JP3076034B2 - t−PA変異体及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents
t−PA変異体及びそれをコードする遺伝子Info
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Description
阻害に対して抵抗性であるキモトリプシン ス−パ−フ
ァミリ−のセリン プロテア−ゼ変異株、及びそれをコ
−ドする遺伝子に関する。本発明は又、本発明のセリン
プロテア−ゼ変異株を阻害するセリンプロテア−ゼ
インヒビタ−変異株、及びそれをコ−ドする遺伝子に関
する。セリン プロテア−ゼ変異株、及びセリン プロ
テア−ゼ インヒビタ−変異株は、例えば薬剤として有
用である。
チド結合分裂における求核試薬としてセリンを使用する
エンドペプチダ−ゼのサブ−サブクラスである(Bar
rett,A.J.,於:Proteinase In
hibitors,出版 Barrett,A.J.
等,Elsevier,Amsterdam,3−22
頁;及びHartley,B.S.,Ann.Rev.
Biochem.,29:45−72(1960))。
あり、セリン プロテア−ゼの2つのス−パ−ファミリ
−、すなわちキモトリプシン ス−パ−ファミリ−、及
びストレプトミセス ズブチリシン ス−パ−ファミリ
−はこれまでに観察されていた(Barrett.A.
J.,於:Proteinase Inhibitor
s,出版 Barrett,A.J.等,Elsevi
er,Amsterdam,3−22頁(1986);
及びJames,M.N.G.,於:Proteoly
sis and Physiological Reg
ulation,出版 Ribbons,D.W.等,
Academic Press,NewYork,12
5−142頁(1976))。
リン プロテア−ゼの例には組織−型プラスミノ−ゲン
活性化因子(下文では”t−PA”)、トリプシン、ト
リプシン−様プロテア−ゼ、キモトリプシン、プラスミ
ン、エラスタ−ゼ、ウロキナ−ゼ(又は尿−型プラスミ
ノ−ゲン活性化因子(下文ではu−PA”)、アクロシ
ン、活性化プロテインC、Clエステラ−ゼ、カテプシ
ンG、チマ−ゼ、ならびにカリクレイン、トロンビン及
び因子VIIa,IXa,Xa,XIa及びXIIaを
含む血液凝固カスケ−ドのプロテア−ゼが含まれる(B
arrett.A.J.,於:Proteinase
Inhibitors,出版 Barrett,A.
J.等,Elsevier,Amsterdam,3−
22頁(1986);Strassburger,W.
等,FEBS Lett.,157:219−223
(1983);Dayhoff,M.O.,Atlas
ofProtein Sequence and S
tructure,5巻,National Biom
edical Research Foundatio
n,Silver Spring,Maryland
(1972);及びRosenberg,R.D.等,
Hosp.Prac.,21:131−137(198
6))。 t−PA、プラスミン、u−PA、及び血液
凝固カスケ−ドのプロテア−ゼを含むキモトリプシン
ス−パ−ファミリ−のセリン プロテア−ゼのいくつか
は巨大分子であり、セリン プロテア−ゼ触媒ドメイン
の他にその活性の調節に一部関与する構造ドメインを含
む(Barrett.A.J.,於:Proteina
se Inhibitors,出版 Barrett,
A.J.等,Elsevier,Amsterdam,
3−22頁(1986);Gerard,R.D.等,
Mol.Biol.Med.,3:449−457(1
986);及びBlasi,F.等,於:Human
Genes andDiseases,出版 Blas
i,F.等,John Wiley & Sons,L
td.,377−414頁(1986))。
べてのセリン プロテア−ゼの触媒ドメインは配列相同
性、及び構造相同性の両方を有する。配列相同性は以
下: (i)特徴的活性化部位残基(例えばトリプシンの場合
Ser195,His57,及びAsp102); (ii)オキシアニオン ホ−ル(例えばトリプシンの
場合Gly193,Asp194);及び (iii)構造中にジスルフィド架橋を形成するシステ
イン残基の全部の保持を含む(Hartley,B.
S.,Symp.Soc.Gen.Microbio
l.,24:152−182(1974))。
(Richardson,J.,Adv.Prot.C
hem.,34:167−339(1981)); (ii)触媒残基の共通の配置;及び (iii)分子のコア中の構造の詳細な保持(Stro
ud,R.M.,Sci.Am.,231:24−88
(1974))を含む。
ンバ−の配列を比較すると触媒ドメイン内のアミノ酸の
挿入、又は欠失の存在が明らかになる(例えば図1を参
照)。すべての場合、これらの挿入又は欠失は折りたた
まれた分子の表面にあり、従って分子の基本的構造に影
響しない(Strassburger,W.等,FEB
S Lett.,157:219−223(198
3))。 II.セリン プロテア−ゼ インヒビタ− セリン プロテア−ゼ インヒビタ−は文献により周知
であり、以下の科(ファミリ−)に分けられる:(i)
塩基性プロテア−ゼ インヒビタ−としても知られる牛
すい臓トリプシン インヒビタ−(Kunitz)ファ
ミリ−(Ketcham,L.K.等,於:Atlas
of Protein Sequence and
Structure,出版 Dayhoff,M.
O.,131−143頁(1978)(下文では”BP
TI”)、(ii)Kazalファミリ−、(iii)
ストレプトミセス ズブチリシンインヒビタ−ファミリ
−(下文では”SSI”)、(iv)セルピン ファミ
リ−、(v)大豆トリプシンインヒビタ−(Kunit
z)ファミリ−、(vi)ポテト インヒビタ−ファミ
リ−、及び(vii)ボ−マン−バ−ク ファミリ−
(Laskowski,M.等,Ann.Rev.Bi
ochem.,49:593−626(1980);R
ead.R.J.等,於:Proteinase In
hibitors,出版 Barrett,A.J.
等,Elsevier,Amsterdam,301−
336頁(1986);及びLaskowski,M.
等,ColdSpring Harbor Symp.
Quant.Biol.,LII:545−553(1
987))。
プシン、及びポテト インヒビタ−ファミリ−のメンバ
−を含む多くの完全な形の阻害剤、及びセルピン アル
ファ−1−アンチトリプシンの分裂形に関して結晶学的
デ−タが得られる(Read,R.J.等,於:Pro
teinase Inhibitors,出版 Bar
rett,A.J.等,Elsevier,Amste
rdam,301−336頁(1986))。これらの
セリン プロテア−ゼ インヒビタ−は大きさ及び配列
が膨大なタンパク質であるにもかかわらず、これまでに
研究された完全な形のインヒビタ−はすべて分子の表面
から伸びる特徴的なル−プを共通して有しており、それ
は同起源のセリン プロテア−ゼの活性化部位に対する
認識配列を含む(Levin,E.G.等,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,80:6804
−6808(1983))。異なるセリン プロテア−
ゼインヒビタ−のル−プが構造的に類似していることは
驚くべきことである(Papamokos,E.等,
J.Mol.Biol.,158:515−537(1
982))。阻害剤のKaZalファミリ−及びストレ
プトミセス ズブチリシン ファミリ−はいくらか構造
及び配列に類似性があるが、一般に異なるファミリ−の
セリン プロテア−ゼ インヒビタ−は活性化部位ル−
プ以外に構造的関連性はない。
くは広範囲の特異性を持ち、血液凝固セリン プロテア
−ゼを含むプロテア−ゼのキモトリプシン ス−パ−フ
ァミリ−、及びセリン プロテア−ゼのストレプトミセ
ス ズブチリシン ス−パ−ファミリ−の両方を阻害す
ることができる(Laskowski,M.等,An
n.Rev.Biochem.,49:593−626
(1980))。各阻害剤の特異性はセリン プロテア
−ゼによる阻害剤の潜在分裂の部位への直接のアミノ末
端であるアミノ酸の同定によりまず決定すると思われ
る。P1部位残基として知られるこのアミノ酸はセリン
プロテア−ゼの活性部位内のセリンとアシル結合を形
成すると思われる(Laskowski,M.等,An
n.Rev.Biochem.,49:593−626
(1980))。
ンヒビタ−には、BPTI、ヘビ毒インヒビタ−、イン
タ−アルファ インヒビタ−、及びA4アミロイド前駆
体A4695が含まれる(Laskowski,M.
等,Ann.Rev.Biochem.,49:593
−626(1980);Read,R.J.等,於:P
roteinase Inhibitors,出版 B
arret,A.J.等,Elsevier,Amst
erdam,301−336頁(1986);及びPo
nte,P.等,Nature,331:525−52
7(1988))。セリン プロテア−ゼ、及びそれら
と同起源のBPTIファミリ−阻害剤の例を下表Iに挙
げる。
インヒビタ−には、すい臓分泌阻害剤、オボムコイド、
及び精奬アクロシン インヒビタ−が含まれる(Las
kowski,M.等,Ann.Rev.Bioche
m.,49:593−626(1980);Read,
R.J.等,於:ProteinaseInhibit
ors,出版 Barrett,A.J.等,Else
vier,Amsterdam,301−336頁(1
986);及びLaskowski,M.等,Cold
Spring Harbor Symp.Quan
t,Biol.,LII:545−553(198
7))。セリン プロテア−ゼ、及びそれらと同起源の
Kazalファミリ−阻害剤の例を下表IIに挙げる。
ミリ−に属するセリンプロテア−ゼ インヒビタ−には
ストレプトミセス アルボグリセオルスから得られる阻
害剤、及びプラスミノストレプチンが含まれる(Las
kowski,M.等,Ann.Rev.Bioche
m.,49:593−626(1980))。セリン
プロテア−ゼ及びそれらと同起源のストレプトミセス
ズブチリシン クラスの阻害剤の例を下表IIIに挙げ
る。
インヒビタ−にはプラスミノ−ゲン活性化因子インヒビ
タ−PAI−1,PAI−2及びPAI−3、Clエス
テラ−ゼ インヒビタ−、アルファ−2−アンチプラス
ミン、コントラプシン、アルファ−1−アンチトリプシ
ン、アンチトロンビン III、プロテア−ゼ ネクシ
ン I、アルファ−1−アンチキモトリプシン、プロテ
インCインヒビタ−、ヘパリン補因子 II、及び成長
ホルモン調節タンパク質が含まれる(Carrel,
R.W.等,Cold Spring Harbor
Symp.Quant.Biol.,52:527−5
35(1987);Sommer,J.等,Bioche
m.,26:6407−6410(1987);Suz
uki,K.等,J.Biol.Chem.,262:
611−616(1987);及びStump,D.
C.等,J.Biol.Chem.,261:1275
9−12766(1986))。
害はTravis,J.等,Ann.Rev.Bioc
hem.,52:655−709(1983);Carre
l,R.W.等,Trends Biochem.Sc
i.,10:20−24(1985);Sprenge
rs,E.D.等,Blood,69:381−387
(1987);及びProteinase Inhib
itors,出版 Barrett,A.J.等,El
sevier,Amsterdam(1986)で調査
されている。
源のセルピン インヒビタ−の例を下表IVに挙げる。
ミリ−の唯一の例は配列が決定されている。牛すい臓ト
リプシンとのその複合体が研究されている(Swee
t,R.M.等,Biochem.,13:4214−
4228(1974))。
ロテア−ゼ インヒビタ−には、じゃがいも、大麦、及
びひるからの阻害剤が含まれる(Read,R.J.
