JPH07143878A - 改善された繊維素溶解性及びトロンビン阻害作用を有する２官能性ウロキナーゼ変異体 - Google Patents

改善された繊維素溶解性及びトロンビン阻害作用を有する２官能性ウロキナーゼ変異体

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JPH07143878A
JPH07143878A JP6162445A JP16244594A JPH07143878A JP H07143878 A JPH07143878 A JP H07143878A JP 6162445 A JP6162445 A JP 6162445A JP 16244594 A JP16244594 A JP 16244594A JP H07143878 A JPH07143878 A JP H07143878A
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Gerd J Steffens
ゲルト・ヨット・シユテフエンス
Stephan Wnendt
シユテフアン・ヴネント
Johannes Schneider
ヨハネス・シユナイダー
Regina Dr Heinzel-Wieland
レジナ・ハインツエル−ウイーラント
Derek John Saunders
デレ−ク・ヨーハン・ザウンダース
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Gruenenthal GmbH
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 改善された繊維素溶解特性及びトロンビン阻
害作用を有する２官能性ウロキナーゼ変異体、これらの
ポリペプチドを得る際に用いるべきプラスミド、及び上
記２官能性ウロキナーゼ変異体を作用物質として含む結
線溶解薬を提供する。 【構成】 図２及び２ａないし２ｐに従いプラスミドｐ
ＢｌｕｅｓｋｒｉｐｔＫＳ ＩＩ＋、ｐＵＣ ８及びｐ
ＧＲ ２０１から得たプラスミドを用いて上記２官能性
ウロキナーゼ変異体を遺伝子工学的に調製する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は改善された繊維素溶解特
性及びトロンビン阻害作用を有する２官能性ウロキナー
ゼ変異体、これらのポリペプチド類を得る際に用いるた
めのプラスミド類、並びに作用物質として２官能性ウロ
キナーゼ変異体を含む血栓溶解薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】人の血液の重要な性質の１つは血栓の形
成によって血路の損傷を閉鎖できる能力である。血液の
凝固は血液中に含まれている一連の酵素によって引き起
こされるが、これらはいわゆる凝固カスケードにおいて
最終的に、酵素トロンビンが前駆蛋白質フィブリノーゲ
ンを蛋白質酵素分解的に反応させてフィブリンにするこ
とをもたらす。フィブリンは血小板、赤血球及び他の種
々の血液成分を包含して創傷の位置において血栓の形成
のもとに重合する。
【０００３】その上に血液はまた、凝固に対して逆に作
用して血液流を血管壁の再生の後で確実にする一連の酵
素をも含んでいる。血栓溶解に対して最も重要な酵素は
プラスミンであり、このものはフィブリン網に蛋白質酵
素分解的に作用し、そしてそれにより血栓の溶解をもた
らす。プラスミンは不活性の前駆蛋白質プラスミノーゲ
ンの蛋白質酵素分解によって形成される。その活性化は
プラスミノーゲンアクチベーターによりプラスミノーゲ
ンの蛋白質酵素分解的分解によって行われる。人内在性
の２つのプラスミノーゲンアクチベーターが知られてお
り、すなわち尿の中に存在するプラスミノーゲンアクチ
ベーターであるウロキナーゼと、及び組織プラスミノー
ゲンアクチベーターである。
【０００４】心筋梗塞及び脳梗塞は血栓の病的形成と密
接に結びついている。これら両方の梗塞症において、特
定的な条件のもとで血管壁の上に（殆どは動脈硬化的な
動脈の変質によって）血栓が発生する。これらの血栓は
動脈の中の血流を阻害し、それにより、もはやその組織
に酸素を充分に供給することができなくなる。これは心
筋梗塞の場合には心臓筋肉の部分的な、又は全面的な壊
死をもたらす。同様に脳動脈の閉塞は脳組織の重大な障
害に導く。
【０００５】梗塞症患者の治療のために種々のプラスミ
ノーゲンアクチベーターが血栓溶解薬として用いられ、
これらはプラスミンによる血栓の分解を開始させる。現
在この治療にはストレプトキナーゼ、ＡＰＳＡＣ（Ａｎ
ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｋｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｃｏｍｐｌ
ｅｘ）、２重鎖ウロキナーゼ（ＵＫ）、組換え体１重鎖
ウロキナーゼ（組換え体プロウロキナーゼ）及び組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）を用いること
ができる〔Ｃｏｌｌｅｎ及びＬｉｊｎｅｎ：“Ｂｌｏｏ
ｄ”７８， ３１１４−３１２４（１９９１）〕。スト
レプトキナーゼは溶血性ストレプトコッカス類の蛋白質
である。ストレプトキナーゼはプラスミノーゲンを活性
化するが、その際これはプラスミノーゲンと錯化合物を
形成し、そしてそれによりそのプラスミノーゲンを活性
のコンフォーメーションに移行させる。この錯化合物自
身は遊離のプラスミノーゲンを反応させてプラスミンに
し、このものは次に再びストレプトキナーゼと結合した
プラスミノーゲンを解裂させる。ストレプトキナーゼの
もう一つの展開物はＡＰＳＡＣ、すなわちストレプトキ
ナーゼと人のプラスミノーゲンとの試験管内で作り出さ
れた化合物である。ＡＰＳＡＣはそのプラスミノーゲン
の活性中心の化学的変性に基づいてストレプトキナーゼ
よりも高められた生物学的半減期を有する。
【０００６】ウロキナーゼは人の蛋白質の１つであり、
これは蛋白質酵素分解的に活性の蛋白質として２つの形
で尿から得ることができ、すなわち高分子量のウロキナ
ーゼ（ＨＵＫ）及び低分子量のウロキナーゼ（ＬＵＫ）
である〔Ｓｔｕｍｐ等：“Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．”２６１， １２６７−１２７３（１９８６）〕。
ＨＵＫ及びＬＵＫは２重鎖の分子である。ウロキナーゼ
は１重鎖のウロキナーゼ（プロウロキナーゼ）として種
々の組織の中で形成され、そしてプロ酵素として僅かな
量で人の血液の中で確認することができる〔Ｗｕｎ等：
“Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．”２５７， ３２７６
−３２８３（１９８２）〕。プロウロキナーゼの活性化
型はＨＵＫとして５４キロダルトンの分子量を有し、そ
して３つのドメインよりなっており、すなわちアミノ末
端の成長因子ドメイン、カール部（Ｋｒｉｎｇｅｌ）及
びセリン−プロテアーゼドメインである〔Ｇｕｅｎｚｌ
ｅｒ等：“Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ． Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．”３６３， １１５５−１１
６５（１９８２）、Ｓｔｅｆｆｅｎｓ等：“Ｈｏｐｐｅ
−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．”３６３， １０４３−１０５８（１９８２）〕。
プロウロキナーゼ及びプラスミノーゲンはプロ酵素とし
て存在するけれども、プロウロキナーゼは固有の活性に
基づいてプラスミノーゲンを活性のプラスミンに転換さ
