헵타노일, 아세틸, 프로피오닐, 부타노일, 페닐아세틸, 시클로헥실아세틸, 나프틸아세틸, 신나모일, 페닐, 벤조일, 12-Ado, 7'-아미노 헵타노일, 6-Ahx, Amc 또는 8-Aoc를 포함하거나, 또는 N-말단 캡핑기는 -(CH₂)_m-NH(v₃), -(CH₂)_m-CH₃, -C(=O)-(CH₂)_m-CH₃, -C(=O)-(CH₂)_m-NH(v₃), -C(=O)-(CH₂)_m-C(=O)-OH, -C(=O)-(CH₂)_m-C(=O)-(v₄), -(CH₂)_m-C(=O)-OH, -(CH₂)_m-C(=O)-(v₄), C(=O)-(CH₂)_m-O(v₃), -(CH₂)_m-O(v₃), C(=O)-(CH₂)_m-S(v₃), 또는 -(CH₂)_m-S(v₃)이다. 여기서 v₃는 H 또는 C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 알킬쇄이고 v₄는 C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 알킬쇄이며 m은 0 내지 17이다.

페닐 고리는 그 페닐 고리가 직접 또는 에테르 결합을 통해 부착된 아릴기, 히드록실, 할로겐 또는 알킬을 독립적으로 포함하는 하나 이상의 치환기들을 포함하는 경우 "치환"된다. 페닐 고리가 이렇게 치환될 경우, 아미노산 잔기는 치환되었다고 예컨대 치환 Phe, 치환 HPhe 또는 치환 Pgl과 같이 치환되었다고 칭해진다.

"알켄"이라는 용어는 하나 이상의 이중 탄소-탄소 결합을 함유하는 불포화 탄화수소를 포함한다. 알켄기의 예로는 에틸렌, 프로펜 등을 들 수 있다.

"알케닐"이라는 용어는 적어도 하나의 이중 결합을 함유하는, 2 내지 6개의 탄소 원자의 선형 일가 탄화수소 래디칼 또는 3 내지 6개의 탄소 원자의 분지상 일가 탄화수소 래디칼을 포함하며; 그 예로서 에테닐, 2-프로페닐 등을 들 수 있다.

본 명세서에서 "알킬"기는 직쇄 또는 분지상 입체배열을 갖는 지정된 길이의 알킬 래디칼을 포함한다. 알킬 래디칼의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 2차-부틸, 3차 부틸, 펜틸, 이소펜틸, 헥실, 이소헥실 등을 들 수 있다.

"아릴"이라는 용어는 6 내지 12개의 고리 원자를 갖는 모노시클릭 또는 바이시클릭 방향족 탄화수소 래디칼을 포함하며, 이 래디칼은 필요에 따라 알킬, 할로알킬, 시클로알킬, 알콕시, 알킬티오, 할로, 니트로, 아실, 시아노, 아미노, 일치환 아미노, 이치환 아미노, 히드록시, 카르복시, 또는 알콕시-카르보닐 중에서 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 독립적으로 치환될 수 있다. 아릴기의 예로는 페닐, 바이페닐, 나프틸, 1-나프틸 및 2-나프틸, 이들의 유도체 등을 들 수 있다.

"아르알킬"이라는 용어는 래디칼 -R^aR^b 를 포함하는데, 여기서 R^a는 알킬렌 (2가 알킬)기이고 R^b는 상기 정의된 바와 같은 아릴기이다. 아르알킬기의 예로는 벤질, 페닐에틸, 3-(3-클로로페닐)-2-메틸펜틸 등을 들 수 있다.

"지방족"이라는 용어에는 알칸, 알켄, 알킨 및 이들의 유도체와 같은 탄화수소 사슬을 갖는 화합물이 포함된다.

"아실"이라는 용어에는 R-C(=O)-기가 포함되며, 여기서, R은 유기기이다. 일례로서 아세틸기 CH₃-C(=O)-를 들 수 있으며, 본 명세서에서 "Ac"로서 칭해진다.

전술한 바와 같이 정의된 아릴, 알킬 또는 치환 알킬기가 하나 이상의 카르보닐 {-(C=O)-}기를 통해 결합될 경우, 펩타이드나 지방족 모이어티는 "아실화"된 것이다. 펩타이드는 N-말단에서 대체로 가장 많이 아실화된다.

"오메가 아미노 지방족"이라는 표현에는 말단 아미노기를 갖는 지방족 모이어티가 포함된다. 오메가 아미노 지방족의 예로는 오르니틴과 라이신의 아미노산 측쇄 모이어티와 7'-아미노-헵타노일을 들 수 있다.

"헤테로아릴"이라는 용어에는 질소, 산소 및 황 중에서 선택된 헤테로원자를 1 내지 4개 함유하는 모노시클릭 및 바이시클릭 방향족 고리가 포함된다. 5-원 또는 6-원 헤테로아릴은 모노시클릭 헤테로방향족 고리로서; 그의 예로는 티아졸, 옥사졸, 티오펜, 퓨란, 피롤, 이미다졸, 이속사졸, 피라졸, 트리아졸, 티아디아졸, 테트라졸, 옥사디아졸, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 등을 들 수 있다. 바이시클릭 헤테로방향족 고리의 비제한적인 예로는 벤조티아디아졸, 인돌, 벤조티오펜, 벤조퓨란, 벤즈이미다졸, 벤즈이속사졸, 벤조티아졸, 퀴놀린, 벤조트리아졸, 벤족사졸, 이소퀴놀린, 퓨린, 퓨로피리딘 및 티에노피리딘을 들 수 있다.

"아미드"라 함은 카르보닐기 (-C(=O)-NH₂)에 부착된 3가의 질소를 갖는 화합물을 말하며, 예컨대, 메틸아미드, 에틸아미드, 프로필아미드 등을 들 수 있다.

"이미드"라 함은 이미도기 (-C(=O)-NH-C(=O)-)를 함유하는 화합물을 가리킨다.

"아민"에는 아미노기 (-NH₂)를 함유하는 화합물이 포함된다.

"니트릴"에는 카르복실산 유도체로서 유기기에 결합된 (-CN)기를 함유하는 화합물이 포함된다.

"할로겐"이라는 용어는 할로겐 원자인 불소, 염소, 브롬 및 요오드와, -CF₃ 등과 같이 할로겐 원자를 하나 이상 포함하는 기를 포함하는 것이다.

약학적 조성물에서와 같은 "조성물"이라는 용어는 활성 성분(들), 및 담체와 같은 불활성 성분(들), 및 직간접적으로 상기 성분들의 2 이상의 조합, 착화, 또는 응집에 의해 야기되는 여하한 생성물, 또는 상기 성분들 하나 이상의 기타 유형의 반응 또는 상호반응에 의해 야기되는 여하한 생성물을 모두 포함하여 이루어지는 생성물을 포괄하도록 의도된다.

"EC₅₀"이라는 용어는 어떤 아고니스트에 대해 가능한 최대 반응의 50%를 생산하는 그 아고니스트의 몰 농도를 나타낸다. 예컨대, 어떤 구조물이 72 nM의 농도에서, cGMP 분석법으로 측정시 그 구조물에 대해 가능한 최대 반응의 50%를 나타내었다면, 그 구조물의 EC₅₀은 72 nM이다. 달리 명시하지 않는 한, EC₅₀ 측정과 관련된 몰 농도는 나노몰(nM)이다.

"Ki(nM)"이라는 용어는 경쟁인자가 부재시 평형상태에서 수용체 결합부위의 절반에 결합하는 경쟁 화합물의 몰 농도를 나타내는 평형 수용체 결합 친화도를 나타낸다. 일반적으로, Ki는 그 수용체에 대한 화합물의 친화도와 역비례 관계에 있으며, 예를들어 Ki가 낮으면, 친화도는 높은 것이다. Ki는 Cheng 및 Prusoff의 방정식에 따라 측정할 수 있다 (Cheng Y., Prusoff W. H., Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108, 1973):

식 중, "ligand"는 리간드의 농도이며, 방사능리간드일 수 있고, K_d는 50% 수용체 점유율을 생산하는 수용체 친화도의 역척도(inverse measure)이다. 달리 명시하지 않는 한, Ki 측정과 관련된 몰 농도는 nM이다.

본 명세서에서 사용된 화학적 명명 프로법과 구조 다이아그램은 ChemDraw 프로그램 (Cambridgesoft Corp., Cambridge, Mass.에서 구입가능)에서 사용되는 화학적 명명법 특성에 따라 사용한 것이다. 특히, 특정 화합물의 명칭은 Chemdraw Ultra 또는 ISIS base (MDL Corp.)에 의해 사용되는 것과 같은 Autonom 프로그램을 이용한 구조로부터 유래된 것이다. 일반적으로, 구조 다이아그램에서 수소 원자는 말단기에 있는 경우와 기타 특수 환경을 제외하고, 탄소 원자와 결합된 경우 도시하지 않았다.

본 명세서에서 특정의 구조 다이아그램과 그림, 예컨대 표 1 및 표 2에 나타낸 것들은 아미노산 대체물과 아미노산 잔기들로 이루어진 구조물을 도시한 것으로, 대체물은 구조 다이아그램으로 표시한 것이고, 아미노산 잔기는 3문자 약어로 표시하였다. 달리 명시하지 않는 한, N-말단과 C-말단 양쪽 모두에서, 대체물과 잔기 사이의 결합, 또는 잔기와 대체물 사이의 결합, 또는 대체물과 잔기 사이의 결합은 통상적인 펩타이드 결합 -C(=O)-NH- 이거나, 펩타이드 결합이 대체물의 N-말단 상의 고리 질소에 대한 것일 경우, -C(=O)-N-이다. 일반적으로, 이러한 결합을 설명함에 있어서, 아미노산 대체물의 원자들은 표시되지만 (예컨대, -C(=O)- 또는 -N), 아미노산 잔기의 원자들은 표시되지 않는다.

포뮬레이션 및 용도

본 명세서에 개시된 구조물은 의약 용도와 축산 또는 수의용 분야 모두에서 사용가능하다. 일반적으로, 구조물, 이 구조물을 포함하는 약학적 조성물은 사람에 대해 사용되지만, 다른 포유류에 대해서도 사용가능하다. "환자"라는 용어는 포유류 개체를 가리키는 것으로서, 본 명세서와 청구범위에서도 이러한 의미로 사용된다. 본 발명의 주분야는 사람 환자를 대상으로 한 것이지만, 본 발명은 실험실, 농장, 동물원, 야생, 애완동물, 돌연변종 또는 기타 동물에 대해서도 사용가능하다.

본 명세서에 개시된 구조물은 항고혈압의 유도, 심장혈관계, 신장 및/또는 내분비 효과가 요망되는 모든 종류의 증상, 증후군 또는 질병을 치료하는데 이용될 수 있다. 여기에는 특히 천연 나트륨 이뇨 펩타이드가 사용될 수 있는 모든 증상, 증후군 또는 질병이 포함된다. 따라서, 본 명세서에 개시된 구조물은 소망되는 환자에 있어서 나트륨 이뇨, 이뇨 및/또는 혈관확장을 일으키는데 이용될 수 있다.

한가지 측면에서, 본 명세서에 개시된 구조물은 조기 단계, 예컨대 클래스 1의 울혈성 심부전증을 치료하는데 이용가능하다. 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 구조물은 만성 또는 대상부전형 울혈성 심부전증을 치료하는데 이용된다. 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 구조물은 휴식 중 또는 최소한의 활동 중에도 호흡곤란을 일으키는 환자의 급성 대상부전형 울혈성 심부전증을 비롯한 급성 울혈성 심부전증을 치료하는데 이용된다.

구조물의 염 형태. 본 발명의 구조물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다. "약학적으로 허용가능한 염"이라는 용어는 무기 또는 유기 염기 및 무기 또는 유기산을 비롯하여 약학적으로 허용가능한 비독성 염기 또는 산으로부터 제조된 염을 가리킨다. 무기 염기로부터 유래한 염에는 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 구리, 제1철, 제2철, 리튬, 마그네슘, 망간, 제2망간, 칼륨, 나트륨, 아연 등의 염이 포함된다. 특히 바람직한 것은 암모늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨 및 나트륨염이다. 약학적으로 허용가능한 유기 비독성 염기로부터 유래된 염에는 일차, 이차 또는 삼차 아민, 자연 발생적인 치환 아민을 비롯한 치환 아민, 사이클릭 아민, 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대, 아르기닌, 베타인, 카페인, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-에틸-모르폴린, N-에틸피페리딘, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 하이드라바민, 이소프로필아민, 라이신, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 트로메타민 등이 포함된다.

본 발명의 구조물이 염기성인 경우, 무기산 및 유기산을 비롯한 약학적으로 허용가능한 비독성 산으로부터 산부가염이 제조될 수 있다. 이러한 산에는 아세트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 캠포설폰산, 카르복실산, 시트르산, 에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 글루콘산, 글루탐산, 브롬화수소산, 염산, 이세티온산, 락트산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄설폰산, 말론산, 뮤신산, 질산, 팜산, 판토텐산, 인산, 프로피온산, 숙신산, 황산, 타르타르산, p-톨루엔설폰산, 트리플루오로아세트산 등이 포함된다. 본 발명의 구조물의 산부가염은 적절한 용매 중에서 구조물과 과량의 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 아세트산, 트리플로오로아세트산, 시트르산, 타르타르산, 말레산, 숙신산 또는 메탄설폰산으로부터 만들어진다. 아세테이트 염 형태가 특히 유용하다. 본 발명의 구체예의 구조물이 산성 모이어티를 포함할 경우, 적절한 약학적으로 허용가능한 염은 나트륨염 또는 칼륨염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘염이나 마그네슘염과 같은 알칼리토 금속염을 포함할 수 있다.

또한, 본 출원인은 본 발명의 펩타이드 구조물로부터의 특정 염 형태, 예를 들어 파모에이트, 옥타노에이트, 데카노에이트, 올리에이트, 스테아레이트, 소듐 탄네이트 및 팔미테이트 염 형태가 대응한 아세테이트 염 형태에 비해, 몇몇 경우에는 배가되는 정도로까지 순환 반감기가 증가됨을 발견하였다. 이러한 염 형태는 특히 만성 질환 치료시 피하 주사나 근육 주사에 의한 투여에 특히 적합한데, 이는 반감기가 연장된 결과로 달성가능하게 된 것으로 믿어지는 감소된 투약 횟수에 기인하는 것이다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 이러한 반감기의 증가는 아세테이트 염 형태에 비해 용해도가 감소된 것과 관련이 있는 것으로 믿어진다. 본 발명의 펩타이드 구조물의 이와 같이 반감기가 증가된 염 형태는 예컨대, 이온 교환, 구조물의 아세테이트 염 형태의 용액을 디소듐 파모에이트와 혼합하여 파모에이트 현탁액을 얻는 방법, 또는 구조물 제조시 최종 정제 단계(들)에서 소망되는 염을 사용하는 것을 비롯한 여러 방법에 의해 제조될 수 있다.

약학적 조성물. 본 발명의 또 다른 구체예에 따라 본 발명의 구조물과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 담체는 액상 포뮬레이션일 수 있으며, 바람직하게는, 완충, 등장된 수용액인 것이 좋다. 약학적으로 허용가능한 담체는 또한 부형제, 예컨대, 희석제, 담체 등, 및 첨가제, 예컨대, 안정화제, 방부제, 가용화제, 완충제 등도 포함하며, 이에 대해서는 후술한다.

본 발명의 몇몇 구체예의 구조물은 본 발명의 구조물 적어도 한가지와 예컨대 희석제, 담체 등과 같은 부형제 및 안정화제, 방부제, 가용화제, 완충제 등과 같은 첨가제를 비롯한 약학적으로 허용가능한 담체 한가지 이상을 필요에 따라 포함하는 약학적 조성물이 되도록 조성되거나 혼합될 수 있다. 포뮬레이션 부형제에는 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 히드록시 셀룰로스, 아카시아, 폴리에틸렌 글리콜, 만니톨, 소듐 클로라이드 및 소듐 시트레이트가 포함될 수 있다. 주사 또는 기타 액상 투여용 포뮬레이션의 경우, 적어도 한가지 이상의 완충 성분을 함유하는 물이 바람직하며, 안정화제, 방부제 및 가용화제도 사용할 수 있다. 고상 투여용 포뮬레이션의 경우, 여러가지 농후제, 충전제, 벌크화제 및 담체 첨가물, 예컨대 전분, 슈가, 지방산 등을 사용할 수 있다. 국소 투여용 포뮬레이션의 경우, 여러가지 크림제, 연고제, 겔제, 로션제 등을 사용할 수 있다. 대부분의 약학적 포뮬레이션에 있어서, 비활성 성분은 제제 부피나 중량에 대해 더 큰 부분을 차지할 것이다. 약학적 포뮬레이션에 있어서, 다양한 측정 방출, 서방형 또는 타임 방출형 포뮬레이션 및 첨가제를 사용하여, 본 발명의 구조물의 전달이 일정 시간 동안 지속적으로 효과를 나타낼 수 있도록 조성할 수 있다. 예컨대, 젤라틴, 소듐 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 기타 셀룰로스계 부형제를 포함시킴으로 해서 특히, 피하 주사 및 근육 주사에 의해 투여되도록 타임 방출형 또는 서방형 포뮬레이션을 제공할 수 있다.

일반적으로, 환자에게 투여되는 구조물의 실제량은 투여 방식, 사용되는 포뮬레이션, 및 소망되는 반응 정도에 따라 큰폭으로 달라질 수 있다.

실제 사용시, 본 발명의 구조물은 통상적인 약학적인 제약 기술에 따라 혼합물 중에 활성 성분으로서, 약학적 담체와 결합될 수 있다. 담체는 예컨대, 경구, 비경구(정맥 경로 포함), 요도내, 질내, 콧속, 경피, 폐내, 폐심부내, 흡입, 입안, 설파 등을 비롯한 소망되는 투여경로에 의한 제제 형태에 따라 광범위한 형태를 취할 수 있다. 경구 투여용 조성물을 제조하는 경우, 예컨대 현탁제, 엘릭시르제 및 용액제와 같은 경구용 액상 제제의 경우에는 예컨대, 물, 글라이콜, 오일, 알코올, 풍미제, 방부제, 색소 등과 같은 통상적인 약학적 매질을 사용할 수 있고; 예컨대, 분말제, 경질 및 연질 캡슐 및 정제와 같은 경구용 고상 제제의 경우에는, 전분, 슈가, 미세결정성 셀룰로스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 바인더, 붕괴제 등을 사용할 수 있다.

정제와 캡슐제는 투여하기가 쉽기 때문에, 이로운 경구 투여 단위 형태를 대표한다. 소망되는 경우, 본 발명의 구조물을 포함하는 조성물을 표준 수성 또는 비수성 기술에 의해 피복시킬 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물 중 활성 구조물의 양은 효과적인 투여량이 얻어지도록 하는 양이다. 또 다른 바람직한 투여 단위 형태에서, 시트, 웨이퍼, 정제 등과 같이, 설하용 약학적 조성물을 사용할 수 있다. 활성 구조물은 또한 예컨대 액상 점적제 또는 스프레이제와 같이 콧속으로도 투여될 수 있다.

정제, 알약, 캡슐제 등 역시도 트라가칸트검, 아카시아, 옥수수 또는 젤라틴과 같은 바인더; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분 또는 알긴산과 같은 붕괴제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 수크로스, 락토스 또는 사카린과 같은 감미료를 포함할 수 있다. 투여 단위 형태가 캡슐일 경우, 이것은 전술한 종류에 더해서, 지방 오일과 같은 액상 담체를 함유할 수도 있다.

여러가지 다른 물질들이 코팅제로서 사용가능하거나 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키는데 사용될 수 있다. 예컨대, 정제는 쉘락, 슈가 또는 두가지 모두에 의해 피복될 수 있다. 시럽이나 엘릭시르제는 활성 성분에 더해서, 감미료로서 수크로스, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리향 또는 오렌지향과 같은 향료를 함유할 수 있다.

구조물은 또한 비경구적으로 투여될 수 있다. 이러한 활성 펩타이드의 용액 또는 현탁액은 히드록시-프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 함께 물 속에서 적절히 혼합될 수 있다. 분산제 역시 글리세롤, 오일 중 액상 프로필렌 글리콜 및 이들의 혼합물 중에서 제조가능하다. 이러한 제제들은 미생물의 성장을 방지하기 위해 필요에 따라 방부제를 함유할 수 있다. 동결건조된 단일의 단위 포뮬레이션 역시 사용가능하며, 이것은 투여 직전에 식염수 등으로 재조성되므로 방부제를 필요로 하지 않는다.

주사용 용도로 적합한 약학적 형태는 예컨대, 멸균 주사용액 또는 분산액의 임시처방을 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말, 예컨대 동결건조된 포뮬레이션을 포함한다. 모든 경우에 있어서, 투여 형태는 멸균 상태여야 하고, 주사에 의해 투여될 수 있는 정도로 유동가능하여야 한다. 투여 형태는 제조 및 유통 과정에서 안정하여야 하며 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 활동에 대해 안전하게 유지되어야 한다. 담체는 예컨대 물, 에탄올, 폴리올, 예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜 또는 액상 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 적절한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.

본 명세서에 개시된 구조물은 비내 투여 수단에 의해 치료적으로 적용가능하다. "비내 투여(nasal administration)"이라 함은 본 발명의 여하한 구조물을 콧속으로 투여하는 모든 투여 형태를 가리킨다. 본 발명의 구조물은 수용액, 예컨대 식염수, 시트레이트 또는 기타 보통의 부형제 또는 방부제를 포함하는 용액과 같은 수용액 중에 조성될 수 있다. 이 구조물은 또한 건조 또는 분말 포뮬레이션일 수도 있다.

또 다른 구체예에서, 구조물은 폐 속으로 직접 투여될 수 있다. 계량된 투여량 흡입 수단, 즉, 숨을 들이쉬는 동안 환자에 의해 작동될 경우, 본 발명의 구조물의 계량된 볼러스를 자가 투여가능하게 해주는 장치에 의해 폐속으로 투여가능하다.

본 발명의 또 다른 구체예에 따라, 본 발명의 구조물은 펩타이드 약물을 비롯하여, 약물의 효과적인 비내 흡수를 증가시켜주는 여하한 제제와 함께 조성될 수 있다. 이러한 제제는 점막에 허용불가능한 손상을 입히는 일 없이 비내 흡수를 증가시켜준다. 미국특허 5,693,608, 5,977,070 및 5,908,825는 그 중에서도 흡수 촉진제를 포함하여, 사용가능한 여러가지 약학적 조성물을 개시하고 있으며, 이들 문헌의 개시 내용은 본 발명에 참고 통합되어 있다.

본 발명의 수용액, 특정 구조물은 식염수, 아세테이트, 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 또는 기타 완충제 수단에 의해 적절히 완충될 수 있고 적절한 생리적으로 허용가능한 pH, 일반적으로 약 pH 4 내지 약 pH 7로 완충가능하다. 예컨대 포스페이트 완충 식염수, 식염수와 아세테이트 완충액, 등과 같이 완충제의 조합도 이용가능하다. 식염수의 경우, 0.9% 식염수 용액을 사용할 수 있다. 아세테이트, 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 등의 경우, 50 mM 용액을 사용할 수 있다. 완충제에 더해서, 세균 및 기타 미생물의 성장을 예방하거나 제한하기 위해, 적절한 방부제를 사용할 수 있다. 사용가능한 이러한 방부제의 일례로 0.05% 벤잘코늄 클로라이드를 들 수 있다.

