JPH0327286A - 組織プラスミノーゲン活性化因子の誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業七の利用分野） 本発明は、新規なｔ−ＰＡ誘導体、該新規な１−ＰＡ誘
導体をコードするＤＮＡ配列、該１−ＰＡ誘導体をコー
ドするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドおよび該プラス
ミドの製造方法、 ！＝ＰＡ誘導体の産生方法、ならびに該ｉＰＡ誘導体を
含有する血餅溶解用薬物に関する。

（従来の技術） 凝固した血岐は、タンパクマトリノクスの主成分である
高分子フィブリン（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　ｆｉｂｒｉｎ
）を含有する。フィブリンは、血液凝固におけると同様
の反応力スケード中のフィブリン溶解ンステムによって
生理学的条件下で溶解きれる。このカスケードの中心的
な反応は、ブラスミノーゲンのブラスミンへの活性化で
あり、これは、例えば組織ブラスミノーゲン活性化因子
ｔ．−ＰＡによクて媒介される。次に、ブラスミンは、
凝固した血液のタンパクマトリックスの主或分であるフ
ィブリンを溶解する。天然１−ＰＡまたは遺伝子工学に
よって真核生物から得られたｔ−ＰＡの酵素活性、ずな
わち、ブラスミノーゲンのブラスミンへの触媒活性化は
、フィブリンまたはフィブリノーゲン開裂生戒物の非存
在下では、非常に低いが、これらのタンパクの存在下で
は実質的に、すなわち■０倍以」二も増大し得る。

ｔ−ＰＡは、血液中に存在するプロテアーゼによってＡ
鎖およびＢ鎖に開裂される。両鎖の一部は、システイン
架橋を介１，て結合されたまま残る。

ｔ一ＰＡの活性を刺激ｔる能力は、他の公知のブラスミ
ノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはス１
・レブトキナーゼ［例えば、エム・ホイレルツ（Ｍ　．
　Ｈ　ｏｙ　ｌａｅｒｔｓ）ら、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリ−（Ｊ　．　Ｂ　ｉｏｌ．　
Ｃｈｅ鴎，）２５７　（１９８２）、２９１２−２９１
９　：ダブリス・ノイヴユンホイツエン（Ｗ．　Ｎ　ｉ
ｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ）ら、ビオシミ力・エト・ビオ
フィジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ｅｔ　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓｉｅａ　Ａｅｔａ）、７５５　（１９８３）、５
３１−５３３参照］と比べて有意に優れている。

インビボでのＬ−ＰＡの作用のメカニズムは、例エハ、
フルニゲル（　Ｋ　ｏｒｎ　ｉｇｅｒ）およびコレン（
Ｃｏｔ　ｔｅｎ）、トロンボウシス・ヘモスタシス（Ｔ
ｈｒｏｍｂ．１１ｊｉＩｌｏｓｔａｓｉｓ　４６　（１
９８１）、５６ｌ−５６５）に開示されている。このフ
ィブリン表面上での酵素活性が、ｔＰＡを病的脈管閉塞
（例えば、心筋梗塞）の治療に適した薬物としており、
臨床的な試行によって広範に確認された「コレン（Ｃｏ
ｌｌｅｎ）ら、サーキュレーション（Ｃ　ｉｒｃｕｌａ
ｔｉｏｎ）　７０　（１９８４）、１０１２　：サーキ
ュレーション７３　（１９８６）、５１１］。

（発明が解決ｌ７ようとする課題） しかし、ｔ−ＰＡの欠点は、その血漿濃度が迅速に減少
することである（クリアランス速度）。そのＩ．ｌＩ果
、血栓の有効な溶解を行うためには比較的多量のＬ−Ｐ
Ａが必娑である。他方、高い治療量を用いると、例えば
出血のような副作用が生じる。

ｔ−ＰＡの自然分解産物は、ＥＰ　　０　　１９６　　
９２０に開示されており、これは、ｔ−ＰＡのクリング
ル（ｋｒｉｎｇｌｅ）　２ドメインおよびプロテアーゼ
ドメインを含有しているだけであり、そのＮ一末端アミ
／酸は、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　３０１　（１９
８３）、２１４−２２１においてベンニカ（　Ｐ　ｅｎ
ｎｉｃａ）らによって開示されているアミノ酸配列のア
ラニン１６０である。しかし、このｔ−ＰＡ分解産物の
クリアランス速度は、天然ｔ−ＰＡのクリアランス速度
とは有意には異なっていない。この改善は、保護基の結
合を介して触媒ドメインの化学的修飾によって達成し得
るだけである。