せることができる。しかしながらこのプラスミノーゲン
アクチベーターは、その生じたプラスミンがその側でプ
ロウロキナーゼを 158リジンと 159イソロイシンとの間
で切り離してしまった後で初めて完全な活性を得る〔Ｌ
ｉｊｎｅｎ等：“Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．”２６
１， １２５３−１２５８（１９８６）〕。大腸菌の中
でウロキナーゼを遺伝子工学的に得ることは Ｈｅｙｎ
ｅｋｅｒ によって初めて記述された〔工業的微生物の
遺伝学についての１９８２年の第４回国際シンポジウム
の会報〕。グリコシル化されていないプロウロキナーゼ
（ザルプラーゼ）は合成遺伝子を用いて作られる〔Ｂｒ
ｉｇｅｌｉｕｓ−Ｆｌｏｈｅ等：“Ａｐｐｌ． Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．”３６， ６４０−
６４９（１９９２）〕。
【０００７】組織プラスミノーゲンアクチベーターは血
液中及び種々の組織の中に存在する蛋白質の１つであっ
て７２キロダルトンの分子量を有する。このプラスミノ
ーゲンアクチベーターは５つのドメインよりなり、すな
わちアミノ末端のフィンガードメイン、成長因子ドメイ
ン、カール部１、カール部２及びセリン−プロテアーゼ
ドメインである。プロウロキナーゼと異なって、ｔＰＡ
はフィブリンに結合することによって初めてプラスミノ
ーゲンを分離させる状態にかわる。プロウロキナーゼと
同様に、ｔＰＡはカール部２とセリン−プロテアーゼド
メインとの間のプラスミンで触媒された分解によってそ
の活性型に移行する。この場合に、その組織プラスミノ
ーゲンアクチベーターはフィブリンには結合するけれど
もフィブリノーゲンには結合せず、それによりプラスミ
ノーゲンは血栓特異的に活性化される。２重鎖ウロキナ
ーゼと異なって、一般的なプラスミノーゲン活性化は著
しく回避される〔Ｃｏｌｌｅｎ及びＬｉｊｎｅｎ：“Ｂ
ｌｏｏｄ”７８， ３１１４−３１２４（１９９
１）〕。
【０００８】１９８０年代の初め頃に既に、血栓溶解薬
による心筋梗塞の活性的処置が有効でありかつ効果的で
あると実証された。一連の研究において、心筋梗塞患者
のストレプトキナーゼ、ＡＰＳＡＣ、ＵＫ、組換え体プ
ロウロキナーゼ或いはｔＰＡによる処置が、非処置の患
者に比して明らかに低下した致死率に導くことが示され
た。これらの物質の治療における有効性を改善するため
に、遺伝子工学的な種々の方法の応用のもとに一連の組
織プラスミノーゲンアクチベーター及びプロウロキナー
ゼの誘導体が作られている。高い繊維素溶解活性と副作
用の低下とに加えて、ボーラス適用に適した種々の形態
の開発が興味の中心となっている。プラスミノーゲンア
クチベーターの改良についての手がかりに関する展望は
“Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓ
ｉｓ”６６， ８８−１１０（１９９１）及び“Ｔｒｅ
ｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．”９， ８６−９０
（１９９１）に見出される。
【０００９】溶解治療におけるプラスミノーゲンアクチ
ベーターの有効性を改善し、中でもその生物学的半減期
を高めるために、組織プラスミノーゲンアクチベーター
の種々の削除変異体及び置換変異体が作られたが、その
際例えば、そのフィンガードメイン及び成長因子ドメイ
ンを除去するか、又はセリン−プロテアーゼドメインを
ウロキナーゼのセリン−プロテアーゼドメインと置き換
えた〔Ｃｏｌｌｅｎ等：“Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏ
ｓｔａｓｉｓ”６５， １７４−１８０（１９９１）、
Ｆｒｏｍａｇｅ等：“Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ”５，
１８７−１９０（１９９１）、Ｌｕ等：“Ｂｌｏｏ
ｄ”７８， １２５−１３１（１９９１）〕。実際に、
フィンガードメイン及び成長因子ドメインの削除はｔＰ
Ａ変異体の生物学的半減期を増大することが示された
〔Ｌｉｊｎｅｎ及びＣｏｌｌｅｎ：“Ｔｈｒｏｍｂ．
Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ”６６， ９４−９５（１９９
１）〕。ｔＰＡの両方のカール部ドメインとＵＫのセリ
ン−プロテアーゼドメインとからなる削除変異体及び置
換変異体は著しく長い半減期に基づいてもとの、すなわ
ち変化されなかったプラスミノーゲンアクチベーター類
に比して血栓溶解性において優れていた。しかしながら
これらのプラスミノーゲンアクチベーター変異体は僅か
なフィブリン特異性しか有していない〔Ｌｕ等：“Ｂｌ
ｏｏｄ”７８，１２５−１３１（１９９１）〕。
【００１０】高められたフィブリン特異性を有する種々
のプラスミノーゲンアクチベーターを作り出すために、
種々の研究が行われた。出血の危険を低下させるために
そのような作用物質はできるだけプラスミノーゲンを排
除してその血栓の近くで活性化させるべきであるが、全
身的なプラスミノーゲンの活性化を引き起こさないよう
にするべきである。すなわち、例えばカール部１がもと
の分子のカール部２と置き換えられたｔＰＡの変異体が
公知である。この変異体はＮ末端の種々のリジン残基に
対して高められた親和性を有するけれども、フィブリン
に対しては親和性を持たない。動物モデルにおいてこの
変異体は血栓溶解についてもとの組織プラスミノーゲン
アクチベーターよりも有効ではなかった〔Ｃｏｌｌｅｎ
等：“Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ”６
５， １７４−１８０（１９９１）〕。血栓特異的種々
の抗体と種々のプラスミノーゲンアクチベーターとの融
合体よりなる他の公知の種々の変異体は動物モデルにお
いてもとのプラスミノーゲンアクチベーター類よりも有
効であった〔Ｌｉｊｎｅｎ及びＣｏｌｌｅｎ：“Ｔｈｒ
ｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ”６６， ８８−１
１０（１９９１）〕。こうもり Ｄｅｓｍｏｄｕｓ ｒ
ｅｔｕｎｄｕｓ から分離されたプラスミノーゲンアク
チベーターは非常に高いフィブリン特異性を有している
〔Ｇａｒｄｅｌｌ等：“Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．”２６４， １９７４７−１９７５２（１９８
９）〕。このプラスミノーゲンアクチベーターは動物実
験において高められた半減期及び低下した全身的プラス
ミノーゲン活性化とともにｔＰＡよりも改善された血栓
溶解性を示す〔Ｇａｒｄｅｌｌ等：“Ｃｉｒｃｕｌａｔ
ｉｏｎ”８４， ２４４−２５３（１９９１）、Ｍｅｌ
ｌｏｔｔ等：“Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ． Ｔｈｒｏｍ
ｂ．”１２， ２１２−２２１（１９９２）〕。
【００１１】しかしながら種々のプラスミノーゲンアク
チベーターによる血栓症患者の処置の成功は血栓溶解性
に依存するのみならず、その開放されている血管の再閉
塞をどの程度まで阻止することができるかにも依存す
る。種々の研究結果によって、それら血栓の中に結合さ
れているトロンビンが血栓溶解に際して再び活性の酵素
として遊離され、そして血管の再閉塞をもたらし得るこ
とが示されている〔Ｓｚｃｚｅｋｌｉｋ等：“Ａｒｔｅ
ｒｉｏｓｃｌ． Ｔｈｒｏｍｂ．”１２， ５４８−５
５３（１９９２）、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ：“Ｃｉｒｃｕ
