ES2911435T3 - Conjugados de polímero-resto de Factor VIII - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende una pluralidad de conjugados, teniendo cada conjugado de uno a tres restos de poli(etilenglicol) unidos covalentemente a un resto de Factor VIII, en donde cada resto de poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio nominal en el intervalo de aproximadamente 20.000 daltons a aproximadamente 85.000 daltons.
Description
DESCRIPCIÓN
Conjugados de polímero-resto de Factor VIII
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a composiciones que comprenden una pluralidad de conjugados que comprenden un resto de Factor VIII (es decir, un resto que tiene actividad de Factor VIII) y un polímero.
Además, la invención se refiere a métodos para sintetizar los conjugados y métodos para tratar pacientes.
Antecedentes de la invención
La hemostasia es el proceso de detener la salida de sangre de un vaso sanguíneo lesionado. Para los mamíferos, así como muchos otros organismos, el proceso hemostático es de importancia crítica para la supervivencia continua. Los defectos en el proceso hemostático pueden dar lugar, por ejemplo, a la incapacidad para formar coágulos sanguíneos de manera eficaz que sirvan para detener la pérdida de sangre después de una lesión vascular. En los seres humanos, las personas que padecen una incapacidad para formar coágulos sanguíneos se denominan hemofílicos. Para los hemofílicos es especialmente preocupante el riesgo letal de que, una vez iniciada la hemorragia, ésta no cese nunca.
Generalmente, los hemofílicos carecen de la capacidad de producir cantidades eficaces de una o más sustancias necesarias para formar coágulos sanguíneos. Por ejemplo, los hemofílicos que padecen hemofilia A (también llamada "hemofilia clásica") tienen una incapacidad para producir niveles eficaces de Factor VIII (también conocido como "factor antihemofílico A", "globulina antihemofílica", y "AHG", por sus siglas en inglés). El Factor VIII es un componente clave de una de varias "cascadas" de reacciones que dan como resultado la formación de coágulos sanguíneos. Crítico para la cascada de reacciones denominada "vía intrínseca", el Factor VIII finalmente influye en la conversión de fibrinógeno en el componente principal de los coágulos sanguíneos, fibrina.
Aunque la vía intrínseca de la formación de coágulos sanguíneos es relativamente compleja, el papel del Factor VIII se puede describir brevemente. En presencia de cantidades relativamente pequeñas de trombina (liberada, por ejemplo, por las células de los tejidos rotos), el Factor VIII se convierte en su forma activada conocida como. Factor VIIIa. El Factor VIIIa (junto con otras sustancias), a su vez, activa otro factor, el Factor X en Factor Xa. Posteriormente, el Factor Xa (junto con otras sustancias) convierte la protrombina en trombina, con el resultado de que se produce una cantidad relativamente grande de trombina a lo largo del tiempo. Cantidades relativamente grandes de trombina convierten de manera eficaz el fibrinógeno en fibrina. La fibrina, a su vez, forma la matriz o red responsable de la formación de coágulos sanguíneos. El papel del Factor VIII en la vía intrínseca de la coagulación de la sangre se muestra esquemáticamente a continuación.
Afectando a uno o dos varones por cada 10.000 nacidos vivos en todas las poblaciones, la hemofilia A puede ser el resultado de una cualquiera de una variedad de mutaciones del gen del Factor VIII, que se encuentra en el cromosoma X. Dependiendo de la mutación particular, la hemofilia A puede manifestarse como grave, moderada o leve. Las personas que padecen las formas más graves de hemofilia A carecen por completo de la capacidad de expresar formas activas del Factor VIII. Clínicamente, las personas afectadas con hemofilia A padecen hemorragia muscular, hemorragia articular, hematomas fáciles y sangrado prolongado de las heridas. La edad media de las personas que padecen hemofilia A sin tratamiento es de veinte años. El tratamiento actual de la hemofilia A implica
la infusión de concentrado de Factor VIII exógeno extraído de plasma humano o preparado mediante técnicas de ADN recombinante. Debido a que estos tratamientos únicamente sirven para complementar la falta de niveles eficaces de Factor VIII, las personas que padecen Factor VIII necesitan inyecciones regulares de concentrado de Factor VIII durante toda su vida.
Están disponibles diversas formas comerciales de concentrados de Factor VIII para proporcionar terapia de reemplazo para pacientes que padecen hemofilia A. Por ejemplo, productos concentrados de Factor VIII derivados de sangre vendidos con las marcas Hemofil® M (Baxter, Deerfield. IL), Koate®-DVI (Bayer, Research Tringle Park, NC), Monarc-M™ (American Red Cross, Washington, D.C.) y Monoclate-P® (Aventis, Bridgewater, NJ). Con respecto a los concentrados de Factor VIII preparados de forma recombinante, los productos comerciales se proporcionan con las marcas Helixate® FS (Aventis, Bridgewater, NJ), Kogenate FS® (Bayer, Research Triangle Park, NC), Recombinate® (Baxter, Deerfield, IL), Advate® (Baxter, Deerfield, IL) y ReFacto® (Wyeth/Genetics Institute, Cambridge, MA).
Generalmente, las fuentes recombinantes de concentrados de Factor VIII se prefieren a las fuentes derivadas de sangre, ya que estas últimas implican el riesgo de transmitir virus y/u otras enfermedades asociadas con la donación de sangre. Si bien las formulaciones basadas en recombinantes evitan estos inconvenientes, el procesamiento de productos basados en recombinante con frecuencia requiere la presencia de determinadas proteínas como la albúmina, que inevitablemente están presentes en la formulación final administrada al paciente. Con frecuencia, los pacientes que reciben dichas formulaciones presentan reacciones alérgicas a estas proteínas extrañas. En cualquier caso, tanto los productos derivados de sangre como los basados en recombinantes tienen la desventaja de la administración repetida.
La PEGilación, o la unión de un derivado de poli(etilenglicol) a una proteína, se han descrito como un medio para reducir la inmunogenicidad, así como un medio para prolongar la semivida de una proteína in vivo. Sin embargo, con respecto al Factor VIII, las experiencias previas con la formación de conjugados de proteína-polímero han demostrado tener poco valor predictivo frente al acoplamiento del polímero con el Factor VIII. Véase la patente de EE.UU. n.° 4.970.300.
A pesar de estas dificultades, se han descrito intentos de preparar composiciones satisfactorias de conjugados de determinados polímeros con el Factor VIII. Por ejemplo, la Patente de EE. UU. n.° 4.970.300 a la que se hace referencia anteriormente describe la PEGilación del Factor VIII usando un derivado de poli(etilenglicol) específico que tiene un peso molecular que se encuentra en el intervalo de aproximadamente 500 a 5.000. Además, la Patente de EE. UU. N.° 6.048.720 describe una protección eficaz contra la degradación en un ambiente in vitro cuando se conjugan cuatro o cinco cadenas de monometoxi poli(etilenglicol) con el Factor VIII.
Ninguno de estos conjugados descritos, sin embargo, ha demostrado abordar satisfactoriamente los problemas asociados con las terapias actuales basadas en el Factor VIII. Por ejemplo, conjugados compuestos de polímeros relativamente pequeños (por ejemplo, de aproximadamente 5.000 daltons o menos) puede no proporcionar adecuadamente una semivida in vivo prolongada y/o una respuesta inmunitaria suficientemente reducida. Además, es más probable que los conjugados que tienen muchos polímeros individuales unidos al Factor VIII tengan una actividad reducida como resultado de los sitios de bloqueo del uno o más polímeros necesarios para la actividad. Por tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de proporcionar conjugados adicionales entre polímeros solubles en agua y restos que tengan actividad de Factor VIII. Por lo tanto, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden dichos conjugados, así como métodos relacionados, como se describe en el presente documento, que se cree que son nuevos y completamente sin sugerir por la técnica.
Sumario de la invención
En consecuencia, es un objeto principal de esta invención proporcionar una composición que comprenda una pluralidad de conjugados, teniendo cada uno de ellos de uno a tres polímeros solubles en agua unidos covalentemente a un resto de Factor VIII, en donde cada polímero soluble en agua tiene preferentemente un peso molecular medio nominal en el intervalo de aproximadamente 20.000 daltons a aproximadamente 85.000 daltons. En la invención, cada uno de los polímeros solubles en agua es un poli(etilenglicol).
La composición puede comprender una pluralidad de conjugados de resto de Factor VIII monoPEGilado.
Es un objeto adicional más de la invención proporcionar un método para preparar conjugados poliméricos que comprende las etapas de poner en contacto un reactivo de poli(etilenglicol) activado con un resto de Factor VIII en condiciones suficientes para dar como resultado una pluralidad de conjugados, teniendo cada uno de ellos de uno a tres restos de poli(etilenglicol) unidos covalentemente a un resto de Factor VIII, en donde el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio nominal en el intervalo de aproximadamente 20.000 daltons a aproximadamente 85.000 daltons.
Es un objeto adicional de la invención proporcionar una composición para su uso en el tratamiento de un paciente que necesita terapia con Factor VIII, que comprende la etapa de administrar al paciente una composición como se describe en el presente documento, en donde la composición contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los conjugados.
Es un objeto adicional más de la invención proporcionar un método para preparar un conjugado de poli(etilenglicol)-resto de Factor VIII que comprende la etapa de poner en contacto, en condiciones de conjugación, un resto de Factor VIII con un reactivo de poli(etilenglicol) que tiene un grupo reactivo adecuado para la reacción con el resto de Factor VIII y un peso molecular medio nominal en el intervalo de aproximadamente 20.000 daltons a aproximadamente 85.000 daltons.
Objetos, ventajas y características novedosas adicionales de la invención se expondrán en la descripción a continuación, y en parte, resultará evidente para los expertos en la materia al leer lo siguiente, o puede aprenderse mediante la puesta en práctica de la invención.
Entonces, en una realización, se proporciona una composición que comprende una pluralidad de conjugados, teniendo cada uno de ellos de uno a tres polímeros solubles en agua unidos covalentemente a un resto de Factor VIII, en donde cada polímero soluble en agua tiene un peso molecular medio nominal en el intervalo de aproximadamente 20.000 daltons a aproximadamente 85.000 daltons. Aunque se puede usar cualquier resto de Factor VIII, se prefiere que las composiciones comprendan Factor VIII per se (como se describe en, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.757.006), Factor VIIIa (es decir., la forma activada del Factor VIII que se produce cuando el Factor VIII se pone en contacto con cantidades relativamente pequeñas de trombina), Factor VIII: vWF (es decir., Factor VIII unido al Factor de von Willebrand), y/o versiones truncadas del Factor VIII tal como el Factor VIII con dominio B eliminado (como se describe en, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.868.112).
El uno o más polímeros de poli(etilenglicol) se usa como el polímero en la presente invención.
Los conjugados descritos en el presente documento reducen ventajosamente la inmunogenicidad, un problema al que se enfrentan muchos hemofílicos tratados con fuentes exógenas de Factor VIII. Además, los presentes conjugados requieren una menor frecuencia de dosificación en comparación con las composiciones de Factor VIII que carecen de conjugados. Al reducir la frecuencia de dosificación, los conjugados disminuyen ventajosamente el número de inyecciones dolorosas que los hemofílicos deben soportar para proporcionar niveles sostenidos de un agente que tiene actividad de Factor VIII.
En otra realización, se proporciona un método para preparar un conjugado. El método comprende la etapa de poner en contacto uno o más polímeros solubles en agua activados (es decir,, un reactivo polimérico) que tiene un peso molecular medio nominal en el intervalo de aproximadamente 20.000 daltons a aproximadamente 85.000 daltons con un resto de Factor VIII. La activación del polímero soluble en agua se puede lograr mediante cualquier método conocido en la técnica siempre que el polímero resultante, en las condiciones adecuadas de pH, temperatura, etc., forme un enlace covalente de manera que el resto de Factor VIII se una covalentemente al polímero. Poner en contacto uno o más polímeros solubles en agua activados con el resto de Factor VIII se lleva a cabo en las condiciones necesarias para que el polímero soluble en agua activado forme un enlace covalente en el sitio deseado en el resto. El método da como resultado una pluralidad de conjugados, teniendo cada uno de ellos de uno a tres polímeros solubles en agua unidos covalentemente al resto de Factor VIII. En algunos casos, el conjugado puede comprender un solo polímero unido a dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, o más restos de Factor VIII. Opcionalmente, la composición resultante se puede procesar adicionalmente para eliminar especies no deseadas tales como, por ejemplo, conjugados que tienen un número indeseado de polímeros. Para eliminar estas especies indeseadas, se pueden usar técnicas de purificación tales como cromatografía de exclusión por tamaño.