본 발명의 구조물은 또한 건조한 미립자 형태로 사용가능하다. 바람직한 구체예에서, 이러한 입자들은 크기가 약 0.5 내지 6.0㎛인 것이 좋고, 이에 따라 입자들은 토출됨이 없이 폐 표면에 머물기에 충분한 질량을 가질 수가 있으면서도, 폐에 도달하기 전에 기도 표면에 흡착되지 않을 정도로 충분히 작다. 비제한적인 예로서 마이크로 밀링, 분무 건조 및 동결건조를 수반하는 급속 동결 에어로졸법 등 여러가지 다양한 기술들을 이용하여 건조 분말 미립자를 만들 수 이다. 미립자 형태로 구조물은 폐심부에 흡착될 수 있기 때문에, 혈류 내로 신속하고 효율적으로 흡수될 수 있다. 또한, 이러한 접근법에서는 경피, 비내 또는 구강 점막 전달 경로에서 때로 그러하듯이 침투 촉진제가 필요하지 않다. 추진식 에어로졸, 분무기, 단일 투여 건조 분말 흡입기 및 멀티투여 건조 분말 흡입기를 비롯한 여러가지 다양한 흡입기를 사용할 수 있다. 현재 흔히 이용되는 기기에는 계량식 투여 흡입기가 있는데, 이것은 천식, 만성 폐쇄폐병 등의 치료약을 전달하는데 이용된다. 바람직한 기기로는 입도가 언제나 약 6.0㎛ 미만인 미세분말의 분진 또는 에어로졸을 형성하도록 고안된 건조 분말 흡입기를 들 수 있다.

평균 크기 분포를 비롯한 미립자 크기는 제조방법 수단에 의해 제어할 수 있다. 마이크로 밀링의 경우, 밀링 헤드의 크기, 로터의 속도, 가공 시간 등에 의해 미립자의 크기가 조절된다. 분무 건조의 경우, 노즐 크기, 유속, 드라이어의 온도 등에 의해 미립자 크기가 결정된다. 동결건조를 수반하는 신속 동결 에어로졸 수단에 의해 제조할 경우, 노즐 크기, 유속, 에어로졸 용액의 농도 등에 의해 미립자 크기가 조절된다. 이러한 변수 및 기타의 변수는 미립자 크기를 조절하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 구조물은 시간 방출형 주사용 포뮬레이션 형태로 볼기 근육이나 삼각근에 주사, 전형적으로는 심부 근육 주사함으로써, 치료적으로 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 구조물은 pH 등의 조절을 위해 폴리(에틸렌 글리콜)3350과 같은 PEG 및 임의로 한가지 이상의 부가적인 부형제 및 방부제, 예컨대 비제한적인 예로서 염, 폴리소르베이트 80, 소듐 히드록사이드 또는 염산과 같은 부형제와 함께 조성될 수 있다. 또 다른 구체에에서, 본 발명의 구조물은 폴리(오르토 에스테르)와 함께 조성될 수 있는데, 이것은 폴리머 백본 중 다양한 백분율의 락트산에 의해 자가-촉매된 폴리(오르토 에스테르)일 수 있으며, 필요에 따라 한가지 이상의 부가적인 부형제와 함께 조성될 수 있다. 일 구체예에서, 폴리 (D,L-락타이드-코-글리콜라이드) 폴리머 (PLGA 폴리머)가 사용되며, 바람직하게는 Boehringer Ingelheim, Inc. (독일, 잉겔하임)사가 판매하는 PLGA RG502H와 같은 친수성 말단기를 갖는 PLGA 폴리머를 사용하는 것이 좋다. 이러한 포뮬레이션은 예컨대, 반응기 중에서 본 발명의 구조물을 적절한 용매, 예컨대 메탄올 중에서 메틸렌 클로라이드 중 PLGA 용액과 함께 결합시키고, 여기에 적절한 혼합 조건 하에 폴리비닐 알코올의 연속상 용액을 첨가함으로써 만들 수 있다. 일반적으로, 바람직하게는 부착성 폴리머이기도 한 여하한 몇가지 주사가능하며 생분해성인 폴리머들을 시간 방출형 주사용 포뮬레이션에 사용할 수 있다. 미국특허 4,938,763, 6,432,438, 및 6,673,767의 개시내용과, 본 명세서에 개시된 포뮬레이션 방법 및 생분해성 폴리머는 본 발명 명세서에 참고로 통합된다. 구조물의 농도 및 양, 폴리머의 생분해율, 및 기타 당업자에게 알려진 인자들에 따라, 주일별, 월별 또는 기타 주기적 기준으로 포뮬레이션을 주사할 수 있다.

투여 경로. 만일 주사 투여될 경우, 정맥, 피하, 근육내, 복강내 또는 기타 기술 분야에 알려진 다른 수단으로 주사될 수 있다. 본 발명의 구조물은 비제한적인 예로서 정제, 캡슐제, 캐플렛제, 현탁제, 분말제, 동결건조 제제, 좌약제, 점안제, 피부 팻치제, 경구 가용성 포뮬레이션, 스프레이제, 에어로졸제 등과 같은 포뮬레이션을 비롯한 여하한 수단에 의해 조성될 수 있으며, 완충제, 바인더, 부형제, 안정화제, 항산화제 및 기술분야에 알려진 기타 제제와 함께 혼합 및 조성될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 세포의 표피층을 통하여 도입되는 여하한 투여경로에 의해 투여될 수 있다. 따라서 투여 수단에는 점막을 통한 투여, 구강내 투여, 경구 투여, 경피 투여, 흡입 투여, 폐내 투여, 비내 투여, 요도내 투여, 질내 투여 등이 포함된다.

한가지 측면에서, 본 발명의 구조물은 본 발명의 구조물을 PEG, 폴리(오르토 에스테르) 또는 PLGA 폴리머와 함께 조성시키는 것처럼, 시간-방출 주입형 포뮬레이션 수단에 의해 투여될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 구조물은 자동화 전달 장치 수단에 의해 연속 또는 간헐적으로 경피 전달하는 방식으로 투여된다. 전술한 여하한 방법과 포뮬레이션은 만성 울혈성 심부전증 및 특히 만성 대상부전 울혈성 심부전증과 같은 만성 질환이나 증후군을 치료하는데 특히 적용가능하다.

한가지 측면에서, 본 발명의 여하한 구조물은 미국특허 6,586,396에 개시된 모든 방법을 비롯한 경피 투여에 의해 투여될 수 있다. 또 다른 측면에서, 환자들, 특히 외래 환자 세팅에서 비교적 대상부전형이거나 울혈성 심부전증을 앓는 환자들에게 미국특허출원 공개 2004/0077537 및 국제특허출원 공개 WO 2003/079979에 개시된 방법과 투여량으로 본 발명의 구조물을 투여할 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 구조물을 미국특허출원 공개 2005/0113286에 기재된 방법에 의해 환자에게 투여할 수 있다. 또 다른 측면에서, 심장근육이 손상된 환자들은 미국특허출원 공개 2006/0019890에 개시된 바와 같은 방법에 의해 심장 리모델링을 위해 치료될 수 있다.

본 발명의 구조물은 또한 미국특허출원 공개 2006/0034903에 개시된 방법 및 장치를 비롯한 전달 시스템 수단에 의해, 경피적으로 투여될 수 있다. 마찬가지로, 이 문헌에 개시된 하이드로젤 포뮬레이션 및 고체상태 포뮬레이션들을 본 발명의 구조물에 대한 사용을 위해 채택할 수 있다.

치료학적 유효량. 일반적으로, 환자에 대한 본 발명의 구조물의 실제 투여량은 투여 방식, 사용되는 포뮬레이션 및 소망되는 반응에 따라 매우 광범위하게 변할 수 있다. 치료를 위한 투여량은 전술한 여하한 수단이나 방법에 의해, 소망되는 치료학적 효과를 가져오는데 충분한 투여량이다. 따라서, 치료학적 유효량은 특히 항고혈압, 심장혈관, 신장 및/또는 내분비 효과를 유도하는데 충분한 본 발명의 구조물 또는 약학적 조성물의 양을 포함한다. 한가지 측면에서 치료학적 유효량은 소망되는 나트륨 이뇨, 이뇨, 및/또는 혈관확장을 초래하는 양이다.

일반적으로, 본 발명의 구조물은 매우 활성적이다. 예컨대, 이러한 조성물은 선택된 특정 구조물, 소망되는 치료적 반응, 투여 경로, 포뮬레이션 및 당업자에게 알려진 기타의 인자에 따라, 약 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 또는 100 μg/kg 체중의 양으로 투여될 수 있다.

복합 요법

본 발명의 몇가지 구체예에 따른 구조물들은 특히 울혈성 심부전증을 치료하는데 사용되는 다른 약제나 제제와 함께 복합적으로 사용되는 것이 가능하며 또 그러한 복합 사용을 고려할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 울혈성 심부전증을 치료하기 위한 방법이 제공된다. 이 방법은 울혈성 심부전증을 앓는 환자에게 본 명세서에 개시된 구조물의 치료학적 유효량을 울혈성 심부전증을 치료하는데 유용한 다른 화합물의 치료학적 유효량, 또는 본 발명의 구조물의 환자에 있어서의 생체이용성을 증진하는데 유용한 다른 화합물의 치료학적 유효량과 함께 투여하는 것을 포함한다. 한가지 측면에서, 미국특허출원 공개 2004/0063630에 개시된 방법 및 이뇨제와 같은 이뇨제와 본 발명의 구조물을 복합적으로 환자에게 투여할 수 있다. 복합 사용가능한 이뇨제의 비제한적인 예로는 티아자이드-, 루프- 및 포타슘-스페어링 이뇨제 하이드로클로로티아자이드((Hydrodiuril

), 클로르탈린돈, 퓨로즈미드 (Lasix

), 스피로노락톤(Aldactone

) 및 트리암테린을 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 구조물의 치료학적 유효량을, 이뇨제 이외의 항고혈압제의 치료학적 유효량과 함께 복합 투여하는 것으로 되는 울혈성 심부전증의 치료법이 제공된다. 이러한 항고혈압 약제에는 일반적으로 칼슘 채널 차단제(디하이드로피리딘 및 비디하이드로피리딘이 포함됨), 교감신경 억제제, 비특이적 아드레날린 차단제, α-아드레날린 안타고니스트(비선택적 및 선택적 α1-차단제를 포함함), β-차단제 (선택적 차단제 뿐 아니라 비선택적 차단제가 포함되며 내인성 교감신경작용 활성을 갖는 차단제가 포함됨), 혈관확장제 (내성 고혈압 및 응급 고혈압의 치료를 위한), 안지오텐신 전환효소 억제제 및 안지오텐신 II 안타고니스트가 포함된다. 복합 사용가능한 항고혈압제로는 혼합형 α 및 β 안타고니스트, 예컨대 라베톨롤(Normodyne

); 혈관확장제, 예컨대 하이랄라진(Apresoline

), 미녹시딜(Loniten

), 니트로프루시드(Nipride

), 또는 디아족사이드(Hyperstat IV

); 칼슘 차단제, 예컨대 니페디핀(Adalat

), 딜티아젬(Cardizem

), 또는 베라파밀(Calan

); 교감신경작용제, 예컨대 클로니딘(Catapres

), 메틸도파 (Aldomet

), 레세르핀 (Serpasil

), 또는 과네티딘(Ismelin

); ACE 억제제, 예컨대 캡토프릴(Capoten

), 에날라프릴 (Vasotec

) 또는 리시노프릴(Prinivil

); α-아드레날린 안타고니스트, 예컨대 펜톨아민(Regitine

), 또는 프라조신(Minipress

); 안지오텐신 II 안타고니스트, 예컨대, 로사르탄(Cozaar

); 또는 β-아드레날린 안타고니스트, 예컨대, 프로판올롤(Inderal

), 나돌롤(Corgard

), 메토프롤롤 (Lopressor

) 또는 핀돌롤을 들 수 있다.

기타 효능

본 발명의 구조물의 주요 용도는 울혈성 심부전증, 급성 신부전증, 및 신장 고혈압의 치료 및 경감에 관한 것이지만, 본 발명의 구조물은 나트륨 이뇨, 이뇨 및/또는 혈관확장 화합물이 치료적 장점을 제공하는여하한 치료방법이나 치료양태에도 사용가능하다. 따라서, 한가지 측면에서, 본 발명의 구조물은 미국특허 5,965,533에 개시된 바와 같이, 복강 투석 용액에 첨가제로서 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 구조물은 국제특허공개 WO 00/18422에 개시된 바와 같이, 안과학적 분야에 사용될 수 있다..

아미노산 대체물들의 합성 방법

다음에 예시된 본 발명의 아미노산 대체물의 합성방법들은 어디까지나 예시를 위한 것으로, 당업자는 이를 필요에 따라 변형시킬 수 있으며, 이러한 변형 역시 본 발명 범위에 포괄되는 것으로 이해되어야 한다.

관능화된 R 측쇄가 없는 아미노산을 모방하는 케토피페라진 스캐폴드의 합성 (방법 A 및 B)

다음 방법 A 및 B에 설명된 바와 같이 여러가지 방법으로 구조물을 제조하였다.

방법 A: 혼합 무수법에 의해 Boc-세린 (OBn)-OH (1), 및 α-아미노 에스테르 (2)를 사용하여 디펩타이드(3)을 형성하였다. 디펩타이드는 고수율로 얻어졌으며, 대개 정제를 요하지 않는다. 2차 아민을 보호시킨 채로 디보란-테트라히드로퓨란을 이용하여 메틸 에스테르와 아미드기를 두가지 모두 환원시켜 di-Boc 보호된 아미노 알코올 중간체(4)를 얻었다. 알코올을 피리디늄 디크로메이트(PDC)로 산화시키는 동시에 고리화시킴으로써 한 단계로 피페라진-2-온(5)을 얻어다. 수소첨가에 의해 벤질 에테르를 제거한 다음, 보호기 교환시켜 Fmoc 보호된 피페라진-2-온 (6)을 얻엇다. 마지막으로, 몇가지 상이한 방법 (PDC, Jones 산화, 루테늄 클로라이드-소듐 퍼요오데이트, 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시, 유리 래디칼(TEMPO) 산화)에 의해 일차 알코올을 산이 되도록 산화시켜 최종 생성물(7)을 얻었다.

2-(3-벤질옥시-2-3차-부톡시카르보닐아미노-프로피오닐아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (3)의 합성: 질소 하, -20℃에서 유지된 30mL의 건조 테트라히드로퓨란 중 10mmol의 Boc 세린 벤질 에테르 (1) 용액에, 22mmol의 트리에틸아민을 첨가한 다음 11.4mmol의 이소부틸클로로포르메이트를 서서히 첨가하였다. 백색의 고체가 석출되었다. 슬러리를 15분간 교반한 다음, 11.1 mmol의 α-아미노 에스테르(2)를 한번에 첨가하였다. 이 슬러리를 -20℃에서 30분간 교반한 다음, 실온으로 승온시킨 다음, 2시간 교반한 후 농축 건조시켰다. 이어서 혼합물을 50 mL의 에틸 아세테이트/30ml의 1N 염산 용액에서 분별시켰다. 층들을 분리하고, 유기층을 1x 20ml의 1N 염산, 및 1 x 20 mL의 중탄산나트륨 포화용액으로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물 (3)은 일반적으로 90% 초과의 수율로 얻어지며, 정제를 필요하지 않았다.

Di-Boc-2-치환-(2-아미노-3-벤질옥시-프로필-아미노)-에탄올(4)의 합성: 질소 하 실온에서 유지된 건조 테트라히드로퓨란 50mL 중 35 mmol의 (3)의 용액에 테트라히드로퓨란 중 1N 디보란 용액 200 mL를 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음, 1N 염산 용액 200 mL의 빙냉 용액에 천천히 부었다. 이중상(biphasic) 용액을 고상 수산화나트륨으로 중화시켰다. 중탄산나트륨 포화용액 140mL를 첨가한 다음, 디-3차-부틸-디카보네이트 70mmol을 첨가한 후 혼합물을 실온에서 2일간 교반한 다음, 200mL의 에틸 아세테이트로 희석하고 층을 분리하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 생성물(4)를 실리카 겔 컬럼 크로 마토그래피로 정제하였다.

1,4-디-Boc-6-벤질옥시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (5)의 합성: 300 mL의 건조 디메틸포름아미드 중 400mmol의 피리디늄 디크로메이트와 70 mmol의 (4)의 용액을 질소 하 48℃에서 6시간 교반하고, 실온으로 냉각한 다음 1500mL의 물에 부은 다음 4 x 500 mL 에틸 에테르로 추출하였다. 에테르층을 결합시키고 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 생성물(5)를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

4-Fmoc-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (6)의 합성: 200mL 에탄올 중 탄소상 2g의 10% 팔라듐과 19mmol의 (5)의 현탁액을 실온 및 대기압 하에서 밤새 수소첨가시켰다. 이 현탁액을 셀라이트를 통해 여과 및 농축시켰다. 잔사를 디클로로메탄 중 50% 트리프루오로아세트산 40 mL에 용해시켰다. 용액을 실온에서 2시간 교반한 다음 농축시켰다. 잔사를 60 mL 테트라히드로퓨란/40 mL 물에 재용해시키고, 고상 중탄산나트륨으로 중화시킨 다음, 고상 중탄산나트륨 40mmol 및 Fmoc 클로라이드 20 mmol을 첨가하였다. 이어서 이 혼합물을 실온에서 2시간 교반하고, 에틸 아세테이트 300 mL로 희석한 다음, 층을 분리하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 농축시킨 다음 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.

4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-카르복실산 (7)의 합성: 화합물 (7)을 여러가지 방법으로 제조하였다.

(a) 180 mL 아세토니트릴, 180 mL 사염화탄소, 및 240 mL 물 중 10 mmol (6)의 이중상(biphasice) 용액을 0℃로 냉각한 다음 112 mmol의 고상 소듐 퍼요오데이트를 첨가하고 이어서 340mg의 염화루테늄을 첨가하였다. 반응물을 실온으로 승온시키고 2시간 교반한 다음, 셀라이트를 통해 여과하였다. 층들을 분리하고, 수층을 2 x 75 mL 에틸 아세테이트로 재추출하였다. 유기층을 결합하고 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.

(b) 60 mL 건조 디메틸포름아미드 중 12 mmol의 (6), 및 59 mmol의 PDC 용액을 질소 분위기 하 48℃에서 ~ 5시간 교반한 다음, 실온으로 냉각하고 600 mL의 물을 붓고, 3 x 200 mL의 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 결합시키고 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.

(c) 실온으로 유지된 350mL의 아세톤 중 17 mmol의 (6)의 용액에 25mL의Jones 시약 (8.0 g의 크롬산, 17.4 mL의 물, 및 6.9 mL의 진한 황산으로부터 제조됨)을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 이소프로판올 150 mL를 첨가한 다음 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하였다. 셀라이트를 에틸 아세테이트로 세척하였다. 유기층을 결합 및 농축시켰다. 잔사를 250 mL의 에틸 아세테이트에 용해시키고 2 x 50 mL의 물로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.

(d) 실온에서 유지된 810mL의 아세토니트릴 중 81mmol 알코올(6)의 용액에, 포스페이트 완충용액 (물 295mL 중 7.2 g의 소듐 포스페이트 모노베이직, 및 14.3 g의 소듐 포스페이트 디베이직으로부터 제조됨)을 첨가한 다음, 3.3 g (20.7 mmol)의 TEMPO, 및 18.6 g (164.4 mmol)의 소듐 클로라이트를 첨가하고, 이중상 용액을 43℃로 유지된 유조에 넣은 다음, 43.3 mL (25.9 mmol)의 소듐 하이포클로라이트 용액 (19.3 mL의 10-13% 소듐 하이포클로라이트 용액, 및 24 mL의 물을 혼합하여 제조함)을 서서히 첨가하였다. 반응물을 43℃에서 4시간 교반하였다. 용액을 실온으로 냉각하고, 200 mL의 10% 소듐 히드로겐 설파이트 용액 을 첨가한 다음 10분간 교반한 후, 500 mL의 에틸 아세테이트로 희석한 다음 층들을 분리하였다. 유기층을 1 x 100 mL의 식염수, 1 x 160mL의 1N 염산 용액으로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.

생성물(7)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

방법 B: 상기 방법 A에 설명한 바와 같이 제조된 중간체 디-Boc-2-치환-(2-아미노-3-벤질옥시-프로필-아미노)-에탄올 (4)를 TEMPO 이소시아누르산 시약을 이용하여 산이 되도록 산성화시킨 다음, 요오도메탄으로 에스테르화시켜 완전히 보호된 환원 디펩타이드 유사체(8)을 얻었다. Boc기, 및 벤질 에테르의 탈보호에 의해, 3치환 5-히드록시메틸-피페라진-2-온이 수득되었으며, 이를 Fmoc 유도체로 보호시켜 (6)을 얻고, 방법 A에 설명된 바와 같이 산화시켜 최종 생성물을 얻었다.

디-Boc-(2-아미노-3-벤질옥시-프로필아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (8)의 합성: 0℃에서 유지된 210mL의 중탄산나트륨 포화용액 및 680 mL의 아세톤 중 76 mmol의 (4)의 현탁액에, 21 mmol의 고상 브롬화나트륨, 2.9mmol의 TEMPO를 첨가한 다음 156mmol의 트리클로로이소시아누르산을 서서히 첨가하였다. 0℃에서 반응물을 30분간 교반한 다음, 실온에서 밤새 교반하고, 1N 염산 용액으로 산성화시킨 다음 2 x 300 mL 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 3 x 50 mL의 1N 염산으로 세척하고, 황산 마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 잔사를 건조 디메틸포름아미드 40 mL 및 95 mmol의 고상 중탄산나트륨에 재용해시키고 112 mmol의 요오도메탄을 첨가한 다음, HPLC가 반응이 종결되었음을 알릴 때까지 실온에서 혼합물을 교반하였다.; 이어서 용액을 200mL의 에틸 에테르로 희석하고, 2 x 100mL의 물로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 생성물(8)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

4-Fmoc-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (6)의 합성: 디클로로메탄 중 50% 트리플루오로아세트산 40 mL 중 36 mmol의 (8)의 용액을 실온에서 2시간 교반한 다음, 중탄산나트륨 포화용액 200 mL에 부었다. 층들을 분리하고, 유기층을 농축시켰다. 잔사를 100 mL 에틸 아세테이트에 재용해시킨 다음 2 x 50 mL의 물로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 잔사를 100 mL의 에탄올에 용해시키고, 탄소상 10% 팔라듐 5g과 35mL의 1N 염산 용액을 첨가한 다음 혼합물을 실온에서 수소첨가하고 HPLC가 반응 종결을 알릴 때가지 실온 및 대기압 하에서 혼합물을 수소첨가하였다; 이어서 용액을 셀라이트를 통해 여과 및 농축시켰다. 잔사를 80mL의 에틸 아세테이트에 재용해시키고, 30mL 물 중 중탄산나트륨 70mmol을 첨가한 다음, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 에틸 아세테이트를 제거하고 100 mL 테트라히드로퓨란을 첨가한 다음, 178 mmol의 고상 중탄산나트륨 및 43 mmol의 Fmoc 클로라이드를 첨가하고, HPLC가 반응 종결을 나타낼 때가지 혼합물을 교반한다음, 에틸 아세테이트 300 mL로 희석한 다음 층들을 분리하였다. 유기층을 2 x 50 mL의 물로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 생성물(6)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-카르복실산 (7)의 합성: 화합물 (7)을 방법 A에 설명된 바와 같이 제조하였다.

관능화된 R 측쇄를 갖거나 갖지 않는 화합물에 적용가능한 케토피페라진 스캐폴드의 제조를 위한 일반적인 공통 합성 방법 (방법 C, E, F)

방법 C: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여 Fmoc O-보호 세린알을 α-아미노 에스테르 (2)로 환원적 아민화시킴으로써 (2-Fmoc-아미노-3- R'-O-프로필아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (10)를 제조하였다. 에스테르(12)를 디-이소부틸알루미늄 하이드라이드에 의해 환원, Dess-Martin 퍼요오디난 (Des-Martin periodinane)에 의한 Fmoc O-보호 세린알(13)의 산화나, 또는 수소화리튬 알루미늄에 의한 Fmoc O-보호 세린 Weinreb 아미드(14)의 환원에 의해 환원성 아민화에 필요한 Fmoc O-보호 세린알 (9)는 방법 D에 의해 제조하였다. Fmoc O-보호 세린알(9)의 바람직한 제조 방법은 Weinreb 아미드 유사체를 환원시키는 것이었다. (2-Fmoc-아미노-3-R'-O-프로필아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (10)를 이어서 N 및 O 탈보호, 고리화시키고 Fmoc 보호시켜 3치환 6-히드록시메틸-피페라진-2-온 (6)을 얻고, 이어서 이를 방법 A에 설명된 바와 같이 산성화시켜 최종 생성물을 얻었다.