したがって、本発明の目的は、得られた誘導体のクリア
ランス速度が非常に減少し、その結果、血漿中の半減期
が一層長くなるようにｔ−ＰＡを修飾することである。

この方法においては、血栓を溶解する能力およびフィブ
リンによって刺激される能力は保持すべきである。

（課題を解決するための手段） 本発明は、グリコシル化されておらず、下記アミ／酸配
列： （Ｍ） Ｓ＠ｒ　？ｙｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｎ　　工１＠　八ｓｐ　
Ｔｈｒ　ｋｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　？ｙｒ　Ｇ１
＋ａ　八ｓｐ　Ｇｉｎ　Ｇｌ■ Ｘｌｍ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｎ　’ｒｙｒ　Ｔｈｒ　
Ａｌａ　Ｇ）、ｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ａｌａ　
Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌｓｕ　Ｇ撃■ １３０　　　　　　　　　　　　　　　１３５　　　　
　　　　　　　　　　　１４ＧＬｓｕ　Ｇａｙ　Ｌｙｓ
　Ｈｌｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　ｌ：ｙｓ　Ａｚｇ　Ａｓｎ
　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｙｅ　
Ｐｒ■ Ｐｈ＠　Ａｒｇ　　１：ｌ＠　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　Ｇｌ
ｙ　　Ｌａｕ　　Ｐｈｓｉ　λｌａ　Ａｓｐ　　丁ｉｓ
　　Ａｌａ　　Ｓａｒ　　８Ｐ、ｓ　　Ｐｒｏ　丁ｒｐ Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｘｌｓｉ　Ｐｈ僚Ａｌａ　Ｌ
ｙｓ　ｌｉｉｓ　Ｉ％ｘｑ　Ａｒｇ　ｇｅｒ　Ｐｒｏ　
Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｐ■■ １＠ｕ　（：ｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　　ＩＩ＠　Ｔａａ
ｕ　　Ｘｉ＠　Ｓｉｒ　Ｓａｒ　Ｃｙｓ　テｒＰ　　工
１ａ　Ｌａｕ　　Ｓｅｒ　Ａ撃＝八１ａ ＋１１ｓ　ｅｙｓ　Ｐｈ＠Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｗ
ｈｏ　Ｐｒｏ　’Ｉｈ：ｏ　Ｈｊ．ｓ　Ｍｉｓ　Ｘａ＊
ｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＸｉｓＬｅｕ Ｇｕｙ　Ａｒｇ　テｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　　
Ｖａエ　Ｐｒｏ　Ｇｕｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　
　Ｇｉｎ　　Ｌｙｓ　　Ｐ１刀磨　Ｇｌｕ Ｖａｌ　Ｇｌｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔ’ｙｒ　Ｉｌｓ　Ｖａ３
、Ｈｉｓ　Ｌｙｅ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　
Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａ唐■ ２７５　　　　　　　　　　　’　　２８０　　　　　
　　　　　　　２８５ｋｅｎ　Ｊｋｓｐ　！ｌ＠　Ａｌ
ａ　Ｌｓｕ　Ｉ，＠ｎ　Ｇｌｒｉ　！ａｎ　Ｌｙｓ　Ｓ
＠ｔ　Ａｓｐ　ｌｉａｒ　Ｓｓｒ　Ａｒｇ　ＣｙｓＪｕ
ａ Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｓａｙ：　Ｓｉｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　
Ａｒｇ　Ｔｈｙ：　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌｓｕ　Ｐｒｏ　
Ｐｒｏ八ｌａ　ＡＩＩＩＰ　ｋａｕ Ｒ２Ｇ Ｇｉｎ　ＴＡｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　？ｒｐ　？ｈｒ　Ｇ
ｌｕ　Ｃｙａ　Ｇｌｕ　Ｌ＠ｕ　Ｓｓｒ　Ｇｌｙ　’１
７ｒ　Ｇｕｙ　Ｌｙｓ　ｔ！奄■ Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ｌ＠ｕ　　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　　Ｐ
ｈ＠　？ｙｒ　　Ｓ＠ｔ　Ｇｌｕ　轟ｒｇ　Ｔａａｕ　
　Ｌｙｓ　　Ｇｉｕ　Ａｌａ　Ｒｉｍ　　Ｖａ見 ３４０　　　　　　　　　　　　３４５　　　　　　　
　　　　　３５ＧＡｒｇ　Ｌ＠ｕ　？ｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓ
＠ｒ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓテｈｒ　！＊ｒ　Ｇｌｓ
　Ｉｌｉｓ　ｋｕ　Ｌ仙Ａｓｎ　ＡｒｇＴｈｒ　Ｖａｎ
　　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　）ｌ＠ｔ　Ｉａｕ　Ｃｙ
−　轟１ａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　丁ｈｒ　Ａｒｇ　　Ｓｅ
ｒ　Ｇｌｙ　ｆｌｙ ３７０　　　　　　　　　　　　３７５　　　　　　　
　　　　　３８ＧＰｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｊｕｎ　Ｌ
ｓｕ　ｉｌｉｓ　ＪＩＪＰ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　
Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｓｓｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐ窒■ ３８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３９０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　コ９５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　Ｓ００ Ｌａｕ　％Ｆａｌ　Ｃｙｍ　Ｌ＠ｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　
Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｎｓｔ　？ｈｒ　Ｌ軸Ｖａｎ　Ｇｌｙ
　ＩＩｓ　ＸＬ＊　Ｓｉｒ？ｒｐ　Ｇｕｙ　Ｌａｖ　Ｇ
ｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｌｙｅ＾ｓｐ　Ｖａｌ
　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｎ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＬｙｓＶ
ａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　ＴＹＴ　Ｌ＠ｕ　ＡＩＩＰ　Ｔ
ｒｐ　　Ｘｉｓ　ｋｇ　＾ｓｐ　ｋｎ　Ｍａｔ　Ａｒｇ
　　Ｐｒｏからなることを特徴とする組織ブラスミノー
ゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ誘導体、実施例ではＫＩＫ２
Ｐとも記す）を提供することである。

