CZ282035B6 - Derivát tkáňového aktivátoru plasminogenu, kódový řetězec, způsob výroby derivátu, způsob výroby plasmidu a prostředek k rozpouštění krevních sraženin - Google Patents

Derivát tkáňového aktivátoru plasminogenu, kódový řetězec, způsob výroby derivátu, způsob výroby plasmidu a prostředek k rozpouštění krevních sraženin Download PDF

Info

Publication number
CZ282035B6
CZ282035B6 CS902676A CS267690A CZ282035B6 CZ 282035 B6 CZ282035 B6 CZ 282035B6 CS 902676 A CS902676 A CS 902676A CS 267690 A CS267690 A CS 267690A CZ 282035 B6 CZ282035 B6 CZ 282035B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ser
leu
gly
arg
thr
Prior art date
Application number
CS902676A
Other languages
English (en)
Inventor
Anne Dr. Stern
Ulrich Dr. Kohnert
Rainer Dr. Rudolph
Stephan Dr. Fischer
Ulrich Dr. Martin
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of CZ267690A3 publication Critical patent/CZ267690A3/cs
Publication of CZ282035B6 publication Critical patent/CZ282035B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Podstatu řešení tvoří derivát tkáňového aktivátoru plasminogenu, t-PA s neglykosylovaným řetězcem aminokyselin, řetězec DNA, který je kodovým řetězcem pro tento derivát, způsob výroby plasmidu pro expresi tohoto derivátu s obsahem jeho kodového řetězce, způsob výroby derivátu t-PA při použití plasmidu s obsahem kodového řetězce pro uvedený derivát. Součástí řešení je i prostředek pro rozpouštění krevních sraženin, který obsahuje uvedený derivát jako svou účinnou složku. ŕ