等,於:Proteinase Inhibitor
s,出版 Barrett,A.J.等,Elsevi
er,Amsterdam,301−336頁(198
6))。セリン プロテア−ゼ、及びそれらのポテト
インヒビタ−の例を下表Vに挙げる。
セリン プロテア−ゼインヒビタ−はマメからの相同タ
ンパク質を含む(Laskowski,M.等,An
n.Rev.Biochem.,49:593−626
(1980))。セリン プロテア−ゼ、及びそれらの
ボ−マン−バ−ク インヒビタ−の例を下表VIに挙げ
る。
ヒビタ−はそれらと同起源のセリン プロテア−ゼと安
定な1:1複合体を形成する。これらの複合体の解離は
非常におそい(数時間から数日)(Laskowsk
i,M.等,Ann.Rev.Biochem.,4
9:593−626(1980);及びLevin,
E.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,80:6804−6808(1983))。セル
ピンを除くすべてのセリン プロテア−ゼ インヒビタ
−の場合、解離生成物は完全な形の、及び分裂した阻害
剤分子の混合物である。他方、セリン プロテア−ゼ−
セルピン複合体は解離により分裂した阻害剤分子のみを
生ずるようなので、セルピンは他のセリン プロテア−
ゼインヒビタ−と多少異なる機構を使用すると思われ
る。
オボムコイド インヒビタ−、キモトリプシン−ポテト
インヒビタ−、及びストレプトミセス ズブチリシン
−ストレプトミセス ズブチリシン インヒビタ−を含
む数種のセリン プロテア−ゼ−阻害剤複合体に関する
構造デ−タが得られる(Read,R.J.等,於:P
roteinase Inhibitors,出版 B
arrett,A.J.等,Elsevier,Ams
terdam,301−336頁(1986))。これ
らの構造を調べると、阻害剤の膨大な配列にもかかわら
ず、各阻害剤とその同起源のセリン プロテア−ゼ間の
特異的な相互作用において顕著な類似性があることが明
らかになる。本発明においてこの構造的類似性により、
結晶構造が得られない場合でも阻害剤及びそれと同起源
のセリン プロテア−ゼの間に起きるアミノ酸相互作用
を予測することができるということを示唆した。
み、それがセリン プロテア−ゼの活性部位に対する拮
抗基質となる。活性中心のP1−P1残基(例えばPAI
−1の場合ARG346−Met347)間のペプチド結合へ
の攻撃によりセリン プロテア−ゼからの生成物の正常
で迅速な解離が起こらず、おそらくプロテア−ゼの活性
部位のセリン及び阻害剤のP1残基の間の共有結合の形
成により安定なセリンプロテア−ゼ−インヒビタ−複合
体が確立される(Laskowski,M.等,An
n.Rev.Biochem.,49:593−626
(1980))。この機構は、PAI−1などの阻害剤
の活性中心がセリン プロテア−ゼの活性部位に緊密
に、正確に適合しなければならないこを示す。しかしこ
れまでPAI−1、それと同起源のセリン プロテア−
ゼ、t−PA、又はt−PA/PAI−1複合体につい
てのX−線結晶学的デ−タはない。従ってこのタンパク
質の対の間の相互作用の正確な性質は未知である。他の
セルピン、又はセルピン−セリン プロテア−ゼ複合体
の構造についての情報も同様に不足している。 IV.セリン プロテア−ゼの利用 キモトリプシン ス−パ−ファミリ−の特に重要なセリ
ン プロテア−ゼはt−PAである。t−PAは直接作
用して血栓(血餅)を溶解するわけではないが、心筋梗
塞、肺塞栓症、及び重症の静脈血栓の治療に、冠動脈内
又は静脈内投与によって現在使用されている。t−PA
はプラスミノ−ゲンのArg560及びVal561の間のペ
プチド結合の分裂を促進し(Robbins,K.C.
等,J.Biol.Chem.,242:2333−2
342(1967))、それにより不活性なチモ−ゲン
を強力であるが非特異的なプロテア−ゼ、プラスミンに
変換し、それが血餅のフィブリンの網目を分解する(B
achmann,F.等,Semin.Throm.H
aemost.,43:77−89(1984);Ge
rard,R.D.等,Mol.Biol.Med.,
3:449−557(1986);及びVerstra
ete,M.等,Blood,67:1529−154
1(1986))。
ゲンを枯渇させることなく局部的なフィブリン溶解現象
を起こす。これはt−PAがフィブリンに直接結合しフ
ィブリン−t−PA複合体を形成することができ、その
プラスミノ−ゲンに対する親和力が約500倍に増加す
るからである(Ranby,M.等,Biochem.
Biophys.Acta,704:461−469
(1982);及びRijken,D.C.等,J.B
iol.Chem.,257:2920−2925(1
982))。このようにプラスミノ−ゲンも高濃度で存
在する(Wiman,B.等,Nature,272:
549−550(1978))冠動脈血栓に、静脈内投
与されたt−PAが結合すると血栓の部位でプラスミン
が有効に製造され、そこで最高に働く。
投与され、その後一定の注入を続ける。3時間の標準の
治療の間に投与される酵素の合計量は一般に約50−1
00mgである。2つの理由でこのような大量を必要と
することが明白である:第1に、肝細胞による循環から
の急速なt−PAのクリアランスの効果を補うため(K
rause,J.,Fibrinolysis,2:1
33−142(1988))、及び第2に、血漿及び血
小板中に存在する比較的高濃度のセリン プロテア−ゼ
インヒビタ−の影響を克服するため(Carrel
l,R.W.等,於:Proteinase Inhi
bitors,出版 Barrett,A.J.等,E
lsevier,Amsterdam,頁403−42
0(1986))。
ン、PAI−1、約50kdの糖タンパク質である(P
annekoek,H.等,EMBO J.,5:25
39−2544(1986);Ginsberg,D.
等,J.Clin.Invest.,78:1673−
1680(1980);及びCarrell,R.W.
等,於:Proteinase Inhibitor
s,出版 Barrett,A.J.等,Elsevi
er, Amsterdam,頁403−420(19
86))。PAI−1は心筋肉梗塞から生き残った人か
らの血漿のフィブリン溶解現象の能力が減少している原
因とされてきた(Hamsten,A.等,New E
ng.J.Med.,313:1557−1563(1
985))。さらにPAI−1は急性期反応性タンパク質
であり、心筋梗塞に伴いその量が増加することにより、
治療のためのt−PAの注入後に血漿中に残った実質的
量のt−PAのフィブリン溶解現象活性を減衰させうる
(Lucore,C.L.等,Circ.,77:66
0−669(1988))。PAI−1とt−PAの結
合の2次速度定数は非常に高く(Hekman,C.
等,Arch.Biochem.Biophys.,2
62:199−210(1988))、人の血漿による
t−PAの最初の”急速相(fast−phase)”
阻害を説明している(Colucci,M.等,J.L
ab.Clin.Med.,108:53−59(19
86))。従ってインビボにおけるPAI−1によるt
−PAの急速な中和は、急性心筋梗塞の治療をした10
%から35%の患者が冒される合併症である、血栓分解
治療後の冠動脈レステノシスに寄与しうる(Chese
bro,J.H.等,Circ.,76:142−15
4(1987))。
ルファ−2−アンチプラスミンなどの他のセルピンとt
−PAの結合定数はPAI−1の場合より低次数である
が(Ranby,M.等,Throm.Res.,2
7:175−183(1982);及びHekman,
C.等,Arch.Biochem.Biophy
s.,262:199−210(1988))、それに
もかかわらずこれらのセルピンは注入されたt−PAと
結合し、t−PAの有利な薬理学的性質を減衰させるこ
とができる。
ン プロテア−ゼ−セルピンの対が医学的に非常に重要
である。例えばu−PAはt−PAと同様に心筋梗塞の
治療に有用であり、t−PAと同様のセリン プロテア
−ゼ インヒビタ−による阻害を受ける。
されるセリン プロテア−ゼであるトロンビンはプロ凝
固剤である。それと同起源のセルピンである、アンチト
ロンビン IIIは、トロンビン、及び因子IXa,X
a,XIa及びXIIaを含む血液凝固カスケ−ドに関
与する多くのセリン プロテア−ゼを特異的に阻害する
凝固防止剤である(Heimburger,N.等,
於:Proceedings of the Inte
rnational Research Confer
ence on Proteinase Inhibi
tors,出版Fritz,H.等,Walter d
e Gruyter,New York,頁1−22
(1971);Kurachi,K.等,Bioche
m.,15:373−377(1976);Kirac
hi,K.等,Biochem.,16:5831−5
839(1977);及びOsterud,B.等,S
emin.Thromb.Haemost.,35:2
95−305(1976))。アンチトロンビン II
Iは播種性血管内血液凝固の治療に使用されてきた。ト
ロンビンによりプロテインCを活性化すると、活性化プ
ロテインCが凝固因子Va及びVIIIaを不活性化
し、それ自身はそれと同起源のセルピン、プロテインC
インヒビタ−により阻害されるので血液凝固過程の自己
制限が起こる。
及び血液凝固の内部経路を起こす機能を持つカリクレイ
ンは、比較的重要なセルピンのひとつであるアルファ−
1−アンチトリプシンにより阻害を受ける。
シンと同様に白血球エラスタ−ゼ、及びカテプシンも阻
害する(Heimburger,N.等,於:Proc
eedings of the Internatio
nal ResearchConference on
Proteinase Inhibitors,出版
Fritz,H.等,Walter de Gruy
ter,New York,頁1−47(1971);
Janoff,A.,Am.Rev.Resp.Di
s.,105:121−127(1972);及びOh
lsson,K.等,Eur.J.Biochem.,
36:473−481(1973))。アルファ−1−
アンチトリプシンの遺伝子欠失は直接気腫に関連し(C
arrell,R.W.等,Trends
24(1985))、従ってアルファ−1−アンチトリ
プシン置換が気腫の治療に使用されてきた(Marx,
J.L.,Science,243:315−316
(1989))。
は、キモトリプシン ス−パ−ファミリ−の野生型セリ
ン プロテア−ゼ、特に野生型t−PAをタンパク質工
学により改良し、必ずしも他の有利な薬理学的性質を変
えることなくその酵素有効性を増し、及び/又は必要な
投薬量を変えることである。
シン ス−パ−ファミリ−の改良セリン プロテア−ゼ
をコ−ドする遺伝子を提供することである。
ファミリ−の野生型セリン プロテア−ゼ インヒビ
タ−、特に野生型PAI−1を変え、それらの阻害有効
性を増し、及び/又はその投薬必要量を変え、本発明の
変異セリン プロテア−ゼを阻害することができるよう
にすることである。
プロテア−ゼ インヒビタ−をコ−ドする遺伝子を提供
することである。
源の阻害剤による阻害に対して抵抗性であるキモトリプ
シン ス−パ−ファミリ−のセリン プロテア−ゼ 変
異株;及びそれをコ−ドする遺伝子;ならびにセリン
プロテア−ゼ インヒビタ−抵抗性セリン プロテア−
ゼを阻害するセリン プロテア−ゼ インヒビタ−変異
株;及びそれをコ−ドする遺伝子により満たされ、これ
は下文に示す本発明の詳細な説明により明らかとなるで
あろう。
発明の上記の目的は、それらと同起源の阻害剤による阻
害にたいして抵抗性を持つキモトリプシン ス−パ−フ
ァミリ−のセリン プロテア−ゼ変異株;及びそれをコ
−ドする遺伝子を用いたひとつの具体化により達成する
ことができた。
発明のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−−抵抗性セ
リン プテア−ゼを阻害するセリン プロテア−ゼ イ
ンヒビタ−変異株;及びそれをコ−ドする遺伝子により
上記の目的を達成した。
ン プロテア−ゼ インヒビタ−変異株はキモトリプシ
ン ス−パ−ファミリ−の野生型セリン プロテア−ゼ
をも阻害する。
ア−ゼ サブ−サブクラスのメンバ−はすべて相同タン
パク質であり、共通の作用機構を有するので、本発明に
おいて使用するキモトリプシン ス−パ−ファミリ−の
特定のセリン プロテア−ゼはここで重要ではない。そ
のようなキモトリプシン ス−パ−ファミリ−のセリン
プロテア−ゼの特別な例には上記で上げたセリン プ
ロテア−ゼ、すなわちt−PA、トリプシン、トリプシ
ン−様プロテア−ゼ、キモトリプシン、プラスミン、エ
