HU217101B - Javított fibrinolitikus tulajdonságokkal és thrombingátló hatással rendelkező bifunkciós urokinázvariánsok - Google Patents

Javított fibrinolitikus tulajdonságokkal és thrombingátló hatással rendelkező bifunkciós urokinázvariánsok Download PDF

Info

Publication number
HU217101B
HU217101B HU9402063A HU9402063A HU217101B HU 217101 B HU217101 B HU 217101B HU 9402063 A HU9402063 A HU 9402063A HU 9402063 A HU9402063 A HU 9402063A HU 217101 B HU217101 B HU 217101B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
pro
gly
glu
val
leu
Prior art date
Application number
HU9402063A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9402063D0 (en
HUT70579A (en
Inventor
Regina Heinzel-Wieland
Derek John Saunders
Johannes Schneider
Gerd J. Steffens
Stephan Wnendt
Original Assignee
Grünenthal GmbH.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Grünenthal GmbH. filed Critical Grünenthal GmbH.
Publication of HU9402063D0 publication Critical patent/HU9402063D0/hu
Publication of HUT70579A publication Critical patent/HUT70579A/hu
Publication of HU217101B publication Critical patent/HU217101B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Javítőtt fibrinőlitikűs tűlajdőnságőkkal és thrőmbingátló hatássalrendelkező bifűnkciőnális űrőkinázvariánsők, e pőlipeptidekelőállításánál felhasználható plazmidők, és hatóanyagként egybifűnkciőnális űrőkinázvariánst tartalmazó thrőmbőlitikűmők kerülnekismertetésre. A találmány szerinti bifűnkciőnális űrőkinázvariánsők az(I) általánős képletnek felelnek meg – mely képletben M4 jelentése az1. ábra szerinti, nem glikőzilezett prőűrőkináz 47Ser és 411Leűközötti aminősavszekvenciája; X1 jelentése az M4 és Y1 közötti kötés,vagy valamely Ser-Prő-Prő-Ser- Prő-Prő-Gly-Gly-PhevagySer-Prő-Prő-Ser-Prő-Prő-Ser-Prő-Prő-Gly-Gly- PhevagySer-Prő-Prő-Ser-Prő-Prő-Ser-Prő-Prő-Gly-Gly-Phe-Glyképletű peptid; vagy valamely (II) általánősképletű peptidszekvencia – ahől X2 jelentése Prő vagy Leű; X3jelentése Val vagy Prő; X4 jelentése Lys, Val, Arg, Gly vagy Glű; X5jelentése Ala, Val, Gly, Leű vagy Ile; X6 jelentése Phe, Trp, Tyr vagyVal, és X7 jelentése Gly, vagy X6 és Y1 közötti közvetlen kötés –; ésY1 jelentése valamelyY2-Arg-Prő-Y3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly- Asp-Phe-Glű-Glű-Ile-Prő-Glű-Glű-Tyr-Leű-Y4; vagy va- lamelyY2-Arg-Prő-Phe-Leű-Leű-Arg-Asn-Prő-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glű-Prő-Phe- Trp-Glű-Asp-Glű-Glű-Lys-Asn-Glű; vagyY2-Arg-Prő-Ser-Ser-Glű-Phe- Glű-Glű-Phe-Glű-Ile- Asp-Glű-Glű-Glű-Lysáltalánős képletnek megfelelő szekvenciájú peptid, ahől isY2 jelentése Prő vagy Val; Y3 jelentése Leű, vagy Prő és Gly közöttiközvetlen kötés, és Y4 jelentése Gln vagy hidrőxilcsőpőrt. ŕ

