JPH03500125A - プロウロキナーゼの低分子量誘導体及び該誘導体を含有する薬剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロウロキナーゼの低分子！誘導体及び該誘導体を含有する薬剤組成物 本発明は、プロウロキナーゼの低分子量誘導体（単鎖ウロキナーゼ型プラスミノ ーゲン活性化因子（ｓｃｕ−Ｐ＾）及び組換えＤＮＡ法による該誘導体の製造に 係る。

本発明によって提供される誘導体は、改良された重要な薬理学的特性を有する。

これらの誘導体は特に、血栓融解活性をもつ物質として有用である。

発明者等は、プロウロキナーゼ（ｓｃｕ−Ｐ＾とも呼ばれる）をコードするヒト 遺伝子を改造するために特定部位の突然変異誘発技術を利用し、突然変異遺伝子 を大腸菌の組換え菌株中で発現させた。低分子量誘導体を得るという目的に適う 改造を選択した。

次に、本発明の主題である新規な分子形態のプロウロキナーゼを精製し、それら を生化学的及び生物学的に特性決定した。これらの誘導体は野性型プロウロキナ ーゼと同様の比活性及び選択的血餅溶解性を有していた。しかしながら、これら の誘導体では、プロウロキナーゼの細胞結合ドメインが欠失しており従って循環 中の半減期が延長していた。

更に、前記誘導体はｒＤＮ＾ＤＮＡよってより効率的に産生できるので血栓融解 剤を廉価に製造することが可能である。

従来技術 生理学的フィブリン溶解を調節する分子相互作用の研究の進展は、血餅溶解メカ ニズムの解明及び新しい血栓融解剤の開発に重要な関連をもつ。

ヒトフィブリン溶解系においては、プロ酵素であるプラスミノーゲンが数種のプ ラスミノーゲン活性化因子によって活性化され、活性酵素であるプラスミンにな る（Ｃｏ１１ｅｎ。

Ｄ、　＆　Ｌｉｊｎｅｎ、　Ｈ，Ｒ，Ｔｈｅ　ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｓｙ ｓｔｅｍ　ｉｎ　ｍａｎ（ヒトのフィブリン溶解系＞、　ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａ ｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　ｏｎｅｏ−１ｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、４． 　Ｎｏ、３．　２４９．　１９８６；Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ、Ｍ、＆Ｃｏ１１ｅ ｎ、Ｄ、、Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｅｉｇ ｈｔｉｅｓ　Ｂｌｏｏｄ。

６〕、　Ｎｏ、６．１５２９．１９８６）、プラスミンは血餅のフィブリン成分 の分解の主因となるプロテアーゼである（Ｒａｋｏｃｚｉ、　！、。

Ｈｉｍａｎ、Ｂ、　＆　Ｃｏ１１ｅｎ、Ｄ、、　Ｏｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉ ｅａｌ　５１ｇｎ１ｆｉｅａｎｃｅｏｆ　ｔｈｅ　５ｐｅｃｉｆｉｅ　１ｎｔｅ ｒａｅｔｉｏｎｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｆｉｂｒｉｎ、ｐｌａｓｍｉ−ｎｏｇｅｎ 　ａｎｄ　ａｎｔｉｐｌａｓ＋＊ｉｎ（フィブリン、プラスミノーゲン及び抗プ ラスミン間の特異的相互作用の生物学的重要性）。

Ｂｉｏｅｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｅｔａ、５４０．　２９５．　１９フ８； Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｋ、Ｃ，。

Ｓｕｍｍａｒｉａ、Ｌ、、Ｈｓｉｅｈ、Ｂ、＆　５ｈｉｈ、Ｒ，Ｓ、、Ｔｈｅ　 ｐｅｐｔｉｄｅｅｈａｉｎｓ　ｏｆ　ｈｕ＋ｅａｎ　ｐｌａｓｍｉｎ、Ｍｅｅｈ ａｎｉｓｓ＋　ｏｆ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆｈｕｍａｎ　ｐｌａｓｍｉｎ ｏｇｅｎ　ｔｏ　ｐｌａｓｍｉｎ（ヒトプラスミンのペプチド鎖、ヒトプラスミ ノーゲンからプラスミンへの活性化メカニズム）、　、ｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｗ、、　２４２．２３３３．１９６７；ＷｉｄＩｅａｎ。

Ｂ、、Ｐｒｉｍａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂ　ｃｈａｉｎ　 ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｓｍｉｎ（ヒトプラスミンのＢ鎖の一次構造）、　Ｅ ｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

７６．１２９．１９７７）。

しかしながらプラスミンはまた、いくつかの血漿タンパク質、特に凝血経路の成 分であるフィブリノーゲン、■因子及び■因子にタンパク質分解作用を与える（ Ｃｏｌｌｅｎ、　Ｄ。

＆　Ｌｉｊｎｅｎ、Ｆｌ、Ｒ，、Ｔｈｅ　ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｓｙｓｔ ｅｍ　ｉｎ　ｍａｎ（ヒ　トのフィブリン溶解系）＋　ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ 　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　ｏｎｃｏｌｏ−ｇｙ／ｈｅｍｉｔｏｌｏｇｙ、　４． 　Ｎｏ、３．２４９．１９８６；Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ、　Ｍ、　＆Ｃｏ１１ｅ ｎ、Ｄ、：Ｔｈｒｏｗｂｏｌｙｔｉｃ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｅｉｇ ｈｔｉｅｓ　Ｂｌｏｏｄ。

６７、Ｎｏ、６．　１５２９．　１９８６；Ｎｉｍａｎ、Ｂ、Ｂ、、Ｌｉｊｎｅ ｎ、Ｈ，Ｒ，＆Ｃｏ１１ｅｎ、　Ｄ、、　Ｏｎ　ｔｈｅ　５ｐｅｃｉｆｉｅ　１ ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅｌｙｓｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ 　５ｉｔｅｓ　ｉｎ　ｐｌａｓｍｉｎ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｓ ｉｔｅｓ　ｉｎ　ａｌｆａ２−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ　ａｎｄ　ｉｎ　ｆｉｂ ｒｉｎｏｇｅｎ（プラスミンのリジン結合部位とα２−抗プラスミン及びフィブ リノ−タン中の相補的部位との間の特異的的相互作用）、　Ｂｉｏ−ｃｈｉｍ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｅｔａ、　５７９．１４２．１９７９）。

プラスミノーゲンの活性化は全身的レベルで生じ、Ｃ２−抗プラスミンによって 速やかに中和される循環プラスミンになる。従ってこの循環プラスミンはフィブ リン溶解に利用されない（Ｃｏｌｌｅｎ、　Ｄ、　＆　Ｌｉｊｎｅｎ、　Ｈ，Ｒ ，、Ｔｈｅ　ｆｉｂｒｉｎｏ−ｌｙｔｉｅ　５ｙｓｔｅ＋ｍ　ｉｎ　ｍ１ｎ（ヒ トのフィブリン溶解系）、　ＣＲＣＣｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　 ｏｎｅｏｌｏｇｙ／ｈｅ＋＊ａｔｏｌｏｇｙ、　４．　Ｎｏ、３，２４９゜１９ ８６；Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ、Ｍ、　＆　Ｃｏ１１ｅｎ、Ｄ、、　Ｔｈｒｏｍｂ ｏｌｙｔｉｅ　ｔｈｅｒａｐｙｉｎ　ｔｈｅ　Ｅｉｇｈｔｉｅｓ　Ｂｌｏｏｄ、 　６７、　Ｎｏ、８．１５２９．１９８６）、Ｃ２−抗プラスミンのレベルが顕 著に低下すると、プラスミンの中和が遅くなり、フィブリン溶解作用だけでなく 前記のごとき凝血タンパク質に対しても溶解作用を生じる。フィブリノーゲン、 ■因子、■因子の血漿濃度が過度に低下し、同時にいくつかのフィブリノーゲン 分解産物が止血（ｈａｅｓｏｓｔａｔｉｃ）過程、血小板集合及びフィブリン重 合に阻害作用を与えるとき、止血物質が欠失しその結果として大出血の危険を生 じる（Ｌａｔａｌｌｏ、　Ｚ、　Ｓ、　＆　Ｌｐａｃｉｕｋ、　Ｓ、、　Ｎｓｗ 　ａｐ−ｐｒｏａｃｂ　ｔｏ　ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ　ｔｈｅｒａｐｙ：ｔ ｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｄｅｆｉｂｒａｓｅｉｎ　ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔ ｈ　５ｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ（血栓融解療法の新しい方法、ストレプトキナ ーゼとデフイブラーゼとの併用）。

Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、Ｄｉａｔｈ、Ｈａｅｍｏｕｈ、、５６．　２５３．　１９７ ３；Ｔｏｔｔｙ、Ｌ　Ｇ、。

Ｇ１１ｕｌａ、Ｌ、＾、、Ｍｅ、Ｃｌｅｎｎｍａｎ、Ｍ、、＾ｈｅｅｄ、Ｐ、＆ 　５ｈｅｒｖａｎＬ、、　Ｌｏｗ　ｄｏｓｅ　１ｎｔｒａｖａｓｅｕｌａｒ　ｆ ｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｔｈｅｒａｐｙ（静脈内低量投与のフィブリン溶解療 法）、　Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ、　１４３．５９゜１９８２）　、他方、フィブリ ンのレベルでプラスミノーゲンの活性化が生じ（フィブリン結合プラスミノーゲ ン活性化）、その結果としてフィブリン結合プラスミンが生じる（Ｃｏ１−ｆｅ ｎ、Ｄ、＆　Ｌｉｊｎｅｎ、Ｂ、Ｒ，、Ｔｈｅ　ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｓ ｙｓｔｅｍ　ｉｎｍｉｎ　（ヒトのフィブリン溶解系）、　ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃ ａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎｏｎｅｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、４．　 Ｎｏ、３．　２４９．　１９８６；Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ。

Ｍ、＆　Ｃｏ１１ｅｎ、Ｄ、、Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｉ ｎ　ｔｈｅ　Ｅｉｇｈｔｉｅｓ　Ｂｌｏｏｄ、　６７、　Ｎｏ、６．１５２９． １９８６）、該プラスミンはＣ２−抗プラスミンの作用を受けないので全身性フ ィブリノーゲン溶解を誘発できない。