ラスタ−ゼ、u−PA、アクロシン、活性化プロテイン
C、Clエステラ−ゼ、カテプシンG、チマ−ゼ、及び
カリクレイン、トロンビン、及び因子VIIa,IX
a,Xa,XIa,ならびにXIIaを含む血液凝固カ
スケードのプロテア−ゼが含まれる。本発明において使
用した好ましいキモトリプシン ス−パ−ファミリ−の
セリン プロテア−ゼはt−PAである。
異セリン プロテア−ゼが阻害にたいして抵抗性を示す
特定のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−は本発明に
おいて重要ではない。そのようなインヒビタタ−の例に
はBPTIファミリ−、Kazalファミリ−、SSI
ファミリ−、セルピン ファミリ−、大豆トリプシンイ
ンヒビタ−(Kunitz) ファミリ−、ポテト イ
ンヒビタ− ファミリ−、及びボ−マン−バ−ク ファ
ミリ−のメンバ−が含まれる。
異セリン プロテア−ゼが阻害に対して抵抗性を示す特
定のBPTIインヒビタ−は本発明において重要ではな
い。そのようなBPTIインヒビタ−の例にはBPT
I、ヘビ毒インヒビタ−、インタ−アルファ インヒビ
タ−、及びA4アミロイド前駆体A4695が含まれ
る。
異セリン プロテア−ゼが阻害に対して抵抗性を示す特
定のKazalインヒビタ−は本発明において重要では
ない。そのようなKazalインヒビタ−の例にはすい
臓分泌インヒビタ−、オボムコイド、及び精漿アクロシ
ン インヒビタ−が含まれる。
異セリン プロテア−ゼが阻害に対して抵抗性を示す特
定のセルピン インヒビタ−は本発明において重要では
ない。そのようなセルピン インヒビタ−の例にはPA
I−1,PAI−2,PAI−3,Clエステラ−ゼ
インヒビタ−(Clinh),プロテインC インヒビ
タ−(PCinh)、ヘパリン 補因子 II(HCI
I)、アルファ−2−アンチプラスミン(A2AP)、
アンチトロンビン III(ATIII)、アルファ−
1−アンチトリプシン(A1AT)、プロテア−ゼ ネ
クシン I(Nex−1)、コントラプシン(Cntrp
s)、成長ホルモン調節タンパク質(GHRP)、及び
アルファ−1−アンチキモトリプシン(AChym)が
含まれる。キモトリプシン ファミリ−のセリン プロ
テア−ゼが阻害に対して抵抗性を示す好ましいセルピン
はPAI−1である。
リ−のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−−抵抗性セ
リン プロアテア−ゼを阻害することができる変異セリ
ンプロテア−ゼ インヒビタ−をそれから誘導すること
ができる特定のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−
は、本発明において重要ではない。そのようなセリンプ
ロテア−ゼ インヒビタ−の例にはBPTI、Kaza
l、SSI、Kunitz、ポテト インヒビタ−、ボ
−マン−バ−ク インヒビタ−、及びセルピン ファミ
リ−のメンバ−が含まれ、PAI−1、PAI−2、P
AI−3、Clエステラ−ゼ インヒビタ−、プロテイ
ンC インヒビタ−、ヘパリン 補因子 II、アルフ
ァ−2−アンチプラスミン、アンチトロンビン III、
アルファ−1−アンチトリプシン、プロテア−ゼ ネク
シン I、コントラプシン、成長ホルモン調節タンパク
質、及びアルファ−1−アンチキモトリプシンなどのセ
ルピン ファミリ−のセリン プロテア−ゼ インヒビ
タ−が好ましい。キモトリプシン ス−パ−ファミリ−
のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−−抵抗性セリン
プロテア−ゼを阻害する好ましい変異セルピンはPA
I−1である。
ンヒビタ−はその活性中心ル−プにおいて構造的に相同
であり、それらと同起源のセリン プロテア−ゼと類似
の相互作用を行う(Read,R.J.等,於:Pro
teinase Inhibitors、出版 Bar
rett,A.J.等,Elsevier,Amste
rdam,頁301−336(1986))。セリン
プロテア−ゼ、及びセリン プロテア−ゼ インヒビタ
−の間の構造における対応はこれまでに研究されたこと
のない複合体のモデルの構築に利用することができる。
の触媒ドメインの間の構造的相同性が高いので(Blu
ndell,T.等,Nature,326:347−
352(1987))、本発明においてトリプシン、及
びBPTI間の複合体の周知の構造(Huber,R.
等,J.Mol.Biol.,89:73−101(1
974);及びBode,W.等,於:Proteol
ysis and Physiological Re
gulation,Academic Press,N
ew York,頁43−76(1976))がt−P
A及びPAI−1の間の相互作用のモデルとなり得ると
仮定した。主な認識部位のアミノ酸以外にBPTIと直
接接触するトリプシンのアミノ酸はポリペプチド鎖の2
つの別の領域に位置する(残基37−41、及び210
−213)(図1参照)。
はキモトリプシン ス−パ−ファミリ−のすべてのメン
バ−の間に高度に保持されている。反対にアミノ酸残基
36NSGYHF41の周囲の領域は比較的変化し易く、イ
ンヒビタ−と相互作用を行う表面の部分を形成する。図
1に示される通りこの領域のt−PAのアミノ酸配列は
2つの大きな点でトリプシンのアミノ酸配列と異なる。
第1にトリプシンのTyr(Y39)残基がt−PAにお
いてはArg(R304)で置換されている。t−PA及
びPAI−1の間の相互作用がトリプシン及びBPTI
の間の相互作用を模倣しているという仮定に基づくモデ
リングはt−PAのR304がPAI−1のGlu
(E350)残基と塩橋を形成することを示唆する。この
PAI−1のGlu残基の位置は、トリプシンのY39と
ファン デル ワ−ルス結合を形成するBPTIのI19
に対応する(下表VII)(Huber,R.等,J.M
ol.Biol.,89:73−101(1974));
及びBode,W.等,於:Proteolysis
and Physiological Regulat
ion,Academic Press,New Yo
rk,頁43−76(1976))。従ってPAI−1
のE350はt−PAのR304とイオン対を形成すると思わ
れる。
(E350)の間の接点と思われる位置に隣接して位置す
る余分な7個のアミノ酸(296KHRRSPG302,図1
を参照)を有する。これらの7個のアミノ酸の中の4個
は正に帯電しており、PAI−1(350EEIIM
D355)の相補的領域と思われる領域は3個の負に帯電
した残基を含む。本発明においては、これらの領域間の
静電的相互作用がt−PA及びPAI−1の間の複合体
の形成、及び安定化に重要な役割を果たし得ると思われ
た。逆にt−PAがその基質である、同領域に負に帯電
した残基を持たないプラスミノ−ゲン(PLG)と相互
作用を行う場合はこのような相互作用が起こり得ない
(上記表VIIを参照)。
−ファミリ−の種々のセリン プロテア−ゼの配列の比
較は、キモトリプシン ス−パ−ファミリ−の種々のセ
リンプロテア−ゼの1種類又はそれ以上の変異を設計し
てそれらと同起源の野生型阻害剤による阻害に対して抵
抗性とするための指針として使用することができる。t
−PAと同様に図1に示すキモトリプシン ス−パ−フ
ァミリ−の他のセリン プロテア−ゼは、重要な結合残
基(トリプシンのY39)、及び結合残基に隣接して位置
する種々の大きさの挿入残基を含む点でトリプシンと異
なる。従って変異の候補の例には以下が含まれる: (i)他のセリン プロテア−ゼにおいてトリプシンの
Tyr(Y39)(BPTIのIle(I19)と結合し、
従って2個のタンパク質間の相互作用において重要な役
割を果たす残基)の位置に対応する位置を占めるアミノ
酸残基。例えばプラスミンにおいて、Met(M)残基
はトリプシンのY39に対応する位置を占める。このMe
t残基を電荷、又は大きさなどの性質の異なる他のアミ
ノ酸(例えばGlu(E))に変異させると、プラスミ
ンのアンチプラスミンによる不活性化に対する感受性が
なくなるか、又は減少することが期待されるが、使用す
る特定の置換アミノ酸は本発明において重要でない。同
様にトロンビンのGln(Q)残基(トリプシンのY39
に対応する位置を占める)を電荷、又は大きさなどの性
質が異なる別のアミノ酸(例えばAsp(D))に変異さ
せると、トロンビンのアンチトロンビンIIIによる不
活性化に対する感受性がなくなる、又は減少することが
期待されるが、使用する特定の置換アミノ酸は本発明に
おいて重要でない;及び (ii)トリプシンには存在せず、分子の表面の小さい
挿入として活性部位の近辺に位置するキモトリプシン
ス−パ−ファミリ−の他のセリン プロテア−ゼの残基
(図1を参照)。例えばプラスミンは結合残基に隣接し
てt-PAの296KHRRSPG302により占められている
位置に対応する位置に、2個のアミノ酸(RF)の挿入
を含む。これらの2個のアミノ酸のどちらか、又は両方
の欠失、又は置換、あるいは少量の別のアミノ酸の挿入
による変異により、必ずしもセリン プロテア−ゼの触
媒部位に影響することなく阻害剤との相互作用を失わせ
る、又は減少させることが期待される。もうひとつの例
として、u−PAは結合残基に隣接してt−PAの296
KHRRSPG302により占められている位置に対応す
る位置に6個のアミノ酸(RHRGGS)の挿入を含
む。これらの6個の残基の変異、又は欠失は変異t−P
A(Del296-302)の場合に観察される相互作用と類
似の方法によるセリン プロテア−ゼ インヒビタ−と
の相互作用が減少する、又はなくなることが期待され
る。
タ−の活性中心内の領域は非常に変化し易く、セリン
プロテア−ゼと相互作用を行う表面の部分を形成する。
図2〜3に示すようなセルピン ファミリ−の種々のセ
リン プロテア−ゼ インヒビタ−の配列の比較は種々
のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−において、特に
セリン プロテア−ゼ インヒビタ−のセルピン ファ
ミリ−のメンバ−に、本発明のキモトリプシン ス−パ
−ファミリ−のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−−
抵抗性セリン プロテア−ゼを有効に阻害することがで
きるような1種類かそれ以上の変異を起こす設計の指針
として利用することができる。PAI−1と同様に図2
〜3に示した他のセルピン ファミリ−のメンバ−は、
重要な結合アミノ酸残基(PAI−1のE350)におけ
る配列が異なり、結合残基に隣接した位置に種々の大き
さの挿入を含む(下表VIIIを参照)。
て、PAI−1のGlu(E350)(t−PAのArg
(R304)と結合し、従って2個のタンパク質の相互作
用において重要な役割を果たす残基)の位置に対応する
位置(P4’)を占めるアミノ酸残基。本発明において
は、t−PAにおけるR304−>E変異の構築によりこ
われた静電的相互作用を復活させるためにPAI−1
(E350)のGlu残基をArg(R)に変異させた。
このセルピンにおける特異的な変異は、セリン プロテ
ア−ゼに導入され野生型セルピンによる阻害に対する抵
抗性を与えた変異と相補的であるように構築された。セ
ルピンにおけるこの相補的E350−>R変異はセルピン
に本発明のキモトリプシンス−パ−ファミリ−のセリン
プロテア−ゼ インヒビタ−−抵抗性セリン プロテア
−ゼを阻害する能力を与えるために特別に選んだ;しか
し使用した特定の置換アミノ酸は本発明に対して重要で
はない。例えばトリプシンのY39に対応するプラスミン
のMet(M)残基(図1参照)を電荷又は大きさなど
の性質の異なる別のアミノ酸(上記の例のようにGlu
(E))に変え、変異プラスミンが野生型アルファ−2
−アンチプラスミンによる阻害に対する感受性の減少を
示した場合、アルファ−2−アンチプラスミンのP4’
Ser(S)残基を、プラスミンにおいて代わったGl
u残基と相互作用のできる他のアミノ酸(例えばArg
(R))に変異させると、変異アルファ−2−アンチプ
ラスミンによる不活性化に対する変異プラスミンの感受
性が復活することが期待される。同様にトロンビンの変
異に関する上記の例のようにトロンビンのGln(Q)
残基Asp(D)に変えた場合、アンチトロンビン I
IIのP6’Arg(R)残基をGlu(E)に変異さ
せると変異アンチトロンビン IIIによる阻害に対す
る野生型インヒビタ−−抵抗性トロンビンの感受性が復
活することが期待される; (ii)同種のセリン プロテア−ゼとの相互作用表面
を形成する、種々のファミリ−のセリン プロテア−ゼ
インヒビタ−の他のメンバ−の活性中心内の余分な残
基。セリン プロテア−ゼインヒビタ−のセルピンファ
ミリ−に関してこれらの残基を上記の表VIIIに示