ｌａｔｉｏｎ”８４，２６０１−２６０３（１９９
１）〕。実際に血栓溶解薬の作用は、トロンビン阻害剤
ヘパリンの同時的又は事前の投与によって改善される。
またアルガトロバン、ヒルゲン又はプロテインＣの投与
によっても溶解治療における再閉塞の発生を低下させる
ことができる〔Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ：“Ｔｈｒｏｍｂ．
Ｒｅｓ．”６４， ６７７−６８９（１９９０）、Ｙ
ａｏ等：“Ａｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．”２６２ （“Ｈ
ｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．”３１， Ｈ
３７４−Ｈ３７９）（１９９２）、Ｇｒｕｂｅｒ等：
“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ”８４， ２４５４−２４６
２（１９９１）〕。その上に、心筋梗塞患者の致死率が
ヘパリンの事前の投与及び引き続くプロウロキナーゼの
適用によって、対照群（予めヘパリンを投与することな
くプロウロキナーゼを適用）よりも重大に低下すること
が取られている〔Ｔｅｐｐｅ等：“Ｚ． Ｋａｒｄｉｏ
ｌ．”８０，Ｓｕｐｐｌ． ３， ３２（１９９
１）〕。
【００１２】最も強力なトロンビン阻害剤の１つは水蛭
Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｅｓ から分離さ
れたヒルジンであり、このものはそのカルボキシル末端
の半部によってトロンビンのいわゆるアニオン結合部位
に特異的に結合する。ヒルジン分子のアミノ末端の半部
の特定のアミノ酸がトロンビンの基質結合ポケットへの
到達を遮蔽する〔Ｒｙｄｅｌ等：“Ｓｃｉｅｎｃｅ”２
４９， ２７７−２８０（１９９０）〕。更にまた、ト
ロンビンがヒルジンの比較的小さな誘導体によっても阻
害され得ることが知られており、その際、中でも Ｍａ
ｒａｇａｎｏｒｅ等によって“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ”２９， ７０９５−７１０１（１９９０）に記述さ
れている各種ヒルログ分子を取りあげるべきである〔Ｋ
ｒｕｓｔｅｎａｎｓｋｙ等：“Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅ
ｍ．”３０， １６８８−１６９１（１９８７）、Ｙｕ
ｅ等：“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”
５，７７−８５（１９９２）〕。
【００１３】血栓に基づく血管疾病を処置するために、
プラスミノーゲンアクチベーターと組み合わせてヒルジ
ンを使用することはヨーロッパ特許出願ＥＰ ３２８９
５９号及びＥＰ ３６５４６８号に記述されている。血
栓溶解薬と組み合わせてヒルジン誘導体を治療のために
用いることは国際特許出願ＷＯ ９１／０１１４２号か
ら公知である。
【００１４】トロンビンはまた、人のトロンビン受容体
のアミノ末端の配列から導かれたペプチドによっても阻
害され得る〔Ｖｕ等：“Ｎａｔｕｒｅ”２５３， ６７
４−６７７（１９９１）〕。トロンビン受容体はそのア
ミノ末端の領域内にトロンビンのための隣接する解裂部
位を有するトロンビン結合配列を含む。こ受容体のトロ
ンビン結合領域は、その構造においてヒルジンのカルボ
キシル末端の領域に非常に類似している。この受容体は
トロンビンによって活性化されるが、その際その受容体
配列が解裂される。受容体とトロンビンとの間の親和性
に基づいて、この結合領域と改質された解裂部位とを有
する受容体のフラグメントはトロンビン阻害剤として作
用する。
【００１５】同様に、トロンビンはまた、ヘマジンのア
ミノ酸４１ないし５７から導かれたペプチドによっても
阻害され得る〔Ｓｔｒｕｂｅ等：“Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．”２６８， ８５９０−８５９５（１９９
３）〕。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、非常
に短時間のうちに充分な血栓溶解をもたらし、そして同
時に、最初に成功した血栓溶解の後の血管の再閉塞を阻
止するような、血栓に基づく血管閉塞の処置のための作
用物質を開発することである。更に、これらの作用物質
によれば全身的プラスミノーゲン活性化が回避されるべ
きである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、そのよう
な作用物質に課せられた高度の要求条件が特定的な２官
能性ウロキナーゼ変異体により満足されることを見出し
た。
【００１８】従って本発明の対象は、下記一般式（Ｉ）
の２官能性ウロキナーゼ変異体である： Ｍ4 −Ｘ1 −Ｙ1 （Ｉ） この式において Ｍ4 は添付の図１に従う非グリコシル化プロウロキナ
ーゼの47Ｓｅｒないし411 Ｌｅｕのアミノ酸配列を意味
し、 Ｘ1 はＭ4 とＹ1 との間の直接結合か、 Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ又は Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓ
ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ又は Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓ
ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙの配列のペプチドか、又は下記一般式（ＩＩ） Ｓｅｒ−Ｘ2 −Ｘ3 −Ｘ4 −Ｘ5 −Ｘ6 −Ｘ7 （ＩＩ） のペプチド配列を表わすが、ここでＸ2 はＰｒｏ又はＬ
ｕｅを、Ｘ3 はＶａｌ又はＰｒｏを、Ｘ4 はＬｙｓ、Ｖ
ａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ又はＧｌｕを、Ｘ5 はＡｌａ、Ｖ
ａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ又はＩｌｅを、Ｘ6 はＰｈｅ、Ｔ
ｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌを、そしてＸ7 はＧｌｙか、又
はＸ6 とＹ1との間の直接結合を意味し、そして Ｙ1 は Ｙ2 −Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｙ3 −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｙ4又は Ｙ2 −Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ又は Ｙ2 −Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓの配列のペプチドを
意味し、その際Ｙ2 はＰｒｏ又はＶａｌを、Ｙ3 はＬｅ
ｕか、又はＰｒｏとＧｌｙとの間の直接結合を、そして
Ｙ4 はＧｌｎ又はヒドロキシル基を意味する。
【００１９】一般式（Ｉ）においてＹ1 が Ｙ2 −Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｙ3 −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｙ4の配列のペプチドを表わし、その際Ｙ2 はＰ
ｒｏ又はＶａｌを、Ｙ3 はＬｅｕか、又はＰｒｏとＧｌ