En otra realización más de la invención, se proporcionan composiciones que comprenden un conjugado de la invención en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones abarcan todo tipo de formulaciones y en particular aquellas que son adecuadas para inyección tales como polvos que se pueden reconstituir, así como líquidos (por ejemplo, suspensiones y soluciones).
Se describe un método para administrar el conjugado. El método de administración comprende la etapa de administrar al paciente una composición como se describe en el presente documento, en donde la composición contiene una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado. Normalmente, la etapa de administrar la composición que contiene el conjugado se efectúa mediante inyección (por ejemplo, inyección intramuscular, inyección intravenosa, inyección subcutánea, etc.).
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es un gráfico de SEC correspondiente a la mezcla de reacción formada tras la PEGilación del Factor VIII con dominio B eliminado con mPEG-SPA, 30 K, tal como se describe en el ejemplo 4.
La figura 2 es un gráfico de SEC correspondiente al conjugado de PEG-Factor VIII con dominio B eliminado
purificado preparado conjugando la proteína con mPEG-SPA, 30 K, tal como se describe en el ejemplo 4.
La figura 3 es un gráfico de SEC correspondiente a la mezcla de reacción formada tras la PEGilación del Factor VIII con dominio B eliminado con mPEG-MAL, 20 K, tal como se describe en el ejemplo 5. Tal como se puede observar, el rendimiento del producto monoPEGilado fue aproximadamente del 33 %.
La figura 4 es un gráfico de SEC correspondiente al conjugado de PEG-Factor VIII con dominio B eliminado purificado preparado conjugando la proteína con mPEG-MAL, 20 K, tal como se describe en el ejemplo 5. El conjugado purificado era ~94 % de monómero de PEG.
La figura 5 es un gráfico de SEC correspondiente a la mezcla de reacción formada tras la PEGilación del Factor VIII con dominio B eliminado con mPEG-SMB, 30 K, tal como se describe en el ejemplo 6. El rendimiento de la proteína monoPEGilada (1-mero) fue de aproximadamente el 41 %.
Descripción detallada de la invención
Cabe señalar que, como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "uno/a", y "el/la" incluyen las referencias plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un polímero" incluye un solo polímero así como dos o más polímeros iguales o diferentes, la referencia a "un excipiente opcional" se refiere a un solo excipiente opcional así como a dos o más excipientes opcionales iguales o diferentes, y similares.
Al describir y reivindicar la presente invención, se usará la siguiente terminología según las definiciones descritas a continuación.
"PEG", "polietilenglicol" y "poli(etilenglicol)" como se usa en el presente documento, se utilizan indistintamente y pretenden abarcar cualquier poli(óxido de etileno) soluble en agua. Normalmente, los PEG para su uso según la invención comprenden la siguiente estructura "-(OCH2CH2)n-" donde (n) es 450 a 1.900 Como se usa en el presente documento, PEG también incluye CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-" y "-(OCH2CH2)nO-", dependiendo de si los oxígenos terminales se han desplazado o no. A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, debe recordarse que el término "PEG" incluye estructuras que tienen varios grupos terminales o de "protección con caperuza", etc. El término "PEG" también significa un polímero que contiene una mayoría, es decir, mayor del 50 %, de subunidades -OCH2CH2- repetidas. Con respecto a las formas específicas, el PEG puede tomar cualquier número de una variedad de pesos moleculares, así como estructuras o geometrías tales como "ramificada", "lineal", "bifurcada", "multifuncional", y similares, que se describirá con mayor detalle a continuación.
Las expresiones "protegido finalmente con caperuza" y "protegido terminalmente con caperuza" se usan en el presente documento indistintamente para referirse a un punto final o terminal de un polímero que tiene un resto de protección final con caperuza. Normalmente, aunque no necesariamente, el resto de protección final con caperuza comprende un grupo hidroxi o alcoxi C1-20, más preferentemente un grupo alcoxi C1-10 y aún más preferentemente un grupo alcoxi C1-5. Por tanto, ejemplos de fracciones de protección final con caperuza incluyen alcoxi (p. ej., metoxi, etoxi y benciloxi), así como arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo y similares. Debe recordarse que el resto de protección final con caperuza puede incluir uno o más átomos del monómero terminal en el polímero [por.ejemplo., el resto de protección final "metoxi" en CH3(OCH2CH2)n-]. Además, se prevén formas saturadas, insaturadas, sustituidas y sin sustituir de cada uno de los anteriores. Por otra parte, el grupo de protección final con caperuza también puede ser un silano. El grupo de protección final con caperuza puede comprender ventajosamente un marcador detectable. Cuando el polímero tiene un grupo de protección final con caperuza que comprende un marcador detectable, la cantidad o ubicación del polímero y/o el resto (p. ej., agente activo) al que se acopla el polímero se puede determinar utilizando un detector adecuado. Tales marcadores incluyen, sin limitación, sustancias fluorescentes, sustancias quimioluminiscentes, restos usados en marcadores de enzimas, sustancias colorimétricas (por ejemplo., colorantes), iones metálicos, restos radioactivos y similares. Los detectores adecuados incluyen fotómetros, películas, espectrómetros, y similares. El grupo de protección final con caperuza también puede comprender ventajosamente un fosfolípido. Cuando el polímero tiene un grupo de protección final con caperuza que comprende un fosfolípido, se imparten propiedades exclusivas al polímero y al conjugado resultante. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen, sin limitación, los seleccionados de la clase de fosfolípidos denominados fosfatidilcolinas. Los fosfolípidos específicos incluyen, sin limitación, los seleccionados del grupo que consiste en dilauroilfosfatidilcolina, dioleilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, disteroilfosfatidilcolina, behenoilfosfatidilcolina, araquidoilfosfatidilcolina y lecitina.
"De origen no natural" con respecto a un polímero como se describe en el presente documento, significa un polímero que en su totalidad no se encuentra en la naturaleza. Un polímero de origen no natural de la invención puede contener, sin embargo, uno o más monómeros o segmentos de monómeros que son de origen natural, siempre que la estructura global del polímero no se encuentre en la naturaleza.
La expresión "soluble en agua" como en un "polímero soluble en agua" es cualquier polímero que sea soluble en agua a temperatura ambiente. Normalmente, un polímero soluble en agua transmitirá al menos aproximadamente el
75 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 95 %, de la luz transmitida por la misma solución después del filtrado. Basándose en el peso, un polímero soluble en agua será preferentemente al menos aproximadamente un 35 % (en peso) soluble en agua, más preferentemente al menos aproximadamente un 50 % (en peso) soluble en agua, aún más preferentemente aproximadamente un 70 % (en peso) soluble en agua, y aún más preferentemente aproximadamente un 85 % (en peso) soluble en agua. Lo más preferido, sin embargo, es que el polímero soluble en agua sea aproximadamente el 95 % (en peso) soluble en agua o completamente soluble en agua.
"Peso molecular medio nominal" en el contexto de un polímero de origen no natural soluble en agua, tal como PEG, se refiere al peso molecular medio en masa del polímero, generalmente determinado por cromatografía de exclusión por tamaño, MALDI (desorción/ionización láser asistida por matriz), técnicas de dispersión de luz o determinación de la velocidad intrínseca en 1,2,4-tricloiobenceno. Los polímeros son normalmente polidispersos, poseyendo bajos valores de polidispersidad preferentemente menor que aproximadamente 1,2, más preferentemente menor que aproximadamente 1,15, incluso más preferentemente menor de aproximadamente 1,10, incluso aún más preferentemente menor de aproximadamente 1,05, y lo más preferentemente menor de aproximadamente 1,03. El término "activo" o "activado" cuando se usa junto con un grupo funcional particular, se refiere a un grupo funcional reactivo que reacciona fácilmente con un electrófilo o un nucleófilo en otra molécula. Esto contrasta con los grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones de reacción duras para reaccionar (es decir, un grupo "no reactivo" o "inerte").
Como se usa en el presente documento, la expresión "grupo funcional" o cualquier sinónimo de la misma pretende abarcar formas protegidas del mismo así como formas no protegidas.
Los términos "enlace" o "enlazador" se usan en el presente documento para referirse a un átomo o una colección de átomos que se usan opcionalmente para unir restos interconectados, tal como un extremo de un segmento de polímero y un resto de Factor VIII o un electrófilo o nucleófilo de un resto de Factor VIII. Los enlazadores de la invención pueden ser hidrolíticamente estables o pueden incluir un enlace fisiológicamente hidrolizable o enzimáticamente degradable.
"Alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo, normalmente que varía entre aproximadamente 1 y 15 átomos de longitud. Dichas cadenas de hidrocarburo están preferentemente pero no necesariamente saturadas y pueden ser de cadena lineal o ramificada, aunque normalmente se prefiere de cadena lineal. Los grupos alquilo ilustrativos incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, 1 -metilbutilo, 1-etilpropilo, 3-metilpentilo y similares. Como se usa en el presente documento, "alquilo" incluye cicloalquilo así como alquilo que contiene cicloalquileno.
"Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, y puede ser de cadena lineal o ramificada, como se ejemplifica por metilo, etilo, n-butilo, /-butilo y f-butilo.
"Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo cíclico saturado o insaturado, incluyendo compuestos puenteados, fusionados o cíclicos, preferentemente compuesto de 3 a aproximadamente 12 átomos de carbono, más preferentemente de 3 a aproximadamente 8 átomos de carbono. "Cicloalquileno" se refiere a un grupo cicloalquilo que se inserta en una cadena de alquilo mediante la unión de la cadena en cualquiera de los dos carbonos del sistema de anillo cíclico.
"Alcoxi" se refiere a un grupo -O-R, en donde R es alquilo o alquilo sustituido, preferentemente alquilo C1-6 (por ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, etc.).
El término "sustituido" como en, por ejemplo, "alquilo sustituido", se refiere a un resto (p.ej., un grupo alquilo) sustituido con uno o más sustituyentes que no interfieren, tales como, pero sin limitación: alquilo, cicloalquilo C3-8 , por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo y similares; halo, por ejemplo, flúor, cloro, bromo y yodo; ciano; alcoxi, fenilo inferior; fenilo sustituido; y similares. "Arilo sustituido" es arilo que tiene uno o más grupos que no interfieren como sustituyentes. Para sustituciones en un anillo de fenilo, los sustituyentes pueden estar en cualquier orientación (es decir,, orto, meta, o para).
Los "sustituyentes que no interfieren" son aquellos grupos que, cuando están presente en una molécula, son normalmente no reactivos con otros grupos funcionales que se encuentran en la molécula.
"Arilo" significa uno o más anillos aromáticos, cada uno de 5 o 6 átomos de carbono centrales. Arilo incluye múltiples anillos de arilo que pueden estar fusionados, tal como en naftilo o sin fusionar, tal como en bifenilo. Los anillos de arilo también pueden estar fusionados o sin fusionar con uno o más anillos de hidrocarburos cíclicos, heteroarílicos o heterocíclicos. Como se usa en el presente documento, "arilo" incluye heteroarilo.
"Heteroarilo" es un grupo arilo que contiene de uno a cuatro heteroátomos, preferentemente azufre, oxígeno, nitrógeno o una combinación de los mismos. Los anillos heteroarílicos también pueden fusionarse con uno o más anillos de hidrocarburos cíclicos, heterocíclicos, arílicos o heteroarílicos.
"Heterocido" o "heterocídico" significa uno o más anillos de 5-12 átomos, preferentemente 5-7 átomos, con o sin insaturación o carácter aromático y que tiene al menos un átomo en el anillo que no es un carbono. Los heteroátomos preferidos incluyen azufre, oxígeno y nitrógeno.
"Heteroarilo sustituido" es heteroarilo que tiene uno o más grupos que no interfieren como sustituyentes.
"Heterociclo sustituido" es un heterociclo que tiene una o más cadenas laterales formadas a partir de sustituyentes que no interfieren.
"Electrófilo" y "grupo electrófilo" se refieren a un ion o átomo o colección de átomos, que pueden ser iónico, que tiene un centro electrófilo, es decir, un centro que busca electrones, capaz de reaccionar con un nucleófilo.
"Nucleófilo y "grupo nucleofílico" se refiere a un ion o átomo o colección de átomos que pueden ser iónicos que tienen un centro nucleofílico, es decir, un centro que busca un centro electrófilo o con un electrófilo.