す。 例えばアルファ−2−アンチプラスミンは活性中心のP
AI−1の348APEEIIMD355に対応する位置に配
列SLSSFSVNを含む。これらの8個のアミノ酸の
いずれかの置換により、又は少量の別のアミノ酸の挿入
により変異を起こすと、これらの置換又は挿入が電荷、
大きさ、あるいは嫌水性などの性質において、セリン
プロテア−ゼに導入されて最初に野生型セルピンに対す
る抵抗性を与えたアミノ酸残基と相補的であればセリン
プロテア−ゼとの相互作用を復活することが期待され
る。
変異セリン プロテア−ゼ インヒビタ−は、例えばオ
リゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発などの周知の方法
により製造することができる(Zoller,M.等,
DNA,3:479−488(1984);Kunke
l,T.等,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,82:488−492(1985);及びKu
nkel,T.等,Current Protocol
s in Molecular Biology,Gr
een Publishing Associates
& Wiley Interscience,New
York(1987))。しかしセリン プロテア−
ゼ、又はセリン プロテア−ゼ インヒビタ−に変異を
起こす正確な方法は本発明にとって重要ではない。
ottenberg,R.等,Meth.Enzymo
l.,80:341−361(1981)に記載の方法
などの周知のアッセイを用いて所望の性質、すなわちセ
リン プロテア−ゼ活性、及び同起源の阻害剤による阻
害に対する抵抗性を持つセリン プロテア−ゼに関して
スクリ−ニングを行うことができる。
ヒビタ−は、Lottenberg,R.等,Met
h.Enzymol.,80:341−361(198
1);Holmes,W.E.等,Bilchem.,
26:5133−5140(1987);及びHekm
an,C.M.等,Arch.Biochem.Bil
phys.,262:199−210(1988)に記
載の方法などの周知のアッセイを用いて所望の性質、す
なわち本発明のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−−
抵抗性セリン プロテア−ゼに対するセリン プロテア
−ゼ インヒビタ−活性を有するセリン プロテア−ゼ
インヒビタ−に関してスクリ−ニングを行うことがで
きる。
−ゼを突然変異誘発により修正し、キモトリプシン ス
−パ−ファミリ−のセリン プロテア−ゼ、及びそれと
同起源の阻害剤の間の相互作用を減少させる、又はなく
すことが可能であることを初めて示すものである。これ
により変異セリン プロテア−ゼは同起源の阻害剤の存
在下で野生型の酵素より酵素活性が多く残り、残留活性
の量はそれと同起源の阻害剤との相互作用が阻害される
程度に依存している。そのような変異セリンプロテア−
ゼの投与は多種類の臨床的、及び商業的用途において有
益であると思われる。例えば活性化プロテインCの変異
型は、血液の凝固を阻害するのが有利である場合有用で
あると思われ、本文の実施例1に記載のt−PAの変異
型が、フィブリン溶解現象を延長する必要がある場合に
血栓性の異常のある患者の循環におけるt−PAの有効
寿命を延ばすのに有用であると思われるのとちょうど同
じである。
ア−ゼ インヒビタ−を突然変異誘発により修正し、セ
リン プロテア−ゼ インヒビタ−の構造を適切に変化
させることにより、キモトリプシン ス−パ−ファミリ
−のセリン プロテア−ゼインヒビタ−−抵抗性変異セ
リン プロテア−ゼ、及びそれと同起源のセリンプロテ
ア−ゼ インヒビタ−間の相互作用を機能的に復活させ
ることが可能であることを初めて示すものである。これ
により同起源の野生型セリン プロテア−ゼ インヒビ
タ−が存在する場合より急速に変異セリン プロテア−
ゼを不活性化することができ、阻害の速度は変異セリン
プロテア−ゼとの相互作用が復活した程度に依存す
る。このような変異セリン プロテア−ゼ インヒビタ
−の投与は、多種の臨床的及び商業的用途においてセリ
ン プロテア−ゼ インヒビタ−−抵抗性セリン プロ
テア−ゼの活性を制限するのに有益であると思われる。
例えばプロテインC インヒビタ−の変異型は、活性化
プロテインCの変異型の存在下で血液の凝固を促進する
のが有利であるような場合に有用であると思われる。同
様にPAI−1の変異型は、侵入的な方法が必要な場合
に、血栓性異常の治療をした患者の循環においてセリン
プロテア−ゼ インヒビタ−−抵抗性t−PA、例え
ばt−PA(R304−>E)の有効寿命を短縮するのに
有用であると思われる。従ってこのような変異セリン
プロテア−ゼ インヒビタ−はセリン プロテア−ゼ
インヒビタ−−抵抗性セリン プロテア−ゼの解毒薬と
して使用することができる。
変異セリン プロテア−ゼの量は使用する特定の変異セ
リン プロテア−ゼ、所望するセリンプロテア−ゼの治
療効果、及び性別、年令、体重、ならびにプロテア−ゼ
を投与する患者の生理学的条件などの因子に依存するで
あろう。変異セリン プロテア−ゼの使用量は日常的実
験により決定することができる。 臨床的用途において
投与するべき本発明の変異セリン プロテア−ゼ イン
ヒビタ−の量は使用する特定の変異セリン プロテア−
ゼ インヒビタ−、所望するセリン プロテア−ゼ イ
ンヒビタ−の治療効果、及び性別、年令、体重、ならび
にセリン プロテア−ゼ インヒビタ−を投与する患者
の生理学的条件などの因子に依存するであろう。変異セ
リン プロテア−ゼ インヒビタ−の使用量は日常的実
験により決定することができる。
ロ、及びインビボ モデルにおける試験、ならびに臨床
試験により決定した通りに投与しなければならない。必
要な投薬量は野生型t−PAの場合の必要量の10−1
000分の1となるであろうと思われる。
ロ、及びインビボ モデルにおける試験、ならびに臨床
試験により決定した通りに投与しなければならない。必
要な投薬量は変異t−PAの場合に必要な量と大体同じ
であろうと思われる。
により周知のいずれの製薬上許容できるキャリヤ−、又
は希釈剤、例えば生理食塩溶液と共にでも投与すること
ができる(Lucore,C.L.等,Circ.,7
7:660−669(1988);及びChesebr
o,J.H.等,Circ.,76:142−154
(1987))。
の投与形態はその特定の用途に依存する。そのような投
与形態の例には、静脈内又は腹腔内注射、冠動脈内注
入、局所的適用、及びエ−ロゾル吸入が含まれる。
ヒビタ−の特定の投与形態はその特定の用途に依存す
る。そのような投与形態の例には、静脈内又は腹腔内注
射、冠動脈内注入、局所的適用、及びエ−ロゾル吸入が
含まれる。
り、本発明の範囲をどのようにも制限するものではな
い。
t−PAを使用し、同起源のセリン プロテア−ゼ イ
ンヒビタ−としてPAI−1を使用する場合を対象とす
るが、上記のようなキモトリプシン ス−パ−ファミリ
−の他のセリンプロテア−ゼ、及び上記のようなそれと
同起源の阻害剤も本発明の精神と範囲から逸脱すること
なく本文に記載の方法により容易に使用することができ
る。
選択 t−PAの残基Arg304及び(296KHRRSP
G302)がPAI−1と相互作用をするという仮定を試
験するため、オリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発を
用いて下表IXに示すt−PAの3種類の変異型を製造
した。
リプシンには存在しない7個のアミノ酸挿入を含まず、
同起源のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−、PAI
−1と相互作用する部分のt−PA配列を完全に除去し
て構築した。変異株t−PA(R304−>S)及びt−
PA(R304−>E)はArg304がそれぞれSer及び
Gluに置換されており、正に帯電したArg残基を選
択的に変え、それと同起源のセリン プロテア−ゼ イ
ンヒビタ−、PAI−1との相互作用を除去するように
選んだ。R304に対して、電荷対相互作用の欠落のため
に同起源のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−に対す
る感受性の減少したt−PAを与える種々の他の置換を
行うことができる。例えばル−プ中の正に帯電した残基
(残基296−302)を負に帯電した、又は中性のア
ミノ酸に変える点変異は、t−PA及びPAI−1の間
の相互作用を妨げる、減少させる、又は不安定化すると
予測される。P301をGly(G)以外の他のアミノ酸
で置換することにより類似の結果を得ることができる。
さらに残基304と305の間、又は残基296と30
5の間のどこかに、PAI−1の残基と全く相互作用し
ない約1−6個のアミノ酸の系列を挿入するように挿入
変異を行うことができる。異なる置換、及び/又は置
換、挿入及び欠失の組み合わせは、t−PAとPAI−
1の相互作用に異なる程度で影響し、それによって特定
の用途、又は臨床的条件に適する性質を持った種々のt
−PAを製造することができるであろう。
突然変異誘発 t−PAのオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発は基
本的にZoller,M.等,DNA,3:479−4
88(1984)の記載に従い、Kunkel,T.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
2:488−492(1985);及びKunkel,
T.等,Current Protocols in
Molecular Biology,Green P
ublishing Associates & Wi
ley Interscience,New York
(1987)による修正により行った。
cDNAをクロ−ニングした複写を含むプラスミドpS
VT7(RI-)/t−PAを、Sambrook,
J.等,Mol.Biol.Med.,3:459−4
81(1986)に従って用意した。pSVT7(RI
-)/t−PAはpSVT7の誘導体である(Bir
d.P.M.等,J.Cell Biol.,105:
2905−2914(1987))(図4を参照)。
C3は、AvaI部位からEcoRI部位までのpBR
322−誘導配列(これは複製の源、及びβ−ラクタマ
−ゼ遺伝子を含む)がpUC 8(Messing,
J.,Meth.Enzymol.,101:20−7
8(1983))の配列に置換されているpko(Va
n Doren,K.等,J.Virol.,50:6
06−614(1984))の誘導体である。さらに独
特のHindIII部位にポリリンカ−が挿入されてお
り、SV40オリジンのPvuII部位上流がClaI
部位に変換されている。ベクタ−pSVT7はバクテリ
オファ−ジ T7 RNA ポリメラ−ゼ特異性プロモ
−タ−を含む20個の塩基対フラグメント(Pharm
aciaFine Chemicals,Piscat
away,NJ)をpKC3の独特のStuI部位に挿
入することによって得た。このStiI部位はSV40
の初期領域から誘導した配列内のSV40配列のヌクレ
オチド5190の位置、初期転写の開始点から下流約3
0塩基対にある(Tooze,J.等,DNA Tum
or Viruses,Cold Spring Ha
rbor Press,頁813(1981))。
のクレノウフラグメントを用いてくぼんだ3’−末端を
満たすことにより単一のEcoRI部位をpSVT7か
ら除去した。得られた発現ベクタ−をpSVT7(RI
-)と称する(図4を参照)。
をプラスミドpL611から切り出し(Sambroo
k,J.等,Mol.Biol.Med.,3:459
−481(1986);Genetics Insti
tute,Boston,MAから提供)、pSVT7
(RI-)に挿入した。pL611はt−PAのAUG
開始コドンからすぐ上流にNcoI及びBamHIの切
断部位を導入する合成オリゴヌクレオチドを含む。t−
PA cDNAの3’非翻訳配列内の、TGA終結コド
ンの下流約280塩基対の位置にBa1I部位がある。
プラスミド pL611から切り出したt−PA DN
Aの約1965塩基対NcoI−BalIフラグメント
にXbaIリンカ−を加えた。このBcoI−BalI
フラグメントは完全なt−PAタンパク質をコ−ドする
配列を含むが、(i)t−PAmRNAの末端3’−非
翻訳領域、及び(ii)t−PA mRNAの5’−非
翻訳領域全体、すなわちSalI部位及びATG開始コ
ドンの間の配列に対応する配列が欠けている(Penn
ica,D.等,Nature,301:214−22
1(1983))。各末端にXbaI部位を持つt−P
A cDNAのフラグメント(Sambrook,J.
