JP2991769B2 - セルピン抵抗性キモトリプシン スーパーフアミリー プロテアーゼ、特にＰＡＩ―１抵抗性ｔ―ＰＡ、相補的阻害剤変異株；組成；遺伝子；発現 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 関連出願へのヘロスリファレンス これは1989年３月６日出願のU.S.特許出願番号07/31
9,212の一部継属出願である。

発明の分野 本発明は同起源阻害剤による阻害に対して抵抗性であ
るキモトリプシン スーパーファミリーのセリン プロ
テアーゼ変異株、及びそれをコードする遺伝子に関す
る。本発明は又、本発明のセリン プロテアーゼ変異株
を阻害するセリン プロテアーゼ インヒビター変異
株、及びそれをコードする遺伝子に関する。セリン プ
ロテアーゼ変異株、及びセリン プロテアーゼ インヒ
ビター変異株は、例えば薬剤として有用である。

発明の背景 I.セリン プロテアーゼ セリン プロテアーゼ（E.C.3.4.21）はペプチド結合
分裂における求核試薬としてセリンを使用するエンドペ
プチダーゼのサブーサブクラスである（Barrett,A.J.,
於:Proteinase Inhibitors,出版Btarrett,A.J.等,Else
vier,Amsterdam,3−22頁；及びHartley,B.S.,Ann.Rev.B
iochemt.,29:45−72（1960）。

セリン プロテアーゼは文献により周知であり、セリ
ン プロテアーゼの２つのスパーファミリー、すなわち
キモトリプシン スーパーファミリー、及びストレプト
ミセス ズブチリシン スーパーファミリーはこれまで
に観察されていた（Berrett.A.J.,於:Proteinase Inhi
bitors,出版Btarrett,A.J.等,Elsevier,Amsterdam,3−2
2頁（1986）；及びJames,M.N.G.,於:Proteolysis and
Physiological Regulation,出版Ribbons,D.W.等,Aca
demic Press,New York,125−142頁（1976））。

キモトリプシン スーパーファミリーのセリン プロ
テアーゼの例には組織−型プラスミノーゲン活性化因子
（下文では“ｔ−PA"）、トリプシン、トリプシン−様
プロテアーゼ、キモトリプシン、プラスミン、エラスタ
ーゼ、ウロキナーゼ（又は尿−型プラスミノーゲン活性
化因子（下文ではｕ−PA″）、アクロシン、活性化プロ
テインＣ、Clエステラーゼ、カテプシンＧ、チマーゼ、
ならびにカリクレイン、トロンビン及び因子VII a,IX
a,X a,XI a及びXII aを含む血液凝固カスケードのプロ
テアーゼが含まれる（Barrett.A.J.,於:Proteinase In
hibitors,出版Barrett,A.J.等,Elesevier,Amsterdam,3
−22頁（1986）;Strassburger,W.等,FEBS Lett.,157:2
19−223（1983）;Dayhoff,M.O.,Atlas of Protein S
equence and Structure,5巻,National Biomedical
Research Foundation,Silver Spring,Maryland（197
2）；及びRosenberg,R.D.等,Hosp.Prac.,21:131−137
（1986））。

ｔ−PA、プラスミン、ｕ−PA、及び血液凝固カスケー
ドのプロテアーゼを含むキモトリプシン スーパーファ
ミリーのセリン プロテアーゼのいくつかは巨大分子で
あり、セリン プロテアーゼ触媒ドメインの他にその活
性の調節に一部関与する構造ドメインを含む（Barrett.
A.J.,於:Proteinase Inhibitors,出版Barrett,A.J.等,
Elsevier,Amsterdam,3−22頁（1986）;Gerard,R.D.等,M
ol.Biol.Med.,3:449−457（1986）；及びBlasi,F.等，
於:Human Genes and Diseases,出版Blasi,F.等,John
Wiley ＆ Sons,Ltd.,377−414頁（1986））。

キモトリプシン スーパーファミリーのすべてのセリ
ン プロテアーゼの触媒ドメインは配列相同性、及び構
造相同性の両方を有する。配列相同性は以下： （ｉ）特徴的活性化部位残基（例えばトリプシンの場合
Ser₁₉₅,His₅₇,及びAsp₁₀₂）； （ii）オキシアニオン ホール（例えばトリプシンの場
合Gly₁₉₃,Asp₁₉₄）；及び （iii）構造中にジスルフィド架橋を形成するシステイ
ン残基の全部の保持を含む（Hartley,B.S.,Symp.Soc.Ge
n.Microbiol.,24:152−182（1974））。

構造相同性は以下： （ｉ）２個のグリーク鍵構造から成る共通折りたたみ
（Richardson,J.,Adv.Prot.Chem.,34:167−339（198
1））； （ii）触媒残基の共通の配置；及び （iii）分子のコア中の構造の詳細な保持（Stroud,R.
M.,Sci.Am.,231:24−88（1974））を含む。

キモトリプシン スーパーファミリーのメンバーの配
列を比較すると触媒ドメイン内のアミノ酸の挿入、又は
矢失の存在が明らかになる（例えば図１を参照）。すべ
ての場合、これらの挿入又は矢失は折りたたまれた分子
の表面にあり、従って分子の基本的構造に影響しない
（Strassburger,W.等,FEBS Lett.,157:219−223（198
3））。

II.セリン プロテアーゼ インヒビター セリン プロテアーゼ インヒビターは文献により周
知であり、以下の科（ファミリー）に分けられる：
（ｉ）塩基性プロテアーゼ インヒビターとしても知ら
れる牛すい臓トリプシン インヒビター（Kunitz）ファ
ミリー（Ketcham,L.K.等，於:Atlas of Protein Seq
uence and Structure,出版Dayhoff,M.O.,131−143頁
（1978）（下文では“BPTI"）、（ii）Kazalファミリ
ー、（iii）ストレプトミセス ズブチリシンインヒビ
ターファミリー（下文では“SSI"）、（iv）セルピン
ファミリー、（ｖ）大豆トリプシン インヒビター（Ku
nitz）ファミリー、（vi）ポテト インヒビターファミ
リー、及び（vii）ボーマン−バーク ファミリー（Las
kowski,M.等,Ann.Rev.Biochem.,49:593−626（1980）;R
ead.R.J.等，於:Proteinase Inhibitors,出版Barrett,
A.J.等,Elsevier,Amsterdam,301−336頁（1986）：及び
Laskowski,M.等,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Bi
ol.,LII:545−553（1987））。

BPTI、Kazal、SSI、大豆トリプシン、及びポテト イ
ンヒビターファミリーのメンバーを含む多くの完全な形
の阻害剤、及びセルピン アルファー１−アンチトリプ
シンの分裂形に関して結晶学的データが得られる（Res
d,R.J.等，於:Proteinase Inhibitors,出版Barrett,A.
J.等,Elsevier,Amsterdam,301−336頁（1986））。これ
らのセリン プロテアーゼ インヒビターは大きさ及び
配列が膨大なタンパク質であるにもかかわらず、これま
でに研究された完全な形のインヒビターはすべて分子の
表面から伸びる特徴的なループを共通して有しており、
それは同起源のセリン プロテアーゼの活性化部位に対
する認識配列を含む（Levin,E.G.等,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,80:6804−6808（1983））。異なるセリン プロ
テアーゼ インヒビターのループが構造的に類似してい
ることは驚くべきことである（Papamokos,E.等,J.Mol.B
iol.,158:515−537（1982））。阻害剤のKaZalファミリ
ー及びストレプトミセス スブチリシン ファミリーは
いくらか構造及び配列に類似性があるが、一般に異なる
ファミリーのセリン プロテアーゼ インヒビターは活
性化部位ループ以外に構造的関連性はない。

セリン プロテアーゼ インヒビターの多くは広範囲
の特異性を持ち、血液凝固セリン プロテアーゼを含む
プロテアーゼのキモトリプシン スーパーファミリー、
及びセリン プロテアーゼのストレプトミセス ズブチ
リシン スーパーファミリーの両方を阻害することがで
きる（Laskowski,M.等,Ann.Rev.Biochem.,49:593−626
（1980））。各阻害剤の特異性はセリン プロテアーゼ
による阻害剤の潜在分裂の部位への直接のアミン末端で
あるアミノ酸の同定によりまず決定すると思われる。P₁
部位残基として知られるこのアミノ酸はセリン プロテ
アーゼの活性部位内のセリンとアシル結合を形成すると
思われる（Laskowski,M.等,Ann.Rev.Biochem.,49:593−
626（1980））。

A. BPTIファミリー BPTIファミリーに属するセリン プロテアーゼ イン
ヒビターには、BPTI、ヘビ毒インヒビター、インターア
ルファ インヒビター、及びA4アミロイド前駆体A4695
が含まれる（Laskowski,M.等,Ann.Rev.Biochem.,49:593
−626（1980）;Read,R.J.等，於:Proteinase Inhibito
rs,出版Barret,A.J.等,Elsevier,Amsterdam,301−336頁
（1986）；及びPonte,P.等,Nature,331:525−527（198
8））。セリン プロテアーゼ、及びそれらと同起源のB
PTIファミリー阻害剤の例を下表Ｉに挙げる。

表Ｉ セリン プロテアーゼ 同起源BPTI阻害剤 トリプシン BPTI ヘビ毒インヒビター インターアルファ インヒビ ター （未知） A4アミロイド前駆体A4695 プロテアーゼ ネクシンII B. Kazalファミリー Kazelファミリーに属するセリン プロテアーゼ イ
ンヒビターには、すい臓分泌阻害剤、オボムコイド、及
び精奬アクロシン インヒビターが含まれる（Laskowsk
i,M.等,Ann.Rev.Biochem.,49:593−626（1980）;Read,
R.J.等，於:Proteinase Inhibitors,出版Barrett,A.J.
等,Elsevier,Amsterdam,301−336頁（1986）；及びLask
owski,M.等,Cold Spring Harbor Symp.Quant,Biol.,
LII:545−554（1987））。セリン プロテアーゼ、及び
それらと同起源のKazalファミリー阻害剤の例を下表II
に挙げる。

表II セリン プロテアーゼ 同起源Kazal阻害剤 トリプシン すい臓分泌阻害剤 オボムコイド 精奬アクロシン インヒビタ ー アクロシン オボムコイド 精奬アクロシン インヒビタ ー C. ストレプトミセス ズブチリシン インヒビター ストレプトミセス ズブチリシン インヒビター フ
ァミリーに属するセリン プロテアーゼ インヒビター
にはストレプトミセス アルボグリセオルスから得られ
る阻害剤、及びプラスミノストレプチンが含まれる（La
skowski,M.等,Ann.Rev.Biochem.,49:593−626（198
0）。セリン プロテアーゼ及びそれらと同起源のスト
レプトミセス ズブチリシン クラスの阻害剤の例を下
表IIIに挙げる。

表III セリン プロテアーゼ 同起源SSIインヒビター ズブチリシン BPN′ ストレプトミセス アルボグ リセオルス インヒビター プラスミン プラスミノストレプチン トリプシン プラスミノシトレプチン D. セルピン ファミリー セルピン ファミリーに属するセリン プロテアーゼ
インヒビターにはプラスミノーゲン活性化因子インヒ
ビターPAI−1,PAI−２及びPAI−３、Clエステラーゼ、
インヒビター、アルファ−２−アンチプラスミン、コン
トラプシン、アルファ−１−アンチトリプシン、アンチ
トロンビンIII、プロテアーゼ ネクシンＩ、アルファ
−１−アンチキモトリプシン、プロテインＣインヒビタ
ー、ヘパリン補因子II、及び成長ホルモン調節タンパク
質が含まれる（Carrel,R.W.等,Cold Stpring Harbor
Symp.Quant.Biol.,52:527−535（1987）;Sommer,J.
等,Biochem.,26:6407−6410（1987）;Suzuki,K.等,J.Bi
ol.Chem.,262:611−616（1987）；及びStump,D.C.等,J.
Biol.Chem.,261:12759−12766（1986））。

セルピンによるセリン プロテアーゼの阻害はTravi
s,J.等,Ann.Rev.Biochem.,52:655−709（1983）;Carre
l,R.W.等,Trends Biochem.Sci.,10:20−24（1985）;Sp
rengers,E.D.等,Blood,69:381−387（1987）；及びProt
einase Inhibitors,出版Barrett,A.J.等,Elsevier,Ams
terdam（1986）で調査されている。

セリン プロテアーゼ、及びそれらと同起源のセルピ
ン インヒビターの例を下表にIVに挙げる。

表IV セリン プロテアーゼ 同起源セルピン インヒビター 活性化プロテインＣ プロテインＣ阻害 剤 PAI−１ Clエステラーゼ Clエステラーゼ インヒビター カテプシン Ｇ アルファ−１−ア ンチトリプシン アルファ−１−ア ンチキモトリプシ ン チマーゼ アルファ−１−ア ンチキモトリプシ ン キモトリプシン アルファ−１−ア ンチキモトリプシ ン アルファ−２−ア ンチプラスミンコ ントラプシン 凝固因子（VII a,IX a,X a,XI a,XII a） アンチトロン
ビン III Clエステラー ゼ インヒビター エラスターゼ アルファ−１−ア ンチトリプシン カリクレイン Clエステラーゼイ ンヒビター アルファ−１−ア ンチトリプシン プラスミン アルファ−２−ア ンチプラスミン トロンビン アンチトロンビン III ヘパリン補因子II ｔ−PA PAI−1,PAI−2, PAI−３ トリプシン アルファ−１−ア ンチトリプシン 成長ホルモン調節 蛋白質 トリプシン−様 プロテアーゼ プロテアーゼ ネ クシンＩ ｕ−PA PAI−1,PAI−2, PAI−３ E.大豆トリプシン インヒビター ファミリー 大豆から精製した大豆トリプシン インヒビター フ
ァミリーの唯一の例は配列が決定されている。牛すい臓
トリプシンとのその複合体が研究されている（Sweet,R.
M.等,Biochem.,13:4214−4228（1974））。