従来のヒトの血栓融解療法で最も普通に使用されているプラスミノーゲン活性化 因子であるウロキナーゼ及びストレプトキナーゼはフィブリンに対して特異的な 活性をもたない１両方の化合物は循環プラスミノーゲン及びフィブリン結合プラ スミノーゲンを比較的無差別に活性化する（Ｚａ　−ｍａｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｌｉ ｊｎｅｎ、Ｈ，Ｒ，、Ｖａｎ　Ｂｏｅｒ、Ｂ、＆　Ｃｏ１１ｅｎ、Ｄ、。

Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｔｈｒｏｅ＋ｂｏｌｙｔｉｅ　ｐｒｏｐｅｒｔ ｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｅｎｚｙｍｅａｎｄ　ａｅｔｉｖｅ　ｆｏｒｓ＋ｓ　ｏｆ 　ｈｕｓａｎ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅ、ｌ　、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｅａｎｃｌ 　ｆｉｂｉｎｏｇｅｎｏｌｙｔｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ 　ｐｌａｓｍａ　１ｎｖｉｔｒｏ　ｏｆ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｏｂｔａｉｎｅ ｃｌ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｕｒｉｎｅ　ｏｒ　ｂｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ 　ＤＮＡ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（プロ酵素及び活性形態のヒトウロキナーゼＩ の生物学的特性及び血栓融解性、ヒト尿または組換えＤＮＡ技術によって得られ たウロキナーゼのヒト血漿中でのｉｎ　ｖｉｔｒｏフィブリン溶解性及びフィブ リノーゲン溶解性＞、　Ｔｈｒｏｗ、　ＨａｅｍｏｓＬａｓ、、　５２．１９． １９８４ＨＳａ＋ｏａｍａ。

Ｎ、　＆　Ｋｈｅｒ、＾、、　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｅ　ａｎｄ　Ａｎｔｉｆ ｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｅ＾ｇｅｎｔｓ（フィブリン及び抗フィブリン溶解剤）、 　Ｓｅｓ＋、　ｆｌｏｐ。

Ｐａｒｉｓ、　６１．　Ｎｏ、２０．１４２３．　Ｌ９８５）、従って、ストレ プトキナーゼ及びウロキナーゼを用いたとき、治療中にしばしば全身的な止血物 質の分解（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）が生じ、その結果として大出血の危険性が高く なる。その臨床効果が証明されているにもかかわらずこれらの血栓融解剤の臨床 使用が普及しない理由がここにある（Ｓａｍａｍａ、　Ｍ、　＆　Ｋｈｅｒ、＾ 、、　Ｆｉｂ−ｒｉｎｏｌｙｔｉｅ　ａｎｄ　Ａｎｔｉｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉ ｅ　Ａｇｅｎｔｓ（フィブリン溶解剤及び抗フィブリン溶解剤）、　Ｓｅ＋ｓ、 　Ｈｏｐ、　Ｐａｒｉｓ、６１．　Ｎｏ、２０゜１４２３．１９８５；Ｍａｉｚ ｅｌ、＾、Ｓ、＆　Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎ、Ｊ、Ｊ、、５ｔｒｅｐｔ。

ｋｉｎａｓｅ、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ａｎｃｌ　ｔｉｓｓｕｅ　ｐｌａｓｍｉｎ ｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ。

Ｐｈａｒｍａｃｏ−ｋｉｎｅｔｉｃｓ、ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｄｖａｎｔａｇｅ ｓ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ　ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ　ｒａｔｅｓ　ａｎ ｄ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｅｙ　ｏｆ　１ｙｓｉｓ（ストレプトキナーゼ、ウロキ ナーゼ及び組織プラスミノーゲン活性化因子、溶解の速度及び持続を最大にする ための薬物動態学、相対的利点及び方法）、　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｅ、　Ｉｎｔ ｅｒｖｅｎｔ。

Ｒａｄｉｏ！、、　９．２３６．１９８６ＨＢｅｌｌ、　Ｌ　Ｒ，、５ｔｒｅｐ ｔｏｋｉｎａｓｅ　ａｎｄｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅ ｎｔ　ｏｆ　ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｅ＋５ｂｏｌｉ（肺動脈塞栓症の治療におけ るストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ）、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓ 、、３５．　５７．　１９７６；＾Ｃａｒ、Ｊ、＋Ｖａｂａｎｉｉｎ、＾、、Ｍ ｉｃｈｅｌ、Ｐ、Ｌ、、Ｓｌｉ＋＊ｉ、Ｍ、、Ｃｏｒｍｉｅｒ、Ｂ。

＆　Ｒｏｖｅｒ、Ｖ、、Ｔｈｒｏｒｂｏｌｙｔｉｃ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｉｎ 　ａｃｕｔｅ　Ｍｙｏ−ｃａｒｄｉａｌ　Ｉｎｆａｒｅｔｉｏｎ（急性心筋梗塞 の血栓融解治療）。

Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｏｍｂ、ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔ、、１３．　 Ｎｏ、２，１８６，１９８７；Ｇｒｕｐｐｏ　Ｉｔａｌｉａｎｏ　ｐｅｒ　ｌｏ 　５ｔｕｄｉｏ　ｄｅｌｌａ　Ｓ’ｔｒｅｐｔｏｅｈｉｎａｓｉｎｅｌｌ　１ｎ ｆａｒｔｏ　ｍ１ｏｅａｒｄｉｃｏ（１１：ｌ５ＳＩ）　Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎ ｅｓｓ　ｏｆｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｔｂｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ　ｔｒｅａｔ ｍｅｎｔ　ｉｎ　ａｃｕｔｅ　−ｙｏｃａｒ−ｄｉａｌ　１ｎｆａｒｃｔｉｏｎ （急性心筋梗塞の静脈内血栓融解処置の効果）、Ｌａｎｃｅｔ、１．　３９７． 　１９８６）。

これに反して、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）（）Ｉｏｙｌａ ｅｒｔｓ、　Ｍ、、　Ｒｙｋｅｎ、　Ｄ、　Ｃ，、Ｌｉｊｎｅｎ、　Ｈ，Ｒ，＆ 　Ｃｏ１１ｅｎ。

Ｄ、、　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ａｅｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉ ｎｏｇｅｎ　ｂｙ　ｈｕｍａａｔｉｓｓｕｅ　ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔ ｉｖａｔｏｒ；ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｆｉｂｒｉｎ（ヒト組織プラスミノーゲン活性 化因子によるプラスミノーゲン活性化の動態学、フィブリンの役割）、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５７゜Ｎｏ、６．２９１２．１９８２）、及びよ り最近のプロウロキナーゼ（ｐｒｏｕＫ）（ｆｌｕｓａｉｎ、　Ｓ、　Ｓ、　＆ 　（：ｕｒｅｗｈｉｃｈ、　Ｖ、、　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ　ｐａｒ ｔｉａｌ　ｅｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈ ａｉｎ、　ｈｉｇｈｍｏｌｅｅｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｆｏｒｍ　ｏｆ　ｕｒ ｏｋｉｎａｓｅ　ｉｎ　ｈｕ＋＊ａｎ　ｕｒｉｎｅ（ヒト尿中の単鎖高分子量形 態のウロキナーゼの精製及び部分的特性決定）、＾ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　２２０．３１．１９８３）は、双方とも天然タンパク質 であり、循環プラスミノーゲンに対しては弱い活性化因子であるが、逆にフィブ リン結合プラスミノーゲンに対しては強い活性化因子であることが判明した。従 ってこれらは全身的な止血物質の分解またはＣ２−抗プラスミン及びプラスミノ ーゲンの消耗を伴わないので、臨床使用の場合に出血の危険が少ない。

ｔ−ｐ＾のフィブリン特異的血栓融解活性は、ｔ−ＰＡが、三重ジスルフィド結 合した分子のｒｋｒｉｎｇｌｅドメイン」に局在する特異的リジン結合部位を介 してフィブリンに結合できる能力をもっためであると説明されてきた。従って、 フィブリン結合プラスミノーゲンは止血物質の有意な分解を生じることなく活性 化され得る（Ｃｏｌｌｅｎ、　Ｄ、　＆　Ｌｉｊｎｅｎ、　Ｈ，Ｒ，。

Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　Ａｅｔｉｖａｔｏｒ、Ｍｅｅｈａｎｉ ｓ＋＊　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎ　ａｎｄｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ　ｐｒｏｐｅｒ ｔｉｅｓ（組織プラスミノーゲン活性化因子、作用メカニズム及び血栓融解性） 、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　１６゜Ｎｏ、３．２５．１９８６）、他方、ｐ ｒｏＵに（単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、５ｃｕ−ＰＡとも 呼ばれる）はフィブリンに結合しないが、全身的な止血物質の消耗を伴うことな くフィブリン特異的血栓融解活性を示す（Ｐａｎｎｅｌｌ、　Ｒ，＆Ｇｕｒｅｗ ｉｅｈ、　Ｖ、、　Ｐｒｏ−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ、＾５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ｉｔｓ 　５ｔａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｐｌａｓｍａ　ａｎｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈ ａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｉｔｓ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｅ Ｈｅｃｔ（１０ウロキナーゼ、その血漿中での安定性及び選択的フィブリン溶解 作用メカニズムに関する研究）、　Ｂｌｏｏｄ、　６７、１２１５．１９８６； Ｇｕｒｅｗｉｃｈ、　Ｖ、　＆　Ｐａｎｎｅｌｌ。

Ｒ，、’Ｆｉｂｒｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｚｙｍｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏ ｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅ（Ｐｒｏ −Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）（単鎖ウロキナーゼ（プロウロキナーゼ）のフィブリン 結合性及びチモーゲン性）、Ｓｅｓ＋１ｎａｒｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｏｍｂ、ａｎｄ 　Ｈａｅｓｏｓｔａｔ、、１３．　Ｎｏ、２゜１４Ｂ、１９８７；Ｌｉｊｎｅｎ 、Ｈ，Ｒ，、Ｚａｍａｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｂｌａｂｅｒ、Ｍ、。