等,Mol.Biol.Med.,3:459−481
(1986))をpSVT7/t−PAの製造に使用し
た(図4を参照)。得られたプラスミドからXbaIを
用いた消化、0.8%(w/v)アガロ−スゲル電気泳
動による精製により約1970塩基対DNAフラグメン
トを切り出し、t−PAのN−末端をコ−ドする配列が
バクテリオファ−ジ T7及びSV40初期プロモ−タ
−のすぐ下流におかれるようにしてプラスミドpSVT
7(RI-)のXbaI部位に挿入した。得られたプラ
スミドをpSVT7(RI-)/t−PAと称した(図
4を参照)。
EcoRIを用いて完全に消化した。t−PAの472
塩基対フラグメント(アミノ酸206−364を含む領
域をコ−ドするヌクレオチド842−1314)を1.
2%(w/v)アガロ−スゲル電気泳動により精製し
た。このフラグメントを、前以てEcoRIで消化し、
牛腸アルカリホスファタ−ゼを用いて脱ホスホリル化し
たバクテリオファ−ジM13ベクタ−M13mp18
(Yanish−Perron,C.等,Gene.3
3:103−119(1985)の複製型DNAと連結
した(図4を参照)。
らの、及び他の標準的組み替えDNA法は(i)Man
iatis,T.等,Molecular Cloni
g:A Laboratory Manual,第1
版,Cold SpringHarbor(198
2)、及び(ii)Meth.Enzymol.,15
2巻,出版Berger,S.等,Academic
Press,New York(1987)に記載の要
領で行った。
ibson,T.,Thesis,Universit
y of Cambridge,England(19
84))にトランスフェクションした。組み替えバクテ
リオファ−ジにより形成された白いプラ−クを採取し、
適切な472塩基対EcoRIフラグメントの存在を制
限マッピング、サザンハイブリッド形成、及びDNA配
列決定により確認した。
l.Acad.Sci.USA,82:488−492
(1985);及びKunkel,T.,Meth.E
nzymol.,154:367−382(1987)
の記載に従い、5’−ホスホリル化合成突然変異誘発プ
ライマ−を用いて472塩基対EcoRIフラグメント
における変異を導入した。t−PA変異株の構築に使用
した3種類の突然変異誘発プライマ−の配列は以下であ
る: 5′ 3′ t−PA(R304−>S) GCCCGGAGAGTCGTTCCTGTGC 5′ 3′ t−PA(R304−>E) GCCCGGAGAGGAGTTCCTGTGC 5′ 3′ t−PA(Del296-302) GCCATCTTTGCCGAGCGGTTCCTG 上記原案はdut-,ung-であるE.coliの株、
すなわち株CJ236において製造したDNA鋳型を使
用する(Kunkel,T.等,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,82:488−492(1
985);及びKunkel,T.,Meth.Enz
ymol.,154:367−382(1987))。
DNA鋳型はチミンの位置に少量のウラシル残基を含
む。
ばした後、部分的充填環状DNAをdut+,ung+で
あるE.coliの株、すなわちTG−1にトランスフ
ェクトした(Gebson,T.,Thesis,Un
iversity of Cambridge,Eng
land(1984))。鋳型らせん中のウラシル残基
を酵素ウラシル N−グリコシラ−ゼの作用によりイン
ビボで除去した。これにより鋳型らせんに致死損害が加
えられ、変異株を迅速に、及び有効に回収することがで
きる。
た5’ホスホリル化突然変異誘発プライマ−にアニ−ル
した。プライマ−の伸長はE.coliDNAポリメラ
−ゼのクレノウフラグメントを用いて15℃にて12−
16時間行った。新規に合成したらせんをバクテリオフ
ァ−ジT4 DNAリガ−ゼを用いて突然変異誘発プラ
イマ−の5’末端に連結し、不適正を持つ環を形成し
た。得られたDNAを用いてE.coli株TG−1
(Gibson,T.Thesis,Universi
ty of Cambridge,England(1
984))のトランスフェクションを行い、多くのプラ
−クから一重鎖DNAを製造した。これらのDNAの配
列を完全に決定した。その後立証された変異株の複製型
2重鎖DNAを、EcoRIによる消化、及び1.2%
(w/v)アガロ−スゲルによる電気泳動により単離し
た。下記に詳細に記載する通り、変異を含むこれらのフ
ラグメントを使用して問題のt−PA変異株をコ−ドす
るt−PA cDNAのバ−ジョンを構築した。
の構築 プラスミドpSVT7(RI-)/t−PAにおけるt
−PAの変異株は以下のようにして構築した:t−PA
cDNAの中心472塩基対EcoRIフラグメント
をEcoRIによる消化、及び1.2%(w/v)アガ
ロ−スゲルによる電気泳動によりpSVT7(RI-)
/t−PAから除去した。その後残ったプラスミドDN
Aの直線状フラグメントをオリゴヌクレオチド−媒介−
突然変異誘発によって作った472塩基対フラグメント
のバ−ジョンに連結した(図4を参照)。得られたプラ
スミドをpSVT7(RI-)/t−PA(R304−>
S),pSVT7(RI-)/t−PA(R304−>
E)、及びpSVT7(RI-)/t−PA(Del
296-302)と称した。
n,D.等,DNA Cloning,1巻,出版 G
lover,D.M.,I.R.L.Press,Ox
ford,頁109−135(1985))を上記の変
異株プラスミドを用いて形質転換し、得られた株をそれ
ぞれpSVT7(RI-)/t−PA(R304−>S)
[DH−1];pSVT7(RI-)/t−PA(R304
−>E)[DH−1];及びpSVT7(RI-)/t
−PA(Del296-302)[DH−1]と称した。正し
いフラグメントの存在は適した放射標識突然変異誘発オ
リゴヌクレオチドとのハイブリッド形成により確認し、
フラグメントの配向は適した突然変異誘発オリゴヌクレ
オチドをプライマ−として用いた制限マッピング、及び
DNA配列決定により確認した。
>S)[DH−1]、pSVT7(RI-)/t−PA
(R304−>E)[DH−1]、及びpSVT7(R
I-)/t−PA(Del296-302)[DH−1]はAm
erican Type Culture Colle
ctionにそれぞれATCC番号67894,678
96及び67895として供託した。
luzman,Y.等,Cell,23:175−18
2(1981))をアルカリリシス法により精製した
1.0μgの適したプラスミドDNAを用いてトランス
フェクトした(Maniatis,T.等,Molec
ular Cloning:A Laboratory
Manual,第1版,Cold Spring H
arbor(1982))。特に、吸引により培地をC
OS細胞から除去し、単層を10mMのHEPES(p
H7.15)(Sigma Chemical C
o.)を含む5.0mlのダルベッコの培地(GIBC
O,Inc.)で1回洗浄した。洗浄液を除去した後、
300μgのDEAE−デキストラン(Pharmac
ia,Inc.)を含む1.5mlの洗浄液中の単層に
プラスミドDNAを加えた。その後単層を6.0%のC
O2を含む湿潤大気中、37℃にて1時間インキュベ−
トした。この間20分毎に単層をおだやかに撹拌した。
単層をプラスミドDNAに1時間暴露した後、10mM
のHEPES(pH7.15)を含むダルベッコの培地
で1回洗浄し、10%(v/v)の牛胎児血清(GIB
CO,Inc.)を含む10mlのダルベッコの培地、
及び100μMのクロロキン(Sigma Chemi
cal Co.)を加えた。その後単層を上記に従い3
7℃にて4時間インキュベ−トし、牛胎児血清を含まず
10mMのHEPES(pH7.15)を含むダルベッ
コの培地5.0mlで2回洗浄した。その後10%(v
/v)の牛胎児血清を含む10mlのダルベッコの培地
を加え、単層を上記に従い37℃にて12時間インキュ
ベ−トした。そして単層を牛胎児血清を含まないそれぞ
れ5.0mlのダルベッコの培地で3回洗浄し、同培地
中、37℃にてさらに30−60時間インキュベ−トし
た。DEAE−デキストランを含む溶液からプラスミド
DNAを省略する以外は同様の方法で偽−トランスフェ
クション細胞を処理した。インキュベ−ション期間の最
後に上澄み培地を細胞から集め下記に従い分析した。
型、及び変異t−PAの定量 固相ラジオイムノアッセイは基本的にインフルエンザH
Aに関して記載されている方法に従い(Gethin
g,M.J.等,Nature,293:620−62
5(1981))、精製ヒトt−PAに対するうさぎの
抗血清のIgGフラクションを用いて行い、COS細胞
中の製造された野生型、及び変異t−PAの量を定量し
た。この方法によって決定したt−PAの濃度は0.5
−1.0μg/mlであった。
るアッセイ COS細胞中に製造された野生型、及び変異株t−PA
の活性を決定するため、間接的色素澱粉法を行った。こ
のアッセイにおいては、遊離のp−ニトロアニリンが色
素澱粉法の基質、スペクトルザイムPL(H−D−ノル
ロイシルヘキサヒドロチロシル−リシン−p−ニトロア
ニリド 二酢酸塩)(AmericanDiagnos
tica,Inc.)から、プラスミノ−ゲン上のt−
PAの作用により生成されたプラスミンの作用により放
出される。遊離のp−ニトロアニリンの放出は分光光度
分析によりOD405nmにて測定した。
t−PA、0.4mMのスペクトルザイムPL、0.1
μMのLys−プラスミノ−ゲン(American
Diagnostica,Inc.)、及び0.5−2
5μg/mlの可溶性フィブリン(Des−A−フィブ
リノ−ゲン)(American Diagnosti
ca,Inc.)を、50mMのトリス−HCl(pH
7.5)、0.1MのNaCl、1.0mMのEDTA
及び0.01%(v/v)のツイ−ン80から成る緩衝
液中に含む反応混合物を96ウェルの平底ミクロタイタ
−プレ−ト(Costar,Inc.)中で37℃にて
インキュベ−トし、2時間の間15又は30分間隔でB
io−tecミクロプレ−トリ−ダ−を用いてOD405
nmを測定した。偽−トランスフェクション細胞からの
緩衝液、又は適切に希釈した試料のアリコ−トを標準と
して分析し、得られたOD値(<0.01単位)を対応
する試験値から差し引いた。デルタOD値を30分と6
0分の間の光学濃度の変化として、すなわち反応の遅滞
期、及び1本鎖t−PAから2本鎖の形態への完全な変
換による変化として測定した。標準的アッセイに使用す
る条件下で(0.1μMのLys−プラスミノ−ゲン及
び25μg/mlのDes−A−フィブリノ−ゲン)、
可溶性フィブリンはt−PAの活性を20−40倍賦活
した。結果を図5に示す。
変異株の3種類全部が酵素として活性であり、その活性
の特異性は野生型の活性と大きく異なるものではないこ
とが見い出された。さらに上記の本発明のt−PA変異
株は野生型t−PAと類似の方法でDes−A−フィブ
リノ−ゲンの濃度の変化に応答することが見い出され
た。Des−A−フィブリノ−ゲンによる最適刺激は2
0−40倍であった。これはDes−A−フィブリノ−
ゲン製造を用いた野生型t−PAについての他の観察と
一致する(Karlan,B.等,Biochem.B
iophys.Res.Comn.,142:147−
154(1987))。それぞれの場合、Des−A−
フィブリノ−ゲンの濃度が約1.0μg/mlの場合に
半−最適刺激が起きた。
ゲン(25μg/ml)、及び種々の濃度(0.02−
0.16μM)の基質、Lys−プラスミノ−ゲンの存
在下における種々の形態の酵素のアッセイにより、野生
型及び変異株t−PAのKm及びKcat値を決定した。結
果を下表Xに示す。
m及びKcat値は互いに類似していた。又、それらの値は
Boose,J.等,Biochem.,28:635
−643(1989);及びHoylaerts,M.