Un enlace "fisiológicamente escindible" o "hidrolizable" o "degradable" es un enlace relativamente débil que reacciona con el agua (es decir, se hidroliza) en condiciones fisiológicas. Se prefieren los enlaces que tienen una semivida de hidrólisis a pH 8, a 25 °C de menos de aproximadamente 30 minutos. La tendencia de un enlace a hidrolizarse en agua dependerá no solo del tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales, sino también de los sustituyentes unidos a estos átomos centrales. Los enlaces débiles o hidrolíticamente inestables apropiados incluyen, pero sin limitación, éster de carboxilato, éster de fosfato, anhídridos, acetales, cetales, aciloxialquilo éter, iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos.
Un "enlace enzimáticamente degradable" significa un enlace que está sujeto a degradación por una o más enzimas. Un enlace o unión "hidrolíticamente estable" se refiere a un enlace químico, normalmente un enlace covalente, que es sustancialmente estable en agua, es decir, no experimenta hidrólisis en condiciones fisiológicas en un grado apreciable durante un período prolongado de tiempo. Los ejemplos de enlaces hidrolíticamente estables incluyen, aunque sin limitación, los siguientes: enlaces carbono-carbono (por ejemplo, en cadenas alifáticas), éteres, amidas, uretanos y similares. Generalmente, un enlace hidrolíticamente estable es uno que presenta una tasa de hidrólisis de menos de aproximadamente 1-2 % por día en condiciones fisiológicas. Las tasas de hidrólisis de enlaces químicos representativos se pueden encontrar en la mayoría de los libros de texto de química convencionales.
Las expresiones "excipiente o transportador farmacéuticamente aceptable" se refieren a un excipiente que puede incluirse opcionalmente en las composiciones de la invención y que no causa efectos toxicológicos adversos significativos al paciente. Las expresiones "cantidad farmacológicamente eficaz", "cantidad fisiológicamente eficaz", y "cantidad terapéuticamente eficaz" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a la cantidad de un conjugado de polímero-resto de Factor VIII que se necesita para proporcionar un nivel deseado del conjugado (o resto de Factor VIII no conjugado correspondiente) en el torrente sanguíneo o en el tejido diana. La cantidad exacta dependerá de numerosos factores, por ejemplo, el resto de Factor VIII concreto, los componentes y características físicas de la composición terapéutica, población de pacientes prevista, consideraciones de pacientes individuales, y similares, y puede determinarse fácilmente por un experto en la materia, basándose en la información proporcionada en el presente documento.
"Multifuncional" significa un polímero que tiene 3 o más grupos funcionales que se encuentran en el mismo, donde los grupos funcionales pueden ser iguales o diferentes. Los reactivos poliméricos multifuncionales de la invención contendrán normalmente de aproximadamente 3-100 grupos funcionales, o de 3-50 grupos funcionales, o de 3-25 grupos funcionales, o de 3-15 grupos funcionales, o de 3 a 10 grupos funcionales, o contendrán 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 grupos funcionales en la cadena principal polimérica.
La expresión "resto de Factor VIII", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto que tiene actividad de Factor VIII. El resto de Factor VIII también tendrá al menos un grupo electrófilo o un grupo nucleófilo adecuado para reaccionar con un reactivo polimérico. Normalmente, aunque no necesariamente, el resto de Factor VIII es una proteína. Además, la expresión "resto de Factor VIII" abarca tanto el resto de Factor VIII antes de la conjugación como el residuo del resto de Factor VIII después de la conjugación. Como se explicará con más detalle a continuación, un experto normal en la materia puede determinar si cualquier resto dado tiene actividad de Factor VIII. El término "paciente", se refiere a un organismo vivo que padece o es propenso a padecer una afección que puede prevenirse o tratarse mediante la administración de un agente activo (p. ej., un conjugado), e incluye tanto a seres humanos como a animales.
"Opcional" u "opcionalmente" significa que la circunstancia descrita a continuación puede producirse o no, de modo que la descripción incluye casos en los que se produce la circunstancia y casos en los que no.
Los restos de aminoácidos en los péptidos se abrevian de la siguiente manera: fenilalanina es Phe o F; leucina es
Leu o L; isoleucina es Ile o I; metionina es Met o M; valina es Val o V; serina es Ser o S; prolina es Pro o P; treonina es Thr o T; alanina es Ala o A; tirosina es Tyr o Y; histidina es His o H; glutamina es Gln o Q; asparagina es Asn o N; lisina es Lys o K; ácido aspártico es Asp o D; ácido glutámico es Glu o E; cisteína es Cys o C; triptófano es Trp o W; arginina es Arg o R; y glicina es Gly o G.
Volviendo a una primera realización de la invención entonces, se proporciona una composición que comprende una pluralidad de conjugados, teniendo cada uno de ellos de uno a tres polímeros solubles en agua unidos covalentemente a un resto de Factor VIII, en donde cada uno de los polímeros solubles en agua tiene preferentemente un peso molecular medio nominal en el intervalo de aproximadamente 20.000 daltons a aproximadamente 85.000 daltons.
El Factor VIII natural es una glucoproteína monocatenaria de 2.351 aminoácidos que se organiza estructuralmente como A1-A2-B-A3-C1-C2. La secuencia de 2.351 aminoácidos expresada se proporciona como la EQ. ID. NO: 1. Cuando el polipéptido expresado se traslada a la luz del retículo endoplásmico, sin embargo, se escinde una secuencia señal de 19 aminoácidos, dando como resultado una segunda secuencia. Esta segunda secuencia, en el presente documento proporcionada como la SEQ. ID. NO: 2, que carece de los 19 aminoácidos principales se utiliza convencionalmente por los investigadores para asignar una ubicación numérica (por ejemplo, Arg372) a un resto de aminoácido dado del Factor VIII. Por tanto, a menos que se indique específicamente, todas las asignaciones de una ubicación numérica de un resto de aminoácido como se proporciona en el presente documento se basan en la SEQ. ID. NO: 2.
En presencia de cantidades relativamente pequeñas de trombina, el Factor VIII es escindido por la trombina en Arg372, Arg740y Arg1689 para producir Factor VIIIa. El Factor VIIIa es un heterotrímero compuesto por la subunidad A1 unida (a través de un ion de cobre) a la cadena ligera escindida por trombina A3-C1-C2 y la subunidad A2 libre unida a A1 mediante interacciones iónicas. Se apreciará que un resto de Factor VIII no se limita a formas meramente "activas" de Factor VIII (p. ej., Factor VIIIa) y que la expresión "resto de Factor VIII" abarca formas "precursoras" así como otras sustancias que tienen un efecto procoagulante similar.
Para cualquier resto dado, es posible determinar si ese resto tiene actividad de Factor VIII. Por ejemplo, varias líneas de animales se han criado intencionalmente con la mutación genética para la hemofilia, de modo que un animal producido a partir de dicha línea tiene niveles muy bajos e insuficientes de Factor VIII. Dichas líneas están disponibles en una variedad de fuentes tales como, sin limitación, la Division of Laboratories and Research, New York Department of Public Health, Albany, NY y el Department of Pathology, Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, NC. Ambas fuentes, por ejemplo, proporcionan perros que padecen hemofilia A canina. Para probar la actividad del Factor VIII de cualquier resto dado en cuestión, el resto se inyecta en el animal enfermo, se realiza un pequeño corte y se compara el tiempo de sangrado en comparación con un control sano. Otro método útil para determinar la actividad del Factor VIII es determinar la actividad cofactor y procoagulante. Véase, por ejemplo, Mertens et al. (1993) Brit J. Haematol. 85:133-42. También se pueden usar otros métodos conocidos por los expertos en la materia para determinar si un resto dado tiene actividad de Factor VIII. Dichos métodos son útiles para determinar la actividad del Factor VIII tanto del propio resto (y por lo tanto se puede usar como un "resto de Factor VIII) como del correspondiente conjugado de polímero-resto.
Los ejemplos no limitantes de restos de Factor VIII incluyen los siguientes: Factor VIII; Factor VIIIa; Factor VIII:C; Factor VIII:vWF; Factor VIII con dominio B eliminado (y otras versiones truncadas del Factor VIII); proteínas híbridas, tal como las descritas en la Patente de los EE.UU. n.° 6.158.888; proteínas glucosiladas que tienen actividad de Factor VIII, tal como las descritas en la publicación de solicitud de patente de EE.UU N.° US2003/0077752; y miméticos peptídicos que tienen actividad de Factor VIII. Las versiones preferidas del Factor VIII truncado (abarcadas por la expresión "Factor VIII con dominio B eliminado) corresponden a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del Factor VIII humano (SEQ. ID. NO:1) que tiene una eliminación correspondiente a al menos 581 aminoácidos dentro de la región entre Arg759 y Ser170 , más preferentemente en donde la eliminación corresponde a una de las regiones entre Pro1000 y Asp 582, la región entre Thr778 y Pro1659, y la región entre Thr778 y Glu169. También pueden servir como resto de Factor VIII fragmentos biológicamente activos, variantes por eliminación, variantes por sustitución o variantes por adición de cualquiera de los anteriores que mantienen al menos algún grado de actividad de Factor VIII.
El resto que tiene actividad de Factor VIII se puede modificar ventajosamente para incluir uno o más restos de aminoácidos tales como, por ejemplo, lisina, cisteína y/o arginina, para proporcionar una fácil unión del polímero a un átomo en la cadena lateral del aminoácido. Las técnicas para añadir restos de aminoácidos son bien conocidas por los expertos en la materia. Se hace referencia a J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4a Ed. (Nueva York: Wiley-Interscience, 1992).
El resto de Factor VIII se puede obtener de fuentes derivadas de la sangre. Por ejemplo, el Factor VIII se puede fraccionar a partir de plasma humano utilizando técnicas de precipitación y centrifugación conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Wickerhauser (1976) Transfusion 16(4):345-350 y Slichter et al. (1976) Transfusion 16(6):616-626. El Factor VIII también se puede aislar de granulocitos humanos. Véase Szmitkoski et al. (1977) Haematologia (Budap.) 11(1-2):177-187.
Además, el resto de Factor VIII también se puede obtener a partir de métodos recombinantes. En resumen, los métodos recombinantes implican la construcción del ácido nucleico que codifica el polipéptido o fragmento deseados, clonar el ácido nucleico en un vector de expresión, transformar una célula hospedadora (p. ej., bacterias, levadura o célula de mamífero, tal como células de ovario de hámster chino o células de riñón de cría de hámster), y expresar el ácido nucleico para producir el polipéptido o fragmento deseados Los métodos para producir y expresar polipéptidos recombinantes in vitro y en células hospedadoras procariotas y eucariotas son conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 4.868.122.
Para facilitar la identificación y purificación del polipéptido recombinante, las secuencias del ácido nucleico que codifican una etiqueta de epítopo u otra secuencia de unión por afinidad pueden insertarse o añadirse en marco con la secuencia codificante, produciendo así una proteína de fusión compuesta por el polipéptido deseado y un polipéptido adecuado para la unión. Las proteínas de fusión se pueden identificar y purificar pasando primero una mezcla que contiene la proteína de fusión a través de una columna de afinidad que lleva restos de unión (p. ej., anticuerpos) dirigidos contra la etiqueta del epítopo u otra secuencia de unión en las proteínas de fusión, uniendo así la proteína de fusión dentro de la columna. Posteriormente, la proteína de fusión se puede recuperar lavando la columna con la solución adecuada (p. ej., ácido) para liberar la proteína de fusión unida. El polipéptido recombinante también se puede identificar y purificar lisando las células hospedadoras, separando el polipéptido, por ejemplo, por cromatografía de exclusión por tamaño, y recogiendo el polipéptido. Estos y otros métodos para identificar y purificar polipéptidos recombinantes son conocidos por los expertos en la materia.
Las composiciones de la invención pueden comprender una pluralidad de conjugados, cada conjugado compuesto por el mismo resto de Factor VIII (es decir, dentro de la composición completa, solamente se encuentra un tipo de resto de Factor VIII). Además, la composición puede comprender una pluralidad de conjugados en donde cualquier conjugado dado se compone de un resto seleccionado del grupo que consiste en dos o más restos de Factor VIII diferentes (es decir, dentro de toda la composición, se encuentran dos o más restos de Factor VIII diferentes). De manera óptima, sin embargo, sustancialmente la totalidad de la pluralidad de conjugados en la composición (p. ej., el 85 % o más de la pluralidad de conjugados en la composición) están compuestos cada uno por el mismo resto de Factor VIII.