Description

A leírás terjedelme 30 oldal (ezen belül 19 lap ábra)
HU 217 101 Β
Υ ι jelentése valamely
Y 2-Arg-Pro-Y 3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly- AspPhe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Y4; vagy valamely
Y2-Arg-Pro-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-AspLys-Tyr-Glu-Pro-Phe-Trp-Glu-Asp-Glu-Glu-LysAsn-Glu; vagy
Y2-Arg-Pro-Ser-Ser-Glu-Phe-Glu-Glu-Phe-Glu-IleAsp-Glu-Glu-Glu-Lys általános képletnek megfelelő szekvenciájú peptid, ahol is Y2 jelentése Pro vagy Val; Y3 jelentése Leu, vagy Pro és Gly közötti közvetlen kötés, és Y4 jelentése Gin vagy hidroxilcsoport.
Találmányunk javított fibrinolitikus tulajdonságokkal és thrombingátló hatással rendelkező bifunkcionális urokinázvariánsokra, e polipeptidek kinyerésénél felhasználható plazmidokra, valamint hatóanyagként valamely bifunkcionális urokinázvariánst tartalmazó thrombolitikumokra vonatkozik.
Az emberi vér fontos tulajdonsága, hogy a vérutak sérüléseinek thrombusképződéssel történő elzárására képes. A véralvadást a vérben jelen levő számos enzim hozza létre, amelyek az úgynevezett alvadáskaszkádban végül is odavezetnek, hogy a thrombin nevű enzim a fibrinogén nevű előfehéijét proteolitikusan fibrinné alakítja. A fibrin a sérülés helyén thrombociták, eritrociták, és más vérkomponensek közreműködésével thrombus képződése közben polimerizálódik.
A vér továbbá egy sor olyan enzimet tartalmaz, amelyek a véralvadás ellen hatnak és a véráramlást az érfalak regenerálódása után helyreállítják. A thrombolízis szempontjából legfontosabb enzim a plazmin, amely a fibrinrostot proteolitikusan megtámadja, és ezáltal a thrombusok feloldódását idézi elő. A plazmin a plazminogén nevű, inaktív előfehétje proteolitikus hasítása útján képződik. Az aktiválást a plazminogénaktivátor a plazminogén proteolitikus hasításával idézi elő. Két emberi endogén plazminogénaktivátor ismert: a vizeletben előforduló plazminogénaktivátor (urokináz) és a szövet-plazminogénaktivátor.
A szívinfarktus és agyinfarktus a thrombusok patologikus képződésével szoros összefüggésben van. Mindkét infarktusforma esetében - főként az artériák arterioszklerotikus elváltozásai következtében - meghatározott körülmények között az érfalakon thrombusok keletkeznek. Ezek a thrombusok az artériákban a véráramlást zavaiják, és emiatt a szövetek megfelelő oxigénellátása már nem biztosított. Fentiek szívinfarktus esetében a szívizom részleges vagy teljes elhalásához vezetnek. Ennek megfelelően az agyi artériák elzáródása az agyszövet súlyos károsodását eredményezi.
Az infarktusban szenvedő betegek gyógyításához thrombolitikumként plazminogénaktivátorokat alkalmaznak, amelyek a thrombusoknak plazmin által történő lebontását megkezdik. Jelenleg a gyógyászat számára a sztreptokináz, APAC (Anizolált Plazminogén Sztreptokináz Aktivátor Komplex), kétláncú urokináz (UK), rekombináns egyláncú urokináz (rekombináns prourokináz) és a szövet-plazminogénaktivátor (tPA) áll rendelkezésre [Collen und Lijnen, Blood 78, 3114-3124. (1991)]. A sztreptokináz hemolitikus sztreptokokkuszok fehéijéje. A sztreptokináz a plazminogént oly módon aktiválja, hogy a plazminogénnel komplexet képez és ezáltal a plazminogént aktív konformációvá alakítja. Ez a komplex maga is a szabad plazminogént plazminná ala15 kítja át, amely ismét sztreptokinázhoz kötődő plazminogént hasít. A sztreptokináz továbbfejlesztett formája az APSAC, amely sztreptokinázból és emberi plazminogénből in vitro előállított vegyület. Az APSAC a plazminogén aktív centrumának kémiai módosítása révén sztreptokinázzal szemben hosszabb biológiai felezési idővel rendelkezik.
Az urokináz a vizeletből proteolitikusan aktív fehérjeként két formában kinyerhető emberi fehéije: éspedig a nagymolekulájú urokináz (HŰK) és a kismolekulájú urokináz (LUK) [Stump et al.: J. Bioi. Chem. 261, 1267-1273. (1986)]. A HŰK és LUK kétláncú molekulák. Az urokináz egyláncú urokinázként (prourokináz) különböző szövetekben képződik és az emberi vérben proenzimként kis mennyiségben kimutatható [Wun et al.: J. Bioi. Chem. 257, 3276-3283. (1982)]. A prourokináz aktivált formája HUK-ként 54 kilodalton molekulatömegű és 3 tartományból áll: az aminoterminális növekedésfaktor-tartomány, a Kringel és a szerin-proteáztartomány [Günzler et al., Hoppe-Seyler’s Z. Physiol.
Chem. 363, 1155-1165. (1982); Steffens et al., HoppeSeyler’s Z. Physiol. Chem. 363, 1043-1058. (1982)]. Bár a prourokináz és plazminogén proenzim formájában van jelen, a prourokináz belső aktivitása révén plazminogénnek aktív plazminná történő átalakítására képes.
Ez a plazminogénaktivátor azonban teljes aktivitását csak azután nyeri el, hogy a képződő plazmin a ,5Slizin és 159izoleucin közötti prourokinázt már felhasította [Lijnen et al., J. Bioi. Chem. 261, 1253-1258. (1986)]. Az urokináz Escherichia coliban történő géntechnikai kinyerését először Heyneker írta le [Proceedings of the IVth International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms 1982]. A nem glikozilezett prourokinázt (szarupláz) egy szintetikus gén felhasználásával állítják elő [Brigelius-Flohé et al., Appl. Microbiol. Bio50 tech. 36, 640-649. (1992)].
A szövet-plazminogénaktivátor a vérben és szövetben előforduló, 72 kilodalton molekulatömegű fehéije. Ez a plazminogénaktivátor 5 tartományból áll: az aminoterminális Finger-tartományból, a növekedésfaktor55 tartományból, a Kringel 1-ből, a Kringel 2-ből és a szerin-proteáz-tartományból. A tPA - a prourokinázzal ellentétben - csak a fibrinhez történő kötődés után válik plazminogén hasítására képessé. A tPA-t - a prourokinázhoz hasonlóan - a Kringel 2 és a szerin-proteáz60 tartomány közötti plazminkatalizált hasítás alakítja aktív
HU 217 101 Β formává. Ekkor a szövet-plazminogénaktivátor a fibrinogén helyett a fibrinhez kötődik és ezáltal a plazminogén thrombusspecifikus módon aktiválódik. A kétláncú urokinázzal ellentétben az általános plazminogénaktiválást messzemenően elkerülik [Collen és Lujnen, Blood 75, 3114-3124. (1991)].
A 80-as évek kezdete óta a miokardiális infarktusnak thrombolitikumokkal történő aktív kezelése hatékonynak és eredményesnek bizonyult. Tanulmányok sora igazolta, hogy szívinfarktusban szenvedő betegeknek sztreptokinázzal, APSAC-kal, UK-val, rekombináns prourokinázzal vagy tPA-val történő kezelése a kezeletlen betegekhez viszonyítva jelentős mértékben csökkentett halálozáshoz vezet. A fenti anyagok gyógyászati hatékonyságának javítása céljából géntechnikai módszerekkel a szövet-plazminogénaktivátor és prourokináz számos származékát állították elő. A fibrinolitikus aktivitás növelése és a mellékhatások csökkentése mellett bólusz alakjában történő felhasználásra alkalmas formák kifejlesztése az érdeklődés középpontjába került. A plazminogénaktivátorok javításával foglalkozó tanulmányok és közlemények áttekintése az alábbi irodalmi helyen található : „Thrombosis and Haemostasis” 66, 88-110. (1991) és „Trends in Biotech.” 9,86-90. (1991).
A plazminogénaktivátoroknak a lizálógyógyászatban mutatott hatékonyságának javítása és különösen a biológiai felezési idő növelése céljából a szövet-plazminogénaktivátor törlésekkel és helyettesítésekkel képezett variánsait állították elő. Ennek során például a Finger- és növekedésfaktor-tartományt eltávolították vagy a szerin-proteáz-tartományt az urokináz szerin-proteáztartományával cserélték ki (Collen et al., Thromb. Haemostasis 65, 174-180. (1991); Fromage et al., Fibrinolysis 5, 187-190. (1991); Lu et al., Blood 78, 125-131. (1991)]. Ténylegesen azt találták, hogy a Finger- és növekedésfaktor-tartomány törlése a tPA-variánsok biológiai felezési idejét megnövelte [Lijnen és Collen, Thromb. Haemostasis 66, 94-95. (1991)]. A tPA két Kringel-tartományából és az UK szerin-proteáz-tartományából álló törlési és helyettesítéses variáns az eredeti, meg nem változtatott plazminogénaktivátorokat a thrombolízis során mutatott jelentősen nagyobb felezési idejében múlja felül. Ezek a plazminogénaktivátor-variánsok azonban csupán csekély fibrinspecifikussággal rendelkeznek [Lu et al., Blood 78, 125-131. (1991)].