Ｍｉｎｂｌｅｒ、Ｎ、Ｅ、＆　Ｃｏ１１ｅｎ、Ｄ、、＾ｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｐ［ａｓｍｉｎｏ−ｇｅｎ　ｂｙ　ｐｒｏ−ｕｒｏｋｉｎａｓｅ、　ｌ　、 　Ｍｅｅｈａｎｉｓ＠（プロウロキナーゼＩによるプラスミノーゲンの活性化、 メカニズム）、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｅｉ、、２６１．　１２５３．　１９８６）。

これらのタンパク質をコードするヒト遺伝子を単離及び特性決定しさらに組換え ＤＮＡ技術によってこれらのタンパク質を産生ずる研究が盛んに行なわれた（Ｃ ｏｌｌｅｎ、　Ｄ、。

５ｔｉｓｓｅｎ、　Ｊ、　Ｍ、、　Ｈａｒａｆｉｎｏ、　Ｂ、　Ｊ、、　Ｂｕｉ ｌｄｅｒ、　ＪＲ，Ｓ、、　ＤｅＣｏｃｋ、　ｐ、ｌ　Ｏｇｅｚ、　Ｊ、、　Ｔ ａｊｉｒｉ、　Ｄ、、　Ｐｅｎｎ１ｅａ、　Ｄ、、Ｂｅｎｎｅｔｔ。

Ｌ　Ｔ、、Ｓａｌｗａ、Ｔ、＆　Ｉｌｏｙｎｇ、Ｃ，Ｆ、、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ ｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆ　ｈｕ識ａｎ　ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ　ｐｌａ ｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｂｔａｉｎｅｄｂｙ　ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　 ｃｅｌｌｓ（ｑ＠乳類細胞中の組換えＤＮＡの発現によって得られたヒト組織型 プラスミノーゲン活性化因子の生物学的特性）、Ｊ、　Ｐｈａｒ−ｍｏｅｏｌ、 Ｅｘｐ、Ｔｈｅｒ、、２３１．　Ｎｏ、１．　１４６．　１９８４；Ｅｌｏｌｗ ｉｅｓ、Ｈ，Ｅ。

、　Ｐｅｎｎ１ｃａ、Ｄ、、　Ｂｌａｂｅｒ、　Ｍ、、　Ｒｅｙ、　Ｍ、　Ｍ、 、　Ｃｕｎｚｌｅｒ、　Ｍ、＾、１Ｓｔｅｆｆｅｎｓ、　Ｇ、　Ｊ、　＆　Ｈｅ ｙｎｅｃｋｅｒ、　Ｈ，Ｌ、、　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｐｒｏ−ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｉｎ　Ｅｓ ｅｈｅｒｉ−ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（大腸菌におけるプロウロキナーゼ遺伝子のク ローニング及び発現）、　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ、　３．９２３．１９８ ５）。

急性心筋梗塞の患者に喪中心性臨床試験で組換えｔ−ＰＡを投与すると、このｔ −ＰＡが、閉塞した冠動脈の開通回復のためにストレプトキナーゼよりもかなり 優れた効力を示すことが判明した（Ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｏｐｅｒａ ｔｉｖｅ　５ｔｕｄｙ　Ｇｒｏｕｐｆｏｒ　Ｒｅｃｏｓ＋ｂｉｎａｎｔ　Ｔｉ５ ｓｕｅ−ｔｙｐｅ　ＰＩａ＋ａｉｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ。

Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ　ｔｒｉａｌ　ｏｆ　１ｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｒｅｅｏ ｍｂｉｎａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ　ｐｌａｍｎｉｎｏｇｅｎ　１ｃｔｉ ｖａｔｏｒ　ｖｅｒｓｕｓ　１ｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　５ｔｒｅｐ−ｔｏｋｉｎ ａｓｅ　ｉｎ　ａｃｕｔｅ　Ｂｏｃａｒｄｉａ　１ｎｆａｒｃｔｉｏｎ（組換え 組織型プラスミノーゲン活性化因子の欧州共同研究班、急性心筋梗塞における静 脈内組換え組織型プラスミノーゲン活性化因子対静脈内ストレプトキナーゼの無 作為試、験）、　Ｌａｎｃｅｔ。

１、８４２．１９８５；５）ｅｅｈａｎ、　Ｆ、　Ｈ，、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ、 　Ｅ、、　Ｃａｎｎｅｒ。

Ｐ、、Ｄｏｏｄｇｅ、Ｂ、Ｔ、、Ｇｏｒｅ、Ｊ、、Ｖａｎ　Ｎａｔｔａ　Ｐ、、 Ｐａｓｓａｍａｎｉ。

Ｅ、　Ｒ，、Ｍｉｌｌｉａｍｓ、　Ｄ、　０．、　Ｚａｒｅｔ、　Ｂ、、　Ｔｈ ｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ　 ｔｈｅｒａｐｙ　ｏｎ　１ｅｆｔ　ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎ： ａ　ｒｅｐｏｒｔ　ｏｎ　ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ　ｐｌａｓｅ＋ｉｎｏｇｅｎ 　ａｅｔｉ−ｖａｔｏｒ　ａｎｄ　５ｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｔ ｈｅ　ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｍｙ。

ｅａｒｄｉａｌ　ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ（ＴＩＭＩ　Ｐｈａｓｅ　Ｉ　）（左心 室機能に対する静脈内血栓融解療法の効果、心筋梗塞の血栓融解に基づく組織型 プラスミノーゲン活性化因子及びストレプトキナーゼに関する報告＞、　Ｃ１ｒ ｃｕｌａｔｉｏｎ、　７５．４．８１７．１９８７）。

プロウロキナーゼは現在第■段階の臨床試験の時期であり、血栓融解活性及び安 全性に間してはｔ−ｐ＾と少なくとも同程度に有効であると考えられている（Ｖ ａｎ　ｄｅ　ｋｌｅｙ（、Ｆ、。

Ｎｏｂｕｈａｒａ、Ｍ、、＆　Ｃｏ１１ｅｎ、Ｄ、Ｃｏｒｏｎａｒｙ　丁ｈｒｏ ｍｂｏｌｙｓｉｓｗｉｔｈ　Ｉ（ｕｍａｎ　ｓｉｎｇｌｅ−ｅ、ｈａｉｎ　ｕｒ ｏｋｉｎａｓｅ　ｔｙｐｅ　ＰＩａｓ＠ｉｎｏｇｅｎ＾ｃｔｉｖａＬｏｒ（Ｐｒ ｏ−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）　ｉｎ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ａｃｕｔｅ　 Ｍｙｏ−ｃａｒｄｉａｌ　Ｉｎｆｉｒｅｔｉｏｎ（ヒト単鎖ウロキナーゼ型プラ スミノーゲン活性化因子（プロウロキナーゼ）による急性心筋梗塞患者の冠動脈 血栓融解）、＾ｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｅｃｉｎｅ。

１０４、３４５．１９８６；Ｖａｎ　ｄｅ　Ｗｅｒｆ、　Ｆ、、　Ｖａｎｈａｅ ｃｋｅ、　Ｊ、、　ＤｅＧｅｅｓｔ、　Ｈ，、Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ、　Ｍ、　 ＆　Ｃｏ１１ｅｎ、　Ｄ、　ＣｏｒｏｎａｒｙＴｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ　ｗｉ ｔｈ　ｒｅｅｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ　ｕｒｏｋｉｎａｓ ｅ−ｔｙｐｅ　ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎ　ｐａｔｉ ｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｃｕｔｅＢｏｃａｒｄｉａｌ　１ｎｆａｒｃｔｉｏｎ（ 組換え単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子による急性心筋梗塞患者 の冠動脈血栓融解）、　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ、　７４．　Ｎｏ、５．１０６ ６、１９８６）。

１１へ１１ ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡｓ）はヒトの尿、血漿及 び種々の細胞系に由来のならし培地中で少なくとも３つの異なる形態で検出され る。　ｕ−ＰＡとして特性決定された第１の形態は、４１０個のアミノ酸から成 り見掛は分子量５４０００ダルトンのフィブリン溶解活性のポリペプチドから構 成され、２つのジスルフィド結合鎖を含んでいた（Ｇｕｎｚｌｅｒ、　Ｌ＾、、 　５ｔｅｆｆｅｎｓ、　１．ｓ、　Ｊ、、　Ｏｅｔｔｉｎｇ、　Ｆ、。

Ｋｉｎ、　ＳＮ、＾、、　’Ｆｒａｎｋｕｓ、　Ｆ、　＆　Ｆｌｏｈｅ、　Ｌ、 　Ｔｈｅ　ｐｒｉａ＋ａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｒ　ｈｉｇｈ　ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ　ｍａｓｓ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｆｒｏｍｈｕｍａｎ　ｕｒｉｎｅ、 Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｍｉｎｏ　ａｅｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　 ｔｈｅ＾ｃｈａｉｎ（ヒト尿に由来の高分子量ウロキナーゼの一次楕遣。

Ａ鎖の完全アミノ酸配列）、　Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　Ｐｈ１ｓ ｉｏｌ。

Ｃｂｅｖａ、、　３６３．１１５５．１９８２）。

ＡＭまたは軽鎖は１５７個のアミノ酸と１つの三重ジスルフィド結合した’ｋｒ ｉｒ＋ｇｌｅＪｉ造とを含む、この鎖はまた、正常細胞及び悪性細胞（単球、単 球様細胞及びＡ４３１類表皮細胞）の受容体結合ドメインを含む、ＢＭまたは重 ｇ　（３００（ｔ。

ダルトン）は２５３個のアミノ酸から成り触媒ドメインを含む。

この分子形態のｕ−Ｐｈは一般に、ウロキナーゼ（ＵＫ）、二本　。

鎖ウロキナーゼ（ＴＣ−ＵＩＣ）　、ｔたは高分子量ウロキナーゼ（ＢＮＩＩ− ＵＫ）と呼ばれる（Ｇｕｎｚｌｅｒ、　！１．＾、、　５ｔｅｆｆｅｎｓ、Ｇ、 　Ｊ、、　Ｏｔｔｉｎｇ。