F.ポテト インヒビター ファミリー ポテト インヒビター ファミリーに属するセリン
プロテアーゼ インヒビターには、じゃがいも、大麦、
及びひるからの阻害剤が含まれる（Read,R.J.等，於:Pr
oteinase Inhibitors,出版Barrett,A.J.等,Elsevier,A
msterdam,301−336頁（1986））。セリン プロテアー
ゼ、及びそれらのポテト インヒビターの例を下表Ｖに
挙げる。

表Ｖ セリンプロテアーゼ ポテト インヒビター キモトリプシン 大麦キモトリプシン インヒビター ズブチリシン ノボ 大麦キモトリプシン インヒビター ズブチリシン カルスベルグ ひる阻害剤 エグリン G.ボーマン−バーク インヒビター ボーマン−バーク インヒビター ファミリーに属す
るセリン プロテアーゼ インヒビターはマメからの相
同タンパク質を含む（Laskowski,M.等,Ann.Rev.Bioche
m.,49:593−626（1980））。セリン プロテアーゼ、及
びそれらのボーマン−バーク インヒビターの例を下表
VIに挙げる。

表VI セリン プロテアーゼ ボーマン−バーク インヒビ ター トリプシン あおいまめ阻害剤IV エラスターゼ ガーデンビーン阻害剤 キモトリプシン アズキマメ阻害剤II III.セリン プロテアーゼ−インヒビター複合体 すべてのファミリーからのセリン プロテアーゼ イ
ンヒビターはそれらと同起源のセリン プロテアーゼと
安定な1:1複合体を形成する。これらの複合体の解離は
非常におそい（数時間から数日）（Laskowski,M.等,An
n.Rev.Biochem.,49:593−626（1980）；及びLevin,E.
G.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:6804−6808（198
3））。セルピンを除くすべてのセリン プロテアーゼ
インヒビターの場合、解離生成物は完全な形の、及び
分裂した阻害剤分子の混合物である。他方、セリン プ
ロテアーゼ−セルピン複合体は解離により分裂した阻害
剤分子のみを生ずるようなので、セルピンは他のセリン
プロテアーゼ インヒビターと多少異なる機構を使用
すると思われる。

トリプシン−BPTI、キモトリプシン−オボムコイド
インヒビター、キモトリプシン−ポテト インヒビタ
ー、及びストレプトミセス ズブチリシン−ストレプト
ミセス ズブチリシン インヒビターを含む数種のセリ
ン プロテアーゼー阻害剤複合体に関する構造データが
得られる（Read,R.J.等、於:Proteinase Inhibitors,
出版Barrett,A.J.等,Elsevier,Amsterdam,301−336頁
（1986））。これらの構造を調べると、阻害剤の膨大な
配列にもかかわらず、各阻害剤とその同起源のセリン
プロテアーゼ間の特異的な相互作用において顕著な類似
性があることが明らかになる。本発明においてこの構造
的類似性により、結晶構造が得られない場合でも阻害剤
及びそれと同起源のセリン プロテアーゼの間に起きる
アミノ酸相互作用を予測することができるということを
示唆した。

上記の議論の通り阻害剤は活性中心を含み、それがセ
リン プロテアーゼの活性部位に対する拮抗基質とな
る。活性中心のP₁−P₁残基（例えばPAI−１の場合ARG
₃₄₆−Met₃₄₇）間のペプチド結合への攻撃によりセリン
プロテアーゼからの生成物の正常で迅速な解離が起こ
らず、おそらくプロテアーゼの活性部位のセリン及び阻
害剤のP₁残基の間の共有結合の形成により安定なセリン
プロテアーゼ−インヒビター複合体が確立される（La
skowski,M.等,Ann.Rev.Biochem.,49:593−626（198
0））。この機構は、PAI−１などの阻害剤の活性中心が
セリン プロテアーゼの活性部位に緊密に、正確に適合
しなければならないこを示す。しかしこれまでPAI−
１、それと同起源のセリン プロテアーゼ、ｔ−PA、又
はｔ−PA/PAI−１複合体についてのＸ−線結晶学的デー
タはない。従ってこのタンパク質の対の間の相互作用の
正確な性質は未知である。他のセルピン、又はセルピン
−セリン プロテアーゼ複合体の構造についての情報も
同様に不足している。

IV.セリン プロテアーゼの利用 キモトリプシン スーパーファミリーの特に重要なセ
リン フロテアーゼはｔ−PAである。ｔ−PAは直接作用
して血栓（血餅）を溶解するわけではないが、心筋梗
塞、肺塞栓症、及び重症の静脈血栓の治療に、冠動脈内
又は静脈内投与によって現在使用されている。ｔ−PAは
プラスミノーゲンのArg₅₆₀及びVal₅₆₁の間のペプチド結
合の分裂を促進し（Robbins,K.C.等,J.Biol.Chem.,242:
2333−2342（1967））、それにより不活性なチモーゲン
を強力であるが非特異的なプロテアーゼ、プラスミンに
変換し、それが血餅のフィブリンの網目を分解する（Ba
chmann,F.等,Semin.Throm.Haemost.,43:77−89（198
4）;Gerard,R.D.等,Mol.Biol.Med.,3:449−557（198
6）；及びVerstraete,M.等,Blood,67:1529−1541（198
6））。

ｔ−PAは必ずしも全身的にフィブリノーゲンを枯渇さ
せることなく局部的なフィブリン溶解現象を起こす。こ
れはｔ−PAがフィブリンに直接結合しフィブリン−ｔ−
PA複合体を形成することができ、そのプラスミノーゲン
に対する親和力が約500倍に増加するからである。（Ran
br,M.等,Biochem.Biophys.Acta,704:461−469（198
2）；及びRijken,D.C.等,J.Biol.Chem.,257:2920−2925
（1982））。このようにプラスミノーゲンも高濃度で存
在する（Wiman,B.等,Nature.272:549−550（1978））冠
動脈血栓に、静脈内投与されたｔ−PAが結合すると血栓
の部位でプラスミンが有効に製造され、そこで最高に働
く。

現在、ｔ−PAは最初にボーラスの形態で投与され、そ
の後一定の注入を続ける。３時間の標準の治療の間に投
与される酵素の合計量は一般に約50−100mgである。２
つの理由でこのような大量を必要とすることが明白であ
る：第１に、肝細胞による循環からの急速なｔ−PAのク
リアランスの効果を補うため（Krause,J.,Fibrinolysi
s,２:133−142（1988））、及び第２に、血漿及び血小
板中に存在する比較的高濃度のセリン プロテアーゼ
インヒビターの影響を克服するため（Carrell,R.W.等，
於:Proteinase Inhibitors,出版Barrett,A.J.等,Elsev
ier,Amsterdam,頁403−420（1986））。

ｔ−PAの主な生理学的阻害剤はセルピン、PAI−１、
約50kdの糖タンパク質である（Pannekoek,H.等,EMBO
J.,５:2539−2544（1986）;Ginsberg,D.等,J.Clin.Inve
st.,78:1673−1680（1980）；及びCarrell,R.W.等，於:
Proteinase Inhibitors,出版Barrett,A.J.等,Elsevie
r,Amsterdam,頁403−420（1986））。PAI−１は心筋肉
梗塞から生き残った人からの血漿のフィブリン溶解現象
の能力が減少している原因とされてきた（Hamsten,A.
等,New Eng.J.Med.,313:1557−1563（1985））。さら
にPAI−１は急性期反応性タンパク質であり、心筋梗塞
に伴いその量が増加することにより、治療のためのｔ−
PAの注入後に血漿中に残った実質的量のｔ−PAのフィブ
リン溶解現象活性を減衰させうる（Lucore,C.L.等,Cir
c.,77:660−669（1988））。PAI−１とｔ−PAの結合の
２次速度定数は非常に高く（Hekman,C.等,Arch.Bioche
m.Biophys.,262:199−210（1988））、人の血漿による
ｔ−PAの最初の“急速相（fast−phase）”阻害を説明
している（Colucci,M.等,J.Lab.Clin.Med.,108:53−59
（1986））。従ってインビボにおけるPAI−１によるｔ
−PAの急速な中和は、急性心筋梗塞の治療をした10％か
ら35％の患者が冒される合併症である、血栓分解治療後
の冠動脈レステノシスに寄与しうる（Chesebro,J.H.等,
Circ.,76:142−154（1987））。

Clエステラーゼ インヒビター、及びアルファ−２−
アンチプラスミンなどの他のセルピンとｔ−PAの結合定
数はPAI−１の場合より低次数であるが（Ranby,M.等,Th
rom.Res.,27:175−183（1982）；及びHekman,C.等,Arc
h.Biochem.Biophys.,262:199−210（1988））、それに
もかかわらずこれらのセルピンは注入されたｔ−PAと結
合し、ｔ−PAの有利な薬理学的性質を減衰させることが
できる。

ｔ−PA及びPAI−１の他に多くのセリン プロテアー
ゼ−セルピンの対が医学的に非常に重要である。例えば
ｕ−PAはｔ−PAと同様に心筋梗塞の治療に有用であり、
ｔ−PAと同様のセリン プロテアーゼ インヒビターに
よる阻害を受ける。

傷における血餅形成の促進に局所的に使用されるセリ
ン プロテアーゼであるトロンビンはプロ凝固剤であ
る。それと同起源のセルピンである、アンチトロンビン
III、トロンビン、及び因子IX a,X a,XI a及びXII aを
含む血液凝固カスケードに関与する多くのセリン プロ
テアーゼを特異的に阻害する凝固防止剤である（Heimbu
rger,N.等，於:Proceedings of the International
Research Conference on Proteinase Inhibitor
s,出版Fritz,H.等,Walter de Gruyter,New York,頁
１−22（1971）;Kurachi,K.等,Biochem.,15:373−377
（1976）;Kirachi,K.等,Biochem.,16:5831−5839（197
7）；及びOsterud,B.等,Semin.Thromb.Haemost.,35:295
−305（1976））。アンチトロンビンIIIは播種性血管内
血液凝固の治療に使用されてきた。トロンビンによりプ
ロテインＣを活性化すると、活性化プロテインＣが凝固
因子V a及びVIII aを不活性化し、それ自身はそれと同
起源のセルピン、プロテインＣインヒビターにより阻害
されるので血液凝固過程の自己制限が起こる。

子宮収縮を起こす、血管の浸透性を増す、及び血液凝
固の内部経路を起こす機能を持つカリクレインは、比較
的重要なセルピンのひとつであるアルファ−１−アンチ
トリプシンにより阻害を受ける。

アルファ−１−アンチトリプシンはトリプシンと同様
に白血球エラスターゼ、及びカテプシンも阻害する（He
imburger,N.等，於:Proceedings of the Internatio
nal Research Conference on Proteinase Inhibit
ors,出版Fritz,H.等,Walter de Gruyter,New York,
頁１−47（1971）;Janoff,A.,Am.Rev.Resp.Dis.,105:12
1−127（1972）；及びOhlsson,K.等,Eur.J.Biochem.,3
6:473−481（1973））。アルファ−１−アンチトリプシ
ンの遺伝子欠失は直接気腫に関連し（Carrell,R.W.等,T
rends Biochem.Sci.,10:20−24（1985）、従ってアル
ファ−１−アンチトリプシン置換が気腫の治療に使用さ
れてきた（Marx,J.L.,Science,243:315−316（198
9））。

発明の要約 従って本発明の目的は、キモトリプシン スーパーフ
ァミリーの野生型セリン プロテアーゼ、特に野生型ｔ
−PAをタンパク質工学により改良し、必ずしも他の有利
な薬理学的性質を変えることなくその酵素有効性を増
し、及び／又は必要な投薬量を変えることである。

本発明もうひとつの目的はキモトリプシン スーパー
ファミリーの改良セリン プロテアーゼをコードする遺
伝子の提供である。

本発明のさらに別の目的は特にセルピン ファミリー
の野生型セリン プロテアーゼ インヒビター、特に野
生型PAI−１を変え、それらの阻害有効性を増し、及び
／又はその投薬必要量を変え、本発明の変異セリン プ
ロテアーゼを阻害することができるようにすることであ
る。

本発明のさらに別の目的は改良セリン プロテアーゼ
インヒビターをコードする遺伝子を提供することであ
る。

本発明のこれらの、及び他の目的は、同起源の阻害剤
による阻害に対して抵抗性であるキモトリプシン スー
パーファミリーのセリン プロテアーゼ変異株；及びそ
れをコードする遺伝子；ならびにセリン プロテアーゼ
インヒビター抵抗性セリン プロテアーゼを阻害する
セリン プロテアーゼ イヒビター変異株；及びそれを
コードする遺伝子により満たされ、これは下文に示す本
発明の詳細な説明により明らかとなるであろう。

図の簡単な説明 図１はキモトリプシン スーパーファミリーの種々の
セリン プロテアーゼの配列の比較を示す。配列は、保
持されたアミノ酸の重複が示されるように並べた。トリ
プシン上の数字はプロテイン データ バンクのPDB3pt
p.entエントリーで使用されている番号付による。ｔ−P
A上の数字は成熟ｔ−PA分子におけるアミノ酸による。

図２はセリン プロテアーゼ インヒビターのセルピ
ン ファミリーの種々のメンバーの配列の比較を示す。
配列は保持されたアミノ酸の重複がわかるように並べ
た。アルファ−１−アンチトリプシン下の数字、及びPA
I−１上の数字は成熟分子におけるアミノ酸残基によ
る。

