PT94227B - Processo de producao de um plasmideo de expressao, de um derivado de activador de plasminogenio tissular por meio do plasmideo e de composicoes farmaceuticas - Google Patents
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Description
MEMÓRIA DESCRITIVA DA
PATENTE DE INVENÇÃO Nq 94 227
NOME: BOEHRINGER MANNHEIM GmbH epígrafe:Processo de produçSo de um plasmídeo de expressão, de um derivado de activador de plasminogênio tiscular por meio do plasmídeo e de composições farma ceuticas
INVENTORES: Ame Stern, Ulrich Kohnert, Rainer Rudolph, Stephan Fischer e Ulrich Martin
Reivindicação do direito de prioridade (ao abrigo do artigo 4q da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883):
República Federal da Alemanha em 31 de Maio de 1989 sob o η- P 39 17 781.5 e em 14 de Julho de 1989 sob o n2 P 39 23 339.1.
1 0 2 9
2 0 0 /C'A /Ρ Ί
ΡαΓ&ΝΤΕ Ν2. 94 2 27
Processo de produção de um plasmideo de expressão, de um derivado de activador de ρ1asminogénio tissular por meio do plasmídeo e de composições farmacêuticas para que
BOEHRINGER MANNHEIM GmbH, pretende obter privilégio de invenção em Portugal .
RE S UM 0
Prooesso de produção de um plasmideo de expressão, o qual contem uma sequência de ADN ou uma sequência de ADN que difere dela nos limites da degeneração do código genético, ou do plasmideo pA33, caracterizado por se introduzir num plasmideo uma sequência de ADN que codifica toda a proteina de t-PA ou um dos seus derivados, o qual apresenta, além dos dominios Kringel I, Kringel II e de protease, ainda outros segmentos da proteína de t-PA, e por se eliminar, através de uma mutagénese dirigida, os fragmentos que codificam aminoácidos não existentes no derivado de t-PA.
derivado de t-PA é obtido introduzindo o plasmideo de expressão em células hospedeiras, obtendo-se o produto de expressão a partir do meio nutritivo ou depois da rotura das c é 1 u las hospedeiras.
invento refere-se ainda ao processo de preparação de composições farmacêuticas à base do referido derivado de t-PA.
-2MEMÓRIADESCRITIVA
Ο presente invento diz respeito a um novo derivado de t-PA, a uma sequência de ADN que codifica o novo derivado de t-PA, a plasmideos de expressão que apresentam uma sequência de ADN que codifica o novo derivado de t-PA, bem como a um processo para a produção de tais plasmideos, a processos para a produção do derivado de t-PA, e a um remédio para a dissolução de trombos, contendo o derivado de t-PA.
sangue coagulado contém, como componente principal da matriz proteica, fibrina polímera. A fibrina é dissolvida, em condições fisiológicas, por um sistema fibrino 1ítico, numa cascata de reacções semelhantes à da coagulação do sangue. A reacção central, neste caso, é a activação do ρ1asminogénio à plasmina, activação essa que é provocada, por exemplo, pelo activador de ρ1asminogénio tissular t-PA (tissue type plasminogen activator). A plasmina, por sua vez, dissolve a fibrina, a qual é o componente principal da matriz protéica de sangue coagulado. A actividade enzimát ica do t-PA natural ou do obtido pela tecnologia genética de células eucarióticas, quer dizer, a activação catalítica do ρ1asminogénio à plasmina, é muito reduzida no caso de estarem ausentes a fibrina ou produtos de fissão do fibrinogénio, mas pode ser nitidamente aumentada estando presentes estas proteínas, quer dizer, mais do que o factor 10.
t-PA é cindido no sangue, por proteases existentes, numa cadeia A e numa cadeia B . As duas cadeias parciais ficam ligadas u ma à outra por meio de uma ponte de cisteína. A possibilidade de a actividade do t-PA poder ser estimulada é uma vantagem decisiva face a outros activadores de ρ1asminogénio conhecidos, como, por exemplo, uroquinase ou estreptoquinase (comparar, por exemplo, M. Hoylaerts e outros, J. Biol. Chem. 25 7 ('1982), 2912-2919; W. Nieuwenhuizen e outros, Biochem. Biophys. Acta, 755 (1983), 531-533).
mecanismo de acção do t-PA in vivo é descrito, por exemplo, em Korniger e Collen, Thromb. Hámostasis 46 (1981),
S· 2 Ο Ο /0 A / ύ' Τ
-3561-565. A actividade da enzima, focalizada na superfície da fibrina, faz com que pareça ser um remédio adequado para a luta contra obstruções patológicas dos vasos sanguíneos (por exemplo, na caso do enfarte cardíaco), o que pôde ser confirmado, na maioria dos casos, por ensaios clínicos (Collen e outros, Circulation 70 (1984), 1012; Circulation 73 (1986), 511).
No entanto, a rápida diminuição da sua concentração no plasma (taxa de çlearance) deve considerar-se como uma desvantagem do t-PA. A. consequência disso é que é necessária uma quantidade reiativamente elevada de t-PA, para conseguir uma lise eficaz in vivo de trombos. As altas doses de tratamento, por sua vez, provocam efeitos secundários como, por exemplo, hemorragias.