ｙとの間の直接結合を、そしてＹ4 はＧｌｎ又はヒドロ
キシル基を意味する２官能性ウロキナーゼ変異体におい
て、Ｘ1 は好ましくは下記一般式（ＩＩ） Ｓｅｒ−Ｘ2 −Ｘ3 −Ｘ4 −Ｘ5 −Ｘ6 −Ｘ7 （ＩＩ） のペプチド配列であり、その際Ｘ2 はＰｒｏ又はＬｅｕ
を、Ｘ3 はＶａｌを、Ｘ 4 はＬｙｓ、Ｖａｌ又はＡｒｇ
を、Ｘ5 はＡｌａ、Ｖａｌ又はＧｌｙを、Ｘ6 はＰｈ
ｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌを、そしてＸ7 はＧｌｙ
か、又はＸ6 とＹ1との間の直接結合を意味する。これ
ら２官能性ウロキナーゼ変異体の中で、一般式（ＩＩ）
においてＸ2 がＰｒｏ又はＬｅｕを、Ｘ3 がＶａｌを、
Ｘ4 がＬｙｓ又はＶａｌを、Ｘ5 がＡｌａ又はＶａｌ
を、Ｘ6 がＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒを、そしてＸ7 が
Ｇｌｙか、又はＸ6 とＹ1 との間の直接結合を意味する
ペプチド配列が特に好ましい。
【００２０】一般式（Ｉ）においてＹ1 が Ｙ2 −Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕの配列（但し
Ｙ2 はＰｒｏ又はＶａｌを表わす）のペプチドである２
官能性ウロキナーゼ変異体において、Ｘ1 は好ましくは
下記一般式（ＩＩ） Ｓｅｒ−Ｘ2 −Ｘ3 −Ｘ4 −Ｘ5 −Ｘ6 −Ｘ7 （ＩＩ） のペプチド配列であり、その際Ｘ2 はＰｒｏ又はＬｅｕ
を、Ｘ3 はＶａｌを、Ｘ 4 はＬｙｓ又はＶａｌを、Ｘ5
はＡｌａ又はＶａｌを、Ｘ6 はＰｈｅ又はＴｒｐを、そ
してＸ7 はＸ6 とＹ1 との間の直接結合を意味する。
【００２１】公知の種々のプラスミノーゲンアクチベー
ター及びプラスミノーゲンアクチベーターの１つとトロ
ンビン阻害剤の１つとの公知の混合物に比して本発明に
従う２官能性ウロキナーゼ変異体は予期できなかった良
好なトロンビン阻害的性質と組み合わされたより強力な
繊維素溶解作用によって優れている。その上に本発明に
従うポリペプチド類のうち、血漿フィリノーゲンは驚く
べきことに著しく僅かな量でしか消費されない。これか
ら得られる極めて高いフィブリン特異性、なかでも公知
のプラスミノーゲンアクチベーターとトロンビン阻害剤
との混合物に比しても極めて高いフィブリン特異性は、
血液の凝固能力がほんの僅かしか影響を受けず、そして
全身的フィブリノーゲン分解の可能な合併症としての制
御できない出血の危険を最小になることをもたらす。従
って本発明に従うウロキナーゼ変異体の高いフィブリン
特異性は公知の血栓溶解薬のボーラス適用に比して著し
く低下した出血の危険性とともにボーラス適用を可能と
する。
【００２２】一般式（Ｉ）の２官能性ウロキナーゼ変異
体は毒性的に問題がなく、従ってこのものはそのまま、
血栓に基づく血管閉塞を有する患者に適当な薬物調剤と
して投薬することができる。
【００２３】本発明の別の対象は、従って有効物質とし
て一般式（Ｉ）の２官能性ウロキナーゼ変異体を含む種
々の血栓溶解薬である。血栓に基づく血管閉塞、例えば
心筋梗塞、脳梗塞、末梢動脈閉塞、急性動脈閉塞、肺塞
栓及び深部の脚及び骨盤の動脈血栓症を処置するために
は本発明に従うポリペプチドの０．１ないし１ｍｇ／ｋ
ｇが必要である。これら２官能性ウロキナーゼ変異体は
静脈内、及びなかでもボーラス注射によって適用するこ
とができる。
【００２４】本発明に従う血栓溶解薬は少なくとも１種
類の２官能性ウロキナーゼ変異体に加えて種々の助剤、
例えば担体物質、溶剤、稀釈剤、染料及び結合剤等を含
む。これら助剤の選択及びこのものの使用量は、その医
薬をどのように適用すべきかに依存し、そして当業者に
はなんらの問題も起こさない。
【００２５】２官能性ウロキナーゼ変異体の製造は遺伝
子工学的方法によって行われる。従って、一般式（Ｉ）
の２官能性ウロキナーゼ誘導体を得るときに用いるため
のプラスミド類も本発明の対象であり、これらはそのオ
ペロンが制御可能なプロモータ、リボソーム結合部位と
して有効なシャイン−ヂルガルノ配列、開始コドン、一
般式（Ｉ）の２官能性ウロキナーゼ変異体のための合成
構造遺伝子及びその構造遺伝子の下流側の１個又は２個
のターミネーターを有するものである。
【００２６】制御可能なプロモータとしては、なかでも
ｔｒｐプロモータ又はｔａｃプロモータが適している。
ターミネーターとしては、好ましくはＴｎ１０からなる
ｔｒｐＡターミネーター及び／又はｔｅｔＡ／ｏｒｆＬ
ターミネーターが用いられる。
【００２７】本発明に従うプラスミドの制御部位内で、
シャイン−ダルガルノ配列と開始コドンとの間の間隔は
６−１２ヌクレオチド、好ましくは８−１０ヌクレオチ
ドである。
【００２８】本発明に従うプラスミドの発現は大腸菌の
種々の株、なかでもＫ１２群の大腸菌株、例えばＥ．ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ １０１（ＡＴＣＣ ３３８７
６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ １０３（ＡＴＣＣ
３９４０３）、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ ＪＭ １０５
（ＤＳＭ ４１６２）及びＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＤＨ
１（ＡＴＣＣ ３３８４９）において行われる。そのバ
クテリア細胞の中で一般式（Ｉ）の本発明に従う２官能
性ウロキナーゼ変異体は封入体中で高い収率で発生し、
この封入体の中でその蛋白質は変性された形で存在す
る。封入体を分離した後、その変性された蛋白質は或る
酸化還元系の作用のもとに蛋白質化学的に所望の３次構
造に再生される。
【００２９】
【実施例】
１） 本発明の２官能性ウロキナーゼ変異体の調
製、分離及び精製 −ａ）クローニング操作Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ の中での本発明に従
うポリペプチドの遺伝子工学的製造のための発現プラス
ミドを公知の態様で作った。個々の調製段階の順序は図
２及び図２ａないし２ｐに示してある。このプラスミド
の調製の出発生成物は、プラスミドｐＢｌｕｅｓｋｒｉ
ｐｔ ＫＳ ＩＩ＋（ハイデルベルクのＳｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ社）、ｐＵＣ８（フライブルクのＰｈａｒｍａｃ
ｉａ社）及びｐＧＲ２０１であった。ｐＧＲ２０１はヨ
ーロッパ特許ＥＰ４０８９４５号及び“Ａｐｐｌ． Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．”３６， ６
４０−６４９（１９９２）に記述されているプラスミド
ｐＢＦ１６０と同一である。各制限エンドヌクレアーゼ
ＢａｎＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、
ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ、並びにア
ルカリ性ホスファターゼのようなＤＮＡを変性する酵素
類、Ｔ４−リガーゼ、Ｔ４−キナーゼ及びＴ７−ポリメ
ラーゼはＰｈａｒｍａｃｉａ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社（マンハイム）及びＧｉｂ
ｃｏ社（エッゲンシュタイン）から入手した。それらプ
ラスミド類のその調製の間における変化は制限分析及び
ＤＮＡの配列決定によって検査した。ＤＮＡの配列決定
はそのメーカーの仕様に従いＰｈａｒｍａｃｉａ社の試