驚くべきことに、天然ｔ−ＰＡに存在する他のドメイン
の欠失は、タンパクの血栓崩壊性効力に対する効果がな
く、突然変異夕冫バクのフィブリン依存の刺激性は天然
ｔ＝ＰＡＯものと同じであるこεが確認された。

さらに、本発明は、本発明のＬ−ＰＡ誘導体をコードし
、かつ下記配列： を含むＤＮＡ配列を提供するものである。

本発明のＤＮＡ配列は発現プラスミド上に存在させて、
本発明のｔ．　−　Ｐ　Ａ誘導体を発現きせるために用
いる。このような発現プラスミドも、本発明の他の態様
であり、本発明のｔ−ＦＡＸ導体をコードする他のＤＮ
Ａ配列を有する発現プラスミドも同様である。遺伝暗号
の変形により前記のＤＮＡ配列と異なった配列がこの目
的に適している。

複製起源は別として、ｔ−ＰＡ誘導体をコードしている
配列のほかに、発現プラスミドは、好ましくは、調節き
れたプロモーター構造（例えば、ｔａｅプロモーター）
、効果的なターミネーター（例えば、ｃｄ）、および選
択マーカー（例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子）をも含
んでいる。

また、本発明は、プラスミドｐＡ３　３を提供するもの
である。このプラスミドの製造方法を実施例１に記載す
る。該プラスミドは本発明のｔ−ｐΔ誘導体をコードし
ているＤＮＡ配列を含んでいる。

さらに、本発明は、本発明のｔ．−ＰＡタンパクをフー
ドするＤＮＡ配列、またはクリングル！、クリングル■
およびプロテアーゼドメインに加え、ｔ−ＰＡタンパク
の他の領域を含んでいるその誘導体をプラスミド中に取
込み、本発明のｔ−ＰＡ誘導体中に存在しないアミノ酸
をコードするドメインが特定部位の突然変異誘発によっ
て欠失されることを特徴とする本発明の発現プラスミド
のうちの１つの構築方法を提供するものでもある。

本発明のｔ−ＰＡ誘導体をコードしているＤＮＡ配列を
取込ませようとするプラスミドの選択は、該誘導体を発
現するのに後に用いられる宿主細胞に依存する。適当な
プラスミドおよびこのようなプラスミドに関する最小限
の要求（例えば、複製起源、制限部位）は、当業者に公
知である。本発明では、プラスミドの代わりに、コスミ
ド、ファ一ジの複製２本鎖型（λ、Ｍ１３）、および当
業者に公知の他のベクターを使用することができる。

特定部位の突然変異誘発の方法は、モリナガ（Ｍｏｒｉ
ｎａｇｑ）らによってバイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ）　２１，　（１９８４）、６３４に
開示されており、実質的に開示のとおりに行われる。

また、本発明は、本発明のプラスミドのうちの１つを適
切な宿主細胞中で発現させ、培養し、所望により、宿主
細胞の溶解の後に該溶解が行われた液体（例えば、緩衝
液または培養培地）から産生物を単離することを特徴と
する本発明のｔ，ＰＡ誘導体の産生方法を提供するもの
でもある。本発明のｌ−ＰＡ誘導体を産生ずるために宿
主細胞として原核細胞を使用するのが好ましい。これに
関して、まず、この工程の間に可溶性細胞粒子から形成
される、いわゆる「封入体」（不溶性タンパク凝果物）
を分離し、グアニジン・塩酸塩による処理によってｔ−
ＰＡを含有する封入体を可溶化し、次いで、酸化型グル
タチオンによって誘導し、最後に１７−アルギニンおよ
びグアニジン・塩酸塙の添加によってｔ−ＰＡ誘導体を
復元することが特に好ましい。例えば、ヨーロソバ特許
出願明細書ＥＩＡ　０　　２１９　　８７４およびＥＰ
−Ａ　Ｏ２４１　　０２２には、「封入体」由来のｔ，
−ＰＡの活性化に関する厳密な指示が開示されている。