図３は野生型ｔ−PA、及び本発明のｔ−PAのセルピン
−抵抗性変異株の変異、及び発現に用いられたベクター
構築を図示したものである。

図４は野生型ｔ−PA及びｔ−PAのセルピン−抵抗性変
異株の活性の間接的色素澱粉法における比較を示す。図
４で■は野生型ｔ−PAを示し、○はｔ−PA（R₃₀₄−＞
Ｓ）を示し、□はｔ−PA（R₃₀₄−＞Ｅ）を示し、・はｔ
−PA（Del_296-302）を示す。

図５は間接的色素澱粉法による野生型ｔ−PA、及びｔ
−PAのセルピン−抵抗性変異株の活性に対するPAI−１
の効果を示す。図５において、■は野生型ｔ−PAを示
し、○はｔ−PA（R₃₀₄−＞Ｓ）を示し、□はｔ−PA（R
₃₀₄−＞Ｅ）を示し、・はｔ−PA（Del_296-302）を示
す。

図６は間接的色素澱粉法による野生型ｔ−PA、及びｔ
−PAのセルピン−抵抗性変異株の活性の比較を示す。図
６において、□はｔ−PA（H₂₉₇−＞Ｙ）を示し、・は野
生型ｔ−PAを示し、＋はｔ−PA（K₂₉₆−＞Ｅ）を示し、
■は三重変異株ｔ−PA（K₂₉₆,R₂₉₈,R₂₉₉−＞E,E,E）を
示し、▲はｔ−PA（R₂₉₉−＞Ｅ）を示し、△はｔ−PA
（R₂₉₈−＞Ｅ）を示し、○はｔ−PA（P₃₀₁−＞Ｇ）を示
す。図７は間接的色素澱粉法による野生型ｔ−PA、及び
ｔ−PAのセルピン−抵抗性変異株の活性に対するPAI−
１の効果を示す。図７において、□はｔ−PA（H₂₉₇−＞
Ｙ）を示し、・は野生型ｔ−PAを示し、＋はｔ−PA＝K
₂₉₆−＞Ｅ）を示し、■はｔ−PA（K₂₉₆,R₂₉₈,R₂₉₉−＞
E,E,E）を示し、▲はｔ−PA（R₂₉₉−＞Ｅ）を示し、△
ｔ−PA（R₂₉₈−＞Ｅ）を示し、○はｔ−PA（P₃₀₁−＞
Ｇ）を示す。

図８は野生型PAI−１、及び本発明のPAI−１の変異株
の変異、及び発現に使用したベクターの構築を図示した
ものである。

発明の詳細な説明 上記で議論した通り、本発明の上記の目的は、それら
と同起源の阻害剤による阻害にたいして抵抗性を持つキ
モトリプシン スーパーファミリーのセリン プロテア
ーゼ変異株；及びそれをコードする遺伝子を用いたひと
つの具体化により達成することができた。

本発明のもうひとつの具体化において、本発明のセリ
ン プロテアーゼ インヒビター−抵抗性セリン プテ
アーゼを阻害するセリン プロテアーゼ インヒビター
変異株；及びそれをコードする遺伝子により上記の目的
を達成した。

さらに別の具体化において、本発明のセリン プロテ
アーゼ インヒビター変異株はキモトリプシン スーパ
ーファミリーの野生型セリン プロテアーゼをも阻害す
る。

エンドペプチダーゼのこのセリン プロテターゼ サ
ブ−サブクラスをメンバーはすべて相同タンパク質であ
り、共通の作用機構を有するので、本発明において使用
するキモトリプシン スーパーファミリーの特定のセリ
ン プロテアーゼはここで重要ではない。そのようなキ
モトリプシン スーパーファミリーのセリン プロテア
ーゼの特別な例には上記で上だけセリン プロテアー
ゼ、すなわちｔ−PA、トリプシン、トリプシン−様プロ
テアーゼ、キモトリプシン、プラスミン、エラスター
ゼ、ｕ−PA、アクロシン、活性化プロテインＣ、Clエス
テラーゼ、カテプシンＧ、チマーゼ、及びカリクレイ
ン、トロンビン、及び因子VII a,IX a,X a,XI a,ならび
にXII aを含む血液凝固カスケードのプロテアーゼが含
まれる。本発明において使用した好ましいキモトリプシ
ン スーパーファミリーのセリン プロテアーゼはｔ−
PAである。

キモトリプシン スーパーファミリーの変異セリン
プロテアーゼが阻害にたいして抵抗性を示す特定のセリ
ン プロテアーゼ インヒビターは本発明において重要
ではない。そのようなインヒビタターの例にはBPTIファ
ミリー、Kazalファミリー、SSIファミリー、セルピン
ファミリー、大豆トリプシン インヒビター（Kunitz）
ファミリー、ポテト インヒビター ファミリー、及び
ボーマン−バーク ファミリーのメンバーが含まれる。

キモトリプシン スーパーファミリーの変異セリン
プロテアーゼが阻害に対して抵抗性を示す特定のBPTIイ
ンヒビターは本発明において重要ではない。そのようBP
TIインヒビターの例にはBPTI、ヘビ毒インヒビター、イ
ンターアルファ インヒビター、及びA4アミロイド前駆
体A4695が含まれる。

キモトリプシン スーパーファミリーの変異セリン
プロテアーゼが阻害に対して抵抗性を示す特定のKazal
インヒビターは本発明において重要ではない。そのよう
なKazalインヒビターの例にはすい臓分泌インヒビタ
ー、オボムコイド、及び精漿アクロシン インヒビター
が含まれる。

キモトリプシン スーパーファミリーの変異セリン
プロテアーゼが阻害に対して抵抗性を示す特定のセルピ
ン インヒビターは本発明において重要ではない。その
ようなセルピン インヒビターの例にはPAI−1,PAI−2,
PAI−３、Clエステラーゼ インヒビター（CIinh），プ
ロテインＣインヒビター（PCinh）、ヘパリン補因子II
（HCII）、アルファ−２−アンチプラスミン（A2AP）、
アンチトロンビンIII（ATIII）、アルファ−１−アンチ
トリプシン（A1AT）、プロテアーゼ ネクシンＩ（Nex
−１）、コントラプシン（Cntrps）、成長ホルモン調節
タンパク質（GHRP）、及びアルファ−１−アンチキモト
リプシン（AChym）が含まれる。キモトリプシン ファ
ミリーのセリン プロテアーゼが阻害に対して抵抗性を
示す好ましいセルピンはPAI−１である。

本発明のキモトリプシン スーパーファミリーのセリ
ン プロテアーゼ インヒビター−抵抗性セリン プロ
テアーゼを阻害することができる変異セリン プロテア
ーゼ インヒビターをそれから誘導することができる特
定のセリン プロテアーゼ イヒビターは、本発明にお
いて重要ではない。そのようなセリン プロテアーゼ
インヒビターの例にはBPTI、Kazal、SSI、Kunitz、ポテ
ト インヒビター、ボーマン−バーク インヒビター、
及びセルピン ファミリーのメンバーが含まれ、PAI−
１、PAI−２、PAI−３、Clエステラーゼ インヒビタ
ー、プロテインＣ インヒビター、ヘパリン補因子II、
アルファ−２−アンチプラスミン、アンチトロンビンII
I、アルファ−１−アンチトリプシン、プロテアーゼ
ネクシンＩ、コントラプシン、成長ホルモン調節タンパ
ク質、及びアルファ−１−アンチキモトリプシンなどの
セルピン ファミリーのセリン プロテアーゼ インヒ
ビターが好ましい。キモトリプシン スーパーファミリ
ーのセリン プロテアーゼ インヒビター−抵抗性セリ
ン プロテアーゼを阻害する好ましい変異セルピンはPA
I−１である。

すべての周知のセリン プロテアーゼ インヒビター
はその活性中心ループにおいて構造的に相同であり、そ
れらと同起源のセリン プロテアーゼと類似の相互作用
を行う（Read,R.J.等，於:Proteinase Inhibitors、出
版Barrett,A.J.等,Elsevier,Amsterdam,頁301−336（19
86））。セリン プロテアーゼ、及びセリン プロテア
ーゼ インヒビターの間の構造における対応はこれまで
に研究されたことのない複合体のモデルの構築に利用す
ることができる。

ｔ−PA、及び他のセリン プロテアーゼの触媒ドメイ
ンの間の構造的相同性が高いので（Blundell,T.等,Natu
re,326:347−352（1987））、本発明においてトリプシ
ン、及びBPTI間の複合体の周知の構造（Huber,R.等,J.M
ol.Biol.,89:73−101（1974）；及びBode,W.等，於Prot
eolysis and Physiological Regulation,Academic
Press,New York,頁43−76（1976））がｔ−PA及びPAI
−１の間の相互作用のモデルとなり得ると仮定した。主
な確認部位のアミノ酸以外にBPTIと直接接触するトリプ
シンのアミノ酸はポリペプチド鎖の２つの別の領域に位
置する（残基37−41、及び210−213）（図１参照）。

アミノ酸残基₂₁₄SWGS₂₁₇の周知の領域はキモトリプシ
ン スーパーファミリーのすべてのメンバーの間に高度
に保持されている。反対にアミノ酸残基₃₆NSGYHF₄₁の周
囲の領域は比較的変化し易く、インヒビターと相互作用
を行う表面の部分を形成する。図１に示される通りこの
領域のｔ−PAのアミノ酸配列は２つの大きな点でトリプ
シンのアミノ酸配列と異なる。第１にトリプシンのTyr
（Y₃₉）残基がｔ−PAにおいてはArg（R₃₀₄）で置換され
ている。ｔ−PA及びPAI−１の間の相互作用がトリプシ
ン及びBPTIの間の相互作用を模倣しているという仮定に
基づくモデリングはｔ−PAのR₃₀₄がPAI−１のGlu
（E₃₅₀）残基と塩橋を形成することを示唆する。このPA
I−１のGlu残基の位置は、トリプシンのY₃₉とファン
デル ワールス結合を形成するBPTIのI₁₉に対応する
（下表VII）（Huber,R.等,J.Mol.Biol.,89:73−101（19
74））；及びBode,W.等，於:Proteolysis and Physio
logical Regulation,Academic Press,New York,頁43
−76（1976））。従ってPAI−１のE₃₅₀はｔ−PAのR₃₀₄
とイオン対を形成すると思われる。

第２にｔ−PAは、ｔ−PA（R₃₀₄）及びPAI−１
（E₃₅₀）の間の接点と思われる位置に隣接して位置する
余分な７個のアミノ酸（₂₉₆KHRRSPG₃₀₂,図１を参照）を
有する。これらの７個のアミノ酸の中の４個は正に帯電
しており、PAI−１（₃₅₀EEIIMD₃₅₅）の相補的領域と思
われる領域は３個の負に帯電した残基を含む。本発明に
おいては、これらの領域間の静電的相互作用がｔ−PA及
びPAI−１の間の複合体の形成、及び安定化に重要な役
割を果たし得ると思われた。逆にｔ−PAがその基質であ
る、同領域に負に帯電した残基を持たないプラスミノー
ゲン（PLG）と相互作用を行う場合はこのような相互作
用が起こり得ない（上記表VIIを参照）。

図１に示すようなキモトリプシン スーパーファミリ
ーの種々のセリン プロテアーゼの配列の比較は、キモ
トリプシン スーパーファミリーの種々のセリン プロ
テアーゼの１種類又はそれ以上の変異を設計してそれら
と同起源の野生型阻害剤による阻害に対して抵抗性とす
るための指針として使用することができる。ｔ−PAと同
様に図１に示すキモトリプシン スーパーファミリーの
他のセリン プロテアーゼは、重要な結合残基（トリプ
シンのY₃₉）、及び結合残基に隣接して位置する種々の
大きさの挿入残基を含む点でトリプシンと異なる。従っ
て変異の候補の例には以下が含まれる： （ｉ）他のセリン プロテアーゼにおいてトリプシンの
Tyr（Y₃₉）（BPTIのIle（I₁₉）と結合し、従って２個の
タンパク質問の相互作用において重要な役割を果たす残
基）の位置に対応する位置を占めるアミノ酸残基。例え
ばプラスミンにおいて、Met（Ｍ）残基はトリプシンのY
₃₉に対応する位置を占める。このMet残基を電荷、又は
大きさなどの性質の異なる他のアミノ酸（例えばGlu
（Ｅ））に変異させると。プラスミンのアンチプラスミ
ンによる不活性化に対する感受性がなくなるか、又は減
少することが期待されるが、使用する特定の置換アミノ
酸は本発明において重要でない。同様にトロンビンのGl
n（Ｑ）残基（トリプシンのY₃₉に対応する位置を占め
る）を電荷、又は大きさなどの性質が異なる別のアミノ
酸（例えばAsp（Ｄ））に変異させると、トロンビンの
アンチトロンビンIIIによる不活性化に対する感受性が
なくなる。又は減少することが期待されるが、使用する
特定の置換アミノ酸は本発明において重要ではない；及
び （ii）トリプシンには存在せず、分子の表面の小さい挿
入として活性部位の近辺に位置するキモトリプシン ス
ーパーファミリーの他のセリン プロテアーゼの残基
（図１を参照）。例えばプラスミンは結合残基に隣接し
てｔ−PAの₂₉₆KHRRSPG₃₀₂により締められている位置が
対応する位置に、２個のアミノ酸（RF）の挿入を含む。
これらの２個のアミノ酸のどちらか、又は両方の欠失、
又は置換、あるいは少量の別のアミノ酸の挿入による変
異により、必ずしもセリン プロテアーゼの触媒部位に
影響することなく疎外剤との相互作用を失わせる。又は
減少させることが期待される。もうひとつの例として、
ｕ−PAは結合残基に隣接してｔ−PAの₂₉₆KHRRSPG₃₀₂に
より占められている位置に対応する位置に６個のアミノ
酸（RHRGGS）の挿入を含む。これらの６個の残基の変
異、又は欠失は変異ｔ−PA（Del_296-302）の場合に観察
される相互作用と類似の方法によるセリン プロテアー
ゼ インヒビターとの相互作用が減少する、又はなくな
ることが期待される。