薬コレクションを用いて行なった。各プラスミドの調製
に際して種々のオリゴデオキシリボヌクレオチド（オリ
ゴ）を用いたが、それらの配列はそれぞれの表示記号と
ともに下記表１にあげてある。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【表２】
【００３２】
【表３】
【００３３】それらオリゴデオキシリボヌクレオチド類
を脱トリチル化した形で、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ社（ウァイターシュタット）の合成装置（モ
デル３９１）によりこのメーカーの仕様に従いｂ−シア
ノエチルで保護されたジイソプロピルアミノホスホアミ
ダイトを用い、０．１μモルの尺度で作った。１００ピ
コモル当り、５０ミリモルのトリ（ヒドロキシメチル）
アミノメタン／ＨＣｌ（トリス／ＨＣｌ）の中でｐＨ
７．５において１０ミリモルの塩化マグネシウムと５ミ
リモルのジチオスレイトールとを１０ミリモルのアデノ
シントリ燐酸の存在のものに酵素単位Ｔ４キナーゼによ
りホスホリル化し、次いで同じ緩衝液の中で２重鎖ＤＮ
Ａ分子に変えた。得られた合成２重鎖ＤＮＡ分子をポリ
アクリルアミドゲル（５％ポリアクリルアミド）の上で
ゲル電気泳動により精製し、次いで対応して予め調製し
ておいた各プラスミドと連結反応させた。この各プラス
ミドの予備調製は各種制限酵素による消化、対応する各
制限フラグメントの分離とその５’末端の脱ホスホリル
化、引き続く連結反応及びＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ
１０３の中での形質転換、並びにその他の全ての遺伝子
工学的な操作によって公知の態様で行ない、そしてこれ
は、米国コールドスプリングハーバーのコールドスプリ
ングハーバープレス１９８９年刊行の、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ等：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”第２版に記述さ
れている。 −ｂ）継代培養物の調製及び発酵 各組換え発現プラスミドｐＳＪ６９、ｐＳＪ７６、ｐＳ
Ｊ７７、ｐＳＪ７８、ｐＳＪ７９、ｐＳＪ８１、ｐＳＪ
８３、ｐＳＪ９０、ｐＳＪ９１、ｐＳＪ９２、ｐＳＪ９
３、ｐＳＪ９４、ｐＳＪ９５、ｐＳＪ１０１、ｐＳＪ１
０２、ｐＳＪ１０３、ｐＳＪ１０４、ｐＳＪ１０５、ｐ
ＳＪ１０６、ｐＳＪ１０９、ｐＳＪ１１１、ｐＳＪ１１
４及びｐＳＪ１１３をＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０
３（ＡＴＣＣ３９４０３）の中に導入し、そして標準Ｉ
−寒天（１５０ｍｇ／ｌのアンピシリン）の上に塗布し
た（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ”）。各形質転換の個々のコロニーを２０℃において
標準Ｉ−培地（ｐＨ７．０、アンピシリン１５０ｍｇ／
ｌ）で５７８ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）１まで培養
し、２ｍｌづつの５つの部分に分けて継代培養物として
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、最終濃度７．５％）
の添加のもとに液体窒素の中で深冷凍結して−７０℃で
保存した。２官能性ウロキナーゼ変異体を得るためには
各継代培養物のそれぞれ１ｍｌを２０ｍｌの標準Ｉ−培
地（ｐＨ７．０、アンピシリン１５０ｍｇ／ｌ）の中に
懸濁させ、そして５７８ｎｍでのＯＤ１まで３７℃にお
いて培養した。
【００３４】次にその得られた培養物の全量を１リット
ルの標準Ｉ−培地（ｐＨ７．０、アンピシリン１５０ｍ
ｇ／ｌ）の中に懸濁させ、そして震盪フラスコの中で３
７℃において発酵させた。誘導は、５７８ｎｍでのＯＤ
０．５ないし１において２ｍｌのインドールアクリル酸
溶液（エタノール２ｍｌ中６０ｍｇ）を添加することに
より行なった。 −ｃ）発現の試験 発現率（１ｍｌ当り１ＯＤについてのＰｌｏｕｇ単位）
を試験するために誘導の直前及び誘導後の各１時間毎
（合計６時間）に５７８ｎｍでのＯＤが１の細胞懸濁液
１ｍｌに相当する細胞を遠心分離した。それら遠心分離
された細胞をリゾチーム〔５０ミリモルトリス／ＨＣｌ
緩衝液（ｐＨ８．０）の中の５０ミリモルのエチレンジ
アミン４酢酸（ＥＤＴＡ）及び１５容積％のサッカロー
スの１ｍｌ当りリゾチーム１ｍｇ〕で溶解させた。それ
ら溶解された細胞を４−５Ｍのグアニジニウムヒドロク
ロリド溶液の中で溶解化させ、そして１．２Ｍのグアニ
ジニウムヒドロクロリドに稀釈した後で還元剤（グルタ
チオン又はシステイン）の添加のもとに２−５時間再生
反応させた〔Ｗｉｎｋｌｅｒ等：“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ”２５， ４０４１−４０４５ （１９８
６）〕。得られた１重鎖の２官能性ウロキナーゼ変異体
をプラスミンの添加により対応する２重鎖のウロキナー
ゼ変異体に変えたが、その活性を２重鎖の活性ウロキナ
ーゼによってのみ解裂される色素原性基質ピロ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドにより求めた。
本発明に従う２官能性ウロキナーゼ変異体のプラスミン
による活性化は５０ミリモルのトリス／ＨＣｌ緩衝液、
１２ミリモルの塩化ナトリウム、０．０２％のトゥイー
ン８０の中でｐＨ７．４において３７℃で行なった。２
官能性ウロキナーゼ変異体のプラスミンに対する割合は
モル濃度で約１００ないし１５００対１、又は酵素単位
について約８，０００ないし３６，０００対１であっ
た。試験インキュベーションは５０ミリモルのトリス／
ＨＣｌ緩衝液及び３８ミリモルの塩化ナトリウムの中で
ｐＨ８．８において０．３６μモルのアプロチニン（プ
ラスミン阻害用）及び０．２７ミリモルの基質ピロ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドの存在のも
とに３７℃において行なった。２官能性ウロキナーゼ変
異体の濃度に依存して反応を５ないし６０分間のインキ
ュベーションの後で５０％濃度酢酸の添加により停止さ
せ、そして４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。基質
のメーカー（スエーデンのＫａｂｉ Ｖｉｔｒｕｍ）の
仕様書によれば、この操作法で４０５ｎｍにおける１分
間当り０．０５の吸光度変化は試験溶液１ｍｌ当り２５
Ｐｌｏｕｇ単位のウロキナーゼ活性に相当する。本発明
に従う２官能性ウロキナーゼ変異体は、１ｍｇの精製蛋
白質当り１２０，０００ないし１５５，０００ｐｌｏｕ
ｇ単位の比活性度を有した。その溶液の蛋白質含有量は
Ｐｉｅｒｃｅ社のＢＣＡアッセイにより求めた。 −ｄ）分離及び精製 誘導の５ないし６時間後に、上記１−ｂ）に記述した条
件のもとで行なった発酵を停止させた（５７８ｎｍにお
けるＯＤ密度５−６）。細胞を遠心分離した。細胞の沈
殿を２００ｍｌの水に再懸濁させ、そして高圧ホモジナ
イザの中で溶解化させた。あらためて遠心分離した後、
１重鎖２官能性ウロキナーゼ変異体の全量を含んでいる
その沈殿物を５Ｍの塩酸グアニジニウム、４０ミリモル
のシステイン、１ミリモルのＥＤＴＡの５００ｍｌの中
にｐＨ８．０において溶解させ、そしてｐＨ９．０の２
５ミリモルトリス／ＨＣｌの２，０００ｍｌで稀釈し
た。その再生反応は約１２時間の後に停止させた。
【００３５】得られた２官能性ウロキナーゼ変異体をシ
リカゲル８ｇの添加の後２時間撹拌することにより完全
にシリカゲルの上に結合させた。この結合したシリカゲ