합성에 사용되는 Fmoc-O-보호 세린알 (9)의 히드록실기 상의 보호기 (R')는 아미노 에스테르의 측쇄 R의 특성에 좌우된다. R이 관능기를 함유하지 않으면, Fmoc 세린의 측쇄를 tBu 에테르로서 보호하였다. R이 관능기를 함유하면, Fmoc 세린의 측쇄를 트리틸 에테르로서 보호하였다.

방법 D: 여러가지 Fmoc-O-보호 세린알 (9)의 합성. Fmoc-O-R' 세린 메틸 에스테르 (12)의 합성: 질소 하에 유지된 80 mL의 건조 디메틸포름아미드 중 80 mmol의 Fmoc O-R' 세린 (11), 10.0 g (120 mmol)의 고상 중탄산나트륨 및 10.0 mL (160 mmol)의 요오도메탄의 약한 현탁액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 500 mL의 물에 붓고, 고체를 여과하였다. 고체를 800 mL의 에틸 아세테이트에 재용해하고 1 x 200 mL의 물로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 정제는 필요하지 않았다.

Fmoc-O-R' 세린올 (13)의 합성: 질소 하, -20℃에서 유지된 50 mL의 건조 테트라히드로퓨란 중 10.0 mmol의 Fmoc O-R' 세린 (11)의 용액에 1.77 mL (12.7 mmol)의 트리에틸 아민을 첨가한 다음 1.57 mL (12.0 mmol)의 이소부틸클로로포르메이트를 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 30분간 교반한 다음, 10 mL의 물 중 소듐 보로하이드라이드 3.77g(99.6 mmol)의 빙냉 용액에 서서히 붓고, 온도를 5℃ 미만으로 유지하였다. 반응물을 0℃에서 15분간 교반한 다음 1N 염산 용액으로 중단시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 100 mL로 희석시키고 층을 분리하였다. 유기층을 1N 염산 용액 2 x 25 m, 물 2 x 25 mL로 세척하고 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

Fmoc-O-R' 세린 Weinreb 아미드(14)의 합성: 80 mL의 건조 디클로로메탄 중 20.2 mmol의 Fmoc O-R' 세린 (11), 6.98 g (21.6 mmol)의 2-(1H-벤조벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU), 및 2.5 mL (22.7 mmol)의 N-메틸-모르폴린의 현탁액을 실온에서 질소 분위기 하에 20분간 교반한 다음, 3.02 g (31 mmol)의 N,O-디-메틸-히드록실아민 히드로클로라이드 및 3.3 mL (30 mmol)의 N-메틸-모르폴린을 첨가하고, 이 현탁액을 실온에서 밤새 교반하였다. 형성된 용액을 농축 건조시키고, 200 mL의 에틸 아세테이트와 100 mL의 물 사이에서 재분배한 다음, 2 x 40 mL의 1N 염산 용액으로 세척한 다음 2 x 40 mL의 중탄산나트륨 포화용액으로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 정제는 필요하지 않았다.

에스테르 (12)로부터 Fmoc-O-R' 세린알 (9)의 합성: 질소 하 -78℃에서 유지된 5 mL의 테트라히드로퓨란 중 3.5 mmol의 (12) 용액에, 10 mL의 1N 디이소부틸 알루미늄 하이드라이드 (DIBAL) 용액을 서서히 첨가하고, 15분간 교반한 다음 주석산 나트륨 및 주석산칼륨의 포화용액을 서서히 첨가하여 중단(quenching)시켰다. 반응물을 실온으로 승온시키고, 에틸 아세테이트 50 mL로 희석한 다음, 50 mL의 주석산나트륨 및 주석산 칼륨 포화용액을 첨가하였다. 층을 분리하고 수층을 1 x 50 mL의 에틸 아세테이트로 재추출하였다. 유기층을 결합시키고 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물(9)를 다음 단계에서 추가 정제하지 않고 사용하였다.

알코올 (13)으로부터 Fmoc-O-R' 세린알 (9)의 합성: 질소 하, 실온에서 유지된 건조 디클로로메탄 200 mL 중 80 mmol의 Fmoc-O-R' 세린올 (13) 용액에, 88 mmol의 Dess-Martin 퍼요오디난을 첨가하고, 반응물을 2.5시간 교반한 다음 400 mL의 10% 소듐 트리설페이트 수용액을 첨가하여 중단시켰다. 층을 분리하고, 유기층을 농축한 다음 300 mL의 에틸 에테르로 희석하고, 10% 소듐 티오설페이트를 함유하는 바이카보네이트 포화수용액으로 3회 세정한 후 황산 마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.

Weinreb 아미드 (14)로부터의 Fmoc-O-R' 세린알(9)의 합성: 질소 하, -78℃로 냉각시킨 60 mL의 건조 테트라히드로퓨란 중 8.8 g (20.2 mmol)의 조질의 Fmoc-O-R' 세린 Weinreb 아미드 중간체 (14) 용액에, 테트라히드로퓨란 중 1N 수소화리튬 알루미늄 용액 30 mL를 첨가하였다. 이 용액을 15분간 교반한 다음 30 mL의 1.4N 황산수소칼륨 용액을 서서히 첨가함으로써 중단시켰다. 실온으로 승온시킨 후, 고체를 여과하고 여액을 농축 건조시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트 50 mL와 25 mL의 1N 염산 용액 사이에서 재분배하였다. 층을 분리하고, 유기층을 황산마그네슘으로 건조, 여과 및 농축시켰다.

(2-Fmoc-아미노-3-R'-O-프로필아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (10)의 합성: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여 환원적 아민화에 의해 화합물(10)을 제조하였다.

소듐 시아노보로하이드라이드 방법: 질소 하, 실온에서 유지된 20 mL의 메탄올 중 8.5 mmol의 (2) 하이드로클로라이드 염의 용액에 2.3 mmol의 고상 수산화칼륨을 첨가하고 혼합물을 25분간 교반하였다. 10 mL 메탄올 중 Fmoc-O-R' 세린알 (9)의 용액을 전술한 현탁액에 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 테트라히드로퓨란 중 1N 소듐 시아노보로하이드라이드 8.5 mL 용액을 서서히 첨가하고, 반응물을 1시간 교반한 다음 여과 및 농축시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트와 물 사이에서 분배하고 유기층을 1 x 20 mL의 포화 중탄산나트륨으로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조 및 농축하였다.

소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 방법: 50 mL의 건조 테트라히드로퓨란 중 21 mmol의 (2) 하이드로클로라이드 염, 및 2.9 mL (21 mmol)의 트리에틸 아민의 용액을 실온에서 45분간 교반한 다음, 30 mL 테트라히드로퓨란 중 ~20 mmol의 조질의 Fmoc-(O-R')-세린알 (9) 용액을 첨가하고, 이어서 1.7 g의 4A 분말상 분자체를 첨가한 다음 이 현탁액을 다시 2시간 동안 교반하였다. 6.4 g (30 mmol)의 고상 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 첨가하고, 실온에서 현탁액을 밤새 교반하였다. 현탁액을 메탄올로 희석하고, 분자체를 여과하고 여액을 농축시켰다. 잔사를 100 mL의 에틸 아세테이트와 50 mL의 물 사이에서 분배하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조, 여과 및 농축시켰다.

4-Fmoc-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (6)의 합성: 화합물 (6)을 생산하기 위해서는 3 단계가 필요하다: (a) 부수적인 사이클화를 수반하는 Fmoc 탈보호, (b) Fmoc 보호, 및 (c) 히드록실기 탈보호.

Fmoc기의 제거 및 사이클화: 에틸 아세테이트 용액 중 30 mL의 30% 디에틸 아민 중 10 mmol의 사이클릭 화합물 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음, 농축 건조시켰다.

(a) Fmoc 보호: 20 mL의 테트라히드로퓨란 및 10 mL의 물 중 10 mmol의 화합물의 이중상 용액에, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨, 이어서, 3.36 g (13 mmol)의 Fmoc-Cl을 첨가하였다. 이 혼합물을 3시간 동안 교반하고, 에틸 아세테이트로 희석한 다음, 층을 분리하고, 유기층을 물로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.

(b) 히드록시실기 탈보호: tBu 에테르 보호기를 함유하는 화합물의 경우: 디클로로메탄 중 90% 트리플루오로아세트산 용액으로 화합물들을 1-2시간 동안 탈보호시킨 다음 농축 건조시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고 중탄산나트륨 포화용액으로 세척한 다음 황산 마그네슘으로 건조 및 농축하였다. Trt 에테르 보호기를 함유하는 화합물의 경우: 2-10% 트리-이소프로필 실란을 함유하는 디클로로메탄 중에서 1-10% 트리플루오로아세트산의 용액을 첨가함으로써 화합물들을 탈보호시켰다. 반응은 즉각적이었다. 이어서 용액을 중탄산나트륨 포화용액에 부어 중화시켰다. 층을 분리하고, 황산나트륨으로 건조 및 농축시켰다.

화합물 (6)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-카르복실산 (7)의 합성: 방법 A에 설명된 바와 같이 화합물 (7)을 제조하였다. 화합물 (7)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

방법 E: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드나 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여, Fmoc 세린알(OR')(9)를 α 아미노 에스테르(2)의 환원적 아민화에 의해 (2-Fmoc-아미노-3-히드록시-프로필-Cbz-아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (15)를 제조하였다. 2차 아민을 벤질클로로포르메이트로 보호시킨 다음, 트리플루오로아세트산 용액으로 히드록실기를 탈보호하였다. 이어서 화합물 (15)를 Fmoc 탈보호시켰다. 아미노 에스테르 중간체를 즉시 사이클화시켜 4-Cbz-3치환 6-히드록시메틸-피페라진-2-온 (16)을 형성하였다. Fmoc 3치환 6-히드록시메틸-피페라진-2-온 (6)을 보호기 교환에 의해 제조한 다음 방법 A에 설명된 바와 같이 산화시켜 소망 생성물 (7)을 얻었다.

(2-Fmoc-아미노-3-히드록시-프로필-Cbz-아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (15)의 합성: 80 mL 메탄올 중 67 mmol의 아미노 에스테르 하이드로클로라이드 (2), 및 20.9 mmol의 고상 수산화칼륨의 현탁액을 실온에서 25분간 교반한 다음, 250 mL의 메탄올 중의 현탁액(9)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 1.5시간 교반하고, 테트라히드로퓨란 중 70 mL의 1N 소듐 시아노보로하이드라이드 용액을 서서히 첨가하였다. 반응물을 밤새 교반한 다음 농축하였다. 잔사를 300 mL의 테트라히드로퓨란과 50 mL의 1N 염산 용액 사이에서 분배하였다. 층을 분리하고, 유기층을 50 mL의 물 중 239 mmol의 중탄산나트륨 용액으로 중화시킨 다음 66 mmol의 벤질 클로로포르메이트르르 서서히 첨가하고, 반응물을 3시간 교반한 다음 200 mL의 에틸 아세테이트로 희석하고 층을 분리하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조, 및 농축하였다. 잔사를 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산 용액에 용해시키고 실온에서 2시간 교반하였다. 용액을 중탄산나트륨 포화 용액 200 mL에 부었다. 층을 분리하고, 유기층을 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물(15)를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

4-Cbz-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (16)의 합성: 에틸 아세테이트 중 100 mL의 30% 디에틸 아민 중 24 mmol의 (15)의 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축 건조시켰다. 이 화합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

4-Fmoc-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (6)의 합성: 50 mL의 에탄올 중 15 mmol의 (16), 및 1.8 g의 탄소상 10% 팔라듐의 현탁액을 실온 및 대기압 하에서 HPLC가 반응 종류를 나타낼 때까지 수소첨가하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트를 통해 여과, 농축시키고 잔사를 35 mL의 테트라히드로퓨란 및 10 mL의 물에 용해시킨 다음 62 mmol의 고상 중탄산나트륨을 첨가한 후, 16 mmol의 Fmoc-Cl을 첨가하고, 이 혼합물을 3시간 교반한 다음, 100 mL의 에틸 아세테이트 및 10 mL의 물로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 황산마그네슘으로 건조 및 농축하였다. 화합물 (6)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-카르복실산 (7)의 합성: 화합물 (7)을 방법 A에 설명된 바와 같이 제조하고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.

방법 F: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하고, Cbz 세린알 (OBn) (19)를 α-아미노 에스테르(2)에 의해 환원적으로 아민화시킴으로써 (2-Cbz-아미노-3-벤질옥시-프로필아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (20)를 제조하였다. 환원적 아민화에 필요한 Cbz O-벤질 세린알 (19)는 Cbz 세린올 (OBn) (18)을 Dess-Martin 퍼요오디난으로 산화시킴으로써 수득하였다. (20)을 수소첨가한 다음 사이클화시켜 3-치환 6-히드록시메틸-피페라진-2-온을 얻고 이를 Fmoc 보호시켜 4-Fmoc-3-치환 6-히드록시메틸-피페라진-2-온 (6)을 얻었다. 최종 생성물 (7)은 방법 A에서와 같이 제조하였다.

Cbz-세린올 (OBn) (18)의 합성: 화합물 (13)에 대해 설명된 바와 같이 화합물 (18)을 제조하였다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 정제 후 화합물 (18)을 79% 수율로 얻었다. ¹H NMR δ (CDCl₃) 3.57 -3.74 (two m, 3H, CHN, 및 CH₂O), 3.76-3.96 (two m, 2H, CH₂O), 4.50 (s, 2H, CH₂O), 5.10 (s, 2H, CH₂O), 5.40-5.50 (br. d, 1H, NH), 7.22-7.38 (m, 10H, Ph); HPLC t_R = 5.33 분, (M⁺ + Na⁺) = 337.64.

Cbz 세린알 (OBn) (19)의 합성: 화합물 (9)에 대해 설명한 바와 같이 화합물 (19)를 제조하였다. 질소 하 실온에서 유지된 200 mL의 건조 디클로로메탄 중 80 mmol의 Cbz-O-Bn 세린올 (18)의 용액에 88 mmol의 Dess-Martin 퍼요오디난을 첨가하고, 반응물을 2.5시간 교반한 다음 400 mL의 10% 소듐 티오설페이트 수용액을 첨가함으로써 중단시켰다. 층을 분리하고 유기층을 농축시킨 다음 300 mL의 에틸 에테르로 희석하고, 10% 티오황산나트륨을 함유하는 바이카보네이트 포화수용액으로 3회 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물 (19)는 99% 조질 수율로서 수득되었고, 추가 정제 없이 사용하였다. ¹H NMR δ (CDCl₃) 3.69-3.78 (dd, 1H, CH₂O), 3.99-4.06 (dd, 1H, CH₂O), 4.37-4.46 (m, 1H, CHN), 4.47-4.52 (d, 2H, CH₂O), 5.14 (s, 2H, CH₂O), 5.65-5.75 (br. d, 1H, NH), 7.14-7.48 (연속적인 m, 9H, Ph), 7.98-8.08 (dd, 1H, Ph), 9.63 (s, 1H, CHO).

(2-Cbz-아미노-3-벤질옥시-프로필아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (20)의 합성: 알데하이드로서 Cbz 세린알 (19)을 사용한 것을 제외하고, 화합물 (10)에 대해 설명한 바와 같이 화합물 (20)을 제조하였다. 화합물 (20)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

4-Fmoc-6- 히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (6)의 합성: 160 mL의 에탄올, 38 mL의 1N 염산 및 20 g의 탄소상 10% 팔라듐 중 38 mmol의 (20)의 현탁액을 실온 및 대기압 하에서 HPLC가 반응 종료를 나타낼 때가지 수소첨가하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고 농축 건조시켰다. 잔사를 75 mL의 테트라히드로퓨란으로 희석한 다음 중탄산나트륨 포화용액으로 중화시켰다. 106 mmol의 고상 중탄산나트륨 및 53 mmol의 Fmoc 클로라이드를 첨가하고, HPLC가 반응 종료를 나타낼 때까지 반응물을 실온에서 교반한 다음, 300 mL의 에틸 아세테이트 및 300 mL의 식염수로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 식염수로 2회 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 생성물(6)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-카르복실산 (7)의 합성: 화합물 (7)을 방법 A에서 설명된 바와 같이 제조하였다.

관능화 측쇄가 없는 아미노산을 모방하는 2,2-이치환 케토피페라진 스캐폴드의 합성(방법 G)

관능화된 측쇄가 없는 아미노산을 모방하는 4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-메틸-2-카르복실산 스캐폴드의 합성은 방법 G를 이용하여 수행하였다. 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드나 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여, 2-Boc-아미노-2-메틸-3-옥소-프로피온산 메틸 에스테르 (22)를 α-아미노 에스테르(2)로 환원적 아미노화시킴으로써 2-Boc-아미노-3-메톡시카르보닐-1-치환-메틸아미노-2-메틸-프로피온산 3차-부틸 에스테르 (23)를 제조하였다. 환원적 아민화에 필요한 화합물 (22)는 α-메틸-Boc 세린 3차-부틸 에스테르 (21)를 Dess-Martin 퍼요오디난으로 산화시킴으로써 수득하였다. (23)의 Boc기를 디옥산 중 2N 염화수소, 및 아미노 에스테르에 의해 제거하고 사이클화시켜 보호되지 않은 5-치환-6-옥소-피페라진-2-메틸-2-카르복실산 3차-부틸 에스테르 (24)를 얻고, 이를 Fmoc 클로라이드로 보호시켜 4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-메틸-2-카르복실산 3차-부틸 에스테르를 얻은 다음, 이를 트리플루오로아세트산으로 탈보호시켜 최종 생성물 (25)를 얻었다.

2-Boc-아미노-2-메틸-3-옥소-프로피온산 3차-부틸 에스테르 (22)의 합성: 전술한 바와 같이 Dess-Martin 퍼요오디난을 이용하여Boc α-메틸 세린 3차-부틸 에스테르 (21)를 산화시켜 소망 생성물 (22)를 96%의 조질 수율로서 얻었다. 이 화합물을 추가 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다. ¹H NMR δ (CDCl₃): 1.44 (s, 18H, ^t Bu), 1.46 (s, 3H, CH₃), 5.63-5.70 (br. s, 1H, NH), 9.5 (s, 1H, CHO)

2-Boc-아미노-3-메톡시카르보닐-1-치환-메틸아미노-2-메틸-프로피온산 3차-부틸 에스테르 (23)의 합성: 알데하이드로서 화합물 (22)를 사용한 것을 제외하고 화합물 (10)에 대해 설명한 것과 유사한 방법을 이용하여 화합물 (23)을 제조하였다. 화합물 (23)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

2-메틸-6-옥소-5-치환-피페라진-2-카르복실산 (25)의 합성: 디옥산 중 8 mL의 2N 염화수소 중 4 mmol의 (23)의 용액을 실온에서 5시간 교반한 다음, 농축 건조시켰다. 잔사를 20 mL의 테트라히드로퓨란에 현탁시키고, 10 mmol의 트리에틸아민으로 중화시킨 다음 60℃에서 2일간 교반하였다. 이어서, 이를 농축 건조시키고, 20 mL의 테트라히드로퓨란과 10 mL의 물에 재현탁시킨 다음 고상 중탄산나트륨을 첨가하여 pH를 염기성으로 조절한 다음, 5.6 mmol의 고체 Fmoc 클로라이드를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음 1N 염산 용액으로 pH를 1로 조정한 후, 100 mL의 에틸 아세테이트로 희석한 다음 층을 분리하였다. 유기층을 2 x 100 mL의 식염수로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 잔사를 디클로로메탄 중 10 mL의 50% 트리플루오로아세트산에 용해시키고 용액을 실온에서 3시간 교반하였다. 용매를 농축하고 생성물(25)를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

관능화 측쇄를 갖는 아미노산을 모방하는 2,2-이치환 케토피페라진 스캐폴드의 합성 (방법 H)

관능화 측쇄를 갖는 아미노산을 모방하는 4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-메틸-2-카르복실산 스캐폴드의 합성을 방법 H를 이용하여 수행하였다. 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드나 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여, 2-Alloc-아미노-2-메틸-3-옥소-프로피온산 메틸 에스테르 (28)를 α-아미노 아릴 에스테르 (29)로 환원적 아민화시킨 다음, 2차 아민을 벤질클로로포르메이트로 보호시켜 2-Alloc-아미노-3-메톡시카르보닐-1-치환-메틸아미노-2-메틸-프로피온산 메틸 에스테르 (30)를 제조하였다. 환원적 아민화에 필요한 화합물 (28)은 화합물 (27)을 Dess-Martin 퍼요오디난으로 산화시켜 수득하였다. 유사체(30)의 alloc기와 알릴 에스테르를 테트라키스트리페닐 포스핀 팔라듐(0) 및 펩타이드 커플링제와의 반응에 의해 사이클화된 아미노산을 이용하여 제거하여 5-치환-6-옥소-피페라진-2-메틸-2-카르복실산 메틸 에스테르 (31)를 얻었다. 메틸 에스테르의 비누화 및 이어 서 보호기 교환에 의해 4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-메틸-2-카르복실산 (25)을 얻었다.

Alloc α-메틸 세린 메틸 에스테르 (27)의 합성: 질소하에 유지된 8 mL의 건조 디메틸포름아미드 중 8 mmol의 Boc α-메틸 세린 (26), 1.0 g (12 mmol)의 고상 중탄산나트륨, 및 1.0 mL (16 mmol)의 요오도메탄의 용액을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 50 mL의 물에 붓고, 50 mL의 디에틸 에테르로 추출한 다음, 1 x 20 mL의 물로 세척하고 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 잔사를 디클로로메탄 중 20 mL의 90% 트리플루오로아세트산에 용해시키고, 용액을 실온에서 3시간 교반한 다음 농축 건조시켰다. 잔사를 35 mL의 테트라히드로퓨란, 및 10 mL의 물에 용해시킨 다음, 30 mmol의 고상 중탄산나트륨을 첨가하고, 12 mmol의 알릴 클로로포르메이트를 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 2시간 교반하고, 50 mL의 에틸 아세테이트로 희석한 다음, 층을 분리하였다. 유기층을 1 x 10 mL의 중탄산나트륨 포화용액 및, 1 x 10 mL의 1N 염산 및 1 x 10 mL의 물로 세척하고 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물 (27)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

2-Alloc-아미노-2-메틸-3-옥소-프로피온산 메틸 에스테르 (28)의 합성: 전술한 바와 같이 Dess-Martin 퍼요오디난을 이용하여 Alloc α-메틸 세린 메틸 에스테르 (27)을 산화시킴으로써 소망 생성물 (28)을 얻었다.

2-Alloc-아미노-3-메톡시카르보닐-1-치환-메틸-Cbz-아미노-2-메틸-프로피온산 알릴 에스테르 (30)의 합성: 알데하이드로서 화합물 (28)을 사용한 것을 제외하고 화합물(15)에 대해 설명된 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (30)을 제조하였다.

4-Cbz-2-메틸-6-옥소-5-치환-피페라진-2-카르복실산 메틸 에스테르 (31)의 합성: 질소 하 실온에서 유지된 30 mL의 디클로로메탄 중 10 mmol의 화합물 (30) 용액에, 2 당량의 페닐실란과 0.3 당량의 테트라키스트리페닐포스핀 팔라듐(0)을 첨가하고, 용액을 2시간 교반한 다음, 11 mmol의 TBTU, 및 14 mmol의 N-메틸-모르폴린을 첨가하고, 이 용액을 실온에서 2시간 교반한 다음 농축 건조시켰다.