同様に、セリン プロテアーゼ インヒビターの活性
中心内の領域は非常に変化し易く、セリン プロテアー
ゼと相互作用を行う表面の部分を形成する。図２に示す
ようなセルピン ファミリーの種々のセリン プロテア
ーゼ インヒビター配列の比較は種々のセリン プロテ
アーゼ インヒビターにおいて、特にセリン プロテア
ーゼ インヒビターのセルピン ファミリーのメンバー
に、本発明のキモトリプシン スーパーファミリーのセ
リン プロテアーゼ インヒビター−抵抗性セリン プ
ロテアーゼを有効に阻害することができるような１種類
かそれ以上の変異を起こす設計の指針として利用するこ
とができる。PAI−１と同様に図２に示した他のセルピ
ン ファミリーのメンバーは、重要な結合アミノ酸残基
（PAI−１のE₃₅₀）における配列が異なり、結合残基に
隣接した位置に種々の大きさの挿入を含む（下表VIIIを
参照）。

従って変異の候補の例には以下が含まれる： （ｉ）他のセリン プロテアーゼ インヒビターにおい
て、PAI−１のGlu（E₃₅₀）（ｔ−PAのArg（R₃₀₄）と結
合し、従って２個のタンパク質の相互作用において重要
な役割を果たす残基）の位置に対応する位置（P4′）を
占めるアミノ酸残基。本発明においては、ｔ−PAにおけ
るR₃₀₄−＞Ｅ変異の構築によりこわれた静電的相互作用
を復活させるためにPAI−１（E₃₅₀）のGlu残基をArg
（Ｒ）に変異させた。このセルピンにおける特異的な変
異は、セリン プロテアーゼに導入され野生型セルピン
による阻害に対する抵抗性を与えた変異と相補的である
ように構築された。セルピンにおけるこの相補的E₃₅₀−
＞Ｒ変異はセルピンに本発明のキモトリプシン スーパ
ーファミリーのセリン プロテアーゼ インヒビター−
抵抗性セリン プロテアーゼを阻害する能力を与えるた
めに特別に選んだ；しかし使用した特定の置換アミノ酸
は本発明に対して重要ではない。例えばトリプシンのY
₃₉に対応するプラスミンのMet（Ｍ）残基（図１参照）
を電荷又は大きさなどの性質の異なる別のアミノ酸（上
記の例のようにGlu（Ｅ））に変え、変異プラスミンが
野生型アルファ−２−アンチプラスミンによる阻害に対
する感受性の減少を示した場合、アルファ−２−アンチ
プラスミンのP4′Ser（Ｓ）残基を、プラスミンにおい
て代わったGlu残基と相互作用のできる他のアミノ酸
（例えばArg（Ｒ））に変異させると、変異アルファ−
２−アンチプラスミンによる不活性化に対する変異プラ
スミンの感受性が復活することが期待される。同様にト
ロンビンの変異に関する上記の例のようにトロンビンの
Glu（Ｑ）残基Asp（Ｄ）に変えた場合、アンチトロンビ
ンIIIのP6′Arg（Ｒ）残基をGlu（Ｅ）に変異させると
変異アンチトロンビンIIIによる阻害に対する野生型イ
ンヒビター−抵抗性トロンビンの感受性が復活すること
が期待される； （ii）同種のセリン プロテアーゼとの相互作用表面を
形成する、種々のファミリーのセリン プロテアーゼ
インヒビターの他のメンバーの活性中心内の余分な残
基。セリン プロテアーゼ インヒビターのセルピン
ファミリーに関してこれらの残基を上記の表VIIIに示
す。

例えばアルファ−２−アンチプラスミンは活性中心の
PAI−１の₃₄₈APEEIIMD₃₅₅に対応する位置に配列SLSSFSV
Nを含む。これらの８個アミノ酸のいずれかの置換によ
り、又は少量の別のアミノ酸の挿入により変異を起こす
と、これらの置換又は挿入が電荷、大きさ、あるいは嫌
水性などの性質において、セリン プロテアーゼに導入
されて最初に野生型セルピンに対する抵抗性を与えたア
ミノ酸残基と相補的であれば、セリン プロテアーゼと
の相互作用を復活することが期待される。

本発明の変異セリン プロテアーゼ、及び変異セリン
プロテアーゼ インヒビターは、例えばトリゴヌクレ
オチド−媒介突然変異誘発などの周知の方法により製造
することができる（Zoller,M.等,DNA,3:479−488（198
4）;Kunkel,T.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488−492
（1985）；及びKunkel,T,等,Current Protocols in
Molecular Biology,Green Publishing Associates
＆ Wiley Interscience,New York（1987））。しか
もセリン プロテアーゼ、又はセリン プロテアーゼ
インヒビターに変異を起こす正確な方法は本発明にとっ
て重要ではない。

本発明の変異セリン プロテアーゼは、Lotteneberg,
R.等,Meth.Enzymol.,80:341−361（1981）に記載の方法
などの周知のアッセイを用いて所望の性質、すなわちセ
リン プロテアーゼ活性、及び同起源の阻害剤による阻
害に対する抵抗性を持つセリン プロテアーゼに関して
スクリーニングを行うことができる。

本発明の変異セリン プロテアーゼ インヒビター
は、Lottenberg,R.等,Meth.Enzymol.,80:341−361（198
1）:Holmes,W.E.等,Bilchem.,26:5133−5140（1987）；
及びHekman,C.M.等,Arch.Biochem.Bilphys.,262:199−2
10（1988）に記載の方法などの周知のアッセイを用いて
所望の性質、すなわち本発明のセリン プロテアーゼ
インヒビター−抵抗性セリン プロテアーゼに対するセ
リン プロテアーゼ インヒビター活性を有するセリン
プロテアーゼ イヒビターに関してスクリーンニング
を行うことができる。

本文に記載する研究は、セリン プロテアーゼを突然
変異誘発により修正し、キモトリプシン スーパーファ
ミリーのセリン プロテアーゼ、及びそれと同起源の阻
害剤の間の相互作用を減少させる。又はなくすことが可
能であることを初めて示すものである。これにより変異
セリン プロテアーゼは同起源の阻害剤の存在下で野生
型の酵素より酵素活性が多く残り、残留活性の量はそれ
と同起源の阻害剤との相互作用が阻害される程度に依存
している。そのような変異セリン プロテアーゼの投与
は多種類の臨床的、及び商業的用途において有益である
と思われる。例えば活性化プロテインＣの変異型は、血
液の凝固を阻害するのが有利である場合有用でると思わ
れ、本分の実施例１に記載のｔ−PAの変異型が、フィブ
リン溶解現象を延長する必要がある場合に血栓性の異常
のある患者の循環におけるｔ−PAの有効寿命を延ばすの
に有用であると思われるのとちょうど同じである。

本分に記載した研究は又、セリン プロテアーゼ イ
ンヒビターを突然変異誘発により修正し、セリン プロ
テアーゼ インヒビターの構造を適切に変化させること
により、キモトリプシン スーパーファミリーのセリン
プロテアーゼ インヒビター−抵抗性変異セリン プ
ロテアーゼ、及びそれと同起源のセリン プロテアーゼ
インヒビター間の相互作用を機能的に復活させること
が可能であることを初めて示すものである。これにより
同起源の野生型セリン プロテアーゼ インヒビターが
存在する場合より急速に変異セリン プロテアーゼを不
活性化することができ、阻害の速度は変異セリン プロ
テアーゼとの相互作用が復活した程度に依存する。この
ような変異セリン プロテアーゼ インヒビターの投与
は、多種の臨床的及び商業的用途においてセリン プロ
テアーゼ インヒビター−抵抗性セリン プロテアーゼ
の活性を制限するのに有益であると思われる。例えばプ
ロテインＣ インヒビターの変異型は、活性化プロテイ
ンＣの変異型の存在下で血液の凝固を促進するのが有利
であるような場合に有用であると思われる。同様にPAI
−１の変異型は、侵入的な方法が必要な場合に、血栓性
異常の治療をした患者の循環においてセリン プロテア
ーゼ インヒビター−抵抗性ｔ−PA、例えばｔ−PA（R
₃₀₄−＞Ｅ）の有効寿命を短縮するのに有用であると思
われる。従ってこのような変異セリン プロテアーゼ
インヒビターはセリン プロテアーゼ インヒビター−
抵抗性セリン ピロテアーゼの解毒薬として使用するこ
とができる。

臨床的用途において投与すべき本発明の変異セリン
プロテアーゼの量は使用する特定の変異セリン プロテ
アーゼ、所望するセリンプロテアーゼの治療効果、及び
性別、年令、体重、ならびにプロテアーゼを投与する患
者の生理学的条件などの因子に依存するであろう。変異
セリン プロテアーゼの使用量は日常的実験により決定
することができる。

臨床的用途において投与するべき本発明の変異セリン
プロテアーゼ インヒビターの量は使用する特定の変
異セリン プロテアーゼ インヒビター、所望するセリ
ン プロテアーゼ インヒビターの治療効果、及び性
別、年令、体重、ならびにセリン プロテアーゼ イン
ヒビターを投与する患者の生理学的条件などの因子に依
存するであろう。変異セリン プロテアーゼ インヒビ
ターの使用量は日常的実験により決定することができ
る。

本発明の変異ｔ−PAは適したインビトロ、及びインビ
ボ モデルにおける試験、ならびに臨床試験により決定
した通りに投与しなければならない。必要な投薬量は野
生型ｔ−PAの場合の必要量の10−1000分の１となるであ
ろうと思われる。

本発明の変異PAI−１も適したインビトロ、及びイン
ビボ モデルにおける試験、ならびに臨床試験により決
定した通りに投与しなければならない。必要な投薬量は
変異ｔ−PAの場合に必要な量と大体同じであろうと思わ
れる。

本発明の変異セリン プロテアーゼは文献により周知
のいずれの製薬上許容できるキャリヤー、又は希釈剤、
例えば生理食塩溶液と共にでも投与することができる
（Lucore,C.L.等,Circ.77:660−669（1988）；及びChes
ebro,J.H.等,Circ.,76:142−154（1987））。

本発明の変異セリン プロテアーゼの特定の投与形態
はその特定の用途に依存する。そのような投与形態の例
には、静脈内又は腹腔内注射、冠動脈内注入、局所的適
用、及びテーロゾル吸入が含まれる。

本発明の変異セリン プロテアーゼ インヒビターの
特定の投与形態その特定の用途に依存する。そのような
投与形態の例には、静脈内又は腹腔内注射、冠動脈内注
入、局所的適用、及びエーロゾル吸入が含まれる。

以下の実施例は説明のみを目的としており、本発明の
範囲をどのようにも制限するものではない。

実施例１ ｔ−PA変異株 本実施例に記載する方法はセリン プロテアーゼとし
てｔ−PAを使用し、同起源のセリン プロテアーゼ イ
ンヒビターとしてPAI−１を使用する場合を対象とする
が、上記のようなキモトリプシン スーパーファミリー
の他のセリン プロテアーゼ、及び上記のようなそれと
同起源の阻害剤も本発明の精神と範囲から逸脱すること
なく本文に記載の方法により容易に使用することができ
る。

A. 突然変異誘発のためのｔ−PA部の選択 ｔ−PAの残基Arg₃₀₄及び（₂₉₆KHRRSPG₃₀₂）がPAI−１
と相互作用をするという仮定を試験するため、オリゴヌ
クレオチド−媒介突然変異誘発を用いて下表IXに示すｔ
−PAの３種類の変異型を製造した。

変異ｔ−PA（Del_296-302）は上記で議論した、トリプ
シンには存在しない７個のアミノ酸挿入を含まず、同起
源のセリン プロテアーゼ インヒビター、PAI−１と
相互作用する部分のｔ−PA配列を完全に除去して構築し
た。変異株ｔ−PA（R₃₀₄−＞Ｓ）及びｔ−PA（R₃₀₄−＞
Ｅ）はArg₃₀₄がそれぞれSer及びGluに置換されており、
正に帯電したArg残基を選択的に変え、それと同起源の
セリン プロテアーゼ インヒビター、PAI−１との相
互作用を除去するように選んだ。R₃₀₄に対して、電荷対
相互作用の欠落のために同起源のセリン プロテアーゼ
インヒビターに対する感受性の減少したｔ−PAを与え
る種々の他の置換を行うことができる。例えばループ中
の正に帯電した残基（残基296−302）を負に帯電した、
又は中性のアミノ酸に変える点変異は、ｔ−PA及びPAI
−１の間の相互作用を妨げる、減少させる、又は不安定
化すると予測される。P₃₀₁をGly（Ｇ）以外の他のアミ
ノ酸で置換することにより類似の結果を得ることができ
る。さらに残基304と305の間、又は残基296と305の間の
どこかに、PAI−１の残基と全く相互作用しない約１−
６個のアミノ酸の系列を挿入するように挿入変異を行う
ことができる。異なる置換、及び／又は置換、挿入及び
欠失の組み合わせは、ｔ−PAとPAI−１の相互作用に異
なる程度で影響し、すれによっては特定の用途、又は臨
床的条件に適する性質を持った種々のｔ−PAを製造する
ことができるであろう。

B. ｔ−PAのオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発 ｔ−PAのオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発は基
本的にZoller,M.等,DNA,３T:479−488（1984）の記載に
従い、Kunkel,T.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488−492
（1985）；及びKunkel,T.等,Current Protocols in
Molecular Biology,Green Publishing Associates
＆ Wiley Interscienc,New York（1987）による修正
により行った。