等,J.Biol.Chem.,257:2912−2
919(1982)により報告されている野生型t−P
Aに関する値とも類似している。
−PAのアミノ酸296−302の欠失、及び(ii)
304位のArgのSer又はGluへの置換が、プラ
スミノ−ゲンを活性化する、及び可溶性フィブリン フ
ラグメントにより賦活されるt−PAの能力にほとんど
影響しないことを示している。
g304の置換がt−PAとPAI−1の相互作用に影響
するかどうかを調べるために、それぞれ250pg
(3.8フェントモル)の野生型、及び変異株t−PA
を0−480フェントモル(femtomoles)の部分的に精製
した組み替えPAI−1と共に20分間予備的にインキ
ュベ−トした。その後上記の間接的色素澱粉法により残
留酵素活性を測定した。部分的精製組み替えPAI−1
は下記の実施例2の記載にしたがって得た。結果を図6
に示す。
A変異株のすべてが野生型t−PAと全く異なる挙動を
示した。すなわち野生型t−PA(■)がPAI−1に
より完全に阻害される条件下で(24フェントモルのP
AI−1)、欠失変異株t−PA(Del296-302)
(・)はその活性の約95%を保持していた。高濃度の
PAI−1(480フェントモルのPAI−1)が存在
する場合に初めて変異株t−PA(Del296-302)
(・)の酵素活性がかなりの減少を示した。2種類の置
換変異株、すなわちt−PA(R304−>S)(〇)及
びt−PA(R304−>E)(□)も程度は異なるがP
AI−1による阻害に対して抵抗性であった。又、図6
に示す通り、Argの代わりにSer又はGluを含む
2種類の置換変異株がその酵素活性の半−最適阻害に要
するPAI−1の量は野生型t−PAのそれぞれ4及び
25倍であった。
び304がt−PAの酵素機能に含まれておらず、同種
のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−、PAI−1と
酵素の相互作用に重要な役割を果たすことを示してい
る。モデルとしてトリプシンの構造を用いて、これらの
アミノ酸がセリン プロテア−ゼの活性部位の近辺、及
び触媒性3回回転軸からある程度離れた位置にあること
が予想される。したがってt−PAとPAI−1の接触
面積はt−PAとその本当の基質であるプラスミノ−ゲ
ンノ相互作用より広い。
の血漿中に存在するセリン プロテア−ゼ インヒビタ
−の複合混合物に対して抵抗性を示すかどうかを調べる
ために、上記の原案において部分的精製組み替えPAI
−1をヒトの血漿の1:100希釈液に置換した。この
条件下で野生型t−PAの活性の約70%が阻害された
がt−PA(Del296-302)の活性は影響を受けなか
った。
l296-302)を、希釈しないヒトの血漿と共にインキュ
ベ−トし、混合物を酸性化してpH5.0とし、12,
000xgで5分間遠心した。透明になった上澄みを希
釈し、残留t−PA活性に関して分析すると変異t−P
A(Del296-302)の場合90%であり、野生型t−P
Aの場合20%以下であった。上記の結果は変異t−P
A(Del296-302)がヒトの血漿中に存在するセリン
プロテア−ゼ インヒビタ−の複合混合物に対して抵
抗性であることを示しており、したがって治療薬として
野生型t−PAより優れていると思われる。
及び304が酵素、及び同起源の阻害剤、PAI−1の
相互作用に重要な役割を果たすが、基質、Lys−プラ
スミノ−ゲンとの相互作用には影響しないことを示す。
トリプシンの周知の構造に基づいたt−PAの触媒ドメ
インのモデリングは、残基296−302が酵素の活性
部位の端において表面ル−プを形成することを示唆して
いる。このル−プは正の高い電荷を帯びている。節A及
びFで議論した通り、この領域の効果がPAI−1との
静電的結合の形成に媒介されているという考えが本発明
において提出された。この仮定の試験のために、ル−プ
内の帯電した残基のそれぞれを変え、酵素のPAI−1
との相互作用に与えるその変異の効果を下記に従って評
価した。ル−プ中の正に帯電した残基がセリン プロテ
ア−ゼ インヒビタ−、PAI−1の相補的領域と塩橋
を形成するならば、負に帯電した残基で置換すると、こ
れらの2個のタンパク質の会合の際に同一に帯電した残
基が並列するためt−PAとPAI−1の相互作用は崩
壊すると予想される。
然変異誘発を行い、Lys296,Arg298、又はArg
299がGlu残基により置換されたt−PA変異株をコ
−ドするcDNAの構築に使用した。これらの3個の残
基のすべてがGluに置換された、t−PAの3重変異
株をコ−ドするcDNAも構築した。さらに2個のcD
NAを製造した;ひとつはHis297がTyr残基によ
り置換されたt−PA変異株をコ−ドし、他方はPro
301がGlyにより置換された酵素をコ−ドする。
6種類の突然変異誘発プライマ−の配列は以下である: t-PA(K296->E):5′-ATCTTTGCCGAGCACAGGA-3′ t-PA(H297->Y):5′-TTTGCCAAGTACAGGAGGT-3′ t-PA(R298->E):5′-GCCAAGCACGAGAGGTCGCCC-3′ t-PA(R299->E):5′-AAGCACAGGGAGTCGCCCGG-3′ t-PA(P301->G):5′-AGGAGGTCGGGCGGAGAGCG-3′ t-PK(K296, R298, R299 -> E, E, E): 5′-GCCATCTTTGCCGAGCACGAGGAGTCGCCCGGAGA-3′ 変異酵素t−PA(K296−>E),t−PA(H297−
>Y),t−PA(R 298−>E)及びt−PA(P301
−>G)を上記の要領で遷移発現ベクタ−pSVT(R
I-)に連結した。
−>E,E,E)、及びt−PA(R299−>E)をコ
−ドするcDNAを遷移発現ベクタ−pSTEに連結し
た。pSTEはpSVT7の誘導体であり、pSTV7
の350bp ClaI−HindIIIプロモ−タ−
/オリジン フラグメントをSV40 cs1085の
プロモ−タ−/オリジン領域からの418bp Hpa
LL−HindIIIフラグメントで置換することによ
り構築した(Dimaio,D.等,J.Mol.Bi
ol.,140:129−142(1980))。
I-)/t−PA(K296−>E),pSVT7(RI-)
/t−PA(H297−>Y);pSVT7(RI-)/t
−PA(R298−>E);pSTE7(RI-)/t−P
A(R299−>E);pSVT7(RI-)/t−PA
(R301−>G);及びpSTE7(RI-)/t−PA
(K296,R298,R299−>E,E,E)と称した。
n,D.等,DNA Cloning,1巻,Glov
er,D.M.,I.R.L.Press,Oxfor
d,頁109−135(1985))を上記の変異プラ
スミドを用いて形質転換し、得られた株をそれぞれpS
VT7(RI-)/t−PA(K296−>E)[DH−
1],pSVT7(RI-)/t−PA(H297−>Y)
[DH−1];pSVT7(RI-)/t−PA(R298
−>E)[DH−1];pSTE7(RI-)/t−P
A(R299−>E)[DH−1];pSVT7(RI-)
/t−PA(R301−>G)[DH−1];及びpST
E7(RI-)/t−PA(K296,R298,R299−>
E,E,E)[DH−1]と称した。正しいフラグメン
トの存在を、適した放射活性突然変異誘発オリゴヌクレ
オチドへのハイブリッド形成により確認し、フラグメン
トの配向を、適した突然変異誘発オリゴヌクレオチドを
プライマ−として使用した制限マッピング、及びDNA
配列決定により確認した。
>E)[DH−1];pSTE7(RI-)/t−PA
(R299−>E)[DH−1];及びpSTE7(R
I-)/t−PA(K296,R298,R299−>E,E,
E)[DH−1]をAmerican Type Cu
lture CollectionにてそれぞれATC
C番号68157,68154及び68153として供
託した。
でCOS細胞のトランスフェクションに使用した。得ら
れた条件下の培地の希釈液(典型的には1:300)、
及び免疫精製酵素の両方を用いて上記の要領でアッセイ
を行った。
ゲン(25μg/ml)及び種々の濃度(0.02−
0.16μM)の基質、Lys−プラスミノ−ゲンの存
在下における種々の形態の酵素のアッセイにより野生
型、及び変異株t−PAのKm及びKcat値を決定した。
結果を下表XIに示す。
もt−PAとその基質との相互作用を変化させなかっ
た。
PAとその正のエフェクタ−であるDes−A−フィブ
リノ−ゲンとの相互作用を変えなかったことを示してい
る。逆に図8に示したデ−タは野生型t−PAと変異t
−PAのいくつかの挙動における明確な差を示してい
る。特に3種類の変異株t−PA、すなわちt−PA
(R298−>E),t−PA(R299−>E)及びt−P
A(K296,R298,R299−>E,E,E)の場合、セ
ルピン、PAI−1と正常に相互作用する能力が実質的
に変化した。特に三重変異株の挙動は顕著である;20
0倍モル以上過剰のPAI−1と共に予備的インキュベ
−トを行った後でさえ活性の損失を示さない。これらの
発見はt−PAの表面ル−プ、すなわち残基396−3
02が特異的に同起源の阻害剤PAI−1と相互作用す
るという提案を支持しており、この相互作用にArg
298及びArg299が含まれることを示唆している。これ
らの観察はt−PA、及びPAI−1の間の特異的相互
作用に静電的結合が含まれるという仮定を満足する。こ
れらの相互作用に含まれるt−PAの残基はAr
g298,Arg299及びArg304である。
t−PAを、及びセリン プロテア−ゼ インヒビタ−
としてPAI−1を使用する場合を対象としているが、
上記のようなキモトリプシン ス−パ−ファミリ−の他
のセリン プロテア−ゼ、及び上記のような他のセリン
プロテア−ゼ インヒビタ−を、本発明の精神及び範
囲から逸脱することなく本文の方法を用いて容易に使用
することができる。
−1の発現、精製、及びアッセイ PAI−1をコ−ドする3.2kb及び2.2kb m
RNAから誘導した2種類のcDNAクロ−ン(Ny,
T.等,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,83:6776−6780(1986);及びPa
nnekoek,H.等,EMBO J.,5:253
9−2544(1986))を使用して哺乳類発現ベク
タ−中に全長のcDNAを構築した。第1のクロ−ン、
ラムダPAI−1は、ヒトの胎盤性cDNAライブラリ
からスクリ−ニングにより得たcDNAの先端を切り取
ったバ−ジョンであり(Dr.Carol Mende
lson Center,Dwpartment of
Biochemistry,Southwester
n Medical Center,Dallas,T
Xより提供)PAI−1の以下の8アミノ酸配列に対応
する合成オリゴヌクレオチドを有する(AVDQLTR
L)(Ny,T.等,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,83:6776−6780(198
6);及びPannekoek,H.等,EMBO
J.,5:2539−2544(1986))。Eco
RIを用いた消化によりこのクロ−ンから放出されるD
NAのフラグメントはNy,T.等,Proc,Nat
l.Acad.Sci.USA,83:6776−67
80(1986)に報告されているPAI−1配列のヌ
クレオチド147−2013に対応した。このフラグメ
ントをプラスミドベクタ−pUC 18(Yanisch
−Perron,C.等,Gene,33:103−1
19(1985))にサブクロ−ニングし、組み替えプ
ラスミドpPAI−1を得た。このプラスミドからの挿
入を、バクテリオファ−ジ ラムダ gtllに構築し
たヒトの内皮細胞cDNAライブラリのスクリ−ニング
に使用した(Huynh,T.等,DNA Cloni
ng,1巻,出版 Glover,D.M.,I.R.