4-Fmoc-2-메틸-6-옥소-5-치환-피페라진-2-카르복실산 (25)의 합성: 질소 하 실온에서 유지된 25mL 메탄올 중 10 mmol의 화합물 (31)의 용액에, 11 mmol의 1N 수산화나트륨 용액을 서서히 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 21 mL의 1N 염산 용액으로 중화시키고, 탄소상 10% 팔라듐 1g을 첨가한 다음 현탁액을 실온 및 대기압 하에서 3시간 동안 수소첨가시켰다. 이 현탁액을 셀라이트를 통해 여과 및 농축시켰다. 잔사를 25 mL의 테트라히드로퓨란, 및 10 mL의 물에 재용해시킨 다음, 30 mmol의 고상 중탄산나트륨과 10 mmol의 Fmoc 클로라이드를 첨가하고, 반응물을 질소 하, 실온에서 2시간 교반하였다. 이어서 반응물을 50 mL의 에틸 아세테이트로 희석하고, 1N 염산 용액으로 산성화시켰다. 이어서 층을 분리하고, 유기층을 1 x 20 mL의 물로 세척한다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물 (25)를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

(5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세트산 스캐폴드의 합성 (방법 I, J, K)

(5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세트산 스캐폴드의 합성을 몇가지 방법에 의해 수행하였다.

방법 I: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여, 3차-부틸 3-보호-아미노-4-옥소-부티레이트 (34)를 α-아미노 에스테르 (2)로 환원적 아민화시킴으로써 (3차-부틸 3-보호-아미노-4-(메톡시카르보닐-치환-메틸아미노)-부티레이트 (35)를 제조하였다. 환원적 아민화에 필요한 3차-부틸 3-보호-아미노-4-옥소-부티레이트 (34)는 Weinreb 아미드 유도체 (33)의 수소화리튬 알루미늄 (LAH) 환원에 의해 제조하였다. 이어서 3차-부틸 (3-보호-아미노-4-(메톡시카르보닐-치환-메틸아미노)-부티레이트 유사체(35)를 탈보호, 사이클화 및 Fmoc 보호시켜 3차-부틸(5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세테이트 (36)을 얻고, 이를 탈보호시켜 최종 생성물 (37)을 수득하였다.

아미노 보호된 Asp-(O ^t Bu) Weinreb 아미드 (33)의 합성: 화합물(14)에 대해 설명된 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (33)를 제조하였다.

3차-부틸 3-아미노 보호된-아미노-4-옥소-부티레이트 (34)의 합성: 화합물(9)에 대해 설명된 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (34)를 제조하였다.

3차-부틸 3-보호-아미노-4-(메톡시카르보닐-치환-메틸아미노)-부티레이트 (35)의 합성: 알데하이드로서 화합물(34)를 사용한 것을 제외하고 화합물(10)에 대해 설명된 것과 유사한 방법으로 화합물 (35)를 제조하였다.

3차-부틸 (4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세테이트 (36)의 합성: Fmoc 아미노 보호기를 함유하는 화합물의 경우, 에틸 아세테이트 용액 중 30 mL의 30% 디에틸 아민 중 10 mmol의 화합물 (35)의 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음, 농축건조시켰다. Cbz 아미노 보호기를 함유하는 화합물의 경우, 30mL 에탄올 중 10 mmol의 화합물 (35)의 용액을 실온 및 대기압 하에서 2시간 동안 수소첨가시키고, 셀라이트를 통해 여과 및 농축 건조시켰다. Fmoc 보호의 경우, 잔사를 20 mL의 테트라히드로퓨란 및 10 mL의 물에 용해시키고, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨을 첨가한 다음 3.3 g (13 mmol)의 Fmoc-Cl을 첨가하였다. 혼합물을 3시간 교반한 다음 에틸 아세테이트로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 물로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물(36)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

(4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세테이트 (37)의 합성: 디클로로메탄 중 90% 트리플루오로아세트산 용액으로 화합물(36)을 3시간 동안 탈보호시킨 다음, 농축 건조시켰다. 최종 생성물 (37)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

방법 J: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드나 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여, 디페닐메틸 3-Fmoc-아미노-4-옥소-부티레이트 (40)를 α-아미노 에스테르 (2)에 의해 환원적 아민화시켜 디페닐메틸 3-Fmoc-아미노-4-(메톡시카르보닐-치환-메틸아미노)-부티레이트 (41)를 제조하였다. 환원적 아민화에 필요한 디페닐메틸 3-Fmoc-아미노-4-옥소-부티레이트 (40)는 Weinreb 아미드 유도체 (39)를 수소화리튬 알루미늄 환원시켜 얻었으며, 상기 아미드 유도체는, 미츠노부 조건 하에서 β-에스테르를 보호함으로써 시판하는 Fmoc-아스파르트산 α-알릴 에스테르 유도체 (38)로부터 형성되었다. 알릴 에스테르를 팔라듐(0) 촉매를 이용하여 제거한 다음, 커플링제로서 TBTU를 이용하여 Weinreb 아미드 형성시켰다. 이어서, 디페닐메틸 3-Fmoc-아미노-4-(메톡시카르보닐-치환-메틸아미노)-부티레이트 (41)를 Fmoc 탈보호시키고, 사이클화시켜 디페닐메틸 에스테르를 수소첨가에 의해 제거한 다음, Fmoc 보호시켜 최종생성물 (4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세트산 (37)을 얻었다.

Fmoc-Asp-(OCHPh₂) Weinreb 아미드 (39)의 합성: 0℃ 질소하에서 유지된, 3.4 g (13 mmol)의 트리페닐포스핀, 및 2.41 g (13.1 mmol)의 디페틸메탄올을 함유하는 30 mL의 건조 테트라히드로퓨란 중 5.1 g (13.0 mmol)의 Fmoc-아스파르트산 α-알릴 에스테르 (38)의 용액에, 2.6 mL (13.4 mmol)의 디이소프로필 아조디카르복실레이트를 서서히 첨가하였다. 아이스배쓰를 제거하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축 건조시킨 후 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. ¹H NMR δ (CDCl₃) 2.96-3.06 (dd, 1H, CH₂CO), 3.15-3.26 (dd, 1H, CH₂CO), 4.18-4.76 (연속적인 m, 3H, CH, CH₂), 5.14-5.32 (m, 1H, CHN), 5.76-5.86 (m, 1H, CHO), 7.20-7.80 (연속적인 m, 18H, 풀벤, 및 Ph); HPLC t_R = 7.68 분, (M⁺ + Na⁺) = 583.90.

이어서 생성물 (9.8 mmol)을 1.5 g (1.3 mmol)의 테트라키스 트리페닐포스핀 팔라듐 (0)을 함유하는 40 mL의 디클로로메탄:아세트산:N-메틸 모르폴린 용액 (37:2:1)에 용해시키고 이 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축 건조시키고 100 mL의 에틸 아세테이트와 30 mL의 물 사이에서 분배하였다. 층들을 분리하고, 유기 층을 1 x 50 mL의 물로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조 및 농축시켰다. 잔사를 20 mL의 건조 디클로로메탄에 현탁시키고, 1.65 mL (15 mmol)의 N-메틸 모르폴린, 및 4.07 g (12.7 mmol)의 TBTU를 첨가한 다음 현탁액을 실온에서 20분간 교반한 후, 1.65 mL (15 mmol)의 N-메틸 모르폴린, 및 1.52 g (15.6 mmol)의 N,O-디메틸 히드록실아민 하이드로클로라이드 염을 첨가하였다. 이 현탁액을 실온에서 2시간 교반한 다음, 농축하고 100 mL의 에틸 아세테이트와 50 mL의 물 사이에서 분배하였다. 유기층을 1 x 30 mL의 물, 1 x 30 mL의 중탄산나트륨 포화용액 및 1 x 30 mL의 1N 염산 용액으로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조 및 농축시켰다. 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. ¹H NMR δ (CDCl₃) 2.76-2.88 (dd, 1H, CH₂CO), 2.89-3.00 (dd, 1H, CH₂CO), 3.16 (s, 3H, CH₃N), 3.70 (s, 3H, CH₃O), 4.14-4.22 (dd, 1H, CH), 4.28-4.40 (t, 2H, CH₂), 5.07-5.16 (dd, 1H, CHN), 5.69-5.76 (d, 1H, CHO), 7.24-7.8 (연속적인 m, 18H, 풀벤, 및 Ph); HPLC t_R = 7.08, (M⁺ + Na⁺) = 587.03.

디페닐메틸 3-Fmoc-아미노-4-옥소-부티레이트 (40)의 합성: 화합물(9)에 대해 설명된 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (40)을 제조하였다.

디페닐메틸 3-Fmoc-아미노-4-(메톡시카르보닐-치환-메틸아미노)-부티레이트 (41)의 합성: 알데하이드로서 화합물(40)을 사용한 것을 제외하고, 화합물(10)에 대해 설명된 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (41)을 제조하였다.

(4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세트산 (37)의 합성: 에틸 아세테이트 중 30 mL의 30% 디에틸아민 중 10 mmol의 화합물 (41)의 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용액을 건조 농축하고, 2 x 30 mL의 에틸 아세테이트에 재용해시킨 다음 재농축시켰다. 잔사를 50 mL의 에탄올 및 20 mL의 1N 염산용액에 용해시키고, 대기압 하 실온에서, 밤새 수소첨가시키고, 셀라이트를 통해 여과 및 농축건조시켰다. 잔사를 20 mL의 테트라히드로퓨란 및 10 mL의 물에 용해시키고, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨을 첨가한 다음, 3.3 g (13 mmol)의 Fmoc-Cl을 첨가하였다. 혼합물을 3시간 교반하고, 100 mL의 에틸 아세테이트로 희석한 다음 층을 분리하고 유기층을 2 x 50 mL의 물로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

방법 K: 시판하는 Fmoc-아스파르트산 α3차-부틸 에스테르 (42)로부터 출발하여 (5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세트산 스캐폴드를 합성한다. 혼합 무수물을 통해 소듐 보로하이드라이드를 이용하여 Fmoc-아스파르트산 α 3차-부틸 에스테르를 Fmoc-호모세린으로 환원시킨 다음, 알코올을 벤질 브로마이드로 보호하여Fmoc-호모세린 벤질 에테르 α 3차-부틸 에스테르 (43)을 얻었다. 이 3차-부틸 에스테르를 트리플루오로아세트산을 이용하여 제거하고, 혼합 무수물을 통해 소듐 보로하이드라이드를 이용하여 산을 알코올로 환원시켜 2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-1-부탄올 (44)를 얻었다. 이어서 전술한 바와 같이 Dess-Martin 퍼요오디난을 이용하여 알코올 (44)을 2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시부탄알 (45)로 전환시켰다. 2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시부탄알 (45) 및 α-아미노 에스테르 (2)의 환원적 아민화에 의해 (2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-부틸아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (46)을 얻는다. 디에틸 아민에 의한 Fmoc 탈보호에 의해 유리 일차 아민을 얻고 이를 사이클화하여 6-벤질옥시에틸-3-치환-피페라진-2-온을 자연적으로 얻는다. 이 벤질 에테르를 수소첨가에 의해 제거하고, 2차 아민을 그의 Fmoc 유도체로서 보호시켜 4-Fmoc-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (47)을 얻었다. 마지막으로, 일차 알코 올을 산이 되도록 산화시켜 최종 생성물(48)을 방법 A에 설명된 바와 같이 얻었다.

Fmoc-호몰세린 (OBn) α 3차-부틸 에스테르 (43)의 합성: 질소 하, -20℃에서 유지된 50 mL의 건조 테트라하이드로퓨란 중 10.0 mmol의 Fmoc Asp-O ^t Bu (42) 용액에, 1.77 mL (12.7 mmol)의 트리에틸 아민을 첨가한 다음, 1.57 mL (12.0 mmol)의 이소부틸클로로포르메이트를 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 30분간 교반한 다음, 10 mL 물 중 소듐 보로하이드라이드 3.77g (99.6 m mol)의 빙냉 용액에 서서히 붓고, 온도를 5℃ 미만으로 유지하였다. 반응물을 0℃에서 15분간 교반한 다음, 1N 염산 용액으로 중단시켰다. 반응 혼합물을 100 mL의 에틸 아세테이트로 희석하고, 2 x 25 mL의 물로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시키고 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이어서 정제된 화합물을 30 mL의 테트라히드로퓨란에 용해시키고, 미네랄 오일 중 12 mmol의 60% 소듐 하이드라이드 분산액을 첨가한 다음, 0.2 mmol의 테트라부틸암모늄 요오다이드 및 12 mmol의 벤질 브로마이드를 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반한 다음 50 mL의 중탄산나트륨 포화수용액으로 중단시킨 후 100 mL의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이어서 이 화합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.

2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-1-부탄올 (44)의 합성: 방법 I에서 화합물(37)에 대해 설명된 바와 같이, 90% 트리플루오로아세트산을 이용하여 3차-부틸 에스테르를 탈보호시킨 다음, 화합물 (13)에 대해 설명된 바와 같이 혼합 무수물 중간체를 경유하여 소듐 보로하이드라이드로 산을 알코올로 환원시켰다.

2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-부탄알 (45)의 합성: 화합물(9)의 합성에 대해 설명된 바와 같이 Dess-Martin 퍼요오디난을 이용하여 2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-1-부탄올 (44)을 알데하이드로 산화시켰다.

(2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-부틸아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (46)의 합성: 화합물 (10)의 합성에 대해 설명한 바와 같이, 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여 2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-부탄알 (45)을 α-아미노 에스테르 (2)로 환원적 아민화시켰다.

4-Fmoc-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (47)의 합성: 방법 J에서 화합물(37)에 대해 설명된 바와 같이, 부수적인 사이클화를 수반하는 (2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-부틸아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (46)의 Fmoc 탈보호에 이어 탈벤질화 및 Fmoc 재보호를 수행한다.

4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-일-아세트산 (37)의 합성: 방법 A에 설명된 바와 같이 4-Fmoc-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (47)을 산이 되도록 산화시킨다. 사용된 산화제의 선택은 5-위치에 있는 기의 특성에 의해 좌우된다.

2치환 3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실산 스캐폴드의 합성 (방법 L, M, N)

여러가지 방법에 의해 2치환 3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실산 스캐폴드를 제조한다.

방법 L: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드를 이용하여, 아미노 에스테르(51)로 3차-부틸 Cbz-2-아미노-4-옥소-부티레이트 (50)를 환원적 아민화시킨 다음, 2차 아민을 Boc보호시킴으로써 3차-부틸 2-Cbz-아미노-4-(벤질옥시카르보닐-치환-메틸-Boc 아미노)-부티레이트 (52)를 제조한다. 환원적 아민화에 필요한 3차-부틸 Cbz-2-아미노-4-옥소-부티레이트 (50)은 Weinreb 아미드 유도체 (49)의 리튬 알루미늄 하이드라이드 환원에 의해제조한다. 보호기 제거에 의해 디아제판 고리를 형성시킨 다음, 펩타이드 형성 시약으로 사이클화시킴으로써 화합물(53)을 얻는다. 마지막으로, 보호기 교환에 의해, 4-Fmoc-2치환 3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실산 (54)을 형성한다.

Cbz-Asp-(Weinreb 아미드)-O ^t Bu (49)의 합성: 화합물 (14)에 대해 설명한 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (49)를 제조한다..

3차-부틸 3-Cbz-아미노-4-옥소-부티레이트 (50)의 합성: 화합물 (9)에 대해 설명한 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (50)을 제조한다.

3차-부틸 2-Cbz-아미노-4-(벤질옥시카르보닐-치환-메틸아미노)-부티레이트 (52)의 합성: 화합물(10)에 대해 설명한 것과 유사한 공정을 이용하여 환원적 아민화를 수행한다.조질의 혼합물을 테트라히드로퓨란 중 2 당량의 Boc 디카보네이트와 반응시킴으로써 2차 아민을 보호시킨다.

3차-부틸 1-Boc 2-치환-3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실레이트 (53)의 합성: 30 mL 에탄올 중 10 mmol의 화합물 (52) 용액을 대기압 하 실온에서 2시간 동안 수소첨가하고, 셀라이트를 통해 여과한 다음 농축 건조시켰다. 잔사를 100 mL 디클로로메탄에 용해시키고, 1.2 당량의 TBTU와, 2.6 당량의 N-메틸-모르폴린을 첨가한다. 이 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축시켰다. 잔사를 50 mL의 에틸 아세테이트와 25 mL의 1N 염산 용액 사이에서 분배하고, 1 x 20 mL의 중탄산나트륨 포화용액으로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.

1-Fmoc 2-치환-3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실산 (54)의 합성: 디클로로메탄 중 10 mL의 90% 트리플루오로아세트산 중 10 mmol의 화합물 (53)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 이 용액을 농축 건조시켰다. 잔사를 20 mL의 테트라히드로퓨란과 10 mL의 물에 용해시키고, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨을 첨가한 다음, 3.36 g (13 mmol)의 Fmoc-Cl을 첨가하였다. 이 혼합물을 3시간 교반한 다음, 에틸 아세테이트로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 2 x 50 mL의 물로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.

방법 M: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여 디페닐메틸 Alloc-2-아미노-4-옥소-부티레이트 (59)를 아미노 에스테르 (29)로 환원적 아민화시킨 다음, 2차 아민을 Cbz 보호시킴으로써 환원된 디펩타이드 유사체(60)을 제조하였다. 환원적 아민화에 필요한 디페닐메틸 Alloc-2-아미노-4-옥소-부티레이트 (59)는 Weinreb 아미드 유도체(57)의 보호기 교환에 의해 제조된 Winreb 아미드 유도체(58)의 수소화리튬 알루미늄 환원에 의해 제조한 다. 이어서 알릴 및 alloc기 제거, 및 이어서 펩타이드 형성제 존재 하에 폐환시킴으로써 디아제판 고리를 형성한다. 2-치환 3-옥소[1,4]-디아제판-5-카르복실산 스캐폴드(54)를 보호기 교환에 의해 형성한다.

Fmoc-Asp-(Weinreb 아미드)-OCHPh₂ (57)의 합성: 화합물(39)에 설명된 것과 유사한 공정에 의해 화합물 (57)을 제조한다.

Alloc-Asp-(Weinreb 아미드)-OCHPh₂ (58)의 합성: 에틸 아세테이트 중 20 mL의 30% 디에틸아민 중 10 mmol의 화합물 (56)의 용액을 2시간 동안 교반한 다음 농축 건조시켰다. 잔사를 20 mL의 테트라히드로퓨란 및 10 mL의 물에 용해시키고, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨을 첨가한 다음 13 mmol의 Alloc-Cl을 첨가하였다. 혼합물을 3시간 교반한 다음 에틸 아세테이트로 희석한다. 층을 분리하고, 유기층을 물로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물(58)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.

디페닐메틸 3-Alloc-아미노-4-옥소-부티레이트 (59)의 합성: 화합물 (9)에 대해 설명된 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (59)를 제조한다.

디페닐메틸 2-Alloc-아미노-4-(알릴옥시카르보닐-치환-메티아미노)-부티레이트 (60)의 합성: 알데하이드로서 화합물(59)를 사용한 것을 제외하고, 화합물(15)에 대해 설명된 것과 유사한 공정을 이용하여 환원적 아민화에 의해 화합물 (60)을 제조한다. 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.

디페닐메틸 1-Cbz 2-치환-3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실레이트 (61)의 합성: 질소 하 실온에서 유지된 30 mL의 디클로로메탄 중 10 mmol의 화합물 (60)의 용액에, 2 당량의 페닐실란과 0.3 당량의 테트라키스트리페닐포스핀 팔라듐(0)을 첨가하고 이 용액을 2시간 교반한 다음, 1.2 당량의 TBTU 및 1.3 당량의 N-메틸-모르폴린을 첨가한다. 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축한다. 잔사를 50 mL의 에틸 아세테이트 및 25 mL의 1N 염산 용액 사이에서 분배하고, 1 x 20 mL의 중탄산나트륨 포화용액으로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조 및 농축하였다.

1-Fmoc 2-치환-3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실산 (54)의 합성: 30 mL 에탄올 중 10 mmol의 화합물 (61) 용액을 실온에서 2시간 동안 수소첨가하고, 셀라이트를 통해 여과한 다음 용액을 농축 건조시킨다. 잔사를 20 mL의 테트라히드로퓨란 및 10 mL의 물에 용해시키고, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨을 첨가한 다음, 3.36 g (13 mmol)의 Fmoc-Cl을 첨가한다. 혼합물을 3시간 동안 교반한 다음, 에틸 아세테이트로 희석한다. 층을 분리하고, 유기층을 물로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시킨다.

방법 N: 혼합 무수물을 경유하여, Fmoc-아스파르트산 β 3차-부틸 에스테르를 소듐 보로하이드라이드에 의해 Fmoc-아스파르탄올 β 3차-부틸 에스테르 (63)으로 환원시켜 Fmoc-아스파르탄올 알릴 에테르 β 3차-부틸 에스테르 (64)를 제조한다. 이어서 3차-부틸 에스테르를 트리플루오로아세트산으로 제거하고, 혼합 무수물을 경유하여 소듐 보로하이드라이드에 의해 산을 알코올이 되도록 환원시켜 3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-1-부탄올 (65)을 얻는다. 이어서 전술한 바와 같이 Dess-Martin 퍼요오디난을 이용하여 알코올 (65)을 3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시부탄올 (66)로 전환시킨다. 3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시부탄알 (66) 및 α 아미노 에스테르(51)의 환원적 아민화와 후속적인 2차 아민 상의 alloc 보호에 의해, (3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-부틸-alloc-아미노)-2치환 아세트산 벤질 에스테르 (67)를 얻는다. 벤질 에스테르의 비누화 및 그에 이은 디에틸 아민에 의한 Fmoc 탈보호에 의해 유리 일차 아민을 얻고, 이를 TBTU와 같은 펩타이드 형성 시약을 이용하여 사이클화함으로써 Alloc 7-알릴옥시메틸-3-치환-[1,4]-디아제판-2-온 (68)을 형성시킨다. 최종 생성물 (54)는 보호기 교환에 의해 형성된다; 알릴 에테르와 alloc을 팔라듐(0)에 의해 제거하고, 2차 아민을 그의 Fmoc 유도체로서 보호하여 4-Fmoc-7-벤질옥시메틸-3-치환-[1,4]-디아제판-2-온을 얻은 다음, 산이 되도록 일차 알코올 산화시켜, 최종 생성물 (54)를 얻는다. 사용되는 산화제의 선택은 2-위치에 있는 기의 특성에 좌우된다.

Fmoc-아스파르탄올 β 3차-부틸 에스테르 (63)의 합성: 출발물질로서 Fmoc-아스파르트산 β 3차-부틸 에스테르 (62)를 이용하여 화합물(13)의 합성에 설명된 것과 같이 화합물 (63)을 제조한다.

3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-부티르산 3차-부틸 에스테르 (64)의 합성: 질소 하, 실온에서 유지된 30 mL의 테트라히드로퓨란 중 10 mmol의 (63)의 용액에, 미네랄 오일 중 12 mmol의 60% 소듐 하이드라이드 분산액, 2 mmol의 테트라부틸암모늄 요오다이드, 및 13 mmol 알릴 브로마이드를 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반한 다음, 10 mL의 중탄산나트륨 포화수용액으로 중단시키고, 50 mL의 에틸 아세테이트로 추출하였다.

3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-1-부탄올 (65)의 합성: 화합물(44)의 합성에 대해 설명된 바와 같이 화합물 (65)를 제조한다.

3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-부탄알 (66)의 합성: 화합물 (9)의 합성에 대해 설명된 바와 같이 Dess-Martin 퍼요오디난을 이용하여 3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-1-부탄올 (65)을 알데하이드가 되도록 산화시킨다.

(3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-부틸-alloc-아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (67)의 합성: 화합물(10)에 대해 설명된 바와 같이 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여 α-아미노 에스테르(51)에 의해 3-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-부탄알 (66)을 환원적으로 아민화시킨 다음, 벤질 클로로포르메이트 대신 알릴 클로로포르메이트를 사용한 것을 제외하고 화합물(15)에 대해 설명된 것과 같이, 2차 아민을 alloc 유도체로서 보호 한다.