第１に、ヒトのｔ−PA全長をコードするcDNAをクロー
ニングした複写を含むプラスミドpSVT7（RI^-）/t−PA
を、Sambrook,J.等,Mol.Biol.Med.,３:459−481（198
6）に従って用意した。pSVT7（RI^-）/t−PAはpSVT7の誘
導体である（Bird.P.M.等,J.Cell Biol.,105:2905−29
14（1987））（図３を参照）。

pSVT7はpKC3から構築した。pKC3は、Ava I部位からEc
oR I部位までのpBR322−誘導配列（これは複製の源、及
びβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む）がpUC8（Messing,
J.,Meth.Enzymol.,101:20−78（1983））の配列に置換
されているpko（Van Doren,K.等,J.Virol.,50:606−61
4（1984））の誘導体である。さらに独特のHind III部
位にポリリンカーが挿入されており、SV40オリジンのPv
u II部位上流がCla I部位に変換されている。ベクターp
SV7はバクテリオファージT7RNAポリメラーゼ特異性プロ
モーターを含む20個の塩基対フラグメント（Pharmacia
Fine Chemicals,Piscataway,NJ）をpKC3の独特のStu
I部位に挿入することによって得た。このSti I部位はS
V40の初期領域から誘導した配列内のSV40配列のヌクレ
オチド5190の位置、初期転写の開始点から下流約30塩基
対にある（Tooze,J.等,DNA Tumor Viruses,Cold Spr
ing Harbor Press,頁813（1981））。

その後E.coli DNAポリメラーゼのクレノウフラグメ
ントを用いてくぼんだ３′−末端を満たすことにより単
一のEcoR I部位をpSVT7から除去した。得られた発現ベ
クターをpSVT7（RI^-）と称する（図３を参照）。

次に野生型ｔ−PAをコードするcDNAをプラスミドpL61
1から切り出し（Sambrook,J.等,Mol.Biol.Med.,３459−
481（1986）;Genetics Institute,Boston,MAから提
供）、pSVT7（RI^-）に挿入した。pL611はｔ−PAのAUG開
始コドンからすぐ上流にNco I及びBamH Iの切断部位を
導入する合成オリゴヌクレオチドを含む。ｔ−PA cDNA
の３′非翻訳配列内の、TGA終結コドンの下流約280塩基
対の位置にBal I部位がある。プラスミドpL611から切り
出したｔ−PA DNAの約1965塩基対Nco I−Bal Iフラグ
メントにXba Iリンカーを加えた。このBco I−Bal Iフ
ラグメントは完全なｔ−PAタンパク質をコードする配列
を含むが、（ｉ）ｔ−PA mRNAの末端３′−非翻訳領
域、及び（ii）ｔ−PA mRNAの５′−非翻訳領域全体、
すなわいSal I部位及びATG開始コドンの間の配列に対応
する配列が欠けている（Pennica,D.等,Nature,301:214
−221（1983））。各末端にXba I、部位を持つｔ−PA
cDNAのフワグメント（Sambrook,J.等,Mol.Biol.Med.,
３:459−481（1986））をpSVT7/t−PAの製造に使用した
（図３を参照）。得られたプラスミドからXba Iを用い
た消化、0.8％（w/v）アガロースゲル電気泳動により精
製により約1970塩基対DNAフラグメントを切り出し、ｔ
−PAのＮ−末端をコードする配列がバクテリオフォージ
T7及びSV40初期プロモーターのすぐ下流におかれるよう
にしてプラスミドpSVT7（RI^-）のXba I部位に挿入し
た。得られたプラスミドをpSVT7（RI^-）/t−PAと称した
（図３を参照）。

その後pSVT7（RI^-）/t−PAをEcoR Iを用いて完全に消
化した。ｔ−PAの472塩基対フラグメント（アミノ酸206
−364を含む領域をコードするヌクレオチド842−1314）
を1.2％（w/v）アガロースゲル電気泳動により精製し
た。このフラグメントを、前以てEcoR Iで消化し、牛腸
アルカリホスファターゼを用いて脱オスホリル化したバ
クテリオファージM13ベクターM13mp18（Yanish−Perro
n,C.等,Gene.33:103−119（1985）の複製型DNAと連結し
た（第３を参照）。

他の特定しない場合は本文に記載するこれらの、及び
他の標準的組み替えDNA法は（ｉ）Maniatis,T.等,Molec
ular Clonig:A Laboratory Manual,第１版,Cold Sp
ring Harbor（1982）、及び（ii）Meth.Enzymol.,152
巻，出版Berger,S.等,Academic Pres,New York（198
7）に記載の要領で行った。

連結DNAをE.coli株TG−１（Gibson,T.,Thesis,Univer
sity of Cambridge,England（1984））にトランスフ
ェクションした。繰り替えバクテリオファージにより形
成された白いプラークを採取し、適切な472塩基対EcoR
Iフラグメントの存在を制限マッピング、サザンハイブ
リッド形成、及びDNA配列決定により確認した。

Kunkel,T.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488−492
（1985）；及びKunkel,T.,Meth.Enzymol.,154:367−382
（1987）の記載に従い、５′−ホスホリル化合突然変異
誘発プライマーを用いて472塩基対EcoR Iフラグメント
における変異を導入した。ｔ−PA変異株の構築に使用し
た３種類の突然変異誘発プライマーの配列は以下であ
る： 上記原案はdut^-,ung^-であるE.coliの株、すなわち株C
J236において製造したDNA鋳型を使用する（Kunkel,T.
等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488−492（1985）；及
びkunkel,T.,Meth.Enzymol.,156:367−382（1987））。
DNA鋳型はチミンの位置に少量のウラシル残基を含む。

突然変異誘発プライマーをインビトロで伸ばした後、
部分的充填環状DNAをdut⁺,ung⁺であるE.coliの株、すな
わちTG−１にトランスフェクトした（Gebson,T.,Thesi
s,University of Cambridge,England（1984））。鋳
型らせん中のウラシル残基を酵素ウラシルＮ−グリコシ
ラーゼの作用によりインビボで除去した。これにより鋳
型らせんに致死損害が加えられ、変異株を迅速に、及び
有効に回収することができる。

特に、ウラシル含有鋳型DNAを上に示した５′ホスホ
リル化突然変異誘発プライマーにアニールした。プライ
マーの伸長はE.coliDNAポリメラーゼのグレノウフラグ
メントを用いて15℃にて12−16時間行った。新規に合成
したらせんをバクテリオファージT4 DNAリガーゼを用
いて突然変異誘発プライマーの５′末端に連結し、不適
正を持つ環を形成した。得られたDNAを用いてE.coli株T
G−１（Gibson,T.Thesis,University of Cambridge,E
ngland（1984））のトランスフェクションを行い、多く
のプラークから一重鎖DANを製造した。これらのDNAの配
列を完全に決定した。その後立証された変異株の複製型
２重鎖DNAを、EcoR Iによる消化、及び1.2％（w/v）ア
ガロースゲルによる電気泳動により単離した。下記に詳
細に記載する通り、変異を含むこれらのウラグメントを
使用して問題のｔ−PA変異株をコードするｔ−PA cDNA
のバージョンを構築した。

C. 変異株ｔ−PAのための発現ベクターの構築 プラスミドpSVT7（RI^-）/t−PAにおけるｔ−PAの変異
株は以下のようにして構築した:t−PA cDNAの中心472
塩基対EcoRIフラグメントをEcoRIによる消化、及び1.2
％（w/v）アガロースゲルによる電気泳動によりpSVT7
（RI^-）/t−PAから除去した。その後残ったプラスミドD
NAの直線状フラグメントをオリゴヌクレオチド−媒介−
突然変異誘発によって作った472塩基対フラグメントの
バージョンに連結した（図３を参照）。得られたプラス
ミドをpSVT7（RI^-）/t−PA（R₃₀₄−＞Ｓ）,pSVT（RI^-）
ｔ−PA（R₃₀₄−＞Ｅ）、及びpSVT7（RI^-）/t−PA（Del
_296-302）を称した。

E.Coli株DH−１（Hanahan,D.等、DNA Cloning,1巻，
出版 Glover,D.M.,I.R.L.Press,Oxford,頁109−135（1
985））を上記の変異株プラスミドを用いて形質転換
し、得られた株をそれぞれpSVT7（RI^-）/t−PA（R₃₀₄−
＞Ｓ）［DH−１］;pSVT7（RI^-）/t−PA（R₃₀₄−＞Ｅ）
［DH−１］；及びpSVT7（RI^-）/t−PA（Del_296-302）
［DH−１］と称した。正しいフラグメントの存在は適し
た放射標識突然変異誘発オリゴヌクレオチドとのハイブ
リッド形式により確認し、フラグメントの配向は適した
突線変異誘発オリゴヌクレオチドをプライマーとして用
いた制限マッピング、およびDNA配列決定により確認し
た。

pSVT7（RI^-）/t−PA（R₃₀₄−＞Ｓ）［DH−１］、pSVT
7（RI^-）/t−PA（R₃₀₄−＞Ｅ）［DH−１］、及びpSVT7
（RI^-）/t−PA（Del_296-302）［DH−１］はAmerican T
ype Culture CollectionにそれぞれATCC番号67894,67
896及び67895として供託した。

D. COS細胞のトランスフェクション 次に100mmの皿当たり約10⁶個のCOS細胞（Gluzman,Y.
等,Cell,23:175−182（1981））をアルカリリシス法に
より精製した1.0μｇの適したプラスミドDNAを用いてト
ランスフェクトした（Maniatis,T.等,Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual,第１版,Cold Spring Harb
or（1982））。特に、吸引により培地をCOS細胞から除
去し、単層を10mMのHEPES（pH7.15）（Sigma Chemical
Co.）を含む5.0mlのダルベッコの培地（GIBCO,Inc.）
で１回洗浄した。洗浄液を除去した後、300μｇのDEAE
−デキストラン（Pharmacia,Inc.）を含む1.5mlの洗浄
液中の単層にプラスミドDNAを加えた。その後単層を6.0
％のCO₂を含む湿潤大気中、37℃にて１時間インキュベ
ートした。この間20分毎に単層をおだやかに撹拌した。
単層をプラスミドDNAに１時間暴露した後、10mMのHEPES
（pH7.15）を含むダルベッコの培地で１回洗浄し、10％
（v/v）の牛胎児血清（GIBCO,Inc.）を含む10mlのダル
ベッコの培地、及び100μＭのクロロキン（Sigma Chem
ical Co.）を加えた。その後単層を上記に従い37℃に
て４時間インキュベートし、牛胎児血清を含まず10mMの
HEPES（pH7.15）を含むダルベッコの培地5.0mlで２回洗
浄した。その後10％（v/v）の牛胎児血清を含む10mlの
ダルベッコの培地を加え、単層を上記に従い37℃にて12
時間インキュベートした。そして単層を牛胎児血清を含
まないそれぞれ5.0mlのダルベッコの培地で３回洗浄
し、同培地中、37℃にてさらに30−60時間インキュベー
トした。DEAE−デキストランを含む溶液からプラスミド
DNAを省略する以外は同様の方法で偽−トランスフェク
ション細胞を処理した。インキュベーション期間の最後
の上澄み培地を細胞から集め下記に従い分析した。

E. 固相ラジオイムノアッセイによる野生型、及び変異
ｔ−PAの定量 固相ラジオイムノアッセイは基本的にインフルエンザ
HAに関して記載されている方法に従い（Gething,M.J.
等,Nature,293:620−526（1981））、精製ヒトｔ−PAA
に対するうさぎの抗血清のIgGフラクションを用いて行
い、COS細胞中の製造された野生型、及び変異ｔ−PAの
量を定量した。この方法によって決定したｔ−PAの濃度
は0.5−1.0μg/mlであった。

F. 野生型、及び変異ｔ−PAの酵素によるアッセイ COS細胞中に製造された野生型、及び変異株ｔ−PAの
活性を決定するため、間接的色素澱粉法を行った。この
アッセイにおいては、遊離のｐ−ニトロアニリンが色素
澱粉法の基質、スペクトルザイムPL（Ｈ−Ｄ−ノルロイ
シルヘキサヒドロチロシル−リシン−ｐ−ニトロアニリ
ド 二酢酸塩）（American Diagnostica,Inc.）から、
プラスミノーゲン上のｔ−PAの作用により生成されたプ
ラスミンの作用により放出される。遊離のｐ−ニトロア
ニリンの放出は分光光度分析によりOD₄₀₅nmにて測定し
た。

特に、150−200pgの試験するべきｔ−PA、0.4mMのス
ペクトルザイムPL、0.1μＭのLys−プラスミノーゲン
（American Diagnostica,Inc.）、及び0.5−25μg/ml
の可溶性フィブリン（Des−Ａ−フィブリノーゲン）（A
merican Diagnostica,Inc.）を、50mMのトリス−HCl
（pH7.5）、0.1MのNaCl、1.0mMのEDTA及び0.01％（v/
v）のツイーン80から成る緩衝液中に含む反応混合物を9
6ウェルの平底ミクロタイタープレート（Costar,Inc.）
中で37℃にてインキュベートし、２時間の間15又は30分
間隔でBio−tecミクロプレートリーダーを用いてOD₄₀₅n
mを測定した。偽−トランスフェクション細胞からの緩
衝液、又は適切に希釈した試料のアリコートを標準とし
て分析し、得られたOD値（＜0.01単位）を対応する試験
値から差し引いた。デルタOD値を30分と60分の間の光学
濃度の変化として、すなわち反応の遅滞期、及び１本鎖
ｔ−PAから２本鎖の形態への完全な変換による変化とし
て測定した。標準的アッセイに使用する条件下で（0.1
μＭのLys−プラスミノーゲン及び25μg/mlのDes−Ａ−
フィブリノーゲン）、可溶性フィブリンはｔ−PAの活性
を20−40倍賦活した。結果を図４に示す。