Por otra parte, se prefiere que la composición que contiene los conjugados esté libre o sustancialmente libre de albúmina. También se prefiere que la composición esté libre o sustancialmente libre de proteínas que no tengan actividad de Factor VIII. Por tanto, se prefiere que la composición esté un 85 %, más preferentemente un 95 %, y lo más preferentemente un 99 % libre de albúmina. Adicionalmente, se prefiere que la composición esté un 85 %, más preferentemente un 95 %, y lo más preferentemente un 99 % libre de cualquier proteína que no tenga actividad de Factor VIII.
Como se analiza anteriormente, cada conjugado comprende un resto de Factor VIII unido a un polímero soluble en agua. Con respecto al polímero soluble en agua, el polímero soluble en agua no es peptídico, no es tóxico, no es de origen natural y es biocompatible. Con respecto a la biocompatibilidad, una sustancia se considera biocompatible si los efectos beneficiosos asociados con el uso de la sustancia sola o con otra sustancia (p. ej., un agente activo como un resto de Factor VIII) en relación con los tejidos vivos (por.ejemplo, administración a un paciente) supera cualquier efecto nocivo evaluado por un facultativo, por ejemplo, un médico. Con respecto a la no inmunogenicidad, una sustancia se considera no inmunogénica si el uso previsto de la sustancia in vivo no produce una respuesta inmunitaria no deseada (por ejemplo, la formación de anticuerpos) o, si se produce una respuesta inmunitaria, que dicha respuesta no se considere clínicamente significativa o importante según la evaluación de un facultativo. Se prefiere particularmente que el polímero soluble en agua sea biocompatible y no inmunogénico.
Además, el polímero se caracteriza normalmente por tener de 2 a aproximadamente 300 extremos. El polímero es polietilenglicol (PEG)
El polímero no se limita a una estructura particular y puede ser lineal (por ejemplo, PEG alcoxi o PEG bifuncional), ramificado o de múltiples brazos (por ejemplo, PEG bifurcado o PEG unido a un núcleo de poliol), dendrítico o con enlaces degradables.
Normalmente, El PEG se activa con un grupo activador apropiado para acoplarse a un sitio deseado en el resto de Factor VIII. Un reactivo polimérico activado poseerá un grupo reactivo para reaccionar con el resto de Factor VIII. Los reactivos poliméricos representativos y los métodos para conjugar estos polímeros con un resto activo se conocen en la técnica y se describen con más detalle en Zalipsky, S., et al., "Use of Functiarialized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, Nueva York (1992), y en Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews16:-157-182.
Normalmente, el peso molecular promedio nominal de cualquier polímero dado en el conjugado está en el intervalo de aproximadamente 20.000 daltons a aproximadamente 85.000 daltons, y en el intervalo de aproximadamente 53.o0o daltons a aproximadamente 85.000 daltons.
Los pesos moleculares promedio nominales ilustrativos para el segmento de polímero soluble en agua incluyen aproximadamente 20.000 daltons, aproximadamente 22.500 daltons, aproximadamente 25.000 daltons, aproximadamente 30.000 daltons, aproximadamente 40.000 daltons, aproximadamente 50.000 daltons, aproximadamente 60.000 daltons y aproximadamente 75.000 daltons.
Los PEG normalmente comprenderán una serie de monómeros (OCH2CH2). Como se usa a lo largo de la descripción, el número de unidades repetidas se identifica con el subíndice "n" en "(OCH2CH2V "Por lo tanto, el valor de (n) normalmente se encuentra dentro de uno o más de los siguientes intervalos: de aproximadamente 450 a aproximadamente 1.900 y de aproximadamente 1.200 a aproximadamente 1.900. Para cualquier polímero dado en el que se conoce el peso molecular, es posible determinar el número de unidades repetidas (es decir, "n") dividiendo el peso molecular total del polímero por el peso molecular de la unidad repetida.
Un polímero particularmente preferido para su uso en la invención es un polímero protegido con caperuza, es decir, un polímero que tiene al menos un extremo protegido con caperuza con un grupo relativamente inerte, tal como un grupo alcoxi C1-6 inferior. Se prefiere usar un metoxi-PEG (comúnmente conocido como mPEG), que es una forma lineal de PEG en donde un extremo del polímero es un grupo metoxi(-OCHa), mientras que el otro extremo es un hidroxilo u otro grupo funcional que puede modificarse químicamente de manera opcional.
En una forma útil en la presente invención, el PEG libre o sin unir es un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo:
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)m-CH2CH2-OH,
en donde (m') normalmente varía entre
El polímero anterior, alfa, omega-dihidroxilpoli(etilenglicol), puede representarse en forma abreviada como HO-PEG-OH donde se entiende que el símbolo -PEG- puede representar la siguiente unidad estructural:
-CH2CH2O-(CH2CH2O)m-CH2CH2-,
en donde (m') es como se define anteriormente.
Otro tipo de PEG útil en la presente invención es metoxi-PEG-OH, o mPEG en resumen, en el que un término es el grupo metoxi relativamente inerte, mientras que el otro extremo es un grupo hidroxilo. La estructura de mPEG se proporciona a continuación.
CHaO-CH2CH2O-(CH2CH2O)m-CH2CH2-OH
en donde (m') es como se describe anteriormente.
También se pueden utilizar moléculas de PEG con múltiples brazos o ramificadas, tal como se describe en la patente de los EE.u U. n.° 5.932.462, como polímero de PEG. Por ejemplo, PEG puede tener la estructura:
polya— P
R"— C—
polyb— Q
en donde:
polia y polib son cadenas principales de PEG (ya sean iguales o diferentes), tales como metoxi poli(etilenglicol); R" es un resto no reactivo, tal como H, metilo o una cadena principal de PEG; y
P y Q son enlaces no reactivos. En una realización preferida, el polímero de PEG ramificado es lisina bisustituida con metoxi poli(etilenglicol). Dependiendo del resto de Factor VIII específico utilizado, el grupo funcional éster reactivo de la lisina bisustituida puede modificarse adicionalmente para formar un grupo funcional adecuado para la reacción con el grupo diana dentro del resto de Factor VIII.
Estos polímeros pueden ser lineales o pueden estar en cualquiera de las formas descritas anteriormente.
Además, el PEG puede comprender un PEG bifurcado. Un ejemplo de PEG bifurcado está representado por la siguiente estructura:
en donde: X es un resto espaciador de uno o más átomos y cada Z es un grupo terminal activado unido a CH por una cadena de átomos de longitud definida. WO1999045964, divulga varias estructuras de PEG bifurcado que se pueden usar en la presente invención. La cadena de átomos que une los grupos funcionales Z al átomo de carbono de ramificación sirve como grupo de anclaje y puede comprender, por ejemplo, cadenas de alquilo, cadenas de éter, cadenas de éster, cadenas de amida y combinaciones de las mismas.
El polímero de PEG puede comprender una molécula de PEG colgante que tiene grupos reactivos, tales como carboxilo, unido covalentemente a lo largo del PEG en lugar de al final de la cadena de PEG. Los grupos reactivos colgantes se pueden unir al PEG directamente o a través de un resto espaciador, como un grupo alquileno.
Además de las formas de PEG descritas anteriormente, el polímero también se puede preparar con uno o más enlaces débiles o degradables en el polímero, incluyendo cualquiera de los polímeros descritos anteriormente. Por ejemplo, el PEG se puede preparar con enlaces éster en el polímero que están sujetos a hidrólisis. Como se muestra a continuación, esta hidrólisis da como resultado la escisión del polímero en fragmentos de menor peso molecular:
-PEG-CO2-PEG- H2O ^ -PEG-CO2H HO-PEG-Otros enlaces hidrolíticamente degradables, útiles como un enlace degradable dentro de una cadena principal de polímero, incluyen: enlaces de carbonato; enlaces imina resultantes, por ejemplo, de la reacción de una amina y un aldehído (véase, por ejemplo, Ouchi et al. (1997) Polymer Preprints 38(1):582-3); enlaces de éster de fosfato formados, por ejemplo, haciendo reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; enlaces de hidrazona que se forman normalmente por reacción de una hidrazida y un aldehído; enlaces de acetal que normalmente se forman por reacción entre un aldehído y un alcohol; enlaces ortoéster que se forman, por ejemplo, por reacción entre un formiato y un alcohol; enlaces amida formados por un grupo amina, por ejemplo, en un extremo de un polímero tal como PEG y un grupo carboxilo de otra cadena de PEG; enlaces de uretano formados a partir de la reacción de, por ejemplo, un PEG con un grupo isocianato terminal y un alcohol de PEG; enlaces peptídicos formados por un grupo amino, por ejemplo, en un extremo de un polímero tal como PEG y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces de oligonucleótidos formados por, por ejemplo, un grupo fosforamidito, por ejemplo, al final de un polímero, y un grupo hidroxilo 5' de un oligonucleótido.
Tales características opcionales del polímero conjugado, es decir, la introducción de uno o más enlaces degradables en la cadena polimérica, puede proporcionar un control adicional sobre las propiedades farmacológicas finales deseadas del conjugado tras la administración. Por ejemplo, un conjugado grande y relativamente inerte (es decir, que tiene una o más cadenas de PEG de alto peso molecular unidas al mismo, por ejemplo, una o más cadenas de PEG que tienen un peso molecular superior a aproximadamente 20.000, en donde el conjugado no posee esencialmente bioactividad) puede administrarse, hidrolizándose para generar un conjugado bioactivo que posee una porción de la cadena de PEG original. De este modo, las propiedades del conjugado se pueden adaptar de forma más eficaz para equilibrar la bioactividad del conjugado a lo largo del tiempo.
Como se usa en el presente documento, la expresión "reactivo polimérico" generalmente se refiere a una molécula completa, que puede comprender un segmento polimérico soluble en agua y un grupo funcional.
Como se describe anteriormente, un conjugado de la invención comprende un polímero soluble en agua unido covalentemente a un resto de Factor VIII. Para cualquier conjugado dado, habrá de uno a tres polímeros solubles en agua unidos covalentemente a uno o más restos que tienen actividad de Factor VIII.
El enlace particular dentro del resto que tiene actividad de Factor VIII y el polímero depende de una serie de factores. Tales factores incluyen, por ejemplo, la química de enlace particular empleada, el resto particular que tiene actividad de Factor VIII, los grupos funcionales disponibles dentro del resto que tiene actividad de Factor VIII (ya sea para la unión a un polímero o para la conversión a un sitio de unión adecuado), la posible presencia de grupos funcionales reactivos adicionales dentro del resto que tiene actividad de Factor VIII, y similares.
Los conjugados de la invención pueden ser, aunque no necesariamente, profármacos, lo que significa que el enlace entre el polímero y el resto de Factor VIII es hidrolíticamente degradable para permitir la liberación del resto original. Ejemplos de enlaces degradables incluyen éster de carboxilato, éster de fosfato, tioléster, anhídridos, acetales, cetales, aciloxialquilo éter, iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos. Dichos enlaces se pueden preparar fácilmente mediante la modificación apropiada del resto de Factor VIII (p. ej., el extremo C del grupo carboxilo de la proteína o un grupo hidroxilo de la cadena lateral de un aminoácido tal como serina o treonina que se encuentra en la proteína) y/o el reactivo polimérico utilizando métodos de acoplamiento comúnmente empleados en la técnica. Lo
más preferentemente, sin embargo, son enlaces hidrolizables que se forman fácilmente mediante la reacción de un polímero adecuadamente activado con un grupo funcional sin modificar que se encuentra en el resto que tiene actividad de Factor VIII.
Como alternativa, también se puede emplear un enlace hidrolíticamente estable, tal como una amida, uretano (también conocido como carbamato), amina, enlace tioéter (también conocido como sulfuro) o urea (también conocida como carbamida) como enlace para acoplar el resto de Factor VIII, En algunos casos, sin embargo, se prefiere que el enlace no sea un enlace carbamato ni un enlace carbamida, y además, que no se forme ningún enlace basándose en la reacción de un derivado de polímero que lleva un isocianato o una especie de isotiocianato a un resto de Factor VIII. De nuevo, un enlace hidrolíticamente estable preferido es una amida. Una amida se puede preparar fácilmente mediante la reacción de un grupo carboxilo que se encuentra en el resto de Factor VIII (p. ej., el carboxilo terminal de un resto peptídico que tiene actividad dl Factor VIII) con un polímero terminado en amino.