4-Alloc-7-알릴옥시메틸-3-치환-[1,4]-디아제판-2-온 (68)의 합성: 20 mL의 메탄올, 및 10 mL의 물 중 10 mmol의 (3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-부틸-alloc-아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (67), 20 mmol의 탄산칼륨의 용액을 실온에서 3시간 교반하고, 21 mL의 1N 염산 용액으로 중화한 다음 농축 건조시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트 중 20 mL의 30% 디에틸 아민에 용해시키고 3시간 교반한 다음, 농축 건조시켰다. 잔사를 100 mL의 디클로로메탄에 용해시키고, 12 mmol의 TBTU 및 24 mmol의 N-메틸모르폴린을 첨가한 다음, 이 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축 건조시켰다. 잔사를 30 mL의 에틸 아세테이트 및 30 mL의 1N 염산 용액 사이에서 분배한 다음, 층을 분리하였다. 유기층을 30 mL의 중탄산나트륨 포화용액으로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조한 다음 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.

4-Fmoc-2-치환-3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실산 (54)의 합성: 질소 하 실온에서 유지된 30mL의 디클로로메탄 중 10 mmol의 화합물 (68)의 용액에, 2 당량의 페닐실란과 0.3 당량의 테트라키스페닐포스핀 팔라듐(0)을 첨가하고, 이 용액을 2시간 교반한 다음 농축 건조시켰다. 2차 아민을 20 mL의 테트라히드로퓨란, 및 10 mL의 물에 용해시킨 다음, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨과 1.2 당량의Fmoc-Cl을 첨가하고 이 이중상 용액을 실온에서 2시간 교반한 다음, 30 mL의 에틸 아세테이트로 희석한 후 층을 분리하였다. 방법 A에 설명된 바와 같이 4-Fmoc-7-히드록시메틸-3-치환-[1,4]-디아제판-2-온을 산화시켜 최종 생성물(54)을 얻는다. 사용되는 산화제의 선택은 화합물 (6)을 (7)로 전환시키는데 사용된 방법 A에서와 같이, 2-위치에 있는 기의 특성에 좌우된다.

6-치환-5-옥소-피페라진-2-카르복실산 스캐폴드의 합성 (방법 O)

6-위치에 비관능화 측쇄를 함유하는 6-치환-5-옥소-피페라진-2-카르복실산 스캐폴드의 합성은 방법 O에 개략된 바와 같이 수행하며, 시판하는 3-Fmoc-아미노-1,2-프로판-디올 1-클로로-트리틸 수지(69)로부터 출발하여 이를 Dess-Martin 퍼요오디난을 이용하여 케톤(70)으로 산화시킨다. 케톤(70)을 α 아미노 에스테르(2)로 환원 적 아민화시켜 수지 결합된 (1-아미노메틸-2-클로로-트리틸옥시-에틸아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (71)를 얻고, 아민을 탈보호한 뒤 이를 사이클화시켜, 5-클로로트리틸옥시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (72)을 얻는다. 2차 아민을 재보호한 다음, 수지로부터 절단하여 Fmoc-5-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (73)을 얻고, 방법 A에 설명된 것 중 어느 하나의 공정을 이용하여 이를 산화시켜 6-치환-5-옥소-피페라진-2-카르복실산 (74)를 얻는다.

1-아미노-3-클로로트리틸옥시-프로판-2-온(70)의 합성: 삼산화황 산화, NMO/TPAP(N-메틸모르폴린-N-옥사이드/테트라프로필 암모늄 퍼루테네이트)산화 또는 PDC 산화를 이용하여 수지 결합 알코올(69)을 산화시킨다. 삼산화황 산화의 경우, Parikh, J.R. 및 Doering, W.V., J. Am. Chem. Soc. 89:5505-5507 (1967)에 설명된 것과 유사한 공정을 이용한다. NMO/TPAP 산화의 경우, 0.3 mmol의 수지-결합 알코 올 용액에 10 mL의 건조 디메틸포름아미드 중 3 mmol의 N-메틸모르폴린 N-옥사이드용액을 첨가한 다음, 이 수지 현탁액에 0.06 mmol의 테트라프로필암모늄 퍼루테네이트(TPAP)를 첨가한다. 반응물을 80분간 진탕시킨다. 용매를 배수하고, 수지를 테트라히드로퓨란 및 디클로로메탄으로 세척한 다음, 진공 건조시킨다. PDC 산화의 경우, 디메틸포름아미드 중 0.2M 피리디늄 디크로메이트 중의 수지 결합 알코올의 현탁액을 37℃에서 4시간 진탕시키고, 용매를 배수한 다음 수지를 디메틸포름아미드, 테트라히드로퓨란 및 디클로로메탄으로 세척하였다.

(1-아미노메틸-2-클로로-트리틸옥시-에틸아미노)-2-치환 아세트산 메틸 에스테르(71)의 합성: 2가지 방법 중 한 방법에 의해 아미노산으로 수지 결합 케톤(70)을 환원적 아민화시킨다. 한가지 방법에서, 디메틸포름아미드 중 20 mL의 1% 아세트산 중 α 아미노 에스테르(2) 2.6 mmol의 용액을 2.6 mmol의 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드에 첨가한 다음, 케톤-유도화된 수지(70) 0.5mmol을 즉시 첨가하고, 이 혼합물을 60분간 진탕시킨 다음 메탄올, 10% 디-이소프로필 에틸 아민, 디메틸포름아미드, 및 메탄올로 헹군다. 두번째 방법에서는, 0.05M 소듐 시아노보로하이드라이드를 함유하는, 메탄올 중 0.05 mmol의 케톤-유도화된 수지 (70) 및 2.0 M α 아미노 에스테르 하이드로클로라이드(2)의 현탁액을 실온에서 5시간 동안 진탕하고, 배수 및 세척한다.

5-클로로트리틸옥시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (72)의 합성: 디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘 10 mL 중 0.05 mmol의 현탁액을 실온에서 2시간 진탕한다.

Fmoc-5-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (73)의 합성: 0.25 mmol의 Fmoc- Cl 및 0.25 mmol의 트리에틸 아민을 함유하는 10 mL의 디클로로메탄 중, 0.05mmol의 화합물(72)의 현탁액을 실온에서 6시간 교반하고, 배수 및 디클로로메탄으로 세척한다. 수지를 디클로로메탄 중 95% 트리플루오로아세트산 10 mL에 재현탁하고, 현탁액을 2시간 진탕 및 여과하고 여액을 농축시킨다.

Fmoc-6-치환-5-옥소-피페라진-2-카르복실산 (74)의 합성: 방법 A에 설명된 여하한 공정에 의해 화합물 (73)을 소망하는 생성물이 되도록 산화시킨다.

α,α-이치환 아미노산의 합성 (방법 P 및 Q)

본 발명의 특정 구조물에서, 치환기가 서로 같거나 다른 α,α-이치환 아미노산과 같은 이치환 아미노산 잔기를 사용하는 것이 가능하며 또한 이를 고려할 수 있다. 한가지 측면에서, α,α-이치환 아미노산을 Aaa¹또는Aaa⁸ 위치에 사용하고, 여기서, α,α-이치환 아미노산의 측쇄 중 적어도 하나는 Nle, Ala, Leu, Ile, Val, Nva, Met(O) 또는 Met(O₂)의 측쇄이다. 다음의 합성방법 P 및 Q는 α,α-디-n-부틸글라이신 (2-아미노-2-부틸-헥산산)의 제조 방법을 설명하는 것인데, 각각의 측쇄는 -(CH₂)₃-CH₃이므로 이들 각각은 Nle의 측쇄와 동일하다. 그러나, 치환기가 서로 같거나 다른 여타의 α,α-이치환 아미노산을 제조하는데도 유사한 방법과 반응을 사용할 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, α,α-이치환 아미노산의 어떠한 제조방법이든 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있으며, 본 발명의 실시는 다음의 합성 반응 방법에 국한되는 것은 아니다. 따라서, α,α-이치환 아미노산의 공지 합성 방법은 모두 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있다. 다음의 문헌들은 α,α-이치환 아미노산을 제조하는 대안적인 방법을 개시하고 있다. Clark J.S. 및 Middleton M.D.: Synthesis of novel alpha치-substituted and alpha,alpha-disubstitued amino acid by rearrangement of ammonium ylides generated from metal carbenoids. Org. Lett. 4(5):765-8 (2002); Guino M., Hii K.K.: Wang-aldehyde resin as a recyclable support for the synthesis of alpha,alpha-disubstitued amino acid derivatives. Org Biomol. Chem. 3(17):3188-93 (2005); 및 Kotha S., Behera M.: Synthesis and modification of dibenzylglycine derivatives via the Suzuki-Miyaura cross-coupling reaction. J. Pept. Res. 64(2):72-85 (2004).

벤조일 디-n-부틸글라이신 (80)의 합성: 질소 하, 0℃에서 유지된 20 mL 디클로로메탄 중 10 mmol 벤조일 글라이신 (75) 용액에, 12 mmol의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC)를 서서히 첨가하고, 반웅물을 2시간 교반하여 화합물 (76)을 생산한다. 고체를 여과하고, 여액을 농축하였다. 잔사를 15 mL 테트라히드로퓨란 중에 용해하고, 0℃로 냉각한 다음 24 mmol의 소듐 하이드라이드를 첨가한 후 30 mmol의 n-부틸 브로마이드를 첨가한다. 이 현탁액을 0℃에서 2시간 교반한 다음 실온으로 승온시키고, 용액을 농축 건조시켜 화합물 (77)을 생산한다. 또 다른 방 법으로, 화합물 (77)은 또한 12 mmol의 소듐 하이드라이드 및 15 mmol의 n-부틸 브로마이드가 사용되는 것을 제외하고, 유사한 방법으로 벤조일 노르류신(78)로부터 제조될 수 있다. 화합물 (77)을 메탄올에 용해시키고, 50 mL의 1N 염산을 첨가한 다음, 용액을 2시간 교반 및 농축하였다. 화합물(80)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.

Fmoc 디-n-부틸글라이신 (81)의 합성: 10 mmol의 화합물 (80)을 30 mL의 디옥산에 첨가하고, 용액을 밤새 환류시킨다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 농축 건조시킨 다음 30 mL의 테트라하이드로퓨란에 재용해시킨 다음, 10 mL의 물 및 30 mmol의 중탄산나트륨을 첨가한 후, 15 mmol의 Fmoc-Cl을 첨가한다. 이 이중상 용액을 1시간 교반하고, 테트라히드로퓨란을 진공 하에 제거한다. 수용액을 1 x 50 mL의 디에틸 에테르로 추출하고, 1N 염산 용액으로 산성화시킨 다음, 2 x 50 mL의 에틸 아세테이트로 추출한다. 에틸 아세테이트 층을 결합시키고 황산나트륨으로 건조 및 농축시킨다. 화합물(81)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.

적절한 아미노산 유도체 (화합물 78과 유사한 것)로부터 출발하여, 유사한 방법을 사용할 수 있으며, 적절한 알킬 부틸, 아릴 부틸 또는 아르알킬 부틸 시약을 사용함으로써, 이 반응에 의해 R과 R'이 서로 다른 여러가지 다양한 이치환 (R,R') 아미노산 대체물을 얻는다.

Fmoc - α,α 디-n-부틸 글라이신 (87)의 합성: 실온에서 유지된 40 mL의 건조 테트라히드로퓨란 중 20 mmol의 글라이신 메틸 에스테르 하이드로클로라이드 (82), 및 2 g의 분말화된 분자체의 현탁액에, 24 mmol의 수산화칼륨을 첨가한 다음 22 mmol의 벤즈알데하이드를 첨가한다. 현탁액을 2시간 교반하고, 여과한 다음 여액을 농축한다. 잔사를 40 mL의 건조 톨루엔에 재용해시킨 다음, 톨루엔 중 60 mmol의 소듐 하이드라이드 현탁액에 첨가한 다음, 60 mmol의 n-부틸 브로마이드를 첨가한다. 이 현탁액을 12시간 교반한 다음, 30 mL의 6N 염산 용액을 첨가하고 실온에서 2시간 교반한 다음 층을 분리한다. 이렇게 얻어진 하이드로클로라이드 염 (84)를 화합물 (87)의 제조를 위해 in situ 사용한다. (84)를 하이드로클로라이드 염으로서 분리하기 위해 수층을 농축 건조시키고 생성물을 건조 메탄올-에테르로부터 결정화시킨다.

또한, (86)을 (84)로 전환시키는데 30 mmol의 n-부틸 브로마이드와 30mmol의 소듐 하이드라이드를 사용한 것을 제외하고, 유사한 합성 공정을 이용하여 노르류신 메틸 에스테르 하이드로클로라이드로부터 화합물 (84)를 제조할 수 있다.

전술한 바와 같이 수득된 화합물(84)의 하이드로클로라이드 형태의 수성 혼합물을 1시간 동안 가열 환류시킨 다음 실온으로 냉각한다. 이를 고상 수산화나트륨으로 중화시킨 다음 30 mL의 테트라하이드로퓨란으로 희석한다. 중탄산나트륨 (30 mmol)을 첨가한 다음 15 mmol의 Fmoc-Cl을 첨가한다. 이중상 용액을 1시간 교반하고, 진공 하에서 테트라히드로퓨란을 제거한다. 수용액을 1x50 mL의 디에틸 에테르로 추출하고, 1N 염산 용액으로 산성화한 다음, 2 x 50 mL의 에틸 아세테이트로 추출한다. 에틸 아세테이트 층을 결합시키고 황산나트륨으로 건조 및 농축시킨다. 화합물(87)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.

적절한 아미노산 유도체 (화합물 85와 유사한 것)로부터 출발함으로써 유사한 방법을 사용하고, 적절한 알킬 부틸, 아릴 부틸, 또는 아르알킬 부틸 시약을 사용함으로서 R'과 R'이 서로 다른 다양한 이치환 (R, R') 아미노산 대체물들을 생산할 수 있다.

이치환 (R, R') 스캐폴드의 합성 (방법 R)

본 발명은 두개의 R기, R 및 R'를 갖는 아미노산 대체물이 사용되는 구조물을 제공한다. 다음의 방법은 Fmoc 보호된 (R)-5,5-디부틸-6-옥소-피페라진-2-카르복실산의 합성 방법을 설명한 것으로, 여기서 R 및 R'은 각각 노르류신 측쇄 모이어티에 대응하는 기이다. 하기의 방법을 부분적으로 전술한 방법에 기초하여 변형시킴으로서 유사하게 이치환된(R, R') 아미노산 대체물들을 얻을 수 있음을 이해할 것이다. 유사한 방법들은 적절한 아미노산 유도체 (화합물(84)에 유사한 화합물)을 출발물질로 할 수 있으며, 이러한 반응에 의해 R과 R'이 상이한 여러가지 이치환 (R,R') 아미노산 대체물을 생산할 수 있다.

(2-Fmoc-아미노-3-3차-부톡시-프로필아미노)-2,2,디-n-부틸 아세트산 메틸 에스테르 (88)의 합성: 50 mL 건조 테트라히드로퓨란 중 21 mmol의 (84, 반응도 Q), 및 2.9 mL (21 mmol)의 트리에틸 아민의 현탁액을 실온에서 45분간 교반한 다음 30 mL 중 ~ 20 mmol 조질의 Fmoc-(O-t-부틸)-세린알 (9, 반응도 D) 용액을 첨가한 다음, 1.7 g의 4Å 분말상 분자체를 첨가한 후 현탁액을 다시 2시간 교반한다. 6.4 g (30 mmol)의 고상 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 첨가하고, 현탁액을 실온에서 밤새 교반한다. 현탁액을 메탄올로 희석하고, 분자체를 여과한 다음 여액을 농축한다. 잔사를 100 mL의 에틸 아세테이트 및 50 mL의 물 사이에서 분배한다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고 농축한다. 화합물(88)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.

4-Fmoc-6-히드록시메틸-3,3-디-n-부틸-피페라진-2-온 (89)의 합성: 에틸 아세테이트 중 30% 디에틸 아민 30 mL 중 10 mmol의 화합물 (88)의 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축 건조시킨다. 잔사를 20 mL 테트라히드로퓨란과 10 mL의 물에 용해시키고, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨을 첨가한 후, 3.36 g (13 mmol)의 Fmoc-Cl을 첨가한다. 이 혼합물을 3시간 교반하고, 에틸아세테이트 50 mL로 희석한 다음, 층을 분리하고 유기층을 30 mL 물로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시킨다. 조질의 혼합물을 디클로로메탄 중 90% 트리플루오로아세트산 10 mL의 용액에 용해시키고, 2시간 교반한 다음 농축 건조시킨다. 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고 50 mL의 중탄산나트륨 포화 용액으로 세척한 다음 황산 마그네슘으로 건조 및 농축시킨다. 화합물(89)를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.

4-Fmoc-5,5-디-n-부틸-6-옥소-피페라진-2-카르복실산 (90)의 합성: 실온에서 유지된 81 mL의 아세토니트릴 중 8 mmol 알코올 (89) 용액에, 포스페이트 완충 용액 (29.5 mL 물 중 0.72 g의 소듐 포스페이트 모노베이직 및 1.43 g의 소듐 포스페이트 디베이직으로 제조됨)을 첨가하고, 0.33g (2.1 mmol)의 TEMPO, 및 1.86 g (16.5 mmol)의 소듐 클로라이트를 첨가한 후, 이 이중상 용액을 43℃로 유지된 유조에 넣는다. 4.3 mL(2.6 mmol)의 소듐 하이포클로라이트 용액 (1.9 mL의 10-13% 소듐 하이포클로라이트 용액 및 2.4 mL의 물을 혼합하여 제조함)을 서서히 첨가한다. 반응물을 43℃에서 4시간 교반하고 50 mL의 에틸 아세테이트로 희석한 다음 층을 분리한다. 유기층을 1 x 10 mL 식염수, 1 x 10 mL의 1N 염산 용액으로 세척하고 황산나트륨으로 건조 및 농축시킨다. 화합물 (90)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.

본 발명의 구조물의 합성

본 발명의 몇가지 구체예에 개시된 구조물들은 아미노산들 사이의 펩타이드 결합을 형성하기 위한 공지의 통상적인 방법에 의해 쉽게 합성될 수 있다. 이러한 통상적인 방법으로는, 예컨대, 카르복실기나 기타 보호된 반응성기를 갖는 아미노산 잔기의 유리 알파 아미노기와 아미노기 또는 기타 보호된 반응성기를 갖는 또 다른 아미노산 잔기의 유리 일차 카르복실기 사이의 축합을 가능케하는 고상 공정을 들 수 있다. 바람직한 통상적인 공정에서, 본 발명의 구조물은 기술 분야에 알려진 고상 합성 및 정제 공정에 의해 합성될 수 있다. 본 발명의 아미노산 대체물은 잔기에 대해 사용된 것과 실제로 유사하거나 동일한 방법을 이용함으로써 본 발명의 구조물 내로 통합될 수 있다. 여러가지 수지와 시약을 사용하는 많은 공지의 공정들을 이용하여 본 발명의 구조물을 제조할 수 있다.

구조물의 합성 방법은 소망되는 서열의 아미노산 또는 아미노산 대체물 각각을 다른 아미노산 잔기 또는 아미노산 대체물에 연속적으로 한번에 하나씩 부가하는 방법에 의해, 또는 하나 이상의 아미노산 대체물을 포함할 수 있는 소망되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 단편을 먼저 통상적으로 합성한 다음 축합시켜 소망 구조물을 얻는 방법에 의해 수행가능하다. 얻어진 구조물을 사이클화시켜 본 발명의 사이클 구조물을 생산한다.

고상 펩타이드 합성법은 기술 분야에 잘 알려져 있으며 실제로 실시되고 있다. 이러한 방법에서 본 발명의 구조물의 합성은 소망되는 아미노산 잔기 또는 아미노산 대체물을 고상 방법의 일반적인 이론에 따라 성장중의 펩타이드쇄에 한번에 하나씩 연속적으로 부가하는 방식으로 수행할 수 있다. 이러한 방법은 Merrifield R.B., Solid phase synthesis (Nobel lecture). Angew. Chem. 24:799-810 (1985) 및 Barany et al., The Peptides, Analysis, Synthesis 및 Biology, Vol. 2, Gross E. 및 Meienhofer J., Eds. Academic Press, 1-284 (1980)을 비롯한 여러 문헌에 개시되어 있다..

구조물을 화학적으로 합성하는데 있어서, 여러가지 아미노산 잔기 또는 아미노산 대체물의 반응성 측쇄기를 적절한 보호기로 보호시켜 보호기가 제거될 때까지 그 부위에서 화학 반응이 일어나는 것을 방지한다. 또한 아미노산 잔기나 아미노산 대체물의 알파 아미노기를 보호하는 한편, 그것이 카르복실기에서 반응한 다음, 알파 아미노 보호기를 선택적 제거하여 후속반응이 그 부위에서 일어나도록 하는 방 식도 흔한 방법이다. 특이적인 보호기가 개시되어 있으며 고상 합성법과 용액상 합성법이 알려져 있다.

알파 아미노기는 예컨대 우레탄형 보호기, 예컨대 벤질옥시카르보닐(Z) 및 치환 벤질옥시카르보닐, 예컨대, p-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐, p-비페닐-이소프로폭시카르보닐, 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 및 p-메톡시벤질옥시카르보닐(Moz); t-부틸옥시카르보닐(Boc), 디이소프로필메톡시카르보닐, 이소프로폭시카르보닐 및 알릴옥시카르보닐과 같은 지방족 우레탄형 보호기를 비롯한 적절한 보호기에 의해 보호될 수 있다. Fmoc은 알파 아미노 보호에 바람직하다.

구아니디노기는 니트로, p-톨루엔설포닐(Tos), Z, 펜타메틸크로만설포닐(Pmc), 아다만틸옥시카르보닐, 펜타메틸디하이드로벤조퓨란-5-설포닐(Pbf), Fmoc 및 Boc와 같은 적절한 보호기에 의해 보호될 수 있다. Pbf는 Arg에 대한 바람직한 보호기의 하나이다. 기타 바람직한 보호기로는 Z, Fmoc, 및 Boc을 들 수 있다. 특히 구아니디노 보호기는 합성 중에 절단되어 제거되거나, 다른 과정 중에 절단 또는 제거될 수 있음을 이해하여야 하는데, 이 경우 보호기가 달린 측쇄는 본 명세서에 정의된 바와 같은 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체를 형성한다. 특히 보호기가 불안정한 경우, 환자에게 투여시 생체내의 어떤 메카니즘에 의해 제거될 수 있는데, 이 경우 구조물은 "전구약물(prodrug)", 즉, 환자에게 투여시, 어떠한 화학적 또는 생리학적 과정을 거쳐 소망되는 약물 형태로 전환되는 약물 전구체가 된다 (예컨대, 생리학적 pH에서 또는 효소 작용을 통해 소망되는 약물 형태로 전환된다 ).

본 발명 명세서에 설명된 구조물은 수동으로 또는 제조업자가 제시한 프로토콜에 따라 제조업자가 제공한 프로그래밍 모듈을 이용함으로써 자동화 펩타이드 합성기에 의해 고상 합성법을 이용하여 제조될 수 있으며, 또는, 어려운 커플링 작업의 수율을 향상시키기 위해 제조업자의 프로토콜을 변형시켜 제조할 수도 있다.