図４に示す通り、上記の本発明のｔ−PA変異株の３種
類全部が酵素として活性であり、その活性の特異性は野
生型の活性と大きく異なるものではないことが見い出さ
れた。さらに上記の本発明のｔ−PA変異株は野生型ｔ−
PAと類似の方法でDes−Ａ−フィブリノーゲンの濃度の
変化に応答することが見い出された。Des−Ａ−フィブ
リノーゲンによる最適刺激は20−40倍であった。これは
Des−Ａ−フィブリノーゲン製造を用いた野生型ｔ−PA
についての他の観察と一致する（Karlan,B.等,Biochem.
Biophys.Res.Comn.,142:147−154（1987））。それぞれ
の場合、Des−Ａ−フィブリノーゲンの濃度が約1.0μg/
mlの場合に半−最適刺激が起きた。

次に飽和濃度のDes−Ａ−フィブリノーゲン（25μg/m
l）、及び種々の濃度（0.02−0.16μＭ）の基質、LSy−
プラスミノーゲンの存在下における種々の形態の酵素の
アッセイにより、野生型及び変異株ｔ−PAのK_m及びK_cat
値を決定した。結果を下表Ｘに示す。 表Ｘ 酵素 K_m（μＭ） K_cat（s^-1） 野生型ｔ−PA 0.024 0.22 ｔ−PA（R₃₀₄−＞Ｓ） 0.019 0.23 ｔ−PA（R₃₀₄−＞Ｅ） 0.023 0.22 ｔ−PA（Del_296-302） 0.029 0.17 上記の表に示す通り、異なるｔ−PA変異株に関するK_m
及びK_cat値は互いに類似していた。又、それらの値はBo
ose,J.等,Biochem.,28:635−643（1989）：及びHoylaer
ts,M.等,J.Biol.Chem.,257:2912−2919（1982）により
報告されている野生型ｔ−PAに関する値とも類似してい
る。

図４及び表Ｘに示されたデータは（ｉ）ｔ−PAのアミ
ノ酸296−302の欠失、及び（ii）304位のArgのSer又はG
luへの置換が、プラスミノーゲンを活性化する、及び可
溶性フィブリン フラグメントにより賦活されるｔ−PA
の能力にほとんど影響しないことを示している。

アミノ酸296−302の欠失、及びArg₃₀₄の置換がｔ−PA
とPAI−１の相互作用に影響するかどうかを調べるため
に、それぞれ250pg（3.8フェトモル）の野生型、及び変
異株ｔ−PAを０−480フェントモル（femtomoles）の部
分的に精製した組み替えPAI−１と共に20分間予備的に
インキュベートした。その後上記の間接的色素澱粉法に
より残留酵素活性を測定した。部分的精製組み替えPAI
−１は下記の実施例２の記載にしたがって得た。結果を
図５に示す。

図５に示す通り、３種類の本発明のｔ−PA変異株のす
べてが野生型ｔ−PAと全く異なる挙動を示した。すなわ
ち野生型ｔ−PA（■）がPAI−１により完全に阻害され
る条件下で（24フェントモルのPAI−１）、欠失変異株
ｔ−PA（Del_296-302）（・）はその活性の約95％を保持
していた。高濃度のPAI−１（480フェントモルのPAI−
１）が存在する場合に初めて変異株ｔ−PA（De
l_296-302）（・）の酵素活性がかなりの減少を示した。
２種類の置換変異株、すなわちｔ−PA（R₃₀₄−＞Ｓ）
（○）及びｔ−PA（R₃₀₄−＞Ｅ）（□）も程度は異なる
がPAI−１による阻害に対して抵抗性であった。又、図
５に示す通り、Argの代わりにSer又はGluを含む２種類
の置換変異株がその酵素活性の半−最適阻害に要するPA
I−１の量は野生型ｔ−PAのそれぞれ４及び25倍であっ
た。

上記データは、アミノ酸296−302及び304がｔ−PAの
酵素機能に含まれておらず、同種のセリン プロテアー
ゼ インヒビター、PAI−１と酵素の相互作用に重要な
役割を果たすことを示している。モデルとしてトリプシ
ンの構造を用いて、これらのアミノ酸がセリンプロテア
ーゼの活性部位の近辺、及び触媒性３回回転軸からある
程度離れた位置にあることが予想される。したがってｔ
−PAとPAI−１の接触面積はｔ−PAとその本当の基質で
あるプラスミノーゲンノ相互作用より広い。

変異株ｔ−PA（Del_296-302）もヒトの血漿中に存在す
るセリン プロテアーゼ インヒビターの複合混合物に
対して抵抗性を示すかどうかを調べるために、上記の原
案において部分的精製組み替えPAI−１をヒトの血漿の
1:100の希釈液に置換した。この条件下で野生型ｔ−PA
の活性の約70％が阻害されたがｔ−PA（Del_296-302）の
活性は影響を受けなかった。

さらに野生型ｔ−PA及びｔ−PA（Del_296-302）を、希
釈しないヒトの血漿の共にインキュベートし、混合物を
酸性化してpH5.0とし、12,000xgで５分間遠心した。透
明になった上澄みを希釈し、残留ｔ−PA活性に関して分
析すると変異ｔ−PA（Del_296-302）の場合90％であり、
野生型ｔ−PAの場合20％以下であった。上記の結果は変
異ｔ−PA（Del_296-302）がヒトの血漿中に存在するセリ
ン プロテアーゼ インヒビターの複合混合物に対して
抵抗性であることを示しており、したがって治療薬とし
て野生型ｔ−PAより優れていると思われる。

G.別のｔ−PA変異株 上記Ｆに示したデータはｔ−PAの残基296−302及び30
4が酵素、及び同起源の阻害剤、PIAI−１の相互作用に
重要な役割を果たすが、基質、Lys−プラスミノーゲン
との相互作用には影響しないことを示す。トリプシンの
周知の構造に基づいたｔ−PAの接触ドメインのモデリン
グは、残基296−302が酵素の活性部位の端において表面
ループを形成することを示唆している。このループは正
の高い電荷を帯びている。節Ａ及びＦで議論した通り、
この領域の効果がPAI−１との静電的結合の形成に媒介
されているという考えが本発明において提出された。こ
の仮定の試験のために、ループ内の帯電した残基のそれ
ぞれを変え、酵素のPAI−１との相互作用に与えるその
変異の効果を下記に従って評価した。ループ中の正に帯
電した残基がセリン プロテアーゼ インヒビター、PA
I−１の相補的領域と塩橋を形成するならば、負に帯電
した残基で置換すると、これらの２個のタンパク質の会
合の際に同一に帯電した残基が並列するためｔ−PAとPA
I−１と相互作用は崩壊すると予想される。

特に、節Ｂに記載した要領で特定部位の突然変異誘発
を行い、Lys₂₉₆,Arg₂₉₈、又はArg₂₉₉がGlu残基により置
換されたｔ−PA変異株をコードするcDNAの構築に使用し
た。これらの３個の残基をすべてがGluに置換された、
ｔ−PAの３重変異株をコードするcDNAも構築した。さら
に２個のcDNAを製造した；ひとつはHis₂₉₇がTyr残基に
より置換されたｔ−PA変異株をコードし、他方はPro₃₀₁
がGlyにより置換された酵素をコードする。

これらのｔ−PA変異株の構築に使用した６種類の突然
変異誘発プライマーの配列は以下である： 変異酵素ｔ−PA（K₂₉₆−＞Ｅ）,t−PA（H₂₉₇−＞
Ｙ）,t−PA（R₂₉₈−＞Ｅ）及びｔ−PA（P₃₀₁−＞Ｇ）を
上記の要領で遷移発現ベクターpSVT（RI^-）に連結し
た。

変異酵素ｔ−PA（K₂₉₆,R₂₉₈,R₂₉₉−＞E,E,E）、及び
ｔ−PA（R₂₉₉−＞Ｅ）をコードするcDNAを遷移発現ベク
ターpSTEに連結した。pSTEはpSVT7の誘導体であり、pST
V7の350bp Cla I−Hind IIIプロモーター／オリジン
フラグメントをSV40 cs1085のプロモーター／オリジン
領域からの418bp HpaLL−Hind IIIフラグメントで置換
することにより構築した（Dimaio,D.等,J.Mol.Biol.,14
0:129−142（1980））。

得られたプライマーをpSVT7（RI^-）/t−PA（K₂₉₆−＞
Ｅ）,pSVT7（RI^-）/t−PA（H₂₉₇−＞Ｙ）;pSVT7（RI^-）
/t−PA（R₂₉₈−＞Ｅ）;pSTE7（RI^-）/t−PA（R₂₉₉−＞
Ｅ）;pSVT7（RI^-）/t−PA（K₃₀₁−＞Ｇ）；及びpSVE（R
I^-）/t−PA（K₂₉₆,R₂₉₈,R₂₉₉−＞E,E,E）と称した。

E.coli株DH−１（Hanahan,D.等,DNA Cloning,1巻,Gl
over,D.M.,I.R.L.Press,Oxford,頁109−135（1985））
を上記の変異プラスミドを用いて形質転換し、得られた
株をそれぞれpSTV7（RI^-）/t−PA（K₂₉₆−＞Ｅ）［DH−
１］,pSTV7（RI^-）/t−PA（H₂₉₇−＞Ｙ）［DH−１］;pS
VT7（RI^-）/t−PA（R₂₉₈−＞Ｅ）［DH−１］;pSTE7（RI
^-）/t−PA（K₂₉₉−＞Ｅ）［DH−１］;pSVT7（RI^-）/t−
PA（R₃₀₁−＞Ｇ）［DH−１］；及びpSTV7（RI^-）/t−PA
（K₂₉₆,R₂₉₈,R₂₉₉−＞E,E,E）［DH−１］と称した。正
しいフラグメントの存在を、適した放射活性突然変異誘
発オリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成により確認
し、フラグメントの配向を、適した突然変異誘発オリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用した制限マッピン
グ、及びDNA配列決定により確認した。

pSVT7（RI^-）/t−PA（R₂₉₈−＞Ｅ）［DH−１］;pSTE7
（RI^-）/t−PA（R₂₉₉−＞Ｅ）［DH−１］；及びpSTE7
（RI^-）/t−PA（K₂₉₆,R₂₉₈,R₂₉₉−＞E,E,E）［DH−１］
をAmerican Type Culture CollectionにてそれぞれA
TCC番号68157,68154及び68153として供託した。

上記プラスミドDNAはその後上記の要領でCOS細胞のト
ランスフェクションに使用した。得られた条件下の培地
の希釈液（典型的には1:300）、及び免疫精製酵素の両
方を用いて上記の要領でアッセイを行った。

次に飽和濃度のDes−Ａ−フィブリノーゲン（25μg/m
l）及び種々の濃度（0.02−0.16μＭ）の基質、Lys−プ
ラスミノーゲンの存在下における種々の形態の酵素のア
ッセイにより野生型、及び変異株ｔ−PAのK_m及びK_cat値
を決定した。結果を下表XIに示す。

上記の表XIの示す通り、上記で議論したいずれの変異
もｔ−PAとその基質との相互作用を変化させなかった。

同様に図６に示したデータは、変異がｔ−PAとその正
のエフェクターであるDes−Ａ−フィブリノーゲンとの
相互作用を変えなかったことを示している。逆に図７に
示したデータは野生型ｔ−PAと変異ｔ−PAのいくつかの
挙動における明確な差を示している。特に３種類の変異
株ｔ−PA、すなわちｔ−PA（R₂₉₈−＞Ｅ）,t−PA（R₂₉₉
−＞Ｅ）及びｔ−PA（K₂₉₆,R₂₉₈,R₂₉₉−＞E,E,E）の場
合、セルピン、PAI−１と正常に相互作用する能力が実
質的に変化した。特に三重変異株の挙動は顕著である;2
00倍モル以上過剰のPAI−１と共に予備的インキュベー
トを行った後でさえ活性の損失を示さない。これらの発
見はｔ−PAの表面ループ、すなわち残基296−302が特異
的に同起源の阻害剤PAI−１と相互作用するという提案
を支持しており、この相互作用にArg₂₉₈及びArg₂₉₉が含
まれることを示唆している。これらの観察はｔ−PA、及
びPAI−１の間の特異的相互作用に静電的結合が含まれ
るという仮定を満足する。これらの相互作用に含まれる
ｔ−PAの残基はArg₂₉₈,Arg₂₉₉及びArg₃₀₄である。

実施例２ PAI−１変異株 本実施例に記載する方法はセリン プロテアーゼとし
てｔ−PAを、及びセリン プロテアーゼ インヒビター
としてPAI−１を使用する場合を対象としているが、上
記のようなキモトリプシン スーパーファミリーの他の
セリン プロテアーゼ、及び上記のような他のセリン
プロテアーゼ インヒビターを、本発明の精神及び範囲
から逸脱することなく本文の方法を用いて容易に使用す
ることができる。