L.Press,Oxford,頁49−88(198
5))。このようにして単離したcDNA クロ−ンの
ひとつ、すなわちラムダ PAI−1−11Aは、5’
末端に2個の余分なヌクレオチドが存在する以外既報の
(Pannekoek,H.等,EMBO J.,5:
2539−2544(1986))PAI−1 cDN
Aと同一配列の挿入を持つ。このクロ−ンの5’末端、
ヌクレオチド52−1479から誘導したEcoRI−
BglIIフラグメントをpPAI−1の3’BglI
I−EcoRIフラグメントに融合させ、pPAI−1
−RBRを得た。
用したSV40ベクタ−は以下の要領で構築した。pP
AI−1−RBRから放出されたEcoRIフラグメン
トの末端にE.coli DNAポリメラ−ゼのクレノ
ウ フラグメントを満たし、合成XbaI リンカ−に
連結し、プラスミドpSV/t−PA3中のt−PAフ
ラグメントの代わりに挿入し、pSVL−PAI−1を
得た(Sambrook,J.等,Mol.Biol.
Med.,3:459−481(1986))。SVL
−PAI−1の株を製造し、Doyle,C.等,J.
Cell.Biol.,105:704−714(19
85)に記載の要領で増殖させた。
BO J.,5:2539−2544(1986)及び
Ginsberg,D.等,J.Clin.Inves
t.78:1673−1680(1986)に記載され
たPAI−1 クロ−ンはpPAI−1−RBRにより
コ−ドされる配列と同一配列のPAI−1タンパク質を
コ−ドし、SVL−PAI−1の構築にpPAI−1−
RBRの代わりに使用することができた。
長させ、SVL−PAI−1を注入した。24時間後、
培地を血清を含まないダルベッコの培地(GIBCO,
Inc.)に置換し、さらに48時間インキュベ−ショ
ンを続けた。その後分泌されたPAI−1を含む上澄み
培地を0.45ミクロンのフィルタ−(Nalge C
o.)を通して濾過した。Nonidet P40(S
igma Chemical Co.)、及び1.0M
のリン酸ナトリウム(pH7.2)緩衝液をそれぞれ
0.1%(v/v)、及び10mMの濃度まで加えた。
安定化した培地を、20mMのリン酸ナトリウム(pH
7.2)、135mMのNaCl、7.0mMのKCl
から成る緩衝液(後文では”PBS”)を用いて1時間
当たり50mlの流量で平衡化したコンカナバリアン
A−セファロ−ス 4Bのアフィニティ− カラム(充
填床容量1.0ml)に適用した。カラムを0.1%
(v/v)のNonidet P40を含むPBS、2
5容量、0.1%(v/v)のNonidet P4
0、及び1.0MのNaClを含むPBS25容量、及
び最後に20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.
2)10容量で連続的に洗浄した。結合PAI−1は2
0mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中の
0.5Mのアルファ−メチル−D−グルコシド(Sig
ma Chemical Co.)で特異的に溶離し
た。PAI−1を含む留分(上記間接的色素澱粉法にお
いてCalbiochem,Inc.からのウロキナ−
ゼの阻害により分析して)をプ−ルした。その後Non
idet P40を0.1%(v/v)の濃度まで加
え、プ−ルした溶離物1ml当たり0.57gのグアニ
ジン ヒドロクロリド(U.S.Biochemica
ls)を加えた。このようにして得た部分的精製PAI
−1を20mMのリン酸ナトリウムから成る緩衝液(p
H7.2)、及び10%(v/v)のグリセロ−ルに対
して透析し、使用まで−80℃にてアリコ−トとして保
存した。
μg/mlの全タンパク質(Biorad Inc.販
売によるBradfordの試薬により分析)、及び1
2.5%(w/v)のSDS−ポリアクリルアミドゲル
の染色により分析して15μg/mlのPAI−1を含
んでいた。ウロキナ−ゼ(それ自身は3H−ジイソプロ
ピルフルオロホスフェ−ト(New England
Nuclear,Inc.からのNET−065)を用
いた滴定により活性52%)に対する滴定により、本文
の記載に従って製造したPAI−1の活性は16.6%
であり、活性PAI−1の濃度は48nMであることが
明らかになった。
の選択 PAI−1の残基Glu350及びGlu351がt−PAと
相互作用するという仮定を試験するため、特定オリゴヌ
クレオチドの突然変異誘発を使用して下表XIIに示す
PAI−1の2種類の変異株を形成した。
(E351−>R)はそれぞれGlu350及びGlu351の
Argへの置換を含み、負に帯電したGlu残基を正に
帯電したArg残基に代え、t−PA(R304−>E)
に存在する負に帯電したGlu残基との有力な相互作用
を促進するために選択的に選んだ。置換がt−PAの残
基Arg304に導入された特異的変異と相補的であれ
ば、Glu350をt−PA(R304−>E)変異株などと
の相互作用が強化されたPAI−1を形成する他のいろ
いろな置換基に、本発明の精神及び範囲から逸脱するこ
となく置換することができた。
介突然変異誘発 第1に、メチオニル−PAI−1を直接発現し、1方で
発現ベクタ−からのシグナル配列及びcDNAの3’非
翻訳領域を除去するための、プラスミド pPAIST
7と称するPAI−1発現プラスミドの構築が必要であ
った。この達成のため、合成DNAリンカ−を使用して
PAI−1コ−ド配列の両末端の再構築、及び成熟PA
I−1の第1残基をコ−ドするトリプレットの直前にA
TGタンパク質合成開始コドンの導入を行った。さらに
プラスミドpBR322へのcDNAコ−ド領域の挿入
を容易にするため、PAI−1 cDNAフラグメント
のそれぞれ5’及び3’末端に、EcoRI及びHin
dIII制限エンドヌクレア−ゼ認識部位を形成するリ
ンカ−を設計した。
PAI−1−RBRを消化することによりプラスミドp
PAIST7を得た。得られたPAI−1の残基1のた
めの2bpのコドン、及び379残基タンパク質の残基
2−376のための全コ−ド配列を含む1127bpフ
ラグメントをゲル電気泳動により精製した。次に合成リ
ンカ−(5’末端にて10bp、及び3’末端にて13
bp)を1127bpApaLI、及びPflMI D
NAフラグメントと連結し、EcoRL及びHindI
IIを用いて消化し、1146bp EcoRI−及び
HindIII−消化DNAフラグメントをゲル電気泳
動により単離した。その後このフラグメントをEcoR
I−及びHindIII−消化pBR322にクロ−ニ
ングした。
ブクロ−ンをEcoRIで消化し、直鎖プラスミドを細
菌のアルカリホスファタ−ゼを用いて脱ホスホリル化し
た。その後trpプロモ−タ−、及びリボソ−ム結合部
位を含むpC5A−48からの360bp EcoRI
DNAフラグメント(Franke,A.等,Met
h.Enzymol.,162:653−668(19
88))を用いて、二フラグメントを連結することによ
りPAI−1発現プラスミドを構築した。次に、得られ
たプラスミドを用い、Maniatis,T.等,Mo
lecularCloning:A Laborato
ry Manual,第1版,ColdSpring
Harbor(1982)に記載の要領でE.coli
の形質転換を行った。得られた形質転換物のプラスミド
DNAをHindIIIを用いた制限分析によりtrp
プロモ−タ−フラグメントの存在、及び配向に関してス
クリ−ニングを行った。多くの形質転換物がtrpプロ
モ−タ−に隣接して阻害剤の直接の発現に必要な立体配
置でPAI−1遺伝子を持つプラスミドを含むと同定さ
れた。それらのプラスミドのひとつをpPAIST7と
称した。
をコ−ドするPAI−1のヌクレオチド配列を含むプラ
スミドpPAIST7のSalI−HindIIIフラ
グメントをSalI−HindIII消化複製型M13
mp18(図9を参照)に連結した。連結DNAをE.