Description

Oblast techniky
Vynález se týká způsobu výroby nového derivátu tkáňového aktivátoru plasminogenu, řetězce DNA. který je kódem pro tento nový derivát, kódového řetězce DNA pro tento derivát a také způsob výroby plasmidu, s obsahem tohoto řetězce, jakož i prostředků pro rozpuštění krevních sraženin, které obsahují uvedený derivát.
Dosavadní stav techniky
Vytékající krev obsahuje jako hlavní složku bílkovinné matrice polymemí fibrin. Fibrin je za fyziologických podmínek rozpouštěn fibrinolytickým systémem v reakční kaskádě, centrální reakcí je aktivace plasminogenu na plasmin, která je zahajována například tkáňovým aktivátorem plasminogenu t-PA (tissue type plasminogen activator). Plasmin rozpouští fibrin, který je hlavní složkou bílkovinné matrice sražené krve. Enzymatická účinnost přírodního nebo genetickou technologií z eukaryotických organismů získaného t-PA. zejména katalytická aktivace plasminogenu na plasmin je v nepřítomnosti fibrinu nebo štěpných produktů fibrinu velmi malá, je ji však možno v podstatě zvýšit za přítomnosti těchto bílkovin, obvykle více než desetkrát.
Uvedený aktivátor se proteázami v krvi štěpí na řetězec A a B. Oba řetězce jsou spojeny cysteinovým můstkem. Stimulovatelnost účinností t-PA je velká výhoda oproti známým aktivátorům plasminogenu, jako jsou urokináza nebo streptokináza, popsané v M. Hoylaerts a další, J. Biol. Chem., 257, 1982, 2912 až 2919, W. Nieuvvenhuizen a další, Biochem. Biophys. Acta, 755, 1983, 531 až 533.
Mechanismus účinku t-PA in vivo byl popsán například v Komiger a Collen, Thromb, Hámostasis, 46, 1981. 561 až 565. Účinnost enzymu, spočívající v působení na povrch fibrinu by umožňovala jeho využití například při infarktu, což bylo potvrzeno klinickými pokusy, například v Collen a další, Circulation, 70, 1984, 1012, Circulation, 73. 1986, 511.
Nevýhodou t-PA je rychlý pokles koncentrace v plasmě. V důsledku toho je nutno použít poměrně vysokých dávek k rozpuštění thrombu in vivo. Vysoké dávky však mají vedlejší účinky, například krvácení.
V evropském patentovém spisu č. 196 920 je popsán přírodní produkt odbourávání t-PA, který obsahuje ještě oblast Kringel 2 a proteázovou oblast t-PA, přičemž N-terminální řetězec až do aminokyseliny alanin 160 byl popsán v Pennica a další. Nátuře, 301, 1983, 214 až 221. Pokles koncentrace tohoto derivátu v plasmě se však do vlastního derivátu příliš neliší. Teprve chemickou modifikací je možno dosáhnout zlepšení.
Vynález si klade za úkol modifikovat t-PA tak, aby vzniklý derivát měl prodloužený poločas v krevní plasmě. Při tom musí být zachován účinek na rozpuštění thrombů a stimulovatelnost fibrinem.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří derivát tkáňového aktivátoru plasminogenu (t-PA) s následujícím neglvkosylovaným řetězcem aminokyselin:
- 1 CZ 282035 B6 (Μ)
Ser Tyr Gin Val Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gin Gly
1015
Ile Ser TyrArg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu Cys
2530
Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr Ser Gly Arg 35 4045
Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg 50 5560
Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala Gly 65 70 7580
Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly Asn 85 9095
Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser 100 105 ’110
Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu 115 ' 120125
- Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly 130 ' 135140
Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro
145 ' 150 155160
Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp 165 170175
Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin 180 185190
Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp 195 ’ 200205
Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe 210 215220
Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala
225 ' 230· 235240
His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu
245 250255
Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu 260 ' 265270
Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp
275 280285
Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala
290 295300
Gin Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu
305 310 315320
Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His
325 330' 335
Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val
340 345 350
Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg 355 360365
Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly
370 375380
Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro
385 390 395400
Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser
405 410 '415
Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys
420 425430
Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
435 ’ 440445
Nyní bylo zjištěno, že vypuštění zbývajících, v nativním t-PA se vyskytujících oblastí nemá žádný vliv na thrombolytickou účinnost a na stimulovatelnost nativního t-PA fibrinem.
Podstatu vynálezu tvoří rovněž řetězec DNA, který je kódem pro uvedený derivát:
ATGTCTTACCAAGTGATCGATACCAGGGCCACGTGCTACGAGGACCAGGGCATCAG CTACAGGGGCACGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGCCGAGTGCACCAACTGGAACA GCAGCGCGTTGGCCCAGAAGCCCTACAGCGGGCGGAGGCCAGACGCCATCAGGCTG GGCCTGGGGAACCACAACTACTGCAGAAACCCAGATCGAGACTCAAAGCCCTGGTG CTACGTCTTTAAGGCGGGGAAGTACAGCTCAGAGTTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTC TGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACA GCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCA AGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAAT TACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGC AGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAG TACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCAC CCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTG TGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGG AGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCC CTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTC GATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCC
- J CZ 282035 B6
CGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTG CAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTT GTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAG CCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGC TGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCG ATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCA TCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTT ACC AACTACCTAGACTGGATTCGTGAC AAC ATGCGACCG 1341
Řetězec DNA podle vynálezu slouží k expresi derivátu t-PA podle vynálezu v případě, že je uložen v plasmidu pro expresi. Použít je možno i plasmid pro expresi, který obsahuje odchylný řetězec DNA, který je však přece kódovým řetězcem pro derivát t-PA podle vynálezu. Na základě degenerace genetického kódu jsou totiž vhodné také některé řetězce, odchylné od svrchu uvedeného kódového řetězce.
Plasmid pro expresi obsahuje kromě počátku replikace s výhodou kromě kódového řetězce pro t-PA ještě řiditelnou strukturu promotoru, například tac-promotor, účinný terminátor, například fd a označení pro příští selekci, například gen pro beta-laktamázu.
Podstatu vynálezu tvoří rovněž způsob výroby plasmidu pro expresi, který spočívá v tom, že se uloží do určitého plasmidu řetězce DNA, který je kódem pro bílkovinu t-PA nebo její derivát, který obsahuje kromě oblastí Kringel I, Kringel II a oblasti pro proteázu ještě další oblasti pro bílkoviny t-PA a řízenou mutagenezou se odstraní oblasti, které jsou kódem pro aminokyseliny, neobsažené v derivátu t-PA podle vynálezu.
Volba plasmidu pro uložení kódového řetězce DNA pro derivát t-PA závisí na buňkách, které budou později použity pro expresi derivátu. Vhodné plasmidy a požadavky, které jsou na tyto plasmidy uloženy, například počátek replikace nebo místa působení restrikčních enzymů zná každý odborník. Místo plasmidu je možno použít také kosmid, tj. replikativní forma fágu, například lambda nebo M13, s dvojitým řetězcem a další vektory. Metoda řízené mutagenesy je známa z publikace Morinaga a další, Biotechnology, 21, 1984, 634 a byla prováděna způsobem, v této publikaci popsaným..
Vynález se rovněž týká způsobu výroby derivátu t-PA, který spočívá v tom, že se dosáhne exprese plasmidu podle vynálezu ve vhodných cílových buňkách a produkt se pak izoluje ze živného prostředí nebo po rozrušení buněk z kapaliny, v níž byly buňky rozrušeny, například z pufru nebo živného prostředí. K produkci derivátu t-PA se s výhodou užije prokaryotických buněk. Přitom je výhodné, aby se vytvořená tak zvaná inkluzní tělíska, která jsou nerozpustnými agregáty bílkoviny nejprve oddělila od rozpustných částí buněk, pak je možno inkluzní tělíska s obsahem t-PA solubilizovat působením guanidinhydrochloridu. podrobit derivatizaci působením oxidovaného glutathionu, načež je možno renaturovat derivát t-PA přidáním L-argininu a guanidinhydrochloridu. Přesný návod k aktivaci t-PA inkluzních tělísek je možno nalézt v evropských patentových spisech č. 219 874 a 241 022. Při provádění způsobu podle vynálezu je však možno užít také jiných postupů pro získání účinných bílkovin z inkluzních tělísek.
Způsob podle vynálezu se s výhodou provádí za přítomnosti L-argininu. zvláště v koncentraci 25 až 1000 mmol/1.