しかし、本発明の、封入体由来の活性タンパクの単離に
関する他の方法を用いることもできる。

本発明の方法は、特に２５〜１０００ミリモル／ｇの濃
度のＬ−アルギニンの存在下で行うのが好ましい。

アフィニティークロマ］・グラフィーによる本発明の異
種タンパクの除去は、ＥＴＩ（エリトリナ・トリブシン
阻害薬）吸着カラムによって行うのが好ましい。ＥＴ［
は、例えば、ＢｒＣＮ−セファロースのような担体物質
（吸青剤）−Ｌに固定化される。ＥＴＩ吸青カラムによ
る精製は、０．８モル／籾ものアルギニンのような高濃
度のアルギニンの存在下でさえ、濃縮された再酸化調製
物をＥＴ■吸着力ラム物質に直接負荷することができる
どいう長所を有している。この方法では、２５ミリモル
／Ｑ以下の低いアルギニン濃度で生じ得るｐｔ−Ｐ　Ａ
の凝集が回避される。したがって、０２〜１．０Ｍ，好
ましくは０．５〜ｌ．ＯＭアルギニンの存在下、ＥＴ［
吸ｄカラムによってｐ−ｔ−ｐＡ調製物の精製を行うの
が特に好ましい。この方法で、Ｋ　Ｉ　Ｋ　２　Ｐ／Ｐ
ｒｏを含有ずる溶液は、好ましくはｐＨ６．５以上、特
に好ましくはｐＨ７以上である。

ＥＴＩ力ラムからの溶離は、原核生物中で発現されたｔ
−ｉ’　Ａを良好に溶解させる条件下、アルギニンの存
在下、ｐＨを低ドさせることによって行われる。溶離の
間のｐＨは、酸性領域であるのが好ましく、特に好まし
くは４〜６の範囲である。

本発明によって産生されたＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏの調製物
は、＞０．４Ｘ　１０８ＩＩＪ／ｍ９、好ましくは＞ｏ
．ｅＸ　１　０＠ｌＵ／即のｔ−ＰＡ比活性を有してお
り、フィブリン開裂生成物による・二の刺激性（フィブ
リノゲンベブチド存在下での活性／フィブリノゲンベブ
チド非存在下での活性）は、１０倍以Ｅ，好ましくは２
０倍以−Ｌである。本発明の調製物の純度は、９０％以
上、好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以−
１二である。

したがって、本発明のｔ−ＰＡ誘導体は、本発明の他の
態様である血餅溶解用薬物において用いるのに特に適し
ている。

以下の実施例および添付した図面によって、本発明をさ
らに詳しく説明する。

（実施例） 友鞭１生１ プラスミドｐＡ３３の構築 出発プラスミドとしてヨーロッパ特許出願明細書ＥＰＡ
　　Ｏ　　２４２　　８３６に開示されているプラスミ
ドｐｅＰａｌ３３を用いた。特異的な突然変異誘発、す
なわちｐｅＰａ１３３からドメインＦおよび屁の欠失に
関する全ての実験工程（第１図参照）は、本質的に、モ
リナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ）ら「バイオテクノロジー（
Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｉｅ）　２１　（１９８４）
、６３４］の方法を用いて行った。このため、ｐｅＰａ
ｌ３３から２つの開裂調製物を調製ｌ７た。調製物Ａは
、ＥｅｏＲＩで開裂させ、最大フラグメントを単離した
。調製物Ｂは、ＸｈｏＩで開裂させた。この方法では、
生成物は線形であった。ヘテロ２本鎖形成のために下記
オリゴヌクレオチド：５’　ＴＡＣ　ＣＡＡ　ＧＴＧ　
ＡＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＣ　ＡＧＧ　ＧＣＣ　　３’を用
いた。所望のプラスミドｐＡ３３を含むクローンを、−
Ｌ記突然変異誘発のオリゴヌクレオチドを用いるコロニ
ーハイブリンド法によって判定した。このプラスミドは
制限分析によって特徴付けられており、フィンガードメ
イン（４ｉｎｇｅｒ　ｄｏｍａｉｎ）をコードするｔ−
ＰＡ発現カセットの部分に位置するＳｓｐｌ制限開裂部
位の非存在について検査した。