A. 真核細胞におけるグリコシル化PAI−１の発現、精
製、及びアッセイ PAI−１をコードする3.2kb及び2.2kb mRNAから誘導
した２種類のcDNAクローン（Ny,T.等,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,83:6776−6780（1986）；及びPannekoek,H.等,E
MBO J.,５:2539−2544（1986））を使用して哺乳類発
現ベクター中に全長のcDNAを構築した。第１のクロー
ン、ラムダPAI−１は、ヒトの胎盤性cDNAライブラリか
らスクリーニングにより得たcDNAの先端を切り取ったバ
ージョンであり、（Dr.Carol Mendelson Center,Dwpa
rtment of Biochemistry,Southwestern Medical Ce
nter,Dallas,TXより提供）PAI−１の以下の８アミノ酸
配列に対応する合成オリゴヌクレオチドを有する（AVDQ
LTRL）（Ny,T.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83:6766−67
80（1986）；及びPannekoek,H.等,EMBO J.,５:2539−2
544（1986））。EcoR Iを用いた消化によりこのクロー
ンから放出されるDNAのフラグメントはNy,T.等,Proc,Na
tl.Acad.Sci.USA,83:6766−6780（1986）に報告されて
いるPAI−１配列のヌクレオチド147−2013に対応した。
このフラグメントをプラスミドベクターpUC 18（Yanis
ch−Perron,C.等,Gene,33:103−119（1985））にサブク
ローニングし、組み替えプラスミドpPAI−１を得た。こ
のプラスミドからの挿入を、バクテリオファージ ラム
ダ gtllに構築したヒトの内皮細胞cDNAライブラリのス
クリーニングに使用した（Huynh,T.等,DNA Cloning,1
巻，出版Glover,D.M.,I.R.L.Press,Oxford,頁49−88（1
985））。このようにして単離したcDNAクローンのひと
つ、すなわちラムダPAI−１−11Aは、５′末端に２個の
余分なヌクレオチドが存在する以外既報の（Pannekoek,
H.等,EMBO J.,５:2539−2544（1986））PAI−1cDNAと
同一配列の挿入を持つ。このクローンの５′末端、ヌク
レオチド52−1479から誘導したEcoR I−Bgl IIIフラグ
メントをpPAI−１の３′Bgl II−EcoR Iフラグメントに
融合させ、pPA I−１−RBRを得た。

哺乳類細胞におけるPAI−１の発現に使用したSV40ベ
クターは以下の要領で構築した。pPA I−１−RBRから放
出されたEcoR Iフラグメントの末端にE.coli DNAポリ
メラーゼのクレノウ フラグメントを満たし、合成Xba
Iリンカーに連結し、プラスミドpSV/t−PA3中のｔ−PA
フラグメントの代わりに挿入し、pSV_L−PAI−１を得た
（Sambrook,J.等,Mol.Biol.Med.,３:459−481（198
6））。SV_L−PAI−１の株を製造し、Dayle,C.等,J.Cel
l.Biol.,105:704−714（1985）に記載の要領で増殖させ
た。

以前にPannekoek,H.等,EMBO J.,５:2539−2544（198
6）及びGinsberg,D.等,J.Clin.Invest.78:1673−1680
（1986）に記載されたPAI−１ クローンはpPAI−１−R
BRによりコードされる配列と同一配列のPAI−１タンパ
ク質をコードし、SV_L−PAI−１の構築にpPAI−１−RBR
の代わりに使用することができた。

CV−１シミアン細胞の単層を37℃で成長させ、SV_L−P
AI−１を注入した。24時間後、培地を血清を含まないダ
ルベッコの培地（GIBCO,Inc.）に置換し、さらに48時間
インキュベーションを続けた。その後分泌されたPAI−
１を含み上澄み培地を0.45ミクロンのフィルター（Nalg
e Co.）を通して濾過した。Nonidet P40（Sigma Che
mical Co.）、及び1.0Mのリン酸ナトリウム（pH7.2）
緩衝液をそれぞれ0.1％（v/v）、及び10mMの濃度まで加
えた。安定化した培地を、20mMのリン酸ナトリウム（pH
7.2）、135mMのNaCl、7.0mMのKClから成る緩衝液（後文
では“PBS"）を用いて１時間当たり50mlの流量で平衡化
したコンカナバリアンＡ−セファロース4Bのアフィニテ
ィー カラム（充填床容量1.0ml）に適用した。カラム
を0.1％（v/v）のNonidet P40を含むPBS、25容量、0.1
％（v/v）のNonidet P40、及び1.0MのNaClを含むPBS25
容量、及び最後に20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
2）10容量で連続的に洗浄した。結合PAI−１は20mMのリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）中の0.5Mのアルファー
メチル−Ｄ−グルコシド（Sigma Chemical Co.）で特
異的に溶離した。PAI−１を含む留分（上記間接的色素
澱粉法においてCalbiochem,Inc.からのウロキナーゼの
阻害により分析して）をプールした。その後Nonidet P
40を0.1％（v/v）の濃度まで加え、プールした溶離物1m
l当たり0.57gのグアニジン ヒドロクロリド（U.S.Bioc
hemicals）を加えた。このようにして得た部分的精製PA
I−１を20mMのリン酸ナトリウムから成る緩衝液（pH7.
2）、及び10％（v/v）のグリセロールに対して透析し、
使用まで−80℃にてアリコートとして保存した。

このようにして製造したPAI−１は40μg/mlの全タン
パク質（Biorad Inc.の販売によるBradfordの試薬によ
り分析）、及び12.5％（w/v）のSDS−ポリアクリルアミ
ドゲルの染色により分析して15μg/mlのPAI−１を含ん
でいた。ウロキナーゼ（それ自身は³H−ジイソプロピル
フルオロホスフェート（New England Nuclear,Inc.か
らのNET−065）を用いた滴定により活性52％）に対する
滴定により、本文の記載に従って製造したPAI−１の活
性は16.6％であり、活性PAI−１の濃度は48nMであるこ
とが明らかになった。

B. 突然変異誘発のためのPAI−１部位の選択 PAI−１の残基Glu₃₅₀及びGlu₃₅₁がｔ−PAと相互作用
するという仮定を試験するため、特定オリゴヌクレオチ
ドの突然変異誘発を使用して下表XIIに示すPAI−１の２
種類の変異株を形成した。

変異株PAI−１（E₃₅₀−＞Ｒ）、及びPAI−１（E₃₅₁−
＞Ｒ）はそれぞれGlu₃₅₀及びGlu₃₅₁のArgへの置換を含
み、負に帯電したGlu残基を正に帯電したArg残基に代
え、ｔ−PA（R₃₀₄−＞Ｅ）に存在する負に帯電したGlu
残基との有力な相互作用を促進するために選択的に選ん
だ。置換がｔ−PAの残基Arg₃₀₄に導入された特異的変異
と相補的であれば、Glu₃₅₀をｔ−PA（R₃₀₄−＞Ｅ）変異
株などとの相互作用が強化されたPAI−１を形成する他
のいろいろな置換期に、本発明の精神及び範囲から逸脱
することなく置換することができた。

C. PAI−１のオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発 第１に、メチオニル−PAI−１を直接発現し、１方で
発現ベクターからのシグナル配列及びcDNAの３′非翻訳
領域を除去するための、プラスミド pPAIST7と称するP
AI−１発現プラスミドの構築が必要であった。この達成
のため、合成DNAリンカーを使用してPAI−１コード配列
の両末端の再構築、及び成熟PAI−１の第１残基をコー
ドするトリプレットの直前にATGタンパク質合成開始コ
ドンの導入を行った。さらにプラスミドpBR322へのcDNA
コード領域の挿入を容易にするため、PAI−１ cDNAフ
ラグメントのそれぞれ５′及び３′末端に、EcoR I及び
Hind III制限エンドヌクレアーゼ確認部位を形成するリ
ンカーを設計した。

特にApaLi及びPflMIを用いてpPAI−１−RBRを消化す
ることによりプラスミドpPAIST7を得た。得られたPAI−
１の残基１のための2bpのコドン、及び379残基タンパク
質の残基２−376のための全コード配列を含む1127bpフ
ラグメントをゲル電気泳動により精製した。次に合成リ
ンカー（５′末端にて10bp、及び３′末端にて13bp）を
1127bp ApaLI、及びPflMI DNAフラグメントと連結
し、EcoR L及びHind IIIを用いて消化し、1146bp EcoR
I−及びHind III−消化DNAフラグメントをゲル電気泳
動により単離した。その後このフラグメントをEcoR I−
及びHind III−消化pBR322にクローニングした。

発現プラスミドの構築の開始のために、サブクローン
をEcoR Iで消化し、直鎖プラスミドを細菌のアルカリホ
スファターゼを用いて脱ホスホリル化した。その後trp
プロモーター、及びリボソーム結合部位を含むpC5A−48
からの36bp EcoR I DNAフラグメント（Franke,A.等,M
eth.Enzymol.,162:653−668（1988））を用いて、二フ
ラグメントを連結することによりPAI−１発現プラスミ
ドを構築した。次に、得られたプラスミドを用い、Mani
atis,T.等,Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l,第１版,Cold Spring Harbor（1982）に記載の要領
でE.coliの形質転換を行った。得られた形質転換物のプ
ラスミドDNAをHind IIIを用いた制限分析によりtprプロ
モーターフラグメントの存在、及び配向に関してスクリ
ーニングを行った。多くの形質転換物がtrpプロモータ
ーに隣接して阻害剤の直接の発現に必要な立体配置でPA
I−１遺伝子を持つプラスミドを含むと同定された。そ
れらのプラスミドのひとつをpPAIST7と称した。

アミノ酸残基Val₂₈₄からPro₃₉₇までをコードするPAI
−１のヌクレオチド配列を含むプラスミドpPAIST7のSal
I−Hind IIIフラグメントをSal I−Hind III消化複製
型M13mp18（図８を参照）に連結した。連結DNAをE.coli
株TG−１にトランスフェクトした。組み替えバクテリオ
ファージにより形成された白色プラークを採取し、適し
た290塩基対Sal I−Hind IIIフラグメントの存在をサザ
ン ハイブリッド形成、制限マッピング、及びDNA配列
決定により確認した。

290塩基対Sal I−Hind IIIフラグメントにおける変異
をｔ−PAについての上記の記載の要領で５′−ホスホリ
ル化合成突然変異誘発オリゴヌクレオチドプライマーを
用いて導入した（図８を参照）。これらのPAI−１変異
株の構築に使用した２個の突然変異誘発プライマーの配
列は以下である： 得られたPAI−１ DNAの変異株Sal I−Hind IIIフラ
グメントの配列を完全に決定した。立証された変異株の
DNAの二重鎖複製型を単離し、変異290塩基対Sal I−Hin
d IIIフラグメントをSal I−Hind III消化、及び6.0％
（w/v）の非変性ポリアクリルアミドゲルを通した電気
泳動により単離した。下記に詳細に記載する通り、変異
を含むこれらのフラグメントを使用し、問題のPAI−１
変異株をコードするPAI−１ cDNAのバージョンを再構
築した。

D.変異株PAI−１のための発現ベクターの構築 プラスミド pPAIST7HS（ヌクレオチド対１におけるH
ind III部位、及びヌクレオチド対2106におけるSal I部
位の欠落したプラスミドpPAIST7の誘導体であり、PAI−
１ cDNAコード配列における変異Sal IのHind IIIフラ
グメントへの交換を容易にするために構築された）にお
けるPAI−１の変異株を以下の要領で構築した： PAI−１ cDNAの中心290塩基対のSal IからHind III
までのフラグメントを、Sal I及びHind IIIを用いた消
化、及び1.0％（w/v）アガロースゲル電気泳動によりプ
ラスミドpPAIST7HSから除去した。その後ベクターDNAの
残留直鎖フラグメントを特定オリゴヌクレオチドの突然
変異誘発で製造した上記の290塩基対Sal IからHind III
フラグメントの変異株バージョンに連結した（図８を参
照）。得られたプラスミドをpPAIST7HS（E₃₅₀−＞Ｒ）
及びpPAIST7HS（E₃₅₁−＞Ｒ）と称した。

E.coli株DH−１（Hanahan,D.等,DNA Cloning,1巻，
出版 Glover,D.M.,I.R.L.Press,Oxford,頁109−135（1
985））を上記変異プラスミドを用いて形質転換し、得
られた株をそれぞれpPAIST7HS［DH−１］;pPAIST7HS（E
₃₅₀−＞Ｒ）［DH−１］；及びpPAIST7HS（E₃₅₁−＞Ｒ）
［DH−１］と称した。E.coli株TG−１（Gibson,T.,Thes
is,University of Cambridge,England（1984））を上
記変異プラスミドを用いて形質転換し、得られた株をそ
れぞれpPAIST7HS［TG−１］;pPAIST7HS（E₃₅₀−＞Ｒ）
［TG−１］；及びpPAIST7HS（E₃₅₁−＞Ｒ）［TG−１］
と称した。正しいフラグメントの存在を適した放射標識
突然変異誘発オリゴヌクレオチドへのハイブリッド形
成、及び核酸配列決定により確認した。

pPAIST7HS（E₃₅₀−＞Ｒ）［DH−１］；及びpPAIST7HS
（E₃₅₁−＞Ｒ）［DH−１］をAmerican Type Culture
CollectionにてそれぞれATCC番号68155及び68156とし
て供託した。

E.野生型、及び変異株PAI−１の発現、抽出、及びアッ
セイ E. coli株pPAIST7HS［TG−１］,pPAIST7HS（E₃₅₀−
＞Ｒ）［TG−１］，及びpPAIST7HS（E₃₅₁−＞Ｒ）［TG
−１］を、ルリアーベルタニ ブイヨン中で37℃にて飽
和濃度まで終夜成育した。50μｌの培養物を使用して、
１リットル当たり6.0gのNa₂HPO₄,3.0gのKH₂PO₄,0.5のNa
Cl,0.5gのNgSO₄・7H₂O,1.0gのNH₄Cl,5.0gのカサミノ
酸、10.0gのグルコース、10.0mlのグリセロール、1.0mg
のチアミン−HCl、及び25mgのアンピシリンを含む修正M
9培地（pH7.4）50mlに接種した。250mlのアーレンメイ
ヤーフラスコ中、37℃にて培養細菌を22時間成育した。
抽出細胞を以下の要領で培養物から得た。