Na EP 0 196 920 é descrito um produto de decomposição natural do t-PA, o qual já só contém os domínios de Kringel 2 e de protease do t-PA., e cujo aminoácido N-ter minai é a alanina 160 da sequência de aminoácidos descrita por Pennica e outros, Nature 301 (1983) 214-221). A taxa de clearanoe deste produto de decomposição do t-PA não é , no entanto, essencialmente diferente da do t-PA natural. No que a isso se refere, só pode ser obtido um aperfeiçoamento por uma modificação química do segmento catalítico pela colocação de um grupo de bloqueio.
A finalidade do presente invento é, portanto, modificar o t-PA de modo a que o derivado resultante apresente uma taxa de cleararce fortemente reduzida e, consequentemente, um período de semi desintegração prolongado no plasma sanguíneo. Nesta situação., o efeito trombolítico e a possibilidade de ser estimulado pela fibrina devem ser preservados.
objecto do invento é , por isso, um a c t i v a d o r de p 1 asmirioqénio tissular (derivado de t-PA, nos exemplos também chamado K1K2P) que é caracterizado por não estar glicosilado e por consistir na seguinte sequência de aminoácidos:
1 0 2 9
2 Ο'Ο /ΟΑ/ΡΪ
(Μ) | |||||||||||||||
Ser | Tyr | Gin | Vai | Ile | Asp | Thr | Arg | Ala | Thr | Cys | Tyr | Glu | Asp | Gin | Gly |
5 | 10 | 15 | |||||||||||||
Ile | Ser | Tyr | Arg | Gly | Thr | Trp | Ser | Thr | Ala | Glu | Ser | Gly | Ala | Glu | Cys |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Thr | Asn | Trp | Asn | Ser | Ser | Ala | Leu | Ala | Gin | Lys | Pro | Tyr | Ser | Gly | Arg |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Arg | Pro | Asp | Ala | Ile | Arg | Leu | Gly | Leu | Gly | Asn | His | Asn | Tyr | Cys | Arg |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Asn | Pro | Asp | Arg | Asp | Ser | Lys | Pro | Trp | Cys | Tyr | Vai | Phe | Lys | Ala | Gly |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Lys | Tyr | Ser | Ser | Glu | Phe | Cys | Ser | Thr | Pro | Ala | Cys | Ser | Glu | Gly | Asn |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ser | Asp | Cys | Tyr | Phe | Gly | Asn | Gly | Ser | Ala | Tyr | Arg | Gly | Thr | His | Ser |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Leu | Thr | Glu | Ser | Gly | Ala | Ser | Cys | Leu | Pro | Trp | Asn | Ser | Met | Ile | Leu |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ile | Gly | Lys | Vai | Tyr | Thr | Ala | Gin | Asn | Pro | Ser | Ala | Gin | Ala | Leu | Gly |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Leu | Gly | Lys | His | Asn | Tyr | Cys | Arg | Asn | Pro | Asp | Gly | Asp | Ala | Lys | Pro |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Trp | Cys | His | Vai | Leu | Lys | Asn | Arg | Arg | Leu | Thr | Trp | Glu | Tyr | Cys | Asp |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Vai | Pro | Ser | Cys | Ser | Thr | Cys | Gly | Leu | Arg | Gin | Tyr | Ser | Gin | Pro | Gin |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Phe | Arg | Ile | Lys | Gly | Gly | Leu | Phe | Ala | Asp | Ile | Ala | Ser | His | Pro | Trp |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Gin | Ala | Ala | Ile | Phe | Ala | Lys | His | Arg | Arg | Ser | Pro | Gly | Glu | Arg | Phe |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Leu | Cys | Gly | Gly | Ile | Leu | Ile | Ser | Ser | Cys | Trp | Ile | Leu | Ser | Ala | Ala |
225 | 230 | 235 | 240 |
1 0 2 9
2200/ΟΑ/ΡΤ
His Cys | Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His | His | Leu | Thr | Vai | Ile 255 | Leu | |
245 | 250 | |||||||
Gly Arg | Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly | Glu | Glu | Glu | Gin | Lys | Phe | Glu |
260 265 | 270 | |||||||
Vai Glu | Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu | Phe | Asp | Asp | Asp | Thr | Tyr | Asp |
275 280 | 285 | |||||||
Asn Asp | Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys | Ser | Asp | Ser | Ser | Arg | Cys | Ala |
290 | 295 | 300 | ||||||
Gin Glu | Ser Ser Vai Vai Arg Thr Vai | Cys | Leu | Pro | Pro | Ala | Asp | Leu |
305 | 310 | 315 | 320 | |||||
Gin Leu | Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu | Leu | Ser | Gly | Tyr | Gly | Lys | His |
325 | 330 | 335 | ||||||
Glu Ala | Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu | Arg | Leu | Lys | Glu | Ala | His | Vai |
340 345 | 350 | |||||||
Arg Leu | Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr | Ser | Gin | His | Leu | Leu | Asn | Arg |
355 360 | 365 | |||||||
Thr Vai | Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala | Gly | Asp | Thr | Arg | Ser | Gly | Gly |
370 | 375 | 380 | ||||||
Pro Gin | Ala Asn Leu His Asp Ala Cys | Gin | Gly | Asp | Ser | Gly | Gly | Pro |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||
Leu Vai | Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met | Thr | Leu | Vai | Gly | Ile | Ile | Ser |
405 | 410 | 415 | ||||||
Trp Gly | Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp | Vai | Pro | Gly | Vai | Tyr | Thr | Lys |
420 425 | 430 | |||||||
Vai Thr | Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg | Asp | Asn | Met | Arg | Pro | ||
435 440 | 445 | |||||||
Surpreendentemente, verificou- | -se | que | a | eliminação | dos | |||
d o m ί n i | os -'estantes, existentes | η o | t-PA nativo, | não | tem | |||
influência na eficácia trombolítica | da | proteína, | e q li e a |
possibilidade de a muteína ser estimulada, em dependência da fibrina, é igual à do t-PA nativo.