Podle vynálezu se oddělení cizorodé bílkoviny s výhodou provádí afinitní chromatografií při použití sloupce s obsahem ETI (Erythrina-trypsin-inhibitor). ET1 je fixován na nosném materiálu, například BrCN-Sepharose. Čištění na uvedeném sloupci má tu výhodu, že uvedený sloupec je možno zatížit i za přítomnosti tak vysokých koncentrací argininu jako 0.8 mol/l. Tím je možno se vyvarovat shlukování p-t-PA. k němuž může docházet při koncentraci argininu pod
-4CZ 282035 B6 mmol/l. Zvláště výhodné je čištění p-t-PA na uvedeném sloupci za přítomnosti 0,2 až 1.0 M, s výhodou 0,5 až 1,0 M argininu. Roztok s obsahem K1K2P/Pro má s výhodou pH vyšší než 6,5, s výhodou vyšší než 7.
Eluce sloupce s obsahem ETI se provádí snížením pH za přítomnosti argininu za podmínek, které umožňují dobrou rozpustnost t-PA po expresi v prokaryotických buňkách. S výhodou je pH v kyselé oblasti, zvláště v rozmezí 4 až 6.
Derivát K1K2P/Pro, získaných způsobem podle vynálezu má specifickou účinnost t-PA přibližně > 0,4 . 106 IU/mg (IU = mezinárodní jednotka), s výhodou > 0,6 . 106 IU/mg, stimulovatelnost štěpnými produkty fibrinogenu (účinnost za přítomnosti peptidů fibrinogenu/účinnost bez přítomnosti těchto peptidů) je více než desetinásobná, s výhodou než dvacetinásobná. Čistota produktu je vyšší než 90 %, s výhodou vyšší než 95 % a zvláště vyšší než 98 %.
Derivát t-PA podle vynálezu je zvláště vhodný pro použití ve farmaceutických prostředcích pro rozpouštění krevních sraženin, tyto prostředky představují další předmět vynálezu.
Vynález bude dále osvětlen formou příkladů v souvislosti s přiloženými výkresy.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. I je schematicky znázorněna výroba plasmidu pA33.
Na obr. 2 je znázorněn časový průběh koncentrace t-PA v plasmě po nitrožilním podání většího množství prostředku t-PA (ActilyseR), který se běžně dodává, pro srovnání je uveden i průběh poklesu koncentrace pro derivát podle vynálezu, v lineární formě.
Na obr. 3 je znázorněn průběh koncentrací v logaritmickém vyjádření.
Příklady provedení wnálezu
Příklad 1
Konstrukce plasmidu pA33
Výchozím plasmidem byl plasmid pePa 133, popsaný v evropském patentovém spisu č. 242 836. Všechny stupně specifické mutagenity, vedoucí k vypuštění oblastí F a E z plasmidu pePa 133 (obr. 1), byly provedeny způsobem podle publikace Morinaga a další, Biotechnologie 21 (1984), 634. Z plasmidu byly připraveny dvě štěpné směsi. Směs A byla štěpena enzymem EcoRI a byl izolován větší fragment. Ve směsi B bylo provedeno štěpení enzymem Xhol a produkt byl linearizován. K tvorbě heteroduplexu byl použit následující oligonukleotid:
5’ TAC CAA GTG ATC GAT ACC AGG GCC 3'
Hybridizací kolonií se svrchu uvedeným oligonukleotidem k dosažení mutagenese byly získány klony, obsahující plasmid pA33. Tento plasmid byl charakterizován pomocí restrikčních enzymů a bylo ověřeno, že v nich chybí místo působení restrikčního enzymu SspL které leží v kódové oblasti F kazety pro expresi t-PA.
Příklad 2
Příprava účinného K1K2P/Pro z E. coli
a) Rozrušení buněk a příprava inkluzních tělísek (IB)
1.6 kg vlhké buněčné hmoty E. coli DSM 3689, transformované plasmidem p-A33 se uvede do suspenze v 10 litrech 0,1 mol/1 tris-HCl. 20 mmol/1 EDTA o pH 6,5 při teplotě 4 °C. Pak se přidá 2,5 g lysozymu, směs se inkubuje 30 minut při teplotě 4 °C a pak se buňky rozruší zvýšeným tlakem. K roztoku se přidá 5 litrů 0.1 mol/1 tris-HCl, 20 mmol/1 EDTA, 6 % Tritonu X100 a 1,5 mol/1 NaCl o pH 6,5 a směs se inkubuje ještě 30 minut při teplotě 4 °C. Pak se nerozpustný podíl inkluzních tělísek oddělí odstředěním.
Usazenina se uvede do suspenze v 10 litrech 0,1 mol/1 Tris-HCl, 20 mmol/1 EDTA o pH 6,5, inkubuje se 30 minut při 4 °C a inkluzní tělíska se izolují odstředěním.
b) Solubilizace IB
8.7 g vlhké hmoty IB se uvede do suspenze ve 100 ml 0,1 M tris, 6 M guanidinu, 0,1 M DTE o pH 7,5 a směs se 30 minut míchá při 25 °C.
Po úpravě pH na hodnotu 3 přidáním 25% kyseliny chlorovodíkové se provádí dialýza proti 4 mol/1 guanidinhydrochloridu o pH 2,5 (3 x 3 litry, 24 hodin, 4 °C).
c) Derivatizace
Svrchu uvedený dialyzát se smísí s oxidovaným glutathionem (GSSG) do koncentrace 50 mmol/1 a přidá se tris-pufr do 100 mmol/1 a pH se titruje při použití 5 mol/1 NaOH na 7,5. Pak se směs inkubuje 90 minut při 25 °C. Po úpravě pH na 3 přidáním 25% kyseliny chlorovodíkové se provádí dialýza proti 10 mmol/1 HCI (3 x 100 litrů, 48 hodin, 4 °C).
d) Renaturace
Do reakční nádoby s objemem 10 litrů se vloží 0,8 mol/1 argininu/HCI, pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 glutathionu (GSH). Postup se provádí při teplotě 20 °C trojnásobným přidáním vždy 100 ml derivátu, předem dialyzovaného proti 6 mol/1 guanidinhydrochloridu o pH 2, vždy v odstupu 24 hodin.
Tímto způsobem se získá materiál se specifickou účinností 50 až 75 KU/mg, účinnost se stanoví podle publikace H. Lili, Z. gesamte inn. Med. ihre Grenzgeb. (1987), 42. 478 až 486.
