KR20210110848A - 변형된 유로키나제 유형 플라스미노겐 활성제 폴리펩타이드 및 사용 방법 - Google Patents

변형된 유로키나제 유형 플라스미노겐 활성제 폴리펩타이드 및 사용 방법 Download PDF

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KR20210110848A
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크리스토퍼 타노스
바네사 소로스
미하일 폽코프
킴벌리 팁톤
매튜 존 트레일러
에릭 스티븐 퍼파인
제프리 찰스 웨이
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Abstract

본 발명은 u-PA 폴리펩타이드 및 u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 융합 단백질을 제공한다. u-PA 폴리펩타이드는 변경된 활성 및/또는 특이성을 갖도록 변형되어, 보체 단백질 C3과 같은 보체 단백질을 절단함으로써 보체 활성화를 억제한다. 보체 활성화를 억제하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 융합 단백질은 보체 활성화에 의해 매개되거나 보체 활성화가 역할을 하는 질환 및 병태의 치료에 사용될 수 있다. 이들 장애는 허혈성 및 재관류 장애, 예컨대 심근경색 및 뇌졸중, 패혈증, 자가면역 질환, 당뇨병성 망막병증, 연령 관련 황반 변성, 이식된 기관 거부, 염증성 질환 및 염증성 요소를 갖는 질환을 포함한다.

Description

변형된 유로키나제 유형 플라스미노겐 활성제 폴리펩타이드 및 사용 방법
관련 출원
우선권의 이익은 발명자는 Edwin L. Madison, Christopher Thanos, Mikhail Popkov, Vanessa Soros, 및 Kimberly Tipton이고 출원인은 Catalyst Biosciences, Inc.인, 2018년 12월 28일에 출원된 미국 가출원 제62/786,302호(발명의 명칭: "MODIFIED UROKINASE-TYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE")에 대해 청구된다. 허용되는 경우, 본 출원의 요지는 그 전문이 참조로 포함된다.
전자적으로 제공된 서열 목록의 참고에 의한 포함
서열 목록의 전자 버전은 본원과 함께 출원되고, 그의 내용은 그 전문이 참조로 포함된다. 전자 파일은 2019년 12월 26일에 생성되었고, 크기가 2,294 킬로바이트이고, 표제가 4940seqPC1.txt이다.
발명의 분야
보체 단백질을 절단하여 보체 활성화를 억제하는 변형된 u-PA 폴리펩티드가 제공된다. 이러한 억제에 의해, 변형된 u-PA 폴리펩티드는 보체에 의해 매개되거나 보체 활성화가 역할을 하는 질환 및 병태의 치료에 사용될 수 있다. 이들 질환 및 병태는 황반 변성, 예컨대 연령 관련 황반 변성(AMD) 및 스타르가르트(Stargardt) 질환, 신장 지연 이식편 기능(DGF), 허혈성 및 재관류 장애, 예컨대 심근경색 및 뇌졸중, 패혈증, 자가면역 질환, 염증성 질환 및 염증성 요인을 갖는 질환, 예컨대 알츠하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 포함한 안과 적응증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
보체(C) 시스템은 면역계의 일부이고 침입 병원체를 제거하고 염증 반응을 개시하는데 역할을 한다. 인간 및 다른 포유동물의 보체계는 보체 활성화를 야기하는 질서있는 일련의 반응에 참여하는 30개 초과의 가용성 및 막-결합 단백질을 포함한다. 혈액 보체계는 항-미생물 및 항-바이러스 작용을 포함하는 광범위한 숙주 방어 메카니즘과 연관된 광범위한 기능을 갖는다. C 성분의 활성화로부터 유래된 생성물은 비-자가-인식 분자 C3b, C4b 및 C5b, 뿐만 아니라 다양한 세포 면역 반응에 영향을 미치는 아나필라톡신 C3a, C4a 및 C5a를 포함한다. 이들 아나필라톡신은 또한 전-염증제로서 작용한다.
보체계는 효소 및 비-효소 단백질 및 수용체의 어레이로 구성된다. 보체 활성화는 "고전적" 경로, "대안적" 경로 및 "렉틴" 경로로서 공지된 3가지 주요 방식 중 하나에 의해 발생한다(도 1 참조). 보체는 전형적으로 이들 3개의 경로 중 1개에 의해 활성화되거나 촉발되며, 이는 도 1에 나타낸 바와 같이 C3 활성화에서 수렴된다. 고유 경로로 지칭되는 제4 보체-활성화 메카니즘에서, 응고/섬유소용해 캐스케이드와 연관된 세린 프로테아제는 고전적, 대안적 및 렉틴 경로와 독립적으로 C3 또는 C5의 절단을 통해 직접 보체계를 활성화시킨다.
이들 경로는 보체 활성화를 개시하는 과정에 의해 구별될 수 있다. 고전적 경로는 항체-항원 복합체 또는 면역글로불린의 응집된 형태에 의해 개시되고; 대안적인 경로는 미생물 및 세포 표면 상의 구조의 인식에 의해 개시되며; 항체-독립적 경로인 렉틴 경로는 박테리아 또는 바이러스의 표면 상에 나타나는 것과 같은 탄수화물에 만난 결합 렉틴(MBL, 또한 만노스 결합 단백질로 명명됨)의 결합에 의해 개시된다. 캐스케이드의 활성화는 단백질분해 또는 세포 용해에 관여하는 복합체 및 옵소닌화, 아나필락시스 및 화학주성에 관여하는 펩타이드를 생성한다.
동물의 면역 반응의 중추 성분인 보체 캐스케이드는 비가역적인 캐스케이드이다. 다수의 단백질 보조인자가 과정을 조절한다. 과정의 부적절한 조절, 전형적으로 부적절한 활성화는 부적절한 염증 및 면역 반응을 포함하는 다양한 장애, 예컨대 급성 및 만성 염증 질환 및 부적절한 면역 반응을 수반하는 다른 병태에서 관찰되는 장애의 양상일 수 있거나, 또는 이러한 장애에서 발생할 수 있다. 이들 질환 및 장애는 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염 및 루푸스, 심장 장애 및 다른 염증성 질환, 예를 들어 패혈증 및 허혈-재관류 손상을 포함한다.
다양한 질환 및 병태에서의 보체 경로의 관여로 인해, 보체 경로의 성분은 치료적 개입, 특히 경로의 억제를 위한 표적이다. 이러한 치료제의 예는 합성 및 천연 소분자 치료제, 항체 억제제, 및 막 보체 조절제의 재조합 가용성 형태를 포함한다. 이러한 치료제를 제조하기 위한 전략에는 한계가 있다. 소분자는 생체 내에서 짧은 반감기를 가지며, 보체 억제를 유지하기 위해 지속적으로 주입되어 특히 만성 질환에서 그의 역할을 제한할 필요가 있다. 치료 항체는 대상체에서 면역 반응을 초래할 수 있고, 따라서 치료, 특히 면역 반응을 조정하도록 설계된 치료에서 합병증을 초래할 수 있다. 따라서, 보체 매개 질환 및 보체 활성화가 역할을 하는 질환의 치료를 위한 치료제에 대한 필요성이 존재한다. 이들은 급성 및 만성 염증성 질환을 포함한다. 따라서, 본원의 목적 중에서, 이러한 치료제를 제공하여 보체 캐스케이드의 활성화를 표적화하고, 질환의 치료제 및 치료 방법을 제공하는 것이 목적이다.
야생형 u-PA 프로테아제 도메인에 비해 보체 단백질 C3에 대한 절단 활성을 증가시키는 프로테아제 도메인 내의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함하는 변형 유로키나제 유형 플라스미노겐 활성화제(u-PA) 폴리펩타이드가 제공된다(여기서 프로테아제 도메인은 유리 Cys를 Ser로 대체하여 응집을 감소/제거하는 것을 포함할 수 있음). 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 프로테아제 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩타이드, 예를 들어 전장 활성화된 프로테아제, 이의 자이모겐 형태, 및 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 약리학적 특성 또는 활성을 부여하는 융합 파트너를 함유하는 융합 단백질이다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 상기 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 융합 단백질은, 활성 형태일 때, 보체 활성화를 억제한다. 특히 이들 폴리펩타이드 및 융합 단백질은 C3을 절단함으로써 C3 활성이 억제되거나 제거된다.
본원에 제공된 아미노산 결실, 치환 및 삽입을 포함하는 변형은 프로테아제 도메인에 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 프로테아제 도메인이거나 이를 포함한다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 1차 아미노산 서열 이외의 다른 번역후 및 다른 변형, 예컨대 혈청 반감기 및 내인성 프로테아제에 대한 내성과 같은 특성을 변경시키는 다른 폴리펩타이드 및 모이어티에 대한 접합 또는 연결을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 변형은 알부민에 대한 연결, 다량체화 도메인(들)에의 연결, 및 페길화를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 페길화, 알부민화, 파르니실화, 카르복실화, 히드록실화, 인산화, 및 당업계에 공지된 다른 폴리펩타이드 변형에 의해 변형될 수 있다. 변형 중에는 특히 시험관 내 발현시 응집을 감소시키기 위해 키모트립신 넘버링에 의한 C122와 같은 자이모겐 내의 유리 시스테인의 세린 또는 알라닌으로의 치환이 있다. 이러한 치환은 선택적이며, 생체 내에서 페길화되거나 발현되는 폴리펩타이드에 반드시 포함되는 것은 아니다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 절단에 의해 보체 단백질 C3을 불활성화시킨다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 C3을 절단함으로써 보체 활성화를 억제하고, 이들은 C3 활성을 불활성화 또는 억제하여 보체 활성화를 억제하는 부위, 예컨대 활성 부위에서 C3를 절단한다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 QHARASHLG 내에서 절단하도록 선택되고 설계되었으며, 특히 P1-P1'이 RA인 경우(QHAR↓ASHL;_서열번호: 47 잔기 737-744 참조, 여기서 절단은 잔기 740과 741 사이임). 그 결과, 이들 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 활성화가 그의 억제가 장애, 질환 및/또는 병태를 치료할 수 있도록 하는 역할을 하는 장애, 질병 및/또는 병태를 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 또한, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 야생형 u-PA에 비해 또는 키모트립신 넘버링에 의해 단지 C122S에 상응하는 치환을 갖는 것에 비해 천연 기질, 예컨대 플라스미노겐에 대해 감소된 활성을 가질 수 있다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드가 임의의 C3 매개된 또는 보체 매개된 또는 관련된 질환 및 병태인 질병 및 병태 중에서. 이들은 안과 장애, 예컨대 연령 관련 황반 변성(AMD) 및 당뇨병성 망막병증, 및 기관 거부, 예컨대 신장 지연 이식편 기능(DGF) 뿐만 아니라 보체 활성화를 억제함으로써 치료될 수 있는 다른 질환, 장애 및 병태를 포함한다. AMD는 유리체내 주사 또는 망막내 또는 망막하 주사에 의한 것과 같이 유리체액으로의 투여에 의해 치료되고, DGF는 정맥내 또는 다른 전신 투여로 치료된다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 융합 단백질은 증가된 반감기 및/또는 감소된 면역원성을 포함하는 바람직한 약리학적 특성을 향상 또는 개선 또는 부여하기 위해 예컨대 페길화에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 질환 및 병태는, 예를 들어 류마티스 관절염(RA), 안구 질환, 막증식성 사구체신염(MPGN), 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 천식, 염증성 장 질환, 면역 복합체(IC) 매개 급성 염증성 조직 손상, 알츠하이머병(AD), 허혈-재관류 손상, 비전형적 용혈성 요독 증후군 (aHUS), 및 보체 3 사구체병증(C3G)을 포함한다.
비변형된 u-PA 폴리펩타이드는 전구체 형태, 성숙 형태, 촉매 도메인, 및 그의 촉매 활성 형태, 및 또한 융합 단백질, 예컨대 실시예 14-16에 기재된 것을 포함한다. 비변형된 u-PA 폴리펩타이드의 예는 서열이 서열번호: 1-6에 기재된 것이다. 비변형된 u-PA 폴리펩타이드 중에는 촉매 도메인 (키모트립신 넘버링에 의한 C122에 상응함) 내의 유리 시스테인이 촉매 활성을 변경시키지 않지만 폴리펩타이드의 응집을 감소시키는 또 다른 아미노산, 예컨대 S 또는 A, 특히 S로 치환된 것이 포함된다. 모든 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 키모트립신 넘버링에 의해 C122에 상응하는 잔기에서 치환, 일반적으로 S를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 제공되는 변형된 유로키나제 유형 플라스미노겐 활성화제(u-PA) 폴리펩타이드 중에는 R35Q, H37Y, V41R, V41L, Y40Q, D60aP, L97bA, T97aI, 및 H99Q에 상응하는 치환, 및 이에 대한 보존적 아미노산 변형물 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 변형을 함유하는 것들이 있으며, 이에 의해 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 u-PA 폴리펩타이드의 변형되지 않은 활성 형태와 비교하여 보체 단백질에 대한 증가된 활성/특이성을 가지며, 여기서: 아미노산 변형은 치환, 삽입 및 결실 중에서 선택되고; 상응하는 잔기는 u-PA의 성숙 형태와의 정렬에 의해 결정될 수 있고; 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질을 절단함으로써, 아미노산 변형을 함유하지 않는 비변형된 u-PA 폴리펩타이드에 비하여 보체 활성화를 억제하거나 감소시키고; 잔기는 키모트립신 넘버링에 의해 넘버링되고; 비변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 1-6 (야생형 인간 전장 u-PA, 야생형 프로테아제(촉매) 도메인 u-PA, 야생형 성숙 u-PA, C122S에 상응하는 치환을 갖는 전장 u-PA, C122S에 상응하는 치환을 갖는 프로테아제 도메인 u-PA, 및 C122S에 상응하는 치환을 갖는 성숙 u-PA) 중 임의의 것에 제시된 서열 및 아미노산 치환(들)을 포함하는 그의 촉매 활성 단편을 포함한다. 보존적 변형은 키모트립신 넘버링에 의해 R35Y, W, F 또는 N; H37 R, Q, E, W 또는 F, V41K, D60aS, T97aD, L 또는 V, L97bG 또는 S 및 H99N 중에서 선택된다.
특히, 이들 변형된 유로키나제 유형 플라스미노겐 활성화제(uPA) 폴리펩타이드 중에는 R35Q, H37Y, V41R, V41L, Y40Q, D60aP, L97bA, T97aI, 및 H99Q에 상응하는 치환 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 함유하는 것들이 있다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 플라스미노겐에서 기질 서열의 절단에 대해 감소된 활성 및/또는 특이성을 갖는다. 폴리펩타이드가 증가된 특이성/활성을 갖는 보체 단백질은 C3이고; 절단은 C3을 불활성화시킨다. 절단 부위의 예는 C3의 활성 부위 내에 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중에는 서열 번호: 5(C122S 치환을 갖는 프로테아제 도메인)의 비변형 u-PA 폴리펩타이드보다 적어도 3배 더 크게 증가된 C3 절단에 대한 활성을 갖는 것들이 있다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드에는 치환 H37Y, 예를 들어 치환 H37Y/V38E를 함유하는 것들이 포함된다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 치환 R35Y/H37K 또는 R35Q/H37K를 함유하는 것들, 예컨대 치환 R35Y/H37K/V38E 또는 R35Q/H37K/V38E를 포함하는 것들을 포함한다.
또한, 치환 L97bA 및/또는 R35Q, 및/또는 H99Q, 및/또는 D60aP, 및/또는 T97aI를 또한 함유하는, 전술한 것들을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 제공된다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 T39Y, T39W, T39F, 예를 들어 T39Y에 상응하는 아미노산 치환, 또는 T39M 또는 T39L로부터 선택된 보존적 치환을 추가로 포함할 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 다른 것은 아미노산 치환 R35Q/H37Y 및/또는 V38E/V41R/Y149R을 포함하거나 추가로 포함한다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드의 다른 것은 변형 V41R을 포함하는 것들, 예를 들어 변형 V38E/V41R를 포함하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드며, 위치 R35, H37 및 V38 중 하나 이상에서 치환을 추가로 포함하는 것들을 포함한다. 이들은 V38에서의 치환이 E인 변형된 u-PA 폴리펩타이드, 예를 들어, R35Y/H37S/V38E/V41R, H37Y/V38E, 및 예컨데 체액에서 C3의 절단 및/또는 안정성에 기여하는 잔기들의 다른 조합을 포함하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중에는 시험관 내 검정에서 100 nM, 또는 50 nM 또는 30 nM 또는 25 nM 이하의 C3의 불활성화 절단에 대한 ED50를 갖는 것이 제공된다. 이들의 예는 표 14에 제시된 것들(여기서 ED50은 100 nM 이하임), 또는 표 14에 제시된 것들(여기서 ED50은 50 nM 미만임), 또는 표 14에 제시된 것들(여기서 ED50은 30 nM 미만임), 또는 표 14에 제시된 것들(여기서 ED50는 25 nM 미만임)이다. ED50을 평가하기 위한 검정의 예는 기질 보체 단백질 인간 C3을 다양한 농도의 각각의 변형된 프로테아제와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 특히, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 50 nM 이하의 ED50으로 C3을 절단하는 임의의 것이다.
비변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 1-6 중 임의의 것에 제시된 아미노산의 서열로 이루어질 수 있거나 또는 추가의 삽입 및 결실을 포함하는 추가의 변형을 포함할 수 있다. 본원의 임의의 치환, 삽입 또는 결실은 비변형된 u-PA 폴리펩타이드, 예컨대 프로테아제 도메인, 특히 서열번호: 5의 프로테아제 도메인에 포함될 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 1-6 중 임의의 것의 폴리펩타이드 또는 그의 촉매 활성 부분과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 1-6 중 임의의 것의 비변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 그의 촉매 활성 부분에 비하여 1 또는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유할 수 있다.
따라서, 변형 V41R, 또는 H37Y, 또는 L97bA, 또는 R35Q, 또는 H99Q, 또는 D60aP, 또는 T97aI 또는 이들의 조합을 함유하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 제공된다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것은 T39Y, T39W, T39F에 상응하는 아미노산 치환 또는 T39M 또는 T39L로부터 선택된 그의 보존적 치환을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 아미노산 치환 T39Y, 예컨대 조합 T39Y/V41R, 및 최대 12 또는 13개의 추가의 변형 뿐만 아니라 선택적 C122S를 추가로 함유할 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것은 아미노산 치환 V38E를 추가로 함유할 수 있고, 아미노산 변형 R35Q, Y60bQ 및/또는 Y149R 중 하나 이상을 추가로 함유할 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것은 아미노산 변형 R37aE 또는 R37aS를 추가로 함유할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 치환 R35Q/H37Y/T39Y/V41R 또는 R35Q/H37Y/T39Y/V41R/C122S를 함유할 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것은 H99Q에 상응하는 치환을 함유할 수 있다.
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중에는 아미노산 변형 R35Q/H37Y/T39Y/V41R/L97bA/H99Q/C122S 또는 R35Q/H37Y/T39Y/V41R/L97bA/H99Q, 또는 T39Y/V41R/Y60bQ/L97bA/H99Q 또는 T39Y/V41R/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S 또는 T39Y/V41R/D60aP/L97bA/H99Q/C122S 또는 T39Y/V41R/D60aP/L97bA/H99Q/C122S를 함유하는 것이 있다. 또한 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중에는 Y40Q/V41L/L97bA/C122S 또는 Y40Q/V41R/L97bA/C122S 또는 Y40Q/V41L/L97bA 또는 Y40Q/V41R/L97bA 또는
R37aS/V41R/L97bG/H99Q 또는 R37aS/V41R/L97bG/H99Q/C122S 또는
T39Y/V41L/L97bA/H99Q/C122S 또는 T39Y/V41R/L97bA/H99Q/C122S에 상응하는 아미노산 변형을 함유하는 것이 있다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드 중에는 변형: R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 또는
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/Y149R를 함유하는 것이 포함된다.
아미노산 변형을 함유하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 제공되고, 하기의 변형을 갖는 폴리펩타이드가 포함된다: H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
R35Q/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
R35Q/H37Y/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
R35Q/H37Y/R37aE/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/H99Q/C122S/Y149R; 또는
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/C122S/Y149R; 또는
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S 또는
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aA/Y60bP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R
또는
R35L/H37D/R37aS/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R
또는
R35M/H37G/R37aD/V38E/T39W/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R
또는
R35Q/H37G/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R
또는
R35A/H37G/R37aE/V38E/T39F/V41R/D60aE/Y60bP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R
또는
R35Q/H37S/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R
또는
R35Q/H37T/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aE/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R
또는
R35Q/H37G/R37aE/V38E/T39H/V41R/D60aP/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R
또는
R35W/H37D/R37aS/V38E/T39Y/V41R/D60aE/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 또는
R35Q/H37G/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 또는
R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bL/D97T/T97aE/L97bG/A98S/H99L/C1 22S 또는
R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41K/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192A 또는
R35Y/H37V/R37aW/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192T 또는
R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41K/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192T 또는
각각은 C122에서의 치환을 갖지 않음. 예시적인 이들 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 변형 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R을 함유하는 것들이다.
이들 폴리펩타이드의 예는 서열번호: 8 내지 44 및 987, 예컨대 21 및 39 내지 44에 기재된 서열을 갖는 폴리펩타이드뿐만 아니라 서열번호: 8-44에 기재된 서열 및 이의 촉매 활성 부분을 갖는 폴리펩타이드를 함유하는 전구체 및 전장 변형된 u-PA 폴리펩타이드이다. 또한, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것에서 키모트립신 넘버링에 의해 잔기 122의 Cys는 Ser로 치환될 수 있거나, 또는 Cys로 유지될 수 있는 것으로 이해된다. Cys는 변형된 u-PA 프로테아제 도메인을 함유하는 융합 단백질을 비롯한 폴리펩타이드가, 유리 C122가 폴리펩타이드 내의 또 다른 유리 Cys와의 디설파이드 결합을 형성하거나, 또는 Cys가 예를 들어 페길화에 의해 변형된 2개의 사슬 형태로서 사용되도록 의도된 구현예에 유지된다. 본원에 기재된 모든 구현예에서, 위치 122는 Cys 또는 Ser일 수 있다. 당업자는 의도된 용도에 따라 적절한 잔기를 선택할 수 있다.
비변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 2 또는 서열번호: 5의 프로테아제 도메인만을 포함하거나 함유하는, 서열번호: 1-6 중 임의의 것의 프로테아제 도메인, 또는 이의 촉매 활성 부분을 포함한다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 번역 후 변형, 글리코실화 부위를 도입 또는 제거하는 변형, 혈청 반감기를 증가시키고/거나 면역원성을 감소시키기 위해 또는 둘 다를 위해 PEG와 같은 중합체에 대한 연결 또는 접합과 같은 변형을 포함하는 추가의 변형을 함유할 수 있다. 특히, 본원에 기재되고 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것 및 모두가 페길화될 수 있다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 융합 단백질, 예컨대 Fc 도메인, 또는 표적화된 세포 또는 항원에 특이적인 표적화제와의 융합 단백질이 또한 제공된다.
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 융합 단백질 중에는 PBS 또는 체액, 예컨대, 안방수 또는 혈청 중에서 7일 동안 인큐베이션한 후 50% 또는 80% 초과의 안정성을 갖는 것이 있다. 또한, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중에는 활성 형태인 경우, 비변형 u-PA 폴리펩타이드의 상응하는 형태와 비교하여 플라스민에 대해 적어도 100배 감소된 활성을 갖는 것이 있다.
또한, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 융합 단백질 중에는 본원의 실시예에 예시된 것과 같은 시험관 내 분석에서 100 nM, 또는 50 nM 또는 30 nM 또는 25 nM 또는 15 nM 또는 10 nM 이하의 C3의 불활성화 절단에 대한 ED50을 갖는 것이 있다. 이들은 실시예 2에 기재된 바와 같이 평가된 ED50을 나타내는 변형된 u-PA 폴리펩타이드 프로테아제 도메인에 대한 ED50 및 다수의 돌연변이 스트링(string)을 열거하는, 표 14에 제시된 프로테아제 도메인을 함유하거나 또는 상기 프로테아제 도메인인 폴리펩타이드를 포함한다. ED50이 100 nM 이하, 50 nM 미만, 30 nM 미만, 25 nM 미만, 15 nM 미만, 10 nM 미만인 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 융합 폴리펩타이드는 프로테아제 도메인으로서 사용될 수 있는 것들 중 하나이거나, 더 긴 u-PA 형태 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질에서 사용될 수 있다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드, 또는 비-프로테아제 폴리펩타이드 또는 이의 일부에 융합된 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 임의의 것의 촉매 활성 부분을 함유하는 융합 단백질을 포함하는 접합된 단백질이 제공된다. 다량체화 도메인, 예컨대 Fc 도메인, 혈청 안정성을 증가시키는 폴리펩타이드, 예컨대 알부민, 또는 단백질 형질도입 도메인 (PTD)을 포함하는 것과 같은 비-프로테아제 폴리펩타이드가 제공된다.
상기 논의된 바와 같이, 모든 변형은 그의 서열이 서열번호: 1-6 중 임의의 것에 제시된 비변형된 폴리펩타이드 및 그의 촉매 활성 부분에서일 수 있다. 폴리펩타이드 중에는 비변형된 폴리펩타이드가 서열번호: 5에 제시된 서열을 갖는 것 (C122S 치환을 갖는 프로테아제 도메인)이 포함된다.
또한, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 추가의 폴리펩타이드, 예컨대 혈청 알부민, 다량체화 도메인, 신호 서열 및 발현 및 단리를 용이하게 하는 다른 트래피킹 서열 및 태그를 함유하는 융합 단백질이 제공된다. 융합 단백질은 또한 u-PA 부분을 활성화하기 위한 활성화 서열을 포함할 수 있다. 융합 단백질의 활성 형태는 C3을 절단하는 활성 융합 단백질을 생성하는 신호 서열, 및 임의의 다른 프로세싱 및 트래피킹 신호의 발현 및 제거시 생성된다. 융합 단백질의 활성 형태는 2개의 사슬 활성화된 형태 및 또한 이량체, 예컨대 다량체화 도메인의 포함으로부터 생성된 것을 포함한다.
융합 단백질 중에는 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 촉매 활성 부분, 예컨대 비-프로테아제 폴리펩타이드 또는 이의 일부에 융합된 표 14의 것을 함유하는 것이 있다. 융합 단백질은 또한 활성화 서열, 및 프로세싱 전에 신호 서열 및 다른 트래피킹 신호를 포함할 수 있다. 비-프로테아제 폴리펩타이드는 바람직한 약제학적 활성 또는 특성을 부여하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 것, 다량체화 도메인, 예컨대 Fc, 단백질 형질도입 도메인(PTD), 히알루론산 결합 도메인(HABD), 특정 항원에 대한 표적에 대한 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 융합 단백질은 또한 활성화 서열, 예컨대 천연 u-PA 활성화 서열 또는 퓨린 활성화 서열을 포함할 수 있다. 퓨린 활성화 서열의 예는 QSGQKTLRRRKR (서열번호: 996) 또는 QCGQKTLRRRKR (서열번호: 995) 또는 QSGQKTLRRKR (서열번호: 1044) 또는 그와 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 퓨린 활성 부위이거나 이를 포함하는 것이다.
예를 들어, 본원에 기재되거나 제공된 바와 같은 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질, 및 또한 프로세싱 또는 활성화 전에 신호 서열 및 변형된 U- PA 폴리펩타이드 또는 이의 촉매 활성 부분을 포함한다. 융합 단백질의 분비를 인코딩하는 신호 서열은, 예를 들어, Il-2, u-PA, 또는 IgGκ로부터의 신호 서열을 포함한다.
융합 단백질은 융합 파트너, 예컨대 다량체화 도메인, 또는 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드, 또는 또 다른 바람직한 약리학적 특성 또는 활성을 부여하는 것을 포함할 수 있다. 이들의 예는 알부민, 또는 Fc 도메인, 또는 단일 사슬 항체 또는 항체의 다른 항원 결합 단편, 또는 하이알루론산 결합 도메인 (HABD)이다. 예시적인 융합 파트너는 종양 괴사 인자 자극 유전자-6 (TSG-6); HSA, IgG Fc, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예컨대 항 유형 II 콜라겐 항체 scFv 단편 또는 항-VEGFR 항체, 또는 그의 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
융합 단백질은 또한 u-PA를 함유하는 생성된 융합 단백질이 활성 형태, 예컨대 2 사슬 형태로 존재하도록 활성화 서열을 포함할 수 있다. 활성화 서열은 변형된 u-PA 폴리펩타이드 내에 유리 Cys, 예컨대 C122와의 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 시스테인을 함유하거나 함유하도록 변형될 수 있고, 이에 의해 활성화 시, 생성된 활성화된 폴리펩타이드는 2개의 사슬을 포함한다. 예시적인 활성화 서열은 u-PA 활성화 서열 및 퓨린 활성화 서열, 및 그의 변경된 형태, 예컨대 서열번호: 995-998, 1041, 및 1044 중 임의의 것에 제시된 서열 또는 그와 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 활성화 서열이다.
예시적인 융합 단백질은 서열번호: 1014, 1015, 1016, 1019 및 1040 중 임의의 것에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는 임의의 것과 같은 활성화 서열, 변형된 u-PA 폴리펩타이드, 및 HSA, 또는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 (그리고 u-PA 부분의 서열에서 변형을 함유하는) 변경된 형태를 함유하는 것들이다. 치료 방법에서 사용하기 위해, 융합 단백질은 일반적으로 신호 서열을 함유하지 않는다. 유전자 요법 방법에서 사용하기 위해, 핵산은 신호 서열을 인코딩할 수 있다.
이러한 융합 단백질, 예를 들어, 서열번호: 1004-1019 및 1034-1040 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 것 또는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 것(및 u-PA 부분의 서열에서 변형을 함유하는 것)이 제공된다. 융합 단백질의 예는 서열번호: 1015 또는 1019에 제시된 아미노산의 서열을 갖는 것이다. 특히, 신호 서열은 사용 전에 또는 생체 내 발현시에 또는 시험관 내에서 생산될 때 제거된다. 이들은 A 사슬 및 B 사슬을 함유하는 2-사슬 활성화된 형태인 것을 포함한다. 예를 들어, B 사슬이 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 잔기 IIGG에서 시작하고 융합 단백질의 C-말단에서 종결되는 융합 단백질, 예컨대 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 HSA를 함유하는 것들, 서열번호: 1005, 1011, 1014, 1015 및 1036 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열을 함유하지만 신호 서열은 결여된 것들. 활성화된 형태의 융합 단백질의 예는 잔기 21-178의 A 사슬, 및 잔기 168-299 사이에 디설파이드 연결을 갖는 단백질의 C-말단에 잔기 179-의 B 사슬을 함유하는 융합 단백질이다. 이들은 또한 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 (그리고 u-PA 부분의 서열에서 변형을 함유하는) 융합 단백질을 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, A 사슬 및 B 사슬을 함유하는 융합 단백질이 제공되며, 여기서 A 사슬은 서열번호: 1015의 잔기 21-178로 이루어지고, B 사슬은 잔기 179-1022로 이루어지고; A 및 B 사슬들은 디설파이드 가교를 통해 서열번호: 1015의 C168과 C299 사이에 연결된다.
본원에 제공된 다른 융합 단백질은 프로세싱시 다량체, 예컨대 상보성 다량체화 도메인, 예컨대 Fc 도메인의 상호작용을 통해 형성되는 이량체를 형성하는 다량체화 도메인을 함유한다.
또한, 모든 구현예에서와 같이, 융합 단백질, 특히 활성화된 형태 또는 이의 다수를 포함하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 제1 조성물, 및 보체 매개 질환 또는 장애를 치료하기 위한 제2 제제 또는 제제들을 함유하는 제2 조성물을 함유하는, 키트로서 포장될 수 있는 조합물이 제공된다. 제2 제제 또는 제제들은, 예를 들어, 항염증제(들) 또는 항응고제(들)일 수 있다. 이러한 제제의 예는 비스테로이드 항-염증성 약물 (NSAID), 항대사산물, 코르티코스테로이드, 진통제, 세포독성제, 전-염증 사이토카인 억제제, 항-염증성 사이토카인, B 세포 표적화 제제, T 항원을 표적화하는 화합물, 부착 분자 차단제, 케모카인 수용체 길항제, 키나제 억제제, PPAR-g (감마) 리간드, 보체 억제제, 헤파린, 와파린, 아세노쿠마롤, 페닌디온, EDTA, 시트레이트, 옥살레이트, 아르가트로반, 레피루딘, 비발리루딘 및 지멜라가트란 중 임의의 1종 이상으로부터 선택된 항염증제(들)이다.
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 융합 단백질 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 이러한 핵산 분자를 함유하고 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 벡터가 또한 제공된다. 벡터는 원핵생물 벡터, 및 포유동물 및 곤충 벡터, 예컨대 배큘로바이러스 벡터, 효모 벡터, 예컨대 피치아 및 사카로마이세스(Saccharomyces)를 포함하는 진핵생물 벡터, 및 바이러스 벡터, 예컨대 단순 포진 바이러스 벡터, 또는 백시니아 바이러스 벡터, AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 벡터는 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및/또는 벡터, 예컨대 아데노바이러스 및 AAV 바이러스, 특히 유전자 요법을 위한 관심 조직, 예컨대 간 또는 눈에 대한 굴성을 갖는 것들의 생산을 위한 발현 벡터일 수 있다.
벡터가 발현되는 조건 하에 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 인코딩하는 벡터 또는 핵산을 함유하는 세포를 성장시키고, 선택적으로, 발현된 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 단리 또는 회수함으로써, 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 생산하는 방법이 제공된다.
핵산 분자 또는 벡터를 함유하는 단리된 세포 및 세포 배양물이 또한 제공된다. 세포는 비-인간 세포 또는 인간 세포 배양물일 수 있지만, 인간으로 발달하는 임의의 접합체 또는 세포를 포함하지 않는다. 세포는 포유동물 세포 및 박테리아 세포를 포함하고, 박테리아 세포, 예컨대 대장균(E. coli), CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0, BHK, 곤충 세포, 효모 세포 및 폴리펩타이드의 재조합 발현에 통상적으로 사용되는 다른 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 생산하는 방법은 인코딩된 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 발현되는 조건 하에서 세포를 성장시키는 단계, 및 선택적으로 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 단리 또는 정제하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 이의 접합체, 예컨대 융합 단백질은 단백질을 당화시키는 세포에서 생성된다. 단리된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 예를 들어 페길화에 의해 추가로 변형될 수 있다.
또한, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 융합 단백질 및/또는 핵산 및/또는 벡터를 함유하는 약제학적 조성물이 제공된다. 보체 활성화를 억제함으로써 보체 활성화에 의해 매개되거나 또는 보체 활성화가 질환 또는 장애의 병인 또는 근본적인 병인에서 역할을 하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물, 핵산 또는 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 용도가 제공된다. 특히, 보체 활성화에 의해 매개되거나 이를 수반하는 이러한 질환, 장애 및 병태를 치료하기 위한 유전자 요법을 위한 핵산 분자 및/또는 벡터의 용도가 제공되며, 여기서 보체 활성화의 억제는 질환 또는 병태의 치료 또는 개선에 영향을 미친다. 벡터를 투여하거나 핵산 분자를 투여함으로써 보체 활성화에 의해 매개되거나 이를 수반하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 특히, 질환, 장애 및 병태는 C3의 불활성화에 의해 보체 활성화 효과 치료를 억제 또는 감소시키는 질환, 장애 및 병태이다.
보체 매개 질환, 장애 또는 병태 또는 보체 활성화가 병인 또는 근본적인 병인에서 역할을 하는 질환, 장애 및 병태는 임의의 염증성 장애, 패혈증, 류마티스성 관절염(RA), 안구 또는 안과용 질환, 심혈관 장애, 막증식성 사구체신염(MPGN), 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 천식, 염증성 장 질환, 면역 복합체(IC) 매개 급성 염증성 조직 손상, 알츠하이머병 (AD), 허혈-재관류 손상, 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS), 보체 3 사구체병증(C3G), 및 기관 이식 거부, 특히 지연 기관 이식 거부를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 질환 및 장애는 안구 또는 안과 장애, 예컨대 황반 변성 또는 당뇨병성 망막병증, 또는 이식된 기관으로 인한 염증을 포함한다. 질환, 장애 및 병태 중에는 연령 관련 황반 변성(AMD) 및 지연 신장 이식 기능(DGF)이 포함된다.
보체 활성화를 억제하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 보체 단백질 C3과 접촉시킴으로써 실시되며, 이에 의해 보체 활성화가 감소 또는 억제되도록 보체 단백질 C3이 절단된다. 접촉은 시험관 내에서 수행될 수 있지만, 일반적으로 보체 불활성화 또는 감소가 요망되는 대상체에 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 투여함으로써 생체 내에서 수행된다. 투여는 전신, 예컨대 정맥내를 비롯한 비경구, 또는 국소, 예컨대 환부 조직, 예컨대 눈의 접촉에 의한 것일 수 있다. 눈으로의 투여는 단백질 형질도입 도메인에 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 연결함으로써, 또는 유리체내 주사, 망막내, 또는 망막하 주사, 또는 다른 이러한 방법에 의한 점적을 포함한다. DGF와 같은 질환 및 병태의 경우, 투여는 정맥내 투여에 의해 수행될 수 있다. 다른 방법은 피하 및 경피 투여를 포함한다.
방법 및 용도는 보체 활성화의 억제가 염증성 장애, 신경퇴행성 장애, 안과 장애 및 심혈관 장애로부터 선택된 보체 매개 질환 또는 장애와 연관된 염증성 증상의 감소를 유발하는 임의의 질환, 장애 또는 병태의 치료를 포함한다. 이들은 염증성 질환, 병태 및 장애, 패혈증, 류마티스성 관절염(RA), 안구 장애, 막증식성 사구체신염(MPGN), 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 천식, 염증성 장 질환, 면역 복합체(IC) 매개 급성 염증성 조직 손상, 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS), 보체 3 사구체병증(C3G), 알츠하이머병 (AD), 안과 장애, 예컨대 AMD 및 당뇨병성 망막병증, 및 허혈-재관류 손상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 허혈-재관류 손상은 심근경색(MI), 뇌졸중, 혈관성형술, 관상동맥 우회로 이식, 심폐 우회로(CPB), 및 혈액투석 또는 대상체의 치료로부터 선택된 사건 또는 치료와 관련하거나 이에 의해 유발될 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 사용한 치료는 대상체의 치료 전에 수행된다. 치료는 기관 이식을 포함한다. 질환, 장애 또는 병태는 안과 병태를 포함하거나 안구 질환이거나 또는 이식된 장기로 인한 거부 또는 염증, 예컨대 당뇨병성 망막병증 또는 황반 변성이다. 특히, 지연된 신장 이식 기능(DGF)의 치료 방법과 마찬가지로, 연령 관련 황반 변성(AMD)의 치료 방법이 제공된다. 치료는 정맥내로 또는 피하로 또는 국소적으로, 예컨대 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 눈에 주사함으로써 수행될 수 있다. 유리체내 또는 망막내, 망막하, 주사 또는 단백질 형질도입 도메인에 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 연결하여 유리체액 내로의 형질도입을 용이하게 한다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 특정 기관 또는 조직에 대한 폴리펩타이드의 표적화를 수행하거나, 혈청 반감기를 증가시키거나 면역원성을 감소시키는 모이어티, 예컨대 페길화 및/또는 Fc 도메인 또는 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 대한 연결에 연결되거나 접합될 수 있다.
따라서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 투여함으로써, 보체 매개 장애 또는 병태, 또는 보체 활성화가 이러한 장애 또는 병태에서 역할을 하는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 융합 단백질의 이러한 용도가 또한 제공된다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 융합 단백질은 보체 단백질 C3을 절단함으로써 보체 활성화를 억제하거나 감소시키기 때문에 치료에 효과적이거나 이러한 치료를 위해 사용될 수 있다. 보체 활성화의 억제는 염증 반응을 수반하는 보체 매개 장애, 질환 또는 병태와 연관된 염증 증상의 감소를 초래하고, 염증성 장애, 신경퇴행성 장애 및 심혈관 장애로부터 선택된 보체 매개 질환, 병태 또는 장애와 연관된 염증성 증상의 감소를 초래한다. 이들은 안과 병태, 예컨대 당뇨병성 망막병증 및 황반 변성, 및 또한 지연 기관 거부, 예컨대 DGF를 포함한다.
용도 및 방법을 위한 복용량 및 단일 투여 제형이 본원에 제공된다. 단일 복용량은 숙련된 의료 종사자에 의해 경험적으로 결정될 수 있고, 예를 들어, 국소 투여에 대해 0.1 mg 내지 1 mg, 및 정맥내 투여와 같은 전신에 대해 0.1 mg 내지 10, 15, 20, 30 mg 또는 그 이상 범위인 단일 복용량을 포함한다. 특정한 복용량은 특정한 장애 또는 질환 또는 병태, 치료되는 대상체, 질환, 장애 또는 병태의 단계; 투여 경로, 요법 및 다른 이러한 파라미터에 따라 달라진다. 복용량은 매일, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일마다, 적어도 격주로, 적어도 2주, 3주, 4주 또는 더 긴 간격마다 반복될 수 있다. 특정 레지멘 및 복용량은, 예를 들어 대상체의 치료되는 장애, 투여 방식, 및 특히 체중에 따라 달라진다. 이의 결정은 숙련된 의료 종사자의 기술 내에 있다.
또한, 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 변형 V41R 또는 V41L, 특히 V41R, 예컨대 V41I 또는 R 및 V38E, 및 H37Y/V38E를 함유하는 것을 포함하는, 방법, 용도 및 조합 및 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 융합 단백질이 제공된다. 이러한 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 예는 변형 Y40Q/V41R/L97bA 또는 Y40Q/V41L/L97BA 또는 R37aS/V41R/L97bG/H99Q, 또는 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/Y149R을 함유하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드이다. 변형은 서열번호: 1-6 중 임의의 것에 기재된 것을 포함하는 임의의 비변형된 u-PA 폴리펩타이드, 및 V41에 상응하는 잔기를 포함하는 이의 촉매 활성 부분에서 이루어진다. 이러한 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 예는 서열번호: 21 또는 987 또는 서열번호: 40-44, 또는 키모트립신 넘버링에 의해 C122에서 변형되지 않은 40-44 중 임의의 것에 제시된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 이의 촉매 활성 부분, 및 이의 변경된 형태, 예컨대 페길화된 형태, 및 융합 단백질 및 변경된 형태다.
또한, 서열번호: 21 및 40-44 중 임의의 것에 제시된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드, 및 이의 변경된 형태, 예컨대 페길화된 형태를 포함하는, 본원에 기재되고 제공된 바와 같은 (활성화된 형태의) 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 정맥내 투여함으로써 DGF와 같은 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 단일 복용량은 숙련된 의료 종사자에 의해 경험적으로 결정될 수 있고, 0.1 mg 내지 1 mg 범위의 단일 복용량을 포함한다. 복용량은 대상체, 질환 또는 장애, 예컨대 DGF의 중증도 또는 단계에 의존한다. 치료는 복수회, 예컨대 1일 2, 3 또는 4회, 1일 1회, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일마다, 매주, 격월 또는 매월 반복될 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 치환/삽입, 키모트립신 넘버링에 의해 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 및 성숙 넘버링에 의해 R20Q/H22Y/R23E/V27E/T28Y/V30R/D50P/Y51Q/T91I/L92A/H94Q/C121S/Y148R을 포함하는 것일 수 있다. 그의 예는 서열번호: 21에 제시된 프로테아제 도메인 또는 그의 촉매 활성 부분을 함유하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드, 또는 프로테아제 도메인을 함유하는 전장 또는 전구체 형태, 및 그의 변경된 형태, 예컨대 페길화된 형태 및 융합 단백질이다. 투여는 정맥내, 피하, 경피, 국소, 근육내, 경구 및 다른 전신 투여 경로를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 투여된 형태는 일반적으로 단백질의 성분(예를 들어, 실시예 15 참조)에 따라 2개의 사슬 형태인 활성화된 형태이다.
상기 및 하기에 기재된 바와 같은 본원에 기재된 방법은 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것, 및 그의 변경된 형태, 예컨대 페길화된 형태 및 융합 단백질, 예컨대 단백질 형질도입 도메인을 함유하는 것을 눈에 투여함으로써 안과 장애 또는 안구 장애를 치료하는 방법을 포함한다. 보체 활성화를 수반하는 안과 장애, 질환 또는 병태는 당뇨병성 망막병증 및 황반 변성, 예컨대 AMD를 포함한다. 복용량은 상기 기재된 바와 같고, 0.1 mg 내지 1 mg의 단일 복용량을 포함한다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 치환 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 또는
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/Y149R, Y40Q/V41L/L97bA/C122S 또는 Y40Q/V41R/L97bA/C122S 또는 Y40Q/V41L/L97bA 또는 Y40Q/V41R/L97bA, 및 서열번호: 21 및 40 내지 44 중 임의의 것에 기재된 아미노산 잔기의 서열 및 이의 촉매 활성 부분뿐만 아니라 이의 변경된 형태를 함유하는 것들을 포함한다. 치료는 복수회, 예컨대 1일 1회 반복될 수 있다. AMD 또는 DGF를 치료하기 위한 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 이의 변경된 형태의 용도가 제공된다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 치환 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 또는
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/Y149R 또는 Y40Q/V41L/L97bA/C122S 또는 Y40Q/V41R/L97bA/C122S 또는 Y40Q/V41L/L97bA 또는 Y40Q/V41R/L97bA 및 페길화되거나 본원에서 기재된 바와 같은 융합 단백질인 그것의 변경된 형태를 함유하는 것들을 포함하는 본원에 기재된 임의의 것을 포함한다.
도 1은 고전적, 렉틴 및 대안적인 보체 경로 및 말단 보체 복합체, 막 공격 복합체(MAC)의 활성화의 개요를 나타낸다. 상기 도면은 보체 캐스캐이드에 참여하는 30개 초과의 단백질 중 다수, 상기 캐스케이드 내에서의 이들의 작용, 및 적용가능한 경우, 보체 경로 사이의 이들의 수렴점을 도시한다. 예를 들어, 3개의 경로는 C3 전환효소의 생성시 수렴되며, 이는 C3을 절단하여 C5 전환효소를 형성하여 MAC 복합체를 형성한다. 상기 도면은 또한 많은 보체 절단 생성물의 생성을 도시한다.
도 2a 및 2b는 N-말단 u-PA 융합 단백질의 개략도이다. 도 2a는 u-PA 촉매 도메인에 대한 융합 파트너(즉, Fc) N-말단을 함유하는 N-말단 u-PA 융합 단백질의 개략도이다. 예시적인 N-말단 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 신호 서열, Fc(융합 파트너), AGS(링커), u-PA 활성화 서열, 및 변형된 u-PA 촉매 도메인을 함유하는 서열번호: 1004에 기재되어 있다. 도 2b는 융합 파트너를 함유하지 않는 N-말단 야생형 단백질의 개략도이다. 예시적인 N-말단 야생형 단백질은 서열번호: 1005에 제시되며, 이는 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 신호 서열, u-PA의 N-말단, u-PA 활성화 서열, 및 변형된 u-PA 촉매 도메인을 함유한다.
도 3a 내지 3c는 C-말단 u-PA 융합 단백질의 개략도이다. 도 3a는 u-PA 촉매 도메인에 대한 C-말단의 융합 파트너를 함유하는 C-말단 u-PA 융합 단백질의 개략도이며, 여기서 융합 단백질은 u-PA 촉매 도메인의 N-말단에 활성화 서열이 결여되어 있다. 예시적인 C-말단 융합 단백질은 인간 IL2 신호 서열(hIL2SP), 변형된 u-PA 촉매 도메인, 링커, 및 Fc (융합 파트너)를 함유하는 서열번호: 1006에 제시된다. 또 다른 예시적인 C-말단 융합 단백질은 인간 IL2 신호 서열(hIL2SP), 변형된 u-PA 촉매 도메인, 링커, 및 HSA (융합 파트너로서 인간 혈청 알부민)를 함유하는 서열번호: 1007에 제시된다. 또 다른 예시적인 C-말단 융합 단백질은 인간 IL2 신호 서열(hIL2SP), 변형된 u-PA 촉매 도메인, 링커, 및 콜라겐 II (C2scFv)에 결합하는 scFv (융합 파트너)를 함유하는 서열번호: 1008에 제시된다. 또 다른 예시적인 C-말단 융합 단백질은 인간 IL2 신호 서열(hIL2SP), 변형된 u-PA 촉매 도메인, 링커, 및 HABD (히알루론산 결합 도메인 (융합 파트너)를 함유하는 서열번호: 1009에 제시된다. 또 다른 예시적인 C-말단 융합 단백질은 인간 IL2 신호 서열(hIL2SP), 야생형 u-PA 촉매 도메인, 링커, 및 Fc (융합 파트너)를 함유하는 서열번호: 1012에 제시된다. 또 다른 예시적인 C-말단 융합 단백질은 인간 IL2 신호 서열(hIL2SP), 야생형 u-PA 촉매 도메인, 링커, 및 HSA (융합 파트너)를 함유하는 서열번호: 1013에 제시된다. 도 3b는 u-PA 촉매 도메인에 대한 융합 파트너(즉, Fc 또는 HSA) C-말단을 함유하는 C-말단 u-PA 융합 단백질의 개략도이다. 예시적인 C-말단 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 신호 서열, 퓨린 활성화 부위, 변형된 u-PA 촉매 도메인, 링커 및 Fc(융합 파트너)를 함유하는 서열번호: 1010에 기재되어 있다. 또 다른 예시적인 C-말단 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파 (κ) 신호 서열, 퓨린 활성화 서열, 변형된 u-PA 촉매 도메인, 링커, 및 HSA (융합 파트너)를 함유하는 서열번호: 1016에 제시된다. 도 3c는 u-PA 촉매 도메인의 C-말단에 융합 파트너(즉, Fc 또는 HSA) 및 u-PA 촉매 도메인의 N-말단에는 융합 파트너 (즉, u-PA의 야생형 N-말단)를 함유하는 u-PA 융합 단백질의 개략도이다. 예시적인 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 신호 서열, u-PA N-말단 도메인, 변형된 u-PA 촉매 도메인, 링커 및 Fc(융합 파트너)를 함유하는 서열번호: 1011에 제시된다. 또 다른 예시적인 C-말단 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파 (κ) 신호 서열, u-PA의 N-말단 영역, 퓨린 활성화 부위, 변형된 u-PA 촉매 도메인, 링커, 및 HSA (융합 파트너)를 함유하는 서열번호: 1014에 제시된다. 또 다른 예시적인 C-말단 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 신호 서열, u-PA의 N-말단 영역, u-PA 활성화 서열, 변형된 u-PA 촉매 도메인, 링커, 및 HSA(융합 파트너)를 함유하는 서열번호: 1015에 제시된다.
도 4a 내지 도 4h는 융합 단백질의 활성화된 형태의 개략도이며, 여기서 SPD는 세린 프로테아제 도메인(본원에서 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 프로테아제 도메인)을 지칭하고; u-PA N-말단은 일반적으로 u-PA의 잔기 1-178 또는 이의 임의의 변경된 형태를 지칭한다. 도 4a는 u-PA 프로테아제 도메인의 C-말단에 Fc 도메인 (서열번호: 21) 및 퓨린 활성화 서열을 함유하는 서열번호: 1010의 융합 단백질의 개략도이며, 여기서 Fc 도메인 사이의 디설파이드 연결은 이량체를 형성한다. 도 4b는 u-PA 프로테아제 도메인의 C-말단에 Fc 도메인(서열번호: 987)을 함유하고, 단백질의 N-말단에서 u-PA의 N-말단 및 u-PA 활성화 서열을 함유하는 서열번호: 1011의 융합 단백질의 개략도이며, 여기서 Fc 도메인 사이의 디설파이드 결합은 이량체를 형성한다. 도 4c는 u-PA 프로테아제 도메인의 C-말단에 Fc 도메인(서열번호: 987), 및 융합 단백질의 N-말단에서 u-PA의 N-말단 및 퓨린 활성화 서열을 함유하는 서열번호: 1036에 제시된 융합 단백질의 개략도이며, 여기서 Fc 도메인 사이의 디설파이드 결합은 이량체를 형성한다. 도 4d는 u-PA 프로테아제 도메인의 C-말단에 HSA(서열번호: 987) 및 융합 단백질의 N-말단에서 u-PA의 N-말단 및 퓨린 활성화 서열을 함유하는 서열번호: 1014에 기재된 융합 단백질의 개략도이다. 도 4e는 u-PA 프로테아제 도메인의 C-말단에 HSA(서열번호: 987) 및 융합 단백질의 N-말단에서 u-PA의 N-말단 및 u-PA 활성화 서열을 함유하는 서열번호: 1015에 기재된 융합 단백질의 개략도이다. 도 4f는 u-PA 프로테아제 도메인의 C-말단에 HSA (서열번호: 21) 및 프로테아제 도메인의 N-말단의 퓨린 활성화 서열을 함유하는 서열번호: 1016에 제시된 융합 단백질의 개략도이다. 도 4f는 u-PA 프로테아제 도메인의 C-말단에 HSA (서열번호: 21) 및 프로테아제 도메인의 N-말단의 SUMO 활성화 서열을 함유하는 서열번호: 1017에 제시된 융합 단백질의 개략도이다. 도 4h는 u-PA 프로테아제 도메인의 C-말단에 Fc 도메인(서열번호: 21) 및 u-PA의 N-말단 및 프로테아제 도메인의 N-말단의 SUMO 활성화 서열을 함유하는 서열번호: 1018에 제시된 융합 단백질의 개략도이며, 여기서 Fc 도메인 사이의 디설파이드 결합은 이량체를 형성한다.
개요
A. 정의
B. u-PA 구조 및 기능
1. 세린 프로테아제
2. 구조
3. 기능/활성
C. C3 표적화에 의한 보체 억제
1. 보체 단백질 C3 및 보체 개시에서의 그의 역할
a. 고전적 경로
b. 대안적인 경로
c. 렉틴 경로
d. 보체 매개 효과기 기능
i. 보체 매개 용해: 막 공격 복합체
ii. 염증
iii. 화학주성
iv. 옵소닌화
v. 체액성 면역 반응의 활성화
2. C3 구조 및 기능
a. C3a
b. C3b
c. C3b의 억제제
D. C3을 절단하는 변형된 U-PA 폴리펩타이드
1. 예시적인 변형된 u-PA 폴리펩타이드
2. 추가의 변형
a. 감소된 면역원성
b. Fc 도메인
c. 중합체에 대한 접합
d. 단백질 형질도입 도메인
E. 보체 매개 기능에 대한 u-PA 활성을 평가하거나 모니터하기 위한 검정
1. 보체 단백질 C3의 기능에 대한 u-PA 활성을 평가하는 방법
a. 단백질 검출
i. SDS-PAGE 분석
ii. 효소 면역검정
iii. 방사성 면역확산(RID)
b. 용혈성 검정
c. 절단 부위를 결정하는 방법
2. 야생형 u-PA 활성을 평가하는 방법
a. 플라스미노겐의 절단
b. 플라스미노겐 활성화 검정
c. u-PA- uPAR 결합 검정
d. C3 절단
ACC - AGR + ELISA
펩타이드 라이브러리를 사용하는 특이성의 평가
3. 특이성
4. 질환 모델
F. 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 생산하는 방법
1. u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 단리 또는 제조
2. 돌연변이체 또는 변형된 핵산의 생성 및 폴리펩타이드의 인코딩
3. 벡터 및 세포
4. 발현
a. 원핵 세포
b. 효모 세포
c. 곤충 및 곤충 세포
d. 포유동물 발현
e. 식물
5. 정제
6. 추가의 변형
a. 페길화
b. 융합 단백질 및 다른 접합체
7. 핵산 분자
G. 조성물, 제형 및 복용량
1. 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 투여
2. 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 투여 (유전자 요법)
H. 치료 용도 및 치료 방법
1. 보체 활성화에 의해 매개된 질환
a. 류마티스성 관절염
b. 패혈증
c. 다발성 경화증
d. 알츠하이머병
e. 허혈- 재관류 손상
f. 안구 장애
연령 관련 황반 변성(AMD)
g. 장기 이식 및 지연된 이식 기능( DGF )
2. 치료 용도
a. 면역 매개 염증성 질환
b. 신경퇴행성 질환
c. 심혈관 질환
d. 연령 관련 황반 변성(AMD)
e. 장기 이식
지연된 이식 기능( DGF )
3. 조합 요법
I. 실시예
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명(들)이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 전체 개시내용을 통해 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공개된 출원 및 공보, 유전자은행 서열, 웹사이트 및 다른 공개된 물질은, 달리 나타내지 않는 한, 그 전문이 참조로 포함된다. 본원의 용어에 대해 복수의 정의가 존재하는 경우, 이 섹션에서의 정의가 우선한다. URL 또는 다른 이같은 식별자 또는 주소가 언급되는 경우, 이같은 식별자를 변화시킬 수 있고, 인터넷 상의 특정 정보를 얻을 수 있지만, 등가의 정보가 공지되어 있고, 예컨대 인터넷 및/또는 적절한 데이터베이스를 검색함으로써 용이하게 접근할 수 있는 것으로 이해된다. 이에 대한 참조는 이러한 정보의 이용가능성 및 공중 전파를 입증한다.
본원에 사용된 절단은 프로테아제에 의한 펩타이드 결합의 파괴를 지칭한다. 프로테아제에 대한 절단 부위 모티프는 자를 수 있는 결합에 대한 잔기 N- 및 C-말단을 포함한다(프라이밍되지 않은 측면 및 프라이밍된 측면, 각각, ... P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'...로 정의된 프로테아제의 절단 부위, 및 P1과 P1' 잔기 사이에서 절단이 발생함). 인간 C3에서, C3 전환효소에 의한 절단은 C3의 잔기 R과 S 사이에서 일어난다(서열번호: 47의 잔기 746-751, 인간 C3에서 잔기 748과 749 사이의 절단을 참조함):
Figure pct00001
전형적으로, 생화학적 경로에서의 기질의 절단은 활성화 절단 또는 억제 절단이다. 활성화 절단은 불활성 형태로부터 활성 형태로의 폴리펩타이드의 절단을 지칭한다. 이는 예를 들어, 자이모겐의 활성 효소로의 절단을 포함한다. 활성화 절단은 또한 단백질이 그 자체가 활성을 갖는 하나 이상의 단백질로 절단되는 절단이다. 예를 들어, 보체계는 단백질분해 절단 이벤트의 비가역적 캐스케이드이며, 이의 종결은 염증을 자극하고, 항원 포식작용을 촉진하고, 일부 세포를 직접적으로 용해시키는 다수의 효과기 분자의 형성을 초래한다. 따라서, C3 전환효소에 의한 C3의 C3a 및 C3b로의 절단은 활성화 절단이다. 대조적으로, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 예컨대 활성 부위에서의 절단에 의한 C3의 억제성 절단을 수행한다.
본원에 사용된 바와 같이, 억제성 절단 또는 불활성화 절단은 기능성이 아닌 하나 이상의 분해 생성물로의 단백질의 절단이다. 억제성 절단은 단백질의 활성의 약화 또는 감소를 초래한다. 전형적으로, 단백질의 활성의 감소는 단백질이 관여하는 경로 또는 과정을 감소시킨다. 일 예에서, 억제성 절단인 임의의 하나 이상의 보체 단백질의 절단은 보체의 고전적, 렉틴, 또는 대안적 기능적 경로 중 임의의 하나 이상을 동시에 감소시키거나 억제한다. 억제되기 위해, 절단은 단백질의 천연 형태에 비해 활성을 적어도 또는 적어도 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 감소시킨다. 절단이 억제되는 데 필요한 단백질의 절단 백분율은 단백질 간에 다양하지만, 단백질의 활성을 검정함으로써 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "보체 활성화"는 보체 경로의 활성화를 지칭하며, 예를 들어 보체 활성화는 프로테아제에 의한 임의의 하나 이상의 보체 경로의 기능 또는 활성의 증가 또는 보체 경로에서 임의의 단백질의 활성의 증가를 지칭한다. 보체 활성화는 보체 매개 세포 용해로 이어질 수 있거나, 또는 세포 또는 조직 파괴로 이어질 수 있다. 숙주 조직 상의 부적절한 보체 활성화는 많은 자가면역 및 염증성 질환의 병리학에서 중요한 역할을 하고, 또한 생체비친화성과 연관된 많은 질환 상태의 원인이 되거나 그와 연관된다. 활성화는 기존 활성의 증가뿐만 아니라 새로운 활성의 유도를 의미할 수 있는 것으로 이해된다. 보체 활성화는 시험관 내 또는 생체 내에서 일어날 수 있다. 검정될 수 있고 본원에 기재된 보체의 예시적인 기능은 용혈 검정, 및 예컨대 SDS PAGE에 이어서 웨스턴 블랏 또는 쿠마시 브릴리언트 블루 염색에 의해 또는 ELISA에 의해 보체 효과기 분자 중 임의의 하나 이상을 측정하는 검정을 포함한다. 일부 구현예에서, 보체 활성화는 프로테아제, 예컨대 본원에 기재된 프로테아제에 의해, 프로테아제의 부재 하의 보체의 활성과 비교하여 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 이상만큼 억제된다.
본원에 사용된 바와 같이, "보체 활성화의 억제" 또는 "보체의 불활성화"는 프로테아제에 의한 보체 경로 중 임의의 하나 이상의 보체 매개 기능 또는 활성의 약화 또는 감소, 또는 경로 중 임의의 단백질의 활성을 지칭한다. 보체의 기능 또는 활성은 시험관 내 또는 생체 내에서 발생할 수 있다. 검정될 수 있고 본원에 기재된 보체의 예시적인 기능은 용혈 검정, 및 예컨대 SDS PAGE에 이어서 웨스턴 블랏 또는 쿠마시 브릴리언트 블루 염색에 의해 또는 ELISA에 의해 보체 효과기 분자 중 임의의 하나 이상을 측정하는 검정을 포함한다. 프로테아제는 보체 활성화를 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 억제할 수 있다. 다른 구현예에서, 보체 활성화는 프로테아제의 부재 하의 보체의 활성과 비교하여 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 이상 만큼 프로테아제에 의해 억제된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "보체 단백질" 또는 "보체 성분"은 감염에 대한 숙주의 방어 및 염증 과정에서 기능하는 보체계의 단백질이다. 보체 단백질은 고전적 경로에서 기능하는 것, 대안적인 경로에서 기능하는 것들, 및 렉틴 경로에서 기능하는 것들을 포함한다. 보체 단백질 중에는 보체 경로에 참여하는 프로테아제가 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 보체 단백질은 보체 캐스케이드의 활성화 시 형성되는 임의의 "절단 생성물" ("단편"으로도 지칭됨)을 포함한다. 또한 보체 단백질 중에는 불활성 또는 변경된 형태의 보체 단백질, 예컨대 iC3b 및 C3a-desArg가 포함된다. 따라서, 보체 단백질은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: C1q, C1r, C1s, C2, C3, C3a, C3b, C3c, C3dg, C3g, C3d, C3f, iC3, C3a-desArg, C4, C4a, C4b, iC4, C4a-desArg, C5, C5a, C5a-des-Arg, C6, C7, C8, C9, MASP-1, MASP-2, MBL, 인자 B, 인자 D, 인자 H, 인자 I, CR1, CR2, CR3, CR4, 프로페르딘, C1Inh, C4bp, MCP, DAF, CD59 (MIRL), 클러스테린 및 HRF 및 임의의 보체 단백질의 대립유전자 및 종 변이체.
본원에 사용된 바와 같이, 보체 단백질의 "천연" 형태는 보체 활성화의 부재 하에 척추동물과 같은 유기체로부터 단리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 것이다. 천연 보체 단백질의 예는 C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4, 인자 B, 인자 D, 프로페르딘, C5, C6, C7, C6, 및 C9를 포함한다.
일반적으로, "천연 보체 단백질"은 불활성이고, 활성화 시 활성을 획득한다. 활성화는 활성화 절단, 성숙 절단 및/또는 다른 단백질과의 복합체 형성을 필요로 할 수 있다. 이에 대한 예외는 그의 천연 형태에서 효소 활성을 갖는 인자 I 및 인자 D이다. 일부 예에서, 천연 보체 단백질의 활성화는 단백질의 절단 후에 발생한다. 예를 들어, C3과 같은 보체 자이모겐은 C3 전환효소 C4b2b에 의한 C3의 절단이 활성 단편 C3a 및 C3b를 생성하도록 그 자체가 프로테아제 절단에 의해 활성화되는 프로테아제이다. 또 다른 예에서, 불활성 천연 보체 단백질의 절단은 단백질의 구조적 안정성의 변화를 초래하여 단백질의 활성화를 초래한다. 예를 들어, C3은 천연 단백질에서 안정한 내부 티오에스테르 결합을 함유하지만, 고도로 반응성이 될 수 있고, 단백질의 절단으로부터 초래되는 형태적 변화에 따라 활성화될 수 있다. 따라서, C3의 절단 생성물은 생물학적으로 활성이다. C3의 활성화는 또한 절단의 부재 하에 자발적으로 발생할 수 있다. 이는 보체의 대안적인 경로의 개시 사건인 천연 C3에서 티오에스테르 결합의 자발적 전환이다. 다른 예에서, 천연 보체 단백질의 활성화는 달리 활성인 천연 보체 단백질 활성을 억제하는 복합체화된 조절 분자의 방출 후에 발생한다. 예를 들어, C1inh는 이들이 C1q와 복합체로 존재하지 않는 한 C1s 및 C1r에 결합하여 이를 불활성화시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, "성숙 절단"은 자이모겐의 활성화에 필요한 임의의 절단을 지칭하는 일반적인 용어이다. 이는 활성 (즉, 활성화 절단)을 야기하는 형태적 변화를 야기하는 절단을 포함한다. 이는 또한 중요한 결합 부위가 노출되거나 입체 장애가 노출되거나 억제성 분절이 제거되거나 이동되는 절단을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 보체 단백질의 "변경된 형태"는 그의 분자 구조에서의 변형으로부터 생성된 비-천연 형태로 존재하는 보체 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 물과 티오에스테르의 C3 반응은 전환효소 절단의 부재 하에 일어나서, iC3로 명명된 C3의 가수분해된 불활성 형태를 제공할 수 있다. 또 다른 예에서, C3a, C5a, 및 C4a를 포함하는 아나필라톡신은 카르복시펩티다아제 N에 의해 보다 안정하고 덜 활성인 형태로 탈사될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 보체 단백질의 "단편" 또는 "절단 생성물"은 천연 보체 단백질의 폴리펩타이드 서열의 일부를 함유하는 보체 단백질의 영역 또는 절편이다. 보체 단백질의 단편은 일반적으로 보체 캐스케이드의 활성화 후에 생성된다. 일반적으로, 단편은 천연 보체 단백질의 단백질분해적 절단으로부터 생성된다. 예를 들어, 보체 단백질 C3은 C3 전환효소에 의해 효소적으로 절단되어 2개의 단편을 생성한다: C3의 N-말단 부분을 구성하는 C3a; 및 C-말단부를 구성하고 세린 프로테아제 부위를 함유하는 C3b. 보체 단백질의 단편은 또한 보체 단백질의 또 다른 단편의 단백질분해 절단으로부터 생성된다. 예를 들어, C3의 절단으로부터 생성된 단편인 C3b는 인자 I에 의해 절단되어 단편 iC3b 및 C3f를 생성한다. 일반적으로, 보체 단백질의 절단 생성물은 생물학적 활성 생성물이고, 보체계의 절단 효과기 분자로서 기능한다. 따라서, 보체 단백질의 단편 또는 부분은 보체 단백질의 절단 생성물 및 또한 보체 단백질의 적어도 하나의 활성을 보유하거나 나타내는 단백질의 부분을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "절단 효과기 분자" 또는 "절단 효과기 단백질"은 보체계의 촉발된-효소 캐스케이드의 결과로서 생성된 활성 절단 생성물을 지칭한다. 보체 활성화로부터 생성된 절단 효과기 분자, 단편 또는 절단 생성물은 옵소닌화, 아나필락시스, 세포 용해 및 염증을 포함하는 보체 매개 기능 또는 활성 중 임의의 하나 이상에 기여할 수 있다. 절단 또는 효과기 분자의 예는 C3a, C3b, C4a, C4b, C5a, C5b-9, 및 Bb를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 보체계의 절단 효과기 분자는, 캐스케이드에 참여함으로써, 염증을 자극하고, 항원 포식작용을 촉진하고, 일부 세포를 직접 용해시키는 것을 포함하는 활성을 나타낸다. 보체 절단 생성물은 보체 경로의 활성화를 촉진하거나 이에 참여한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아나필라톡신"은 특히 기생충에 대한 방어의 일부로서 염증 반응에 참여하는 비만 세포 또는 호염기구로부터의 물질의 탈과립화 또는 방출을 유발하는 절단 효과기 단백질이다. 탈과립화가 너무 강한 경우, 이는 알레르기 반응을 야기할 수 있다. 아나필라톡신은 예를 들어 C3a, C4a 및 C5a를 포함한다. 아나필라톡신은 또한 평활근 세포의 연축(예컨대 기관지경련), 모세혈관의 투과성 증가 및 화학주성을 간접적으로 매개한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "화학주성"은 전형적으로 아나필라톡신의 농도 증가 방향으로 백혈구가 화학유인물질 쪽으로 수용체 매개 이동하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "옵소닌화"는 병원체 또는 다른 입자의 표면이 식세포에 의해 섭취될 수 있도록 하는 변경을 지칭한다. 병원체의 표면에 결합하거나 또는 이를 변경시키는 단백질은 옵소닌으로 지칭된다. 항체 및 보체 단백질은 식세포, 예컨대 호중구 및 대식세포에 의한 흡수 및 파괴를 위해 세포외 박테리아를 옵소닌화한다.
본원에 사용된 바와 같이, "세포 용해"는 그의 벽 또는 막의 파괴에 의한 세포의 파괴 개방을 지칭한다. 적혈구의 용혈은 세포 용해의 척도이다.
본원에 사용된 바와 같이, "보체 단백질 C3" 또는 "C3"은 감염에 대한 숙주 방어 및 염증 과정에서 기능하는 보체계의 보체 단백질 C3을 지칭한다. 인간 보체 단백질 C3은 잔기 C559와 C816 사이의 디설파이드 결합에 의해 연결된 베타 사슬 (서열번호: 47의 아미노산 23-667) 및 알파 사슬 (서열번호: 47의 아미노산 672-1663)를 함유하는 성숙 2개 사슬 단백질을 생성하는 퓨린-유사 효소에 의해 제거되는 22개 아미노산 신호 펩타이드 (서열번호: 47의 아미노산 1-22) 및 테트라-아르기닌 서열(서열번호: 47의 아미노산 678-671)을 함유하는, 서열번호: 47에 제시된 1663개 아미노산 단쇄 프리-프로단백질 또는 자이모겐이다. 보체 단백질 C3은 아나필라톡신 C3a 및 옵소닌 C3b를 생성하는 서열번호: 47의 아미노산 748과 749 사이의 C3 전환효소 (C4b2b 또는 C3bBb)에 의한 단백질분해 절단에 의해 추가로 활성화된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "자이모겐"은 성숙 절단, 예컨대 활성화 절단, 및/또는 다른 단백질(들) 및/또는 보조인자(들)과 복합체 형성을 포함하는 단백질분해 절단에 의해 활성화되는 단백질을 지칭한다. 자이모겐은 단백질의 불활성 전구체이다. 이러한 전구체는 일반적으로 활성 형태보다 더 크지만 반드시 더 크지는 않다. u-PA 또는 보체 단백질 C3과 관련하여, 자이모겐은 촉매 및 자가촉매 절단을 포함하는 특이적 절단에 의해, 또는 활성 효소를 생성하는 활성화 보조인자의 결합에 의해 활성 효소로 전환된다. 따라서, 자이모겐은 활성화제의 작용에 의해 단백질분해 효소로 전환되는 효소적으로 불활성 단백질이다. 절단은 자가촉매적으로 수행될 수 있다. 다수의 보체 단백질은 자이모겐이고; 이들은 불활성이지만, 감염 후 보체계의 개시 시 절단되고 활성화된다. 일반적으로, 자이모겐은 불활성이고, 자이모겐으로부터의 프로영역의 촉매적 또는 자가촉매적 절단에 의해 성숙 활성 폴리펩타이드로 전환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로영역", "프로펩타이드" 또는 "프로 서열"은 절단되어 성숙 단백질을 생산하는 단백질의 영역 또는 절편을 지칭한다. 이는 촉매 기구를 차폐하여 촉매 중간체의 형성을 방지함으로써(즉, 기질 결합 부위를 입체적으로 폐색함으로써) 효소 활성을 억제하는 기능을 하는 세그먼트를 포함할 수 있다. 프로영역은 성숙한 생물학적 활성 폴리펩타이드의 아미노 말단에 위치한 아미노산의 서열이고, 소수의 아미노산만큼 적을 수 있거나 다중도메인 구조일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "활성화 서열"은 활성 프로테아제를 형성하기 위한 활성화 절단 또는 성숙 절단에 필요한 부위인 자이모겐 내의 아미노산의 서열을 지칭한다. 활성화 서열의 절단은 자가촉매적으로 또는 활성화 파트너에 의해 촉매화될 수 있다. 활성화 절단은 활성에 필요한 형태적 변화가 일어나는 성숙 절단의 유형이다. 이는, 예를 들어 세린 프로테아제에 대한 고전적인 활성화 경로이며, 여기서 절단은 활성에 필요한 형태적 변화를 유도하기 위해 촉매 기구, 예컨대 촉매 잔기의 보존된 영역과 상호작용하는 새로운 N-말단을 생성한다. 활성화는 프로테아제의 다중-쇄 형태의 생성을 초래할 수 있다. 일부 경우에, 프로테아제의 단일 사슬 형태는 단백질분해 활성을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "도메인"은 분자의 다른 부분과 구조적으로 및/또는 기능적으로 구별되고 확인가능한, 단백질 또는 인코딩 핵산과 같은 분자의 일부를 지칭한다. 예시적인 폴리펩타이드 도메인은 하나 이상의 구조적 모티프 (예를 들어, 루프 영역에 의해 연결된 알파 나선 및/또는 베타 가닥의 조합)로 구성된 폴리펩타이드 내에서 독립적으로 폴딩된 구조를 형성할 수 있고/거나 특정한 기능적 활성, 예컨대 효소적 활성, 이량체화 또는 기질-결합에 의해 인식되는 폴리펩타이드의 일부이다. 폴리펩타이드는 하나 이상의, 전형적으로 하나 초과의 별개의 도메인을 가질 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 하나 이상의 구조 도메인 및 하나 이상의 기능성 도메인을 가질 수 있다. 단일 폴리펩타이드 도메인은 구조 및 기능에 기초하여 구별될 수 있다. 도메인은 아미노산의 인접 선형 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 도메인은 폴리펩타이드의 아미노산의 선형 서열을 따라 비인접한 복수의 비인접 아미노산 부분을 포함할 수 있다. 전형적으로, 폴리펩타이드는 다수의 도메인을 함유한다. 예를 들어, 세린 프로테아제는 프로테아제 도메인(들)의 서열에 기초하여 특성화될 수 있다. 당업자는 폴리펩타이드 도메인에 친숙하고, 다른 이러한 도메인과의 구조적 및/또는 기능적 상동성에 의해 이들을 확인할 수 있다. 본원의 예시를 위해, 정의가 제공되지만, 특정 도메인을 명칭으로 인지하는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있는 것으로 이해된다. 필요한 경우, 도메인을 확인하기 위해 적절한 소프트웨어를 사용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드의 "구조 영역"은 하나 이상의 구조 도메인을 함유하는 폴리펩타이드의 영역이다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로테아제 도메인"은 프로테아제의 촉매 활성 부분이다. 프로테아제의 프로테아제 도메인에 대한 언급은 이들 단백질 중 임의의 것의 단일, 2- 및 다중-쇄 형태를 포함한다. 단백질의 프로테아제 도메인은 그의 단백질분해 활성, 예를 들어 그의 촉매 중심에 필요한 단백질의 모든 필요한 특성을 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 프로테아제, 예를 들어 u-PA 폴리펩타이드의 "촉매적 활성 부분" 또는 "촉매적 활성 도메인"은 프로테아제 도메인, 또는 프로테아제 활성을 보유하는 그의 임의의 단편 또는 부분을 지칭한다. 예를 들어, u-PA 폴리펩타이드의 촉매 활성 부분은 프로테아제 도메인의 단리된 단일 사슬 형태 또는 활성화된 2-사슬 형태를 포함하는 u-PA 프로테아제 도메인일 수 있다. 유의하게, 적어도 시험관 내에서, 프로테아제 및 촉매 도메인의 단일 사슬 형태 또는 그의 단백질분해 활성 부분 (전형적으로 C-말단 절단)은 프로테아제 활성을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, "프로테아제 도메인 또는 프로테아제의 촉매 활성 부분을 인코딩하는 핵산"은 연속 서열로서 프로테아제의 다른 인접 부분이 아닌, 언급된 단일 사슬 프로테아제 도메인 또는 그의 활성 부분만을 인코딩하는 핵산을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드가 프로테아제 도메인으로 본질적으로 이루어진다는 언급은 폴리펩타이드의 유일한 부분이 프로테아제 도메인 또는 그의 촉매 활성 부분이라는 것을 의미한다. 폴리펩타이드는 선택적으로, 및 일반적으로 아미노산의 추가의 비-프로테아제-유래 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로테아제의 활성 부위"는 기질의 촉매작용이 일어나는 기질 결합 부위를 지칭한다. 활성 부위의 구조 및 화학적 특성은 기질의 인식 및 결합, 및 기질에서 분리되기 쉬운 결합의 후속 가수분해 및 절단을 허용한다. 프로테아제의 활성 부위는 펩타이드 절단의 촉매 메카니즘에 기여하는 아미노산, 예컨대 아미노산 Gln His Ala Arg Ala Ser His Leu (C3의 활성 부위; 서열번호: 47의 잔기 737-744)뿐만 아니라 기질 서열 인식에 기여하는, 예컨대 연장된 기질 결합 특이성에 기여하는 아미노산을 함유한다. 예를 들어, C3의 활성 부위에서의 절단은 하기와 같은 그의 활성을 억제할 수 있다:
Figure pct00002
(서열번호: 47의 잔기 737-744)
Figure pct00003
본원에 사용된 바와 같이, "기질 인식 부위" 또는 "절단 서열"은 프로테아제에 의해 절단되는 프로테아제의 활성 부위에 의해 인식되는 서열을 지칭한다. 전형적으로, 세린 프로테아제에 대한 절단 서열은 많은 프로테아제의 연장된 기질 특이성에 부합하도록 길이가 6개의 잔기이지만, 프로테아제에 따라 더 길거나 더 짧을 수 있다. 전형적으로, 예를 들어 세린 프로테아제의 경우, 절단 서열은 기질 내의 P1-P4 및 P1'-P4' 아미노산으로 구성되고, 여기서 절단은 P1 위치 후에 일어난다. 전형적으로, 세린 프로테아제에 대한 절단 서열은 많은 프로테아제의 연장된 기질 특이성에 부합하도록 길이가 6개의 잔기이지만, 프로테아제에 따라 더 길거나 더 짧을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "표적 기질"은 프로테아제에 의해 절단되는 기질을 지칭한다. 전형적으로, 표적 기질은 프로테아제에 의해 그의 기질 인식 부위에서 특이적으로 절단된다. 최소한으로, 표적 기질은 절단 서열을 구성하는 아미노산을 포함한다. 선택적으로, 표적 기질은 절단 서열 및 임의의 다른 아미노산을 함유하는 펩타이드를 포함한다. 프로테아제에 의해 인식되는 절단 서열을 함유하는 전장 단백질, 대립유전자 변이체, 동형단백질 또는 그의 임의의 부분은 그 프로테아제에 대한 표적 기질이다. 예를 들어, 보체 불활성화가 의도되는 본원의 목적을 위해, 표적 기질은 보체 단백질 C3, 또는 u-PA 폴리펩타이드에 의해 인식되는 절단 서열을 함유하는 그의 임의의 부분 또는 단편이다. 이러한 표적 기질은 정제된 단백질일 수 있거나, 시험관 내 혼합물 또는 생체 내 혼합물과 같은 혼합물로 존재할 수 있다. 혼합물은 예를 들어 혈액 또는 혈청, 또는 다른 조직 유체를 포함할 수 있다. 추가로, 표적 기질은 프로테아제에 의한 기질의 절단에 영향을 미치지 않는 추가의 모이어티를 함유하는 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 예를 들어, 표적 기질은 형광발생 모이어티에 화학적으로 연결된 4개의 아미노산 펩타이드 또는 전장 단백질을 포함할 수 있다. 프로테아제는 표적 기질에 대해 더 큰 기질 특이성을 나타내도록 변형될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "u-PA" 또는 "uPA", 또는 "u-PA 폴리펩타이드"는 재조합적으로 생산된 폴리펩타이드, 합성에 의해 생산된 폴리펩타이드 및 간 및 혈액을 포함하지만 이에 한정되지 않는 세포 또는 조직으로부터 추출되거나 단리된 u-PA 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 u-PA 폴리펩타이드를 지칭한다. u-PA에 대해 상호 교환적으로 사용되는 대안적인 명칭은 유로키나제 및 소변 플라스미노겐 활성화제 및 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 및 소변-타입 플라스미노겐 활성화제 및 유로키나제 유형 플라스미노겐 활성화제를 포함한다. u-PA는 인간 및 비-인간 기원의 동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 상이한 종으로부터의 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 인간 u-PA는 u-PA, 대립유전자 변이체, 동형단백질, 핵산으로부터의 합성 분자, 인간 조직 및 세포로부터 단리된 단백질, 및 그의 변경된 형태를 포함한다. 예시적인 변형되지 않은 인간 u-PA 폴리펩타이드는 변형되지 않고 야생형 천연 성숙 u-PA 폴리펩타이드(서열번호: 3), 프로펩타이드 및/또는 신호 펩타이드(예를 들어, 서열번호: 1에 제시된 u-PA 폴리펩타이드)를 포함하는 변형되지 않으며 야생형 전구체 u-PA 폴리펩타이드 및 프로테아제 도메인(예를 들면, 서열번호: 2에 제시된 u-PA 프로테아제 도메인)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 당업자는 신호 펩타이드 서열을 함유하는 u-PA 폴리펩타이드인 전구체 u-PA 폴리펩타이드(서열번호: 1)와 비교할 때 성숙 u-PA 폴리펩타이드(서열번호: 3)의 기준 위치들은 20개의 아미노산 잔기만큼 상이하다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 서열번호: 3의 첫번째 아미노산 잔기는 서열번호: 1의 21번째 아미노산 잔기에 "상응한다".
"u-PA"의 언급은 잔기 148C와 279C 사이에 디설파이드 결합에 의해 연결된 N-말단 A 사슬 (서열번호: 3의 아미노산 1-158) 및 C-말단 B 사슬 (서열번호: 3의 아미노산 159-411)를 함유하는 u-PA 폴리펩타이드의 활성화된 또는 2-쇄 형태 (서열번호 3에 제시된 성숙 u-PA 폴리펩타이드에 상응함)를 포함한다. 2-사슬 형태, 또는 고분자량 (HMW) u-PA는 아미노산 잔기 Lys158 이후 잔기 Ile159 이전에 단백질분해적 절단에 의해 성숙 u-PA 폴리펩타이드 (예를 들어, 서열번호: 3에 제시된 것)로부터 형성된다. 단백질분해 절단은, 예를 들어 플라스민, 칼리크레인, 카텝신 B, 매트립타제 및 신경 성장 인자-감마에 의해 수행될 수 있다. 본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드는 예컨대 화학적 변형 또는 번역후 변형에 의해 추가로 변형될 수 있다. 이러한 변형은 글리코실화, 페길화, 알부민화, 파르니실화, 카르복실화, 히드록실화, 인산화, 및 관련 기술분야에 공지된 다른 폴리펩타이드 변형을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
u-PA는 인간 및 비-인간 종을 포함하는 임의의 종으로부터의 u-PA를 포함한다. 비-인간 기원의 u-PA 폴리펩타이드는 뮤린, 개, 레포린, 조류, 소, 양, 돼지 및 다른 영장류 u-PA 폴리펩타이드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비-인간 기원의 예시적인 u-PA 폴리펩타이드는, 예를 들어, 마우스(무스 무스쿨루스 ( Mus musculus), 서열번호: 52), 랫트(라투스 노르베기쿠스 ( Rattus norvegicus ), 서열번호: 53), 소(보스 타우루스 ( Bos taurus), 서열번호: 54), 돼지(수스 스크로파 ( Sus scrofa), 서열번호: 55), 토끼(오리크토라구스 튜니쿨루스 , 서열번호: 56), 닭(갈루스 갈루스 ( Gallus gallus ), 서열번호: 57), 황색 개코원숭이(파피오 시노세팔루스 (Papio cynocephalus ), 서열번호: 58), 수마트란 오랑우탄(Sumatran orangutan)(폰고 아벨리이 ( Pongo abelii ), 서열번호: 59), 개(카니스 루프스 ( Canis lupus, 서열번호: 60), 양(오비스 아리에스 ( Ovis aries), 서열번호: 61), 마모셋(marmoset)(칼리트릭스 자쿠스(Callithrix jacchus), 서열번호: 62), 붉은털원숭이 (마카카 물라타 (Macaca mulatta ), 서열번호: 63), 북부흰뺨긴팔원숭이(노마스쿠스 류코게닉스(Nomascus leucogenys ), 서열번호: 64) 및 침팬지(팬 트로글로디테스(Pan troglodytes), 서열번호: 65)를 포함한다.
u-PA 폴리펩타이드에 대한 언급은 또한 단쇄 또는 2-쇄 형태의 전구체 폴리펩타이드 및 성숙 u-PA 폴리펩타이드, 활성을 갖는 그의 절두 형태, 단리된 프로테아제 도메인을 포함하고, 대립유전자 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 인코딩되는 변이체, 및 서열번호: 1에 제시된 전구체 폴리펩타이드 또는 그의 성숙 형태 (서열번호: 3) 또는 그의 프로테아제 도메인 (서열번호: 2)과 적어도 또는 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 다른 변이체를 포함한다. u-PA 폴리펩타이드는 조직-특이적 동형단백질 및 그의 대립유전자 변이체, 핵산의 번역에 의해 제조된 합성 분자, 재조합 방법을 통한 보다 짧은 폴리펩타이드의 결찰을 포함하는 합성과 같은 화학적 합성에 의해 생성된 단백질, 인간 및 비-인간 조직 및 세포로부터 단리된 단백질, 키메라 u-PA 폴리펩타이드 및 그의 변경된 형태를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. u-PA 폴리펩타이드는 또한 전장 성숙 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성(필요에 따라 활성화시)을 보유하는 적절한 영역을 포함하거나 또는 충분한 길이의 u-PA의 단편 또는 부분을 포함한다. 일 예에서, u-PA의 부분은 프로테아제 도메인, 예를 들어, 서열번호: 1에 제시된 u-PA 서열의 아미노산 179 내지 431에 상응하는 서열번호: 2에 제시된 프로테아제 도메인이며, 이는 또한 화학적 또는 번역후 변형을 함유하는 것들 및 화학적 또는 번역후 변형을 함유하지 않는 것들을 포함한다. 이러한 변형은 페길화, 알부민화, 글리코실화, 파르니실화, 카르복실화, 히드록실화, 인산화, HES화 (생분해성 히드록시에틸 전분 (HES)에 약물 분자를 커플링함으로써 반감기 연장), PAS화 (소형 L-아미노산 Pro, Ala 및/또는 Ser로 제조된 천연적으로 무질서한 생합성 중합체와 약리 활성 화합물, 예컨대 단백질, 펩타이드 및 저분자량 약물의 유전적 융합 또는 화학적 커플링을 통한 접합), 및 관련 기술분야에 공지된 다른 폴리펩타이드 변형을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "u-PA 프로테아제" 또는 "u -PA 프로테아제 도메인"은 재조합에 의해 생성된 폴리펩타이드, 합성에 의해 제조된 폴리펩타이드, 및 간 및 혈액을 포함하지만 이에 한정되지 않는 세포 또는 조직으로부터 추출되거나 단리된 u-PA 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 임의의 u -PA 폴리펩타이드를 지칭한다. u-PA 프로테아제는 비제한적으로 인간 및 비-인간 기원의 동물을 포함하는 상이한 종으로부터의 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 인간 u-PA 프로테아제 또는 u-PA 프로테아제 도메인에는, u-PA, 대립유전자 변이체, 동형단백질, 핵산으로부터의 합성 분자, 인간 조직 및 세포로부터 단리된 단백질, 및 이들의 변경된 형태가 포함된다. 예시적인 참조 인간 u-PA 프로테아제 도메인은 비변형 및 야생형 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 2) 및 대안적인 프로테아제 도메인 (예컨대, 서열번호: 5에 기재된 u-PA 프로테아제 도메인)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 당업자는 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 2)의 참조된 위치가 전장 WT 서열을 함유하는 u-PA 폴리펩타이드인 성숙 u-PA 폴리펩타이드(서열번호: 1)와 비교할 때 178개의 아미노산 잔기만큼 상이하다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 서열번호: 2의 첫번째 아미노산 잔기는 서열번호: 1의 179번째 (179번째) 아미노산 잔기에 "상응한다".
본원에 사용된 바와 같이, "변형"은 폴리펩타이드의 아미노산 서열 또는 핵산 분자 내의 뉴클레오타이드 서열의 변형에 관한 것이며, 각각 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 및 치환을 포함한다. 폴리펩타이드를 변형시키는 방법은 재조합 DNA 방법을 사용하는 것과 같이 당업자에게 일상적이다. 폴리펩타이드의 아미노산의 서열에 대한 변형과 폴리펩타이드의 변형에는 차이가 있다. 전자는 아미노산의 삽입, 결실, 및 치환 또는 대체를 지칭하고; 후자는 폴리펩타이드의 변형, 예컨대 번역후 변형, 페길화, 및 특성 및/또는 활성을 변경시키는 단백질의 다른 이러한 변형을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대체" 또는 "치환"은 분자의 길이 (잔기의 수로 기재됨)를 변화시키지 않으면서 천연, 표적, 야생형 또는 다른 핵산 또는 폴리펩타이드 서열 내의 1개 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 대안적 뉴클레오타이드 또는 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다. 따라서, 분자 내의 하나 이상의 치환은 분자의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 수를 변화시키지 않는다. 특정 폴리펩타이드와 비교하여 아미노산 치환은 폴리펩타이드 서열의 길이를 따라 아미노산 잔기의 수로 표현될 수 있다. 예를 들어, 아르기닌(Arg; R)의 글루타민(Gln; Q)으로의 대체/치환인 아미노산 서열의 35번째 위치의 아미노산에 변형을 갖는 변형된 폴리펩타이드는 R35Q, Arg35Gln, 또는 35Q로서 표현될 수 있다. 단순히 R35는 변형된 35번째 위치의 아미노산이 아르기닌임을 나타내기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "변형된 u-PA" 또는 "변형된 u-PA 폴리펩타이드"는 변형되지 않은 형태와 비교하여 변경된 활성, 예컨대 변경된 기질 특이성을 나타내는 u-PA 프로테아제를 지칭한다. 이러한 프로테아제는 야생형 u-PA와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 변형 (즉, 아미노산의 변화)을 포함하여, 보체 단백질 C3을 절단하기 위한 u-PA 프로테아제의 활성, 예컨대 기질 특이성 또는 선택성이 변경된다. 변형된 u-PA 프로테아제가 프로테아제의 활성 또는 기질 특이성을 변경시키는 영역에서 변형을 함유하고 프로테아제가 단백질분해적으로 활성인 한, 변형된 u-PA는 전장 u-PA 프로테아제일 수 있거나, 또는 전장 프로테아제의 일부, 예컨대 u-PA의 프로테아제 도메인일 수 있다. 또한, 변형된 u-PA 프로테아제, 또는 변형된 u-PA 프로테아제 도메인은 프로테아제의 기질 특이성에 영향을 미치지 않는 영역에서 다른 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 전형적으로 야생형 u-PA 폴리펩타이드의 아미노산의 상응하는 서열과 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다. 변형된 전장 u-PA 폴리펩타이드 또는 이의 촉매 활성 부분 또는 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 프로테아제 도메인은 융합 단백질이 표적 특이성을 보유하는 한 융합 단백질인 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 키모트립신 넘버링은 서열번호: 76의 성숙 키모 트립신 폴리펩타이드의 아미노산 넘버링을 지칭한다. 예를 들어, u-PA의 프로테아제 도메인과 같은 또 다른 프로테아제의 프로테아제 도메인의 정렬은 키모트립신으로 이루어질 수 있다. 이러한 경우에, 키모트립신의 아미노산에 상응하는 u-PA 폴리펩타이드의 아미노산은 키모 트립신 아미노산의 넘버링으로 주어진다. 상응하는 위치는 수동 정렬을 사용하거나 이용가능한 다수의 정렬 프로그램 (예를 들어, BLASTP)을 사용하여 당업자에 의해 이러한 정렬에 의해 결정될 수 있다. 상응하는 위치는 또한, 예를 들어 단백질 구조의 컴퓨터 시뮬레이션된 정렬을 사용함으로써 구조적 정렬에 기초할 수 있다. 폴리펩타이드의 아미노산이 개시된 서열 내의 아미노산에 상응한다는 언급은 표준 정렬 알고리즘, 예컨대 GAP 알고리즘을 사용하여 동일성 또는 상동성(보존된 아미노산이 정렬되는 경우)을 최대화하기 위해 폴리펩타이드를 개시된 서열과 정렬시킬 때 확인된 아미노산을 지칭한다. 서열번호: 3에 제시된 u-PA 폴리펩타이드의 아미노산 위치 159-411의 상응하는 키모트립신 수가 표 1에 제공된다. 서열번호: 3에 제시된 서열에 대한 아미노산 위치는 정상 서체로 있고, 이들 위치에서의 아미노산 잔기는 굵은체로 있고, 상응하는 키모트립신 수는 이탤릭체로 있다. 예를 들어, u-PA의 세린 프로테아제 도메인(서열번호: 2)과 성숙 키모트립신의 정렬시, u-PA 내의 위치 159에서의 이소류신(I)은 I16의 키모트립신 넘버링으로 주어진다. 후속 아미노산은 이에 따라 번호가 매겨진다. 일 예에서, 성숙 u-PA(서열번호: 3)의 아미노산 위치 173에서의 페닐알라닌(F)은 키모트립신 넘버링에 기초한 아미노산 위치 F30에 상응한다. 잔기가 프로테아제에 존재하지만 키모트립신에 존재하지 않는 경우, 아미노산 잔기는 문자 표기로 주어진다. 예를 들어, 키모트립신 넘버링에 기초하여 아미노산 60을 갖는 루프의 일부이지만 키모 트립신과 비교하여 u-PA 서열에 삽입된 키모 트립토판 내의 잔기는 예를 들어 D60a, Y60b 또는 P60c로 지칭된다. 이들 잔기는 각각 서열번호: 3에 제시된 성숙 u-PA 서열에 대한 넘버링에 의해 D208, Y209 및 P210에 상응한다.
u-PA의 키모트립신 넘버링
159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173
I I G G E F T T I E N Q P W F
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188
A A I Y R R H R G G S V T Y V
31 32 33 34 35 36 37 37A 37B 37C 37D 38 39 40 41
189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203
C G G S L I S P C W V I S A T
42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56
204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218
H C F I D Y P K K E D Y I V Y
57 58 59 60 60A 60B 60C 61 62 62A 63 64 65 66 67
219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233
L G R S R L N S N T Q G E M K
68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82
234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248
F E V E N L I L H K D Y S A D
83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97
249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263
T L A H H N D I A L L K I R S
97A 97B 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110
264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278
K E G R C A Q P S R T I Q T I
110A 110B 110C 110D 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121
279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293
C L P S M Y N D P Q F G T S C
122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136
294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308
E I T G F G K E N S T D Y L Y
137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151
309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323
P E Q L K M T V V K L I S H R
152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166
324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338
E C Q Q P H Y Y G S E V T T K
167 168 169 170 170A 170B 171 172 173 174 175 176 177 178 179
339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353
M L C A A D P Q W K T D S C Q
180 181 182 183 184 185 185A 185B 186 187 188 189 190 191 192
354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368
G D S G G P L V C S L Q G R M
193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207
369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383
T L T G I V S W G R G C A L K
208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 220 221 222 223
384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398
D K P G V Y T R V S H F L P W
223A 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237
399 400 401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411
I R S H T K E E N G L A L
238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250
본원에 사용된 kcat은 효소의 촉매 활성을 측정하고; kcat의 단위는 초-1이다. kcat의 역수(reciprocal)는 하나의 기질 분자를 "턴 오버"하는 효소 분자에 의해 요구되는 시간이고; kcat은 초당 효소 분자 당 턴 오버된 기질 분자의 수를 측정한다. kcat은 때때로 턴오버 수(turnover number)로 불린다. 효소학에서, kcat (턴오버 수로도 지칭됨)는 주어진 효소에 대해 단일 촉매 부위가 실행하는 초당 기질 분자의 화학적 전환의 최대 수이다. 이는 모든 효소 촉매 부위가 기질로 포화될 때 반응의 최대 속도(Vmax)이다.