Nagyobb fibrinspecifikusságú plazminogénaktivátorok előállítása céljából különböző kísérleteket végeztek. A vérzés veszélyének csökkentése végett célszerű, hogy az ilyen hatóanyagok a plazminogént lehetőleg kizárólag a thrombus közelében aktiválják, azonban szisztémás plazminogénaktiválást ne idézzenek elő. így például a tPA olyan variánsa ismert, amelynél a Kringel 1-et az eredeti molekula Kringel 2 tartományával cserélték ki. Ez a variáns az N-terminális lizinmaradékokhoz megnövekedett affinitást mutat, a fibrinhez azonban nem. Ez a variáns állatmodellben thrombolízis tekintetében az eredeti szövet-plazminogénaktivátomál nem bizonyult hatásosabbnak [Collen et al., Thromb. Haemostasis 65, 174-180. (1991)]. A thrombusspecifikus antitestek és plazminogénaktivátorok fiiziójából álló más ismert variánsok állatmodellben az eredeti plazminogénaktivátoroknál hatásosabbnak bizonyultak [Lijnen és Collen, Thromb. Haemostasis 66, 88-110. (1991)]. A Desmodus retundus denevérből izolált plazminogénaktivátor nagyon magas fibrinspecifikussággal rendelkezik [Gardell et al., J. Bioi. Chem. 264, 17 947-17 952. (1989)]. Ez a plazminogénaktivátor állatkísérletben tPA-val szemben nagyobb felezési idő és kisebb szisztémás plazminogénaktiválás mellett javított thrombolízist mutat [Gardell et al., Circulation 84, 244-253. (1991); Mellott et al., Arterioscl. Thromb. 72,212-221.(1992)].
A szívinfarktusban szenvedő betegek plazminogénaktivátorokkal történő kezelésének sikere azonban nem csupán a thrombolízistől ffigg, hanem attól is, hogy a megnyitott véredények újraelzáródását milyen mértékben sikerül megakadályozni. Különböző felismerések arra mutatnak, hogy a thrombusokban megkötött thrombin a thrombolízis során aktív enzimként újra felszabadul és az erek újraelzáródását okozhatja [Szczeklik et al., Arterioscl. Thromb. 72, 548-553. (1992); Eisenberg, Circulation 84, 2601-2603. (1991)]. A thrombolitikumok hatása a thrombininhibitor hatású heparin egyidejű vagy előzetes hozzáadásával ténylegesen javítható. A lizálógyógyászatban Argatroban, Hirugen vagy C-fehérje hozzáadásával az újraelzáródás fellépése csökkenthető [Schneider, Thromb. Rés. 64, 677-689. (1990); Yao et al., Am. Physiol. 262 (Heart Circ. Physiol. 31, Η 374-H 379. (1992); Gruber et al., Circulation 84, 2454-2462. (1991)]. Ismeretes továbbá, hogy szívinfarktusban szenvedő betegek halálozási aránya heparin előzetes hozzáadásával és prourokináz azt követő alkalmazásával a kontrollcsoporttal (prourokináz alkalmazása, előzetes heparin-hozzáadás nélkül) szemben szignifikáns mértékben csökkenthető [Tebbe et al., Z. Kardiol. 80, Suppl. 3,32 (1991)].
Az egyik leghatékonyabb thrombininhibitomak a Hirudo medicinales piócából izolált hirudin bizonyult, amely karboxiterminális végével a thrombin úgynevezett anionkötődési helyéhez specifikusan kötődik. A hirudinmolekula aminoterminális felének bizonyos aminosavai a thrombin szubsztrátumkötődési tasakjához vezető bejáratot lezárják [Rydel et al., Science 249, 2TJ-2&0. (1990)]. Ezenkívül ismeretes, hogy a thrombint a hirudin kisebb származékai is gátolják; e tekintetben különösen a Maragonare és társai által leírt [Biochemistry 29, 7095-7101. (1990)] hirulogmolekulákat kell kiemelni [Krstenansky et al., J. Med. Chem. 30, 1688-1691. (1987); Yue et al., Protein Engineering 5, 77-85. (1992)].
A 328957 és 365468 számú európai közrebocsátási iratban hirudin valamely plazminogénaktivátorral együtt thrombotikus folyamatokkal összefüggő érmegbetegedések kezelésére történő felhasználását írták le. Hirudinszármazékoknak thrombolitikumokkal együtt történő gyógyászati felhasználása a WO 91/01142 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésből vált ismertté.
A thrombin továbbá egy olyan peptiddel gátolható, amely a humán thrombuszreceptor aminoterminális
HU 217 101 Β szekvenciájából származtatható le (Vu et al., Natúré 253, 674-677. (1991)]. A thrombinreceptor az aminoterminális tartományban szomszédos thrombinhasító helyet magában foglaló thrombinmegkötő szekvenciát tartalmaz. A receptorok thrombinmegkötő tartománya szerkezetében a hirudin karboxiterminális tartományához nagyon hasonló. A thrombin a receptort a receptorszekvencia hasításával aktiválja. A receptor és thrombin közötti affinitás alapján a receptor kötődési tartománnyal és módosított hasítóhellyel rendelkező fragmense thrombininhibitorként hat.
Hasonlóképpen a thrombin a hemidin 41-57 aminosavaiból leszármaztatható peptiddel gátolható (Strube et al., J. Bioi. Chem. 268, 8590-8595. (1993)].
Találmányunk célkitűzése thrombotikus folyamatokkal összefüggő érelzáródások kezelésére szolgáló olyan hatóanyagok előállítása, amelyek nagyon rövid időn belül teljes thrombolízist idéznek elő és egyidejűleg az ereknek a sikeres thrombolízis után bekövetkező újraelzáródását megakadályozzák. A találmányunk szerinti hatóanyagokkal szemben támasztott további követelmény a szisztémás plazminogénaktiválódás elkerülése.
Azt találtuk, hogy az ilyen hatóanyagokkal szemben támasztott magas követelményeket bizonyos bifünkcionális urokinázvariánsok kielégítik.
Találmányunk tárgya (I) általános képletű bifünkcionális urokinázvariánsok, mely képletben M4 jelentése az 1. ábra szerinti nem glikozilezett prourokináz 47Ser és 41 'Leu közötti aminosavszekvenciája; X, jelentése az M4 és Y[ közötti kötés, vagy valamely
Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe vagy
Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe vagy
Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-PheGly képletű peptid; vagy valamely (Π) általános képletű peptidszekvencia - ahol X2 jelentése Pro vagy Leu; X3 jelentése Val vagy Pro; X4 jelentése Lys, Val, Arg, Gly vagy Glu; X5 jelentése Alá, Val, Gly, Leu vagy Ile; X6 jelentése Phe, Trp, Tyr vagy Val és X7 jelentése Gly, vagy X6 és Yj közötti közvetlen kötés -; és
Yi jelentése valamely
Y 2-Arg-Pro-Y 3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-AspPhe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Y4; vagy valamely
Y2-Arg-Pro-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-AspLys-Tyr-Glu-Pro-Phe- Trp-Glu-Asp-Glu-Glu-LysAsn-Glu; vagy
Y2-Arg-Pro-Ser-Ser-Glu-Phe-Glu-Glu-Phe-GluIle-Asp-Glu-Glu-Glu-Lys általános képletnek megfelelő szekvenciájú peptid, ahol is Y2 jelentése Pro vagy Val; Y3 jelentése Leu, vagy Pro és Gly közötti közvetlen kötés, és Y4 jelentése Gin vagy hidroxilcsoport.
Az olyan (I) általános képletű bifunkcionális urokinázvariánsokban, amelyekben Y | jelentése valamely
Y2-Arg-Pro-Y3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-PheGlu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Y4 általános képletű peptidszekvencia (ahol Y2 jelentése
Pro vagy Val; Y3 jelentése Leu, vagy Pro és Gly közötti közvetlen kötés, és Y4 jelentése Gin vagy hidroxilcsoport);
X] jelentése előnyösen valamely (II) általános képletű peptidszekvencia (mely képletben X2 jelentése Pro vagy Leu; X3 jelentése Val; X4 jelentése Lys, Val vagy Arg; X5 jelentése Alá, Val vagy Gly; X6 jelentése Phe, Trp, Tyr vagy Val, és X7 jelentése Gly, vagy X6 és Y[ közötti közvetlen kötés).
A fenti (II) általános képletű peptidszekvenciát tartalmazó bifunkcionális urokinázvariánsok különösen előnyös képviselőiben X2 jelentése Pro vagy Leu; X3 jelentése Val; X4 jelentése Lys vagy Val; X5 jelentése Alá vagy Val; X6 jelentése Phe, Trp vagy Tyr, és X7 jelentése Gly, vagy X6 és Y[ közötti közvetlen kötés. Különösen előnyösek azok a származékok, amelyekben X7 jelentése X6 és Y! közötti közvetlen kötés.
Az (I) általános képletű olyan bifunkcionális urokinázvariánsokban, amelyekben Y, jelentése valamely Y2Arg-Pro-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-TyrGlu-Pro-Phe-Trp-Glu-Asp-Glu-Glu-Lys-Asn-Glu általános képletű peptidszekvencia (ahol Y2 jelentése Pro vagy Val), X! előnyösen valamely (II) általános képletű peptidszekvenciát képvisel (ahol X2 jelentése Pro vagy Leu; X3 jelentése Val; X4 jelentése Lys vagy Val; X5 jelentése Alá vagy Val; Xy, jelentése Phe vagy Trp, és X7 jelentése X6 és Y, közötti közvetlen kötés).