e) Koncentrace renaturovaného materiálu
Renaturovaný materiál je v případě potřeby možno zahustit při použití hemodialyzátoru.
Příklad 3
Čištění K1K2P/Pro z E. coli
Čištění se provádí afinitní chromatografii na Erythrina-trypsin-inhibitor- (ETI)-Sepharose.
Směs se koncentruje v hemodialyzátoru (Asahi AM 300) v poměru 1 : 5 přes noc proti 0.8 mol/1 Arg/HCl o pH 7.5 s následným odstředěním. Pak se dialyzát v množství 1,8 litru nanese na
-6CZ 282035 B6 sloupec s obsahem 120 ml ETI-Sepharose v tomtéž pufru. Průtok je 4 objemy sloupce (SV) za hodinu, sloupec se pak promývá tímtéž pufrem s 0,5 mol/1 chloridu sodného tak dlouho, až absorpce eluátu při 280 nm je stejná jako pro pufr. Po druhém promytí pěti objemy 0,3 mol/1
Arg/HCl o pH 7,0 se provádí další eluce stejným pufrem, avšak při pH 4.5.
objem ml účinnost • KU/ml Cprot mg/ml SA KU/mg F'
dialyzát 1800 74 1,05 70 15
K1K2P- směs 200 610 0.82 744 28
x F = stimulace fibrinem = účinnost za přítomnosti fibrinu/účinnost bez fibrinu.
Příklad 4
Stanovení vlastností čištěného K1K2P/Pro z E. coli
a) Vlastnosti bílkoviny
- SDS-PAGE a vysokotlaká kapalinová chromatografie v reverzní fázi
Homogenita materiálu, čištěného afinitní chromatografii na ETI-Sepharose byla stanovena SDS-PAGE a vysokotlakou kapalinovou chromatografii v reverzní fázi (RP-HPLC). Po elektroforetické analýze čištěného materiálu bylo možno vypočítat pro K1K2P z E. coli zjevnou molekulovou hmotnost 50 800 ± 2000. Densitometrické vyhodnocení prokázalo čistotu vyšší než 90 %.
RP-HPLC je založena na různé výměně bílkovin v hydrofobních matricích. Tyto vlastnosti se využívají jako analytický postup pro zjištění čistoty.
Analýza čištěného K1K2P/Pro z E. coli byla prováděna na sloupci Nucleosil 300 (Knauer) při použití gradientu kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu. Pufr A: 1,2 ml kyseliny trifluoroctové v 1000 ml vody. Pufr B: 300 ml vody, 700 ml acetonitrilu, 1 ml kyseliny trifluoroctové, 0 až 100 %. Chromatografická analýza prokázala čistotu vyšší než 95 %.
- N-terminální řetězec
N-terminální řetězec aminokyselin byl stanoven zařízením pro stanovení řetězce aminokyselin (ABI 470) se standardním programem a současnou detekcí PTH. Zjištěný řetězec S1-Y2-Q3-V4I5-D6-T7-R8-A9-T10-C11-Y12-E13-D14 je v plném souladu s očekávaným řetězcem, teoreticky odvozeným od řetězce DNA.
b) Stanovení účinnosti
Účinnost K1K2P/Pro z E. coli in vitro byla stanovena podle publikace H. Lili, Z. gesamte inn. Med. ihre Grenzgeb. (1987), 42, 478 až 486. Specifická účinnost (SA) byla 650 000 ± 200 000 IU/mg. Stimulovatelnost BrCN-fragmenty fibrinogenu (účinnost za přítomnosti fragmentu fibrinogenu, dělená účinností bez přítomnosti těchto fragmentů) bylo při tomto zkušebním systému 25 až 30.
c) Vazba na fibrin in vitro
Vazba K1K2P/Pro na fibrin in vitro byla stanovena způsobem podle publikace Higgins D. L. a Vehar G. A., (1987), Biochem. 26. 7786 až 7791.
Bylo prokázáno, že K1K2P/Pro oproti t-PA z buněk CHO nevykazuje žádné podstatné vazby na fibrin.
ío Příklad 5
Farmakokinetika K1 K2P/Pro u králíků
Zkoušky byly provedeny na bílých králících (Neuseeland-Kaninchen), srovnání bylo prováděno 15 s prostředkem Actilyse(R) (Alteplase, Thomae GmbH, Biberach, NSR). Obě fibrinolytika byla podávána v dávce 200 000 IU/kg v průběhu 1 minuty, šlo o nitrožilní podání. Vzorky plasmy byly odebrány předem a pak v určitých intervalech po injekci. Hladina t-PA v plasmě byla stanovena spektrofotometricky podle publikace J. H. Verheijen a další, Thromb. Haemostas. 48, 266, 1982 v modifikaci podle publikace H. Lili, Z. Ges. Inn. Med. 42, 478, 1987.
K vypočítání farmakokinetických parametrů bylo užito počítačového programu pro nelineární regrese v modifikaci podle publikace Η. Y. Huang (Aero-Astronautics Report 64, Rice University 1 - 30, 1969. Při analýze křivky bylo užito modelu s jednou nebo dvěma komorami. Před vypočítáním byla vždy odečtena základní koncentrace v krvi od následujících hodnot.
K1K2P/Pro byl vylučován pouze u dvou ze šesti zvířat s rychlou α-fází a pomalou β-fází.
U těchto dvou zvířat byl podíl fáze a na celkovém vylučování 53 %. Naproti tomu všechna zvířata ve skupině, jíž byl podáván prostředek ActilysetR) vylučovala látku v rychlé fázi a, jejíž podíl na celkovém vylučování byl více než 70 %. K1K2P/Pro byl vylučován převážně 30 s poločasem 15,1 ± 3,1 minut. Naproti tomu prostředek ActilyselR) měl velmi malý poločas
1,63 minut, pomalý poločas byl 10,1 minut, jak je zřejmé z následující tabulky 1. Celkový clearance v plasmě pro K1K2P/Pro byl 6,3 ± 1,5 ml/kg/min aje tedy podstatně nižší než v případě prostředku Actilyse(R) (Cltot = 22,9 ± 9,1 ml/kg/min).
Jde tedy o mutantu t-PA, která má ve srovnání s Actiiyse(R> podstatně zlepšený farmakokinetický profil (obr. 2 a 3).