본원에 사용된 바와 같이, 표적 기질에 대한 특이성은 비-표적 기질로 지칭되는 또 다른 기질과 비교하여 프로테아제에 의한 표적 기질의 절단에 대한 선호를 지칭한다. 특이성은 그의 기질에 대한 프로테아제의 친화도 및 효소의 효율의 척도인 특이성 상수 (kcat/Km)에 반영된다. kcat/Km은 효소 효율의 척도이고; kcat의 큰 값 (급속 전환) 또는 Km의 작은 값 (기질에 대한 높은 친화도)은 kcat/Km을 크게 만든다.
본원에 사용된 바와 같이, 절단에 대한 특이성 상수는 (kcat/Km)이고, 여기서 Km은 미카엘리스-멘톤 상수 (1/2 Vmax 에서의 [S]이고 kcat은 Vmax/[ET]이고, ET는 최종 효소 농도이다. 파라미터 kcat, Km 및 kcat/Km은 기질 농도의 역수 대 기질 절단 속도의 역수를 그래프화하고, Lineweaver-Burk 방정식 (1/속도=(Km/Vmax)(1/[S] + 1/Vmax; 여기서 Vmax=[ET]kcat)에 피팅함으로써 계산될 수 있다. 다양한 농도의 기질의 존재 하에 시간에 따른 절단의 증가 속도를 결정하는 임의의 방법을 사용하여 특이성 상수를 계산할 수 있다. 예를 들어, 기질은 프로테아제에 의한 절단시 방출되는 형광원성 모이어티에 연결된다. 상이한 효소 농도에서 절단 속도를 결정함으로써, kcat가 특정 프로테아제에 대해 결정될 수 있다. 특이성 상수는 또 다른 기질에 비해 하나의 표적 기질에 대한 프로테아제의 선호도를 결정하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 기질 특이성은 또 다른 것에 비해 하나의 표적 기질에 대한 프로테아제의 선호를 지칭한다. 기질 특이성은 특이성 상수의 비로서 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 기질 특이성 비는 특이성 상수의 비이고, 둘 이상의 기질에 대한 둘 이상의 프로테아제 또는 프로테아제의 특이성을 비교하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 경쟁 기질을 위한 프로테아제의 기질 특이성 또는 기질에 대한 경쟁 프로테아제의 기질의 기질 특이성은 kcat/Km을 비교함으로써 비교될 수 있다. 예를 들어, 표적 기질에 대해 2 X 106 M- 1sec-1 및 비-표적 기질에 대해서는 2 X 104 M- 1sec-1의 특이성 상수를 갖는 프로테아제가 표적 기질에서 보다 특이적이다. 상기로부터의 특이성 상수를 사용하여, 프로테아제는 표적 기질에 대해 100의 기질 특이성 비를 갖는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 표적 기질에 대한 선호 또는 기질 특이성은 기질 특이성 비로서 표현될 수 있다. 선호도를 반영하는 비의 특정 값은 문제의 기질 및 프로테아제의 함수이다. 1보다 큰 기질 특이성 비는 표적 기질에 대한 선호도를 의미하고, 1보다 작은 기질 특이성은 비-표적 기질의 선호도를 의미한다. 일반적으로, 적어도 또는 약 1의 비는 후보 치료제로 간주되는 프로테아제에 대한 충분한 차이를 반영한다.
본원에 사용된 바와 같이, 변경된 특이성은 출발 야생형 프로테아제와 비교하여 변형된 프로테아제의 기질 특이성의 변화를 지칭한다. 일반적으로, 특이성의 변화는 프로테아제의 야생형 기질 (본원에서 비-표적 기질로 지칭됨)과 비교하여 표적 기질에 대한 변형된 프로테아제의 선호도 변화의 반영이다. 전형적으로, 본원에 제공된 변형된 u-PA 프로테아제는 야생형 u-PA 프로테아제의 기질 특이성에 비해 보체 단백질 C3에 대한 증가된 기질 특이성을 나타낸다. 예를 들어, 표적 기질 대 비-표적 기질에 대해 100의 기질 특이성 비를 갖는 변형된 프로테아제는 기질 특이성 비가 10인 스캐폴드 프로테아제와 비교하여 10배 증가된 특이성을 나타낸다. 또 다른 예에서, 0.1의 비와 비교하여 1의 기질 특이성 비를 갖는 변형된 프로테아제는 기질 특이성에서 10배 증가를 나타낸다. 스캐폴드 프로테아제와 비교하여 증가된 특이성을 나타내기 위해, 변형된 프로테아제는 보체 단백질 중 임의의 것 이상에 대해 1.5배, 2배, 5배, 10배, 50배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배 또는 그 보다 더 큰 기질 특이성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "선택성"은 경쟁 기질의 혼합물 중에서 하나의 표적 기질을 선택하고 절단하는 프로테아제의 능력을 지칭할 때 특이성과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 임의의 다른 하나 이상의 표적 기질과 비교하여 표적 기질에 대한 프로테아제의 증가된 선택성은, 예를 들어 프로테아제에 의한 표적 기질의 절단 특이성 상수를 비교함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제가 표적 기질에 대해 2 X 106 M- 1sec-1 및 하나 이상의 기질 중 임의의 다른 하나에 대해 2 X 104 M- 1sec-1의 절단의 특이성 상수를 갖는 경우, 프로테아제는 표적 기질에 대해 보다 선택적이다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드, 예컨대 프로테아제의 "활성" 또는 "기능적 활성"은 폴리펩타이드에 의해 나타나는 임의의 활성을 지칭한다. 이러한 활성은 경험적으로 결정될 수 있다. 예시적인 활성은 예를 들어, 기질-결합, DNA 결합, 또는 이량체화, 효소 활성, 예를 들어 키나제 활성 또는 단백질분해 활성을 통해 생체분자와 상호작용하는 능력을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 프로테아제(프로테아제 단편 포함)의 경우, 활성은 특정 기질에 특이적으로 결합하는 능력, 기질-결합의 친화도 및/또는 특이성(예를 들어, 높은 또는 낮은 친화도 및/또는 특이성), 효과기 기능, 예컨대 기질 (예, 단백질, 즉 C3) 억제, 중화, 절단 또는 제거를 촉진하는 능력, 및 생체 내 활성, 예컨대 단백질 절단 또는 제거를 촉진하는 능력을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 활성은 인식된 검정, 예컨대 ELISA, 유동 세포측정법, 표면 플라즈몬 공명 또는 온- 또는 오프-속도를 측정하기 위한 동등한 검정, 면역조직화학 및 면역형광 조직학 및 현미경검사, 세포-기반 검정, 및 결합 검정을 사용하여 시험관 내 또는 생체 내에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제, 예를 들어 변형된 u-PA 프로테아제의 경우, 시험관 내 및/또는 생체 내에서 기질 단백질 절단, 턴오버(turnover), 잔류 활성, 안정성 및/또는 수준을 측정함으로써 활성을 평가할 수 있다. 폴리펩타이드가 활성을 나타낸다는 것을 나타내는 이러한 시험관 내 검정의 결과는 생체 내 활성이 치료 활성 또는 생물학적 활성으로 지칭될 수 있는 생체 내 폴리펩타이드의 활성과 상관될 수 있다. 변형된 폴리펩타이드의 활성은 비변형된 폴리펩타이드와 비교하여 활성의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는 비변형된 폴리펩타이드의 활성의 임의의 수준 백분율일 수 있다. 변형된 (또는 변이체) 프로테아제의 기능성 또는 활성을 결정하기 위한 검정은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
기능적 활성은 생물학적 활성, 촉매 또는 효소 활성, 항원성(항-폴리펩타이드 항체에 결합하기 위해 폴리펩타이드에 결합하거나 폴리펩타이드와 경쟁하는 능력), 면역원성, 다량체를 형성하는 능력, 및 폴리펩타이드에 대한 수용체 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 능력을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 보체 단백질과 관련하여 기능적 활성은 아나필락시스, 옵소닌화, 화학주성 또는 세포 용해를 포함하나 이에 제한되지는 않는 보체 매개 기능을 지칭한다. 보체 활성의 활성을 시험하기 위한 검정의 예는 적혈구의 용혈, 및 예를 들어 ELISA 또는 SDS-PAGE에 의한 보체 효과기 분자의 검출을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 촉매 활성 또는 절단 활성은 선택된 기질의 단백질분해를 검출하는 시험관 내 단백질분해 검정에서 평가된 바와 같은 프로테아제의 활성을 지칭한다. 절단 활성은 프로테아제의 촉매 효율을 평가함으로써 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 표적 기질에 대한 활성은 절단 활성 및/또는 기능적 활성, 또는 표적 기질 상의 또는 표적 기질을 향한 프로테아제의 활성을 반영하는 다른 측정치를 지칭한다. 프로테아제에 의한 보체 단백질 표적 기질의 기능적 활성은 보체 검정, 예컨대 적혈구 용해, 또는 보체 활성을 평가하기 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되거나 본원에 제공된 다른 이러한 검정에서 IC50을 평가함으로써 측정될 수 있다. 절단 활성은 프로테아제의 촉매 효율을 평가함으로써 측정될 수 있다. 본원의 목적을 위해, 프로테아제가 표적 기질의 더 큰 단백질분해 또는 절단을 나타내고/나타내거나, 프로테아제의 부재시에 비해 보체 단백질의 기능적 활성을 조절 (즉, 활성화 또는 억제)하는 경우에 활성이 증가된다.
본원에 사용된 바와 같이, 변형된 u-PA 폴리펩타이드와 관련하여 "증가된 활성"은, 동일한 조건 하에서 시험될 때, 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 비변형 u-PA 폴리펩타이드와 비교하여 더 큰 활성을 나타낸다는 것을 의미한다. 예를 들어, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 변형되지 않은 또는 기준 u-PA 폴리펩타이드의 활성의 적어도 또는 적어도 약 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 또는 그 이상을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일한"은, 항체 결합 친화도와 관련하여 사용될 때, EC50, 결합 상수 (Ka) 또는 해리 상수(Kd)가 참조 항체의 것의 약 1 내지 100배 또는 1 내지 10배 이내임을 의미한다(참조 항체보다 1 내지 100배 더 큰 친화도 또는 1 내지 100배 더 적은 친화도, 또는 이러한 범위 내의 임의의 수치 값 또는 범위 또는 값).
본원에 사용된 바와 같이, "결합 활성"은 하나 이상의 결합 파트너에 결합하는지 여부 및 어떻게 결합하는지에 관한 분자, 예를 들어 폴리펩타이드의 특징을 지칭한다. 결합 활성은 결합 파트너(들)에 결합하는 능력, 결합 파트너에 결합하는 친화도 (예를 들어, 고친화도), 결합 파트너와의 결합 강도 및/또는 결합 파트너와의 결합에 대한 특이성을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 겉보기 Kd로도 불리는 EC50은 최대 활성의 50%가 고정된 양의 기질 상에서 관찰되는 프로테아제의 농도 (예를 들어, nM)이다(예를 들면, 이용가능한 hC3의 50%를 절단하는데 필요한 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 농도). 전형적으로, EC50 값은 S자형 용량-반응 곡선으로부터 결정되고, 여기서 EC50은 변곡점에서의 농도이다. 그의 기질에 대한 높은 프로테아제 친화도는 낮은 EC50 값과 상관관계가 있고, 낮은 친화도는 높은 EC50 값에 상응한다. 친화도 상수는 프로테아제 반응에 대한 표준 동역학적 방법, 예를 들어 면역검정, 예컨대 ELISA에 이어서 곡선-피팅 분석에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "친화도 상수"는 프로테아제와 기질 사이의 친화도 또는 분자 결합 강도를 측정하는데 사용되는 결합 상수 (Ka)를 지칭한다. 친화성 상수가 높을수록, 기질에 대한 프로테아제의 친화성이 커진다. 친화도 상수는 상호 몰농도(즉, M-1)의 단위로 표현되고, 프로테아제-기질 반응에 대한 표준 동역학적 방법(예를 들어, 면역검정, 표면 플라즈몬 공명, 또는 당업계에 공지된 다른 동역학적 상호작용 검정)에 의해 측정되는 결합-해리 반응에 대한 속도 상수로부터 계산될 수 있다. 프로테아제의 결합 친화도는 또한 해리 상수 또는 Kd로서 표현될 수 있다. 해리 상수는 결합 상수의 역수, Kd = 1/Ka이다. 따라서, 친화도 상수는 또한 Kd로 나타낼 수 있다. 친화도 상수는 프로테아제 반응에 대한 표준 동역학 방법, 예를 들어 하기에 의해 결정될 수 있다: 면역검정, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (Rich and Myszka (2000) Curr . Opin . Biotechnol 11:54; Englebienne (1998) Analyst. 123:1599), 등온 적정 열량측정법 (ITC) 또는 당업계에 공지된 다른 동역학적 상호작용 검정 (예를 들어, Paul, ed., Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, New York, 페이지 332-336 (1989) 참조). 실시간 검출 및 결합 속도의 모니터링을 위한 기기 및 방법은 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, BIAcore 2000, BIAcore AB, Uppsala, Sweden and GE Healthcare Life Sciences; Malmqvist (2000) Biochem . Soc . Trans. 27:335 참조).
친화도를 계산하는 방법, 예컨대 EC50 값을 결정하는 방법 또는 본원에 예시된 것들을 포함하는 결합/해리 상수를 결정하는 방법은 널리 공지되어 있다. 예를 들어, EC50과 관련하여, 높은 결합 친화도는 프로테아제가 약 10 ng/mL, 9 ng/mL, 8 ng/ml, 7 ng/ml, 6 ng/ml, 5 ng/mL, 3 ng/mL, 2 ng/ml, 1 ng/l 또는 그 이하의 EC50으로 표적 단백질에 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 높은 결합 친화도는 또한 10-6 M 또는 그 미만, 예컨대 10-7 M, 10-8 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 10-12 M 또는 그 미만의 평형 해리 상수 (Kd)를 특징으로 할 수 있다. 평형 결합 상수 (Ka)의 관점에서, 높은 결합 친화도는 일반적으로 약 106 M-1 이상, 약 107 M-1 이상, 약 108 M-1 이상, 또는 약 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 또는 1012 M-1 이상의 Ka 값과 관련된다. 친화도는 경험적으로 추정될 수 있거나, 또는 친화도는 예를 들어 특정 항원에 대한 2개 이상의 항체의 친화도를 비교함으로써, 예를 들어 시험된 항체의 친화도의 쌍별 비를 계산함으로써 상대적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 이러한 친화도는 통상적인 기술을 사용하여, 예컨대 ELISA; 평형 투석; 표면 플라즈몬 공명; 방사성표지된 표적 항원을 사용하는 방사성면역검정; 또는 통상의 기술자에게 공지된 또 다른 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 친화도 데이터는, 예를 들어 Scatchard 등, Ann N.Y . Acad . Sci., 51:660 (1949) 또는 곡선 피팅 분석에 의해, 예를 들어 하기 방정식을 사용하여 4 파라미터 로지스틱 비선형 회귀 모델을 사용하여 측정될 수 있다:
y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D, 여기서 A는 최소 점근선이고, B는 기울기 인자이고, C는 변곡점 (EC50)이고, D는 최대 점근선이다.
본원에 사용된 바와 같이, "ED50"은 전체 집단의 50%에서 명시된 결과 (예를 들어, 보체 단백질 C3의 절단)를 생성하는 프로테아제(예를 들면, 변형된 u-PA)의 용량 (예를 들면, mg/kg 또는 nM)이다(예를 들어, 샘플에 존재하는 C3의 총량).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표면 플라즈몬 공명"은, 예를 들어 BIAcore 시스템 (GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변경의 검출에 의해 실시간 상호작용의 분석을 허용하는 광학 현상을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 인간 단백질은 모든 대립유전자 변이체 및 그의 보존적 변이체를 포함하는, 인간의 게놈에 존재하는 핵산 분자, 예컨대 DNA에 의해 인코딩되는 것이다. 단백질의 변이체 또는 변형은 변형이 인간 단백질의 야생형 또는 우세한 서열을 기초로 하는 경우 인간 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같이, 천연 발생 α-아미노산의 잔기는 인간에서 그의 동족 mRNA 코돈을 갖는 하전된 tRNA 분자의 특이적 인식에 의해 단백질에 혼입되는 자연에서 발견되는 20개의 α-아미노산의 잔기이다.
본원에 사용된 바와 같이, 비-천연 발생 아미노산은 유전적으로 인코딩되지 않은 아미노산을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "핵산"은 전형적으로 포스포디에스테르 연결에 의해 함께 연결된 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA) 및 그의 유사체를 포함한 적어도 2개의 연결된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체를 지칭한다. 용어 "핵산"에는 또한 핵산의 유사체, 예컨대 펩타이드 핵산(PNA), 포스포로티오에이트 DNA, 및 다른 이러한 유사체 및 유도체 또는 그의 조합이 포함된다. 핵산은 또한 예를 들어 포스포디에스테르 결합, 예를 들어, 포스포트리에스테르 결합, 포스포르아미데이트결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩타이드 결합 (펩타이드 핵산) 이외의 뉴클레오타이드 유사체 또는 "골격" 결합을 함유하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 상기 용어는 또한, 등가물로서, 뉴클레오타이드 유사체, 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중-가닥 핵산으로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 유도체, 변이체 및 유사체를 포함한다. 데옥시리보뉴클레오타이드는 데옥시아데노신, 데옥시시티딘, 데옥시구아노신 및 데옥시티미딘을 포함한다. RNA의 경우, 우라실 염기는 우리딘이다. 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 예컨대 검출가능한 표지, 예컨대 형광 또는 방사성표지로 임의로 표지된 프로브 또는 프라이머를 언급할 때, 단일-가닥 분자가 고려된다. 이러한 분자는 전형적으로 그의 표적이 통계적으로 특유한 길이이거나 또는 라이브러리를 프로빙하거나 프라이밍하기 위한 낮은 카피수 (전형적으로 5 미만, 일반적으로 3 미만)이다. 일반적으로 프로브 또는 프라이머는 관심 유전자에 상보적이거나 동일한 서열의 적어도 14, 16 또는 30개의 인접 뉴클레오타이드를 함유한다. 프로브 및 프라이머는 10, 20, 30, 50, 100개 이상의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "단리된 핵산 분자"는 핵산 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. "단리된" 핵산 분자, 예컨대 cDNA 분자는 재조합 기술에 의해 생산될 때 다른 세포 물질, 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 본원에 제공된 예시적인 단리된 핵산 분자는 제공된 u-PA 프로테아제를 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.
예를 들어, 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩타이드와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, "합성"은 재조합 방법 및/또는 화학적 합성 방법에 의해 생성된 핵산 분자 및 폴리펩타이드 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리펩타이드"는 공유 결합된 2개 이상의 아미노산을 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "펩타이드"는 길이가 2 내지 약 또는 40개의 아미노산인 폴리펩타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에 제공된 아미노산의 다양한 서열에서 발생하는 아미노산은 그의 공지된, 3-문자 또는 1-문자 약어에 따라 확인된다(표 2). 다양한 핵산 단편에서 발생하는 뉴클레오타이드는 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 표준 단일 문자 명칭으로 지정된다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산"은 아미노 기 및 카르복실산 기를 함유하는 유기 화합물이다. 폴리펩타이드는 2개 이상의 아미노산을 함유한다. 본원의 목적을 위해, 아미노산은 20개의 천연 발생 아미노산(표 2), 비-천연 아미노산 및 아미노산 유사체 (즉, α-탄소가 측쇄를 갖는 아미노산)를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 나타난 폴리펩타이드의 다양한 아미노산 서열에서 발생하는 아미노산은 그의 널리 공지된, 3-문자 또는 1-문자 약어에 따라 확인된다(표 2 참조). 다양한 핵산 분자 및 단편에서 발생하는 뉴클레오타이드는 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 표준 단일 문자 명칭으로 지정된다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 그의 펩타이드 연결에서 폴리펩타이드의 화학적 소화 (가수분해) 시 형성된 아미노산을 지칭한다. 본원에 기재된 아미노산 잔기는 "L" 이성질체 형태로 존재하는 것으로 추정된다. 그렇게 지정된 "D" 이성질체 형태의 잔기는 목적하는 기능적 특성이 폴리펩타이드에 의해 유지되는 한 임의의 L-아미노산 잔기를 대체할 수 있다. NH2는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노 기를 지칭한다. COOH는 폴리펩타이드의 카르복실 말단에 존재하는 유리 카르복시 기를 지칭한다. J. Biol . Chem., 243: 3557-3559 (1968)에 기재되고 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822에 채용된 표준 폴리펩타이드 명명법과 관련하여, 아미노산 잔기에 대한 약어는 표 2에 나타낸다:
대응 표
기호
1-문자 3-문자 아미노산
Y Tyr 티로신
G Gly 글리신
F Phe 페닐알라닌
M Met 메티오닌
A Ala 알라닌
S Ser 세린
I Ile 이소류신
L Leu 류신
T Thr 트레오닌
V Val 발린
P Pro 프롤린
K Lys 라이신
H His 히스티딘
Q Gln 글루타민
E Glu 글루탐산
Z Glx Glu 및/또는 Gln
W Trp 트립토판
R Arg 아르기닌
D Asp 아스파르트산
N Asn 아스파라긴
B Asx Asn 및/또는 Asp
C Cys 시스테인
X Xaa 알려지지 않은 것 또는 기타
본원에서 화학식으로 표시되는 아미노산 잔기의 모든 서열은 아미노-말단에서 카르복실-말단으로의 통상적인 방향으로 왼쪽에서 오른쪽 배향을 갖는다. 어구 "아미노산 잔기"는 대응 표 (표 2)에 열거된 아미노산, 변형된, 비-천연 및 비통상적인 아미노산을 포함한다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 말단에서의 대시는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가의 서열 또는 아미노-말단 기, 예컨대 NH2 또는 카르복실-말단기, 예컨대 COOH에 대한 펩타이드 결합을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "천연 발생 아미노산"은 폴리펩타이드에서 발생하는 20개의 L-아미노산을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 천연 발생 α-아미노산의 잔기는 인간에서 그의 동족 mRNA 코돈을 갖는 하전된 tRNA 분자의 특이적 인식에 의해 단백질에 혼입되는 자연에서 발견되는 20개의 α-아미노산의 잔기이다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-천연 아미노산"은 천연 아미노산과 유사한 구조를 갖지만 천연 아미노산의 구조 및 반응성을 모방하도록 구조적으로 변형된 유기 화합물을 지칭한다. 따라서, 비-천연 발생 아미노산은 예를 들어 20개의 천연 발생 아미노산 이외의 아미노산 또는 아미노산의 유사체를 포함하고, 아미노산의 D-입체이성질체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 비-천연 아미노산은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 이에는 파라-아세틸 페닐알라닌, 파라-아지도 페닐알라닌, 2-아미노아디프산(Aad), 3-아미노아디프산(bAad), β-알라닌/β -아미노-프로피온산(Bala), 2-아미노부티르산(Abu), 4-아미노부티르산/피페리딘산(4Abu), 6-아미노카프로산(Acp), 2-아미노헵탄산(Ahe), 2-아미노이소부티르산(Aib), 3-아미노이소부티르산(Baib), 2-아미노피멜산(Apm), 2,4-디아미노부티르산(Dbu), 데스모신(Des), 2,2'-디아미노피멜산(Dpm), 2,3-디아미노프로피온산(Dpr), N-에틸글리신(EtGly), N-에틸아스파라긴(EtAsn), 하이드록실라이신(Hyl), 알로-하이드록실라이신(Ahyl), 3-하이드록시프롤린(3Hyp), 4-하이드록시프롤린(4Hyp), 이소데스모신(Ide), 알로-이소류신(Aile), N-메틸글리신, 사르코신(MeGly), N-메틸이소류신(MeIle), 6-N-메틸라이신(MeLys), N-메틸발린(MeVal), 노르발린(Nva), 노르류신(Nle), 및 오르니틴 (Orn)이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 비천연 아미노산은 본원에 기재되어 있고, 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 등속성 혼합물은 아미노산의 몰비가 그의 보고된 반응 속도에 기초하여 조정된 것이다(예를 들어, Ostresh 등 (1994) Biopolymers 34:1681을 참조한다).
본원에 사용된 바와 같이, DNA 작제물은 자연에서 발견되지 않는 방식으로 조합되고 병치된 DNA의 절편을 함유하는 단일 또는 이중 가닥, 선형 또는 원형 DNA 분자이다. DNA 작제물은 인간 조작의 결과로서 존재하고, 클론 및 조작된 분자의 다른 카피를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 절편은 명시된 속성을 갖는 보다 큰 DNA 분자의 일부이다. 예를 들어, 명시된 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 절편은 보다 긴 DNA 분자, 예컨대 플라스미드 또는 플라스미드 단편의 일부이며, 이는 5'에서 3' 방향으로 판독시 명시된 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 인코딩한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 동원체는 상이한 종으로부터의 폴리펩타이드 또는 단백질의 기능적 대응물인 하나의 종으로부터 수득된 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 동원체 간의 서열 차이는 종분화의 결과이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3' 말단으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 염기의 단일- 또는 이중-가닥 중합체를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 천연 공급원으로부터 단리되거나, 시험관 내에서 합성되거나, 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 분자의 길이는 뉴클레오타이드("nt"로 약칭됨) 또는 염기쌍("bp"로 약칭됨)의 관점에서 본원에 제공된다. 용어 뉴클레오타이드는 문맥상 허용되는 경우 단일- 및 이중-가닥 분자에 대해 사용된다. 상기 용어가 이중-가닥 분자에 적용되는 경우, 이는 전체 길이를 나타내는 것으로 사용되고, 용어 염기쌍과 동등한 것으로 이해된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드의 2개의 가닥이 길이가 약간 상이할 수 있고, 그의 말단이 엇갈릴 수 있고; 따라서 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 분자 내의 모든 뉴클레오타이드는 쌍을 이룰 수 없다는 것을 이해한다. 이러한 쌍을 이루지 않은 말단은 일반적으로 20개 뉴클레오타이드 길이를 초과하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 서열의 정렬은 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 2개 이상의 서열을 정렬하기 위한 상동성의 사용을 지칭한다. 전형적으로, 50% 이상의 동일성에 의해 관련된 2개 이상의 서열이 정렬된다. 정렬된 서열 세트는 상응하는 위치에서 정렬된 2개 이상의 서열을 지칭하고, 게놈 DNA 서열과 정렬된 RNA, 예컨대 EST 및 다른 cDNA로부터 유래된 정렬 서열을 포함할 수 있다. 관련 또는 변이체 폴리펩타이드 또는 핵산 분자는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 정렬될 수 있다. 이러한 방법은 전형적으로 매치를 최대화하고, 수동 정렬을 사용하고 당업자에게 공지된 수많은 정렬 프로그램 (예를 들어, BLASTP) 등을 사용하는 것과 같은 방법을 포함한다. 폴리펩타이드 또는 핵산의 서열을 정렬함으로써, 당업자는 보존되고 동일한 아미노산 잔기를 가이드로서 사용하여 유사한 부분 또는 위치를 확인할 수 있다. 추가로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 인간 및 비-인간 서열 사이에 및 이들 사이에 상응하는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 잔기를 발견하기 위한 가이드로서 보존된 아미노산 또는 뉴클레오타이드 잔기를 사용할 수 있다. 상응하는 위치는 또한, 예를 들어 단백질 구조의 컴퓨터 모의된 정렬을 사용함으로써 구조적 정렬에 기초할 수 있다. 다른 경우에, 상응하는 영역이 확인될 수 있다. 당업자는 또한 인간 및 비-인간 서열 사이 및 사이에 상응하는 아미노산 잔기를 찾기 위한 가이드로서 보존된 아미노산 잔기를 이용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "서열 동일성"은 시험과 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 사이의 비교에서 동일하거나 유사한 아미노산 또는 뉴클레오타이드 염기의 수를 지칭한다. 서열 동일성은 유사성 또는 동일성 영역을 확인하기 위해 핵산 또는 단백질 서열의 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다. 본원의 목적을 위해, 서열 동일성은 일반적으로 동일한 잔기를 확인하기 위한 정렬에 의해 결정된다. 정렬은 국소적 또는 전체적일 수 있다. 매치, 미스매치 및 갭이 비교된 서열 사이에서 확인될 수 있다. 갭(gap)은 동일하거나 유사한 특징이 정렬되도록 정렬된 서열의 잔기 사이에 삽입된 결실 아미노산 또는 뉴클레오타이드이다. 일반적으로, 내부 및 말단 갭이 존재할 수 있다. 서열 동일성은 동일한 잔기의 수/최단 서열의 길이 x 100으로서 갭을 고려하여 결정될 수 있다. 갭 패널티를 사용하는 경우, 서열 동일성은 말단 갭에 대한 페널티(penalty) 없이 결정될 수 있다(예를 들어, 말단 갭은 페널리화되지 않음). 대안적으로, 서열 동일성은 갭을 고려하지 않고 동일한 위치의 수/전체 정렬된 서열의 길이 x 100으로서 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "그에 상응하는 위치에서" 또는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치가 서열목록에 기재된 바와 같은, 개시된 서열 내의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치에 "상응한다" 라고 언급하는 것은 GAP 알고리즘과 같은 표준 정렬 알고리즘을 사용하여 동일성을 최대화하기 위해 개시된 서열과의 정렬 시에 확인된 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 위치를 지칭한다. 본원의 목적을 위해, u-PA 서열의 정렬은 서열번호: 2 또는 5에 제시된 인간 u-PA의 프로테아제 도메인의 아미노산 서열, 특히 서열번호: 5의 기준 인간 u/PA에 대한 것이다. 서열을 정렬함으로써, 당업자는 예를 들어 보존되고 동일한 아미노산 잔기를 가이드로서 사용하여 상응하는 잔기를 확인할 수 있다. 일반적으로, 상응하는 위치를 확인하기 위해, 아미노산의 서열을 정렬시켜 가장 높은 순서의 매치가 수득되도록 한다(예를 들어, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo 등 (1988) SIAM J Applied Math 48:1073]를 참조한다). 대안적으로, 통상의 기술자는 키모트립신 수에 의해 잔기를 넘버링함으로써 상응하는 잔기를 확인할 수 있다. 밀접하게 관련된 서열의 경우, 컴퓨터 알고리즘이 필요하지 않으며; 정렬은 시각적으로 수행될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "전체 정렬"은 시작부터 끝까지 2개의 서열을 정렬하고, 각각의 문자들을 각각의 서열에서 단지 1회 정렬하는 정렬이다. 서열 사이에 유사성 또는 동일성이 존재하는지 여부와 무관하게 정렬이 생성된다. 예를 들어, "전체 정렬"에 기초한 50% 서열 동일성은 각각 길이가 100개 뉴클레오타이드인 2개의 비교 서열의 전체 서열의 정렬에서, 잔기의 50%가 동일한 것을 의미한다. 전체 정렬은 또한 정렬된 서열의 길이가 동일하지 않은 경우에도 서열 동일성을 결정하는데 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 서열의 말단 단부의 차이는 "말단 갭에 대한 패널티 없음"이 선택되지 않는 한 서열 동일성을 결정하는데 고려된다. 일반적으로, 전체 정렬은 대부분의 길이에 걸쳐 유의한 유사성을 공유하는 서열에 사용된다. 전체 정렬을 수행하기 위한 예시적인 알고리즘은 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman 등 (1970) J. Mol . Biol. 48: 443)을 포함한다. 전체 정렬을 수행하기 위한 예시적인 프로그램은 공개적으로 이용가능하고, 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 웹사이트(ncbi.nlm.nih.gov/)에서 이용가능한 전체 서열 정렬 툴(Global Sequence Alignment Tool), 및 deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html 에서 이용가능한 프로그램을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "국소 정렬"은 2개의 서열을 정렬하지만, 유사성 또는 동일성을 공유하는 서열의 부분만을 정렬하는 정렬이다. 따라서, 국소 정렬은 한 서열의 하위-절편이 또 다른 서열에 존재하는지를 결정한다. 유사성이 없는 경우, 정렬은 복귀되지 않는다. 국소 정렬 알고리즘은 BLAST 및 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘 (Adv . Appl . Math. 2: 482 (1981)을 포함한다. 예를 들어, "국소 정렬"에 기초한 50% 서열 동일성은 임의의 길이의 2개의 비교 서열의 전체 서열의 정렬에서, 100개 뉴클레오타이드 길이의 유사성 또는 동일성의 영역이 유사성 또는 동일성을 갖는 영역에서 동일한 잔기의 50%를 갖는다는 것을 의미한다.
본원의 목적을 위해, 서열 동일성은 각각의 공급자에 의해 확립된 디폴트 갭 패널티와 함께 사용되는 표준 정렬 알고리즘 프로그램에 의해 결정될 수 있다. GAP 프로그램에 대한 디폴트 파라미터는 다음을 포함할 수 있다: (1) 단항 비교 매트릭스(동일성에 대해 1의 값 및 비동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Gribskov 등 (1986) Nucl . Acids Res. 14: 6745, Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)의 가중된 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대해 3.0의 패널티 및 각각의 갭에서 각각의 기호에 대해 추가의 0.10 패널티; 및 (3) 말단 갭에 대한 페널티 없음. 임의의 두 핵산 분자가 뉴클레오타이드 서열 또는 임의의 두 폴리펩타이드가 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% "동일한" 아미노산 서열 또는 퍼센트 동일성을 인용하는 다른 유사한 변이를 갖는지 여부는 국소 또는 전체 정렬에 기초한 공지된 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 다수의 공지되고 공개적으로 이용가능한 정렬 데이터베이스 및 프로그램에 대한 연결을 제공하는, wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software 참조). 일반적으로, 본원의 목적을 위해, 서열 동일성은 전체 정렬에 기초한 컴퓨터 알고리즘, 예컨대 NCBI/BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome); LAlign (William Pearson implementing the Huang and Miller algorithm (Adv . Appl . Math. (1991) 12:337-357)); 및 deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/Align.html.Generally에서 이용가능한 Xiaoqui Huang로부터의 프로그램을 사용하여 결정된다. 일반적으로, 본원의 뉴클레오티드 서열을 비교할 때, 말단 갭에 대한 페널티를 갖는 정렬이 사용된다. 국소 정렬은 또한 비교되는 서열이 실질적으로 동일한 길이일 때 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일성"은 시험과 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 사이의 비교 또는 정렬을 나타낸다. 한 비제한적 예에서, "~와 적어도 90% 동일한"은 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 대해 90% 내지 100%의 동일성 퍼센트를 지칭한다. 90% 이상의 수준에서의 동일성은 예시 목적을 위해 시험 및 참조 폴리펩타이드 또는 100개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드 길이가 비교된다고 가정하면, 시험 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 내의 10% 또는 그 미만 (즉, 100개 중 10개)의 아미노산 또는 뉴클레오타이드가 참조 폴리펩타이드의 것과 상이하다는 사실을 나타낸다. 유사한 비교가 시험 폴리뉴클레오타이드와 참조 폴리뉴클레오타이드 사이에서 이루어질 수 있다. 이러한 차이는 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 무작위로 분포된 점 돌연변이로서 나타낼 수 있거나, 또는 이들은 최대 허용 가능한, 예를 들어 10/100개의 아미노산 차이 (대략 90% 동일성)까지 다양한 길이의 하나 이상의 위치에서 클러스터링될 수 있다. 차이는 또한 아미노산 잔기의 결실 또는 절단에 기인할 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 비교된 서열의 길이에 따라, 약 85-90% 초과의 상동성 또는 동일성 수준에서, 결과는 프로그램 및 갭 파라미터 세트에 독립적일 수 있고; 이러한 높은 수준의 동일성은 종종 소프트웨어에 의존하지 않고 용이하게 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 디설파이드 결합 (S-S 결합 또는 디설파이드 가교로도 지칭됨)은 티올 기의 커플링으로부터 유래된 단일 공유 결합이다. 단백질 내의 디설파이드 결합은 시스테인 잔기의 티올 기 사이에 형성되고, 폴리펩타이드 도메인 사이의 상호작용을 안정화시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, "커플링된" 또는 "접합된"은 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 부착된 것을 의미한다. 본원에 제공된 접합체는 변형된 u-PA 폴리펩타이드 프로테아제 도메인("SPD"로 지칭됨, 예를 들어 도 4 참조), 및 링커를 다른 모이어티, 예컨대 혈청 반감기 증가와 같은 특성을 부여하거나(즉, 인간 혈청 알부민 HSA), 발현 또는 정제를 용이하게 하거나(즉 SUMO, his-SUMO, TSG-6), 또는 단백질을 수용체에 결합하는 항체와 같은 수용체로 표적화하는 폴리펩타이드에 직접 또는 바이알에 연결된 나머지 u-PA 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 함유한다. 폴리펩타이드는 직접적으로 또는 폴리펩타이드 링커, 일반적으로 약 4-20개의 짧은 아미노산, 예컨대 Ser 및 Gly 잔기의 조합을 통해 연결될 수 있다. 폴리펩타이드를 함유하는 접합체는 일반적으로 융합 단백질이다. 접합체는 또한 아미노산 잔기가 모이어티, 예컨대 PEG 모이어티, 글리코실화 모이어티 및 다른 이러한 모이어티에 연결된 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머"는 적절한 조건 (예를 들어, 4개의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합화제, 예컨대 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사효소의 존재 하에) 하에 적절한 완충액 중에서 적합한 온도에서 주형-지정 DNA 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 당업자는 특정 핵산 분자가 "프로브" 및 "프라이머"로서 작용할 수 있음을 이해한다. 그러나, 프라이머는 연장을 위한 3' 히드록실기를 가진다. 프라이머는 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 역전사효소 (RT)-PCR, RNA PCR, LCR, 멀티플렉스 PCR, 팬핸들 PCR, 포획 PCR, 발현 PCR, 3' 및 5' RACE, 계내(in situ) PCR, 결찰 매개 PCR 및 다른 증폭 프로토콜을 포함하는 다양한 방법에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머"는 전형적으로 3개 초과의 2개 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭하며, 이로부터 프라이머 연장 생성물의 합성이 개시될 수 있다. 합성에 도움이 되는 실험 조건은 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합 및 확장을 위한 제제, 예컨대 DNA 폴리머라제, 및 적합한 완충액, 온도 및 pH의 존재를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "프라이머 쌍"은 (예를 들어, PCR에 의해) 증폭될 서열의 5' 말단과 혼성화하는 5' (상류) 프라이머, 및 증폭시킬 서열의 3' 말단의 상보체와 혼성화하는 3' (하류) 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적으로 혼성화하다"는 상보적 염기-쌍형성에 의해 핵산 분자 (예를 들어 올리고뉴클레오타이드)를 표적 핵산 분자에 어닐링하는 것을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특이적 혼성화, 예컨대 특정한 분자의 길이 및 조성에 영향을 미치는 시험관 내 및 생체 내 파라미터에 친숙하다. 시험관 내 혼성화에 특히 관련된 파라미터는 추가로 어닐링 및 세척 온도, 완충액 조성 및 염 농도를 포함한다. 높은 엄격도에서 비-특이적으로 결합된 핵산 분자를 제거하기 위한 예시적인 세척 조건은 0.1 x SSPE, 0.1% SDS, 65℃고, 중간 엄격도에서는 0.2 x SSEP, 0.1%SDS, 50℃이다. 동등한 엄격성 조건은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 특정 적용에 적절한 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자의 특이적 혼성화를 달성하기 위해 이들 파라미터를 용이하게 조정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 생성물과 실질적으로 동일하다는 것은 실질적으로 동일한 생성물이 생성물 대신에 사용될 수 있도록 관심 특성이 충분히 변하지 않도록 충분히 유사하다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "유사한"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 문맥에 따라 달라지는 것으로 또한 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드 또는 핵산 분자의 야생형 형태는 유전자에 의해 또는 유전자에 의하여 인코딩된 코딩 서열에 의하여 인코딩된 형태이다. 전형적으로, 야생형 형태의 유전자, 또는 그에 의해 인코딩되는 분자는 기능 또는 구조를 변경시키는 돌연변이 또는 다른 변형을 함유하지 않는다. 용어 야생형은 또한 종 사이 및 종 사이에서 발생하는 대립유전자 변이를 갖는 형태를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드 또는 핵산 분자의 우세한 형태는 유전자로부터 생성된 주요 형태인 분자의 형태를 지칭한다. "우세한 형태"는 공급원마다 다양하다. 예를 들어, 상이한 세포 또는 조직 유형은, 예를 들어 대안적 스플라이싱 및/또는 대안적 단백질 프로세싱에 의해 상이한 형태의 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 각각의 세포 또는 조직 유형에서, 상이한 폴리펩타이드는 "우세한 형태"일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 대립유전자 변이체 또는 대립유전자 변이는 동일한 염색체 유전자좌를 점유하는 유전자의 임의의 2개 이상의 대안적 형태를 지칭한다. 대립유전자 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하고, 집단 내에서 표현형 다형성을 초래할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵할 수 있거나 (인코딩된 폴리펩타이드에서 변화가 없음), 또는 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. 용어 "대립유전자 변이체"는 또한 유전자의 대립유전자 변이체에 의해 인코딩된 단백질을 나타내기 위해 본원에 사용된다. 전형적으로, 유전자의 기준 형태는 종의 집단 또는 단일 기준 구성원으로부터의 야생형 형태 및/또는 우세한 형태의 폴리펩타이드를 인코딩한다. 전형적으로, 종들 사이 및 종들 사이에 변이체를 포함하는 대립유전자 변이체는 동일한 종으로부터의 야생형 및/또는 우세한 형태와 적어도 80%, 90% 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 갖고; 동일성의 정도는 유전자 및 비교가 종간 또는 종내인지 여부에 의존한다. 일반적으로, 종내 대립유전자 변이체는 야생형 및/또는 우세한 형태의 폴리펩타이드와 적어도 또는 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 포함하여, 야생형 및/또는 우세한 형태와 적어도 또는 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "대립유전자 변이체"와 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "대립유전자"는 유전자 또는 그의 일부의 대안적 형태를 지칭한다. 대립유전자는 상동 염색체 상의 동일한 유전자좌 또는 위치를 차지한다. 대상체가 유전자의 2개의 동일한 대립유전자를 갖는 경우에, 대상체는 그 유전자 또는 대립유전자에 대해 동형접합성인 것으로 언급된다. 대상체가 유전자의 2개의 상이한 대립유전자를 갖는 경우에, 대상체는 유전자에 대해 이형접합성인 것으로 언급된다. 특정 유전자의 대립유전자는 단일 뉴클레오타이드 또는 여러 뉴클레오타이드에서 서로 상이할 수 있고, 뉴클레오타이드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립유전자는 또한 돌연변이를 함유하는 유전자의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 종 변이체는 상이한 포유동물 종, 예컨대 마우스 및 인간을 포함한 상이한 종 중 폴리펩타이드 내의 변이체를 지칭한다. 일반적으로, 종 변이체는 약 또는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다. 종 변이체 사이의 상응하는 잔기는, 예를 들어, 서열 사이의 동일성이 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상이 되도록, 매칭 뉴클레오타이드 또는 잔기의 수를 최대화하도록 서열을 비교하고 정렬함으로써 결정될 수 있다. 이어서, 관심 위치는 참조 핵산 분자에 지정된 수로 주어진다. 정렬은 수동으로 또는 눈에 의해 수행될 수 있고, 특히 서열 동일성은 80% 초과이다.
본원에 사용된 바와 같이, 스플라이스 변이체는 하나 초과의 유형의 mRNA를 생성하는 게놈 DNA의 1차 전사체의 차등적 프로세싱에 의해 생성된 변이체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드의 아미노산의 1차 서열 또는 핵산 분자 내의 뉴클레오타이드 서열의 변형에 관한 변형은 각각 아미노산 및 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 및 치환을 포함한다. 이는 번역후 변형, 예컨대 글리코실화, 파르니실화, 페길화, 및 융합, 예컨대 특성을 변화시키는 다른 폴리펩타이드, 예컨대 알부민화에 의한 혈청 반감기, 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민과의 융합, 및 폴리펩타이드에 대한 다른 이러한 변형을 포함하는 폴리펩타이드 자체의 변형과 대조적이다. 따라서, 아미노산 서열의 변형에 대한 언급은 삽입, 결실, 치환/대체, 및 이들의 조합을 지칭한다. 폴리펩타이드의 변형은 폴리펩타이드의 서열을 변화시키지 않는 폴리펩타이드에 부가되는 변형을 지칭한다.
본원의 목적을 위해, 생성된 단백질이 프로테아제 활성 또는 다른 활성을 나타낸다면, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은 임의의 u-PA 폴리펩타이드 또는 이의 촉매 활성 단편에서 이루어질 수 있다(또는, 원하는 경우, 이러한 변화는 활성을 제거하기 위해 이루어질 수 있음). 변형은 보존적 아미노산 치환 및 또한 비-보존적 아미노산 치환을 수행함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 단백질의 특성을 바람직하게 또는 유리하게 변경시키는 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 일 구현예에서, 폴리펩타이드의 분해를 방지하는 돌연변이가 이루어질 수 있다. 다수의 프로테아제는 염기성 잔기, 예컨대 R 및 K 후에 절단되고; 이러한 절단을 제거하기 위해, 염기성 잔기는 비-염기성 잔기로 대체된다. 프로테아제와 억제제의 상호작용은 억제제와 프로테아제의 상호작용 부위에서 비-보존적 변화를 수행함으로써 촉매 활성을 유지하면서 차단될 수 있다. 다른 활성도 변경될 수 있다. 예를 들어, 수용체 결합은 촉매 활성을 변경하지 않고 변경될 수 있다.
고려되는 아미노산 치환은 단백질분해 활성을 제거하지 않는 보존적 치환, 예컨대 표 3에 제시된 것을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 단백질의 특성을 변경시키는 치환, 예컨대 절단 부위 및 다른 이러한 부위의 제거가 또한 고려되며; 이러한 치환은 일반적으로 비-보존적이지만, 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 아미노산의 적합한 보존적 치환은 당업자에게 공지되어 있으며, 일반적으로 생성된 분자의 생물학적 활성을 변경시키지 않으면서 이루어질 수 있다. 당업자는 일반적으로 폴리펩타이드의 비필수 영역 내의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인지한다(예를 들어, Watson 등 Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224를 참조한다). 이러한 치환은 하기와 같이 표 3에 기재된 것에 따라 이루어질 수 있다:
표 3
최초 잔기 예시적인 보존적 치환
Ala (A) Gly; Ser
Arg (R) Lys
Asn (N) Gln; His
Cys (C) Ser
Gln (Q) Asn
Glu (E) Asp
Gly (G) Ala; Pro
His (H) Asn; Gln
Ile (I) Leu; Val
Leu (L) Ile; Val
Lys (K) Arg; Gln; Glu
Met (M) Leu; Tyr; Ile
Phe (F) Met; Leu; Tyr
Ser (S) Thr
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe
Val (V) Ile; Leu
다른 치환도 허용가능하고, 경험적으로 또는 공지된 보존적 치환에 따라 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 프로모터는 RNA 폴리머라제의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 함유하는 유전자의 일부를 의미한다. 프로모터 서열은 일반적으로 유전자의 5' 비-코딩 영역에서 발견되지만 항상 그런 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분은 단백질이 유래된 조직의 세포로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 제제는 표준 분석 방법, 예컨대 박층 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 쉽게 검출가능한 불순물이 없는 것으로 보이거나, 이러한 순도를 평가하기 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 사용되거나, 또는 추가의 정제가 물질의 물리적 및 화학적 특성, 예컨대 효소적 및 생물학적 활성을 검출가능하게 변경시키지 않도록 충분히 순수한 것으로 보이는 경우에 실질적으로 없는 것으로 결정될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 제조하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 이러한 경우에, 추가의 정제는 화합물의 특이적 활성을 증가시킬 수 있다.
세포 물질이 실질적으로 없는이라는 용어는 단백질이 단리되거나 재조합에 의해 생산되는 세포의 세포 성분으로부터 분리된 단백질의 제제를 포함한다. 일 구현예에서, 용어 세포 물질이 실질적으로 없는 것은 약 30% (건조 중량 기준) 미만의 비-프로테아제 단백질 (본원에서 오염 단백질로도 지칭됨), 일반적으로 약 20% 미만의 비-프로테아제 단백질 또는 10% 미만의 비-프로테아제 단백질 또는 약 5% 미만의 비-프로테아제 단백질을 갖는 프로테아제 단백질의 제제를 포함한다. 프로테아제 단백질 또는 그의 활성 부분이 재조합적으로 생산될 때, 이는 또한 배양 배지가 실질적으로 없으며, 즉 배양 배지는 프로테아제 단백질 제제의 부피의 약 20%, 10% 또는 5% 또는 그 미만을 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같이, 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는이라는 용어는 프로테아제 단백질의 제제를 포함하며, 여기서 단백질은 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 및 다른 화학물질로부터 분리된다. 상기 용어는 약 30% (건조 중량 기준) 미만, 20%, 10%, 5% 또는 그 미만의 화학적 전구체 또는 비-프로테아제 화학물질 또는 성분을 갖는 프로테아제 단백질의 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 재조합 DNA 방법을 사용하는 재조합 수단에 의한 생산은 클로닝된 DNA에 의해 인코딩된 단백질을 발현시키기 위한 분자 생물학의 널리 공지된 방법의 사용을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오타이드의 전사 및 번역에 의해 폴리펩타이드가 생산되는 과정을 지칭한다. 폴리펩타이드의 발현 수준은, 예를 들어 숙주 세포로부터 생산된 폴리펩타이드의 양을 결정하는 방법을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 방법은 ELISA, 겔 전기영동 후의 쿠마시 블루 염색, 로우리 단백질 검정 및 브래드포드 단백질 검정에 의한 세포 용해물 중 폴리펩타이드의 정량화를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 벡터를 수용, 유지, 재생 및/또는 증폭시키는데 사용되는 세포이다. 숙주 세포는 또한 벡터에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 벡터 내에 함유된 핵산은 숙주 세포가 분열할 때 복제되어 핵산을 증폭시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터" 또는 "플라스미드"는 벡터가 적절한 숙주 세포로 형질전환될 때 하나 이상의 이종 단백질이 발현될 수 있는 복제가능한 핵산이다. 벡터에 대한 언급은 이종 핵산을 그의 발현 또는 복제를 위해 세포 내로 도입하기 위해 사용되는 별개의 요소를 포함한다. 벡터에 대한 언급은 또한 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산이 전형적으로 제한 소화 및 결찰에 의해 도입될 수 있는 벡터를 포함한다. 벡터에 대한 언급은 또한 프로테아제, 예컨대 변형된 u-PA를 인코딩하는 핵산을 함유하는 벡터를 포함한다. 벡터는 핵산의 증폭 또는 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드의 발현/디스플레이를 위해 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용된다. 벡터는 전형적으로 에피솜으로 유지되지만, 유전자 또는 그의 일부를 게놈의 염색체 내로 통합시키도록 설계될 수 있다. 또한, 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체 및 포유동물 인공 염색체인 벡터가 고려된다. 이러한 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 벡터는 또한 "바이러스 벡터(virus vector)" 또는 "바이러스 벡터(viral vector)” 포함한다. 바이러스 벡터는 외인성 유전자를 세포로 (운반체 또는 셔틀로서) 전달하기 위해 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 조작된 바이러스이다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현 벡터"는 조절 서열, 예컨대 이러한 DNA 단편의 발현을 수행할 수 있는 프로모터 영역과 작동가능하게 연결된 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 이러한 추가의 세그먼트는 프로모터 및 종결자 서열을 포함할 수 있고, 임의로 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선택 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래되거나, 둘 모두의 요소를 함유할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 작제물, 예컨대 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내로의 도입 시 클로닝된 DNA의 발현을 유발하는 다른 벡터를 지칭한다. 적절한 발현 벡터는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 진핵 세포 및/또는 원핵 세포에서 복제가능한 것들 및 에피솜으로 남아있는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합되는 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터는 또한 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터"를 포함한다. 바이러스 벡터는 외인성 유전자를 세포로(비히클 또는 셔틀로서) 전달하기 위해 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 조작된 바이러스이다.
본원에 사용된 바와 같이, 아데노바이러스는 인간에서 결막염 및 상기도 감염을 유발하는 DNA-함유 바이러스의 군 중 임의의 것을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 네이키드 DNA는 백신 및 유전자 요법에 사용될 수 있는 히스톤-무함유 DNA를 지칭한다. 네이키드 DNA는 형질전환이라 불리는 유전자 전달 과정 동안 세포로부터 세포로 통과하는 유전 물질이다. 형질전환에서, 정제된 또는 네이키드 DNA는 수용 세포에 새로운 특징 또는 표현형을 제공할 수용 세포에 의해 흡수된다.
핵산 서열, 영역, 요소 또는 도메인과 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된"은 핵산 영역이 서로 기능적으로 관련되어 있음을 의미한다. 예를 들어, 리더 펩타이드를 인코딩하는 핵산은 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 이에 의해 핵산은 전사되고 번역되어 기능적 융합 단백질을 발현할 수 있고, 여기서 리더 펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 분비에 영향을 미친다. 일부 경우에, 제1 폴리펩타이드 (예를 들어, 리더 펩타이드)를 인코딩하는 핵산은 제2 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 핵산은 단일 mRNA 전사체로서 전사되지만, mRNA 전사체의 번역은 2개의 폴리펩타이드 중 하나가 발현되도록 할 수 있다. 예를 들어, 앰버(amber) 종결 코돈은 제1 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산과 제2 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 사이에 위치할 수 있어서, 부분적인 앰버 억제 세포 내로 도입될 때, 생성된 단일 mRNA 전사체가 번역되어 제1 및 제2 폴리펩타이드 중 임의의 것을 함유하는 융합 단백질을 생산할 수 있거나, 또는 번역되어 단지 제1 폴리펩타이드만을 생성할 수 있다. 또 다른 예에서, 프로모터는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있고, 이에 의해 프로모터는 핵산의 전사를 조절하거나 매개한다.
본원에 사용된 바와 같이, "1차 서열"은 폴리펩타이드 내의 아미노산 잔기의 서열 또는 핵산 분자 내의 뉴클레오타이드의 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질 결합 서열은 다른 단백질 또는 펩타이드 서열, 일반적으로 한 세트의 단백질이나 펩타이드 서열 또는 특정 단백질 혹은 펩타이드 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 혹은 펩타이드 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "태그" 또는 "에피토프 태그"는 전형적으로 폴리펩타이드의 N- 또는 C- 말단에 부가된 아미노산, 예컨대 본원에 제공된 u-PA의 서열을 지칭한다. 폴리펩타이드에 융합된 태그의 포함은 폴리펩타이드 정제 및/또는 검출을 용이하게 할 수 있다. 전형적으로, 태그 또는 태그 폴리펩타이드는 항체에 의해 인식되는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖거나 검출 또는 정제를 위해 제공될 수 있지만, 그것이 연결된 폴리펩타이드의 활성을 방해하지 않도록 충분히 짧은 폴리펩타이드를 지칭한다. 태그 폴리펩타이드는 전형적으로 그에 특이적으로 결합하는 항체가 그에 연결된 폴리펩타이드 내의 에피토프와 실질적으로 교차-반응하지 않도록 충분히 독특하다. 에피토프 태그부착된 단백질은 태그에 대해 생성된 고도로 특이적인 항체를 사용하여 친화성 정제될 수 있다.
적합한 태그 폴리펩타이드는 일반적으로 적어도 5 또는 6개의 아미노산 잔기, 및 통상적으로 약 8-50개의 아미노산 잔기를 갖고, 전형적으로 9-30개의 잔기를 갖는다. 태그는 하나 이상의 단백질에 연결될 수 있고, 샘플 또는 혼합물로부터 단백질의 검출 또는 이의 회수를 허용한다. 이러한 태그는 널리 공지되어 있고, 용이하게 합성되고 설계될 수 있다. 예시적인 태그 폴리펩타이드는 친화성 정제에 사용되는 것을 포함하고, 소형 유비퀴틴-유사 개질제(SUMO) 태그, FLAG 태그, His 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그 폴리펩타이드 및 그의 항체 12CA5 (Field 등 (1988) Mol . Cell. Biol. 8:2159-2165); c-myc 태그 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체(예를 들어, Evan 등 (1985) Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616); 및 단순 포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체(Paborsky 등 (1990) Protein Engineering 3:547-553)를 포함한다. 에피토프-태그부착된 항체를 검출하는데 사용되는 항체는 전형적으로 본원에서 2차 항체로 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 금속 결합 서열은 일반적으로 금속 이온, 금속 이온 세트 또는 특정 금속 이온에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 또는 펩타이드 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 평가는 샘플에 존재하는 프로테아제 또는 그의 도메인의 활성에 대한 절대값을 얻고, 또한 활성 수준을 나타내는 지수, 비, 백분율, 시각적 또는 다른 값을 얻는 의미에서 정량적 및 정성적 결정을 포함하도록 의도된다. 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있고, 실제로 검출된 화학 종은 물론 단백질분해 생성물 자체일 필요는 없지만, 예를 들어 그의 유도체 또는 일부 추가의 물질일 수 있다. 예를 들어, SDS-PAGE 및 쿠마시 블루로의 단백질 염색에 의한 보체 단백질의 절단 생성물의 검출.
본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 활성은 화합물, 조성물 또는 다른 혼합물의 생체 내 투여시 생성되는 화합물의 생체 내 활성 또는 생리학적 반응을 지칭한다. 따라서, 생물학적 활성은 이러한 화합물, 조성물 및 혼합물의 치료 효과 및 약제학적 활성을 포함한다. 생물학적 활성은 이러한 활성을 시험하거나 사용하도록 설계된 시험관 내 시스템에서 관찰될 수 있다. 따라서, 본원의 목적상, 프로테아제의 생물학적 활성은 폴리펩타이드가 가수분해되는 그의 촉매 활성이다.
본원에 사용된 바와 같이, 동등한 것은, 2개의 핵산 서열을 언급할 때, 해당 2개의 서열이 동일한 아미노산 서열 또는 동등한 단백질을 인코딩함을 의미한다. 2개의 단백질 또는 펩타이드를 언급하는 데 등가물이 사용되는 경우, 이는 2종의 단백질 또는 펩타이드가 단백질 또는 폴리펩타이드의 활성 또는 기능을 실질적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환만을 갖는 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 비제한적으로, 보존적 변화, 예컨대 상기 표 3에 제시된 것)을 갖는다는 것을 의미한다. 동등물이 특성을 지칭하는 경우, 특성은 동일한 정도로 존재할 필요는 없지만 (예를 들어, 2개의 펩타이드는 동일한 유형의 효소 활성의 상이한 속도를 나타낼 수 있음), 활성은 통상적으로 실질적으로 동일하다. 상보적이라는 것은, 2개의 뉴클레오타이드 서열을 언급할 때, 뉴클레오타이드의 2개의 서열이 전형적으로 대향하는 뉴클레오타이드 사이에 25%, 15% 또는 5% 미만의 미스매치로 혼성화할 수 있다는 것을 의미한다. 필요한 경우, 상보성의 백분율은 명시될 것이다. 전형적으로, 2개의 분자는 높은 엄격성 조건 하에 혼성화되도록 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질의 활성 또는 유전자 또는 핵산의 발현을 조절하는 제제는 단백질의 활성을 감소시키거나 증가시키거나 달리 변경시키거나, 또는 일부 방식으로, 세포에서 핵산의 발현을 상향- 또는 하향-조절하거나 달리 변경시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질" 프로테아제는 상이한 폴리펩타이드에 작동가능하게 연결된 폴리펩타이드를 지칭한다. 본원에 제공된 키메라 또는 융합 단백질은 하나 이상의 프로테아제 또는 이의 일부, 예컨대 이의 단쇄 프로테아제 도메인, 및 전사/번역 제어 신호, 신호 서열, 국재화 태그, 정제를 위한 태그, 면역글로불린 G의 도메인의 일부, 및/또는 표적화제 중 임의의 하나 이상에 대한 하나 이상의 다른 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 이들 키메라 또는 융합 단백질은 융합 단백질로서 재조합 수단에 의해 생성된 것, 화학적 수단에 의해, 예컨대 화학적 커플링에 의해, 예를 들어 술프히드릴 기에 대한 커플링을 통해 생성된 것 및 적어도 1종의 프로테아제 또는 그의 일부가 링커(들)를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 또 다른 폴리펩타이드에 연결되는 임의의 다른 방법에 의해 생성된 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 융합 단백질을 언급할 때 작동가능하게 연결된은 서로 인-프레임으로 융합된 프로테아제 폴리펩타이드 및 비-프로테아제 폴리펩타이드를 지칭한다. 비-프로테아제 폴리펩타이드는 프로테아제 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 표적화제는, 일부 경우에 결합된 접합체 또는 그의 일부를 내재화할 수 있는, 세포 표면 수용체에 대한 접합체의 특이적 결합을 제공하는 임의의 모이어티, 예컨대 단백질 또는 그의 유효 부분이다. 표적화제는 또한, 예를 들어 접합체의 친화도 단리 또는 정제; 표면에의 접합체의 부착; 또는 접합체를 함유하는 접합체 또는 복합체의 검출을 촉진하거나 용이하게 하는 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "링커"는 2개의 폴리펩타이드 (또는 이러한 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산)를 연결하는 아미노산의 짧은 서열을 지칭한다. "펩타이드 링커"는 2개의 폴리펩타이드 서열을 연결하는 아미노산의 짧은 서열을 지칭한다. 폴리펩타이드 링커의 예는 scFv 단편과 같은 합성 항체 단편에서 2개의 항체 사슬을 연결하는 링커이다. 링커는 널리 공지되어 있고, 임의의 공지된 링커가 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 예시적인 폴리펩타이드 링커는 (Gly-Ser)n 아미노산 서열이고, 일부 Glu 또는 Lys 잔기는 용해도를 증가시키기 위해 전체적으로 분산된다. 다른 예시적인 링커가 본원에 기재되어 있고; 임의의 이들 및 다른 공지된 링커가 제공된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 분자의 유도체 또는 유사체는 분자로부터 유래된 부분 또는 분자의 변형된 버전을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "질환 또는 장애"는 감염, 후천성 상태, 유전적 상태, 환경 노출 및 인간 거동과 관련된 상태, 및 확인가능한 증상을 특징으로 하는 상태를 포함하나 이에 제한되지는 않는 원인 또는 상태로부터 생성된 유기체에서의 병리학적 상태를 지칭한다. 질환 또는 장애는 임상적으로 진단된 질환뿐만 아니라 임상적 질환으로 진단되지 않은 유기체의 정상 상태에서의 파괴를 포함한다. 본원에서 관심 질환 및 장애는 보체 활성화에 의해 매개되는 것들 및 보체 활성화가 병인 또는 병리학에서 역할을 하는 것들을 포함하는, 보체 활성화를 수반하는 것들이다. 본원에서 관심 질환 및 장애는 보체 활성화 (예를 들어, 연령 관련 황반 변성 및 신장 지연 이식 기능)를 특징으로 하는 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 황반 변성은 황반으로 알려진 망막의 작은 중심 부분이 악화될 때 발생한다. 두 가지 유형의 AMD가 존재한다: 건성(위축성) 및 습성(신혈관 또는 삼출성). 대부분의 AMD는 건식 유형으로서 시작하고, 개체의 10-20%에서, 이는 습식 유형으로 진행된다. 연령 관련 황반 변성은 항상 양측성이지만 (즉, 양쪽 눈에서 발생함), 양쪽 눈에서 동일한 속도로 반드시 진행되지는 않는다.
본원에 사용된 연령 관련 황반 변성(AMD)은 노인에서 시각 장애 및 실명을 유발하는 염증성 질환이다. 보체계의 단백질은 이러한 질환의 발생에 중요하다. AMD에서 국소 및 전신 염증은 보체계의 대안적인 경로의 탈조절된 작용에 의해 매개된다.
본원에 사용된 바와 같이, 지연된 이식 기능(DGF)은 이식 과정에 독특한 속성을 갖는 급성 신장 손상 (AKI)의 징후이다. 이는 이식 후 수술에서 발생한다. 지연된 이식 기능(DGF)은 이식 후 첫 주 동안 투석의 필요성으로서 빈번하게 정의되는 흔한 합병증이다. 제3 보체 성분 C3 (C3)의 고유 신장 합성은 T-세포 매개 반응을 프라이밍함으로써 급성 거부에 기여한다. 예를 들어, 뇌사 공여자에서, 국소 신장 C3 수준은 획득에서 더 높을수록 이식 후 14일에 신장 기능과 역으로 관련된다.
본원에 사용된 바와 같이, 보체 매개 질환 또는 장애는 보체 단백질 또는 보체 관련 단백질의 부재 또는 존재 또는 보체 또는 보체 관련 단백질의 활성화 또는 불활성화로 인해, 임의의 하나 이상의 보체 단백질이 질환에서 역할을 하는 임의의 장애이다. 일부 구현예에서, 보체 매개 장애는 보체 단백질(들)의 결핍으로 인한 것이다. 본원에 기재된 바와 같은 다른 구현예에서, 보체 매개 장애는 보체 단백질(들)의 활성화 또는 과다-활성화로 인한 것이다. 보체 매개 장애는 또한 보체 단백질 중 임의의 하나 이상의 존재 및/또는 보체 경로의 지속적인 활성화로 인한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "황반 변성 관련 장애"는 망막 황반이 변성되거나 기능이상이 되는 임의의 다수의 상태를 지칭한다(예를 들어, 황반 세포의 감소된 성장, 황반 세포 (예를 들면, RPE 세포)의 증가된 사멸 또는 재배열, 정상 생물학적 기능의 상실, 또는 이들 사건의 조합의 결과로서). 황반 변성은 정상 황반의 세포 및/또는 세포외 기질의 조직구조의 완전성의 손실 및/또는 황반의 세포의 기능의 손실을 초래한다. 황반 변성 관련 장애의 예는 연령 관련 황반 변성(AMD), 지도형 위축(GA), 노쓰 캐롤리나 황반 이영양증, 소르스비 스타가르트 질환, 패턴 이상증, 베스트병(Best disease), 우성 드루젠(dominant drusen), 및 말라티아 레벤티네스((방사상 드루젠))를 포함한다. 황반 변성 관련 장애는 또한 황반의 기능장애 및/또는 변성 이전에 또는 이후에 발생하는 혈관외 변화를 포함한다. 따라서, 용어 "황반 변성 관련 장애"는 또한 황반의 완전성 또는 기능(예를 들어, RPE 또는 브루크(Bruch) 막에 대한 손상)을 변경 또는 손상시키는 임의의 상태를 광범위하게 포함한다. 예를 들어, 상기 용어는 망막 박리, 맥락망막 변성, 망막 변성, 광수용체 변성, RPE 변성, 뮤코다당체침착증, 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증 및 추체 변성을 포함한다.
본원에 기재된 황반 변성 관련 장애는 황반 변성, 예컨대 AMD 황반 변성을 포함한다. 황반 변성 관련 장애는 항-VEGF 치료, 예컨대, 예를 들어, 안티-VEGF 항체, 또는 레이저 치료 또는 이식 가능한 망원경에 의해 치료되는 장애를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 병태를 갖는 대상체를 "치료하는"은 대상체의 증상이 치료 후 부분적으로 또는 전체적으로 완화되거나 또는 정적으로 유지되는 것을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 치료 및/또는 치유를 포함한다. 예방은 잠재적 질환의 예방 및/또는 증상의 악화 또는 질환의 진행의 예방을 지칭한다. 치료는 또한 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 조성물의 임의의 약제학적 용도를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "방지(prevention)" 또는 "예방(prophylaxis)"는 질환 또는 병태가 발생할 위험 또는 가능성이 감소되는 방법을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료제", "치료 레지멘"," "방사선보호제" 또는 "화학요법"은 당업자에게 공지된 백신을 비롯한 통상적인 약물 및 약물 요법을 의미한다. 방사선치료제는 당업계에 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 병태, 장애 또는 질환의 증상이 개선되거나 달리 유익하게 변경되는 임의의 방식을 의미한다. 치료는 또한 본원의 조성물의 임의의 약제학적 용도를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료에 의한, 예컨대 약제학적 조성물 또는 다른 치료제의 투여에 의한 특정 질환 또는 장애의 "증상의 완화"는 조성물 또는 치료제의 투여로 인한 것이거나 그와 연관될 수 있는 증상의 영구적이든지 일시적이든지 간에 임의의 완화를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약제학적 유효 제제 "은, 예를 들어 마취제, 혈관수축제, 분산제, 및 소분자 약물 및 치료 단백질을 비롯한 통상적인 치료 약물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 치료제 또는 생물활성제를 포함한다.
본원에 사용된 특정 질환을 치료하기 위한 화합물 또는 조성물의 "유효량"은 질환과 연관된 증상을 개선하거나, 또는 일부 방식으로 감소시키기에 충분한 양이다. 이러한 양은 단일 복용량으로서 투여될 수 있거나 또는 요법에 따라 투여될 수 있으며, 이에 의해 효과적이다. 양은 질환을 치유할 수 있지만, 전형적으로 질환의 증상을 개선하기 위해 투여된다. 전형적으로, 증상의 원하는 개선을 달성하기 위해 반복 투여가 요구된다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료 유효량" 또는 "치료 유효 용량"은 적어도 대상체에게의 투여 후에 치료 효과를 생성하기에 충분한 화합물을 함유하는 제제, 화합물, 물질 또는 조성물의 양을 지칭한다. 따라서, 이는 질환 또는 장애의 증상을 예방, 치유, 개선, 정지 또는 부분적으로 정지시키는데 필요한 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료 효과"는 질환 또는 병태의 증상을 변경, 전형적으로 개선하거나 완화하거나, 또는 질환 또는 병태를 치유하는 대상체의 치료로부터 생성된 효과를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "예방 유효량" 또는 "예방적 유효 용량"은 대상체에게 투여되는 경우에 의도된 예방 효과를 갖는, 예를 들어 질환 또는 증상의 발병 또는 재발을 예방 또는 지연시키거나, 질환 또는 징후의 발병 또는 재발생의 가능성을 감소시키거나, 또는 바이러스 감염의 발생을 감소시키는, 화합물을 함유하는 제제, 화합물, 물질 또는 조성물의 양을 지칭한다. 완전한 예방 효과는 반드시 1회 용량의 투여에 의해 일어날 필요는 없고, 일련의 용량의 투여 후에만 일어날 수 있다. 따라서, 예방 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-보체 프로테아제의 투여", 예컨대 변형된 u-PA 프로테아제는 비-보체의 프로테아제가 그의 기질과 접촉되는 임의의 방법을 지칭한다. 투여는 생체 내 또는 생체 외 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 생체 외 투여를 위해, 체액, 예컨대 혈액을 대상체로부터 제거하고, 신체 외부에서 변형된 비-보체 프로테아제, 예컨대 변형된 u-PA 프로테아제와 접촉시킨다. 생체 내 투여를 위해, 변형된 비-보체 프로테아제, 예컨대 변형된 u-PA 프로테아제는 예컨대 국소, 국소, 전신 및/또는 다른 도입 경로에 의해 체내로 도입될 수 있다. 시험관 내 투여는 세포 배양 방법과 같은 방법을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "단위 용량 형태"는 인간 및 동물 대상체에게 적합하고 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 개별적으로 패키징된 물리적 분리 단위를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 치료될 "환자" 또는 "대상체"는 인간 및 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 포유동물은 영장류, 예컨대 인간, 침팬지, 고릴라 및 원숭이; 가축 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 돼지, 염소 및 소; 및 설치류, 예컨대 마우스, 랫트, 햄스터 및 게르빌루스쥐를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "조합"은 2개 이상의 항목 사이의 임의의 연관성을 지칭한다. 연관은 공간적일 수 있거나 또는 공통 목적을 위한 2개 이상의 품목의 사용을 지칭할 수 있다. 조합은 2개 이상의 개별 항목, 예컨대 2개의 조성물 또는 2개의 집합물, 이들의 혼합물, 예컨대 둘 이상의 항목의 단일 혼합물, 또는 이들의 임의의 변형일 수 있다. 조합의 요소는 일반적으로 기능적으로 결합되거나 관련된다.
본원에 사용된 바와 같이, "조성물"은 2종 이상의 생성물 또는 화합물 (예를 들어, 제제, 조절제, 조절인자 등)의 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성 또는 비수성 제제 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 안정화제는 항체 또는 접합체를 보호하기 위해, 예컨대 본원의 제제가 저장 또는 사용되는 조건 (예를 들어 온도) 하에 제제에 첨가되는 화합물을 지칭한다. 따라서, 조성물 내의 다른 성분으로부터 단백질이 분해되는 것을 방지하는 제제가 포함된다. 이러한 제제의 예는 아미노산, 아미노산 유도체, 아민, 당, 폴리올, 염 및 완충액, 계면활성제, 억제제 또는 기질 및 본원에 기재된 바와 같은 다른 제제다.
본원에 사용된 바와 같이, "유체"는 유동할 수 있는 임의의 조성물을 지칭한다. 따라서, 유체는 반고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 겔, 로션, 크림 및 다른 이러한 조성물의 형태인 조성물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "제조 물품"은 제조 및 판매되는 제품이다. 본원 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이, 상기 용어는 동일한 또는 별개의 패키징 물품에 함유된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 핵산 분자를 갖는 치료제를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, "키트"는 조합의 요소를 사용하여 방법을 실행하기 위한 시약 및 다른 생성물 및/또는 성분을 선택적으로 포함하는 패키징된 조합물을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 제공된 변형된 u-PA 프로테아제와 같은 변형된 프로테아제 폴리펩타이드, 또는 본원에 제공된 핵산 분자 및 생물학적 활성 또는 특성의 투여, 진단 및 평가를 포함하지만 이에 제한되지 않는 목적을 위한 또 다른 품목을 함유하는 키트가 제공된다. 키트는 임의로 사용 설명서를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "세포 추출물"은 용해된 또는 파괴된 세포로부터 제조된 제제 또는 분획을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "동물"은 인간, 고릴라 및 원숭이를 포함한 영장류; 마우스 및 랫트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 돼지와 같은 돼지 및 다른 동물과 같은 임의의 동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비-인간 동물은 고려되는 동물로서 인간을 배제한다. 본원에 제공된 프로테아제는 임의의 공급원, 동물, 식물, 원핵 및 진균으로부터 유래된다. 대부분의 프로테아제는 포유동물 기원을 포함하는 동물 기원이다.
본원에 사용된 바와 같이, "단일 복용량" 제형은 직접 투여를 위한 단일 복용량의 치료제를 함유하는 제형을 지칭한다. 단일 복용 제형은 일반적으로 임의의 보존제를 함유하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 다중-용량 제형은 치료제의 다중 용량을 함유하고 치료제의 여러 단일 용량을 제공하도록 직접 투여될 수 있는 제형을 지칭한다. 용량은 수분, 시간, 주, 일 또는 개월의 과정에 걸쳐 투여될 수 있다. 다중-용량 제제는 용량 조정, 용량-풀링(pooling) 및/또는 용량-분할을 가능하게 할 수 있다. 다중-용량 제형이 시간 경과에 따라 사용되기 때문에, 이들은 일반적으로 미생물 성장을 방지하기 위해 하나 이상의 보존제를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대조군" 또는 "표준"은 시험 파라미터로 처리되지 않은 것을 제외하고는 시험 샘플과 실질적으로 동일한 샘플을 지칭하거나, 또는 혈장 샘플인 경우에, 이는 관심 상태에 의해 영향을 받지 않는 정상 지원자로부터의 것일 수 있다. 대조군은 또한 내부 대조군일 수 있다. 예를 들어, 대조군은 공지된 특성 또는 활성을 갖는 샘플, 예컨대 바이러스일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의" 제제에 대한 언급은 하나 이상의 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "또는"은 대안만을 지칭하도록 명시적으로 지시되지 않는 한 또는 대안이 상호 배타적인 경우 "및/또는"을 의미하도록 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로 표현될 수 있다. 약은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서, "약 5개의 염기"는 "약 5개의 염기" 및 또한 "5개의 염기"를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "선택적인" 또는 "선택적으로"는 후속적으로 기재된 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않는 것을 의미하고, 상기 기재는 상기 사건 또는 환경이 일어나는 경우 및 일어나지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, t선택적으로 치환된 기는 기가 비치환되거나 또는 치환된 것을 의미한다.
본원에 사용된 임의의 보호기, 아미노산 및 다른 화합물에 대한 약어는, 달리 나타내지 않는 한, 그의 통상의 용법에 따라 인지된 약어, 또는 생화학 명명법에 대한 IUPAC-IUB Commission ((1972) Biochem. 11:1726을 참조한다).
본 개시내용의 명확성을 위해, 그리고 비제한적으로, 상세한 설명은 하기 하위섹션으로 나누어진다.
B. u-PA 구조 및 기능
유로키나제 유형 플라스미노겐 활성화제(u-PA, 유로키나제 또는 소변 플라스미노겐 활성화제로도 지칭됨)는 플라스미노겐의 플라스민으로의 가수분해를 촉매하는 세린 프로테아제이다. u-PA는 소변, 혈액, 정액, 및 많은 암 조직에서 발견된다. 이는 그 자체가 세린 프로테아제인 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환과 관련된 다양한 생물학적 과정에 관여한다. 플라스민은, 예를 들어 피브린, 피브로넥틴, 프로테오글리칸 및 라미닌을 포함하는 다양한 분자의 절단을 통한 세포 이동 및 조직 파괴를 포함하는 다양한 정상 및 병리학적 과정에서 역할을 한다. u-PA는 상처 치유, 염증성 세포 이동, 신생혈관형성 및 종양 세포 침윤 동안 조직 재형성에 관여한다. u-PA는 또한 간세포 성장 인자/산란 인자 (HGF/SF), 막 유형 1 매트릭스 메탈로프로테아제(MT-SP1)의 잠재적 형태, 혈소판 유래 성장 인자 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 기질을 절단하고 활성화시킨다.
C3의 C3a 및 C3b 단편으로의 활성화가 억제되도록 C3 내의 억제성 서열을 절단하도록 변형된 변형된 유로키나제 유형 플라스미노겐 활성화제(u-PA) 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 활성/특이성은 비변형 u-PA 폴리펩타이드, 특히 서열번호: 1-6 중 임의의 것과 비교하여 더 큰 활성 및/또는 특이성 또는 kcat/Km으로 C3을 절단하도록 한다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 또한 비변형 u-PA 폴리펩타이드의 천연 생리적 기질 플라스미노겐에 대해 감소된 활성 또는 특이성 또는 둘 모두를 가질 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 경로에서 보체 활성화를 억제한다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 또한 플라스미노겐과 같은 다른 u-PA 기질에 비해 C3 절단에 대해 증가된 선택성을 나타낸다. 따라서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 생리적 천연 u-PA 기질에 대해 바람직하지 않은 절단 활성을 나타내지 않아서 바람직하지 않은 부작용을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 프로테아제 도메인 또는 단일 사슬 형태이며; 이러한 경우에, 유리 시스테인 (키모트립신 넘버링에 의한 잔기 위치 122)은 세린으로 대체되어, 단백질의 제조 시 응집을 감소시키거나 제거한다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 절단에 의해 활성화되는 전장 또는 다른 형태인 구현예에서, 위치 122 (키모트립신 넘버링에 의함)에서의 잔기는 일반적으로 S로 대체되지 않아서 디설파이드 결합이 형성되어 2개의 사슬 활성화된 폴리펩타이드를 생성할 수 있다.
1. 세린 프로테아제
분비된 효소 및 세포질 저장 기관에서 격리되는 효소를 포함하는 세린 프로테아제(SP)는 혈액 응고, 상처 치유, 소화, 면역 반응 및 종양 침윤 및 전이를 비롯한 다양한 생리학적 역할을 갖는다. 예를 들어, 키모트립신, 트립신, 및 엘라스타제는 소화관에서 기능하고; 인자 10, 인자 11, 트롬빈, 및 플라스민은 응고 및 상처 치유에 관여하고; C1r, C1s, 및 C3 전환효소는 보체 활성화에서 역할을 한다.
유형 II 막관통 세린 프로테아제로 지정된 세포 표면 단백질의 부류는 세포외 도메인을 갖는 막-고정된 단백질인 프로테아제이다. 세포 표면 단백질로서, 이들은 세포내 신호 전달 및 세포 표면 단백질분해 이벤트를 매개하는 역할을 한다. 다른 세린 프로테아제는 막 결합되고 유사한 방식으로 기능한다. 다른 것들이 분비된다. 많은 세린 프로테아제는 세포 표면 수용체에 결합시 그의 활성을 발휘하고, 따라서 세포 표면에서 작용한다. 세포 표면 단백질분해는 다양한 세포 기능을 매개하는 생물학적 활성 단백질의 생성을 위한 메카니즘이다.
분비 및 막관통 세린 프로테아제를 비롯한 세린 프로테아제는 신생물 발생 및 진행을 포함하는 과정에 관여한다. 이들 프로테아제의 정확한 역할은 완전히 정교화되지 않았지만, 세린 프로테아제 및 그의 억제제는 암 세포 침윤 및 전이성 확산에서의 분해 작용, 및 종양 진행에 관여하는 종양의 신생혈관화를 비롯한 많은 세포내 및 세포외 생리학적 과정의 제어에 관여한다. 프로테아제는 세포외 기질 (ECM)의 분해 및 재형성에 관여하고, 조직 재형성에 기여하고, 암 침습 및 전이에 필요하다. 일부 프로테아제의 활성 및/또는 발현은 종양 진행 및 발달과 상관관계가 있는 것으로 나타났다.
20개 초과의 패밀리 (S1-S27로 표시됨)의 세린 프로테아제가 확인되었고, 이들은 구조적 유사성 및 다른 기능적 증거에 기초하여 6개의 클랜 (SA, SB, SC, SE, SF 및 SG)로 그룹화된다(Rawlings ND 등 (1994) Meth . Enzymol. 244: 19-61). 여러 세린 펩티다아제의 반응 메카니즘에는 유사성이 있다. 키모트립신, 서브틸리신 및 카르복시펩티다아제 C 클랜은 공통적으로 세린, 아스파르테이트 및 히스티딘의 촉매 트라이어드(triad)를 갖는다: 세린은 친핵체로서 작용하고, 아스파르테이트는 친전자체로서 작용하고, 히스티딘은 염기로서 작용한다. 촉매 잔기의 기하학적 배향은 상이한 단백질 접힘에도 불구하고 패밀리 사이에서 유사하다. 촉매 잔류물의 선형 배열은 통상적으로 집단 관계를 반영한다. 예를 들어, 키모트립신 집단(SA) 내의 촉매 트라이어드는 HDS로 정렬되지만, 서브틸리신 집단(SB)에서는 DHS으로 및 카르복시펩티다아제 집단(SC)에서는 SDH으로 정렬된다.
키모트립신 슈퍼패밀리의 세린 프로테아제의 예는 조직 유형 플라스미노겐 활성화제(tPA), 트립신, 트립신-유사 프로테아제, 키모트립신, 플라스민, 엘라스타제, 유로키나제(또는 소변-유형 플라스미노겐 활성화제, u-PA) 및 아크로신, 활성화된 단백질 C, C1 에스테라제, 카텝신 G, 키마제, 및 칼리크레인, 트롬빈 및 인자 VIIa, IXa, Xa,XIa 및 XIIa를 포함한 혈액 응고 캐스케이드의 프로테아제를 포함한다(Barret, A.J., In: Proteinase Inhibitors, Ed. Barrett, A.J., 등, Elsevier, Amsterdam, Pages 3-22 (1986); Strassburger, W. 등, (1983) FEBS Lett ., 157:219-223; Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol 5, National Biomedical Research Foundation, Silver Spring, Md. (1972); 및 Rosenberg, R.D. 등 (1986) Hosp. Prac., 21: 131-137).
세린 프로테아제 패밀리 내의 프로테아제의 활성은 그의 활성 부위를 형성하는 아미노산 잔기의 세트에 의존한다. 잔기 중 하나는 항상 세린이며; 따라서 세린 프로테아제로 명명된다. 예를 들어, 키모트립신, 트립신 및 엘라스타제는 유사한 구조를 공유하고, 그의 활성 세린 잔기는 3개 모두에서 동일한 위치 (Ser195)에 있다. 이들의 유사성에도 불구하고, 이들은 상이한 기질 특이성을 가지며; 이들은 단백질 소화 동안 상이한 펩타이드 결합을 절단한다. 예를 들어, 키모트립신은 카르보닐 탄소가 절단되는 펩타이드 결합의 일부인 잔기 상의 방향족 측쇄를 선호한다. 트립신은 이 위치에서 양으로 하전된 Lys 또는 Arg 잔기를 선호한다. 세린 프로테아제는 그의 기질 인식 특성에서 현저하게 상이하다: 일부는 고도로 특이적이고 (즉, 혈액 응고 및 면역 보체계에 관여하는 프로테아제); 일부는 단지 부분적으로 특이적이고(즉, 포유동물 소화 프로테아제 트립신 및 키모트립신); 다른 것, 예컨대 박테리아 프로테아제인 서브틸리신은 완전히 비-특이적이다. 특이성의 이러한 차이에도 불구하고, 세린 프로테아제의 촉매 메카니즘은 잘 보존되어 있다.
세린 프로테아제에 의한 표적 단백질의 절단 메카니즘은 세린에 의한 표적화된 펩타이드 결합의 친핵성 공격에 기초한다. 아스파르테이트 또는 금속과 관련된 시스테인, 트레오닌 또는 물 분자 또한 이러한 역할을 할 수 있다. 많은 경우에, 기의 친핵성 특성은 아스파르테이트에 의해 "양성자 수용체 상태"로 유지되는 히스티딘의 존재에 의해 개선된다. 세린, 히스티딘 및 아스파르테이트의 정렬된 측쇄는 대부분의 세린 프로테아제에 공통적인 촉매 트리아드를 구축한다. 예를 들어, 키모트립신의 활성 부위 잔기, 및 예를 들어 MTSP-1과 같은 키모 트립신과 동일한 패밀리의 구성원인 세린 프로테아제는 Asp102, His57 및 Ser195이다.
키모트립신 슈퍼패밀리의 모든 세린 프로테아제의 촉매 도메인은 서열 상동성 및 구조적 상동성을 갖는다. 서열 상동성은 1) 특징적인 활성 부위 잔기 (예를 들어, 트립신의 경우에 Ser195, His57, 및 Asp102); 2) 옥시음이온 홀 (oxyanion hole; 예를 들어, 트립신의 경우에 Gly193, Asp194); 및 3) 구조 내에 디설파이드 가교를 형성하는 시스테인 잔기의 보존을 포함한다(Hartley, B.S., (1974) Symp . Soc. Gen. Microbiol., 24: 152-182). 구조적 상동성은 1) 2개의 그리스 키 구조(Greek key structure)를 특징으로 하는 공통 폴드 (Richardson, J. (1981) Adv. Prot . Chem., 34:167-339); 2) 촉매 잔류물의 공통 배치; 및 3) 분자의 코어 내의 구조의 상세한 보존 (Stroud, R.M. (1974) Sci . Am., 231: 24-88)을 포함한다.
세린 프로테아제의 키모트립신 패밀리 전체에 걸쳐, 기질과 효소 사이의 골격 상호작용은 완전히 보존되지만, 측쇄 상호작용은 상당히 다양하다. 활성 부위의 S1-S4 포켓을 함유하는 아미노산의 동일성은 특정 포켓의 기질 특이성을 결정한다. 하나의 세린 프로테아제의 아미노산을 동일한 폴드 중 또 다른 것으로 이식하는 것은 하나의 아미노산의 다른 것에 대한 특이성을 변형시킨다. 전형적으로, S1-S4 포켓을 함유하는 프로테아제의 아미노산은 기질의 4 내지 5 옹스트롬 내에 측쇄를 갖는 것이다. 이들 아미노산이 프로테아제 기질과 갖는 상호작용은 일반적으로 이들이 기질과 직접 접촉하기 때문에 "제1 쉘" 상호작용으로 불린다. 그러나, 궁극적으로 제1 쉘 아미노산을 위치시키는 "제2 쉘" 및 "제3 쉘" 상호작용이 있을 수 있다. 제1 쉘 및 제2 쉘 기질 결합 효과는 주로 베타-배럴 도메인 사이의 루프에 의해 주로 결정된다. 이들 루프는 단백질의 핵심 요소가 아니기 때문에, 폴드의 완전성이 유지되는 반면, 새로운 기질 특이성을 갖는 루프 변이체는 분자 수준에서 필요한 대사 또는 조절 니치(niche)를 충족시키기 위해 진화 과정 동안 선택될 수 있다. 전형적으로 세린 프로테아제에 대해, 1차 서열 내의 하기 아미노산은 특이성의 결정인자이다: 195, 102, 57 (촉매 트리아드); 189, 190, 191, 192, 및 226 (S1); 57, 58 내지 64 사이의 루프, 및 99 (S2); 192, 217, 218 (S3); Cys168과 Cys280 사이의 루프, 215, 및 97 내지 100 (S4); 및 41 및 151 (S2') (키모트립신 넘버링에 기초함), 여기서 S1 위치 내의 아미노산은 P1 특이성에 영향을 미치고, S2 위치 내의 아미노산이 P2 특이성에 영향에 미치며, S3 위치 내의 아미노산의 P3 특이성에 영향 받으며, S4 위치 내의 아미노산의 P4 특이성에 영향을 미친다. 세린 프로테아제 내의 위치 189는 S1 특이성을 결정하는 포켓의 바닥에 매립된 잔기이다. u-PA에 대한 구조적 결정인자는 표 4에 열거되어 있으며, 각각의 지정된 프로테아제에 대한 프로테아제 도메인은 키모트립신의 프로테아제 도메인의 것과 정렬된다. Cys168-Cys182 및 60's 루프 컬럼 제목 아래의 수는 2개의 아미노산 사이의 루프 및 루프 내의 아미노산의 수를 나타낸다. Cys191-Cys220 컬럼 제목 하에 예/아니오는 디설파이드 가교가 프로테아제에 존재하는지를 나타낸다. 이들 영역은 키모트립신-유사 세린 프로테아제의 패밀리 내에서 가변적이고, 그 자체로 구조적 결정인자를 나타낸다.
2. 구조
u-PA cDNA는 다수의 포유동물 종으로부터 클로닝되었다. 예시적인 u-PA 전구체 폴리펩타이드, 또는 프리프로-유로키나제 폴리펩타이드는 인간 (서열번호: 1, 및 서열번호: 7에 의해 인코딩됨), 마우스 (서열번호: 52), 랫트 (서열번호: 53), 소 (서열번호: 54), 돼지 (서열번호: 55), 토끼 (서열번호: 56), 닭 (서열번호: 57), 황색 개코원숭이 (서열번호: 58), 스마트란 오랑우탄 (서열번호: 59), 개 (서열번호: 60), 양 (서열번호: 61), 마모셋 (서열번호: 62), 레서스 원숭이(rhesus monkey) (서열번호: 63), 북부흰뺨긴팔원숭이 (서열번호: 64) 및 침팬지 (서열번호: 65) u-PA 폴리펩타이드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. mRNA 전사체는 전형적으로 N-말단에 20개 아미노산 신호 서열을 함유하는 전구체 단백질을 생성하도록 번역된다. ER로의 수송 후, 신호 펩타이드를 제거하여 프로유로키나제 폴리펩타이드를 수득한다. 예시적인 프로유로키나제 폴리펩타이드는 인간 (서열번호: 3), 마우스 (서열번호: 66), 랫트 (서열번호: 67), 소 (서열번호: 68), 돼지 (서열번호: 69), 토끼 (서열번호: 70), 닭 (서열번호: 71), 황색 개코원숭이 (서열번호: 72), 수마트란 오랑우탄 (서열번호: 73), 개 (서열번호: 74) 및 양 (서열번호: 75) u-PA 폴리펩타이드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 인간 u-PA mRNA 전사체는 N-말단 Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Ser Asp Ser Lys Gly (서열번호: 1의 아미노산 잔기 1-20)에서 20개 아미노산 신호 서열을 함유하는 431개 아미노산 전구체 단백질(서열번호: 1)을 형성하도록 정상적으로 번역된다. 따라서, ER로의 수송 및 신호 펩타이드의 제거 후, 서열번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 411개의 아미노산 프로유로키나제 폴리펩타이드가 생성된다. 하기에 추가로 상세히 기재된 바와 같이, 프로유로키나제는 단백질분해 절단에 의해 추가로 처리되어 2개의 사슬 성숙 u-PA 폴리펩타이드를 생성하는 자이모겐 또는 프로효소이다. 따라서, 예를 들어, 성숙 u-PA(서열번호: 3)와 관련하여, 야생형 사슬 활성화된 u-PA는 Cys148(C97a 키모트립신 넘버링)과 Cys279(C122 키모 트립신 넘버링) 사이의 디설파이드 결합을 통해 잔기 159-411(B 사슬)에 디설파이드에 의해 연결된 잔기 1-158인 제1 사슬(A 사슬)을 함유한다. 따라서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드에서, 프로테아제 도메인이 생산되는 경우, 이는 치환 C122S를 함유하지만, 활성화된 형태가 2 사슬 형태인 경우, 122에서의 잔기 (키모트립신 넘버링)는 일반적으로 활성화 서열에서 또 다른 C와의 디설파이드 결합을 형성하도록 C이다(하기 논의 및 실시예 15 참조).