A találmányunk szerinti bifunkcionális urokinázvariánsok az ismert plazminogénaktivátorokkal és a valamely plazminogénaktivátorból és thrombininhibitorból álló ismert keverékekkel összehasonlítva előre nem látható mértékben jó thrombingátló tulajdonságokkal kísért, erősebb fibrinolitikus hatással rendelkeznek. Fentiekből következik, hogy a találmányunk szerinti polipeptidek meglepő módon kisebb mennyiségű plazmafibrinogént használnak fel. A szignifikáns mértékben megnövekedett, fentiekből következő fibrinspecifikusság - különösen valamely plazminogénaktivátorból és thrombininhibitorból álló ismert keverékekkel szemben mutatott szignifikánsan nagyobb fibrinspecifikusság - azt eredményezi, hogy a találmányunk szerinti polipeptid alkalmazása a vér alvadóképességét csupán kismértékben befolyásolja, és a szabályozatlan vérzésekből, illetve szisztémás fibrinogénlebomlásból eredő lehetséges komplikációk veszélye minimumra csökken. A találmányunk szerinti urokinázvariánsok magas fibrinspecifikussága tehát az ismert thrombolitikumok bóluszként történő alkalmazásával összehasonlítva jelentősen kisebb vérzési kockázattal járó bóluszfelhasználást tesz lehetővé.
Az (I) általános képletű bifunkcionális urokinázvariánsok toxikológiai szempontból biztonságosan alkalmazhatók és thrombotikus folyamatokkal összefüggő érelzáródásokban szenvedő betegeknek megfelelő gyógyászati készítmények formájában beadhatók.
Találmányunk tárgya továbbá thrombolitikum, amely hatóanyagként valamely (I) általános képletű bifünkcionális urokinázvariánst tartalmaz.
A találmányunk szerinti polipeptidek thrombotikus folyamatokkal összefüggő érelzáródások (például szív4
HU 217 101 Β infarktus, agyinfarktus, perifériás akut artériaelzáródás, tüdőembólia és mélyvénás láb- vagy medencetrombózis) kezelése során alkalmazandó dózisa általában 0,1 mg/kg és 1 mg/kg közötti érték. Az (I) általános képletű bifunkcionális urokinázvariánsok intravénásán és különösen bóluszinjekció formájában adagolhatok.
A találmányunk szerinti thrombolitikumok legalább egy, találmányunk szerinti bifunkcionális urokinázvariáns mellett segédanyagokat (például hordozóanyagok, oldószerek, hígítóanyagok, színezőanyagok és kötőanyagok) tartalmaznak. A segédanyagok kiválasztása, illetve a beadandó hatóanyag-mennyiség megállapítása a szakember kötelező tudásához tartozik.
A találmányunk szerinti bifunkcionális urokinázvariánsok géntechnikai eljárásokkal állíthatók elő.
Találmányunk tárgya ennek megfelelően az (I) általános képletű bifunkcionális urokinázvariánsok előállítására szolgáló olyan plazmidok, amelyeknek az operonja egy szabályozható promotort; egy riboszómamegkötő helyként hatékony Shine-Dalgamo-szekvenciát; egy startkodont; az (I) általános képletű bifunkcionális urokinázvariánsok számára valamely szintetikus strukturgént, és a strukturgéntől az áramlás irányában lefelé egy vagy két terminátort tartalmaz.
Szabályozható promotorként különösen a trp-promotor vagy tac-promotor bizonyult előnyösnek. Terminátorként előnyösen a trp-A terminátor és/vagy a Tn 10ből származó tét A/orf L terminátor alkalmazható.
A találmányunk szerinti plazmidok szabályozó tartományában a Shine-Dalgamo-szekvencia és a startkodon közötti távolság 6-12, előnyösen 8-10 nukleotid.
A találmányunk szerinti plazmidok kifejezését Escherichia coli törzsekben, különösen a K 12 csoportba tartozó Escherichia coli törzsekben végezhetjük el. Ezek példáiként az alábbi törzseket soroljuk fel: E. coli K 12 JM 101 (ATCC 33876), E. coli K 12 JM 103 (ATCC 39403), E. coli K 12 JM 105 (DSM 4162) és E. coli K 12 DH 1 (ATCC 33849).
A találmányunk szerinti bifunkcionális urokinázvariánsok a baktériumsejtekben zárványtestekben magas kitermeléssel vannak jelen; ezekben a fehérje denaturált formában található. A zárvány testek izolálása után a de5 naturált fehéijét egy redoxrendszer hatására fehéijekémiai úton a kívánt tercier szerkezetre hajtogatjuk vissza.
Találmányunk részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk.
Példák
1. példa
A találmányunk szerinti bifunkcionális urokinázvariánsok előállítása, izolálása és tisztítása
a) Klónozási műveletek
A találmányunk szerinti polipeptidek Escherichia coliban végrehajtott géntechnikai előállításához felhasznált kifejező plazmidokat önmagában ismert módon állítjuk elő. Az egyes előállítási lépéseket a 2. és 2a-2p ábrán tüntetjük fel. A plazmid előállításánál kiindulási termékként a pBlueskript KS II + (Firma Stratagene, Heidelberg), pUC8 (Fa. Pharmacia, Freiburg) és pGR201 plazmidokat alkalmazzuk. A pGR201 a 408945 számú európai közrebocsátási iratban és az Appl. Microbiol.
Biotech. 36, 640-649. (1992) közleményben leírt pBF160 plazmiddal azonos. A Banll, BamHI, Clal, HindlII, Ncol, Ndel, Nhel és NotI restrikciós endonukleázokat, valamint a DNS-módosító enzimeket (például alkálikus foszfatáz, T4-ligáz, T4-kináz és T7-polimeráz) a Pharmacia, Stratagene, Boehringer (Mannheim) és Gibco (Eggenstein) cégtől szereztük be. A plazmidok előállítás során bekövetkező változásait restrikciós analízissel és DNS-szekvencia-meghatározással ellenőrizzük. A DNS-szekvencia-meghatározást a Pharmacia cég reagensgyűjteményével, a gyártó cég előírásainak megfelelően hajtjuk végre. A plazmidok előállításánál különböző oligodezoxiribonukleotideket (Oligók) alkalmazunk, amelyeknek a szekvenciáit a hozzájuk tartozó jelölésekkel együtt az alábbi, 1. táblázatban ismertetjük.
1. táblázat
Oligomegjclölcs Oligoszekvencia (5’ —> 3’ leírva)
0105 TATGAGCAAAACTTGCTACGAAGGTAACGGTCACTTCTACCGTGGTAAGGCTTCTACCGACAC
0106 CATGGTGTCGGTAGAAGCCTTACCACGGTAGAAGTGACCGTTACCTTCGTAGCAAGTTTTGCT CA
0220 CGGTTAAGGCTTTCCCGAGGCCTGGTGGTGGTGGTAACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAG AGTACCTGTGATAGGATCAA
0221 CTAGTTGATCCTATCACAGGTACTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTTACCACCACCACCA GGCCTCGGGAAAGCCTTAACCGGGCT
0222 CGCCGAGCCCGCCGAGCCCGCCGGGTGGTTTCCCGAGGCCTGGTGGTGGTGGTAACGGTGACT TCGAAGAAATCCCGGAAGAGTACCTGTGATAGGATCAA
0223 CTAGTTGATCCTATCACAGGTACTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTTACCACCACCACCA GGCCTCGGGAAACCACCCGGCGGGCTCGGCGGGCTCGGCGGGCT
0224 CGCCGGGTGGTTTCCCGAGGCCTGGTGGTGGTGGTAACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAG AGTACCTGTGATAGGATCAA
0225 CTAGTTGATCCTATCACAGGTACTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTTACCACCACCACCA GGCCTCGGGAAACCACCCGGCGGGCT
HU 217 101 Β
1. táblázat (folytatás)
Oligomegjelölcs Oligoszekvoncia (5’ —> 3’ leírva)
0226 CGCCGAGCCCGCCGAGCCCGCCGGGTGGTTTCGGTCCGAGGCCTGGTGGTGGTGGTAACGGTG ACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAGTACCTGTGATAGGATCAA
0227 CTAGTTGATCCTATCACAGGTACTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTTACCACCACCACCA GGCCTCGGACCGAAACCACCCGGCGGGCTCGGCGGGCTCGGCGGGCT
0265 CACCCGGCGGAGACGGCGGGCTCAGAGCCAGACCGTTTTCTTCTTTGGTGTGAGAACG
0281 CGTCCGGGTGGTGGTGGTAACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGTAAG
0282 GATCCGTTCTCACACCAAAGAAGAAAACGGTCTGGCTCTGAGCCCGCCGTCTCCGCCGGGTGGI TTCCCG
0283 CTAGCTTACAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTTACCACCACCACCCGGACGCG GGAAAC
0329 AAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAATAAG
0330 CGGTTAAGGCTTGGGGACCGCGGCCGCTGGGTGGTGGTGGTAACGGTGACTTCG
0331 ACCACCACCCAGCGGCCGCGGTCCCCAAGCCTTAACCGGGCT
0332 CTAGCTTATTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTTACC
0333 CGGTTAAGGCTTTCGGACCGC
0334 GGCCGCGGTCCGAAAGCCTTAACCGGGCT
0335 CGGTTCGGGCTTTCGGTCCGC
0336 GGCCGCGGACCGAAAGCCCGAACCGGGCT
0337 CGGTTAAGGCTTACGGACCGC
0338 GGCCGCGGTCCGTAAGCCTTAACCGGGCT
0339 CGGTTGTTGCTTTCGGTCCGC
0340 GGCCGCGGACCGAAAGCAACAACCGGGCT
0341 CGGTTCGGGCTTTCCCGC
0342 GGCCGCGGGAAAGCCCGAACCGGGCT
0343 CGGTTAAGGCTTACCCGC
0344 GGCCGCGGGTAAGCCTTAACCGGGCT
0347 CGGTTGTTGCTTTCCCGC
0348 GGCCGCGGGAAAGCAACAACCGGGCT
0381 CGGTTAAGGCTTGGCCGC
0383 GGCCGCGGCCAAGCCTTAACCGGGCT
0384 CGGTTAAGGCTTTCCCGC
0385 GGCCGCGGGAAAGCCTTAACCGGGCT
0386 CGGTTGTAGTTTTCCCGC
0387 CGGTTGAAGTTTTCCCGC
0388 GGCCGCACTACAACTACAACCGGGCT
0389 CGGTTGTAGTTGTAGTGC
0390 GGCCGCGGGAAAACTTCAACCGGGCT
0391 GGCCGCGGGAAAACTACAACCGGGCT
0392 CTAGCTTATTCGTTTTTTTCTTCGTCTTCCCAGAACGGTTCGTATTTGTCGTTCGGGTTCCGCAGC AGGAAC
0393 GGCCGTTCCTGCTGCGGAACCCGAACGACAAATACGAACCGTTCTGGGAAGACGAAGAAAAAA ACGAATAAG
0453 TGGTTAAAGCTTTCCCGC
0454 GGCCGCGGGAAAGCTTTAACCAGGCT
0455 TGGTTGTTGCTTTCCCGC
0456 GGCCGCGGGAAAGCAACAACCAGGCT
HU 217 101 Β
I. táblázat (folytatás)
Oligomegjelölés Oligoszekvencia (5’ —> 3’ leírva)
0465 GGCCGCGGGAACAGAGCCAGACCGTTTTCTTCTTTGGTGTGAGAACG
0466 GATCCGTTCTCACACCAAAGAAGAAAACGGTCTGGCTCTGTTCCCGC
0467 CGGTTAAGGCTTTCCCGCGGCCGTTCCTGCTGCGGAAC