Ί 029
3200/OA/PT
-6Um out.ro objecto do presente invento é uma sequência de ADN que codifica o derivado do t-PA de acordo com o invento, e que contem a sequência seguinte:
ATGTCTTACCAAGTGATCGATACCAGGGCCACGTGCTACGAGGACCAGGGCATCAGCTAC AGGGGCACGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGCCGAGTGCACCAACTGGAACAGCAGCGCG TTGGCCCAGAAGCCCTACAGCGGGCGGAGGCCAGACGCCATCAGGCTGGGCCTGGGGAAC CACAACTACTGCAGAAACCCAGATCGAGACTCAAAGCCCTGGTGCTACGTCTTTAAGGCG GGGAAGTACAGCTCAGAGTTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTCTGAGGGAAACAGTGACTGC TACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCC TGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGT GCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAG CCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCC TGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTC TTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCG CCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCC GCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACA TACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCAT AAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGAT TCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGAC CTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTG TCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGC TGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGAC ACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGC CCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTG GGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGG ATTCGTGACAACATGCGACCG 1341
A sequência de ADN de acordo com o invento serve para a expressão do derivado de t-PA de acordo com o invento, no caso de ela estar presente num plasmídeo de expressão. Um tal plasmídeo de expressão é um outro objecto do presente invento, assim oomo, também, um plasmídeo de expressão que apresenta uma sequência de ADN diferente, a qual codifica, no entanto, igualmente o derivado de t-PA de acordo com o invento. Por causa da degeneração do código genético, são também apropriadas para este fim sequências que diferem da sequência de AON representada.
O plasmídeo de expressão contém adicionalmente de preferência, além de uma origem de replicação (origin of rep 1 i cat.i on) , além da sequência que codifica o derivado de t-PA, uma estrutura regulável de promotor (por exemplo, promotor tac), um terminador eficaz (por exemplo, fd), um marcador de selecção (por exemplo, gene de β-lactamase).
Um outro objecto do invento é o plasmídeo pA33 . A produção deste plasmídeo é descrita no exemplo 1, ele contém uma sequência de ADN que codifica o derivado de t-PA de acordo com o i nvento.
Mais um objecto do invento é, por sua vez, um processo para a produção de um dos plasmídeos de expressão, de acordo com o invento, caracterizado por se introduzir num plasmídeo uma sequência de ADN que codifica a proteína de t-PA, de acordo com o invento, ou um dos seus derivados, derivado este que apresenta, além dos domínios de Kringel I, Kringel II e de protease, ainda outros domínios da proteína de t-PA, e por se el i rni narem, através de uma mutagénese dirigida, os domínios que codificam aminoácidos não existentes no derivado de t-PA de acordo com o invento.
A escolha do plasmídeo no qual é introduzida a sequência de ADN que codifica o derivado do t-PA de acordo com o invento, depende das células hospedeiras utilizadas mais tarde para a expressão do derivado. Os peritos conhecem plasmídeos apropriados, assim como as exigências mínimas às quais deve responder um tal plasmídeo (por exemplo, origem de replicação, sítio de cisão (da restrição). Dentro dos limites do presente invento, ê. no entanto, também possível utilizar, em vez de um plasmídeo, um cosmídeo, a forma replicativa com duas cadeias, dos fagos (^, M13), e outros vectores gue os peritos conhecem. 0 método da mutagénese dirigida (site-directed mutagenesis) é descrito por Morinaga e outros, Biotechnology 21, (1984), 634, e realiza-se, essencia 1mente, tal como aí descrito.
2'Uú/Oa/PT
•8Um outro objecto do invento ê, por sua vez, um processo para a produção de um derivado de t-PA de acordo com o invento, caracterizado por se exprimir um dos plasmideos de acordo com o invento em células hospedeiras apropriadas, e por se obter o produto a partir do meio nutritivo, ou, depois da ruptura das células hospedeiras, a partir do líquido em que foi feita a ruptura (por exemplo, o tampão ou, também, o meio nutritivo). Oe preferência, utilizam-se, para a produção do derivado de t-PA de acordo com o invento, células procarióticas, como células hospedeiras. Neste caso, é parti cu 1armente preferível, por sua vez, que sejam separados, em primeiro lugar, os chamados corpos de inclusão (agregados de proteína insolúveis), que se formam nesta ocasião, das partículas celulares solúveis, que sejam solubilizados os corpos de inclusão contendo t-PA, por um tratamento com cloridrato de guanidina, que sejam, a seguir, produzidos derivados com glutationa oxidada, e, finalmente, que seja renaturado o derivado de t-PA pela adição de arginina L e cloridrato de guanidina. Indicações exactas para a activação do t-PA obtido a partir de corpos de inclusão são publicadas, por Pedidos de patente EP-A 0 219 874 e EP-A
De acordo com o invento, podem igualmente ser no entanto, quaisquer outros processos para a exemplo, nos 0 241 022.
utilizados, >bterição da proteína activa a partir dos corpos de inclusão.
processo de acordo com o invento é realizado, de μ- e f e r ê n c i a, em presença de a r g i n i n a L, sobretudo numa concentração de 25 a 1 000 mirto 1/1.