実施例２ イー・コリ（Ｅ．ｅｏｌｉ）由来活性Ｋ　Ｉ　Ｋ　２　
Ｐ／Ｐｒｏ調製物 ａ）細胞溶解および封入体（ＩＢ’ｓ）の調製プラスミ
ドｐＡ３３によって形質転換された湿重量１．６ｋ９の
細胞（イー・コリ、ＤＳＭ　３６８９）を、ｏ．ｉモル
／Ｑ　トリス（Ｔｒｉｓ）−１−｛ＣＬ　２０　ミ’）
　モｔｋ／Ｑ　ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）ｌ（Ｎ２に４°
Ｃで懸濁させた。これにリゾチ・−ム２．５ｇを添加し
、４°Ｃで３０分間インキュベー］・シた；その後、高
圧分散によって完全な細胞溶解を行った。０．１｛−ル
／１２　｝　’Ｊ　７．　一Ｈ　Ｃ（１，　２　０　ミ
リモル／Ｑ．ＥＤＴＡ，６％トリトン（ＴｒｉＬｏｎ）
　Ｘ　１　０　０および１．５モル／Ｑ　ＮａＣ（！（
ｐＨ　６．　５）５（を添加して溶解産物溶液と混合ｌ
７、４℃でさらに３０分間インキュべ−ｌ−Ｌた。この
後、封入体（ＩＢ’ｓ）を遠心分離によって分離した。

ベレットを０．１モル／Ｑ１・リスーＨＣｆ２，２０ミ
リモル／Ｑ．ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）’１　０（２に懸
濁させ、４℃で３０分間インキユベートし、次いで、Ｉ
Ｂ−調製物を遠心分離によって単離した。

ｂ）ＩＢ’ｓの可溶化 ０．１ＭトＩＪス、６Ｍグアニジン、Ｏ．ｌＭＤＴ　Ｅ
　（ｐＨ　７．　５）　］．　Ｏ　Ｏｘ（ｌに［　Ｂ’
ｓ　８．７ｇ（４重電）を懸濁きせ、２５℃で３０分間
撹拌した。

Ｈ（Ｊ（２５％）でｐＨを３に調節した後、該溶ｔ夜を
４モル／０．グアニジン−ＨＣ（！（ｐＨ２．５）に対
して透析した（３Ｘ３ｆｆ、２４時間、４゜Ｃ）。

Ｃ）返導 上記透析物を、酸化望グルタチオン（ＧＳＳＧ）で５０
ミリモル／ｌ２に、１・リスで１００ミリモル／ｆ２に
調節し、５モル／ＣＮａＯＨでｐＨ値を７．５に滴定し
た。調製物を２５゜Ｃで９０分間インキユベートした。

ＨＣｌ２（２５％）でｐＨを３に調節Ｉ７た後、１０ミ
リモル／（ＩＨｃ（ｌに対して透析したく３ＸＩＯＯｆ
２，４８侍間、４゜Ｃ）。

ｄ）弔轄令 ｉｏ（の反応容藩に、０．８モル／１２　Ａｒｇ／ＨＣ
ｆ２（ｐＨ８．５）、ｌミリモル／ＱＥＤＴＡ，１ミリ
モル／ＣＧＳＨ（グルタチオン）を入れた。予め６モル
／ｉ２グアニジン−Ｈ　（Ｊ（ｐＨ　２．　５）に対し
て透析した誘導体１００ｍ＋２を、２０℃で２４時問お
きに３回添加することによって再結合を行った。

再結合の後、５０〜７５ＫＩＪ／ｚｖの比活性を有する
調製物を得た［エイチ・リル（Ｈ．Ｉ，　ｉｌｌ）（Ｚ
　．）（ｅｓａｍｔｅ　ｉｎｎ．　Ｍａｄ．　　ｉｈｒ
ｅ　Ｇｒｅｎｚｇｅｂ．　（１１８７），４２，　４７
８−４８６）による試験法］。

Ｃ）再結合調製物の濃縮 必要に応じて、再結合調製物を血液透析器によって濃縮
した。

実施例３ イー・コリ由来ＫＩＫ２ｐ／ｐｒｏの精製エリトリナー
トリブシンー阻害薬（ＥＴＩ）一セファロース上でのア
フィニティークロ゛７トグラフィーによってイー・コリ
由来ＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏの精？を行った。

再結合調製物を、血液透析器［アサヒ（Ａｓａｈｉ）Ａ
Ｍ３００］によって１：５に濃縮し、０．８モル／　（
ｌ　Ａ　ｒｇ／　Ｈ　Ｃ　ｆ２（ｐＨ　７．５）に対し
て一晩透析し、次いで、遠心分離１，た。透析物１．８
１２を、０４８モル／（ｌ　Ａｒｇ／ＨＣ（！（ｐＨ７
．５）で平衡にしたＥＴＩ〜セファロース力ラム（Ｘ２
０ｍ■に入レ［４カラム容量（ＣＶ）／時コ、２８０ｒ
＋ｉの吸光度が緩衝液のブランク値に達するまで緩衝液
（０．８モル／Ｑ　Ａｒｇ／ＨＣＩ２、ｐＨ７．５、０
．５モル／９ＮａＣので洗浄した。５ＣＶの０．３モル
／ｆｆＡｒｇ／ＨＣｆｆ（ｐＨ　７．　０）テ２度目の
洗浄をした後、０．３モル／Ｑ．Ａｒｇ／Ｈ（Ｊ（ｐＨ
４．５）で溶離を行った。