Ｆ、、Ｂｕｚｅ、Ｇ、＆　Ｆｏｈｅ、Ｌ、、５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｒｅｌａｔ ｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎ　ｈｉｇｈ　ａｎｄ　ｌｏｗ　ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ　ｍａｓｓ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅ（高分子量ウロキナーゼと低分子量ウロキナ ーゼとの構造的関係）。

Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　Ｐｈ１ｓｉｏ１．　Ｃｈｅｗ、、　３６ ３．１３３．１９８２）。

第２の形態のｕ−Ｐｈは分子量３３０００ダルトンであり、プラスミンまたはト リプシンによってＢＭＷ形態のタンパク質を分解することによって得られる。こ れらは低分子量ウロキナーゼ（Ｌｌｎｌ−１１Ｋ）と呼ばれる。タンパク質の配 列決定の結果、プラスミンまたはトリプシンの作用によって特異的に除去された Ｎ１（−末端の１３５個のアミノ酸が欠失していることを除けばＬＭＷ−ＵＫが １８トｔｌＫに等しいことが判明した（Ｓｔｅｆｆｅｎｓ、　Ｇ。

Ｊ、、　Ｇｕｎｚ！ｅｒ、　Ｈ，＾、、　Ｏｔｔｉｎｇ、、　Ｆ、、　Ｆｒａｎ ｋｅｎｓ、Ｅ、　＆　Ｆｌｏｈｅ。

Ｌ、Ｔｈｅ　ｅｏｍｐｌｅｔｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏ ｆ　ｌｏｗ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｆｒｏ曽 ｈｕ＠ａｎ　ｕｒｉｎｅｃヒト尿に由来の低分子量ウロキナーゼの完全アミノ酸 配列）＊Ｂｏｌｌｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’　ｓＺ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ 、、　３６３．１０４３．１９３２）。

同定された第３の形態のｕ−ＰＡｇよプロウロキナーゼ（ｐｒｏＵＫ＞である、 これは単鎖（５４０００ダルトン）形態のウロキナーゼであり、従って単鎖ウロ キナーゼ型ブラスミノーゲ〉゛活性化因子（ｓｅｕ−Ｐｈ）と呼ばれる。

これらのすべての分子形態のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は組換 えＤＮＡ技術によって既に得られている（Ｚａ＊ａｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｌｉｊｎ ｅｎ、　Ｈ，Ｒ，、Ｖａｎ　ＩＩｏｅｆ、　Ｂ、　＆Ｃｏ１１ｅｎ、　Ｄ、、　 Ｂｉｏｌｏｇｉｅａｌ　ａｎｄ　ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉ ｅｓｏｆ　ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖｅ　ｆｏｒｍｓ　ｏｆ　ｈ ｕｍａｎ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅ、Ｉ　。

Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｅ　ａｎｄ　Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｏｌｙｔｉｃ　ｐｒ ｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｉｎｈｕｍａｎ　ｐｌａｓｍａ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆ　 ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍｈｕｍａｎ　ｕｒｉｎｅ　ｏ ｒ　ｂｙ　ｒｅｅｏｍｂｉｎａｎｔ　［ｌＮＡ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（プロ酵 素及び活性形のヒトウロキナーゼＩの生物学的特性及び血栓融解性、ヒト尿また は組撓えＩＮＮ＾技術から得られたウロキナーゼのヒト血漿中におけるｉｎ　ｖ ｉｔｒｏフィブリンまたはフィブリノーゲン溶解性）、　Ｔｈｒｏｍｂ、　ｆｌ ａｅｍｏｓｔａｓ、、　５２．１９゜１９８４、；Ｅｌｏｌｍｅｓ、　Ｌ　Ｅ、 、　Ｐｅｎｎ１ｃａ、　Ｄ、、　Ｂｌａｂｅｒ、　Ｎ、、　Ｒｅｙ、　Ｎ。

Ｌ、　Ｇｕｎｚｌｅｒ、　Ｈ，＾、、　５ｔｅｆｆｅｎｓ、　Ｇ、　Ｊ、　＆　 Ｈｅｙｎｅｃｋｅｒ、　Ｈ。

Ｌ、　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｙ、ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｒ　ｔｈｅ　ｇｅ ｎｅ　ｆｏｒ　ｐｒｏ−ｕｒｏｋｉ−ｎａｓｅ　ｉｎ　Ｅｓｅｈｅｒｉｅｈｉａ 　ｃｏｌｉ（大腸菌中の７０ウロキナーゼ遺伝子のクローニング及び発現）、　 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３．９２３゜１９８５；Ｇｕｎｚｌｅｒ、　Ｍ 、＾、、　Ｈｅｎｎｉｎｇｅｒ、　ｉｌｌ、、　Ｈｅｎｎ１ｅｓ、　Ｈ，Ｈ，。

Ｏｔｔｉｎｇ、　Ｆ、、　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｊ、、　Ｆｒ１ｄｅｒｉｃｈｓ 、　Ｅ、、　に１ｅｒｔｚ、　Ｉｔ、。

Ｆｌｏｈｅ、Ｌ、、Ｂｌａｂｅｒ、Ｈ，＆　Ｗｉｎｋｌｅｒ　Ｍ、Ｆｕｎｃｔｉ ｏｎａｌｅｈａｒａｃｔｅｒｉｚａＬｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｕｒｏｋｉｎ ａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　１ｎｂａｃｔｅｒｉａ　ａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　 ｔｏ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｓｔｈｕｍａｎ　ｕｒｉ ｎｅ（ヒト尿から得られたウロキナーゼとの比較による細菌中で産生されたしト ウロキナーゼの機能的特性決定）、ｌｌａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、１４．　６０． 　１９８４）。

発明者等は、プロウロキナーゼをコードするヒト遺伝子を出発材料とし、特定部 位の突然変異誘発を用いて、単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の 新規な独創的誘導体をコードする１組の改造遺伝子を構築した。これらの誘導体 は、最初の１６２個のアミノ酸中の種々の大きさの配列部分が欠失した低分子量 類似体である。

改造遺伝子を大腸菌の組換え菌株中で発現させ、単鎖形態の新しい組換え産生物 を精製し、フィブリンクロットの特異的溶解能力に基づいて特性決定した。

これまでに天然に検出されたことはないこれらの新しい分子独立体（ｅｎｔｉｔ ｙ）が本発明の目的を構成する。これらの単鎖低分子量プロウロキナーゼ誘導体 はフィブリン特異的血栓融解活性を有し、天然ｐｒｏＵＫまたは組換えｐｒｏＵ Ｋの実用可能な代替物を提供する。試験によれば、これらの誘導体はより長い半 減期を有し、従って薬理学的活性が持続することが判明した。

本発明の１つの目的は、単鎖配置の成熟プロウロキナーゼのアミノ酸１６３から アミノ酸４１１までの配列を少なくとも含むヒト１０ウロキナーゼの低分子量誘 導体を提供することである。

より好ましくは誘導体は、アミノ酸１５１からアミノ酸４１１までの配列、アミ ノ酸１４１からアミノ酸４１１までの配列または成熟プロウロキナーゼのアミノ 酸１３６〜４１１に接合した成熟プロウロキナーゼのアミノ酸１〜１０の配列を 少なくとも含む。

本発明は更に、アミノＭ４８〜１３５の配列中に含まれた成熟プロウロキナーゼ のｋｒｉｎｇｌｅドメインまたはアミノ酸１１〜４７の配列中に含まれた成熟プ ロウロキナーゼの受容体結合ドメインまたは細胞結合ドメインが欠失した誘導体 を包本発明は更に、アミノ酸の欠失、挿入または置換によって更に改造された前 記誘導体を包含し、また少なくとも１つの付加的アミノ酸を含む誘導体を包含す る。

本発明は更に、前記誘導体を含有する薬剤組成物、かかる誘導体の製造に使用さ れるＤＮＡ配列、ベクター及び形質転換細胞を包含する。

成熟プロウロキナーゼとは、完全な長さのプロウロキナーゼを意味すると理解さ れたい。

本発明の別の目的は、成熟プロウロキナーゼの−ｋｒｉｎｇｌｅドメイン、及び 、 −受容体結合ドメインまたは細胞結合ドメインの少なくとも１つが欠失した誘導 体を提供することである。

上記別の目的によって提供される本発明の誘導体は、ポリペプチドのＮＨ２末端 に付加的メチオニン残基を含んでもよく、または、少なくとも１つのグリコシド 側鎖を更に含んでもよい、更に、誘導体が任意の起源のアミノ酸配列を少なくと も１つ含んでもよい。

上記別の目的によって提供される本発明の誘導体は、前記誘導体をプラスミンで 処理することによって産生され得る。

本発明の誘導体は薬剤として許容される担体と結合した薬剤組成物の形状で提供 され得る。かかる組成物は血栓融解剤として有用である。

新規なｐｒｏＵＫ誘導体の分子特性 特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発によって新規なｐｒｏＵＫ誘導体を構築 した。特に、ｐｒｏＵＫ遺伝子の内部のコード領域の欠失を生起するようにオリ ゴヌクレオチドを設計し合成した。この方法の原理は、ファージベクター８１３ のごとき単鎖形態で得ることが可能なベクターにｐｒｏＵに遺伝子をサブクロー ニングすることである。所望のコード配列を含み欠失させるべき配列が欠如した 相補的合成オリゴデオキシリボヌクレオチドと組換え単鎖とをアニーリングする ０次にＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼを使用して新しいストランドを伸長させ 、環状に結合する。新しく形成されたヘテロ二ｍ　Ｍ　ＤＮＡを使用して細胞系 を形質転換する。該ＤＮＡは該細胞系において複製され、野性型遺伝子または所 望の欠失をもつ遺伝子を担うファージが２つの異なる分子種に分離した後代を産 生ずる。出発物質である突然変異オリゴヌクレオチドをプローブとして使用して 突然変異遺伝子を認識し得る。