Los conjugados (a diferencia de un resto de Factor VIII no conjugado) pueden o no poseer un grado medible de actividad de Factor VIII. Es decir, un conjugado polimérico según la invención poseerá en cualquier lugar entre aproximadamente el 0,1 % y aproximadamente el 100 % o más de la bioactividad del resto de Factor VIII original no modificado. Preferentemente, los compuestos que poseen poca o ninguna actividad de Factor VIII normalmente contienen un enlace hidrolizable que conecta el polímero con el resto, de modo que, independientemente de la falta de actividad en el conjugado, la molécula original activa (o un derivado de la misma) se libera tras la escisión inducida por agua del enlace hidrolizable. Dicha actividad puede determinarse usando un modelo adecuado in vivo o in vitro, dependiendo de la actividad conocida del resto particular que tiene actividad de Factor VIII empleado.
Para conjugados que poseen un enlace hidrolíticamente estable que acopla el resto que tiene actividad de Factor VIII al polímero, el conjugado poseerá normalmente un grado medible de actividad específica. Por ejemplo, dichos conjugados poliméricos se caracterizan normalmente por tener una actividad de al menos aproximadamente un 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 100 % o más en relación con la del resto original no modificado que tiene actividad de Factor VIII, cuando se mide en un modelo adecuado, tal como los conocidos en la técnica. Preferentemente, los compuestos que tienen un enlace hidrolíticamente estable (p. ej., un enlace amida) poseerán al menos cierto grado de bioactividad del resto original no modificado que tiene actividad de Factor VIII.
Ahora se describirán ejemplos de conjugados poliméricos según la invención en donde el resto que tiene actividad de Factor VIII es una proteína. Normalmente, se espera que dicha proteína comparta (al menos en parte) una secuencia de aminoácidos similar a la del Factor VIII natural. Por tanto, si bien se hará referencia a ubicaciones o átomos específicos dentro de la proteína de Factor VIII natural, dicha una referencia es solo por conveniencia y un experto en la materia podrá determinar fácilmente la ubicación o átomo correspondiente en otros restos que tienen actividad de Factor VIII. En particular, la descripción proporcionada en el presente documento para el Factor VIII natural es aplicable al Factor VIIIa, Factor VIII:vWF, y versiones de Factor VIII con dominio B eliminado, así como fragmentos, variantes de eliminación, variantes de sustitución o variantes de adición de cualquiera de los anteriores.
Los grupos amino en los restos del Factor VIII proporcionan un punto de unión entre el resto de Factor VIII y el polímero soluble en agua. El Factor VIII natural comprende 158 restos de lisina que contienen amina (6,8 por ciento en peso de la proteína completa) y un extremo amino. Con respecto al Factor VIIIa, existen 78 restos de lisina (5,5 por ciento en peso de la proteína completa) y dos extremos amino (resultantes de la escisión del Factor VIII). Por consiguiente, a pesar de las consideraciones estructurales secundarias y terciarias, tanto el Factor VIII como el Factor VIIIa (así como cualquier resto peptídico del Factor VIII, por ejemplo, Factor VIII con dominio B eliminado) tiene varias aminas disponibles para participar en las reacciones de conjugación.
Hay una serie de ejemplos de reactivos poliméricos solubles en agua adecuados útiles para formar enlaces covalentes con aminas disponibles de un resto de Factor VIII. Se proporcionan ejemplos específicos, junto con el conjugado correspondiente, en la tabla 1, a continuación. En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas repetidas y "-NH-F8" representa el resto de Factor VIII posterior a la conjugación con el polímero soluble en agua. Si bien cada porción polimérica presentada en la tabla 1 termina en un grupo "CH3", pueden sustituirse por otros grupos (tales como H y bencilo).
La conjugación de un reactivo polimérico a un grupo amino de un resto de Factor VIII puede lograrse por un experto en la materia sin experimentación indebida. Habitual de un enfoque es una reacción de aminación reductora utilizada, por ejemplo, para conjugar una amina primaria de un resto de Factor VIII con un polímero funcionalizado con una cetona, aldehído o formas hidratadas de los mismos (por ejemplo, hidrato de cetona, hidrato de aldehído). En este enfoque, la amina primaria del resto de Factor VIII reacciona con el grupo carbonilo del aldehído o la cetona (o el correspondiente grupo que contiene hidroxi de un aldehído o una cetona hidratados), formando así una base de Schiff. La base de Schiff, a su vez, después se puede convertir mediante reducción en un conjugado estable mediante el uso de un agente reductor como el borohidruro sódico. Las reacciones selectivas (por ejemplo, en el extremo N son posibles) son posibles, particularmente con un polímero funcionalizado con una cetona o un aldehído alfa-metil ramificado y/o en condiciones de reacción específicas (p.ej., pH reducido).
Los grupos amino preferidos en el Factor VIII que pueden servir como sitio para unir un polímero incluyen aquellos grupos amino que se encuentran dentro de los siguientes restos de lisina: Lys493, Lys496, Lys499, Lys1804, Lys1808, Lys , Lys , Lys , Lys , Lys , Lys , siendo Lys , Lys y Lys particularmente preferidos. La numeración corresponde a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 2. Como se indica anteriormente, el grupo amino correspondiente a cada uno de estos restos de lisina en una proteína distinta del Factor VIII humano puede servir como un sitio útil para la conjugación. Además, el extremo N de cualquier resto de Factor VIII que sea una proteína puede servir como sitio de unión polimérico.
Los grupos carboxilo representan otro grupo funcional que puede servir como punto de unión en el resto de Factor VIII. Estructuralmente, el conjugado comprenderá lo siguiente:
donde F8 y el grupo carbonilo adyacente corresponden al resto de Factor VIII que contiene carboxilo, X es un enlace, preferentemente un heteroátomo seleccionado de O, N(H) y S, y POLY es el polímero PEG soluble en agua, terminando opcionalmente en un resto de protección final con caperuza.
El enlace C(O)-X es el resultado de la reacción entre un derivado polimérico que lleva un grupo funcional terminal y un resto de Factor VIII que contiene carboxilo. Como se analiza anteriormente, el enlace específico dependerá del tipo de grupo funcional utilizado. Si el polímero está funcionalizado en el extremo o "activado" con un grupo hidroxilo, el enlace resultante será un éster de ácido carboxílico y X será O. Si la cadena principal del polímero está funcionalizado con un grupo tiol, el enlace resultante será un tioéster y X será S. Cuando se emplean determinados polímeros con múltiples brazos, ramificados o bifurcados, el resto C(O)X, y en particular el resto X, puede ser relativamente más complejo y puede incluir una estructura de enlace más larga.
Los derivados solubles en agua que contienen un resto hidrazida también son útiles para la conjugación en grupos carboxilo. Un ejemplo de dicho derivado incluye un polímero que tiene la siguiente estructura:
que, tras la conjugación con un resto de Factor VIII, tiene la siguiente estructura:
donde F8 es el resto de Factor VIII posterior a la conjugación y POLY es el polímero soluble en agua PEG, terminando opcionalmente en un resto de protección final con caperuza.
Los grupos tiol que se encuentran en el resto de Factor VIII pueden servir como sitios eficaces de unión para el polímero soluble en agua. En particular, los restos de cisteína proporcionan grupos tiol cuando el resto de Factor VIII es una proteína, Los grupos tiol en dichos restos de cisteína pueden reaccionar después con un PEG activado que es específico para la reacción con grupos tiol, por ejemplo, un polímero de N-maleimidilo u otro derivado, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5.739.208 y en la publicación internacional del PCT n.° WO 01/62827.
Se proporcionan ejemplos específicos, junto con el conjugado correspondiente, en la tabla 2, a continuación. En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas repetidas y "-S-F8" representa el resto de Factor VIII posterior a la conjugación con el polímero soluble en agua. Si bien cada porción polimérica presentada en la tabla 1 termina en un grupo "CH3", pueden sustituirse por otros grupos (tales como H y bencilo).
Con respecto a los conjugados formados a partir de polímeros solubles en agua que portan uno o más grupos funcionales maleimida (independientemente de si la maleimida reacciona con un grupo amina o tiol en el resto de Factor VIII), la una o más formas de ácido maleámico correspondientes del polímero soluble en agua también pueden reaccionar con el resto de Factor VIII. En determinadas condiciones (por ejemplo, un pH de aproximadamente 7-9 y en presencia de agua), el anillo de maleimida se "abrirá" para formar el ácido maleámico correspondiente. El ácido maleámico, a su vez, puede reaccionar con un grupo amina o tiol de un resto de Factor VIII. A continuación se muestran esquemáticamente reacciones ilustrativas basadas en ácido maleámico. POLY representa el polímero soluble en agua y F8 representa el resto de Factor VIII.
Un conjugado representativo según la invención puede tener la siguiente estructura:
POLY-Lq,1-C(O)Z-Y-S-S-F8
en donde POLY es el polímero PEG soluble en agua, L es un enlazador opcional, Z es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, NH, y S, e Y se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2-10, alquilo C2-10 sustituido, arilo y arilo sustituido. Los reactivos poliméricos que pueden reaccionar con un resto de Factor VIII y dar como resultado este tipo de conjugado se describen en el documento US20050014903.
Los grupos tiol preferidos en el Factor VIII que pueden servir como sitio para unir un reactivo polimérico incluyen aquellos grupos tiol que se encuentran en los siguientes restos de cisteína: Cys248, Cys310, Cys329, Cys630, Cys692, Cys , Cys , Cys y Cys , siendo Cys , Cys , y Cys , particularmente preferidos. La numeración corresponde a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 2.
Con respecto a los reactivos poliméricos, los descritos aquí y en otros lugares se pueden adquirir de fuentes comerciales (por ejemplo, Nektar Therapeutics, Huntsville Al). Además, los métodos para preparar los reactivos poliméricos se describen en la bibliografía.
Normalmente, aunque no necesariamente, el enlace entre el resto de Factor VIII y el reactivo polimérico incluye uno o más átomos tales como uno o más de carbono, nitrógeno, azufre y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el enlace comprende un grupo amida, amina secundaria, carbamato, tioéter o disulfuro. Opcionalmente, átomos adicionales pueden conectar el enlace a la cadena de monómeros repetidos dentro del reactivo polimérico. Los ejemplos no limitantes de series específicas de átomos que conectan el resto de Factor VIII a la cadena de monómeros repetidos incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste en -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -O-C(O)-, -C(O)-O-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2CH2-CH2-CH2-, -0 -CH2-, -CH2-0 -, -0 -CH2-CH2 , -CH2-0 -CH2-, -CH2CH2-0 -, -0 -CH2-CH2-CH2-, -CH2-0 -CH2-CH2-, -CH2-CH2-0 -CH2-, -CH2-CH2-CH2-0 -, -0 -CH2-CH2-CH2.CH2-, -CH2-0 -CH2-CH2-CH2 , -CH2-CH2-0 -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CHrCH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2C(O)-NH4CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH2-, 4CH2C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-M-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2~, -CH2-4CH2-C(O)-CH2-, -CH2-M2-C(O)-CH2-CH2, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]o-6-(OCH2CH2)o-2-, -C(O)-NH-(CH2)i-6-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH2)i-6-NH-C(O)-, -O-C(O)-CH2-, -O-C(O)-CH2-CH2-, and -O-C(O)-CH2-CH2-CH2-.
Los conjugados son parte de una composición. La composición comprende una pluralidad de conjugados, teniendo cada uno de ellos de uno a tres polímeros solubles en agua unidos covalentemente a un resto de Factor VIII.
El control del número deseado de polímeros para cualquier resto dado se puede lograr seleccionando el reactivo polimérico adecuado, la proporción de reactivo polimérico al resto de Factor VIII, la temperatura, las condiciones de pH y otros aspectos de la reacción de conjugación. Además, la reducción o eliminación de los conjugados no deseados (p. ej., aquellos conjugados que tienen cuatro o más polímeros unidos) puede lograrse a través de medios de purificación.
Por ejemplo, los conjugados de polímero-resto de Factor VIII pueden purificarse para obtener/aislar diferentes especies conjugadas. En concreto, la mezcla de productos se puede purificar para obtener un promedio de uno, dos o tres PEG por resto de Factor VIII. La estrategia para la purificación de la mezcla de reacción del conjugado final dependerá de una serie de factores, que incluyen, por ejemplo, el peso molecular del reactivo polimérico empleado, el resto de Factor VIII concreto, la pauta posológica deseada, y la actividad y las propiedades in vivo residuales del uno o más conjugados individuales.