宜Ｆ−フィブ９ンによる刺激一フィブリン存在下での活
性／フィブリン非存在下での活性。

夾麹１ｍ４− 精製されたイー・コリ『｛１来ＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏの特
性 ａ）タンパクの特性 ＳＤＩ−ＰＡＧＥおよび逆相Ｈ　Ｐ　Ｌ　ＣＥＴＩ−−
セファロース上でのアフィニティークロ″７１・グラフ
ィーによって精製された調製物の等質性（ｈｏｍｏｇｅ
ｎｅｉｔｙ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび逆相１−ＩＰ
ＬＣ（ＲＩ”ＨＰＬＣ）によって示した。

＄ｌｔｉ製した物質の電気泳動分析における泳動の相対
距離から５　０　８　０　０　　Ｄａ±２０００Ｄａの
イー・コリ由来ＫＩＫ２Ｐに関する見かけ分子量を算出
した。比重分析によると純度〉９０％であった。

Ｒ　Ｐ　−　１−｛　１）　Ｌ　Ｃは、疎水性マトリノ
クスを有するタンパクの種々の相互作用に基づいた。こ
の性質は、純度を定量化する分析方法として用いられた
。

ｔｌｌｆ製したイー・コリ由来ＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏの分
析は、Ｉ−リフルオロ酢酸／アセ１・二１・リル勾配液
（緩衝液Ａ　：　Ｈ　ｔｏ　ｌ　０　０　０　ｚＱ中ｌ
・リフルオロ酢酸１．２ｘ（／：緩衝液Ｂ　：　［｛，
０　３　０　０＋Ｑ．、アセトニトリル７００肩Ｑ，　
　トリフルオロ酢酸１ｉ１２；Ｏ〜１００％｝を用いて
、ヌクレオジル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）３　００分離カ
ラム［ナウアー（　Ｋ　ｎａｕｅｒ）］上で行った。

クロマトグラフ分析の積分によって純度〉９５％が得ら
れた。

Ｎ一末端配列 標準プログラムおよびオンラインＰ　Ｔ　Ｈ検出を有す
るＡＢ＋　　４７０シークエンサーを用いてＮ末端アミ
ノ酸配列を決定した。決定された配列ＳＩＹ２−ＱＩＶ
４−１５−Ｄ６−Ｔ７−Ｒ８−Ａ９−Ｔ　１　０−Ｃ　
ｌ　ｌ　−Ｙ　１　２−Ｅ　１　３〜Ｄｌ４は、ＤＮＡ
配列から誘導された予想された配列と一致した。

ｂ）故快廻宏 エイチ・リル（Ｈ．Ｌｉｌｌ）（Ｚ．　ｇｅｓａｍｔｅ
　ｉｎｎ．　Ｍｅｄ．ｉｈｒｅ　Ｇｒｅｎｚｇｅｂ．　
（１９８７），　４２．　４７Ｌ４８６）に従って、イ
ー・コリ由来ＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏのインビトロ活性を測
定した。比活性（ＳＡ）は６５００００　　ＩＵ／ｘｇ
±２０００００　　１Ｕ／ｍｙであった。ＢｒＣＮ−−
フィブリノゲンフラグメントによるこの試験システムで
のイー・コリ山来ＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏの刺激性（フィブ
リノゲンフラグメント存在下の活性をフィブリノゲンフ
ラグメンｌ・非存在下の活性で割クた商）は、２５〜３
０であった。

Ｃ）フィブリンとのインビトロ結合 ヒギンズおよびベハー［ヒギンズ，ディー・エル（Ｈｉ
ｇｇｉｎｓ，　　Ｄ．Ｌ．）およびベハー，ジー・工一
（Ｖｅｈａｒ，　Ｇ．　Ａ．）、（１９８７）、バイオ
ケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ．　）　２６、７７８
６−７７９１４によって開示された方法に従って、ＫＩ
Ｋ２Ｐ／Ｐｒｏとフイブリンとのインビトロ結合を測定
した。

ＣＨＯ細胞由来ｔ−ＰＡと比較してＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏ
は、フィブリンとの有意な結合率を有していないことが
わかった。

実巖牲旦 ウサギにおけるＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏの薬物動力学ニュー
−ジーランド白ウザギにおいて、ＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏの
薬物動力学特性を、アクテイリセ（Ａｅｔｉｌｙｓｅ”
）［アルテブラーセ（Ａ　ｌｔｅｐｌａｓｅ）、１・一
メ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシ１レンクテル・ハフ
ツング（Ｔｈｏｍａｅ　ＧＩＩｌｂＨ）、ビベラソシュ
、ドイツ連邦共和国］の薬物動力学特性と厖較した。