次に、新規なｐｒｏＵＫ誘導体の合成を誘発し得る大腸菌発現ベクターに突然変 異遺伝子を挿入した０次いで組換え分子を精製し特性決定した。

本発明の目的を構成する新規なｐｒｏＵに誘導体を以下にまとめる。

（ａ）Δ１２５と呼ばれる形態（見掛は分子量約３１ｋｄ）　、この誘導体はｐ ｒｏＵＫ遺伝子からアミノ酸１１〜１３５をコードするＤＮ＾配列を欠失さぜる ことによって得られた。２８６個のアミノ酸から成るこのｐｒｏＵＫ誘導体はｒ ｋｒｉｎｇｌｅ」ドメインを喪失しているが、タンパク質分解ドメインを維持し ている。この形態の誘導体は単鎖形態で単離され、プラスミンによって二本鎖配 置に変換され得る。プラスミンで処理した後のΔ１２５はアミド分解活性である 。

（ｂ）Δ１４０と呼ばれる形Ｂ（見掛は分子量約３０ｋｄ）　、この誘導体はｐ ｒｏＵＫから最初の１４０個のアミノ酸を欠失させることによって得られた。２ ７１個のアミノ酸から成るこの誘導体は単鎖配置で単離された。Δ１４０はプラ スミンで処理することによってアミド分解活性の二本鎖形態に変換された。

（ｅ）Δ１５０と呼ばれる形態（見掛は分子量約２９ｋｄ）　、この誘導体はｐ ｒｏＵＫから最初の１５０個のアミノ酸を欠失させることによって得られた。２ ６１個のアミノ酸から成るこの誘導体は単鎖配置ではアミド分解活性でない、Δ １５０はプラスミンで処理後に十分に活性になる。

（ｄ）Δ１６２と呼ばれる形態（見掛は分子量約２７ｋｃｌ）　、この誘導体は ｐｒｏＬＩＫから最初の１６２個のアミノ酸を欠失させることによって得られた 。わずか２４９個のアミノ酸から成るこの誘導体は最初の４つのアミノ酸をもた ないＢ鎖つロキナーゼと等価である。

本発明の新規な誘導体全部を第１図に概略図で示す、夫々の比活性を表１に示す 。

ｆｉｎ　ｖｉｔｒｏ」”’Ｉ−標識フイブリンクロット溶解及びフィブリノーゲ ン溶解活性 いくつかの代表的な本発明のｐｒｏＵＫ誘導体の相対的フィブリン溶解性及びフ ィブリノーゲン溶解性を、クエン酸を加えたヒト血漿に浸漬したｌ　１ｓｌ−標 識ヒト血漿クロットから成るｒｉｎ　ｖｉｔｒｏ、１系で決定した（Ｍｔｔｓｕ ｏ、　０．、　Ｒｙｋｅｎ、　Ｄ、　Ｃ。

＆　Ｃｏ１１ｅｎ、　Ｄ、、　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｌａ ｔｉｖｅ　ｆｉｂｒｉｎｏ−ｇｅｎｏｌｙｔｉｃ、ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ　 ａｎｄ　ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ 　ｐｌｓｈｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ａｎｄ　ｕｒｏｋｉｎａｓ ｅ　１ｎｖｉｔｒｏ（組織プラスミノーゲン活性化因子及びウロキナーゼのフィ ブリノーゲン溶解性、フィブリン溶解性及び血栓融解性のｉｎ　ｖｉｔｒｏ相対 比較）、　Ｔｈｒｏｗ、　Ｈａｅｍｏｓｔ、、　４５．２２５゜１９８１）、野 性型ｐｒｏＵＫ及びヒト尿の二本鎖ウロキナーゼを基準物質とした。

プールした血漿の２．０ｓｌのアリコートに１２５■−標識した血漿クロットを 添加し、計数し、各ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の非存在下（対 照）またはＴＣ−υに以外は１５０ｉ、ｕ、／ｉｊ！の存在下に水浴中で３７℃ でインキュベートした。

ＴＣ−ＵＫは５０ｉ、ｕ、／ｘｉ’で試験した。４時間インキュベーション後に 血漿サンプルを取り出し、７２５Ｉの含量を測定し、可溶化した放射性同位体か ら溶解％を決定した。更に、各サンプルについて血漿フィブリノーゲンレベルを 決定しくＶｅｒｍｙｌｅｎ、　Ｃ，、Ｄｅ　Ｖｒｅｋｅｒ、Ｒ，＆　Ｖｅｒｓｔ ｒａｅｔｅ、　Ｍ、＾ｒａｐｉｄｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ 　ａｓｓａｙ　ｏｆ　ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ：ｆｉｂｒｉｎｐｏｌｙｍｅｒｉｚ ａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ（ＦＰＴ−ｔｅｓｔ）（フィブリノーゲン：フィブリン重 合時間の高速酵素アッセイ法）、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉｎ。

＾ｅｔａ、、　８．４１８．１９６３）、基線値（対照サンプル）の％で示した 。

血漿中のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｐｒｏＵＫ及びそのＬＭ Ｗ誘導体の場合は１５０ｉ、ｕ、／ｙｊ！及びＴＣ−ＵＫの場合は５０ｉ、ｕ、 ／ｍ／）の安定性を１４時間の室温ブレインキュベーション後に測定した。この ブレインキュベーション後に、新しく調製した１２％ｌ−５１１識血漿クロツト を各混合物に添加し３７℃に維持した。三重サンプルで前記のごとく溶解速度を 測定し計算した。

得られた結果を表■にまとめる。これらの結果は、試験した全部の低分子量誘導 体が、有意なフィブリノーゲン溶解を伴うことなくほぼ完全なりロット溶解活性 を誘発したことを示す１本発明の低分子量ｐｒｏ！ＪＫ誘導体は極めて有効なフ ィブリン特異的クロット溶解活性を有することが判明した。

更に、本発明の低分子量誘導体はヒト血漿中で２４時間インキュベーション後に もクロット溶解効力を維持しており、これは、これらの分子がＴＣ−υにとは違 って野性型ｐｒｏＵＫと同様に血漿中でより安定であることを示す。

新規なｐｅｏＵＫ誘導体の薬物動態学的プロフィールいくつかの代表的な本発明 のｐｒｏｌｌＫ誘導体の薬物動態学的プロフィールを、８０，０ＯＯＩＵ／ｋｇ の静注を１回行なった正常ラットで測定しな。

処理前及び処理の０．５．１．２．５．１０．２０及び３０分後の真正グロブリ ン（ｅｕｇｌｏｂｕｌｉｎ）分画のウロキナーゼ様抗原レベル及びフィブリン溶 解活性を測定した。

得られた結果を第２図に示す。

これらの結果は、Δ１２５誘導体によれば血漿中のｕ−Ｐ＾関連抗原の消滅速度 （初期ｔ１／２が２５分間）が天然野性型ｐｒｏＬＩＫ（初期ｔ１／２が５分未 満）に比較してはるかに遅いことを示す。

更に、真性グロブリン分画のフィブリン溶解活性は血漿中のｕ−Ｐ＾抗原レベル に相関する。

新規なｐｒｏＵＫ誘導体とヘパリンとの相互作用抗凝血療法下の血漿中で従来か ら使用されている薬理学的投与量（０，０１〜ＩＩＵ／ｚｆ）のヘパリンは、い くつかの代表的な新規なＬＮＷ−誘導体（Δ１２５）のプラスミンによる活性化 率を極めて有意なレベルでｒｉｎ　ｖｉｔｒｏ」増強することが判明したく第３ 図）。

かかる効果はまた野性型ｐｒｏｌＪＫでも観察されたが増強の程度ははるかに小 さかった。

検討及び結論 試験した本発明の新規な誘導体Δ１２５．Δ１４０及びΔ１５０について観察さ れたアミド分解挙動は、単鎖配置のプロウロキナーゼの最終２６１個のアミノ酸 を維持する分子がプラスミン活性化によって二本鎖配置に変換された際に完全に アミド分解活性になることを示した（表１）。

血栓融解療法に付随する抗凝血治療中に得られる濃度（０，０１〜１１Ｌｌ＃ｌ ）で血漿中に存在するヘパリンは、本発明の新規なＬＨＷ誘導体の１つ（Δ１２ ５）がプラスミンによって二本鎖配置に変換するときにこの変換を極めて有意な レベルで刺激することが判明した。この効果はまた、野性型ｐｒｏＵＫを使用し た場合にも得られるが刺激の程度がはるかに小さい（第２図）。

他方、新規なＬＭＭ誘導体を用いた場合には、フィブリノーゲン溶解を同時に生 じることなく１２５１−標識ヒトフィブリンクロットのほぼ完全な溶解が得られ た。これは、二本鎖ウロキナーゼの場合には得られながった。

更にこの効果は、１２５Ｉ−標識ヒトフィプリンタロットの添加以前に新規な誘 導体を血漿中で２４時間以上インキュベーションした後にも維持されていた（表 ■）、これに反して、ＴＣ−ＵＫのクロット溶解活性はヒト血漿中で長期間ブレ インキュベーション後に完全に消滅した。

最後に、本発明の新規な誘導体の１つ（Δ１２５）を１回静注した後のラットで は血液中の半減期の顕著な延長が観察された（第３図）。

結論として、 一本発明の新規な分子量誘導体は野性型ｐｒｏＵＫの固有のアミド分解活性を維 持し、プラスミン活性化によってアミド分解活性の二本鎖形態で完全に活性化さ れ得る。

一本発明の新規な分子量誘導体のプラスミン活性化及びその結果として生じる十 分にアミド分解活性の二本鎖配置への変換はヘパリンによって強力に刺激される 。臨床状態の血栓融解療法にはヘパリンが常に関連しているので、本発明の新規 なｐｒｏＵＫ誘導体に対するヘパリンの刺激効果は血栓融解活性を向上させる。

一本発明の新規な分子量誘導体は完全に非特異的なＴＣ−ＵＫに比較してフィブ リン特異的なりロット溶解活性を示す。

従って、単鎖配置中にアミノ酸配列１５１〜４１１を維持するすべてのｐｒｏＵ Ｋ誘導体はＴＣ−ＵＫに比較して改良された血栓融解剤であると考えることがで き出血の危険も少ない。