De acordo com o invento, a separação da proteína estranha, per meio de cromatografia de afinidade, é realizada, numa forma preferida no invento, através de uma coluna de adsorção ETI (Ervthrina-Trypsin-Inhibitor). Neste caso, o ETI está fixado num material de apoio (adsorvente) como, por exemplo, BrCN-Sepharose. A purificação através de uma coluna de adsorção ETI tem a vantagem de o material da coluna de adsorção ETI poderser carregado directamente a partir da preparação de reoxidação concentrada, mesmo em presença de concentrações tão altas de arginina como 0,8 mol/1 de arginina . Assim, evita-se uma agreqacác de P-t-PA, que pode ocorrer em concentrações reduzidas de arginina abaixo de 25 mmol/1. Por isso, de preferencia, a
-t-PA é realizada através de uma em presença de 0,2 a 1,0 Μ , de e arginina. A solução contendo
Ί Ο 2 y 3 ί Ο Ο / ΟΑ /ί-Ί
purificação do | preparado de | |
coluna de a d s | o r ç ã o | ETI, |
preferência de | 0,5 a | 1,0 M |
K1K2P/Pro tem, | neste | caso, |
6,5, ou melhor, | ma i or | do que |
A eluição da coluna ETI realiza-se pela redução do pH, em presença de arginina, sob condições que tornam possivel uma boa solubilidade de t-PA expresso pelas células procarióticas. Quando da eluição, o valor pH encontra-se, de preferência, no domínio ãcido, prefere-se principa1 mente de 4 a õ .
Um preparado de K1K2P/Pro produzido de acordo com o invento possui uma actividade de t-PA específica í 0,4x10^ IU/mg, de preferéncia,, 2 0,6x10^ IU/mg, cuja capacidade de estimulação por produtos de fissão de fibrinogénio (actividade em presença de péptidos de fibrinogénio/actividade sem pépti dos de fibrinogénio) é mais do gue dez vezes maior, de preferência mais do gue 20 vezes maior. A pureza do preparado de acordo com o invento é maior do que 90% e, de preferência, maior do que 95%, particu 1 armente maior do que 98%.
derivado do t-PA de acordo com o invento é, por isso, parti cu 1armente apropriado para ser utilizado num medicamento para a dissolução de trombes, o gue constitui, por sua vez, um c-utro cb iectc· do presente invente .
• emρ lo sequinte em
Ίju r to com a f i q u r a i 1 u s t ra o • ι? v eni
A figu ra 1
A. fia u r s 2 mostra esguematicamente a produção do plasmideo pA? 2 .
mostra a variação no tempo da concentração de actividade de t-PA no plasma apôs uma injecção intravenosa de bolus de t-PA de tipo comercial (AC T I L Y SE^ ) , em comparação oom o derivado do t-P.A de acordo com o invento, em representação
1 0 2 9
32ΟΟ/ΟΑ/ΡΊ
- I 0Ί inear e
A figura 3 mostra a variação da concentração em representação logarítmica.
& x e m p i c 1
Construção do plasmídeo pA33 .
Como plasmídeo de base utilizou-se o plasmídeo pePa 133, o qual é descrito no pedido de patente EPA 0 242 836 . Todos os passos experimentais para a mutagênese específica, isto é, para a deleção dos domínios F e E de pePa 133 (ver a figura 1), realizarsm-se aplicando essencialmente o método de Morinaga e outros, Biotechnologie 21 (1984), 634. Para isso, foram feitos a partir do pePa 133, dois preparados para cisão. 0 preparado A foi cindido por meio de EcoRI, sendo isolado o fragmento maior. 0 preparado B foi cindido por meio de X h ο I , sendo, assim, linearizado o produto. Para a formação do heterodúplex foi introduzido o oligonuc1eótido seguinte:
5' TAC CAA GTG ATC GAT ACC AGG GCC 3’
Através de uma hibridaçâo em colónia com o oligonuc1eótido de mutaqênese acima mencionado foram determinados os clones que continham o plasmideo pA33 procurado. Este plasmídeo foi caracterizado pela análise de restrição, verificando-se a ausência do sitio de restrição Sspl o qual se encontra na parte da cassette de expressão de t-PA que codifica o domínio de F i n g e r .
E x e m ρ 1 o 2
Preparação de K1K2P/Pro activo a partir de E. coli
a) Lise celular e preparação dos corpos de inclusão ( IB's)
1,6 Pg de massa celular molhada (E.coli, DSM 3689), transformada com o plasmídeo pA33, foram suspensos em 10 1 de Tris-HCl 0.1 mol/Ί, EDTA 20 mmol/1, pH 6,5 a 4~C. Foram adicionados, além disso, 2,5 g de lisozima, e incubou-se durante 30 minutos a 4~C ; a seguir realizou-se uma lise
celular total por meio de dispersão sob alta pressão. Com a solução da lise foram misturados 5 Ί de Tris-HCl 0,1 mol/l, EDTA 20 mmol/1, 6½ Triton X100 e NaCl 1,5 mol/1, pH 6,5, e fez-se, mais uma vez, uma incubação de 30 minutos a
4-C. A seguir, foi realizada a separação dos componentes insolúveis (corpos de inclusão) por centrifugação.
bolo foi suspenso em 10 1 de Tris-HCl 0,1 mol/1, EDTA 20 mmol/1, pH 6,5, incubado durante 30 minutos a 4~C, e foi isolado o preparado dos corpos de inclusão, por centrifugação subsequente.
b) Solubilização dos corpos de inclusão
Foram suspensos 8,7 g de corpos de inclusão (peso húmido)
em 1 0 0 | m 1 | de Tris 0,1 | M, guanidina 6 Μ, | DTE 0,1 | M, | com um |
ρH de 7 | , 5 , | e agitados | durante 30 minutos | a 25~C. | ||
Depois | d e | ajustar o | pH a um valor de | 3 , com | HCl | (25%) , |
realizou-se uma diálise contra cloridrato de guanidina 4 mol/1, ρΗ 2,5 (3x3 1, 24 horas, a 4-C).
c) Produção de derivados dialisado acima mencionado foi ajustado, com glutationa oxidada (GSSG) 50 mmol/1 e, com Tris 100 mmol/1, titulou-se com NaOH 5 mol/1, obtendo-se pH 7,5. A preparação foi incubada durante 90 minutos a 25~C. Depois de se ajustar o ph a um valor de 3, com HCl (25%), realizou-se uma diálise contra HCl 10 mmol/1 (3x100 1, 48 horas, a 4~C).
d) Renaturação
Encheu-se um vaso reaccional de 10 1 com Arg/HCl 0,8 mol/1, ρ H 8.5. E D1A 1 mmol/1, G S H (glutationa) 1 mmol/1. A renaturação foi efectuada s 20~C, pela tripla adição de 100 ml do derivado, antes dialisado contra cloridrato de guanidina 6 mol/1, com um pH de 2,5. em intervalos de 24 h o r as.
Depois da renaturação, obtém-se um material com uma actividade específica de 50 a 75 KU/mg (teste de acordo com
6200 /ΌΑ/ΡΊ
-12H.Lill (2. gesamte inn. Med. ihre Grenzqeb. (1987), 42,
7 8-486) .
e) Concentração da preparação de renaturação
A preparação de renaturação pode ser concentrada, se for necessário, através de um aparelho de hemodiálise.
Exemplo 3
Purificação de K1K2P/Pro a partir de E.coli
A purificação de K1K2P/Pro a partir de E.coli realiza-se. por meio da cromatografia de afinidade em Inibidor-Eritrina-Tripsina(ETI)-Sepharose. A preparação de naturação foi
concentrada 1 : 5, através de um aparelho de hemodiálise (Asahi AM 300), dialisada durante a noite contra Arg/HCl 0,8 mol/1, com um pH 7,5, e centrifugada. Uma coluna de ETI-Sepharose (120 ml) equilibrada com Arg/HCl 0,8 mol/1, pH de 7,5, foi carregada com 1,8 1 de dialisado (4 volumes de coluna (SV)/h), e lavada com um tampão (Arg/HCl 0,8 mol/1, pH de 7,5, NaCl 0,5 mol/1) até a absorção do eluido ter atingido.a 280 nm, o va 1 or zero do tampão. Depois de uma segunda lavagem com 5 SV (volumes de coluna) de Arg/HCl 0,3 mol/1, pH 7,0, realizou-se a eluição por meio de Arg/HCl 0,3 mol/1, pH 4,5. | |||||
VoI ume | Actividade | actividade específica | F* | ||
ml | K U / m 1 | mg/ml | KU/mç | ||
Diali s a d o K1K2P/-Pool | Ί 8 0 0 200 | 74 610 | 1 ,05 0,82 | 70 744 | 1 5 28 |
Estimulação pela fibrina = Actividade em presença de fibrina/actividade sem fibrina.
' 1 Ο 2 9
2 ϋ 0/ΟΑ./Ρ Τ
13Exemplo 4
Caracterização de K1K2P/Pro purificado obtido a partir de E.coli
a) Caracterização proteico-química
-SDS-Paae e HPLC de fase inversa
A homogeneidade do material purificado por eromatografia de afinidade, por ET 1-Sepharose, foi testada por meio de SDS-PAGE e pela HPLC de fase inversa (RP-HPLC). Após uma análise electroforética foi calculado, através do deslocamento relativo, para ο K1K2P obtido a partir de E.coli, um peso molecular aparente de 50.800 Da ± 2.000 Da. Da avaliação densimêtrica resultou uma pureza de >90%.
A. RP-HPLC assenta na diferente interaeção de proteínas com matrizes hidrófobas. Aproveitou-se esta propriedade como método analítico para a quantificação do grau de pureza.
A análise do K1K2P/Pro purificado obtido a partir de E.coli realizou-se numa coluna de separação Nucleosil 300 (Knauer), por meio de um gradiente de ácido trif1uoroacético/acetonitri1 o (tampão A: 1,2 ml de ácido trifluoroacético em 1 000 ml de H2O; tampão B: 300 ml de Η 2O, 700 ml de acetonitrilo, 1 ml de ácido trifluoroacético; 0 a 100%). Da integração da análise cromatográfica resultou uma pureza de >95%.
- sequência N-terminal
A sequência de aminoácidos N-terminal foi determinada com um seguenciador ABI 470 com programa padrão e detecção on line PTH. A sequência verificada,
S 1-Y2-D3-V4-I5-D6-T7-R8-A9-T10-C11 -Y12-E13-D14, está de acordo com a sequência esperada, derivada da sequência de ADN.
b) Determinação da actividade
A actividade i n vitro de K 1 K2 Ρ/P r o obtido a partir de E.coli foi determinada de acordo com H. Lill, 2. gesamte inn. Me d. ihre Grenzgeb. (1987), 42, 478-486, A actividade
(SA) era 650.000 IU/mg ± 200.000 IU/mg. A capacidade
1 Ο 2 9 ί200/0A/Ρ7
- 14de estimulação de K1K2P/Pro obtido a partir de E.coli, por fragmentes de BrCN do fibrinogénio (actividade em presença de fragmentos de fibrinogénio, dividida pela actividade sem fragmentos de fibrinogénio) era, neste sistema de ensaio, 25-30.
c) Ligação in vitro à fibrina
A ligação in vitro de K1K2P/Pro à fibrina foi determinada de acordo com o método descrito por Higgins e Vehar (Higgins, D.L. e Vehar, G.A. (1987), Biochem. 26, 7786-7791).
Neste caso verifica-se que o K1K2P/Pro não apresenta, ao contrário do t-PA obtido a partir de células de CHO, nenhuma ligação notável à fibrina.
Exemplo 5
C i n étic a fa r ma c o 1 óg i c a d e K 1K 2 P /P r o no coelho
K1K2P/Pro foi comparado com Actilyse^ (Alteplase, THomae GmbH, Biberaoh, R.F.A.), no que diz respeito às suas propriedades farmacocinéticas, em coelhos brancos de N o v a -Zelândia. Ambos os f i brinolíticos foram injectados, de modo intravenoso, durante 1 minuto, numa dose de 200.000 IU/kg de peso do corpo (KG). Tiraram-se amostras de plasma antes e a momentos definidos depois da injecção. A actividade de t-PA no plasma foi medida por meio de um teste espectrofotométrico de acordo com J. H. Verheijen e outros (Thromb. Haemostas. 48, 266, 198 2 ) , modificado de acordo oom H. Lill (Z. Ges . Inn. Med. 42, 47S. 1987).
Para o cálculo de parâmetros farmacocinéticos foi utilizado um programa de computador para regressão não linear, modificado de acordo com Η. Y. Huang (Aero-Astronautics Report 64, Rice University, 1-30, 1969). Na adaptação das curvas foi tomado como base, caso a caso diferente, um modelo de 1 ou 2 compartimentos. Antes do cálculo o valor do nível básico próprio do corpo foi sempre subtraído aos valores subsequentes.
K1K2P/Pro é eliminado só em 2 de 6 animais com uma fase a rápida e uma fase fi lenta. Nestes 2 animais a parte de fase
2ύΟ/ΟΑ/ΡΊ
15alfa na eliminação total é de 53%. Em contrapartida, todos os animais do grupo de Actilyse^ apresentam uma fase alfa rápida
K1K2P/Pro período de P.
A Acti 1yse período de semidesintegraçãi que contribui com mais de 70% na eliminação total é eliminado, de preferência, só com um semides1nteqração que se eleva a 15,1 ± 3,1 min apresenta, em contrapartida, um rápido de 1,63 min e um período de sem i des i nteqração lento de 10,1 min (tabela 1). A clearance do plasma total de K1K2P/Pro eleva-se a 6,3 ± 1,5 ml/kg/min, sendo assim, significativamente, mais baixa do que no caso da Actilyse^ (C1 = 22,9 ± 9,1 ml /kg/mi ri) .
Em suma, o K1K2P/Pro apresenta-se como um mutante de t-PA que tem, em comparação com Actilyse^, a qual representa o mvel actual da técnica um perfil farmacocinético nitidamente melhorado (figuras 2 e 3).
Exemplo 6
Dinâmica farmacológica de K1K2P/Pro no coelho
Para verificar a eficácia trombolítioa, foi aplicado o modelo da trombose da veia jugular do coelho, estabelecido por D. Collen e outros ( J . C1 i n . Invest. 71, 368, 1983). Os fibrinolíticos e o dissolvente, foram respectivamente. injectados como bolus, de forma intravenosa, durante 1 minuto. A seguir foram determinadas a taxa trombolítioa e escolhidos do sistema coagulador, assim como o trombócitos. (tabela 2).
parâmetros número de
Sendo aplicada uma dose igual (200 000 IU/kq de peso do corpo), o K1K2P/Pro alcançou, após uma injecção intravenosa de bolus, uma taxa trombolítioa significativamente mai:
forme estatística, de 50.7 ± 6,5, %, do que a Actilyse1-' (24. Ί + 3.7 %). A dose de Actilyse^ comparável ao K1K2F respeito a eficácia trombolítioa eleva-se a 80u uuu ju/xg ae peso do corpo (tabela 2).
ma i s | a 1 ta |
1 yse^ | ; (24, |
ro nc | que |
000 | IU/kq |
Numa dosagem equipotente de K1K2P/Pro, em comparação com
Ac t i 1 yc resultam face ao grupo de dissolvente ligeiras : 1 ί.) 2 Ρ i Ο ϋ zOA/PI
6-
consequências para os parâmetros de coagulação fibrinoqénio, p 1 asminogénio e a 1fa 2-antiρ1asmina, as quais não diferem, no entanto, das consequências de uma dose equipotente de Actilyse^.
K1K2P/Pro é, portanto, um mutante de t-PA que apresenta no modelo da trombose da veia jugular do coelho, após uma injecção de bolus, uma eficácia trombolítioa que é, em comparação com Actilyse^, essencialmente mais alta. 0 K1K2P/Pro conserva, nisto, a sua especificidade para a fibrina numa dimensão que também é válida para a Actilyse^.
1 0 2 9
3200/OA/PT
-17Parâmetros farmacocinéticos, derivados de cálculos de computador a partir de dados
I d
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o | φ | d | | | •k | •k | •k | |
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AUC = superfície debaixo da curva; para a aplicaçao de um fibrinolítico como injecção de bolus, a superfície debaixo da curva (AUC”) é particularmente interessante, porque permite uma comparação das concentrações existentes no plasma ao longo do tempo.
i d.;·?
3200/ÚA/ΡT
O κΰ
Taxa trombolítica, número de plaquetas e parâmetros escolhidos do sistema coagulador
- - - “ 1 -p após uma injecçSo intravenosa de bolus (durante 1 min) de Actilyse , K1K2P/Pro ou de o
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Expressão optimizada em E.coli
Para aumentar o rendimento da expressão, foi reclonada a sequência que codifica o gene de K 1 K 2P/Pro num plasmídeo de alto número de cópias. Para este fim, foi utilizado o plasmídeo pePa 126.1 descrito no pedido de patente P 39 31 933.4. Este plasmídeo é composto essencia 1mente pelo vector pKK223-3 e pela sequência que codifica o t-PA, tal como está descrita no pedido de patente EP-A-0 242 835.
Neste plasmídeo foi integrada, primeiro, a sequência de um terminador fd. Para este fim, foi o plasmídeo linearizado pePa 126.1 com a enzima de restrição Hind III. 0 plasmídeo assim cindido foi separado por electroforese em gel e obtido como preparado. 0 plasmídeo pLBU1 (Sentz e outros (1981) PNAS 78(8):4963) foi restringido com Hind III, e foi preparado, por meio de electroforese em gel e eluição em gel, um fragmento de Hind III, de uma extensão de cerca de 360 bp (pares de bases), o qual contém o terminador f d . Foram ligados o plasmídeo linearizado pePa 126.1 e o fragmento de Hind III de 360 bp, obtido a partir de pLBU1. A preparação de ligação foi co-transformada , com o plasmídeo pUBS 500, tal como descrito no pedido de patente P 39 31 933.4, em E.coli, DSM 2102. Dos clones foram escolhidos aqueles que contêm o plasmídeo desejado pePe i ? 6 f cf . o qual difere dc· plasmídeo de base pePa 126.1 pelo facto de conter um segundo sítio de corte Hind III.
Do plasmídeo pePa 126 fd foram obtidos dois fragmentos: um fragmento BamHI/PvuI com um tamanho de 3,4 kb , e um fragmento Pvul /Xííial com um tamanho de cerca de 1 ,3 kb.
Os dois fragmentos mencionados foram ligados a um fragmento
BamHI/Xmal, com um tamanho de cerca de 1,6 kb , obtido a partir do plasmídeo pA33 e transf ormados com o plasmídeo pUBS 500 em
E.coli. 0 plasmídeo resultante foi chamado pA33 fd, podendo ser distinguido de pePa 126 fd pelo facto de gue, numa preparação de
1 029
3200/QA/PT
restrição com EcoRI, o segundo fragmento mais pequeno feito por
EcoRI, obtido a partir de pePa 126 fd, com um comprimento de cerca de 610 bp, encontra-se encurtado, em pA33 fd, cerca de 250 bp.
029
3200/ΟΑ/ΡΤ
Claims (12)
- REIVINDICACÕES1 - Processo de produção de um plasmídeo de expressão, o qual contém a sequência de ADNATGTCTTACCAAGTGATCGATACCAGGGCCACGTGCTACGAGGACCAGGGCATCAGCTAC AGGGGCACGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGCCGAGTGCACCAACTGGAACAGCAGCGCG TTGGCCCAGAAGCCCTACAGCGGGCGGAGGCCAGACGCCATCAGGCTGGGCCTGGGGAAC CACAACTACTGCAGAAACCCAGATCGAGACTCAAAGCCCTGGTGCTACGTCTTTAAGGCG GGGAAGTACAGCTCAGAGTTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTCTGAGGGAAACAGTGACTGC TACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCC TGCCTCCCCTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGT GCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAG CCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCC TGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTC TTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCG CCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCC GCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACA TACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCAT AAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGAT TCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGAC CTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTG TCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGC TGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGAC ACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGC CCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTG GGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGG ATTCGTGACAACATGCGACCG 1341 ou uma sequência de ADN que difere dela nos limites da degeneração do código genético ou é o plasmídeo pA33, caracterizado por se introduzir num plasmídeo uma sequência de ADN que codifica toda a proteína de t-PA ou um dos seus derivados, o qual apresenta, além dos domínios Kringel I, Kringel II e de protease, ainda outros segmentos da proteína de t-PA, e por se eliminar, através de uma mutagénese dirigida ao local, os fragmentos que codificam aminoácidos não existentes no derivado de t-PA com a seguinte sequência de aminoácidos:71 0293200/ΟΑ/ΡΤ (Met)
Ser Tyr Gin Vai Ile 5 Asp Thr Arg Ala Thr 10 Cys Tyr Glu Asp Gin 15 Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu Cys 20 25 30 Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr Ser Gly Arg 35 40 45 Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg 50 55 60 Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Vai. Phe Lys Ala Gly 65 70 75 80 Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly Asn 85 90 95 Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser 100 105 110 Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu 115 120 125 Ile Gly Lys Vai Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly 130 135 140 Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro 145 150 155 160 Trp Cys His Vai Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp 165 170 175 Vai Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin 180 185 190 Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp 195 200 205 Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe 210 215 220 Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala 225 230 235 240 71 0293200/ΟΑ/ΡΤHis Cys Phe Gin Glu 245 Arg Phe Pro Pro His 250 His Leu Thr Vai Ile 255 Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu 260 265 270 Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp 275 280 285 Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala 290 295 300 Gin Glu Ser Ser Vai Vai Arg Thr Vai Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu 305 310 315 320 Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His 325 330 335 Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Vai 340 345 350 Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg 355 360 365 Thr Vai Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly 370 375 380 Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro 385 390 395 400 Leu Vai Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Vai Gly Ile Ile Ser 405 410 4 15 Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Vai Pro Gly Vai Tyr Thr Lys 420 425 430 Vai Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 435 440 445 - 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar, como sequência de ADN, para a proteína de t-PA ou para um dos seus derivados, o respectivo ADNc.
- 3 - Processo de produção de um derivado de activador de plasminogênio tissular (t-PA) o qual não está glicosilado e apresenta a sequência de am aminoáeidos seguinte:Segue sequência71 0293200/ΟΑ/ΡΤ (Met)
Ser Tyr Gin Vai Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gin 15 Gly 5 10 Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu Cys 20 25 30 Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr Ser Gly Arg 35 40 45 Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg 50 55 60 Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Vai Phe Lys Ala Gly 65 70 75 80 Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly Asn 85 90 95 Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser 100 105 110 Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu 115 120 125 Ile Gly Lys Vai Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly 130 135 140 Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro 145 150 155 160 Trp Cys His Vai Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp 165 170 175 Vai Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin 180 185 190 Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp 195 200 205 Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe 210 215 220 Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala 225 230 235 240 TL 0293200/OA/PTHis Cys Phe Gin Glu 245 Arg Phe Pro Pro His 250 His Leu Thr Vai Ile 255 Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu 260 265 270 Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp 275 280 285 Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala 290 295 300 Gin Glu Ser Ser Vai Vai Arg Thr Vai Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu 305 310 315 320 Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys 11 i s 325 330 335 Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Vai 340 345 350 Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg 355 360 365 Thr Vai Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly 370 375 380 Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro 385 390 395 400 Leu Vai Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Vai Gly Ile Ile Ser 405 410 415 Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Vai Pro Gly Vai Tyr Thr Lys 420 425 430 Vai Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg- Asp Asn Met Arg Pro 435 440 445 caracterizado por se introduzir um plasmideo preparado de acordo com a reivindicação 1 em células hospedeiras, e por se obter o produto de expressão a partir do meio nutritivo ou depois da rotura das células hospedeiras. - 4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se utilizarem células procarióticas, particularmente E. coli, como células hospedeiras.
- 5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o rendimento da proteína activa ser aumentado por isolamento71 0293200/ΟΑ/ΡΤ-26dos corpos de inclusão que se formam, solubilização destes através de um tratamento com cloridrato de quanidina e, por fim, renaturação do derivado de t-PA pela adição de arginina L e GSH.
- 6 - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado por, a pós a renaturação, o derivado de t-PA ser concentrado na preparação de renaturação e se realizar subsequentemente uma purificação cromatográfica por meio de cromatografia de afinidade.
- 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se utilizar uma coluna de adsorção ETI para a purificação cromatográf ica.
- 8 - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se operar em presença de 25 a 1000 mmol/1 de arginina L.
- 9 - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por se realizar a purificação cromatográfica com o concentrado da preparação de reactivação, o qual contém de 25 a 1000 mmol/1, de preferência de 200 a 1000 mmol/1, de arginina L, através de uma coluna de adsorção ETI.
- 10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se ajustar o pH do concentrado, utilizado para a purificação cromatográfica, a um valor de mais de 7,0.
- 11 - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por se realizar a eluição a um valor pH de 4 a 6.
- 12 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica adequada à dissolução de trombos, caracterizado por se associar um derivado de t-PA preparado de acordo com a reivindicação 3, com veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.71 0293200/ΟΑ/ΡΤ-27Lisboa, õí MAi i>$0Por BOEHRINGER MANNHEIM GmbH
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