両フィプリン溶解薬物を２０００００　　１Ｕ／ｋｇ体
重（ｈｖ）の用叡で１分間静脈内注射した。該注射の前
と該注射の後の所定時間に血漿試料を採取した。ジュイ
・エイチ・フェルハイエン（　Ｊ　．　Ｈ　．Ｖ　ｅｒ
ｈｅｉｊｅｎ）ら［トロンボウシス・アンド・ヘモスタ
シス（Ｔ　ｈｒｏｍｂ．　Ｈ　ａｅｍｏｓｔａｓ．　）
、４８、２６６、１９８２］の分光光度試験を、エイチ
・リル（Ｈ．　Ｌ　ｉｌｌ）（Ｚ．ｇｅｓ．　［　ｎｎ
．　Ｍｅｄ、４２、４７８、１９８７）に従って変えて
、血漿におけるｔ−Ｐ　Ａ活性を測定した。

エイチ−’７イ−７アンク（Ｈ，　Ｙ，　Ｈｕａｎｇ）
［工一ローアストロナウティクスーｌノボート（Ａｅｒ
ｏＡｓｔ．ｒｏｎａｕｔｉｅｓ　一Ｒｅｐｏｔ）　６４
、ライス・エニバーシティ（Ｒ　ｉｃｅ　Ｕ　ｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ）、１−３０、１９６９］に従つ”Ｃ変えた
非線形回帰用のコンピュータープログラムを用いて、薬
物動力学バラメーターを計算した。

曲線を設定するに際しては個体によって異なる１または
２コンバートメントモデルを想定した。各々の場合、計
算の前に、結果の値から内因性基底濃度の値を引いた。

ＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏは、速いα相および遅いβ相を有す
る６匹の動物のうちの２匹だけにおいて排泄される。こ
れら２匹の動物において、α相部分は、全排泄の５３％
であった。対照的に、アクティリセグループにおいて全
ての動物が速いα相を示し、この部分は全排泄の７０％
以−Ｌであった。Ｋ）Ｋ２Ｐ／Ｐｒｏは、主に、唯−の
半減Ｍ１５．１±３．１分で排泄された。対照的に、ア
クティリセは速い半減期１．６３分および遅い半減期１
０．ｌ分を有している（第１表）。ＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏ
の全血漿クリアランスは、６４３±１　．　５　ｚ（１
／　ｋｇ／分であり、したがって、アクティリセの全血
漿クリアランス（Ｃ　ｌ，。，＝　２　２．　９±９、
１　ｘＱ．／　ｋ９／分）よりもかなり低かった。

全体として、ＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏは、公知のアクティリ
セと比較して、薬物動力学プロフィルについて明らかに
改良されたｔ−ＰＡ突然変異体を示す（第２図および第
３図）。

実施例６ ウサギにおけるＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏの薬理学ディー・コ
レン（Ｄ，Ｃ０目ｅｎ）ら［ジャーナル・オブ・クリニ
カル・インベステイゲーション（ＪＣ　ｌｉｎ．　Ｉ　
ｎｖｅｓｔ．　）、７１、３６８、＋９８：｛］によっ
て確党きれた頚静脈血栓に関するウづギモデルを用いて
、血栓溶解効果を実験１，た。フイブリン溶解薬物また
は溶媒をボーラスとして１分間かけて静脈内注射した。

その後、血栓溶解率を測定し、ｌＭ固ンステムのパラメ
ーターを選択し、血小板の数を測定したく第２表）。

静脈内ボーラス注射の後、同一の用ｆｆｉ（２　０　０
０００　　１０／Ｊｃ９体重）で、ＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏ
は、アクティリセ（２４．１±３，７％）よりも統計学
的に有意に高い血栓溶解率５０．７±６．５％を達成し
た。ＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏの血栓溶解効果に匹敵するアク
ティリ砒の用鼠は、８０００００　　１Ｕ／静体重であ
った（第２表）。

Ｋ　Ｉ　Ｋ　２　Ｐ／　Ｉ’ｒｏは、溶媒グループと比
較するト、凝固バラメーター、すなわちフイブリノーゲ
ン、ブラスミ／−ゲンおよびα，−抗ブラスミンへの影
響は少なかったが、等効用量のアクティリセの効果とは
相異しなかった。

すなわち、ＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏは、頚静脈血栓のウサギ
モデルにおい゛Ｃ、ボーラス注射の後、アクティリセに
比べて非常に増大した血栓溶解効果を何するｔ−ＰＡ突
然変異体であった。一方、ＫＩＫ２Ｐ／Ｐｒｏは、その
フイブリン特異性をアクテイＪセと同様な範囲に維持し
た。

第１表 ＡＵＧ一曲線下面積二曲線下面積（ｒ　Ａ　Ｕ　Ｃ　Ｊ
）は、主な血漿１期変の時間に対する比較を可能にする
ので、ボーラス注射としてのフィブリン溶解薬物の投与
について特に興味深いものである。