Příklad 6
Farmakodynamika K1K2P/Pro u králíků
Ke zkouškám thrombolytické účinnosti bylo užito modelu thrombosy králičí jugulámí žíly podle publikace D. Collen a další, J. Clin. Invest. 71, 368, 1983. Fibrinolytické látky nebo rozpouštědlo 45 byly podány v průběhu 1 minuty nitrožilně ve větší dávce. Pak byla sledována rychlost thrombolýzy a zvolené parametry srážecího systému a také počet thrombocytů, výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.
Při stejné dávce 200 000 IU/kg bylo možno pozorovat pro K1K2P/Pro po nitrožilním podání 50 statisticky významně vyšší rychlost thrombolýzy 50,7 ± 6.5 % než v případě prostředku
Actilyse'R), kde je tato hodnota 24.1 ± 3,7 %. Srovnatelně potřebná dávka prostředku ActilysetR) k dosažení této účinnosti by byla 800 000 IU/kg hmotnosti (tabulka 2).
-8CZ 282035 B6
Při dávkách K1K2P/Pro se stejnou účinností jako pro prostředek Actilyse(R) je možno pozorovat ve srovnání s působením rozpouštědla pouze malý vliv na srážecí systém, a to na fibrinogen, plasminogen, a ct2-antiplasmin, tyto účinky se nijak neliší od působení prostředku ActilyselR\
Je tedy možno uzavřít, že K1K2P/Pro je mutanta t-PA, která má na králičím modelu thrombozy jugulámí žíly po nitrožilním podání thrombolytickou účinnost, která je ve srovnání s účinností prostředku Actilyse'R> podstatně vyšší. K1K2P/Pro má specifičnost vůči fibrinu v míře, která přibližně odpovídá stejnému parametru pro prostředek Actilyse(R).
Tabulka l
Farmakokinetické parametry, získané z počítače zpracováním údajů o koncentraci v plasmě (účinnost t-PA) u narkotizovaných králíků po nitrožilním podání 200 000 ÍU/kg hmotnosti.
látka tl/2<* min tl/ζβ min Cinj. IU/ml ' v/ ml/kg Cltotx ml.kg'1.min'1 AUCextrapoiX IU.mrLh
Actilyse(R) 1,63 10,1 3051,9 63,2 22,9 161,1
(n = 6) (n=5) ± 1318,8 ±29,3 ±9.1 ±49,8
K1K2P/Pro 8,9 15,1 1695,9 119,1 6.3 556,4
(n = 6) (n=2) ±3,1 ±345,8 ±26,6 ± 1.5 ±118,8
V tabulce jsou uvedeny průměrné hodnoty ± standardní odchylky.
*VC = objem středního oddílu. Cltot = celkový clearance v plasmě.
AUC = plocha pod křivkou, která je velmi důležitá, protože umožňuje srovnání koncentrace v plasmě v čase.
Tabulka 2
Rychlost thrombolýzy. počet destiček a zvolené parametry srážecího systému po nitrožilní injekci (1 minuta) Actilyse(R), K1K2P/Pro nebo rozpouštědla na králičím modelu thrombosy jugulámí žíly.
Parametr rozpouštědlo ActilyselR) 200 000 ÍU/kg K1K2P/Pro 200 000 ÍU/kg Actilyse(R) 800 000 IU/kg
rychlost thrombolýzy (%) 12,9 ± 0,9 24,1 ±3,7 50,7 ± 6,5 44,6 ± 4,8
fibrinogen (%) 89,5 ± 2,1 90,5 ± 2,6 81,1 ±5.1 81.4 ±3.4
plasminogen (%) 90,5 ± 2,7 83,8 ±4,4 60,1 ±4,3 69,6 ± 3,3
aj-antiplasmin (%) 90,9 ± 4,4 100,8 ±5,3 67,6 ±6,7 74,2 ± 5,9
PTT (%) 113,8 ± 4,9 112,9 ±4.3 113,1 ±3,0 115,1 ±5,5
thrombocyty (%) 86,1 ± 12.1 91,4 ±4,9 84,4 ± 0,3 . 86.3 ±2,8
Údaje jsou uvedeny v % výchozí hodnoty před injekcí jako průměrná hodnota ± SEM.
Skupiny obsahovaly 6 zvířat, PTT = částečná thromboplastinová doba.
-9CZ 282035 B6
Příklad 7
Optimalizovaná exprese v E. coli
Ke zvýšení exprese byl dále klonován kódový řetězec pro K1K2P v plasmidu při větším počtu kopií. K tomuto účelu byl využit plasmid pePa 126.1, popsaný v NSR patentové přihlášce č. 39 31 933.4. Tento plasmid je v podstatě tvořen z vektoru pKK223-3 a kódového řetězce pro t-PA, jak je uvedeno v evropském patentovém spisu č. 242 835.
Do tohoto plasmidu se nejprve zařadí řetězec fd-terminátoru. K tomuto účelu se plasmid pePa 126.1 linearizuje působením enzymu Hind III. Takto rozštěpený plasmid se dělí elektroforézou na gelu. Plasmid pLBUl, popsaný v publikaci Gentz a další, (1981) PNAS 78(8) : 4963 se rozštěpí rovněž enzymem Hind III a fragment s obsahem přibližně 360 bp s obsahem fd-terminátoru se získá v čisté formě elektroforézou na gelu s následnou elucí. Linearizovaný plasmid pePa 126.1 a fragment z plasmidu pLBUl po štěpení enzymem Hind III o velikosti 360 bp se naváží. Vazná směs se kotransformuje plasmidem pUBS 500 v E. coli DSM 2102 podle svrchu uvedené patentové přihlášky. Ze získaných klonů se izolují ty klony, které obsahují požadovaný výsledný plasmid pePa 126 fd, který se od výchozího plasmidu pePa 126.1 liší také tím, že obsahuje druhé místo působení enzymu Hind III.
Z plasmidu pePa 126 fd se získají dva fragmenty. Jeden fragment BamHI/PvuI o velikosti 3.4 kb a druhý fragment Pvul/Xmal o 1,3 kb. Oba uvedené fragmenty se váží na fragment z plasmidu pA33 po štěpení BamHI/Xmal o velikosti 1,6 kb a transformují spolu s plasmidem pUBS 500 v E. coli. Výslednému plasmidu byl přiřazen název pA33 fd, který se liší od plasmidu pePa 126 fd tím způsobem, že při štěpení enzymu EcoRl druhý nejkratší fragment z plasmidu pePa 126 fd je z původní délky 610 bp zkrácen v plasmidu pA33 fd o přibližně 250 bp.