인간 전구체 u-PA는 서열번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 갖고 서열번호 7에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다. 신호 서열이 결여된, 성숙 u-PA로도 지칭되는 인간 프로-u-PA는 서열번호: 3에 제시되어 있다. 인간 u-PA의 2개의 동형단백질은 선택적 스플라이싱에 의해 생성된 바와 같이 존재한다. 인간 u-PA의 동형단백질 1은 서열번호: 1에 기재된 상기 기재된 표준 형태이다. 인간 u-PA의 동형단백질 2에서, 서열번호: 1의 아미노산 1-29는 서열번호: 51의 아미노산 1-12로 대체되고, 생성된 단백질은 414개의 아미노산(서열번호: 51에 제시됨)을 함유한다. 인간 u-PA의 대립유전자 변이체 및 다른 변이체는 공지되어 있다. 예를 들어, uPA 변이체는 서열번호: 1에 제시된 아미노산의 서열 내에 아미노산 변형 V15L을 함유하는 것으로 공지되어 있다. 또 다른 예에서, 서열번호: 1에 제시된 아미노산 서열(서열번호: 4에 제시된 아미노산의 서열에 상응함)에 아미노산 변형 C299S(키모트립신 넘버링에 의한 C122S)를 함유하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 공지되어 있다. 추가의 변이체는 서열번호: 3에 제시된 성숙 u-PA에서 아미노산 변형 P121L, D130G, C131W, I194M, K211Q, G366c 및 A410V를 함유하는 것을 포함한다(서열번호: 1에서 아미노산 변형 P141L, D150G, C151W, I214M, K231Q, G386C 및 A430V에 상응함).
u-PA 폴리펩타이드는 단쇄 자이모겐 분자 (프로유로키나제 또는 단쇄 유로키나제로도 지칭됨)로서 합성되고 분비되며, 이는 예를 들어 플라스민, 칼리크레인, 카텝신 B, 매트립타제 및 신경 성장 인자-감마를 비롯한 다양한 프로테아제에 의해 활성 2-쇄 u-PA로 전환된다. 2개의 사슬 형태를 생성하기 위한 절단은 인간 프로유로키나제 서열(서열번호: 1의 아미노산 잔기 178 및 179에 상응함)에서 잔기 158과 159 (서열번호: 3) 사이에서 일어난다. 2개의 생성된 사슬은 Cys148과 Cys279 사이의 디설파이드 결합에 의해 연결되어, u-PA의 2-쇄 형태를 형성한다. u-PA의 두 사슬 형태는 또한 고분자량 u-PA(HMW-u-PA)로 불린다. HMW-u-PA는 단쇄 A(A1, 서열번호: 3의 아미노산 136-157) 및 아미노 말단 단편으로의 A 사슬의 절단에 의해 저분자량 u-PA(LMW-u-PA)로 추가로 프로세싱될 수 있다. 21-178은 Cys148 및 Cys279 (서열번호: 3)에 상응하는 Cys를 통해 연결된 179-411에 디설파이드를 연결하였다.
유로키나아제 유형 플라스미노겐 활성화제, u-PA는, His-Asp-Ser 촉매 트라이어드(triad)를 함유하는 고전적인 세린 프로테아제로서, 이는 플라스미노겐에서 특이적 Arg-Val 결합을 절단하여 플라스민을 형성한다. 플라스민은 다시 서열번호: 3의 Lys158-Ile159에서 u-PA를 절단할 수 있고 (키모트립신 넘버링에 의해 Lys15-Ile16에 상응함), 이는 상기 기재된 2-쇄 형태를 형성한다. 인간 u-PA의 촉매 트라이어드는 서열번호: 3의 아미노산 His204, Asp255 및 Ser356을 포함한다(키모트립신 넘버링에 의한 His57, Asp102 및 Ser195에 상응함). 서열번호: 3에 제시된 인간 uPA의 잔기 Ser138 및 Ser303은 인산화된다(Franco 등 (1997) J Cell Biol 137:779-791). 인간 u-PA는 서열번호: 3의 아미노산 잔기 Thr18에서 O-연결된 글리코실화, 예를 들어 푸코실화 (Buko 등 (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:3992-3996) 및 서열번호: 3의 아미노산 잔기 Asn302에서의 N-연결된 글리코실화를 함유한다. 성숙 인간 u-PA는 서열번호: 3의 잔기 C11-C19, C13-C31, C33-C42, C50-C131, C71-C113, C102-C226, C189-C205, C197-C268, C293-C362, C325-C341 및 C352-C380 사이에 사슬내 디설파이드 결합 및 서열번호: 3의 잔기의 잔기 C148-C279 사이에 사슬간 디설파이드 결합을 함유한다.
u-PA의 성숙형은 411 잔기 단백질이다(20개의 아미노산 신호 펩타이드를 포함하는 전구체형인 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 21-431에 상당한다). u-PA는 3개의 도메인, 즉 세린 프로테아제 도메인, 크링글 도메인 및 성장 인자 도메인을 함유한다. 인간 u-PA의 성숙 형태에서, 아미노산 1-158은 성장 인자 도메인 (아미노산 1-49), 크링글 도메인 (아미노산 50-131), 및 도메인간 링커 영역 (아미노산 132-158)을 포함하는 N-말단 A 사슬을 나타낸다. 아미노산 159-411은 C-말단 세린 프로테아제 도메인 또는 B 사슬을 나타낸다. u-PA는 단쇄 자이모겐 분자로서 합성되고 분비되며, 이는 예를 들어, 플라스민, 칼리크레인, 카텝신 B, 및 신경 성장 인자-감마를 포함하는 다양한 프로테아제에 의해 활성 2-쇄 u-PA로 전환된다. 2개의 사슬 형태로의 절단은 성숙 u-PA 서열(서열번호: 3에서 아미노산 잔기 178과 179에 상응함)에서 잔기 158과 159 사이에서 일어난다. 2개의 생성된 사슬은 디설파이드 결합에 의해 함께 유지되어, u-PA의 2-쇄 형태를 형성한다.
유로키나제 유형 플라스미노겐 활성화제는 3개의 도메인: 세린 프로테아제 도메인, 크링글 도메인 및 성장 인자 도메인을 함유한다. 인간 u-PA의 자이모겐 또는 프로효소 형태에서, 서열번호: 3의 아미노산 1-158은 표피 성장 인자 도메인 (아미노산 1-49), 크링글 도메인 (아미노산 50-131) 및 도메인간 링커 영역 (아미노산 132-158)을 포함하는 N-말단 A 사슬 (또는 장쇄 A)를 나타내고, 아미노산 159-411은 촉매 활성 C-말단 세린 프로테아제 도메인 또는 B 사슬을 나타낸다. 표피 성장 인자 도메인은 세포 표면-고정된 u-PA 수용체(uPAR)에 대한 u-PA의 결합을 담당한다. 세포외 기질에서, u-PA는 u-PA 수용체에 결합함으로써 세포막에 테더링된다. LMW-u-PA는 단백질 분해적으로 활성이지만 u-PA 수용체에 결합하지 않는다. 세린 프로테아제 도메인은 키모트립신 넘버링에 의해 잔기 37, 60, 96, 110, 170 및 185 주위에 표면 노출된 루프를 함유한다. 활성화 또는 절단시, 아미노 말단은 소수성 상호작용을 형성하는 촉매 프로테아제 도메인의 소수성 결합 틈 및 Asp194의 측면 포켓에 대한 염 브릿지로 삽입되고, 이는 기질 결합 포켓 및 옥시음이온 홀을 촉매적으로 생산적인 형태로 안정화시킨다. Asp194는 키모트립신 넘버링에 따라 Gly142의 주쇄 아미노 기 및 Lys143의 주쇄 카르보닐 기에 대한 수소 결합에 참여한다(Blouse 등 (2009) J Biol Chem 284:4647-4657). 절단 후 형태적 변화는 활성화 루프(잔기 16-21), 자가분해 루프(잔기 142-152), 옥시음이온 안정화 루프(잔기를 184-194) 및 S1 입구 프레임(잔기를 216-223)을 포함하는 활성화 도메인의 4개의 무질서한 영역을 포함하고, 모든 넘버링은 키모트립신 넘버링에 따른다(Blouse 등 (2009) J Biol Chem 284:4647-4657; Hedstrom (2002) Chem Rev 102:4501-4524; Huber and Bode (1978) Acc Chem Res 11:114-122; Madison 등 (1993) Science 262:419-421).
u-PA에 대한 구조적 결정인자는 성숙 키모트립신의 넘버링을 기초로 하여 넘버링으로 하기 표 4에 제시된다. Cys168-Cys182 및 60's 루프 컬럼 제목 아래의 수는 2개의 아미노산 사이의 루프 및 루프 내의 아미노산의 수를 나타낸다. Cys191-Cys220 칼럼 제목 하의 예는 디설파이드 가교가 존재함을 나타낸다. 이들 영역은 키모트립신-유사 세린 프로테아제의 패밀리 내에서 가변적이고, 그 자체로 구조적 결정인자를 나타낸다. S1-S4 포켓 내의 임의의 하나 이상의 아미노산을 변경하기 위한 u-PA 폴리펩타이드의 변형은 표적 기질에 대한 u-PA 폴리펩타이드의 특이성 또는 선택성에 영향을 미친다. 연장된 기질 특이성(P1-P4)은 u-PA가 P1 Arg 후의 절단에 대한 높은 특이성, P2 위치에서의 작은 아미노산에 대한 선호, P3 위치에서의 작은 극성 아미노산(Thr 및 Ser)에 대한 선호 및 P4 위치에서의 선호를 갖지 않는다는 것을 나타낸다(Ke 등 (1997) J. Biol . Chem., 272:16603-16609; Harris 등 (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97:7754-7759).
표 4. u-PA 기질 절단(키모트립신 넘버링)에 대한 구조적 결정인자
특이성을 결정하는 잔기
S4 S3 S2 S1
171 174 180 215 Cys168 Cys182 192 218 99 57 60's 루프 189 190 226 Cys191 Cys220
H S M W 15 Q R H H 11 D S G 예
3. 기능/활성
유로키나제 유형 플라스미노겐 활성화제는 플라스미노겐의 플라스민으로의 가수분해를 촉매하는 세린 프로테아제이다. 플라스민은 세포외 기질 단백질의 분해에 직접적으로 작용한다(Andreasen 등 (2000) Cell. Mol . Life Sci. 57:25-40). u-PA는 세포 부착, 이동 및 침윤, 조직 재형성 및 암에서 중요한 역할을 한다(Blasi 등 (2002) Rev Mol Cell Biol 3:932; Andreasen 등 (2000) Cell. Mol . Life Sci. 57:25-40; Mondino and Blasi (2004) Trends Immunol 25:450; Ploug (2003) Curr Pharm Des 9:1499). u-PA의 비정상적인 발현은 류마티스 관절염, 알레르기성 혈관염, 색소성 건피증 및 악성 종양의 침습 능력과 관련되어 있다.
u-PA는 고친화성 세포 표면 수용체 uPAR에 결합함으로써 조절된다. uPAR에 대한 u-PA의 결합은 플라스미노겐 활성화 속도를 증가시키고 세포외 기질 분해 및 세포 침입을 향상시킨다. uPAR과 u-PA 사이에 형성된 이원 복합체는 막 관련 플라스미노겐과 상호작용하여 플라스미노겐 활성화를 위한 Km(즉, 기질에 대한 대략적인 친화도의 동역학 속도 상수)을 감소시키는 고차 활성화 복합체를 형성한다(Bass 등 (2002) Biochem . Soc . Trans., 30: 189-194). uPAR에 대한 u-PA의 결합은 동족 억제제, 즉 PAI-1에 의한 억제로부터 프로테아제를 보호한다. 이는 혈장 내에 정상적으로 존재하는 단일 사슬 u-PA가 PAI-1에 의한 억제에 민감하지 않고, 혈장 내의 임의의 활성 u-PA는 PAI-1에 의해 억제될 것이기 때문이다. 수용체 결합된 활성 u-PA는 PAI-1에 의한 억제에 완전히 이용 가능하지만, PAI-1은 결합된 활성 분자에 접근할 수 없다(Bass 등 (2002) Biochem . Soc . Trans., 30: 189-194). 그 결과, u-PA는 주로 세포 표면 상에서 기능하고, 그의 기능은 플라스민 의존 세포주위 단백질분해의 활성화와 상관관계가 있다.
u-PA는 또한 간세포 성장 인자/산란 인자 (HGF/SF), 막 유형 1 매트릭스 메탈로프로테아제(MT-SP1; 매트립타제)의 잠재적 형태, 혈소판 유래 성장 인자 C (PDGF-C), 혈소판 유도 성장 인자 D (PDGF-D), 혈소판 유래 성장 인자 DD (PDGF-DD) 및 기타 단백질을 절단한다(예를 들어, Hurst 등 (2012) Biochem J 441:909-918; Ustach and Kim (2005) Mol Cell Biol 5:6279-6288; Ehnman 등 (2009) Oncogene 28(4):534-544]를 참조한다). 플라스민은 피브린 응괴를 분해하고, 피브린, 피브로넥틴, 트롬보스폰딘, 라미닌 및 폰 빌레브란트 인자를 절단하고, 보체계의 매개체를 단백질분해하고, 콜라게나제를 활성화시킨다. 이와 같이, 플라스민은 혈소판용해 또는 세포외 기질 분해에 참여하여, 플라스민과 혈관 질환 및 암을 연결한다. 예를 들어, 플라스미노겐 활성화 시스템의 성분은 악성 종양에서 고도로 발현되는 것으로 관찰되었다. 간세포 성장 인자/산란 인자는 활성화된 HGF의 HGF-수용체 c-Met에의 결합에 의해 세포 성장, 세포 운동성 및 형태발생을 조절하고, 유사분열, 세포 이동성 및 기질 침입을 자극하는 그의 능력은 이를 혈관신생, 종양생성 및 조직 재생에 연결시킨다. 혈소판 유래 성장 인자는 세포 성장 및 분열을 조절하고, 혈관신생에서 중요한 역할을 하며, 이는 제어되지 않는 경우에 암의 특징이다. 일단 단백질분해 절단에 의해 활성화되면, PDGF는 PGDF 수용체 티로신 키나제에 결합하여 인산화 및 암에 관여하는 다수의 하류 신호전달 경로를 유발한다. 혈관 질환에서 u-PA 및 상기 언급된 단백질의 역할로 인해, 본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드는 이들 단백질에 대한 선택성을 감소시키도록 변경된다. 특이성 및 활성의 변화에 의해, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질 C3에 대한 비변형 u-PA와 비교하여, 천연 기질에 대한 활성이 감소되거나 없거나 또는 실질적인 활성이 없으며, 높은 활성을 나타낸다. 그 결과, 치료 복용량에서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 활성화를 특이적으로 억제하지만, 천연 u-PA 표적의 절단으로부터의 부작용은 없거나 거의 없다.
C. C3 표적화에 의한 보체 억제
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 아미노산 변형을 함유하지 않는 u-PA (예를 들어, 야생형 인간 u-PA (서열번호: 1 또는 3 참조)) 또는 그의 촉매 도메인 또는 프로테아제 도메인 (서열번호: 2 참조) 또는 키모트립신 넘버링에 의한 치환 C122S를 포함하는 상응하는 비변형된 u-PA 폴리펩타이드에 비해 보체 단백질 C3에서 억제성 절단 서열에 대해 증가된 특이성 및/또는 활성을 나타낸다. 잔기 122에서 S로의 치환은 C3에 대한 특이성 또는 활성을 변경시키지 않지만, 응집을 감소시킨다. C3은 보체의 3 개시 경로에 관여하기 때문에 (예를 들어, 도 1 참조), 단백질분해 억제에 의해 C3을 표적화하는 것은 보체 캐스케이드의 불활성화를 위한 일반적이고 광범위한 치료 표적을 제공한다. C3의 불활성화 절단은 보체의 말단 활성뿐만 아니라 대안적인 경로 증폭 루프를 차단한다. 모든 3개의 경로는 C3에서 수렴한다(예를 들어, 도 1 참조). 보체 활성화를 억제하는 능력에 의해, 이러한 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 활성화와 관련된 다양한 질환, 병태 및 병리, 예컨대 염증 반응 및 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 보체 활성화는 효과기 분자 및 막 공격 복합체의 생성에 의해 부분적으로 야기되는 국소 염증 및 조직에 대한 손상을 촉진함으로써 질환 및 병태의 발생과 관련된다. 일 예에서, 예컨대 많은 자가면역 질환에서, 보체는 부적절한 환경, 예컨대 숙주 조직에 대한 항체에 의해 활성화되기 때문에 조직 손상을 생성한다. 다른 상황에서, 보체는 정상적으로, 예컨대 패혈증에 의해 활성화될 수 있지만, 여전히 질환 진행, 예컨대 호흡 곤란 증후군에 기여한다. 병리학적으로, 보체는 적절하게 제어되지 않는다면 혈관 (혈관염), 신장 기저막 및 부착된 내피 및 상피 세포 (신장염)), 관절 활액 (관절염) 및 적혈구 (용혈)에 대한 실질적인 손상을 야기할 수 있다. 보체 활성화에서 C3의 역할은 하기에서 추가로 상세히 논의된다.
1. 보체 단백질 C3 및 보체 개시에서의 그의 역할
보체계는 항체 매개된 면역 반응뿐만 아니라, 병원체, 예컨대 박테리아, 바이러스-감염된 세포, 및 기생충을 인식하고 사멸시키는 선천성 면역 반응에서 기능하는 30개 초과의 가용성 및 세포-막 결합된 단백질을 수반한다. 보체 활성화는 3개의 별개의 경로를 통해 병원체 표면 상에서 개시된다: 고전적 경로, 대안적인 경로, 및 렉틴 경로. 이들 경로는 그의 개시에 필요한 성분이 상이하지만, 경로는 궁극적으로 보체 단백질 C3을 절단하여 막 공격 복합체(MAC)의 형성을 촉발시키는 동일한 세트의 효과기 분자 (예를 들어, C3 전환효소)를 생성한다는 점에서 구별된다(예를 들면, 도 1 참조). 따라서, 보체 단백질 C3은 C3의 조절이 다양한 옵소닌, 아나필라톡신 및 MAC의 조절을 초래하기 때문에 치료용으로 매력적인 표적이다. 추가로, 인자 H (FH), CR1, 보체 수용체 Ig (CR1g), DAF 및 MCP를 포함하는 자연 발생 보체 억제제 단백질은 C3 수준에서 억제한다.
3개의 보체 활성화의 경로가 있다(이러한 경로를 도시한 도 1 참조). 보체 경로는 구별되며; 각각은 개시를 위한 상이한 분자 및 메카니즘에 의존한다. 경로는 이들이 수렴하여 동일한 세트의 효과기 분자, 즉 C3 전환효소를 생성한다는 점에서 유사하다. 고전적 및 렉틴 경로에서 C4b2b는 C3 전환효소로서 작용하고; 대안적인 경로에서, C3bBb은 C3 전환효소이다(표 5 참조). C3의 절단은 옵소닌 및 후속 보체 반응을 위한 보체계의 주요 효과기 분자로서 작용하는 C3b, 및 염증의 펩타이드 매개인자인 C3a를 생성한다. 각각의 C3 전환효소에 대한 C3b의 첨가는 C5a 및 C5b를 생성하는 C5 전환효소를 형성한다. C3a와 같은 C5a는 염증의 펩타이드 매개체이다. C5b는 막 공격 복합체(MAC)의 생성을 초래하는 반응의 서열을 개시하는 보체 활성화의 "후기" 사건을 매개한다. 3개의 경로는 상이한 C3 및 C5 전환효소를 생성하지만, 모든 경로는 C3와 C5의 분열 생성물을 생성하고 MAC를 형성한다. 대안적으로, C3은 외인성 프로테아제, 예컨대 리소좀 효소 및 엘라스타제에 의해 절단되고 활성화될 수 있다(Markiewski and Lambris (2007) Am J Pathology 171:715-727; Ricklin and Labris(2007) Nat Biotechnol 25:1265-1275).
표 5. 보체 캐스케이드
대안적인 경로 고전적 경로 렉틴 경로
활성화제 병원체 표면 분자
LPS, 테이코산, 자이모산		 항원-결합 IgM 및 IgG; 비-면역 분자 표면 상의 탄수화물의 인식을 통한 병원체
C3 전환효소 C3bBb C4b2b C4b2b
C5 전환효소 C3bBb3b C4b2b3b C4b2b3b
MAC C5678poly9 C5678poly9 C5678poly9
아나필라톡신 C3a, C5a C3a, C4a, C5a C3a, C4a, C5a
a. 고전적 경로
C1q는 보체의 고전적 경로의 제1 성분이다. C1q는 전체 공유된 구조적 상동성으로 인해 단백질의 콜렉틴 패밀리와 연관된 칼슘 의존 결합 단백질이다(Malhotra 등, (1994) Clin Exp Immunol. 97(2):4-9; Holmskov 등 (1994) Immunol Today 15(2):67-74). 종종 패턴 인식 분자로 불리는 콜렉틴은 일반적으로 면역 세포에 의한 포식작용을 위한 병원체를 표적화하는 옵소닌으로서 기능한다. MBL과 같은 종래의 콜렉틴과는 대조적으로, C1q의 카르복시-말단 구형 인식 도메인은 렉틴 활성을 갖지 않지만, 그의 구형 도메인의 정전기 표면 전위의 현저한 차이로 인해 "하전된" 패턴 인식 분자로서 작용할 수 있다(Gaboriaud 등 (2003) J. Biol. Chem. 278(47):46974-46982).
C1q는 2가지 상이한 방식으로 보체의 고전적 경로를 개시한다. 첫째로, 고전적 경로는 C1q와 면역 복합체 (즉, 항원-항체 복합체 또는 응집된 IgG 또는 IgM 항체)의 상호작용에 의해 활성화되고, 따라서 항체 매개 체액성 면역 반응을 보체 활성화와 연결한다. IgM 또는 IgG의 Fab 부분(가변 영역)이 항원에 결합하는 경우, Fc(불변) 영역의 입체구조가 변경되어, C1q가 결합할 수 있게 한다. C1q는 활성화될 2개 이상의 Fc 영역에 결합하여야 한다. 그러나, C1q는 또한 항체의 부재 하에 보체를 활성화시켜 감염에 대한 선천적 또는 즉각적인 면역 반응에서 기능할 수 있다. 항체에 의한 개시 이외에도, 보체 활성화는 또한 C1q와 비-면역 분자, 예컨대 다중음이온 (박테리아 지질다당류, DNA, 및 RNA), 특정 소형 다당류, 바이러스 막, C 반응성 단백질 (CRP), 혈청 아밀로이드 P 성분 (SAP), 및 박테리아, 진균 및 바이러스 막 성분과의 상호작용에 의해 달성된다.
C1q는 각각 자이모겐 C1r 및 C1s의 2개의 분자에 결합된 단일 C1q 분자를 함유하는 C1 복합체의 일부이다. 표적 표면 (예컨대 응집된 항체 또는 병원체)에 대한 C1q 구형 도메인 중 1개 초과의 결합은 (C1r:C1s)2 복합체에서의 형태적 변화를 유발하여 C1s를 절단하여 활성 세린 프로테아제를 생성하는 C1r 프로테아제의 활성화를 유발한다. 활성 C1s는 후속 보체 성분 C4 및 C2를 절단하여, C4b와 C2b를 생성하며, 이는 함께 고전적 경로의 C3 전환효소를 형성한다. C3 전환효소는 C3을 병원체 표면에 공유적으로 부착되어 옵소닌으로서 작용하는 C3b, 및 염증을 자극하는 C3a로 절단한다. 일부 C3b 분자는 C4b2b 복합체와 회합하여 고전적인 캐스케이드 C5 전환효소인 C4b2b3b를 생성한다. 표 6은 보체의 고전적 경로에 관여하는 단백질을 요약한다.
표 6. 고전적 경로의 단백질
천연 성분 활성 형태 활성 형태의 기능
C1 (C1q:(C1r:C1s) 2 ) C1q 병원체 표면에 직접적으로 또는 병원체에 결합된 항체에 간접적으로 결합한다
C1r C1s를 활성 프로테아제로 절단한다.
C1s C4 및 C2를 절단한다

C4 		C4b 병원체에 결합하고 옵소닌으로서 작용하고; C1s에 의한 절단을 위해 C2에 결합한다.
C4a 염증의 펩타이드 매개체

C2 		C2b 고전적 경로 C3/C5 전환효소의 활성 효소; C3 및 C5를 절단한다.
C2a 혈관활성 C2 키닌의 전구체

C3
C3b		 병원체 표면에 결합하고 옵소닌으로서 작용하고; 대안적인 경로를 통해 증폭을 개시하고; C2b에 의한 절단을 위해 C5에 결합한다.
C3a 염증의 펩타이드 매개체
b. 대안적인 경로
대안적인 경로는 항체의 부재 하에 외래 병원체에 의해 개시된다. 대안적인 경로에 의한 보체의 개시는 C3의 C3b로의 자발적인 가수분해를 통해 일어난다. 혈청 및 조직 프로테아제 활성으로 인해 소량의 C3b가 항상 체액에 존재한다. 숙주 자가-세포는 일반적으로 결합하는 경우 C3b를 불활성화시키는 높은 수준의 막 시알산을 함유하지만, 박테리아는 낮은 외부 시알산 수준을 함유하므로, 불활성화 없이 C3b에 결합한다. 병원체 표면 상의 C3b는 프로테아제 자이모겐 인자 B에 의해 인식된다. 인자 B는 인자 D에 의해 절단된다. 인자 D는 자이모겐으로서라기 보다는 활성 효소로서 순환하는 보체계의 유일한 활성화 프로테아제이지만, 인자 B는 인자 D에 대한 유일한 기질이기 때문에 정상 혈청 중 낮은 수준의 활성 프로테아제의 존재는 일반적으로 숙주에 대해 안전하다. 인자 D에 의한 인자 B의 절단에 의해 활성 생성물 Bb가 수득되며, 이는 C3b와 회합되어 대안적인 경로의 C3 전환효소인 C3Bb를 형성할 수 있다. 고전적 경로와 유사하게, C3 전환효소는 C3으로부터 더 많은 C3b 및 C3a를 생성한다. C3b는 병원체 표면에 공유적으로 부착되어 옵소닌으로서 작용하고, 추가로 대안적인 경로를 개시하는 한편, C3a는 염증을 자극한다. 일부 C3b는 복합체를 결합하여 대안적인 경로 C5 전환효소인 C3bBb3b를 형성한다. C3bBb3b는 미생물 표면에 결합하고 전환효소를 안정화시키는 혈장 단백질 프로페르딘 또는 인자 P에 의해 안정화된다. 표 7은 보체의 대안적인 경로에 관여하는 단백질을 요약한다.
표 7. 대안적인 경로의 단백질
천연 성분 활성 형태 활성 형태의 기능
C3 C3b 병원체 표면에 결합하고, 인자 D에 의한 절단을 위해 인자 B에 결합한다.

인자 B 		Ba 인자 B의 작은 단편, 알려지지 않은 기능
Bb C3 전환효소 및 C5 전환효소의 활성 효소
인자 D D 혈장 세린 프로테아제는 이것이 C3b에 Ba 및 Bb에 결합될 때 인자 B를 절단한다.
인자 P (프로페르딘) P 박테리아 세포 상의 C3bBb 전환효소에 대한 친화성을 갖는 혈장 단백질; 전환효소를 안정화시킴;
c. 렉틴 경로
렉틴 경로(MBL 경로로도 지칭됨)는 렉틴 단백질에 의한 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP; 즉, 탄수화물 모이어티)의 인식 및 결합 후에 개시된다. 보체의 렉틴 경로를 활성화시키는 렉틴 단백질의 예는 만노스 결합 렉틴 (MBL) 및 피콜린 (즉, L-피콜린, M-피콜린 및 H-피콜린)을 포함한다. MBL은 단백질의 콜렉틴 패밀리의 구성원이고, 이에 따라 각각 시스테인-풍부, 콜라겐-유사, 목, 및 탄수화물-인식 또는 렉틴 도메인을 함유하는 동일한 폴리펩타이드 사슬로 구성된 서브유닛의 올리고머로서 존재한다. MBL은 칼슘 의존 방식으로 그의 구형 렉틴 도메인을 통해 병원체의 표면 상의 탄수화물 모이어티, 특히 중성 당, 예컨대 만노스 또는 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 인식하는 패턴 인식 분자로서 작용한다. MBL은 또한 포식 세포에 의한 박테리아, 바이러스 및 진균 병원체의 포식작용을 용이하게 하는 옵소닌으로서 작용한다. 렉틴 경로의 추가의 개시제는 L-피콜린, M-피콜린 및 H-피콜린을 포함하는 피콜린을 포함한다(예를 들어, Liu 등 (2005) J Immunol . 175:3150-3156]를 참조한다). MBL과 유사하게, 피콜린은 탄수화물 모이어티, 예를 들어 N-아세틸 글루코사민 및 만노스 구조를 인식한다.
MBL 또는 피콜린에 의한 대안적인 경로의 활성화는 단일 렉틴 분자가 2개의 프로테아제 자이모겐과 상호작용하는 C1q에 의한 고전적 경로의 활성화와 유사하다. 렉틴 단백질의 경우, 자이모겐은 MBL 관련 세린 프로테아제인 MASP-1 및 MASP-2이며, 이는 고전적 경로의 C1r 및 C1s 자이모겐과 밀접하게 상동성이다. 예를 들어 병원체 표면에 결합함으로써 렉틴 단백질에 의한 PAMP의 인식 시, MASP-1 및 MASP-2는 활성화되어 C4 및 C2를 절단하여 MBL 캐스케이드 C3 전환효소를 형성한다. 이어서, C3b는 복합체를 결합하여 MBL 캐스케이드 C5 전환효소를 형성한다. MASP 활성화는 미생물에 대한 반응뿐만 아니라, 조직 손상, 예컨대 기관 이식에서 관찰되는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 중성 당의 노출을 수반하는 임의의 반응에 연루된다. 대안적인 캐스케이드와 같이, MBL 캐스케이드는 항체와 무관하게 활성화되며; 고전적인 캐스케이드와 마찬가지로, MBL 캐스케이드는 C4 및 C2를 이용하여 C3 전환효소를 형성한다. 표 8은 보체의 렉틴 경로에 관여하는 단백질을 요약한다.
표 8. 렉틴 경로의 단백질
천연 성분 활성 형태 활성 형태의 기능
MBL MBL PAMP를, 예컨대 병원체 표면 상에서 (예를 들어, 탄수화물의 인식을 통해) 인식한다.
Ficolins L-피콜린; M-피콜린, 또는 H-피콜린 PAMP를, 예컨대 병원체 표면 상에서 (예를 들어, 탄수화물의 인식을 통해) 인식한다.
MASP-1 MASP-1 C4 및 C2 절단
MASP-2 MASP-2 C4 및 C2 절단
d. 보체 매개 효과기 기능
어떤 개시 경로가 사용되는지에 상관없이, 최종 결과는 보체 단백질의 활성화된 단편 (예를 들어, C3a, C4a, 및 C5a 아나필라톡신 및 C5b-9 막 공격 복합체)의 형성이며, 이는 다양한 효과기 기능을 매개하는 효과기 분자로서 작용한다. 효과기 기능(예를 들어, 화학주성 및 옵소닌화)의 개시를 위한 세포에 의한 보체 효과기 분자의 인식은 보체 수용체의 다양한 군에 의해 매개된다. 보체 수용체는 적혈구, 대식세포, B 세포, 호중구 및 비만 세포를 포함하는 광범위한 세포 유형 상에 분포된다. 수용체에 대한 보체 성분의 결합 시, 수용체는 세포내 신호전달 캐스케이드를 개시하여 세포 반응, 예컨대 박테리아의 포식작용을 자극하고 세포로부터 염증성 분자를 분비한다. 예를 들어, C3b, C4b를 인식하는 보체 수용체 CR1 및 CR2, 및 이들의 생성물은 화학주성을 자극하는데 중요하다. CR3(CD11b/CD18) 및 CR4(CD11c/CD18)는 식세포 반응에서 유사하게 중요할뿐만 아니라 iC3b에 반응하여 백혈구 부착 및 이동에서 역할을 하는 인테그린이다. C5a 및 C3a 수용체는 C5A 및 C6a 아나필라톡신의 전-염증성 매개 기능 중 다수에서 역할을 하는 G 단백질-커플링된 수용체이다. 예를 들어, C3a, C3aR에 대한 수용체는 비만 세포, 호산구, 호중구, 호염기구 및 단핵구 상에 존재하고, C3a의 전염증성 효과에 직접 관여한다.
따라서, 보체 수용체를 통해, 이들 보체 효과기 분자 단편은 백혈구 화학주성, 대식세포의 활성화, 혈관 투과성 및 세포 용해를 포함한 여러 기능을 매개한다(Frank, M. and Fries, L. Complement. In Paul, W. (ed.) Fundamental Immunology, Raven Press, 1989). 보체 생성물의 일부 효과기 기능의 요약은 표 9에 열거되어 있다.
표 9: 보체 효과기 분자 및 기능
생성물 활성
C2b (프로키닌) 체액의 축적
C3a (아나필라톡신) 호염기구 및 비만 세포 탈과립; 향상된 혈관 투과성; 평활근 수축; 억제인자 T 세포의 유도
C3b 및 그것의 생성물 옵소닌화; 포식세포 활성화
C4a (아나필라톡신) 호염기구 및 비만 세포 활성화; 평활근 수축; 향상된 혈관 투과성
C4b 옵소닌화
C5a (아나필라톡신; 화학주성 인자) 호염기구 및 비만 세포 활성화; 향상된 혈관 투과성; 평활근 수축; 화학주성; 호중구 응집; 산화적 대사 자극; 류코트리엔 방출 자극; 헬퍼 T-세포 유도.
C5b67 화학주성; 다른 세포막에 대한 부착 및 방관자 세포의 용해
C5b6789 (C5b-9) 표적 세포의 용해
i. 보체 매개 용해: 막 공격 복합체
모든 3가지 경로에 의한 보체 캐스케이드의 최종 단계는 막 공격 복합체(MAC)의 형성이다(도 1). C5는 임의의 C5 전환효소에 의해 C5a 및 C5b로 절단될 수 있다. C5b는 용액 중에서 C6 및 C7과 조합되고, C5b67 복합체는 C7 상의 소수성 부위를 통해 병원체 지질 막과 회합된다. C8 및 소수성 부위를 또한 갖는 C9의 여러 분자가 연결되어 C5b6789 또는 C5b-9로도 불리는 막 공격 복합체를 형성한다. C5b-9는 물 및 용질이 통과할 수 있는 막에서 기공을 형성하여, 삼투 용해 및 세포 사멸을 초래한다. 보체가 C5b67이 부착될 수 있는 지질 막 없이 항원 상에서 활성화되는 경우, C5b67 복합체는 근처의 세포에 결합하여 방관자 용해를 개시할 수 있다. 단일 MAC는 적혈구를 용해시킬 수 있지만, 유핵 세포는 다수의 MAC가 존재하지 않는 한 MAC를 세포내이입하고 손상을 복구할 수 있다. 그람 음성 박테리아는 그의 노출된 외막 및 외피 바이러스와 함께 일반적으로 보체 매개 용해에 민감하다. 원형질막이 두꺼운 펩티도글리칸 층에 의해 보호되는 그람 양성 박테리아, 세포벽 주위에 캡슐 또는 점액층을 갖는 박테리아, 또는 지질 외피를 갖지 않는 바이러스가 덜 민감하다. 마찬가지로, MAC는 막 삽입 전에 복합체에 결합하는 단백질, 예컨대 보체의 스트렙토코커스 억제제(SIC) 및 클러스테린에 의해 파괴될 수 있다. 전형적으로, MAC는 그람-음성 박테리아뿐만 아니라 외래 항원을 나타내는 인간 세포 (바이러스-감염된 세포, 종양 세포 등)를 그의 용해를 야기함으로써 파괴하는 것을 돕고, 또한 외피보유 바이러스의 외피를 손상시킬 수 있다.
ii. 염증
염증은 혈관이 확장되고 보다 투과성이 되어 신체 방어 세포 및 방어 화학물질이 혈액을 떠나 조직으로 들어갈 수 있게 하는 과정이다. 보체 활성화는 C3a, C4a 및 C5a와 같은 몇몇 전염증성 매개체의 형성을 초래한다. 혈청 또는 혈장 중 온전한 아나필라톡신은 카르복시펩티다아제 N에 의해 보다 안정하고 덜 활성인 C3a-desArg, C4a-desArg 또는 C5a-desArg 형태로 신속하게 전환된다. C3a, C4a 및 C5a, 및 보다 적은 정도로 그의 desArg 유도체는 그의 염증성 활성으로 인해 아나팔라톡신으로 지칭되는 강력한 생물활성 폴리펩타이드이다. 아나필라톡신은 다양한 세포 유형 상의 수용체에 결합하여 평활근 수축을 자극하고, 혈관 투과성을 증가시키고, 비만 세포를 활성화시켜 염증성 매개체를 방출한다. 가장 강력한 아나필라톡신인 C5a는 주로 백혈구, 특히 호중구에 작용한다. C5a는 부착 분자의 증가된 발현을 자극함으로써 감염 부위에서 혈관 벽에 대한 백혈구 부착을 자극하여 백혈구가 혈관 밖으로 나와 조직 내로 스퀴즈할 수 있도록 하며, 이는 혈구누출로 불리는 과정이다. C5a는 또한 호중구를 자극하여 세포외 사멸, 단백질분해 효소 및 류코트리엔을 위한 반응성 산소 종을 생성한다. C5a는 또한 케모카인, 사이토카인 및 다른 전염증성 매개체의 생성을 유도함으로써 간접적으로 염증 과정을 추가로 증폭시킬 수 있다. C5a는 또한 비만 세포와 상호작용하여 혈관확장제, 예컨대 히스타민을 방출하여 혈관이 보다 투과성이 되게 한다. C3a는 또한 백혈구와 상호작용하며, 호산구에 대한 주요 효과는 알레르기성 염증에서 C3a의 역할을 시사한다. C3a는 평활근 수축을 유도하고, 혈관 투과성을 향상시키고, 호염기구의 탈과립 및 히스타민 및 다른 혈관활성 물질의 방출을 유발한다. C2a는 혈관을 확장시킴으로써 혈압을 조절하는 C2 키닌으로 전환될 수 있다.
기술적으로 아나필라톡신으로 간주되지는 않지만, C3b의 불활성 유도체인 iC3b는 혈관 내피에 대한 백혈구 부착을 유도하고 그의 세포 표면 인테그린 수용체에의 결합을 통해 전염증성 사이토카인 IL-1의 생성을 유도하는 기능을 한다. C5b-9는 또한 E-셀렉틴과 같은 세포 부착 분자의 발현을 유도하고 인터루킨-8 분비를 유도함으로써 백혈구 부착, 활성화 및 화학주성을 간접적으로 자극한다(Bhole 등 (2003) Crit Care Med 31(1):97-104). C5b-9는 또한 염증에 기여하는 2차 매개체, 예를 들어 프로스타글란딘 E2, 류코트리엔 B4 및 트롬복산의 방출을 자극한다.
각각의 아나필라톡신 생성물을 수득하기 위한 인간 보체 성분 C3 및 C5의 전환은 자가면역 장애, 예컨대 전신 홍반성 낭창, 류마티스 관절염, 악성종양, 심근경색, 푸르처(Purtscher) 망막병증, 패혈증 및 성인 호흡 곤란 증후군을 포함한 특정 자연 발생 병리학적 상태에 연루되어 왔다. C3a 및 C5a의 증가된 순환 수준은 의인성 보체 활성화와 연관된 특정 조건, 예컨대: 심폐 우회술, 신장 투석, 및 나일론 섬유 백혈구이동에서 검출되었다.
iii. 화학주성
화학주성은 세포가 그 환경에서 화학물질에 반응하여 이동하도록 유도되는 과정이다. 면역 반응에서, 다양한 케모카인은 식세포와 같은 세포의 감염 부위로의 이동을 지시한다. 예를 들어, C5a는 순환 호중구에 대한 주요 화학주성 인자이지만, 단핵구의 화학주성도 유도할 수 있다. 식세포는 증가하는 농도의 C5a를 향해 이동하고, 후속적으로 그의 CR1 수용체를 통해 항원에 부착된 C3b 분자에 부착된다. 호염기구, 호산구, 호중구 및 단핵 식세포에서 관찰된 C5a의 화학주성 효과는 10-10 M만큼 낮은 농도에서 활성이다.
iv. 옵소닌화
보체의 중요한 작용은 식세포에 의한 병원체의 흡수 및 파괴를 용이하게 하는 것이다. 이는 표적 박테리아에 결합된 보체 성분이 식세포 세포, 예컨대 호중구 또는 대식세포의 표면 상의 보체 수용체와 상호작용하는 옵소닌화로 불리는 과정에 의해 발생한다. 이 경우에, 보체 효과기 분자는 옵소닌으로 명명된다. 병원체의 옵소닌화는 C3b 및 C4b의 주요 기능이다. iC3b는 또한 옵소닌으로서 기능한다. C3a 및 C5a는 식세포 상의 C3b 수용체의 발현을 증가시키고 그의 대사 활성을 증가시킨다.
C3b 및 더 적은 정도로, C4b는 신체로부터 해로운 면역 복합체를 제거하는 것을 돕는다. C3b 및 C4b는 적혈구 상의 CR1 수용체에 면역 복합체를 부착시킨다. 이어서, 적혈구는 파괴를 위해 비장 및 간 내의 고정된 대식세포에 복합체를 전달한다. 면역 복합체는 해로운 유형 III 과민증을 야기할 수 있다.
v. 체액성 면역 반응의 활성화
B 세포의 활성화는 항원에 의한 B 세포 수용체(BCR)의 결찰을 필요로 한다. 그러나, 보체는 항원에 대한 B 세포 반응에 대한 역치를 1000배까지 낮추는 역할을 하는 것으로 나타났다. 이는 C3의 파괴 단편으로부터 생성된 보체 생성물인 C3d 또는 C3dg가 BCR과 공동 결찰될 수 있는 B-림프구 상의 CR2 수용체에 결합함으로써 발생한다. 공동-결찰은 C3d로 옵소닌화된 항원 입자, 예컨대 예를 들어 면역 복합체가 항원을 통해 BCR뿐만 아니라 C3d를 통해 CR2 수용체에 결합하는 경우에 발생한다. 항원 복합체의 공동-결찰은 또한 C3d가 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포에 의한 그의 흡수를 증진시키는 항원에 결합하는 경우에 발생할 수 있고, 이는 이어서 항원을 B 세포에 제시하여 항체 반응을 증진시킬 수 있다. CR2 결핍 마우스는 B 세포 기능의 결함을 나타내어 천연 항체의 수준이 감소되고 체액성 면역 반응이 손상된다.
2. C3 구조 및 기능
본원에 제공된 변이체 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질 C3 또는 이의 단백질분해 단편을 절단함으로써 보체를 억제한다. 인간 보체 단백질 C3 (Uniprot 수탁 번호 P01024)은 서열번호: 47에 제시된 아미노산 서열을 갖는 1663개의 아미노산 단일 사슬 프리-프로단백질이다. 단백질은 염색체 19 (서열번호: 46에 제시된 뉴클레오타이드 서열) 상에 위치한 41 kb 유전자에 의해 인코딩된다. 프리-프로단백질은 아미노산 잔기 Cys559와 Cys816 사이의 사슬간 디설파이드 결합에 의해 연결된, 베타 사슬(서열번호: 47의 아미노산 23-667) 및 알파 사슬(서열번호: 47의 아미노산 672-1663)을 함유하는 성숙 2 사슬 단백질의 형성을 유발하는 퓨린-유사 효소에 의해 제거되는 22개의 아미노산 신호 펩타이드 (서열번호: 45의 아미노산 1-22) 및 테트라-아르기닌 서열(서열번호: 47의 아미노산 678-681)을 함유한다. 성숙 2 사슬 단백질은 서열번호: 77에 제시된 아미노산의 서열을 갖는다.
보체 캐스케이드 동안, 보체 단백질 C3은 단백질분해 절단에 의해 추가로 프로세싱되어 다양한 C3 단백질분해 단편을 형성한다. 상기 기재된 바와 같이, 모든 3개의 보체 개시 경로는 C3 전환효소 C4b2b 및 C3bBb 상에 수렴된다. C3 전환효소는 서열번호: 47의 잔기 748과 749 사이의 C3을 절단하여(하기 표 10 참조), 아나필라톡신 C3a(서열번호: 47의 아미노산 672-748) 및 옵소닌 C3b(C3b 알파쇄; 서열번호: 47의 아미노산 749-1663)를 생성한다. C3a는 염증에 관여하고, C3b는 궁극적으로 C5a 아나필라톡신 및 MAC로 이어지는 C5 전환효소를 형성한다. 본원에 제공된 변이체 u-PA 폴리펩타이드는 보체를 억제하고, 따라서 상기 GLAR 절단 부위에서 C3을 절단하지 않는다.
C3b는 C5, 프로페르딘 (P), 인자 H, B 및 I, 보체 수용체 1 (CR1) 및 막 보조인자 단백질 (MCP)을 비롯한 다양한 보체 성분에 대한 결합 부위를 갖는다(Sahu and Lambris (2001) Immunological Reviews 180:35-48 참조). 보조인자 H, CR1 및 MCP의 존재 하에 혈장 프로테아제인 인자 I의 결합은 C3b의 불활성화를 초래하는 반면, 인자 D의 존재 하에서 인자 B 및 P의 결합은, C3 전환효소의 증폭 및 MAC의 개시를 초래한다. 인자 I는 서열번호: 47의 잔기 1303-1304, 1320-1321 및 954-955 (하기 표 10 참조) 사이의 보조인자의 존재 하에 C3b를 절단하여 단편 iC3b (서열번호: 47의 아미노산 749-1303) 및 C3f (서열번호: 47의 아미노산 1304-1320)를 생성한다. 인자 I는 후속적으로 iC3b를 절단하여 C3c (C3c 알파 사슬 단편 1; 서열번호: 47의 아미노산 749-954) 및 C3dg (서열번호: 47의 아미노산 955-1303)를 생성한다. 최종 결과는 C3b가 영구적으로 불활성화된다는 것이다(Sahu and Lambris (2001) Immunological Reviews 180:35-48 참조). 인자 I는 C3b를 불활성화시키기 때문에, 인자 I 절단 부위는 본원에 제공된 변이체 u-PA 폴리펩타이드에 의한 절단에 대한 후보이다. 추가의 C3b 단백질분해 단편은 C3g (서열번호: 47의 아미노산 955-1001), C3d (서열번호: 47의 아미노산 1002-1303), 및 C3c 알파 사슬 단편 2 (서열번호: 47의 아미노산 1321-1663)를 포함한다. 보체 단백질 C3에서의 절단 서열은 하기 표 10에 제시되며, 이는 P4-P1 잔기, 절단 부위의 아미노산 잔기 (P1-P1' 부위) 및 절단을 담당하는 프로테아제를 열거한다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 이들 부위에서 절단하지 않는다.
표 10: 보체 단백질 C3 절단 서열
P4-P1 잔기 절단 부위
(서열번호: 47)
잔기 사이 		프로테아제 서열번호.
GLAR 748-749 C3 전환효소 78
RLGR 954-955 인자 I 79
LPSR 1303-1304 인자 I 80
SLLR 1320-1321 인자 I 81
a. C3a
C3a (서열번호: 47의 아미노산 672-748)는 염증, 호염기구 및 비만 세포 탈과립화, 증진된 혈관 투과성, 평활근 수축 및 억제 T 세포의 유도에 관여하는 아나필라톡신이다.
b. C3b
C3b (서열번호: 47의 아미노산 749-1663)는 보체 캐스케이드에서 다양한 역할을 갖는다. C3b는 포식 세포에 의한 병원체의 흡수 및 파괴를 촉진하는 옵소닌이다. 추가로, C3b는 C3 전환효소와 조합되어 보체 단백질 C5를 활성화시키는 C5 전환효소를 생성하고, 이에 의해 C5a 아나필라톡신 및 C5b를 생성하며, 이는 C6, C7, C8 및 C9와 조합되어 막 공격 복합체를 형성한다. 또한, 상기 섹션 1b에 기재된 바와 같이, C3b는 보체 개시의 대안적인 경로에 관여한다. C3b는 보체 조절 단백질 인자 I에 의해 조절되며, 혈장 프로테아제는 C3b를 iC3b, C3c, C3d, C3f 및 C3dg를 포함하는 다양한 단편으로 분해하고, 이에 의해 C3b를 영구적으로 불활성화시킨다.
C3b는 C3 전환효소 C4b2b 및 C3bBb에 결합하여 C5 전환효소 C4b2b3b 및 C3bBb3b를 생성하는 그의 능력에 의해 보체 매개 효과기 기능에서 중요한 역할을 한다. C5 전환효소는 자이모겐 C5를 그의 활성 단편, 즉 C5a 아나필라톡신 및 C5b로 절단한다. C5a는 화학주성 및 염증에 관여하고, C5b는 MAC의 형성에 관여한다.
c. C3b의 억제제
C3b는 C5, 프로페르딘 (P), 인자 H, B 및 I, 보체 수용체 1 (CR1) 및 막 보조인자 단백질 (MCP)을 비롯한 다양한 보체 성분에 대한 결합 부위를 갖는다(Sahu and Lambris (2001) Immunological Reviews 180:35-48 참조). 보조인자 H, CR1 및 MCP의 존재 하에 인자 I, 혈장 프로테아제의 결합은 C3b의 불활성화를 초래하는 반면, 인자 D의 존재 하에서 인자 B 및 P의 결합은, C3 전환효소의 증폭 및 MAC의 개시를 초래한다. 인자 I는 서열번호: 47의 잔기 1303-1304, 1320-1321 및 954-955 사이의 보조인자의 존재 하에 C3b를 절단하여 단편 iC3b (서열번호: 47의 아미노산 749-1303) 및 C3f (서열번호: 47의 아미노산 1304-1320)를 생성한다. 기술적으로 아나필라톡신으로 간주되지는 않지만, C3b의 불활성 유도체인 iC3b는 혈관 내피에 대한 백혈구 부착을 유도하고 그의 세포 표면 인테그린 수용체에의 결합을 통해 전염증성 사이토카인 IL-1의 생성을 유도하는 기능을 한다. 단백질 iC3b는 옵소닌으로서 기능한다. 이어서, 인자 I는 iC3b를 절단하여 단편 C3c (C3c 알파쇄 단편 1: 서열번호: 47의 아미노산 749-954 및 C3c 알파 사슬 단편 2: 서열번호: 47의 아미노산 1321-1663) 및 C3dg (서열번호: 47의 아미노산 955-1303)를 생성한다. 최종 결과는 C3b가 영구적으로 불활성화된다는 것이다(Sahu and Lambris (2001) Immunological Reviews 180:35-48 참조). C3dg는 추가로 절단되어 단편 C3g (서열번호: 47의 아미노산 955-1001) 및 C3d (서열번호: 47의 아미노산 1002-1303)를 생성할 수 있다.
D. C3를 절단하는 변형된 U-PA 폴리펩타이드
본원은 변형된 또는 변이체 유로키나제 유형 플라스미노겐 활성화제(u-PA) 폴리펩타이드를 제공한다. 또한, 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 함유하여 이의 생성된 활성화된 형태가 C3을 절단하도록 하는 접합체, 예컨대 융합 단백질이 제공된다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 야생형, 천연 또는 기준 u-PA 폴리펩타이드와 비교하여 변경된 활성 또는 특성을 나타낸다. 예를 들어, 본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 1-6 중 임의의 것에 제시된 야생형, 천연 또는 참조 u-PA 폴리펩타이드와 비교하여, 또는 서열번호: 5에 제시된 참조 u-PA 프로테아제 도메인과 같은 서열번호: 1-6 중 임의의 것과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 특히 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드에 변형을 함유한다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중에는 보체 단백질 C3의 억제성 절단을 수행함으로써 보체 활성화를 변경 (억제)하는 u-PA 폴리펩타이드가 포함된다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중에는 보체 단백질 C3의 억제성 절단을 수행하는 것이 있다. 변형(치환, 결실 및/또는 삽입)을 함유하지 않는 u-PA의 상응하는 형태와 비교하거나, 서열번호: 1-6 중 임의의 것에 기재된 서열을 갖는 비변형 u-PA의 상응하는 형태에 비해, 더 큰 활성 또는 특이성, kcat/Km으로 C3의 억제성 절단을 수행하는 것이 포함된다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 또한, 아미노산 변형(들)을 함유하지 않는 상응하는 u-PA 폴리펩타이드와 비교하여, 플라스미노겐의 절단 및/또는 uPAR에 대한 결합을 포함하여, 비변형 u-PA에 의해 절단되거나 인식되는 기질 및 표적에 대해 감소된 특이성 및/또는 및 선택성을 가질 수 있다.
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질 C3의 억제 또는 불활성화 절단을 통해 보체를 억제 또는 불활성화시킨다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 절단 부위에서 보체 단백질 C3을 절단함으로써 보체를 억제하거나 불활성화시켜 C3의 억제 또는 불활성화를 초래한다. 보체 단백질 C3의 불활성화 또는 억제 절단은 C3에서 임의의 서열일 수 있으며, 단, 생성된 C3 절단은 보체의 불활성화 또는 보체의 활성화의 억제를 초래한다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 활성화를 억제하기 때문에, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 C3의 자이모겐 형태의 절단에 영향을 주지 않아 C3a 및 C3b 활성화된 단편을 생성한다. 따라서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 47의 잔기 748 내지 749 사이의 C3을 절단하지 않으며, 이는 C3a 및 C3b의 생성을 초래할 것이다. 보체 단백질 C3의 억제 또는 불활성화 절단 부위는 경험적으로 결정되거나 확인될 수 있다. 필요한 경우, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 하기 섹션 E에 기재되고 실시예에 예시된 바와 같이 보체를 억제하는 그의 능력에 대해 시험될 수 있다.
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질 C3의 억제 또는 불활성화 절단을 촉매한다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 생성된 C3 단편이 불활성이거나 보체 매개 효과기 기능을 활성화시킬 수 없는 한 임의의 절단 서열에서 보체 단백질 C3을 절단한다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 플라스미노겐 및 uPAR을 포함하는 u-PA의 천연 표적에 대해 변경된(즉, 감소된) 특이성 및/또는 선택성을 갖는다. 일 예에서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 플라스미노겐의 절단에 대해 감소된 특이성을 갖는다. 또 다른 예에서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 uPAR에 대한 결합에 대해 감소된 선택성을 갖는다. 일부 예에서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 플라스미노겐의 절단에 대한 감소된 특이성 및 uPAR에 대한 결합에 대한 감소된 선택성을 갖는다. 다른 예에서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질 C3의 절단에 대한 증가된 특이성 및 플라스미노겐의 절단에 대한 감소된 특이성을 갖는다. 다른 예에서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질 C3에 대한 증가된 선택성 및 플라스미노겐 및/또는 uPAR에 대한 감소된 선택성을 갖는다.
본원에서 제공되고 실시예에 기술된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는, 예를 들어, u-PA의 단리된 프로테아제 도메인이다. 프로테아제 활성을 보유하는 그의 보다 작은 부분이 또한 고려된다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 u-PA의 프로테아제 도메인의 돌연변이체, 특히 유리된(즉, 단백질 내의 임의의 다른 Cys 잔기와 디설파이드 결합을 형성하지 않는) 프로테아제 도메인 내의 Cys 잔기가 또 다른 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환 또는 활성을 제거하지 않는 치환, 예를 들어 세린으로의 치환으로 치환된 변형된 u-PA 폴리펩타이드, 및 당화 부위(들)가 제거된 변형된 u-PA 폴리펩타이드이다. 촉매 활성이 유지되는 다른 보존적 아미노산 치환이 또한 고려된다(예시적인 아미노산 치환에 대해서는 표 3 참조).
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체의 불활성화 또는 억제를 초래하는 방식으로 보체 단백질 C3을 절단하도록 하나 이상의 아미노산 변형을 함유한다. 상기 변형은 단일 아미노산 변형, 예컨대 단일 아미노산 대체(치환), 삽입 또는 결실, 또는 다중 아미노산 변경, 예컨대 다중 아미노산 치환, 삽입 또는 결실일 수 있다. 예시적인 변형은 단일 또는 다중 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 치환이다. 아미노산 치환은 보존적 치환, 예컨대 표 3에 제시된 것, 또는 비-보존적 치환 예컨대 본원에 기재된 것일 수 있다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 변형을 함유하지 않은 u-PA 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 이상의 변형된 위치를 함유할 수 있다.
본원에 기재된 변형은 임의의 u-PA 폴리펩타이드에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5 또는 서열번호: 6을 포함하거나 그에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 u-PA 폴리펩타이드, 또는 이의 대립유전자 변이체; 서열번호: 52 또는 66을 포함하거나 그에 제시된 아미노산의 서열을 갖는 마우스 u-PA 폴리펩타이드; 서열번호: 53 또는 67을 포함하거나 그에 제시된 아미노산의 서열을 갖는 랫트 u-PA 폴리펩타이드; 서열번호: 54 또는 68을 포함하거나 그에 제시된 아미노산의 서열을 갖는 젖소 u-PA 폴리펩타이드; 서열번호: 55 또는 69를 포함하거나 그에 제시된 아미노산 서열을 갖는 돼지 u-PA 폴리펩타이드; 서열번호: 56 또는 70을 포함하거나 그에 제시된 아미노산 서열을 갖는 토끼 u-PA 폴리펩타이드; 서열번호: 57 또는 71을 포함하거나 그에 제시된 아미노산 서열을 갖는 닭 u-PA 폴리펩타이드; 서열번호: 58 또는 72를 포함하거나 그에 제시된 아미노산 서열을 갖는 황색 개코원숭이 u-PA 폴리펩타이드; 서열번호: 59 또는 73을 포함하거나 그에 제시된 아미노산 서열을 갖는 스마트란 오랑우탄 u-PA 폴리펩타이드; 서열번호: 60 또는 74를 포함하거나 그에 제시된 아미노산 서열을 갖는 개 u-PA 폴리펩타이드; 서열번호: 61 또는 75를 포함하거나 그에 제시된 아미노산 서열을 갖는 양 u-PA 폴리펩타이드; 서열번호: 62를 포함하거나 그에 제시된 아미노산 서열을 갖는 마모셋 u-PA 폴리펩타이드; 서열번호: 63을 포함하거나 그에 제시된 아미노산 서열을 갖는 붉은털원숭이 u-PA 폴리펩타이드; 서열번호: 64를 포함하거나 그에 제시된 아미노산 서열을 갖는 북부흰뺨긴팔원숭이 u-PA 폴리펩타이드; 및 서열번호: 65를 포함하거나 그에 제시된 아미노산 서열을 갖는 침팬지 u-PA 폴리펩타이드; 또는 서열번호: 1-6 및 52-75 중 임의의 것과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 변이체 또는 촉매 활성 단편에서 변형이 이루어진다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드가 보체 단백질 C3의 불활성화 또는 억제 절단에 영향을 미치는 그의 능력을 보유하는 한, 본원에서 제공되는 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 본원에서 제공되는 u-PA 폴리펩타이드의 임의의 영역 또는 도메인에서 변형될 수 있다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 단쇄 또는 2개의 사슬 폴리펩타이드, 종 변이체, 대립유전자 변이체, 동형단백질, 또는 그의 촉매적 활성 단편, 예를 들어 그의 프로테아제 도메인일 수도 있다. 본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드는 전장 또는 말단절단된(truncated) u-PA 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 u-PA의 프로테아제 도메인 또는 u-PA의 프로테아제 도메인의 변경된 형태일 수 있다. 또한, u-PA 폴리펩티드가 보체 단백질 C3의 억제성 또는 불활성화 절단에 영향을 미치는 능력을 보유하는 한, 변형된 U-PA 폴리펩티드의 자이모겐, 전구체 또는 성숙 형태가 본원에서 사용될 것으로 고려된다. u-PA 폴리펩타이드에서의 변형은 또한 폴리펩타이드의 1차 서열의 변형 및 1차 서열에서의 변형이 아닌 변형을 포함하는 다른 변형을 또한 함유하는 u-PA 폴리펩타이드에 대해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형은 융합 폴리펩타이드 또는 키메라 폴리펩타이드인 u-PA 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 또한 PEG 시약과 같은 중합체에 접합된 폴리펩타이드를 포함한다.
본원의 목적을 위해, 아미노산 치환 또는 치환을 포함하는 변형을 위한 위치 및 아미노산에 대한 언급은 본원에서 서열번호: 1-6 중 임의의 것에 제시된 u-PA 폴리펩타이드를 언급한다. 서열번호: 1-6 중 임의의 것에 기재된 u-PA 폴리펩타이드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 또 다른 u-PA 폴리펩타이드, 예를 들어, 서열번호: 1-6 중 임의의 것에 기재된 u-PA 폴리펩타이드 또는 이의 변이체에서 상응하는 아미노산 잔기를 확인함으로써 또 다른 u-PA 폴리펩타이드에서 본원에 제공된 임의의 변형을 만드는 것은 당업자의 수준 내이다. 또 다른 u-PA 폴리펩타이드 내의 상응하는 위치는 u-PA 폴리펩타이드와 서열번호: 1-6 중 임의의 것에 기재된 참조 u-PA 폴리펩타이드의 정렬에 의해 확인될 수 있다. 변형 (예를 들어, 아미노산 대체)의 목적을 위해, 상응하는 아미노산 잔기는 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, 서열번호: 1-6 중 임의의 것에 제시된 잔기와 동일할 필요는 없다. 전형적으로, 예를 들어 서열번호: 5 내의 잔기와의 정렬에 의해 확인된 상응하는 아미노산 잔기는 서열번호: 5와 동일한 아미노산 잔기이거나, 또는 그에 대한 보존적 또는 반-보존적 아미노산 잔기이다. 또한, 치환이 u-PA 폴리펩티드의 변형되지 않은 형태, 예를 들어, U-PA의 프로테아제 도메인에 존재하는 것과 상이한 한, 본원에 제공된 예시적인 치환은 u-AP 폴리펩티드, 예를 들면, u- PA의 프로테아제 도메인 내의 상응하는 잔기에서 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 본 명세서 및 본원의 다른 곳에서의 설명에 기초하여, 기재된 돌연변이 중 임의의 하나 이상을 함유하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 생성하고, 본원에 기재된 바와 같은 특성 또는 활성에 대해 각각 시험하는 것은 당업자의 수준 내에 있다.
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질 C3의 단백질분해 매개된 억제 또는 불활성화에 의해 보체 활성을 변경시킨다. 추가로, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 플라스미노겐의 절단 및/또는 uPAR에 대한 결합에 대해 감소된 특이성을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 플라스미노겐의 절단에 대한 u-PA 폴리펩타이드의 야생형 활성의 100% 미만, 예컨대 아미노산 변형을 함유하지 않는 상응하는 폴리펩타이드와 같은 야생형 또는 기준 u-PA 폴리펩타이드의 플라스미노겐의 절단에 대한 활성의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 그 이하를 나타낸다. 또 다른 예에서, 본 발명에서 제공되는 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 uPAR에 대한 u-PA 폴리펩타이드의 야생형 결합 활성의 100% 미만, 예컨대, 아미노산 변형을 함유하지 않는 상응하는 폴리펩타이드와 같은 야생형 또는 기준 u-PA 폴리펩타이드의 uPAR에 대한 결합 활성의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 그 이하를 나타낸다.
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산 분자가 또한 본원에 제공된다. 일부 예에서, 인코딩 핵산 분자는 또한 폴리펩타이드의 발현 및 분비를 변경 (예를 들어 증가)하기 위해 이종 신호 서열을 함유하도록 변형될 수 있다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 인코딩 핵산 분자는 천연 공급원으로부터의 단리, 세포, 조직 및 유기체에서 재조합적으로 생성된 단백질의 단리를 포함하는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 및 재조합 방법 및 인실리코 단계, 합성 방법 및 당업자에게 공지된 임의의 방법을 포함하는 방법에 의해 생성되거나 단리될 수 있다. 본원에 제공된 변형된 폴리펩타이드 및 인코딩 핵산 분자는 당업자에게 공지된 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 표적 단백질에서 임의의 하나 이상의 아미노산의 돌연변이를 수행하는 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 방법은 인코딩 핵산 분자의 표준 부위 지정 또는 무작위 돌연변이유발, 또는 고체상 폴리펩타이드 합성 방법을 포함한다. 예를 들어, u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자는 인코딩 핵산의 무작위 돌연변이유발, 오류 유발 PCR, 부위 지정 돌연변이유발, 중첩 PCR, 유전자 셔플링(gene shuffling), 또는 다른 재조합 방법과 같은 돌연변이유발에 적용될 수 있다. 이어서, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하여 이종성으로 발현시킬 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 임의의 변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자가 또한 본원에 제공된다. 일부 예에서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 합성적으로, 예컨대 고체상 또는 용액상 펩타이드 합성을 사용하여 생산된다. 핵산 분자는 생체 내, 예컨대 눈에서 또는 전신 투여를 위해 인코딩된 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 발현을 위해 유전자 요법 벡터, 예컨대 AAV 또는 아데노바이러스 벡터에서 제공될 수 있다. 인코딩된 u-PA 폴리펩타이드는 전장 폴리펩타이드 또는 프로테아제 도메인 또는 활성이거나 활성화될 수 있는 다른 형태일 수 있다.
본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질 C3의 억제 또는 불활성화 절단 서열의 절단에 대한 증가된 특이성 및/또는 선택성을 갖도록 변형되었다. u-PA 폴리펩타이드는 단백질의 변형에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 변형될 수 있다. 이러한 방법은 부위-지정 및 무작위 돌연변이유발을 포함한다. 본원에서 제공되고 당업계에 공지된 보체 활성화의 생물학적 기능에 대한 검정과 같은 검정은 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 절단 및 불활성화를 위해 보체 단백질 C3을 표적으로 하는지를 결정하기 위해 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 생물학적 기능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. u-PA 폴리펩타이드 및 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 확인하는 예시적인 방법이 본원에 제공된다.
1. 예시적인 변형된 u-PA 폴리펩타이드
본원에서는 u-PA 폴리펩타이드 내에 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 그 초과 개의 아미노산 변형을 포함한 1개 이상의 아미노산 변형을 함유하고, 및 보체 단백질 C3을 절단하여 보체가 억제되거나 불활성화되도록 하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 제공한다. 변형은 1차 아미노산 서열 내에 있고, 아미노산 잔기의 대체, 결실 및 삽입을 포함한다. 변형은 활성 형태일 때 u-PA 폴리펩타이드의 특이성/활성을 변화시킨다. 본원에서 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질, 특히 C3 내의 표적 부위를 인식하고 절단하여 이를 불활성화시키도록 선택된다. 이들은 또한 생체 내 기질, 예컨대 플라스미노겐 상에서 감소된 특이성/활성을 갖도록 추가로 변형되고 스크리닝될 수 있다. 이들은 임의의 적합한 프로테아제 스크린 방법에 의해 선택되고 확인될 수 있다. 본원의 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 처음에 미국 특허 제8,211,428호에 기재된 스크리닝 방법을 사용하여 확인되었으며, 여기서 변형된 프로테아제의 라이브러리는 반응성 부위 루프 내에 표적 서열을 포함하도록 변형된 동족 또는 다른 억제성 세르핀과 반응하여 이러한 표적을 절단할 변형된 프로테아제를 포획한다.
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 C3을 불활성화시키는 부위에서 보체 단백질 C3에 대한 증가된 활성 또는 특이성 또는 kcat/Km을 나타내고, 또한 플라스미노겐에 대한 감소된 활성 또는 특이성을 가질 수 있고/있거나 표적 부위 보체 단백질 C3에 대해 증가된 선택성, 특이성 및/또는 활성을 나타낼 수 있고, 이에 의해 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 C3를 불활성화시킨다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 치환 C122S (키모트립신 넘버링에 의함)를 갖는 야생형 또는 야생형 상응하는 형태에 비해 C3의 절단 및 불활성화에 대해 증가된 활성을 나타낸다. 특히, 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 프로테아제 도메인은 서열번호: 5의 u-PA 프로테아제 도메인(C122S를 갖는 u-PA 프로테아제 도메인)과 비교하여 C3의 증가된 불활성화 절단 활성을 나타낸다. 활성의 증가는 비변형 u-PA와 비교하여 10%, 20%, 50%, 100%, 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상일 수 있다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 천연 기질, 예컨대 플라스미노겐에 대해 감소된 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 플라스미노겐에 대해 서열번호: 5에 기재된 u-PA 폴리펩타이드와 같은 야생형 또는 기준 u-PA 폴리펩타이드의 0 내지 99%를 나타내고 및 C3를 불활성화시키기 위해 C3을 절단하는 것에 대한 적어도 0.5배, 1배, 2배, 3배 또는 그 이상을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 야생형 또는 기준 u-PA 폴리펩타이드, 예컨대 아미노산 변형(예를 들어, 아미노산 치환)을 함유하지 않는 상응하는 폴리펩타이드, 예를 들어 서열번호: 5에 기재된 u-PA 프로테아제 도메인의 u-PA 활성의 약 99%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 그 이하를 나타낸다.
예를 들어, 아미노산 대체 또는 치환에 의해 변형될 수 있는 예시적인 위치는 서열번호: 3에 제시된 아미노산의 서열에 대해 위치 173, 178, 179, 180, 181, 185, 186, 187, 188, 208, 209, 249, 250, 252, 306, 314 또는 353에 상응하는 임의의 위치 (키모트립신 넘버링에 따른 위치 30, 35, 36, 37, 37a, 38, 39, 40, 41, 60a, 60b, 97a, 97b, 99, 149, 157 또는 192에 상응함)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 아미노산 위치는 서열번호: 3에 제시된 아미노산 위치 (키모트립신 넘버링에 따라 각각 F30, R35, R36, H37, R37a, V38, T39, Y40, V41, D60a, Y60b, T97a, L97b, H99, Y149, M157 및 Q192에 상응함)를 참조하여 위치 173, R178, R179, H180, R181, V185, T186, Y187, V188, D208, Y209, T249, L250, H252, Y306, M314 또는 Q353 중 하나 이상에서 페닐알라닌 (F)의 치환에 상응하는 위치에서의 치환일 수 있다.
임의의 상기 위치에서의 예시적인 아미노산 치환은 표 11에 제시된다. 표 11의 상응하는 위치에 대한 언급은 서열번호: 3에 제시된 위치를 참조한다. (하기 실시예 참조). 치환은 서열번호: 3에 제시된 서열과의 정렬에 의해 또 다른 u-PA 폴리펩타이드의 상응하는 위치에서 이루어질 수 있고, 이때 상응하는 위치는 정렬된 위치인 것으로 이해된다. 예를 들어, 치환은 u-PA 프로테아제 도메인 내에서 서열번호: 2에 기재된 서열로 이루어질 수 있거나, 또는 기준 u-PA 프로테아제 도메인이 서열번호: 5에 기재된 서열을 갖도록 이루어질 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 치환(들)은, 생성된 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 플라스미노겐에 대한 u-PA 활성 및/또는 보체 단백질 C3에 대한 변경된 선택성에 비해 보체 단백질 C3에 대해 변경된(즉, 향상된) 특이성을 나타내는 한, 서열번호: 5에 제시된 바와 같은 u-PA 폴리펩타이드 또는 이에 대해 적어도 또는 적어도 약 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 특히 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체에서 상응하는 위치에 있을 수 있다. 일 예에서, 생성된 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 플라스미노겐에 대한 u-PA 활성 및/또는 보체 단백질 C3에 대한 변경된 선택성에 비해 보체 단백질 C3에 대해 변경된(즉, 향상된) 특이성을 나타내는 한, 임의의 하나 이상의 치환은 서열번호: 1-6 중 임의의 것이다.
표 11. C3의 절단에 대한 증가된 활성을 초래하는 예시적인 돌연변이
상응하는 위치
(서열번호: 3) 		상응하는 위치 (키모트립신 넘버링) 치환
173 30 Y
178 35 W Y Q
179 36 H
180 37 E P D N G K Y
181 37a Q P E N S
185 38 D E
186 39 W Y F
187 40 H F Q
188 41 R L
208 60a P T
209 60b Q H S A T L
249 97a E I
250 97b A G
252 99 Q
279 122 S
306 149 K R
314 157 K
353 192 H
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드에서의 예시적인 아미노산 변형은 위치 173 (키모트립신 넘버링에 의해 30)에 상응하는 위치의 티로신(Y); 위치 178 (키모트립신 넘버링에 의해 35)에 상응하는 위치의 W; 위치 178에 상응하는 위치의 Y; 위치 178에 상응하는 위치의 Q; 위치 179(키모트립신 넘버링에 의해 36)에 상응하는 위치의 H; 위치 180(키모트립신 넘버링에 의해 37)에 상응하는 위치의 E; 위치 180에 상응하는 위치의 P; 위치 180에 상응하는 위치의 D; 위치 180에 상응하는 위치의 N; 위치 180에 상응하는 위치의 G; 위치 180에 상응하는 위치의 K; 위치 180에 상응하는 위치의 Y; 위치 181(키모트립신 넘버링에 의해 37a)에 상응하는 위치의 Q; 위치 181에 상응하는 위치의 P; 위치 181에 상응하는 위치의 E; 위치 181에 상응하는 위치의 N; 위치 181에 상응하는 위치의 S; 위치 185(키모트립신 넘버링에 의해 38)에 상응하는 위치의 D; 위치 185에 상응하는 위치의 E; 위치 186(키모트립신 넘버링에 의해 39)에 상응하는 위치의 W; 위치 186에 상응하는 위치의 Y; 위치 186에 상응하는 위치의 F; 위치 187(키모트립신 넘버링에 의해 40)에 상응하는 위치의 H; 위치 187에 상응하는 위치의 F; 위치 187에 상응하는 위치의 Q; 위치 188(키모트립신 넘버링에 의해 41)에 상응하는 위치의 R; 위치 188에 상응하는 위치의 L; 위치 208에 상응하는 위치의 P; 위치 208(키모트립신 넘버링에 의해 60a)에 상응하는 위치의 T; 위치 209(키모트립신 넘버링에 의해 60b)에 상응하는 위치의 Q; 위치 209에 상응하는 위치의 H; 위치 209에 상응하는 위치의 S; 위치 209에 상응하는 위치의 A; 위치 209에 상응하는 위치의 T; 위치 209에 상응하는 위치의 L; 위치 249(키모트립신 넘버링에 의해 97a)에 상응하는 위치의 E; 위치 249에 상응하는 위치의 I; 위치 250(키모트립신 넘버링에 의해 97b)에 상응하는 위치의 A; 위치 250에 상응하는 위치의 G; 위치 252(키모트립신 넘버링에 의해 99)에 상응하는 위치의 Q; 위치 306(키모트립신 넘버링에 의해 149)에 상응하는 위치의 K; 위치 306에 상응하는 위치의 R; 위치 314(키모트립신 넘버링에 의해 157)에 상응하는 위치의 K; 또는 위치 353(키모트립신 넘버링에 의해 192)에 상응하는 위치의 H에 의한 치환을 비제한적으로 포함하고; 이들 각각은 서열 번호: 3에 기재된 아미노산 위치를 참조함. 키모트립신 넘버링에 의해 위치 279(122S)에 상응하는 위치에서 S는 유리 Cys를 대체함으로써 응집 경향을 감소시킨다.
2개 이상의 아미노산 변형을 함유하는 예시적인 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 하기 표 12에 제시되어 있고, 표 14에 기재된 C3을 절단하기 위한 그의 활성이 기재되어 있다. 서열 번호는 언급된 대체물을 함유하는 예시적인 u-PA 프로테아제 도메인을 언급하며, 이는 응집을 감소시키거나 제거하기 위한 C122S에서의 대체물을 포함한다. C122는 프로테아제 폴리펩타이드 사이에 가교를 일으킬 수 있는 유리 시스테인이다. 프로테아제 도메인은 예시적이고, 전장 및 전구체 분자뿐만 아니라 프로테아제 도메인의 다른 촉매적 활성 부분, 전체 길이 및 전구체 폴리펩타이드는 언급된 치환을 포함하여 전장 활성화된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 다른 형태를 형성할 수 있는 것으로 이해된다.
표 12. 변형된 u-PA 폴리펩타이드
성숙한 u-PA 넘버링 키모트립신 넘버링 예시적인 서열번호
F173Y/V185D/Y187H/V188R/L250A/H252Q/C279S/M314K F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 8
F173Y/R178W/R179H/H180E/V185E/T186W/Y187H/V188R/Y209Q/T249E/L250A/H252Q/C279S/Y306K/M314K F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 9
F173Y/R178W/R179H/H180D/V185E/T186Y/Y187F/V188R/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R/M314K F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 10
R178W/R179H/H180N/V185E/T186F/Y187F/V188R/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R/M314K/Q353H R35W/R36H/H37N/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192H 11
F173Y/R178Y/R179H/H180K/V185E/T186F/Y187F/V188R/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R/M314K F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 12
F173Y/R178W/R179H/H180N/V185E/T186Y/Y187F/V188R/Y209S/T249E/L250A/H252Q/C279S/Y306K/M314K F30Y/R35W/R36H/H37N/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 13
F173Y/R178W/R179H/H180P/V185E/T186Y/Y187F/V188R/Y209S/T249E/L250A/H252Q/C279S/Y306K/M314K F30Y/R35W/R36H/H37P/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 14
V185E/Y187Q/V188L/Y209L/L250A/H252Q/ C279S V38E/Y40Q/V41L/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S 15
F173Y/R178Q/R179H/H180G/R181E/V185E/T186F/Y187F/V188R/D208P/Y209S/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R/M314K F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39F/Y40F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 16
F173Y/R178Y/R179H/H180P/R181Q/V185E/T186Y/Y187F/V188R/Y209H/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R/M314K F30Y/R35Y/R36H/H37P/R37aQ/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bH/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 17
R178Q/H180Y/R181E/V185E/T186Y/V188R/D208T/Y209T/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aT/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 18
R178W/H180P/R181N/V185E/T186Y/V188R/D208P/Y209L/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bL/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 19
R178W/H180D/R181P/V185E/T186W/V188R/Y209A/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R R35W/H37D/R37aP/V38E/T39W/V41R/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 20
R178Q/H180Y/R181E/V185E/T186Y/V188R/D208P/Y209Q/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 21
H180Y/R181E/V185E/T186Y/V188R/D208P/Y209Q/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 22
R178Q/R181E/V185E/T186Y/V188R/D208P/Y209Q/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R R35Q/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 23
R178Q/H180Y/V185E/T186Y/V188R/D208P/Y209Q/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R R35Q/H37Y/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 24
R178Q/H180Y/R181E/T186Y/V188R/D208P/Y209Q/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R R35Q/H37Y/R37aE/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 25
R178Q/H180Y/R181E/V185E/V188R/D208P/Y209Q/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R R35Q/H37Y/R37aE/V38E/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 26
R178Q/H180Y/R181E/V185E/T186Y/D208P/Y209Q/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 27
R178Q/H180Y/R181E/V185E/T186Y/V188R/Y209Q/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 28
R178Q/H180Y/R181E/V185E/T186Y/V188R/D208P/T249I/L250A/H252Q/C279S/Y306R R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 29
R178Q/H180Y/R181E/V185E/T186Y/V188R/D208P/Y209Q/L250A/H252Q/C279S/Y306R R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 30
R178Q/H180Y/R181E/V185E/T186Y/V188R/D208P/Y209Q/T249I/H252Q/C279S/Y306R R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/H99Q/C122S/Y149R 31
R178Q/H180Y/R181E/V185E/T186Y/V188R/D208P/Y209Q/T249I/L250A/C279S/Y306R R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/C122S/Y149R 32
R178Q/H180Y/R181E/V185E/T186Y/V188R/D208P/Y209Q/T249I/L250A/H252Q/C279S R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S 33
Y187Q/V188L/Y209L/ L250A/H252Q/ C279S Y40Q/V41L/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S 34
V185E/Y187Q/ Y209L/L250A/H252Q/ C279S V38E/Y40Q/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S 35
V185E/Y187Q/ V188L/L250A/H252Q/ C279S V38E/Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S 36
V185E/Y187Q/ V188L/Y209L/H252Q/ C279S V38E/Y40Q/V41L/Y60bL/H99Q/C122S 37
V185E/Y187Q/ V188L/ Y209L/L250A/ C279S V38E/Y40Q/V41L/Y60bL/L97bA/C122S 38
Y187Q/ V188L/L250A/H252Q/C279S Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S 39
Y187Q/ V188L/L250A/ C279S Y40Q/V41L/L97bA/C122S 40
R181S/ V188R/ L250G/ H252Q/C279S R37aS/V41R/L97bG/H99Q/C122S 41
T186Y/ V188R/ L250A/ H252Q/C279S T39Y/V41R/L97bA/H99Q/C122S 42
T186Y/V188R/Y209Q/L250A/H252Q/C279S T39Y/V41R/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S 43
T186Y/V188R/D208P/L250A/H252Q/C279S T39Y/V41R/D60aP/L97bA/H99Q/C122S 44
2. 추가 변형
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것은 임의의 하나 이상의 추가 변형을 함유할 수 있다. 추가의 변형은, 예를 들어 당업계에 공지된 임의의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입, 전형적으로 플라스미노겐에 대한 u-PA 활성에 비해 보체 단백질 C3에 대한 특이성을 증가시키고/거나 보체 단백질 C3에 대해 선택성을 변경시키는 임의의 것을 포함할 수 있다. 또한, 관심있는 임의의 다른 활성을 변경시키는 변형이 고려된다. 1차 서열의 아미노산 변형이 부가적이라는 것은 당업계에 오랫동안 공지되어 있다(예를 들어, Wells (1990) Biochem 29:8509-8517 참조). 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것은 추가의 활성을 제공하거나 활성을 변경시키기 위해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 추가의 아미노산 변형을 함유할 수 있다.
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 포함될 수 있는 추가 변형의 예는 미국 특허 번호 4,997,766; 5,126,134; 5,129,569; 5,275,946; 5,571,708; 5,580,559; 5,648,253; 5,728,564; 5,759,542; 5,811,252; 5,891,664; 5,932,213; 5,980,886; 6,248,712; 6,423,685; 7,070,925; 7,074,401; 7,807,457; 7,811,771; 8,211,428; 미국 특허 공개 번호 2002/0106775; 2004/0265298; 2004/0146938; 2009/0010916; 2011/0055940; 2008/0020416; 2006/0142195; 국제 공개 특허 번호 WO1988/008451; WO1989/010401; WO1990/004635; WO1996/013160; WO 2002/40503; Petersen 등 (2001) Eur J Biochem 268:4430-4439; Skeldal 등 (2006) FEBS J 273:5143-5149; Sun 등 (1997) J Biol Chem 272:23818-23823; Blouse 등 (2009) J Biol Chem 284:4647-4657; Nelles 등 (1987) JBC 262:5682-5689; Crowley 등 (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 90:5021-5025; Zeslawska 등 (2000) J Mol Biol 301:465-475; Zeslawska 등 (2003) J Mol Biol 328:109-118; Quax 등 (1998) Arterioscler Thromb Vasc Biol 18:693-701; Homandberg and Wai (1990) Thrombin Res 58:403-412; Zaitsev 등 (2010) Blood 115:5241-5248; Yang 등 (1994) Biochemistry 33:606-612; Davidow 등 (1991) Protein Eng 4:923-928; Boutad and Castellino (1993) Arch Biochem Biophys 303:222-230; Tsujikawa 등 (1996) Yeast 12:541-553; Carriero 등 (2002) Biol Chem 383:107-113; Stopelli 등 (1985) Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A . 82:4939-4943; Stoppelli 등 (1987) J Biol Chem 262:4437-4440; Franco 등 (1998) J Biol Chem 273:27734-27740; Franco 등 (1997) J Cell Biol 137:779-791; Li 등 (1995) J Biol Chem 270:30282-30285; Botkjaer 등 (2009) Biochemistry 48:9606-9617; Bdeir 등 (2003) Blood 102:3600-3608; Eguchi 등 (1990) J Biochem 108:72-79; Miyake 등 (1988) J Biochem 104:643-647; Bergstrom 등 (2003) Biochem 42:5395-5402; Sun and Liu (2005) Proteins 61:870-877; Sun 등 (1998) Biochemistry 37:2935-2940; Anderson 등 (2008) Biochem J 412:447-457; Li 등 (1992) Biochim Biophys Acta 1159:37-43; Lijnen 등 (1988) Eur J Biochem 177:575-582; Lijnen 등 (1988) Eur J Biochem 172:185-188; Lijnen 등 (1992) Eur J Biochem 205:701-709; Lijnen 등 (1994) Eur J Biochem 224:567-574; Lijnen 등 (1990) J Biol Chem 265:5232-5236; Yoshimoto 등 (1996) Biochim Biophys Acta 1293:83-89; Magdolen 등 (1996) Eur J Biochem 237:743-751; Nienaber 등 (2000) J Biol Chem 275:7239-7248; Gurewich 등 (1988) J Clin Invest 1956-1962; Liu 등 (1996) Biochemistry 35:14070-14076; Liu 등 (2002) Circ Res 90:757-763; Mukhina 등 (2000) J Biol Chem 275:16450-16458; Peng 등 (1997) Biochem Mol Biol Int 41:887-894; Turkmen 등 (1997) Electrophoresis 18:686-689; Peng 등 (1999) Biotechnol Lett 21:979-985; Ueshima 등 (1994) Thromb Haemost 71:134-140; 및 Melnick 등 (1990) J Biol Chem 265:801-807에 기재된 것들을 비제한적으로 포함한다. 당업계에 기재된 예시적인 아미노산 변형의 비제한적인 예는 서열번호: 3에 제시된 아미노산의 서열에 따라 S9A, C13A, T18A, C19A, V20A, S21A, N22Y, N22A, N22Q, N22R, K23A, K23H, K23Q, K23E, Y24A, F25A, S26A, S26F, N27A, N27R, I28A, H29A, H29R, W30A, W30R, W30F, N32S, K35A, G38R, E43A, I44A, D45A, K46A, S47A, S47G, K48A, K48P, T49A, Y51A, N54A, L80H, Q81R, Q82P, T83R, H99Y, P105A, D106A, N107A, R108A, R108D, R109A, R110A, G118N, L119R, K120R, K120A, P121L, L122T, L122R, V123Y, V123W, Q124A, E125A, H129A, D130G, C131W, K135G, K135S, K135Y, K135Q, K136P, S138E, C148S, C148A, K151E, T152A, R154G, R154P, R154A, P155R, P155L, P155A, P155N, P155S, P155G, P155Q, R156P, R156A, R156H, R156S, R156Y, R156E, R156G, R156L, F157L, F157T, F157G, F157Q, F157D, F157E, K158R, K158E, K158A, K158H, K158S, K158Y, K158G, K158W, K158V, K158M, I159R, I159A, I159P, I159G, I160A, I160K, G162R, E163A, F164V, F164A, F164V, I167L, P171L, F173I, F173V, F173L, F173T, F173G, F173M, A175S, Y177A, R178A, R179A, H180A, R181A, S184A, T186A, T186E, T186D, Y187A, Y187H, V188A, S192N, I194M, S195A, H204A, H204Q, F206A, D208A, Y209A, P210A, K211A, K211Q, K212A, E213A, D214A, Y215A, I216A, Y218A, R221A, S222L, R223G, R223A, L224A, L224P, N225A, S226P, N227A, Q229A, E231G, K233E, K233A, F234A, E235K, E235A, E237A, I240V, K243E, K243A, D244A, Y245A, D255A, R262A, K264A, E265A, R267A, C268Y, C279S, C279A, F289L, G290D, E294G, I295T, G297D, F298A, G299A, G299H, K300A, K300H, K300W, E301D, E301A, E301H, N302A, N302Q, N302V, N302L, N302I, N302S, N302T, S303E, S303A, S303E, T304A, T304V, T304M, D305A, Y306A, Y306G, Y306V, Y306H, L307A, Y308A, P309A, P309S, P309T, P309V, P309G, P309N, P309L, P309D, P309R, P309H, P309F, P309W, E310A, Q311A, L312P, L312V, L312M, K313Y, K313T, K313A, K313H, T315A, T315I, V316A, V317A, Y330H, A343T, D344A, Q346A, W347A, K348A, K348E, T349I, D350A, S351A, Q353A, G354R, D355A, S356A, G357E, G366C, R378C, R378A, K383A, K385A, R400A, H402A, K404A, E405A, E406A G408A, 또는 A410V 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 추가의 변형은 글리코실화 부위를 도입하는 아미노산 치환을 포함한다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 화학적 또는 번역후 변형을 함유하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 화학적 또는 번역후 변형을 함유하지 않는다. 화학적 및 번역후 변형은 페길화, 시알화, 알부민화, 글리코실화, 파르니실화, 카르복실화, 히드록실화, PAS화, HES화, 인산화, 다량체화 도메인(들), 예컨대 Fc에 대한 연결, 및 관련 기술분야에 공지된 다른 폴리펩타이드 변형을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 제공된 임의의 하나 이상의 아미노산 변형, 예컨대 아미노산 치환, 삽입, 결실 및 이들의 조합 이외에, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 화학적 및 재조합 방법을 비롯한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 임의의 모이어티에 접합 또는 융합될 수 있고, 이로써 생성된 폴리펩타이드는 활성 형태일 때 보체 단백질 C3의 억제 또는 불활성화 절단을 수행하는 능력을 보유한다.
예를 들어, 본원에 제공된 임의의 하나 이상의 아미노산 변형, 예컨대 아미노산 치환에 더하여, 본원에서 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 또한 탄수화물 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티, 실란화 모이어티, 면역글로불린 G로부터의 Fc 도메인, 또는 임의의 다른 도메인 또는 모이어티에 의한 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 폴리펩타이드의 1차 서열에 존재하거나 존재하지 않는 다른 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 이러한 추가의 변형은 단백질의 안정성 또는 혈청 반감기를 증가시키도록 이루어질 수 있다.
a. 감소된 면역원성
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 감소된 면역원성을 갖도록 변형될 수 있다. 감소된 면역원성은 폴리펩타이드로부터 항원성 에피토프를 제거하는 서열 변화에 의해 또는 번역후 변형을 변경함으로써 수행될 수 있다. 당업자는 폴리펩타이드 내의 항원성 에피토프를 확인하는 방법에 친숙하다(예를 들어, Liang 등 (2009) BMC Bioinformatics, 10:302; Yang 등 (2009) Rev. Med . Virol., 19:77-96을 참조한다). 일부 예에서, 하나 이상의 아미노산은 항원성 에피토프를 제거하거나 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 또 다른 예에서, 단백질의 글리코실화의 변경은 또한 면역원성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드가 보체 단백질 C3의 억제 또는 불활성화 절단을 수행하는 능력을 보유하는 한, 펩타이드의 글리코실화를 변경시키는 것이 고려된다. 글리코실화 부위는 단일 돌연변이에 의해 제거될 수 있다. 글리코실화 부위는 표준 서열을 도입함으로써, 예컨대 삽입 또는 단일 또는 복수의 돌연변이, 예컨대 NXS(T) (여기서, X는 프롤린이 아님)에 의해 부가될 수 있다. 글리코실화 부위는 또한 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다.
b. Fc 도메인
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 면역글로불린 폴리펩타이드의 Fc 영역에 연결될 수 있다. 전형적으로, 이러한 융합체는 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 적어도 기능적으로 활성인 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 보유한다. 예를 들어, IgG1의 전장 Fc 서열은 하기 서열번호: 45에 제시된 서열의 아미노산 99-330을 포함한다.
Figure pct00004
Figure pct00005
hIgG1에 대한 예시적인 Fc 서열은 서열번호: 50에 제시된다:
Figure pct00006
Figure pct00007
이는 서열번호: 45의 아미노산 100-110에 상응하는 거의 모든 힌지 서열; 서열번호: 45에 제시된 CH2 및 CH3 도메인에 대한 완전한 서열을 함유한다.
또 다른 예시적인 Fc 폴리펩타이드는 PCT 출원 공개 번호 WO 93/10151에 제시되어 있고, 인간 IgG1 항체의 Fc 영역의 N-말단 힌지 영역으로부터 천연 C-말단으로 연장되는 단일 사슬 폴리펩타이드다(서열번호: 50). 연결이 이루어지는 정확한 부위는 중요하지 않다: 특정 부위는 잘 알려져 있고 HABP 폴리펩타이드의 생물학적 활성, 분비 또는 결합 특징을 최적화하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 다른 예시적인 Fc 폴리펩타이드 서열은 서열번호: 45에 제시된 서열의 아미노산 C109 또는 P113에서 시작한다(예를 들어, 미국 공개 번호 2006/0024298).
hIgG1 Fc 이외에, 다른 Fc 영역 및 다른 다량체화 도메인이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, Fc/FcγR 상호작용에 의해 매개되는 효과기 기능이 최소화되어야 하는 경우에, 보체 또는 효과기 세포를 불량하게 동원하는 IgG 동형단백질, 예컨대 예를 들어 IgG2 또는 IgG4의 Fc와의 융합이 고려된다. 추가로, Fc 융합체는 항체의 IgG (인간 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 포함), IgA (인간 하위부류 IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, 및 IgM 부류를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 항체 부류에 속하는 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 인코딩되는 면역글로불린 서열을 함유할 수 있다. 링커는 Fc를 또 다른 폴리펩타이드에 공유적으로 연결하여 Fc 키메라를 생성하는데 사용될 수 있다.
변형된 Fc 도메인 또한 잘 알려져 있다. 일부 예에서, Fc 영역은 야생형 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 효과기 기능보다 변경된 (즉, 다소의) 효과기 기능을 초래하도록 FcR에 대한 변경된 결합을 나타내도록 변형된다. 따라서, 변형된 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 증가된 친화도 또는 낮은 친화도 또는 무 친화도를 포함하나 이에 제한되지는 않는 변경된 친화도를 가질 수 있다. 예를 들어, 상이한 IgG 하위부류는 FcγR에 대해 상이한 친화도를 가지며, IgG1 및 IgG3은 전형적으로 IgG2 및 IgG4보다 수용체에 실질적으로 더 양호하게 결합한다. 상이한 FcγR은 상이한 효과기 기능을 매개한다. FcγR1, FcγRIIa/c 및 FcγRIIIa는 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프 (ITAM)를 갖는 세포내 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는, 면역 복합체 촉발된 활성화의 양성 조절제이다. 그러나, FcγRIIb는 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)를 가지며, 따라서 억제성이다. 수용체에 대한 Fc 영역의 친화도의 변경은 Fc 도메인에 의해 연관된 효과기 기능 및/또는 약동학적 특성을 조정할 수 있다. 변형된 Fc 도메인은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 문헌에 기재되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 번호 5,457,035; 미국 특허 공개 번호 참조. US 2006/0024298; 및 예시적인 변형을 위한 국제 특허 공개 번호 WO 2005/063816을 참조한다.
Fc 모이어티를 함유하는 생성된 키메라 폴리펩타이드, 및 그로부터 형성된 다량체는 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 상에서의 친화도 크로마토그래피에 의해 용이하게 정제될 수 있다.