Si se desea, los conjugados que tienen diferentes pesos moleculares se pueden aislar usando cromatografía de filtración en gel y/o cromatografía de intercambio iónico. Es decir, la cromatografía de filtración en gel se utiliza para fraccionar proporciones de polímero a resto de Factor VIII numeradas de manera diferente (p. ej., 1-mero, 2-meros y 3-meros, en donde "1-mero" indica 1 polímero a resto de Factor VIII, "2-meros" indica dos polímeros a resto de Factor VIII, y así sucesivamente) sen función de sus diferentes pesos moleculares (donde la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promedio de la porción de polímero soluble en agua). Por ejemplo, en una reacción ilustrativa, donde una proteína de 100.000 daltons se conjuga aleatoriamente con un reactivo polimérico que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 daltons, la mezcla de reacción resultante puede contener proteína no modificada (que tiene un peso molecular de aproximadamente 100.000 daltons), proteína monoPEGilada (que tiene un peso molecular de aproximadamente 120.000 daltons), proteína diPEGilada (que tiene un peso molecular de aproximadamente 140.000 daltons), etc.
Si bien este enfoque se puede utilizar para separar PEG y otros conjugados de polímero-resto de Factor VIII que tienen diferentes pesos moleculares, este enfoque es generalmente ineficaz para separar los isómeros posicionales que tienen diferentes sitios de unión al polímero dentro del resto de Factor VIII. Por ejemplo, la cromatografía de filtración en gel se puede usar para separar entre sí mezclas de 1-mero, 2-meros, 3-meros de PEG, etc., aunque cada una de las composiciones de meros de PEG recuperadas, puede contener PEG unidos a diferentes grupos amino reactivos (por ejemplo, restos de lisina) dentro del resto de Factor VIII.
Las columnas de filtración en gel adecuadas para llevar a cabo este tipo de separación incluyen columnas Superdex™ y Sephadex™ disponibles de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). La selección de una columna en particular dependerá del intervalo de fraccionamiento deseado. La elución se realiza generalmente utilizando un tampón adecuado, tal como fosfato, acetato o similar. Las fracciones recogidas pueden analizarse mediante diversos métodos diferentes, por ejemplo, (i) densidad óptica (DO) a 280 nm para contenido de proteína, (ii) análisis de proteína de seroalbúmina bovina (BSA), (iii) pruebas de yodo para contenido de PEG (Sims et al. (1980) AnaL Biochem, 107:60-63), y (iv) electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS PAGE), seguido de tinción con yoduro de bario.
La separación de los isómeros posicionales se realiza mediante cromatografía de fase inversa utilizando una columna C18 de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) (Amersham Biosciences o Vydac) o mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna de intercambio iónico, por ejemplo, una columna de intercambio iónico Sepharose™ disponible en Amersham Biosciences. Para separar isómeros de biomoléculas del agente activo polimérico que tengan el mismo peso molecular (isómeros posicionales), se puede utilizar cualquier estrategia.
Las composiciones preferentemente están sustancialmente libres de proteínas que no tienen actividad de Factor VIII. Además, las composiciones preferentemente están sustancialmente libres de todos los demás polímeros solubles en agua unidos de forma no covalente. Por otra parte, al menos una especie de conjugado en la composición tiene al menos un polímero de agua soluble en agua unido a un resto que transforma el Factor X en Factor Xa. En algunas circunstancias, sin embargo, la composición puede contener una mezcla de conjugados de polímero-resto de Factor VIII y Factor VIII sin conjugar.
Opcionalmente, la composición de la invención comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. Si se desea, el excipiente farmacéuticamente aceptable se puede añadir a un conjugado para formar una composición. Los excipientes ilustrativos incluyen, sin limitación, los seleccionados del grupo que consiste en hidratos de carbono, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, tensioactivos, tampones, ácidos, bases, y combinaciones de los mismos.
Un hidrato de carbono tal como un azúcar, un azúcar derivatizado tal como un alditol, ácido aldónico, un azúcar esterificado y/o un polímero de azúcar puede estar presente como excipiente Los excipientes de hidratos de carbono específicos incluyen, por ejemplo: monosacáridos, tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosil sorbitol, mioinositol y similares.
El excipiente también puede incluir una sal inorgánica o un tampón tal como ácido cítrico, cloruro sódico, cloruro potásico, sulfato sódico, nitrato potásico, fosfato sódico monobásico, fosfato sódico dibásico, y combinaciones de los mismos.
La composición puede incluir también un agente antimicrobiano pare prevenir o impedir el crecimiento microbiano. Los ejemplos no limitantes de agentes antimicrobianos adecuados para la presente invención incluyen cloruro benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, timersol, y combinaciones de los mismos.
Puede estar presente también un oxidante en la composición. Los antioxidantes se usan para prevenir la oxidación, por lo tanto, para impedir el deterioro del conjugado o de otros componentes de la preparación. Los antioxidantes adecuados para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, galato de propilo, bisulfito sódico, formaldehído sulfoxilato sódico, metabisulfito sódico, y combinaciones de los mismos.
Un tensioactivo puede estar presente como un excipiente. Los ejemplos de tensioactivos incluyen: polisorbatos, tales como "Tween 20" y "Tween 80", y pluronics tales como F68 y P88 (ambos disponibles en BASF, Mount Olive, Nueva Jersey); ésteres de sorbitán; lípidos, tales como fosfolípidos tales como lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque preferentemente no en forma liposómica), ácidos grasos y ésteres grasos; esteroides, tales como colesterol; y agentes quelantes, tales como EDTA, cinc y otros cationes de este tipo adecuados.
Pueden estar presentes ácidos o bases como un excipiente en la composición. Los ejemplos no limitantes de ácidos que pueden utilizarse incluyen los ácidos seleccionados del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen, sin limitación, bases seleccionadas del grupo que consiste en hidróxido sódico, acetato sódico, hidróxido amónico, hidróxido potásico, acetato amónico, acetato potásico, fosfato sódico, fosfato potásico, citrato sódico, formiato sódico, sulfato sódico, sulfato potásico, fumarato potásico y combinaciones de los mismos.
La cantidad de conjugado (es decir, el conjugado formado entre el agente activo y el reactivo polimérico) en la composición, variará dependiendo de diversos factores, pero será óptimamente una dosis terapéuticamente eficaz cuando la composición se almacene en un recipiente de dosis unitaria (por ejemplo, un vial). Además, la preparación farmacéutica se puede guardar en una jeringa. Mediante la administración repetida de cantidades crecientes del conjugado, puede determinarse experimentalmente una dosis terapéuticamente eficaz para determinar qué cantidad produce un criterio de valoración clínicamente deseado.
La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición variará dependiendo de la actividad del excipiente y las necesidades concretas de la composición. Normalmente, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual se determina a través de experimentación habitual, es decir, preparando composiciones que contengan diversas cantidades del excipiente (que varían desde bajas a altas), examinando la estabilidad y otros parámetros y después determinando el intervalo al cual se logra el comportamiento óptimo sin efectos adversos significativos.
Generalmente, sin embargo, el excipiente estará presente en la composición en una cantidad de aproximadamente 1 % a aproximadamente 99 % en peso, desde aproximadamente 5 % a aproximadamente 98 % en peso, más preferentemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 95 % en peso del excipiente, siendo las
concentraciones más preferidas inferiores al 30 %.
Estos excipientes farmacéuticos anteriores junto con otros excipientes se describen en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference", 52a ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998) y en Kibbe, A.H. Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
Las composiciones abarcan todo tipo de formulaciones y en particular aquellas que son adecuadas para inyección, por ejemplo, polvos o liofilizados que pueden reconstituirse así como líquidos. Los ejemplos de diluyentes adecuados para reconstituir composiciones sólidas antes de la inyección incluyen agua para inyección bacteriostática, dextrosa al 5 % en agua, solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución salina, agua estéril, agua desionizada y combinaciones de los mismos. Con respecto a las composiciones farmacéuticas líquidas, se prevén soluciones y suspensiones.
Las composiciones de la presente invención, normalmente, aunque no necesariamente, se administran mediante inyección y, por lo tanto, generalmente son soluciones o suspensiones líquidas inmediatamente antes de la administración. La preparación farmacéutica también puede adoptar otras formas tales como jarabes, cremas, pomadas, comprimidos, polvos y similares. También se incluyen otros modos de administración, tal como pulmonar, rectal, transdérmica, transmucosa, oral, intratecal, subcutánea, intraarterial, etc.
La invención también proporciona un método para administrar, a un paciente que padece una afección que responde al tratamiento con el conjugado, un conjugado como se proporciona en el presente documento. El método comprende administrar, generalmente por inyección, una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado (preferentemente proporcionado como parte de una composición farmacéutica). Como se describe previamente, los conjugados pueden administrarse inyectados por vía parenteral mediante inyección intravenosa, o menos preferentemente, mediante inyección intramuscular o subcutánea. Los tipos de formulación adecuados para la administración parenteral incluyen soluciones listas para inyección, polvos secos para combinar con un disolvente antes de su uso, suspensiones listas para inyección, composiciones secas insolubles para combinar con un vehículo antes de su uso, y emulsiones y concentrados líquidos para diluir antes de su administración, entre otros.
El método de administración puede utilizarse para tratar cualquier afección que pueda remediarse o prevenirse mediante la administración del conjugado. Los expertos en la materia apreciarán qué afecciones puede tratar de manera eficaz un conjugado específico. Por ejemplo, los conjugados se pueden usar para tratar a personas que padecen hemofilia A. Además, los conjugados son adecuados para su uso como agente profiláctico contra el sangrado incontrolado, opcionalmente en pacientes que no padecen hemofilia. Por tanto, por ejemplo, el conjugado se puede administrar a un paciente con riesgo de sangrado incontrolado antes de cirugía.
La dosis real a administrar variará dependiendo de la edad, el peso, y el estado general del sujeto así como de la gravedad de la afección que se está tratando, el juicio del profesional de la salud y el conjugado que se está administrando. Los expertos en la materia conocen y/o describen las cantidades terapéuticamente eficaces en los textos y en la bibliografía de referencia pertinentes. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz variará de aproximadamente 0,001 mg a 100 mg, preferentemente en dosis de 0,01 mg/día a 75 mg/día, y más preferentemente en dosis de 0,10 mg/día a 50 mg/día.
La dosis unitaria de cualquier conjugado dado (de nuevo, preferentemente proporcionado como parte de una preparación farmacéutica), puede administrarse en una variedad de programas de dosificación dependiendo del criterio del médico, de las necesidades del paciente, etc. Los expertos en la materia conocerán el programa de dosificación específico o se puede determinar experimentalmente usando métodos habituales. Los programas de dosificación ilustrativos incluyen, sin limitación, administración cinco veces al día, cuatro veces al día, tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, dos veces al mes, una vez al mes, y cualquier combinación de los mismos. Una vez alcanzado el criterio de valoración clínico, se interrumpe la dosificación de la composición.
Una ventaja de administrar determinados conjugados de la presente invención es que se pueden escindir partes individuales de polímero soluble en agua. Dicho resultado es ventajoso cuando la eliminación del cuerpo es posiblemente un problema debido al tamaño del polímero. De manera óptima, la escisión de cada parte de polímero soluble en agua se facilita utilizando enlaces fisiológicamente escindibles y/o enzimáticamente degradables, tales como los enlaces que contienen uretano, amida, carbonato o éster. De este modo, la eliminación del conjugado (mediante escisión de partes individuales de polímero soluble en agua) se puede modular seleccionando el tamaño molecular del polímero y el tipo de grupo funcional que proporcionaría las propiedades de eliminación deseadas. Un experto en la materia puede determinar el tamaño molecular del polímero así como el grupo funcional escindible adecuados. Por ejemplo, un experto en la materia, utilizando experimentación habitual, puede determinar un tamaño molecular y grupo funcional escindible adecuados preparando primero una variedad de derivados poliméricos con diferentes pesos de polímero y grupos funcionales escindibles, y después obteniendo el perfil de eliminación (por ejemplo, muestreando periódicamente sangre u orina) administrando el derivado polimérico a un paciente y tomando muestras periódicas de sangre y/u orina. Una vez obtenida una serie de perfiles de eliminación de cada conjugado
analizado, se puede identificar un conjugado adecuado.