고상 합성법은 보호된 α 아미노산, α-아미노산 대체물 또는 α-아미노 알코올 모방체를 적절한 수지에 커플링시킴으로서 구조물의 C-말단으로부터 개시된다. 이러한 출발 물질은 α-아미노-보호된 아미노산 또는 α-아미노-보호된 아미노산 대체물을 에스테르 결합에 의해 p-벤질옥시벤질 알코올 (Wang) 수지 또는 2-클로로트리틸 클로라이드 수지에 부착하거나, 예컨대 p-[(R, S)-α-[1-(9H-플루오-렌-9-일)-메톡시포름아미도]-2,4-디메틸옥시벤질]-페녹시아세트산 (Rink 링커)와 같은 Fmoc-링커 사이의 아미드 결합을 통해 벤즈히드릴아민(BHA) 수지에 부착하거나, 또는 기술분야의 공지수단에 의해, 예컨대 α-아미노-보호된 알코올 모방체를 클로로메틸 폴리스티렌 수지에 부착된 3,4-디히드로-2H-피란-2일-메탄올 링커에 부착함으로써 제조된다. Fmoc-링커-BHA 수지 지지체는 시중에서 구입가능하고, 적합한 경우에 일반적으로 사용된다. 수지들은 필요한 만큼의 반복 사이클을 통해 아미노산에 연속적으로 부가된다. 알파 아미노 Fmoc 보호기는 염기성 조건 하에서 제거된다. N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 중 피페리딘, 피페라진, 디에틸아민 또는 모르폴린 (20-40% v/v)를 이러한 목적에 사용할 수 있다.

알파 아미노 보호기를 제거한 다음, 후속적으로 보호된 아미노산 또는 아미노산 대체물을 단계적으로 소망되는 순서로 커플링시켜 중간체 펩타이드-수지를 얻 는다. 펩타이드의 고상 합성시 아미노산을 커플링시키는데 사용되는 활성 시약은 기술 분야에 잘 알려져 있다. 구조물 합성 후, 필요하다면 직각으로 보호된 측쇄 보호기를 공지기술로 제거하여 구조물을 추가로 유도화시킬 수 있다.

구조물 중의 반응성기들은 고상 합성시 또는 수지를 제거한 후에 선택적으로 변형시킬 수 있다. 예컨대, 구조물들을 변형시켜 수지 상에서 아세틸화와 같은 N-말단 변형물을 얻거나, 또는 절단 시약을 이용함으로서 수지로부터 제거한 다음 변형시킬 수도 있다. 아세틸화와 같은 N-말단 변형법, 또는 아미드화 또는 N-아세틸기의 도입과 같은 C-말단 변형법이 기술 분야에 알려져 있다. 마찬가지로, 아미노산의 측쇄 변형방법은 펩타이드 합성기술 분야에 잘 알려져 있다. 구조물 상에 존재하는 반응성기에 대해 이루어지는 변형의 선택은, 부분적으로는 구조물에서 요망되는 특성에 의해 결정될 것이다.

일 구체예에서, 본 발명의 구조물은 수지로부터 분리되기 전에 사이클화된다. 반응성 측쇄 모이어티를 통한 사이클화를 위해서, 소망되는 측쇄를 보호시키고, 적절한 용매 중에 현탁된 구조물과 사이클릭 커플링제를 첨가한다. 적절한 용매로는, 예컨대 DMF, 디클로로메탄 (DCM) 또는 1-메틸-2피롤리돈 (NMP)을 들 수 있다. 적절한 사이클릭 커플링 시약에는 예컨대, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU), 벤조트리아졸-1-일-트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트 (BOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(피롤리디노)포스포늄헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TATU), 2-(2-옥소-1(2H)-피리딜)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TPTU) 또는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드/1-히드록시벤조트리아졸 (DCCI/HOBt)을 들 수 있다. 커플링은 통상적으로 예컨대, N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA), sym-콜라이딘 또는 N-메틸모르폴린 (NMM)과 같은 적절한 염기를 사용함으로써 개시된다.

고상 합성 후 구조물을 분리한 다음, 이 구조물을 C₁₈ 컬럼과 같은 적절한 컬럼을 이용하는, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)와 같은 몇몇 방법에 의해 정제할 수 있다. 구조물의 크기나 전하에 기초한 방법과 같은 분리 또는 정제를 위한 기타 방법들 역시 이용가능하다. 일단 정제되면, 구조물을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 아미노산 분석, 질량 분광계 등과 같은 몇가지 방법에 의해 특징화시킨다.

치환된 아미드 유도체 C-말단, 일반적으로 N-알킬기를 갖는 본 발명의 구조물은 구조물의 C-말단으로부터 개시되는 고상 합성에 의해, 보호된 알파 아미노산 또는 아미노산 대체물을 적절한 수지에 커플링시킴으로써 제조한다. 고상으로 치환 아미드 유도체를 제조하는 이러한 방법은 기술 분야에 이미 설명되어 있다. 예컨대, Barn D.R., Morphy J.R., Rees D.C. Synthesis of an array of amids by aluminum chloride assisted cleavage of resin-bound esters. Tetrahedron Lett. 37, 3213-3216 (1996); DeGrado W. F. Kaiser E. T. Solid-phase synthesis of protected peptides on a polymer bound oxime: Preparation of segments comprising the sequences of a cytotoxic 26-peptide analogue. J. Org. Chem. 47:3258-3261 (1982) 참조. 이러한 출발물질은 알파 아미노-보호된 아미노산 또는 아미노산 대체물을 에스테르 결합에 의해 p-벤질옥시벤질 알코올(Wang) 수지에 공지 수단에 의해 부착시킴으로써 제조할 수 있다. 펩타이드쇄는 아미노산 또는 아미노산 대체물의 소망되는 서열로 성장하며, 생성물을 사이클화시키고, 디클로로메탄 중 적절한 아민 및 알루미늄 클로라이드 (예컨대, 메틸아민, 디메틸 아민, 에틸아민 등)의 용액으로 수지를 처리한다. 얻어진 아미드 유도체 구조물을 수지로부터 용액 중에 방출시킨다. 수지를 여과하고 아미드 유도체 구조물을 용매 농축 및 에테르를 이용한 침전에 의해 회수한다. 조질의 구조물을 건조시키고 남은 아미노산 측쇄 보호기를 물과 트리이소프로필실란(TIS)의 존재 하에 트리플루오로아세트산(TFA)를 이용하여 절단한다. 차가운 에테르를 첨가하여 최종 생성물을 침전시킨 다음 여과 수집한다. 최종 정제는 C₁₈ 컬럼을 이용하여 RP-HPLC에 의한다.

바람직한 한가지 방법에서, 실시예 1의 구조물을 다음 방법에 의해 합성하였다. 각각의 구조물들은 케토-피페라진 구조에 기초하여 1 또는 2개의 아미노산 대체물을 가졌다. 아미노산대체물을 상기와 같이 합성하였다. 구조물들은 Fmoc 화학을 이용하여 합성하였다. 케토-피페라진 아미노산 대체물의 통합 직전 및 직후에 커플링을 위해 수동 합성 접근법을 이용하였다.

다음의 프로토콜을 이용하여 예컨대 아미노산 대체물이 말단 위치에 있는 경우, 아미노산 대체물을 수지에 부착시켰다. Rink 아미드 수지(부하량 0.3 mmol/g, Advanced ChemTech)을 DMF에서 30분간 팽창시켰다. 수지의 Fmoc 탈보호를 20% 피페리딘/DMF를 이용하여 20분간 수행하였다. 선택된 케토-피페라진 아미노산 대체물(2eq)와 수지와의 커플링은 DMF 중에서 PyBop (2 eq) 및 DIEA (4 eq)와 함께 밤새 인큐베이션시킴으로써 달성하였다. 다음의 Kaiser 테스트가 양성적인 결과를 나타내면, 커플링 반응을 2회 수행하였다. DMF 중에서 Ac₂O (10 eq) 및 피리딘 (20 eq)을 이용하여 아세틸화를 수행하였다.

다음의 케토-피페라진 아미노산 대체물을 펩타이드 수지에 부착하기 위해 다음 프로토콜을 사용하였다. Fmoc-보호된 케토 피페라진 아미노산 대체물(2 eq), TBTU (2 eq) 및 DIEA (4 eq)를 DMF 중에서 혼합한 다음 밤새 인큐베이션시켜 커플링을 수행하였으며, 양성적인 Kaiser 테스트 결과가 얻어질 경우에는 커플링 반응을 반복하였다. DMF 중에서 Ac₂O (10 eq) 및 피리딘 (20 eq)을 이용하여 아세틸화를 수행하였다.

다음의 프로토콜을 이용하여 Fmoc-보호된 아미노산을 고상의 케토-피페라진 아미노산 대체물에 커플링시켰다. 대부분의 경우 적어도 2회의 커플링 사이클이 필요하였으며 종종 3회의 사이클이 요구되었다. 전형적인 사이클에서 Fmoc-보호된 아미노산(4 eq)를 DMF 중 HOAt (4 eq) 및 DIC (4 eq)과 혼합하였다. 이어서, 얻어진 혼합물을 SPE 튜브에서, 수지에 직접 부착되거나 중간체를 통해 부착된 케토-피페라진 아미노산 대체물과 함께 밤새 혼합하였다.

서열 중 케토-피페라진 아미노산 대체물에 직접 인접하지 않은 아미노산들 사이의 커플링은 고상 펩타이드 합성을 위한 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 다음의 보호기를 이용하였다: Lys 및 Orn에는 Boc, Tyr과 Ser에는 t-부틸, Cys와 His에는 Trityl, Asp에는 O-t-부틸 및 Arg에는 Pbf.

TFA/티오아니솔/페놀/H₂O/DTT/TIS (87.5/2.5/2.5/5/2.5/11) (5 mL) 혼합물을 이용하여 3시간 동안 구조물을 수지로부터 떼어내었다. 결과적인 물질을 여과하고 동결조건하 1시간 동안 차가운 에테르로부터 침전시켰다. 침전된 시스테이닐 펩타이드를 산화 단계에 사용하기에 앞서 3회 이상 차가운 에테르로 세척하였다.

공기 산화를 통한 디설파이드 결합을 형성하기 위한 사이클화에 있어서, 조질의 시스테이닐 구조물을 아세토니트릴과 물의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물의 pH를 5% NH₄OH를 이용하여 7-8로 조정하였다. 얻어진 용액을 2일간 150 mg 과립 활성탄소와 함께 서서히 교반하였다. 다음 공정 단계로 진행하기에 앞서 LC-MS 분석을 통해 사이클화가 완결되었는지 확인하였다. 여과액을 급속 진공 하에 동결건조 건조시킴으로써 조질의 사이클릭 구조물을 얻었다.

본 발명의 특정 구조물들은, 그 대체물이 수지 또는 기타 펩타이드 고상 지지체에 결합되고 C-말단 위치에 있을 경우, 다음 반응에 의해 합성될 수 있다. 다음의 반응도는 구조물 1-132의 합성을 예시한 것이지만, 실제로 이와 유사한 방법을 이용하여 대체물이 수지나 기타 펩타이드 고상 지지체에 결합되어 있는 여하한 구조물에 대해서도 사용가능함을 이해하여야 한다.

전술한 방법 A나 또는 기타 여하한 대안법에 따라 대체물 (7)을 제조한다. 디메틸포름아미드와 디클로로메탄의 1:1 혼합물 200 mL 중 Fmoc 보호된 Sieber 아미드 수지 23.8g (0.63 mmol/g 치환, 15 mmol)을 팽윤시킴으로써 상기 수지를 처리한 다음, 이를 여과하고 2 x 125 mL의 디메틸포름아미드로 세척하였다. 세척된 수지를 디메틸포름아미드 중 2 x 125 mL의 20% 피페리딘으로 15분간 탈보호시키고, 여과한 다음 4 x 125 mL의 디메틸포름아미드로 세척하였다.

160 mL의 디메틸포름아미드 중 21.5 g (MW = 717, 30 mmol)의 Fmoc-보호 대체물 (7)의 용액을 전술한 바와 같이 제조된 탈보호된 Sieber 아미드 수지에 부가한 다음, 15.6 g (MW = 520.3, 30 mmol)의 고상 PyBop, 및 10.4 mL (MW = 129.25, d = 0.742, 60 mmol)의 디이소프로필에틸아민을 첨가하고, 이어서 또 다시 40 mL의 디메틸포름아미드를 첨가하였다. 혼합물을 질소 발포시키면서 밤새 교반하였다. 수지를 여과하고, 4 x 130 mL의 디메틸포름아미드로 세척한 다음, 디메틸포름아미 드:무수아세트산:피리딘의 3:2:1의 용액으로 된 150 mL의 캡핑 용액으로 30분간 캡핑시킨 다음, 여과하고, 4 x 130 mL의 디메틸포름아미드로 세척하여 수지에 착화(complexed)된 대체물(7)을 얻었다.

수지에 착화된 결과적인 Fmoc-보호 대체물 (7)을 디메틸포름아미드 중 2 x 130 mL의 20% 피페리딘으로 15분간 탈보호시키고, 여과한 다음 4 x 130 mL의 디메틸포름아미드로 세척하여 수지에 착화된 대체물 (7)을 얻었다. 디메틸포름아미드(200 mL) 중 27.6 g의 Fmoc-Tyr-(tBu)-OH (60 mmol, 4 eq.) 용액을 수지에 착화된 대체물 (7)에 첨가한 다음, DMF 중 24.8 g의 HCTU (60 mmol, 4 eq.), 및 20.8 mL (120 mmol, 8 eq.)의 디이소프로필에틸아민의 용액을 최종 부피 200 mL가 되도록 첨가하고 질소 기포발생 하에 밤새 커플링시켰다. 얻어진 Fmoc-Tyr-(tBu)-대체물 (7)-수지를 여과에 의해 분리하고 2 x 130 mL의 디메틸포름아미드로 세척하였다. 커플링의 완결을 확인하기 위해, 생성물을 디메틸포름아미드 중 27.6 g의 Fmoc-Tyr-(tBu)-OH (MW = 459.6, 60 mmol, 4 eq.) 용액으로 최종 부피가 200 mL가 될 때까지 재차 처리한 다음, DMF 중 24.8 g의 HCTU (60 mmol, 4 eq.), 및 디이소프로필에틸아민 (20.8 mL, 120 mmol, 8 eq.)의 용액으로 최종 부피가 200 mL가 될 때까지 다시 처리한 후 질소 기포발생시키면서 밤새 커플링시켰다. 수지를 여과하고, 2 x 130 mL의 디메틸포름아미드로 세척하였다. HPLC 및 LC/MS 결과 대체물 (7)-수지와 Fmoc-Tyr-(tBu)-OH 사이의 커플링은 완료된 것으로 나타났다.

결과적인 Fmoc-Tyr-(tBu)-대체물 (7)-수지를 전술한 바와 같이 150 mL의 캡핑 용액으로 30분간 캡핑시켰다. 수지를 여과하고 4 x 130 mL의 디메틸포름아미드, 4 x 130 mL의 디클로로메탄, 2 x 130 mL의 MeOH, 2 x 130 mL의 디에틸 에테르로 세정한 다음, 진공 하에 건조시켜 36.7 g을 얻었다.

그 후 각각의 연속적인 아미노산을 커플링시킬 수 있다. 최초 아미노산을 커플링시키기에 앞서, 결과적인 Fmoc-Tyr-(tBu)-대체물 (7)-수지를 200 mL의 디메틸포름아미드:디클로로메탄 1:1 용액으로 팽윤시켰다. 각각의 아미노산 (Fmoc-AA-OH)을 다음 단계를 반복함으로써 커플링시켰다. 말단 아미노산 잔기를 디메틸포름아미드 중 2 x 125 mL의 20% 피페리딘으로 15분간 탈보호시키고, 여과시킨 다음 4 x 125 mL의 디메틸포름아미드로 세척하였다. 닌히드린 테스트에 의해 비드를 체크하였다. 디메틸포름아미드 중 Fmoc-AA-OH (60 mmol, 4 eq.)의 최종 부피 200 mL 용액을 수지에 첨가한 다음, DMF 중 HBTU (60 mmol, 4 eq.), 및 (120 mmol, 8 eq.) N-메틸모르폴린의 용액을 최종 부피가 200 mL가 되도록 첨가하고 [Fmoc-AA-OH의 농도 = 150 mM 용액], 질소 기포발생시키면서 30분간 커플링시켰다 (커플링 반응은 닌히드린 테스트에 의해 검정하였다). 닌히드린 테스트가 음성일 경우, 수지를 여과하고, 디메틸포름아미드 4 x 130 mL의 디메틸포름아미드로 세척하였다.

모든 아미노산이 커플링된 후, 수지를 4 x 130 mL의 디클로로메탄, 4 x 130 mL의 메탄올, 4 x 130 mL의 디에틸 에테르로 세척하고, 진공 건조시켜 생성물을 얻었다. 중량 증가는 정량적이었다.

트리플루오로아세트산:페놀:티오아니솔:물:DDT:트리이소프로필 실란의 81.5:5:5:5:2.5:1 용액으로 구성된 100 mL의 절단 시약(cleavage reagent)을 다음의 선형 구조물 32 g (~ 6.4 mmol)에 첨가하였다:

현탁액을 실온에서 5분간 방치한 다음 여과하였다. 수지에 절단 시약 100 mL를 더 첨가한 다음 5분간 방치 및 여과시켰다. 이 과정을 반복하였다.

얻어진 수지를 이어서 2 x 40 mL의 트리플루오로아세트산으로 세척하였다. 여과액을 결합시키고 실온에서 2.5시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 ~ 100 mL 부피가 되도록 농축시켰다. 차가운 디에틸 에테르 (1.5 L, -20℃로 예냉시킴)를 여과액에 첨가한 다음 냉장고 (-20℃)에 1시간 동안 넣어두고 소결 유리 펀넬을 통해 여과시킨 다음, 고체를 3 x 200 mL의 차가운 디에틸 에테르로 세척한 후 1시간 동안 진공 하에 건조시키는 한편, 고체를 매15분마다 분쇄하여 용매가 효과적으로 제거되도록 하였다. 다음의 구조물이 얻어졌다 (15.4 g) (103% 전체적인 조수율):

상기 구조물 (15.4 g, 6.4 mmol)을 물 중 16 L의 30% 아세토니트릴에 용해시켰다. 5% 수산화암모늄 용액을 이용하여 pH를 8.4로 조정하였다. 분쇄된 활성탄소 (15.4 g)을 첨가하고, 현탁액을 밤새 교반하였다. 셀라이트를 통해 여과시킴으로써 탄소를 제거하였다. 셀라이트를 물 중 3 x 100 mL 50% 아세토니트릴로 세척하였다. 여과액을 결합시키고 10% 아세토니트릴의 최종 농도가 되도록 물로 희석한 다음, 정제용 컬럼에 로딩시켰다. 얻어진 구조물의 트리플루오로아세테이트 염을 다음 조건 하에서 정제시켰다:

컬럼: Luna C₁₈, 10 μ, 50 x 33 mm

유속w: 70 mL/분

용매 A: 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 물

용매 B: 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴

구배 : 5% 용매, B 5분간

26% B 내지 52% B 30분간

순수한 분획들을 결합 및 동결건조시켜 본 발명 구조물의 정제된 트리플루오로아세테이트 염을 얻었다. Dowex SBR, LCNG-OH 수지 (450g)를 2 L의 물에 현탁시키고 15분간 가볍게 교반한 다음, 15분간 방치시킨 후 따라내었다. 이 공정을 반복한 다음, 0.5 L의 물을 첨가하고 슬러리를 6 x 60 cm 컬럼으로 옮겼다. 물을 빼내고, 4 L의 물로 세척한 다음, 6.5 L의 20% 아세트산 용액으로 이온교환하였다. 수지를 실온에서 밤새 방치한 다음 여과액의 pH가 ~ 4가 될 때까지 물로 세척하였다 (사용된 물 8L). 상기와 같이 제조된 상기 구조물(11.1g)의 트리플루오로아세테이트 염을 80 mL의 물에 용해시킨 다음, 이온 교환 수지로 로딩시키고, 물로 용출시켰다. 79-1을 함유하는 분획을 결합시키고, 20% 아세트산 용액을 첨가하여 최종 농도를 5% 아세트산으로 조정한 다음 동결건조시켰다. 다음의 구조물 1-132 (10.4 g)이 수득되었다:

대체물이 수지나 여타 펩타이드 고상 지지체에 결합되어 있고 C-말단 위치에 존재하는 구조물이면 어떤 것이든 유사한 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명의 펩타이드 구조물의 임의적인 PEG화(PEGylation)는 후술하는 것과 같은 여하한 방법으로든 수행가능하다.

라이신 또는 오르니틴 측쇄, Aaa¹ 위치의 오메가 아미노 지방족, 또는 Aaa¹⁵ 에서의 아미노산 대체물의 J 중의 아민기와 같은 반응성 아민기의 PEG화는, 0.005 mmol의 정제된 구조물을 2mL의 디메틸설폭사이드에 용해시킨 다음, 55.5 mg (0.011mmol, 2eq)의 PEG-5K-OSu (5,000 Da MW 숙신이미딜 프로피오네이트 반응기가 부착된 메톡시-PEG), 및 17.7μL (0.13 mmol, 20 eq)의 트리에틸아민을 첨가한 다음, 약간 탁한 용액을 실온에서 3시간 교반함으로써 달성하였다. 과량의 PEG-5K-OSu를 7 μL (0.111 mmol, 10eq.)의 에탄올 아민을 첨가함으로써 중단시킨 다음 반응물을 밤새 교반하였다.

반응성 카르복실기, 예컨대 잔기들이나 대용체 상의 Aaa¹⁵의 말단 카르복실이나 Asp 또는 Glu 측쇄의 PEG화는 Asp 또는 Glu의 측쇄 또는 C-말단에 카르복실기를 함유하는 구조물에 PEG-NH₂(PEG-아민)을 커플링시킴으로써 수행한다. 펩타이드 구조 물 (0.005 mmol)을 DMSO (2 mL)에 용해시킨 다음, 55.5 mg (0.011 mmol, 2 eq)의 PEG-NH₂ 및 HOBt(0.01 mmol)를 첨가한다. 0.0055 mmole의 커플링 시약 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDAC)를 첨가함으로써 커플링을 개시한다. 약간 탁한 용액을 실온에서 밤새 교반한다. 이어서 PEG화된 펩타이드 구조물을 HPLC에 의해 정제한다.

Aaa¹에서 아미노산 대체물의 Q 중의 티올기나 Cys 또는 Hcys 측쇄와 같은 반응성 티올기의 PEG화는, 펩타이드 구조물을 DMSO 중에서 PEG-메틸-말레이미드 시약 (SunBio, Orinda, California)으로 밤새 처리함으로서 수행한다. 이렇게 PEG화된 펩타이드 구조물을 HPLC로 정제한다.

PEG화에 이어서, 결과적인 조질의 화합물을 HPLC에 의해 정제한 다음, 하나 이상의 아미노산 대체물을 포함하는 PEG 유도화 구조물을 생산한다.

시험관내 및 생체내 테스트 시스템

선별된 구조물들의 결합상태와 기능 상태를 측정하기 위해 분석하였다. 다음의 분석법이 사용되었다.

세포 배양 인간의 나트륨 이뇨 펩타이드 수용체 A (NPRA)를 코딩하는 cDNA 클론을 Bio S&T Inc. (Montreal, Quebec)로부터 구입하였다. cDNA 클론을 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen)에 삽입하고 HEK-293 세포 내로 트랜스펙션시켰다. G418 설페이트의 존재 하에 새포를 배양함으로써 안정한 클론들을 선별하였다. 클론 세포주로부터 제조된 막 균질물에 대한 [¹²⁵I]-심방 나트륨 이뇨 펩타이드 ([¹²⁵I]-ANP)의 결합에 의해 NPRA의 발현을 시험하였다. 10% FBS, G418 설페이트 (300 μg/mL) 소듐 글루타메이트 (0.29 mg/mL), 페니실린(100 units/mL) 및 스트렙토마이신 (100 ug/mL)이 보강된 Dulbecco's Modified Eagle's 배지 (DMEM) 중 37℃에서 5% CO₂ 중 배양물에서 HEK-hNPRA 세포들을 유지시켰다.