또 다른 예에서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 인간 혈청 알부민(HSA), 예컨대 HSA의 잔기 25-608, 또는 전장, 또는 이의 일부에 연결될 수 있다:
Figure pct00008
c. 중합체에 대한 접합
일부 예에서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 다른 중합체에 접합된다. 중합체는 폴리펩타이드의 크기를 증가시켜 신장 간극(kidney clearance)을 감소시킴으로써 반감기를 증가시키거나 폴리펩타이드의 구조를 변형시켜 반감기를 증가시키거나 면역원성을 감소시킬 수 있다. u-PA 폴리펩타이드에 접합될 수 있는 예시적인 중합체는 천연 및 합성 단독중합체, 예컨대 폴리올 (즉 폴리-OH), 폴리아민 (즉 폴리-NH2) 및 폴리카복실산(즉 폴리-COOH), 및 다른 이종중합체 즉 하나 이상의 상이한 커플링 기 예를 들어 하이드록실 기 및 아민 기를 포함하는 중합체를 포함한다. 적합한 중합체 분자의 예는 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO), 예컨대 폴리에틸렌 글라이콜 (PEG), 메톡시폴리에틸렌 글라이콜 (mPEG) 및 폴리프로필렌 글라이콜을 포함하는 폴리알킬렌 글라이콜 (PAG), PEG-글리시딜 에테르 (Epox-PEG), PEG-옥시카보닐이미다졸 (CDI-PEG), 분지형 폴리에틸렌 글라이콜 (PEG), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리-D,L-아미노산, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 카복시메틸-덱스트란을 포함하는 덱스트란, 헤파린, 상동성 알부민, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 카복시에틸셀룰로스 및 하이드록시프로필셀룰로스를 포함하는 셀룰로스, 키토산의 가수분해물, 전분 예컨대 하이드록시에틸-전분 및 하이드록시프로필-전분, 글리코겐, 아가로스 및 그의 유도체, 구아르 검, 풀루란, 이눌린, 크산탄 검, 카라기난, 펙틴, 알긴산 가수분해물 및 바이오-폴리머 중에서 선택된 중합체성 분자를 포함한다.
전형적으로, 중합체는 폴리알킬렌 옥시드 (PAO), 예컨대 폴리에틸렌 옥시드, 예컨대 PEG, 전형적으로 mPEG이며, 이는 가교가능한 반응성 기를 거의 갖지 않는다. 전형적으로, 중합체는 비교적 간단한 화학을 사용하여 u-PA 폴리펩타이드에 (예를 들어, 단백질 표면 상의 부착 기에) 공유 결합될 수 있는 (메톡시)폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)과 같은 비독성 중합체 분자이다.
u-PA 폴리펩타이드에 부착하기에 적합한 중합체 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PEG 유도체, 예를 들어 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG) 또는 PEG-옥시카보닐이미다졸(CDI- PEG), 분지형 PEG 및 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Roberts 등, Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris and Zalipsky (eds.) "Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar 등, J. Pharm . Pharmaceut . Sci ., 3(1):125-136, 2000; Harris and Chess (2003) Nat Rev Drug Discov . 2(3):214-21; 및 Tsubery, J Biol . Chem 279(37):38118-24, 2004). 중합체 분자는 전형적으로 약 3 kDa 내지 약 60 kDa 범위의 분자량을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 u-PA 폴리펩타이드에 접합된 중합체 분자는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 또는 60 kDa 초과의 분자량을 갖는다.
PEG 또는 PEG 유도체를 공유적으로 부착 (접합)시킴으로써 폴리펩타이드를 변형시키는 방법 (즉, "페길화")은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, US 2006/0104968; US 5,672,662; US 6,737,505; 및 US 2004/0235734 참조). 페길화를 위한 기술은 특수화된 링커 및 커플링 화학 (예를 들어, Harris, Adv . Drug Deliv . Rev. 54:459-476, 2002 참조), 단일 접합 부위에의 다중 PEG 모이어티의 부착 (예컨대 분지형 PEG의 사용을 통한 것; 예를 들어, Veronese 등, Bioorg . Med. Chem . Lett . 12:177-180, 2002 참조), 부위-특이적 페길화 및/또는 모노-페길화 (예를 들어, Chapman 등, Nature Biotech. 17:780-783, 1999 참조), 및 부위-지정 효소적 페길화 (예를 들어, Sato, Adv . Drug Deliv . Rev., 54:487-504, 2002 참조). J. Peptide Protein Res. 43:127-138; Lu and Felix (1993) Peptide Res. 6:142-6, 1993; Felix 등 (1995) Int . J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar 등 (1994) J. Biol . Chem . 269:13398-404; Brumeanu 등 (1995) J Immunol. 154:3088-95; 또한, Caliceti 등 (2003) Adv . Drug Deliv . Rev. 55(10):1261-77 및 Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야에 기재된 방법 및 기술은 단일 단백질 분자에 부착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 PEG 또는 PEG 유도체를 갖는 단백질을 생산할 수 있다(예를 들어, 미국 2006/0104968).
페길화를 위한 다수의 시약이 당업계에 기재되어 있다. 그와 같은 시약은 비제한적으로, N-하이드록시석신이미딜 (NHS) 활성화된 PEG, 석신이미딜 mPEG, mPEG2-N-하이드록시석신이미드, mPEG 석신이미딜 알파-메틸부타노에이트, mPEG 석신이미딜 프로피오네이트, mPEG 석신이미딜 부타노에이트, mPEG 카복시메틸 3-하이드록시부탄산 석신이미딜 에스테르, 동종이중작용성 PEG-석신이미딜 프로피오네이트, 동종이중작용성 PEG 프로피온알데하이드, 동종이중작용성 PEG 부티르알데하이드, PEG 말레이미드, PEG 하이드라자이드, p-니트로페닐-카보네이트 PEG, mPEG-벤조트리아졸 카보네이트, 프로피온알데하이드 PEG, mPEG 부티르알데하이드, 분지형 mPEG2 부티르알데하이드, mPEG 아세틸, mPEG 피페리돈, mPEG 메틸케톤, mPEG "무링커" 말레이미드, mPEG 비닐 설폰, mPEG 티올, mPEG 오르토피리딜티오에스테르, mPEG 오르토피리딜 디설파이드, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, 비닐설폰 PEG-NHS, 아크릴레이트 PEG-NHS, 플루오레세인 PEG-NHS, 및 바이오틴 PEG-NHS를 포함한다(예를 들어, Monfardini 등, Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese 등, J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; U.S. 5,672,662; U.S. 5,932,462; U.S. 6,495,659; U.S. 6,737,505; U.S. 4,002,531; U.S. 4,179,337; U.S. 5,122,614; U.S. 5,183,550; U.S. 5,324, 844; U.S. 5,446,090; U.S. 5,612,460; U.S. 5,643,575; U.S. 5,766,581; U.S. 5,795, 569; U.S. 5,808,096; U.S. 5,900,461; U.S. 5,919,455; U.S. 5,985,263; U.S. 5,990, 237; U.S. 6,113,906; U.S. 6,214,966; U.S. 6,258,351; U.S. 6,340,742; U.S. 6,413,507; U.S. 6,420,339; U.S. 6,437,025; U.S. 6,448,369; U.S. 6,461,802; U.S. 6,828,401; U.S. 6,858,736; U.S. 2001/0021763; U.S. 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S. 2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U.S. 2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; U.S. 2005/000360; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 01064951; EP 0822199; WO 00176640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; 및 WO 0187925 참조).
d. 단백질 형질도입 도메인
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 요법을 위한 표적 부위, 예컨대 점막 부위, 예를 들어 눈에서 항체의 체류를 증가시키는 단백질 형질도입 도메인 (PTD)에 접합된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 함유하는 융합 단백질과 같이 연결될 수 있다. PTD가 치료 부위(예를 들어, 점막 부위)에서 표적 세포 표면에 대한 결합 및/또는 치료 부위에서 표적 세포(예를 들면, 눈과 같은 점막 위치)에 의한 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 흡수를 촉진하는 한, 임의의 PTD를 사용할 수 있다.
일반적으로, PTD는 세포막에 대한 정전기적 부착을 통해 세포 표면에 결합할 수 있고 막 전위에 의해 세포에 의해 흡수될 수 있는 짧은 양이온성 펩타이드를 포함한다(Kabouridis (2003) TRENDS Biotech 21(11) 498-503). 제공된 PTD는 일반적으로 글리코사미노글리칸 (GAG), 예를 들어 히알루론산, 헤파린, 헤파란 설페이트, 더마탄 설페이트, 케라틴 설페이트 또는 콘드로이틴 설페이트 및 그의 유도체에 대한 결합을 통해 표적 세포와 상호작용한다.
단백질 형질도입 도메인은 임의의 길이일 수 있다. 일반적으로 PTD의 길이는 5 또는 약 5 내지 100 또는 약 100개 아미노산 길이 범위이다. 예를 들어, PTD의 길이는 5 또는 약 5 내지 25 또는 약 25개 아미노산 길이 범위일 수 있다. 일부 예에서, PTD는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 아미노산 길이이다.
단일 PTD 또는 이의 다수는 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 접합될 수 있다. 이들은 유리하게는 안구 또는 안과 장애, 예컨대 당뇨병성 망막병증 또는 AMD를 포함한 황반 변성의 치료에 사용된다. 예를 들어, 동일한 PTD (예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 십량체 또는 더 큰 다량체) 또는 상이한 PTD의 다중 카피가 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 접합될 수 있다.
여러 단백질 및 그의 펩타이드 유도체는 세포 내재화 특성을 갖는다. 예시적인 PTD는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 하기를 포함하는, 아래의 표에 열거된 PTD를 비제한적으로 포함한다: 인간 면역결핍 바이러스 1 (HIV-1) TAT (서열번호: 125-135; Ruben 등 (1989) J. Virol . 63:1-8), 헤르페스 바이러스 외피 단백질 VP22 (서열번호: 140; Elliott and O'Hare (1997) Cell 88:223-233), 드로소필라 멜라노가스터 안테나페디아 (Antp) 단백질의 호메오틱 단백질 (페네트라틴 PTD; 서열번호: 112; Derossi 등 (1996) J. Biol . Chem . 271:18188-18193), 프로테그린 1 (PG-1) 항-미생물성 펩타이드 SynB (예를 들어, SynB1 (서열번호: 121), SYnB3 (서열번호: 122), 및 StyB4 (서열번호: 123); Kokryakov 등 (1993) FEBS Lett. 327:231-236) 및 카포시 섬유모세포 성장 인자 (서열번호: 105; Lin 등, (1995) J. Biol . Chem. 270-14255-14258).
다른 단백질 및 그의 펩타이드 유도체는 유사한 세포 내재화 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들 단백질로부터 유래된 담체 펩타이드는 서로 서열 상동성을 거의 나타내지 않지만, 모두 고도로 양이온성이고 아르기닌 또는 리신이 풍부하다. 실제로, 합성 폴리-아르기닌 펩타이드는 높은 수준의 효율로 내재화되는 것으로 밝혀졌고, 제공된 캔(can) 항체에 대한 접합을 위해 선택될 수 있다(Futaki 등 (2003) J. Mol. Recognit. 16:260-264; Suzuki 등 (2001) J. Biol . Chem . 276:5836-5840). PTD는 또한 트랜스포탄 (서열번호: 136; Pooga 등 (1988) FASEB J. 12:67-77; Pooga 등 (2001) FASEB J. 15:1451-1453), MAP (서열번호: 103; Oehlke 등 (1998) Biochim. Biophys . Acta. 1414:127-139), KALA(서열번호: 101; Wyman 등 (1997) Biochemistry 36:3008-3017) 및 다른 양이온성 펩타이드, 예를 들어 다양한
β-양이온성 펩타이드 (Akkarawongsa 등 (2008) Antimicrob . Agents and Chemother. 52(6):2120-2129)을 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 합성 PTD로부터 선택될 수 있다. 추가의 PTD 펩타이드 및 변이체 PTD가 또한, 예를 들어 미국 특허 공보 번호 US 2005/0260756, US 2006/0178297, US 2006/0100134, US 2006/0222657, US 2007/0161595, US 2007/0129305, 유럽 특허 공보 번호 EP 1867661, PCT 공개 번호 WO 2000/062067, WO 2003/035892, WO 2007/097561, WO 2007/053512 및 본원의 표 13 (아래)에 제공된다. 본원에 제공되거나 당업계에 공지된 임의의 이러한 PTD는 제공된 치료 항체에 접합될 수 있다.
표 13: 알려진 단백질 형질도입 도메인
단백질 형질도입 도메인 (PTD) 공급원 단백질 서열번호
TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK Buforin II 82
RKKRRRESRKKRRRES DPV3 83
GRPRESGKKRKRKRLKP DPV6 84
GKRKKKGKLGKKRDP DPV7 85
GKRKKKGKLGKKRPRSR DPV7b 86
RKKRRRESRRARRSPRHL DPV3/10 87
SRRARRSPRESGKKRKRKR DPV10/6 88
VKRGLKLRHVRPRVTRMDV DPV1047 89
VKRGLKLRHVRPRVTRDV DPV1048 90
SRRARRSPRHLGSG DPV10 91
LRRERQSRLRRERQSR DPV15 92
GAYDLRRRERQSRLRRRERQSR DPV15b 93
WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA 갈라 94
KGSWYSMRKMSMKIRPFFPQQ 피브리노겐 베타 사슬 95
KTRYYSMKKTTMKIIPFNRL 피브리노겐 감마 사슬 전구체 96
RGADYSLRAVRMKIRPLVTQ 피브리노겐 알파 사슬 97
LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP hCT(9-32) 98
TSPLNIHNGQKL HN-1 99
NSAAFEDLRVLS 인플루엔자 바이러스 핵단백질 (NLS) 100
WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA KALA 101
VPMLKPMLKE Ku70 102
KLALKLALKALKAALKLA MAP 103
GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV MPG 104
AAVALLPAVLLALLAP 인간 섬유아세포 성장 인자 4 (카포시 섬유아세포 성장 인자) 105
VQRKRQKLM N50 (NLS of NF-kB P50) 106
KETWWETWWTEWSQPKKKRKV Pep-1 107
SDLWEMMMVSLACQY Pep-7 108
RQIKIWFQNRRMKWKK Penetratin 109
GRQIKIWFQNRRMKWKK Penetratin 변이체 110
RRMKWKK 짧은 Penetratin 111
ERQIKIWFQNRRMKWKK Penetratin 42-58 112
RRRRRRR Poly 아르기닌 - R7 113
RRRRRRRRR Poly 아르기닌 - R9 114
RVIRVWFQNKRCKDKK pISL 115
MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP 프리온 마우스 PrPc1-28 116
LLIILRRRIRKQAHAHSK pVEC 117
LLIILRRRIRKQAHAH pVEC 변이체 118
VRLPPPVRLPPPVRLPPP SAP 119
PKKKRKV SV-40 (NLS) 120
RGGRLSYSRRRFSTSTGR SynB1 121
RRLSYSRRRF SynB3 122
AWSFRVSYRGISYRRSR SynB4 123
YGRKKRRQRRRPPQ Tat 47-60 124
YGRKKRRQRRR Tat 47-57 125
YGRKKRRQRR Tat 47-56 126
GRKKRRQRR Tat 48-56 127
GRKKRRQRRR Tat 48-57 128
RKKRRQRRR Tat 49-57 129
RKKRRQRR Tat 49-56 130
GRKKRRQRRRPPQ Tat 48-60 131
GRKKR Tat 48-52 132
CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQFSQTHQVSLSKQ Tat 37-72 133
FITKALGISYGRKKRRQRRRPQFSQTHQVSLSKQ Tat 38-72 134
YGRKKRRQRRRPP Tat 47-59 135
GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL 트랜스포르탄 136
AGYLLGKINLKALAALAKKIL 트랜스포르탄 10 137
GWTLNSAGYLLG 트랜스포르탄 유도체 138
INLKALAALAKKIL 트랜스포르탄 유도체 139
DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD VP22 140
DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD VT5 141
GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV 신호 서열-기반펩타이드 142
KLALKLALKALKAALKLA 양친매성모델 펩타이드 143
KFFKFFKFFK 박테리아 세포 벽
침투		 144
LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES LL- 37 145
SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR 세크로핀 P1 146
ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC 알파 데펜신 147
DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCCK 베타 데펜신 148
RKCRIWIRVCR Bactenecin 149
RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFPGKR PR- 39 150
ILPWKWPWWPWRR Indolicidin 151
GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV MPS 152
PVIRRVWFQNKRCKDKK pIs1 153
일부 예에서, PTD는 리신 또는 아르기닌을 또 다른 염기성 아미노산으로 대체함으로써, 예컨대 리신을 아르기닌으로 대체하거나 아르기닌을 리신으로 대체하여 변형될 수 있다.
E. 보체 매개 기능에 대한 u-PA 활성을 평가하거나 모니터하기 위한 검정
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질 C3에 대해 변경된 특이성 및/또는 선택성을 나타낸다. 예시적인 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질 C3을 특이적으로 절단함으로써 보체 활성화를 변경시킨다. 추가로, 본원에 제공된 예시적인 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 u-PA의 천연 기질, 예컨대 플라스미노겐의 절단 및 uPAR에 대한 결합에 대해 변경되거나 감소된 특이성 및/또는 선택성을 갖는다.
다양한 시험관 내 및 생체 내 검정을 사용하여 보체 단백질 C3을 절단하는 그의 능력 및 보체 활성화 및 보체 매개 질환 및 장애에 대한 그의 효과에 대해 u-PA 폴리펩타이드를 모니터링 또는 스크리닝할 수 있다. 이러한 검정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 당업자는 특정 u-PA 폴리펩타이드를 보체 단백질 C3의 절단에 대해 시험하고/하거나 프로테아제의 부재와 비교하여 보체 매개 활성에 대한 u-PA의 효과의 임의의 변화를 평가하기 위한 시험을 할 수 있다. 일부 이러한 검정은 본원에 예시되어 있다.
보체 단백질 C3의 기능에 대한 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 활성을 비교하기 위한 예시적인 시험관 내 및 생체 내 검정이 본원에 제공된다. 하기에 논의된 바와 같이, 보체 활성화를 측정하기 위한 검정과 같은 수많은 검정이 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 야생형 u-PA 활성, 예컨대 플라스미노겐의 절단 또는 PAR에 대한 결합에 대한 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 활성을 결정하기 위한 예시적인 검정이 본원에 제공된다. 보체 단백질 C3에 대한 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 특이성을 결정하기 위한 검정이 또한 제공된다. 예시적인 검정은 하기에 기재되어 있다.
1. 보체 단백질 C3의 기능에 대한 u-PA 활성을 평가하는 방법
변형된 u-PA 프로테아제는 임의의 하나 이상의 보체 단백질에 대한 특이성 및/또는 선택성의 변경을 나타낼 수 있고, 이에 의해 변형된 u-PA 프로테아제의 상응하는 전장, 스캐폴드 또는 야생형 형태와 비교하여, 예를 들어, C3과 같은 임의의 하나 이상 보체 단백질을 불활성화시킬 수 있다. 변형된 u-PA 프로테아제는 그의 프로테아제 활성을 보유하지만, 임의의 하나 이상의 보체 단백질에 대한 증가된 특이성 및/또는 선택성을 나타낼 수 있다. 예시적인 변형된 u-PA 프로테아제는 예를 들어, C3와 같은 임의의 하나 이상의 보체 단백질을 특이적으로 절단함으로써, 보체 단백질의 활성을 변경시킨다. 임의의 하나 이상의 보체 단백질에 대한 증가된 특이성 및/또는 선택성을 갖는 모든 이러한 변형된 u-PA 프로테아제는 후보 치료제이다.
변형된 u-PA 프로테아제가 임의의 하나 이상의 보체 단백질에 대한 증가된 특이성 및/또는 선택성을 나타내는 경우, 시험관 내 및 생체 내 검정을 사용하여 보체 매개 기능에 대한 효과에 대해 프로테아제를 모니터링 또는 스크리닝할 수 있다. 이러한 검정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 당업자는 예를 들어, C3와 같은 하나 이상의 보체 단백질의 절단에 대해 변형된 u-PA 프로테아제를 시험할 수 있고/있거나, 변형된 u-PA 프로테아제의 부재와 비교하여 보체 매개 활성에 대한 변형된 u-PA 단백질의 효과에서의 임의의 변화를 평가하기 위한 시험을 할 수 있다. 일부 이러한 검정은 본원에 예시되어 있다.
임의의 하나 이상의 표적화된 보체 단백질의 기능에 대한 변형된 u-PA 프로테아제의 활성의 비교를 위한 예시적인 시험관 내 및 생체 내 검정이 본원에 제공된다. 많은 검정은 다른 프로테아제 및 변형된 프로테아제에 적용가능하다. 상기 논의된 바와 같이, 보체의 활성에 대한 검정은 보체 활성화의 활성화 생성물, 예컨대 예를 들어 C5b-9 MAC 복합체, 및 보체 절단 생성물 중 임의의 하나 이상, 예컨대 C4a, C5a, C3b, 및 C3d의 생성을 측정하는 검정을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 보체 활성화를 측정하기 위한 검정은 또한 보체 경로의 특정 성분의 기능적 활성을 측정하는 기능적 검정, 예를 들어 고전적, 렉틴 또는 대안적인 경로 중 임의의 것의 활성화를 측정하기 위해 사용되는 용혈 검정을 포함한다. 보체 단백질 및/또는 보체 매개 기능에 대한 프로테아제 및 변형된 프로테아제의 효과를 평가하기 위한 검정은 SDS-분석 후 웨스턴 블랏 또는 쿠마시 브릴리언트 블루 염색, 효소 면역검정, 및 용혈 검정을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일 예에서, 시험관 내 검정은 정제된 보체 단백질을 사용하여 수행될 수 있다. 또 다른 예에서, 생체 내 검정은 보체의 기능적 활성화를 위해 포유동물 또는 인간 종을 포함한 종의 혈청을 시험함으로써 수행될 수 있다. 예시적인 검정은 하기에 기재되어 있다.
일 예에서, 시험관 내 검정은 실시예 2-4에 예시된 바와 같이 정제된 보체 단백질 C3을 사용하여 수행될 수 있다. 또 다른 예에서, 실시예 5에 예시된 바와 같이, 시험관 내 검정은 생리학상 관련 용액 (즉, 유리체액)에서 수행될 수 있다. 또 다른 예에서, 절단 특이성을 평가하기 위해 펩타이드 라이브러리를 사용하여 시험관 내 분석을 수행할 수 있다. 또 다른 예에서, 분석은 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 정상적인 기능, 즉, 정상적인 기질에 대한 활성을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 당업자에게 공지된 다양한 질환 모델을 사용하여 다양한 보체 매개 질환 및 장애에 대한 본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드의 효능을 시험할 수 있다.
a. 단백질 검출
단백질 검출은 샘플 내의 개별 보체 성분을 측정하는 수단이다. 보체 단백질은 보체 단백질 C3의 절단에 대한 u-PA 폴리펩타이드의 효과를 직접적으로 평가하기 위해 검출될 수 있거나, 대안적으로, 보체 단백질을 보체 활성화를 평가하기 위한 수단으로서 측정할 수 있다. u-PA 폴리펩타이드의 존재 또는 부재 하에 처리된 보체 단백질 C3은 SDS-PAGE 후 쿠마시 염색 또는 웨스턴 블랏, 효소 면역검정, 면역조직화학, 유동 세포측정법, 비탁법, 한천 겔 확산 또는 방사상 면역확산을 포함하는 임의의 하나 이상의 검정에 의해 분석될 수 있다. 단백질 검출을 위한 예시적인 검정은 하기에 기재되어 있다.
i. SDS-PAGE 분석
증가하는 농도의 u-PA 폴리펩타이드의 존재 또는 부재 하에서의 보체 단백질의 분석은 SDS-PAGE 상에서 단백질의 분석에 이어서 이들 단백질의 검출에 의해 수행될 수 있다. 이러한 예에서, 보체 단백질은 전체 단백질에 대한 염색, 예컨대 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색, 실버(Silver) 염색에 의해, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 방법에 의해 또는 명시된 단백질에 대해 특이적인 다중클론성 또는 단클론성 항체를 사용하는 웨스턴 블랏에 의해 검출될 수 있다. 전형적으로, 정제된 보체 단백질, 예를 들어, 보체 단백질 C3은 u-PA 폴리펩타이드의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션될 수 있다. 처리된 보체 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 분해한 후, 예를 들어 코마시 브릴리언트 블루로 염색함으로써 겔 중의 단백질을 검출하는 방법을 수행할 수 있다. 처리된 단백질을 그의 동족 전장 단백질과 비교할 수 있고, 단백질의 프로테아제 절단에 의해 형성된 분해 생성물을 결정할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 샘플, 예를 들어, 인간 혈청 또는 혈장은 u-PA 폴리펩타이드의 존재 또는 부재 하에 처리될 수 있거나, 또는 u-PA 폴리펩타이드를 갖거나 갖지 않는 동물 또는 인간의 처리 후에 수집될 수 있다. u-PA-처리된 샘플은 SDS-PAGE 상에서 분석될 수 있고, 특이적 보체 단백질, 예를 들어 C3, C5, 또는 인자 B는 단백질에 대한 단클론성 또는 다중클론성 항체를 사용하는 웨스턴 블랏에 의해 검출될 수 있다. 보체 단백질의 절단은 u-PA 폴리펩타이드로 처리되지 않은 샘플과 비교될 수 있다. 추가로, 샘플은, 예컨대 고전적 경로의 활성화를 자극하는 IgG와의 인큐베이션에 의해 또는 대안적인 경로의 활성을 자극하는 LPS에 의해, 보체 활성화를 개시하기 위해 자극될 수 있다. 샘플은 임의의 하나 이상의 천연 보체 단백질의 검출을 위해 SDS-PAGE에 의해 분해되어 u-PA 폴리펩타이드로 처리되지 않은 단백질의 샘플과 비교하여 명시된 단백질의 절단 생성물의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다. 이러한 예에서, 천연 보체 단백질의 절단 효과기 분자는 또한 하나 이상의 보체 경로의 활성화를 평가하기 위해 단클론성 및 다중클론성 항체를 사용하는 웨스턴 블랏에 의해 분석될 수 있다. 보체 효과기 분자의 예는 C3a, C3d, iC3b, Bb, 및 C5-b9를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, Bb 샘플에서의 감소된 발현은 u-PA 폴리펩타이드가 보체의 대안적인 경로의 활성화를 억제하였음을 나타낼 수 있다. 효과기 분자의 절단 생성물은 또한 보체 효과기 분자 자체의 절단에 대한 u-PA 폴리펩타이드의 증가하는 농도의 효과를 평가하기 위해 결정될 수 있다.
ii. 효소 면역검정
효소 면역검정 (EIA; 효소-결합 면역흡착 검정으로도 지칭됨; ELISA)은 샘플 중 단백질의 존재를 측정하는데 사용되는 검정이다. 전형적으로, 단백질의 측정은 그 자체가 검출가능한 기질, 예컨대 효소 또는 형광 화합물로 화학적으로 표지된 항체에 대한 단백질의 결합의 간접적 측정이다. EIA 검정은 보체 활성화 후 생성된 보체 효과기 분자의 존재를 측정함으로써 보체 활성화에 대한 u-PA 폴리펩타이드의 효과를 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 예를 들어 인간 혈청 또는 혈장과 같은 샘플은 증가하는 농도의 u-PA 폴리펩타이드의 존재 또는 부재 하에 전처리될 수 있고, 후속적으로 활성화되어 개시 분자와의 인큐베이션에 의해 보체 활성화를 유도할 수 있거나, 또는 동물 또는 인간을 u-PA 폴리펩타이드로 처리한 후에 수집될 수 있다. 예를 들어, 고전적 경로는 IgG와의 인큐베이션에 의해 활성화될 수 있고, 대안적인 경로는 샘플을 LPS와 함께 인큐베이션하는 것에 의해 활성화될 수 있다. 렉틴 경로에 특이적인 보체 활성화 검정은 렉틴 경로의 C4/C2 절단 활성이 고전적인 보체 경로와 공유되기 때문에 고전적 보체 경로가 억제되는 것을 필요로 한다. 고전적 경로의 억제는 면역 복합체에 대한 C1q의 결합을 억제하고 C1 복합체를 파괴하는 고 이온 강도 완충액을 사용하여 달성될 수 있는 반면, 고 이온 강도 완충액은 MBL의 탄수화물 결합 활성에 영향을 미치지 않는다. 결과적으로, 렉틴 경로의 활성화는 샘플, 예컨대 인간 혈청 또는 혈장을 1 M NaCl의 존재 하에 만난-코팅된 표면과 인큐베이션함으로써 유도될 수 있다.
활성화 후, 페파블록(Pefabloc) (Roche) 및 EDTA의 첨가로 샘플을 억제하여(quenched) 경로의 계속된 활성화를 최소화할 수 있다. 샘플은 EIA 또는 ELISA 검정에 의해 보체 효과기 분자의 존재에 대해 분석될 수 있다. 보체 단백질을 측정하기 위한 EIA 및 ELISA 검정은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 임의의 보체 활성화 생성물이 평가될 수 있다. 보체 활성화의 측정을 위한 예시적인 보체 활성화 생성물은 iC3b, Bb, C5b-9, C3a, C3a-desArg 및 C5a-deArg를 포함한다. 활성화된 보체 경로는 측정된 보체 활성화 생성물에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, Bb 절단 생성물의 측정은 대안적인 경로의 독특한 마커이다.
일부 예에서, EIA는 SDS-PAGE에 의한 프로테아제-처리된, 보체 자극 샘플의 분석에 이어서 특이적 보체 성분의 확인을 위한 웨스턴 블랏 분석에 의해 절단된 보체 단백질의 검출과 쌍을 이룰 수 있다. 밀도측정 소프트웨어를 사용하여, 보체 생성물의 절단을 검정 전반에 걸쳐 절단된 전장 보체 성분과 비교할 수 있고, 모든 주요 분해 생성물의 출현 및 절단 퍼센트를 결정할 수 있다.
iii. 방사성 면역확산(RID)
방사상 면역확산(RID)은 부어질 때 아가로스 겔에 혼입된 항체와 샘플 웰 주위의 원형 침강소 라인을 야기하는 시험 샘플에 존재하는 항원 사이에 형성된 면역 복합체의 침전에 의존하는 기술이다. 침강소 고리의 직경은 시험 샘플에 존재하는 항체(또는 항원)의 농도에 비례한다. 시험 표본 침강소 고리의 직경을 공지된 표준과 비교함으로써, 특이적 항체 또는 항원의 농도의 비교적 둔감한 추정이 달성될 수 있다. RID는 샘플 중 보체 단백질의 양을 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 혈청 또는 혈장과 같은 샘플은 증가하는 농도의 u-PA 폴리펩타이드의 존재 또는 부재하에 처리될 수 있다. 프로테아제-처리된 샘플은 C3, C5, C6, C7, C9, 또는 인자 B를 포함하나 이에 제한되지 않는 보체 단백질 중 임의의 것에 대한 다중클론성 또는 단클론성 항체를 혼입하도록 제조된 아가로스 겔의 웰에 첨가될 수 있다. 0.15 M NaCl에 노출시킴으로써 침전되지 않은 단백질을 제거한 후, 침전된 단백질 고리를 단백질 염료, 예를 들어 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant blue) 또는 크로울스(Crowles) 이중 염색에 의한 염색에 의해 평가할 수 있다.
b. 용혈 검정
기능적 용혈 검정은 전체로서 보체 기능에 대한 정보를 제공한다. 이러한 유형의 검정은 항체-감작 또는 비감작 양 적혈구를 사용한다. 용혈 검정은 고전적 경로 및 MAC의 양 RBC를 용해시키는 능력을 측정하는 총 용혈 보체 검정(CH50)을 포함한다. 이는 세포 항원-항체 복합체를 제조하기 위해 최적량의 토끼 항-양 적혈구 항체로 감작된 양 적혈구를 용해시키기 위한 고전적 경로 성분 (C1 내지 C9)의 순차적 활성화에 의존한다. 용혈 검정은 또한 대안적인 경로 CH50 검정 (토끼 CH50 또는 APCH50)을 포함할 수 있고, 이는 토끼 RBC를 용해시키는 대안적인 경로 및 MAC의 능력을 측정한다. 하나의 CH50 및/또는 APCH50 단위는 시험에서 적혈구의 50%를 용해시키는 데 필요한 혈청의 양 또는 희석으로서 정의된다. 전형적으로, 보체 활성화를 평가하기 위해, 샘플, 예를 들어, 인간 혈청 또는 인간 혈장은 증가하는 농도의 u-PA 폴리펩타이드의 존재 또는 부재 하에 처리될 수 있거나, 또는 동물 또는 인간의 치료 후 u-PA 폴리펩타이드의 부재 또는 존재 하에 수집될 수 있다. 프로테아제-처리된 샘플은 후속적으로 IgG로 활성화되거나 감작된 양의 적혈구와 혼합될 수 있다. 양 적혈구와 혼합된 물 단독 샘플은 분석된 샘플의 용해 퍼센트를 정확하게 평가하기 위해 총 용해 대조군으로서 작용할 수 있다. 샘플에 0.15M NaCl을 첨가하여 용해 반응을 중지시킬 수 있다. 보체 경로의 말단 성분의 활성화에 의해 유도된 적혈구의 용해는 헤모글로빈의 방출을 측정함으로써 평가될 수 있다. 측정은 415 nm의 OD에서 분광광도계를 사용하여 샘플의 광학 밀도 (OD) 판독에 의해 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 제한 희석 용혈 검정을 사용하여 어느 경로의 특정 성분의 기능적 활성을 측정할 수 있다. 이러한 검정에서, 과량의 모든 보체 성분을 갖지만, 샘플에서 측정되기에 결핍된 혈청 공급원이 사용되며, 즉, 배지 또는 혈청 공급원은 특이적 단백질에 대해 보체-고갈된다. 따라서, 용혈의 정도는 시험 샘플 중 측정된 성분의 존재에 의존한다. 이러한 검정에서, 정제된 보체 단백질, 예를 들어 C3을 포함하나 이에 제한되지는 않는 천연 보체 단백질 중 임의의 것은 증가하는 농도의 u-PA 폴리펩타이드의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션될 수 있다. 이어서, 프로테아제-처리된 정제된 보체 단백질을 보체-고갈 배지 또는 혈장 및 IgG-활성화 양 적혈구와 혼합할 수 있고, 샘플의 용혈을 상기 기재된 바와 같이 평가할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 프로테아제 절단은 프로테아제-처리된 샘플의 용혈 활성에 대해 검정하고, 이어서 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하고, 이어서 단백질 염색, 예컨대 예를 들어 쿠마시 블루로 염색함으로써 보체 활성화와 상관관계가 있을 수 있다. 프로테아제로 처리된 정제된 보체 단백질을 절단에 대해 평가할 수 있고, 검정 전반에 걸쳐 절단된 전장 보체 성분의 백분율 및 모든 주요 분해 생성물의 출현을 계산할 수 있다. 대안적으로, 프로테아제-처리된 보체 단백질의 분석은 웨스턴 블랏에 의한 것일 수 있다.
리포솜 면역검정 (LIA)으로 불리는 용혈 검정에 대한 대안이 고전적 경로의 활성화를 평가하기 위해 사용될 수 있다. LIA (Waco Chemicals USA, Richmond, VA)는 효소 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 함유하는 디니트로페닐 (DNP)-코팅된 리포솜을 이용한다. 혈청을 리포솜 및 항-DNP 항체, 글루코스-6-포스페이트, 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드를 함유하는 기질과 혼합할 때, 활성화된 리포솜이 용해되고, 총 고전적인 보체 활성에 비례하는 효소 비색 반응이 발생한다.
c. 절단 부위를 결정하는 방법
보체 단백질 C3에서의 절단 서열은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, 미국 공개 번호 US 2004/0146938). 일 예에서, 절단 서열은 보체 단백질 C3을 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것과 함께 인큐베이션함으로써 결정된다. u-PA 폴리펩타이드와의 인큐베이션 후, C3 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리될 수 있고, 분해 생성물은 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)와 같은 단백질 염료로 염색함으로써 확인될 수 있다. 단백질분해 단편은 절단 서열의 동일성을 결정하기 위해 서열분석될 수 있다. 확인 후, 원하는 표적 기질의 절단 서열에 기초하여 설계된 형광발생 펩타이드 기질을 사용하여 하기 기재된 바와 같이 활성을 평가할 수 있다.
2. 야생형 u-PA 활성의 평가 방법
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 플라스미노겐 및 uPAR에 대해 변경되거나 감소된 특이성을 갖는다. u-PA 폴리펩타이드는 천연 기질 플라스미노겐에 대한 촉매 효율 및/또는 기질 특이성을 보유하는지 여부를 결정하기 위해 시험될 수 있다. 예를 들어, 플라스미노겐의 절단은 u-PA 폴리펩타이드와 플라스미노겐의 인큐베이션 및 단백질 절단 생성물의 검출에 의해 평가될 수 있다. 또 다른 예에서, 플라스미노겐의 절단은 펩타이드 기질, 예를 들어 형광발생 기질, 예컨대 테트라펩타이드 기질에 연결된 형광단 ACC (7-아미노-4-카르바모일메틸쿠마린) 또는 AMC (7-아미노-4-메틸쿠매린)의 형광발생적으로 태그부착된 테트라펩타이드의 절단을 측정함으로써 시험관 내에서 결정될 수 있다. 일부 예에서, 플라스미노겐 활성화 검정은 본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드의 특이성을 결정하기 위해 사용된다. 다른 예에서, u-PA 수용체(uPAR)에 결합하는 본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드의 능력이 결정된다.
a. 플라스미노겐의 절단
일 예에서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 원하는 절단 서열에 상응하는 개별 형광발생 펩타이드 기질을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 원하는 절단 서열 중 임의의 하나 이상을 절단할 수 있는 변형된 u-PA 프로테아제에 대한 검정 방법은 (a) 프로테아제의 작용 시 형광원성 모이어티가 펩타이드 기질 서열로부터 방출되어 형광 모이어티를 생성하는 방식으로 펩타이드 형광원성 샘플 (원하는 표적 절단 서열을 함유함)을 프로테아제와 접촉시켜, 형광 모이어티를 생산하는 단계; 및 (b) 샘플이 형광에서 검출가능한 변화를 겪는지 여부를 관찰하는 단계를 포함하고, 검출가능한 변화는 샘플 중 효소적 활성 프로테아제의 존재의 지표이다. 이러한 예에서, 원하는 절단 서열은 당업계에 공지된 방법에 의해 형광발생 펩타이드로 만들어진다. 일 구현예에서, 개별 펩타이드 절단 서열은 형광표지된 기질, 예를 들어 ACC 또는 AMC 형광발생 이탈기에 부착될 수 있고, 형광발생 모이어티의 방출은 펩타이드 절단 서열에 대한 프로테아제의 특이성의 척도로서 결정될 수 있다. 표적 절단 서열의 형광 증가율은 예컨대 형광 분광광도계를 사용하여 측정될 수 있다. 형광의 증가 속도는 시간에 따라 측정될 수 있다. 미카엘리스-멘톤 반응속도 상수는 표준 동역학 방법에 의해 결정될 수 있다. 반응속도 상수 kcat, Km 및 kcat/Km은 기질 농도의 역수 대 기질 절단 속도의 역수를 그래프화하고, 라인위버-버크(Lineweaver-Burk) (1/속도=(Km/Vmax)(1/[S]) + 1/Vmax; 여기서 Vmax=[ET]kcat)에 피팅함으로써 계산될 수 있다. 2차 속도 상수 또는 특이성 상수 (kcat/Km)는 기질이 특정 프로테아제에 의해 얼마나 잘 절단되는지의 척도이다. 예를 들어, ACC- 또는 AMC- 테트라펩타이드, 예컨대 Ac-CPGR-AMC를 제조하고, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드와 함께 인큐베이션할 수 있고, u-PA 폴리펩타이드의 활성을 형광원성 모이어티의 방출을 검정함으로써 평가할 수 있다. 테트라펩타이드의 선택은 표적에 대한 목적하는 절단 서열에 따라 달라지며, 경험적으로 결정될 수 있다.
다른 구현예에서, u-PA 폴리펩타이드는 또한 활성 형태일 때, 전장 단백질과 관련하여 제공될 때 원하는 서열을 절단하는 것을 확인하기 위해 분석될 수 있다. 일 예에서, 정제된 표적 단백질, 즉 플라스미노겐은 선택된 u-PA 폴리펩타이드의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션될 수 있고, 절단 사건은 SDS-PAGE에 이어서 단백질에 대한 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 및 밀도측정법을 사용한 절단 생성물의 분석에 의해 모니터링될 수 있다.
b. 플라스미노겐 활성화 검정
당업자에게 공지된 임의의 검정을 사용하여 u-PA 폴리펩타이드가 플라스미노겐을 활성화시키는지를 결정할 수 있다. 일 예에서, 플라스미노겐의 활성화는, 예를 들어, 발색 기질 H-D-Val-Leu-Lys-p-니트로아날리드 (크로모게닉스 S-2251) 또는 형광발생 기질 H-D-Val-Leu-Lys-7-아미도-4-메틸쿠마린과 같은 검출가능한 플라스민 기질 및 플라스미노겐의 존재 하에 폴리펩타이드를 인큐베이션함으로써 결정될 수 있다. 이어서, 405 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 또는 390 nm의 여기 파장 및 480 nm의 방출 파장을 갖는 형광 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 검출함으로써 가수분해를 모니터링하였다. 또 다른 예에서, u-PA 폴리펩타이드가 uPAR에 결합되는 동안 플라스미노겐의 활성화가 평가된다. 이러한 예에서, u-PA 폴리펩타이드는 먼저 U397 세포와 같은 세포 표면 상의 uPAR에 결합한 후, 플라스미노겐 및 검출 가능한 플라스민 기질을 첨가하고, 가수분해를 상기 기재된 바와 같이 측정한다.
c. u-PA- uPAR 결합 검정
uPAR에 대한 u-PA 폴리펩타이드의 결합은 단백질-단백질 결합 상호작용을 검출하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 분석, 예를 들어 고체상 결합 분석, ELISA, 표면 플라즈몬 공명 및 FACS에 의해 평가할 수 있다. 일 예에서, ELISA가 사용될 수 있다. 재조합 uPAR을 미세적정 플레이트 상에 고정시키고, u-PA 폴리펩타이드 결합을, 예를 들어, u-PA 결합 항체와 같은 u-PA에 특이적으로 결합하는 시약의 첨가에 의해 평가한다. 또 다른 예에서, 결합은 u-PA 수용체를 발현하는 세포주, 예를 들어 U397 세포를 사용하는 세포 기반 검정에서 결정될 수 있다. u-PA 폴리펩타이드는 예를 들어, 결합의 검출을 수행하기 위해 발색, 형광 또는 방사성 기질로 표지될 수 있다.
d. C3 절단
다양한 농도의 변형된 uPA 프로테아제와 함께 인큐베이션한 후 남아 있는 온전한 인간 C3의 양을 측정함으로써 기질 보체 단백질 인간 C3의 절단에 의해 변경된 uPA 폴리펩타이드의 활성을 평가할 수 있다. 이 검정에 따르면, 신호는 온전한 인간 C3의 존재 하에 생성되고, C3이 절단됨에 따라 손실된다. 다른 예에서, 본원에 제공된 변형된 uPA 폴리펩타이드의 특이성을 결정하기 위해 C3 활성화 분석을 사용한다.
정제된 C3 단백질은 변형된 u-PA 폴리펩타이드와 함께 인큐베이션될 수 있고, 소화되지 않은 인간 C3의 잔류 수준은 단백질 농도를 평가하기 위해 당업계에 공지된 임의의 검정에 의해, 예를 들어 증폭된 발광 근접 동질 검정 스크린(AlphaScreen®; Perkin Elmer)을 사용하여 정량화될 수 있다. C3/uPA 폴리펩타이드 혼합물을 α-마우스 IgG-코팅된 수용체 비드와 함께 인큐베이션하고, 인큐베이션 후, α-hC3 mAb/수용체 비드 혼합물을 비오티닐화 α-hC3 pAb와 함께 인큐베이션한다. 스트렙타비딘-코팅된 공여자 비드를 혼합물에 첨가하고, 이어서 '알파스크린 신호 (여기 = 680 nm, 방출 = 570 nm)를 측정하였다. 이 신호는 남아있는 C3 단백질의 농도에 상응한다. 이용가능한 hC3의 50%를 절단하는데 필요한 uPA 폴리펩타이드의 농도(EC50)를 계산할 수 있다.
ACC - AGR + ELISA
변형된 u-PA 폴리펩타이드의 기질 특이성을 평가하는 방법이 본원에 제공된다. 형광발생성 펩타이드 기질, 예를 들어 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC) 형광생성 펩타이드 기질 또는 7-아미노-4-카르바모일메틸쿠말린(ACC) 형광생성 펩타이드 기질의 사용은 변형된 프로테아제의 활성을 검정하는데 사용될 수 있고, 이에 의해 형광생성 모이어티가 프로테아제의 작용 시 펩타이드 기질로부터 방출되고, 형광발생 모이어티의 방출은 펩타이드 절단 서열에 대한 프로테아제의 특이성의 척도로서 결정될 수 있다. 비-표적 기질 절단 서열 또는 표적 절단 서열의 형광 증가 속도는 예컨대 형광 분광광도계를 사용하여 측정될 수 있다. 형광의 증가 속도는 시간에 따라 측정될 수 있다. 미카엘리스-멘톤 반응속도 상수는 표준 동역학 방법에 의해 결정될 수 있다. 반응속도 상수 kcat, Km 및 kcat/Km은 기질 농도의 역수 대 기질 절단 속도의 역수를 그래프화하고, 라인위버-버크(Lineweaver-Burk) 방정식 ((1/속도=(Km/Vmax)(1/[S]) + 1/Vmax; 여기서 Vmax=[ET]kcat)에 피팅함으로써 계산될 수 있다. 특이성 상수(kcat/Km)는 기질이 특정 프로테아제에 의해 얼마나 잘 절단되는지를 측정하는 것이다.
일 예에서, 보체 단백질의 임의의 하나 이상의 절단 서열이 결정되고 원하는 표적 절단 서열로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 임의의 하나 이상의 C3 절단 서열. 또 다른 예에서, 야생형 프로테아제의 기질에 상응하는 서열을 사용하여 잔류 프로테아제 활성을 검정할 수 있다.
추가 구현예에서, 전장 보체 단백질은 프로테아제의 전장 천연 표적 기질과 비교하여 프로테아제 특이성에 대한 검정을 위한 표적 기질로서 사용될 수 있다. 추가로, 전장 보체 단백질을 사용하여 기질 특이성과 전장 표적 기질의 프로테아제에 의한 절단 대 표적 기질 내에 함유된 4개의 아미노산 P1-P4 기질 절단 서열 사이의 상관관계를 평가할 수 있다. 일 예에서, 전장 C3 단백질은 특이성을 평가하기 위해 임의의 하나 이상의 프로테아제의 원하는 절단 표적으로서 사용될 수 있다. 이 예에서, 변형된 프로테아제에 의한 C3의 절단은 또 다른 전장 기질의 절단과 비교될 수 있거나, 절단은 C3의 형광발생 테트라펩타이드 절단 서열과 비교될 수 있다. 프로테아제에 의한 전장 단백질의 절단의 특이성 상수는 프로테아제의 존재 하에 인큐베이션된 전장 표적 기질 밴드의 시간에 따른 밀도측정에서의 변화를 평가하기 위한 겔 밀도측정을 사용하여 결정될 수 있다.
추가 구현예에서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 활성은 사이노몰구스 혈장 또는 유리체액에서 연장된 인큐베이션 후에 평가될 수 있다. 일 예에서, 잔류 프로테아제 활성은 80% 사이노몰구스 유리체액에서의 인큐베이션 후에 형광원성 기질 AGR-ACC (7-아미노-4-카르바모일메틸-쿠마린)로 검정된다. 예를 들어, 서열번호: 21의 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 유리질 및 PBS에서 7일 인큐베이션 후 형광원성 기질 AGR-ACC를 절단하는 유사한 능력을 나타낸다. 또 다른 예에서, 서열번호: 21의 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 유리체액에서 7일 인큐베이션 전 및 후에 유사한 수준으로 형광원성 기질 AGR-ACC를 절단한다.
펩타이드 라이브러리를 사용한 특이성의 평가
형광발생 펩타이드에 커플링된 펩타이드 라이브러리를 사용하여 생성된 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 기질 특이성을 평가하는 방법이 본원에 제공된다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 형광원성 기질에 커플링된 펩타이드 라이브러리를 사용하여 임의의 주어진 하위 부위에서 P1-P4 기질 특이성에 대해 확인될 수 있다(Harris 등, (2000) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 97:7754; US 2004/0175777; US2004/0146938). 펩타이드 라이브러리 또는 펩타이드 라이브러리의 사용은 단백질분해 기질의 신속하고 용이한 결정을 가능하게 한다. 이러한 전략은 라이브러리 내의 하나의 위치가 일정하게 유지되는(즉, P1 위치) 펩타이드의 라이브러리의 사용을 수반하는 반면, 나머지 위치(즉 P4-P2 및/또는 P1' 및/또는 P2')는 라이브러리를 제조하기 위해 사용되는 아미노산의 모든 조합으로 구성된다. 조합 형광발생 펩타이드 기질 라이브러리, 예를 들어 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC) 형광생성 펩타이드 기질 또는 7-아미노-4카르바모일메틸쿠말린(ACC) 형광생성 펩타이드 기질의 사용은 변형된 프로테아제의 활성에 대해 검정하는데 사용될 수 있고, 이에 의해 형광발생 모이어티는 프로테아제의 작용 시 펩타이드 기질로부터 방출된다. 당업자는 이들 방법이 매우 다양한 대안적인 라이브러리 포맷을 제공한다는 것을 이해할 것이다. 일 예에서, 프로테아제는 P1-다양 라이브러리로 프로파일링될 수 있다. P1 다양한 테트라펩타이드 라이브러리는 ACC- 또는 AMC- 형광발생 테트라펩타이드를 함유하며, 이에 의해 P1 위치는 체계적으로 일정하게 유지되고, P2, P3 및 P4 위치는 15개 아미노산 중 임의의 하나 이상의 등몰 혼합물을 함유한다. 임의의 특정 효소 또는 기질 서열 특이성 결정 방법과 관련된 특정 제한의 결정 및 고려사항은 당업자의 능력 내에 있다.
당업자는 펩타이드를 제조하기 위한 많은 방법이 존재한다는 것을 인식한다. 예시적인 구현예에서, 기질 라이브러리는 형광발생적으로 태그부착된 기질을 고체 지지체에 부착시킴으로써 스크리닝된다. 일 예에서, 기질 펩타이드로부터의 형광발생성 이탈기는 N-Fmoc 쿠마린 유도체를 산-불안정성 링크(Rink) 링커에 축합시켜 ACC 수지를 제공함으로써 합성된다(Backes 등, (2000) Nat Biotechnol . 18:187). Fmoc-제거는 유리 아민을 생성한다. 천연, 비천연 및 변형된 아미노산은 아민에 커플링될 수 있고, 이는 추가의 아미노산의 커플링에 의해 정교화될 수 있다. 대안적 구현예에서, 형광발생성 이탈기는 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC)일 수 있다(Harris 등, (2000) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 97:7754). 펩타이드의 합성이 완료된 후, 펩타이드-형광원성 모이어티 접합체는 고체 지지체로부터 절단될 수 있거나, 또는 대안적으로, 접합체가 고체 지지체에 테더링된 상태로 유지될 수 있다.
전형적으로, 형광원성 펩타이드 또는 형광원성 펩타이드를 포함하는 물질을 제조하는 방법은 (a) 고체 지지체에 공유 결합된 형광원성 모이어티를 함유하는 제1 컨쥬게이트를 제공하는 단계; (b) 제1 컨쥬게이트를 제1 보호된 아미노산 모이어티 및 활성화제와 접촉시켜, 제1 컨쥬게이트의 아민 질소와 카복실 기 사이에 펩타이드 결합을 형성하는 단계; (c) 탈보호하여, 반응성 아민 모이어티를 갖는 제2 컨쥬게이트를 형성하는 단계; (d) 제2 컨쥬게이트를 제2 보호된 아미노산 및 활성화제와 접촉시켜, 카복실 기와 반응성 아민 모이어티 사이에 펩타이드 결합이 형성되는 단계, 및 (e) 탈보호하여, 반응성 아민 잔기를 갖는 제3 컨쥬게이트를 형성하는 단계를 포함한다. 예시적 구현예에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함한다: (f) 제3 컨쥬게이트를 제3 보호된 아미노산 및 활성화제와 접촉시켜, 카르복실기와 반응성 아민 모이어티 사이에 펩타이드 결합을 형성하는 단계; 및 (e) 탈보호하여, 반응성 아민 모이어티를 갖는 제4 컨쥬게이션을 형성하는 단계.
커플링하기 어려운 아미노산(예를 들어, Ile, Val 등)의 경우, 유리, 미반응 아민이 지지체 상에 잔류할 수 있고, 후속 합성 및 검정 작업을 복잡하게 할 수 있다. DMF 중 아세트산의 3-니트로트리아졸 활성 에스테르를 사용하는 특수 캡핑 단계는 잔류 아닐린을 효율적으로 아실화한다. 미정제된 기질 서열 용액에 존재할 수 있는 생성된 아세트산 캡핑된 쿠마린은 일반적으로 프로테아제 기질 서열이 아니다.
서열의 C-말단 아미노산이 불용성 지지체에 부착된 후 서열 내의 나머지 아미노산이 순차적으로 첨가되는 고체상 펩타이드 합성은 본원에 제공된 폴리펩타이드의 펩타이드 골격을 제조하는 예시적인 방법이다. 고체상 합성을 위한 기술은 Narany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp.3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2; Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Gross and Meienhofer, eds. Academic press, N.Y., (1980); 및 Stewart 등, (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, IL. 고체상 합성은 Fmoc 또는 t-BOC 화학을 이용하는 상업적으로 입수가능한 펩타이드 합성기로 가장 용이하게 달성된다.
예를 들어, 펩타이드 합성은 널리 공지된 Fmoc 합성 화학을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, Asp, Ser, Thr 및 Tyr의 측쇄는 t-부틸을 사용하여 보호되고, Cys 잔기의 측쇄는 S-트리틸 및 S-t-부틸티오를 사용하여 보호되며, Lys 잔기는 t-Boc, Fmoc 및 4-메틸트리틸을 사용하여 보호된다. 적절하게 보호된 아미노산 시약은 상업적으로 입수가능하거나, 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 다수의 보호기의 사용은 임의의 특정한 목적하는 측쇄에 대한 형광단의 선택적 탈차단 및 커플링을 허용한다. 따라서, 예를 들어, t-Boc 탈보호는 디클로로메탄 중 TFA를 사용하여 달성된다. Fmoc 탈보호는, 예를 들어 DMF 중 20% (v/v) 피페리딘 또는 N-메틸피롤리돈을 사용하여 달성하고, 4-메틸트리틸 탈보호는 예를 들어 물 중 1 내지 5% (부피/부피) TFA 또는 DCM 중 1% TFA 및 5% 트리이소프로필실란을 사용하여 달성한다. A-t-부틸티오 탈보호는, 예를 들어 수성 메르캅토에탄올 (10%)을 사용하여 달성된다. t-부틸, t-boc, 및 S-트리틸 기의 제거는, 예를 들어 TFA:페놀:물:티오-아니소:에탄디티오 (85:5:5:2.5:2.5), 또는 TFA:페놀:물 (95:5:5)을 사용하여 달성된다.
임의의 특정 위치 또는 위치의 조합에서의 다양성은 적어도 2, 6, 12, 20개 또는 그 이상의 아미노산의 혼합물을 사용하여 도입되어 펩타이드 사슬을 성장시킬 수 있다. 아미노산의 혼합물은 임의의 유용한 양의 하나 이상의 상이한 아미노산과 조합된 임의의 유용한 양의 특정 아미노산을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 혼합물은 아미노산의 등속성 혼합물 (모든 성분의 동등한 몰 반응성을 허용하는 적절한 비의 혼합물)이다. 변형된 프로테아제, 예를 들어 본원에 기재된 변형된 u-PA 프로테아제는 목적하는 절단 서열에 상응하는 개별 형광원성 펩타이드 기질을 사용하여 검정될 수 있다. C3 절단 서열 중 임의의 하나 이상을 절단할 수 있는 변형된 프로테아제에 대한 검정 방법은 (a) 프로테아제의 작용 시 형광원성 모이어티가 펩타이드 기질 서열로부터 방출되는 방식으로 펩타이드 형광원성 샘플 (C3 절단 서열을 함유함)을 프로테아제와 접촉시켜, 형광 모이어티를 생산하는 단계; 및 (b) 샘플이 형광에서 검출가능한 변화를 겪는지 여부를 관찰하는 단계를 포함하며, 검출가능한 변화는 샘플 중 효소적 활성 프로테아제의 존재의 지표이다. 이러한 예에서 ACC- 또는 AMC- 테트라펩타이드, 예컨대 Ac-AGR-AMC가 제조되고, 변형된 프로테아제와 함께 인큐베이션될 수 있고, 프로테아제의 활성은 형광원성 모이어티의 방출을 검정함으로써 평가될 수 있다.
용액 중 프로테아제에 대한 검정은 형광발생 프로테아제 지시제 펩타이드에 일정량의 프로테아제 원액을 첨가하고, 흡수 스펙트럼에서 형광의 후속 증가 또는 여기 밴드의 감소를 측정하는 것을 간단히 필요로 한다. 용액 및 형광원성 지시약은 또한 프로테아제의 활성을 최적화하는 "분해 완충액"에서 조합되고 검정될 수 있다. 프로테아제 활성을 검정하는데 적합한 완충액은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 완충액은 특정 프로테아제의 최적 pH에 상응하는 pH로 선택된다. 예를 들어, 엘라스타제 활성을 검정하는데 특히 적합한 완충액은 pH 8.9에서 50 mM 인산나트륨, 1 mM EDTA를 함유한다. 측정은 형광단에 대한 "여기" 광원을 제공한 다음 특정 파장에서 후속적으로 방출되는 광을 측정하는 장치인 형광계에서 가장 용이하게 이루어진다. 프로테아제가 결여된 대조군 지시약 용액과의 비교는 프로테아제 활성의 척도를 제공한다. 활성 수준은 공지된 활성의 프로테아제 용액에 의해 생성된 형광의 변화율이 측정되는 프로테아제/지시제 조합에 대한 표준 곡선을 생성함으로써 정확하게 정량화될 수 있다.
형광원성 화합물의 검출은 형광계를 사용하여 달성될 수 있지만, 검출은 또한 당업자에게 잘 알려진 다양한 다른 방법에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 예를 들어 형광단이 가시 파장에서 방출하는 경우, 검출은 단순히 광원에 의한 여기에 반응하여 형광을 육안 검사함으로써 이루어질 수 있다. 검출은 또한 디지타이저 또는 다른 영상 획득 시스템에 연결된 비디오 카메라를 이용하는 영상 분석 시스템에 의해 이루어질 수 있다. 검출은 또한 형광 현미경 하에서와 같이 필터를 통한 시각화에 의해 이루어질 수 있다. 현미경은 작업자에 의해 간단히 가시화되는 신호를 제공할 수 있다. 대안적으로, 신호는 사진 필름 상에 또는 비디오 분석 시스템을 사용하여 기록될 수 있다. 신호는 또한 이미지 분석 시스템 또는 광도계를 사용하여 실시간으로 간단히 정량화될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 샘플의 프로테아제 활성에 대한 염기성 검정은 샘플을 완충액 (검정되는 특정 프로테아제의 pH 최적치에서) 또는 시험 조건 (예를 들어, 유리체액 또는 혈청) 중에 현탁 또는 용해시키고, 완충액에 형광발생 프로테아제 펩타이드 지시제를 첨가하고, 생성된 형광 변화를 예를 들어 Harris 등, (1998) J Biol Chem 273:27364]에 제시된 바와 같이 분광형광계를 사용하여 모니터링하는 것을 포함한다. 분광형광계는 형광단의 여기 파장에서 형광단을 여기시키도록 설정된다. 형광발생 프로테아제 지표는 지표를 절단하는 프로테아제로 인해 형광이 변하는 프로테아제의 기질 서열이다.
변형된 프로테아제는 또한 전장 단백질과 관련하여 제공될 때 원하는 서열을 절단할 것임을 확인하기 위해 검정된다. C3 절단 부위를 함유하는 표적 기질 단백질은 C3 활성화 절단 또는 활성 부위에 존재한다. 표적 단백질의 절단을 평가하는 방법은 본원에 기재되어 있고/거나 당업계에 널리 공지되어 있다. 일 예에서, 정제된 보체 단백질, 예를 들어 C3은 변형된 프로테아제의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션될 수 있고, 절단 사건은 SDS-PAGE에 이어서 단백질에 대한 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색 및 밀도측정을 사용한 절단 생성물의 분석에 의해 모니터링될 수 있다. 표적 단백질의 활성은 또한 그의 기능이 절단 사건에 의해 파괴되었음을 확인하기 위해, 예를 들어 본원에 기재된 또는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 용혈 검정에서 검정된다.
3. 특이성
변형된 u-PA 폴리펩타이드에 의한 표적 기질, 예를 들어, 보체 단백질 C3 또는 플라스미노겐의 절단의 특이성 상수는 u-PA 폴리펩타이드의 존재 하에 인큐베이션된 전장 표적 기질의 시간에 따른 밀도측정에서의 변화를 평가하기 위해 겔 밀도측정법을 사용하여 결정될 수 있다. 구체적 구현예에서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 특이성의 비교는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 야생형 u-PA 폴리펩타이드에 비해 C3에 대해 변경된, 예를 들어 증가된 특이성을 나타내는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 표적 기질, 예를 들어 보체 단백질 C3에 대한 u-PA 폴리펩타이드의 특이성은 비-표적 기질 (예를 들어, u-PA의 천연 야생형 기질)과 비교하여 표적 기질의 절단의 특이성 상수로부터 결정될 수 있다. 표적 기질 C3 대 비-표적 기질, 예를 들어 플라스미노겐에 대한 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 특이성 상수의 비를 만들어 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 절단 효율의 비를 결정할 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드와 야생형 u-PA 폴리펩타이드 사이의 절단 효율의 비의 비교를 이용하여 표적 기질에 대한 특이성의 배수 변화를 평가할 수 있다. 특이성은 표적 기질 대 비-표적 기질에 대한 야생형 u-PA 폴리펩타이드의 특이성과 비교할 때 적어도 2배, 적어도 4배, 하나 이상의 5배, 6배, 7배, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000배 이상일 수 있다.
u-PA 폴리펩타이드의 천연 기질의 절단의 동역학 분석을 보체 단백질 C3에서 원하는 표적 기질의 절단 분석과 비교하여 보체 단백질 C3에 대한 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 특이성을 평가할 수 있다. 2차 저해 속도 상수(ki)는 보체 단백질 C3에 대한 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 효율 및 반응성을 모니터링하기 위해 평가될 수 있다. 본원의 목적을 위해, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 C3을 절단하여 보체 활성화가 억제되고, 실시예에 나타낸 바와 같이, 이들은 비변형 u-PA 폴리펩타이드 (또는 유리 시스테인을 제거하여 응집을 감소시키는, C122S 치환으로 변형된 u-PA 폴리펩타이드)보다 유의하게 더 큰 활성, 예컨대 적어도 5배 더 큰 활성을 갖는다. 예를 들어, 서열번호: 21의 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 5의 야생형 프로테아제 도메인에 대한 3380 nM과 비교하여 19 nM의 EC50으로 본원에 기재된 검정에서 인간 C3을 절단한다.
4. 질환 모델
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 매개 질환 또는 장애에 대한 이의 효과를 결정하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 임상적으로 관련된 질환 모델에서 사용될 수 있다. 예시적인 검정은 인간 소도세포(islet cell)를 사용한 시험관 내 검정 (Tjernberg 등 (2008) Transplantation 85:1193-1199) 및 돼지 신장을 이용한 생체 외 검정 (Fiane 등 (1999) Xenotransplantation 6:52-65)을 포함하는 이식; 시험관 내 인공 표면-유도된 염증을 포함하는 생체비혼화성(Lappegard 등 (2008) J Biomed Mater Res A 87:129-135; Lappegard 등 (2005) Ann Thorac Surg 79:917-923; Nilsson 등 (1998) Blood 92:1661-1667; Schmidt 등 (2003) J Biomed Mater Res A 66:491-499); 시험관 내 대장균(E. coli)-유도된 염증을 포함하는 염증(Mollnes 등 (2002) Blood 100:1867-1877) 및 개코원숭이에서의 헤파린/프로타민 복합체-유도된 염증(Soulika 등 (2000) Clin Immunol 96:212-221); 토끼 및 원숭이 및 설치류에서 연령 관련 황반 변성(Chi 등 (2010) Adv Exp Med Biol 703:127-135; Pennesi 등 (2012) Mol . Aspects Med . 33(4):487-509; Fletcher 등 (2014) Optm . Vis . Sci . 91(8):878-886; Forest 등, (2015) Disease Models and Mechanisms 8:421-427); 및 돼지에서의 지연된 이식 기능(Hanto 등, (2010) Am J Transplant 10(11):2421-2430) 및 개에서의 지연된 이식 기능(Petrinec 등, (1996) Surgery 61:1331-1337)을 비제한적으로 포함한다.
F. 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 생산 방법
본원에 기재된 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 폴리펩타이드는 단백질 정제 및 재조합 단백질 발현에 대해 당업계에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 화학적으로 합성될 수 있다. 절단된 형태를 포함하는 변형된 또는 변이체는 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 야생형 폴리펩타이드로부터 조작될 수 있다. 예를 들어, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 야생형 폴리펩타이드로부터, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발에 의해 조작될 수 있다.
1. u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 단리 또는 제조
폴리펩타이드는 핵산 분자의 클로닝 및 단리를 위해 당업계에 공지된 임의의 이용가능한 방법을 사용하여 클로닝 또는 단리될 수 있다. 이러한 방법은 핵산의 PCR 증폭 및 핵산 혼성화 스크리닝, 항체 기반 스크리닝 및 활성 기반 스크리닝을 포함하는 라이브러리의 스크리닝을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드가 재조합 수단에 의해 생산될 때, 원하는 유전자를 인코딩하는 핵산의 확인을 위한 당업자에게 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 당업계에서 이용가능한 임의의 방법을 사용하여, 예컨대 세포 또는 조직 공급원으로부터의 u-PA를 인코딩하는 전장 또는 부분 (즉, 전체 코딩 영역을 포괄함) cDNA 또는 게놈 DNA 클론을 수득할 수 있다.
예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 방법을 포함하는, 원하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 단리하기 위해 핵산의 증폭 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법의 예는 Perkin-Elmer Cetus thermal cycler 및 Taq 중합효소(Gene Amp)의 사용을 포함한다. 핵산 함유 물질은 목적하는 폴리펩타이드-인코딩 핵산 분자가 단리될 수 있는 출발 물질로서 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 mRNA 제제, 세포 추출물, 조직 추출물, 유체 샘플 (예를 들어, 혈액, 혈청, 타액), 및 건강한 및/또는 질환에 걸린 대상체로부터의 샘플이 증폭 방법에 사용될 수 있다. 공급원은 척추동물, 포유동물, 인간, 돼지, 소, 고양이, 조류, 말, 개 및 다른 영장류 공급원을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 진핵생물 종으로부터 유래될 수 있다. 핵산 라이브러리는 또한 출발 물질의 공급원으로서 사용될 수 있다. 프라이머는 원하는 폴리펩타이드를 증폭시키도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 원하는 폴리펩타이드가 생성되는 발현된 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 프라이머는 폴리펩타이드 아미노산 서열의 역-번역에 기초하여 설계될 수 있다. 원하는 경우, 축퇴성 프라이머를 증폭에 사용할 수 있다. 원하는 서열의 3' 및 5' 말단에서 서열에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 핵산 샘플로부터 PCR 서열에 의해 증폭시키기 위한 프라이머로서 사용될 수 있다. 프라이머는 전체 전장 u-PA, 또는 이의 절두된 서열, 예를 들어 본원에 제공된 가용성 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 증폭에 의해 생성된 핵산 분자는 서열분석될 수 있고, 원하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 것으로 확인될 수 있다.
합성 유전자를 벡터, 예를 들어, 단백질 발현 벡터 또는 코어 단백질 코딩 DNA 서열의 증폭을 위해 설계된 벡터 내로 클로닝하기 위해 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 링커 서열을 포함하는 추가의 뉴클레오타이드 서열이 폴리펩타이드-인코딩 핵산 분자에 연결될 수 있다. 또한, 기능적 DNA 요소를 특정하는 추가의 뉴클레오타이드 서열이 폴리펩타이드-인코딩 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 서열의 예는 세포내 단백질 발현을 촉진하도록 설계된 프로모터 서열, 및 단백질 분비를 촉진시키도록 설계된 분비 서열, 예를 들어 이종 신호 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 서열은 당업자에게 공지되어 있다. 추가의 뉴클레오타이드 잔기 서열, 예컨대 단백질 결합 영역을 특정하는 염기의 서열이 또한 효소-인코딩 핵산 분자에 연결될 수 있다. 이러한 영역은 특정 표적 세포 내로의 효소의 흡수를 용이하게 하거나, 또는 다르게는 합성 유전자의 생성물의 약동학을 변경시키는 단백질을 용이하게 하거나 인코딩하는 잔기의 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
태그 및/또는 다른 모이어티는, 예를 들어 폴리펩타이드의 검출 또는 친화성 정제를 보조하기 위해 첨가될 수 있다. 예를 들어, 에피토프 태그 또는 다른 검출가능한 마커를 특정하는 염기의 서열과 같은 추가의 뉴클레오타이드 잔기 서열이 또한 효소-인코딩 핵산 분자에 연결될 수 있다. 이러한 서열의 예는 SUMO 태그 또는 His 태그 또는 Flag 태그를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
이어서, 확인되고 단리된 핵산을 적절한 클로닝 벡터에 삽입할 수 있다. 당업계에 공지된 다수의 벡터-숙주 시스템이 사용될 수 있다. 가능한 벡터는 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지는 않지만, 벡터 시스템은 사용된 숙주 세포와 상용성이어야 한다. 이러한 벡터는 박테리오파지, 예컨대 람다 유도체, 또는 플라스미드, 예컨대 pCMV4, pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체 또는 블루스크립트 벡터 (Stratagene, La Jolla, CA)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 클로닝 벡터 내로의 삽입은, 예를 들어 DNA 단편을 상보성 응집 말단을 갖는 클로닝 벡터 내로 결찰시킴으로써 달성될 수 있다. 삽입은 TOPO 클로닝 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 수행할 수 있다.
DNA를 단편화하는데 사용되는 상보적 제한 부위가 클로닝 벡터에 존재하지 않는 경우, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, 원하는 임의의 부위는 DNA 말단에 뉴클레오타이드 서열(링커)을 결찰함으로써 생산될 수 있고; 이들 결찰된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 인코딩하는 화학적으로 합성된 특이적 올리고뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 대안적인 방법에서, 절단된 벡터 및 단백질 유전자는 동종중합체 테일링에 의해 변형될 수 있다.
재조합 분자는 예를 들어 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공 및 초음파천공을 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있어서, 유전자 서열의 많은 카피가 생성된다. 구체적 구현예에서, 단리된 단백질 유전자, cDNA 또는 합성된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 사용한 숙주 세포의 형질전환은 유전자의 다중 카피의 생성을 가능하게 한다. 따라서, 형질전환체를 성장시키고, 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자를 단리하고, 필요한 경우, 단리된 재조합 DNA로부터 삽입된 유전자를 회수함으로써 유전자를 대량으로 수득할 수 있다.
재조합 생산에 더하여, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 고체상 기술을 사용하여 직접 펩타이드 합성에 의해 생산될 수 있다(예를 들어, Stewart 등 (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc ., 85:2149-2154). 시험관 내 단백질 합성은 수동 기술을 사용하여 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은, 예를 들어 제조업체에 의해 제공된 지침에 따라 Applied Biosystems 431A 펩타이드 합성기 (Perkin Elmer, Foster City CA)를 사용하여 달성될 수 있다. 폴리펩타이드의 다양한 단편을 개별적으로 화학적으로 합성하고 화학적 방법을 사용하여 조합할 수 있다.
또한, 본원에서는 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 활성 또는 활성화된 또는 활성화가능한 형태, 예컨대, 2개의 사슬 활성화된 형태 및 이량체의 발현 방법이 제공된다. 본원에서 논의되고 기재되고, 실시예 14 내지 16에서 예시된 바와 같이, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 제조할 수 있다. 핵산은 분비 신호, 예컨대, 예를 들어, u-PA 신호 서열, IgG 카파 사슬 신호 서열 및 IL-2 신호 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 서열, (전장 u-PA를 생성하기 위한) u-PA 의 N-말단 부분, 활성화 서열, 예컨대 예를 들어 u-PA 활성화 서열 또는 퓨린 서열, 및 융합 파트너, 예컨대 알부민에 연결되어 u-PA의 특성, 예컨대 혈청 반감기를 변경시키고/거나, 발현을 증가시키고/거나 단리를 용이하게 하기 위한 His 태그 및/또는 SUMO와 같은 서열을 인코딩하는 핵산에 연결된 변형된 u-PA 프로테아제 도메인을 인코딩한다. 이들 핵산 분자는 변형된 u-PA 및/또는 융합 단백질의 생산을 위해 당업자에게 잘 알려진 적합한 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 일반적으로, 핵산은 분비 또는 정제를 위한 유전자좌로의 수송을 위한 신호 서열 또는 다른 수송 서열을 인코딩한다. 활성화 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 것을 사용하여 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 활성화된 형태를 생성할 수 있다.
2. 돌연변이체 또는 변형된 핵산의 생성 및 폴리펩타이드의 인코딩
본원에 제공된 변형은 당업자에게 통상적인 표준 재조합 DNA 기술에 의해 이루어질 수 있다. 표적 단백질에서 임의의 하나 이상의 아미노산의 돌연변이를 일으키기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 방법은 인코딩 핵산 분자의 표준 부위-지정 돌연변이유발 (예를 들어 키트, 예컨대 Stratagene으로부터 입수가능한 QuikChange를 사용함), 또는 고체상 폴리펩타이드 합성 방법을 포함한다.
3. 벡터 및 세포
원하는 단백질 중 하나 이상, 예컨대 본원에 기재된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것의 재조합 발현을 위해, 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 핵산을 적절한 발현 벡터, 즉 삽입된 단백질 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 함유하는 벡터 내로 삽입할 수 있다. 필요한 전사 및 번역 신호는 또한 효소 유전자에 대한 천연 프로모터, 및/또는 그의 측부 영역(flanking region)에 의해 공급될 수 있다.
효소를 인코딩하는 핵산을 함유하는 벡터가 또한 제공된다. 벡터를 함유하는 세포가 또한 제공된다. 세포는 진핵 및 원핵 세포를 포함하고, 벡터는 이에 사용하기에 임의의 적합하다. 일반적으로, 세포는 인코딩된 단백질의 글리코실화를 수행할 수 있는 세포이다.
벡터를 함유하는 원핵 및 진핵 세포가 제공된다. 이러한 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균 세포, 고세균, 식물 세포, 곤충 세포 및 동물 세포를 포함한다. 세포는, 인코딩된 단백질이 세포에 의해 발현되는 조건하에서 상기 세포를 증식시키고, 발현된 단백질을 회수함으로써, 그 단백질을 생산하는데 사용된다. 본원의 목적을 위해, 예를 들어, 효소는 배지 내로 분비될 수 있다.
숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 발현된 단백질을 원하는 방식으로 프로세싱하는 능력에 대해 선택될 수 있다. 폴리펩타이드의 이러한 변형은 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 번역후 프로세싱은 폴리펩타이드의 폴딩 및/또는 기능에 영향을 줄 수 있다. 상이한 숙주 세포, 예컨대 CHO (DG44, DXB11, CHO-K1), HeLa, MCDK, 293 및 WI38 (이에 제한되지는 않음)은 이러한 번역후 활성에 대한 특정한 세포 기구 및 특징적인 메카니즘을 갖고, 도입된 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하도록 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포의 선택은 N-연결된 글리코실화를 발현된 폴리펩타이드 내로 도입할 수 있는 것이다. 따라서, 벡터를 함유하는 진핵 세포가 제공된다. 진핵 세포의 예는 포유동물 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제가 결핍된 CHO 세포 (예를 들어, DG44 세포)를 사용하여 본원에 제공된 폴리펩타이드를 생산한다.
천연 또는 이종 신호 서열에 커플링된, 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드의 서열뿐만 아니라 그의 다수의 카피를 함유하는 벡터가 제공된다. 벡터는 세포에서 효소 단백질의 발현을 위해 또는 효소 단백질이 분비된 단백질로서 발현되도록 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 프로테아제 활성을 갖고 프로테아제 도메인의 전부 또는 일부, 또는 그의 다중 카피를 함유하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 벡터가 제공된다. 프로테아제 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드의 서열 및 전장 프로테아제 단백질까지 및 이를 포함하는 프로테아제 단백질의 추가의 부분뿐만 아니라 그의 다중 카피를 함유하는 벡터가 또한 제공된다. 벡터는 세포에서 스캐폴드 또는 변형된 프로테아제 단백질 또는 그의 프로테아제 도메인의 발현을 위해 또는 프로테아제 단백질이 분비된 단백질로서 발현되도록 선택될 수 있다. 프로테아제 도메인이 발현되는 경우, 핵산은 분비 신호, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애 α-교배성 인자 신호 서열 또는 그의 일부, 또는 천연 신호 서열을 인코딩하는 핵산에 연결된다.
다양한 숙주-벡터 시스템을 사용하여 단백질 코딩 서열을 발현시킬 수 있다. 이들은 바이러스 (예를 들어, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 다른 바이러스)로 감염된 포유동물 세포 시스템; 바이러스(예를 들면, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 미생물, 예컨대 효모 함유 효모 벡터; 또는 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 벡터의 발현 요소는 그의 강도 및 특이성이 다양하다. 사용된 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적합한 전사 및 번역 요소 중 임의의 것이 사용될 수 있다.
DNA 단편을 벡터 내로 삽입하기 위한 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 적절한 전사/번역 제어 신호 및 단백질 코딩 서열을 함유하는 키메라 유전자를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은 시험관 내 재조합 DNA 및 합성 기술 및 생체 내 재조합 (유전자 재조합)을 포함할 수 있다. 단백질, 또는 그의 도메인, 유도체, 단편 또는 상동체를 인코딩하는 핵산 서열의 발현은 유전자 또는 그의 단편이 재조합 DNA 분자(들)로 형질전환된 숙주에서 발현되도록 제2 핵산 서열에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 발현은 당업계에 공지된 임의의 프로모터/인핸서에 의해 제어될 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 원하는 단백질에 대한 유전자에 고유하지 않다. 사용될 수 있는 프로모터는 SV40 초기 프로모터 (Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복에 함유된 프로모터 (Yamamoto 등 Cell 22:787-797 (1980)), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터 (Wagner 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:1441-1445 (1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(Brinster 등, Nature 296:39-42 (1982)); 원핵생물 발현 벡터, 예컨대 β-락타마제 프로모터 (Jay 등, (1981) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:5543) 또는 tac 프로모터 (DeBoer 등, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 80:21-25 (1983); 또한 ["Useful Proteins from Recombinant Bacteria": in Scientific American 242:79-94 (1980) 참조); 노팔린 합성효소 프로모터 (Herrara-Estrella 등, Nature 303:209-213 (1984)) 또는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터를 함유하는 식물 발현 벡터 (Garder 등, Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), 및 광합성 효소 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제의 프로모터 (Herrera-Estrella 등, Nature 310:115-120 (1984)); 효모 및 다른 진균으로부터의 프로모터 요소, 예컨대 Gal4 프로모터, 알콜 데히드로게나제 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 프로모터, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내고 트랜스제닉 동물에 사용된 하기 동물 전사 제어 영역: 췌장 선방 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역 (Swift 등, Cell 38:639-646 (1984); Ornitz 등, Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역 (Hanahan 등, Nature 315:115-122 (1985)), 림프성 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역 (Grosschedl 등, Cell 38:647-658 (1984)); Adams 등, Nature 318:533-538 (1985); Alexander 등; Mol. Cell Biol . 7:1436-1444 (1987)), 고환, 유방, 림프 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역 (Leder 등, Cell 45:485-495 (1986), 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역(Pinckert 등, Genes and Devel . 1:268-276 (1987)), 간에서 활성인 알파-태아단백질 유전자 제어 영역 (Krumlauf 등, Mol . Cell. Biol . 5:1639-1648 (1985); Hammer 등, Science 235:53-58 (1987)), 간에서 활성인 알파-1 항트립신 유전자 제어 영역 (Kelsey 등, Genes and Devel . 1:161-171 (1987)), 골수 세포에서 활성인 베타 글로빈 유전자 제어 영역 (Magram 등, Nature 315:338-340 (1985); Kollias 등, Cell 46:89-94 (1986)), 뇌의 희소돌기아교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역 (Readhead 등, Cell 48:703-712 (1987), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역 (Shani,Nature 314:283-286 (1985)) 및 시상하부의 고나도트로프에서 활성인 생식선영양성 방출 호르몬 유전자 조절 영역 (Mason 등; Science 234:1372-1378 (1986)을 포함한다.
구체적 구현예에서, 원하는 단백질, 또는 그의 도메인, 단편, 유도체 또는 상동체를 인코딩하는 핵산, 하나 이상의 복제 기점, 및 선택적으로 하나 이상의 선택 마커 (예를 들어, 항생제 내성 유전자)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터가 사용된다. 발현 시스템에 따라, u-PA 서열의 효율적인 번역을 위해 특이적 개시 신호가 또한 요구된다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. u-PA 또는 이의 촉매 활성 단편의 개시 코돈 및 상류 서열이 적절한 발현 벡터 내로 삽입되는 경우, 추가의 번역 제어 신호는 필요하지 않다. 코딩 서열 또는 그의 일부만이 삽입되는 경우, ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 전사 제어 신호가 제공되어야 한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입체의 전사를 보장하기 위해 정확한 리딩 프레임에 있어야 한다. 외인성 전사 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 다양한 기원의 것일 수 있다. 발현 효율은 사용시 세포 시스템에 적절한 인핸서의 포함에 의해 증진될 수 있다(Scharf 등 (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bittner 등 (1987) Methods in Enzymol , 153:516-544).
대장균(E. coli) 세포의 형질전환을 위한 예시적인 플라스미드 벡터는, 예를 들어, pQE 발현 벡터 (Qiagen®; Valencia, CA로부터 입수가능함; 시스템을 기재하는 Qiagen®에 의해 공개된 문헌을 또한 참조함)를 포함한다. pQE 벡터는 파지 T5 프로모터(대장균 RNA 중합효소에 의해 인식됨) 및 이중 lac 오퍼레이터 억제 모듈을 가져, 대장균에서 재조합 단백질의 엄격하게 조절된 고수준 발현, 효율적인 번역을 위한 합성 리보솜 결합 부위(RBS II), 6XHis 태그 코딩 서열, t0 및 T1 전사 종결자, ColE1 복제 기점, 및 암피실린 내성을 부여하기 위한 베타-락타마제 유전자를 제공한다. pQE 벡터는 재조합 단백질의 N- 또는 C-말단에 6xHis 태그를 배치할 수 있다. 이러한 플라스미드는 모든 3개의 리딩 프레임에 대해 다중 클로닝 부위를 제공하고 N-말단 6xHis-태그부착된 단백질의 발현을 제공하는 pQE 32, pQE 30, 및 pQE 31을 포함한다. 대장균 세포의 형질전환을 위한 다른 예시적인 플라스미드 벡터는, 예를 들어, pET 발현 벡터를 포함한다(미국 특허 4,952,496 참조; Novagen®, Madison, WI로부터 입수가능; 또한 시스템을 기술하는 Novagen®에 의해 공개된 문헌 참조). 이러한 플라스미드는 T7lac 프로모터, T7 종결자, 유도성 대장균 lac 오퍼레이터, 및 lac 억제 유전자를 함유하는 pET 11a; T7 프로모터, T7 종결자, 및 대장균 ompT 분비 신호를 함유하는, pET 12a-c; 및 His 칼럼을 사용한 정제에 사용하기 위한 His-TagTM 리더 서열, 및 칼럼 상에서의 정제 후 절단을 허용하는 트롬빈 절단 부위, T7-lac 프로모터 영역 및 T7 종결자를 함유하는 PET 15b 및 pET19b (Novagen174;, Madison, WI)를 포함한다.
전형적으로, 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 생체 내 또는 시험관 내 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 발현에 사용되는 당업계에 공지된 다른 것일 수 있다. 예를 들어, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 포유동물 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현된다.
바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 백시니아 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 일부 예에서, 벡터는 결함이 있거나 약독화된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터이다(미국 특허 제4,980,286호 참조). 예를 들어, 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다(Miller 등, Meth . Enzymol . 217: 581-599 (1993)). 이들 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 패키징 및 숙주 세포 DNA 내로의 통합에 필요하지 않은 레트로바이러스 서열을 결실시키도록 변형되었다. 일부 예에서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 갖춘 바이러스는 그들의 복제 및 표적 조직 내에서의 확산을 용이하게 할 수 있다. 바이러스는 또한 바이러스가 조직 특이적 프로모터 하에서 선택적으로 복제하는 용해 바이러스 또는 비-용해 바이러스일 수 있다. 바이러스가 복제됨에 따라, u-PA 폴리펩타이드와 바이러스 유전자의 공동발현은 생체 내 바이러스의 확산을 용이하게 할 것이다.
4. 발현
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 생체 내 및 시험관 내 방법을 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 원하는 단백질은 예를 들어, 투여 및 치료에 필요한 것과 같은 단백질의 필요한 양 및 형태를 생성하기에 적합한 임의의 유기체에서 발현될 수 있다. 발현 숙주는 원핵 및 진핵 유기체, 예컨대 대장균(E. coli), 효모, 식물, 곤충 세포, 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포주 및 트랜스제닉 동물을 포함한다. 발현 숙주는 그의 단백질 생산 수준뿐만 아니라 발현된 단백질 상에 존재하는 번역후 변형의 유형에서 상이할 수 있다. 발현 숙주의 선택은 이들 및 다른 인자, 예컨대 조절 및 안전성 고려사항, 제조 비용 및 정제의 필요성 및 방법에 기초하여 이루어질 수 있다.
많은 발현 벡터가 이용가능하고 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있다. 발현 벡터의 선택은 숙주 발현 시스템의 선택에 의해 영향을 받을 것이다. 일반적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터 및 선택적으로 인핸서, 번역 신호, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함할 수 있다. 안정한 형질전환을 위해 사용되는 발현 벡터는 전형적으로 형질전환된 세포의 선택 및 유지를 허용하는 선택가능 마커를 갖는다. 일부 경우에, 복제 기점을 사용하여 벡터의 카피수를 증폭시킬 수 있다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 또한 단백질 융합체로 이용되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, 효소 융합체는 효소에 추가의 작용기를 부가하도록 생성될 수 있다. 효소 융합 단백질의 예는 신호 서열, 예컨대 국재화를 위한 태그, 예를 들어 his6 태그 또는 myc 태그, 또는 정제용 태그의 융합, 예컨대 GST 융합, 및 단백질 분비 및/또는 막 회합을 지시하는 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 본원에 기재된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 1 내지 6, 8 내지 44 및 52 내지 75 중 임의의 것에 기재된 프로테아제 도메인을 인코딩하는 핵산 분자 또는 서열번호: 1 내지 6, 8 내지 44 및 52 내지 75 중 임의의 것에 기재된 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열의 발현에 의해 생성된 것이다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 요구된다. 예를 들어, 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 안정하게 발현하는 세포주는 바이러스 복제 기원 또는 내인성 발현 요소 및 선택 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 형질전환될 수 있다. 벡터의 도입 후, 세포는 선택 배지로 전환되기 전에 영양강화 배지에서 1-2일 동안 성장할 수 있다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하는 것이고, 이의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수를 허용한다. 안정적으로 형질전환된 세포의 내성 세포는 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다.
임의의 수의 선택 시스템을 사용하여 형질전환된 세포주를 회수할 수 있다. 이들은 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(Wigler 등, (1977) Cell 11:223-232) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy I 등, (1980) Cell, 22:817-23) 유전자 (이는 각각 TK- 또는 APRT- 세포에서 사용될 수 있음)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 항대사물, 항생제 또는 제초제 저항성이 선택을 위한 기초로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 DHFR (Wigler M 등 (1980) Proc . Natl . Acad . Sci, 77:3567-70); 아미노글리코시드 네오마이신 및 G-418에 대한 내성을 부여하는 npt (Colbere-Garapin F 등 (1981) J. Mol . Biol., 150:1-14); 및 각각 클로르설푸론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제에 대한 내성을 부여하는 als 또는 pat가 사용될 수 있다. 추가의 선택 가능한 유전자가, 예를 들어, trpB (이는 세포가 티프토판 대신에 인돌을 이용할 수 있게 함), 또는 hisD (이들은 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용하게 함) (Hartman SC and RC Mulligan (1988) Proc . Natl . Acad . Sci, 85:8047-8051)로 기재되어 있다. 가시 마커, 예컨대, 비제한적으로, 안토시아닌, 베타 글루쿠로니다제 및 이의 기질, GUS, 및 루시퍼라제 및 이의 기질의 루시페린은 또한 형질전환체를 확인하고 또한 특정 벡터 시스템에 기인하는 일시적 또는 안정한 단백질 발현의 양을 정량화하는데 사용될 수 있다(Rhodes CA 등 (1995) Methods Mol . Biol . 55:121-131).
u-PA 폴리펩타이드의 존재 및 발현을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 기능적 폴리펩타이드의 검출은 적절한 조건 하에 히알루로니다제 효소 활성에 대해 조건화 배지를 시험함으로써 결정될 수 있다. 발현된 단백질의 용해도 및 활성을 평가하기 위한 예시적인 검정이 본원에 제공된다.
a. 원핵 세포
원핵생물, 특히 대장균(E. coli)은 다량의 단백질을 생산하기 위한 시스템을 제공한다. 대장균의 형질전환은 당업자에게 널리 공지된 간단하고 신속한 기술이다. 대장균에 대한 발현 벡터는 유도성 프로모터를 함유할 수 있고; 이러한 프로모터는 높은 수준의 단백질 발현을 유도하고 숙주 세포에 대해 일부 독성을 나타내는 단백질을 발현하는데 유용하다. 유도성 프로모터의 예는 lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7 및 SP6 RNA 프로모터 및 온도 조절된 λPL 프로모터를 포함한다.
본원에서 제공하는 것과 같은 단백질은 대장균의 세포질 환경에서 발현될 수 있다. 세포질은 환원 환경이며, 일부 분자의 경우, 이는 불용성 봉입체의 형성을 초래할 수 있다. 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 및 β-메르캅토에탄올 및 변성제, 예컨대 구아니딘-HCl 및 요소를 사용하여 단백질을 재용해시킬 수 있다. 대안적 접근법은 산화 환경 및 샤페로닌-유사 및 디설파이드 이소머라제를 제공하고 가용성 단백질의 생성을 초래할 수 있는 박테리아의 주변세포질 공간에서의 단백질의 발현이다. 전형적으로, 리더 서열은 단백질을 주변세포질로 유도하는 발현될 단백질에 융합된다. 이어서, 리더는 주변세포질 내부의 신호 펩티다아제에 의해 제거된다. 주변세포질-표적화 리더 서열의 예는 펙테이트 리아제 유전자로부터의 pelB 리더 및 알칼리성 포스파타제 유전자로부터 유래된 리더를 포함한다. 일부 경우에, 주변세포질 발현은 발현된 단백질의 배양 배지 내로의 누출을 허용한다. 단백질의 분비는 배양 상청액으로부터 신속하고 간단한 정제를 가능하게 한다. 분비되지 않는 단백질은 삼투압 용해에 의해 주변세포질로부터 수득될 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 일부 경우에 단백질은 불용성이 될 수 있고, 변성제 및 환원제는 가용화 및 리폴딩을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 유도 및 성장 온도는 또한 발현 수준 및 용해도에 영향을 미칠 수 있고, 전형적으로 25℃ 내지 37℃의 온도가 사용된다. 전형적으로, 박테리아는 비글리코실화된 단백질을 생산한다. 따라서, 단백질이 기능을 위해 글리코실화를 필요로 하는 경우, 글리코실화는 숙주 세포로부터의 정제 후에 시험관 내에서 첨가될 수 있다.
b. 효모 세포
효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비사에 ( Saccharomyces cerevisae ), 스키조사카로미세스 폼베 ( Schizosacchacromyce pombe ), 야로위아 리폴리티카 ( Yarrowia lipolytica), 클루이베로미세스 락티스 ( Kluyveromyces lactis ) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 본원에 기재된 바와 같은 단백질의 생산에 사용될 수 있는 널리 공지된 효모 발현 숙주이다. 효모는 에피솜 복제 벡터로 또는 상동성 재조합에 의한 안정한 염색체 통합에 의해 형질전환될 수 있다. 전형적으로, 유도성 프로모터는 유전자 발현을 조절하기 위해 사용된다. 이러한 프로모터의 예는 GAL1, GAL7 및 GAL5 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 CUP1, AOX1 또는 다른 피키아 또는 다른 효모 프로모터를 포함한다. 발현 벡터는 종종 형질전환된 DNA의 선택 및 유지를 위해 LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3과 같은 선택 마커를 포함한다. 효모에서 발현되는 단백질은 종종 가용성이다. Bip 및 단백질 디설파이드 이소머라제와 같은 샤페로닌과의 공동-발현은 발현 수준 및 용해도를 개선시킬 수 있다. 추가로, 효모에서 발현된 단백질은 분비 신호 펩타이드 융합체, 예컨대 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisae)로부터의 효모 교배형 알파-인자 분비 신호 및 효모 세포 표면 단백질, 예컨대 Aga2p 교배 부착 수용체 또는 악술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans) 글루코아밀라제와의 융합체를 사용하여 분비에 대해 유도될 수 있다. Kex-2 프로테아제와 같은 프로테아제 절단 부위는 이들이 분비 경로를 빠져나갈 때 발현된 폴리펩타이드로부터 융합된 서열을 제거하도록 조작될 수 있다. 효모는 또한 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 글리코실화가 가능하다.
c. 곤충 및 곤충 세포
특히 바큘로바이러스 발현을 이용하는 곤충 세포는 폴리펩타이드, 예컨대 u-PA 폴리펩타이드를 발현시키는데 유용하다. 곤충 세포는 높은 수준의 단백질을 발현하고, 고등 진핵생물에 의해 사용되는 대부분의 번역후 변형이 가능하다. 바큘로바이러스는 안전성을 개선시키고 진핵 발현의 조절 문제를 감소시키는 제한된 숙주 범위를 갖는다. 전형적인 발현 벡터는 높은 수준의 발현을 위한 프로모터, 예컨대 바큘로바이러스의 폴리헤드린 프로모터를 사용한다. 통상적으로 사용되는 바큘로바이러스 시스템에는 바쿨로바이러스, 예컨대 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica ) 핵 다각체병 바이러스 (AcNPV), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori ) 핵 다각체병 바이러스 (BmNPV); 및 곤충 세포주, 예컨대 스포도프테라 프루기페르다 ( Spodoptera frugiperda), 슈달레티아 운이푼크타(Pseudaletia unipuncta ) (A7S) 및 다나우스 플렉시푸스 ( Danaus plexippus) (DpN1)로부터 유래된 Sf9가 포함된다. 고수준 발현을 위해, 발현될 분자의 뉴클레오타이드 서열은 바이러스의 폴리헤드린 개시 코돈의 바로 하류에 융합된다. 포유동물 분비 신호는 곤충 세포에서 정확하게 프로세싱되고, 발현된 단백질을 배양 배지 내로 분비하는데 사용될 수 있다. 세포주 슈달레티아 운디펑크타(Pseudaletia undipuncta ) (A7S) 및 다나우스 플렉시푸스 ( Danaus plexippus) (DpN1)는 포유동물 세포 시스템과 유사한 글리코실화 패턴을 갖는 단백질을 생산한다. 예시적인 곤충 세포는 "포유동물화" 바큘로바이러스 발현 벡터를 갖는 것들 및 효소 FT3이 결여된 것들을 포함하여 면역원성을 감소시키도록 변경된 것들이다.