ルを分離して酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．０）で洗浄した。
それらウロキナーゼ変異体を０．１モルの酢酸塩緩衝液
（ｐＨ４）で溶離させた。クロマトグラフィーによる２
回の分離（銅キレートカラム及びカチオン交換樹脂）の
後でそのウロキナーゼ変異体が純粋の形で得られた。Ｎ
末端の配列分析により、一方において１重鎖度が、そし
て他方においてその所望のアミノ末端の配列が確認され
た。個々の変異体の、その変化したカルボキシル末端の
領域の蛋白質化学的特性確認は、その蛋白質（９０％蟻
酸１ｍｌ及びヘプタフルオル酪酸１ｍｌの中に溶解し
た）を修飾ＣＮＢｒ分解した後、トリプトファン残基の
後ろのペプチド鎖の解裂により達成された。そのカルボ
キシル末端のペプチドはＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグ
ラフィー）による配列分析に先立って分離し、精製し
た。
【００３６】分離して表２にあげた全ての２官能性ウロ
キナーゼ変異体はウロキナーゼ用の色素原性基質を用い
た活性化試験において全く、又は極めて僅かの活性（精
製蛋白質１ｍｇ当り１２００Ｐｌｏｕｇ単位以下）しか
示さなかった。プラスミンによる解裂〔条件は上記１−
ｃ）に記載した〕の後で初めて精製蛋白質１ｍｇ当り１
２０，０００ないし１５５，０００Ｐｌｏｕｇ単位の酵
素活性が得られた。従って全てのウロキナーゼ変異体は
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０３の中で１重鎖蛋白質
として発現された。
【００３７】 註１）：Ａ＝Ｙ2 −Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｙ3 −Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｙ4 ２）：Ｂ＝Ｙ2 −Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙ
ｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ
−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ ２） 薬理学的試験トロンビン阻害作用の測定 本発明に従う２官能性ウロキナーゼ変異体の阻害剤活性
をトロンビン時間の測定によって求めたが、その際ベロ
ナール緩衝液の中の人クエン酸血漿の１：１０の稀釈液
２００μｌを、０．５−５０μｇの２官能性ウロキナー
ゼ変異体の含まれた水溶液５０μｌ及び５０μｌのトロ
ンビン溶液（０．２単位）と混合した。次にフィブリン
網が形成されるまでの時間を測定した。表３にそれら測
定した阻害係数をあげるが、これはそれぞれ、本発明に
従う２官能性ウロキナーゼ変異体の１０μｇの存在のも
とでのトロンビン時間の増大を示す。このトロンビン時
間の、濃度に依存する増大も同様に測定し、そしてこれ
は２官能性ウロキナーゼ変異体Ｍ１２、Ｍ２３、Ｍ２
９、Ｍ３２、Ｍ３３について、及び比較のためにＭ４に
ついて図３にグラフとして示してある。本発明に従う２
官能性ウロキナーゼ変異体と異なり、凝固までの時間は
１ｍｇの投与量ではＭ４、すなわち図１に従うグリコシ
ル化されていないプロウロキナーゼの47Ｓｅｒないし
411Ｌｅｕまでのアミノ酸配列についてのもの、によっ
ても、またグリコシル化されていないプロウロキナーゼ
（ザルプラーゼ）によっても、また更に、ＬＵＫ自身に
よっても増大されなかった。
【００３８】 註 １）：蛋白質１０μｇの作用についての値 阻害係数＝〔阻害剤なしのトロンビン時間〕÷〔阻害剤
入りトロンビン時間〕２官能性ウロキナーゼ変異体Ｍ１２及びＭ２３の動物実
験における薬理学的性質 薬理学的生体内モデルにおいて２官能性ウロキナーゼ変
異体Ｍ１２及びＭ２３の動脈血管閉塞の血栓溶解に対す
る作用をザルプラーゼ（グリコシル化されていないプロ
ウロキナーゼ）と比較して試験した。これには麻酔した
家兎について大腿動脈の一時的に分離した約１ｃｍの長
さの部分の中に側枝を介してトロンビン及び 125Ｊで標
識した人フィブリノーゲンを注射した。これによって血
栓が形成されたが、これは完全な血管閉塞に導いた。生
じた血栓の大きさは取り込まれた人フィブリンの放射能
によりγ線検出器を用いて体外で測定した。血液貫流の
電磁的測定及び血栓の放射能の測定は全実験時間にわた
り連続的に行なった。従ってフィブリン溶解作用は血栓
により閉塞した血管の再潅流としても、またその血栓
の、取り込まれた放射能標識フィブリンの分解によって
も定量測定された。本発明に従う２官能性ウロキナーゼ
変異体の適用前並びにウロキナーゼ変異体の適用のそれ
ぞれ３０、６０及び９０分後に血液試料を採取し、そし
てこれらの血漿のフィブリノーゲンの濃度を測定した。
１ｋｇ当りそれぞれ６ｍｇのＭ１２、Ｍ２３及びザルプ
ラーゼを静脈内ボーラス注射として適用した。Ｍ１２及
びＭ２３はザルプラーゼに比して追加的な抗凝集作用を
有するので、４つの実験群においてザルプラーゼと抗凝
血剤ヘパリンとを組み合わせた（１ｋｇ当り１５０Ｕの
静脈内ボーラス）。これらの群の大きさはそれぞれ動物
６匹であった。
【００３９】９０分間の実験時間の間、標識された血栓
フィブリンの血栓溶解性はＭ１２について４６±１１
％、Ｍ２３について４３±１２％、ザルプラーゼについ
て２２±５％、そしてザルプラーゼ／ヘパリンの組み合
わせについて３９±１５％であった。Ｍ１２及びＭ２３
のボーラス適用は全ての６匹の動物において血栓で閉塞
した血管の開放に導いたが、ザルプラーゼの適用によっ
ては６匹中５匹の動物において、そしてザルプラーゼ／
ヘパリンの適用によっては６匹中４匹の動物においてそ
の血管が再潅流できた。この再潅流の流れの最高値（出
発値の％で表わした）はＭ１２について９５±１０％、
Ｍ２３について８２±９％であり、そしてザルプラーゼ
についての４３±１２％と言う再潅流流量の最高値と大
きく異なっていた。ザルプラーゼとヘパリンとで処理し
た場合の５８±８％と言う再潅流流量の最高値はＭ１２
及びＭ２３の結果とザルプラーゼの結果との中間であ
り、そして両方の側へ大きくは異なっていない。総合繊
維素溶解作用を再潅流の流れの面積（最初の流れの％と
して）としてその９０分間の実験時間にわたり求めた。
この総合効果はＭ１２について４，５０２±１，１２７
％・分、そしてＭ２３について４，２７０±８８５％・
分であり、そして本発明に従う両方のウロキナーゼ変異
体についてはザルプラーゼについての１，５１９±６４
３％・分の値よりも極めて大きかった。ザルプラーゼ／
ヘパリンの組み合わせ処理によれば総合効果２，２１７
±７６１％・分の値が測定されたが、これはザルプラー
ゼの単独処理におけるよりもそれほど良好ではなく、そ
してＭ１２及びＭ２３についての結果よりも明らかに下
であった。それらの結果を表４にまとめて示す。
【００４０】 註 ＊）：Ｐ＜０．０５対ザルプラーゼ 驚くべきことに、Ｍ１２のボーラス適用によってのみら
なずＭ２３のボーラス適用によってもフィブリノーゲン
の血漿中濃度はザルプラーゼのボーラス適用によるより
も重大に低く低下することが見出された。この結果は表
５にまとめて示してある。
【００４１】 註 ＊）：Ｐ＜０．０５対ザルプラーゼ これらの結果は、本発明に従う２官能性ウロキナーゼ変
異体Ｍ１２及びＭ２３が血管の完全な閉塞をもたらす動
脈血栓を溶解し、そして血栓の生じた血管の血液貫流を
再び形成することを示している。この作用はＭ１２又は
Ｍ２３の１回のボーラス適用によってヘパリン処理され
ていない動物について達成された。驚くべきことにこ