Claims (14)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Derivát tkáňového aktivátoru plasminogenu t-PA s následujícím neglykosylovaným řetězcem aminokyselin:
    (M)
    Ser Tyr Gin Val Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gin Gly
    5 1015
    Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu Cys
    20 2530
    Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr Ser Gly Arg
    35 4045
    Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg
    50 5560
    Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala Gly
    65 70 75 '80
    - 10CZ 282035 B6
    Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly Asn
    85 .9095
    Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser 100 105110
    Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu 115 120125
    Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly 130 135140
    Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro 145 150 155160
    Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp
    165 170' 175
    Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin 180 185190
    Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp
    195 ' 200205
    Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe 210 215220
    Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala
    225 230 235240
    His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu
    245 250255
    Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu
    260 265270
    Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp 275 280285
    Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala 290 295300
    Gin Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu
    305 310 315320
    Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His
    325 330' 335
    Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val
    340 345 '350
    Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg
    355 360365
    -11CZ 282035 B6
    Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly
    370 375380.
    Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro . 5 385 390 395400
    Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser
    405 410415 ío Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys
    420 425430
    Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
    435 440445
  2. 2. Řetězec DNA, který je kódem pro derivát t-PA podle nároku 1, a je možno jej vyjádřit následujícím vzorcem:
    ATGTCTTACCAAGTGATCGATACCAGGGCCACGTGCTACGAGGACCAGGGCATCAG
    20 CTACAGGGGCACGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGCCGAGTGCACCAACTGGAACA
    GCAGCGCGTTGGCCCAGAAGCCCTACAGCGGGCGGAGGCCAGACGCCATCAGGCTG
    GGCCTGGGGAACCACAACTACTGCAGAAACCCAGATCGAGACTCAAAGCCCTGGTG
    CTACGTCTTTAAGGCGGGGAAGTACAGCTCAGAGTTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTC TGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACA 25 GCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCA
    AGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAAT
    TACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGC
    AGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAG TACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCAC 30 CCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTG
    TGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGG
    AGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCC
    CTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTC
    GATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCC
    35 CGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTG
    CAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTT GTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAG CCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGC TGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCG 40 ATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCA
    TCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTT
    ACCAACTACCTAGACTGG ATTCGTGACAACATGCGACCG 1341.
  3. 3. Způsob výroby plasmidu pro expresi s obsahem kódového řetězce pro tkáňový aktivátor 45 plasminogenu, vyznačující se tím, že se řetězec DNA, který je kódem pro bílkovinu t-PA nebo její derivát, obsahující kromě oblastí Kringel I, Kringel II a oblasti pro proteázu ještě další úseky této bílkoviny EGF a Finger uloží do plasmidu a řízenou mutagenesí se odstraní ty oblasti, které jsou kódem pro aminokyseliny, neobsažené v derivátu t-PA podle nároku 1.
  4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím. že se jako řetězec DNA pro bílkovinu t-PA nebo její derivát užije příslušná cDNA.
    - 12 CZ 282035 B6
  5. 5. Způsob výroby derivátu t-PA podle nároku 1, vyznačující se tím, že se plasmid, získaný podle nároku 3, uloží do cílových buněk a produkt exprese se izoluje ze živného prostředí nebo po rozrušení z uvedených buněk.
    5
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se jako produkční buňky užij i prokaryotické buňky, zejména E. coli.
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m . že se ke zvýšení výtěžku účinné bílkoviny oddělí inkluzní tělíska, tato tělíska se solubilizuj í působením guanidinhydrochloridu, ío derivatizují působením oxidovaného glutathionu, načež se derivát t-PA renaturuje přidáním L-argininu a glutathionu.
  8. 8. Způsob podle nároků 3až7, vyznačující se tím, že se po renaturaci derivát t-PA v renaturační směsi koncentruje a pak se čistí chromatografii při použití afinitní
    15 chromatografie.
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se výsledný materiál chromatografieky čistí na sloupci ETI-absorpčního materiálu.
    20
  10. 10. Způsob podle nároků 3 až 9, vyznačující se tím, že se postup provádí za přítomnosti 25 až 1000 mmol/l L-argininu.
  11. 11. Způsob podle nároků 3 až 10, vyznačující se tím, že se k chromatografickému čištění užije koncentrát reaktivované směsi, který obsahuje 25 až 1000, s výhodou 200 až
    25 1000 mmol/l L-argininu a čištění se provádí chromatograficky na sloupci Erythrina-trypsininhibitor ETI -absorpčního materiálu.
  12. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že se koncentrát, určený k chromatografickému čištění upraví na pH větší než 7,0.
  13. 13. Způsob podle nároků 3 až 12, vyznačující se tím, že se eluce chromatografického sloupce provádí při pH 4 až 6.
  14. 14. Prostředek k rozpouštění krevních sraženin, vyznačující se tím, že jako 35 účinnou složku obsahuje derivát t-PA podle nároku 1.
    3 výkresy
CS902676A 1989-05-31 1990-05-30 Derivát tkáňového aktivátoru plasminogenu, kódový řetězec, způsob výroby derivátu, způsob výroby plasmidu a prostředek k rozpouštění krevních sraženin CZ282035B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3917781 1989-05-31
DE3923339A DE3923339A1 (de) 1989-05-31 1989-07-14 Gewebs-plasminogen-aktivator-derivat