곤충 세포에서의 대안적인 발현 시스템은 안정하게 형질전환된 세포의 사용이다. Schnieder 2 (S2) 및 Kc 세포 도로소필라 멜라노가스터 ( Drosophila melanogaster) 및 C7 세포 아에데스 알보픽투스 ( Aedes albopictus ) 와 같은 세포주가 발현을 위해 사용될 수 있다. 도로소필라 메탈로티오네인 프로모터는 카드뮴 또는 구리에 의한 중금속 유도의 존재 하에 높은 수준의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 네오마이신 및 하이그로마이신과 같은 선택 마커의 사용에 의해 유지된다.
d. 포유동물 발현
포유동물 발현 시스템은 u-PA 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. 발현 작제물은 바이러스 감염, 예컨대 아데노바이러스에 의해 또는 직접 DNA 전달, 예컨대 리포솜, 인산칼슘, DEAE-덱스트란에 의해 및 물리적 수단, 예컨대 전기천공 및 미세주입에 의해 포유동물 세포로 전달될 수 있다. 포유동물 세포에 대한 발현 벡터는 전형적으로 mRNA 캡 부위, TATA 박스, 번역 개시 서열(코작 공통 서열) 및 폴리아데닐화 요소를 포함한다. IRES 요소는 또한 또 다른 유전자, 예컨대 선택가능 마커와의 바이시스트로닉 발현을 허용하기 위해 첨가될 수 있다. 이러한 벡터는 종종 고수준 발현을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예를 들어 SV40 프로모터-인핸서(enhancer), 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 라우스 육종 바이러스(RSV)의 긴 말단 반복부를 포함한다. 이들 프로모터-인핸서는 많은 세포 유형에서 활성이다. 조직 및 세포 유형 프로모터 및 인핸서 영역이 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 예시적인 프로모터/인핸서 영역은 유전자, 예컨대 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유방 종양 바이러스, 알부민, 알파 태아단백질, 알파 1 항트립신, 베타 글로빈, 미엘린 염기성 단백질, 미오신 경쇄 2, 및 생식선자극 방출 호르몬 유전자 대조군으로부터의 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 선별가능한 마커를 사용하여 발현 작제물을 갖는 세포를 선별하고 유지할 수 있다. 선택가능 마커 유전자의 예는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 데아미나제, 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아미노글리코시드 포스포트랜스페라제, 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 티미딘 키나제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 발현은 메토트렉세이트의 존재 하에 수행되어 DHFR 유전자를 발현하는 세포만을 선택할 수 있다. TCR-ζ 및 FcεRI-γ와 같은 세포 표면 신호전달 분자와의 융합은 세포 표면 상의 활성 상태에서 단백질의 발현을 지시할 수 있다.
마우스, 랫트 인간, 원숭이, 닭 및 햄스터 세포를 포함하는 많은 세포주가 포유동물 발현에 이용가능하다. 예시적인 세포주는 CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0 (비분비) 및 다른 골수종 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유모세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, 및 HKB 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 세포주는 또한 세포 배양 배지로부터 분비된 단백질의 정제를 용이하게 하는 무혈청 배지에 적합화되어 이용가능하다. 예는 CHO-S 세포 (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat # 11619-012) 및 무혈청 EBNA-1 세포주 (Pham 등, (2003) Biotechnol . Bioeng . 84:332-42.)를 포함한다. 최대 발현을 위해 최적화된 특별한 배지에서 성장하도록 적합화된 세포주가 또한 이용가능하다. 예를 들어, DG44 CHO 세포는 화학적으로 정의된 동물 산물이 없는 배지에서 현탁 배양으로 성장하도록 적합화된다.
e. 식물
트랜스제닉 식물 세포 및 식물을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 단백질을 발현시킬 수 있다. 발현 작제물은 전형적으로 직접적인 DNA 전달, 예컨대 미세발사체 충격 및 원형질체로의 PEG 매개된 전달을 사용하고 아그로박테리움 매개 형질전환을 이용하여 식물로 전달된다. 발현 벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사 종결 요소 및 번역 제어 요소를 포함할 수 있다. 발현 벡터 및 형질전환 기술은 통상적으로 쌍떡잎 숙주, 예컨대 아라비돕시스 및 담배, 및 외떡잎 숙주, 예컨대 옥수수 및 벼로 나누어진다. 발현에 사용되는 식물 프로모터의 예는 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터, 노팔린 신타아제 프로모터, 리보스 비스포스페이트 카르복실라아제 프로모터 및 유비퀴틴 및 UBQ3 프로모터를 포함한다. 하이그로마이신, 포스포만노스 이소머라제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제와 같은 선별가능한 마커는 종종 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 용이하게 하는데 사용된다. 형질전환된 식물 세포는 세포, 응집체(캘러스 조직)로서 배양물에서 유지되거나 전체 식물로 재생될 수 있다. 트랜스제닉 식물 세포는 또한 히알루로니다제 폴리펩타이드를 생산하도록 조작된 조류를 포함할 수 있다. 식물은 포유동물 세포와 상이한 글리코실화 패턴을 갖기 때문에, 이는 이들 숙주에서 생산된 단백질의 선택에 영향을 미칠 수 있다.
5. 정제
변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포 배양물로부터 인코딩된 단백질의 발현 및 회수에 적합한 조건 하에 배양될 수 있다. 재조합 세포에 의해 생산된 단백질은 일반적으로 분비되지만, 사용되는 서열 및/또는 벡터에 따라 세포내에 함유될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, u-PA를 인코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 세포막을 통한 u-PA의 직접 분비를 용이하게 하는 신호 서열을 갖도록 설계될 수 있다.
따라서, 숙주 세포로부터 폴리펩타이드를 정제하는 방법은 선택된 숙주 세포 및 발현 시스템에 의존한다. 분비된 분자의 경우, 단백질은 일반적으로 세포를 제거한 후 배양 배지로부터 정제된다. 세포내 발현을 위해, 세포를 용해시키고, 단백질을 추출물로부터 정제할 수 있다. 트랜스제닉 식물 및 동물과 같은 트랜스제닉 유기체를 발현에 사용하는 경우, 조직 또는 기관을 출발 물질로서 사용하여 용해된 세포 추출물을 제조할 수 있다. 추가로, 트랜스제닉 동물 생산은 모유 또는 알에서 폴리펩타이드를 생산하는 것을 포함할 수 있으며, 이는 수집될 수 있고, 필요한 경우, 단백질은 당업계의 표준 방법을 사용하여 추출되고 추가로 정제될 수 있다.
단백질, 예컨대 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 SDS-PAGE, 크기 분별 및 크기 배제 크로마토그래피, 황산암모늄 침전 및 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대 음이온 교환을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 또한, 친화성 정제 기술을 이용하여 제제의 효율 및 순도를 개선시킬 수 있다. 예를 들어, u-PA 단백질에 결합하는 항체, 수용체 및 다른 분자는 친화성 정제에 사용될 수 있다.
발현 작제물은 또한 소형 유비퀴틴-유사 개질제(SUMO) 태그, myc 에피토프, GST 융합 또는 His6와 같은 단백질에 친화성 태그를 부가하도록 조작될 수 있고, 각각 SUMO 또는 myc 항체, 글루타티온 수지 및 Ni-수지로 친화성 정제될 수 있다. 이러한 태그는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 u-PA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있으며, 이는 가용성 단백질의 정제를 용이하게 한다. 예를 들어, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 단백질 정제를 용이하게 하기 위해 첨가된 하나 이상의 추가의 폴리펩타이드 도메인을 갖는 재조합 단백질로서 발현될 수 있다. 이러한 정제 촉진 도메인은 금속 킬레이팅 펩타이드, 예컨대 고정화된 금속 상에서의 정제를 가능하게 하는 히스티딘-트립토판 모듈, 고정화된 면역글로불린 상에서의 정제가 가능하게 하는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 연장/친화성 정제 시스템 (Immunex Corp., Seattle Wash.)에서 이용되는 도메인을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 정제 도메인과 발현된 u-PA 폴리펩타이드 사이에 절단가능한 링커 서열, 예컨대 인자 XA 또는 엔테로키나제(Invitrogen®, San Diego, CA)의 포함은 정제를 용이하게 하는데 유용하다. 하나의 이러한 발현 벡터는 엔테로키나제 절단 부위에서 u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 융합 단백질의 발현을 제공한다. 소형 유비퀴틴 유사 개질제(SUMO) 태그는 IMIAC(고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피) 상에서의 정제를 용이하게 하는 반면, 엔테로키나제 절단 부위는 융합 단백질로부터 폴리펩타이드를 정제하는 수단을 제공한다.
순도는 겔 전기영동, 직교 HPLC 방법, 염색 및 분광광도 기술을 비롯한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 발현되고 정제된 단백질은 당업자에게 공지된 임의의 검정 또는 방법, 예를 들어 섹션 3에 기재된 임의의 것을 사용하여 분석될 수 있다. 이들은 겔 전기영동에 의한 분석, 면역검정 및 u-PA 활성의 검정을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 단백질의 물리적 및/또는 기능적 특성에 기초한 검정을 포함한다.
6. 추가 변형
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 약동학적 및 약리학적 특성을 개선 또는 변경시키도록 변형될 수 있다. 특히, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 면역성 면역을 감소시키고/시키거나 혈청 및 유리체액(vitreous humor)을 포함하는 다른 체액에서 반감기를 증가시키기 위해 PEG 모이어티 또는 덱스트란 또는 시알릴화와 같은 중합체에 접합될 수 있다.
a. 페길화
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 생체물질, 생명공학 및 의학에서 주로 사용되는데, 그 이유는 PEG가 전형적으로 비면역원성인 생체적합성, 비독성, 수용성 중합체이기 때문이다(Zhao and Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997). 약물 전달 분야에서, PEG 유도체는 혈청 반감기를 증가시키고 용해도를 향상시키기 위해 면역원성, 단백질분해 및 신장 제거를 감소시키기 위한 단백질에 대한 공유 부착 (즉, 단백질에 대한 "페길화")에 널리 사용되어 왔다(Zalipsky, Adv . Drug Del . Rev. 16:157-82, 1995). 유사하게, PEG는 낮은 분자량의 비교적 소수성인 약물에 부착되어 용해도를 향상시키고, 독성을 감소시키고, 생체분포를 변경시켰다. 전형적으로, 페길화 약물은 용액으로서 주사된다.
관련된 적용은 약물 전달에 사용하기 위한 가교된 분해성 PEG 네트워크 또는 제제의 합성인데, 이는 분해성 가용성 약물 담체의 설계에 사용되는 많은 동일한 화학이 분해성 겔의 설계에도 사용될 수 있기 때문이다(Sawhney 등, Macromolecules 26: 581-87, 1993). 또한, 거대분자간 복합체는 2개의 상보적 중합체의 용액을 혼합함으로써 형성될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 이러한 복합체는 일반적으로 관련된 중합체 사이의 정전기적 상호작용 (폴리음이온-폴리양이온) 및/또는 수소 결합 (폴리산-폴리염기)에 의해, 및/또는 수성 주변에서 중합체 사이의 소수성 상호작용에 의해 안정화된다(Krupers 등, Eur . Polym J. 32:785-790, 1996). 예를 들어, 적절한 조건 하에서 폴리아크릴산(PAAc) 및 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)의 혼합 용액은 대부분 수소 결합에 기초한 복합체의 형성을 초래한다. 생리학적 조건에서 이들 복합체의 해리는 유리 약물의 전달을 위해 사용되었다 (즉, 비-페길화). 상보적 중합체의 복합체는 단독중합체 및 공중합체로부터 형성되었다.
페길화를 위한 다수의 시약이 PEG 모이어티 (페길화된) 치료 단백질로서 공지되어 있다. 그와 같은 시약은 폴리펩타이드와 하기와의 반응을 비제한적으로 포함한다: N-하이드록시석신이미딜 (NHS) 활성화된 PEG, 석신이미딜 mPEG, mPEG2-N-하이드록시석신이미드, mPEG 석신이미딜 알파-메틸부타노에이트, mPEG 석신이미딜 프로피오네이트, mPEG 석신이미딜 부타노에이트, mPEG 카복시메틸 3-하이드록시부탄산 석신이미딜 에스테르, 동종이중작용성 PEG-석신이미딜 프로피오네이트, 동종이중작용성 PEG 프로피온알데하이드, 동종이중작용성 PEG 부티르알데하이드, PEG 말레이미드, PEG 하이드라자이드, p-니트로페닐-카보네이트 PEG, mPEG-벤조트리아졸 카보네이트, 프로피온알데하이드 PEG, mPEG 부티르알데하이드, 분지형 mPEG2 부티르알데하이드, mPEG 아세틸, mPEG 피페리돈, mPEG 메틸케톤, mPEG "무링커" 말레이미드, mPEG 비닐 설폰, mPEG 티올, mPEG 오르토피리딜티오에스테르, mPEG 오르토피리딜 디설파이드, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, 비닐설폰 PEG-NHS, 아크릴레이트 PEG-NHS, 플루오레세인 PEG-NHS, 및 바이오틴 PEG-NHS(예를 들어, Monfardini 등, Bioconjugate Chem . 6:62-69, 1995; Veronese 등, J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; U.S. 5,672,662; U.S. 5,932,462; U.S. 6,495,659; U.S. 6,737,505; U.S. 4,002,531; U.S. 4,179,337; U.S. 5,122,614; U.S. 5,324, 844; U.S. 5,446,090; U.S. 5,612,460; U.S. 5,643,575; U.S. 5,766,581; U.S. 5,795, 569; U.S. 5,808,096; U.S. 5,900,461; U.S. 5,919,455; U.S. 5,985,263; U.S. 5,990,237; U.S. 6,113,906; U.S. 6,214,966; U.S. 6,258,351; U.S. 6,340,742; U.S. 6,413,507; U.S. 6,420,339; U.S. 6,437,025; U.S. 6,448,369; U.S. 6,461,802; U.S. 6,828,401; U.S. 6,858,736; U.S. 2001/0021763; U.S. 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S. 2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U.S. 2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; WO0500360; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 01064951; EP 0822199; WO 00176640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; 및 WO 0187925를 참조한다).
일 예에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 3 kD 내지 약 50 kD, 전형적으로 약 5 kD 또는 약 30 kD 범위의 분자량을 갖는다. 약물에 대한 PEG의 공유 부착("페길화"로 공지됨)은 공지된 화학적 합성 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 페길화는 NHS-활성화된 PEG를 적합한 반응 조건 하에 단백질과 반응시킴으로써 달성될 수 있다.
페길화를 위한 수많은 반응이 기재되어 있지만, 가장 일반적으로 적용가능한 것은 방향성을 부여하고, 온화한 반응 조건을 사용하며, 독성 촉매 또는 부산물을 제거하기 위한 광범위한 하류 공정을 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 모노메톡시 PEG (mPEG)는 단지 하나의 반응성 말단 히드록실을 가지며, 따라서 그의 사용은 생성된 PEG-단백질 생성물 혼합물의 불균질성의 일부를 제한한다. 말단 메톡시 기에 반대되는 중합체의 말단에서의 히드록실 기의 활성화는 유도체화된 PEG를 친핵성 공격에 더 민감하게 만드는 것을 목적으로 하는 효율적인 단백질 페길화를 달성하기 위해 일반적으로 필요하다. 공격 친핵체는 통상적으로 리실 잔기의 엡실론-아미노기이지만, 국소 조건이 유리한 경우 다른 아민 (예를 들어, N-말단 알파-아민 또는 히스티딘의 고리 아민)이 또한 반응할 수 있다. 보다 직접적인 부착은 단일 리신 또는 시스테인을 함유하는 단백질에서 가능하다. 후자의 잔기는 티올-특이적 변형을 위해 PEG-말레이미드에 의해 표적화될 수 있다. 대안적으로, PEG 하이드라지드는 과요오드산염 산화된 히알루로난-분해 효소와 반응되고, NaCNBH3의 존재 하에 환원될 수 있다. 보다 구체적으로, 페길화된 CMP 당은 적절한 글리코실-트랜스퍼라제의 존재 하에 히알루로난-분해 효소와 반응할 수 있다. 한 기법은 다수의 중합체 분자가 해당 폴리펩타이드에 커플링되는 "페길화" 기법이다. 이러한 기술을 사용하는 경우, 면역계는 항체의 형성을 담당하는 폴리펩타이드의 표면 상의 에피토프를 인식하여 면역 반응을 감소시키는 데 어려움을 갖는다. 특정 생리학적 효과를 제공하기 위해 인체의 순환계 내로 직접 도입된 폴리펩타이드(즉, 약제)의 경우, 전형적인 잠재적 면역 반응은 IgG 및/또는 IgM 반응인 반면, 호흡기계를 통해 흡입되는 폴리펩타이드(예를 들어, 산업용 폴리펩타이드)는 잠재적으로 IgE 반응(즉 알레르기 반응)을 야기할 수 있다. 감소된 면역 반응을 설명하는 이론들 중 하나는 중합체 분자(들)가 항체 형성을 야기하는 면역 반응의 원인이 되는 폴리펩타이드의 표면 상의 에피토프를 차폐한다는 것이다. 또 다른 이론 또는 적어도 부분적인 인자는 접합체가 더 무거워질수록 더 감소된 면역 반응이 수득된다는 것이다.
전형적으로, 본원에 제공된 페길화된 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 제조하기 위해, PEG 모이어티는 공유 부착을 통해 폴리펩타이드에 접합된다. 페길화를 위한 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 C122S 치환 없이 제조될 수 있고; 대신에 C122는 PEG 모이어티에 대한 접합체를 위한 및/또는 원하는 디설파이드 결합을 형성하기 위한, 예컨대 2개의 사슬 활성화된 형태 또는 이량체를 위한 부위로서 작용할 수 있다.
페길화를 위한 기술은 특수화된 링커 및 커플링 화학(예를 들어, Harris, Adv. Drug Deliv . Rev. 54:459-476, 2002 참조), 단일 접합 부위에의 다중 PEG 모이어티의 부착 (예컨대 분지형 PEG의 사용을 통한 것; 예를 들어, Veronese 등, Bioorg. Med . Chem . Lett. 12:177-180, 2002 참조), 부위-특이적 페길화 및/또는 모노-페길화 (예를 들어, Chapman 등, Nature Biotech. 17:780-783, 1999), 및 부위-지정 효소적 페길화 (예를 들어, Sato, Adv .Drug Deliv . Rev., 54:487-504, 2002)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 당업계에 기재된 방법 및 기술은 단일 단백질 분자에 부착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 PEG 또는 PEG 유도체를 갖는 단백질을 생산할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2006/0104968 참조).
b. 융합 단백질 및 다른 접합체
본원에 제공된 u-PA 및 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 접합체가 본원에 제공된다. 예시적인 이러한 접합체는 실시예 14-16에 예시된 융합 단백질이다. 본원에 기재된 바와 같이, 포함된 활성화 폴리펩타이드의 절단에 의해 활성화될 때 접합체의 일부는 2-사슬 활성화된 u-PA 폴리펩타이드를 형성하고; Fc 도메인을 함유하는 것과 같은 다른 것들은 Fc 도메인의 연결을 통해 토우 사슬을 형성할 수 있다. 다른 것들은 발현 및 단리/정제를 용이하게 하는 서열, 예컨대 SUMO 및 HIS-SUMO를 함유한다. 실시예 14 및 15, 및 또한 도 1 내지 4는 생성된 접합체를 설명하고 도시한다. 약제로서 사용하기 위해, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 일반적으로 활성화된 형태, 예컨대 2-사슬 활성화된 형태로 제공된다. 하기 논의는 생성된 생성물에서 나타나지 않을 신호 서열 및 다른 조절 서열을 포함할 수 있는 융합 폴리펩타이드를 기술하는 것으로 이해된다. 특히, 융합 폴리펩타이드는 활성화 서열을 포함할 수 있고, 이에 의해 절단 시, 생성된 폴리펩타이드는 2-사슬 활성화된 폴리펩타이드이다. 이는 일반적으로 대상체에게 투여되는 약제학적 제품일 폴리펩타이드의 활성화된 형태이다.
i. 예시적인 융합 단백질 및 다른 단백질 접합체
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 다른 폴리펩타이드 및 이의 부분 및 모이어티에 융합되어 원하는 특성, 예컨대 증가된 혈청 반감기, 및/또는 감소된 면역원성, 및/또는 다른 특성을 부여할 수 있다. 이들은, 예를 들어 알부민에 대한 융합, 표적화 모이어티, 예컨대 항체 및 그의 항원 결합 단편에의 융합, 면역글로불린에 의한 융합, Fc 융합, 글리코실화 패턴의 변형, 파스닐화 및 다른 이러한 변형을 포함한다(치료 단백질의 약동학적 특성을 개선시키기 위한 다양한 융합 단백질의 검토를 위해 Strohl (2015) BioDrugs 29:215-239 참조). 치료제의 약리학적 특성을 변경시키기 위한 임의의 이러한 양상은 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 적용될 수 있다. 일반적으로, 변형이 폴리펩타이드 또는 이의 부분인 경우, 변형된 u-PA는 융합 단백질로서 생성된다. 비-폴리펩타이드성 변형, 예컨대 페길화를 위해, 변형은 단리된 단백질 상에서 수행된다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 번역-후 또는 정제-후 변형을 위한 부위를 제공하기 위해 잔기 122에서 Cys를 갖는 것을 포함한다(키모트립신 수에 의함). 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 프로테아제 도메인, 또는 성숙 폴리펩타이드 또는 활성화된 2-쇄 폴리펩타이드와 같은 이의 전장 및 촉매 활성 부분인 것을 포함한다.
본원에서 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 하나 이상의 다른 폴리펩타이드를 함유하는 융합 단백질이 또한 제공된다. 적합한 경로에 의한 투여를 위해 제형화된 이러한 융합 단백질을 함유하는 약제학적 조성물이 제공된다. 융합 단백질은 프로테아제의 정제를 용이하게 하고/하거나, u-PA 폴리펩타이드를 표적화된 세포 또는 조직으로 유도함으로써 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 약력학적 특성을 변경시키고/시키거나, u-PA 폴리펩타이드의 발현 또는 분비를 증가시킬 목적을 위해 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 또 다른 폴리펩타이드, 예컨대 항체 또는 그의 단편, 성장 인자, 수용체, 리간드 및 다른 이러한 제제를 임의의 순서로 연결시킴으로써 형성된다. u-PA 폴리펩타이드 융합 단백질 내에서, u-PA 폴리펩타이드는 u-PA 폴리펩타이드의 전부 또는 이의 촉매 활성 부분 또는 u-PA 폴리펩타이드의 촉매 활성 부분과 전장 u-PSA가 아닌 u-PA의 추가 부분일 수 있다. 본원에 제공된 융합 단백질은 보체 단백질 C3에 대한 이의 특이성 및/또는 선택성의 실질적으로 모두를 보유한다. 일반적으로, u-PA 융합 폴리펩타이드는 비융합 u-PA 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 기질 특이성 및/또는 선택성을 보유하며, 비융합 u-PA 폴리펩타이드의 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 기질 특이성을 포함한다.
ii. 작제물 생성
u-PA 융합 단백질은 표준 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 상이한 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 DNA 단편은 통상적인 기술에 따라, 예를 들어 결찰을 위한 블런트-말단 또는 스태거-말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 소화, 적절한 경우에 응집 말단의 충전, 바람직하지 않은 연결을 피하기 위한 알칼리성 포스파타제 처리, 및 효소적 결찰에 의해 인-프레임으로 함께 결찰될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 비롯한 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 후속적으로 어닐링되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 2개의 연속적인 유전자 단편 사이의 상보적 오버행을 발생시키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Ausubel 등 (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). 융합 모이어티 (예를 들어, his 태그, SUMO 폴리펩타이드, 또는 GST 폴리펩타이드)를 인코딩하는 많은 발현 벡터가 상업적으로 입수가능하다. u-PA-인코딩 핵산은 융합 모이어티가 u-PA 폴리펩타이드에 인-프레임으로 연결되도록 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
예시적인 발현 벡터는 예를 들어, pCMV와 같은 임의의 포유동물 발현 벡터를 포함한다. 박테리아 발현을 위해, 이러한 벡터는 pBR322, pUC, pSKF, pET23D, 및 융합 벡터, 예컨대 MBP, GST 및 LacZ를 포함한다. 다른 진핵생물 벡터, 예를 들어 진핵생물 바이러스로부터의 조절 요소를 함유하는 임의의 것이 진핵생물 발현 벡터로서 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어 SV40 벡터, 유두종 바이러스 벡터, 및 엡스타인-바 바이러스로부터 유래된 벡터를 포함한다. 예시적인 진핵 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMT010/A-, pMAMneo-5, 바큘로바이러스 pDSCE, 및 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터(Rous sarcoma virus promoter), 다면체 프로모터, 또는 진핵생물에서의 발현에 효과적인 것으로 나타난 다른 프로모터의 지시하에서 단백질의 발현을 허용하는 임의의 다른 벡터를 포함한다.
iii. 신호 서열
u-PA 융합 단백질은 프로테아제의 수송을 지시하는 신호 펩타이드(SP 또는 신호 서열 또는 위치 신호 또는 리더 펩타이드)를 함유할 수 있다. 신호 펩타이드는 소포체 막을 가로지르는 전좌를 위한 단백질을 세포 내에서 또는 단백질이 분비되는 경우 세포 외부에서 그의 특이적 목적지로 표적화하는 신생 단백질의 N-말단에서 발견되는 서열 모티프이다. 따라서, SP 선택 및 SP의 변형은 단백질 표적화에 영향을 미친다(Zhang 등 (2005) J Gene Med 7:354-365). 최적화된 SP는 보다 효율적인 활성을 위해 개발되었다. SP 효능을 예측하고 SP 공통 서열을 정의하기 위해 컴퓨터 모델 및 알고리즘이 개발되었다(Burdukiewicz 등 (2018) Int J Mol Sci 19(12): 3709; Peason 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444-2448).
수용체(핵, 4 막관통, G 단백질-커플링된 및 티로신 키나제), 사이토카인 (케모카인), 호르몬 (성장 및 분화 인자), 신경펩타이드 및 혈관매개체, 단백질 키나제, 포스파타제, 포스포리파제, 포스포디에스테라제, 뉴클레오타이드 시클라제, 매트릭스 분자 (부착, 카드헤린, 세포외 매트릭스 분자, 인테그린, 및 셀렉틴), G 단백질, 이온 채널 (칼슘, 클로라이드, 칼륨, 및 나트륨), 프로테아제, 수송체/펌프 (아미노산, 단백질, 당, 금속 및 비타민; 칼슘, 포스페이트, 칼륨 및 나트륨) 및 조절 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 단백질이 SP를 갖는 것으로 공지되어 있다. 일부 예에서, 원래의 신호 펩타이드는 생산을 위해 선택된 원하는 숙주 세포에서 단백질의 분비를 위해 최적화된다. u-PA 폴리펩타이드, 예를 들어, 본원에 제공된 변형된 u-PA 프로테아제 도메인은 u-PA 표적화를 위해 비-uPA 신호 펩타이드에 직접 또는 간접적으로 융합될 수 있다.
신호 펩타이드는 항체의 신호 펩타이드, 예컨대 항체의 중쇄 및 항체의 경쇄의 신호 펩타이드일 수 있다. 항체의 동형단백질은 IgG, IgM, IgD, IgA 및 IgE를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 중쇄는 감마, 뮤, 델타, 알파 및 엡실론 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄는 카파 또는 람다 경쇄를 포함할 수도 있다. 본원에 제시된 u-PA 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 리더 신호 펩타이드 서열, 예컨대 서열번호: 999에 제시된 신호 서열과 같은 항체 신호 펩타이드로 제조될 수 있다.
다른 예시적인 신호 펩타이드는 연구 및 단백질 생산에 광범위하게 사용되는 인간 인터류킨-2 (IL-2)로부터 유래된 것이다(Bamford 등 (1998) J Immunol 160:4418; Komada 등 (1999) Biol Pharm Bull 22:846). 증가된 염기도 및 소수성을 갖는 변형된 IL-2 SP는 융합된 단백질의 분비를 3.5배까지 증가시키는 것으로 개발되었다(Zhang 등 (2005) J. Gene Med . 7:354). 본원의 u-PA 융합 단백질은, 예를 들어 IL-2 신호 펩타이드, 예컨대 인간 IL2 신호 펩타이드 (hIL2SP), 예컨대 서열번호: 1000에 제시된 신호 서열을 사용하여 제조될 수 있다.
본원에 제시된 예시적인 u-PA 융합 단백질은 프로테아제의 수송을 지시하는 신호 펩타이드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 1004, 1005, 1010, 1011, 1014-1018, 1036 및 1040으로 제시된 u-PA 융합 폴리펩타이드는 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999)을 함유한다. 또 다른 예에서, 서열번호: 1006-1009, 1012, 1013, 1034 및 1035로 제시된 u-PA 융합 폴리펩타이드는 인간 IL2 신호 펩타이드(hIL2SP) 서열(서열번호: 1000)을 함유한다.
iii. 예시적인 융합 단백질 및 펩타이드 링커
변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 또 다른 폴리펩타이드의 연결은 직접적으로, 또는 링커를 통해 간접적으로 수행될 수 있다. 일 예에서, 연결은 화학적 연결, 예컨대 이종이중작용성 제제 또는 티올 연결 또는 다른 이러한 연결을 통한 것일 수 있다. 또 다른 폴리펩타이드에 대한 u-PA 폴리펩타이드의 융합은 변형된 u-PA 폴리펩타이드, 예컨대, 변형된 u-PA 프로테아제 도메인의 N- 또는 C- 말단에 대한 것일 수 있다. 본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드와의 융합 단백질에 사용될 수 있는 폴리펩타이드의 비제한적인 예는, 예를 들어, 면역글로불린 G로부터의 Fc 도메인, 혈청 알부민 (즉, 인간 혈청 알부민), 콜라겐 IIm에 결합하는 scFv (C2scFv), 하이알루론산 결합 도메인 (HABD), GST (글루타티온 S-트랜스퍼라제) 폴리펩타이드, his 태그 (즉, HHHHHH), 작은 유비퀴틴-유사 개질제(SUMO) 태그, 인플루엔자 혈구응집소 (HA) 태그 폴리펩타이드 및 그것의 항체 12CA5, 및/또는 이종성 신호 서열(예를 들어, 트롬빈 또는 마우스 Ig 카파 사슬 V-III 영역 (IgGκ) 또는 인간 인터류킨-2 (hIL2)을 포함한다. 융합 단백질은 세포에 의한 단백질의 흡수를 돕는 대장균 말토스 결합 단백질(MBP)과 같은 추가 성분을 함유할 수 있다(국제 PCT 출원 공개 WO 01/32711 참조).
펩타이드 링커는 u-PA 융합 단백질에 포함될 수 있다. 일 예에서, 펩타이드 링커는 제1 폴리펩타이드의 C-말단 및 제2 폴리펩타이드의 N-말단에 융합될 수 있다. 이러한 구조는 적어도 1개, 및 선택적으로 2, 3, 4개 또는 그 이상의 폴리펩타이드가 그의 각각의 말단에서 펩타이드 링커를 통해 서로 연결되도록 다수회 반복될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 서열 X-Y-Z를 포함할 수 있고, 여기서 X는 야생형 또는 변형된 u-PA 촉매 도메인이고, Y는 펩타이드 링커이고, Z는 융합 파트너 (예를 들어, HSA, Fc, HABD, 또는 C2 scFv)의 모두 또는 일부이다. 일부 예에서, X는 u-PA의 N-말단 및 u-PA의 프로테아제 도메인을 포함하는 변형된 u-PA 모두이다. 다른 예에서, X는 u-PA 프로테아제 도메인의 바로 상류의 12개의 아미노산 및 u-PA 프로테아제 도메인을 포함하는 변형된 u-PE의 일부이다. 또 다른 예에서, 폴리펩타이드는 서열 A-X-Y-Z를 포함할 수 있고, 여기서 "A"는 생성된 폴리펩타이드의 발현 및/또는 단리를 용이하게 하는 또 다른 융합 파트너, 예컨대 SUMO 또는 HIS-SUMO와 같은 폴리펩타이드이다.
펩타이드 링커는 일반적으로 Gly, Ser, 및 이들의 조합, 또는 Ala 및 프롤린을 포함한다. 링커는 일반적으로 2개 내지 20개 또는 25개 이하의 잔기를 함유한다. 펩타이드 링커의 예는 __Gly-Gly__, GSG, AGS (서열번호: 1003), GGGGS (서열번호: 1001), GGSSGG (서열번호: 1002), SSSSG (서열번호: 1024), GKSSGSGSESKS (서열번호: 1025), GGSTSGSGKSSEGKG (서열번호: 1026), GSTSGSGKSSSEGSGSTKG (서열번호: 1027), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열번호: 1028), EGKSSGSGSESKEF (서열번호: 1029), 또는 AlaAlaProAla 또는 (AlaAlaProAla)n (서열번호: 1030) (여기서, n은 1 내지 6, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6임)을 비제한적으로 포함한다.
연결 모이어티는, 예를 들어 Huston 등 (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 85:5879-5883, Whitlow 등 (1993) Protein Engineering 6:989-995, 및 Newton 등, (1996) Biochemistry 35:545-553에 기재되어 있다. 다른 적합한 펩타이드 링커는 미국 특허 번호 4,751,180 또는 4,935,233에 기재된 임의의 것을 포함한다. 원하는 펩타이드 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 임의의 적합한 통상적인 기술을 사용하여 u-PA 프로테아제 도메인을 포함하는 u-PA의 전부 또는 일부를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 동일한 리딩 프레임 사이에 삽입될 수 있다. 일 예에서, 융합 단백질은 펩타이드 링커(들)에 의해 분리된 u-PA 폴리펩타이드, 예를 들어 u-PA 프로테아제 도메인, 및 융합 파트너, 예컨대 HSA, Fc, HABD, 또는 C2 scFv를 함유한다.
예시적인 u-PA 융합 폴리펩타이드는 u-PA 프로테아제 도메인을 C-말단 융합 파트너, 예컨대 HSA 또는 Fc에 연결시키는 u-PA 프로테아제 도메인의 C- 말단에 링커를 포함한다. u-PA-링커-Fc 및 u-PA-링커-HSA 분자는 에피토프 태그 및/또는 발현 및 분비를 위한 신호를 선택적으로 함유할 수 있다. 예시적인 u-PA-링커-Fc 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파 (κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), HIS-SUMO (서열번호: 990), u-PA 프로테아제 도메인 (서열번호: 21), 링커 (서열번호: 1002), 및 인간 IgG1 중쇄의 Fc 단편 (서열번호: 992)을 함유하는 서열번호: 1018에 제시된다.
다른 예에서, 예시적인 u-PA 융합 단백질은 서열번호: 1015-1017로 제시된 융합 단백질과 같은, u-PA-링커-HSA 융합 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 서열번호: 1015에 제시된 융합 폴리펩타이드는 인간 면역글로불린 경쇄 카파 (κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), u-PA의 N-말단 도메인 (서열번호: 1042), 야생형 u-PA 활성화 서열(서열번호: 997), u-PA 프로테아제 도메인 (서열번호: 987), 링커 (서열번호: 1002), 및 HSA (서열번호: 991)를 함유한다. 또 다른 예에서, 서열번호: 1016에 제시된 융합 폴리펩타이드는 인간 면역글로불린 경쇄 카파 (κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), u-PA 활성화 서열 내 퓨린 활성화 부위(서열번호: 996), u-PA 프로테아제 도메인 (서열번호: 21), 링커 (서열번호: 1002), 및 HSA (서열번호: 991)를 함유한다. 또 다른 예에서, 서열번호: 1017에 제시된 융합 폴리펩타이드는 인간 면역글로불린 경쇄 카파 (κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), HIS-SUMO (서열번호: 990), u-PA 프로테아제 도메인 (서열번호: 21), 링커 (서열번호: 1002), 및 HSA (서열번호: 991)를 함유한다.
다른 예에서, 링커는 u-PA 프로테아제 도메인의 N-말단에 있고 프로테아제 도메인을 N-말단 융합 파트너에 연결한다. 예를 들어, 융합 단백질은 u-PA에 연결된 N-말단 Fc를 함유할 수 있다. 예시적인 FC-링커-u-PA 융합 폴리펩타이드는 서열번호: 1004에 제시되고, 이는 인간 면역글로불린 경쇄 카파 (κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), 인간 IgG1 중쇄의 Fc 단편(서열번호: 992), 링커 (서열번호: 1003), 야생형 u-PA 활성화 서열(서열번호: 997), 및 u-PA 프로테아제 도메인 (서열번호: 987)를 함유한다.
iv. 융합 파트너
융합 단백질, 예컨대 Fc에 대한 융합, 인간 혈청 알부민 (HSA)에 대한 융합, 단쇄 단편 가변 (scFv) 항체, 예컨대 콜라겐 II에 결합하는 scFv (C2scFv)에 대한 융합, HABD에 대한 융합, 및 다른 폴리펩타이드에 대한 융합된 융합 단백질은 펩타이드 또는 생물학적 약물의 약동학을 개선시키기 위한 공지된 변형이다. 또한 이들 중에는 선형 또는 분지쇄 모노메톡시 폴리-에틸렌 글리콜 (PEG)에 대한 접합이 있어, 분자량 및 유체역학적 반경의 증가, 및 신장에 의한 사구체 여과 속도의 감소를 초래한다. 약동학적 파라미터를 개선시키기 위한 또 다른 접근법은 글리코실화 패턴의 변형을 포함하여, 감소된 제거 및 반감기의 연장을 초래한다.
예시적인 u-PA 융합 폴리펩타이드는 융합 파트너(즉, HSA, HABD, C2 scFv 또는 Fc)의 u-PA 프로테아제 도메인의 N-말단 또는 u-PA 프로테아제 도메인의 C-말단의 배치를 포함한다. 융합 파트너가 u-PA 프로테아제 도메인의 N-말단인 예시적인 u-PA 융합 단백질은 서열번호: 1004에 기재되어 있다. 융합 파트너가 u-PA 프로테아제 도메인에 대한 C-말단인 예시적인 u-PA 융합 단백질은 서열번호: 1006-1018에 제시되어 있다.
(a) Fc 도메인
u-PA 융합 단백질의 일부 예는 면역글로불린 폴리펩타이드의 중쇄, 가장 일반적으로 중쇄의 불변 도메인을 포함한다. 인간 IgG 하위 유형에 대한 중쇄 불변 영역의 예시적인 서열은 서열번호: 45 (IgG1), 서열번호: 1020 (IgG2), 서열번호: 1021 (IgG3), 및 서열번호: 1022 (IgG4)에 제시된다. 예를 들어, 서열번호: 45에 제시된 예시적인 중쇄 불변 영역에 대해, CH1 도메인은 아미노산 1-98에 상응하고, 힌지 영역은 아미노산 99-110에 상응하며, CH2 도메인은 아미노산 111-223에 상응하는 것이고, CH3 도메인은 아미노산 224-330에 상응하는 것이다.
일 예에서, u-PA 융합 단백질은 면역글로불린 폴리펩타이드, 예컨대 인간 면역글로불린의 Fc 영역을 포함할 수 있다. 전형적으로, 이러한 융합체는 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 적어도 기능적으로 활성인 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 보유한다. 예를 들어, IgG1의 전장 Fc 서열은 서열번호: 45에 제시된 서열의 아미노산 105-330을 포함한다. hIgG1에 대한 예시적인 Fc 서열은 서열번호: 992 및 1023에 제시되고, 서열번호: 45의 아미노산 100-110에 상응하는 거의 모든 힌지 서열, 및 서열번호: 45에 제시된 바와 같은 CH2 및 CH3 도메인에 대한 완전한 서열을 함유한다. 또 다른 예시적인 Fc 폴리펩타이드는 PCT 출원 WO 93/10151에 제시되어 있고, 인간 IgG1 항체의 Fc 영역의 N-말단 힌지 영역으로부터 천연 C-말단으로 연장되는 단일 사슬 폴리펩타이드다(서열번호: 50). 연결이 이루어지는 정확한 부위는 중요하지 않다: 특정 부위는 잘 알려져 있고, u-PA 폴리펩타이드의 생물학적 활성 또는 안정성을 최적화하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 다른 예시적인 Fc 폴리펩타이드 서열은 서열번호: 45에 제시된 서열의 아미노산 C109 또는 P113에서 시작한다(예를 들어, 미국 공개 번호 2006/0024298).
hIgG1 Fc 이외에, 다른 Fc 영역이 또한 본원에 제공된 u-PA 융합 단백질에 포함될 수 있다. 예를 들어, Fc/FcγR 상호작용에 의해 매개되는 효과기 기능이 최소화되어야 하는 경우에, 보체 또는 효과기 세포를 불량하게 동원하는 IgG 동형단백질, 예컨대 예를 들어 IgG2 또는 IgG4의 Fc와의 융합이 고려된다. 추가로, Fc 융합체는 항체의 IgG (인간 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 포함), IgA (인간 하위부류 IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, 및 IgM 부류를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 항체 부류에 속하는 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 인코딩되는 면역글로불린 서열을 함유할 수 있다. 추가로, 링커는 Fc를 또 다른 폴리펩타이드에 공유적으로 연결하여 Fc 키메라를 생성하는데 사용될 수 있다.
변형된 Fc 도메인은 또한 u-PA 융합 폴리펩타이드를 갖는 키메라에 사용하기 위해 본원에서 고려된다. 일부 예에서, Fc 영역은 FcR에 대한 변경된 결합을 나타내도록 변형되어, 야생형 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 효과기 기능보다 변경된 (즉, 다소의) 효과기 기능을 생성해야 한다. 따라서, 변형된 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 증가된 친화도 또는 낮은 친화도 또는 무 친화도를 포함하나 이에 제한되지는 않는 변경된 친화도를 가질 수 있다. 예를 들어, 상이한 IgG 하위부류는 FcγR에 대해 상이한 친화도를 가지며, IgG1 및 IgG3은 전형적으로 IgG2 및 IgG4보다 수용체에 실질적으로 더 양호하게 결합한다. 상이한 FcγR은 상이한 효과기 기능을 매개한다. FcγR1, FcγRIIa/c 및 FcγRIIIa는 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프 (ITAM)를 갖는 세포내 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는, 면역 복합체 촉발 활성화의 양성 조절제이다. 그러나, FcγRIIb는 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)를 가지며, 따라서 억제성이다. 일부 경우에, 본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드-Fc 융합 단백질은 보체 단백질 C1q에 대한 결합을 증진시키도록 변형될 수 있다. 추가로, Fc는 FcRn에 대한 그의 결합을 변경시키도록 변형될 수 있고, 이에 의해 u-PA-Fc 융합 폴리펩타이드의 약동학이 개선된다. 따라서, 수용체에 대한 Fc 영역의 친화도의 변경은 Fc 도메인에 의해 연관된 효과기 기능 및/또는 약동학적 특성을 조정할 수 있다. 변형된 Fc 도메인은 당업자에게 공지되어 있고, 문헌에 기재되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 번호 5,457,035; 미국 특허 공개 번호 참조. US 2006/0024298; 및 예시적인 변형을 위한 국제 특허 공개 번호 WO 2005/063816을 참조한다.
일부 예에서, u-PA 폴리펩타이드 다량체가 형성된다. 전형적으로, 폴리펩타이드 다량체는 동일하거나 상이한 u-PA 폴리펩타이드들 중 2개, 예를 들어, u-PA 프로테아제 도메인을 Fc 폴리펩타이드에 직접 또는 간접적으로 연결시킴으로써 생성된 2개의 키메라 단백질의 이량체이다. 일부 예에서, u-PA-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 유전자 융합체는 적절한 발현 벡터 내로 삽입된다. 생성된 u-PA-Fc 융합 단백질은 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에서 발현될 수 있고, 매우 유사한 항체 분자를 조립할 수 있으며, 여기서 사슬간 디설파이드 결합이 Fc 모이어티 사이에 형성되어 2가 u-PA 폴리펩타이드를 생성한다.
Fc 영역을 함유하는 u-PA 융합 폴리펩타이드는 또한 금속 킬레이트 또는 다른 에피토프를 갖는 태그를 포함하도록 조작될 수 있다. 태그된 도메인은 금속-킬레이트 크로마토그래피 및/또는 항체에 의한 신속한 정제에 사용되어, 웨스턴 블랏의 검출, 면역침전, 또는 생물학적 검정에서의 활성 고갈/차단을 가능하게 할 수 있다.
예시적인 u-PA-Fc 융합 폴리펩타이드는 u-PA 프로테아제 도메인과 Fc의 융합을 포함한다. 예시적인 u-PA-Fc 융합 단백질은 서열번호: 1004, 1006, 1010, 1011, 1012 및 1018에 제시되어 있다. u-PA-Fc 분자는 에피토프 태그 또는 발현 및 분비를 위한 신호를 선택적으로 함유할 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 1004, 1010, 및 1011로 제시된 예시적인 u-PA-Fc 융합 폴리펩타이드는 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), 인간 IgG1 중쇄의 Fc 단편(서열번호: 992), 및 Fc에 대한 N-말단(서열번호: 1004) 또는 C-말단 (서열번호: 1010 및 1011) 중 임의의 것의 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 21 또는 987)을 함유한다. 또 다른 예에서, 서열번호: 1006 및 1012로 제시된 예시적인 u-PA-Fc 융합 폴리펩타이드는 인간 IL2 신호 펩타이드(hIL2SP) 서열(서열번호: 1000), u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 5 또는 21), 및 u-PA 프로테아제 도메인에 대한 N-말단에 있는 인간 IgG1 중쇄의 Fc 단편(서열번호: 992)을 함유한다.
(b) 혈청 알부민
u-PA 융합 단백질은 반감기, 안정성, 생체이용성, 분포를 증가시키고/거나 u-PA의 약동학을 개선시키기 위해 융합 파트너로서 알부민과 함께 생성될 수 있다. 인간 혈청 알부민 (HSA)과 연관된 수많은 제품은 암 치료제로서의 사용 및 제2형 당뇨병의 치료를 포함한 치료제로서의 사용이 승인되었다(AlQahtani 등 (2019) Biomed and Pharmacotherapy 113:108750; Roscoe 등, (2018) Mol . Pharmaceutics 151:15046-5047; Strohl, W.R. (2015) BioDrugs 4:215-239). 일부 예에서, 신호 서열 및 활성화 서열이 결여된 성숙 HSA 단백질은 관심 단백질에 융합된다. u-PA 융합 단백질의 일부 예에서, 인간 혈청 알부민(HSA)과 같은 혈청 알부민은 u-PA 프로테아제 도메인과 같은 u-PA에 접합된다. 예시적인 HSA는 서열번호: 991에 기재되어 있다.
u-PA-HSA 융합 폴리펩타이드는 u-PA 프로테아제 도메인과 HSA의 융합을 포함한다. 예시적인 u-PA-HSA 융합 단백질은 서열번호: 1007 및 1013-1017에 기재되어 있다. u-PA-HAS 분자는 에피토프 태그 및/또는 발현 및 분비를 위한 신호를 선택적으로 함유할 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 1014-1017로 제시된 예시적인 u-PA-HSA 융합 폴리펩타이드는 인간 면역글로불린 경쇄 카파 (κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), u-PA 프로테아제 도메인 (서열번호: 987 또는 21), 및 C-말단 HSA (서열번호: 991)를 함유한다. 또 다른 예에서, 서열번호: 1013으로 제시된 예시적인 u-PA-HSA 융합 폴리펩타이드는 인간 IL2 신호 펩타이드(hIL2SP) 서열(서열번호: 1000), u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 5), 및 C-말단 HSA (서열번호: 991)를 함유한다.
(c) 콜라겐 II에 결합하는 scFv(C2scFv)
단쇄 단편 가변 (scFv) 항체 형태의 재조합 항체 단편, 예컨대 콜라겐 II에 결합하는 scFv (C2scFv)는 u-PA와의 융합 파트너로서 사용될 수 있다. 파지 디스플레이로부터 생성된 scFv 항체는 마커, 또는 활성 또는 치료 단백질에 융합될 수 있다(Ahmad 등 (2012) Clin Dev Immunol 2012:980250). scFv의 융합은 접합된 단백질의 수율 및 활성을 증가시키는데 사용될 수 있다(Martin 등, (2006) BMC Biotech 6:46).
단쇄 단편 가변 항체는 펩타이드 링커 또는 디설파이드 결합에 의해 연결된 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 영역을 포함한다(Glockshuber 등 (1990) Biochemistry 29(6):1362-1367). 펩타이드 링커는 폴리펩타이드 사슬의 폴딩에서 중요한 역할을 한다. 통상적으로 이용되는 링커는 용해도를 향상시키기 위해 Glu 및 Lys, 또는 유연성을 위해 Gly 및 Ser 잔기를 포함한다(Whitlow 등 (1993) Protein Engineering 6(8):989-995).
scFv는 항원-제시 세포로의 특이적 전달을 위해 단백질에 융합될 수 있다(Ahmad 등 (2012) Clin Dev Immunol 2012:980250). 예를 들어, scFv는 연구 제제로서의 용도 및 인간 콜라겐 II를 발현하는 부위로의 치료 분자의 전달 제제로서와 같이 콜라겐 II를 표적화하기 위해 생성될 수 있다. 예를 들어, scFv는 VH 영역 및 VL 영역을 포함하는, 인간 콜라겐 II에 결합하는 단리된 단클론성 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 C2scFv는 서열번호: 993에 제시된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
예시적인 u-PA-C2scFv 융합 폴리펩타이드는 u-PA 프로테아제 도메인 및 C2scHv의 융합을 포함한다. 예시적인 u-PA-C2scFv 융합 단백질은 서열번호: 1008에 제시되어 있다. u-PA-C2scFv 분자는 에피토프 태그 또는 발현 및 분비를 위한 신호를 선택적으로 함유할 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 1008로 제시된 예시적인 u-PA-C2scFv 융합 폴리펩타이드는 인간 IL2 신호 펩타이드(hIL2SP) 서열(서열번호: 1000), u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 21), 및 C-말단 C2cFv(서열번호: 993)를 함유한다.
(d) 히알루론산 결합 도메인(HABD)
일부 예에서, u-PA 융합 단백질은 HABD 융합 파트너, 예컨대 종양 괴사 인자 자극 유전자-6 (TSG-6), 예컨대 서열번호: 994(인간 TSG-6의 아미노산 32-134에 상응함; NCBI 번호 NP_009046.2)로 제시된 TSG-6-를 함유한다. u-PA 융합 단백질은 반감기, 안정성, 생체이용성, 분포를 증가시키고/거나 u-PA의 약동학을 개선시키기 위해 융합 파트너로서 TSG-6과 같은 HABD를 사용하여 생성될 수 있다.
종양 괴사 인자 자극 유전자-6 (TSG-6, 종양 괴사 인자 알파-유도된 단백질 6, TNFAIP6; NCBI 번호 NP_009046.2)은 단일 N-말단 연결 모듈 및 C-말단 CUB 도메인으로 구성된 ~35 kDa 분비된 당단백질이다. TSG-6의 발현은 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 염증 매개체에 의해 많은 세포 유형에서 유도된다. 대략 아미노산 35-132를 함유하는 것으로 보고된 그의 연결 모듈을 통해, TSG-6은 다형핵 백혈구 이동의 강력한 억제제이다. TSG-6은 세린 프로테아제 억제제 인터-알파-억제제(IαI)와 안정한 복합체를 형성하고, IαI의 항-플라스민 활성을 강화시킨다. TSG-6은 또한 HA-풍부 세포주위 코트 및 세포외 매트릭스의 형성 및 리모델링에 중요하다.
예시적인 u-PA-HABD 융합 폴리펩타이드는 u-PA 프로테아제 도메인과 HABD의 융합을 포함한다. 예시적인 u-PA-HABD 융합 단백질은 서열번호: 1009에 제시되어 있고, u-PA-HABD 분자는 에피토프 태그(tag) 또는 발현과 분비에 대한 신호를 선택적으로 함유할 수도 있다. 예를 들어, 서열번호: 1009로 제시된 예시적인 u-PA-HABD 융합 폴리펩타이드는 인간 IL2 신호 펩타이드(hIL2SP) 서열(서열번호: 1000), u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 21), 및 C-말단 HABD(서열번호: 994)를 함유한다.
v. 활성화 부위
예시적인 u-PA 융합 단백질은 u-PA 활성화를 위한 부위를 함유한다. 예를 들어, u-PA 융합 단백질은 자가-활성화를 위한 야생형 u-PA 서열을 포함하거나; 단백질 발현 동안 활성화를 위한 퓨린 서열을 함유하거나; 분비 신호 절단 후에 활성화되며, 이들 모두는 활성화된 u-PA 프로테아제를 생성한다.
(a) 퓨린
퓨린 단백질은 분비 경로 내의 단일, 쌍 또는 다중 염기성 컨센서스 부위에서 불활성 전구체 단백질의 엔도단백질분해 성숙 프로세싱에 연루되어 왔다(Nakayama(1997) Biochem.J. 327:625-635; Seidah and Chretien, Current Opinions in Biotechnology (1997) 8:602-607). 새로 합성된 전구체 단백질이 소포체로부터 골지 구획으로 수송되면, 프로펩타이드는 퓨린 절단 모티프에서 2-단계 프로세싱 사건에서 자가촉매적으로 제거된다(Leduc 등 (1992) J. Biol . Chem 267:14304-14308; Anderson 등 (1997) EMBO 1508-1518). 퓨린은 절단을 위해 R-X-X -R 부위를 필요로 하고, 최적의 프로세싱은 R-X-K/R-R 모티프에서 발생한다(Molloy 등 (1992) J. Biol Chem 267:16396-16402). 퓨린 RRKR 절단 부위를 함유하는 예시적인 u-PA 활성화 서열은 서열번호: 995 및 996에 제시된다.
u-PA 융합 단백질은 u-PA 프로테아제 도메인의 N-말단에 퓨린 활성화 부위를 포함할 수 있어서, u-PA 단백질이 발현 동안 활성화된다. 예를 들어, u-PA 활성화 서열에 퓨린 활성화 부위를 포함시킴으로써 발현 동안 u-PA 활성화는 하류 프로세싱 동안 활성화 단계에 대한 필요성을 제거하도록 의도된다.
퓨린 활성화 부위 및 u-PA 프로테아제 도메인을 포함하는 u-PA 융합 폴리펩타이드를 생성하였다. 예시적인 퓨린-u-PA 단백질은 서열번호: 1010, 1014 및 1016에 기재되어 있다. 퓨린 활성화된 u-PA 분자는 융합 파트너, 및/또는 발현 및 분비를 위한 신호를 선택적으로 함유한다. 예를 들어, 서열번호: 1014 및 1016으로 제시된 예시적인 u-PA 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), u-PA 활성화 서열 내의 퓨린 활성화 부위(서열번호: 995 또는 996), u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 21 또는 987), 및 HSA (서열번호: 991)를 함유한다. 서열번호: 1014로 제시된 u-PA 융합 단백질은 u-PA의 N-말단(서열번호: 1 또는 서열번호: 1042의 아미노산 21-178로 제시됨), 서열번호: 987로 제시된 u-PA 프로테아제 도메인을 갖는 퓨린-u-PA 프로테아제 도메인의 N-말단을 추가로 함유한다. 또 다른 예에서, 서열번호: 1010으로 제시된 u-PA 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), u-PA 활성화 서열 내의 퓨린 활성화 부위(서열번호 995), u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 21), 및 Fc(서열번호: 992)를 함유한다.
(b) u-Pa
u-PA 자이모겐 활성화는 u-PA 촉매 도메인의 N-말단에 단일 펩타이드 결합의 절단에 의해 일어나, 단백질에서 형태적 변화를 개시한다. 본원에서 생성된 u-PA 작제물은 12개의 아미노산 u-PA 활성화 서열(서열번호: 997) 또는 이의 변경된 형태(서열번호: 998)를 함유할 수 있거나, 또는 활성화 서열을 포함하는 u-PA N-말단의 연장된 부분을 함유할 수 있어서, u-PA는 전장 성숙 폴리펩타이드, 예컨대 서열번호: 3에 기재된 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 예에서, u-PA는 N-말단, 예컨대 서열번호: 1 또는 서열번호: 1042의 아미노산 21 내지 178로서 제시된 u-PA의 N-말단 영역, 및 12개의 아미노산 u-PA 활성화 서열(서열번호: 997) 또는 u-PA 활성화 서열의 변경된 형태(서열번호: 998)를 포함한다.
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 융합 단백질을 제조하였다. 야생형 또는 변형된 u-PA 활성화 부위 및 u-PA 프로테아제 도메인을 포함하는 u-PA 융합 폴리펩타이드를 생성하였다. 활성화를 위한 야생형 u-PA 활성화 서열을 함유하는 예시적인 u-PA 단백질은 서열번호: 1004, 1005, 1011 및 1015에 기재되어 있다. 융합 펩타이드는 융합 파트너, 및/또는 발현 및/또는 분비를 위한 신호를 선택적으로 함유할 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 1004로 제시된 예시적인 u-PA 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), Fc(서열번호: 992), u-PA 활성화 서열(서열번호: 995), 및 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 987)을 함유한다. 추가 예에서, 서열번호: 1005로 제시된 u-PA 융합 단백질은 전장 성숙 u-PA 서열(서열번호: 987로 제시된 변형된 프로테아제 도메인을 갖는 서열번호: 3) 및 N-말단 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999)을 함유한다. 추가의 예에서, 서열번호: 1011로 제시된 u-PA 융합 단백질은 N-말단 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), 전장 성숙 u-PA 서열(서열번호: 987로 제시된 변형된 프로테아제 도메인을 갖는 서열번호: 3), 및 Fc(서열번호: 992)를 함유한다. 또 다른 예에서, 서열번호: 1015로 제시된 u-PA 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), (서열번호: 1의 아미노산 21 내지 178로 제시된) u-PA의 N-말단(u-PA 활성화 서열 포함), u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 987), 및 HSA(서열번호: 991)를 함유한다. 서열번호: 1006, 1007, 1009 및 1010의 것과 같은 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 발현시, u-PA 프로테아제 활성을 나타내었다. C-말단에서 Ig FC 융합을 갖는 u-PA에 대한 N-말단 퓨린 활성화 서열을 갖는 변형된 u-PA (예컨대 서열번호: 1010에 제시된 것)는 가장 높은 활성을 나타내었다.
vi. 정제 태그
예시적인 u-PA 융합 단백질은 u-PA 또는 u-PA 융합 단백질의 정제를 위한 태그를 함유한다. u-PA 융합 단백질의 정제를 위한 예시적인 태그는 상기 섹션 F에 기재되어 있다. 예시적 u-PA 융합 단백질은 정제를 위해 SUMO 또는 His 서열을 포함할 수 있다.
(a) His 태그
u-PA 융합 단백질은 서열번호: 989에 기재된 6xHis와 같은 His 태그, 및 u-PA 프로테아제 도메인을 포함할 수 있다.
His 정제 태그 및 u-PA 프로테아제 도메인을 포함하는 u-PA 융합 폴리펩타이드를 생성하였다. 예시적인 HIS-u-PA 융합 단백질은 서열번호: 1017 및 1018에 기재되어 있다. His 태그된 u-PA 분자는 융합 파트너 및/또는 발현 및 분비를 위한 신호를 선택적으로 함유할 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 1017로 제시된 예시적인 His-u-PA 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), 6xHis(서열번호: 989), SUMO(서열번호: 1031), u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 21), 및 HSA(서열번호: 991)를 함유한다. 또 다른 예에서, 서열번호: 1018로 제시된 예시적인 His 태깅된-u-PA 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), 6xHis(서열번호: 989), SUMO(서열번호: 1031), u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 21), 및 Fc(서열번호: 992)를 함유한다.
(b) SUMO
u-PA 융합 단백질은 봉입체 내에 축적되는 His 태그 및/또는 SUMO 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 990에 기재된 HIS-SUMO 서열 및 u-PA 프로테아제 도메인은 전장 변형된 u-PA 폴리펩타이드, 또는 이의 촉매 활성 부분, 예컨대 프로테아제 도메인, 또는 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 더 큰 부분에 연결될 수 있다. His-SUMO 태그 및 u-PA 프로테아제 도메인을 포함하는 u-PA 융합 폴리펩타이드를 생성하였다. 예시적인 HIS-SUMO-u-PA 단백질은 서열번호: 1017 및 1018에 제시된다. HIS-SUMO 태그된 u-PA 분자는 융합 파트너, 및/또는 발현 및 분비를 위한 신호를 선택적으로 함유할 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 1017로 제시된 His-SUMO-u-PA 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), 6xHis(서열번호: 989), SUMO(서열번호: 1031), u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 21), 및 HSA(서열번호: 991)를 함유한다. 다른 예에서, 서열번호: 1018로 제시된 예시적인 His-SUMO-u-PA 융합 단백질은 인간 면역글로불린 경쇄 카파(κ) 리더 신호 펩타이드 서열(서열번호: 999), 6xHis(서열번호: 989), SUMO(서열번호: 1031), u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 21), 및 Fc(서열번호: 992)를 함유한다.
7. 핵산 분자
u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자가 본원에서 제공된다. 핵산 분자는 임의의 인코딩된 u-PA 폴리펩타이드 또는 이의 촉매 활성 부분의 대립유전자 변이체 또는 스플라이스 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 핵산 분자는 임의의 핵산 인코딩된 u-PA 폴리펩타이드 또는 이의 촉매 활성 부분과 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 핵산 분자는 임의의 u-PA 폴리펩타이드 또는 그의 촉매 활성 부분의 축퇴성 코돈 서열을 갖는 것들, 예컨대 본원에 제공된 것들을 포함할 수 있다.
포유동물 세포에서의 발현을 위한 유도성 프로모터와 같은 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 분자, 또는 핵산 분자의 촉매 활성 부분을 함유하는 융합 단백질이 또한 제공된다. 이러한 프로모터는 CMV 및 SV40 프로모터; 아데노바이러스 프로모터, 예컨대 HPV E7 종양단백질에 반응성인 E2 유전자 프로모터; PV 프로모터, 예를 들어 PV E2 단백질에 반응성인 PBV p89 프로모터; 및 HIV 또는 PV 또는 종양유전자에 의해 활성화되는 다른 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 제공된 u-PA 프로테아제는 또한 유전자 전달 벡터 내의 세포로 전달될 수 있다. 전달 벡터는 또한 프로테아제가 투여되는 질환 또는 장애, 예컨대 류마티스 관절염 또는 심혈관 질환 또는 AMD 또는 DGF의 치료를 위한 추가의 다른 치료제(들)를 인코딩할 수 있다. 프로테아제를 인코딩하는 전달 벡터는 핵산을 대상체에게 투여함으로써 전신으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 전달 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 프로테아제를 인코딩하는 벡터는 또한 줄기 세포 내로 혼입될 수 있고, 이러한 줄기 세포는 예컨대 요법을 위한 부위에서 줄기 세포를 이식 또는 생착시킴으로써 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 프로테아제를 발현하도록 조작될 수 있고, 이러한 MSC는 요법을 위한 이식 부위에서 생착된다.
G. 조성물, 제형 및 복용량
변형된 u-PA 폴리펩타이드들, 변형된 u-PA 융합 단백질들 또는 인코딩 핵산 분자들을 포함하는 약제학적 조성물들은 선택된 양의 폴리펩타이드를 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체들 또는 부형제와 혼합함으로써 임의의 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 대부분의 구현예에서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 투여를 위한 조성물에서 활성화된 형태일 것이다. 따라서, 예를 들어, 폴리펩타이드는 2개의 사슬 활성화된 형태이거나, 융합 단백질이 다량체화 도메인을 함유하는 경우, 단백질은 다량체, 예컨대 이량체일 수 있다.
담체 또는 부형제의 선택은 투여 전문가의 기술 내에 있으며, 다수의 파라미터에 의존할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 투여 방식 (즉, 전신, 경구, 비내, 폐, 국부, 국소 또는 임의의 다른 방식) 및 치료되는 장애를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 약제학적 조성물은 단일 복용량 (직접) 투여를 위해 또는 희석 또는 다른 변형을 위해 제제화될 수 있다. 제제 중 화합물의 농도는 투여시 의도된 치료에 효과적인 양의 전달에 효과적이다. 전형적으로, 조성물은 단일 복용량 투여를 위해 제제화된다. 조성물을 제제화하기 위해, 화합물 또는 그의 혼합물의 중량 분율을 선택된 비히클 중에 치료된 상태가 완화 또는 개선되도록 하는 유효 농도로 용해, 현탁, 분산 또는 달리 혼합한다. 본원에 제공된 화합물의 투여에 적합한 약제학적 담체 또는 비히클은 특정한 투여 방식에 적합한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 이러한 담체를 포함한다.
1. 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 투여
본 섹션의 목적을 위해, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 변형된 프로테아제 도메인과 같은 변형을 함유하는 u-PA 폴리펩타이드를 지칭하고, 융합 단백질과 같은 접합체를 포함한다. 폴리펩타이드는 조성물 중 단독 약제학적 활성 성분으로서 제제화될 수 있거나, 또는 다른 활성 성분과 조합될 수 있다. 폴리펩타이드는 예컨대 표적화제, 예컨대 항체에의 접합에 의해 전달을 위해 표적화될 수 있다. 조직-표적화 리포솜을 포함하는 리포솜 현탁액은 또한 약학적으로 허용가능한 담체로서 적합할 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 리포솜 제형은 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 리포솜 전달은 또한 약제학적 매트릭스, 예컨대 콜라겐 겔 및 피브로넥틴으로 변형된 리포솜을 포함한 서방형 제제를 포함할 수 있다(예를 들어, Weiner 등 (1985) J Pharm Sci. 74(9): 922-5).
활성 화합물은 치료되는 대상체에 바람직하지 않은 부작용의 부재 하에 치료상 유용한 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 약제학적으로 허용되는 담체 중에 포함된다. 치료 유효 농도는 공지된 시험관 내 및 생체 내 시스템, 예컨대 본원에 제공된 검정에서 화합물을 시험함으로써 경험적으로 결정될 수 있다.
본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드(즉, 활성 화합물)는 혼합물, 예컨대 체액 또는 다른 조직 샘플을 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 중 임의의 것을 포함하는 본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드를 접촉시킴으로써 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 투여될 수 있다. 예를 들어, 생체 외에서 화합물을 투여할 때, 대상체로부터의 체액, 예컨대 유리체액, 또는 조직 샘플을 튜브 또는 필터, 예컨대 우회 기계에서 트루(true) 또는 필터 상에 코팅된 u-PA 폴리펩타이드와 접촉시킬 수 있다. 생체 내 투여하는 경우, 활성 화합물은 임의의 적절한 경로에 의해, 예를 들어 경구로, 비강으로, 폐, 비경구로, 정맥내로, 진피내로, 유리체내로, 망막내로, 망막하로, 눈주위로, 피하로, 또는 국소적으로, 액체, 반-액체 또는 고체 형태로 투여될 수 있고, 각각의 투여 경로에 적합한 방식으로 제제화된다. 복용량의 결정은 의사의 기술 내에 있고, 특정한 장애, 투여 경로 및 대상체의 함수일 수 있다. 예시적인 복용량은 예를 들어 0.1 내지 1 mg을 포함한다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용가능한 염 및 용매화물은 흡입(입 또는 코를 통함), 경구, 경피, 폐, 비경구 또는 직장 투여에 의한 투여를 위해 제형화될 수도 있다. 흡입에 의한 투여를 위해, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 제시의 형태로 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한, 예를 들어 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 치료 화합물 및 적합한 분말 베이스, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하여 제제화될 수 있다.
폐로의 폐 투여를 위해, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 적합한 추진제를 사용하여 네뷸라이저, 터보네뷸라이저 또는 마이크로프로세서-제어된 계량 용량 경구 흡입기로부터 에어로졸 스프레이 제시의 형태로 전달될 수 있다. 일반적으로, 에어로졸의 입자 크기는 0.5 내지 5 마이크로미터의 범위와 같이 작다. 폐 투여용으로 제제화된 약제학적 조성물의 경우에, 세제 계면활성제는 전형적으로 사용되지 않는다. 폐 약물 전달은 전신 투여의 유망한 비-침습적 방법이다. 폐는 주로 흡수를 위한 높은 표면적, 얇은 폐포 상피, 광범위한 혈관화, 간 제1-통과 대사의 결여, 및 비교적 낮은 대사 활성으로 인해 약물 전달을 위한 매력적인 경로를 나타낸다.
경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은, 예를 들어 약제학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 결합제(예를 들어, 전호화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제(예를 들어, 락토스, 미세결정성 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예를 들어, 마그네슘스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예를 들어, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글라이콜레이트); 또는 습윤제(예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트)를 사용하여 통상적인 수단에 의해 제조된 정제, 환제, 액체 현탁액 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업계에 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 제제는, 예를 들어 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 또는 이들은 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클과 구성하기 위한 건조 생성물로서 제공될 수 있다. 이러한 액체 제제는 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예컨대 현탁화제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화 식용 지방); 유화제(예를 들면, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클 (예컨대, 아몬드 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알콜 또는 분별 식물성 오일); 및 보존제(예컨대, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 사용하여 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 제제는 또한 적절한 경우에 완충액 염, 향미제, 착색제 및 감미제를 함유할 수 있다.
경구 투여용 제제는 활성 화합물의 제어 방출을 위해 제제화될 수 있다. 협측(buccal) 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 데포(depot) 제제로서 제형화될 수 있다. 이러한 장기-작용 제형은 이식 (예를 들어, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 치료 화합물은 적합한 중합체 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용되는 오일 중 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 난용성 유도체로서, 예컨대 난용성인 염으로서 제제화될 수 있다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 주사에 의한(예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한) 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제제는 보존제가 첨가된 단위 투여 형태 (예를 들어, 앰플 또는 다중-용량 용기)로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 제제화제, 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열원-무함유 물로 구성하기 위한 분말-동결건조 형태일 수 있다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 안구 또는 안구 전달을 위해 제형화될 수 있다. 안구 약물 전달은, 예를 들어, 국소, 경구 또는 전신, 및/또는 주사될 수 있다. 예를 들어, 변형된 u-PA 폴리펩타이드(들), 또는 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물은 국소적으로, 예컨대 점안제의 형태로 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드(들) 또는 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물은 안구주위 및/또는 유리체내 또는 망막내 또는 레티날하 투여에 의해, 예를 들어 안구주위, 또는 망막내로, 또는 유리체내 주사에 의해 투여될 수 있다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드, 또는 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유하는 약제학적 조성물은 DGF의 치료를 위해 전신 투여용으로 제형화될 수 있다. 또 다른 예에서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 함유하는 약제학적 조성물은 신장 내로 또는 이식된 신장에 인접하거나 이를 둘러싸는 조직 또는 기관 내로 직접 주입 또는 주사된다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드, 또는 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물은 동종이식 이식 전에 또는 만성 방식으로 계속 투여하면서 이식 시에 투여될 수 있고/있거나, 이러한 에피소드가 발생하는 경우에 거부 에피소드 동안 투여될 수 있다.
약제학적 조성물은 국소(local) 또는 국소(topical) 적용, 예컨대 피부 (경피) 및 점막, 예컨대 눈으로의 국소 적용을 위해, 겔, 크림 및 로션 형태로, 및 눈으로의 적용 또는 수조내 또는 척수내 적용을 위해 제제화될 수 있다. 이러한 용액, 특히 안과용으로 의도된 용액은 적절한 염을 사용하여 0.01% 내지 10% 등장성 용액 및 pH 약 5-7로서 제제화될 수 있다. 화합물은 국소 적용을 위한 에어로졸로서, 예컨대 흡입에 의해 제제화될 수 있다(예를 들어, 염증성 질환, 특히 천식의 치료에 유용한 스테로이드의 전달을 위한 에어로졸을 기재하는 미국 특허 번호 4,044,126, 4,414,209 및 4,364,923 참조).
약물 조성물 중 활성 화합물의 농도는 활성 화합물의 흡수, 불활성화 및 배출 속도, 투여 스케줄, 및 투여되는 양뿐만 아니라 당업자에게 공지된 다른 인자에 따라 달라진다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 복용량은 변형되지 않은 및/또는 야생형 u-PA 폴리펩타이드와 비교하여 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 특성 및 활성(예를 들어, 하나 이상의 보체 단백질의 절단)의 비교를 사용하여 경험적으로 결정될 수 있다.
조성물은, 원하는 경우에, 활성 성분을 함유하는 1종 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 패키지, 키트 또는 분배기 장치로 제공될 수 있다. 일부 예에서, 조성물은 장치, 예컨대 예를 들어 우회 기계 내의 튜브 또는 필터 상에 코팅될 수 있다. 패키지는, 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터 팩을 함유한다. 팩 또는 분배기 장치는 투여를 위한 지침서를 수반할 수 있다. 활성제를 함유하는 조성물은 포장재, 본원에 제공된 제제, 및 제제가 제공되는 장애를 나타내는 라벨을 함유하는 제조 물품으로서 포장될 수 있다.
u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 발현 벡터를 포함하는 핵산 분자를 함유하는 조성물이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자 및 이를 인코딩하는 발현 벡터의 조성물은 유전자 요법에 적합하다. 단백질을 전달하기보다는, 핵산은 생체 내에서, 예컨대 전신적으로 또는 다른 경로에 의해, 또는 생체 외에서, 예컨대 림프구를 포함한 세포의 제거, 그 안에 핵산의 도입, 및 숙주 또는 상용성 수용자 내로의 재도입에 의해 투여될 수 있다.
2. 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 투여 (유전자 요법)
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 핵산 분자의 발현에 의해 세포 및 조직으로 전달될 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 생체 외 기술 및 직접적인 생체 내 발현을 포함하여, 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자로서 투여될 수 있다. 핵산은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 세포 및 조직으로 전달될 수 있다. 단리된 핵산은 추가의 조작을 위해 벡터 내로 혼입될 수 있다. 인코딩 핵산 분자의 발현에 의해 u-PA 폴리펩타이드를 투여하는 방법은 재조합 벡터의 투여를 포함한다. 벡터는 예컨대 복제 기원의 포함에 의해 에피솜을 유지하도록 설계될 수 있거나, 또는 세포 내의 염색체 내로 통합되도록 설계될 수 있다.
u-PA 폴리펩타이드는 또한 벡터를 사용하는 생체 외 유전자 발현 요법에 사용될 수 있다. 적합한 유전자 요법 벡터 및 전달 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 세포는 조절 서열에 작동적으로 연결되거나 게놈 위치에서 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 배치되는 것과 같이, 예를 들어 u-PA 폴리펩타이드 인코딩 핵산을 게놈 위치 내로 통합시킴으로써 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 발현하도록 조작될 수 있다. 이어서, 이러한 세포는 치료를 필요로 하는 환자와 같은 대상체에게 국소 또는 전신 투여될 수 있다. 생체 내 및 생체 외 유전자 요법을 위한 예시적인 벡터는 바이러스 벡터, 및 비-바이러스 벡터, 예를 들어 리포솜 또는 인공 염색체를 포함한다.
바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노-회합된 바이러스 (AAV), 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스, EBV, SV40, 사이토메갈로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 및 유전자 요법을 위해 설계된 다른 것들이 사용될 수 있다. 벡터는 에피솜으로 남아있는 것들 또는 치료된 대상체의 염색체 내로 통합될 수 있는 것들일 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 바이러스 벡터, 예컨대 AAV에서 인코딩될 수 있다.
유전자 요법에 적합한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노 회합된 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 상기 언급된 다른 것을 포함한다. 예를 들어, 아데노바이러스 발현 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 아데노바이러스 생산 및 투여 방법 또한 잘 알려져 있다. 아데노바이러스 혈청형은, 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC® Rockville, MD)으로부터 입수가능하다. 아데노바이러스는 생체 외에서 사용될 수 있으며, 예를 들어, 세포는 치료를 필요로 하는 환자로부터 분리되고, 변형된 u-PA 폴리펩타이드-발현 아데노바이러스 벡터로 형질도입된다. 적합한 배양 기간 후, 형질도입된 세포는 국소적으로 및/또는 전신적으로 대상체에게 투여된다. 대안적으로, u-PA 폴리펩타이드-발현 아데노바이러스 입자는 대상체의 질환 또는 병태를 예방, 치료 또는 개선하기 위한 치료적 유효량의 전달을 위해 약학적으로 허용가능한 담체에서 단리 및 제형화된다. 일 구현예에서, 치료될 질환은 보체 활성화에 의해 야기된다. 전형적으로, 아데노바이러스 입자는 대상체 중량 킬로그램 당 1개 입자 내지 1014 개의 입자, 일반적으로 대상체 중량 킬로그램당 106 또는 108 입자 내지 1012 개의 입자 입자 범위의 용량으로 전달된다.
핵산 분자는 인공 염색체 및 다른 비-바이러스 벡터 내로 도입될 수 있다. 인공 염색체, 예컨대 ACES (Lindenbaum 등 Nucleic Acids Res. (2004) 32(21):e172)는 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하고 발현하도록 조작될 수 있다. 간략하게, 포유동물 인공 염색체(MAC)는 유전 정보의 큰 페이로드를 자율적으로 복제하는 비통합성 포맷으로 세포 내로 도입하는 수단을 제공한다. MAC 중에서 독특한 것은, 포유동물 위성 DNA-기반 인공 염색체 발현 시스템 (ACES)이 상이한 종의 세포주에서 새로 재현가능하게 생성되고 숙주 세포의 염색체로부터 용이하게 정제될 수 있다. 이어서, 정제된 포유동물 ACE를 다양한 수용 세포주 내로 재도입할 수 있고, 여기서 ACE 시스템을 사용하여 선택압의 부재 하에 장기간 동안 안정하게 유지되었다. 이러한 접근법을 사용하여, 1개 또는 2개의 유전자 표적의 특이적 로딩이 LMTK(-) 및 CHO 세포에서 달성되었다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 도입하기 위한 또 다른 방법은 완전한 아데노바이러스 게놈으로 시작하는 효모에서의 2-단계 유전자 치환 기술이며(Ad2; Ketner 등 (1994) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 91: 6186-6190), 효모 인공 염색체(YAC) 및 YAC 클론 내의 특정 영역을 표적화하기 위한 아데노바이러스 서열, 관심 유전자에 대한 발현 카세트 및 양성 및 음성 선택가능 마커를 함유하는 플라스미드에 클로닝되었다. YAC는 더 큰 유전자의 혼입을 허용하기 때문에 특히 관심의 대상이다. 이러한 접근법은 포유동물 세포 또는 전체 동물로의 유전자 전달을 위한 임의의 기재된 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 보유하는 아데노바이러스-기반 벡터의 구축에 사용될 수 있다.
핵산은 비히클, 예컨대 리포솜 내에 캡슐화되거나, 세포, 예컨대 박테리아 세포, 특히 약독화된 박테리아 내로 도입되거나, 또는 바이러스 벡터 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 리포솜이 사용되는 경우, 세포내이입과 연관된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들어 특정 세포 유형에 대한 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 사이클링에서 내재화를 겪는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국재화를 표적화하고 세포내 반감기를 증진시키는 단백질을 표적화하고/거나 흡수를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드와 같은 세포를 표적화하는 제제를 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 및 발현 벡터는 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자를 함유하는 핵산 벡터가 추가로 제공된다. 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자를 함유하는 핵산 벡터 및 이들 벡터를 함유하는 세포가 추가로 제공된다.
생체 외 및 생체 내 방법의 경우, u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자는 적합한 공여자 또는 치료될 대상체로부터의 세포 내로 도입된다. 치료 목적을 위해 핵산이 도입될 수 있는 세포는, 예를 들어, 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; 혈액 세포, 예컨대 T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거핵세포, 과립구; 조혈 줄기 또는 전구 세포를 포함하는 다양한 줄기 세포 또는 전구 세포, 예를 들면, 골수, 제대혈, 말초혈, 태아 간, 및 이들의 다른 공급원으로부터 수득된 줄기 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 치료될 질환 또는 병태에 적절한 임의의 원하는 이용가능한 세포 유형을 포함한다.
생체 외 치료를 위해, 치료될 대상체와 상용성인 공여자로부터의 세포 또는 치료될 대상체로부터의 세포를 제거하고, 핵산을 이들 단리된 세포 내로 도입하고, 변형된 세포를 대상체에게 투여한다. 치료는 환자에게 이식되는, 예를 들어 다공성 막 내에 캡슐화되는 것과 같은 직접 투여를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,892,538 및 5,283,187 참조). 시험관 내 포유동물 세포로의 핵산의 전달에 적합한 기술은 리포솜 및 양이온성 지질 (예를 들어, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol) 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 및 인산칼슘 침전 방법의 사용을 포함한다. DNA 전달 방법은 생체 내 u-PA 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 핵산의 리포솜 전달 및 국소 및 전신 전달, 예컨대 전기천공, 초음파 및 칼슘-포스페이트 전달을 사용하는 것을 포함하는 네이키드 DNA 전달을 포함한다. 다른 기술은 미세주입, 세포 융합, 염색체 매개 유전자 전달, 미세세포 매개된 유전자 전달 및 스페로플라스트 융합을 포함한다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드의 생체 내 발현은 추가의 분자의 발현에 연결될 수 있다. 예를 들어, u-PA 폴리펩타이드의 발현은 조작된 바이러스에서와 같은 세포독성 생성물의 발현과 연결되거나 세포독성 바이러스에서 발현될 수 있다. 이러한 바이러스는 치료 효과를 위한 표적인 특정 세포 유형에 표적화될 수 있다. 발현된 u-PA 폴리펩타이드는 바이러스의 세포독성을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
u-PA 폴리펩타이드의 생체 내 발현은 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터와 같은 특이적 조절 서열에 핵산 분자를 인코딩하는 u-PA 폴리펩타이드를 작동가능하게 연결하는 것을 포함할 수 있다. u-PA 폴리펩타이드는 또한 표적 세포 유형 및/또는 조직을 특이적으로 감염시키고/시키거나 복제하는 벡터로부터 발현될 수 있다. 유도성 프로모터를 사용하여 u-PA 폴리펩타이드 발현을 선택적으로 조절할 수 있다.
핵산 분자, 네이키드 핵산 또는 벡터, 인공 염색체, 리포솜 및 다른 비히클은 전신 투여, 국소, 국소 및 다른 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 전신 및 생체 내의 경우, 핵산 분자 또는 핵산 분자를 함유하는 비히클은 세포에 표적화될 수 있다.
투여는 또한, 예컨대 전형적으로 세포 또는 조직을 표적화하는 벡터 또는 세포의 투여에 의해 직접적일 수 있다. 예를 들어, 종양 세포 및 증식 세포는 u-PA 폴리펩타이드의 생체 내 발현을 위해 표적화된 세포일 수 있다. u-PA 폴리펩타이드의 생체 내 발현에 사용되는 세포는 또한 환자 자기 유래의 세포를 포함한다. 이러한 세포는 환자로부터 제거될 수 있고, u-PA 폴리펩타이드의 발현을 위한 핵산은 도입된 후, 예컨대 주사 또는 생착에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
AMD 및 다른 안구 질환의 치료를 위한 투여
변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 그의 병인에서 보체 활성화를 수반하는 질환 또는 병태의 치료를 위해 투여될 수 있으며, 여기서 그의 억제는 질환 또는 병태의 증상을 완화시키거나 또는 달리 질환 또는 병태를 치료할 수 있다. 본원에 기재된 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 전달을 위해 설계된 벡터, 예컨대 바이러스 벡터와 같은 핵산은 질환 또는 병태에 따라 임의의 적합한 경로 또는 상이한 경로의 조합에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 핵산 전달은 눈으로의 직접 전달을 통해 (예컨대 안구 전달, 망막하 주사, 유리체내 (IVT) 주사, 망막내 주사, 또는 국소 (예를 들어, 점안제) 전달을 통해), 또는 전신 경로, 예를 들어 동맥내, 안내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 및 다른 비경구 투여 경로를 통한 전달을 통해 수행될 수 있다.
당업자는 투여를 위해 대상체 및 바이러스와 상용성인 임의의 투여 방식을 선택할 수 있고, 또한 바이러스가 표적 세포 유형 또는 조직, 예를 들어 눈, 예컨대 망막 색소 상피(RPE) 세포 및/또는 광수용체 세포에 도달하고 진입하게 할 가능성이 있다. 투여 경로는 질환의 특성, 표적 세포 또는 조직 (예를 들어, 세포 유형)의 특성, 및 투여될 특정 바이러스를 포함하는 임의의 다양한 인자에 따라 당업자에 의해 선택될 수 있다. 투여는 관심 세포 또는 조직, 예컨대 눈, 예를 들어 망막 색소 상피(RPE) 세포 및/또는 광수용체 세포 또는 망막하 공간이 표적화되는 경우에 선택될 수 있다
바이러스 발현 벡터와 같은 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 예를 들어, AMD와 같은 안구 질환과 같은 질환을 특징으로 하는 표적 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, 바이러스를 함유하는 조성물은 망막하 주사, 예컨대 망막 색소 상피(RPE), 광수용체 세포 또는 다른 안구 세포 (예를 들어, 망막 신경절 세포)로의 망막하 주사에 의해 전달될 수 있다. 일부 예에서, 바이러스, 예컨대 본원에 기재된 핵산을 함유하는 임의의 바이러스의 망막하 투여는 숙련된 의사가 유리체절제술을 수행하는 것을 필요로 한다 (즉, 바늘 구멍이 망막에 생성되고 (망막), 유체, 예컨대 바이러스, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 바이러스를 함유하는 유체가 주사됨). 망막하 주사는 각막관통 경로를 통해, 동공을 통해, 이어서 수정체, 유리체 및 망막을 통해 통과할 수 있다. 다른 예에서, 망막하 주사는 바늘 또는 임의의 다른 투여 장치를 공막을 통해 통과시키고, 중심- 또는 후방 유리체를 통해 망막의 반대측을 통해 망막하 공간으로 편평부 또는 변연부에 진입시킴으로써 수행될 수 있다. 다른 예에서, 망막하 주사는 바늘 또는 임의의 다른 투여 장치를 공막을 통해 및 맥락막 및 브루크막을 통해 통과시켜 RPE로의 전달을 달성하는 망막을 피함으로써 수행될 수 있다. 망막하 투여를 위한 다른 적절한 경로는 통상의 기술자 또는 의사 또는 외과의사에 의해 결정될 수 있다. 일부 예에서, 수포 형성은 성공적인 투여를 신호한다.
다른 예에서, 눈에서의 발현을 위해 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 함유하는 조성물은 안구 세포에 유리체내 주사에 의해, 예컨대 표적 유리체 세포 및 내부 망막에서의 세포로의 투여에 의해 전달될 수 있다. 일부 예에서, 유리체내 주사는 바늘 또는 임의의 다른 투여 장치를 망막의 중앙- 또는 후방 유리체를 통해 망막의 반대측으로 편평부를 통해 통과시킴으로써 수행된다. 유리체내 주사 후, 바이러스를 함유하는 조성물은 신경절 세포를 감염시키도록 전달될 수 있다. 다른 예에서, 유리체내 주사에 의해 전달된 바이러스를 함유하는 조성물은 내부 핵층 세포를 표적화한다. 전달의 효능은 바이러스 역가 및 혈청형에 의존한다. 일부 예에서, 치료는 눈의 뒤쪽에 투여된 제제의 농도를 증가시키기 위해 유리체내 이식가능한 장치 (즉, 생침식성 및 비생침식성인 유리체내 삽입가능한 장치)와 조합된 직접적인 유리체내 주사를 포함한다(Hwang 등 (2012) J Korean Med Sci 27:1580-85).
다른 예에서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 함유하는 조성물은 안검 정맥을 통해 표적 안구 세포에 주사된다. 다른 예에서, 바이러스는 예를 들어 망막 이식편으로서 눈으로의 이식을 위해 생체 외에서 적용된다(예를 들어, 절제된 RPE 맥락막 또는 태아 망막 세포 또는 망막 세포에 적용됨). 다른 예에서, 당업자, 예컨대 숙련된 의사는 본원에 기재된 핵산을 함유하는 임의의 바이러스의 투여를 위한 적절한 경로를 선택할 수 있다. 원한다면, 투여 경로가 조합될 수 있다.
일 예에서, 바이러스는 표적 세포, 예를 들어 병든 세포가 존재하는 부위에서, 즉 눈 또는 망막에 국소적으로 투여된다. 국소 투여는 종종 눈의 전방 분절의 눈 질환에서 사용된다(Patel 등 World J Pharmacol (2013) 2:47-64).
일 예에서, 유리체내로 전달될 바이러스는 유리체 내부의 편평부를 통해 얇은 바늘(27 내지 30G)로 투여될 수 있다. 당업자는 바늘 샤프트가 눈에 어디까지 삽입되는지(예를 들어, 삽입 깊이), 투여 속도(예를 들면, 플런저에 가해지는 압력), 베벨의 배향 각도, 및 샤프트와 평면부 사이의 각도를 결정할 것이다.
H. 치료 용도 및 치료 방법
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질 C3을 표적화하고, 보체 매개 질환 및 장애의 조절을 허용한다. 치료 프로테아제, 예컨대 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 전통적인 치료 접근법에 비해 많은 잠재적인 이점을 갖는다. 이들 중 핵심은 촉매 방식 (즉, 1 내지 많은 화학량론)으로 질환 표적을 불활성화시키는 능력이다. 따라서, 프로테아제는 표적 농도보다 상당히 낮은 농도에서 효과적인 조절을 유지할 수 있다. 추가의 구별 이점은 (1) 비가역적 불활성화; (2) 낮은 투여; (3) 감소된 투여 빈도; (4) 작은 분자 크기; (5) 번역후 변형을 표적화하는 능력; (6) 높은 표적 농도를 중화시키는 능력; 및 (7) 활성 부위로부터 멀리 표적화하는 능력을 포함한다. 치료제로서, 프로테아제는 여전히 하기 특징을 나타내어야 한다: (1) 분자 표적 (세포외)으로의 접근, 및 (2) 질환 상태에 중요한 표적에 대해 충분히 엄격한 특이성을 보유한다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 매개 질환 및 장애의 치료에 사용될 수 있다.
당업자는 질환 과정에서 보체계의 역할을 이해하고, 다양한 이러한 질환을 알고 있다. 예시적인 질환 및 그의 병인 및 병리학에서의 보체 단백질 C3의 역할에 대한 간략한 논의가 제공된다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 핵산 분자는 보체 경로의 활성화가 관련된 임의의 병태, 특히 급성 염증성 병태, 예컨대 패혈성 쇼크, 및 만성 염증성 병태를 포함하는 염증성 질환, 예컨대 류마티스 관절염(RA)의 치료에 사용될 수 있다. 급성 및 염증성 병태는 면역 매개 질환, 예를 들어, 자가면역 질환 또는 면역-복합체 매개 염증에 의해 야기되는 조직 손상으로서 나타날 수 있다. 보체 매개 염증성 상태는 또한 염증성 성분을 갖는 신경퇴행성 또는 심혈관 질환으로서 나타날 수 있다. 본 섹션은 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 예시적인 용도 및 투여 방법을 제공한다. 기재된 이들 요법은 예시적이며, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 적용을 제한하지 않는다. 이러한 방법은 하기 기재되고 열거된 생리학적 및 의학적 상태의 치료 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 방법은 연령 관련 황반 변성(AMD), 지리학적 위축증(GA), 발작성 야행성 혈색소뇨증(PNH), 신장 지연된 이식편 기능(DGF), 패혈증, 류마티스성 관절염(RA), 막증식성 사구체신염(MPGN), 홍반성 낭창, 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 천식, 염증성 장 질환, 호흡기 곤란 증후군, 면역 복합체(IC) 매개 급성 염증성 조직 손상, 다중-장기 부전, 알츠하이머병(AD), 사건 또는 치료, 예컨대 심근 경색(MI)에 의해 야기되는 허혈-재관류 손상, 뇌졸중, 심폐 우회로(CPB) 또는 관상동맥 우회로 이식술, 혈관성형술, 또는 혈액투석, 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 특발성 폐 섬유증(IPF) 및/또는 길랑 바레 증후군의 치료 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 의한 질환 및 병태의 치료는 피하 주사, 경구, 유리체내, 망막 내, 망막하, 안구주위 및 경피 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본원에 기재된 바와 같은 적합한 제형을 사용하여 임의의 적합한 투여 경로에 의해 수행될 수 있다. 필요한 경우, 특정 복용량 및 기간 및 치료 프로토콜은 경험적으로 결정되거나 추정될 수 있다. 예를 들어, 야생형 u-PA 폴리펩타이드의 예시적인 용량을 적절한 복용량을 결정하기 위한 출발점으로서 사용할 수 있다. 야생형 u-PA 폴리펩타이드와 비교하여 더 많은 특이성 및/또는 선택성을 갖는 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 감소된 복용량 및/또는 빈도에서 효과적일 수 있다. 복용량 수준은 다양한 인자, 예컨대 개체의 체중, 일반적인 건강, 연령, 사용된 특정 화합물의 활성, 성별, 식이, 투여 시간, 배출 속도, 약물 조합, 질환의 중증도 및 과정, 및 질환에 대한 환자의 배치 및 치료 의사의 판단에 기초하여 결정될 수 있다. 단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다.
환자의 상태의 개선 시, 화합물 또는 조성물의 유지 용량이 필요한 경우에 투여될 수 있고; 복용량, 투여 형태 또는 투여 빈도, 또는 그의 조합이 변형될 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 질환 증상의 임의의 재발 시 장기간 기준으로 간헐적 치료를 필요로 할 수 있다.
1. 보체 활성화에 의해 매개되는 질환
보체 캐스캐이드는 포식작용 및 염증을 촉진함으로써 박테리아 및 바이러스 침입에 대한 보호를 야기하는 양날의 검이다. 반대로, 보체가 정상적으로 기능하는 경우에도, 국소 염증 및 조직에 대한 손상을 촉진함으로써 질환의 발생에 기여할 수 있다. 따라서, 병리학적 효과는 보체의 보호 역할을 담당하는 동일한 매개인자에 의해 매개된다. 예를 들어, 아나필락시스성 및 화학주성 펩타이드 C5a는 호중구의 동원 및 활성화에 의해 염증을 유도하고, C3a는 다른 식세포의 병리학적 활성화를 야기할 수 있고, 막 공격 복합체는 세포를 사멸시키거나 손상시킬 수 있다. 일 예에서, 예컨대 많은 자가면역 질환에서, 보체는 부적절한 환경, 예컨대 숙주 조직에 대한 항체에 의해 활성화되기 때문에 조직 손상을 생성한다. 다른 상황에서, 보체는 정상적으로, 예컨대 패혈증에 의해 활성화될 수 있지만, 여전히 질환 진행, 예컨대 호흡 곤란 증후군에 기여한다. 병리학적으로, 보체는, 적절하게 조절되지 않는 경우, 혈관(혈관염), 신장 기저막 및 부착된 내피 및 상피 세포(신염), 관절 활액(관절염), 및 적혈구(용혈)에 실질적인 손상을 야기할 수 있다.