0468 TTTGTCGTTCGGGTTCCGCAGCAGGAACGGCCGCGGGAAAGCCTTAACCGGGCT
0469 CTAGCTTATTCGTTTTTTTCTTCGTCTTCCCAGAACGGTTCGTA
0470 CCGAACGACAAATACGAACCGTTCTGGGAAGACGAAGAAAAAAACGAATAAG
Az oligodezoxiribonukleotideket detritilezett formában 0,1 pmol méretben az Applied Biosystems (Weiterstadt) szintetizátora (391. modell) segítségével, 15 a gyártó cég útmutatása szerint, β-ciano-etil-védett diizopropilamino-foszfoamiditek felhasználásával állítjuk elő. Ennek során 100-100 pmol oligodezoxiribonukleotidet 50 mM tri(hidroxi-metil)-aminometán/HCl (Tris/HCl) közegben 10 mM magnézium-klorid és 20 5 mM ditiotreit jelenlétében, 7,5 pH értéken, egy T4kináz enzimegység felhasználásával, 10 mM adenozintrifoszfát jelenlétében foszforilezünk, majd ugyanebben a pufferben kétszálú DNS-molekulává alakítunk át.
A kapott szintetikus, kétszálú DNS-molekulákat poliakrilamid gélen (5% poliakrilamid) gélelektroforézissel tisztítjuk, majd a megfelelően előkészített plazmidokkal ligáljuk. A plazmidok előkészítését restrikciós enzimekkel történő emésztéssel, a megfelelő restrikciós fragmensek izolálásával, és az 5’ végeken történő defoszforilezéssel végezzük el. Az ezután következő ligálást és E. coli K12 JM103 törzsön történő transzformálást, valamint az összes további, géntechnikai műveletet önmagában ismert módon végezzük el. Fentiekkel kapcsolatban az alábbi irodalmi helyre hivatkozunk: Sambrook et al. ‘Molecular Cloning: A Laboratory Manual’, 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, USA, 1989.
b) Tartós tenyészetek előállítása és fermentáció
A pSJ69, pSJ76, pSJ77, pSJ78, pSJ79, pSJ81, pSJ83, pSJ90, pSJ91, pSJ92, pSJ93, pSJ94, pSJ95, pSJlOl, pSJ102, pSJ103, pSJ104, pSJ105, pSJ106, pSJ109, pSJl 11, pSJl 14 és pSJl 13 rekombináns kifejezőplazmidokat E. coli KI2 JM103 (ATCC 39403) törzsbe visszük, és standard I-agar táptalajon (150 mg/1 ampicillin) tenyésztjük. (Sambrook et al. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”.) Minden transzformálásnál egy-egy telepet standard I-táptalajban (pH 7,0;
150 mg/1 ampicillin) 20 °C-on 578 nM mellett 1 optimális sűrűségig (OD) tenyésztünk, tartós tenyészetként 5-5ször 2 ml-es részletekben dimetil-szulfoxid (DMSO; 7,5% végső koncentráció) hozzáadása mellett folyékony nitrogénben mélyfagyasztunk és -70 °C-on tárolunk. A bifunkcionális urokinázvariánsok kinyeréséhez minden tartós tenyészet 1-1 ml-ét 20 ml standard I-táptalajban (pH 7,0; 150 mg/1 ampicillin) szuszpendálunk és 37 °C hőmérsékleten 578 nM mellett 1 optimális sűrűségig (OD) tenyésztünk.
Ez után a kapott tenyészet teljes mennyiségét 1 liter standard I-táptalajban (pH 7,0; 150 mg/1 ampicillin) szuszpendáljuk, és rázólombikban 37 °C hőmérsékleten fermentáljuk. Az indukálást 2 ml indol-akrilsav-oldat (60 mg, 2 ml etanolban) hozzáadásával végezzük el, 578 nm mellett 0,5-1 optimális optikai sűrűségig (OD). c) Kifejezőteszt
A kifejezés mértékének meghatározására szolgáló teszt (Ploug-egységek pro optikai sűrűség pro ml) során közvetlenül az indukció előtt és az indukció után óránként (összesen 6 óra) 1 ml sejtszuszpenziónak (578 nm mellett 1 optikai sűrűségig) megfelelő sejteket centrifugálunk. A centrifugált sejteket lizozimmal (1 mg Lysozym pro ml 50 mM Tris/HCl pufferben, pH 8,0, 50 mM 25 etilén-diamin-ecetsav (EDTA) és 15 térfogat% szacharóz) feltáljuk. A lizált sejteket 4-5 M guanidiniumhidroklorid-oldattal szolubilizáljuk, majd 1,2 M guanidin-hidroklorid értékre történő hígítás után valamely redukálószer (glutation vagy cisztein) hozzáadása mel30 lett 2-5 órán át visszahajtogatási reakciónak vetjük alá [Winkler et al., Biochemistry, 25, 4041-4045 (1986)]. A kapott egyláncú bifunkcionális urokinázvaríánsokat plazmin hozzáadásával a megfelelő kétláncú urokinázvariánsokká alakítjuk, amelyeknek az aktivitását a csak 35 kétláncú, aktív urokinázok által hasított pyro-Glu-GlyArg-p-nitro-anilid kromogén szubsztrátum segítségével meghatározzuk. A találmányunk szerinti bifunkcionális urokinázvariánsok plazminnal történő aktiválását 50 mM Tris/HCl pufferben, 12 mM nátrium-klorid és 40 0,02% Tween 80 jelenlétében, pH 7,4 értéken és 32 °C-on végezzük el. A bifunkcionális urokinázvariáns és a plazmin aránya, molaritásra vonatkoztatva, körülbelül 100-1500:1, vagy enzimegységekre vonatkoztatva körülbelül 8000-36000:1. A tesztinkubálást 50 mM 45 Tris/HCl pufferben és 38 mM nátrium-kloridban, pH 8,8 értéken, 0,36 μΜ aprotínín (a plazmin gátlásához) és 0,27 mM pyro-Glu-Gly-Arg-p-nitro-anilid szubsztrátum jelenlétében, 37 °C-on hajtjuk végre. A reakciót a bifunkcionális urokinázvariáns koncentrációjától fíig50 gően 5-60 perces inkubálás után, 50%-os ecetsav hozzáadásával leállítjuk, és az extinkciót 405 nM mellett mérjük. A szubsztrátumgyártó cég (Kabi Vitrum, Svédország) közlése szerint a fenti meghatározási mód esetében 405 nm mellett percenkénti 0,05 extinkcióváltozás 55 25 Ploug-egység/ml tesztoldat urokinázaktivitásnak felel meg. A találmányunk szerinti bifunkcionális urokinázvariánsok fajlagos aktivitása 1 mg tisztított fehérjére vonatkoztatva 120000-155 000 Ploug-egység. Az oldatok fehéijetartalmát a Pierce cég BCA meghatározási 60 tesztje szerint határozzuk meg.
HU 217 101 Β
d) Izolálás és tisztítás
Az indukció után 5-6 órával az lb) pontban leírt körülmények között végrehajtott fermentálást befejezzük (optikai sűrűség 578 nm mellett 5-6). A sejteket centrifugáljuk. A sejtcsapadékot 200 ml vízben újraszuszpendáljuk és nagynyomású homogenizátorban feltárjuk. Az egyláncú bifunkcionális urokinázszármazék teljes mennyiségét tartalmazó csapadékot ismételt centriftigálás után 500 ml 5 M guanidin-hidrokloridban 40 nM cisztein és 1 mM EDTA jelenlétében, 8,0 pH értéken oldjuk, és 2000 ml 25 mM Tris/HCl-val 9,0 pH értéken hígítjuk. A visszahajtogatási reakciót körülbelül 12 óra múlva befejezzük.
A kapott bifunkcionális urokinázvariánst 8 g kovasavgél hozzáadása után 2 órás keveréssel kovasavon teljes mértékben megkötjük. A bifunkcionális urokinázvariánssal töltött kovasavgélt elválasztjuk és acetátpufferrel (pH-4,0) mossuk. Az urokinázvariánsokat 0,5 M tetrametil-ammónium-kloriddal (TMAC) 0,1 M acetátpufferben (pH=4) eluáljuk. Az urokinázvariánsokat két kromatográfiás elválasztás után (réz-kelát-oszlop és kationcserélő) tiszta formában nyerjük ki. Az egyláncú jelleget egyrészről és a kívánt aminoterminális szekvenciát másrészről N-terminális szekvenciaanalízis segítségével igazoljuk. Az egyes variánsok megváltozott karboxiterminális tartományának fehérjekémiai jellemzését a fehérje módosított CNBr hasítása után (1 ml 90%-os hangyasavban és 1 ml heptafluor-vaj savban oldva) a triptofánmaradékok mögötti peptidlánc hasításával hajtjuk végre. A karboxiterminális peptidet szekvenciaanalízis előtt HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia) módszenei elválasztjuk és tisztítjuk.
Az összes izolált és a 2. táblázatban felsorolt bifunkcionális urokinázvariáns az urokináz kromogén szubsztrátumával végzett közvetlen aktivitásteszt során hatást egyáltalán nem, vagy csupán nagyon kis mértékben mutat (1 mg tisztított fehérjére vonatkoztatva 1200 Ploug-egységnél kisebb érték). Az 1 mg tisztított fehérjére vonatkoztatva 120000-155 000 Plougegységnek megfelelő enzimaktivitást csak a plazminnal végzett hasítás után (a körülményeket az le) bekez20 désben adjuk meg) nyerünk. Valamennyi urokinázvariánst E. coli KI 2 JM103 törzsben, egyláncú fehérjeként exprimálunk.
2. táblázat
Találmányunk szerinti (I) általános képletű bifunkcionális urokinázvariánsok (bU)
bU X. Y.
MII Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe A·) Y2=Pro, Y3=Pro és Gly közötti közvetlen kötés, Y4=OH
M12 Ser-Pro-Val-Lys-Ala-Phe A1) Y2=Pro, Y3=Pro és Gly közötti közvetlen kötés, Y4=OH
M13 Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe A1* Y2=Pro,Y3=Pro és Gly közötti közvetlen kötés, Y4=OH
M14 Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe A·) Y2=Pro,Y3=Pro és Gly közötti közvetlen kötés, Y4=OH
M15 Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe- Gly A1' Y2=Pro, Y3=Pro és Gly közötti közvetlen kötés, Y4=OH
M16 Ser-Pro-V al-Lys- Ala-Trp-Gly A') Y2=Pro, Y3=Leu, Y4=Gln
M17 Ser-Pro-Val-Lys-Ala-Phe-Gly AD Y2=Pro,Y3=Leu,Y4=Gln
M18 Ser-Pro-Val-Arg-Ala-Phe-Gly AD Y2=Pro, Y3=Leu, Y4=Gln