경쟁적 결합 분석. HEK-hNPRA 세포로부터 제조된 조질의 막 균질물을 이용하여 경쟁적 저해 결합 분석법을 수행하였다. 막 균질물을 제조하기 위해, 세포들을 인산염 완충염수로 세정한 다음, 저장성 용해 완충액 (hypotonic lysis buffer) (10 mM Tris, pH 7.4 + 5 mM EDTA) 중, 4℃에서 15분간 인큐베이션시켰다. 세포들을 플레이트로부터 폴리프로필렌 튜브로 이동시키고 균질화시켰다. 균질물을 25,000 x g에서 20분간 원심분리시켰다. 50 mM Tris (pH 7.4) 및 1 mM EDTA을 함유하는 완충액에 펠릿을 재현탁시키고, 균질화시킨 다음 25,000 x g에서 20분간 원심분리시켰다. 100 mM Tris (pH 7.4) 및 10 mM MgCl₂로 구성된 완충액에 펠렛을 재현탁시킨 다음 필요할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 분석 당일에, 균질물을 해동 및 균질화시켰다. 25 mM Hepes (pH 7.4), 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0.1% BSA 및 1 mM 1,10-페난트롤린을 함유하는 완충액 중에서 [¹²⁵I]-ANP의 결합을 수행하였다. 균질물 (1-10 μg 단백질/웰)을 [¹²⁵I]-ANP (25-30 pM)와 함께 인큐베이션시킨 다음 Millipore 필터 플레이트 중의 경쟁 리간드의 농도를 4℃에서 120분간 증가시켰다. 차가운 세척 완충액 (포스페이트 완충염수)를 첨가한 다음 배큠 매니 폴드를 이용하여 여과함으로써 분석을 종료시켰다. 감마 계수기를 이용하여 결합 방사능활성을 측정하였다. [I¹²⁵]-hANP의 비트랜스펙션 HEK293 막에 대한 결합에 의해 비특이적인 결합을 정의하였다. GraphPad Prism

곡선-피팅 소프트웨어를 이용하여 데이타를 분석하였다.

EC₅₀ 측정을 위한 일반적인 방법. 재조합 hNPR-A를 발현하는 HEK-293 세포 중 세포내 cGMP의 축적량을 측정함으로써 구조물의 기능 평가를 수행하였다. HE-NPRA 세포들을 Cell Dissociation Buffer (Gibco, Life Technologies) 중에서 세척 및 원심분리시킴으로서 수확하였다. 펠릿화된 세포들을, 10 mM Hepes (pH 7.4), 5 mM MgCl₂, 200 mM L-글루타민, 1 mM 1,10-페난트롤린 및 BSA (0.5 mg/mL)를 함유하는 Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)에 재현탁시켰다. 원심분리에 이어, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX)이 보강된 전술한 완충액에 세포들을 재현탁시켰다. 세포들 (~2 x 10⁵/웰)을 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 15분간 인큐베이션시켰다. 예비-인큐베이션 기간 경과 후, 구조물의 농도를 증가시키면서 세포들을 15분간 더 인큐베이션시켰다. 온도 쇼크에 의해 세포를 용해시킴으로써 반응을 종결시켰다. 반응 플레이트를 드라이아이스/에탄올 배쓰 중에서 15분간 인큐베이션한 다음 90℃에서 10분간 인큐베이션시켰다. cGMP Flashplate RIA (Perkin-Elmer)를 이용하여 cGMP의 축적량을 측정하였다. 데이타 분석 및 EC₅₀값을 GraphPad Prism

소프트웨어에 의해 비선형 회귀 분석을 이용함으로써 측정하였다.

질량 측정 및 핵자기공명 분석. 매트릭스로서 알파-시아노-4-히드록시신남산 (CHCA)를 이용하여 MALDI-TOF 질량 분광계 (포지티브 이온 모드)에 의해 PEG-컨쥬게이션된 구조물의 질량값을 분석하였다. 구조물 대 매트릭스의 비율을 1:10, 1:20 및 1:30으로 해서 샘플 제조에 메탄올을 이용하였다. 또는 시나핀산(SA) 및 2,5-디히드록시벤조산(DHB)와 같은 다른 매트릭스, 및, 아세토니트릴-0.1% 수성 TFA와 같은 용매를 샘플 제조에 사용할 수 있다. 포지티브 모드를 이용하여 Waters MicroMass ZQ 장치에 의해 질량값의 다른 결정을 하였다. PEG화 되지 않은 구조물의 경우, 질량 측정값을 계산값과 비교하고, 달리 언급하지 않는 한 질량 중량 플러스 2를 2로 나눈 형태 (((M+2)/2)로 표현하였다.

Bruker 300 MHz 분광계를 이용하여 양성자 NMR 데이타를 얻었다. 스펙트럼을 클로로포름, DMSO, 또는 메탄올과 같은 중수소화된 적절한 용매에 구조물을 용해시킨 후에 스펙트럼을 얻었다.

1mL/분으로 용출되는 YMC Pack Pro C₁₈ 컬럼 (4.6 x 50 mm, 3μ)이 구비된 Waters Alliance HT를 이용하여 HPLC 측정을 단계별 공정으로 수행하였다. 용매 A (0.1% 트리플루오로아세트산 v/v를 함유하는 물) 및 용매 B (0.1% 트리플루오로아세트산 v/v을 함유하는 아세토니트릴)를 이동상으로서 이용하였다. 케토 피페라진 중간체의 분석을 위해, 컬럼을 10% B로 평형시킨 다음 B를 8분에 걸쳐 90%까지 증가시켰다. 펩타이드 분석을 위해, 컬럼을 2% B로 평형시킨 다음 8분에 걸쳐 B를 90%까지 증가시켰다.

동물 모델 -- 혈압 변환기 이식.　 이소플루란으로 래트를 외과적으로 마취시킨 다음 열패드 상에서 유지시킨다. 복부를 면도하고 70% 알코올과 베타딘 용액으로 복부를 문지른다. 하행 대동맥과 대정맥을 노출시키기 위해 무균 기술을 이용하여, 복부 중앙선을 절개한다. 복부의 내용물을 멸균 거즈와 견인자를 이용해서 살살 끄집어낸다. 제조업자의 지침에 따라 (Data Sciences International's Multiplus TL Series Device Surgical Manual 2000: pp. 3.1-3.10에 설명됨), 복부 대동맥을 조심스럽게 주변의 지방과 연결조직으로부터 절단하고 혈압 변환기 (blood pressure transducer)의 카테테르를 삽입한다. 변환기의 카테테르를 외과용 풀을 이용하여 고정시키고, 변환기의 몸체를 복벽에 봉합시켜 안정화시킨다 (4-0 실크 봉합사). 이 과정 동안 지혈상태가 유지되도록 그리고 혈류가 약해지지 않도록 주의를 기울인다 (예컨대, 대동맥을 한번에 3분 초과하여 폐색시키지 않는다). 원격 라디오 신호를 이용해서 변환기 위치와 고정여부를 확인한다. 변환기 위치를 고정시킨 후, 거즈 스폰지르르 제거하고, 복강을 멸균염수로 헹궈낸다. 이어서 단순 봉합 패턴으로 비흡수성 봉합사 (4-0 실크 봉합사)를 이용하여 복강 절개부분을 봉합시킨다. 흡수성 봉합사 (4-0 바이크릴)를 이용하여 피부를 막는다. 마지막으로 동물을 이소플루란으로부터 제거하고 동물이 완전히 깰 때가지 모니터링하면서 따뜻한 환경에 놓는다.

울혈성 심부전증 (부피 과부하)의 외과적. 이 과정에서는, 원격 장치용 이식 과정에서와 동일한 방식으로 하행 대동맥과 대정맥을 노출시킨다. 일단 신장과 엉덩이 뼈 분기 (iliac bifurcation) 부위 사이의 혈관에 접근되면, 하행 대동맥에 1.8 mm 바늘 (외경)을 이용하여 구멍을 뚫는다. 바늘을 하대정맥내로 전진시킨 다음 회수한다. 하행 대동맥 중 배쪽의 천공을 조직 접착제로 봉한다. 대동맥과 대정맥 사이의 지름길(shunt)의 지속여부를 대정맥의 팽창 및 정맥혈과 동맥혈의 혼합에 의해 육안으로 확인한다. 혈압 변환기도 이식된 경우에는, 두가지 공정을 동시에 행한다. Flaim, S.F., W.J. Minteer, S.H. Nellis, 및 D.P. Clark: Chronic arteriovenous shunt: evaluation of a model for heart failure in rat.　 Am. J. Physiol.　 236:H698-H704 (1979) 및 Garcia, R. 및 S. Diebold: Simple, rapid and effective method of producing aortocaval shunts in the rat.　 Cardiovasc. Res.　24:430-432 (1990)에 설명된 일반적인 방법론은 본 발명에 참고 통합된다.

혈압 모니터링.　Dataquest A.R.T. Gold software version 3.0 (Data Sciences International)를 이용하여 혈압 변환기 (모델 TA11PA-C40, Data Sciences International, St Paul, MN)로부터의 원격 신호를 수집 및 분석한다. 매일 대략 같은 시간에 래트들을 관찰하였다. 우리 안에 들어 있는 각각의 래트를 관찰실의 리시버에 놓고 30분간 장소 변화에 적응하도록 한다. 투약하기 30분 전에 기초 기록을 하고 IV 투여 후 즉시로 135분간 및 SC 투여 후 210분간 치료 기록을 수행한다. 본 명세서에 그 내용이 참고로 통합된 Clemens, L.E., R.G. Almirez, K.A. Baudouin, E.B. Grossbard, 및 A.A. Protter: Human brain natriuretic peptide reduces blood pressure in normotensive and acute norepinephrine-induced hypertensive rabbits.　 Am. J. Hypertens.　10:654-661 (1997)에 앞서 공 개된 바 있는 방법과 유사한 방식으로, 식염수 투여 후의 결과와 상기 치료 결과를 비교한다.

이뇨 및 나트륨 이뇨.　래트들을 소듐 펜토바르비탈로 외과적으로 마취시키고 열 패드 상에서 유지시킨다. 복부를 면도한 다음 70% 알코올과 베타딘 용액으로 문지른다. 방광을 노출시키기 위해, 무균 기술을 이용하여, 복부 중앙선을 절개한다. 퍼스-스트링(purse-string) 봉합사를 방광의 배쪽 표면에 도입하고 봉합 영역 내에 작은 절개부를 만든다. 개구부 내로 삽입된 카테테르의 점점 넓어지는 쪽의 말단부와 그 주변의 퍼스-스트링 봉합사를 동여매서 제자리에 고정시킨다. Abassi, Z.A., J.R. Powell, E. Golomb, 및 H.R. Keiser: Renal and systemic effects of urodilatin in rats with high-output heart failure.　 Am. J. Physiol. 262:F615-F621 (1992) (이들 문헌의 내용은 모두 본 발명에 참고 통합된다)에 공개된 방법과 유사한 방식으로 투약전과 투약후 다양한 시간 간격으로, 소변을 미리 칭량한 미세원심분리 튜브에 수집한다. 소변의 부피를 중량으로 측정한다.

첨부된 도면은 본 발명의 1 이상의 구체예를 도시한 것으로서, 발명의 상세한 설명과 더불어 본 발명의 이론을 설명해준다. 첨부된 도면은 본 발명의 1 이상의 바람직한 구체예를 설명하기 위한 목적으로 제시된 것으로서, 본 발명이 이들 도면 범위로 한정되는 것은 아니다. 도면 설명은 다음과 같다:

도 1은 야생형 내인성 인간 ANP(hANP)의 서열을 도시한 것이다;

도 2는 구조물 1-18을 피하 수단에 의해 5 mg/kg 및 정맥 수단에 의해 2 mg/kg의 양으로 투여한 경우 경시적인 구조물의 농도를 나타낸 그래프이다.

도 3은 구조물 1-18과 1-63을 4마리 래트 그룹에 IV 경로로 투여한 경우 30분에 걸친 총 배뇨량을 나타낸 그래프이다.

도 4는 구조물 1-18을 SC 경로로 4마리 래트 그룹에 다양한 투여량으로 투여한 경우 45분에 걸친 총 배뇨량을 나타낸 그래프이다.

실시예 1

전술한 방법 중 하나 이상의 아미노산 대체물을 이용하여, 다음의 구조물들을 합성하고, 정제한 다음 질량 중량을 측정하였다. 그 결과를 다음에 나타내었다:

실시예 2

전술한 방법 중 하나 이상의 아미노산 대체물을 이용하여, 다음의 표 2의 구조물들을 합성하고, 정제한 다음 질량 중량을 측정하였다. 그 결과를 다음에 나타내었다:

실시예 3

다음 구조를 갖는 구조물 1-1을 전술한 바와 같이 테스트하였다.

수용체 결합 연구에서, hANP의 Ki는 0.05 nM이고 mini-ANP의 Ki는 0.6 nM인 분석 시스템에서 이 구조물의 평균 Ki값은 0.3nM이었다. hANP의 EC₅₀이 0.6 nM이고 mini-ANP의 EC₅₀이 3.3 nM인 분석 시스템에서 구조물 1-1의 EC₅₀은 2 nM이었다.

실시예 4

다음 구조를 갖는 구조물 1-9를 전술한 바와 같이 테스트하였다.

수용체 결합 연구에서, hANP의 Ki는 0.05 nM이고 mini-ANP의 Ki는 0.6 nM인 분석 시스템에서 이 구조물의 평균 Ki값은 0.9 nM이었다. hANP의 EC₅₀이 0.6 nM이고 mini-ANP의 EC₅₀이 3.3 nM인 분석 시스템에서 구조물 1-9의 EC₅₀은 3.5 nM이었다.

실시예 5

다음 구조를 갖는 구조물 1-8을 전술한 바와 같이 테스트하였다.

수용체 결합 연구에서, hANP의 Ki는 0.05 nM이고 mini-ANP의 Ki는 0.6 nM인 분석 시스템에서 이 구조물의 평균 Ki값은 0.2 nM이었다. hANP의 EC₅₀이 0.6 nM이고 mini-ANP의 EC₅₀이 3.3 nM인 분석 시스템에서 구조물 1-8의 EC₅₀은 2 nM이었다.

실시예 6

다음 구조를 갖는 구조물 1-18을 전술한 바와 같이 테스트하였다.

수용체 결합 연구에서, hANP의 Ki는 0.05 nM이고 mini-ANP의 Ki는 0.6 nM인 분석 시스템에서 이 구조물의 평균 Ki값은 0.027 nM이었다. hANP의 EC₅₀이 0.6 nM이고 mini-ANP의 EC₅₀이 3.3 nM인 분석 시스템에서 구조물 1-18의 EC₅₀은 0.2 nM이었다.

구조물 1-18은 래트와 사람의 혈장에서 모두 안정하였으며, 37℃에서 T_1/2는 ~ 2시간 이었다. IV 경로로 투여시, 래트에서의 생체내 T_1/2은 ~20분이었다. 주사된 투여량의 약 25 내지 50%는 피하 경로로 투여시 래트에서 생체이용가능하였다. 도 2는 래트에 있어서 구조물 1-18의 경시적인 농도를 ng/mL로 나타낸 것으로서, "SC"로 표시된 곡선은 5 mg/kg의 투여량에서의 피하 투여를 가리키는 것이고, "IV"로 표시된 곡선은 2 mg/kg의 투여량에서의 정맥내 투여를 가리키는 것이다.

실시예 7

"동물 모델-혈압 변환기 이식"이라는 제하에서 설명된 바와 같이 혈압 변환기를 래트에 이식하였다. "혈압 모니터링"이라는 제하에서 설명된 바와 같이 연구를 수행하였다. 이러한 연구에는 식염수와 본 발명의 구조물을 투여한 경우를 비교한 수축기 혈압의 변화 측정이 포함된다. 한 연구에서, 래트에게 구조물 1-63을 0.03 mg/kg 체중 (n=4), 0.1 mg/kg (n = 7) 또는 0.3 mg/kg (n = 8)의 양으로 IV 경로로 투여하였다. 혈압을 IV 투여하기 5분 전에, 그리고 투여한지 5, 10 및 15분 후에 모니터링하고, 투여한 후 135분 간 15분 간격으로 모니터링하였다. 모든 투여 시점에서 측정된 수축기 혈압은 식염수 대조군의 경우보다 낮았고, 최소 약 5% 내지 최대 약 19%의 범위에서, 일반적으로 투여량 의존 방식으로 혈압의 감소가 일어났으며, 투여 후 10 내지 45분에서 최대 반응성이 나타났다.

두번째 연구에서, 래트에게 구조물 1-63을 피하경로로 0.3 mg/kg 체중(n = 8), 1.0 mg/kg (n = 7) 또는 3.0 mg/kg (n = 7)의 투여량으로 투여하였다. 혈압을 SC 투여하기 5분 전에, 그리고 투여한지 5, 10 및 15분 후에 모니터링하고, 투여후 210분 간 15분 간격으로 모니터링하였다. 모든 투여 시점에서 측정된 수축기 혈압은 식염수 대조군의 경우보다 낮았다. 0.3 mg/kg SC에서, 수축기 혈압의 감소는 투여한지 2시간 후의 시점에서 오차 범위 이내인 2% 범위였다. 그러나, 0.3 mg/kg SC의 경우 그 밖의 모든 시점에서, 그리고 1.0 및 3.0 mg/kg의 경우 모든 시점에서, 혈압 감소는 통계학적으로 달랐으며 식염수 대조군보다 낮았다. 3.0 mg/kg에서, 약 20% 내지 23%의 수축기 혈압의 감소가 투여 후 45 내지 120분 사이에 관찰되었으며, 동 기간 중 최대 감소는 1.0 mg/kg에서 관찰된 17 내지 19%였다.

세번째 연구에서는, 래트에게 구조물 1-18을 IV 경로로 0.3 mg/kg 체중 (n = 8)으로 투여하였다. 혈압을 IV 투여에 앞서 5분간, 그리고, 투여한지 5, 10 및 15분 후에 모니터링하였으며, 투여 후 135분까지는 15분 간격으로 모니터링하였다. 모든 투여 시점에서 측정된 수축기 혈압은 식염수 대조군의 경우보다 낮았고, 최소 약 5% 내지 최대 약 13%의 범위에서, 혈압의 감소가 일어났으며, 투여 후 15분 시점에서 최대 반응성이 나타났다.

네번째 연구에서는 래트에게 구조물 1-18을 피하 경로로 0.1 mg/kg 체중(n = 4), 0.3 mg/kg (n = 7) 또는 1.0 mg/kg (n = 8)의 양으로 투여하였다. 혈압을 SC 투여에 앞서 5분간, 그리고, 투여한지 5, 10 및 15분 후에 모니터링하였으며, 투여 후 225분까지는 15분 간격으로 모니터링하였다. 모든 투여 시점에서 측정된 수축기 혈압은 식염수 대조군의 경우보다 낮았다. 0.1 mg/kg SC에서, 수축기 혈압의 감소는 약 2시간 30분 후에는 통계학적으로 타당하지 않았다. 그러나, 0.1 mg/kg SC의 경우, 그 밖의 모든 시점에서, 그리고 약 2시간 30분 미만의 모든 시간대에서 0.3 mg/kg의 경우, 및 1.0 mg/kg의 모든 시간대에서 차이는 통계학적으로 상이하였으며 식염수 대조군보다 낮았다. 1.0 mg/kg에서 투여 후 45 내지 120분 무렵에 약 9% 내지 13% 범위로 수축기 혈압이 최대로 감소하는 것으로 나타났다.

실시예 8

"이뇨 및 나트륨 이뇨"라는 제하에서 설명된 바와 같이 래트에서 총 배뇨량을 측정하였다. 네마리 동물 군에게 구조물 1-18과 1-63을 IV 경로로 투여하고, 동물에게 구조물 0.03 mg/kg 체중, 0.1 mg/kg 및 0.3 mg/kg을, 그리고 구조물 1-63을 0.1 mg/kg 체중, 0.3 mg/kg 및 1.0 mg/kg을 투여하였다. 투약한지 30분 후 총 배뇨량을 측정하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

별도의 연구를 통해, 대조군으로서 식염수를 사용하고, SC 경로에 의해 구조물 1-63을 0.3, 1.0 및 3.0 mg/kg 체중의 투여량으로 투여받은 네마리 동물들에 있어서 총배뇨량은 유사하게 측정되었다. 결과를 도 4에 나타내었다.

실시예 9

본 발명의 선택된 구조물의 약동학을 수컷 Sprague-Dawley종 래트에게 다음과 같이 정맥 (IV) 및 피하 (SC) 투여하여 연구하였다. 래트에 있어서 선별된 구조물의 약동학적 변수를 측정하여 표 3 및 표 4에 요약하였다.

표 4 및 표 5에 나타낸 것과 같은 본 발명의 구조물을 TFA 염으로서 제조한 다음 IV와 SC 두가지 모두의 투여 경로를 위해 1 mL/kg으로 식염수에 용해시켰다. IV 투여량은 0.3 및 2 mg/kg의 대퇴동맥 커뉼러를 통해 투여하였다. SC 투여량을 1 및 5 mg/kg의 표적 투여량으로 투여하였다. 동물들을 투약 전에 밤새 굶기지는 않았다. 목정맥에 미리 이식시켜 놓은 커뉼라로부터 소정 간격으로 디포타슘 EDTA가 함유된 용기 내로 채혈된 혈액을 넣었다. 혈액을 원심분리하여 혈장을 얻고 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다.

100 μL 주사용 루프, 2개의 Shimadzu Pumps 및 Sciex API 4000 질량 분광계가 구비된 Leap Technologies HTS-PAL 오토샘플러를 포함하는 LC-MS/MS 시스템을 이용하여 데이타를 분석하였다. 분석물의 크로마토그래피 분리는 단계적 공정에 따라 1 mL/분으로 용출되는 Luna C₁₈컬럼 (4.6 x 100 mm; 3μ) 상에서 달성하였다. 용매 A(0.1% 포름산 v/v을 함유하는 물) 및 용매 B (0.1% v/v 포름산을 함유하는 아세토니트릴)을 이동상으로서 이용하였다. 먼저, 컬럼을 5%로 평형시키고, 샘플을 주사한지 2분 후, B를 60%까지 0.5분간 증가시켰으며 이 농도를 1.1분간 유지시켰다. B의 조성을 1.4분 후 80%까지 증가시키고 0.3분간 유지시켰다. B의 조성을 0.2분 후 다시 5%로 복귀시켰다. 총 수행시간은 6분이었다. 포지티브 이온 모드에서 작동하는 Turbo Ionspray 인터페이스를 이용하여 분석물의 질량 분광학적 검출을 실시하였다. 양성자화된 전구체 이온의 선택된 생성물 이온으로의 전이를 다중 반응 모니터링(MRM)에 의해 측정하였다.

일정량의 혈장 (100 μL)을 내부 표준 (IS)와 혼합하고 96 웰 포맷에서 C₈ 카트리지를 이용하여 고상 추출하였다. 물 중 1 mL의 2% 수산화암모늄과 1 mL의 메탄올로 C₈ 카트리지를 프리컨디셔닝시킨 후, 혈장 샘플을 카트리지 상에 로딩시켰다. 40% 메탄올 중 2% 수산화암모늄으로 카트리지를 세척한 다음, 60% 메탄올 중 2% 아세트산 1 mL로 카트리지로부터 구조물을 용출시켰다. 용출물을 깨끗한 플레이트로 옮기고 N₂ 기류 하에 증발시키고 잔사를 LC-MS/MS 분석에 앞서 100 μL의 20 mM 암모늄 아세테이트와 아세토니트릴 (6:4, v:v)에 재현탁시켰다. 여러 농도의 구조물과 그의 대응하는 IS를 100 μL의 미처리 래트 혈장에 첨가함으로써 동일한 방식으로 보정 표준 (2 - 1000 ng/mL)을 제조하였다. 마찬가지로, 구조물과 IS를 100 μL 대조군 혈장에 3가지 구조물 농도 (3.5, 75 및 750 ng/mL)로 첨가함으로서 품질 관리 샘플을 제조하였다.