−更に、新規なｐｒｏＵＫ誘導体においては残基１３〜３０の間に局在するウロ キナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の細胞結合ドメインが欠如しているので （＾ｐｐｅｌｌａ、　Ｉニー１Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｅ、＾、、　Ｕｌｌｒｉｃ ｈ、　Ｓ、　Ｊ、、　５ｔｏｐｐｅｌｌｉ、　Ｍ、　Ｐ、。

Ｃｏｒｔｉ＾、、　Ｃａ５ｓａｎｉ、　Ｇ、　＆　Ｂｌａｓｉ、　Ｆ、、　Ｔｈ ｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｕｒｏｋｉｎ ａｓｅ（ウロキナーゼの受容体結合配列）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、 　２６２．　Ｎｏ、１０．４４３７．１９８７）、野性型ｐｒｏＵＫ及びＴＣ− ＵＫに比較して循環中の半減期が顕著に延長される。従って、本発明の新規な低 分子量プロウロキナーゼ誘導体はフィブリン特異的血栓融解性を有し、同時にヘ パリン療法との併用による血栓融解効果増進の可能性及び循環中の半減期の延長 の可能性をも有するので、二本鎖ウロキナーゼ及び野性型プロウロキナーゼに比 較して治療用として常に有利である。

方法 突然変異誘発 周知の技術（Ｎａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ　Ｅ、　Ｆ、　＆　Ｓａ ＋ｅｂｒｏｏｋ　Ｊ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、＾１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ 、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＦｌａｂｏｕｒ　１９８２）を用いワイズマン研究 所（Ｗｅｉｚｍａｎｎ　Ｉｎ５ｔｉ−ｔｕｔｅ）　（Ｉｓｒａｅｌ）において、 ヒトプレプロウロキナーゼをコードする遺伝子をクローニングした。所望の突然 変異誘発を行わせるために、適当な制限フラグメントを選択し、Ｍ１３ファージ ベクター中でサブクローニングした（Ｚｏｌｌｅｒ　Ｍ、　Ｊ。

７１　Ｓｍ１ｔｈ　Ｎ、　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ 　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｕｓｉｎｇ　８１３−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｖｅｃｔｏｒ ｓ：ａｎ　ｅ［１ｃｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｒａｌｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆ ｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｉｎｔ　ｅ＋ｕｔａｔｉｏｎ ｓ　ｉｎａｎｙ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ＤＮＡ（Ｈ１３由来のベクターを用 いた特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発、任意のＤＮＡフラグメント中で点 突然変異を産生ずる有効な一般手順）、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ、　１０１．６４８７．１９８２）。

単鎖形態の組換えファージベクターを周知の方法で増殖させた。　２０ｎｙのこ れらの８１３単鎖ＤＮＡを１０＋ｅＭのＴｒｉｓ−１（ＣＩｐＨ７，５，０，１ 輸ＨのＥＤＴ＾、５０１１ＮのＮｔＣｊ！中で９５℃で５分間加熱し、室温まで 段階的に冷却することによって適当なオリゴヌクレオチドにアニーリングした１ 次いで以下の成分を順次添加した。ＡＴＰを最終濃度０．４＋ｓＭまで、ｄＣＴ Ｐ、　ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを０．１２＋ｍＭまで、ｄＡＴＰを０．０４ｍＭまで 、１単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントと０．５単 位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｗ＋）、最 終容量は５０１１Ｎの３５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐ［１７，５と０．１輸Ｈの ＥＤＴ＾と６ｍＭのＨｇＣｌ２と０．００６ｍＭのＤＴＴであった。１５℃で１ ２時間インキュベーション後に周知の手順でＤＮＡを大腸菌ＪＭＩＯＩ細胞にト ランスフェクトした（Ｚｏｌｌｅｒ　Ｍ。

Ｊ、＆　Ｓｍ１ｔｈ　Ｍ、、Ｏｌｉｇｏｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅ ｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｕｓｉｎｇ　８１３−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｖｅｃｔｏ ｒｓ；ａｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｒａｌｐｒＯ：＝ｄＩ！ｒ ＝　ｆ＋ｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔ＋Ｌｔ ｉｏｎｓ　１ｎａｎｙ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ＤＮＡ（Ｍ１３由来のベクタ ーを用いた特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発、任意のＤＮＡフラグメント 中で点突然変異を産生ずる有効な一般手順）、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ、　１０１．６４８７．１９８２）。

所望の欠失を生起させるために使用されるオリゴヌクレオチドを５０μｌの反応 混合物中で、１０ｄのＨｇＣｌ２と５＋ＭのＤＴＴと１０単位のＴ４ポリヌクレ オチドキナーゼ（ＢｏｅｂｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）とを含む７０５Ｍの Ｔｒｉｓ−ＩＣ／バッファ　ｐＨｓ中の１５０μＣｉ（７−３２Ｐ）ＡＴＰ（Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　６０００Ｃｉ／ｍａｏｌ）を用いて 放射性標識した０反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。標識オリ ゴヌクレオチドを使用し、突然変異誘発ファージＤＮＡにプラークハイブリダイ ゼーションを行なった。

３ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ、１０　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｔ’　ｓ及び０．２ｗｇ ／ｘｉの変性サケ精子ＤＮＡを含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＲＣ１ｐＨ８中で ６５℃でハイブリダイゼーションを１晩進行させた。６５℃の０．４ＳＳＣ１０ ，１％ＳＯＳを数回交換してニトロセルロースフィルターを３０分間洗浄し、ｘ Ｈフィルムに１晩露光した。陽性ハイブリダイゼーションを示すプラークを選択 し、＾ｍｅｒｓｈａｍ　８１３配列決定キットを用いてＳａｎｇｅｔジデオキシ ヌクレオチド配列決定を行なった。

従来の発現プラスミド（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　Ｅ、　Ｆ 、　＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、、Ｍｏ１ｅｅｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、＾　１ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＩＩＩａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　１９８２）を使用し、突然変異遺伝 子を大腸菌の組換え菌株中で発現させ、この大腸菌を培養して所望の分子を産生 させた。

組換え分子の精製 細菌の溶解後に組換え産生物が不溶分画から検出される。

１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ８，５，０，１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００中で ベレットを洗い、不溶物質を６ＭのグアニジンＨＣ１，０，１１４のβ−メルカ プトエタノール、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ８，５に再懸濁させる。懸濁 液を４℃で１６時間震盪し遠心して上清を採取し、この上清を１：２５の割合で 再生用バッファに加える。再生用バッファは、１０＋＊ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｊ！ 　ｐＨ８，２，５Ｍの尿素、８１１ＭのＥＤＴ＾を含む。

溶液を１５℃で２４時間維持する。イオン強度を低下させるために、再生用溶液 をまず限外ｒ通によって１０倍に濃縮し、次に１０−ＭのＴｒｉｓ−ＨＣ４’　 ｐＨ７，８，２，５Ｍの尿素、８輸ＨのＥＤＴ＾を含む最終バッファで４倍に希 釈する。再活性化したフィブリン溶解物質を次に、Ｓ−セファロース「高速流」 （Ｐｈａｒｍａｅｉａ）のイオン交換クロマトグラフィーでＮｈＣｌの直線濃度 勾配（０〜１Ｍ）に通して精製する。活性分画を収集し、プールし、Ｃ−２５セ フアデツクス（Ｐｈａｒｗｌａｅｉａ）で５０μｌＭのＮＯ，）ＩＣＯ，に対し てゲル濾過して脱塩し、凍結乾燥する。最終純度は８０％〜９８％の範囲である 。

代替方法としては、本発明の誘導体をシグナルペプチドと共に発現させ、誘導体 を上清から採集してもよい。

ウロキナーゼ型アミド分解活性 ＴＣ−１１Ｋ（Ｓｅｒｏｎｏ　；バッチＮｏ、８７０４０２）、ｐｒｏＵＫ（Ｓ ｅｒｏ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、バッチ０００１２０５１００）及び本発明の低分 子！誘導体（Δ１２５、Δ１４０及びΔ１５０）のアミド分解活性を色素原基質 Ｓ−２４４４（Ｇｌｕ−Ｃ１ｙ−＾ｒＨ−ｐＮａ；Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ）を 使用して決定した。このアッセイはｔＣ−ＵＫの固有アミド分解活性及び単鎖ウ ロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のプラスミンによる活性化後のアミド 分解活性の発生に基づく、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子と色素原 基質との反応によって発生したｐＮへの量を、マイクロプレートリーダー（輸１ ｎｉ−ｒｅａｃ！ｅｒＩｒ　、Ｄｙｎａｔｅｅｈ）を使用し４ＬＯｎｍで分光光 度測定でモニターした。

プラスミン活性化に関しては、漸増する種々の濃度の各プラスミノーゲン活性化 因子（濃度範囲１ｎｇ／ｗｌ〜１００μｇ／ｍｌ）を、０．０５ＨのＴｒｉｓと ０．０３８８のＮａＣｊ！と０．０１％のＴｗｅｅｎ８０とを含有するＴｒｉｓ −ＦＩＣｊ’バッファｐＨ８，８中でプラスミンの存在下（ｉ２．５μｇ／ｘ１ ）に３７℃で１５分間インキュベートした。（プラスミンで活性化しない）適当 な対照も含ませた。このインキュベーション期間後に、０．２５Ｂ／ｚｌ’のＳ −２４４４と１００ＫＩυ／ｍｌのアプロチニンをＴｒｉｓ−ＭＣＩバッファｐ Ｈ８，８中に含有する１８０μｌの基質溶液に２０ｕｌの活性化した各混合物を 添加した。

これらの混合物を更に３７℃で３０分間インキュベートした。

５０μ！の５０％酢酸水溶液を添加して反応を停止させた。

同じ手順を用いてＤｒ、　Ｐ、　Ｊ、　（：ａｆｆｎｅｙ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ 　Ｉｎ５ｔｉ−ｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔａｎｃｌａｒｄ ｓ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｌｏｎｄｏｎ、　ＬＩＫ）から得られたウロキナ ーゼ国際標準調製物（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＲｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｐｒｅ ｐａｒａｔｉｏｎ　Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）（ｎ、６６／４Ｂ）を処理して、較正 曲線を作成した。