보체는 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염(예를 들어, Wang 등 (1995) Proc. Natl . Acad . Sci. U.S.A. 92:8955-8959; Moxley 등 (1987) Arthritis & Rheumatism 30:1097-1104), 홍반 루푸스(Wang 등 (1996) Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A. 90:8563-8568; 및 Buyon 등 (1992) Arthritis Rheum. 35:1028-1037) 및 급성 사구체신염(Couser 등 (1995) J Am Soc Nephrol . 5:1888-1894)을 비롯한 다수의 장애의 면역-발병에 역할을 한다. 보체계의 활성화를 수반하는 다른 병리는 패혈증 (예를 들어, Stove 등 (1996) Clin Diag Lab Immunol 3:175-183; Hack 등 (1989) Am. J. Med . 86:20-26 참조), 호흡 곤란 증후군 (예를 들어, Zilow 등 (1990) Clin. Exp . Immunol. 79:151-157; 및 Stevens 등 (1986) J. Clin . Invest. 77:1812-1816 참조), 다기관 부전 (예를 들어, Hecke 등 (1997) Shock 7:74; 및 Heideman 등 (1984) J. Trauma 24:1038-1043), 허혈-재관류 손상, 예컨대 심혈관 질환, 예컨대 뇌졸중 또는 심근경색에서 발생하는 것(Austen WG 등 (2003) Int J Immunopathol Pharm 16(1):1-8), 연령 관련 황반 변성(Bradley 등 Eye 25: 683-693 (2011); Gemenetzi 등 Eye 30: 1-14 (2016)) 및 신장 지연 이식 기능(Danobeitia 등 [abstract]. Am J Transplant. 2013; 13 (suppl 5); Yu 등 (2016) Am J Transplant 16(9):2589-2597; Castallano 등 (2010) Am J Pathol 176(4):1648-1659)을 포함한다. 보체 매개 질환의 일부 예시적인 예가 하기에 기재되어 있다.
a. 류마티스 관절염
류마티스성 관절염(RA)은 만성 염증성 질환이다. 이는 면역계가 침입 병원체인 것처럼 정상 조직 성분을 공격하는 자가면역 질환이다. 류마티스성 관절염과 관련된 염증은 주로 관절의 내벽을 공격한다. 혈관, 심장 및 폐 내벽 막은 또한 염증이 발생할 수 있다. RA는 활성화된 B 세포 및 염증이 있는 활막, 및 확립된 질환 림프성 여포 및 배중심에 존재하는 형질 세포를 특징으로 한다. 이는 고수준의 국소 면역글로불린 생산, 및 IgG 및 IgM 류마티스성 인자를 포함할 수 있는 면역 복합체의, 활액내 및 보체 캐스케이드의 개시제로서 작용할 수 있는 관절 연골과의 회합된 침착을 초래한다. 상승된 수준의 보체 성분, 예컨대 C3a, C5a, 및 C5b-9가 염증성 류마티스 관절 내에서 발견되었다. 이들 보체 성분은 다양한 전염증성 활성, 예를 들어 혈관 투과성, 백혈구 화학주성, 및 다중 세포 유형의 활성화 및 용해의 변경을 유도함으로써 RA와 연관된 염증을 악화시킬 수 있다.
b. 패혈증
패혈증은 전신 염증 반응을 야기하는 심각한 감염, 예컨대 박테리아 감염에 의해 야기되는 질환이다. 박테리아 세포벽 성분인 지질다당류는 종종 패혈증과 연관되지만, 다른 박테리아, 바이러스 및 진균 감염은 패혈 증상을 자극할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응의 전-염증성 결과가 숙주 조직에 손상되도록 신체의 천연 면역계가 침입 미생물에 대해 방어할 수 없는 경우, 종종 패혈증 쇼크가 발생한다. 패혈증의 초기 단계는 혈관 투과성을 증가시키고, 호중구로부터의 초과산화물 생성을 자극하고 히스타민 방출을 자극하는 작용을 하는 보체 아나필라톡신, 예컨대 C3a, C4a 및 C5a의 생성을 증가시키는 과도한 보체 활성화를 특징으로 한다. C5a의 작용은 박테리아 감염에 대한 생산적 면역 반응에 기여할 수 있지만, 조절되지 않은 채로 남아 있으면, C5a는 또한 심하게 손상될 수 있다. 대장균(E. coli)-유도된 염증 모델에서, C5a의 차단은 호중구 매개된 조직 손상을 야기할 수 있는 C5a 매개된 호중구 활성화를 제한함으로써 패혈 동물의 결과를 개선시켰다.
박테리아 감염에 대한 선천성 면역 반응의 지속적인 손상은 종종 만성 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 초래하며, 이는 생명을 위협할 수 있다. 패혈증의 후기 단계에서, 이는 계속된 질환에 기여하는 초기 단계에서 발생하는 과다활성과는 대조적으로 호중구의 "중단된" 활성이다. 후기 단계에서, 화학주성, 호흡 폭발 활성, 및 박테리아 사멸 능력을 포함하는 호중구의 주요 기능이 감소된다. 보체, 특히 C5a는 또한 패혈증의 후기 단계에서 역할을 한다. 패혈증 동안 C5a의 과도한 생산은 호중구 상의 그 자신의 수용체인 C5aR의 C5a-유도된 하향조절과 연관된 과정인 혈액 호중구의 "불활성화"와 연관된다(Guo 등 (2003) FASEB J 13:1889). 호중구 상의 C5aR의 감소된 수준은 C5a에 결합하는 혈액 호중구의 감소된 능력, 화학주성 반응 손상, 초과산화물 생성의 손실, 및 살균 활성 손상과 상관관계가 있다. 그러나, C5aR 수준은 패혈증의 후기 단계에서 "회복"되기 시작하고, 유익한 질환 결과의 사례와 상관관계가 있을 수 있다.
c. 다발 경화증
다발성 경화증(MS) 및 그의 동물 모델 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)은 중추 신경계 (CNS)의 염증성 탈수초성 질환이다. MS에서, 신경 조직의 염증은 뇌 및 척수에서 신경 섬유에 대한 일종의 보호 절연으로서 작용하는 지방 물질인 미엘린의 손실을 야기한다. 이러한 탈수초화는 신경 세포의 피복을 따라 흉터 조직 (경화증)의 다중 영역을 남기고, 이는 뇌로 및 뇌로부터 전기적 자극을 전도하는 신경의 능력을 파괴하여, MS의 다양한 증상을 생성한다. MS는 활성화된 림프구, 대식세포/미세아교세포 및 보체계에 의해 매개된다. 보체 활성화는 그의 이중 역할을 통해 이들 질환의 발병기전에 기여할 수 있다: 활성화된 말단 복합체 C5b-9가 탈수초화를 촉진하는 능력, 및 희소돌기아교세포 (OLG)를 아폽토시스로부터 보호하는 준용해성 C5b-9의 능력.
d. 알츠하이머병
알츠하이머병 (AD)은 뇌 내의 엉킴 (통상적으로 미세관에 결합하는 단백질 타우의 비정상적 쌍 나선 필라멘트) 및 플라크 (주로 베타-아밀로이드 단백질로 구성된 세포외 침착물)를 특징으로 한다. AD의 정확한 원인은 완전히 명확하지는 않지만, AD 뇌의 환부에서 만성 신경염증은 전염증성 매개체가 역할을 할 수 있음을 시사한다. AD 뇌 내의 엉킴 및 플라크는 활성화된 보체 단편, 예를 들어 C4d 및 C3d로 침착된다. 마찬가지로, AD 뇌에서의 이영양 신경돌기는 MAC에 대해 면역염색될 수 있고, 이는 이들 신경돌기의 자가촉매 공격 및 AD에서의 수반되는 신경돌기 손실을 나타낸다. AD에서 보체의 활성화는 응집된 아밀로이드-베타 단백질에 의해 유도된 항체-독립적 기전에 의해 발생한다. 추가로, 보체 캐스케이드는 모두 AD에서 상향조절되는 펜트락신, C-반응성 단백질 (CRP), 및 아밀로이드 P (AP)에 의해 활성화될 수 있다(McGeer 등, (2002) Trends Mol Med 8:519). 보체 매개체의 증가에 의해 표시된 AD에서의 보체의 활성화는 예를 들어 CD59와 같은 보체 조절 단백질의 보상적 상향조절에 의해 적절하게 제어되지 않는다. 따라서, 보체 활성화의 전염증성 결과는 AD 진행을 악화시키고 신경돌기 파괴에 기여할 것이다.
e. 허혈-재관류 손상
허혈-재관류 손상은 허혈성 사건 및 혈류의 후속 회복 후에 지속되는 손상이고, 저산소성 손상에 대한 염증 반응으로부터 발생한다. 허혈-재관류 손상은 심장 수술 절차 동안, 예를 들어 개방 심장 수술 또는 혈관성형술 후와 같이 급성일 수 있거나, 울혈성 심부전 또는 폐쇄 심혈관 질환과 같이 만성일 수 있다. 허혈-재관류 손상을 야기할 수 있는 손상의 예는 심근 경색(MI) 및 뇌졸중을 포함한다. 염증 반응의 개시는 재관류와 함께 발생하는 조직 산소 수준의 증가 및 면역자극성인 산소 유리 라디칼을 생성할 수 있는 대사산물의 동시 축적에 의해 야기될 것이다. 허혈-재관류 손상은 심근경색의 중증도, 뇌 허혈 사건, 장 허혈, 및 혈관 수술, 심장 수술, 외상, 및 이식의 많은 측면을 포함한 다양한 사건과 연관된다. 손상은 선천성 면역계의 염증 사건, 특히 보체계의 활성화에 의해, 새로 변경된 조직에 반응하여 비자기적으로 나타난다. 이러한 허혈-재관류 손상은 증가된 혈관 투과성으로 인한 조직 부종, 및 다형핵 백혈구의 유입으로 인한 급성 염증성 세포 침윤을 특징으로 한다.
보체계의 활성화는 허혈-재관류 손상의 염증성 사건에서 역할을 한다. 허혈 손상은 외부 표면의 지질, 탄수화물 또는 단백질에 영향을 미치는 세포막의 변경을 초래하여, 이들 노출된 에피토프가 변경되고 신생-항원 (변형된 자기 항원)으로서 작용할 수 있다. 순환하는 IgM은 신생-항원을 인식하고 결합하여 손상된 세포 표면 상에 면역 복합체를 형성한다. 형성된 항원-항체 복합체는 고전적인 보체 경로의 전통적인 활성화제이지만, 모든 경로는 일부 방식으로 손상의 악화 효과에 관여할 가능성이 있다. 허혈-재관류 손상에 대한 보체의 고전적 경로의 관여는 손상의 뒷다리 및 동물 모델에서 국소 손상으로부터 동일한 보호를 나타내는 C3 또는 C4가 유전적으로 결핍된 마우스에 의해 입증된다(Austen 등 (2003) Int J Immunopath Pharm 16:1). 반대로, 허혈 손상의 신장 모델에서, C3-, C5-, 및 C6-결핍 마우스는 보호된 반면, C4-결손 마우스는 보호되지 않았고, 이는 대안적인 보체 경로의 중요성을 시사한다(Guo 등 (2005) Ann Rev Immunol 23:821). 보체 활성화시 유도된 매개체는 국소 손상 부위에서 세포막에 대한 염증 반응을 개시한다.
허혈-재관류 손상에서 보체의 주요 효과기 메카니즘은 보체 성분, 예를 들어 C5a에 의한 염증 조직에 대한 호중구의 유입 및 활성화이다. 호중구의 활성화는 궁극적으로 아폽토시스, 괴사, 및 손실 또는 기관 기능을 야기하는 반응성 산소 종의 생산 및 국소 손상된 기관에서의 리소좀 효소의 방출을 증가시킨다. 말단 MAC, C5b-9의 생성은 또한 허혈-재관류 손상에서 국소 조직 손상에 기여한다.
f. 안구 장애
정상적인 눈에서, 보체계는 낮은 수준에서 지속적으로 활성화되고; 막-결합된 및 가용성 안내 보체 조절 단백질은 이러한 자발적인 보체 활성화를 엄격하게 조절한다. 낮은 수준의 보체 활성화는 자기-조직 및 시력 상실에 대한 임의의 손상을 야기하지 않으면서 병원체에 대해 보호한다. 보체계 및 보체 조절 단백질은 자가면역 포도막염에서 안구내 염증을 제어하고, 각막 염증, 연령 관련 황반 변성 및 당뇨병성 망막병증의 발생에서 중요한 역할을 한다. 보체계는 당뇨병성 망막병증(예를 들어, Ghosh 등 (2015) Endocr Rev 36:272-288)뿐만 아니라 당뇨병성 신경병증 및 당뇨병성 심혈관 질환의 발병기전에서 중요한 역할을 한다. 자발적인 보체 활성화는 감염 후 각막 조직에 손상을 야기할 수 있다. 보체 억제는 다양한 안구 질환의 치료에서 관련 치료 표적이다(예를 들어, Purusottam 등 (2007) Mol Immunol. 44:3901-3908).
연령 관련 황반 변성(AMD)
연령 관련 황반 변성은 중심 시력의 진행성 손실을 특징으로 하는 다양한 질환을 기재하는 임상 용어이다. AMD는 많은 산업화된 국가에서 노화된 개체에서 시력 상실의 주요 원인이다(Jager 등 (2008) N Engl J Med 358:2606-2617). 시력 상실은 황반의 진행성 퇴행으로 인해 발생하며, 눈의 뒤쪽 영역은 고밀도의 추상체 광수용체를 포함하고, 이는 높은-시력, 중심 시력에 대해 특수화된다.
AMD는 건성(비-신생혈관) AMD 및/또는 습성 AMD로서 나타날 수 있다. 건성 AMD는 보다 흔하고 (경우의 85-90%), AMD의 보다 경미한 형태이고, 황반 내 및 아래의 작은, 둥근, 백색-황색 병변 (드루젠)을 특징으로 한다. 진행성 건성 AMD, 또는 지도모양 위축은 PRE 광수용체의 손실로 인한 망막의 얇아짐, 황반의 악화 및 궁극적인 실명을 초래한다. 드물지만, 습성 AMD와 연관된 시력 상실은 일반적으로 건성 AAD에서보다 더 극적이다. 습성 AMD는 비정상적인 혈관이 망막의 망막 색소 상피(RPE) 층 아래에서 발생하는 맥락막 신생혈관화 (CNV)로 불리는 병원성 혈관의 형성을 포함한다. 브루크 막에서의 골절, 맥락막과 망막 색소 상피(RPE) 사이의 세포외 기질, 또는 이들의 파손을 통한 기저 맥락막으로부터의 망막의 CNV 침입은 AMD에서 시력 상실 (예를 들어, 망막하 출혈 및/또는 흉터로 인한)을 야기할 수 있다.
AMD의 초기 임상 특징은 브루크 막의 비후화 및 드루젠의 출현을 포함하며(Gass, J. D. (1972) Trans. Am. Ophthalmol . Soc . 70: 409-36), 이는 응집된 단백질 (즉, 알부민, 아포지질단백질 E (APOE)), 보체 경로의 성분 (예를 들어, 보체 인자 H (CFH), C1q, C3, C5, C6, C7, C8, C9, 및 비트로넥틴 (Hageman 등, (2001) Prog . Retin . Eye. Res 29:95-112; Hageman 등 (2005) Proc . Nat. Acad . Sci. 102: 7227-7232; Mullins 등 (2000) FASEB H 14:835-846; Anderson 등, (2010) Pro. Retin . Eye Res. 29:95-112)), 면역글로불린 및/또는 아밀로이드-β (Crabb 등, (2002) Proc Natl Acad Sci 99: 14682-14687; Johnson 등, (2002) 99: 11830-11835)) 및 RPE와 브루크 막 사이에 국소화된 지질 및 세포 성분으로 이루어진 세포외 지방단백질 침착을 포함한다.
AMD에서의 염증은 대안적인 보체 경로의 탈조절에 의해 매개된다. 보체 성분 C3 및 C5는 AMD를 갖는 환자에서 드루젠의 주요 구성성분이다(Mullins 등, (2000) FASEB J 14, 835-46; Johnson 등, (2000) Exp Eye Res 70, 441-9; Anderson et a, (2002) Am J Ophthalmol 134, 411-31; 및Leitner eta, (2001) ExpEye Res 73, 887-96). 드루젠 생물발생은 보체 활성화 및 MAC의 형성을 유발할 수 있는 만성 염증 과정을 수반하는 것으로 가정되며, 이는 RPE 세포를 용해시키거나 RPE 세포에서 생리학적 항상성을 방해하여 AMD의 염증 특징을 야기할 수 있다(Johnson 등 (2001) Exp Eye Res 73, 887-896). 보체 단백질 (예를 들어, C3d)은 또한 AMD 환자에서 혈액에서 검출되었고 (Scholl 등, (2008) PLoS One 3: e2593), 이는 AMD-유도된 염증이 전신일 수 있음을 나타낸다. 건성 AMD의 발병기전에서 보체에서의 역할에 대한 유전적 증거가 존재한다(Klein 등. Science 308(5720):385-389 (2005); Yates 등, NEJM 357:553-561 (2007)), 콤프스타틴 (및 콤프스타틴 유도체 APL-1 및 APL-2) 및 POT-4 (포텐티아 파마슈티칼스(Potentia Pharmaceuticals)), C3의 작은 펩타이드 억제제는 AMD에서 지도모양 위축의 진행을 늦출 수 있으며(Ricklin 등 (2008) Adv . Exp. Med . Biol . 632: 273-292), 이는 C3(즉, C3 억제)가 AMD 치료를 위한 생존가능한 표적일 수 있음을 나타낸다.
g. 장기 이식 및 지연 이식 기능(DGF)
보체는 허혈-재관류 손상의 발병기전에서 역할을 한다. 신장 재관류 손상의 메카니즘은 C5a 및 C5b-9의 생성에 의존하며, 이들 둘 다 급성 세뇨관 괴사 및 아폽토시스에 기여하고, 허혈후 급성 신부전 및 조직 섬유증을 유발하는 신장 세관에 직접적인 독성을 갖는다. 차례로, 이들 말단 경로 성분의 생성은 C3의 신장내 합성 및 보체 활성화에 필수적인 다른 보체 성분의 이용가능성에 의존한다. 공여자 기관에서의 C3의 발현 수준은 저온 허혈성 시간에 강하게 의존한다(Elham 등 (2010) Curr Opin Organ Transplant. 15:486-491).
고형 기관 이식에서의 거부는 초기 염증 반응 및 후속 적응 동종면역 반응에 의해 영향을 받고, 이들 둘 다는 다양한 보체 성분에 의해 영향을 받는다. 보체 단백질은 허혈 재관류 과정에서 및 적응 면역 반응의 활성화를 조절하는 이식 후 기관 손상에서 중요한 역할을 한다. 보체의 억제 또는 보체 단백질 분자의 기능의 조절은 이식 기관 손상을 감소시키고 기관 수명을 증가시킬 수 있다(예를 들어, Elham 등 (2010) Curr Opin Organ Transplant. 15:486-491). 치료적 개입을 위한 보체 성분의 표적화는 기관 회복, 전달 및 이식 후 시점에 기관 손상을 감소시킬 수 있다. 이러한 기관의 예는 신장이다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 이식 후 기관 손상을 완화 및/또는 치료하기 위해 투여될 수 있다.
지연 이식 기능(DGF), 예컨대 신장 지연 이식 기능은 이식된 기관이 이식 직후에 정상적으로 기능하지 못하는 신장 이식 환자의 하위세트에서 발생하는 병태이다. 다른 가능한 이식은 심장, 폐, 혈관 조직, 눈, 각막, 수정체, 피부, 골수, 근육, 결합 조직, 위장 조직, 신경 조직, 뼈, 줄기 세포, 섬, 연골, 간세포, 및 조혈 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 신장 DGF는 신장 동종이식편의 급성 괴사를 특징으로 하며, 이식 직후 투석의 필요성에 의해 임상적으로 정의된다. 이식 과정 동안 급성 신장 손상은 종종 DGF로서 나타난다. DGF의 기저를 이루는 병리학은 공여자-유래 인자, 예컨대 공여자 연령 및 허혈의 지속기간, 및 수용자 인자 예컨대 재관류 손상, 면역학적 반응 및 면역억제제 의약으로의 치료로부터의 기여와 복잡하다.
보체 캐스케이드 및 보체 활성화의 성분은 DGF를 야기하는 이식 거부 및 허혈-재관류 손상의 매개체로서 중요한 역할을 한다. 동물 연구는 허혈성 재관류 손상에서 보체에 대한 핵심 역할을 확립하였다. 예를 들어, C5에 대해 지시된 인간화 단클론성 항체인 에쿨리주맙은 보체 활성화를 차단하고, 고위험 신장 이식 환자의 하위세트에서 지연된 이식 기능을 방지하는 것으로 나타났다(예를 들어, Horizon Scanning Research and Intelligence Centre brief, 2016 September; Johnson 등 (2015) Curr Opin Organ Transplant 20(6):643-651; Yu 등 (2016) Am J Transplant 16(9):2589-2597). 과립 C4d 침착은 인간 신장 동종이식 수용자에서 DGF와 연관되었다(Kicic 등 (2014) Transpl Int 27(3):312-321). 증가된 C3 생산은 신장 이식 거부와 연관된다(Pratt 등 (2002) Nat Med 8(6):582-587; Damman 등 (2011) Nephrol Dial Transplant 26(7):2345-2354). 따라서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 이식 거부 및 DGF의 예방 또는 개선 또는 제거를 위한 치료제로서 사용될 수 있다.
2. 치료 용도
a. 면역 매개 염증성 질환
본원에 기재된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 염증성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 프로테아제로 치료될 수 있는 염증성 질환은 급성 및 만성 염증성 질환을 포함한다. 예시적인 염증성 질환은 중추 신경계 질환 (CNS), 자가면역 질환, 기도 과민반응 상태, 예컨대 천식, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 및 면역 복합체(IC) 매개 급성 염증성 조직 손상을 포함한다.
실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)에 대한 모델로서 작용할 수 있다(Piddsden 등, (1994) J Immunol 152:5477). EAE는 미엘린 및 미엘린 염기성 단백질, 단백지질 단백질 및 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)과 같은 미엘린 성분으로 면역화함으로써 다수의 유전적으로 민감한 종에서 유도될 수 있다. 예를 들어, MOG-유도된 EAE는 만성 재발 임상 질환 과정을 포함하는 인간 MS의 필수적인 특징, 염증의 병리조직학적 트리아드, 반응성 글리오시스, 및 큰 융합성 탈수초화 플라크의 형성을 재현한다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 EAE 동물 모델에서 평가될 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 예컨대 매일 복강내 주사에 의해 투여하고, 증상의 과정 및 진행을 대조군 동물과 비교하여 모니터링한다. 질환을 악화시킬 수 있는 염증성 보체 성분의 수준은 또한 용혈 검정에서 혈청 보체 활성을 검정하고 보체 성분, 예컨대 예를 들어 C1, C3 및 C9의 침착을 검정함으로써 측정될 수 있다.
보체 활성화는 류마티스 관절염(RA)과 같은 질환에서 염증을 조절한다(Wang 등, (1995) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 92:8955). 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 RA를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, u-PA 폴리펩타이드는 국소적으로 또는 전신적으로 주사될 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 매일 또는 매주 투여될 수 있다. 페길화된 u-PA 폴리펩타이드를 사용하여 면역원성을 감소시킬 수 있다. 일 예에서, 유형 II 콜라겐-유도된 관절염(CIA)은 염증성 활막염, 판누스 형성, 및 연골 및 골의 침식을 특징으로 하는 RA와 조직학적으로 유사한 자가면역 염증성 관절 질환의 모델로서 마우스에서 유도될 수 있다. CIA를 유도하기 위해, 완전 프로인트(Freund) 보조제의 존재 하에 소 유형 II 콜라겐 (B-CII)을 꼬리의 기저에서 피내로 주사할 수 있다. 21일 후, 동일한 프로토콜을 사용하여 마우스를 재면역화할 수 있다. u-PA 폴리펩타이드의 효과를 조사하기 위해, B-CII에 의한 초기 시험감염 후 3주째에, u-PA 폴리펩타이드 또는 대조군을 3주 동안 매주 2회 복강내 투여할 수 있다. 조직학적 분석을 위해 초기 면역화 후 7주에 마우스를 희생시킬 수 있다. 확립된 질환에 대한 u-PA 폴리펩타이드의 치료 효과를 평가하기 위해, 하나 이상의 사지에서 임상적 관절염의 발병 후 총 10일 동안 u-PA 폴리펩타이드를 매일 투여할 수 있다. 초기에 영향을 받은 관절에서의 팽윤도는 캘리퍼스를 사용하여 발 두께를 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 두 모델에서, 혈청은 예를 들어 C5a 및 C5b-9와 같은 활성화의 보체 마커의 측정 및 용혈 검정을 위해 마우스로부터 채취될 수 있다. 또 다른 예에서, 영장류 모델은 RA 치료에 이용가능하다. 압통 및 종창된 관절의 반응은 u-PA 폴리펩타이드로 치료된 대상체 및 대조군에서 모니터링되어 u-PA 폴리펩타이드 치료를 평가할 수 있다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 면역 복합체(IC) 매개 급성 염증 조직 손상을 치료하는데 사용될 수 있다. IC 매개 손상은 조직에서 IC 침착에 대한 국소 염증 반응에 의해 야기된다. 이어지는 염증 반응은 부종, 호중구증가증, 출혈, 및 최종적으로 조직 괴사를 특징으로 한다. IC 매개된 조직 손상은 생체 내 아르투스 (RPA) 반응에서 연구될 수 있다. 간략하게, RPA 반응에서, 과량의 항체(예를 들어 토끼 IgG 항-닭 달걀 알부민)를, 예를 들어 랫트 또는 기니아 피그와 같은 동물의 피부 내로 주사하고, 이는 이전에 상응하는 항원 (즉, 닭 알 알부민)이 정맥내로 주입되었다(Szalai 등, (2000) J Immunol 164:463). RPA 반응 개시 직전, u-PA 폴리펩타이드 또는 볼루스 대조군은 오른쪽 대퇴 정맥을 통한 정맥내 주사에 의해 상응하는 항원과 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로, u-PA 폴리펩타이드는 RPA 반응의 초기 시간 동안, 항원의 주사 직후 및 항체의 진피 주사 직전에 투여될 수 있다. 보체 의존 IC 매개된 조직 손상의 생성에 대한 u-PA 폴리펩타이드의 효과는 혈청 용혈 활성을 결정하기 위해 혈액을 수집하고, 병변 크기의 정량화를 위해 피부의 감염된 영역을 수거함으로써 RPA 개시 후 다양한 시간에 평가될 수 있다.
본원에 기재된 것과 같은 치료적 u-PA 폴리펩타이드는 치명적 쇼크를 초래할 수 있는 패혈증 및 중증 패혈증을 치료하는데 사용될 수 있다. 보체 매개 치사 쇼크의 모델을 사용하여 치료제로서의 u-PA 폴리펩타이드의 효과를 시험할 수 있다. 이러한 일 예에서, 랫트를 미량의 지질다당류 (LPS)로 프라이밍한 후, 보체의 막 억제제(항-Crry)에 대한 단클론성 항체를 투여할 수 있다(Mizuno 등, (2002) Int Arch Allergy Immunol 127:55-62). u-PA 폴리펩타이드 또는 대조군은 치명적 쇼크의 개시 과정 동안, 예를 들어 LPS 프라이밍 전, LPS 프라이밍 후, 또는 항-Crry 투여 후 임의의 시간에 투여될 수 있고, 치사적 쇼크로부터의 랫트의 구제를 평가할 수 있다.
b. 신경퇴행성 질환
보체 활성화는 알츠하이머병(AD)의 진행을 악화시키고, AD 뇌에서 신경돌기 손실에 기여한다. 본원에 기재된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 AD를 치료하는데 사용될 수 있다. AD의 신경병리학적 및 행동학적 특징 중 일부를 모방하는 마우스 모델을 사용하여 u-PA 폴리펩타이드의 치료 효과를 평가할 수 있다. 트랜스제닉 마우스 모델의 예는 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 또는 질환-생성 돌연변이를 갖는 프레세닐린 1 (PS1) 단백질을 공격적 프로모터의 제어 하에 마우스 내로 도입하는 것을 포함한다. 이들 마우스는 베타-아밀로이드 플라크 및 이영양성 신경돌기의 증가를 포함하는 AD의 특징을 발달시킨다. APP 및 PS1 돌연변이체 단백질에 대한 이중 트랜스제닉 마우스는 보다 많은 수의 섬유상 베타-아밀로이드 플라크를 발달시키고, 플라크와 연관된 활성화된 교세포 및 보체 인자를 나타낸다. u-PA 폴리펩타이드는 예컨대 매일 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있고, 증상의 과정 및 진행은 대조군 동물과 비교하여 모니터링된다.
c. 심혈관 질환
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 심혈관 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. u-PA 폴리펩타이드는 뇌졸중, 심근경색, 심폐 우회로, 관상 동맥 우회로 이식, 혈관성형술 또는 혈액투석으로 인한 허혈 재관류 손상을 포함하는 심혈관 질환의 치료에 사용될 수 있다. u-PA 폴리펩타이드는 또한 조직 손상에 기여할 수 있는 심폐 우회술과 관련된 염증 반응의 치료에 사용될 수 있다. 일반적으로, u-PA 폴리펩타이드는 보체 매개 허혈 재관류 손상을 유도하는 치료 또는 사건 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 일 예에서, u-PA 폴리펩타이드는 보체 매개, 허혈성-손상 유도 사건, 예컨대 예를 들어 혈관성형술의 관상 동맥 우회로 이식편에 의한 대상체의 치료 전에 대상체에게 투여될 수 있다.
허혈 재관류 손상의 치료에 대한 u-PA 폴리펩타이드의 효과는 손상의 동물 모델에서 평가될 수 있다. 이러한 한 모델에서, 심근 허혈은 그의 기원으로부터 5 내지 8 mm의 왼쪽 전방 하행 (LAD) 관상 동맥 주위에 3-0 실크 봉합사를 놓고 혈관이 완전히 폐색되도록 결찰을 조임으로써 그의 전방 심막에서 절개가 이루어진 토끼에서 유도된다(Buerke 등, (2001) J Immunol 167:5375). u-PA 폴리펩타이드, 예를 들어 변형된 u-PA 폴리펩타이드, 또는 대조군 비히클, 예컨대 염수는 관상동맥 폐색 55분 후 (즉, 재관류 5분 전) 볼루스로서 증가하는 용량으로 정맥내로 제공될 수 있다. 5분 후 (즉, 총 60분의 허혈 후), LAD 결찰은 풀릴 수 있고, 허혈성 심근은 3시간 동안 재관류될 수 있다. 재관류 기간의 마지막에, LAD 주위의 결찰이 조여진다. 허혈 손상에 대한 u-PA 폴리펩타이드의 효과는 심근 괴사, 혈장 크레아틴 키나제 수준, 및 호중구 활성화의 마커, 예를 들어 미엘로퍼옥시다제 활성 및 수퍼옥사이드 라디칼 방출에 대한 효과를 평가함으로써 분석될 수 있다.
6% 인간 혈장을 함유하는 크렙스-헨셀라이트(Krebs-Henseleit) 완충액으로 단리된 마우스 심장의 관류시 지속되는 보체 매개 심근 손상의 또 다른 모델에서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드로의 치료는 심장에 대한 조직 손상을 제한하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 심장을 관류시키는데 사용되는 완충액은 다양한 용량의 변형된 u-PA 폴리펩타이드로 보충될 수 있다. 관류된 심장은 인간 C3 및 C5b-9의 침착, 관상 동맥 관류 압력, 확장기말 압력 및 심박수에 대해 검정될 수 있다.
본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 종종 우회로에 이어지며 조직 손상에 기여할 수 있는 염증성 면역 반응을 억제하기 위해 심장폐 우회(CPB) 또는 관상 동맥 우회로 이식 이전 또는 이후에 치료제로서 사용될 수 있다. 체외 우회 회로에서 전혈의 시험관 내 재순환을 사용하여 혈소판 및 백혈구 변화 및 CPB에 의해 유도된 보체 활성화를 자극할 수 있다(Rinder 등 (1995) J. Clin . Invest. 96:1564). 이러한 모델에서, 체외 회로에 혈액을 첨가하기 직전에, 다양한 용량으로 u-PA 폴리펩타이드 또는 대조군 완충액을 건강한 공여자 및 돼지 헤파린으로부터의 혈액을 이미 함유하는 전달 팩에 첨가할 수 있다. 혈액 샘플은 재순환 후 5분, 15분, 30분, 45분, 60분, 75분 및 90분에 채취될 수 있고, C5a, C3a 및/또는 sC5b-9에 대해 측정하기 위해 보체 연구, 예를 들어 용혈 검정 및/또는 보체 활성화 검정에 대해 검정될 수 있다. 체외 회로에 추가되기 전에 인출된 혈액의 전처리 샘플이 대조군으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, CD11b 및 P-셀렉틴 수준과 같은 혈액 내의 순환 백혈구(즉, 호중구)의 집단 상의 부착 분자의 수준을 결정하기 위해 혈액 샘플의 유동 세포측정법을 수행할 수 있다.
d. 연령 관련 황반 변성(AMD)
본원에 기재된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 연령 관련 황반 변성(AMD)을 치료하는데 사용될 수 있다. 프로테아제로 치료될 수 있는 연령 관련 황반 변성(AMD)은 습성 AMD, 건성AMD 및 지도모양 위축을 포함한다.
인간 장애의 많은 특징을 모방하는 다수의 AMD 동물 모델이 이용가능하다(Pennesi 등 (2012) Mol . Aspects Med . 33(4):487-509)). 보체 경로 유전자에서의 돌연변이는 AMD에 대한 감수성을 증가시키거나 감소시키는 것으로 나타났다(Edwards 등 (2005) Science 308(5720):421-424; Hageman 등 (2005) Proc . Nat. Acad . Sci 102(20): 7227-7232; Klein 등 (2005) Science 308(5720):385-389). 예를 들어, 정상적으로 C3b와 상호작용하는 보체 인자 H (CFH)에서, 단일 뉴클레오타이드 다형성 Y402H는 인자 B와 C3B의 결합을 방지하여, C3 형성의 억제를 유발하였다. Y402H는 사람에서 AMD의 증가된 위험과 연관되고, 돌연변이는 AMD 환자의 43-59%에서 이전에 확인되었다(Haines 등 (2005) Science 308(5720): 419-421; Thakkinstian 등 (2006) Hum. Mol . Genet. 15(18): 2784-2790; Zareparsi 등 (2005) Am. J. Hum. Genet. 77(1): 149-153).
CFH를 만드는 능력이 결여된 유전적으로 변형된 마우스는 망막 이상, 감소된 시력 및 보체 침착을 포함하는 AMD의 특징을 발생시킨다(Coffey 등 (2007) Proc . Nat. Acad . Sci . 104:16651-16656). 보체 단백질 인자 B에서의 돌연변이 (Montes 등 (2009) Proc . Nat. Acad . Sci . 106(11): 4366-4371), C2 (Gold 등 (2006) Nat. Genet. 38(4): 458-462), 및 C3(Maller 등 (2007) Nat. Genet. 39(10): 1200-1201; Yates 등 (2007) New Engl . J. Med . 357(6): 553-561)은 다양한 보체 단백질의 발현 및/또는 활성에 대한 그의 영향에 기초하여 AMD 발병의 증가된 또는 감소된 위험과 연관된다(Reynolds 등 (2009) Invest. Ophthalmol . Vis . Sci . 50(12): 5818-5827).
보체 단백질 C3을 절단하기 위한 u-PA 프로테아제의 활성, 예컨대 기질 특이성 또는 선택성이 변경된, 변형된 u-PA 프로테아제, 예컨대 본원에 제공된 변형된 u-PA 프로테아제가 치료제로서 사용될 수 있다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 예를 들어, 격월로 유리체내 또는 망막하, 또는 망막내 주사에 의해 투여되고, 증상의 과정 및 진행은 대조군 동물 또는 대상체와 비교하여 모니터링된다. 질환을 악화시킬 수 있는 보체 성분의 수준은 또한 용혈 검정에서 혈청 보체 활성을 검정하고, 예를 들어, C1, C3 및 C9와 같은 보체 성분의 침착을 검정함으로써 측정될 수 있다.
보체 활성화는 연령 관련 황반 변성(AMD)에서 질환 진행에서 역할을 한다(예를 들어, Bradley 등, (2011) Eye 25:683-693; Gemenetzi 등 (2016) 30:1-14). 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 AMD를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, u-PA 폴리펩타이드, 또는 본원에 기술된 변형된 u-PA 폴리펩타이드와 같은 u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물은 유리체내, 또는 망막내, 망막하, 또는 안구주위로 주사될 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 매일 또는 매주 또는 덜 빈번하게, 예를 들어 매월 또는 덜 빈번하게, 예컨대 격월로 투여될 수 있다. AMD의 경우, 눈에서 연장된 기간 동안 추가로 "변형"되지 않은 변형된 uPA 폴리펩타이드(예를 들어, 융합 단백질, 페길화 등)의 매월 투약이 가능할 것이다(격월 투약도 고려된다). 적절한 "변형" 후, 3개월마다(또는 덜 빈번하게) 가능할 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 잠재적인 면역원성을 감소시키고/시키거나 혈청 반감기를 증가시키기 위해 페길화에 의해 변형될 수 있다. AMD의 경우, 눈에서 연장된 기간 동안 추가로 변형되지 않는 변형된 u-PA 폴리펩타이드 (예를 들어, 융합 단백질, 페길화)의 매월 투여 또는 격월 투여가 사용된다. 예를 들어 페길화에 의해 변형되는 경우, 투여는 매 3개월 또는 그 이상마다 수행될 수 있다.
e. 장기 이식
지연된 이식 기능(DGF)
본원에 기재된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는, 예를 들어 신장 이식 수용자에서 허혈-재관류 손상의 결과로서 DGF를 포함하는 지연된 이식 기능(DGF)을 치료하는데 사용될 수 있다. u-PA 폴리펩타이드는 또한 조직 손상에 기여할 수 있는 기관 이식과 관련된 염증 반응의 치료에 사용될 수 있다. 일반적으로, u-PA 폴리펩타이드는 보체 매개 허혈 재관류 손상을 유도하는 치료 또는 사건 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 일 예에서, u-PA 폴리펩타이드는 보체 매개, 허혈성-손상 유도 사건, 예를 들어 신장 이식 또는 신장 동종이식편에 의해 대상체의 치료 전에 대상체에게 투여될 수 있다. 지연된 이식 기능, 예를 들어 허혈-재관류 손상의 결과로서 지연된 이식 기능의 치료에 대한 u-PA 폴리펩타이드의 효과는 인간 신장 동종이식편 또는 이식에서 나타나는 특징을 모방하는 손상의 동물 모델에서 평가될 수 있다.
관상 상피 세포 손상에 대한 바이오마커를 포함하는, DGF를 야기하는 초기 이식 기능장애의 초기 바이오마커의 존재는 치료제에 대한 필요성을 나타낼 수 있다. DGF의 바이오마커 (즉, 혈청 크레아틴)가 확인되었다(Malyszko 등 (2015) Nature Scientific Reports 5:11684; Wanga 등 (2015) PLoS One 10(9):e0136276). DGF에 대한 바이오마커의 조기 검출 및 치료적 개입, 예를 들어, 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 이용한 치료적 치료는 임상 결과를 개선시킬 수 있다.
보체 활성화는 장기 이식, 예를 들어 신장 이식 후 지연된 이식 기능과 같은 장애의 질환 진행을 조절한다(Yu 등 (2016) Am J of Transplantation 16(9):2589-2597). 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 사용하여 DGF를 치료할 수 있다. 예를 들어, u-PA 폴리펩타이드는 전신 전달을 위해 투여될 수 있거나 이식편 또는 주변 조직 내로 직접 주사될 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 이식 전, 이식 동안 또는 이식 후에 투여될 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 매일 또는 매주 또는 덜 빈번하게, 예를 들어 매월 또는 덜 빈번하게, 예컨대 격월로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 단일 전신 용량이 투여된다. 수 시간에 걸친 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 다중 주입이 또한 고려된다.
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 만성적으로 전달될 수 있고, 필요한 경우, 예를 들어, 변형된 u-PA 폴리펩타이드, 예컨대, 본원에 기재된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 동종이식 수용자에서 유효량을 유지하기 위해 매일 또는 또 다른 스케줄로 전달될 수 있다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 수용자에서 동종이식편 생존, 특히 동종이식편의 만성 생존을 연장시키는데 사용될 수 있다. 페길화된 u-PA 폴리펩타이드를 사용하여 면역원성을 감소시킬 수 있다.
3. 조합 요법
본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드는 질환 및 병태를 치료하기 위해 다른 기존의 약물 및 치료제와 함께 사용될 수 있다. 이러한 치료는 다른 항염증 약물 및/또는 치료제와 함께 수행될 수 있다. 조합 요법에 유용한 항염증 약물 및 제제의 예는 살리실레이트, 예컨대 아스피린, 전통적인 NSAID, 예컨대 이부프로펜, 나프록센, 케토프로펜, 나부메톤, 피록시캄, 디클로페낙 또는 인도메타신, 및 Cox-2 선택적 억제제, 예컨대 셀레콕시브 (Celebrex® 하에 시판됨) 또는 로텍신(Vioxx® 하에 시판됨)을 포함하는 비-스테로이드성 항염증 약물(NSAID)을 포함한다. 조합 요법에 유용한 다른 화합물은 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 레플루노미드, 코르티코스테로이드 또는 다른 스테로이드, 예컨대 코르티손, 덱사메타손, 또는 프레드니손, 진통제, 예컨대 아세트아미노펜, 아미노살리실레이트, 예컨대 메살라민, 및 세포독성제, 예컨대 아자티오프린(Imuran® 하에 시판됨), 시클로포스파미드 (Cytoxan® 하에 시판됨), 및 시클로스포린 A를 포함한다. 조합 요법에 사용될 수 있는 추가의 제제는 생물학적 반응 조절제를 포함한다. 생물학적 반응 조절제는 TNF-알파의 억제제, 예컨대 에타네르셉트 (Enbrel® 하에 시판됨), 인플릭시맙 (Remicade® 하에 시판됨), 또는 아달리무마다드 (Humira® 하에 시판됨), 및 IL-1의 억제제 예컨대 아나킨라 (Kineret® 하에 시판됨)과 같은 전염증성 사이토카인 억제제를 포함할 수 있다. 생물학적 반응 조절제는 또한 항-염증성 사이토카인, 예컨대 IL-10, B 세포 표적화제, 예컨대 항-CD20 항체(Rituximab® 하에 시판됨), T 항원을 표적화하는 화합물, 부착 분자 차단제, 케모카인 수용체 길항제, 키나제 억제제, 예컨대 미토겐-활성화 단백질 (MAP) 키나제, c-Jun N-말단 키나제(JNK), 또는 핵 인자 (NF) κB (NFκB)에 대한 억제제, 및 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체-감마 (PPAR-γ) 리간드를 포함할 수 있다. 조합 요법에 사용될 수 있는 추가의 제제는 면역억제제를 포함한다. 면역억제제는 타크롤리무스 또는 FK-506; 미코페놀산; 칼시뉴린 억제제(CNI); CsA; 시롤리무오스 또는 면역계를 억제하는 것으로 공지된 다른 제제를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드는 또한 심혈관 질환을 치료하기 위해 투여되고/되거나 심혈관 질환을 치료하는 절차 동안 투여되는 제제, 예컨대 보체 매개 허혈-재관류 손상과 연관된 염증성 병태에 기여하는 본원에 기재된 것과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 제공된 u-PA 폴리펩타이드는 항응고제와 조합하여 투여될 수 있다. 예시적인 항응고제의 예는 헤파린, 와파린, 아세노쿠마롤, 페닌디온, EDTA, 시트레이트, 옥살레이트, 및 직접 트롬빈 억제제, 예컨대 아르가트로반, 레피루딘, 비발리루딘 및 지멜라가트란을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드는 또한 DGF를 치료하기 위해 투여되는 제제와 함께 사용될 수 있다. 본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드는 예를 들어 면역억제제와 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 조합은 수용자에서 동종이식편 생존, 특히 동종이식편의 만성 생존을 연장시키는데 유용하다. 바람직한 일 구현예에서, 조합물은 동종이식편의 수용자에게 만성 투여하기에 적합하도록 제제화 및 제조되며, 예를 들어 안정한 제제가 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 조합물은 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 면역억제 약물을 동종이식편의 수용자에게 동시에 투여하기에 적합하도록 제형화되고 제조된다. 특정 구현예에서, 상기 조합물은 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 면역억제 약물을 동종이식편의 수용자에게 순차적으로(어느 순서로) 투여하기에 적합하도록 제형화되고 제조된다.
본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드는 또한 황반 변성을 치료하기 위해 투여되는 다른 제제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 라니비주맙 (LucentisTM 하에 시판됨); 베바시주맙(AvastinTM 하에 시판됨); 페갑타닙 소듐 (MacugenTM 하에 시판됨): 아플리베르셉트(EyleaTM 하에 시판됨); 및 베르테포르핀(verteporfin) (VisudyneTM 하에 시판됨) 중 임의의 하나 이상과 함께 투여될 수 있다. 본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드는 또한 이식가능한 망원경, 레이저 치료 또는 레이저 광응고, 수술 및/또는 광역학 요법과 조합되어, 단독으로 또는 치료 베르테포르핀과 조합되어 황반 변성을 치료하는데 사용될 수 있다.
추가의 제제, 예컨대 다른 보체 억제제는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 u-PA 폴리펩타이드와의 조합 요법에서 항염증 약물로서 사용될 수 있다. 이러한 다른 보체 억제제의 예는 코브라 독 인자(cobra venom factor: CVF), 다중음이온성 분자, 예컨대 헤파린, 덱스트란 설페이트, 폴리비닐 설페이트, 폴리라이신, 또는 수라민, 천연 분자, 예를 들어 K-76COOH, 로스마린산, 또는 중국 약용 허브 에페드라(Chinese medicinal herb Ephedra)의 추출물, 합성 분자, 예컨대, 아파마스타트 메실레이트(afamastat mesilate: FUT-175), C1s의 합성 억제제(C1s-INH-248), 또는 Cls 및 fD에 대한 억제제(BCX-1470), 펩타이드 억제제, 예컨대 콤프스타틴, 보체의 항체 억제제, 예를 들면, 항-C5(N19-8), 인간화 항-C5 (h5G1.1), 항-C6, 또는 항-C8 항체, 및 가용성 형태의 막 보체 조절제, 예컨대 가용성 CR1(sCR1), 가용성 DAF(sDAF), 가용성 MCP(sMCF), 또는 가용성 CD59(sCD59)를 포함한다(Morgan 등, (2003) Mol Immunol. 40:159).
본원에 기재된 u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물은 보체 활성화에 의해 매개되는 임의의 하나 이상의 염증성 질환 또는 병태를 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 염증성 질환 또는 병태의 치료를 위한 u-PA 폴리펩타이드와 또 다른 치료 또는 화합물의 조합물이 제공된다. u-PA 폴리펩타이드 및 항염증제는 함께 또는 순차적으로 또는 간헐적으로 투여하기 위한 별도의 조성물로서 포장될 수 있다. 대안적으로, 이들은 투여를 위한 단일 조성물로서 또는 단일 조성물로서 투여를 위한 2개의 조성물로서 제공될 수 있다. 조합물은 키트로서, 임의로 추가의 시약, 사용 설명서, 바이알 및 다른 용기, 주사기 및 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 사용을 위한 다른 품목과 함께 포장될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시적인 목적을 위해 포함되고, 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예 1
변형된 u-PA 폴리펩타이드의 클로닝 및 발현, 및 QHAR /AS 부위에서 C3을 절단하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 대한 스크리닝
A. u-PA의 클로닝
인간 u-PA 폴리펩타이드(Uniprot P00749; 서열번호: 1에 제시됨)의 키모트립신 넘버링(서열번호: 5에 제시됨)에 의한 C122S 돌연변이를 갖는 아미노산 179-431을 인코딩하는 핵산을 작은 유비퀴틴-유사 개질제(SUMO) 태그의 C-말단에 있는 pE-SUMO-AMP 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 작제물은 신호 펩타이드(아미노산 1-20) 및 프로테아제 도메인(아미노산 179-431)을 포함하였다.
B. 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 생성
변형된 u-PA 폴리펩타이드는 설계된 돌연변이를 새로 합성된 DNA 내로 도입하기 위한 프라이머로서 작용하는 특이적으로 설계된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 제조자의 지시에 따라 Quikchange 부위 지정 돌연변이유발(스트라타진)에 의해 생성되었다. 주형으로서 야생형 u-PA DNA 및 원하는 돌연변이(들)를 함유하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 함유하는 PCR 반응을 설정하였다. PCR 후, 각각의 반응 생성물을 DpnI로 소화시켜 DNA의 댐 메틸화 모 가닥을 제거하였다. 이어서, DNA를 대장균(E. coli) XL-1 블루 슈퍼컴피턴트 세포(스트라타진) 내로 형질전환시키고, 50 μg/ml 카르베니실린을 함유하는 선택적 한천 상에 플레이팅하였다. 플라스미드 DNA를 선택된 클론으로부터 단리하고, 서열분석하여 u-PA 인코딩 DNA 내의 선택된 위치(들)에서의 의도된 돌연변이의 혼입 및 임의의 추가의 바람직하지 않은 돌연변이의 부재를 확인하였다.
C. u-PA 폴리펩타이드의 제조
1. 형질전환
야생형 및 각각의 변이체 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA를 상기 섹션 A에 상술된 바와 같이 작은 유비퀴틴-유사 개질제(SUMO) 태그 및 프로도메인의 C-말단의 pE-SUMO-AMP 발현 벡터 내로 클로닝하고, 생성된 작제물을 BL21 골드(DE3) 대장균(E. coli) 세포(Agilent Technologies, 카탈로그 번호: 230132) 내로 형질전환시켰다. 대략 50 μL의 화학적으로 적격인 BL21 골드(DE3) 세포를 0.5 μL의 적절한 플라스미드 DNA(전형적으로 1 pg - 50 ng의 총 DNA를 함유함)로 형질전환시켰다. 세포 및 DNA를 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 세포를 42℃에서 45초 동안 열충격시키고, 얼음 상에서 2분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 450 μL의 실온 테리픽 브로쓰(Terrific Broth; TB) 배지(VWR International, 카탈로그 번호 100219-866)를 혼합물에 첨가하고, 세포를 37℃에서 240 rpm으로 진탕하면서 1시간 동안 TB 배지에서 인큐베이션하였다. 이 형질전환 혼합물 20 μL를 2x YT 배지 + 100 μg/mL 카르베니실린 플레이트(Teknova)(카탈로그 번호: Y4420) 상에 펴바르고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
2. u-PA 폴리펩타이드의 발현
원하는 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA를 함유하는 세포(전형적으로 상기에 기재된 형질전환 과정으로부터 단일한 "확인된" 콜로니로부터 수득됨)를 50 μL의 카르베니실린, 0.3 mL의 20% 락토스 용액, 5 mL의 인산 완충액, 및 45 ml의 염기 테리픽 브로쓰(Terrific Broth; TB) 배지(Teknova, 카탈로그 번호 L0350)를 조합함으로써 제조된 대략 50 mL의 배지에서 성장시켰다. 세포 및 성장 배지를 37℃에서 Infors Multitron Shaker에서 400 rpm으로 회전시켰다. 18 내지 22시간의 성장 후, 박테리아를 4℃에서 10분 동안 Fiberlite F13-14x50cs 원심분리 로터(Thermo-Fisher)를 갖는 Beckman Sorval RC6 Plus Centrifuge 내의 50 ml Falcon 원심분리 튜브에서 7,000 rpm으로 원심분리하여 펠렛화하였다. 원심분리 후, 상청액을 따라내었다.
50 mL 배양물로부터의 세포 펠릿을 10 ml의 세포 용해 완충액 A(50 mM Tris, pH 8.0, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.1 mg/mL 리소자임) 중에 재현탁시켰다. 세포 펠릿을 240 rpm에서 1시간 동안 37℃에서 진탕하여 완충액 A에서 재현탁 시켰다. 생성된 혼합물을 7,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내었다. 생성된 펠렛을 20 μL BenzonaseTM(Millipore Sigma)를 함유하는 10 ml BugBuster 추출 시약(Merck Millipore, NC9591474)에 재현탁시켰다. 세포를 볼텍싱 및 37℃에서 1시간 동안 240 rpm에서 진탕함으로써 재현탁시켰다. 진탕 후, 나머지 불용성 물질을 10,000 rpm에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하여 펠릿화하고, 상청액을 따라내었다. 생성된 펠릿을 10 ml의 세척 완충액 A [50 mM Tris(pH 8.0), 300 mM NaCl, 및 1% 트리톤 X-100] 중에서 Power Gen 500 균질기(Fisher Scientific, 14-261-04P)를 사용하여 균질화시킴으로써 재현탁시켰다. 재현탁된 u-PA 폴리펩타이드 봉입체(IB)를 함유하는 이 혼합물을 10,000 rpm으로 15 분 동안 4℃에서 원심 분리하고, 상청액을 폐기하였다. 새로운 펠릿을 10 mL의 세척 완충액 B(50 mM Tris(pH 8.0)) 중에 재현탁시키고, 펠릿이 잘 분산될 때까지 반복적으로 균질화시켰다. 생성된 혼합물을 다시 10,000 rpm에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하고, 상청액을 따라내고, 펠릿을 10 내지 15분 동안 공기 건조시켰다. 이러한 u-PA 폴리펩타이드 봉입체(IB)의 펠릿은 -20℃에서 보관될 수 있거나, 또는 하기 기재된 언폴딩 및 리폴딩을 위해 즉시 사용될 수 있다.
3. uPA의 언폴딩
불용성 SUMO-u-PA 폴리펩타이드 융합 단백질 봉입체를 5 mL의 언폴딩 완충액[6M GuHCl, 50 mM Tris pH 8, (Teknova, 카탈로그 번호: G0380)에 용해시키고 변성시켰다. 새로 제조된 DTT를 리폴딩 절차 당일에 10 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 이 IB 용액을 240 rpm에서 37℃에서 적어도 1시간(전형적으로 2시간) 동안 또는 봉입체가 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 완전히 용해된 IB 용액은 투명하지만 갈색을 띤 색조를 나타낼 수 있다.
4. u-PA의 리폴딩
상기 기재된 언폴딩된 u-PA 폴리펩타이드의 5 ml 용액을 2.5 ml의 2개의 분취물로 나누고, 각각의 분취물을 200 ml의 리폴딩 완충액 [1.5 M 아르기닌, 50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM GSH(L-글루타티온 환원됨, Sigma-Aldrich), 및 4.0 mM GSSG(L-글루타티온 산화됨, Sigma-Aldrich)에 첨가하였다. 리폴딩 완충액 중 u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 이 용액을 진탕기 상에서 150 rpm에서 24시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 폴딩이 일어나도록 하였다.
생성된 단백질 용액을 대략 35 cm 길이인 12,000-14,000 달톤 분자량 컷오프(MWCO) Spectra/Por® 재생 셀룰로스 투석 튜브(VWR)로 옮기고, 25 mM 비스-트리스, pH 6.1에서 투석하였다. 샘플을 적어도 밤새, 보다 전형적으로 수일 동안 투석하였다. 단 1일 동안 투석된 샘플을 실온에서 인큐베이션하고, 1일 이상 동안 투석된 샘플을 4℃에서 인큐베이션하였다. 총 샘플 부피에 대한 총 투석 완충액 부피의 최적 비는 적어도 100이었다. 보다 낮은 비율은 통상적으로 적절하게 폴딩된 u-PA 폴리펩타이드의 보다 낮은 수율을 생성하였다. 투석 후, 프로테아제 샘플을 투석 튜브로부터 제거하고, 500 mL 0.22 μm 플라스크(Millipore)를 사용하여 여과하였다.
4. 자이모겐의 칼럼 정제
이어서, 단백질 용액을 설포프로필 세파로스 패스트 플로우(SPFF) 시스템을 사용하여 정제하였다. 각각의 Econo 칼럼(BioRad)에 6 mL의 SPFF Superflow 슬러리(GE Lifesciences)(약 3 mL의 수지를 가짐)를 첨가하여 칼럼을 제조하고, 저장 용액을 수지로부터 배출시켰다. 이어서, 10 mL의 25 mM 비스-트리스 pH 6.1, 1 M NaCl을 수지를 함유하는 칼럼에 첨가하고, 용액을 칼럼을 통해 유동시켰다. 이어서, 10 mL의 25 mM 비스-트리스 pH 6.1을 수지를 함유하는 칼럼에 첨가하고, 용액을 통과시켰다. 칼럼의 바닥을 캡핑하고, 10 mL의 25 mM 비스-트리스 pH 6.1 완충액을 첨가하여 저장하여 수지를 평형화시켰다.
리폴딩되고 투석된 u-PA 폴리펩타이드 샘플 용액을 평형화된 SPFF 칼럼에 적용한 후, 10 ml의 25 mM 비스-트리스 pH 6.1, 50 mM NaCl을 적용하였다. 이어서, 불활성화된 u-PA 폴리펩타이드 자이모겐을 4 ml의 25 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl로 용리시키고, 이를 50 mL 팔콘 튜브에 수집하였다. 이어서, 샘플을 25 mM Tris pH 7.5로 12 ml의 총 부피로 희석하였다.
5. u-PA 자이모겐의 활성화
12 ml의 활성화 완충액(25 mM Tris pH 7.5, 20 mM 벤즈아미딘)을 첨가하여 정제된 u-PA 폴리펩타이드 자이모겐을 함유하는 12 ml 샘플을 희석하였다. 이어서, u-PA 폴리펩타이드 자이모겐을 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 SUMO 프로테아제 유비퀴틴-유사 특이적 프로테아제-1(ULP-1)을 사용하여 상응하는 활성 u-PA 프로테아제로 전환시켰다. u-PA 폴리펩타이드 자이모겐의 "활성화"는 120 μg의 ULP-1을 정제된 지모젠에 첨가하고, 용액을 잠시 와류시키고, 샘플을 실온에서 밤새 인큐베이션함으로써 달성하였다.
6. 활성화된 u-PA 폴리펩타이드의 정제
이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 활성 u-PA 폴리펩타이드를 정제하였다. 크로마토그래피 전에, 샘플을 50 ml 필터 단위로 여과하였다. Vivapure Q 스핀 칼럼을 5 ml의 25 mM Tris pH 7.5, 1 M NaCl 및 10 ml의 25 mM Tris pH 7.5로 사전-조건화시킨 후, Sorvall Legend RT 원심분리기에서 5분 동안 500 g에서 원심분리시켰다.
활성화된 u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 각각의 샘플을 19 mL 배치로 개별 Q-스핀 컬럼 상에 로딩하고, 각각의 실행에 대해 5분 동안 500g에서 원심분리하였다. SUMO 태그 및 자이모겐이 없는 활성화된 u-PA를 함유하는 통과액을 수집하였다. 생성된 u-PA 샘플의 pH를 12 ml의 25 mM 시트르산, pH = 5.0 및 60 μL의 1 M 시트르산을 첨가함으로써 조정하였다. 이어서, 생성된 단백질 용액을 사전-조건화된 비바퓨어 S 스핀 칼럼 상에 로딩하였다. 이 칼럼을 5 ml의 25 mM Tris pH 7.5, 1 M NaCl 및 10 mL의 25 mM Tris(pH 7.5)로 사전조건화한 후, 칼럼을 500 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 샘플을 19 ml 배치로 S-컬럼(HiTrap SP HP; GE Healthcare) 상에 로딩하고, 컬럼을 500 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 이 공정으로부터의 흐름을 폐기하였다. 이어서, 칼럼을 25 mM 시트르산나트륨 pH 5.0, 20 mM NaCl 10 ml로 "세척"하였다. 칼럼을 세척한 후, 수집 튜브를 희석 완충액 50 mM 시트르산나트륨 pH 5.0 7 ml를 함유하는 새로운 튜브로 대체하였다. 이어서, u-PA 폴리펩티드를 7 ml의 25 mM 인산나트륨 pH 7.0, 250 mM NaCl로 컬럼으로부터 용리시켰다. 이어서, u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 용리액을 농축시키고, 아미콘 울트라-15 원심분리 필터 유닛을 사용하여 시트레이트 완충 염수(CBS; 20 mM 시트르산나트륨 pH 5.0, 50 mM NaCl) 내로 "완충-교환"하여 ≥ 60 μM의 최종 농도(≥ 2.6의 A280)를 달성하였다. 나노드롭 장치를 사용하여 용액의 광학 밀도를 측정하였다. 제제의 품질을 SDS-PAGE에 의해 초기에 평가하였다. Bond-Breaker TCEP를 함유하는 1X 샘플 완충액 중 u-PA 폴리펩타이드 샘플 2 μg을 12-웰 4-12% PAGE NovexBis-Tris 겔의 각각의 "레인" 상에 로딩하고, 40분 동안 200 V에서 1X MES 실행 완충액에서 실행하였다. 단백질을 쿠마시 블루로 겔을 염색한 후 탈색함으로써 "시각화"하였다. 대략 25 kDa에서 이동하는 단일 밴드를 함유하는 분획을 액체 질소 중에서 급속-동결시키고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 개별 u-PA 폴리펩타이드 샘플의 품질을 활성 분석 및 질량 분광법에 의해 추가로 평가하였다.
D. C3을 절단하여 이를 불활성화시키는 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 선택 및 확인
변형된 u-PA 폴리펩타이드는, 예를 들어 미국 특허 제8,211,428호(또한 공개 미국 출원 공개 제2014-0242062-A1호 참조)에 상세히 기재된 바와 같이 변형된 세르핀(PAI-1)에 대한 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인되었다. 세핀과 프로테아제 사이에 공유 아실 효소 중간체를 형성할 수 있는 억제성 세핀 또는 이의 단편이 스크리닝에 사용된다. 일반적으로, 사용되는 세르핀은 생체 내에서 통상적으로 프로테아제를 표적화하는 것이다. 검정에서, 표적 서열(즉, C3에서의 활성 부위)을 포함하도록 그의 반응성 부위 루프(RSL)의 대체에 의해 변형된 세르핀은 표적 부위를 절단하여 안정한 복합체를 형성할 변형된 프로테아제를 포획한다. 이어서, 포획된 변형된 프로테아제를 단리/확인하였다. u-PA의 경우, PAI-1, PAI-2, PAI-3, 특히 이의 억제제인 PAI-1은 동족 세르핀이다. 세르핀 PAI-1을 하기에 나타낸 잔기를 인간 C3의 활성 부위인 QHARASHLG(C3의 잔기 737-745, 서열번호: 47)로 대체함으로써 변형시켰다. 모든 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 이들이 C3의 활성 부위 내에서 절단되도록 선택되었다. 특히, 이들은 R과 A 사이를 절단한다.
Figure pct00009
서열 QHARASHLG가 삽입된 ATIII "베이트(bait)"(아래)(C3에서의 불활성화 절단 부위(서열번호: 47의 잔기 737-745)에 상응함):
Figure pct00010
상기 변형된 PAI-1에서의 돌연변이는 다음과 같다:
Figure pct00011
하기 실시예 2에서 표 14는 돌연변이를 제시하고, 돌연변이를 함유하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 예시적인 프로테아제 도메인에 대한 서열번호를 제공한다. 넘버링은 키모트립신 넘버링이다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 생성하고, 이를 C3을 불활성화시키도록 선택하였으며, 이때 돌연변이가 나타났다. 서열번호는 프로테아제 도메인을 참조하지만, 돌연변이는 전구체, 전장 및 성숙 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. C122S 치환, 또는 S에 대한 다른 보존된 치환은 응집을 감소시키기 위해 포함되고; 유리하지만, 이는 선택적이다. 유전자 요법 또는 페길화를 위해 사용하기 위한 변형된 u-PA의 경우, C122S 치환은 변형된 u-PA 또는 인코딩 핵산에 포함되지 않는다. C122는 페길화 모이어티 또는 다른 변형의 접합체를 위한 부위로서 작용할 수 있다. 생체 내에서 발현되는 경우, 응집은 일반적으로 문제가 되지 않는다. 또한 활성 형태가 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 사슬 형태인 경우에, 잔기 122에서의 유리 Cys는 일반적으로 Ser로 변형되지 않아서 디설파이드 결합을 형성하는데 이용가능하다.
실시예 2
보체 단백질 C3의 시험관 내 절단
C3의 불활성화 절단을 위한 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 활성은 기질 보체 단백질 인간 C3을 다양한 농도의 각각의 변형된 프로테아제와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 남아있는 온전한 인간 C3의 양을 측정함으로써 결정하였다. 이 검정에 따르면, 신호는 온전한 인간 C3의 존재 하에 생성되고, C3이 절단됨에 따라 손실된다.
2 μM 혈장 정제된 인간 C3(Complement Technologies; Tyler, TX)를 50 mM Tris, pH 8.0, 50 mM NaCl, 및 0.01% Tween-20을 함유하는 완충액 중에서 37℃에서 1시간 동안 변형된 u-PA 폴리펩타이드(0-250 nM)와 함께 인큐베이션하였다. EGR-CMK(Haematologic Technologies, EGRCK-01)를 첨가하여 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 활성을 10 μM의 최종 농도로 억제하고(quenched), hC3/변형된 u-PA 폴리펩타이드 혼합물을 주위 온도에서 30분 동안 방치하였다.
소화되지 않은 인간 C3의 잔류 수준을 증폭된 발광성 근접 균질한 검정 스크린(상표명 AlphaScreen® 하에 시판됨; Perkin Elmer)을 사용하여 정량화하였다. 100 μg/mL의 α-마우스 IgG-코팅된 수용체 비드(Perkin Elmer #6760606)를 50 mM Tris, pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.01% Tween-20 및 0.2% BSA 중의 5 nM 마우스 α-hC3a mAb(Abcam #ab11872-50)와 함께 인큐베이션하여 수용체 비드 혼합물을 형성하였다. 수용체 비드 혼합물을 광으로부터 차폐시키고, 회전 진탕기 상에 30 내지 60분 동안 두었다. hC3/변형된 u-PA 폴리펩타이드 반응 혼합물(상기 제조됨)을 50 mM Tris, pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.01% Tween-20, 0.2% BSA 내로 1600배 희석하고, 4 μL 분취물을 384-웰 옵티플레이트(Perkin Elmer #6007299)의 이중 웰에 두었다. α-hC3 mAb/수용체 비드 혼합물 8 μL를 25 nM 비오티닐화 염소 α-hC3 pAb(Complement Technologies #A213으로부터의 비바이오티닐화된 버전으로부터의 써모 사이언티픽 #21327로부터의 EZ-링크 설포-NHS-LC-비오틴 키트를 사용하여 제조됨) 8 μL와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 광으로부터 차폐시키고, 주위 온도에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후에, 4 μL의 100 μg/mL 스트렙타비딘-코팅된 공여자 비드(Perkin Elmer #6760606)를 각각의 웰에 첨가하고, 60분 동안 인큐베이션하고 광으로부터 차폐시켰다. 이어서, 알파스크린 신호(여기 = 680 nm, 방출 = 570 nm)를 엔비전 2104 멀티라벨 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 측정하였다. 이 신호(잔류된 hC3의 농도([hC3])에 상응함)를 Alterase® 농도([알테라제])의 함수로서 플롯팅하고, 데이터를 하기 4개의 파라미터 방정식에 피팅하여, 분석에서 이용가능한 hC3의 50%를 절단하는데 필요한 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 농도(알테라아제® 농도)(EC50), 힐 기울기(Hill)뿐만 아니라 최대(Max) 및 최소(Min) 신호를 결정하였다.
Figure pct00012
돌연변이 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R(서열번호: 21 참조)을 함유하는 u-PA 변이체에 의한 hC3의 절단을 9개의 상이한 로트의 프로테아제를 사용하여 총 13회 독립적으로 측정하였다. 이러한 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 대한 평균 EC50 값은 19 nM(n=13, SD=2.2)인 것으로 결정되었고; 결과가 하기 표 14에 보고된 실험에서, 이는 24.5 nM이었다.
표 14에 기재된 돌연변이를 갖는 프로테아제 도메인을 포함하는 약 600개의 변형된 u-PA 폴리펩타이드. 결과는 하기 표 14에 제시되어 있다. 대부분의 시험된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 C122S 치환을 함유하는 야생형 u-PA 프로테아제 도메인보다 유의하게 더 효율적으로(즉, 더 낮은 ED50) 인간 보체 단백질 C3을 절단하였다; 다수는 100 nM 미만의 ED50을 갖는다. 폴리펩타이드는 예를 들어 프로테아제 도메인의 발현시 응집을 방지하기 위한 C122S 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 활성화되어 2 사슬 활성화된 폴리펩타이드를 형성하는 전장이다. 이러일 구현예에서, 변형된 u-PA 프로테아제 도메인은 C122S 치환(성숙 넘버링에 의해 279개)를 포함하지 않고; 시스테인은 디설파이드 결합(서열번호: 3을 참조하여 성숙 넘버링에 의해 148C 내지 279C)을 형성한다.
시험된 u-PA 변이체들 중에는 야생형 u-PA보다 덜 강력한 변이체, 특히 hC3의 절단이 1시간 검정 동안 관찰되지 않은 변이체(즉, 하기 표 14에서 NA로 표시됨)가 있다. 다른 낮은 활성 변이체는 검정 동안 hC3의 25% 미만을 절단하였고, 따라서 ED50로 지정되지 않았다. 이들 결과에 기초하여, 당업자는 C3에 대한 절단 활성을 증가시키는 돌연변이를 선택할 수 있다.