coli株TG−1にトランスフェクトした。組み替え
バクテリオファ−ジにより形成された白色プラ−クを採
取し、適した290塩基対SalI−HindIIIフ
ラグメントの存在をサザン ハイブリッド形成、制限マ
ッピング、及びDNA配列決定により確認した。
ラグメントにおける変異をt−PAについての上記の記
載の要領で5’−ホスホリル化合成突然変異誘発オリゴ
ヌクレオチドプライマ−を用いて導入した(図9を参
照)。これらのPAI−1変異株の構築に使用した2個
の突然変異誘発プライマ−の配列は以下である: PAI-1(E350->R):5′TGATGATCTCTCTTGGGGC 3′ PAI-1(E351->R):5′CCATGATGATTCTCTCGGGG 3′ 得られたPAI−1 DNAの変異株SalI−Hin
dIIIフラグメントの配列を完全に決定した。立証さ
れた変異株のDNAの二重鎖複製型を単離し、変異29
0塩基対SalI−HindIIIフラグメントをSa
lI−HindIII消化、及び6.0%(w/v)の
非変性ポリアクリルアミドゲルを通した電気泳動により
単離した。下記に詳細に記載する通り、変異を含むこれ
らのフラグメントを使用し、問題のPAI−1変異株を
コ−ドするPAI−1 cDNAのバ−ジョンを再構築
した。
−の構築 プラスミド pPAIST7HS(ヌクレオチド対1に
おけるHindIII部位、及びヌクレオチド対210
6におけるSalI部位の欠落したプラスミドpPAI
ST7の誘導体であり、PAI−1 cDNAコ−ド配
列における変異SalIのHindIIIフラグメント
への交換を容易にするために構築された)におけるPA
I−1の変異株を以下の要領で構築した:PAI−1
cDNAの中心290塩基対のSalIからHindI
IIまでのフラグメントを、SalI及びHindII
Iを用いた消化、及び1.0%(w/v)アガロ−スゲ
ル電気泳動によりプラスミドpPAIST7HSから除
去した。その後ベクタ−DNAの残留直鎖フラグメント
を特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発で製造した上
記の290塩基対SalIからHindIIIフラグメ
ントの変異株バ−ジョンに連結した(図9を参照)。得
られたプラスミドをpPAIST7HS(E350−>
R)及びpPAIST7HS(E351−>R)と称し
た。
n,D.等,DNA Cloning,1巻,出版 G
lover,D.M.,I.R.L.Press,Ox
ford,頁109−135(1985))を上記変異
プラスミドを用いて形質転換し、得られた株をそれぞれ
pPAIST7HS[DH−1];pPAIST7HS
(E350−>R)[DH−1];及びpPAIST7H
S(E351−>R)[DH−1]と称した。E.col
i株TG−1(Gibson,T.,Thesis,U
niversity of Cambridge,En
gland(1984))を上記変異プラスミドを用い
て形質転換し、得られた株をそれぞれpPAIST7H
S[TG−1];pPAIST7HS(E350−>R)
[TG−1];及びpPAIST7HS(E351−>
R)[TG−1]と称した。正しいフラグメントの存在
を適した放射標識突然変異誘発オリゴヌクレオチドへの
ハイブリッド形成、及び核酸配列決定により確認した。
pPAIST7HS(E350−>R)[DH−1];
及びpPAIST7HS(E351−>R)[DH−1]
をAmerican Type Culture Co
llectionにてそれぞれATCC番号68155
及び68156として供託した。
現、抽出、及びアッセイ E .coli株pPAIST7HS[TG−1],pP
AIST7HS(E35 0−>R)[TG−1],及びp
PAIST7HS(E351−>R)[TG−1]を、ル
リア−ベルタニ ブイヨン中で37℃にて飽和濃度まで
終夜成育した。50μlの培養物を使用して、1リット
ル当たり6.0gのNa2HPO4,3.0gのKH2P
O4,0.5gのNaCl,0.5gのNgSO4・7H
2O,1.0gのNH4Cl,5.0gのカサミノ酸、1
0.0gのグルコ−ス、10.0mlのグリセロ−ル、
1.0mgのチアミン−HCl、及び25mgのアンピ
シリンを含む修正M9培地(pH7.4)50mlに接
種した。250mlのア−レンメイヤ−フラスコ中、3
7℃にて培養細菌を22時間成育した。抽出細胞を以下
の要領で培養物から得た。
20mlの冷50mMトリス−HCl(pH8.0)、
及び1.0mMのEDTA中で遠心により洗浄し、氷上
の3.6mlの同緩衝液中に再懸濁した。1ml当たり
10mgのリソチ−ム0.4mlを添加して20分間、
0.1mlの10%(v/v)Nonidet P−4
0を添加して10分間、及び0.2mlの5.0M N
aClを添加して10分間抽出を行った。聴音器(sonif
ier)/細胞切断器のミクロチップを50%使用サイク
ル、及び設定7(Branson Sonic Pow
er Company)で使用して細胞を短く切断し、
粘度を下げ、4℃にて30分間15,000xgの遠心
を行った。透明な溶菌体に10%(v/v)までグリセ
ロ−ルを加え、PAI−1を含む抽出物を使用まで−8
0℃にてアリコ−トとして保存した。
上記に記載した要領でウロキナ−ゼを用いて24℃にて
3時間インキュベ−トすることにより、抽出物を活性P
AI−1に関して滴定した。野生型PAI−1、PAI
−1(E350−>R)、及びPAI−1(E351−>R)
の抽出物はそれぞれ803nM、593nM、及び16
2nMの活性PAI−1を含んでいた。
び変異株PAI−1の相互作用の速度に関する速度論的
測定を、0.1mMのEDTA及び0.1%(v/v)
のツイ−ン20を含む0.1Mトリス−HCl緩衝液
(pH7.4)中、24℃にて行った。上記のt−PA
に関する間接的色素澱粉法を用いて残留酵素活性を時間
の関数として決定した。t−PAに対して過剰のPAI
−1の偽−1次条件下で、時間に対する残留t−PA活
性の直線状片対数プロットの傾きから各阻害剤濃度に関
して半減期(t1/2)を決定した。見掛けの速度定数
(kapp=0.693/t1/2)を阻害剤濃度で割って速
度定数、k1を算出した。
1次条件下で0.6−100nMの範囲の阻害剤濃度に
て研究した。t−PA−PAI−1混合物をマイクロタ
イタ−プレ−トウェル中、24℃にて種々の時間(0−
30分)予備的にインキュベ−トし、その後Lys−プ
ラスミノ−ゲン、スペクトロザイム PL、及びDes
−A−フィブリノ−ゲンをそれぞれ最終濃度300n
M,0.4nM及び12.5μg/mlまで添加した。
基質の添加後、マイクロタイタ−プレ−トを37℃にて
インキュベ−トし、405nmにおける吸収を2次間追
跡して残留t−PA活性を決定した。
型、及び変異株t−PAの阻害の最高速度定数(M-1s
-1)を下表XIIIに示す。
R)及びPAI−1(E351−>R)の両方とも、野
生型PAI−1と比較してt−PA(R304−>E)と
の相互作用の速度定数が増加しており、変異によりセリ
ン プロテア−ゼインヒビタ−−抵抗性t−PA(R
304−>E)の阻害に関するPAI−1の能力が復活し
たことを証明している。 本発明を特別な具体化を参照
して詳細に説明したが、種々の変化及び修正が本発明の
精神、及び範囲から逸脱することなく可能であることが
同業者には明らかであろう。
セリン プロテア−ゼの配列の比較を示す。配列は、保
持されたアミノ酸の重複が示されるように並べた。トリ
プシン上の数字はプロテイン デ−タ バンクのPDB
3ptp.ent エントリ−で使用されている番号付
による。t−PA上の数字は成熟t−PA分子における
アミノ酸による。
ン ファミリ−の種々のメンバ−の配列の比較を示す。
配列は保持されたアミノ酸の重複がわかるように並べ
た。アルファ−1−アンチトリプシン下の数字、及びP
AI−1上の数字は成熟分子におけるアミノ酸残基によ
る。
ン ファミリ−の種々のメンバ−の配列の比較を示す。
配列は保持されたアミノ酸の重複がわかるように並べ
た。アルファ−1−アンチトリプシン下の数字、及びP
AI−1上の数字は成熟分子におけるアミノ酸残基によ
る。
ピン−抵抗性変異株の変異、及び発現に用いられたベク
タ−の構築を図示したものである。
性変異株の活性の間接的色素澱粉法における比較を示
す。図5で■は野生型t−PAを示し、〇はt−PA
(R 304−>S)を示し、□はt−PA(R304−>E)
を示し、・はt−PA(Del296-302)を示す。
t−PAのセルピン−抵抗性変異株の活性に対するPA
I−1の効果を示す。図6において、■は野生型t−P
Aを示し、〇はt−PA(R304−>S)を示し、□は
t−PA(R304−>E)を示し、・はt−PA(De
l296-302)を示す。
t−PAのセルピン−抵抗性変異株の活性の比較を示
す。図7において、□はt−PA(H297−>Y)を示
し、・は野生型t−PAを示し、+はt−PA(K296
−>E)を示し、■は三重変異株t−PA(K296,R
298,R299−>E,E,E)を示し、▲はt−PA(R
299−>E)を示し、△はt−PA(R298−>E)を示
し、〇はt−PA(P301−>G)を示す。
t−PAのセルピン−抵抗性変異株の活性に対するPA
I−1の効果を示す。図8において、□はt−PA(H
297−>Y)を示し、・は野生型t−PAを示し、+は
t−PA=K296−>E)を示し、■はt−PA
(K296,R298,R299−>E,E,E)を示し、▲は
t−PA(R299−>E)を示し、△はt−PA(R298
−>E)を示し、〇はt−PA(P301−>G)を示
す。
変異株の変異、及び発現に使用したベクタ−の構築を図
示したものである。
Claims (17)
- 【請求項1】 t−PAのセリンプロテアーゼインヒビ
ターによる阻害に対して抵抗性のt−PA変異体であっ
て、t−PAの304位置の塩基性アミノ酸が酸性アミ
ノ酸又は中性アミノ酸により置換されているt−PA変
異体。 - 【請求項2】 該t−PA変異体が304位置のアルギ
ニンがセリンで置換されているt−PA又は304位置
のアルギニンがグルタミン酸で置換されているt−PA
である請求項1に記載のt−PA変異体。 - 【請求項3】 t−PAのセリンプロテアーゼインヒビ
ターがPAI−1、PAI−2及びPAI−3から成る
群より選ばれる請求項1に記載のt−PA変位体。 - 【請求項4】 t−PAのセリンプロテアーゼインヒビ
ターによる阻害に対して抵抗性のt−PA変異体であっ
て、t−PAの304位置の塩基性アミノ酸が酸性アミ
ノ酸又は中性アミノ酸により置換されているt−PA変
異体をコードしている遺伝子。 - 【請求項5】 該t−PA変異体が304位置のアルギ
ニンがセリンで置換されているt−PA又は304位置
のアルギニンがグルタミン酸で置換されているt−PA
である請求項4に記載の遺伝子。 - 【請求項6】 t−PAのセリンプロテアーゼインヒビ
ターがPAI−1、PAI−2及びPAI−3からなる
群より選ばれる請求項4に記載の遺伝子。 - 【請求項7】 (A)t−PAの304位置の塩基性ア
ミノ酸が酸性アミノ酸又は中性アミノ酸により置換され
ている該t−PA変異体をコードしている遺伝子を含ん
で成るDNAにより形質転換された宿主細胞を培養し、
そして(B)生ずるt−PA変異体を単離することを特
徴とする、t−PAのセリンプロテアーゼインヒビター
による阻害に対して抵抗性のt−PA変異体を得る方
法。 - 【請求項8】 該t−PA変異体が304位置のアルギ
ニンがセリンで置換されているt−PA又は304位置
のアルギニンがグルタミン酸で置換されているt−PA
である請求項7に記載の方法。 - 【請求項9】 該t−PAのセリンプロテアーゼインヒ
ビターがPAI−1、PAI−2及びPAI−3からな
る群より選ばれる請求項7に記載の方法。 - 【請求項10】 (A)t−PAの304位置の塩基性
アミノ酸が酸性アミノ酸又は中性アミノ酸により置換さ
れているt−PA変異体を得、そして(B)t−PAの
セリンプロテアーゼインヒビターによる阻害に対して抵
抗性のt−PA変異体をスクリーニングする、ことを特
徴とする、t−PAのセリンプロテアーゼインヒビター
による阻害に対して抵抗性のt−PA変異体を提供する
方法。 - 【請求項11】 該t−PA変異体が304位置のアル
ギニンがセリンで置換されているt−PA又は304位
置のアルギニンがグルタミン酸で置換されているt−P
Aである請求項10に記載の方法。 - 【請求項12】 該t−PAのセリンプロテアーゼイン
ヒビターがPAI−1、PAI−2及びPAI−3から
成る群より選ばれる請求項10に記載の方法。 - 【請求項13】 t−PAの304位置の塩基性アミノ
酸を産生アミノ酸又は中性アミノ酸で置換することを特
徴とする、t−PAのセリンプロテアーゼインヒビター
による阻害に対して抵抗性のt−PA変異体を得る方
法。 - 【請求項14】 該t−PA変異体が304位置のアル
ギニンがセリンで置換されているt−PA又は304位
置のアルギニンがグルタミン酸で置換されているt−P
Aである請求項13に記載の方法。 - 【請求項15】 該t−PAのセリンプロテアーゼイン
ヒビターがPAI−1、PAI−2及びPAI−3から
成る群より選ばれる請求項13に記載の方法。 - 【請求項16】 ATCC寄託番号67894を有し且
つ304位置のアルギニンがセリンで置換されているt
−PAをコードするpSVT7(RI-)/t−PA
(R304→S)[DH−1]、又はATCC寄託番号6
7896を有し且つ304位置のアルギニンがグルタミ
ン酸で置換されているt−PAをコードするpSVT7
(RI-)/t−PA(R3 04→E)[DH−1]。 - 【請求項17】 304位置のアルギニンがセリンで置
換されているt−PAをコードするプラスミドpSVT
7(RI-)/t−PA(R304→S)、又は304位置
のアルギニンがグルタミン酸で置換されているt−PA
をコードするプラスミドpSVT7(RI-)/t−P
A(R304→E)。
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