前記較正曲線を使用し、各産生物あたりの光学密度の結果をＩＵ／ｊ１１に変換 した。

各ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子調製物のタンパク質含量の測定後 に、Ｂｉｏ−ｒａｄのＢｒａｄｆｏｒｃｌマイクロアッセイ（ｓｔａｎｄａｒｄ ｌ　、ＢＳ＾）を使用して比活性（タンパク質１１当たりの！Ｕ）を計算した。

Ｓ−２４４４試験及びタンパク質アッセイは既に記載されている（Ｐａｎｎｅｌ ｌ、　Ｒ，＆　Ｃｕｒｅｗｉｃｈ、　Ｖ、。

＾ｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｓ＋ｃｉｎｏＢｅｎ　ｂｙ　ｓｉｎｇｌｅ −ｃｈａｉｎ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅｏｒ　ｂｙ　ｔｗｏ　ｃｈａｉｎ　ｕｒｏｋ ｉｎａｓｅ、＾　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ　ｔｈａｔｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａ ｉｎ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｈａｓ　ａ　ｌｏｗ　ｃｉｔａｌｙｔｉｅ　ａｃｔ ｉｖｉｔｙ（Ｐｒｏ−ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）　（単鎖ウロキナーゼまたは二本鎖 ウロキナーゼによるプラスミノーゲンの活性化、単鎖ウロキナーゼの低触媒活性 の証明＞、　Ｂｌｏｏｄ、　６９．　Ｎｏ、１．２２．１９８７；Ｂｒａｄ−ｆ ｏｒｄ、Ｍ、Ｍ、、Ａ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　５ｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏ ｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｇｒａ＋＊　 ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓｕｔｉｌｉｓｉｎｇ　ｔｈｅ　 ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ（タンパ ク質−色素結合の原理を利用するμｇ量のタンパク質の高速及び高感度定量方法 ）、＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　７２．２４８．１９７６）。

ヘパリンの存在下のウロキナーゼ型アミド分解活性野性型ｐｒｏＵＫ（最終濃度 １０００１Ｕ／ｙｊり及び新規なｐｒｏＵＫ誘導体、即ちΔ１２５（最終濃度１ ０００１１１＃４）を、０．０３８ＭのＮａＣ４’と０．０１％のＴｗｅｅｎ８ ０とを含有する３７℃の０．０５ＨのＴｒｉｓ−ＨＣ１バッファｐ［Ｉ７．４中 で、ヘパリンの非存在下または漸増濃度のへパリ“ン（０，００１，１０１Ｕ／ ｘｉ’）の存在下にプラスミン（最終濃度１０Ｈ／ｚｌ）で処理した１種々の時 間（５，１０及び１５分）後にアリコートを採取し、発生した二本鎖ウロキナー ゼ型アミド分解活性を前記のごとく色素原基質Ｓ−２４４４で測定した。

ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のクロット溶解活性（Ｍａｔｓｕｏ 、　Ｏ，、Ｒｙｋｅｎ、　Ｄ、　Ｃ，＆　Ｃｏ１１ｅｎ、　Ｄ、。

Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｆｉｂｒｉｎｏｇｅ ｎｏｌｙｔｉｃ、ｆｉｂｒｉｎｏ−Ｉｙｔｉｃ　ａｎｄ　ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔ 、ｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ｐｌａｓｍｉ−ｎｏｇｅ ｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ａｎｄ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ（組 織プラスミノーゲン活性化因子とウロキナーゼとのフィブリノーゲン溶解性、フ ィブリン溶解性及び血栓融解性のｉｎ　ｖｉｔｒｏ相対比較）、、　Ｔｈｒｏｍ ｂ、、　１ｌａｅａ＋ｏｓｔ、　４５．２２５．１９８１）。

（１０ｍＭのクエン酸三ナトリウムに収集した）血液プールを３０００ｙで４℃ で１０分間遠心することによって血小板欠乏正常血漿（ＰＰＰ）を得た。

ヒト１２５Ｉ−標識フィブリノーゲン（１０，０ＯＯｃｐｌ＃−＾ｍｅｒｓｈａ ＋ｏ）を含有するクエン酸添加ヒトＰＰＰ（０，５ｚ１）のアリコートは、Ｃａ Ｃ１２（最終濃度２５ｅ＋Ｍ）及びヒトトロンビン（最終濃度２ＮＩｌ（／ｘｉ ）の添加によってクロットを形成した６次に混合物をシリコン管（内径４＋＋＋ ａ）に吸引し、３７℃で３０分間維持してクロットを形成させた。長さ１．５ｃ ｍの試験片を切断した。クロットをベトリ皿に入れ、０．１５８のＮｔＣｌを数 回交換して室温で５分間洗浄した。

放射性同位体の計数後直ちに、０．０３８ＨのＮａＣｆと０．０１％のＴｗｅｅ ｎ８０とを含有する５０μｆのＴｒｉｓ−ＨＩＪ　０．０５Ｍ　ｐＴ１７．４バ ツフアと２ｚｌのＰＰＰとの中でクロットを３７℃でインキュベートした。

ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の溶液（Ｐｒｏ＝υＫ、Δ１２５、 Δ１４０、Δ１５０の最終濃度１５０１１１／ｉｆ、ＴＣ−ＵＫの最終濃度５０ ＴＵ／ｚｌ）またはバッフｙ　（０，０３８ＨのＮａＣ１’と０．０１％のＴｗ ｅｅｎ８０とを含有するＴｒｉｓ−）１ｃ１０．０５Ｍ　ｐ［１７，４バツフア ）とを添加した。

３７℃で４時間インキュベーション後にクロットから遊離し血漿培地中に回収さ れた放射性同位体の量から血栓融解の程度を三重サンプルで計算した。結果を（ フィブリン溶解剤非含有の）基線値の％で示す。

ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の安定性クエン酸添加正常ヒトＰＰ Ｐ中でＴＣ−ＵＫ（５０１Ｕ／ｉ１）、Ｐｒｏ−ＬＩＫ及びそのＬＭＩ１１誘導 体（１５０１Ｕ＃１）を室温で２４時間インキュベートした０次に、新しく調製 した＋１１５１−標識ヒト血漿クロ・７トを添加し血栓融解の程度を前記同様に 測定した（Ｍａｔｓｕｏ。

０、、　Ｒｙｋｅｎ、　Ｄ、　Ｃ，＆　Ｃｏ１１ｅｎ、　Ｄ、、　Ｃｏｍｐａｒ ｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅ　ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｏｌｙｔｉｃ 、　ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｅ　ａｎｄ　ｔｈｒｏｅ＋ｂｏ−１ｙｔｉｅ　ｐｒ ｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃ、ｔｉ ｖａｔｏｒ　ａｎｄｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ（組織プラスミノー ゲン活性化因子とウロキナーゼとのフィブリノーゲン溶解性、フィブリン溶解性 及び血栓融解性のｉｎ　ｖｉｔｒｏ相対比較＞、　Ｔｈｒｏｍｂ、。

１１ａｅａｏｓｔ、、　４５．２２５．１９８１）。

血漿フィブリノーゲンレベル １２５■−ヒト血漿クロットを各ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子と 共に３７℃で４時間インキュベーション後に、血漿アリコート（５０μｍ）を収 集し、フィブリノーゲン−フィブリン重合テストによって夫々のフィブリノーゲ ン含量を測定した（Ｖｅｒｍｙｌｅｎ、　Ｃ，、Ｄｅ　Ｖｒｅｋｅｒ、　Ｒ，＆ Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ、　Ｎ、、＾ｒａｐｉｄ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｍｅｔｈ ｏｄ　ｆｏｒ　ａｓｓａｙｏｆ　ｆｏｂｒｉｎｏｇｅｎ：ｆｉｂｒｉｎ　ｐｏｌ ｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ（ＦＰＴ−ｔｅｓｔ）（フィブリノーゲン− フィブリン重合時間の高速酵素アッセイ法）、Ｃｌ１ｏ、Ｃｈｉ＋ｍ、＾ｅｔａ 、８，４１８．　１９６３）。

薬物動態学的研究 体重１５０〜２５ｈの雄の正常ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ　ＤａｗｌｅｙＨＣｈａ ｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）を使用した。

試験動物を１晩絶食させ、実験当日にベンドパルビタール（５０ｗｇ八ｇの腹腔 内注射）で麻酔した。野性型ｐｒｏＵに及び新で（尾の静脈に）静注した。対照 動物には生理的食塩水を注射した０種々の時間後、即ち０分後（処置前）′、（ 静注の）０．５．１．２．５．１０．２０及び３０分に腹大動脈から血液サンプ ルを採取し、クエン酸三ナトリウム（最終濃度０〜０．１１ｓ＋ｏｌｅ／ｆ）で 人為的に凝血させた（ａｒｔｉｃｏａｇｕｌａｔｅ）　。

被検物質及び被検時間の夫々について少なくとも３体の動物を試験した。血液サ ンプルを遠心しく２０００Ｘｇ、１５分；４℃）、血漿を使用しフィブリン−プ レート法で真性グロブリン分画のフィブリン溶解活性を測定しくＡｔｒｕｐ　Ｔ 、　＆　ＭｕｅｌｌｅｒＬｚ、　Ｓ、、＾ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ−Ｂｉｏｐ ｈｙｓ、、　４０．３４６〜３５１．１９５２）、野性型ｐｒｏｌｌＫの内部標 準調製物に較正したエンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（Ｅｌ　１ｓ ａ）を用いてウロキナーゼ関連抗原レベルを測定した（Ｇｒｏｎｄａｈｌ、　Ｂ ａｎ５ｅｎ　Ｊ、。