の、ザルプラーゼに比してより強いＭ１２及びＭ２３の
繊維素溶解作用は血漿フィブリノーゲンのより少ない消
費と組み合わされていた。このことは、Ｍ１２とＭ２３
とがザルプラーゼに比して著しく高いフィブリン特異性
を示すことを意味する。
【００４２】Ｍ１２及びＭ２３によるザルプラーゼに比
しての血漿フィブリノーゲンに対する良好な好ましい影
響は、血液の凝固性が良好に維持されたままに留まり、
また従って全身的フィブリノーゲン分解の、可能な合併
症としての制御できない出血の危険が低下していること
を意味する。従ってＭ１２及びＭ２３は止血学的副作用
の危険について、ザルプラーゼよりもより安全であると
格付けすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の２官能性ウロキナーゼ変異体の主要部
を構成する非グリコシル化プロウロキナーゼの47Ｓｅｒ
ないし 411Ｌｅｕのアミノ酸配列を示す図。
【図２】本発明に従う各ポリペプチドの遺伝子工学的調
製方法を図解する説明図。
【図３】図３は、本文中図２ａを表す。本発明に従う各
ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説明
図。
【図４】図４は、本文中図２ｂを表す。本発明に従う各
ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説明
図。
【図５】図５は、本文中図２ｃを表す。本発明に従う各
ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説明
図。
【図６】図６は、本文中図２ｄを表す。本発明に従う各
ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説明
図。
【図７】図７は、本文中図２ｅを表す。本発明に従う各
ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説明
図。
【図８】図８は、本文中図２ｆを表す。本発明に従う各
ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説明
図。
【図９】図９は、本文中図２ｇを表す。本発明に従う各
ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説明
図。
【図１０】図１０は、本文中図２ｈを表す。本発明に従
う各ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説
明図。
【図１１】図１１は、本文中図２ｉを表す。本発明に従
う各ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説
明図。
【図１２】図１２は、本文中図２ｊを表す。本発明に従
う各ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説
明図。
【図１３】図１３は、本文中図２ｋを表す。本発明に従
う各ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説
明図。
【図１４】図１４は、本文中図２ｌを表す。本発明に従
う各ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説
明図。
【図１５】図１５は、本文中図２ｍを表す。本発明に従
う各ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説
明図。
【図１６】図１６は、本文中図２ｎを表す。本発明に従
う各ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説
明図。
【図１７】図１７は、本文中図２ｏを表す。本発明に従
う各ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説
明図。
【図１８】図１８は、本文中図２ｐを表す。本発明に従
う各ポリペプチドの遺伝子工学的調製方法を図解する説
明図。
【図１９】図１９は、本文中図３を表す。本発明に従う
２官能性ウロキナーゼ変異体のトロンビン時間（フィブ
リン網形成までの時間）の増大の濃度依存性変化を比較
したグラフ。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/72 Ｃ１２Ｒ 1:19） 9050−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ (72)発明者 ヨハネス・シユナイダー ドイツ連邦共和国、52223 シユトールベ ルク、ローラントストラーセ、40 (72)発明者 レジナ・ハインツエル−ウイーラント ドイツ連邦共和国、52078 アーヒエン、 フーベルトウスウエーク、19 (72)発明者 デレ−ク・ヨーハン・ザウンダース ドイツ連邦共和国、52072 アーヒエン、 フエルステルストラーセ、19

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記一般式（Ｉ）の２官能性ウロキナー
    ゼ変異体。 Ｍ4 −Ｘ1 −Ｙ1 （Ｉ） この式において Ｍ4 は添付の図１に従う非グリコシル化プロウロキナ
    ーゼの47Ｓｅｒないし411 Ｌｅｕのアミノ酸配列を意味
    し、 Ｘ1 はＭ4 とＹ1 との間の直接結合か、 Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ
    ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ又は Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓ
    ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ又は Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓ
    ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇ
    ｌｙの配列のペプチドか、又は下記一般式（ＩＩ） Ｓｅｒ−Ｘ2 −Ｘ3 −Ｘ4 −Ｘ5 −Ｘ6 −Ｘ7 （ＩＩ） のペプチド配列を表わすが、ここでＸ2 はＰｒｏ又はＬ
    ｅｕを、Ｘ3 はＶａｌ又はＰｒｏを、Ｘ4 はＬｙｓ、Ｖ
    ａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ又はＧｌｕを、Ｘ5 はＡｌａ、Ｖ
    ａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ又はＩｌｅを、Ｘ6 はＰｈｅ、Ｔ
    ｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌを、そしてＸ7 はＧｌｙか、又
    はＸ6 とＹ1との間の直接結合を意味し、そして Ｙ1 は Ｙ2 −Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｙ3 −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
    −Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
    Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌ
    ｅｕ−Ｙ4又は Ｙ2 −Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒ
    ｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ
    −Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
    Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ又は Ｙ2 −Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈ
    ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ
    −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓの配列のペプチドを
    意味し、その際Ｙ2 はＰｒｏ又はＶａｌを、Ｙ3 はＬｅ
    ｕか、又はＰｒｏとＧｌｙとの間の直接結合を、そして
    Ｙ4 はＧｌｎ又はヒドロキシル基を意味する。
  2. 【請求項２】 Ｙ1 が Ｙ2 −Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｙ3 −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
    −Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
    Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌ
    ｅｕ−Ｙ4の配列のペプチドを意味する、請求項１に従
    うウロキナーゼ変異体。
  3. 【請求項３】 Ｙ1 が Ｙ2 −Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒ
    ｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ
    −Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
    Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕの配列のペプ
    チドを意味する、請求項１に従うウロキナーゼ変異体。
  4. 【請求項４】 Ｘ1 が一般式（ＩＩ）のペプチド配列で
    あり、その際Ｘ2 はＰｒｏ又はＬｅｕを、Ｘ3 はＶａｌ
    を、Ｘ4 はＬｙｓ、Ｖａｌ又はＡｒｇを、Ｘ5 はＡｌ
    ａ、Ｖａｌ又はＧｌｙを、Ｘ6 はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙ
    ｒ又はＶａｌを、そしてＸ7 はＧｌｙか、又はＸ6 とＹ
    1 との間の直接結合を意味する、請求項１及び／又は２
    に従うウロキナーゼ変異体。
  5. 【請求項５】 Ｘ4 が又はＶａｌを、Ｘ5 がＡｌａ又は
    Ｖａｌを、Ｘ6 がＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒを、そして
    Ｘ7 がＧｌｙか、又はＸ6 とＹ1 との間の直接結合を意
    味する、請求項４に従うウロキナーゼ変異体。
  6. 【請求項６】 Ｘ7 がＸ6 とＹ1 との間の直接結合を意
    味する、請求項４及び／又は５に従うウロキナーゼ変異
    体。
  7. 【請求項７】 Ｘ1 が一般式（ＩＩ）のペプチド配列で
    あり、その際Ｘ2 はＰｒｏ又はＬｅｕを、Ｘ3 はＶａｌ
    を、Ｘ4 はＬｙｓ又はＶａｌを、Ｘ5 はＡｌａ又はＶａ
    ｌを、Ｘ6 はＰｈｅ又はＴｒｐを、そしてＸ7 はＸ6 と
    Ｙ1 との間の直接結合を意味する、請求項１及び／又は
    ３に従うウロキナーゼ変異体。
  8. 【請求項８】 請求項１ないし７の２官能性ウロキナー
    ゼ変異体を得る際に用いるためのプラスミドにおいて、
    そのオペロンが制御可能なプロモータ、リボソーム結合
    部位として働くシャイン−ダルガルノ配列、開始コド
    ン、請求項１ないし７の一般式（Ｉ）の２官能性ウロキ
    ナーゼ変異体のための合成構造遺伝子及びこの構造遺伝
    子から下流側の１個又は２個のターミネーターを有する
    こと、及びそれらプラスミドが大腸菌の各種株に２官能
    性ウロキナーゼ変異体を発現させるのに適していること
    を特徴とする、上記プラスミド。
  9. 【請求項９】 シャイン−ダルガルノ配列と開始コドン
    との間の間隔が６ないし１２ヌクレオチド、好ましくは
    ８ないし１０ヌクレオチドである、請求項８に従うプラ
    スミド。
  10. 【請求項１０】 ｐＳＪ６９、ｐＳＪ７６、ｐＳＪ７
    ７、ｐＳＪ７８、ｐＳＪ７９、ｐＳＪ８１、ｐＳＪ８
    ３、ｐＳＪ９０、ｐＳＪ９１、ｐＳＪ９２、ｐＳＪ９
    ３、ｐＳＪ９４、ｐＳＪ９５、ｐＳＪ１０１、ｐＳＪ１
    ０２、ｐＳＪ１０３、ｐＳＪ１０４、ｐＳＪ１０５、ｐ
    ＳＪ１０６、ｐＳＪ１０９、ｐＳＪ１１１、ｐＳＪ１１
    ４及びｐＳＪ１１３の群から選ばれる、請求項８及び／
    又は９に従うプラスミド。
  11. 【請求項１１】 ｐＳＪ７６、ｐＳＪ８１、ｐＳＪ８
    ３、ｐＳＪ９０、ｐＳＪ９１、ｐＳＪ９２、ｐＳＪ９
    ３、ｐＳＪ９４、ｐＳＪ９５、ｐＳＪ１０１、ｐＳＪ１
    ０２、ｐＳＪ１０３、ｐＳＪ１０５、ｐＳＪ１０６、ｐ
    ＳＪ１０９、ｐＳＪ１１１及びｐＳＪ１１４の群から選
    ばれる、請求項１０に従うプラスミド。
  12. 【請求項１２】 ｐＳＪ７６、ｐＳＪ８１、ｐＳＪ８
    ３、ｐＳＪ９１、ｐＳＪ９２、ｐＳＪ９４、ｐＳＪ９
    ５、ｐＳＪ１０１、ｐＳＪ１０２、ｐＳＪ１０３、ｐＳ
    Ｊ１０６、ｐＳＪ１０９、ｐＳＪ１１１及びｐＳＪ１１
    ４の群から選ばれる、請求項１０及び／又は１１に従う
    プラスミド。
  13. 【請求項１３】 ｐＳＪ７６、ｐＳＪ９４、ｐＳＪ９
    ５、ｐＳＪ１０１、ｐＳＪ１０２、ｐＳＪ１０３、ｐＳ
    Ｊ１０６、ｐＳＪ１０９、ｐＳＪ１１１及びｐＳＪ１１
    ４の群から選ばれる、請求項１０ないし１２の１つ以上
    に従うプラスミド。
  14. 【請求項１４】 請求項８ないし１３に従うプラスミド
    を調製する方法において、これらを添付の図２及び図２
    ａないし２ｐに従いプラスミドｐＢｌｕｅｓｋｒｉｐｔ
    ＫＳ ＩＩ＋、ｐＵＣ ８及びｐＧＲ ２０１から得
    ることを特徴とする方法。
  15. 【請求項１５】 請求項８ないし１３に従うプラスミド
    の１つを請求項１ないし７の一般式（Ｉ）の２官能性ウ
    ロキナーゼ変異体を得る際に使用する方法において、１
    つのプラスミドを用いて或る大腸菌の株を公知の態様で
    形質転換し、その構造遺伝子の発現を誘発させ、その形
    成された一般式（Ｉ）の２官能性ウロキナーゼ変異体の
    前駆蛋白質をその培地及びそれら溶菌されたバクテリヤ
    細胞から分離し、この前駆蛋白質を可溶化させ、そして
    次に或る酸化還元系の作用により一般式（Ｉ）のポリペ
    プチドに再生することを特徴とする方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１ないし７の一般式（Ｉ）の２
    官能性ウロキナーゼ変異体を作用物質として含む血栓溶
    解薬。
  17. 【請求項１７】 ボーラス適用に適する、請求項１６に
    従う血栓溶解薬。
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