서열번호* 돌연변이 스트링 ED50 (nM)
749 R35Y/H37S/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L 0.92
678 R35W/R36Q/H37S/V38P/T39Y/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L 2.38
277 F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/K82R/T97aI/L97bA/H99Q/K110aR/C122S/Y149R/M157K 2.47
280 F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/K179R 2.49
278 F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/K92R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 3.04
614 F30Y/R35V/R36H/H37G/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bW/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149E/M157K 3.47
279 F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/K92S/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 3.48
276 F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/K61R/K62R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 3.51
281 F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/K179S 3.87
291 R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bL/T97aI/L97bA/H99Q/C122S 4.38
690 F30Y/R35W/R36T/H37S/V38S/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157R/Q192Y 4.47
272 F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K 4.68
287 F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/K61S/K62S/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 4.75
751 R35A/H37E/R37aG/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L 4.76
676 R35W/R36Q/H37S/V38T/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151P/M157R 4.78
668 F30Y/R35W/H37Y/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 4.92
977 V38E/T39W/V41R/D60aW/Y60bP/L97bG/H99L/C122S 4.94
682 R35W/R36K/H37S/V38E/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157S/Q192H 5.01
792 R35Q/H37Y/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aQ/Y60bP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 5.14
225 I17V/F30Y/R35Q/R36H/H37W/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T158A 5.21
750 R35Y/H37S/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192H 5.26
10 F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 5.33
675 R35W/R36N/H37S/V38E/T39Y/Y40M/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157S 5.52
802 R35Y/H37D/V38E/T39W/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 5.57
288 F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/K82S/T97aI/L97bA/H99Q/K110aS/C122S/Y149R/M157K 5.82
744 R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bL/D97T/T97aE/L97bG/A98S/H99L/C122S 6.17
275 F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/Y149R/M157K 6.24
753 R35Y/H37S/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S 6.24
669 F30Y/R35W/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 6.35
286 F30Y/R35W/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/M157K 6.38
981 R35H/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/T158A 7.23
656 R35Q/R36H/H37Y/V38E/T39Y/Y40L/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 7.33
705 R35W/H37P/R37aG/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 7.4
824 V38D/V41Q/D60aH/Y60bS/T97aW/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/R217E/K224R 7.48
731 F30Y/R35W/R36H/H37P/R37aQ/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 7.52
677 F30Y/R35W/R36Q/H37S/V38P/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157R 7.55
679 F30H/R35W/R36T/H37S/V38P/T39Y/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157S 7.59
613 F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K 7.64
707 F30Y/R35Y/R36H/H37N/V38E/T39F/Y40F/V41R/K61E/R72H/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q169K 7.64
688 R35W/R36Q/H37S/V38S/T39Y/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157S/Q192H 8.04
752 R35W/H37G/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192T 8.07
19 R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bL/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 8.13
290 F30Y/R35W/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S 8.23
616 F30Y/R35V/R36H/H37G/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 8.3
670 F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 8.44
285 F30Y/R35W/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 8.44
283 F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/M157K 8.6
284 F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S 8.78
683 F30Y/R35W/R36S/H37S/V38Q/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157S/Q192N 8.86
727 F30Y/R35W/R36H/H37P/R37aD/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aE/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 8.9
799 R35Q/H37Y/R37aS/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 8.95
949 R37aS/V38E/Y40V/V41R/H99L/C122S/Y151L/R217V 9.04
831 V38D/V41R/L97bG/H99Q/C122S/Y151L/R217E 9.09
33 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S 9.27
624 F30Y/R35V/R36H/H37D/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 9.54
223 I17V/F30Y/R35Q/R36H/H37W/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K 9.65
617 F30Y/R35V/R36H/H37S/V38E/T39F/Y40H/V41R/Y60bS/T97aM/L97bA/H99Q/C122S/Y149W/M157K 10.2
703 R35Y/H37S/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 10.3
706 N26D/F30Y/R35Y/R36H/H37E/V38E/T39F/Y40F/V41R/K61E/T97aI/L97bA/H99Q/R110dS/P114S/C122S/Y149R/M157K 10.3
732 F30Y/R35W/R36H/H37P/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bA/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 10.3
796 R35L/H37D/R37aN/V38E/T39Y/V41R/D60aP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 10.4
14 F30Y/R35W/R36H/H37P/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 10.6
29 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 10.6
979 R35H/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/T158S/E167K 10.6
24 R35Q/H37Y/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 10.7
633 F30Y/R35Y/R36H/H37D/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 10.8
12 F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 10.8
708 F30Y/R35Y/R36H/H37E/V38E/T39F/Y40F/V41R/K61E/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/T242A 11.1
557 F30Y/R35L/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T158A 11.3
724 F30Y/R35Y/R36H/H37P/R37aQ/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bH/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 11.3
882 V38D/V41R/L97bR/H99E/C122S/Y151L/R217E 11.4
335 H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/R217E/K224R 11.5
746 R35Y/H37V/R37aW/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192T 11.6
615 F30Y/R35M/R36H/H37G/V38E/T39F/Y40H/V41R/Y60bP/T97aF/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 11.7
684 F30Y/R35W/R36Q/H37S/V38T/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157K/Q192T 11.8
701 R35W/H37D/R37aP/V38E/T39W/V41R/D60aR/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 11.8
260 I17V/F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 11.9
218 I17V/F30Y/R35Q/H37W/V38D/Y40H/V41R/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149H/M157K/T158A 12
978 R35H/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/I138V/E167K 12.1
680 F30Y/R35W/R36Q/H37S/V38E/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157T/Q192H 12.4
980 R35H/G37bD/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/T158S 12.4
794 R35H/H37P/R37aG/V38E/T39F/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 12.6
611 F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 12.7
926 V38D/T39Y/Y40L/V41R/L97bI/H99E/C122S/R217E 12.8
224 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T158A 12.9
689 F30H/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40M/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 13
650 R35V/R36H/H37D/V38E/T39W/Y40M/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 13.1
685 R35W/R36K/H37S/V38A/T39Y/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157R/Q192T 13.3
628 F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 13.5
717 F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/N145S/S146V/T147M/D148G/Y149Q/L150F/M157K 13.6
275 F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/Y149R/M157K 13.7
658 F30Y/R35I/R36H/H37D/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 14.1
373 R35V/V38E/Y40Q/V41L/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 14.4
800 R35Q/H37Y/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aN/Y60bN/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 14.5
957 V38E/Y40Q/V41L/L97bG/H99Q/C122S/R217T 14.5
983 R35H/V38E/T39Y/V41R/T56S/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/T158S 14.6
513 F30H/R35Q/H37W/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K 14.7
300 R35Q/H37Y/V38E/T39Y/V41R/D60aP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 14.7
745 R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41K/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192A 14.8
821 V38D/V41R/Y60bR/T97aW/L97bR/H99E/C122S/E175D/R217E/K224R 14.8
674 F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/Y40H/Y60bN/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 15.1
823 V38D/V41L/Y60bP/T97aM/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/R217E/K224R 15.3
627 F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39F/Y40H/V41R/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 15.4
13 F30Y/R35W/R36H/H37N/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 15.7
681 F30Y/R35W/R36K/H37S/V38D/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157R/Q192T 15.9
382 V41R/H99Q/C122S/Y151L/R217V 16
959 V38E/Y40P/V41L/L97bG/H99L/C122S/Y151Q/R217E 16
950 V38E/Y40L/V41R/H99L/C122S/Y151L/R217S 16.1
956 V38E/Y40Q/V41L/L97bG/H99Q/C122S/Y151P/R217T 16.4
973 V38E/T39Y/V41R/D60aW/Y60bP/L97bR/H99I/C122S 16.4
20 R35W/H37D/R37aP/V38E/T39W/V41R/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 16.6
597 F30Y/R36H/H37F/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bD/T97aV/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K 16.8
664 F30Y/R35W/R36H/H37E/S37dP/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 16.8
733 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aA/Y60bP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 17.4
469 R36H/V38D/V41R/A96D/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/T178S/R217D 17.5
830 V38D/V41R/L97bG/H99Q/C122S/Y151L/R217A 17.7
653 F30H/R35Q/R36H/H37Y/V38E/T39Y/Y40L/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 17.8
264 F30Y/R35W/R36K/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/K61E/I65T/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 17.9
604 F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bS/T97aL/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K 18
714 F30Y/R35Q/R36H/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aS/Y60bP/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 18.1
743 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aG/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 18.1
666 I24N/F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40L/V41R/Y60bQ/N87D/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 18.2
36 V38E/Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S 18.2
217 F30Y/R35Q/H37W/V38D/Y40H/V41R/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149H/M157K/T158A 18.3
263 F30Y/R35W/R36A/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/K61D/I65R/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 18.4
221 F30Y/R35Q/R36H/H37W/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K 18.6
289 F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/K187R/K223R/K224R 18.9
687 R35W/R36Q/H37S/V38E/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157S/Q192T 19
986 R35H/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/P60cS/L97bA/H99Q/C122S/I138V/E167K 19.4
18 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aT/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 19.5
222 I17V/F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K 19.6
271 R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 19.9
982 R35H/V38E/T39Y/V41R/T56A/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S 19.9
538 F30Y/V38D/Y40F/V41L/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157R 20.2
953 V38E/Y40A/V41L/L97bG/H99Q/C122S/R217T 20.4
665 I24T/F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 20.6
292 F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 20.7
219 I17V/F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T158A 21.6
747 R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41K/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192T 21.7
514 F30H/R35L/H37D/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K/R217E 21.8
713 F30Y/R35W/R36H/H37D/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aE/Y60bF/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 21.8
619 F30Y/R35L/R36H/H37G/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bP/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149M/M157K 22.1
505 I17V/F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K 22.2
623 F30Y/R35V/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40H/V41R/Y60bN/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 22.6
11 R35W/R36H/H37N/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192H 22.8
360 R35V/Y40Q/V41L/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 22.8
729 F30Y/R35M/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 22.9
834 R35Q/V38D/V41R/L97bG/H99Q/C122S/Y151L 22.9
961 R37aS/V38E/Y40P/V41L/L97bG/H99Q/C122S/Y151Q/R217T 23.4
364 R35V/R37aE/V38E/Y40Q/V41L/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 23.5
486 F30H/V38D/V41R/A96G/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K 23.7
311 T39L/Y40L/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S 23.7
265 F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 23.8
34 Y40Q/V41L/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S 23.9
586 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/S146F/M157K/Q192H/K243Q 24.1
346 Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 24.1
262 F30Y/R35W/R36Q/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/K61L/I65V/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 24.4
21 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 24.5
832 R35Q/V38D/V41R/T97aS/L97bA/H99Q/C122S/Y151L 24.8
369 V41R/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/R217V 25.1
30 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 25.3
621 F30Y/R35V/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bP/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149E/M157K 25.4
754 R35A/H37T/R37aD/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192S 25.5
835 R35S/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L 25.7
836 R35S/V38D/V41L/L97bG/H99Q/C122S/Y151L/R217Q 26.1
562 F30Y/R35H/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T158S 26.3
738 R35Q/H37S/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 26.3
338 H37G/R37aD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 26.7
341 H37G/R37aD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E 26.8
741 R35W/H37D/R37aS/V38E/T39Y/V41R/D60aE/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 26.9
795 R35Q/H37G/R37aD/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 27.1
798 R35Q/H37D/R37aK/V38E/T39F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 27.1
671 R35Y/R36H/H37S/V38D/T39Y/V41R/Y60bN/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 27.3
230 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/K61E/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K 27.9
829 R37aS/V38D/V41Q/L97bG/H99Q/C122S/Y151L/R217T 27.9
484 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K 28.1
693 F30Y/R35K/R36H/H37E/R37aK/V38E/T39F/Y40F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 28.1
694 F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aP/Y60bG/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 28.3
261 F30Y/R35W/R36Q/H37E/V38A/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/K61D/I65V/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 28.4
494 F30Y/R35H/V38D/Y40H/V41R/T56A/L97bA/H99Q/C122S/M157K 28.5
797 R35N/H37T/R37aY/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 28.7
984 R37aH/V38E/T39Y/V41R/T56A/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/T158A 28.8
515 F30H/R35Q/H37T/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K 28.9
503 F30H/R36L/V38E/V41R/K82R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K 29
370 V38D/V41R/H99Q/C122S/Y151L/R217V 29.1
736 R35Q/H37G/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 29.2
726 F30Y/R35Q/R36H/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aE/Y60bA/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 29.3
704 R35Q/H37Y/R37aD/V38E/T39L/V41R/D60aE/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 29.4
657 F30Y/R35L/R36H/H37E/V38E/T39N/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 29.6
963 R36S/V38E/Y40L/V41N/L97bG/H99Q/C122S/Y151L/R217T 29.6
401 T39W/V41R/L97bG/H99Q/C122S 29.7
9 F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 29.8
28 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 29.8
940 R35S/R37aA/V38E/Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S/Y149V 30.2
612 F30Y/R35W/R36H/H37Q/V38E/T39H/Y40H/V41R/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K 30.3
715 F30Y/R35Q/R36H/H37Y/R37aD/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bV/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 30.4
171 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/Y151L/M157K 30.6
511 F30H/R35H/H37I/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149W/Y151L/M157K/R217S 30.6
875 V38D/T39Y/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S 30.7
702 R35F/H37D/R37aN/V38E/T39Y/V41R/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 30.9
402 T39Y/V41R/Y60bQ/L97bG/H99Q/C122S 31.1
398 T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S 31.4
881 V38D/V41R/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/R217E 31.5
924 R36S/V38D/T39L/Y40L/V41R/L97bI/H99E/C122S/R217T 31.5
936 R35S/R37aD/V38E/Y40Q/V41L/Y60bV/T97aL/L97bA/H99Q/C122S/Y149L 31.5
350 Y40Q/V41L/Y60bT/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 31.6
496 F30Y/V38E/Y40H/V41R/T56A/L97bA/H99Q/C122S/M157K/K243M 31.9
231 F30Y/R36H/R37aH/V38E/Y40H/V41R/K61E/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K 31.9
516 F30H/R35Q/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K 32
818 V38D/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 32
324 H37G/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 32.1
948 R35S/R37aD/V38E/Y40Q/V41L/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 32.2
368 R35V/R37aE/V38E/Y40Q/V41L/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S 32.2
351 Y40Q/V41L/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 32.5
551 F30Y/R35H/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/I138V/M157K 33.1
43 T39Y/V41R/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S 33.2
696 F30Y/R35H/R36H/H37D/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 33.4
495 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T158A 33.5
972 V38E/T39W/V41R/D60aP/Y60bD/L97bA/H99L/C122S 33.5
242 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/I65T/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K 33.6
884 V38D/V41R/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/R217V 33.7
801 R35Q/H37S/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 33.8
673 R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 34
958 R36S/V38E/Y40Q/V41R/L97bG/H99L/C122S/Y151P/R217E 34.3
15 V38E/Y40Q/V41L/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S 34.5
340 H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E 34.5
339 H37G/R37aD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E 34.8
282 F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/K187S/K223S/K224Y 34.9
39 Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S 35.2
504 F30H/R35H/V38D/V41R/K61E/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K/R206H 35.4
8 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 35.7
273 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 35.7
943 R35A/R37aE/V38E/Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 35.9
827 V38D/V41L/L97bG/H99Q/C122S/Y151L/R217Q 36.2
517 F30H/R35Q/H37W/V38D/V41R/D60aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/Y151L/M157K/R217D 36.4
620 F30Y/R35F/R36H/H37G/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bS/T97aD/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 36.7
399 T39Y/V41R/L97bG/H99Q/C122S 36.8
608 F30Y/R35I/R36H/H37E/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bS/T97aV/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K 36.9
934 R35S/R37aD/V38E/Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 37.2
387 Y40H/V41Q/L97bG/H99Q/C122S/R217T 37.2
645 R35W/H37D/V38D/T39Y/V41R/Y60bS/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 37.4
869 V38D/T39F/Y40L/V41R/T97aW/L97bA/H99Q/C122S 37.8
878 V38D/T39Y/Y40L/V41R/T97aE/L97bA/H99Q/C122S 37.8
718 F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39F/Y40F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 38.2
873 V38D/T39L/Y40L/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S 38.2
876 V38D/T39Y/Y40L/V41R/T97aW/L97bA/H99Q/C122S 38.4
550 F30Y/R36H/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99L/C122S/F141L/M157K/T158A 38.5
728 F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aA/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 38.5
712 F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 38.6
404 T39Y/V41R/Y60bP/L97bG/H99Q/C122S 39.2
507 F30H/R36H/V38D/V41R/T56A/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K 40
720 F30Y/R35E/R36H/H37D/R37aN/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 40
268 V38E/Y40Q/V41L/D60aP/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S/Y149W 40.4
498 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K 40.5
509 F30H/R35Q/H37W/V38D/V41R/D60aE/Y60bS/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/Y151L/M157K 40.8
742 R35Q/H37G/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 40.9
686 F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151P/M157K/Q192H 41
710 F30Y/R35M/R36H/H37D/R37aD/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 41.2
618 F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bT/T97aD/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 41.3
872 V38D/T39L/Y40L/V41R/T97aV/L97bA/H99Q/C122S 41.6
822 V38D/V41R/Y60bS/T97aI/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192F/R217E/K224R 42.1
403 T39Y/V41R/Y60bP/L97bA/H99Q/C122S 42.1
446 R36H/V38D/Y40F/V41R/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151L/Q192E/R217D 42.2
735 R35M/H37G/R37aD/V38E/T39W/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 42.3
543 F30Y/V38D/Y40L/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K/Q192H 42.4
475 F30H/V38D/Y40F/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157F 42.5
697 H37M/R37aD/V38E/T39A/V41R/D60aP/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 42.7
171 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/Y151L/M157K 42.8
552 T22I/F30Y/R35S/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/I138V/M157K 42.9
734 R35L/H37D/R37aS/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 42.9
561 F30Y/R35L/V38D/Y40H/V41R/N76S/L97bA/H99Q/C122S/M157K/K187E 43.6
481 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157S 43.8
648 R35W/H37D/V38D/T39Y/V41R/Y60bH/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 44.2
595 F30Y/R36H/H37G/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bA/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149Q/M157K 44.6
904 R35Q/H37G/R37aE/V38W/T39Y/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 44.6
330 H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 44.6
879 V38D/T39Y/Y40M/V41R/T97aE/L97bA/H99Q/C122S 45
647 R35Q/H37N/V38D/T39Y/V41R/Y60bP/L97bA/H99Q/C122S 45.4
663 F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 45.8
23 R35Q/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 46.1
975 V38E/T39L/V41R/D60aN/Y60bP/L97bG/H99Q/C122S 46.8
601 F30Y/R36H/H37A/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aV/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 46.9
722 F30Y/R35W/R36H/H37E/R37aP/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149Q/M157K 47.7
748 H37T/R37aL/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192R 47.9
325 H37G/R37aD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 47.9
667 F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/Y40H/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 48.6
868 V38D/T39W/Y40L/V41R/T97aL/L97bA/H99Q/C122S 48.9
326 H37G/R37aD/G37bD/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 49
42 T39Y/V41R/L97bA/H99Q/C122S 49
874 V38D/T39L/Y40L/V41R/T97aW/L97bA/H99Q/C122S 49.1
584 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149N/L150V/M157K 49.3
534 R35S/V38D/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157Y 49.8
925 R37aS/V38D/T39Y/Y40F/V41R/H99L/C122S/R217T 49.9
349 Y40Q/V41L/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 49.9
390 Y40H/V41T/L97bG/H99Q/C122S/R217T 50
506 F30H/R35S/V38E/V41R/Y60bH/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K 50.1
877 V38D/T39Y/Y40M/V41R/T97aW/L97bA/H99Q/C122S 50.1
900 H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 50.9
737 R35A/H37G/R37aE/V38E/T39F/V41R/D60aE/Y60bP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 51.1
22 H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 51.1
598 F30Y/R36H/H37N/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aV/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K 51.4
545 F30Y/V38D/Y40L/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157A/Q192Y 51.5
954 V38E/Y40H/V41Q/L97bG/H99Q/C122S/R217T 51.6
870 V38D/T39Y/Y40Q/V41L/T97aY/L97bA/H99Q/C122S 51.7
942 R35V/R37aE/V38E/Y40Q/V41L/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 51.7
358 R35S/Y40Q/V41L/Y60bT/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 52.4
535 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157T 52.9
356 R35K/Y40Q/V41L/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 53.2
692 F30Y/R35V/R36H/H37T/V38E/T39A/Y40L/V41Q/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 53.7
184 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K/R217D 54
249 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/I65T/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 54.1
672 R36H/H37S/V38E/T39W/V41R/Y60bN/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 54.1
371 V38D/V41R/L97bR/C122S/Y151L/R217V 54.3
553 F30Y/R36S/V38D/T39I/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/S146P/M157K/T158S 54.6
365 R35V/R37aE/V38E/Y40Q/V41L/Y60bS/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 54.6
37 V38E/Y40Q/V41L/Y60bL/H99Q/C122S 54.9
347 R37aE/Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S 54.9
709 F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39F/Y40F/V41R/D60aS/Y60bP/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 55.3
487 F30H/G37bD/V38D/T39H/V41R/L97bA/H99Q/R110dH/C122S/Y151L/M157K/S240I 55.5
902 R35K/H37A/R37aE/V38H/T39Y/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 55.9
603 F30Y/R36H/H37D/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bN/T97aV/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 56
25 R35Q/H37Y/R37aE/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 56.2
436 V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151L/Q192E/R217D 56.3
606 F30Y/R36H/H37E/V38E/T39F/Y40H/V41R/Y60bN/T97aV/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 56.4
337 H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E 56.4
587 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/K61E/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149H/M157K/K187R 57.7
232 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/K61E/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 58
44 T39Y/V41R/D60aP/L97bA/H99Q/C122S 58.2
329 H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 58.5
216 I17V/F30Y/R35Q/H37W/V38D/Y40H/V41R/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149H/M157K 58.6
519 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149W/M157K/R217D 58.8
270 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/M157K 59.3
348 R37aE/Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 59.3
793 R35N/H37S/R37aE/V38E/T39F/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 59.5
226 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 59.9
719 F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aL/V38E/T39N/Y40F/V41R/D60aP/Y60bT/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 59.9
625 F30Y/R35V/R36H/H37G/V38E/T39L/Y40H/V41R/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192T/R239H 60.1
903 R35Q/H37G/R37aE/V38Y/T39F/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 60.1
35 V38E/Y40Q/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S 60.2
176 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149N/Y151L/M157K 60.3
381 H99Q/C122S/Y151L/R217V 60.4
841 R35S/V38D/Y40H/V41L/Y60bD/L97bG/H99Q/C122S 61.5
698 R35F/H37D/R37aS/V38E/T39Y/V41R/D60aE/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 63.4
935 R35V/R37aD/V38E/Y40Q/V41L/Y60bG/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 63.5
951 R36L/V38E/Y40Q/V41R/L97bG/H99Q/C122S/Y151P/R217S 63.7
600 F30Y/R36H/H37D/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bV/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 63.9
607 F30Y/R36H/H37G/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aA/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 64.2
947 R37aD/V38E/Y40Q/V41L/Y60bP/T97aV/L97bA/H99Q/C122S/Y149K 64.8
555 F30Y/R35L/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 65.1
357 R37aD/Y40Q/V41L/Y60bT/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 65.3
699 R35A/H37D/R37aN/V38E/T39F/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 65.8
198 I17V/F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 66
267 V38E/Y40Q/V41Q/D60aP/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S/Y149W 66
711 F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aN/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bA/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 66.2
849 V38D/V41R/Y60bR/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 66.2
518 F30H/R35Q/V38D/V41R/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149N/Y151L/M157K 66.3
313 V38D/T39L/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S 66.3
937 R37aP/V38E/Y40Q/V41L/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 67.2
591 F30Y/R36H/H37S/V38E/T39L/Y40H/V41R/Y60bH/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 67.5
901 R35Q/H37G/R37aE/V38Y/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 67.6
955 V38E/Y40H/V41T/L97bG/H99Q/C122S/R217T 67.8
833 V38D/V41Q/L97bG/H99Q/C122S/Y151L/R217T 68.6
417 V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/R217D 68.8
695 F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39I/Y40F/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149M/M157K 69.2
893 R35G/H37T/R37aE/V38T/T39Y/V41Q/Y60bR/T97aF/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 69.7
932 R37aS/V38D/T39Y/V41R/L97bI/H99E/C122S/R217T 70.1
233 F30Y/R36H/R37aH/V38E/Y40H/V41R/K61E/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 70.3
661 F30H/R35L/R36H/H37E/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 70.4
629 F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192M 70.8
807 V38E/T39L/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149V/Y151L/Q192T 71.1
199 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149W/M157K 71.3
725 F30Y/R35F/R36H/H37D/R37aD/V38E/T39H/Y40F/V41R/D60aP/Y60bA/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 71.3
565 F30H/R35Q/H37Y/V38D/V41R/D60aE/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157K 71.4
376 L97bR/H99Q/C122S/Y151L/R217V 72.3
960 R37aS/V38E/Y40H/V41T/L97bG/H99Q/C122S/R217T 72.6
307 Y40Q/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S 73
466 R36H/G37cD/V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/M157T/R217D 75
839 R35K/V38D/Y40H/V41R/Y60bS/L97bG/H99Q/C122S 75.6
299 R35Q/H37Y/R37aE/V38D/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 77.3
592 F30Y/R35L/R36H/H37D/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bA/T97aD/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 77.9
520 F30Y/R35Q/H37W/V38D/Y40H/V41R/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149H/M157K 78.3
389 Y40H/V41Q/L97bG/H99Q/C122S 78.4
400 T39H/V41R/L97bG/H99Q/C122S 78.4
315 V38D/T39L/Y40L/V41R/L97bA/H99Q/C122S 79
740 R35Q/H37G/R37aE/V38E/T39H/V41R/D60aP/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 80.1
716 F30Y/R35A/R36H/H37T/R37aD/V38E/T39Y/Y40L/V41R/D60aP/Y60bE/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 80.7
700 R35Q/H37D/R37aA/V38E/T39F/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 80.7
312 V38D/Y40L/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S 80.7
651 F30Y/R35L/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192N 80.9
871 R37aS/V38D/T39Y/Y40M/V41R/T97aL/L97bA/H99Q/C122S 81.2
374 R35V/R37aE/Y40Q/V41L/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 81.4
359 R37aE/Y40Q/V41L/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 81.5
938 R35M/R37aQ/V38E/Y40Q/V41L/Y60bE/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 81.6
38 V38E/Y40Q/V41L/Y60bL/L97bA/C122S 82.9
243 F30Y/R36H/V38E/Y40L/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K 83.5
500 F30Y/R35H/V38D/T39S/Y40L/V41R/L97bA/H99Q/C122S/T147S/M157K 84.7
564 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K/Q192H/R239H 85.7
721 F30Y/R36H/H37M/R37aD/V38E/T39G/Y40F/V41R/D60aP/Y60bE/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 85.9
523 F30Y/R35H/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 87.3
544 F30Y/V38D/Y40L/V41Q/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157R/Q192Y 88.1
228 F30Y/R35Q/H37W/V38D/Y40H/V41R/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 88.8
826 V38D/V41Q/Y60bR/T97aW/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 90
985 R37aH/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S 90.7
547 F30H/V38D/V41Q/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157R 91.3
886 V38D/T39Y/Y40L/V41K/L97bR/H99L/C122S/E175D 91.8
944 R37aD/V38E/Y40Q/V41L/Y60bP/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 91.9
32 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/C122S/Y149R 92.3
542 N26D/F30Y/V38D/Y40H/V41R/I65T/L97bA/H99Q/C122S/M126I/M157K 93.2
946 R35A/R37aD/V38E/Y40Q/V41L/Y60bV/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K 93.4
939 R35S/R37aD/V38E/Y40Q/V41L/Y60bT/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 93.5
508 F30H/R35Q/H37T/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149I/Y151L/M157K/R217D 93.6
541 F30H/V38D/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K 94.2
377 V38D/H99Q/C122S/Y151L/R217V 94.4
576 F30Y/R35T/H37T/V38D/Y40H/V41R/D60aP/Y60bD/L97bA/H99Q/C122S/Y149T/M157K 94.7
227 I17V/F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 94.8
855 V38D/V41R/Y60bR/L97bR/H99L/C122S/Y151L/E175D/Q192Y/R217E/K224R 94.9
372 R37aE/V38E/Y40Q/V41L/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 95
594 F30Y/R36H/H37E/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aV/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 96.3
820 V38D/V41Q/D60aP/Y60bS/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192Y/R217E/K224R 96.4
510 F30H/R35Q/H37Q/V38D/V41R/A96D/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/Y151L/M157K/R217D 96.8
240 F30Y/R35Q/H37Y/V38D/Y40H/V41R/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 98.7
891 H37A/R37aE/V38F/T39L/V41Q/Y60bR/T97aW/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 99.6
605 F30Y/R36H/V38E/T39V/Y40H/V41R/Y60bH/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149S/M157K 99.7
485 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S 99.9
622 F30Y/R35V/R36H/H37S/V38E/T39F/Y40H/V41R/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192T 100
585 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/Y60bN/N87D/A96T/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/N145S/M157K/M207K 101
309 V38E/Y40Q/V41L/L97bA/C122S 101
952 R37aS/V38E/V41R/L97bG/H99Q/C122S/R217V 101
445 R36H/V38D/Y40L/V41K/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151L/Q192T/R217D 102
649 F30Y/R35Q/R36H/H37G/V38E/T39H/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192M 102
363 R35V/R37aE/Y40Q/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 103
314 V38D/T39L/Y40L/T97aI/L97bA/H99Q/C122S 104
183 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/R217E 105
655 F30L/R35L/R36H/H37D/V38E/T39Y/V41K/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 105
921 R36S/V38D/T39A/Y40F/V41R/L97bA/H99E/C122S/R217T 105
568 F30Y/R35K/H37E/V38D/Y40H/V41R/D60aP/Y60bD/L97bA/H99Q/C122S/Y149N/M157K 106
691 F30Y/R35L/R36H/H37E/V38E/T39S/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 106
739 R35Q/H37T/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aE/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 106
448 R36H/V38D/Y40I/V41K/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Q192A/R217D 107
540 F30Y/R36H/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T210S 107
397 T39Y/V41R/Y60bQ/L97bA/C122S 108
208 F30Y/R35Q/H37T/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149W/M157K 109
211 F30Y/V38D/Y40H/V41R/T56A/L97bA/H99Q/C122S/M157K 109
546 F30Y/R36S/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 109
850 V38D/V41R/D60aP/Y60bD/T97aW/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/E175D/Q192A/R217E/K224R 109
842 V38D/V41R/Y60bN/T97aL/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 109
883 R35H/V38D/V41Q/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/R217V 109
967 R35H/V38E/L97bR/C122S/Y151L/R217V 109
447 R36H/V38D/V41R/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151L/Q192G/R217D 110
254 F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bH/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192A 111
385 R37aS/V41R/L97bG/H99Q/C122S/R217V 111
887 R35Q/H37G/R37aN/V38F/T39H/V41Q/Y60bR/T97aL/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 112
164 R36S/V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/M157K/R217D 113
210 F30Y/R35Q/H37T/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 113
838 R35S/V38D/Y40Q/V41R/Y60bS/L97bG/H99Q/C122S 113
898 H37S/R37aD/V38H/T39L/V41Q/Y60bR/T97aW/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 113
196 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149F/M157K 114
310 Y40Q/L97bA/H99Q/C122S 114
355 R37aE/Y40Q/V41L/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 114
945 R35S/R37aD/V38E/Y40Q/V41L/T97aD/L97bA/H99Q/C122S/Y149K 115
643 R35Q/H37M/V38D/T39V/V41R/Y60bP/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 116
644 R35L/H37E/V38D/T39Y/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 116
450 R36H/V38D/Y40L/V41R/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151L/Q192D/R217D 118
497 F30Y/Y34N/V38D/Y40H/V41R/Y94F/S95R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T242I 118
323 R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 118
334 H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/Q192T/R217E/K224R 118
392 Y40H/V41T/L97bG/H99Q/C122S 118
8 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 119
434 R37aH/V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151L/Q192G/R217D 119
419 R36H/V38D/V41M/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/R217D 120
317 V38D/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/R217V 120
201 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149W/M157K 121
549 F30Y/R37aH/V38D/Y40H/V41R/K61E/L97bA/H99Q/C122S/M157K 121
767 V38D/L97bR/H99E/C122S/E175D/K224S 121
888 H37N/R37aD/V38Y/T39F/V41Q/Y60bR/T97aW/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 121
452 R36H/V38D/Y40L/V41R/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151L/Q192R/R217D 122
560 F30Y/R37aS/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 122
837 V38D/V41R/L97bG/H99Q/C122S/Y151L/Q192S/R217A 122
361 R37aD/Y40Q/V41L/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 122
880 R35S/V38D/V41T/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/R217E 124
40 Y40Q/V41L/L97bA/C122S 124
173 F30H/V38D/V41R/L97bV/H99Q/C122S/Y151L/M157K 125
229 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 125
322 V38D/V41R/L97bR/H99Q/C122S/Y151L 125
895 H37A/R37aE/V38Y/T39Y/V41Q/Y60bR/T97aV/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 126
892 H37N/R37aE/V38F/T39L/V41Q/Y60bR/T97aW/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 127
652 F30Y/R35L/R36H/H37E/V38E/T39L/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192H 129
451 R36H/V38D/Y40L/V41R/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151M/Q192T/R217D 130
854 V38D/V41R/Y60bR/L97bR/H99L/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 130
308 V38E/Y40Q/L97bA/H99Q/C122S 133
968 V38E/T56I/H99Q/C122S/Y151L/S190G/R217V 134
556 F30Y/S37dP/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 135
964 R35S/V38E/L97bR/C122S/Y151L/R217V/H241N 135
396 T39Y/V41R/L97bA/C122S 135
384 L97bR/C122S/Y151L/R217V 136
599 F30Y/R35L/R36H/H37E/V38E/T39L/Y40H/V41R/Y60bS/T97aD/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 137
596 F30Y/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bD/T97aD/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 137
894 R35K/H37S/R37aE/V38F/T39Y/V41Q/Y60bR/T97aL/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 141
269 F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99L/C122S/Y149K/M157K 142
840 R35Q/V38D/Y40L/V41L/Y60bP/L97bG/H99Q/C122S 142
471 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157E 146
429 V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151L/Q192D/R217D 146
501 F30Y/R36S/V38H/Y40L/V41R/N76K/L97bA/H99Q/C122S/M157K 146
195 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K 147
539 F30H/V38D/Y40F/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157R/Q192H 149
927 R37aP/V38D/T39L/Y40I/V41R/H99L/C122S/R217Q 150
293 V38E/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S 152
375 R35V/R37aE/V38E/Y40Q/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 153
214 V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T158A 154
189 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149F/M157K/R217E 155
31 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/H99Q/C122S/Y149R 155
393 V41R/L97bG/H99Q/C122S 155
890 R35K/H37G/R37aE/G37bS/V38F/T39H/V41Q/Y60bR/T97aW/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 156
571 F30Y/R35S/H37G/V38D/Y40H/V41R/D60aP/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 158
602 F30Y/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bM/T97aD/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 159
203 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 160
843 V38D/V41Q/Y60bR/T97aF/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/E175D/Q192H/R217E/K224R 160
897 H37A/R37aD/V38Y/T39Y/V41Q/Y60bR/T97aD/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 160
896 H37D/R37aD/V38Y/T39Y/V41Q/Y60bR/T97aL/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 162
353 Y40Q/V41L/L97bA/C122S/Y149R 162
488 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149N/Y151L/M157K/R239H 163
930 R36S/V38D/T39S/V41R/L97bI/H99E/C122S/R217T 163
906 V38D/T39V/V41R/L97bV/H99E/C122S/R217E 165
962 R37aS/V38E/Y40Q/V41L/L97bG/C122S/Y151P/R217T 166
484 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K 167
378 V38D/L97bR/C122S/Y151L/R217V 170
593 F30Y/R36H/H37P/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 171
825 V38D/V41K/D60aN/Y60bN/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192H/R217E/K224R 172
889 H37A/R37aE/V38F/T39L/V41Q/Y60bR/T97aF/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 174
345 Y40Q/V41L/H99Q/C122S 174
574 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/Y60bS/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/R217E 175
730 F30Y/R36H/H37D/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 176
941 R35K/R37aD/V38E/Y40Q/V41L/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 178
209 F30Y/R35Q/H37T/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149F/M157K 179
321 V38D/T39L/Y40L/V41R/T97aI/L97bA/C122S 179
245 N26D/F30Y/R36H/R37aH/V38E/Y40H/V41R/K61E/I65T/L97bA/H99Q/C122S/M126I/M157K 185
367 R35V/R37aE/V38E/Y40Q/V41L/Y60bS/T97aE/L97bA/C122S/Y149R 185
483 F30Y/V38D/Y40M/V41R/L97bA/H99Q/C122S 188
768 V38D/L97bV/H99E/C122S/K224S 192
861 V38D/V41R/D60aQ/Y60bP/L97bG/H99Q/C122S 192
202 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149F/M157K 194
931 R37aS/V38D/T39G/V41R/L97bM/H99E/C122S/R217S 194
521 F30Y/R35Q/H37T/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149I/M157K 196
473 F30Y/V38D/Y40H/V41A/L97bA/H99Q/C122S/M157R 197
191 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K/R217E 199
206 F30Y/H37T/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 199
327 H37G/R37aD/G37bD/V38F/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 199
41 R37aS/V41R/L97bG/H99Q/C122S 199
244 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K/Q192H 201
248 N26D/F30Y/V38D/Y40H/V41R/I65T/L97bA/H99Q/C122S/M126I/Y149R/M157K 201
864 R35K/V38D/Y40H/Y60bP/L97bG/H99Q/C122S 201
525 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/E153D/M157K 202
526 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/D148N/M157K/T188S 202
660 R35E/R36H/H37D/V38E/T39W/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192T 202
558 F30Y/R37aS/V38D/Y40H/V41R/E86D/L97bA/H99Q/C122S/M157K/F234Y 203
723 F30Y/R35Q/R36H/H37D/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aE/Y60bG/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 203
563 F30Y/R37aS/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/K187Q/T208S 205
465 R36H/V38D/V41R/A96D/D97G/T97aN/A98G/L97bdel/H99L/C122S/Q192R/R217F 208
170 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/R217D 208
583 F30Y/R35T/H37T/V38D/Y40H/V41R/D60aT/Y60bS/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 208
609 F30Y/R35L/H37D/V38D/Y40H/V41R/D60aE/Y60bT/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 212
352 R37aE/Y40Q/V41L/L97bA/C122S 212
920 R36S/V38D/T39K/Y40F/V41R/L97bI/H99E/C122S/R217S 213
320 V38D/T39L/Y40L/V41K/L97bR/H99L/C122S/E175D 215
169 V38D/V41R/A96E/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151L/T178S/Q192E/R217D 217
588 F30Y/R37aP/V38D/Y40H/V41R/Y60bN/E84D/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T242I 219
190 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149F/M157K/R217D 222
566 F30Y/R35T/H37Q/V38D/Y40H/V41R/D60aE/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 230
536 R37aL/V38D/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157S 231
760 V38D/L97bR/H99E/C122S/E175D/R217E/K224R 234
478 F30Y/V38D/Y40L/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157R 235
238 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/D60aE/Y60bS/L97bA/H99Q/C122S/Y149T/M157K 235
234 F30Y/R35Q/H37D/V38D/Y40H/V41R/D60aE/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149S/M157K 236
207 F30Y/R35Q/H37T/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K 238
344 Y40Q/V41L/C122S 238
554 F30Y/Y34S/R37aH/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149F/M157K 239
354 R37aE/Y40Q/V41L/L97bA/C122S/Y149R 245
247 N26D/F30Y/V38D/Y40L/V41R/I65T/L97bA/H99Q/C122S/M126I/M157K 247
476 F30Y/V38D/Y40H/V41N/L97bA/H99Q/C122S 250
524 F30Y/R35H/V38D/Y40H/V41R/T56A/L97bV/H99Q/R116S/C122S/M157K/T210N 250
212 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151F/M157K 252
388 Y40H/V41Q/L97bG/C122S/R217T 252
974 V38E/T39H/D60aP/Y60bK/L97bG/H99Q/C122S 252
205 F30Y/H37T/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149F/M157K 255
167 V38D/Y40P/V41K/L97bA/H99Q/C122S 257
573 F30Y/R35T/H37A/V38D/Y40H/V41R/D60aP/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K/R217Y 263
559 F30Y/R37aH/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/S174P 267
569 F30Y/R35L/H37D/V38D/Y40H/V41R/Y60bD/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 267
578 F30Y/R35S/V38D/Y40H/V41R/D60aE/Y60bS/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 270
383 L97bR/H99Q/C122S/Y151L 271
572 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/D60aE/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149N/M157K 275
200 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K 276
250 F30Y/V38D/Y40L/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 277
567 F30Y/R35T/V38D/Y40H/V41R/D60aE/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/R217K 277
477 F30S/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K 279
819 V38D/V41Q/D60aK/Y60bD/T97aA/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192Y/R217E/K224R 279
186 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K/R217E 280
976 V38E/T39H/D60aP/Y60bW/L97bG/H99Q/C122S 281
662 F30H/R35L/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40F/V41Q/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 284
316 V38D/T39L/Y40L/V41R/T97aI/H99Q/C122S 284
757 V38D/L97bR/H99Q/C122S/E175D/R217E/K224R 292
923 R37aS/V38D/T39L/Y40L/V41R/L97bM/H99L/C122S/R217S 292
654 F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192Y 297
637 R35E/H37D/V38D/T39N/V41R/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 306
766 V38D/L97bR/H99E/C122S/E175D/K224A 306
763 V38D/L97bV/H99L/C122S/E175D/K224S 310
813 V38D/L97bR/H99L/C122S/E175D/K224A 310
912 R37aP/V38D/T39Y/V41R/L97bV/H99Q/C122S/R217T 316
175 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151M/M157K 321
502 F30H/V38D/V41R/L73Q/L97bA/H99Q/E110bD/C122S/Y149N/Y151L/M157K 321
582 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/D60aE/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 324
817 V38D/L97bT/H99E/C122S/E175D/K224S 326
204 F30Y/H37T/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K 330
522 F30Y/R35Q/H37T/V38D/Y40H/V41R/D60aE/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149H/M157K 331
589 F30Y/R37aP/G37bD/V38D/Y40H/V41R/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/M157K 331
237 F30Y/R35Q/V38Y/Y40H/V41R/D60aE/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149V/M157K/R217M 332
764 V38D/L97bR/H99L/C122S/E175D/R217E 333
235 F30Y/R35Q/H37T/V38D/Y40H/V41R/D60aE/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K 338
773 V38D/L97bG/H99Q/C122S/R217Q 338
187 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K/R217D 341
933 R35E/R37aD/V38E/Y40Q/V41L/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 342
610 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/D60aK/Y60bV/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 344
581 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/D60aP/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/R217K 345
865 R35Q/V38D/Y40M/V41R/Y60bA/L97bG/H99Q/C122S 345
252 F30Y/R36H/V38E/Y40L/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K/Q192H 346
331 H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 347
26 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 348
866 R35K/V38D/Y40F/V41R/Y60bT/L97bG/H99Q/C122S 348
579 F30Y/R35H/H37T/V38D/Y40H/V41R/D60aR/Y60bD/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 349
774 F30H/V38D/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157T/Q192H 349
380 L97bR/H99Q/C122S/Y151L/R217V 351
860 R35S/V38D/V41L/D60aP/Y60bW/L97bG/H99Q/C122S 353
391 Y40H/V41T/L97bG/C122S/R217T 357
301 V38E/V41L/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S 364
815 V38D/L97bK/H99L/C122S/E175D/K224A 365
302 L97bG/H99Q/C122S/R217Q 367
646 R35G/H37G/V38D/T39W/V41A/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S 370
636 R35F/H37G/V38D/T39H/V41A/Y60bD/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 371
332 H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 371
193 F30Y/H37D/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K/R217E 378
862 R35Q/V38D/Y40H/V41L/Y60bD/L97bG/H99Q/C122S 380
828 V38D/V41Q/L97bG/H99Q/C122S/Y151L/Q192S/R217A 385
965 R35S/V38E/H99Q/C122S/S146F/Y151L/V159L/K179N/Q192R/R217V/T242S 408
590 F30Y/R35L/R36H/H37P/V38E/Y40H/V41R/Y60bG/T97aD/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 409
971 V38E/T39R/D60aP/Y60bD/L97bG/H99Q/C122S 412
846 R37aS/V38D/V41R/Y60bT/T97aD/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/E175D/Q192A/R217E/K224R 413
318 V38D/V41R/L97bR/H99Q/C122S/R217V 418
438 R36H/V38D/Y40F/V41R/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151L/Q192D/R217D 421
537 F30N/V38D/V41L/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157R 428
899 H37G/R37aD/V38Y/T39H/V41Q/Y60bR/T97aD/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 433
659 F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39S/Y40L/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192A 434
844 V38D/V41R/D60aP/Y60bD/T97aP/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/E175D/Q192R/R217E/K224R 437
460 F30Y/R36H/V38D/V41K/D97E/T97adel/A98G/L97bdel/H99L/C122S/R217D 445
274 L97bA/H99Q/C122S 449
966 F30Y/R37aH/V38E/H99Q/C122S/Y151L/R217V 449
246 N26D/F30Y/V38D/Y40H/V41R/I65T/L97bA/H99Q/C122S/M126I/M157K/Q192H 455
253 F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39S/Y40H/V41W/Y60bW/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192Y 463
970 V38E/T39S/V41L/Y60bP/L97bG/H99Q/C122S 464
319 V38D/Y40L/V41K/L97bR/H99L/C122S/E175D 466
236 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149Q/M157K/R217S 470
297 V38D/L97bR/H99E/C122S/E175D/R217E 470
343 V41L/L97bA/H99Q/C122S 471
366 R35V/R37aE/V38E/Y40Q/V41L/Y60bS/T97aE/H99Q/C122S/Y149R 478
640 R35F/H37E/V38D/T39S/V41A/Y60bD/L97bA/H99Q/C122S 487
333 H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/E175D/Q192T/R217E/K224R 499
213 V38D/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T158A 503
256 F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39R/Y40H/V41W/Y60bW/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192Y 511
529 F30H/V38D/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157L/Q192H 515
492 F30Y/R37aH/V38D/Y40L/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 516
239 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/D60aE/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K/R217S 530
814 V38D/L97bM/H99S/C122S/K224S 538
575 F30Y/R37aD/V38D/Y40L/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M126K/M157K 539
394 V41Q/L97bG/H99Q/C122S 547
435 V38D/Y40P/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Q192L/R217D 557
258 F30Y/R35Y/R36H/H37E/V38E/T39R/Y40H/V41W/Y60bW/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192H 569
908 R36S/V38D/T39H/Y40L/V41R/L97bV/H99V/C122S/R217Q 574
638 R35Q/H37Y/V38D/T39A/V41R/Y60bP/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Q192S 575
845 V38D/V41Q/Y60bP/T97aW/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/E175D/Q192K/R217E/K224R 578
907 R37aH/V38D/T39M/Y40A/V41K/L97bR/H99Q/C122S/R217E 582
328 H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R 594
811 V38D/L97bR/H99L/C122S/E175D/R217E/K224R 610
848 R37aS/V38D/V41R/D60aS/Y60bP/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/E175D/Q192R/R217E/K224R 614
570 F30Y/R35H/H37T/V38D/Y40H/V41R/D60aE/Y60bD/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K/R217K 622
295 V38E/T97aI/L97bA/H99Q/C122S 630
499 F30Y/R35H/V38D/T39S/Y40H/V41R/S75P/L97bA/H99Q/C122S/M157K/I163M/Q204H/K243E 632
528 F30Y/V38D/Y40M/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157R/Q192M 641
395 V41T/L97bG/H99Q/C122S 646
463 R36H/V38D/V41M/A55S/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/R217D 647
928 V38D/T39V/Y40L/V41S/H99V/C122S/R217V 653
577 F30Y/R35H/H37D/V38D/Y40H/V41R/D60aK/Y60bS/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 659
759 V38D/L97bR/H99L/C122S/E175D/R217E/K224S 661
769 V38D/L97bK/H99L/C122S/R217E 673
174 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151F/M157K 688
867 R35Q/V38D/Y40F/V41T/Y60bP/L97bG/H99Q/C122S 698
462 R36H/V38D/V41M/F59I/D97E/T97adel/A98G/L97bdel/H99L/C122S/R217D 702
969 F30Y/V38E/L97bR/C122S/Y151L/R217V 702
914 V38D/T39H/Y40F/V41K/L97bM/H99T/C122S/R217E 717
386 R37aS/V41R/L97bG/C122S/R217V 726
379 V38D/L97bR/H99Q/C122S/R217V 731
885 R37aS/V38D/V41R/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/Q192T/R217V 738
27 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 743
362 R35V/R37aE/V38E/V41L/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 765
241 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/Q192H 778
527 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/K223N/P236S 781
255 F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39Q/Y40H/V41W/Y60bW/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192F 802
490 F30Y/R37aH/V38D/Y40L/V41R/L97bA/H99Q/R110dH/C122S/M157K/V160I 808
630 F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39V/Y40H/V41W/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192H 819
771 V38D/L97bV/H99L/C122S/K224A 824
444 R36H/V38D/Y40F/V41R/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151M/Q192D/R217D 825
479 F30Y/R36H/V38D/Y40F/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151M/M157Y/Q192A 830
812 V38D/L97bT/H99L/C122S/E175D/R217K 851
294 V38E/T97aE/L97bA/H99Q/C122S 862
580 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/D60aE/Y60bK/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/R217I 917
816 V38D/L97bR/H99V/C122S/E175D/R217E/K224R 930
853 V38D/V41Q/Y60bP/T97aY/L97bR/H99L/C122S/Y151L/E175D/Q192K/R217E/K224R 960
922 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/L97bG/H99S/C122S 989
852 V38D/V41Q/D60aN/Y60bP/T97aN/L97bR/H99I/C122S/Y151L/E175D/Q192R/R217E/K224R 993
635 R35Q/H37D/V38D/T39H/V41R/Y60bP/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Q192T 998
548 F30H/V38D/L97bA/H99Q/C122S/Y151F/M157K 1000
259 F30Y/R35Y/R36H/H37E/V38E/T39R/Y40H/V41W/Y60bW/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192F 1030
847 V38D/V41K/D60aE/Y60bP/T97aA/L97bR/H99L/C122S/Y151L/E175D/Q192R/R217E/K224R 1040
851 V38D/V41Q/D60aN/Y60bP/L97bR/H99L/C122S/Y151L/E175D/Q192R/R217E/K224R 1040
336 H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/K224R 1040
639 R35Q/H37Y/V38D/T39F/V41R/Y60bP/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Q192G 1130
215 F30Y/R37aH/V38D/Y40Q/V41I/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157W/Q192Y 1140
631 F30Y/R35Y/R36H/H37E/V38E/T39A/Y40H/V41W/Y60bV/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192H 1170
859 R36H/V38D/T97aR/L97bG/H99Q/C122S/E175F 1180
177 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149N/Y151F/M157K 1190
305 V38D/L97bG/H99Q/C122S 1190
909 R36S/V38D/T39K/Y40F/V41R/L97bN/H99E/C122S/R217S 1230
251 F30Y/V38D/Y40L/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/Q192H 1240
423 V38D/L97bA/H99Q/C122S 1310
916 V38D/T39L/Y40L/V41K/L97bH/H99L/C122S/R217A 1320
642 R35Q/H37G/V38D/T39W/V41R/Y60bP/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Q192G 1340
929 R37aS/V38D/T39V/V41E/L97bG/H99Q/C122S/R217T 1390
626 F30Y/R35Y/R36H/H37E/V38E/T39L/Y40H/V41W/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192F 1450
863 R37aS/V38D/V41R/D60aT/Y60bN/L97bG/H99Q/C122S 1450
805 V38E/T39W/V41T/D60aP/Y60bW/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/Y151G/Q192T 1480
770 V38D/L97bR/H99L/C122S/E175D/R217T/K224S 1570
808 V38D/L97bR/H99M/C122S/E175D/R217E 1570
424 R36S/V38D/L97bR/H99E/C122S/R217D/K224R 1580
432 R36H/V38D/V41R/A96D/D97G/T97adel/A98G/L97bdel/H99L/C122S/Y151F/Q192D/R217D 1600
809 V38D/L97bR/H99M/C122S/E175D/R217E/K224R 1660
634 F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39V/Y40H/V41W/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192A 1760
197 I17L/F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 1790
632 F30Y/R35Y/R36H/H37P/V38E/T39R/Y40H/V41W/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K/Q192F 1900
810 V38D/L97bR/C122S/E175D/R217E/K224R 1990
761 V38D/L97bR/H99E/C122S/E175D/R217S/K224S 2040
532 F30H/V38D/Y40H/V41Q/L97bA/H99Q/C122S/Q192H 2110
482 F30Y/V38D/Y40H/V41K/L97bA/H99Q/C122S/Y151R/M157R 2190
491 F30Y/A32E/Y34N/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 2210
422 A32S/V38D/H99E/C122S/K224A 2230
493 F30Y/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 2240
762 V38D/L97bR/H99V/C122S/E175D/R217E/K224N 2240
533 F30Q/V38D/Y40L/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151H/M157R/Q192Y 2300
179 F30H/V38D/V41R/L97bV/H99Q/C122S/Y151F/M157K 2390
772 V38D/L97bR/H99V/C122S/E175D/R217E/K224S 2490
756 V38D/L97bR/H99E/C122S/Y172F/E175D/R217E 2720
154 V38D/T97adel/L97bdel/C122S 2950
180 F30H/V38D/V41R/L97bV/H99Q/C122S/Y149N/Y151F/M157K 3230
765 V38D/L97bG/H99Q/C122S/E175D/R217K/K224A 3310
5 C122S 3380
192 F30Y/R35Q/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K/R217G 3860
461 R36H/V38D/V41K/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/V213A/R217D 4030
182 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/R217G 4210
489 F30Y/A32E/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 4280
172 F30Y/V38D/V41R/L97bV/H99Q/C122S/Y151F/M157K 5890
178 F30Y/V38D/V41R/L97bV/H99Q/C122S/M157K 6030
181 F30Y/V38D/V41R/L97bV/H99Q/C122S/Y149N/Y151F/M157K 7110
530 F30H/V38D/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157S/Q192L 7340
194 F30Y/H37D/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K/R217G 7760
755 V38D/L97bR/H99E/C122S/E175D/R217A/K224S 7770
758 V38D/L97bR/H99E/C122S/E175D/R217A/K224Q 7770
775 F30Y/V38D/Y40H/V41K/L97bA/H99Q/C122S/Y151K/M157R/Q192E 7770
776 F30Y/V38D/Y40H/V41K/L97bA/H99Q/C122S/Y151K/M157S/Q192E 7770
777 F30Y/V38D/Y40H/V41K/L97bA/H99Q/C122S/Y151K/Q192E 7770
778 F30M/V38D/Y40F/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151G/Q192T 7770
779 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151M/M157R/Q192T 7770
780 F30H/V38D/Y40P/V41K/L97bA/H99Q/C122S/Y151H/M157E/Q192A 7770
296 V38D/L97bR/H99E/C122S/E175D 7770
804 V38E/T39W/V41T/D60aP/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149V/Y151G/Q192T 7770
303 V38D/H99Q/C122S/R217Q 7770
304 V38D/L97bG/C122S/R217Q 7770
856 V38D/V41R/L97bT/C122S/Y151F/R217E 7770
858 V38D/V41R/L97bN/H99E/C122S/E175D/Q192M/R217E 7770
911 R36H/V38D/T39R/Y40F/V41R/H99S/C122S/R217T 7770
918 R36S/V38D/T39A/V41R/L97bV/H99S/C122S/R217T 7770
905 R36L/V38D/T39R/Y40L/V41T/L97bD/H99P/C122S/R217S 7770
913 R36S/V38D/T39K/Y40M/V41K/L97bI/C122S/R217E 7770
919 R37aH/V38D/T39R/Y40F/L97bT/C122S/R217E 7770
910 V38D/T39K/Y40F/V41Q/L97bI/H99S/C122S/R217T 7770
917 V38D/T39F/Y40L/V41K/L97bT/H99S/C122S/R217T 7770
480 F30Y/V38D/Y40L/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157T/Q192L 9990
474 F30H/V38D/Y40F/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151R/M157K 9990
472 F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151F/M157K/Q192W 9990
185 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K/R217G 9990
188 F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149F/M157K/R217G 9990
266 F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K/Q192P 9990
781 R37aH/V38E/T39S/D60aR/Y60bG/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149T/Y151S 9990
782 R37aH/V38E/T39A/V41R/D60aG/Y60bG/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149V/Y151F/Q192R 9990
783 R37aH/V38E/T39H/V41R/D60aT/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149M/Y151N/Q192T 9990
784 R37aH/V38E/T39G/V41A/D60aG/Y60bE/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151K/Q192T 9990
785 V38E/T39D/V41A/D60aA/Y60bR/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149W/Y151K/Q192T 9990
786 V38E/T39A/V41R/D60aH/Y60bH/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149M/Y151N/Q192T 9990
787 V38E/T39F/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149A/Y151G/Q192T 9990
789 R37aH/V38E/V41A/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149A/Y151M/Q192T 9990
790 R37aH/V38E/T39S/V41A/D60aG/Y60bE/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149S/Y151H 9990
791 R37aP/V38E/T39G/V41R/Y60bR/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149T/Y151P/Q192T 9990
788 V38E/T39D/V41A/D60aS/Y60bR/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149W/Y151K/Q192T 9990
298 V38D/L97bR/H99E/C122S/E175D/K224R 9990
806 V38E/T39W/V41Q/Y60bE/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149I/Y151G/Q192T 9990
803 V38E/T39W/V41T/Y60bK/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149I/Y151G/Q192T 9990
857 V38D/V41K/L97bA/H99L/C122S/Y151R/R217E 9990
915 R36S/V38D/T39K/Y40M/V41K/L97bH/H99T/C122S/R217S 9990
641 R35D/H37R/V38D/T39V/V41T/Y60bT/L97bA/H99Q/C122S/Q192A 16600
5 C122S NA
154 V38D/T97a_L97bdel/C122S NA
155 L73R/L97bG/H99Q/C122S NA
409 V38D/V41T/A96E/D97E/T97aG/A98_H99del/C122S/E175K/R217H NA
407 V38D/V41S/A96E/D97E/T97aG/A98_H99del/C122S/E175K NA
NA V38D/V41S/D97E/A96_-nulldelinsVG/A98_H99del/C122S/E175K/R217H NA
408 V38D/V41A/A96_T97adelinsERG/A98_H99del/C122S/E175N NA
NA V38D/V41L/A96_A98del/-무효_H100insRGL/C122S/Y172E/E175P NA
406 V38D/V41S/A96D/D97E/T97aG/A98_H99del/C122S/E175S NA
NA V38D/V41A/A96del/-nulldelinsRG/A98_H99del/C122S/E175N/R217delinsF NA
405 V38D/V41S/A96_T97adelinsERG/A98_H99del/C122S/E175A NA
156 V38D/L73R/L97bG/H99Q/C122S NA
NA V38D/A96_-nulldelinsVG/D97E/A98_H99del/C122S NA
NA V38D/V41Q/A96_-nulldelinsAG/D97E/A98_H99del/C122S/R217K/K224R NA
NA R35S/V38_Y40delinsDRF/D60adelinsY/A96del/-nulldelinsLK/A98_H99del/C122S/Y151L NA
NA R35T/V38_V41delinsDRF/V41M/D60aP/A96del/-nulldelinsLK/A98_H99del/C122S/Y151L NA
NA R35K/V38_-nulldelinsDQHR/A96del/-nulldelinsLK/A98_H99del/C122S/Y151W NA
410 R35K/V38D/T39S/Y40F/V41M/D60aN/A96D/D97L/A98K/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151L NA
NA R35K/V38D/T39S/Y40F/V41M/D60aN/A96del/-nulldelinsLK/A98_H99del/C122S/Y151L NA
NA R35S/V38E/T39S/Y40H/V41R/A96del/-nulldelinsLK/A98_H99del/C122S/Y151W NA
NA R35K/V38D/T39K/Y40F/A96del/-nulldelinsLK/A98_H99del/C122S/Y151delinsG NA
411 V38D/V41R/A96E/D97G/T97adelinsSG/A98_H99del/C122S NA
412 V38D/L97bG/H99P/C122S/R217V/K224Q NA
412 V38D/L97bG/H99P/C122S/R217V/K224Q NA
413 V38D/A96G/D97R/A98G/T97adel/H99I/L97bdel/C122S NA
NA V38D/A96_-nulldelinsRGI/A98G/C122S NA
414 V38D/A96E/D97E/T97aG/A98_H99del/L97bM/C122S NA
NA V38D/V41R/A96del/-무효_T97ainsG/-무효_L97binsG/A98_H99del/C122S/R217A NA
415 V38D/V41R/A96D/D97G/T97aN/A98G/L97bdel/H99L/C122S/R217F NA
NA V38D/V41R/-nulldelinsDG/D97N/T97aG/A98_H99del/C122S/R217delinsF NA
NA V38D/V41R/A96E/-무효_L97binsG/D97E/A98_H99del/C122S/E175K/R217E/K224S NA
416 V38D/V41Q/A96E/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/R217H NA
416 V38D/V41Q/A96E/D97E/T97aG/A98_H99del/C122S/R217H NA
NA V38D/V41S/A96del/-nulldelinsRG/A98_H99del/C122S/R217delinsY NA
NA V38D/V41R/A96del/-nulldelinsGG/A98_H99del/C122S/R217D NA
418 V38D/V41K/A96D/D97E/T97aG/A98_H99del/C122S/R217K/K224N NA
419 R36H/V38D/V41M/D97E/T97aG/A98_H99del/C122S/R217D NA
419 R36H/V38D/V41M/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/R217D NA
420 V38D/V41H/A96D/D97E/T97aG/A98_H99del/C122S/R217delinsF NA
421 V38D/D97E/T97aG/A98_H99del/C122S/E175G/R217H NA
NA V38D/A96P/D97_-nulldelinsVG/A98_H99del/C122S NA
157 L97bP/H99L/C122S NA
NA -무효_H99delinsRVG/L97bM/C122S NA
NA V41R/A96del/-무효_T97ainsG/-무효_L97binsG/A98_H99del/C122S NA
NA -무효_H99delinsRG/D97G/L97bM/C122S/R217E/K224R NA
423 V38D/L97bA/H99Q/C122S NA
425 V38D/V41Q/A96N/D97G/T97aI/A98G/L97bdel/H99L/C122S NA
427 V38D/V41K/A96K/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S NA
426 R35S/V38D/V41T/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S NA
428 R36H/V38D/V41S/A96E/D97R/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/K224R NA
158 R37aP/V38D/V41R/A96D/D97G/T97aN/A98G/L97bdel/H99L/C122S/M157K/R217F NA
159 R37aS/G37bD/V38D/V41R/A96D/D97G/T97aN/A98G/L97bdel/H99L/C122S/R217F NA
160 R36H/V38D/V41R/A96D/D97G/A98R/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/M157K/R217D NA
161 R37aH/V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/S174P/R217D NA
162 R37aH/V38D/V41G/A96G/D97E/T97aA/A98G/L97bdel/H99M/C122S/Y151N NA
163 R36S/V38D/Y40L/V41R/A96P/D97V/T97aR/A98G/L97bdel/H99L/C122S NA
165 V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Q192E/R217D NA
166 F30Y/V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/M157K/R217D NA
431 V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151K/Q192E/R217D NA
433 V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151W/Q192M/R217D NA
437 V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151N/Q192M/R217D NA
439 R36H/V38D/Y40H/V41K/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151K/Q192V/R217D NA
440 R36H/V38D/Y40L/V41K/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151R/Q192L/R217D NA
441 R36H/V38D/Y40V/V41K/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151F/Q192F/R217D NA
442 R36H/V38D/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151K/Q192E/R217D NA
443 R36H/V38D/Y40L/V41K/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151K/Q192E/R217D NA
449 R36H/V38D/V41K/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151K/Q192E/R217D NA
453 R36H/V38D/Y40F/V41K/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151R/Q192E/R217D NA
454 R36H/V38D/Y40L/V41R/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151N/Q192V/R217D NA
455 R36H/V38D/Y40L/V41R/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151N/Q192D/R217D NA
456 R36H/V38D/V41R/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151K/Q192E/R217D NA
457 R36H/V38D/Y40F/V41R/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151K/Q192E/R217D NA
458 R36H/V38D/Y40I/V41A/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151M/Q192L/R217D NA
459 R36H/V38D/Y40H/V41M/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/R217D NA
464 R36H/V38D/V41R/A96D/D97G/T97aN/A98G/L97bdel/H99L/C122S/G193R/R217F NA
467 V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Q192R/R217D NA
468 F21S/R36H/V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/E175D/R217D NA
470 R36H/V38D/V41R/A96D/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/G193R/R217D NA
168 V38D/Y40P/V41K/L97bA/H99Q/C122S/M157K NA
430 V38D/V41R/A96D/D97G/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151M/Q192E/R217D NA
512 F30H/R35T/H37M/V38D/V41R/D60aS/Y60bT/L97bA/H99Q/A112V/C122S/Y151L/M157K/R217T NA
220 V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S NA
531 F30N/V38D/Y40F/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157S/Q192H NA
257 F30Y/R35Y/R36H/H37E/V38E/T39S/Y40H/V41W/Y60bW/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192F NA
306 V38D/L97bG/H99Q/C122S/S195A/R217Q NA
342 V38D/C122S/S190H/G216A NA
* 치환을 함유하는 예시적인 프로테아제 도메인의 서열번호
실시예 3
사이노몰구스 원숭이 혈장에서 u-PA 변이체의 항-C3 활성
일부 변형된 u-PA 폴리펩티드의 생체 외 항-C3 활성을 구입한 사이노몰구스 원숭이 혈장(BioChemed)에서 측정하였다. C3 절단을 위한 변형된 u-PA 폴리펩티드의 중간 유효 용량(ED50)을 ELISA를 사용하여 계산하였다. 간략하게, 예시적인 변형된 u-PA 폴리펩티드를 1000 nM 내지 39.0 nM(9 포인트 희석)로 1:1.5배 연속 희석하였다. hC3 표준물을 1X PBST(인산 완충 염수 Tween-20) 중 1% BSA 중에서 450 내지 39(7 포인트 희석)로 1:1.5배 연속 희석하였다. 1X PBST에 대한 레시피는 하기를 포함한다:
1. 하기 물질을 800 ml의 증류된 H2O에 용해시켰다.
ο 8g의 NaCl
ο 0.2g의 KCl
ο 1.44g의 Na2HPO4
ο 0.24g의 KH2PO4
ο 2ml의 tween-20
2. pH를 7.2로 조정한다.
3. 추가 증류된 H2O로 부피를 1L로 조정한다.
4. 오토클레이빙에 의해 멸균한다.
50 mM Tris, pH 8.0, 50 mM NaCl, 및 0.01% Tween-20, 및 C3의 희석액을 함유하는 완충액 중 80% 사이노몰구스 유리체 혈장(BioChemed로부터 입수함)을 10분 동안 37℃에서 0.1 μM의 최종 농도로 변형된 u-PA 폴리펩타이드와 함께 인큐베이션하였다. 80% 혈장 소화물을 Biomek 액체 취급 시스템(Beckman Coulter)을 사용하여 1X PBST 중 1% BSA 중 1:15,625로 희석하였다. 2.0 μg/mL의 정제된 A213 항체(항-C4; Quidel specialty products)로 코팅된 편평 바닥 EIA 플레이트(Bio-Rad)를 50 μL/웰의 샘플 또는 표준물과 함께 인큐베이션하고, 1x PBST 중 1% BSA 중 항-hC3a 항체(ab11872; Abcam)로 검출하였다. 웰을 1x PBST 중 1% BSA 중 1:30,000 희석으로 HRP 접합체 염소 항 마우스-HRP 항체(Jackson ImmunoResearch; 카탈로그 번호: 115-035-003)로 추가로 코팅하고, 검출을 위해 WesternBright ECL(화학발광) HRP 기질로 현상하였다.
ED50은 C3의 50% 손실을 일으키는 프로테아제의 농도로서 정의된다. 결과는 서열번호: 8-14 및 16-20에 기재된 서열을 갖는 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 존재 하에 C3의 증가된 손실(즉, 절단)을 나타낸다. 서열번호: 8에 제시된 서열을 갖는 u-PA 폴리펩타이드 프로테아제 도메인은 다른 것보다 수배 더 높은 ED50으로 절단되었다. 결과는 하기 표 15에 제시되어 있다.
표 15: 사이노몰구스 원숭이 혈장에서의 항-C3 활성
키모트립신 넘버링 서열번호* ED 50 80% 사이노몰구스 혈장
(10 min, nM)
F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 8 1700
F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 9 176
F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 10 114
R35W/R36H/H37N/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192H 11 309
F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 12 286
F30Y/R35W/R36H/H37N/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 13 222
F30Y/R35W/R36H/H37P/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 14 145
F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39F/Y40F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 16 481
F30Y/R35Y/R36H/H37P/R37aQ/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bH/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 17 215
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aT/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 18 244
R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bL/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 19 214
R35W/H37D/R37aP/V38E/T39W/V41R/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 20 175
* 치환을 함유하는 예시적인 프로테아제 도메인의 서열번호
실시예 4
사이노몰구스 원숭이 유리체액에서의 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 항-C3 활성
변형된 u-PA 폴리펩타이드의 활성을 기질 보체 단백질 인간 C3의 절단에 의해 평가하였다. 2 μM 정제된 인간 C3(Complement Technologies; Tyler, TX)을 구입한 원숭이 유리체액(BioChemed)에서 37℃에서 1시간 동안 변형된 u-PA 폴리펩타이드(0-250 nM)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 유로키나제 억제제 Glu-Gly-Arg 클로르메틸 케톤(EGR-CMK; Haematologic Technologies, EGRCK-01)을 첨가하여 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 활성을 10 μM의 최종 농도로 억제하고, hC3/변형된 u-PA 폴리펩타이드 혼합물을 주위 온도에서 30분 동안 방치하였다.
소화되지 않은 인간 C3의 잔류 수준을 ELISA를 사용하여 정량화하였다. 치환 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/ T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R, Y40Q/V41L/L97bA/C122S 및 Y40Q/V41L/L97bA/C122S, 및 Y40Q/V41R/L97bA/C122S를 함유하는 것을 포함하는 모든 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 5에 제시된 C122S 치환을 함유하는 참조 u-PA 폴리펩타이드보다 더 높은 턴오버(시간 당)로 보체 단백질 C3을 절단하였다. 결과는 하기 표 16에 제시되어 있다.
표 16: 유리체액에서의 C3 절단
키모트립신 넘버링 서열번호* C3 턴오버 수 (hr -1 )
C122S를 갖는 u-P 야생형 u-PA 5 0.3
V38E/Y40Q/V41L/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S 15 29
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 21 48
Y40Q/V41L/L97bA/C122S 40 8
Y40Q/V41L/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S 34 42
V38E/Y40Q/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S 35 17
V38E/Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S 36 56
V38E/Y40Q/V41L/Y60bL/H99Q/C122S 37 18
V38E/Y40Q/V41L/Y60bL/L97bA/C122S 38 12
R37aS/V41R/L97bG/H99Q/C122S 41 5
T39Y/V41R/L97bA/H99Q/C122S 42 17
T39Y/V41R/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S 43 26
T39Y/V41R/D60aP/L97bA/H99Q/C122S 44 17
* 치환을 함유하는 프로테아제 도메인의 서열번호
실시예 5
사이노몰구스 원숭이 유리체액에서의 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 생체 외 안정성
변형된 u-PA 폴리펩타이드의 생체 외 안정성을 구입한 사이노몰구스 원숭이 유리체액 또는 인산염 완충 염수(PBS) 대조군에서 평가하였다. 유리체액에서 안정성을 나타내는 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 AMD의 치료에 사용될 수 있다.
50 mM Tris, pH 8.0, 50 mM NaCl, 및 0.01% Tween-20 또는 PBS 대조군을 함유하는 완충액 중 80% 사이노몰구스 유리체액(Cynomolgus vitreous humor)(BioChemed로부터 입수함; 카탈로그 번호 BC7615-V1, BC60815- V1 및 BC33115-V6)을 0.1 μM의 최종 농도로 변형된 u-PA 폴리펩타이드와 함께 인큐베이션하였다. 이들 혼합물을 37℃에서 7일 동안 인큐베이션하고, 잔류 프로테아제 활성을 50 mM Tris, pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.01% Tween-20 중 100 μM 형광원성 기질 AGR-ACC(7-아미노-4-카르바모일메틸-쿠마린)로 검정하였다(검정 결과는 여기 파장 = 380 nm 및 방출 파장 = 460 nm에서 평가하였다). 결과는 서열번호: 21-33에 제시된 서열을 갖는 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 사이노몰구스 혈장 및 PBS에서 필적하는 활성을 나타낸다는 것을 보여준다. 결과는 하기 표 17에 제시되어 있다.
표 17: 유리체액 중 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 안정성
7일째의 활성(%)
키모트립신 넘버링 서열번호* 유리체 PBS
C122S를 갖는 야생형 u-PA 프로테아제 도메인 5 102 111
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 21 83 94
H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 22 73 79
R35Q/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 23 88 92
R35Q/H37Y/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 24 87 99
R35Q/H37Y/R37aE/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 25 105 103
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 26 93 108
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 27 88 100
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 28 93 97
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 29 58 61
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 30 86 92
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/H99Q/C122S/Y149R 31 90 111
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/C122S/Y149R 32 89 108
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S 33 74 99
* 치환을 함유하는 예시적인 프로테아제 도메인의 서열번호
하기 표 18의 항-C3 u-PA 변이체의 생체 외 안정성을 구입한 사이노몰구스 원숭이 유리체액에서 7일 및 28일 동안 인큐베이션한 후에 평가하였다. 결과는 몇몇 변이체가 28일 인큐베이션 후에도 유의한 활성을 유지함을 보여준다. 결과는 하기 표 18에 제시되어 있다.
표 18: 유리체액 중 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 안정성
활성(%)
키모트립신 넘버링 서열번호* 7일째 28일째
C122S를 갖는 야생형 u-PA 5 106 90
V38E/Y40Q/V41L/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S 15 43 n/d
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 21 83 34
Y40Q/V41L/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S 34 42 n/d
V38E/Y40Q/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S 35 28 n/d
V38E/Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S 36 17 n/d
V38E/Y40Q/V41L/Y60bL/H99Q/C122S 37 73 n/d
V38E/Y40Q/V41L/Y60bL/L97bA/C122S 38 71 n/d
Y40Q/V41L/L97bA/C122S 40 56 28
R37aS/V41R/L97bG/H99Q/C122S 41 100 74
T39Y/V41R/L97bA/H99Q/C122S 42 92 61
T39Y/V41R/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S 43 98 58
T39Y/V41R/D60aP/L97bA/H99Q/C122S 44 86 42
* 치환을 함유하는 프로테아제 도메인의 서열번호
실시예 6
인간 혈장에서의 생체 외 약력학적 분석
변형된 u-PA 폴리펩타이드(프로테아제 도메인)를 80% 인간 혈장과 함께 인큐베이션한 후, 적혈구를 첨가하여 보체 활성의 용혈 검정에서 보체 단백질 C3의 절단을 평가하였다. 인간 혈장의 존재 하에 기능적 검정을 수행하는 것은 약제학적으로 관련된 환경에서 항-C3 프로테아제의 활성을 시험하고, 예를 들어 이들이 인간 혈액에 존재하는 세르핀 또는 다른 프로테아제 억제제에 의한 불활성화에 감수성인지 여부를 검사한다. 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 일반적으로 인간 혈장의 존재하에 억제되지 않았다. 이는 투여된 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 정맥내 투여되는 경우와 같이 인간 혈장에 노출되는 DGF와 같은 질환 및 장애 및 병태의 치료에 중요하다. 이는 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 혈장에 노출되지 않는 경우, 유리체내 또는 망막 내 또는 망막하 주사에 의한 AMD의 치료와 같은 적용에서 덜 중요하거나 중요하지 않다.
보체 활성의 50% 억제가 달성되는 프로테아제의 농도인 ED50 값을 측정하였다. 야생형 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 5, C122S 포함), 및 다양한 예시적인 변형된 u-PA 프로테아제 도메인을 3 μM에서 0.11 μM로 연속 희석(9 포인트 연속 희석 1:2)하여 ED50을 측정하였다. 야생형 u-PA(서열번호: 5) 프로테아제 도메인 및 변형된 u- PA 프로테아제 도메인을 희석된 프로테아제 용액 4 μL 및 인간 혈장(항응고제로서 시트르산나트륨 포함; Innovative Research, Inc.) 16 μL를 조합함으로써 0.2 mL 튜브에서 80% 혈장의 최종 농도로 사전 인큐베이션하였다. 이는 EC50 프로토콜에 대해 0.6 μM 내지 0.0022 μM 프로테아제의 최종 농도를 제공하도록 프로테아제를 추가로 희석시켰다. 비-프로테아제 대조군(18 μL 혈장 및 2 μL PBST) 및 배경 대조군(20 μL만의 PBST)을 또한 검정에 포함시켰다. 반응물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 70 μL PBST를 첨가하여 20% 혈장으로 추가로 희석하였다.
감수성 양 적혈구(Diamdex, Miami, FL)를 3.0 ml 분취량을 펠렛화하고, 2.7 mL의 완충액을 제거하고, 세포 펠렛을 나머지 0.3 ml 완충액에 재현탁시킴으로써 10X로 농축시켰다. 농축된 감작 적혈구를 폴리프로필렌 96-웰 플레이트에 웰 당 12 μL의 부피로 첨가하였다. 6 μl 또는 60 μl의 예비인큐베이션된 프로테아제/혈장 혼합물을 적혈구에 첨가하여 각각 최종 부피 120 μl 중 1% 혈장 또는 10% 혈장의 최종 농도를 제공하였다(최종 부피에 첨가된 PBST). 용액을 실온에서 45분 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 세포를 5분 동안 2000 rpm에서 회전시켜 파괴되지 않은 세포를 펠릿화하고, 100 μL의 상청액을 제거하고, 투명한 96-웰 미세적정 플레이트에 두었다.
용해된 적혈구로부터 헤모글로빈의 방출을 415 nm에서 광학 밀도(OD)를 판독함으로써 모니터링하였다. 분획 용혈은 모든 웰로부터 배경 대조군을 차감한 다음, 실험 샘플을 비-프로테아제 대조군(양성 대조군)으로 나눔으로써 계산하였으며, 여기서 양성 대조군의 용혈의 분획은 1.00으로 설정하였다. 프로테아제에 의한 용혈의 EC50(nM)은 4 파라미터 로지스틱 곡선 피팅(SoftMax Pro software, Molecular Devices, CA) 상에서 분획 용해 대 프로테아제 농도를 플롯팅함으로써 측정하였다.
결과를 하기 표 19에 나타내었으며, 이는 서열번호: 5에 제시된 C122S 돌연변이를 갖는 야생형 u-PA 및 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 의한 80% 인간 혈장에서의 용혈에 대한 EC50(nM)을 제시한다. 표 19에 나타낸 바와 같이, 80% 인간 혈장에서 야생형 u-PA에 대한 ED50은 6 μM보다 큰 반면; 예시적인 변형된 u-PA 프로테아제 도메인 폴리펩타이드는 더 낮은 ED50(예를 들어, 173 nM 내지 1.028 μM)에 의해 나타나는 바와 같이 보체를 억제하는 능력이 유의하게 증가하였다.
표 19: 인간 혈장에서의 C3 억제
키모트립신 넘버링 서열번호* ED 50 80% 인간 혈장
(60 min, nM)
C122S를 갖는 야생형 u-PA (프로테아제 도메인) 5 > 6000
F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 8 1028
F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 9 257
F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 10 195
R35W/R36H/H37N/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192H 11 208
F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 12 227
F30Y/R35W/R36H/H37N/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 13 220
F30Y/R35W/R36H/H37P/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 14 185
F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39F/Y40F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 16 220
F30Y/R35Y/R36H/H37P/R37aQ/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bH/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 17 173
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aT/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 18 253
R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bL/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 19 318
R35W/H37D/R37aP/V38E/T39W/V41R/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 20 196
* 치환을 함유하는 예시적인 프로테아제 도메인의 서열번호
실시예 7
간접 발색 검정을 사용한 플라스미노겐 활성화의 동력학 분석
정제된 단백질 제제로서 생산된 야생형 및 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 활성을 결정하기 위해 간접적인 발색 검정을 수행하였다(Madison 등(1989) Nature, 339: 721-724; Madison 등(1990) J Biol . Chem., 265: 21423-21426). 이 검정에서, 유리 p-니트로아닐린은 플라스미노겐에 대한 u-PA의 작용에 의해 생성된 플라스민의 작용에 의해서 발색 기질 Spectrozyme PL(H-D-노르류실헥사히드로티로실-리신-p-니트로아닐리드 디아세테이트 염, American Diagnostics, Inc.)로부터 방출된다. 유리 p-니트로아닐린의 방출을 OD405 nm에서 분광광도계로 측정하였다.
검정을 위해, 0.25 내지 1 ng의 시험될 u-PA 효소, 0.62 mM Spectrozyme PL, 및 0.2 μM Lys-플라스미노겐(American Diagnostics, Inc.)을 함유하는 100 μL 반응 혼합물을 50 mM Tris-HCL(pH 7.5), 0.1 M NaCl, 1.0 mM EDTA 및 0.01%(v/v) Tween 80을 함유하는 완충액 중에서 조합하였다. 반응물을 96-웰 편평-바닥 미세적정 플레이트(Costar, Inc.)에서 37℃에서 인큐베이션하고, 405 nm에서의 광학 밀도(OD405)를 분자 장치 Thermomax에서 1시간 동안 30초마다 판독하였다. 반응속도 상수 kcat, Km, 및 kcat/Km(특이성 상수)를 계산하였다(예를 들어, Madison, E. L(1989) Nature 339: 721-724 참조).
결과는 하기 표 20에 제시되어 있다. 결과는 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 기질 플라스미노겐에 대한 효소 활성을 상당히 감소시켰음을 보여준다. 본원에 제공된 모든 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 플라스미노겐에 대한 감소된 활성 및 특이성을 갖고; 모두 비변형 u-PA에 비해 C3에 대한 특이성 및 활성의 수배 증가를 갖고 보체 활성화를 억제한다.
표 20: 플라스미노겐 활성화의 동역학 분석
키모트립신 넘버링 서열번호* k cat /K m
(M -1 s -1 )
C122S를 갖는 야생형 u-PA 5 1.54E+04
F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K 8 4.03E+02
F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K 9 <1.0E+01
F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 12 <1.0E+01
R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aT/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 18 <1.0E+01
R35W/H37D/R37aP/V38E/T39W/V41R/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 20 <1.0E+01
F30Y/R35Y/R36H/H37P/R37aQ/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bH/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K 17 <1.0E+01
* 치환을 함유하는 예시적인 프로테아제 도메인의 서열번호
실시예 8
생체 내 사이노몰구스 원숭이 유리체액에서의 항-C3 u-PA 변이체의 항-C3 활성 및 안정성
치환 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R을 함유하는 프로테아제 도메인인, 서열번호: 21에 제시된 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 생체 내 활성 및 안정성을 평가하였다. 유리체액에서의 안정성 및 C3을 절단하는 능력은 AMD의 치료를 위한 후보를 나타내는 파라미터이다.
12마리의 순수 사이노몰구스 원숭이를 단일 치료군으로 할당하였다. 연구 동물은 한쪽 눈에 125 μg의 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 단일 용량을 유리체내로 투여하였다. 약 25 kDa의 분자량을 갖는 서열번호: 21에 기재된 서열을 갖는 단리된 프로테아제 도메인을 투여하였다. 오른쪽 눈은 시험 물품을 받았고, 왼쪽 눈은 비히클 대조군으로 주사되었다. 4마리의 동물을 하기 시점 각각에서 희생시켰다: 투여 후 24시간, 2일째 및 6일째. 유리체액 샘플을 오른쪽 눈 및 왼쪽 눈으로부터 수집하고, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 비히클 대조군으로 처리한 후 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 안정성 및 C3의 수준에 대해 분석하였고; C3 및 변형된 u-PA 폴리펩타이드 농도를 상기 상술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정하였다.
투약 후 24시간, 2일째 및 6일째에 수득된 유리체액 샘플에 존재하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 농도를 ELISA에 의해 결정하였다. 이어서, EGR-CMK (Haematologic Technologies, EGRCK-01)를 첨가하여 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 활성을 10 μM의 최종 농도로 억제하고, hC3/변형된 u-PA 폴리펩타이드 혼합물을 주위 온도에서 30분 동안 방치하였다.
서열번호: 21의 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 반감기는 대략 2일인 것으로 결정되었고, 이는 인간 시스템에서 대략 5일에 상응해야 한다(Deng 등 MAbs 3(1): 61-66(2011)). 변형된 u-PA 폴리펩타이드(서열번호: 21)의 생체 내 회수율(즉, 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 피크 수준을 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 용량으로 나눈 값)을 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 관찰된 최대 수준으로부터 ELISA에 의해 계산하였다. 100% 생체 내 회수율에 대한 이론적 예측 값은 2.5 μM이었다. 치환 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R을 함유하는 변형된 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 21)의 측정된 생체 내 회수율은 예측된 값의 대략 80% 또는 대략 2.0 μM인 것으로 계산되었다.
유리체액 중의 C3 수준을 실시예 3에 상술된 바와 같이 ELISA에 의해 평가하였다. 비히클-주사된 음성 대조군 눈에서의 C3 수준은 0.4 nM 내지 50 nM 범위였다(유리질의 혈액 오염으로 인해, 비히클-주입된 눈으로부터의 2개의 샘플은 다른 10개와 유의하게 상이함). u-PA 투여 전 C3의 기준선 수준은 대략 2.2 nM이었다. C3은 1일째 및 7일째 후에 변이체-처리된 눈에서 검출가능하지 않았다. 28일 후, 서열번호: 21에 제시된 서열을 갖는 변형된 u-PA 폴리펩타이드로 처리된 눈에서 C3 농도는 대략 2.2 nM이었고, 이는 처리 이전 수준과 동등하다. 따라서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 AMD의 치료를 위한 후보이다.
실시예 9
u-PA에서의 예시적인 돌연변이 및 절단 부위의 확인
전장, 전구체 및 프로테아제 도메인 및 이의 촉매 활성 부분을 포함하는 u-PA 폴리펩타이드에서의 예시적인 위치 및 돌연변이는 표 22(아래)에 제시되어 있다.
표 22: u-PA에서의 예시적인 돌연변이
사이노 넘버링 성숙한 넘버링 wt 서열번호:21의 폴리펩타이드에서의 돌연변이 예시적인 돌연변이 돌연변이에 대한 보존
30 173 F Y, W, F
35 178 R Q Q, W, Y Y, W, F, N
36 179 R H N, Q
37 180 H Y Y, E, P D, N, G, K, Y D, E, Q, H, P, R, Q, E, W, F
37a 181 R E E, P, Q, N D, Q, H
38 185 V E E
39 186 T Y W, Y, F M, L
40 187 Y Q, F M, L, Y, N, Q
41 188 V R R, L K
60a 208 D P P S
60b 209 Y Q L, Q, S, A, Y, T N, T, G, S, I, V, Q
97a 249 T I E, I, D, L, V
97b 250 L A A, G G, S
99 252 H Q Q N
149 306 Y R K, R Q, E
157 314 M K R, Q, E
192 353 Q H N, Q
치환은 프로테아제 도메인(서열번호: 2 또는 5); 전장(서열번호: 1 또는 4) 및 성숙 형태(서열번호: 3 또는 6)를 포함하는 임의의 형태의 u-PA이다. 치환은 15 내지 18개만큼 많은 또는 그 이상의 치환을 포함하여, 본원에 예시된 것을 포함하여 조합될 수 있다.
데이터는 이들 돌연변이를 갖는 변형된 u-pA 폴리펩타이드가 다중 종, 예컨대 인간 및 사이노몰구스 원숭이에서 C3을 절단하고 불활성화시킨다는 것을 보여준다. 인간 C3의 절단은 잔기 740 내지 741(서열번호: 47)일 수 있고, 이러한 절단은 C3을 불활성화시킨다:
Figure pct00013
상기 입증된 바와 같이, 그리고 본 개시내용 전반에 걸쳐, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 C3을 절단하고 불활성화시킨다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 상기 영역에서 절단을 위해 선택하였고, 이를 시험함으로써 확인하였다. 예를 들어, C3을 치환 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R을 함유하는 변형된 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 21)과 함께 또는 치환 Y40Q/V41L/L97bA/C122S을 갖는 변형된 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 40)과 함께 효소 대 기질 비 1:10 또는 1:50에서 총 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 0, 5, 10, 20, 40 및 60분에 이들 반응으로부터 제거하고, TFA의 첨가 및 드라이 아이스에서의 플래시 동결에 의해 절단 반응을 각각의 샘플에서 즉시 종결시켰다. 이들 샘플을 추가로 분석하기 전에, 시스테인 측쇄를 환원시키고 알킬화시키고, 리신 측쇄의 ε-아미노기를 O-메틸이소우레아로 처리하여 차단시킨 다음, 펩타이드 아미노 말단을 NHS-SS-비오틴으로 표지하였다. 생성된 비오티닐화 C3 펩타이드를 포획하고, 트립신 및 GluC 프로테아제로 추가로 소화시켰다. 이러한 제2 프로테아제 소화 후, 펩타이드 생성물을 다시 한번 친화성 포획하였다. 이어서, 비오틴을 포획된 펩타이드로부터 환원에 의해 제거하고, 펩타이드 혼합물을 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 0분 후 각각의 시점에서 MW 8289의 단편이 관찰되었으며, 이는 C3에서 QHAR 부위에서 아르기닌에서의 절단을 나타낸다. 이들 반응에서 추가의 C3 절단 부위는 관찰되지 않았다. 따라서, 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 QHAR에서 절단한다.
Figure pct00014
실시예 10
사이노몰구스 원숭이 유리체액에서의 u-PA 독성
변형된 u-PA 폴리펩타이드의 안전성 및 내약성을 사이노몰구스 원숭이에서 생체 내 평가하였다. 3마리의 순수 사이노몰구스 원숭이를 3개의 처리 군 각각에 할당하였다. 연구 동물은 눈 당 12.5 μg, 37.5 μg 또는 125 μg의 각각의 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 유리체내 투여하였다. 오른쪽 눈은 시험 폴리펩타이드를 받았고, 왼쪽 눈은 비히클 대조군으로 주사되었다. 동물을 임상적으로 관찰하고(즉, 음식 소비), 안과 검사를 수행하였다. 안과 검사는 슬릿-램프 생체현미경검사 및 도상 검안경 관찰, 이어서 투여 전 (T=0) 및 투여 후 2일째, 8일째 및 15일째에 칼라 안저 사진 또는 광간섭 단층촬영(OCT)을 포함하였다. 모든 관찰은 최대 4주 동안 또는 해결될 때까지 계속하였다.
모든 동물에 대해 비-관찰된-유해-효과-수준(NOAEL)을 평가하였다. 서열번호: 42에 제시된 서열을 갖는 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 투여된 동물에 대한 NOAEL은 37.5 μg 이상이었다. 서열번호: 21에 기재된 서열을 갖는 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 투여한 동물에 대해서는 어떠한 부작용도 주지되지 않았고; 따라서, 서열번호:21에 기재된 서열이 있는 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 투여된 동물에 대한 NOAEL은 125 μg 이상(인간에서 375 μg/눈 이상과 동등함)이었다.
실시예 11
예시적인 변이체에서의 돌연변이가 임의의 면역원성 핫스팟을 도입하지 않았다는 것을 확인하기 위해 야생형 u-PA, 야생형 u-PA의 C122S 변이체(서열번호: 5) 프로테아제 도메인 및 예시적인 u-PA 변이체 프로테아제 도메인에서 후보 면역원성 핫스폿을 확인하기 위해 계산을 수행하였다. 관심 변이체에 대한 핫스팟의 전체 프로파일을 비교 단백질의 패널과 비교하기 위해 계산을 또한 수행하였다.
방법의 개요
외래 단백질에 대한 T-세포 반응에서 중요한 단계는 항원 제시 세포에서 발현된 HLA 복합체의 임의의 숙주에 대한 구성 펩타이드(외래 단백질의 절단으로부터 유래됨)의 결합 및 제시이다. 공지된 HLA에 결합하는 것으로 예측되는 단백질로부터 유래된 펩타이드의 확인은 T-세포 반응을 유도하기 위한 서열에서 가능한 핫스팟의 지표로서 사용될 수 있다. 공지된 면역원성 특성을 갖는 단백질의 변이체를 고려할 때, 예측된 HLA-결합제의 프로파일을 비교하는 것은 변화가 임의의 새로운 면역원성 핫스팟을 도입하였는지의 여부를 확인하는 것을 도울 수 있다.
프로파일은 공개적으로 이용가능한 데이터베이스를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 결합 예측 서비스(NetMHCII 2.2server), Technical University of Denmark를 사용하여 HLA에 대한 결합을 예측하였다. NetMHCII 2.3 서버는 인공 뉴런 네트워크를 사용하여 HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP 및 마우스 MHC 클래스 II 대립유전자에 대한 펩타이드의 결합을 예측한다. 예측은 25 HLA-DR 대립유전자, 20 HLA-DQ, 9 HLA-DP, 및 7 마우스 H2 클래스 II 대립유전자에 대해 수득될 수 있다. 예측 값은 nM IC50 값으로 제시되고, 1,000,000개의 무작위 천연 펩타이드 세트에 대한 %-랭크로서 제시된다. 강한 및 약한 결합 펩타이드가 산출물에 지시된다.
상기 서비스를 사용하여, 펩타이드의 1차 서열에 기초하여 14개의 HLA-DR 변이체 패널(하기 표 B 참조)에 대한 예시적인 변이체(서열번호: 40, 및 서열번호: 21), 야생형 프로테아제 도메인(서열번호: 2), 및 C122S(서열번호: 5)를 갖는 야생형 프로테아제 도메인의 15개의 인접 아미노산의 모든 가능한 펩타이드의 결합 친화도를 예측하였다. 각각의 펩타이드/HLA 쌍에 대해, NetMHCII 서버는 예측된 결합 친화성뿐만 아니라 단단한 결합제(Kd ≤ 500), 약한 결합제(Kd ≤ 50 nM), 또는 비-결합제(Kd > 500 nM)로서의 분류를 제공한다. N 아미노산을 함유하는 단백질 서열의 경우, 이는 총 T = (N-14) x 14개의 가능한 펩타이드-HLA 결합 쌍을 초래한다.
NetMHCII 서버로부터의 결합 예측을 사용하여, 결과를 사용하여 다수의 후보 결합 쌍이 확인된 영역에 기초하여 이들 단백질 서열에서 가능한 핫스팟을 확인하였다. 이들 변화를 상응하는 단백질 서열의 공지된 변화와 비교하였다.
각각의 단백질에 대해, 예측된 단단한-결합 펩타이드-HLA 쌍(TB)의 수, 예측된 약한-결합 펩타이드―HLA 쌍(WB)의 수, 및 펩타이드-HLA 쌍의 총 수(T)를 기반으로 한 전체 결합 점수를 다음과 같이 간주하였다:
점수 = (TB + 0.5 * WB )/T
표 B - 가능한 결합제로서 포함된 HLA -DR 분자
Figure pct00015
이 점수는 8개의 HLA의 하위세트를 사용하는 경우에 면역원성을 예측하기 위해 면역정보학 및 시험관 내 기술을 사용하는, 회사 EpiVax(Providence, RI)에 의해 생성된 인실리코 면역원성 예측과 우수한 일치를 나타내었다. 8개의 HLA의 이러한 하위세트를 사용하였다. 동일한 계산을 표준 단백질 패널에 대해 수행하여 u-PA 변이체를 비교하는 비교 세트를 제공하였다.
예측된 HLA 결합 프로파일에 대한 돌연변이의 영향
변이체 u-PA 프로테아제 도메인 중 임의의 것에 대한 주어진 서열 위치의 횟수를 50 nM 및 500 nM의 Kd 컷오프에서 각각의-HLA 복합체에 대해 맵핑하였다. 각 칼럼의 규모는 고정되지만, 칼럼들 간에는 상이하고, 야생형 폴리펩타이드와 비교하여 돌연변이가 면역원성 프로파일을 변경시키는지 여부를 평가한다. 폴리펩타이드 사이의 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
응집된 면역원성 점수
각각의 서열에 대한 응집체 면역원성 점수를 계산하기 위해, 기존에 EpiVax(Providence, RI)에 의해 검증된 8개의 HLA 패널(표 C)에 걸친 각각의 결합 역치에서의 펩타이드-HLA 결합 쌍의 총수가 공개된 인실리코 면역원성 점수와 우수한 일치를 제공한다. EpiVax는 면역원성을 예측하기 위해 면역정보학 및 시험관 내 기술을 사용하는 회사이다. 이어서, 이들 값을 사용하여 상기 방법 요약에 기재된 바와 같이 전체 점수를 계산하였다.
표 C- 전체 면역원성 점수에 사용된HLA-DR 하위세트
Figure pct00016
8개의 HLA의 하위세트에 대한 펩타이드-HLA 결합 쌍의 수 및 uPA에 대한 복합 점수가 하기에 제시된다:
Figure pct00017
결과는 변이체의 면역원성이 야생형 폴리펩타이드와 상이해서는 안된다는 것을 나타낸다. 비교 단백질의 패널에 대한 동일한 분석의 결과를 하기에 나타낸다:
Figure pct00018
실시예 12
wt- 및 변이체 u-PA 폴리펩타이드에 의한 플라스미노겐의 활성화
본원에 제공된 u-PA 폴리펩타이드의 wt- 및 항-C3 변이체에 의한 Glu-플라스미노겐의 활성화를 위한 촉매 효율을 하기 기재된 바와 같이 시험하였다. 이들 실험으로부터의 데이터는 항-C3 u-PA 변이체 단백질이 야생형 u-PA의 생리학적으로 관련된 기질인 플라스미노겐에 대해 상당히 감소된 활성을 나타낸다는 것을 입증하였다. 실시예 7로부터의 데이터와 조합하여, 이들 데이터는 항-C3 u-PA 폴리펩타이드가 "새로운" 기질인 C3에 대해 실질적으로 더 큰 활성을 나타낼뿐만 아니라, wt u-PA의 정상적인 생리학적 기질에 대해서는 실질적으로 감소된 활성을 나타낸다는 것을 입증한다.
따라서, 본원에 기재된 항-C3 변이체 내로 도입된 돌연변이는 wt-u-PA의 것과 비교하여 항-C3 변이체 폴리펩타이드의 기질 특이성을 극적으로 변경시켰다.
wt- 및 항-C3 변이체 u-PA 폴리펩타이드에 의한 플라스미노겐 활성화
1) 단일 시점 반응(30 분 동안 37℃)을 사용한 분석
a) 반응 조건
플라스미노겐 활성화 활성을 야생형 u-PA/C122S(서열번호: 5)뿐만 아니라 돌연변이 Y40Q/V41L/L97bA/C122S(서열번호: 40) 및 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R(서열번호: 21)을 함유하는 항-C3 u-PA 폴리펩타이드 변이체에 대해 측정하였다. 반응 혼합물 중 프로테아제 농도는 25 nM(wt-u=PA) 또는 250 nM(항-C3 u-PA 변이체)이었고, 기질(즉, Glu-플라스미노겐) 농도는 2.5 uM이었다. 반응 부피는 20 uL였고, 반응은 37℃에서 30분 동안 진행되었다. 각 반응은 20 uL의 1M DTT 및 7 uL의 4X 샘플 완충액의 첨가, 및 45초 동안 80℃까지의 가열에 의해 종결하였다. 종결된 반응 혼합물을 4 내지 12% BIS-TRIS 겔의 개별 웰에 로딩하고, XT MES 완충액 중에서 200 V에서 45분 동안 실행한 다음, 심플리블루 세이프스테인으로 염색하였다.
b) 반응 생성물(즉, 플라스민)의 측정
염색된 SDS 겔의 분석은 wt u-PA가 반응에 존재하는 모든 플라스미노겐을 절단하고, 이를 30분 인큐베이션 동안 2-사슬의 활성 플라스민으로 전환시킴을 나타내었다. 대조적으로, 이 반응에서 u-PA 변이체 Y40Q/V41L/L97bA/C122S(서열번호: 40)의 활성은 wt-u-PA의 활성보다 실질적으로 더 낮았지만, 이 반응에서는 u-PA 변이체 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R에 의해 플라스미노겐 활성화가 관찰되지 않았다.
2) 항-C3 u-PA 폴리펩타이드에 의한 Glu - 플라스미노겐 활성화의 동력학
wt- 또는 항-C3 uPA 변이체 폴리펩타이드에 의한 Glu-플라스미노겐의 활성화의 동력학 분석을 하기 기재된 바와 같이 수행하였다. 활성화 반응을 37℃에서 0.1% BSA를 함유하는 I = 0.16 M Hepes/NaCl/EDTA 완충액 중에서 수행하였다. u-PA 폴리펩타이드는 1(wt) 또는 10(변이체) nM의 농도로 존재하였다. 2차 속도 상수(kcat/Km)는 발색 기질 S-2251(H-D-Val-Leu-Lys-pNA·2HCl) 대 Glu-플라스미노겐(즉, u-PA 기질) 농도(0 - 4 μM)의 (반응 생성물 플라스민에 의한) 가수분해에 대한 초기 반응 속도의 피팅된 선형 관계로부터 유도되었다. 또한 표 24를 참조한다.
Figure pct00019
C4S 돌연변이는 프로테아제 도메인에 존재하지 않는다.
15개의 변이체들 간의 비교는 하기 첨부된 표 24에서 "항-C3 u-PA 변이체에 의한 Glu-플라스미노겐의 활성화"로 표지된 결과를 나타내었다.
표 24에 대해:
Glu-플라스미노겐을 1 nM 또는 10 nM 프로테아제의 프로테아제 농도에서 C122S uPA 또는 선택된 uPA 변이체에 의해 활성화시켰다.
반응을 37℃에서 0.1% BSA를 함유하는 I = 0.16 M Hepes/NaCl/EDTA 완충액 중에서 수행하였다.
2차 속도 상수(kcat/Km)는 발색 기질 S-2251(H-D-Val-Leu-Lys-pNA·2HCl)의 가수분해에 대한 초기 반응 속도 대 Glu-플라스미노겐 농도(0 - 4 μM)의 피팅된 선형 관계로부터 유도되었다.
실시예 13
사이노몰구스 원숭이 유리체액에서 보체 단백질 C3의 예시적인 u-PA 프로테아제 도메인 돌연변이체 절단
예시적인 돌연변이체는 서열번호: 5에 제시된 WT u-PA 프로테아제 도메인을 참조하여 하기 표 23에 제시된다. 음영처리된 세포는 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 서열번호: 5에 기재된 참조 u-PA 폴리펩타이드와 비교할 때 이 잔기에서 돌연변이된다는 것을 나타낸다. 음영이 없는 세포는 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 서열번호: 5에 기재된 기준 u-PA 폴리펩타이드와 동일한 아미노산을 함유한다는 것을 나타낸다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 활성은 실시예 2에 상세히 기재되고 제시된 바와 같이 기질 보체 단백질 C3의 절단에 의해 결정되었고, 이는 u-PA 처리 후 C3(nM)의 잔류 수준으로서 제시된다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 의한 C3의 절단을 실시예 3에 상술된 바와 같이 구입한 사이노몰구스 원숭이 유리체액 또는 인산염 완충 식염수(PBS) 대조군에서 수행하였다. 하기 표 23에 기재된 결과는 변형된 u-PA 폴리펩타이드가 서열번호: 5에 기재된 서열의 기준 u-PA 프로테아제 도메인에 비해 C3에 대해 더 큰 활성을 나타낸다는 것을 보여준다. 유리체액 및 PBS에서의 활성%는 7일 후 남아있는 활성의 백분율을 나타낸다. 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 5의 기준 야생형 프로테아제 도메인에 비해 상대적으로 안정하며, 일부는 다른 것보다 더 큰 안정성을 나타낸다. 하기 표의 것들을 포함하는 치료 후보는 높은 C3 절단 활성, 및 특히 유리체액에서 더 큰 안정성을 갖는 것들이다.
Figure pct00020
* 치환을 함유하는 프로테아제 도메인의 서열번호
특히, 이들 데이터 및 다른 데이터는 다음을 나타낸다:
R35Q: 이 돌연변이는 (즉, 완충액 중) 고유 항-C3 활성을 80% 인간 혈장의 존재 하에 대략 2.7배 및 대략 4.3배 증가시켰다.
H37Y: 이 돌연변이는 완충액 중에서 및 80% 인간 혈장의 존재 하에 항-C3 활성을 대략 2.4-2.5배 증가시켰다.
R37aE: 이 돌연변이는 고유 항-C3 활성을 대략 3.2배 감소시켰지만; 80% 인간 혈장의 존재 하에서는 항-C3 활성에 대한 효과가 없었다.
V38E: 이 돌연변이는 완충액 및 유리체액에서 단백질의 안정성을 개선시키고, 80% 인간 혈장에서 항-C3 활성을 ~1.5배만큼 개선시켰다.
T39Y: 이 돌연변이는 80% 인간 혈장에서 고유 항-C3 활성 및 항-C3 활성을 대략 7.5-8.5배만큼 증가시켰다.
V41R: 이 돌연변이는 80% 인간 혈장에서 고유 항-C3 활성 및 항-C3 활성을 대략 25 내지 27배 증가시켰다.
D60aP: 이 돌연변이는 80% 인간 혈장에서 고유 항-C3 활성 및 항-C3 활성을 대략 1.2 - 1.6배 증가시켰다.
Y60bQ: 이 돌연변이는 고유 항-C3 활성을 대략 1.7배 감소시켰고, 37℃에서 7일 동안 인큐베이션한 후 유리체내 단백질의 안정성을 대략 1.4배 감소시켰다; 그러나 80% 인간 혈장의 존재 하에, 항-C3 활성을 약 1.1배 증가시켰다.
T97aI: 이 돌연변이는 80% 인간 혈장의 존재 하에 고유 항-C3 활성 및 항-C3 활성을 대략 1.2 - 1.3-배만큼 증가시켰다.
L97bA: 이 돌연변이는 완충액 및 80% 인간 혈장에서 항-C3 활성을 대략 6.4-8.2-배 증가시켰다.
H99Q: 이 돌연변이는 완충액 및 80% 인간 혈장에서 항-C3 활성을 대략 2.9 - 4.8배 증가시켰다.
Y149R: 이 돌연변이는 완충액 및 80% 인간 혈장에서 항-C3 활성을 대략 1.6-2.1-배 감소시켰다.
I41D/C122S/G151N/Q192T를 함유하는 보다 낮은 돌연변이 부하 변형된 u-PA 폴리펩타이드에서의 치환에 대해 유사한 결과가 달성되었다(예를 들어, 서열이 서열번호: 40에 제시된 변형된 u-PA 폴리펩타이드, 및 또한 이들 치환을 함유하는 전장 및 전구체 및 성숙 형태 참조).
데이터는 본원에 제공된 변형된 u-PA가 다양한 종에서 C3을 절단하고 불활성화시킴을 나타낸다. 예를 들어, 이를 불활성화시키기 위한 인간 C3의 절단은 잔기 740 내지 741(서열번호: 47)일 수 있다:
Figure pct00021
실시예 14
u-PA-인간 혈청 알부민( HSA ) 융합 단백질의 클로닝 , 발현 및 제조
A. u-PA- HSA 융합 폴리펩타이드의 클로닝
u-PA-HSA 융합 단백질의 발현을 위한 작제물을 생성하였다(서열번호: 1015). u-PA-링커-HSA 단편을 합성 올리고뉴클레오타이드 및/또는 PCR 생성물로부터 조립하고, pcDNA3.4-TOPO 벡터(Invitrogen; Cat. No. A14697)내로 클로닝하였으며, 이는 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시-초기 프로모터/인핸서 또는 독점 발현 벡터(Lake Pharma)의 제어 하에 발현을 위한 것일 수 있다. 분비 신호 서열(서열번호: 999(METDTLLLWVLLLWVPGSTG))을 u-PA N-말단 도메인(서열번호: 3의 아미노산 1-158), 및 예시적인 변형된 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 987에 제시됨)의 상류에서 클로닝하고, 링커(서열번호: 1002(GGSSGG))를 통해 인간 혈청 알부민(HSA; 서열번호: 991)의 코딩 영역에 연결하였다:
Figure pct00022
작제물은 신호 펩타이드(아미노산 1-20), u-PA N-말단 도메인, 위치 122에서 C를 제외하고 서열번호: 21의 변형된 프로테아제 도메인(서열번호: 987에 제시됨), GS 링커(GGSSGG, 서열번호: 1002)에 이어서 HSA 코딩 영역을 포함한다. 서열번호: 1015에 제시된 완전한 작제물 서열은 다음과 같다:
Figure pct00023
B. u-PA-HSA 융합 폴리펩타이드의 제조
1. u-PA-HSA 융합 폴리펩타이드의 형질전환 및 발현
변형된 u-PA-HSA 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA를 pcDNA3_4 발현 벡터(Thermo Fisher) 또는 섹션 A에 상술된 바와 같은 분비 신호 서열에 대한 C-말단의 독점적인 벡터(Lake Pharma)내로 클로닝하였다. 이어서, 변형된 u-PA-HSA 융합 단백질을 ThermoFisher에서 HEK expi293 또는 expiCHO 발현 세포 또는 Lake Pharma에서 독점 TunaCHOTM 세포주에서 6일 동안 1 L 부피의 발현 배지에서 발현시켰다.
2. u-PA-HSA 융합 폴리펩타이드의 친화성 정제
변형된 u-PA-HSA 융합 단백질의 자이모겐 형태를 CaptureSelectTM 인간 알부민 친화성 매트릭스 시스템(ThermoFisher Scientific; Cat. No. 19129701L 또는 19127005)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 정제하였다. 대략 10 mL의 CaptureSelectTM 친화성 매트릭스 수지(ThermoFisher)를 칼럼에 첨가함으로써 칼럼을 제조하였다. 저장 용액을 칼럼을 통해 유동시킨 후, 10 칼럼 부피(CV)의 PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4)를 첨가하여 수지를 세척하였다. 다음으로, u-PA-HSA 융합 단백질을 함유하는 발현 수거물을 컬럼에 적용한 후, 5-10 CV의 PBS로 세척하였다. 결합된 u-PA-HSA 융합 단백질을 10 CV의 용리 완충액(20 mM Tris, 2 M MgCl2, pH 7.0)로 용리시켰다. 칼럼을 10 CV의 글리신(0.2 M, pH 3.0)으로 스트리핑하고, 10% 트리스-HCl(1.5 M, pH 7.4)로 중화시키고, PBS 중에서 재평형화시켰다. 유동 통과 및 용리 단계의 샘플을 수집하고, 환원 및 비-환원 SDS PAGE 겔 전기영동 상에서 분석하여 샘플 순도를 평가하였다. u-PA-HSA 융합 단백질을 4℃에서 PBS 내로 16시간 동안 투석하였다.
3. 변형된 u-PA-HSA 융합 폴리펩타이드의 플라스민 활성화
플라스민은 야생형 u-PA 활성화 서열을 갖는 야생형 u-PA 및 다른 u-PA 융합 폴리펩타이드 내의 단일 결합을 선택적으로 절단하여 u-PA-HSA 자이모겐을 활성화시키고, 디설파이드 연결에 의해 N-말단 u-PA 도메인에 테더링된 C-말단 활성 프로테아제 도메인과 디설파이드를 통해 연결된 2-사슬 u-PA-HSA 융합 단백질을 형성한다. 이들 실험을 위해, 사용된 작제물은 키모트립신 넘버링에 의한 C122S가 유리 시스테인을 제공하기 위한 C122C이고, 신호 서열(서열번호: 1015의 잔기 1-20)이 포함되지 않는 것을 제외하고는, 서열번호: 21의 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 함유하는 서열번호: 1015에 제시된 서열을 갖는다. 활성화 후, 생성된 생성물은 2개의 사슬을 갖는다(서열번호: 1015 참조): 잔기 21-178을 갖는 A 사슬, 및 잔기 179-1022를 갖는 B 사슬, u-PA(잔기 179-431), 링커(잔기 432-437), 및 HSA(잔기 438-1022). A 및 B 사슬은 C168과 C299(키모트립신 넘버링에 의한 C122에 상응함) 사이의 디설파이드 결합에 의해 연결된다.
HSA 도메인은 GGSSGG 링커를 통해 프로테아제 도메인의 C-말단에 접합된 상태로 유지된다. 활성화는 하기 절차에 따랐다: 플라스민-아가로스 수지 슬러리(Molecular Innovations; Cat. No. HPL-1)을 1x PBS로 3회 세척하여 제조하였다. 후속적으로, u-PA 융합 폴리펩타이드의 밀리그램 당 1x PBS 중의 200 μL의 수지 슬러리를 PBS 중의 투석된 u-PA-HSA 융합 폴리펩타이드를 함유하는 용액에 첨가하였다. u-PA 폴리펩타이드 자이모겐의 "활성화"는 실온에서 3시간 동안 단백질/수지 용액을 부드럽게 진탕함으로써 달성되었다. 이어서, 변형된 u-PA-HSA 폴리펩타이드 자이모겐을 상응하는 활성 변형된 u-PA -HSA 프로테아제로 완전히 전환시켰다.
활성화된 변형된 u-PA-HSA 폴리펩타이드를 0.2 μm 스핀 필터(2.0 mL 용량)를 사용하여 플라스민 수지로부터 회수하고, 원심분리하여 제조자의 지시에 따라 플라스민 수지로부터 활성화된 변형된 u-PA-HSA를 회수하였다. 회수를 최대화하기 위해, (수지를 스피닝 다운하고 피펫 추출에 의해 상청액을 회수하는 것과는 대조적으로) 추가의 여과 기술이 구상될 수 있다. 다른 저-단백질 결합 여과 장치가 또한 수지의 추가 여과에 사용될 수 있다. 활성화된 u-PA-HSA 융합 단백질을 4℃에서 저장하거나 분취량으로 동결시켰다. 완전한 활성화 단계의 확인을 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 가시화하여 프로테아제 도메인 HSA 융합 접합체로부터 N-말단 도메인을 분리하였다.
4. 활성화된 변형된 u-PA-HSA 융합 단백질의 억제
일부 실험을 위해, u-PA-HSA 융합 폴리펩타이드의 촉매적 불활성 형태(상기 논의된 바와 같이, 서열번호: 1015의 잔기 21-1022로 제시됨; 예를 들어, 서열번호: 1019 참조)를 사용하는 것이 요망되었다. 억제된 변형된 u-PA-HSA(u-PA-HSAi)로 지정된 단백질을 생성하기 위해, 활성화된 변형된 u-PA-HSA(u-PA-HSAa)를 비가역적 활성 부위 억제제, Glu-Gly-Arg-클로로메틸케톤(EGR-CMK)과 함께 인큐베이션하여, 생체 내 실험 동안 변형된 u-PA-HSA 폴리펩타이드의 임의의 자가촉매작용 또는 불활성화/절단을 방지하였다(예를 들어, 실시예 15 및 16 참조). u-PA-HSAi를 제조하기 위해, 동결건조된 EGR-CMK(Molecular Innovations; Cat. No. GGACK)를 10 mM HCl 중에서 100 mM로 재구성하였다. 농축된 EGR-CMK를 1x PBS 중 1mM EGR-CMV 억제제의 최종 억제제 농도에 도달하도록 스톡 농도로 활성화된 변형된 u-PA-HSA 샘플(u-PA-HSAa)에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
u-PA-HSAa가 완전히 억제되었는지 여부를 평가하기 위해, 안정성 실험에서 변형된 u-PA-HSAia의 분해를 변형된 u-PA-HSAa와 비교하였다. 간략하게는, 변형된 u-PA-HSAi 및 변형된 u-PA-HSAa를 37℃에서 0시간, 1일 또는 7일 동안 인큐베이션하였다. 변형된 u-PA-HSAi 및 u-PA-HSAa 분해를 환원 및 비-환원 조건 하에 환원 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 시각적으로 모니터링하였다. 밴드를 쿠마시(Comassie) 또는 다른 유사한 상업적으로 입수가능한 염색에 의해 가시화하였다. 결과는 37℃에서 1일 또는 7일 동안 인큐베이션한 후 변형된 u-PA-HSAa의 관찰된 분해와 비교하여, 7일 이하의 임의의 시점에서 변형된 u-PA-HSAi에 대해 분해 생성물이 관찰되지 않았기 때문에, 억제제와의 전 인큐베이션이 폴리펩타이드를 안정화시킨다는 것을 입증한다.
5. 활성화 후 u-PA-HSAa 및 u-PA-HSAi 폴리펩타이드의 정제
최종 정제 라운드 동안, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 고분자량 및 저분자량 불순물로부터 활성 및 억제된 변형된 u-PA-HSA 폴리펩타이드를 단리하였다. 정제는 주요 u-PA-HSA 피크 전에 별개의 피크로서 용리된 고분자량 종을 배제하였다. 고분자량 종은 추가로 분석되지 않았으나, 과정에서 발현 또는 활성화 단계 동안 형성된 응집체 또는 다량체를 나타낼 수 있다. 발현 또는 활성화 동안 생성된 알부민이 없는 것으로 생각되는 2차 저분자량 종이 또한 제거되었다.
정제는 다음과 같이 진행하였다; 변형된 u-PA-HSAi의 샘플 ~300 μl(0.8 mg) 또는 변형된 u-PA-HSAa의 샘플 ~400 μL(0.8 mg)를 크기-배제 크로마토그래피 컬럼(HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR; GE Heathcare, Cat. No. GE17-1166-01)상에서 0.5 mL/분의 유속으로 pH 7.0에서 PBS에 로딩시켰다. 단백질을 일반적으로 수지(GE Healthcare)에 대한 제조자의 지시에 따라 정제하였으며, 이때 주요 피크는 변형된 u-PA-HSAi 또는 u-PA-HSAa를 함유한다.
제제의 품질 및 분리 정도를 환원 및 비-환원 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 추가로 평가하였다. 변형된 u-PA-HSAi 또는 u-PA-HSAa 폴리펩타이드 샘플의 용리 분획을 12-웰 비-환원 SDS-PAGE 겔의 각각의 "레인"에 로딩하고, 밴드가 충분히 구별가능할 때까지 40V에서 수행하고, 다양한 크기의 단백질 종을 은 염색에 의해 가시화하여 표준 쿠마시 염색에 대한 감수성을 개선시켰다. 75 kDa의 예상 분자량으로 이동하는 단일 밴드를 함유하는 분획을 모으고, 대략 2 mg/mL의 최종 농도로 액체 질소 중에서 급속-동결시키고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. NanoDrop 분광광도계를 사용하여 280 nM에서의 흡수에 의해 최종 농도를 결정하였다. 단백질 크기 및 발현을 나중에 쿠마시 염색 및 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 개별 u-PA-HSA 폴리펩타이드 샘플의 품질을 활성 검정 및 질량 분광법에 의해 추가로 평가하였다.
실시예 15
유리체내 주사 후 변형된 u-PA 프로테아제 도메인 및 변형된 u-PA- HSA 융합 단백질 약동학적 평가
변형된 u-PA-HSA 융합 폴리펩타이드의 약동학 및 명백한 안구 독성을 평가하였다. 융합 단백질은 실시예 14에서 상기 기재된 바와 같이, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 프로테아제 도메인(서열번호: 987, 이는 서열번호: 21이고, 단 C122S는 C222C임)을 함유한다. 융합 단백질은 서열번호: 1015의 잔기 21-1022인 서열번호: 1019에 제시된 서열을 갖는다. 실시예 14에 기재된 바와 같이, 변형된 u-PA의 프로테아제 도메인은 서열번호: 987에 제시된다. 활성화된 및 억제된 변형된 u-PA-HSA 융합 단백질(서열번호: 1015)의 약동학적 프로파일을 두치 벨티드(Dutch Belted) 토끼에서 생체 내에서 평가하고, 서열번호: 21에 기재된 바와 같은 변형된 u-PA 프로테아제 도메인의 약력학적 프로파일의 것과 비교하였다. 8마리의 토끼를 각각의 3개의 처리군에 할당하였다(군 1: 변형된 u-PA-HSAa; 군 2: 변형된 u-PA-HSAi; 군 3: 변형된 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 21)). 연구 동물에 유리체내 주사(IVT)를 통해 눈 당 50 μL의 2.1 mg/mL의 변형된 u-PA-HSAi 및 u-PA-HSAa, 또는 1.15 mg/ml의 변형된 u-PA(서열번호: 21)를 투여하였다. 변형된 프로테아제를 함유하는 변형된 u-PA로 처리된 군의 경우, 오른쪽 눈은 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 받았고, 왼쪽 눈은 비히클 대조군(PBS)으로서 PBS를 주사하였다. 하기 표는 그룹 및 조건, 및 수행된 평가를 요약한다:
Figure pct00024
* OS 및 OD는 각각 오른쪽 및 왼쪽 눈을 의미한다.