M19 Ser-Pro-V al-Lys-Ala-Tyr-Gly AD Y2=Pro, Y3=Leu,Y4=Gln
M20 Ser-Pro-Val-Val-Ala-Phe-Gly AD Y2=Pro,Y3=Leu, Y4=Gln
M21 Ser-Pro-Val-Arg-Ala-Phe AD Y2=Pro, Y3=Leu, Y4=Gln
M22 Ser-Pro-Val-Lys-Ala-Tyr AD Y2=Pro,Y3=Leu,Y4=Gln
M23 Ser-Pro-V al-V al-Ala-Phe AD Y2=Pro, Y3=Leu, Y4=Gln
M24 Ser-Pro-Val-Lys-Ala-Trp AD Y2=Pro, Y3=Leu,Y4=Gln
M25 Ser-Pro-Val-Lys-Ala-Phe AD Y2=Pro, Y3=Leu, Y4=Gln
M26 Ser-Pro-Val-Val-Val-Phe AD Y2=Pro, Y3=Leu, Y4=Gln
M27 Ser-Pro-Val-Glu-Val-Phe AD Y2=Pro, Y3=Leu, Y4=Gln
M28 Ser-Pro-Val-Val-Val-Val AD Y2=Val, Y3=Leu, Y4=Gln
M29 Ser-Leu-Val-Val-Ala-Phe BD Y2=Pro,
M30 Ser-Pro-Val-Val-Ala-Phe AD Y2=Pro, Y3=Leu, Y4=Gin
M31 Ser-Leu-Val-Lys-Ala-Phe AD Y2=Pro, Y3=Leu, Y4=GIn
HU217 101 Β
2. táblázat (folytatás)
bU X. Y,
M32 Ser-Pro-Val-Lys-Ala-Phe B2) Y2=Pro,
M33 közvetlen kötés M4 és Y, között Α» Y2=Pro, Y3=Leu, Y4=Gln
A*> = Y2-Arg-Pro-Y3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Y4
B2' = Yj-Arg-Pro-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phc-Trp-Glu-Asp-Glu-Glu-Lys-Asn-Glu
2. Farmakológiai vizsgálatok 10
Thrombingátló hatás meghatározása
A találmányunk szerinti bifünkcionális urokinázszármazékok gátlóaktivitását a thrombinidő mérésével határozzuk meg. Ennek során humán citrátplazma és veronálpuffer 1:10 arányú hígításából 200 μΐ-t 50 μΐ 15 thrombinoldattal (0,2 egység) és 0,05-50 μ bifunkcionális urokinázvariánst tartalmazó vizes oldattal (50 μΐ) keverünk össze. Ez után a fibrinalvadék képződéséhez szükséges időt megméijük. A 3. táblázatban a 10 μg találmányunk szerinti bifunkcionális urokinázvariáns 20 jelenlétében mért thrombinidő-meghosszabbodásból számított gátlási faktorokat adjuk meg. A thrombinidő koncentrációtól függő meghosszabbodását ugyancsak meghatározzuk, és az M12, M23, M29, M32 és M33 bifünkcionális urokinázvariánsra, és az M4 termékkel 25 összehasonlítva a 3. ábrán grafikusan ábrázoljuk. Az M4 (azaz a glikozilázatlan prourokináz 47Ser-411Leu aminosavszekvenciája (lásd 1. ábra), a glikozilázatlan prourokináz (szarupláz) és maga az LUK 1 mg dózisban - a találmányunk szerinti bifünkcionális urokinázva- 30 riánsokkal ellentétben - a véralvadásig eltelt időt nem hosszabbítja meg.
3. táblázat
Találmányunk szerinti (I) általános képletű bifünkcionális urokinázvariánsok thrombinidőmeghosszabbító hatása
Bifunkcionális urokinázvariáns Gátlási faktort1
MII 1,8
M12 4,6
M13 1,7
M14 1,8
M15 2,5
M16 3,2
MI7 3,1
M18 2,9
M19 2,0
M20 2,2
M21 2,3
M22 3,7
M23 5,3
M24 6,2
M25 2,9
M26 3,2
Bifunkcionális urokinázvariáns Gátlási faktort1
M27 2,0
M28 2,1
M29 2,6
M30 3,4
M31 2,0
M32 3,0
M33 2,0
10 pg fehérje hatására vonatkoztatva Gátlási faktor = valamely inhibitor jelenlétében és távollétében mert thrombinidő hányadosa
Az M12 és M23 jelű bifunkcionális urokinázvariánsok farmakológiai tulajdonságai állatkísérletben
A találmányunk szerinti M12 és M23 bifünkcionális urokinázvariánsok artériás érelzáródások thrombolízisére kifejtett hatását farmakológiai in vivő modell segítségével meghatározzuk és a szaruplázzal (glikozilázatlan prourokináz) hasonlítjuk össze. Narkotizált házinyúl femorális artériájának ideiglenesen izolált körülbelül 1 cm hosszú szegmensébe egy oldalágon keresztül lokálisan thrombint és 125J-jelzett humán fibrinogént fecskendezünk. A képződő thrombusz teljes érelzáródáshoz vezet. A képződő thrombusz nagyságát a humán fibrinbe beépített radioaktivitás útján extrakorporális gamma-detektoron keresztül meghatározzuk. A vérátáramlás elektromágneses mérését és a thrombuszradioaktivitás meghatározását a kísérlet teljes időtartamában folyamatosan végezzük. A fibrinolitikus hatást a thrombotikusan elzárt ér reperfüziója és a thrombusz radioaktív jelzett, beépített fibrinjének lebomlása útján mennyiségileg meghatározzuk. A találmányunk szerinti bifunkcionális urokinázvariánsok alkalmazása előtt, illetve beadása után 30, 60 és 90 perccel vérmintákat veszünk, amelyekben a fibrinogén plazmakoncentrációját meghatározzuk. 6-6 mg/kg M12-t, M23-t és szaruplázt intravénás bóluszinjekció formájában adagolunk. Minthogy az M12 és M23 - a szaruplázzal ellentétben - antikoaguláló hatást is kifejt, egy
4. kísérleti csoportban szaruplázt az antikoaguláns hatású heparinnal (150 egység/kg i. v. - bólusz) kombinálunk. Minden csoport 6 állatból áll.
A 90 perces kísérleti időtartam során a jelzett thrombuszfibrin thrombolízise Ml2 esetében 46±11%, M23 esetében 43± 12%, szarupláz esetében 22±5% és a szarupláz-heparin kombináció esetében 39 ±15%. Az M12 és M23 bólusz alkalmazása valamennyi (mind a 6) állat esetében a thrombotikusan lezárt ér felnyílásához vezetett. Szarupláz alkalmazásakor 6 állatból 5 esetben,
HU 217 101 Β míg szarupláz-heparin kombináció alkalmazásakor 6 állatból 4 esetben az ér reperfundálható. A reperfúziós áramlás maximális értéke (a kiindulási érték %-ában) M12 esetében 95 + 10% és M23 esetében 82+9%; ezek az értékek a szarupláz esetében mért maximális reperfúziós áramlás nagyságától (43 + 12%) szignifikáns mértékben különböznek. A szarupláz-heparin kombináció alkalmazásakor mért maximális reperfúziós áramlás nagysága (58+8%) az Ml2 és M23 alkalmazásakor mért értékek és a szarupláz felhasználásakor kapott eredmény között helyezkedik el, és ezektől az értékektől szignifikáns mértékben nem különbözik. A teljes fibrinolitikus hatást a reperfúziós áramlásnak a 90 perces kísérleti időtartam alatt mért értékével (a kiindulási áramlás %-ában kifejezve) adjuk meg. Ez az összhatás
M12 esetében 4,502+1,127% perc és az M23 esetében
4,270+885%-perc; a kapott eredmények tehát mindkét, találmányunk szerinti urokinázszármazék esetében a szaruplázzal nyert értéknél (1,519+6,43%-perc) szignifikánsan nagyobbak. A szarupláz-heparin kombinációval végzett kezelésnél mért összhatás 2,217+761%-perc, amely a csak szaruplázzal végzett kezelésnél kapott ér10 féknél szignifikánsan nem jobb, ugyanakkor azonban az M12 és M23 felhasználásával kapott eredményeknél jelentősen rosszabb. A kapott eredményeket a 4. táblázatban foglaljuk össze.
4. táblázat
Thrombolitikus hatás i. v. bólusz adagolása után; femorális artériás thrombózis narkotizált házinyúlon
Polipeptid Dózis ,25J-fibrinolízis % Maximális reperfúziós áramlás (előérték %-a) Kumulatív reperfúziós áramlás %perc
M12 6 mg/kg 46+11 95 + 10* 4502+1127
M23 6 mg/kg 43+12 82 + 9* 4270+885*
Szarupláz 6 mg/kg 22+5 43+12 1519+643
Szarupláz + Heparin 6 mg/kg 150E/kg 39+15 58+8* 2217+761
*=p<0,05, szaruplázhoz viszonyítva
Meglepő módon azt találtuk, hogy M12 és M23 bő- szarupláz bólusz beadása után. A kapott eredményeket lusz formában történő adagolása után a fíbrinogén plaz- 30 az 5. táblázatban foglaljuk össze, makoncentráció szignifikánsan kevésbé csökken, mint a
5. táblázat
M12 és M23 bólusz adagolásának a plazmafibrinogén-koncentráció csökkenésére kifejtett hatása narkotizált házinyúlon, önmagában vagy heparinnal együtt alkalmazott szaruplázzal összehasonlítva
Polipeptid Dózis Plazmafibrinogén csökkenése (kiindulási értékhez viszonyított %-os változás)
30 perc 60 perc 90 perc
M12 6 mg/kg -19+9 -20+9* -19+9*
M23 6 mg/kg -20+11* -21+11* -20+11*
30 perc 60 perc 90 perc
Szarupláz 6 mg/kg -64+7 -66+6 -67+6
Szarupláz +Heparin 6 mg/kg + 150E/kg n.h. ') -46+8 -45+9
*=p<0,05, szaruplázhoz viszonyítva ') n. h.= nem határoztuk meg
Az eredmények azt mutatják, hogy a találmányunk szerinti Ml2 és M23 bifunkcionális urokinázvariánsok a teljes érelzáródást előidéző artériás thrombuszokat feloldják, és a thrombusz által elzárt erek vérátáramlását ismét helyreállítják. Ezt a hatást az M12, illetve M23 bóluszok egyszeri adagolásával nem heparizinált állatokon étjük el. Az M12 és M23 szaruplázhoz viszonyított erősebb fibrinolitikus hatása meglepő módon kisebb plazmafibrinogén-felhasználással jár együtt. Ez azt jelenti, hogy az Ml2 és M23 a szaruplázhoz viszonyítva szignifikánsan magasabb fibrinspecifikussággal rendelkezik.
Az Ml2 és M23 a plazmafibrinogént a szarupláznál jobban kíméli. Ez azt jelenti, hogy a vér alvadóképes55 sége jobban megmarad, és ezáltal a szisztémás fibrinogénlebomlás lehetséges komplikációjaként fellépő szabályozatlan vérzések veszélye csökken. A találmányunk szerinti M12 és M23 tehát hemosztazeológiai mellékhatásokkal kapcsolatos kockázatok terén a szarupláznál biztonságosabban alkalmazható.