E.coliを遠心によりペレット化し、20mlの冷50mMトリ
ス−HCl（pH8.0）、及び1.0mMのEDTA中で遠心により洗
浄し、氷上の3.6mlの同緩衝液中に再懸濁した。1ml当た
り10mgのリソチーム0.4mlを添加して20分間、0.1mlの10
％（v/v）Nonidet Ｐ−40を添加して10分間、及び0.2m
lの5.0M NaClを添加して10分間抽出を行った。聴音器
（sonifier）／細胞切断器のミクロチップを50％使用サ
イクル、及び設定７（Branson Sonic Power Compan
y）で使用して細胞を短く切断し、粘度を下げ、４℃に
て30分間15,000xgの遠心を行った。透明な溶菌体に10％
（v/v）までグリセロールを加え、PAI−１を含む抽出物
を使用まで−80℃にてアリコートとして保存した。

哺乳類細胞に発現したPAI−１に関して上記に記載し
た要領でウロキナーゼを用いて24℃にて３時間インキュ
ベートすることにより、抽出物を活性PAI−１に関して
滴定した。野生型PAI−１、PAI−１（E₃₅₀−＞Ｒ）、及
びPAI−１（E₃₅₁−＞Ｒ）の抽出物はそれぞれ803nM、59
3nM、及び162nMの活性PAI−１を含んでいた。

野生型、及び変異株ｔ−PAと野生型、及び変異体PAI
−１の相互作用の速度に関する速度論的測定を、0.1mM
のEDTA及び0.1％（v/v）のツイーン20を含む0.1Mトリス
−HCl緩衝液（pH7.4）中、24℃にて行った。上記のｔ−
PAに関する間接的色素澱粉法を用いて残留酵素活性を時
間の関数として決定した。ｔ−PAに対して過剰のPAI−
１の偽−１次条件下で、時間に対する残留ｔ−PA活性の
直線状片対数プロットの傾きから各阻害剤濃度に関して
半減期（ｔ_1/2）を決定した。見掛けの速度定数（K_app
＝0.693/t_1/2）を阻害剤濃度で割って速度定数、k₁を算
出した。

60pMのｔ−PAの阻害の速度を、偽−１次条件下で0.6
−100nMの範囲の阻害剤濃度にて研究した、ｔ−PA−PAI
−１混合物をマイクロタイタープレートウェル中、24℃
にて種々の時間（０−30分）予備的にインキュベート
し、その後Lys−プラスミノーゲン、スペクトロザイム
PL、及びDes−Ａ−フィブリノーゲンをそれぞれ最終
濃度300nM,0.4nM及び12.5μg/mlまで添加した。基質の
添加後、マイクロタイタープレートを37℃にてインキュ
ベートし、405nmにおける吸収を２次間追跡して残留ｔ
−PA活性を決定した。

野生型、及び変異株PAI−１による野生型、及び変異
株ｔ−PAの阻害の再高速度定数（M^-1s^-1）を下表XIIIに
示す。

上記の表XIIIに示す通り、PAI−１（E₃₅₀−＞Ｒ）及
びPAI−１（E351−＞Ｒ）の両方とも、野生型PAI−１と
比較してｔ−PA（E₃₀₄−＞Ｅ）との相互作用の速度定数
が増加しており、変異によりセリン プロテアーゼ イ
ンヒビター−抵抗性ｔ−PA（R₃₀₄−＞Ｅ）の阻害に関す
るPAI−１の能力が復活したことを証明している。

本発明を特別な具体化を参照して詳細に説明したが、
種々の変化及び修正が本発明の精神、及び範囲から逸脱
することなく可能であることが同業者には明らかであろ
う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８１５７ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８１５４ (72)発明者 ゴールドスミス，エリザベス・ジエイ アメリカ合衆国テキサス州75209ダラ ス・チエロキートレイル4626 (72)発明者 ゲシング，マリイジエイン・エイチ アメリカ合衆国テキサス州75229ダラ ス・アービンシモンズドライブ4320 (72)発明者 ジエラード，ロバート・デイ アメリカ合衆国テキサス州75252ダラ ス・フエザーウツドドライブ18620 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/58 C12N 15/15 C12N 9/64 C07K 15/04 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (32)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ｔ−PAのセリンプロテアーゼインヒビター
   による阻害に対して抵抗性のｔ−PA変異体であって、ｔ
   −PAの298位置の塩基性アミノ酸及びｔ−PAの299位置の
   塩基性アミノ酸の少なくとも１つが酸性アミノ酸又は中
   性アミノ酸により置換されているｔ−PA変異体。
2. 【請求項２】該ｔ−PA変異体が298位置のアルギニンが
   グルタミン酸で置換されているｔ−PA又は299位置のア
   ルギニンがグルタミン酸で置換されているｔ−PAである
   請求の範囲第１項に記載のｔ−PA変異体。
3. 【請求項３】ｔ−PAの296位置の塩基性アミノ酸も酸性
   アミノ酸又は中性アミノ酸により置換されている請求の
   範囲第１項に記載のｔ−PA変異体。
4. 【請求項４】該ｔ−PA変異体が296位置のリシン、298位
   置のアルギニン及び299位置のアルギニンがそれぞれグ
   ルタミン酸、グルタミン酸及びグルタミン酸で置換され
   ているｔ−PAである請求の範囲第３項に記載のｔ−PA変
   異体。
5. 【請求項５】ｔ−PAの296,297,298及び299位置の各々に
   おける塩基性アミノ酸が酸性アミノ酸又は中性アミノ酸
   により置換されている請求の範囲第３項に記載のｔ−PA
   変異体。
6. 【請求項６】該ｔ−PAのセリンプロテアーゼインヒビタ
   ーがPAI−１、PAI−２及びPAI−３から成る群より選ば
   れる請求の範囲第１項に記載のｔ−PA変異体。
7. 【請求項７】ｔ−PAのセリンプロテアーゼインヒビター
   による阻害に対して抵抗性のｔ−PA変異体であって、ｔ
   −PAの298位置の塩基性アミノ酸及びｔ−PAの299位置の
   塩基性アミノ酸の少なくとも１つが酸性アミノ酸又は中
   性アミノ酸により置換されているｔ−PA変異体をコード
   している遺伝子。
8. 【請求項８】該ｔ−PA変異体が298位置のアルギニンが
   グルタミン酸で置換されているｔ−PA又は299位置のア
   ルギニンがグルタミン酸で置換されているｔ−PAである
   請求の範囲第７項に記載の遺伝子。
9. 【請求項９】該ｔ−PA変異体において、ｔ−PAの296位
   置の塩基性アミノ酸も酸性アミノ酸又は中性アミノ酸に
   より置換されている請求の範囲第７項に記載の遺伝子。
10. 【請求項１０】該ｔ−PA変異体が296位置のリシン、298
    位置のアルギニン及び299位置のアルギニンがそれぞれ
    グルタミン酸、グルタミン酸及びグルタミン酸で置換さ
    れているｔ−PAである請求の範囲第９項に記載の遺伝
    子。
11. 【請求項１１】該ｔ−PA変異体において、ｔ−PAの296,
    297,298及び299位置の各々における塩基性アミノ酸が酸
    性アミノ酸又は中性アミノ酸により置換されている請求
    の範囲第９項に記載の遺伝子。
12. 【請求項１２】該ｔ−PAのセリンプロテアーゼインヒビ
    ターがPAI−１、PAI−２及びPAI−３から成る群より選
    ばれる請求の範囲第７項に記載の遺伝子。
13. 【請求項１３】（Ａ）ｔ−PAの298位置の塩基性アミノ
    酸及びｔ−PAの299位置の塩基性アミノ酸の少なくとも
    １つが酸性アミノ酸又は中性アミノ酸により置換されて
    いる該ｔ−PA変異体をコードしている遺伝子を含んで成
    るDNAにより形質転換された宿主細胞を培養し、そして （Ｂ）生ずるｔ−PA変異体を単離する ことを特徴とする、セリンプロテアーゼインヒビターに
    よる阻害に対して抵抗性のｔ−PA変異体を得る方法。
14. 【請求項１４】該ｔ−PA変異体が298位置のアルギニン
    がグルタミン酸で置換されているｔ−PA又は299位置の
    アルギニンがグルタミン酸で置換されているｔ−PAであ
    る請求の範囲第13項に記載の方法。
15. 【請求項１５】該ｔ−PA変異体において、ｔ−PAの296
    位置の塩基性アミノ酸も酸性アミノ酸又は中性アミノ酸
    により置換されている請求の範囲第13項に記載の方法。
16. 【請求項１６】該変異体が296位置のリシン、298位置の
    アルギニン及び299位置のアルギニンがそれぞれグリタ
    ミン酸、グルタミン酸及びグルタミン酸で置換されてい
    るｔ−PAである請求の範囲第15項に記載の方法。
17. 【請求項１７】該ｔ−PA変異体において、ｔ−PAの296,
    297,298及び299位置の各々における塩基性アミノ酸が酸
    性アミノ酸又は中性アミノ酸により置換されている請求
    の範囲第15項に記載の方法。
18. 【請求項１８】該ｔ−PAのセリンプロテアーゼインヒビ
    ターがPAI−１、PAI−２及びPAI−３から成る群より選
    ばれる請求の範囲第13項に記載の方法。
19. 【請求項１９】（Ａ）ｔ−PAの298位置の塩基性アミノ
    酸及びｔ−PAの299位置の塩基性アミノ酸の少なくとも
    １つが酸性アミノ酸又は中性アミノ酸により置換されて
    いるｔ−PA変異体を得、そして （Ｂ）ｔ−PAのセリンプロテアーゼインヒビターによる
    阻害に対して抵抗性のｔ−PA変異体をスクリーニングす
    る、 ことを特徴とする、ｔ−PAのセリンプロテアーゼインヒ
    ビターによる阻害に対して抵抗性のｔ−PA変異体を提供
    する方法。
20. 【請求項２０】該ｔ−PA変異体が298位置のアルギニン
    がグルタミン酸で置換されているｔ−PA又は299位置の
    アルギニンがグルタミン酸で置換されているｔ−PAであ
    る請求の範囲第19項に記載の方法。
21. 【請求項２１】該ｔ−PA変異体において、ｔ−PAの296
    位置の塩基性アミノ酸も酸性アミノ酸又は中性アミノ酸
    により置換されている請求の範囲第19項に記載の方法。
22. 【請求項２２】該ｔ−PA変異体が296位置のリシン、298
    位置のアルギニン及び299位置のアルギニンがそれぞれ
    グルタミン酸、グルタミン酸及びグルタミン酸で置換さ
    れているｔ−PAである請求の範囲第21項に記載の方法。
23. 【請求項２３】該ｔ−PA変異体において、ｔ−PAの296,
    297,298及び299位置の各々における塩基性アミノ酸が酸
    性アミノ酸又は中性アミノ酸により置換されている請求
    の範囲第21項に記載の方法。
24. 【請求項２４】該ｔ−PAのセリンプロテアーゼインヒビ
    ターがPAI−１、PAI−２及びPAI−３から成る群より選
    ばれる請求の範囲第19項に記載の方法。
25. 【請求項２５】ｔ−PAの298位置の塩基性アミノ酸及び
    ｔ−PAの299位置の塩基性アミノ酸の少なくとも１つを
    酸性アミノ酸又は中性アミノ酸により置換することを特
    徴とする、ｔ−PAのセリンプロテアーゼインヒビターに
    よる阻害に対して抵抗性のｔ−PA変異体を得る方法。
26. 【請求項２６】該ｔ−PA変異体が298位置のアルギニン
    がグルタミン酸で置換されているｔ−PA又は299位置の
    アルギニンがグルタミン酸で置換されているｔ−PAであ
    る請求の範囲第25項に記載の方法。
27. 【請求項２７】296位置の塩基性アミノ酸を酸性アミノ
    酸又は中性アミノ酸により置換することを更に含む請求
    の範囲第25項に記載の方法。
28. 【請求項２８】該ｔ−PA変異体が296位置のリシン、298
    位置のアルギニン及び299位置のアルギニンがそれぞれ
    グルタミン酸、グルタミン酸及びグルタミン酸で置換さ
    れているｔ−PAである請求の範囲第27項に記載の方法。
29. 【請求項２９】ｔ−PAの296,297,298及び299位置の各々
    における塩基性アミノ酸が酸性アミノ酸又は中性アミノ
    酸により置換されている請求の範囲第27項に記載の方
    法。
30. 【請求項３０】該ｔ−PAのセリンプロテアーゼインヒビ
    ターがPAI−１、PAI−２及びPAI−３から成る群より選
    ばれる請求の範囲第25項に記載の方法。
31. 【請求項３１】ATCC寄託番号68157を有し且つ298位置の
    アルギニンがグルタミン酸で置換されているｔ−PAをコ
    ードするpSVT7（RI^-）/t−PA（R₂₉₈→Ｅ）［DH−１］、
    又は ATCC寄託番号68154を有し且つ299位置のアルギニンがグ
    ルタミン酸で置換されているｔ−PAをコードするpSTE/t
    −PA（R₂₉₉→Ｅ）［DH−１］、又は ATCC寄託番号68153を有し且つ296位置のリシン、298位
    置のアルギニン及び299位置のアルギニンがそれぞれグ
    ルタミン酸、グルタミン酸及びグルタミン酸で置換され
    ているｔ−PAをコードするpSTE/t−PA（K₂₉₆,R₂₉₈,R₂₉₉
    →E,E,E）［DH−１］。
32. 【請求項３２】298位置のアルギニンがグルタミン酸で
    置換されているｔ−PAをコードするプラスミドpSVT7（R
    I^-）/t−PA（R₂₉₈→Ｅ）、又は 299位置のアルギニンがグルタミン酸で置換されている
    ｔ−PAをコードするプラスミドpSTE/t−PA（R₂₉₉→
    Ｅ）、又は 296位置のリシン、298位置のアルギニン及び299位置の
    アルギニンがそれぞれグルタミン酸、グルタミン酸及び
    グルタミン酸で置換されているｔ−PAをコードするプラ
    スアミドpSTE/t−PA（K₂₉₆,R₂₉₈,R₂₉₉→E,E,E）。