1. 변형된 u-PA 및 변형된 u-PA-HSA 융합 단백질 안구 내약성
투여 기간 동안 및 안락사 전에, 임상 및 안구 관찰을 수행하고, 체중을 기록하였다. 안구 검사를 투여 후 1, 3, 7, 및 14 일(그룹 1 및 2) 또는 1, 3, 및 7 일(그룹 3)에 양쪽 눈에 수행하고, 안구 자극을 드레이즈 스케일을 사용하여 점수화하였다. 드래이즈 점수 시스템(Draize 등, (1944) J Pharm Exper Ther 82 (3) 377-90)은 각막, 홍채 및 결막에서의 눈 자극을 평가하며, 0-2 또는 0-4 규모에서의 점수화 자극을 위한 기준을 제공한다. 0의 점수는 각막, 홍채 또는 결막이 정상임을 나타낸다. 모든 시점에서, 안구 자극을 1마리의 토끼를 제외한 모든 동물에 대해 드레이즈(Draize) 기준을 사용하여 평가한 바와 같이 0으로 점수화하였으며, 단, "1"의 2개의 점수는 "적열상태"을 나타내고, 여기서 "혈관은 정상 초과로 명확하게 주사된다" 및 "결막부종"은 결막의 "정상 초과로 팽창한다". 이들 "1" 점수는 1일째에 u-PA-HSAi의 유리체내 투여 후 몇 시간 내에 그룹 2(u-PA-HSAi)에서 1마리의 토끼에 대해 관찰되었다. 가장 중요하게는, 변형된 u-PA 및 변형된 U-PA-HSA 활성화된 융합 단백질의 유리체내 투여 후에 독성이 관찰되지 않았다.
2. 변형된 u-PA 및 변형된 u-PA-HSA 융합 단백질 약동학
변형된 u-PA 및 변형된 u-PA-HSA 폴리펩타이드 농도(nM) 및 약동학적 파라미터의 결정을 위해, 시점 당 2마리의 동물을 사용하여 1, 3, 7 및 14일째에 두 눈 모두의 적출 후에 안구 조직 및 유체의 말단 샘플을 수집하였다. 안락사 후, 각각의 토끼의 양쪽 눈을 수거하고, u-PA 및 u-PA-HSA 발현 및 활성의 평가를 위해 안구 조직 및 체액(안방수(AH), 유리체액(VH), 망막 및 맥락막)의 수집을 위해 절개하였다. 수집 후, 칭량된 양의 토끼 유리체액, 망막 및 맥락막을 2.8 mm 세라믹 비드를 함유하는 내충격성 마이크로튜브(USA Scientific)에서 균질화시켰다. VH, 망막, 및 맥락막 조직의 경우, 조직 1 mg 당 인산 완충 염수의 일정한 분취량을 각 튜브에 첨가하였다. 망막 및 맥락막 샘플을 9:1(희석 부피: 조직 부피)로 희석하고, VH 샘플을 인산 완충 염수로 4:1(희색 부피: VH 부피)으로 희석하였다. 샘플을 0 내지 10℃에서, 5500 rpm에서 3 x 30초 주기 동안 균질화시키고(Precellys® 균질기), 완전히 균질화될 때까지 주기 사이에 20초 휴지시켰다.
VH에서 변형된 u-PA 및 변형된 u-PA-HSA 폴리펩타이드의 ELISA(nM) 및 활성(nM)에 의해 결정된 농도를 각각 ELISA 및 활성 분석을 이용하여 결정하였다. 농도 결정을 위해, 항-u-PA 샌드위치 ELISA를 다음과 같이 수행하였다: 포획 항체 PA1-36166(Invitrogen)을 ELISA 플레이트 상에 밤새 4℃에서 또는 2시간 동안 실온에서 100 mM 카르보네이트 완충액, pH 9.5 중 1.0 ug/mL의 농도로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBST (트윈을 함유하는 1X PBS)로 3X 세척한 다음, PBS-트윈 중 1% BSA로 밤새 4℃에서 또는 2시간 동안 실온에서 차단하였다. 50 μL의 각각의 샘플을 30분 동안 실온에서 진탕시키면서 인큐베이션한 후, PBS로 3회 세척하고, 검출 항체 PA1-36015(Invitrogen, 0.25ug/mL, 30분)와 함께 인큐베이션하였다. 웰을 다시 세척하고, 후속적으로 실온에서 진탕하면서 30분 동안 1:30,000 희석으로 HRP 접합된 항 염소 항체(Rockland)와 함께 인큐베이션하였다. PBST로 6회 세척한 후, 1-단계 TMB(34028, Thermo)로 검출하고, 2N 황산으로 억제한 후 450 nm에서의 흡광도를 판독함으로써, 결합된 변형된 u-PA 및 변형된 u-PA-HSA 폴리펩타이드를 시각화하였다.
억제된-형광 펩타이드 기질(FRET)의 가수분해를 기초로 한 검정을 사용하여 활성에 의한 VH에서의 변형된 u-PA 및 변형된 u-PA-HSA 폴리펩타이드의 정량화를 따랐고, 공지된 활성 농도의 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 표준 곡선으로 보정하였다. 본 검정은 인간 보체 3(C3)의 절단 서열에 기반한 FRET 펩타이드 기질을 사용한다. 펩타이드의 서열은 RQHAR/ASHL이고, 여기서 "/"는 절단 부위를 나타낸다. 펩타이드의 N-말단 측은 DABCYL 형광단으로 표지되고, C-말단측은 EDANS 형광단으로 표지된다. 펩타이드의 절단은 EDANS/DABCYL FRET 쌍을 분리하여 형광 신호를 생성하고, 이를 다중-웰 형광 플레이트 판독기에서 측정한다.
검정을 하기와 같이 수행하였다: 시험 샘플을 전형적으로 검정 완충액(100 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.01% Tween-80, pH 7.4) 중 1:20의 최소 필요한 희석률로 희석하였다. 희석된 샘플을 96-웰 플레이트에서 80 μM FRET 기질로 1:2로 추가로 희석시켰다. 희석된 시험 샘플과 기질의 조합 즉시, FRET 기질 가수분해 후 형광 신호를 형광 플레이트 판독기에서 매 30초마다 2시간 동안 측정하여 평가하였다. FRET 펩타이드 기질의 효소적 가수분해는 EDANS 형광 생성물을 생성한다. 형광 강도의 생성 속도를 EDANS 표준 곡선에 대해 보간하여 EDANS 생성물 생성 속도를 산출한다. 특이적 활성은 두 가지 방식으로 계산될 수 있다. 먼저, 생성물 생성 속도에 희석 인자를 곱하여 샘플 mL 당 반응 분 당 nmol 생성물의 단위(nmol/분/mL)로 부피 특이적 활성을 산출한다. 부피 특이적 활성은 샘플 중 활성 효소의 총량을 나타낸다. 두번째로, 특이적 활성은 효소 mg 당 반응 분 당 nmol 생성물의 단위로 효소 특이적 활성을 산출하도록 부피 특이적 활성을 샘플 효소 농도로 나눔으로써 계산된다(nmol/분/mg). 미지의 샘플(예를 들어, 생체 내 PK 샘플)의 겉보기 프로테아제 농도를 결정하기 위한 시험을 위해, 샘플의 부피 특이적 활성(nmol/분/mL)을 대조군 변형된 u-PA 또는 변형된 u-PA-HSA 폴리펩타이드의 효소 특이적 활성(nmol/분/mg)으로 나누어 샘플 중 겉보기 프로테아제 농도(mg/ml)를 수득한다.
각각의 눈 및 동물에 대한 데이터는 하기 표에 제공된다. 각 눈에 대해 수득된 농도를 동물마다 평균하였다. 이어서, 각 동물에 대한 약물 농도를 각 시점에 평균하여 동물간 가변성을 보상하였다. 각각의 시점에서의 수단을 계산하고, 하기 표에 나타내었다. 이어서, 생성된 데이터를 하기 분석 방법론에 적용하였다: 먼저, Lee 등에 의해 개발된 반-모수적 부분적 강건한 회귀 접근법(Lee 등(1990) J. Lab Clin. Med . 115:745-748; 및 Lee 등(1997) "The use of robust regression techniques to obtained coagulation factor half-life estimates. XVIth Congress of the International Society for Thrombosis and Hemostasis," Florence, Italy을 참조한다)를 사용하여 반감기를 계산하였다. 이는 구획 모델이다. FDA 제출에 검증되고 사용된 프로그램 데미타스를 사용하여 데이터를 평가하였다. 시간 곡선하 면적(AUC) 및 다른 PK 파라미터의 검정을 위해, 사다리꼴 규칙에 기초한 비-구획 모델을 사용하였다. PK 파라미터를 계산하고, 하기 표에 기재하였다.
Figure pct00025
*진하게 표시된 세포는 검출 한계 밖에 있었고/있거나 이상치 시험(outlier test)에 기초하여 이상치로 간주되거나 배제되었다.
표
Figure pct00026
Figure pct00027
ELISA 및 활성 검정에 기초하여, u-PA의 변형된 프로테아제 도메인(서열번호: 21의 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 함유함)은 대략 2일의 반감기를 갖는다. HSA로의 융합은 단백질의 반감기를 증가시킨다. 활성화된 변형된 u-PA-HSAa는 각각 ELISA 및 활성에 의해 측정된 바와 같이, 2.42일 및 3.27일의 반감기를 가졌다. 반감기는 3.42일의 ELISA-결정된 반감기로 억제 프로토콜에 적용된 u-PA-HSA에 대해 증가되었다. 따라서, HSA에 대한 u-PA의 융합은 생체 내 단백질 반감기를 증가시키고, 융합 단백질은 생체 내 프로테아제 활성을 보유한다.
실시예 16
u-PA 융합 단백질의 클로닝, 발현 및 제조
A. u-PA 융합 폴리펩타이드의 클로닝
u-PA 융합 단백질은 N-말단 또는 C-말단에서 융합 파트너와 함께 생성되었다.
1. 예시적인 융합 단백질
u-PA 융합 단백질의 발현을 위한 몇 가지 대안적인 작제물이 생성되었다(하기 기재됨). 예를 들어, N-말단 융합 단백질이 생성되었다(예를 들어, 도 2A 참조). 작제물은 다음을 함유하였다(N-말단에서 C-말단으로): (1) 분비 신호 (예를 들어, 마우스 Ig 카파 사슬 V-III 영역(IgGκ)(서열번호: 999); (2) 융합 파트너(예를 들면, IgG1 Fc(서열번호: 992)); (3) 링커, 예컨대 AGS(서열번호: 1003); (4) 야생형 u-PA 활성화 서열(서열번호: 997; 서열번호: 1의 아미노산 167-178); 및 (5) 변형된 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 987). N-말단 융합 단백질의 예는 서열번호: 1004에 제시된다.
C-말단 융합 단백질이 또한 생성되었다(예를 들어, 도 3 참조). 일부 예에서, 작제물은 (N-말단에서 C-말단으로) 다음을 함유하였다: (1) 분비 신호 (마우스 Ig 카파 사슬 V-III 영역(IgGκ)(서열번호: 999); 또는 인간 인터류킨-2 (hIL2)(서열번호: 1000)); (2) 야생형 u-PA 활성화 서열(서열번호: 997 또는 998), 퓨린 활성화 서열(서열번호: 995, 996, 또는 1041), 또는 활성화되지 않은 서열; (3) 변형된 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 987 또는 21) 또는 야생형 u-PA 프로테아제 영역(서열번호: 2 또는 5); (4) 링커(서열번호: 1002 또는 1003); 및 (5) 융합 파트너(즉, IgG1 Fc(서열번호: 992); 인간 혈청 알부민 (HSA)(서열번호: 991); 콜라겐 IIm에 결합하는 cFv (C2scFv)(서열번호: 993); 또는 히알루론산 결합 도메인(HABD)(서열번호: 994)). C-말단 융합 단백질의 예는 서열번호: 1006-1010, 1012, 1013, 1016, 및 1040에 제시된다(예를 들어, 도면 3a 및 3b 참조).
u-PA N-말단 영역을 함유하는 C-말단 융합 단백질이 또한 생성되었다. 작제물은 (N-말단에서 C-말단으로) 다음을 함유하였다: (1) 분비 신호 (마우스 Ig 카파 사슬 V-III 영역(IgGκ); 서열번호: 999); (2) 야생형 u-PA N-말단 영역(서열번호: 1 또는 서열번호: 1042의 아미노산 21-178); (3) u-PA의 활성화 서열(서열번호: 997 또는 998) 또는 퓨린 활성화 서열(서열번호: 995, 996, 또는 1041); (4) 키모트립신 넘버링에 의한 C122를 제외하고, 변형된 u-PA 촉매 도메인(서열번호: 987 또는 서열번호: 5, 또는 서열번호: 21); (5) 링커(서열번호: 1002 또는 1003); 및 (6) 융합 파트너(즉, IgG1 Fc(서열번호: 992); 인간 혈청 알부민 (HSA)(서열번호: 991)). C-말단 융합 단백질의 예는 서열번호: 1011, 1014, 1015 및 1036에 제시된다(예를 들어, 도 3c 참조). 또한, u-PA 대신에 퓨린 활성화 서열을 함유하는 서열번호: 1010을 참조한다.
N 말단에서 SUMO 및 C 말단에서 융합 파트너를 함유하는 융합 단백질이 또한 생성되었다. 작제물은 (N-말단에서 C-말단으로) 다음을 함유하였다: (1) 분비 신호 (마우스 Ig 카파 사슬 V-III 영역(IgGκ)(서열번호: 999)); (2) HIS 링커 및 SUMO 서열(서열번호: 990); (3) 변형된 u-PA 촉매 도메인(서열번호: 987); (4) 링커(서열번호: 1002); 및 (5) 융합 파트너(즉, IgG1 Fc(서열번호: 992); 또는 인간 혈청 알부민 (HSA)(서열번호: 991)). C-말단 융합 단백질의 예는 서열번호: 1016 및 1017에 제시된다.
융합 파트너에 융합되지 않은 전장 u-PA 단백질을 대조군으로서 생성하였다(예를 들어, 도 2B 참조). 작제물은 (N-말단에서 C-말단으로) 다음을 함유하였다: (1) 분비 신호 (마우스 Ig 카파 사슬 V-III 영역(IgGκ)(서열번호: 999)); (2) u-PA의 N-말단 도메인(서열번호: 1040; 서열번호: 1의 아미노산 21-166); (3) u-PA 활성화 서열(서열번호: 997); 및 (4) 변형된 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 987). 전장 u-PA 단백질의 예는 서열번호: 1005에 기재되어 있다. 다음은 생성된 작제물의 요약이다:
Figure pct00028
대조군 단백질은 서열번호: 1005에 제시된 서열을 갖는다. 대조군 단백질은 u-PA N-말단(서열번호: 3의 잔기 1 내지 158), 야생형 u-PA 활성화 서열, 및 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 987)을 함유하고, 융합 파트너는 함유하지 않는다. 서열번호: 1004에 제시된 융합 단백질은 N-말단에 융합 파트너(Fc)를 포함한다. 서열번호: 1006-1009에 제시된 융합 단백질은 C-말단에 상이한 융합 파트너를 갖고, 변형된 u-PA 프로테아제 도메인에 대한 N-말단의 활성화 서열이 결여되어 있다. 서열번호: 1010 및 1011에 제시된 융합 단백질은 C-말단에 Fc를 함유하고, 서로 상이하게 활성화된다: 서열번호: 1010에 제시된 융합된 단백질은 퓨린 활성화 서열을 함유하고; 서열번호: 1011에 언급된 융합 단백질은 u-PA의 n-말단 영역 및 야생형 u-PA 활성화 서열을 함유한다. 서열번호: 1012 및 1013에 기재된 융합 단백질은 각각 서열번호: 1006 및 1007에 제시된 융합 단백질과 동일하지만, 변형된 u-PA 프로테아제 도메인 대신에 야생형 u-PA 프로테아제 도메인을 갖는다.
서열번호: 1014-1016에 제시된 융합 단백질은 C-말단에 HSA를 함유하고, 서로 상이하게 활성화된다: 서열번호: 1014에 제시된 융합된 단백질은 퓨린 활성화 서열을 함유하고; 서열번호: 1015에 제시된 바와 같은 융합 단백질은 활성화를 위한 야생형 u-PA 활성화 서열을 함유하며; 서열번호: 1016에 언급된 융합 단백질은 활성화를 위한 퓨린 도메인을 함유한다. 서열번호: 1017 및 1018에 제시된 융합 단백질은 각각 N-말단에서 활성화 도메인으로서 SUMO를 함유하고, C-말단에 HSA 또는 IgG-Fc를 함유한다. 퓨린 활성화 부위를 서열번호: 1010, 1014 및 1016에 제시된 융합 단백질에 첨가하여 단백질이 발현 동안 활성화될 수 있도록 함으로써, 하류 프로세싱 동안 활성화 단계에 대한 요건을 제거하였다.
2. 작제물 생성
(a) u-PA 작제물의 제조
작제물을 합성 올리고뉴클레오티드 및/또는 PCR 생성물로부터 조립하고, 인간 시토메갈로바이러스(CMV) 즉시-초기 프로모터/인핸서의 제어 하에 발현을 위해 pcDNA3.4-TOPO 벡터(Invitrogen; Cat. No. A14697) 내로 클로닝하였다.
(b) SUMO-u-PA 작제물의 제조
SUMO 태그(서열번호: 1017 및 1018에 기재됨)를 함유하는 융합 단백질의 발현을 위해, C122S를 갖는 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA(서열번호: 21에 기재됨)를 코돈 최적화된 pE5 발현 벡터(Thermo Scientific; 서열번호: 488에 기재된 서열)로 클로닝하였다. pE5 플라스미드는 융합 파트너(HSA 또는 Fc ) 및 변형된 u-PA 프로테아제 도메인을 클로닝하기 위한 SUMO 서열에 대한 다중 클로닝 부위 C-말단을 함유한다. 최종 융합 단백질은 (1) 융합 파트너(HSA 또는 FC); (2) C122S를 갖는 변형된 u-PA 프로테아제 도메인(서열번호: 21); (3) N-말단 6xHis 정제 태그를 가짐; 및 (4) SUMO이다.
B. u-PA 융합 폴리펩타이드의 제조
u-PA 융합 단백질의 예상 분자량은 하기에 제시된다:
Figure pct00029
1. u-PA 융합 단백질의 형질전환, 발현, 폴딩 및 리폴딩
서열번호: 1004-1013에 기재된 서열을 갖는 융합 단백질을 상기 실시예 14에 상술된 바와 같이 형질전환시키고 발현시켰다.
2. u-PA-SUMO(소형 유비퀴틴 유사 개질제 ) 융합 단백질의 형질전환, 발현, 폴딩 및 리폴딩
서열번호: 1017 및 1018에 제시된 서열을 갖는 융합 단백질을 하기에 상술된 바와 같이 제조하였다.
대장균(E. coli) 발현을 위한 SUMO-변형된 u-PA 융합 폴리펩타이드의 클로닝
컴피턴트 BL21 골드(Competent BL21 Gold)(DE3) 대장균 세포를 표준 열 충격 방법을 사용하여 Thermo Scientific에 의해 제조된 발현 벡터(서열번호: 988)에서 u-PA 융합 단백질로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 50 μL MQ 물에 재현탁시켜 100 ng/mL 스톡 용액을 수득하였다. 플라스미드 DNA 및 컴피턴트 BL21 골드 DE3 세포를 얼음 상에서 해동시켰다. 0.5 μL DNA를 멸균 미세원심분리 튜브 내의 50 μL 세포에 첨가하고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포/DNA 혼합물을 42℃에서 45초 동안 두어 열 충격을 가하였다. 세포/DNA 혼합물을 즉시 얼음으로 다시 옮기고, 얼음 상에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 450 μl의 미리 가온된 (37℃) SOC 배지를 세포/DNA 혼합물에 첨가하고, 생성된 SOC/세포/DNA 혼합물을 진탕하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. SOC(2-200 μL) 중의 세포를 플레이팅하고, LB-카르베니실린 플레이트 상에 전개시키고, 이를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 박테리아 콜로니를 보유하는 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고, 파라필름으로 밀봉하고, 4℃에서 저장하였다. 개별 형질전환된 콜로니의 글리세롤 스톡을 표준 방법에 의해 제조하고, -70℃에서 저장하였다.
C. 포유동물 세포 배양에서 융합 단백질의 단백질 발현의 평가
expi293 세포 배양 상청액(실시예 14 참조)으로부터의 단백질 농도를 ELISA 및 웨스턴 블랏에 의해 정성적으로 평가하였다. 웨스턴 블랏팅 후 단백질 발현을 1 내지 5 척도로 점수화하였으며, 여기서 1은 최고 발현을 나타내고, 5는 발현이 없음을 나타낸다.
6개의 샘플을 각각의 작제물에 대해 시험하였다. 결과는 하기 표에 제시되어 있다. 결과는 서열번호: 1004, 1007-1009 및 1013에 제시된 융합 단백질의 ELISA 및 웨스턴 블랏팅에 의해 불량하게 발현되었음을 나타낸다. 서열번호: 1005, 1010 및 1011에 제시된 단백질은 정성적 웨스턴 블랏 및 ELISA에 의해 평가 시 가장 높은 발현을 가졌다.
Figure pct00030
R 제곱 = 0.9993; 검출 한계 = 0.109 ng/mL; 정량화 한계 = 1.375 ng/ml
Figure pct00031
D. 융합 단백질 활성화 전략
다양한 전략이 u-PA 활성화를 위해 사용되었다. 서열번호: 1004 내지 1005, 1011 및 1015에 제시된 단백질은 상기 실시예 14에 상술된 바와 같이 플라스민에 의해 활성화되었다. 서열번호: 1010, 1014 및 1016에 제시된 단백질은 발현 동안 세포내 퓨린에 의해 활성화될 것으로 예상되었다. 서열번호: 1006-1008에 제시된 단백질은 발현 동안 자가-활성화되는 것으로 예상되었다. 서열번호: 1017 및 1018에 기재된 단백질을 SUMO 프로테아제 처리에 의해 활성화시켰다. SUMO-u-PA 작제물을 활성화시키기 위해, 전형적으로 단백질 1 mg 당 10 단위의 SUMO 프로테아제를 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. HisTrap 니켈 킬레이트화 컬럼 상에서의 추가 정제는 His-태그된 SUMO 모이어티를 효과적으로 제거할 것이다.
Figure pct00032
E. 효소 활성의 측정
40 μM 인간 C3 FRET 펩타이드 상의 u-PA 융합 단백질을 함유하는 expi293 HEK 상청액의 부피 특이적 활성을 실시예 15에 기재된 바와 같이 평가하였다. 보간되고, 희석-조정된 초기 속도(nM EDANS/분/μL 샘플)를 계산하였다. 서열번호: 1004, 1005, 1008 및 1011-1013에 제시된 융합 단백질은 활성을 나타내지 않았다. 서열번호: 1006, 1007, 1009 및 1010에 제시된 융합 단백질은 u-PA 프로테아제 활성을 나타내었다. C-말단에서 Ig FC 융합을 갖는 u-PA에 대해 N-말단의 퓨린 활성화 서열을 갖는 변형된 u-PA(서열번호: 1010에 제시됨)가 가장 높은 활성을 나타내었다. 결과는 하기 표에 제시되어 있다.
Figure pct00033
F. 친화성 정제
서열번호: 1010 및 1011에 제시된 융합 단백질은 웨스턴 블랏팅 및 ELISA에 의해 평가 시 가장 큰 발현을 가졌다. 각각 서열번호: 1010 및 1011에 기재된 퓨린-변이체 u-PA-Fc 및 전장 uPA-Fc 융합 단백질은 제조자의 권장 조건(GE Healthcare)을 사용하여 정제된 단백질 A 친화도였다.
G. 고발현 융합 단백질의 정제 및 활성 평가
친화성 정제 후, 단백질 농도를 280 nm에서의 흡광도 및 u-PA ELISA(실시예 15 참조)에 의해 평가한 반면, 순도를 실시예 14에 상기 기재된 바와 같이 SDS-PAGE 겔 전기영동 및 분석적 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 평가하였다. 양쪽 융합 단백질을 발현시켰다. 순도는, 겔 전기영동 및 염색, 및 분석적 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 평가될 때, 서열이 서열번호: 1010에 기재된 융합 단백질(u-PA 퓨린 w/o Cys)에 대해 불량한 것으로 간주되었다. 겔 전기영동에 의한 순도는 서열번호: 1011(전장 WT uPA w/Cys)에 제시된 융합 단백질에 대해 양호한 것으로 간주되었다. 결과는 하기 표에 제시된다:
Figure pct00034
친화성 정제 후 u-PA 효소 활성을 상기 실시예 15에 기재된 바와 같이 인간 C3 FRET 펩타이드 검정 상에서 평가하였다. 결과는 하기 표에 제시된다:
Figure pct00035
친화성 정제 후 u-PA 효소 활성을 실시예 15에서 상기 기재된 바와 같이 인간 C3 FRET 펩타이드 검정 상에서 평가하였다. 플라스민 활성화 후 효소 활성을 실시예 14에 기재된 바와 같이 평가하였다. 결과는 하기 표에 제시된다:
Figure pct00036
H. C3을 절단하는 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 갖는 융합 단백질의 설명
u-PA 폴리펩타이드를 갖는 융합 단백질은 하기에 기재되어 있다. 예시적인 서열은 하기 논의에서 제공된다.
1. 촉매 도메인
촉매 도메인(프로테아제 도메인)은 본원에 제공된 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 임의의 프로테아제 도메인일 수 있고 (본원 및 실시예에 기재된 바와 같은 다양한 변형을 함유하는 프로테아제 도메인에 대한 ED50을 제공하는 실시예 2, 표 14 참조), 특히 실시예 2에 기재된 바와 같이 100 nM 미만, 또는 50 nM, 30 nM, 또는 10 nM 미만의 ED50를 갖는 임의의 것일 수 있다. 변형된 uPA 프로테아제 도메인의 예는 서열번호: 21에 제시된 것이며, 단, 이를 활성화시켜 2개의 사슬 폴리펩타이드를 생산할 때, 잔기 122(키모트립신 넘버링에 의함)는 서열번호: 21에서와 같이 S가 아닌 C이다. 변형된 uPA 폴리펩타이드 프로테아제 도메인은:
Figure pct00037
C122S 돌연변이를 함유하는 서열번호: 21 변형된 uPA 폴리펩타이드 프로테아제 도메인:
Figure pct00038
은 하기에 비해 아미노산 치환을 함유한다: 천연 uPA 폴리펩타이드 프로테아제 도메인 서열번호: 2:
Figure pct00039
또는 서열번호: 5에 제시된 바와 같이 (키모트립신 넘버링에 의해) 잔기 122에서의 C가 S인 프로테아제 도메인:
Figure pct00040
본원에 나타낸 바와 같이, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 천연 u-PA와 비교하여 변경된 단백질분해 활성 및 생화학적 특성을 나타낸다. u-PA 폴리펩타이드는 본원에 기재된 바와 같이 C3을 절단하기 위한 증가된 활성을 갖고, 그의 천연 기질을 절단하기 위해 감소된 활성을 갖도록 변형된다.
2. 분비 신호
단백질 발현 동안 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 세포외 분비를 보장하기 위해, 발현시 인코딩된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 분비 신호가 작제물에 포함될 수 있다. 많은 이러한 신호는 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 천연 u-PA 신호, 및 다른 것들, 예컨대 mKLC 분비 신호(서열번호: 999(METDTLLLWVLLLWVPGSTG)) 서열 또는 인간 IL2 분비 신호(서열번호: 1000(MYRMQLLSCI ALSLALVTNS)), 및 본원에 예시된 다른 것들을 포함한다. 신호 서열은 일반적으로 분비를 지시하기 위해 폴리펩타이드의 N-말단 상에서 발생하고; 이들은 숙주 세포에 의해 제거된다.
3. 융합 파트너
아미노산 치환, 삽입 또는 결실 이외에, 추가의 변형이 uPA 폴리펩타이드에 첨가되어 융합 또는 키메라 단백질을 생성할 수 있다. 다수의 융합 파트너 및 이들의 특성은 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 예를 들어, 다량체화될 수 있는 융합 파트너, 혈청 반감기를 증가시킬 수 있는 것들, 및 결합 특성을 변경시키거나 폴리펩타이드를 표적화하는 것들을 포함한다. 예를 들어, 변형된 및 천연 uPA 폴리펩타이드는 항체 단편 또는 다량체화 도메인, 예컨대 면역글로불린 폴리펩타이드 IgG1(서열번호: 992(DKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI STRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKAL파이E KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPG)) 또는 콜라겐 II scFv(서열번호: 983(QVQLQQQPGADL VRPGVSVKLSCKASGYTFTS YWMNWVKQRP GQGLEWIGMI HPSDSETRLS QKFKDKATLT VDKSSSTAYMQLSSPTSEDS AVYYCARLKP GGTKFAYWGQ GTLVTVSAGG GGSGGGGGSGGGSGSGGSDIVLTQSPASLTVS LGQRATISCR ASKSVDSYGN SFMEWYQQKP GQPPKLLIYR ASNLESGIPARFSGSGSRTD FTTLTINPVEA DDVATYYCQQSNEDPYTFGG GTKLEIK))의 Fc 영역에 연결되어 u-PA 폴리펩타이드의 약리학적 특성을 변경시킬 수 있다.
약리학적 특성을 변경하기 위해, uPA 폴리펩타이드는 하기에 융합될 수 있다: 예를 들어, 리간드 또는 폴리펩타이드, 예컨대 항체, 또는 다른 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민(HSA; 서열번호: 991): DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL), 또는 하이알루론산 결합 도메인(HABD), 예컨대 TSG-6(서열번호: 994) ERAAGVYHREA RSGKYKLTYAEAKAVCEFEG GHLATYKQLE AARKIGFHVC AAGWMAKGRV GYPIVKPGPN CGFGKTGIIDYGIRLNRSER WDAYCYNPHA KE.
전형적으로, u-PA 프로테아제 활성은 생성된 융합 단백질 내에서 기능적으로 활성인 채로 남아있지만, 융합 펩타이드는 u-PA 폴리펩타이드의 약동학적 및 약력학적 파라미터를 변화시킬 수 있다. u-PA 변형된 폴리펩타이드를 함유하는 다른 융합 단백질은 성장 인자 또는 수용체와 함께 생성되어 약동학적 및 약력학적 특성을 변경시킬 수 있었다.
4. 활성화 서열
u-PA 폴리펩타이드는 불활성 형태(자이모겐)로 생산될 수 있고, 단백질분해 절단을 통해 번역후 변형되어 성숙 및 활성화된 형태를 생성할 수 있다. 이를 위해, 활성화 서열이 천연 또는 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 포함되어 이의 효소 활성을 억제한다. 단백질 발현 후, 활성화 서열의 절단은 성숙 u-PA 단백질을 생성한다. 활성화 서열의 예는 야생형 u-PA 활성화 서열(서열번호: 997(QCGQKTLRPRFK) 또는 서열번호: 998(QSGQKTLRPRFK)) 또는 퓨린 절단 서열(서열번호: 995, 996, 1041, 또는 1044(예컨대 QCGQKTLRRRKR, 또는 QSGQKTLRRRKR, 또는 QSG KTLRRKR, 또는 QSGQKTLRRKR)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 디설파이드 연결은 활성화 서열 내의 시스테인과 u-PA 촉매 도메인 내의 시스테인(키모트립신 넘버링에 의한 C122) 사이에 유지될 수 있다. 활성화 부위의 절단시, 활성화된 분자는 N-말단 단편 활성화 또는 완전한 N-말단 도메인 사이에 공유 결합을 보유한다.
5. 링커
u-PA 폴리펩타이드를 다른 폴리펩타이드 서열과 연결하기 위해, 아미노산의 짧은 가요성 서열(링커)이 사용된다. 링커의 예는 GGSSGG 또는 GGGGS 또는 AGS(예컨대 서열번호: 1001-1003 및 1024-1030에 제시된 것)뿐만 아니라 상세한 설명에서 논의된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 반복한 이들 서열의 연쇄를 갖는 보다 긴 연결은 또한 링커가 서열(GGSSGG)n +1(여기서, n은 0 또는 1 내지 20의 정수임)을 갖도록 포함된다. 다른 링커는 서열 목록 및 상세한 설명에 기재되어 있다.
6. u-PA의 다른 변형
다른 펩타이드 서열, 예를 들어 6x His SUMO(예를 들어, 서열번호: 990 및 1031-1033(DGHHHHHHGS LQDSEVNQEA KPEVKPEVKP ETHINLKVSD GSSEIFFKIK KTTPLRRLME AFAKRQGKEM DSL(T/R) FLYDGI (E/R) IQADQ (T/A)PED LDMEDNDIIE AHREQIGG)에 기재된 것)를 첨가하여 u-PA 폴리펩타이드의 발현, 분비 또는 정제를 용이하게 할 수 있다. 변경된 또는 천연 u-PA 폴리펩타이드에 대한 추가의 화학적 및 번역후 변형은 중합체에 대한 컨쥬게이션, 예컨대, 페길화, 파실화, 및 시알릴화를 포함하여 u-PA 폴리펩타이드의 약력학적 특성을 변경할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
7. N-말단 융합체를 갖는 예시적인 변형된 u-PA 폴리펩타이드
Figure pct00041
* 서열번호: 21의 u-PA 프로테아제 도메인(C122S 치환을 갖거나 갖지 않음)
도 2는 N-말단 융합체를 갖는 u-PA 폴리펩타이드, 예컨데 서열번호 1004 및 1005에 제시된 N-말단 융햐ㅂ 폴리펩타이드의 개략도를 제시한다.
8. C-말단 융합체를 갖는 예시적인 변형된 u-PA 폴리펩타이드
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
도 3은 C-말단 융합체를 갖는 u-PA 폴리펩타이드, 예컨대 서열번호: 1006-1018 및 1036에 제시된 C- 말단 융합 폴리펩타이드의 개략도를 제시한다.
I. u-PA 양 및 보체 경로 활성을 평가하기 위한 검정
u-PA 폴리펩타이드 융합체는 Expi293TM 세포에서 포유동물 발현 시스템에서 변경된 천연 u-PA 폴리펩타이드의 융합체를 인코딩하는 pcDNA3_4 벡터의 형질감염 후에 생성되었다. Expi293TM 세포에서 정확하게 발현된 u-PA 폴리펩타이드를 HiTrap Protein A HP 또는 CaptureSelectTM Human Albumin Affinity Matrix 상에서 정제하고, uPA 역가를 조사하기 위해 u-PA ELISA와 같은 생물분석 검정을 위해 또는 u-PA 폴리펩타이드 촉매 활성을 시험하기 위해 C3 FRET 단백질분해 절단 검정으로 처리하였다. 결과는 하기 표에 제시된다:
Figure pct00051
1.u-PA ELISA 수준
효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 u-PA 폴리펩타이드의 존재를 측정한다(예를 들어, 실시예 15 참조). 전형적으로, u-PA의 측정은 포획 항체(PA1-36166, 1.0 ug/mL, Invitrogen)에 대한 u-PA의 결합의 간접적인 척도이다. 이어서, 포획된 u-PA 폴리펩타이드를 HRP 접합된 항 염소 항체(Rockland, 605-403-B69)에 의해 인식되는 검출 항체(0.25 ug/mL에서 PA1-36015)로 검출한다. HRP 효소는 TMB 기질의 첨가시 비색 반응을 유발한다. u-PA ELISA 방법을 사용하여, 4개의 u-PA 폴리펩타이드가 높은 uPA 역가 수준(서열번호: 1005, 1010, 1011, 1012, 1015)에서 발현하는 것으로 확인되었고, 중간 역가에서 2개의 u-PA 폴리펩타이드(서열번호: 1006 및 1013)가 발현되었고, 서열번호: 1004, 1007-1009에 제시된 u-PA 폴리펩타이드는 발현되지 않았다.
2. 효소 활성(인간 C3 FRET 펩타이드).
Genscript에 의해 생산된 인간 C3 FRET 펩타이드 RHQARASHL EDANS/DABCYL(로트 #94045990005/ PE6379)을 사용하여 시험관 내에서 인간 C3 상의 uPA 폴리펩타이드의 단백질분해 활성을 측정하였다(예를 들어, 실시예 15 참조). 펩타이드의 N-말단 측은 DABCYL 형광단으로 표지되고, C-말단 측면은 EDANS 형광단로 표지된다. 펩타이드의 절단은 EDANS/DABCYL FRET 쌍을 분리하여 형광 신호를 생성하고, 이를 다중-웰 플레이트 판독기에서 측정한다. 형광 강도의 생성 속도를 EDANS 표준 곡선에 대해 보간하여 EDANS 생성물 생성 속도를 산출한다. 생성물 생성 속도에 희석 인자를 곱하여 샘플 mL 당 반응 분 당 nmol 생성물의 단위(nmol/분/mL)로 부피 특이적 활성을 산출하였다. 부피 특이적 활성은 샘플 중 활성 효소의 총량을 나타낸다. 제2 특이적 활성은 부피 특이적 활성을 샘플 효소 농도로 나누어 효소 특이적 활성을 효소 mg 당 반응 분 당 nmol 생성물의 단위로 산출함으로써 계산된다(nmol/분/mg). 효소 특이적 활성은 농도에 관계없이 샘플 내의 uPA 폴리펩타이드의 고유 활성을 나타낸다. 인간 C3 FRET 활성 분석을 이용하여, 서열번호: 1010에 제시된 uPA 폴리펩타이드는 활성인 것으로 나타났다.
* * *
변형이 당업자에게 명백할 것이기 때문에, 본 발명은 첨부된 청구범위의 범주에 의해서만 제한되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Madison, Edwin L. Thanos, Christopher D. Soros, Vanessa Popkov, Mikhail Tipton, Kimberly Traylor, Matthew John Furfine, Eric Steven Way, Jeffrey Charles <120> MODIFIED UROKINASE-TYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE <130> 33328.04940.WO01/4940 <150> 62/786,302 <151> 2018-12-28 <160> 1044 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UROKINASE-TYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR (u-PA) pro-peptide <400> 1 Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser 1 5 10 15 Asp Ser Lys Gly Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp 20 25 30 Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile 35 40 45 His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile 50 55 60 Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly 65 70 75 80 Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser 85 90 95 Ala Thr Val Leu Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu 100 105 110 Gln Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg 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Leu Lys Met Thr Val 325 330 335 Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly 340 345 350 Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys 355 360 365 Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu 370 375 380 Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys 385 390 395 400 Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu 405 410 415 Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu 420 425 430 <210> 2 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UROKINASE-TYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR (u-PA) protease domain <400> 2 Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe 35 40 45 Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser 50 55 60 Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn 65 70 75 80 Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn 85 90 95 Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln 100 105 110 Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp 115 120 125 Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn 130 135 140 Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys 145 150 155 160 Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu 165 170 175 Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp 180 185 190 Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly 195 200 205 Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu 210 215 220 Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp 225 230 235 240 Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu 245 250 <210> 3 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UROKINASE-TYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR (u-PA) mature <400> 3 Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu 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His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys 35 40 45 Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys 50 55 60 Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile 65 70 75 80 Arg Ile Gln Ala Asp Gln Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn 85 90 95 Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Ile Ile Gly Gly 100 105 110 Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Gln 115 120 125 Arg Tyr Glu Gly Gly Ser Glu Tyr Tyr Arg Cys Gly Gly Ser Leu Ile 130 135 140 Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Pro Gln Pro 145 150 155 160 Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser 165 170 175 Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu Ile Leu His 180 185 190 Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Ile Ala Ala Gln His Asn Asp Ile Ala Leu 195 200 205 Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro Ser Arg Thr 210 215 220 Ile Gln Thr Ile Ser Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Gly 225 230 235 240 Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr Asp Arg 245 250 255 Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile Ser His 260 265 270 Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys 275 280 285 Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gln Gly 290 295 300 Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met Thr Leu 305 310 315 320 Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro 325 330 335 Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg Ser His 340 345 350 Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu Gly Gly Ser Cys Lys 355 360 365 <210> 1040 <211> 875 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgGkSP-furin activation-uPA R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L 97bA/H99Q/C122S/Y149R-linker-HSA <400> 1040 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Gln Ser Gly Gln Lys Thr Leu Arg Arg Lys Arg Ile 20 25 30 Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala 35 40 45 Ile Tyr Gln Arg Tyr Glu Gly Gly Ser Glu Tyr Tyr Arg Cys Gly Gly 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile 65 70 75 80 Pro Gln Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg 85 90 95 Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu 100 105 110 Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Ile Ala Ala Gln His Asn Asp 115 120 125 Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro 130 135 140 Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Ser Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro 145 150 155 160 Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser 165 170 175 Thr Asp Arg Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu 180 185 190 Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val 195 200 205 Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser 210 215 220 Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg 225 230 235 240 Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys 245 250 255 Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile 260 265 270 Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu Gly Gly Ser Ser 275 280 285 Gly Gly Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu 290 295 300 Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr 305 310 315 320 Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val 325 330 335 Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys 340 345 350 Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala 355 360 365 Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln 370 375 380 Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro 385 390 395 400 Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala 405 410 415 Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile 420 425 430 Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala 435 440 445 Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys 450 455 460 Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys 465 470 475 480 Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe 485 490 495 Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg 500 505 510 Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu 515 520 525 Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala 530 535 540 Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser 545 550 555 560 Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys 565 570 575 Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu 580 585 590 Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn 595 600 605 Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr 610 615 620 Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala 625 630 635 640 Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro 645 650 655 His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu 660 665 670 Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu 675 680 685 Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys 690 695 700 Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu 705 710 715 720 Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met 725 730 735 Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val 740 745 750 Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr 755 760 765 Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp 770 775 780 Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His 785 790 795 800 Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln 805 810 815 Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu 820 825 830 Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys 835 840 845 Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys 850 855 860 Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 865 870 875 <210> 1041 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin activation sequence <400> 1041 Gln Ser Gly Lys Thr Leu Arg Arg Lys Arg 1 5 10 <210> 1042 <211> 146 <212> PRT <213> uPA N-terminus <400> 1042 Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn Gly 1 5 10 15 Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His Trp Cys Asn 20 25 30 Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile Asp Lys Ser Lys 35 40 45 Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr 50 55 60 Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr Val Leu 65 70 75 80 Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gln Leu Gly Leu 85 90 95 Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp 100 105 110 Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln Glu Cys Met Val 115 120 125 His Asp Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro Pro Glu Glu Leu 130 135 140 Lys Phe 145 <210> 1043 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chain A, IG GAMMA-1 CHAIN C REGION <400> 1043 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Asp Val Glu Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 20 25 30 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 35 40 45 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 50 55 60 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 65 70 75 80 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 85 90 95 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 100 105 110 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 115 120 125 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 130 135 140 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 145 150 155 160 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 165 170 175 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 180 185 190 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 195 200 205 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 210 215 220 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 225 230 235 240 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 250 255 <210> 1044 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin <400> 1044 Gln Ser Gly Gln Lys Thr Leu Arg Arg Lys Arg 1 5 10

Claims (244)

  1. 변형된 유로키나제 유형 플라스미노겐 활성제(u-PA) 폴리펩타이드로서, R35Q, H37Y, V41R, V41L, Y40Q, D60aP, L97bA, T97aI 및 H99Q에 상응하는 치환, 및 그에 대한 보존적 아미노산 변형 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하되, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 u-PA 폴리펩타이드의 비변형된 활성 형태에 비하여 보체 단백질에 대한 증가된 활성/특이성을 가지며,
    아미노산 변형은 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 1차 서열에서 치환, 삽입 및 결실 중에서 선택되고;
    변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질을 절단함으로써, 아미노산 변형을 함유하지 않는 비변형된 u-PA 폴리펩타이드에 비하여 보체 활성화를 억제하거나 감소시키고;
    잔기는 키모트립신 넘버링에 의해 넘버링되고;
    비변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 1-6 중 임의의 것에 제시된 서열을 포함하되, 이는 야생형(WT) 전장 u-PA, WT 프로테아제 도메인 u-PA, WT 성숙 u-PA, 키모트립신 넘버링에 의해 C122S를 갖는 전장 u-PA, C122S를 갖는 프로테아제 도메인 u-PA, C122S를 갖는 성숙 u-PA, 또는 아미노산 치환(들)을 포함하는 그의 촉매 활성 단편을 제시하고; 그리고
    보존적 변형은 R35Y, W, F 또는 N; H37R, Q, E, W 또는 F; V41K; D60aS; T97aD, L 또는 V; L97bG 또는 S, 및 H99N 중에서 선택되는, 변형된 유로키나제 유형 플라스미노겐 활성제(u-PA) 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, R35Q, H37Y, V41R, V41L, Y40Q, D60aP, L97bA, T97aI, 및 H99Q에 상응하는 치환 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 플라스미노겐에서 기질 서열의 절단에 대한 감소된 활성 또는 특이성을 갖는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 단백질은 C3인, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호:5의 프로테아제 도메인을 포함하는 비변형된 u-PA 폴리펩타이드, 또는 서열번호: 1-4 및 6 중 임의의 것에 제시된 u-PA의 상응하는 형태보다 적어도 3-배 더 크게 증가된 C3의 절단에 대한 활성을 갖는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 1-6 중 임의의 것에 제시된 아미노산의 서열로 이루어지는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 2 또는 서열번호:5에 제시된 아미노산의 서열로 이루어지는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제5 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 1-6 중 임의의 것의 폴리펩타이드(WT 전장 u-PA, WT 프로테아제 도메인 u-PA, WT 성숙 u-PA, C122S를 갖는 전장 u-PA, C122S를 갖는 프로테아제 도메인 u-PA, C122S를 갖는 성숙 u-PA) 또는 그의 촉매 활성 단편과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제5 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 1-6 중 임의의 것의 비변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 그의 촉매 활성 부분에 비하여 1 또는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 치환 V41R을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 치환 V41L을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 치환 V38E를 추가로 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 치환 H37Y을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 치환 H37Y/V38E을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 치환 R35Y/H37K 또는 R35Q/H37K을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 치환 R35Y/H37K/V38E 또는 R35Q/H37K/V38E을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 치환 L97bA을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, R35Q을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, H99Q을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, D60aP을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  21. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, T97aI을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, T39Y, T39W, T39F에 상응하는 아미노산 치환 또는 T39M 또는 T39L로부터 선택된 보존적 치환을 추가로 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환 T39Y을 추가로 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환 R35Q/H37Y 또는 V38E/V41R/Y149R 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aT/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R을 추가로 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 시험관내 검정에서 100 nM, 또는 50 nM 또는 30 nM 또는 25 nM 미만의 C3의 불활성화 절단에 대한 ED50를 갖는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  26. 제25항에 있어서,
    폴리펩타이드는 표 14에 제시된 프로테아제 도메인을 포함하고; 그리고
    100 nM 이하의 ED50를 가지며, 50 nM 이하의 ED50를 갖거나, 또는 30 nM 미만의 ED50를 갖거나, 또는 25 nM 미만의 ED50를 갖는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 검정은 ED50을 결정하기 위해 37℃에서 1시간 동안 다양한 농도의 각각의 변형된 프로테아제와 함께 기질 보체 단백질 인간 C3를 인큐베이션하는 것을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 50 nM 이하의 ED50로 C3을 절단하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  29. 제28에 있어서, 변형 V41R을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  30. 제28항에 있어서, 변형 V38E/V41R을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  31. 제29항에 있어서, 위치 R35, H37 및 V38 중 하나 이상에서 치환을 추가로 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  32. 제31항에 있어서, V38에서의 치환은 E인, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, R35Y/H37S/V38E/V41R을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택된 변형을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드:
    R35Y/H37S/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L;
    R35W/R36Q/H37S/V38P/T39Y/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L;
    F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/K82R/T97aI/L97bA/H99Q/K110aR/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/K179R;
    F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/K92R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35V/R36H/H37G/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bW/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149E/M157K;
    F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/K92S/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/K61R/K62R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/K179S;
    R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bL/T97aI/L97bA/H99Q/C122S;
    F30Y/R35W/R36T/H37S/V38S/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157R/Q192Y;
    F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K;
    F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/K61S/K62S/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    R35A/H37E/R37aG/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L;
    R35W/R36Q/H37S/V38T/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151P/M157R;
    F30Y/R35W/H37Y/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    V38E/T39W/V41R/D60aW/Y60bP/L97bG/H99L/C122S;
    R35W/R36K/H37S/V38E/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157S/Q192H;
    R35Q/H37Y/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aQ/Y60bP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    I17V/F30Y/R35Q/R36H/H37W/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T158A;
    R35Y/H37S/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192H;
    F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    R35W/R36N/H37S/V38E/T39Y/Y40M/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157S;
    R35Y/H37D/V38E/T39W/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/K82S/T97aI/L97bA/H99Q/K110aS/C122S/Y149R/M157K;
    R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bL/D97T/T97aE/L97bG/A98S/H99L/C122S;
    F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/Y149R/M157K;
    R35Y/H37S/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S;
    F30Y/R35W/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35W/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/M157K;
    R35H/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/T158A;
    R35Q/R36H/H37Y/V38E/T39Y/Y40L/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    R35W/H37P/R37aG/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    V38D/V41Q/D60aH/Y60bS/T97aW/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/R217E/K224R;
    F30Y/R35W/R36H/H37P/R37aQ/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35W/R36Q/H37S/V38P/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157R;
    F30H/R35W/R36T/H37S/V38P/T39Y/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157S;
    F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K;
    F30Y/R35Y/R36H/H37N/V38E/T39F/Y40F/V41R/K61E/R72H/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q169K;
    R35W/R36Q/H37S/V38S/T39Y/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157S/Q192H;
    R35W/H37G/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192T;
    R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bL/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35W/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S;
    F30Y/R35V/R36H/H37G/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35W/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/M157K;
    F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S;
    F30Y/R35W/R36S/H37S/V38Q/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157S/Q192N;
    F30Y/R35W/R36H/H37P/R37aD/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aE/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    R35Q/H37Y/R37aS/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    R37aS/V38E/Y40V/V41R/H99L/C122S/Y151L/R217V;
    V38D/V41R/L97bG/H99Q/C122S/Y151L/R217E;
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S;
    F30Y/R35V/R36H/H37D/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    I17V/F30Y/R35Q/R36H/H37W/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K;
    F30Y/R35V/R36H/H37S/V38E/T39F/Y40H/V41R/Y60bS/T97aM/L97bA/H99Q/C122S/Y149W/M157K;
    R35Y/H37S/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    N26D/F30Y/R35Y/R36H/H37E/V38E/T39F/Y40F/V41R/K61E/T97aI/L97bA/H99Q/R110dS/P114S/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35W/R36H/H37P/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bA/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    R35L/H37D/R37aN/V38E/T39Y/V41R/D60aP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35W/R36H/H37P/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K;
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    R35H/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/T158S/E167K;
    R35Q/H37Y/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35Y/R36H/H37D/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35Y/R36H/H37E/V38E/T39F/Y40F/V41R/K61E/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/T242A;
    F30Y/R35L/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T158A;
    F30Y/R35Y/R36H/H37P/R37aQ/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bH/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    V38D/V41R/L97bR/H99E/C122S/Y151L/R217E;
    H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/R217E/K224R;
    R35Y/H37V/R37aW/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192T;
    F30Y/R35M/R36H/H37G/V38E/T39F/Y40H/V41R/Y60bP/T97aF/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35W/R36Q/H37S/V38T/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157K/Q192T;
    R35W/H37D/R37aP/V38E/T39W/V41R/D60aR/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    I17V/F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K;
    I17V/F30Y/R35Q/H37W/V38D/Y40H/V41R/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149H/M157K/T158A;
    R35H/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/I138V/E167K;
    F30Y/R35W/R36Q/H37S/V38E/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157T/Q192H;
    R35H/G37bD/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/T158S;
    R35H/H37P/R37aG/V38E/T39F/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    V38D/T39Y/Y40L/V41R/L97bI/H99E/C122S/R217E;
    F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T158A;
    F30H/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40M/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    R35V/R36H/H37D/V38E/T39W/Y40M/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    R35W/R36K/H37S/V38A/T39Y/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157R/Q192T;
    F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/N145S/S146V/T147M/D148G/Y149Q/L150F/M157K;
    F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/Y149R/M157K;
    F30Y/R35I/R36H/H37D/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    R35V/V38E/Y40Q/V41L/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    R35Q/H37Y/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aN/Y60bN/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    V38E/Y40Q/V41L/L97bG/H99Q/C122S/R217T;
    R35H/V38E/T39Y/V41R/T56S/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/T158S;
    F30H/R35Q/H37W/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K;
    R35Q/H37Y/V38E/T39Y/V41R/D60aP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41K/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192A;
    V38D/V41R/Y60bR/T97aW/L97bR/H99E/C122S/E175D/R217E/K224R;
    F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/Y40H/Y60bN/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    V38D/V41L/Y60bP/T97aM/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/R217E/K224R;
    F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39F/Y40H/V41R/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35W/R36H/H37N/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K;
    F30Y/R35W/R36K/H37S/V38D/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157R/Q192T;
    V41R/H99Q/C122S/Y151L/R217V;
    V38E/Y40P/V41L/L97bG/H99L/C122S/Y151Q/R217E;
    V38E/Y40L/V41R/H99L/C122S/Y151L/R217S;
    V38E/Y40Q/V41L/L97bG/H99Q/C122S/Y151P/R217T;
    V38E/T39Y/V41R/D60aW/Y60bP/L97bR/H99I/C122S;
    R35W/H37D/R37aP/V38E/T39W/V41R/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R36H/H37F/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bD/T97aV/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K;
    F30Y/R35W/R36H/H37E/S37dP/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K;
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aA/Y60bP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    R36H/V38D/V41R/A96D/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/T178S/R217D;
    V38D/V41R/L97bG/H99Q/C122S/Y151L/R217A;
    F30H/R35Q/R36H/H37Y/V38E/T39Y/Y40L/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35W/R36K/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/K61E/I65T/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K;
    F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bS/T97aL/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K;
    F30Y/R35Q/R36H/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aS/Y60bP/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aG/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    I24N/F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40L/V41R/Y60bQ/N87D/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K;
    V38E/Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S;
    F30Y/R35Q/H37W/V38D/Y40H/V41R/Y60bN/L97bA/H99Q/C122S/Y149H/M157K/T158A;
    F30Y/R35W/R36A/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/K61D/I65R/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K;
    F30Y/R35Q/R36H/H37W/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K;
    F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/K187R/K223R/K224R;
    R35W/R36Q/H37S/V38E/T39Y/Y40L/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151L/M157S/Q192T;
    R35H/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/P60cS/L97bA/H99Q/C122S/I138V/E167K;
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    I17V/F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K;
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    R35H/V38E/T39Y/V41R/T56A/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S;
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    I24T/F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K;
    F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    I17V/F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T158A;
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    F30H/R35L/H37D/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K/R217E;
    F30Y/R35W/R36H/H37D/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aE/Y60bF/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35L/R36H/H37G/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bP/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149M/M157K;
    I17V/F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K;
    F30Y/R35V/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40H/V41R/Y60bN/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    R35W/R36H/H37N/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/Q192H;
    R35V/Y40Q/V41L/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35M/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    R35Q/V38D/V41R/L97bG/H99Q/C122S/Y151L;
    R37aS/V38E/Y40P/V41L/L97bG/H99Q/C122S/Y151Q/R217T;
    R35V/R37aE/V38E/Y40Q/V41L/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30H/V38D/V41R/A96G/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K;
    T39L/Y40L/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S;
    F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K
    Y40Q/V41L/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S;
    F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/S146F/M157K/Q192H/K243Q
    Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35W/R36Q/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/K61L/I65V/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K;
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    R35Q/V38D/V41R/T97aS/L97bA/H99Q/C122S/Y151L;
    V41R/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/R217V;
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35V/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bP/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149E/M157K;
    R35A/H37T/R37aD/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192S;
    R35S/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L;
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    F30Y/R35H/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T158S;
    R35Q/H37S/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
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    H37G/R37aD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E;
    R35W/H37D/R37aS/V38E/T39Y/V41R/D60aE/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    R35Q/H37G/R37aD/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    R35Q/H37D/R37aK/V38E/T39F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    R35Y/R36H/H37S/V38D/T39Y/V41R/Y60bN/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/K61E/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K;
    R37aS/V38D/V41Q/L97bG/H99Q/C122S/Y151L/R217T;
    F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K;
    F30Y/R35K/R36H/H37E/R37aK/V38E/T39F/Y40F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aP/Y60bG/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35W/R36Q/H37E/V38A/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/K61D/I65V/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K;
    F30Y/R35H/V38D/Y40H/V41R/T56A/L97bA/H99Q/C122S/M157K;
    R35N/H37T/R37aY/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    R37aH/V38E/T39Y/V41R/T56A/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/T158A;
    F30H/R35Q/H37T/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K;
    F30H/R36L/V38E/V41R/K82R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K;
    V38D/V41R/H99Q/C122S/Y151L/R217V;
    R35Q/H37G/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35Q/R36H/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aE/Y60bA/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    R35Q/H37Y/R37aD/V38E/T39L/V41R/D60aE/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35L/R36H/H37E/V38E/T39N/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    R36S/V38E/Y40L/V41N/L97bG/H99Q/C122S/Y151L/R217T;
    T39W/V41R/L97bG/H99Q/C122S;
    F30Y/R35W/R36H/H37E/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K;
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    R35S/R37aA/V38E/Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S/Y149V;
    F30Y/R35W/R36H/H37Q/V38E/T39H/Y40H/V41R/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K;
    F30Y/R35Q/R36H/H37Y/R37aD/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bV/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/Y151L/M157K;
    F30H/R35H/H37I/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y149W/Y151L/M157K/R217S;
    V38D/T39Y/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S;
    R35F/H37D/R37aN/V38E/T39Y/V41R/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    T39Y/V41R/Y60bQ/L97bG/H99Q/C122S;
    T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S;
    V38D/V41R/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/R217E;
    R36S/V38D/T39L/Y40L/V41R/L97bI/H99E/C122S/R217T;
    R35S/R37aD/V38E/Y40Q/V41L/Y60bV/T97aL/L97bA/H99Q/C122S/Y149L;
    Y40Q/V41L/Y60bT/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/V38E/Y40H/V41R/T56A/L97bA/H99Q/C122S/M157K/K243M;
    F30Y/R36H/R37aH/V38E/Y40H/V41R/K61E/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K;
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    V38D/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R;
    H37G/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R;
    R35S/R37aD/V38E/Y40Q/V41L/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    R35V/R37aE/V38E/Y40Q/V41L/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S;
    Y40Q/V41L/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35H/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/I138V/M157K;
    T39Y/V41R/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S;
    F30Y/R35H/R36H/H37D/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K/T158A;
    V38E/T39W/V41R/D60aP/Y60bD/L97bA/H99L/C122S;
    F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/I65T/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K;
    V38D/V41R/L97bR/H99Q/C122S/Y151L/R217V;
    R35Q/H37S/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    R36S/V38E/Y40Q/V41R/L97bG/H99L/C122S/Y151P/R217E;
    V38E/Y40Q/V41L/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S;
    H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E;
    H37G/R37aD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E;
    F30Y/R35Y/R36H/H37K/V38E/T39F/Y40F/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K/K187S/K223S/K224Y;
    Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S;
    F30H/R35H/V38D/V41R/K61E/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K/R206H;
    F30Y/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/M157K;
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    R35A/R37aE/V38E/Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    V38D/V41L/L97bG/H99Q/C122S/Y151L/R217Q;
    F30H/R35Q/H37W/V38D/V41R/D60aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/Y151L/M157K/R217D;
    F30Y/R35F/R36H/H37G/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bS/T97aD/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    T39Y/V41R/L97bG/H99Q/C122S;
    F30Y/R35I/R36H/H37E/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bS/T97aV/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/M157K;
    R35S/R37aD/V38E/Y40Q/V41L/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    Y40H/V41Q/L97bG/H99Q/C122S/R217T;
    R35W/H37D/V38D/T39Y/V41R/Y60bS/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    V38D/T39F/Y40L/V41R/T97aW/L97bA/H99Q/C122S;
    V38D/T39Y/Y40L/V41R/T97aE/L97bA/H99Q/C122S;
    F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39F/Y40F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    V38D/T39L/Y40L/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S;
    V38D/T39Y/Y40L/V41R/T97aW/L97bA/H99Q/C122S;
    F30Y/R36H/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99L/C122S/F141L/M157K/T158A;
    F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aA/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35Q/R36H/H37G/R37aE/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    T39Y/V41R/Y60bP/L97bG/H99Q/C122S;
    F30H/R36H/V38D/V41R/T56A/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K;
    F30Y/R35E/R36H/H37D/R37aN/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    V38E/Y40Q/V41L/D60aP/Y60bL/L97bA/H99Q/C122S/Y149W;
    F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/M157K;
    F30H/R35Q/H37W/V38D/V41R/D60aE/Y60bS/L97bA/H99Q/C122S/Y149L/Y151L/M157K;
    R35Q/H37G/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/Y151P/M157K/Q192H;
    F30Y/R35M/R36H/H37D/R37aD/V38E/T39Y/Y40F/V41R/D60aP/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bT/T97aD/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    V38D/T39L/Y40L/V41R/T97aV/L97bA/H99Q/C122S;
    V38D/V41R/Y60bS/T97aI/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192F/R217E/K224R;
    T39Y/V41R/Y60bP/L97bA/H99Q/C122S;
    R36H/V38D/Y40F/V41R/D97E/A98G/T97adel/H99L/L97bdel/C122S/Y151L/Q192E/R217D;
    R35M/H37G/R37aD/V38E/T39W/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/V38D/Y40L/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157K/Q192H;
    F30H/V38D/Y40F/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157F;
    H37M/R37aD/V38E/T39A/V41R/D60aP/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/Y151L/M157K;
    T22I/F30Y/R35S/V38D/Y40H/V41R/L97bA/H99Q/C122S/I138V/M157K;
    R35L/H37D/R37aS/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R35L/V38D/Y40H/V41R/N76S/L97bA/H99Q/C122S/M157K/K187E;
    F30H/V38D/V41R/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157S;
    R35W/H37D/V38D/T39Y/V41R/Y60bH/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    F30Y/R36H/H37G/V38E/T39W/Y40H/V41R/Y60bA/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149Q/M157K;
    R35Q/H37G/R37aE/V38W/T39Y/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R;
    H37G/R37aD/G37bD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R;
    V38D/T39Y/Y40M/V41R/T97aE/L97bA/H99Q/C122S;
    R35Q/H37N/V38D/T39Y/V41R/Y60bP/L97bA/H99Q/C122S;
    F30Y/R35W/R36H/H37D/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bS/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149K/M157K;
    R35Q/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    V38E/T39L/V41R/D60aN/Y60bP/L97bG/H99Q/C122S;
    F30Y/R36H/H37A/V38E/T39Y/Y40H/V41R/Y60bQ/T97aV/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    F30Y/R35W/R36H/H37E/R37aP/V38E/T39Y/Y40F/V41R/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149Q/M157K;
    H37T/R37aL/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192R;
    H37G/R37aD/V38F/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R;
    F30Y/R35W/R36H/H37S/V38E/Y40H/Y60bN/T97aE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R/M157K;
    V38D/T39W/Y40L/V41R/T97aL/L97bA/H99Q/C122S;
    H37G/R37aD/G37bD/T39H/V41R/Y60bK/T97aS/L97bR/H99E/C122S/Y151L/E175D/Q192T/R217E/K224R;
    T39Y/V41R/L97bA/H99Q/C122S;
    V38D/T39L/Y40L/V41R/T97aW/L97bA/H99Q/C122S;
    F30Y/R36H/V38E/Y40H/V41R/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149N/L150V/M157K;
    R35S/V38D/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/M157Y;
    R37aS/V38D/T39Y/Y40F/V41R/H99L/C122S/R217T;
    Y40Q/V41L/Y60bE/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    Y40H/V41T/L97bG/H99Q/C122S/R217T; 및
    C122S가 키모트립신 넘버링에 의해 C122C인 그의 폴리펩타이드 중 임의의 것.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변형 R35Q, Y60bQ 및 Y149R 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변형 R37aE 또는 R37aS를 추가로 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 치환 R35Q/H37Y/T39Y/V41R 또는 R35Q/H37Y/T39Y/V41R/C122S를 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변형 R35Q/H37Y/T39Y/V41R/L97bA/H99Q/C122S 또는 R35Q/H37Y/T39Y/V41R/L97bA/H99Q를 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  39. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변형 T39Y/V41R/Y60bQ/L97bA/H99Q 또는 T39Y/V41R/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S를 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  40. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 치환 T39Y/V41R/D60aP/L97bA/H99Q/C122S 또는 T39Y/V41R/D60aP/L97bA/H99Q을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  41. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, Y40Q/V41L/L97bA/C122S 또는 Y40Q/V41R/L97bA/C122S 또는 Y40Q/V41L/L97bA 또는 Y40Q/V41R/L97bA에 상응하는 아미노산 변형을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  42. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, R37aS/V41R/L97bG/H99Q 또는 R37aS/V41R/L97bG/H99Q/C122S에 상응하는 아미노산 변형을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  43. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, T39Y/V41L/L97bA/H99Q/C122S 또는 T39Y/V41R/L97bA/H99Q/C122S 또는 T39Y/V41L/L97bA/H99Q 또는 T39Y/V41R/L97bA/H99Q에 상응하는 아미노산 변형을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  44. 제41항에 있어서, H99Q에 상응하는 치환을 추가로 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  45. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aT/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/Y149R; 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aT/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/Y149R에 상응하는 아미노산 변형을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  46. 제45항에 있어서, 비변형된 폴리펩타이드는 프로테아제 도메인인 서열번호: 2 또는 서열번호:5의 폴리펩타이드로 이루어지는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  47. 제45항에 있어서, 비변형된 폴리펩타이드는 서열번호:3 또는 서열번호:6의 성숙 u-PA로 이루어지는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  48. 제45항에 있어서, 비변형된 폴리펩타이드는 서열번호: 1 또는 서열번호:4의 프로-펩타이드로 이루어지는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  49. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 아미노산 변형을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드:
    H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
    R35Y/H37S/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L; 또는
    R35Q/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
    R35Q/H37Y/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/H99Q/C122S/Y149R; 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/C122S/Y149R; 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S; 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aA/Y60bP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    또는
    R35L/H37D/R37aS/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    또는
    R35M/H37G/R37aD/V38E/T39W/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    또는
    R35Q/H37G/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    또는
    R35A/H37G/R37aE/V38E/T39F/V41R/D60aE/Y60bP/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    또는
    R35Q/H37S/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    또는
    R35Q/H37T/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aE/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    또는
    R35Q/H37G/R37aE/V38E/T39H/V41R/D60aP/Y60bA/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R;
    또는
    R35W/H37D/R37aS/V38E/T39Y/V41R/D60aE/Y60bS/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
    R35Q/H37G/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bT/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R; 또는
    R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bL/D97T/T97aE/L97bG/A98S/H99L/C122S; 또는
    R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41K/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192A; 또는
    R35Y/H37V/R37aW/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bE/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192T; 또는
    R35Y/H37S/R37aP/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L; 또는
    R35W/H37P/R37aN/V38E/T39Y/V41K/D60aP/Y60bD/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y151L/Q192T; 또는 각각은 C122에서의 치환을 갖지 않음.
  50. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 또는 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/Y149R에 상응하는 아미노산 변형을 포함하되, 비변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 2 또는 서열번호:5에 제시된 프로테아제 도메인을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 8-44 중 임의의 것에 제시된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 21 또는 987에 제시된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  53. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 18에 제시된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호:5에 제시된 아미노산 잔기의 서열로 이루어지는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  55. 제49항에 있어서, 비변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 2 또는 서열번호:5에 제시된 아미노산 잔기의 서열로 이루어지는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  56. 제50항에 있어서, 비변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호:5에 제시된 아미노산 잔기의 서열로 이루어지는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 C3(서열번호:47)의 잔기 QHARASHLG(잔기 737-745) 내에서 절단되는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  58. 제57항에 있어서, P1-P1'은 RA인, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 7일 동안 PBS, 또는 체액에서 인큐베이션한 후 50% 초과의 안정성을 갖는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 7일 동안 PBS, 또는 체액에서 인큐베이션한 후 80% 초과의 안정성을 갖는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 인큐베이션은 체액에서 수행되는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  62. 제61항에 있어서, 체액은 안방수인, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 형태인 경우의 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 비변형된 u-PA 폴리펩타이드의 상응하는 형태에 비하여 플라스민에 대해 적어도 100-배수 감소된 활성을 갖는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 직접적으로 또는 링커를 통해 또 다른 모이어티 또는 중합체에 접합되는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  65. 제64항에 있어서, 융합 단백질인, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 페길화되는(PEGylated), 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청 반감기를 증가시키고/거나 면역원성을 감소시키거나 또는 둘 모두인 중합체를 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  68. 제67항에 있어서, 중합체는 폴리펩타이드를 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  69. 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청 알부민에 직접 또는 간접적으로 연결되는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  70. 제69항에 있어서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)인, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, HSA는 서열번호: 991에 제시된 서열, 또는 그것과 적어도 90% 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 형태를 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  72. 제64항에 있어서, 중합체는 Fc 도메인인, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  73. 제72항에 있어서, Fc 도메인은 서열번호: 50 또는 서열번호:992에 제시된 서열 또는 그것과 적어도 90% 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 형태를 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  74. 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체는 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 직접 연결되는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  75. 제64항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드 또는 중합체는 펩타이드 링커를 통해 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 연결되는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  76. 제75항에 있어서, 링커는 Gly 및/또는 Ser을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 링커는 최대 20, 30, 40, 또는 50개의 아미노산 잔기를 함유하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  78. 제75항에 있어서, 링커는 (GS)n 또는 (G)n(S)n 또는 (GGS)n 또는 (SGG)n 또는 (GGSSGG)n 또는 (AGS)n(여기서 n은 1 내지 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20임), 또는 S, G, E 및 K를 함유하는 최대 25개의 잔기를 함유하는 링커를 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드.
  79. 제78항에 있어서, 서열번호: 1001-1003, 1024-1029 중 임의의 것에 제시된 아미노산 잔기 및 그의 다량체의 서열 및 그와 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 변형된 u-PA.
  80. 융합 단백질로서, 비-프로테아제 폴리펩타이드 또는 그의 일부에 융합된 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 촉매 활성 부분을 포함하는 융합 단백질.
  81. 제80항에 있어서, 비-프로테아제 폴리펩타이드는 다량체화 도메인 또는 단백질 형질도입 도메인(PTD)인, 융합 단백질.
  82. 제80항에 있어서, 비-프로테아제 폴리펩타이드는 Fc 도메인인 다량체화 도메인인, 융합 단백질.
  83. 제80항에 있어서, 퓨린 활성화 부위를 포함하는, 융합 단백질.
  84. 제83항에 있어서, 퓨린 활성화 부위는 QSGQKTLRRRKR(서열번호:996) 또는 QCGQKTLRRRKR(서열번호:995) 또는 QSGQKTLRRKR(서열번호: 1044) 또는 그와 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 퓨린 활성화 부위를 포함하는, 융합 단백질.
  85. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 그의 촉매 활성 부분을 포함하는 융합 단백질로서, 융합 단백질은 신호 서열 및 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 그의 촉매 활성 부분을 포함하는, 융합 단백질.
  86. 제85항에 있어서, 신호 서열은 Il-2, u-PA, 또는 IgGκ로 부터인, 융합 단백질.
  87. 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 파트너를 포함하는, 융합 단백질.
  88. 제87항에 있어서, 융합 파트너는 다량체화 도메인인, 융합 단백질.
  89. 제87항에 있어서, 융합 파트너는 알부민, 또는 Fc 도메인, 또는 단일 사슬 항체 또는 항체의 다른 항원 결합 단편, 또는 하이알루론산 결합 도메인(HABD)인, 융합 단백질.
  90. 제89항에 있어서, 융합 파트너는 종양 괴사 인자 자극 유전자-6(TSG-6)인 HABD인, 융합 단백질.
  91. 제89항에 있어서, 융합 파트너는 HSA인, 융합 단백질.
  92. 제89항에 있어서, 융합 파트너는 IgG Fc인, 융합 단백질.
  93. 제91항에 있어서, 융합 파트너는 항 유형 II 콜라겐 항체 scFv 단편 또는 항-VEGFR 항체 또는 그의 단편인, 융합 단백질.
  94. 제80항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  95. 제94항에 있어서, 활성화 서열은 시스테인을 포함하고, 그리고 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 유리 시스테인을 포함함으로써, 활성화 시, 생성된 활성화된 폴리펩타이드는 2개의 사슬을 포함하는, 융합 단백질.
  96. 제94항에 있어서, 활성화 서열은 u-PA 활성화 서열 또는 퓨린 활성화 서열인, 융합 단백질.
  97. 제96항에 있어서, 활성화 서열은 서열번호:995-998, 1041, 및 1044 중 임의의 것에 제시된 서열 또는 그와 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는, 융합 단백질.
  98. 제80항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 서열, 변형된 u-PA 폴리펩타이드, 및 HSA를 포함하는, 융합 단백질.
  99. 제80항에 있어서, 서열번호: 1006, 1007, 1009, 및 1010 중 임의의 것에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  100. 제80항에 있어서, 서열번호: 1004-1019 및 1034-1040 중 임의의 것에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  101. 제80항에 있어서, 서열번호: 1015 또는 1019에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  102. 제80항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 서열을 갖지 않거나 신호 서열이 발현 시 제거된 것인, 융합 단백질.
  103. 제80항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, A 사슬 및 B 사슬을 함유하는 2-사슬 활성화된 형태인, 융합 단백질.
  104. 제103항에 있어서, B 사슬은 폴리펩타이드의 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 잔기 IIGG에서 시작하고 및 융합 단백질의 C-말단에서 종결되는, 융합 단백질.
  105. 제103항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 및 HSA를 포함하는, 융합 단백질.
  106. 제103항 또는 제104항에 있어서, 서열번호: 1005, 1011, 1014, 1015, 1016, 1019, 및 1036 중 임의의 것에 제시되지만, 신호 서열이 결여된 아미노산의 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  107. 제106항에 있어서, 잔기 21-178의 A 사슬, 및 잔기 168-299 사이에 디설파이드 연결을 갖는 단백질의 C-말단에 잔기 179-의 B 사슬 포함하는, 융합 단백질.
  108. 제80항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, A 사슬 및 B 사슬을 포함하는 2개의 사슬 활성화 융합 단백질이되, A 사슬은 서열번호: 1015의 잔기 21-178로 이루어지고, 및 B 사슬은 잔기 179-1022로 이루어지고; 및 A 및 B 사슬은 디설파이드 가교를 통해 서열번호: 1015의 C168과 C299 사이에 연결되는, 융합 단백질.
  109. 제88항에 있어서, 상보적 다량체화 도메인의 상호작용을 통한 이량체인, 융합 단백질.
  110. 제109항에 있어서, 다량체화 도메인은 Fc 도메인인, 융합 단백질.
  111. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 핵산 분자.
  112. 제111항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  113. 제112항에 있어서, 원핵 벡터인, 벡터.
  114. 제112항에 있어서, 진핵 벡터인, 벡터.
  115. 제112항에 있어서, 바이러스 벡터인, 벡터.
  116. 제112항에 있어서, 효모 벡터인, 벡터.
  117. 제112항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 단순 포진 바이러스 벡터, 또는 백시니아 바이러스 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터, 또는 아데노-회합된 바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터, 또는 곤충 벡터인, 벡터.
  118. 제112항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 벡터인, 벡터.
  119. 제112항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 요법 벡터인, 벡터.
  120. 보체 활성화에 의해 매개되거나 그를 수반하는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 유전자 요법을 위한 제111항의 핵산 또는 제112항 내지 제119항 중 어느 한 항의 벡터의 용도로서, 보체 활성화의 억제는 질환 또는 병태의 치료 또는 개선에 영향을 미치는, 용도.
  121. 보체 활성화를 억제하여 보체 매개 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 제112항 내지 제119항 중 어느 한 항의 벡터.
  122. 보체 활성화에 의해 매개되거나 그를 수반하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 제111항의 핵산 분자 또는 제112항 내지 제119항 중 어느 한 항의 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  123. 제122항에 있어서, 보체 매개 질환 또는 장애는 염증성 질환 및 병태, 보체 3 사구체병증(C3G), 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS), 패혈증, 류마티스성 관절염(RA), 심혈관 질환, 막증식성 질환 및 병태, 안과용 또는 안구 질환 또는 장애, 막증식성 사구체신염(MPGN), 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 천식, 염증성 장 질환, 면역 복합체(IC) 매개 급성 염증성 조직 손상, 알츠하이머병(AD), 이식된 기관 거부, 및 허혈-재관류 손상 중에서 선택되는, 방법.
  124. 제122항에 있어서, 질환 또는 병태는 안구 또는 안과용 질환이거나 이식된 기관으로 인한 거부 또는 염증인, 방법.
  125. 제122항에 있어서, 질환 또는 병태는 당뇨병성 망막병증 또는 황반 변성인, 방법.
  126. 제122항에 있어서, 질환 또는 병태는 황반 변성인, 방법.
  127. 제125항에 있어서, 황반 변성은 연령 관련 황반 변성(AMD)인, 방법.
  128. 제122항에 있어서, 질환 또는 병태는 지연된 신장 이식 기능(DGF)인, 방법.
  129. 제122항에 있어서, 질환 또는 병태는 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS)인, 방법.
  130. 제122항에 있어서, 질환 또는 병태는 보체 3 사구체병증(C3G)인, 방법.
  131. 제120항에 있어서, 보체 매개 질환 또는 병태는 염증성 질환 및 병태, 보체 3 사구체병증(C3G), 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS), 패혈증, 류마티스성 관절염(RA), 안구 질환, 막증식성 사구체신염(MPGN), 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 천식, 염증성 장 질환, 면역 복합체(IC) 매개 급성 염증성 조직 손상, 알츠하이머병(AD), 및 허혈-재관류 손상 중에서 선택되는, 용도.
  132. 제120항에 있어서, 질환 또는 병태는 안과용 또는 안구 질환이거나 이식된 기관으로 인한 거부 또는 염증인, 용도.
  133. 제120항에 있어서, 질환 또는 병태는 당뇨병성 망막병증 또는 황반 변성인, 용도.
  134. 제120항에 있어서, 질환 또는 병태는 황반 변성인, 용도.
  135. 제133항에 있어서, 황반 변성은 연령 관련 황반 변성(AMD)인, 용도.
  136. 제120항에 있어서, 질환 또는 병태는 지연된 신장 이식 기능(DGF)인, 용도.
  137. 제120항에 있어서, 질환 또는 병태는 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS)인, 용도.
  138. 제120항에 있어서, 질환 또는 병태는 보체 3 사구체병증(C3G)인, 용도.
  139. 제111항의 핵산 분자 또는 제112항 내지 제119항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는, 단리된 세포 또는 세포 배양물.
  140. 제111항의 핵산 분자 또는 제112항 내지 제119항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는, 비-인간 세포.
  141. 제111항의 핵산 분자 또는 제112항 내지 제119항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 단리된 세포로서, 인간 접합체가 아닌, 단리된 세포.
  142. 보체 활성화를 억제하는 방법으로서, 활성 형태의 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 제80항 내지 제110항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 보체 단백질 C3과 접촉시키는 것을 포함하여, 보체 단백질 C3은 보체 활성화가 감소되거나 억제되도록 절단되는, 방법.
  143. 제142항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드와 보체 단백질 C3와의 접촉은 시험관 내에서 수행되는, 방법.
  144. 제142항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드와 보체 단백질 C3와의 접촉은 생체 내에서 수행되는, 방법.
  145. 제138항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 활성화의 억제는 염증성 장애, 신경퇴행성 장애, 및 심혈관 장애 중에서 선택된 보체 매개 질환 또는 장애와 관련된 염증성 증상의 감소를 초래하는, 방법.
  146. 제145항에 있어서, 보체 매개 질환 또는 장애는 염증성 질환 및 병태, 패혈증, 보체 3 사구체병증(C3G), 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS), 류마티스성 관절염(RA), 안구 장애, 막증식성 사구체신염(MPGN), 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 천식, 염증성 장 질환, 면역 복합체(IC) 매개 급성 염증성 조직 손상, 알츠하이머병(AD), 및 허혈-재관류 손상 중에서 선택되는, 방법.
  147. 제146항에 있어서, 허혈-재관류 손상은 심근 경색(MI), 뇌졸중, 혈관성형술, 관상동맥 우회로 이식술, 심폐 우회로(CPB), 및 혈액투석 중에서 선택된 사건 또는 치료에 의해 야기되는, 방법.
  148. 제142항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 매개 질환 또는 장애는 대상체의 치료에서 유래하는, 방법.
  149. 제142항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 의한 치료는 대상체의 치료 전에 수행되는, 방법.
  150. 보체 활성화에 의해 매개되거나 그를 수반하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 활성 형태로 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 제80항 내지 제110항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하고, 보체 활성화의 억제는 질환 또는 병태의 치료 또는 개선에 영향을 미치는, 방법.
  151. 제150항에 있어서, 보체 매개 질환 또는 장애는 염증성 질환 및 병태, 패혈증, 보체 3 사구체병증(C3G), 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS), 류마티스성 관절염(RA), 안구 질환, 막증식성 사구체신염(MPGN), 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 천식, 염증성 장 질환, 면역 복합체(IC) 매개 급성 염증성 조직 손상, 알츠하이머병(AD), 및 허혈-재관류 손상 중에서 선택되는, 방법.
  152. 제150항에 있어서, 질환 또는 병태는 안구 질환이거나 이식된 기관으로 인한 거부 또는 염증인, 방법.
  153. 제150항에 있어서, 질환 또는 병태는 당뇨병성 망막병증 또는 황반 변성인, 방법.
  154. 제150항에 있어서, 질환 또는 병태는 황반 변성인, 방법.
  155. 제150항에 있어서, 황반 변성은 연령 관련 황반 변성(AMD)인, 방법.
  156. 제150항에 있어서, 질환 또는 병태는 지연된 신장 이식 기능(DGF)인, 방법.
  157. 제150항에 있어서, 질환 또는 병태는 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS)인, 방법.
  158. 제150항에 있어서, 질환 또는 병태는 보체 3 사구체병증(C3G)인, 방법.
  159. 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 인코딩화 핵산 분자 또는 벡터는 정맥내로 투여되는, 방법 또는 용도.
  160. 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 인코딩화 핵산 분자 또는 벡터는 피하로 투여되는, 방법 또는 용도.
  161. 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 인코딩화 핵산 분자 또는 벡터는 눈에 투여되는, 방법 또는 용도.
  162. 제161항에 있어서, 눈에 대한 투여는 유리체내 또는 망막하 또는 망막내 주사에 의해 수행되는, 방법 또는 용도.
  163. 제161항 또는 제162항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 형질도입 도메인에 연결되어 유리체액으로의 형질도입을 용이하게 하는, 방법 또는 용도.
  164. 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 페길화되는, 방법 또는 용도.
  165. 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 알부민화, 글리코실화, 파네실화, 카복실화, 하이드록실화, 인산화, 헤실화(HESylation), 및/또는 파실화(PASylation)에 의해 변형되는, 방법 또는 용도.
  166. 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 복용량은 투여 경로에 따라 0.1 내지 10 mg인, 방법 또는 용도.
  167. 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 복수 회 반복되는, 방법 또는 용도.
  168. 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 2일, 3일, 4일, 5일, 6 일마다, 매주, 격월 또는 매월 반복되는, 방법 또는 용도.
  169. 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 2개월마다, 3개월마다 또는 4개월마다 반복되는, 방법.
  170. 하기를 포함하는 조합:
    (a) 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 제80항 내지 제110항 중 어느 한 항의 융합 단백질; 및
    (b) 보체 매개 질환 또는 장애를 치료하기 위한 제2 제제 또는 제제들.
  171. 제170항에 있어서, 제2 제제 또는 제제들은 항-염증제(들) 또는 항응고제(들)인, 조합.
  172. 제170항 또는 제171항에 있어서, 제2 제제는 비스테로이드 항-염증성 약물(NSAID), 항대사산물, 코르티코스테로이드, 진통제, 세포독성제, 전-염증 사이토카인 억제제, 항-염증성 사이토카인, B 세포 표적화 제제, 화합물 표적화 T 항원, 부착 분자 차단제, 케모카인 수용체 길항제, 키나제 억제제, PPAR-γ(감마) 리간드, 보체 억제제, 헤파린, 와파린, 아세노쿠마롤, 펜인디온, EDTA, 시트레이트, 옥살레이트, 아르가트로반, 레피루딘, 바이발리루딘, 및 크시멜라가트란 중 임의의 하나 이상 중에서 선택된 항-염증제(들)인, 조합.
  173. 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 변형 V41R 또는 V41L을 포함하는, 방법, 용도 또는 조합.
  174. 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 변형 V41R을 포함하는, 방법, 용도 또는 조합.
  175. 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 변형 V38E/V41R을 포함하는, 방법, 용도 또는 조합.
  176. 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 변형 Y40Q/V41R/L97bA 또는 Y40Q/V41L/L97bA 또는 R37aS/V41R/L97bG/H99Q를 포함하는, 방법, 용도 또는 조합.
  177. 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 변형:
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/Y149R을 포함하는, 방법, 용도 또는 조합.
  178. 제173항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 2 또는 서열번호:5에 제시된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는, 방법, 용도 또는 조합.
  179. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 제80항 내지 제110항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제120항 내지 제138항 및 제142항 내지 제178항 중 어느 한 항의 방법, 용도 또는 조합으로서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 서열번호: 21 또는 987 또는 서열번호: 40-44, 또는 키모트립신 넘버링에 의해 C122에서의 변형 없는 40-44 중 임의의 것에 제시된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는, 변형된 u-PA 폴리펩타이드, 융합 단백질, 방법, 용도 또는 조합.
  180. DGF를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 제80항 내지 제110항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 정맥내로 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  181. 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS)을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 제80항 내지 제110항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  182. 보체 3 사구체병증(C3G)을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 제80항 내지 제110항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  183. 제180항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 복용량은 0.1 내지 3 mg, 또는 0.1 내지 2 mg, 또는 1 내지 3 mg, 또는 1 내지 10 mg인, 방법.
  184. 제180항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 서열번호: 21 또는 987 또는 서열번호: 40-44, 또는 키모트립신 넘버링에 의해 C122에서의 변형 없는 40-44 중 임의의 것에 제시된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는, 방법.
  185. 제180항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 복수 회 반복되는, 방법.
  186. 제180항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 2일, 3일, 4일, 5일, 6 일마다, 매주, 격월 또는 매월 반복되는, 방법.
  187. 제180항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 2개월마다, 3개월마다, 또는 4개월마다 반복되는, 방법.
  188. 제102항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 치환 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R을 포함하는, 방법.
  189. 제180항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 서열번호: 21 또는 987에 제시된 프로테아제 도메인 또는 그의 촉매 활성 부분을 포함하는, 방법.
  190. 안과 장애 또는 안구 장애를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 제80항 내지 제110항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 눈에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  191. 제190항에 있어서, 장애는 황반 변성 또는 당뇨병성 망막병증인, 방법.
  192. 제191항에 있어서, 장애는 AMD인, 방법.
  193. 제190항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 복용량은 0.1 mg 내지 2 mg/눈 또는 3 mg/눈인, 방법.
  194. 제190항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 복용량은 1 mg 내지 2 mg/눈인, 방법.
  195. 제190항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 복용량은 0.1 내지 1 mg인, 방법.
  196. 제180항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 21 또는 987 중 임의의 것 또는 서열번호: 40-44, 또는 키모트립신 넘버링에 의해 C122에서의 변형 없는 40-44 중 임의의 것에 제시된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는, 방법.
  197. 제180항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 복수 회 반복되는, 방법.
  198. 제180항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 2일, 3일, 4일, 5일, 6일마다, 매주, 격월 또는 매월, 2개월마다, 3개월마다, 또는 4개월마다 반복되는, 방법.
  199. 제180항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 치환 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/Y149R을 포함하는, 방법.
  200. 제180항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 치환 Y40Q/V41L/L97bA/C122S 또는 Y40Q/V41R/L97bA/C122S 또는 Y40Q/V41L/L97bA 또는 Y40Q/V41R/L97bA를 포함하는, 방법.
  201. 제180항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 21 또는 987에 제시된 프로테아제 도메인 또는 그의 촉매 활성 부분을 포함하는, 방법.
  202. AMD 또는 DGF를 치료하기 위한 변형된 u-PA 폴리펩타이드의 용도로서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 치환 R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/C122S/Y149R 또는
    R35Q/H37Y/R37aE/V38E/T39Y/V41R/D60aP/Y60bQ/T97aI/L97bA/H99Q/Y149R 또는 Y40Q/V41L/L97bA/C122S 또는 Y40Q/V41R/L97bA/C122S 또는 Y40Q/V41L/L97bA 또는 Y40Q/V41R/L97bA를 포함하는, 용도.
  203. 보체 활성화를 억제하기 위한, 활성 형태의 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 제80항 내지 제110항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 용도.
  204. 제203항에 있어서,
    변형된 u-PA 폴리펩타이드는 보체 단백질 C3과 접촉되어, 보체 단백질 C3은 보체 활성화가 감소되거나 억제되도록 절단되고; 그리고
    변형된 u-PA 폴리펩타이드와 보체 단백질 C3와의 접촉은 시험관 내에서 또는 비-인간 동물에서 수행되는, 용도.
  205. 제203항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드와 보체 단백질 C3와의 접촉은 생체 내에서 수행되는, 용도.
  206. 제203항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 활성화의 억제는 염증성 장애, 신경퇴행성 장애, 및 심혈관 장애 중에서 선택된 보체 매개 질환 또는 장애와 관련된 염증성 증상의 감소를 초래하는, 용도.
  207. 제206항에 있어서, 보체 매개 질환 또는 장애는 염증성 질환 및 병태, 패혈증, 보체 3 사구체병증(C3G), 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS), 류마티스성 관절염(RA), 안구 장애, 막증식성 사구체신염(MPGN), 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 천식, 염증성 장 질환, 면역 복합체(IC) 매개 급성 염증성 조직 손상, 알츠하이머병(AD), 및 허혈-재관류 손상 중에서 선택되는, 용도.
  208. 제207항에 있어서, 허혈-재관류 손상은 심근 경색(MI), 뇌졸중, 혈관성형술, 관상동맥 우회로 이식술, 심폐 우회로(CPB), 및 혈액투석 중에서 선택된 사건 또는 치료에 의해 야기되는, 용도.
  209. 제203항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 매개 질환 또는 장애는 대상체의 치료에서 유래하는, 용도.
  210. 제203항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드에 의한 치료는 대상체의 치료 전에 수행되는, 용도.
  211. 보체 활성화에 의해 매개되거나 그를 수반하는 질환 또는 병태를 치료하기 위한, 활성 형태의 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 제80항 내지 제110항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 용도로서, 보체 활성화의 억제는 질환 또는 병태의 치료 또는 개선에 영향을 미치는, 용도.
  212. 제211항에 있어서, 보체 매개 질환 또는 장애는 염증성 질환 및 병태, 보체 3 사구체병증(C3G), 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS), 패혈증, 류마티스성 관절염(RA), 안구 질환, 막증식성 사구체신염(MPGN), 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 천식, 염증성 장 질환, 면역 복합체(IC) 매개 급성 염증성 조직 손상, 알츠하이머병(AD), 및 허혈-재관류 손상 중에서 선택되는, 용도.
  213. 유전자 요법을 위한 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 또는 핵산을 포함하는 벡터의 용도.
  214. 제211항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 병태는 안구 질환이거나 이식된 기관으로 인한 거부 또는 염증인, 용도.
  215. 제211항 또는 제213항에 있어서, 질환 또는 병태는 당뇨병성 망막병증 또는 황반 변성인, 용도.
  216. 제211항 또는 제213항에 있어서, 질환 또는 병태는 황반 변성인, 용도.
  217. 제216항에 있어서, 황반 변성은 연령 관련 황반 변성(AMD)인, 용도.
  218. 제211항 또는 제213항에 있어서, 질환 또는 병태는 지연된 신장 이식 기능(DGF)인, 용도.
  219. 제211항 또는 제213항에 있어서, 질환 또는 병태는 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS)인, 용도.
  220. 제211항 또는 제213항에 있어서, 질환 또는 병태는 보체 3 사구체병증(C3G)인, 용도.
  221. 제213항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 안과 장애의 치료를 위한 유리체내 또는 망막내 또는 망막하 주사를 위한, 용도.
  222. 제221항에 있어서, 단일 복용량은 0.1 내지 1 mg인, 용도.
  223. 제221항에 있어서, 단일 복용량은 0.1 mg 내지 2 mg/눈 또는 3 mg/눈인, 용도.
  224. 제221항에 있어서, 단일 복용량은 1 mg 내지 2 mg/눈인, 용도.
  225. 제203항 또는 제224항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드는 서열번호: 21 또는 987 또는 서열번호: 40-44, 또는 키모트립신 넘버링에 의해 C122에서의 변형 없는 40-44 중 임의의 것에 제시된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는, 용도.
  226. 제203항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 복수 회 반복되는, 용도.
  227. 제203항 내지 제226항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 2일, 3일, 4일, 5일, 6 일 마다, 매주, 격월 또는 매월, 2개월마다, 3개월마다, 또는 4개월마다 반복되는, 용도.
  228. 변형된 u-PA 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서,
    제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제80항 내지 제110항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 또는 벡터를 세포에 도입하는 단계;
    조건 하에서 세포를 배양하여, 폴리펩타이드를 발현시키는 단계; 및
    선택적으로, 발현된 폴리펩타이드를 단리하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  229. 제228항에 있어서, 세포는 진핵 세포인, 방법.
  230. 제229항에 있어서, 세포는 포유동물 세포 또는 효모 세포인, 방법.
  231. 약제학적으로 허용 가능한 비히클 중에 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 제80항 내지 제110항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물.
  232. 제231항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 2-사슬 활성화된 형태인, 약제학적 조성물.
  233. 제230항 또는 제231항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 서열번호: 21 또는 서열번호: 987의 프로테아제 도메인을 포함하는, 약제학적 조성물.
  234. 제231항 내지 제233항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 u-PA 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 서열번호: 1015 또는 1019에 제시된 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
  235. 제231항 내지 제234항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 매개 질환 또는 장애 또는 병태의 치료에 사용하기 위한 것인, 약제학적 조성물.
  236. 제235항에 있어서, 보체 매개 질환 또는 장애는 염증성 장애, 신경퇴행성 장애, 및 심혈관 장애 중에서 선택되는, 약제학적 조성물.
  237. 제235항에 있어서, 보체 매개 질환 또는 장애는 염증성 질환 및 병태, 보체 3 사구체병증(C3G), 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS), 패혈증, 류마티스성 관절염(RA), 안구 장애, 막증식성 사구체신염(MPGN), 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 천식, 염증성 장 질환, 면역 복합체(IC) 매개 급성 염증성 조직 손상, 알츠하이머병(AD), 및 허혈-재관류 손상 중에서 선택되는, 약제학적 조성물.
  238. 제235항에 있어서, 질환 또는 장애는 안구 질환이거나 이식된 기관으로 인한 거부 또는 염증인, 약제학적 조성물.
  239. 제238항에 있어서, 질환 또는 병태는 당뇨병성 망막병증 또는 황반 변성인 안구 질환인, 약제학적 조성물.
  240. 제239항에 있어서, 질환 또는 장애 병태는 황반 변성인, 방법.
  241. 제240항에 있어서, 황반 변성은 연령 관련 황반 변성(AMD)인, 방법.
  242. 제235항에 있어서, 질환 또는 병태는 지연된 신장 이식 기능(DGF)인, 방법.
  243. 제235항에 있어서, 질환 또는 병태는 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS)인, 방법.
  244. 제235항에 있어서, 질환 또는 병태는 보체 3 사구체병증(C3G)인, 방법.
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