Claims (17)

1. Bifunkcionális urokinázvariánsok, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletnek felelnek meg, mely képletben
M4 jelentése az 1. ábra szerinti, nem glikozilezett prourokináz 47Ser és 41'Leu közötti aminosavszekvenciája;
Χ, jelentése az M4 és Yt közötti kötés, vagy valamely Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe vagy
Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe vagy
Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe-Gly képletű peptid; vagy valamely (II) általános képletű peptidszekvencia - ahol X2 jelentése Pro vagy Leu; X3 jelentése Val vagy Pro; X4 jelentése Lys, Val, Arg, Gly vagy Glu; X5 jelentése Alá, Val, Gly, Leu vagy Ile; X6 jelentése Phe, Trp, Tyr vagy Val, és X7 jelentése Gly, vagy X6 és Yj közötti közvetlen kötés -; és
Yj jelentése valamely
Y 2- Arg-Pro-Y 3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp- PheGlu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Y4; vagy valamely Y2-Arg-Pro-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-LysTyr-Glu-Pro-Phe-Trp-Glu-Asp-Glu-Glu-Lys-AsnGlu; vagy
Y2-Arg-Pro-Ser-Ser-Glu-Phe-Glu-Glu-Phe-Glu-IleAsp-Glu-Glu-Glu-Lys általános képletnek megfelelő szekvenciájú peptid, ahol is Y2 jelentése Pro vagy Val; Y3 jelentése Leu, vagy Pro és Gly közötti közvetlen kötés, és Y4 jelentése Gin vagy hidroxilcsoport.
2. Az 1. igénypont szerinti urokinázvariánsok, azzal jellemezve, hogy Yj jelentése valamely Y2-Arg-Pro-Y3Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-ProGlu-Glu-Tyr-Leu-Y4 képletnek megfelelő szekvenciájú peptid.
3. Az 1. igénypont szerinti urokinázvariánsok, azzal jellemezve, hogy Y, jelentése valamely Y2-Arg-ProPhe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-ProPhe-Trp-Glu-Asp-Glu-Glu-Lys-Asn-Glu képletnek megfelelő szekvenciájú peptid.
4. Az 1. és/vagy 2. igénypont szerinti urokinázvariánsok, azzal jellemezve, hogy X[ jelentése valamely (II) általános képletű peptidszekvencia (ahol X2 jelentése Pro vagy Leu; X3 jelentése Val; X4 jelentése Lys, Val vagy Arg; X5 jelentése Alá, Val vagy Gly; X6 jelentése Phe, Trp, Tyr vagy Val, és X7 jelentése Gly, vagy X6 és Y] közötti közvetlen kötés).
5. A 4. igénypont szerinti urokinázvariánsok, azzal jellemezve, hogy X4 jelentése Lys vagy Val; X5 jelentése Alá vagy Val; X6 jelentése Phe, Trp vagy Tyr, és X7 jelentése Gly, vagy X6 és Y[ közötti közvetlen kötés.
6. A 4. igénypont és/vagy 5. igénypont szerinti urokinázvariánsok, azzal jellemezve, hogy X7 jelentése X6 és Y, közötti közvetlen kötés.
7. Az 1. igénypont és/vagy 3. igénypont szerinti urokinázvariánsok, azzal jellemezve, hogy X] jelentése valamely (II) általános képletű peptidszekvencia (ahol X2 jelentése Pro vagy Leu; X3 jelentése Val; X4 jelentése Lys vagy Val; X5 jelentése Alá vagy Val; X6 jelentése Phe vagy Trp, és X7 jelentése X6 és Y( közötti közvetlen kötés).
8. Plazmidok az 1-7. igénypontok szerinti bifunkcionális urokinázvariánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy az operon egy szabályozható promotort; egy riboszómamegkötőhelyként hatásos Shine-Dalgamoszekvenciát; egy startkodont; az 1-7. igénypontok szerinti (I) általános képletű bifunkcionális urokinázvariánsok számára egy szintetikus strukturgént; és a strukturgéntől az áramlás irányában lefelé 1 vagy 2 terminátort tartalmaz, és a plazmidok Escherichia coli törzsekben a bifunkcionális urokinázvariánsok kifejezésére képesek.
9. A 8. igénypont szerinti plazmidok, azzal jellemezve, hogy a Shine-Dalgamo-szekvencia és a startkodon közötti távolság 6-12 nukleotid, előnyösen 8-10 nukleotid.
10. A 8. és/vagy 9. igénypont szerinti plazmidok, azzal jellemezve, hogy a pSJ69, pSJ76, pSJ77, pSJ78, pSJ79, pSJ81, pSJ83, pSJ90, pSJ91, pSJ92, pSJ93, pSJ94, pSJ95, pSJlOl, pSJ102, pSJ103, pSJ104, pSJ105, pSJ106, pSJ109, pSJlll, pSJ114 és pSJ113 csoportba tartoznak.
11. A 10. igénypont szerinti plazmidok, azzal jellemezve, hogy a pSJ76, pSJ81, pSJ83, pSJ90, pSJ91, pSJ92, pSJ93, pSJ94, pSJ95, pSJlOl, pSJ102, pSJ103, pSJ105, pSJ106, pSJ109, pSJlll és pSJ114 csoportba tartoznak.
12. A 10. és/vagy 11. igénypont szerinti plazmidok, azzal jellemezve, hogy pSJ76, pSJ81, pSJ83, pSJ91, pSJ92, pSJ94, pSJ95, pSJlOl, pSJ102, pSJ103, pSJ106, pSJ109, pSJl 11 és pSJl 14 csoportba tartoznak.
13. A 10-12. igénypontok bármelyike szerinti plazmidok, azzal jellemezve, hogy a pSJ76, pSJ94, pSJ95, pSJlOl, pSJ102, pSJ103, pSJ106, pSJ109, pSJl 11 és pSJl 14 csoportba tartoznak.
14. Eljárás a 8-13. igénypontok szerinti plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy ezeket a pBlueskript KSII+, pUC 8 és pGR 201 plazmidokból nyeljük.
15. A 8-13. igénypontok bármelyike szerinti plazmidok felhasználása az 1-7. igénypontok szerinti (I) általános képletű bifunkcionális urokinázvariánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely Escherichia coli törzset egy plazmiddal önmagában ismert módon transzformálunk; a strukturgén kifejezését indukáljuk; az (I) általános képletű bifunkcionális urokinázvariáns képződő előfehérjéjét a táptalajtól és a lizált baktériumsejtektől elválasztjuk; az előfehérjét szolubilizáljuk; majd egy redoxrendszer segítségével (I) általános képletű polipeptiddé visszahajtogatjuk.
16. Thrombolitikum, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként valamely, az 1-7. igénypontok szerinti, (I) általános képletű bifunkcionális urokinázt tartalmaz.
17. A 16. igénypont szerinti thrombolitikum, azzal jellemezve, hogy bólusz formában történő felhasználásra alkalmas.
HU9402063A 1993-07-15 1994-07-11 Javított fibrinolitikus tulajdonságokkal és thrombingátló hatással rendelkező bifunkciós urokinázvariánsok HU217101B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4323754A DE4323754C1 (de) 1993-07-15 1993-07-15 Bifunktionelle Urokinasevarianten mit verbesserten fibrinolytischen Eigenschaften und thrombinhemmender Wirkung