PARTE EXPERIMENTAL
La puesta en práctica de la invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de síntesis orgánica y similares, que se encuentran entre las capacidades de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4a Ed. (Nueva York: Wiley-Interscience, 1992), supra.
En los siguientes ejemplos, se ha hecho todo lo posible por garantizar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, la temperatura está en grados C y la presión es igual o cercana a la presión atmosférica a nivel del mar.
ABREVIATURAS:
DCM diclorometano
mPEG-SPA mPEG-propionato de succinimidilo
mPBG-SBA mPEG-butanoato de succinimidilo
mPEG-OPSS mPEG-ortopiridil-disulfuro
mPEG-MAL mPEG-maleimida, CHaO-(CH2H2O)n-CH2CH2-MAL
mPEG-SMB mPEG-a-metilbutanoato de succinimidilo,
CHaO-CH2CH2O)O-CH2CH2-CH(CHa)-C(O)-O-succinimida
mPEG-ButyrALD
mPEG-PIP CHaO-(CH2CH2O)A-CH2CHrO-C
(O)-NH-(CH2CH2O)4CH2CH2CH2C(O)H CHaO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-C(O)-piperidin-4-ona.
SUC succinimida o succinimidilo
NaCNBHa cianoborohidruro sódico
HCl ácido clorhídrico
HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico
NMR resonancia magnética nuclear
DCC 1,3-diciclohexilcarbodiimida
DI desionizado
PM peso molecular
t.a. temperatura ambiente
K o kDa kilodaltons
SEC cromatografía de exclusión por tamaño
HPLC cromatografía líquida de alto rendimiento
FPLC cromatografía líquida rápida de proteínas
SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico MALDI-TOF desorción/ionización láser asistida por matriz y espectrometría de masas de tiempo de vuelo
MATERIALES:
Todos los reactivos de PEG a los que se hace referencia en los ejemplos adjuntos están disponibles comercialmente a menos que se indique lo contrario.
mPEG-propionato de succinimidilo, mPEG-SPA, peso molecular, 30K (Mn= 31,3 kDa, Nektar Therapeutics) mPEG-maleimida, mPEG-MAL, peso molecular, 20 K (Mn= 21,8 kDa, Nektar Therapeutics)
mPEG-maleimida, mPEG-MAL, peso molecular, 30K (Mn= 31,4 kDa, Nektar Therapeutics)
mPBG-a-metilbutanoato de succinimidilo, mPBG-SMB, peso molecular, 30K (Mn= 30,5 kDa, Nektar Therapeutics) mPEG-butiraldehído, mPEO-ButyrALD, peso molecular, 30K (Mn= 31,5 kDa, Nektar Therapeutics)
L-histidina, rendimiento biotecnológico certificado (Sigma)
HEPBS, rendimiento biotecnológico certificado, 99,5+% (Sigma)
Cloruro cálcico, dihidrato, para biología molecular, 99 % (Sigma)
Cloruro sódico, para biología molecular (Sigma)
Tween 80, Sigma Ultra, (Sigma)
Alcohol etílico, USP, Prueba Absoluta-200 (AAPER)
Polietilenglicol, PM 3.350, SigmaUltra (Sigma)
Recipiente de diálisis Slide-A-Lyzer, capacidad de 0,5-3 ml o 3-12 ml (Pierce)
Ácido acético, reactivo A.C.S., 99,7+% (Aldrich)
Ácido acético IN, patrón volumétrico (VWR)
Hidróxido sódico IN, patrón volumétrico (J.T.Baker)
Cianoborohidruro sódico, 95 % (Aldrich)
Tris/glicina/SDS, 10x, tampón de electroforesis de proteínas (Bio-Rad)
Tampón de muestra Laemmli (Bio-Rad)
SigmaMarker, intervalo bajo (PM.6.500-66.000) (Sigma)
SigmaMarker, gama alta (PM. 36.000-205.000) (Sigma)
Gel preparado con Tris-HCl al 7,5 % (10 pocillos, 30 ul, Bio-Rad)
Reactivo de tinción azul GelCode (Pierce)
MÉTODOS (ANALÍTICO)
Análisis SEC-HPLC
La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se realizó en un sistema HPLC Agilent 1100 (Agilent). Las muestras se analizaron utilizando una columna BIOSEP-SEC-S 4000 (Phenomenex) y una fase móvil de histidina 45 mM, cloruro cálcico 4,5 mM, cloruro sódico 0,36 M, 0,009 %(v/v) de Tween 80 y 10 % de alcohol etílico, pH 6,7. El caudal de la columna fue de 0,3 ml/min. La proteína eluida y los conjugados de PEG-proteína se detectaron mediante UV a una longitud de onda de 280 nm.
Análisis SDS-PAGB
Las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) utilizando el sistema de electroforesis en gel prefabricado Mini-PROTEAN 3 (Bio-Rad). Las muestras se mezclaron con tampón de muestra Laemmli 2x y se colocaron en un baño de agua a 95 °C durante 5 minutos. A continuación, las muestras preparadas se cargaron en un gel preparado con Tris-HCl al 7,5 % y se ejecutaron durante aproximadamente 30 minutos a 200 V usando el tampón de electroforesis Tris/glicina/SDS.
OTROS MÉTODOS
Purificación de conjugados de PBG-Factor VIII
Se usó una columna de filtración en gel Superose 6HR 10/30 de 24 ml (Amersham) con un sistema FPLC y un sistema principal AKTA (Amersham) para purificar los conjugados de PEG-Factor VIII en los ejemplos 4-8. El caudal fue de 0,3 ml/min y el tampón de elución fue histidina 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl24,0 mM y 0,01 % (p/v) de Tween 80, pH 6,7.
Intercambio de tampón de solución madre de Factor VIII
Se sacó un recipiente de diálisis Slide-A-Lyzer (3-12 ml, MWCO de 10.000, Pierce) de la bolsa protectora y se empapó en MiliQ H2O durante 15 minutos (el agua se cambiaba cada 5 minutos). La solución madre de Factor VIII [0,398 mg/ml en histidina 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl24,0 mM, 0,1 % (p/v) de PeG 3.350, 0,01 % (p/v) de Tween 80, pH 6,7] se transfirió después a la cavidad del recipiente a través de uno de los puertos de guía en la parte superior de la junta. El recipiente se colocó en un vaso de precipitados de 1 l de tampón HEPES [HEPES 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl25 mM, 0,1 % (p/v) de PEG 3.350, 0,01 % (v/v) de Tween 80, pH 7,0] con una boya de flotación unida a la parte superior del recipiente. Después se colocó el vaso de precipitados en la placa de agitación para iniciar la diálisis a 4 °C. El tampón HEPES se cambió cuatro veces a intervalos de 2~3 horas y después se dejó en una habitación fría
(4 °C) para diálisis durante la noche. Después de la diálisis, se inyectó aire en la cámara del recipiente y se extrajo la muestra dializada del casete. La concentración de Factor VIII en tampón HEPES se midió a UV 280 nm con un espectrofotómetro SPECTRA max PLUS (Molecular Devices).
Ejemplo 1
PEGilación del Factor VIII con dominio B eliminado con mPEG-SPA, 20 K
El mPEG-propionato de succinimidilo que tiene un peso molecular de 20.000 daltons se obtiene de Nektar Therapeutics, (Huntsville, AL). La estructura básica del reactivo polimérico se proporciona a continuación:
el Factor VIII con dominio B eliminado se disuelve en agua desionizada, a la que se añade trietilamina para elevar el pH a 7,2-9. A la solución anterior se le añade un exceso molar de 1,5 a 10 veces del reactivo PEG, mPEG-SPA. La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante varias horas.
La mezcla de reacción se analiza mediante SDS-PAGE para determinar el grado de PEGilación de la proteína. El grado de PEGilación, 1-mero, 2 meros, etc., también puede determinarse mediante cualquiera de una serie de técnicas analíticas apropiadas para proteínas de este tamaño, tal como la dispersión del ángulo de luz. Los picos mostrados para especies naturales y mono-PBOiladas difieren en aproximadamente 20.000 Da. El aumento de la proporción de reactivo PEG a proteína aumenta el grado de poliPEGilación, es decir, la formación de 2-meros, 3-meros, etc.
Ejemplo 2
PEGilación del Factor VIII con dominio B eliminado con mPEG-MAL, 20 K
El mPEG-maleimida que tiene un peso molecular de 20.000 daltons se obtiene de Nektar Therapeutics, (Huntsville, AL). La estructura básica del reactivo polimérico se proporciona a continuación:
El Factor VIII con dominio B eliminado se disuelve en tampón. A esta solución de proteína se le añade un exceso molar de 3-5 veces de mPEG-MAL. La mezcla se agita a temperatura ambiente en atmósfera inerte durante varias horas. La mezcla de reacción se analiza y purifica mediante HPLC para proporcionar una mezcla de especies conjugadas.
Ejemplo 3
PEGilación del Factor VIII con dominio B eliminado con mPEG-OPSS, 20 K
El reactivo de polímero selectivo de sulfhidrilo, mPEG-ortopiridil-disulfuro (estructura mostrada arriba), que tiene un peso molecular de 20.000, se obtiene de Nektar Therapeutics (Huntsville, AL). Se añade un exceso molar de cinco veces de mPEG-OPSS al Factor VIII con dominio B eliminado en una solución tamponada. La mezcla de reacción se agita durante varias horas a temperatura ambiente en atmósfera inerte para formar el conjugado deseado que tiene un enlace disulfuro que conecta el polímero con la proteína.
Ejemplo 4
Conjugación del Factor VIII con dominio B eliminado con mPEG-SPA, 30 K
Antes de la conjugación, un intercambio de tampón para el Factor VIII con dominio B eliminado (Factor VIII) se realizó para reemplazar histidina con HEPES.
El mPEG-SPA, 30 K, almacenado a -20 °C en argón, se calentó a temperatura ambiente. El mPEG-SPA calentado (2,2 mg) se disolvió en 0,022 ml de HCl 2 mM para proporcionar una solución al 10 % de reactivo polimérico. La solución de mPEG-SPA se añadió rápidamente a 3 ml de solución de Factor VIII [0,412 mg/ml en HEPES 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl24,0 mM, 0,1 % (p/v) de PEG 3.350, 0,01 % (p/v) de Tween 80, pH 7,0] y se mezcló bien. Después de 30 minutos de reacción a temperatura ambiente, el vial de reacción se transfirió a una habitación fría (4 °C) y se añadieron otros 0,022 ml de solución de mPEG-SPA a la mezcla de reacción y se mezcló bien. Se determinó el pH (pH 7,0±0,2). La relación molar de mPEG-SPA a proteína fue 20:1. La concentración final de mPEG-SPA fue de 1,445 mg/ml y la concentración final de Factor VIII fue de 0,406 mg/ml. Se permitió que la reacción prosiguiera durante la noche a 4 °C en Rotomix (baja velocidad, Thermolyne). Al conjugado resultante se le asignó el identificador "pz041701".
La mezcla de conjugados se purificó utilizando cromatografía de filtración en gel. Se desarrolló un método de cromatografía de exclusión por tamaño para analizar las mezclas de reacción y los productos finales. También se utilizó el análisis SDS-PAGE para la caracterización de las muestras.
CARACTERIZACIÓN DE CONJUGADOS. La mezcla de conjugados resultante, antes de la purificación, era una mezcla de Factor VH y monómero (o 1-mero), dímero (o 2-meros) y trímero (o 3-meros) de PEG, correspondiente a los identificadores "pz041701 (bajo)", "pz041701 (medio)", y "pz041701 (alto)" respectivamente, según se determina por SEC. Es decir: "pz041701 (bajo)" corresponde principalmente a especies mono-PEGiladas de Factor VIII o Factor VIII que tiene un resto de p Eg unido al mismo; "pz041701 (medio)" corresponde principalmente a especies di-PEGiladas del Factor VIII, es decir, Factor VIII que tiene dos restos de PEG unidos al mismo; y "pz041701 (alto)" corresponde principalmente al Factor VIII que tiene tres restos de PEG unidos al mismo. Los gráficos de SEC correspondientes se muestran en las figuras 1 y 2. La figura 1 muestra el gráfico de SEC correspondiente a las fracciones recogidas en SEC de la mezcla de reacción del Factor VIII. Según los resultados de la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), el rendimiento de PEGilación de mPEG-SPA-30K-FVIII (pz041701 bajo) fue ~ 39 %. El rendimiento de PEGilación de mPEG30-SPA-30K-FVIII (pz041701 medio) fue ~ 32 %, y el rendimiento de PEGilación de mPEG-SPA-30K-FVIII (pz041701 alto) fue ~ 11 %, con porcentajes basados en cantidades relativas comparadas con todas las especies presentes en la mezcla de reacción resultante. La mezcla de conjugados se purificó adicionalmente por FPLC y se analizó por SDS-PAGE.