＾ｇｅｒｌｉｎ　Ｎ、、’　Ｎｕｎｋｈｏｌｍ、Ｌｉｒｓｅｎ　Ｐ、、Ｂａｃｈ 　Ｆ、、Ｎ１ｅｌｓｅｎ　Ｌ。

Ｓ、、Ｄｏｍｂｅｒｎｏｗｓｋｙ　Ｐ、＆　Ｄａｎｏ　Ｋ、、５ｅｎｓｉｔｉｖ ｅ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏ ｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉ ｎｏｇｅｎ　ａｅｔｉｖａＬｏｒ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　 ｔｏ　ｐｌａｓｓ＋ａｆｒｏｍ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｂｒｅａｓｔ　 ｃａｎｃｅｒ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の高感度特異的ＥＬ ｉｓａアッセイ及び乳癌患者の血漿への使用）、　Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃ１１ｂ、 　Ｎｅｄ、、　１１１゜１．４２〜５１．１９８８）。

宍」二 低分子量プロウロキナーゼ誘導体のウロキナーゼ型アミド分解活性 分子　アミド分解活性（ｉ、ｕ、／ａｙ）車プラスミン非添加　プラスミン添加 Δ１２５　検出不能　９６０００ Δ１４０　検出不能　８５０００ Δ１５０　検出不能　１０５０００ ｐｒｏ−ＵＫ　検出不能　９８０００ ＴＣ−ＵＫ　１２８０００　１２８０００本プラスミン（１２，５μｇ／Ｍｌ） による処置の前後のウロキナーゼ型アミド分解活性を色素原基質Ｓ−２４４４で 測定した（Ｐａｎｎｅｌｌ。

Ｒ，ｌ　Ｇｕｒｅｗｉｃｈ、Ｖ、、＾ｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉ ｎｏｇｅｎ　ｂｙｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｏｒ　ｂｙ 　ｔｗｏ　ｃｈａｉｎ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅ、＾ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ　 ｔｈａｔ　５ｉＢｌｅ−ｃｈａｉｎ　ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｈａｓ　ａ　ｌｏｗ ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｐｒｏ−ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）（単鎖 ウロキナーゼまたは二本鎖ウロキナーゼによるプラスミノーゲンの活性化。

単鎖ウロキナーゼの低触媒活性の証明）、　Ｂｌｏｏｄ、　６９．　Ｎｏ、１゜ ２２、１９８７）。

ｐｒｏ−ＵＫとその低分子量誘導体及びヒトの二本鎖ウロキナーゼ（ＴＣ−ＵＫ ）の比活性をウロキナーゼの国際標準調製物に較正することによって決定した０ 国際標準調製物はＤｒ、　Ｐ。

Ｊ、　Ｇａｆｆｎｅｙ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔａｎ−ｄｔｒｄｓ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、　Ｌｏ ｎｄｏｎ、ＵＫから得られた。

Ｌ 低分子量プロウロキナーゼ誘導体のフィブリン溶解及びフィブリノーゲン溶解活 性分子　＋ｔｑクロットの　基準量のフィブリ　２４時間インキュベーション後 の溶解活性（ｚ）　ノーゲンレベル（＄）　”Ｉクロット溶解活性の安定度ｆｌ ）Δ１２５　９５　８５　９０ Δ１４０　８５　９０　９０ Δ１５０　１００　５０　８５ ｐｒｏ−ＵＫ　１００　８５　８０ ＴＣ−ＵＫ　ｔｏｏ　１０　０ ＦＩＧ、ｌ Ｎｉ１−２　Ｃ００Ｈ Ｎ）Ｉ−２Ｃ叩１１ ７７Ｅミ：：：：ミ：：：ミ：、：駐：Δ１２５　−−−−−　２８５　アミノ 酉変Δ１ｔ４０　−−−−−　２７１　アミノろ焚Δ１５０　−−−−−　２６ １　アミジウ変Ｎ）Ｉ−２ＣＤＯＨ Δ１６２　−−−−−　２４９　アミ月）虻比牽 ＥＦＡ　［ｅ、ムｌ　ｒ、υに、Δ（１（０，ａｌＶｒｎａｘ　ｆ）す”ｔｔｔ ｏ偶−；４補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成 元年１２月１８日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＥＰ　８９１００３９４２、発明の名称　プロウ ロキナーゼの低分子量誘導体及び該誘導体を含有する薬剤組成物 ３、特許出願人 住　所　イタリー国、イー２０１５９・ミラン、ヴイア・カル口・インボナテイ 、２４ 名　称　ファルミタリア・カル口・エルバ・エツセ・エルレ・エルレ４、代　理 　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正書の提出年月日　 １９８９年９月１１日６、添附書類の目録 （１）補正書の翻訳文　１通 補正請求の範囲 （１９８９年９月１８日国際特許庁にて受理、原請求の範囲の請求項１〜１８を 補正請求の範囲の請求項１〜１８に差替え、請求項１９〜２１は補正なしく３頁 ）〕 １、単鎖配置の成熟プロウロキナーゼのアミノ酸１６３からアミノ酸４１１まで の配列を輿愈≠婁二含むことを特徴とするしトプロウロキナーゼの低分子量誘導 体。

２、単鎖配置の成熟プロウロキナーゼのアミノＭ１５１からアミノ酸４１１まで の配列を≠キキキキ含むことを特徴とするヒトプロウロキナーゼの低分子量誘導 体。

３、アミノ［４８〜１３５の配列に含まれる成熟プロウロキナーゼのｋｒｉｎｇ ｌｅドメインが欠失していることを特徴とする４、アミノ酸１１〜４７の配列に 含まれる成熟プロウロキナーゼの受容体結合ドメインまたは細胞結合ドメインが 欠失していることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の誘導体。

５、成熟１０ウロキナーゼのアミノＨ１３６〜４１１に結合した７、更に、アミ ノ末端に付加的メチオニン残基を含むことを特徴とする請求項１から６のいずれ か一項に記載の誘導体。

８、更に、少なくとも１つのグリコシド側鎖を含むことを特徴とする請求項１か ら７のいずれか一項に記載の誘導体。

９、アミノ酸の欠失、置換または挿入によって得られるタンパク質から構成され るか、更に任意のタイプの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むことを特徴とす る請求項１から８のいずれか一項に記載の誘導体。

１０、請求項１から９のいずれか一項の誘導体をプラスミンで処理することによ って産生される低分子量誘導体。

１１、請求項１から１０のいずれか一項の誘導体と薬剤として許容される担体と を含む薬剤組成物。

１２６血栓融解剤として使用される請求項１から１０のいずれか一項に記載の誘 導体。

１３、血栓融解剤の製造のための請求項１から１０のいずれか一項の誘導体の使 用。

１４、請求項１から１０のいずれか一項の誘導体をコードするＤＮＡ配列。

１５、プロウロキナーゼをコードするヒト遺伝子に特定部位の突然変異を誘発す る段階を含むことを特徴とする請求項１４に記載のＤＮＡ配列の産生方法。

１６、欠失させるべき配列の欠如した合成オリゴデオキシリすることを特徴とす る請求項１５に記載の方法。

１７、請求項１４に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。

１８、請求項１７に記載のベクターによって形質転換された宿主微生物。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．単鎖配置の成熟プロウロキナーゼのアミノ酸１６３からアミノ酸４１１まで の配列を少なくとも含むことを特徴とするヒトプロウロキナーゼの低分子量誘導 体。
2. ２．単鎖配置の成熟プロウロキナーゼのアミノ酸１５１からアミノ酸４１１まで の配列を少なくとも含むことを特徴とするヒトプロウロキナーゼの低分子量誘導 体。
3. ３．アミノ酸４８〜１３５の配列に含まれる成熟プロウロキナーゼのＫｒｉｎｇ ｌｅドメインが欠失していることを特徴とする請求項１または２に記載の誘導体 。
4. ４．アミノ酸１１〜４７の配列に含まれる成熟プロウロキナーゼの受容体結合ド メインまたは細胞結合ドメインが少なくとも欠失していることを特徴とする請求 項１から３のいずれか一項に記載の誘導体。
5. ５．成熟プロウロキナーゼのアミノ酸１３６〜４１１に結合した成熟プロウロキ ナーゼのアミノ酸１〜１０から構成されることを特徴とする請求項２に記載の誘 導体。
6. ６．成熟プロウロキナーゼのアミノ酸１４１〜４１１から成ることを特徴とする 請求項２に記載の誘導体。
7. ７．成熟プロウロキナーゼのアミノ酸１５１〜４１１から成ることを特徴とする 請求項２に記載の誘導体。
8. ８．成熟プロウロキナーゼのアミノ酸１６３〜４１１から成ることを特徴とする 請求項１に記載の誘導体。
9. ９．更に、アミノ末端に付加的メチオニン残基を含むことを特徴とする請求項１ から８のいずれか一項に記載の誘導体。
10. １０．更に、少なくとも１つのグリコシド側鎖を含むことを特徴とする請求項１ から９のいずれか一項に記載の誘導体。
11. １１．アミノ酸の欠失、置換または挿入によって得られるタンパク質から構成さ れるか、更に任意のタイプの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むことを特徴と する請求項１から１０のいずれか一項に記載の誘導体。
12. １２．請求項１から１１のいずれか一項の誘導体をプラスミンで処理することに よって産生される低分子量誘導体。
13. １３．実質的に添付の第１図の基づいて本文中に記載した低分子量誘導体。
14. １４．請求項１から１３のいずれか一項の誘導体と薬剤として許容される担体と を含む薬剤組成物。
15. １５．血栓融解剤として使用される請求項１から１３のいずれか一項に記載の誘 導体。
16. １６．血栓融解剤の製造のための請求項１から１３のいずれか一項の誘導体の使 用。
17. １７．請求項１から１３のいずれか一項の誘導体をコードするＤＮＡ配列。
18. １８．プロウロキナーゼをコードするヒト遺伝子に特定部位の突然変異を誘発す る段階を含むことを特徴とする請求項１７に記載のＤＮＡ配列の産生方法。
19. １９．欠失させるべき配列の欠如した合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを使 用し マーカー使用法（ｍａｒｋｅｒ　ｒｅｓｃｕｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）で配列を 完成（して特定部位の突然変異と誘発することを特徴とする請求項１８に記載の 方法。
20. ２０．請求項１７に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
21. ２１．請求項２０に記載のベクターによって形質転換された宿主微生物。