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9402063D0 HU9402063D0 (en) 1994-09-28
HUT70579A HUT70579A (en) 1995-10-30
HU217101B true HU217101B (hu) 1999-11-29

Family

ID=6492909

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9402063A HU217101B (hu) 1993-07-15 1994-07-11 Javított fibrinolitikus tulajdonságokkal és thrombingátló hatással rendelkező bifunkciós urokinázvariánsok

Country Status (27)

Country Link
US (2) US5681721A (hu)
EP (1) EP0669394B1 (hu)
JP (1) JPH07143878A (hu)
KR (1) KR960014346A (hu)
CN (1) CN1057124C (hu)
AT (1) ATE189261T1 (hu)
AU (1) AU679512B2 (hu)
CA (1) CA2127897A1 (hu)
CZ (1) CZ288536B6 (hu)
DE (2) DE4323754C1 (hu)
DK (1) DK0669394T3 (hu)
ES (1) ES2145075T3 (hu)
FI (1) FI943354A (hu)
GR (1) GR3032488T3 (hu)
HK (1) HK1010109A1 (hu)
HR (1) HRP940366B1 (hu)
HU (1) HU217101B (hu)
IL (1) IL109107A0 (hu)
NO (1) NO941561L (hu)
NZ (1) NZ260991A (hu)
PL (1) PL176971B1 (hu)
PT (1) PT669394E (hu)
RU (1) RU2143490C1 (hu)
SI (1) SI0669394T1 (hu)
SK (1) SK281586B6 (hu)
UA (1) UA27132C2 (hu)
ZA (1) ZA944202B (hu)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4440892A1 (de) * 1994-11-17 1996-05-23 Gruenenthal Gmbh Proteine mit fibrinolytischen und gerinnungshemmenden Eigenschaften
DE4442665A1 (de) * 1994-11-30 1996-06-05 Gruenenthal Gmbh Chimäre Proteine mit fibrinolytischen und thrombinhemmenden Eigenschaften
CN1057125C (zh) * 1996-04-26 2000-10-04 南京大学 五种尿激酶变体基因及在大肠杆菌中的表达
CN1111739C (zh) * 1997-02-04 2003-06-18 许文俊 凝血、纤溶功能动态测定试剂
US6503947B1 (en) 1998-01-27 2003-01-07 Brigham And Women's Hospital Method of treating cytotoxic damage
US7498310B1 (en) 1998-08-13 2009-03-03 Beiersdorf Ag Cosmetic or dermatological preparations comprising oligopeptides for lightening the skin of age marks and/or for preventing tanning of the skin, in particular tanning of the skin caused by UV radiation
US6833357B2 (en) * 2000-06-20 2004-12-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for modulating muscle cell and tissue contractility
US7361493B1 (en) 2004-05-26 2008-04-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Veterans Affairs Production of urokinase in a three-dimensional cell culture
WO2006045503A1 (en) 2004-10-19 2006-05-04 Lonza Ag Method for solid phase peptide synthesis
CN104193807B (zh) * 2014-09-28 2016-06-15 广州贝奥吉因生物科技有限公司 凝血酶抑制多肽及其制备方法、应用
CN105385617A (zh) * 2015-09-23 2016-03-09 河北省科学院生物研究所 一株产纤溶酶的海洋放线菌株、用途以及由其制备的纤溶酶及纤溶酶的应用
WO2018107247A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 The University Of Sydney Thrombin inhibitors for treatment of stroke and related coagulative disorders

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3445517C2 (de) * 1984-12-13 1993-11-18 Ciba Geigy Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins
US4751180A (en) * 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US5002887A (en) * 1986-01-31 1991-03-26 Genetics Institute, Inc. Truncated thrombolytic proteins
US5188829A (en) * 1987-08-19 1993-02-23 Sagami Chemical Research Center Rapidly acting prourokinase
DE3804600A1 (de) * 1988-02-13 1989-08-24 Basf Ag Mischung aus einer thrombolytisch wirkenden und einer antithrombotischen substanz
GB8822147D0 (en) * 1988-09-21 1988-10-26 Ciba Geigy Ag Pharmaceutically active combination
US5256770A (en) * 1990-04-09 1993-10-26 Schering Ag Oxidation resistant thrombomodulin analogs
EP0482069A1 (en) * 1989-07-20 1992-04-29 Biogen, Inc. Combinations and methods for treating or preventing thrombotic diseases
GB8927722D0 (en) * 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
US5328898A (en) * 1990-06-22 1994-07-12 Duke University Factor XIIIA fibrin binding fragments
US5242810A (en) * 1990-12-07 1993-09-07 Biogen, Inc. Bifunctional inhibitors of thrombin and platelet activation
US5688768A (en) * 1991-02-19 1997-11-18 Cor Therapeutics, Inc. Recombinant thrombin receptor and related pharmaceuticals
AU1873092A (en) * 1991-04-09 1992-11-17 Brigham And Women's Hospital Chimeric molecule with plasminogen activator activity and affinity for atherosclerotic plaques
US5376367A (en) * 1991-11-22 1994-12-27 Immunex Corporation Fusion proteins comprising MGF and IL-3
US5571708A (en) * 1993-04-19 1996-11-05 Bristol-Myers Squibb Company Thrombin-activatable plasminogen activator

Also Published As

Publication number Publication date
PL304290A1 (en) 1995-01-23
CN1102438A (zh) 1995-05-10
FI943354A (fi) 1995-01-16
ES2145075T3 (es) 2000-07-01
US5681721A (en) 1997-10-28
NZ260991A (en) 1995-10-26
NO941561L (no) 1995-01-16
EP0669394A1 (de) 1995-08-30
ZA944202B (en) 1995-02-08
NO941561D0 (hu) 1994-04-28
DK0669394T3 (da) 2000-05-29
ATE189261T1 (de) 2000-02-15
US5747291A (en) 1998-05-05
HU9402063D0 (en) 1994-09-28
AU6452594A (en) 1995-01-27
AU679512B2 (en) 1997-07-03
DE59409104D1 (de) 2000-03-02
PL176971B1 (pl) 1999-08-31
SK281586B6 (sk) 2001-05-10
DE4323754C1 (de) 1994-12-01
GR3032488T3 (en) 2000-05-31
CZ288536B6 (cs) 2001-07-11
FI943354A0 (fi) 1994-07-14
HRP940366B1 (en) 2001-02-28
HRP940366A2 (en) 1997-04-30
CZ170694A3 (en) 1995-02-15
UA27132C2 (uk) 2000-02-28
JPH07143878A (ja) 1995-06-06
IL109107A0 (en) 1994-06-24
HK1010109A1 (en) 1999-06-11
RU94026095A (ru) 1997-03-10
RU2143490C1 (ru) 1999-12-27
KR960014346A (ko) 1996-05-22
HUT70579A (en) 1995-10-30
SK84594A3 (en) 1995-03-08
CN1057124C (zh) 2000-10-04
PT669394E (pt) 2000-07-31
SI0669394T1 (en) 2000-04-30
EP0669394B1 (de) 2000-01-26
CA2127897A1 (en) 1995-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2529816B2 (ja) 新規なヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体
US5759542A (en) Compositions and methods for the delivery of drugs by platelets for the treatment of cardiovascular and other diseases
US5126134A (en) Pharmaceutically active combination
JP2559538B2 (ja) 組織プラスミノーゲン活性化因子の誘導体
JP2003514789A (ja) 可逆的不活性化酸性化プラスミン
HU213922B (en) Process for producing new tissue plasminogen activator variants, pharmaceutical preparations containing them, and vectors capable of expressing them
HU217101B (hu) Javított fibrinolitikus tulajdonságokkal és thrombingátló hatással rendelkező bifunkciós urokinázvariánsok
NL8902454A (nl) Mutanten van de humane plasminogeen activator inhibitor 1 (pai-1), hun bereiding en toepassing, en recombinante polynucleotiden die voor deze mutanten coderende genetische informatie omvatten.
US6133011A (en) Chimeric proteins having fibrinolytic and thrombin-inhibiting properties
CA2162986A1 (en) Proteins having fibrinolytic and coagulation-inhibiting properties
JP3329340B2 (ja) トロンビン活性化プラスミノーゲン誘導体
JPH01240186A (ja) フィブリン特異性２本鎖プラスミノーゲンアクチベーター
JP2000504941A (ja) トロンビンによって活性化され得るプラスミノーゲンアクチベーター
US5908625A (en) Use of the protease domain of human plasminogen activator for the treatment of thromboembolic diseases
Bachrach et al. Mechanisms of fibrinolysis and clinical use of thrombolytic agents
HU217100B (hu) Eljárás új polipeptidek előállítására
HU216870B (hu) Eljárás szöveti plazminogén aktivátor előállítására
MXPA99000966A (en) Plasminogen activator capable of being activated by thrombin
JPH0775580A (ja) 新規なｔ−ＰＡ改変体

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee