CZ267690A3 - Derivative of plasminogen tissue activator, code chain, process for preparing such derivative, process for preparing a plasmid and preparation for dissolving blood thrombi - Google Patents

Derivative of plasminogen tissue activator, code chain, process for preparing such derivative, process for preparing a plasmid and preparation for dissolving blood thrombi Download PDF

Info

Publication number
CZ267690A3
CZ267690A3 CS902676A CS267690A CZ267690A3 CZ 267690 A3 CZ267690 A3 CZ 267690A3 CS 902676 A CS902676 A CS 902676A CS 267690 A CS267690 A CS 267690A CZ 267690 A3 CZ267690 A3 CZ 267690A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ser
leu
gly
ala
arg
Prior art date
Application number
CS902676A
Other languages
English (en)
Inventor
Anne Dr Stern
Ulrich Dr Kohnert
Rainer Dr Rudolph
Stephan Dr Fischer
Ulrich Dr Martin
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of CZ267690A3 publication Critical patent/CZ267690A3/cs
Publication of CZ282035B6 publication Critical patent/CZ282035B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Oblast techniky
Z L\6 •f-3
Vynález se týká způsobu výroby nového derivátu tkáňové” ho aktivátoru plasminogenu, řetězce DNA, který je kódem pro tento nový derivát, kódového řetězce DNA pro tento derivát a také způsob výroby plasmidů, s obsahem tohoto řetězce, jakož i prostředků pro rozpuštění krevních sraženin, které obsahují uvedený derivát.
Dosavadní stav techniky
Vytékající krev obsahuje jako hlavní složku bílkovinné matrice polymerní fibrin. Fibrin je za fyziologických podmínek rozpouštěn fibrinolytickým systémem v reakční kaskádě, centrální reakcí je aktivace plasminogenu na plasmin, která je zahajována například tkáňovým aktivátorem plasminogenu t-PA (tissue type plasminogen activator). Plasmin rozpouští fibrin, který je hlavní složkou bílkovinné matrice sražené krve. Enzymatická účinnost přírodního nebo genetickou technologií z eukaryotických organismů získaného t-PA, zejména katalytická aktivace plasminogenu na plasmin je v nepřítomnosti fibrinu nebo štěpných produktů fibrinu velmi malá, je ji však možno v podstatě zvýšit za přítomnosti těchto bílkovin, obvykle více než desetkrát.
I
Uvedený aktivátor se proteázami v krvi štěpí na řetězec A a B. Oba řetězce jsou spojeny eysteinovým můstkem. Stimulovatelnost účinností t-PA je velká výhoda oproti známým aktivátorům plasminogenu, jako jsou urokináza nebo streptokináza, popsané v M. Hoylaerts a další, J. Biol. Chem., 257, 1982, 2912 až 2919, W. Nieuwenhuizen a další, Biochem. Biophys. Acta, 755, 1983, 531 až 533.
Mechanismus účinku t-PA in vivo byl popsán například v Korniger a Collen, Thromb, Hámostasis, 46, 1981, 561 až 565. Účinnost enzymu, spočívající v působení na povrch fibrinu by umožňovala jeho využití například při infarktu, což bylo potvrzeno klinickými pokusy, například v Collen a další, Circulation, 70, 1984, 1012, Circulation, 73, 1986, 511.
Nevýhodou t-PA je rychlý pokles koncentrace v plasmě.
V důsledku toho je nutno použít poměrně vysokých dávek k rozpuštění thrombu in vivo. Vysoké dávky však mají vedlejší účinky, například krvácení.
V evropském patentovém spisu č. 196 920 je popsán přírodní produkt odbourávání t-PA, který obsahuje ještě oblast Kringel 2 a proteázovou oblast t-PA, přičemž N-terminální řetězec až do aminokyseliny alanin 160 byl popsán v Pennica a další, .Nátuře, 301, 1983, 214 až 221. Pokles koncentrace tohoto derivátu v plasmě se však do vlastního derivátu příliš neliší. Teprve chemickou modifikací je možno dosáhnout zlepšení.
Vynález si klade za úkol modifikovat t-PA tak, aby vzniklý derivát měl prodloužený poločas v krevní plasmě.
Při tom musí být zachován účinek na rozpuštění thrombů a stimulovatelnost fibrinem.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří derivát tkáňového aktivátoru plasminogenu (t-PA) s následujícím neglykosylovaným řetězcem aminokyselin:
(M)
Ser Tyr Gin Val Ile Aso 5 Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gin Gly
10 15
Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu Cys
20 25 30
Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr Ser Gly Arg
35 40 45
Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg
50 55 60
Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala Gly
65 70 75 80
Lvs Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly Asn
85 90 95
Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser
100 105 110
Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu
115 120 125
Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly
130 135 140
Leu Gly Lys Eis Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro
145 150 155 160
Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp
165 170 175
Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin
180 185 190
E he Arg Ile 195 Lys Gly Gly Leu Phe Ala 200 Asp Ile Ala Ser 205 His Pro Trp
Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe
210 215 220
Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser' Ala Ala
225 230 235 240
His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu
245 250 255
Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu
260 265 270
Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp
275 280 285
Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala
290 295 300
Gin Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu
205 310 315 320
G ln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His
325 330 335
Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val
340 345 350
Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg
355 360 365
Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly
370 375 380
Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro
385 390 395 400
Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser
405 410 415
Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys
420 425 430
Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met, Arg Pro
435 440 445
Nyní bylo zjištěno, že vypuštění zbývajících, v nativním t-PA se vyskytujících oblastí nemá žádný vliv na thrombolytickou účinnost a na stimulovatelnost nativního t-PA fibrinem.
Podstatu vynálezu tvoří rovněž řetězec DNA, který je kódem pro uvedený derivát:
ATGTCTTACCAAGTGATCGATACCAGGGCCACGTGCTACGAGGACCAGGGCATCAGCTAC AGGGGCACGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGCCGAGTGCACCAACTGGAACAGCAGCGCG TTGGCCCAGAAGCCCTACAGČGGGCGGAGGCCAGACGCCATCAGGCTGGGCCTGGGGAAC CACAACTACTGCAGAAACCCAGATCGAGACTCAAAGCCCTGGTGCTACGTCTTTAAGGCG GGGAAGTACAGCTCAGAGTTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTCTGAGGGAAACAGTGACTGC TACTTTC-GGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCC TGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGT GCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAG CCCTGGTGCCACG7GCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCC TGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTC TTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCG CCCGGAGAGCGGTTCGTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCC GCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACA TACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCAT AAGG AATTCG ATG ATG ACACTTACG ACAATGACATTG CG CTG CTG CAGCTG AAATCGG AT TCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGAC CTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTG TCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGC TGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGAC ACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGC CCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTG GGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGG ATTCGTGACAACATGCGACCG 1341
Řetězec DNA podle vynálezu slouží k expresi derivátu t-PA podle vynálezu v případě, že je uložen v plasmidu pro expresi. Použít je možno i plasmid pro expresi, který obsahuje odchylný řetězec DNA, který je vsak přece kódovým řetězcem pro derivát t-PA podle vynálezu. Na základě degeneerace genetického kódu jsou totiž vhodné také některé řetězce, odchylné od svrchu uvedeného kódového řetězce.
Plasmid pro expresi obsahuje kromě počátku replikace s výhodou kromě kódového řetězce pro t-PA ještě řiditelnou strukturu promotoru, například tac-promotor, účinný terminátor, například fd a označení pro příští selekci, například gen pro beta-laktamázu.
Podstatu vynálezu tvoří rovněž způsob výroby plasmidu pro expresi, který spočívá v tom, že se uloží do určitého plasmidu řetězce DNA, který je kódem pro bílkovinu t-PA nebo její derivát, který obsahuje kromě oblastí Kringel I, Kringel II a oblasti pro proteázu ještě další oblasti pro bílkoviny t-PA a řízenou mutagenezou se odstraní oblasti, které jsou kódem pro aminokyseliny, neobsažené v derivátu t-PA podle vynálezu.
Volba plasmidu pro uložení kódového řetězce DNA pro derivát t-PA závisí na buňkách, které budou později použity pro expresi derivátu. Vhodné plasmidy a požadavky, které jsou na tyto plasmidy uloženy, například počátek replikace nebo místa působení restrikčních enzymů zná každý odborník. Místo plasmidu je možno použít také kosmid, tj. replikativní forma fágu, například lambda nebo M13, s dvojitým řetěze
I cem a další vektory. Metoda řízené mutagenesy je známa z publikace Morinaga a další, Biotechnology, 21, 1984, 634 a byla prováděna způsobem, v této publikaci popsaným.
Vynález se rovněž týká způsobu výroby derivátu t-PA, který spočívá v tom, že se dosáhne exprese plasmidu podle vynálezu ve vhodných cílových buňkách a produkt se pak izoluje ze živného prostředí nebo po rozrušení buněk z kapaliny, v níž byly buňky rozrušeny, například z pufru nebo živného prostředí. K produkci derivátu t-PA se s výhodou užije prokaryotických buněk. Přitom gevýhodné, aby se vytvořená tak zvaná inkluzní tělíska, která jsou nerozpustnými agregáty bílkoviny nejprve oddělila od rozpustných částí buněk, pak je možno inkluzní tělíska s obsahem t-PA solubilizovat působením guanidinhydrochloridu, podrobit derivatizaci působením oxidovaného glutathionu, načež je možno renaturovat derivát t-PA přidáním L-argininu a guanidinhydrochloridu. Přesný návod k aktivaci t-PA inkluzních tělísek je možno nalézt v evropských patentových spisech č. 219 874 a 241 022. Při provádění způsobu podle vynálezu je však možno užít také jiných postupů pro získání účinných bílkovin z inkluzních tělísek.
Způsob podle vynálezu se s výhodou provádí za přítomnosti L-argininu, zvláště v koncentraci 25 až 1000 mmol/1.
Podle vynálezu se oddělení cizorodé bílkoviny s výhodou provádí afinitní chromatografií při použití sloupce s obsahem ETI (Ery thrina-trypsin-inhib itorOi. ETI je fixován na nosném materiálu, například BrCN-Sepharose. Čištění na uvedeném sloupci má tu výhodu, že uvedený sloupec je možno zatížit i za přítomnosti tak vysokých koncentrací argininu jako 0,8 mol/1. Tím je možno se vyvarovat shlukování p-t-PA, k němuž může docházet při koncentraci argininu pod 25 mmol/1.
i
Zvláště výhodné je čištění p-t-PA na uvedeném sloupci za přítomnosti 0,2 až 1,0 M, s výhodou 0,5 až 1,0 M argininu,, Roztok s obsahem K1K2P/Pro má s výhodou pH vyšší než 6,5, s výhodou vyšší než 7.
- 8-fž-tO~=|
Eluce sloupce s obsahem ETI se provádí snížením pH za přítomnosti argininu za podmínek, které umožňují dobrou rozpustnost t-rPA po expresi v prokaryotických buňkách. S výhodou je pH v kyselé oblasti, zvláště v rozmezí 4 až 6.
Derivát K1K2P/Pro, získaných způsobem podle vynálezu g
mí specifickou účinnost t-PA přibližně - 0,4 . 10 IU/mg . g (IU = mezinárodní jednotka), s výhodou - 0,6 . 10 IU/mg, stimulovatelnost štěpnými produkty fibrinogenu (účinnost za přítomnosti peptidů fibrinogenu/účinnost bez přítomnosti těchto peptidů) je více než desetinásobná, s výhodou než dvacetinásobná. Čistota produktu je vyšší než 90 %, s výhodou vyšší než 95 % a zvláště vyšší než 98 %.
Derivát t-PA podle vynálezu je zvláště vhodný pro použití ve farmaceutických prostředcích pro rozpouštění krevních sraženin, tyto prostředky představují další předmět vynálezu.
Vynález bude dále osvětlen formou příkladů v souvislosti s přiloženými výkresy.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je schematicky znázorněna výroba plasmidu pA33
Na obr. 2 je znázorněn časový průběh koncentrace t-PA v plasmě po nitrožilním podání většího množství prostředku t-PA (Actilyse ), který se běžně dodává, pro srovnání je uveden i průběh poklesu koncentraee pro derivát podle vynálezu, v lineární formě.
»
Na obr. 3 je znázorněn průběh koncentrací v logaritmickém vyjádření.
t
-XPříklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce plasmidu pA33
Výchozím plasmidem byl plasmid pePa 133, popsaný v evropském patentovém spisu δ. 242 836,
Vgechny stupně specifické mutagenity, vedoucí k vypuštění oblastí F a E z plasmidh pePa 133 (obr. 1), byly provedeny způsobem podle publikace Morinaga a další, Biotechnologie 21 (1984), 634. 2 plasmidu byly připraveny dvě štěpné směsi. Směs A byla štěpena enzymem EcoBI a byl izolován větší fragment. Ve směsi B bylo provedeno Štěpení enzymem Xhol a produkt byl linearizovón. K tvorbě heteroduplexu byl použit následující oligonokleotid:
' TÁC CAA GTG ATC GAT ACC AGG GCC 3 '
Hybridizací kolonií se svrchu uvedenýnoligonukleotidem k dosažení mutagenese byly získány klony, obsahující plasmid pA33. Tento plasmid byl charakterizován pomocí restrikčníchenzymů a bylo ověřeno, že v nich chybí místo působení restrikčního eizymu SspI, které leží
J v kódové oblasti F kazety pro expresi t-PA.
I z
/
JUDr. ZDEŇKÁ kórejzová advokAtka
’Χ
Příklad
Příprava účinného K1K2P/Pro z E. coli
a) Rozrušení buněk a příprava inkluzních tělísek (IB·,)
1,6 kg vlhké buněčné hmoty E. coli D3Í 3689, transformované plasmidem p-A33 se uvede do suspenze v 10 litrech 0,1 mol/l tris-HCl, 20 mmol/l EDTA o pB 6,5 při teplotě 4 °C. Pak se přidá 2,5 g lysozymu, směs se inkubuje 30 minut při teplotě 4 °C a pak ee buňky rozruší zvýšeným tlakem· K roztoku se přidá 5 litrů 0,1 mol/l tris-HCl, 20 mmol/l EETA, 6 % Tritonu XlOO a 1,5 mol/l NaCl o pH 6^5 a směs se inkubuje ještě 30 minut při teplotě 4 °C. Pak se nerozpustný podíl inkluzních tělísek oddělí odstředěním.
Usazenina se uvede do suspenze v 10 litrech 0,1 mol/l Tris-HCl, 20 mmol/l EETA o pH 6-5, inkubuje se 30 minut při 4 °C a inkluzní tělíska se Izolují odstředěním.
b) Solubilizace IB
8,7 g vlhké hmoty IB se uvede do suspenze ve 100 ml 0,1 M tris, 6M guanidinu, 0,1 U ETE o pH 7,5 a směs se 30 minut míchá při 25 °C.
Po úpravě pH na hodnotu 3 přidáním
25% kyseliny chlorovodíkové se provádí dialýza proti mol/l guanidinhydrochloridu o pH 2^5 (3x3 litry, 24 hodin, 4 °C).
-χc) Derivatizace
Svrchu uvedený dialyzát se smísí s oxidovaným glutathionem (GSSG) do koncentrace 50 mmol/l a přidá se tris-pufr do 100 mmol/l a pH se titruje při použití 5 mol/l NaOH na 7,5. Pak se směs inkubuje 90 minut při 25 °C. Po úpravě pH na 3 přidáním 25% kyseliny chlorovodíkové se provádí dialýza proti 10 mmol/l HCl (3 x 100 litrů, 48 hodin, 4 °C).
d) Renaturace
Do reakční nádoby s objemem 10 litrů se vloží 0,8 mol/l argininu/HCl, pH 8,5, 1 mmol/l EDTA, mmol/l glutathionu (GSH). Postup se provádí při teplotě 20 °C trojnásobným přidáním vždy 100 ml derivátu, předem dialyzovaného proti 6 mol/l guanidinhydrochloridu o pH 2f vždy v odstupu 24 hodin.
Tímto způsobem se získá materiál se specifickou účinností 50 až 75 KU/og, účinnost se stanoví ! O
-7145podle publikace H. Lili, Z. gesamte inn. Med. ihre Orenzgeb. /1987), 42, 478 až 486.
e) Koncentrace renaturováného materiálu
Renaturováný materiál je v případě potřeby možno zahustit při použití hemodialyzátoru.
Příklad 3
Čištění KiK2P/?ro z B. coli
Čištění se provádí afinitní chromatografií na Brythrina-trypsin-inhibitor- (ETI)-sepharose.
Smés se koncentruje v hemodialyzá* toru (Asahi AK 300) v poměru 1 í 5 přes noc proti 0,8 mol/l Arg/HCi o pH 7,5 a následným odstředěním. Pak se dialyzát v množství 1,8 litru nanese na sloupec s obsahem 120 ml ETI-Sepahorose v tomtéž pufru. Průtok je 4 objemy sloupce (SV) za hodinu, sloupec se pak promývá tímtéž pufrem s 0,5 mol/l chloridu sodného tak dlouho, až absorpce eluátu při 280 nm je stejná jako pro pufr. Po druhém promytí pěti objemy 0,3 mol/l Arg/HCi o pH 7,0 se provádí další eluce stejným pufrem, avšak při pH 4,5.
objem účinnost cprot ml KU/ ml mg/ml KU/mg dialyzát'’ 1800 74 1,05 70 15
KlK2P-3měs 200 6l0 0,82 744 28 x F = stimulace fibrinem = účinnost za přítomnosti fibrinu/ /účinnost bez fibrinu.
P ř í k 1 a d 4
Stanovení vlastností čištěného ΚΐΚ2Ρ/Ρχ»ο z E. coli
a) Vlastnosti bílkoviny
- SDS-PAGE a vysokotlaká kapalinová chromatografie v reverzní fázi
Homogenita materiálu, čištěného afinitní chromatografií na ETI-Sepharose byla stanovena SDS-PAGE a vysokotlakou kapalinovou chromatografií v reverzní fázi (KP-HPLC). Po elektroforetické analýze čištěného materiálu bylo možno vypočítat pro K1K2P z E. coli zjevnou molekulovou hmotnost 50 800 + 2000. Densitometrické vyhodnocení prokázalo čistotu vyšší než 90 %,
-XRP-líPLC je založena na různé výměně bílkovin v hýdrofobních matricích. Tyto vlastnosti se využívají jako analytický postup pro zjištění čistoty.
Analýza čištěného KlK2?/Pro. z E. coli byla prováděna na sloupci Nucleosil 300 (Knauer) při pov ' užití gradientu kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu.
Pufr A: 1,2 ml kyseliny trif luoroctové v 1000 ml vody.
Pufr B: 300 ml vody, 700 ml acetonitrilu, 1 ml kyseliny trifluoroctové, 0 až 100 %. Chromatografická analýza prokázala čistotu vyšší než 95 %.
- N-terminální řetězec
N-terminální řetězec aminokyselin byl stanoven zařízením pro stanovení řetězce aminokyselin (ABI 470) se standardním programem a současnoudetekcí PTH. Zjištěný řetězec Sl-Y2-Q3-V4-I5-D6-T7-R8-A9-TlO-Cn-Yl2-El3-Dl4 je v plném souladu s očekávaným řetězcem, teoreticky odvozeným od řetězce DNA.
b) Stanovení účinnosti
Účinnost KlK2P/Pro z E. coli in vitrobyla stanovena podle publikace H. Lili, Z. gesamte inn. Med. ihre Grenzgeb.. (1997), 478 až 486. Specifická účinnost
(SA) byla 650 OOO + 200 000 Ιϋ/mg. Stimulovatelnost BrCN-fragmenty fibrinogenu (účinnost za přítomnosti fragmentu fibrinogenu, dělená účinností bez přítomnosti těchto fragmentů) byle při tomto zkušebním systému 25 až 30.
c) Vazba na fibrin in vitro
Vazba KlK2P/Pro na fibrin in <tro byla stanovena způsobem podle publikace Higgins D.L. a Vehar G.A., (1987), Biochem. 26 , 7786 až 7791.
Bylo prokázáno, že KlK2P/Pro oproti t-PA z buněk CHO nevykazuje žádné podstatné vazby na fibrin
Příklad 5
Par mak ok ine tiká KlK2P/Pro u králíků
Zkoušky byly provedeny na bílých králících (Neuseeland-Kaninchen), srovnání bylo prováděno (R) s prostředkem Actilyse' ' (Alteplase, Thomae GmbH, Biberach' NSR). Obě fibrinolytika byla podávána v dávce 200 000 XU/kg v průběhu 1 minuty, šlo o nitrožilní podání. Vzorky plasmy byly odebrány předem a pak v určitých intervalech po injekci. Hladina t-PA v plasmě byla stanovena spektrofoto16 metricky podle publikace J. H. Verheijen a další, Thromb. Kaemostas. 48 f 266, 1982 v modifikaci podle publikace H. Lili, Z. Ges. Inn. Med. 12, 478, 1987.
K vypočítání farmakokinetických parametrů bylo užito pořitačováho programu pro nelineární regrese v modifikaci podle publikace Η. Y. Huang (Aero-Astronautics Repott 64, Rice University 1 - 30, 1969.
Při analýze křivky bylo užito modelu s jednou nebo dvěma komorami. Před vypočítáním byla vždy odečtena základní koncentrace v krvi od následujících hodnot.
KlK2P/Pi«o byl vylučován pouze u dvou ze šesti zvířat s rychlou cc-fází a pomalou β-fází. U těchto dvou zvířat byl podíl fáze a na celkovém vylučování 53 %.
Naproti tomu všechna zvířata ve skupině, jíž byl podáván prostředek Actilysev ' vylučovala látku v rychlé fázi a, jejíž podíl na celkovém vylučování byl více než 70 %.
KiK2P/Pro byl vylučován převážně s poločasem 15,1 + 3,1 (R) minut. Naproti tomu prostředek Actilyse 1 měl velmi ma4 lý poločas 1,63 minut, pomalý pctočas byl 10,1 minut, jak je zřejmé z následující tabulky 1. Celkový clearance v plasmě pro SlK2P/Pro byl 6,3 + 1,5 ml/kg/min a je tedy (R) podstatně nižší než v případě prostředku Actilýse 1 (Cl^ = 22,9 + 9,1 ml/kg/min).
Jde tedy o mutantu t-PA, která má (R) ve srovnání s Actilyse 1 podstatně zlepšený farmakokinetický profil (obr. 2 a 3).
Příklad 6
Farmakodynamika KlK2P/Pro u králíků
Ke zkouškám thrombolytlcké účinnosti bylo ušito modelu thrombosy králičí jugulární žíly podle publikace D. Collen a další, J. Clin. Invest. 2l, 368, 1983. Pibrinolytické látky nebo rozpouštědlo byly podány v průběhu 1 minuty nitrožilně ve větší dávce. Pak byla sledována rychlost thrombolýzy a zvolené parametry srážecího systému a také počet thrombocytů, výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.
Při stejné dávce 200 000 IU/kg bylo možno pozorovat pro Klk2P/Pro po nitrožilním podání statisticky významně vyšší rychlost thrombálýzy 50,7 + 6,5 % než v případě prostředku Actilyse , kde je tato hodnota
24,1 + 3,7 %. Srovnatelně potřebná dávka prostředku Actilyse^) k dosažení této účinnosti by byla 800 000 IU/kg hmotnosti (tabulka 2).
Při dávkách KlK2P/Pro se stejnou (R) účinností jako pro prostředek Actilyse 7 je možno pozorovat ve srovnání s působením rozpouštědla pouze malý vliv . na srážecí systém, a to na fibrinogen, plasminogen, a
1?
1 £-2
-Xo^-antiplasmin, tyto účinky se nijak neliší od působení (R) prostředku Actilyse' ·
Je tedy možno uzavřít, že KlK2P/?ro je mutanta t-RAf která má na králičím modelu thrombozy jugulární žíly po nitrožilním podání thrombolytiekou účinnost, která je ve srovnání s účinností prostředku.
Actilysepodstatně vyšší. KiX2P/Pro má specifičnost vůči fibrinu v míře, která přibližně odpovídá stejnému (R) parametru pro prostředek Actilyse' · o .c G. · α,
Farmakokinetické parametry, získané z počítače zpracováním údajů,
•o Λ1
VI r-l XD Pt Λί Xí O £ 3 > o ta •rl P
O •
•rl
P
<0 03
G O
3 G P
o B
JZ
P-t
1 no
P Xd
P
ca H
o
c O
G O
•H O
X)
X3 O
O
CM
XV
8 M
co G
CO XB
H Ό
G. O
O.
►
Ti B Ή
O G
<0 H
p •H
p »a
G o
© G
o P
G •H
O 6
O o G.
p x
«
1 r“l 00 M- CO
•t a* ·. Λ
6 iH ca «3 co
• \O M IÍA rH
P rH UA γΊ
H + 1 + 1
r-l 1 c
•H
B
X
P r-l O I +> HO r-t r-l
B
CA rH Γ-» IA
et •b •b •b
CM o\ VO rH
CM + 1
+ 1
HO CM n r-l CO
Λί ·» ©b ©b •b
X n ca ca VO
o r-l \o CM H CM
ř> B + 1 r-l
+ »
* •o e c •H p O H
GQ.
CM G X rj r-l 8 P a
CM
X r-l •P
ca co CA co
•b •b •b •b
rH co - UA UA
UA rM CA Μ-
O <n vo η
n r-f rl + »
+ t
f—1 UA r-l i—1
•b II •b ·.
o IA n
r-i H
+ 1
X—»
n CM
\O <Λ li
•b •b G
H
«
© řr Ζ-»
03 >» «: u>
(0 H II Pc II
Λ1 •rl CM
P P G 6
xo O r-l
H <! M
xv
B co 3 r-l O.
•
►
>1
rH ©
5 O G
o 3
Ό P
O 3 ©
Ή r-l
G O
•tí
G CO
Ό O
C Λί
CO r-l
P í>
03 O
+ 1 1)
>> P
P o
o P
G r-l
Ό O
O J2 X» G
P •
XV 3
6 r—1
/3 VI
U Ό
Λ K3 O
C O
« .C
•O VI
• G
► Ό
3 © >G
3 P
O tti
Λ
TJ B v
© TJ
O p
t-l o
3
X> II
3
P o t>
> X
AUC = plocha pod křivkou, která je velmi důležitá, protože umožňuje srovnání koncentrace + i tjO
Rychlost thrombolýzy, počet destiček a zvolené parametry srážecího systému po nitrožilní injekci ( 1 minuta) Actilyee^ , KlK2P/Pro nebo rozpouštědla na
-4 P co M- n CA ir\ co
K «k •k •k w ·» *k
Φ n m ΙΛ tn OJ
a O
>> o + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + J
r-l o
•rl vo vo OJ r-l m
P o •k »k «k •k ©k ©k
O o r-l ca •v· trv VO
<í to •v to VO o- i—1 to
H
P ir\ r-l ©k «h 0- ©k O •k m ©k
O H
tí VO IfA -e- VO n O
P/E 000 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + |
OJ t- r-l r-l VO r-l M-
8 •k o ·» •k o •k Ο- •k m •k
ΙΛ co VO νο r-l r-l co
Φ P 0- vo e n r-> CA
CO H ©k ©k •k ©k •k •k
>s n OJ M- IÍA M-
r-l O
•rl O 4-1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1
P O
O r-l ita CO 00 CA M-
e «=4 O ©k ©k •k •k ©k ©k
>» O -± O n O CM r-l
r-l OJ 04 Ca 00 o r-l Ca
Ή r-l r-l
K)
M tí \3 r-1 3 «0 3
T3 >» ca
O
JO e
o á
P r-t
Φ •a o
ε
O r-l
Ό
XD
P
MS
O
CX
N
O tí
CA r-l t- v· CA r-l •k
«* •k * •k •k 04
o 04 04 « •vť r-l
«a i + 1 + 1 + 1 + 1 + 1
CA ITA ir\ CA co •k r-l
M •k .. •k o •k
04 CA O o r-l %
r-l 00 CA CA r-l
x— Χ-»
íft ift &
•^x & **—* A.X*
>» 69
o
JO ε
o tí •H e
ε ji tí © >»
Ή tí Φ © P
K3 © 60 r-l >>
*rl tí P 60 O O. o
r-l P © O tí •ri o
XD © o tí -ri P .Ω
tí ε H •H ε tí 0
© JÍ tí © © O
tí O © 1 E-l tí
© H r-l OJ EM 5
Pj tí tíl O. a Pí P
Údaje jsou uvedeny v % výchozí hodnoty před injekcí jako průměrná hodnota Skupiny obsahovaly β zvířat, PTT = částečná thromboplastinová doba.
0--4
-XPříklad 7
Optimalizovaná exprese v E. coli
Ke zvýšení exprese byl dále klonován kódový řetězec pro K1K2P v plasmidu při větěím počtu kopií. K tomuto účelu byl využit plasmid pePa 126.1t popsaný v NSR patentové přihláěce č. 39 3l 933.4. Tento plasmid je v podstatě tvořen z vektoru JjKK223-3 a kódového řetězce pro t-PA, jak je uvedeno v evropském patentovém spisu č. 242 835.
Do tohoto plasmidu se nejprve zařadí řetězec fd-terminátoru. X tomuto účelu se plasmid $ePa
126.1 linearizuje působením enzymu Hind TU. Takto rozštěpený plasmid se dělí elektroforézou na gelu. Plasmid pLBUl, popsaný v publikaci Gentz a dalším (l98i) PNAS 78(8) : 4963 se rozštěpí rovněž enzymem Hind HT a fragment s obsahem přibližně 360 bp s obsahem fd-terminátoru se získá v čisté formě elektroforšzou na gelu s následnou elucí. Linearizovaný plasmid pePa 126.1 a fragment z plasmidu pLBUl po štěpení enzymem Hind Til o velikosti 360 bp se naváží. Vazná směs se kotransformuje plasmidem pUBS 500 v E. coli DSI 2i02 podle svrchu uvedené patentové přihlášky. Ze získaných klonů se izolují ty klony, které obsahují požadovaný výsledný plasmid pePa 126 fd, který se od výchoΪ'Ι
- Mzího plasmidu pePa 126.1 liší také tím, že obsahuje druhé místo působení enzymu Hind III,
Z plasmidu pePa 126 fa se získají dva fragmenty. Jeden fragment BamHI/PvuI o velikosti
3,4 kb a druhý fragment Pvul/Xmal o 1,3 kb. Oba uvedené fragmenty se váží na fragment z plasmidu pA33 po štěpení BamHI/Xmal o velikosti 1,6 kb a transformují spolu s plasmidem pUBS 500 v E. coli. Výslednému plasmidu byl přiřazen název pA33 fd, který se liší od plasmidu pePa 126 fd tím způsobem, že při štěpení enzymu EcoRl druhý nejkratší fragment z plasmidu pePa 126 fd je z původní délky 6l0 bp zkrácen v plasmidu pA33 fd o přibližně 250 bp.

Claims (14)

  1. NÁROKY
    1. Derivát tkáňového aktivátoru plasminogenu t-PA s následujícím neglykosylovaným řetězcem aminokyselin:
    M
    J/Ú. j ÍNlSVjA CH řjAf'S ΛΚ QMd qvy c.
    ř
    9 6 X L 0 i ,Á‘ | οτέοα K/Z i Z i\0
    Ser Tyr Gin Val Ile 5 Asp Thr Arg Ala Thr . 10 Cys Tyr Glu Asp Gin 15 Gly Ile Ser Tvr Arg 20 Gly Thr Ser Thr 25 Ala Glu Ser Gly Ala 30 Glu Cys Thr Asn Trn 35 Asn Ser Ser Ala Leu 40 Ala- Gin Lys Pro 45 Ser Gly Arg Arg Pro 50 Asp Ala Ile Arg Leu 55 Gly Leu Gly Asn His 60 Asn Tyr Cys Aru Asn 65 Pro Asp Arg Asp Ser 70 Lys Pro Trp Cys Tvr 75 Val ρ Ηθ Lys Ala Glv 80 Lys Tyr Ser Ser Glu 35 Phe Cys Ser Thr Pro 90 Ala Cys Ser Glu Glv 95 Asn Ser Asp Cys Tvr 100 Phe Gly Asn Gly Ser 105 Ala Tyr Arg Gly Thr 110 His Ser Leu Thr Glu 115 Ser Gly Ala Ser Cvs 120 Leu Pro Trp Asn Ser 125 Met lis Leu Ile Gly 130 Lvs Val Tyr Thr Ala 135 Gin Asn Pro Ser Ala 140 Gin Ala Leu Gly Leu 145 Gly Lys His Asn Tyr 150 Cys Arg Asn Pro As o 155 Gly Asp Ala Lys Pro 150 Trp Cys His Val Leu 165 Lys Asn Arg Arg Leu 170 Thr Tr? Glu Tyr Cys 175 Asp Val Pro Ser Cys 130 Ser Thr Cys Gly Leu 135 Arg Gin Tyr Ser Gin 190 Pro Gin
    - X -
    Phe Arg Ile 195 Lys Gly Gly Leu Phe 200 Ala Gin Ala 210 Ala Ile Phe Ala Lys 215 His Arg Leu 225 Cys Gly Gly Ile Leu 230 Ile Ser Ser His Cys Phe Gin Glu 245 Arg Phe Pro Pro Gly Arg Thr Tvr 260 Arg Val Val Pro Gly 265 Val Glu Lys 275 Tyr Ile Val His Lys 280 Glu Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys
    290 295
    Gin 305 Glu Ser Ser Val Val 310 Arg Thr Val Gin Leu Pro Asp Trn 325 Thr Glu Cys Glu Glu Ala Leu Ser 340 Pro Phe Tyr Ser Glu 345 Arg Leu Tvr 355 Pro Ser Ser Arg Cys 360 Thr Thr Val 370 Thr Asp Asn Met Leu 375 Cys Ala Pro 385 Gin Ala Asn Leu His 390 Asp Ala Cys Leu Val Cys Leu Asn 405 Asp Gly Arg Met Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp
    420 425
    Asp Ile Ala Ser 205 His Pro Trp Arg Ser Pro 220 Gly Glu Arg Phe Cys Trp 235 Ile Leu Ser Ala Ala 240 His 250 His Leu Thr Val Ile 255 Leu Glu Glu Glu Gin Lys 270 Phe Glu Phe Aso Asp Aso 285 Thr Tyr Aso *» Ser Asp Ser 300 Ser Arg Cys Ala Cys Leu 315 Pro Pro Ala Asp Leu 320 Leu 330 Ser Gly Tyr Gly Lvs 335 His Arg Leu Lys Glu Ala 350 His Val Ser Gin His Leu 365 Leu Asn Arg Gly Asp Thr 380 Arg Ser Gly Gly Gin Gly 395 Asp Ser Gly Gly Pro 400 Thr 410 Leu Val Gly Ile Ile 415 Ser Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys
    430
    7al Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 435 440 445
    - m -PA
  2. 2. Řetězec DNA, který je kódem pro derivát t podle nároku 1, a je možno jej vyjádřit následujícím vzorcem;
    ATGTCTTACCAAGTGATCGATACCAGGGCCACGTGCTACGAGGACCAGGGGATCAGCTAC
    AGGGGCACGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGCCGAG7GCACCAACTGGAACAGCAGCGCG
    TTGGGGCAGAAGCCGTACAGCGGGGGGAGGGCAGACGGCATCAGGGTGGGGCTGGGGAAC
    CACAACTACTGCAGAAACCCAGATCGAGACTCAAAGGGCTGGTGCTACGTCTTTAAGGCG
    GGGAAGTACAGCTCAGAGTTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTCTGAGGGAAACAGTC-ACTGC
    TACTT7GGGAATGGG7CAGCGTACCGTGGCACGCACAGCC7CACCGAGTCGGG7GGC7CG
    TGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACGCCAGT ' GCGGAGGGACTGGGGGTGGGCAAACATAATTACTGGCGGAATCGTGATGGGGATGGGAAG CCC7GG7GCCACG7GČTGAAGAACCGCAGGGTGACG7GGGAGTACTG7GATG7GGGG7GG TGGTCGACCxGCGGCGTGAGACAGTACAGCCAGGGTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTG TTCGGGGACATCGCG7GGCACGCCTGGGAGGCTGCGATCT7TGCCAAGCACAGGAGG7GG CGCGGAGAGGGGTTCGTGTGGGGGGGGATACTCATCAGGTGGTGGTGGATTCTCTGTGGG GCCCAC7GCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGG7GATCTTGGGCAGAACA TACCGGGTGGTCCGTGGGGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTGGAAAAATACATTGTCGAT AAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGGTGGTGGAGGTGAAATGGGAT TCGTCCCGC7GTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTG7GTGCCTTCCCCCGGCGGAC
    CTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTG TCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGC TGCACATCACAACAT7TACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGC7GTGTGCTGGAGAC ACTCGGAGGGGGGGGGCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGGCAGGGCGATTGGGGAGGG CCCGTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGGATCATCAGCTGGGGGCTG GGGTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGG7TAGCAACTACCTAGACTGG ATTCGTGAGAACATGCGACCG 1341 \ o
    - x
  3. 3. Způsob výroby plasmidu pro expresi s obsahem kódového řetězce pro tkáňový aktivátor plasminogenu, vyznačující se tím, že se řetězec DNA, který je kódem pro bílkovinu t-PA nebo její derivát, obsahující kromě oblastí Kringel I, Kringel II a oblasti pro proteázu ještě další úseky této bílkoviny EGF a Finger uloží do plasmidu a řízenou mutagenesí se odstraní ty oblasti, které jsou kódem pro aminokyseliny, neobsažené v derivátu t-PA podle nároku 1.
  4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se jako řetězec DNA pro bílkovinu t-PA nebo její derivát užije příslušná cDNA.
  5. 5. Způsob výroby derivátu t-PA podle nároku 1, vyznačující se tím, že se plasmid, získaný podle nároku 3, uloží do cílových buněk a produkt exprese se izoluje ze živného prostředí nebo po rozrušení z uvedených buněk.
  6. 6. Způsob podle nároku 5,vyznačující se t í m , že se jako produkční buňky užijí prokaryotické buňky, zejména E. coli.
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se ke zvýšení výtěžku účinné bílkoviny oddělí inkluzní tělíska, tato tělíska se solubilizují působením guanidinhydrochloridu, derivatizují působením oxidovaného glutathionu, načež se derivát t-PA renaturuje přidáním L-argininu a glutathionu.
  8. 8. Způsob podle nároků 3 až 7, vyznačuj í c í se t í m , že se po renaturacl derivát ‘t-PA v renaturační směsi koncentruje a pak se čistí chromatografií při použití afinitní chromatografie.
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se výsledný materiál chromatograficky čistí na sloupci ETI-absorpčního materiálu.
  10. 10. Způsob podle nároků 3 až 9,vyznačující se t í m , že se postup provádí za přítomnosti 25 až 1000 mmol/1 L-argininu.
  11. 11. Způsob podle nároků 3 až 10, vyznačuj ící se t í m , že se k chromatografíckému čištění užije koncentrát reaktivované směsi, který obsahuje 25 až 1000, s výhodou 200 až 1000 mml/1 L-argininu a čištění se provádí chromatograficky na sloupci Erythrina-trypsin-inhibitor <ETI| -absorpčního materiálu.
  12. 12. Způsob podle nároku 11,vyznačující se tím, že se koncentrát, určený k chromatografíckému čištění upraví na pH větší než 7,0.
  13. 13. Způsob podle nároků 3 až 12, vyznačuj íc í se t í m , že se eluce chromatografického sloupce provádí při pH 4 až 5.
  14. 14. Prostředek k rozpouštění krevních sraženin, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje derivát t-PA podle nároku 1..
    d \
    ADVOKÁTKA
    2o
    0BR.1
    ΛΛ3Γ90ν
    ,. ,.ί, j i /N λ Λ O 3 « ΐ ován j „-u._^
    0 6 . Λ G ε ' •q§o?
    ? 8 8 í- Z O
    5'TACCAAGTGATC GAT ACC AGG GCC 3\
CS902676A 1989-05-31 1990-05-30 Derivát tkáňového aktivátoru plasminogenu, kódový řetězec, způsob výroby derivátu, způsob výroby plasmidu a prostředek k rozpouštění krevních sraženin CZ282035B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3917781 1989-05-31
DE3923339A DE3923339A1 (de) 1989-05-31 1989-07-14 Gewebs-plasminogen-aktivator-derivat

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ267690A3 true CZ267690A3 (en) 1997-04-16
CZ282035B6 CZ282035B6 (cs) 1997-04-16

Family

ID=25881452

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS902676A CZ282035B6 (cs) 1989-05-31 1990-05-30 Derivát tkáňového aktivátoru plasminogenu, kódový řetězec, způsob výroby derivátu, způsob výroby plasmidu a prostředek k rozpouštění krevních sraženin

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0400545B1 (cs)
JP (1) JPH0327286A (cs)
AT (1) ATE119940T1 (cs)
AU (1) AU623781B2 (cs)
CA (1) CA2017636C (cs)
CZ (1) CZ282035B6 (cs)
DD (1) DD300109A5 (cs)
DE (2) DE3923339A1 (cs)
ES (1) ES2070210T3 (cs)
FI (1) FI101475B1 (cs)
HU (1) HU216870B (cs)
IE (1) IE66006B1 (cs)
IL (1) IL94539A (cs)
NO (1) NO902405L (cs)
NZ (1) NZ233796A (cs)
PT (1) PT94227B (cs)
ZA (1) ZA904089B (cs)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3942144A1 (de) * 1989-12-20 1991-06-27 Boehringer Mannheim Gmbh Stabilisierung von k1k2p pro
US6027888A (en) * 1996-04-05 2000-02-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide-bond containing eukaryotic proteins in bacterial cells

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX197183A (es) * 1982-05-05 1994-02-28 Genentech Inc Activador de plasminogeno de tejido humano
FR2594845B1 (fr) * 1986-02-21 1989-12-01 Genetica Preparation par voie microbiologique de l'activateur tissulaire humain du plasminogene (t-pa) et conversion de l'enzyme ainsi obtenue en sa forme active
DE3643158A1 (de) * 1986-04-21 1987-11-19 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogen-aktivator(tpa) - derivat und seine herstellung
FI100106B (fi) * 1986-12-05 1997-09-30 Novartis Ag Menetelmä plasminogeenin yksisäikeisen yhdistelmäaktivaattorin valmist amiseksi
IL87276A (en) * 1987-08-03 1995-07-31 Fujisawa Pharmaceutical Co Analog of a tissue plasminogen activator containing the Pringle 2 and protease regions only, DNA encoding it, processes for its preparation, and pharmaceutical preparations containing it
US5094953A (en) * 1988-03-21 1992-03-10 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator variants
DE3903581A1 (de) * 1989-02-07 1990-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogenaktivator-derivat

Also Published As

Publication number Publication date
AU5600990A (en) 1990-12-06
DE59008693D1 (de) 1995-04-20
HU903267D0 (en) 1990-10-28
ZA904089B (en) 1991-03-27
JPH0327286A (ja) 1991-02-05
IE901848L (en) 1990-11-30
EP0400545B1 (de) 1995-03-15
HUT54734A (en) 1991-03-28
AU623781B2 (en) 1992-05-21
IL94539A (en) 1996-08-04
DD300109A5 (de) 1992-05-21
EP0400545A1 (de) 1990-12-05
DE3923339A1 (de) 1990-12-06
NO902405L (no) 1990-12-03
CA2017636A1 (en) 1990-11-30
FI902700A0 (fi) 1990-05-30
IL94539A0 (en) 1991-03-10
PT94227A (pt) 1991-02-08
ATE119940T1 (de) 1995-04-15
IE66006B1 (en) 1995-11-29
NZ233796A (en) 1992-07-28
PT94227B (pt) 1997-01-31
FI101475B (fi) 1998-06-30
FI101475B1 (fi) 1998-06-30
CZ282035B6 (cs) 1997-04-16
NO902405D0 (no) 1990-05-30
HU216870B (hu) 1999-09-28
ES2070210T3 (es) 1995-06-01
CA2017636C (en) 2000-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5223256A (en) Thrombolytically active non-glycosylated protein
JP5025868B2 (ja) 可逆的に不活性な酸性化プラスミン組成物の調製法
JP2631645B2 (ja) 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物
JP2014129354A (ja) 延長されたｆｉｘアナログ及び誘導体
HU217101B (hu) Javított fibrinolitikus tulajdonságokkal és thrombingátló hatással rendelkező bifunkciós urokinázvariánsok
CZ267690A3 (en) Derivative of plasminogen tissue activator, code chain, process for preparing such derivative, process for preparing a plasmid and preparation for dissolving blood thrombi
EP0666920B1 (en) Thrombin activatable plasminogen derivatives
IE913070A1 (en) Novel compounds
JPH08231594A (ja) 繊維素溶解性の血液凝固阻害性質を有するたん白質
US5908625A (en) Use of the protease domain of human plasminogen activator for the treatment of thromboembolic diseases
KR20000029755A (ko) 트롬빈에의해활성화될수있는플라스미노겐활성화제
Browne et al. Protein engineering and comparative pharmacokinetic analysis of a family of novel recombinant hybrid and mutant plasminogen activators
EP0796323A1 (en) Use of the protease domain of human plasminogen activator for the treatment of thromboembolic diseases
JPH01160481A (ja) 新規なポリペプチド、その製法及び用途

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20030530