Sciex Analyst 1.4.1 소프트웨어에 의해 데이터를 얻고 가공하였다. 구조물 대 IS의 피크 면적 비율을 구조물의 명목 농도의 함수로서 플로팅하였다. 칭량 인자 1/x를 이용하는 선형 회귀법을 이용하여 혈장 샘플 중 구조물의 농도를 계산하였다. 이 분석에 대한 최소정량한계는 대체로 2 또는 5 ng/mL였다.

확립된 비구획화법(Win-Nonlin version 2.1; Consulting Inc., Palo Alto, CA)에 의해 약동학적 변수들을 산출하였다. 상승 기울기에서는 마름모형 보간법으로, 하강 기울기에서는 대수적 마름모형 보간법을 이용하여 혈장 농도 대 시간 곡선 하의 면적 (AUC)을 결정하였다. 최후의 측정가능한 농도로부터 무한대까지의 AUC의 비율을 방정식 C_t/k_el(여기서 C_t는 최후의 측정가능한 농도를 나타내고 k_el은 제거율 상수를 나타낸다)에 따라 평가하였다. 후자는 편대수(semi-logarithmic) 플롯의 터미날 페이즈에서의 선형 회귀에 의해 농도 대 시간 곡선으로부터 결정하였다.

실시예 10

1-132의 포뮬레이션을 약학적 사용을 위해 제조하였다. 1-132를 아세테이트 염의 형태로서 사용하였다. 포뮬레이션을 1 mL 바이알에 분산시키고 이를 스토퍼 및 밀봉시켰다. 각각의 바이알은 다음을 함유한다:

0.1 mg의 1-132 아세테이트, (아세테이트의 펩타이드 순중량에 기초함)

1.181 mg 숙신산, NF

47.0 만니톨, USP

1N NaOH, USP, pH 조정에 필요한 양

1N HCl, USP, pH 조정에 필요한 양

주사용수, 1 mL 부피가 되게 하는 양

최종 생성물의 pH를 필요에 따라 1N NaOH 또는 HCl을 이용하여 pH 4.00 ±0.05가 되도록 조정하였다. 얻어진 용액을 바이알링에 앞서 멸균 0.22 마이크론 필터를 통해 여과하고, 사용 전 5℃에서 보관하였다.

상기한 포뮬레이션과 유사하나, 약 0.02 mg 내지 0.06 mg의 디소듐 파모에이트를 부가적으로 함유하는 1-132의 대안적인 포뮬레이션을 약학적 사용을 위해 제조하였다. 얻어진 용액은 파모에이트 현탁액이었다.

실시예 11

전술한 한가지 이상의 방법의 아미노산 대체물을 사용하여 다음의 구조물을 합성하고, 정제한 다음, PEG-5K-OSu와 컨쥬게이션시키고, 질량을 측정한 다음, 그 결과를 다음 표 5에 나타내었다:

실시예 12

전술한 하나 이상의 방법들의 아미노산 대체물을 이용하여, 표 6의 다음 구조물을 합성하고, 정제한 다음 PEG-5K-OSu 또는 다른 반응성 PEG와 컨쥬게이션 시켜, 매스 질량을 측정하였다:

실시예 13

다음 구조를 갖는 구조물 5-1을 상기한 바와 같이 테스트하였다.

수용체 결합 연구에서 hANP의 Ki는 0.05 nM이고 mini-ANP의 Ki는 0.6 nM인 분석 시스템이서 이 구조물의 평균 Ki는 70 nM 이었다.

실시예 14

다음 구조를 갖는 구조물 5-9를 상기한 바와 같이 테스트하였다.

수용체 결합 연구에서 hANP의 Ki는 0.05 nM이고 mini-ANP의 Ki는 0.6 nM인 분석 시스템에서 이 구조물의 평균 Ki값은 2 nM이었다. hANP의 EC₅₀이 0.6 nM이고 mini-ANP의 EC₅₀이 3.3 nM인 분석 시스템에서 구조물 5-9의 EC₅₀은 약 9.5 nM이었다.

실시예 15

비제한적인 예로서 1-1 내지 1-248, 2-1 내지 2-21, 5-1 내지 5-18 및 6-1 내지 6-12를 비롯한 본 발명의 여하한 구조물들을 시간방출형 주사제로서 조성한다. 이들 구조물들을 폴리(에틸렌 글리콜) 3350과 같은 PEG, 및 임의로 1종 이상의 부형제와 방부제, 예컨대, 비제한적인 예로서 염, 폴리소르베이트 80, pH 조정을 위한 수산화나트륨 또는 염산 등과 같은 부형제와 함께 조성한다. 또는, 이러한 구조물을 폴리머 백본 중 다양한 백분율의 락트산을 갖는 자가촉매형 폴리(오르토 에스테르)와 같은 폴리(오르토 에스테르), 및 임의로 1종 이상의 부가적인 부형제와 함께 조성시킨다. 폴리(D,L-락타이드-코-글라이코라이드)폴리머((PLGA 폴리머), 바람직하게는 친수성 말단기를 갖는 PLGA 폴리머를 사용하는 것이 좋다.

실시예 16

휴식기 또는 최소 활동 중에도 호흡곤란을 겪는 급성 대상부전형 울혈성 심부전증과 같은 울혈성 심부전증을 앓는 환자에게 실시예 10의 여하한 방법에 의한 포뮬레이션을 비롯하여 본 발명의 구조물 1-1 내지 1-248, 2-1 내지 2-21, 5-1 내지 5-18 및 6-1 내지 6-12 중 한가지 이상을 포함하는 포뮬레이션을 피하 주사에 의해 투여한다.

실시예 17

만성 울혈성 심부전증을 앓는 환자에게 실시예 15의 시간 방출형 주사용 포뮬레이션을, 예컨대 엉덩이 또는 삼각근 근육내로 깊이 근육내 주사한다.

실시예 18

본 출원인들은 또한 본 발명에 따른 구조물의 중성 엔도펩티다제에 의한 소화 내성의 정도와 그의 약동학적 소거율(CL) 사이의 역비례적 상관관계를 발견하여 다음 표 7에 나타내었다. 중성 엔도펩티다제 ("NEP")는 인간의 세가지 나트륨 이뇨 펩타이드 모두를 불활성화 및 소거시키는 내인성 효소이다. NEP는 신장의 신장의 요관 세포와 혈관 세포 사이에 존재한다. NEP는 포유류 종들 간에 높은 상동성을 갖는다. 래트와 마우스 사이의 NEP의 상동성 백분율은 98.5%이고 인간와 마우스 사이에는 93.6%이며 인간과 래트 사이에서는 93.7%이다.

본 발명의 다양한 구조물의 NEP 내성을 다음의 실험 방법을 이용하여 평가하였다. 모든 구조물들을 0.1 M Tris-HCL 완충액 (pH 7.4)에 100 μM가 되도록 희석하였다. 희석된 구조물 40 μL을 각각의 시험관에 넣고 모든 시험관들을 얼음 상에서 보관하였다. 8 ng/μL 농도의 사람의 재조합 NPE (R&D Systems, Minneapolis, MN, 카탈로그#1182-ZN) 또는 2.5 ng/μL 농도의 마우스 NEP (R&D Systems, 카탈로그#1126-ZN)의 희석 NEP 40μL을 각 시험관에 첨가하였다. 시험관을 가볍게 혼합 및 회전시켰다. 모든 시험관들을 37℃에서 0, 0.5, 1, 1.5 및 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 기간 말기에, 5 μL의 10% TFA를 첨가함으로써 반응을 중지시켰다. 구조물을 TCEP (트리스[2-카르복시에틸] 포스핀을 이용하여 선형화시켰다. 구조물에 대해 활성적인 NEP의 정도를 HPLC 및/또는 LC/MS에 의해 분석하였다. 데이타 분석은 잔류 출발물질, 즉, 소화되지 않은 펩타이드 구조물의 백분율 측정과 각각의 단백질 분해 단편의 백분율과 서열 측정을 포함하였다.

따라서, 본 발명의 한가지 구체예는 설명된 바와 같은 hNEP 내성 분석 조건 하에서 1시간 후에 출발물질의 적어도 80%가 잔류하는 것으로 입증된 본 발명의 여하한 구조의 구조물을 제공한다. 본 발명의 관련 구체예는 설명된 바와 같은 hNEP 내성 분석 조건 하에서 1시간 후에 출발물질의 적어도 90%가 잔류하는 것으로 입증된 본 발명의 여하한 구조의 구조물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 관련 구체예는 설명된 바와 같은 hNEP 내성 분석 조건 하에서 1시간 후에 출발물질의 적어도 95%가 잔류하는 것으로 입증된 본 발명의 여하한 구조의 구조물을 제공한다. 이러한 여러가지 구체예의 변형예에서, 구조물은 또한 분석 조건하 2시간 후에 출발물질의 적어도 80%가 잔류하는 것으로 입증되었다. 관련 변형예에서, 구조물은 또한 분석 조건하 2시간 후에 출발물질의 적어도 90%가 잔류하는 것으로 입증되었다.

본 발명의 또 다른 구체예는 설명된 바와 같은 hNEP 내성 분석 조건 하에서 1시간 후에 90% 이하의 출발물질이 잔류하는 것으로 입증된 본 발명의 여하한 구조의 구조물을 제공한다. 본 발명의 관련 구체예는 설명된 바와 같은 hNEP 내성 분석 조건 하에서 1시간 후에 80% 이하의 출발물질이 잔류하는 것으로 입증된 본 발명의 여하한 구조의 구조물을 제공한다. 여러가지 구체예의 변형예에서, 구조물은 또한 분석 조건하 2시간 후에 90% 이하의 출발물질이 잔류하는 것으로 입증되었다. 관련 변형예에서, 구조물은 또한 분석 조건하 2시간 후에 80% 이하의 출발물질이 잔류하는 것으로 입증되었다.

따라서, 본 발명의 구조물들은 이들이 입증된 NEP 내성의 정도에 기초한 약동학적 특성에 따라 선택될 수 있다.

전술한 실시예들은 전술한 실시예에서 사용된 일반적으로 또는 특정하게 설명된 본 발명의 반응물 및/또는 작동 조건을 치환시킴으로써 유사한 성공율로 반복가능하다.

비록 바람직한 구체예를 들어 본 발명을 상세히 설명하였으나, 다른 구체예에 의해서도 동일한 결과를 얻을 수 있다. 본 발명의 변형 및 변경은 당업자에게 자명하며 이러한 모든 변경 및 동등한 등가물 역시 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 이해되어야 한다. 상기한 상세한 설명 및/또는 첨부물, 및 대응 출원(들)에서 인용되었거나 첨부된 모든 참고자료, 출원,특허 및 공개문헌등의 개시내용 전체가 본 발명에 참고로 통합된다.

Claims

다음 화학식 III을 갖는 펩타이드 구조물:

식 중, Aaa¹은 Nle, Ala, Leu, Ile, Val, Arg, Phe 및 Tyr로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 L- 또는 D-이성질체; 또는 Aaa¹은 C₂ 내지 C₁₈ 직쇄 알킬 또는 C₃ 내지 C₁₇ 분지상 알킬을 포함하는 아실이거나; 또는 Aaa¹은 다음 구조를 갖는 아미노산 대체물이다:

식 중, 파선은 펩타이드 결합; R 및 R'은 독립적으로 H, 또는 직쇄 또는 분지상 C₁ 내지 C₆ 지방족쇄; x는 1; Y는 C=O; W는 NH; Z는 H; Q는 -H, -C(=O)-(CH₂)_m-CH₃, 또는 -C(=O)-(CH₂)_m-N(v₃)(v₄); n은 0, 1 또는 2; m은 0 내지 17; v₃ 및 v₄ 는 각각 독립적으로 H이고; 별표 표시된 탄소 원자들은 입체화학적 입체배열을 가질 수 있다;

Aaa² 및 Aaa¹³은 같거나 다르고, 각각 Aaa²와 Aaa¹³각각의 측쇄를 통해 환형 다리를 형성하는 L- 또는 D-이성질체 아미노산 잔기들이며, 이 때 상기 환형 다리의 연결기 R₁은 -S-S-이다;

Aaa³은 His, Ala, Lys, Orn 및 Phe로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 L- 또는 D-이성질체, 또는 Aaa³는 다음 구조를 갖는 아미노산 대체물이다:

식 중, R 및 R'은 독립적으로 H 또는 His의 아미노산 측쇄 모이어티; Y는 C=O; W는 NH; Z는 H; x는 1이고; n은 0이다;

Aaa⁴는 Phe, Gly, Leu 및 Ala로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 L- 또는 D-이성질체, 또는 Aaa⁴은 Aaa³와 같은 아미노산 대체물로서, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 Phe의 아미노산 측쇄 모이어티; z는 H 또는 CH₃이고; n은 0 또는 1이다;

Aaa⁵는 Gly, Aib 또는 Ala의 L- 또는 D-이성질체이거나 또는 Aaa⁵는 Aaa³에서와 같은 아미노산 대체물로서, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 -CH₃이고; n은 0 또는 1이다;

Aaa⁶은 Gly, Aib 또는 Ala의 L- 또는 D-이성질체이거나 또는 Aaa⁶는 Aaa³에서와 같은 아미노산 대체물로서, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 -CH₃이고; n은 0 또는 1이다;

Aaa⁷은 Arg, Lys 및 Orn로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 L- 또는 D-이성질체, 또는 Aaa⁷은 Aaa³에서와 같은 아미노산 대체물로서, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 Arg의 아미노산 측쇄 모이어티이고; n은 0 또는 1이다;

Aaa⁸은 Nle, Ile, Leu, Val 및 Ala로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 L- 또는 D-이성질체이다;

Aaa⁹은 Asp 및 Ala로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 L- 또는 D-이성질체, 또는 Aaa⁹은 Aaa³에서와 같은 아미노산 대체물로서, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 Asp의 아미노산 측쇄 모이어티이다;

Aaa¹⁰은 Arg, Ala, Lys 및 Orn으로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 L- 또는 D-이성질체, 또는 Aaa¹⁰은 Aaa³에서와 같은 아미노산 대체물로서, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 Arg의 아미노산 측쇄 모이어티;

Aaa¹¹은 Ile, Leu, Val, Ala 및 Aib로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 L- 또는 D-이성질체, 또는 Aaa¹¹은 Aaa³ 에서처럼 아미노산 대체물로서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 Ile의 아미노산 측쇄 모이어티이다;

Aaa¹²는 Ser, Ala, Lys 및 Orn로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 L- 또는 D-이성질체, 또는 Aaa¹²는 Aaa³에서와 같은 아미노산 대체물로서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 -CH₃이며; n은 0 또는 1이다;

Aaa¹⁴는 Phe, Tyr, Ala 및 Lys으로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 L- 또는 D-이성질체 또는 Aaa¹⁴은 Aaa³에서와 같은 아미노산 대체물로서, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 H 또는 Tyr의 아미노산 측쇄 모이어티이다;

Aaa¹⁵는 Arg의 α-아미노산의 L- 또는 D-이성질체, 또는 Aaa¹⁵은 다음 구조를 갖는 아미노산 대체물이다:

식 중, 파선은 펩타이드 결합을 나타내고; R과 R' 중 적어도 하나는 -(CH₂)_y-R"이고 R 및 R'의 나머지 하나는 H이며 여기서 R"은 다음과 같다:

-H

-NH₂, 또는

-NH-C(=NH)-NH₂,

식 중, x는 1; Y는 C=O; W는 NH; Z는 H; J는 -H, -(CH₂)_m-OH, -C(=O)-(CH₂)_m-OH, -C(=O)-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂), 또는 -C(=O)-NH-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂);

v₁ 및 v₂는 각각 독립적으로 H 또는 C₁ 내지 C₁₇ 직쇄 또는 분지상 알킬쇄; n은 0; m은 0 내지 17; y는 1 내지 5이며; 별표 표시된 탄소 원자들은 입체화학적 입체배열을 가질 수 있고;

단, Aaa¹, Aaa³ 내지 Aaa¹², Aaa¹⁴ 또는 Aaa¹⁵ 중 적어도 하나는 아미노산 대체물이다.
제1항에 있어서, Aaa¹, Aaa³ 내지 Aaa¹², Aaa¹⁴ 또는 Aaa¹⁵ 중 하나가 아미노산 대체물인 것인 펩타이드 구조물.
제1항에 있어서, Aaa¹, Aaa⁵ 및 Aaa¹⁵ 중 하나가 아미노산 대체물인 것인 펩타이드 구조물.
제1항에 있어서, Aaa¹, Aaa³ 내지 Aaa¹², Aaa¹⁴ 및 Aaa¹⁵ 중 두개가 아미노산 대체물인 것인 펩타이드 구조물.
제1항에 있어서, Aaa¹, Aaa⁵ 및 Aaa¹⁵ 중 두개가 아미노산 대체물인 것인 펩타이드 구조물.
제1항에 있어서, Aaa¹, Aaa³ 내지 Aaa¹², Aaa¹⁴ 또는 Aaa¹⁵ 중 세개 이상은 아미노산 대체물인 것인 펩타이드 구조물.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드 구조물은 Aaa²와 Aaa¹³의 측쇄를 통한 디설파이드 결합 형성에 의해 사이클화된 것인 펩타이드 구조물.
제7항에 있어서, Aaa³, Aaa⁵, Aaa⁶, Aaa⁷, Aaa⁹, Aaa¹⁰, 또는 Aaa¹² 중 적어도 하나는 Ala의 L-또는 D-이성질체인 것인 펩타이드 구조물.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산 잔기의 말단기나 측쇄에 있는 아민기 또는 카르복실기에, 또는 상기 대체물이 펩타이드 구조물의 N-말단에 있는 경우 아민 캡핑기 중 아민기에, 또는 상기 대체물이 구조물의 C-말단에 있는 경우 C-말단 캡핑기 중의 아민기 또는 카르복실기에 공유적으로 결합된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 추가로 적어도 한 개 포함하는 펩타이드 구조물.
다음 화학식 IV를 갖는 펩타이드 구조물:

식 중,

Aaa³, Aaa⁴, Aaa⁵, Aaa⁶, Aaa⁷, Aaa⁸, Aaa⁹, Aaa¹⁰, Aaa¹¹, Aaa¹², 및 Aaa¹⁴ 는 제1항에서 정의된 바와 같은 α-아미노산;

Aaa² 및 Aaa¹³는 같거나 다르고, 각각 Aaa²와 Aaa¹³각각의 측쇄를 통해 환형 다리를 형성하는 아미노산 잔기로서, 여기서 R₁은 각각의 Aaa² 및 Aaa¹³의 측쇄의 일부를 형성한다;

R₁은 -S-S-;

R₂ 및 R₂’중 하나는 H이고 다른 하나는 H 또는 직쇄 또는 분지상 C₁ 내지 C₆ 지방족쇄;

R₃ 및 R₃'중 하나는 H이고 다른 하나는 (CH₂)_y-R₅;

R₄는 OH,

R₅는 -H, -NH₂ 또는 -NH-C(=NH)-NH₂;

R₆ 및 R₇는 각각 독립적으로 H, C₁ 내지 C₄ 직쇄 또는 분지상 알킬쇄;

x는 1;

y는 1 내지 5;

z는 1 내지 7이고;

여기서, 별표 표시된 탄소 원자는 입체화학적 입체배열을 가질 수 있다.
제10항에 있어서, R₁은 -S-S- 이고 Aaa² 및 Aaa¹³은 각각 Cys 또는 HCys인 것인 펩타이드 구조물.
삭제
다음 화학식 V를 갖는 구조물:

식 중, Aaa² 내지 Aaa¹⁴, R₁ 및 x는 제1항에서 정의한 바와 같고 R₄는 OH 또는 NH₂인 것인 펩타이드 구조물.
다음 화학식 VI을 갖는 구조물:

식 중, Aaa² 내지 Aaa¹⁴ 및 R₁은 제1항에서 정의한 바와 같고 R₄는 OH 또는 NH₂인 것인 펩타이드 구조물.
다음 화학식 VII, VIII, IX, X, XI 또는 XII를 갖는 펩타이드 구조물:
다음 화학식 VI의 펩타이드 구조물:

식 중, Aaa² 내지 Aaa¹⁴ 및 R₁은 각각 제1항에서 정의된 바와 같고, R₄는 OH 또는 NH₂이다.
삭제
다음 화학식 XIII의 펩타이드 구조물:

식 중 w는 1 내지 17;

Aaa² 및 Aaa¹³은 같거나 다르고, 각각 Aaa²와 Aaa¹³각각의 측쇄를 통해 환형 다리를 형성하는 L- 또는 D-이성질체 아미노산 잔기들이며, 이 때 상기 환형 다리의 연결기 R₁은 -S-S-이고;

Aaa³, Aaa⁴, Aaa⁵, Aaa⁶, Aaa⁷, Aaa⁸, Aaa⁹, Aaa¹⁰, Aaa¹¹, Aaa¹² 및 Aaa¹⁴는 각각 제1항에서 정의된 바와 같고;

R₄는 OH,

R₆ 및 R₇는 각각 독립적으로 H, 또는 C₁ 내지 C₄ 직쇄 또는 분지상 알킬쇄이고;

z는 0이고;

여기서, 별표 표시된 탄소 원자는 입체화학적 입체배열을 가질 수 있다.
삭제
삭제
제15항에 있어서, 화학식 VIII 또는 IX를 갖는 펩타이드 구조물:

또는
다음 화학식 III을 갖는 펩타이드 구조물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하여 이루어지는 고혈압, 심혈관 질환 또는 신장병 치료용 약학적 조성물:

식 중, Aaa¹은 Nle; 또는 C₂ 내지 C₁₈ 직쇄 알킬을 포함하는 아실이거나; 또는 다음 구조를 갖는 아미노산 대체물이다:

식 중, 파선은 펩타이드 결합; R 및 R'은 독립적으로 H, 또는 직쇄 또는 분지상 C₁ 내지 C₆ 지방족쇄; x는 1; Y는 C=O; W는 NH; Z는 H; Q는 -H; n은 0; 별표 표시된 탄소 원자들은 입체화학적 입체배열을 가질 수 있다;

Aaa² 및 Aaa¹³은 각각의 측쇄를 통해 환형 다리를 형성하는 Cys이며, 이 때 상기 환형 다리의 연결기 R₁은 -S-S-이다;

Aaa³은 His 또는 Orn;

Aaa⁴는 Phe;

Aaa⁵는 Gly, 또는 다음 구조를 갖는 아미노산 대체물:

여기서 R 및 R'는 H; Y는 C=O; W는 NH; Z는 H; x는 1이고; n 은 0이다;

Aaa⁶은 Gly;

Aaa⁷은 Arg;

Aaa⁸은 Nle;

Aaa⁹는 Asp;

Aaa¹⁰은 Arg;

Aaa¹¹은 Ile;

Aaa¹²는 Ser;

Aaa¹⁴는 Tyr;

Aaa¹⁵는 Arg, 또는 다음 구조를 갖는 아미노산 대체물:

식 중, 파선은 펩타이드 결합을 나타내고; R과 R' 중 적어도 하나는 -(CH₂)_y-R"이고 R 및 R'의 나머지 하나는 H이며 여기서 R"은 -NH-C(=NH)-NH₂이고;

x는 1; Y는 C=O; W는 NH; Z는 H이고;

J는 -C(=O)-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂), 또는 -C(=O)-NH-(CH₂)_m-N(v₁)(v₂);

v₁ 및 v₂는 각각 독립적으로 H; n은 0; m은 0 내지 17; y는 1 내지 5이며; 별표 표시된 탄소 원자들은 입체화학적 입체배열을 가질 수 있고;

단, Aaa¹, Aaa⁵ 및 Aaa¹⁵ 중 적어도 하나는 아미노산 대체물이다.
삭제
제15항에 기재된 화학식 VII, VIII, IX, X, XI 또는 XII의 펩타이드 구조물 또는 화학식 VII, VIII, IX, X, XI 또는 XII의 펩타이드 구조물의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하여 이루어지는 고혈압, 심혈관 질환 또는 신장병 치료용 약학적 조성물.
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