Ejemplo 5
Conjugación del Factor VIII con dominio B eliminado con mPEG-MAL, 20 K
Antes de la conjugación, un intercambio de tampón para el Factor VIII con dominio B eliminado (Factor VIII) se realizó para reemplazar histidina con HEPES.
El mPEG-MAL, 20 K, almacenado a -20 °C en argón, se calentó a temperatura ambiente. El reactivo mPEG-MAL calentado (4,4 mg) se disolvió en 0,044 ml de tampón HEPES [HEPES 50 mM, NaCl 0,15 M, CaCl24,0 mM, 0,01 % (p/v) de Tween 80, pH 7,0] para preparar una solución de mPEG-MAL al 10 %. La solución de mPEG-MAL se añadió rápidamente a 4 ml de solución de Factor VIII [0,4324 mg/ml en HEPES 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl2 4 mM, 0,1 % (p/v) de PEG 3.350, 0,01 % (p/v) de Tween 80, pH 7,0] y se mezcló bien. Después de 30 minutos de reacción a temperatura ambiente, el vial de reacción se transfirió a la habitación fría(4 °C) y se añadieron otros 0,044 ml de solución de mPEG-MAL a la mezcla de reacción, seguido de la adición de tres alícuotas más de 0,044 ml de solución de mPEG-MAL en el transcurso de dos horas. Se determinó el pH (pH 7,0±0,2). La relación molar de mPEG-MAL a proteína fue 100:1. La concentración final de mPEG-MAL fue de 5,213 mg/ml y la concentración final de Factor VIII fue de 0,410 mg/ml. Se permitió que la reacción prosiguiera durante la noche a 4 °C en Rotomix (baja velocidad, Thermolyne). Al conjugado se le asignó el identificador "pz061201".
La mezcla de conjugados se purificó utilizando cromatografía de filtración en gel. Se desarrolló un método de cromatografía de exclusión por tamaño para analizar las mezclas de reacción y los productos finales. También se utilizó el análisis SDS-PAGB para la caracterización de las muestras.
CARACTERIZACIÓN DE CONJUGADOS (Producto mono-PEGilado). Según los resultados de la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), el rendimiento de FEGilación del conjugado monoPEGilado (1-mero) fue ~33 % (figura 3). Las fracciones de la mezcla del conjugado de Factor VIII se combinaron y purificaron mediante FPLC y después se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de filtración en gel. El producto final pz061201 se analizó tanto mediante SDS-PAGE como SEC, y se determinó que la pureza del producto "pz061201" era aproximadamente del
94 % de Factor VIII monómero de PEG (es decir,, Factor VIII monopegilado), con ~ 6 % de Factor VIII con alto contenido de meros de PEG (figura 4).
Ejemplo 6
Conjugación del Factor VIII con dominio B eliminado con mPEG-SMB, 30 K
Antes de la conjugación, un intercambio de tampón para el Factor VIII con dominio B eliminado (Factor VIII) ) se realizó para reemplazar histidina con HEPES.
El mPEG-SMB, 30 K, almacenado a -20 °C en argón, se calentó a temperatura ambiente. El mPEG-SMB calentado (6,5 mg) se disolvió en 0,065 ml de HCl 2 mM para formar una solución de mPEG-SMB al 10 %. La solución de mPEG-SMB se añadió rápidamente a 4 ml de solución de Factor VIII [0,435 mg/ml en HEPES 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl2 5,0 mM, 0,1 % (p/v) de PEG 3.350, 0,01 % (v/v) de Tween 80, pH 7,0] y se mezcló bien. Después de 30 minutos de reacción a temperatura ambiente, el vial de reacción se transfirió a una habitación fría (4 °C). Se determinó el pH (pH 7,0±0,2). La relación molar de mPEG-SMB a proteína fue 20:1. La concentración final de mPEG-SMB fue de 1,599 mg/ml y la concentración final de Factor VIII fue de 0,428 mg/ml. Se permitió que la reacción prosiguiera durante aproximadamente 48 horas a 4 °C en Rotomix (velocidad lenta, Thermolyne), y después se inactivó mediante la adición de ácido acético (99,7+%) para reducir el pH a 6,0 ± 0,3. Al conjugado se le asignó el identificador "pz082501".
La mezcla de conjugados se purificó utilizando cromatografía de filtración en gel. Se desarrolló un método de cromatografía de exclusión por tamaño para analizar las mezclas de reacción y los productos finales. También se utilizó el análisis SDS-PAGE para la caracterización de las muestras.
CARACTERIZACIÓN DE CONJUGADOS: La mezcla denominada "pz082501" era el resultado de la PEGilación del Factor VIII con mPEG-SMB30K a pH 7,0 ± 0,2. La mezcla conjugada se purificó y analizó mediante SEC. Basándose en los resultados de la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), el rendimiento de PEGilación de pz082501, el conjugado monoPEGilado (Factor VIII 1-mero) fue -41 % (figura 5). La mezcla de productos se purificó adicionalmente mediante FPLC y se analizó mediante SDS-PAGE y SEC. La caracterización del producto conjugado de Factor VIII PEG purificado, pz082501, fue -95 % de Factor VIII con PEG monoconjugado con ~ 5 % más de meros.
Ejemplo 7
Conjugación del Factor VIII con dominio B eliminado con mPEG-MAL, 30 K
Antes de la conjugación, un intercambio de tampón para el Factor VIII con dominio B eliminado (Factor VIII) se realizó para reemplazar histidina con HEPES.
mPEG-MAL, 30 K, almacenado a -20K °C en argón, se calentó a temperatura ambiente. El mPEG-MAL calentado (1,0 mg) se disolvió en 0,010 ml de tampón HEPES [HEPES 50 mM, NaCl 0,15 M, CaCh 4,0 mM, 0,01 % (p/v) de Tween 80, pH 7,0] para preparar una solución de mPEG-MAL al 10 %. La solución de mPEG-MAL se añadió rápidamente a 0,5 ml de solución de Factor VIII [0,447 mg/ml en HEPES 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl24 mM, 0,1 % (p/v) de PEG 3.350, 0,01 % (p/v) de Tween 80, pH 7,0] y se mezcló bien. Después de 30 minutos de reacción a temperatura ambiente, el vial de reacción se transfirió a una habitación fría(4 °C) y se añadieron otros 0,010 ml de solución de mPEG-MAL a la mezcla de reacción, seguido de la adición de tres alícuotas más de 0,010 ml de solución de mPEG-MAL en el transcurso de dos horas. Se determinó el pH (pH 7,0±0,2). La relación molar de mPEO-MAL a proteína fue 100:1. La concentración final de mPEG-MAL fue de 9,091 mg/ml y la concentración final de Factor VIII fue de 0,406 mg/ml. Se permitió que la reacción prosiguiera durante la noche a 4 °C en Rotomix (baja velocidad, Thermolyne).
La mezcla de conjugados se purificó utilizando cromatografía de filtración en gel. Se desarrolló un método de cromatografía de exclusión por tamaño para analizar las mezclas de reacción y los productos finales. También se utilizó el análisis SDS-PAGE para la caracterización de las muestras. Los resultados y rendimientos de la PEGilación utilizando el reactivo mFEG-MAL con un peso molecular de 30 K fueron similares a los del ejemplo 5, que empleó el reactivo mPEG-MAL que tiene un peso molecular de 20K.
Claims (30)
1. Una composición que comprende una pluralidad de conjugados, teniendo cada conjugado de uno a tres restos de poli(etilenglicol) unidos covalentemente a un resto de Factor VIII, en donde cada resto de poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio nominal en el intervalo de aproximadamente 20.000 daltons a aproximadamente 85.000 daltons.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde el poli(etilenglicol) está protegido terminalmente con caperuza con un resto de protección final con caperuza seleccionado del grupo que consiste en hidroxi, alcoxi, alcoxi sustituido, alquenoxi, alquenoxi sustituido, alquinoxi, alquinoxi sustituido, ariloxi y ariloxi sustituido.
3. La composición de la reivindicación 1, en donde cada resto de poli(etilenglicol) es lineal.
4. La composición de la reivindicación 1, en donde cada resto de poli(etilenglicol) está ramificado.
5. La composición de la reivindicación 1, en donde al menos un resto de poli(etilenglicol) está unido covalentemente a un sitio en la forma activa del resto que tiene actividad de Factor VIII.
6. La composición de la reivindicación 1, en donde el poli(etilenglicol) está protegido terminalmente con caperuza con metoxi.
7. La composición de la reivindicación 1, en donde el poli(etilenglicol) está protegido terminalmente con caperuza con hidroxi.
8. La composición de la reivindicación 1, en donde el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio nominal en el intervalo de aproximadamente 53.000 daltons a aproximadamente 75.000 daltons.
9. La composición de la reivindicación 1, en donde cada resto de Factor VIII se selecciona del grupo que consiste en Factor VIII, Factor VIIIa, Factor VIII:C, Factor VIII:vWF, Factor VIII con dominio B eliminado, y fragmentos biológicamente activos, variantes de eliminación, variantes de sustitución o variantes de adición de cualquiera de los anteriores.
10. La composición de la reivindicación 9, en donde cada resto de Factor VIII se selecciona del grupo que consiste en Factor VIII, Factor Villa, Factor VIII:C y Factor VIII:vWF.
11. La composición de la reivindicación 9, en donde cada conjugado de resto de Factor VIII comprende Factor VIII con dominio B eliminado.
12. La composición de la reivindicación 1, en donde cada conjugado de resto de Factor VIII comprende un resto de Factor VIII que se obtiene de forma recombinante.
13. La composición de la reivindicación 1, en donde cada resto de Factor VIII se obtiene de sangre.
14. La composición de la reivindicación 1, en donde la composición está sustancialmente libre de albúmina.
15. La composición de la reivindicación 1, en donde la composición está sustancialmente libre de proteínas que no tienen actividad de Factor VIII.
16. La composición de la reivindicación 1, en donde la composición está sustancialmente libre de polímeros solubles en agua unidos de forma no covalente.
17. La composición de la reivindicación 1, en forma liofilizada.
18. La composición de la reivindicación 1, en forma de líquido.
19. La composición de la reivindicación 1, que comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
20. La composición de la reivindicación 1, en donde cada conjugado comprende de uno a tres restos de poli(etilenglicol) unidos covalentemente al resto de Factor VIII a través de un enlace amida.
21. La composición de la reivindicación 1, en donde cada conjugado comprende de uno a tres restos de poli(etilenglicol) unidos covalentemente al resto de Factor VIII a través de un enlace de amina secundaria.
22. La composición de la reivindicación 1, en donde cada conjugado comprende de uno a tres restos de poli(etilenglicol) unidos covalentemente al resto de Factor VIII a través de un enlace carbamato.
23. La composición de la reivindicación 1, en donde cada conjugado comprende de uno a tres restos de poli(etilenglicol) unidos covalentemente al resto de Factor VIII a través de un enlace tioéter.
24. La composición de la reivindicación 1, en donde cada conjugado comprende de uno a tres restos de poli(etilenglicol) unidos covalentemente al resto de Factor VIII a través de un enlace disulfuro.
25. La composición de la reivindicación 1, en donde el uno a tres restos de poli(etilenglicol) están unidos covalentemente al resto de Factor VIII a través de un enlace hidrolíticamente estable.
26. Un método para preparar una composición de conjugados de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende poner en contacto, en condiciones de conjugación, un resto de Factor VIII con un reactivo de poli(etilenglicol) activado que tiene un grupo reactivo adecuado para la reacción con el resto de Factor VIII y un peso molecular promedio nominal en el intervalo de aproximadamente 20.000 daltons a aproximadamente 85.000 daltons.
27. Una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para su uso en el tratamiento de un paciente que necesita terapia con Factor VIII, que comprende la etapa de administrar al paciente dicha composición, en donde la composición contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de los conjugados.
28. La composición para su uso según la reivindicación 27, en donde dicho paciente padece hemofilia A.
29. La composición para su uso según la reivindicación 27, en donde a dicho paciente se le administra la composición en los dos días previos a la cirugía.
30. El uso de una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 en la fabricación de un medicamento para su uso en un método de tratamiento como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29.
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