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ267690A3 CZ267690A3 (en) 1997-04-16
CZ282035B6 true CZ282035B6 (cs) 1997-04-16

Family

ID=25881452

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS902676A CZ282035B6 (cs) 1989-05-31 1990-05-30 Derivát tkáňového aktivátoru plasminogenu, kódový řetězec, způsob výroby derivátu, způsob výroby plasmidu a prostředek k rozpouštění krevních sraženin

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0400545B1 (cs)
JP (1) JPH0327286A (cs)
AT (1) ATE119940T1 (cs)
AU (1) AU623781B2 (cs)
CA (1) CA2017636C (cs)
CZ (1) CZ282035B6 (cs)
DD (1) DD300109A5 (cs)
DE (2) DE3923339A1 (cs)
ES (1) ES2070210T3 (cs)
FI (1) FI101475B (cs)
HU (1) HU216870B (cs)
IE (1) IE66006B1 (cs)
IL (1) IL94539A (cs)
NO (1) NO902405L (cs)
NZ (1) NZ233796A (cs)
PT (1) PT94227B (cs)
ZA (1) ZA904089B (cs)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3942144A1 (de) * 1989-12-20 1991-06-27 Boehringer Mannheim Gmbh Stabilisierung von k1k2p pro
US6027888A (en) * 1996-04-05 2000-02-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide-bond containing eukaryotic proteins in bacterial cells

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU200615B (en) * 1982-05-05 1990-07-28 Genentech Inc Methods of preparing tissue plasiminogen activator derivative composition
FR2594845B1 (fr) * 1986-02-21 1989-12-01 Genetica Preparation par voie microbiologique de l'activateur tissulaire humain du plasminogene (t-pa) et conversion de l'enzyme ainsi obtenue en sa forme active
DE3643158A1 (de) * 1986-04-21 1987-11-19 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogen-aktivator(tpa) - derivat und seine herstellung
FI100106B (fi) * 1986-12-05 1997-09-30 Novartis Ag Menetelmä plasminogeenin yksisäikeisen yhdistelmäaktivaattorin valmist amiseksi
IL87276A (en) * 1987-08-03 1995-07-31 Fujisawa Pharmaceutical Co Analog of a tissue plasminogen activator containing the Pringle 2 and protease regions only, DNA encoding it, processes for its preparation, and pharmaceutical preparations containing it
US5094953A (en) * 1988-03-21 1992-03-10 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator variants
DE3903581A1 (de) * 1989-02-07 1990-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogenaktivator-derivat

Also Published As

Publication number Publication date
CA2017636C (en) 2000-05-02
CZ267690A3 (en) 1997-04-16
HU216870B (hu) 1999-09-28
ZA904089B (en) 1991-03-27
ATE119940T1 (de) 1995-04-15
PT94227B (pt) 1997-01-31
NO902405D0 (no) 1990-05-30
NO902405L (no) 1990-12-03
CA2017636A1 (en) 1990-11-30
PT94227A (pt) 1991-02-08
IL94539A0 (en) 1991-03-10
DE3923339A1 (de) 1990-12-06
AU5600990A (en) 1990-12-06
IE66006B1 (en) 1995-11-29
IE901848L (en) 1990-11-30
EP0400545A1 (de) 1990-12-05
AU623781B2 (en) 1992-05-21
FI101475B1 (fi) 1998-06-30
FI101475B (fi) 1998-06-30
EP0400545B1 (de) 1995-03-15
HUT54734A (en) 1991-03-28
NZ233796A (en) 1992-07-28
DD300109A5 (de) 1992-05-21
HU903267D0 (en) 1990-10-28
IL94539A (en) 1996-08-04
FI902700A0 (fi) 1990-05-30
DE59008693D1 (de) 1995-04-20
ES2070210T3 (es) 1995-06-01
JPH0327286A (ja) 1991-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5223256A (en) Thrombolytically active non-glycosylated protein
JP2631645B2 (ja) 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物
US4853330A (en) Human tissue plasminogen activator
Winkler et al. Purification and characterization of recombinant single-chain urokinase produced in Escherichia coli
JPH0365151B2 (cs)
JPH07143878A (ja) 改善された繊維素溶解性及びトロンビン阻害作用を有する２官能性ウロキナーゼ変異体
AU620927B2 (en) A preparation of plasminogen activator expressed in prokaryotes
CZ282035B6 (cs) Derivát tkáňového aktivátoru plasminogenu, kódový řetězec, způsob výroby derivátu, způsob výroby plasmidu a prostředek k rozpouštění krevních sraženin
NZ257175A (en) Thrombin activated plasminogen derivatives with the cleavage site p4-p3-pro-arg-p1&#39;-p2&#39;
Li et al. Biochemical properties of recombinant mutants of nonglycosylated single chain urokinase-type plasminogen activator
US5908625A (en) Use of the protease domain of human plasminogen activator for the treatment of thromboembolic diseases
EP0336508A1 (en) Recombinant human single-chain urokinase-type plasminogen activator mutant produced by site-specific mutagenesis of lysine 158 to histidine 158
JPH03500125A (ja) プロウロキナーゼの低分子量誘導体及び該誘導体を含有する薬剤組成物
JP2000504941A (ja) トロンビンによって活性化され得るプラスミノーゲンアクチベーター
Yahara et al. Recombinant variants of tissue-type plasminogen activator containing amino acid substitutions in the finger domain
EP0796323A1 (en) Use of the protease domain of human plasminogen activator for the treatment of thromboembolic diseases
Browne et al. Protein engineering and comparative pharmacokinetic analysis of a family of novel recombinant hybrid and mutant plasminogen activators
JPH03130231A (ja) 医薬製剤
MXPA99000966A (en) Plasminogen activator capable of being activated by thrombin

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20030530