第２表 頚静脈血栓のウサギモデルにおいてアクティリセ、Ｋ　
Ｉ　Ｋ２Ｐ／Ｐｒｏまたは溶媒を静脈内ボーラス注射し
た（１分間かけて）後の、血栓溶解率、血漿の数および
凝固システムの選択されたパラメーター性に基づく血漿
濃度 時間データのコンピューター計算から導かれた平均値士
標準誤差平均（ＳＥＭ） 寛■。一中心区画の分布の量。

ＣＩ．．．一全血漿クリアランス。

凝固パラメーターおよび血小板の数は、注射前の初期値
の％。

ＰＴＴ＝部分的なト口ンボブラスチン時平均値士標準誤
差平均　　　　各グループの動物の数ｎ＝６ｂｗ一体重
。

塞樅埒−Ｚ 最も効果的に活用ざれたイー・コリにおける発現 発現産生物の収率を増加するために、ＫＩＫ２Ｐ一遺伝
子をコードしている配列をプラスミド中で高いコピー数
でサブクローンした。このためにドイツ特許出願第Ｐ３
９３１９３３．４号に開示されているプラスミドｐｅＰ
ａ　１　２　６．　１を用いた。

このプラスミドは、主にベクターｐＫＫ２２３３および
ヨーロッパ特許出願明細書ＥＰ−Ａ　Ｏ２４２　　８３
５に開示されているようなｔ−ＰＡをコードする配列か
らなっている。

ｒｄ−ターミネーター配列を、まず、このプラスミドに
組込んだ。このためには、プラスミドｐｅＰａ１２６．
１を制限酵素Ｈｉｎｄｕで線形にした。この方法で開裂
されたプラスミドをゲル電気泳動で分離し、Ｍした。該
プラスミドｐＬＢＵ１［ゲンツ（Ｇ　ｅｎｔｚ）ら、（
１９８１）　ＰＮＡＳ　　７８　（８）：４９６３１を
Ｈｉｎｄｌｌで開裂し、ｆｄ−ターこネーターを含む約
３　６　０　ｈｐのＨｉｎｄＩ［Ｉフラグメン１・を、
ゲル電気泳動およびゲル溶離によって単離ｊ７た。線形
プラスミドｐｅＰａ　　１　２　６．　１とｐＬＢＵ１
由来の３６０ｂｐＨｉｎｄＩ［Ｉフラグメントを連結し
た。イー・コリ、ＤＳＭ２１０２を、ライゲーション調
製物とドイツ特許出願Ｐ　　３９　　３１　　９３３．
４に開示されているブラスこドｐＵＢＳ　　５００とで
−緒に形質転換した。該クローンから、第２のＨｉｎｄ
ｌＩＩ開裂部位を含むという点で出発プラスミドｐｅＰ
ａ１２６．１とは異なる所望のプラスミドｐｅＰａｌ２
６『ｄを含むクローンを選択した。

プラスミドｐｅＰａ　１２６　　ｒｄから２つのフラグ
メン１・を単離した：大きさ３．４ｋｂのＢａ＋ｉＨＩ
／Ｐｖｕｌ−−フラグメントおよび大きさ１　．　３　
ｋｂのＰｖｕｌ／Ｘｍａｌフラグメント。これら両フラ
グメントを、プラスミドｐＡ３３由来の約１．６ｋｂの
ＢａｍＨ　［／Ｘｍａｌ，フラグメントとライゲートし
、プラスミドｐＵ　Ｂ　Ｓ　　５　０　０と一績にイー
・コリ中に形質転換した。得られたプラスミドはｐＡ３
３ｒｄと命名され、ＥｅｏＲ［による制限消化にｔｊい
て、長さ約６１０ｂｐのｐｅＰａｌ２６由来の第２の最
小ＥｅｏＲＩフラグメントがｐＡ３３ｆｄにおいて短い
約２５０ｂｐであるという点でｐｅＰａ　１　２６　ｆ
ｄと区別することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＡ３３の構築を示す模式図であ
る。 第２図は、本発明のＬ−ＰＡ誘導体と比較する市販の入
手可能なｔ−ＰＡ（アクティリセ）の静脈内ボーラス注
射の後のｔ−ＰＡ活性の血漿濃度の経時変化を示す線形
グラフである。 第３図は、濃度の経時変化を示す対数グラフである。 特許出願人　ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフ
ト・ミント・ベシュレンクテル・ハフツング

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）グリコシル化されておらず、下記アミノ酸配列： Ｓｏｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｔ
   ｈｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　１０ Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　　
   　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　１５ Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔ
   ｈｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　　　　　　　　　　　
   　　　２０　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　
   　　　　　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　
   Ｃｙｓ 　　　　　　　　　　　　　３０ Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａ
   ｌａ　Ｌ■ｕ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　　　　　　　　　　３
   ５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　
   　　　　　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　
   Ａｒｇ 　　　　　　　　　４５　 Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｌ
   ■ｕ　Ｇｌｙ　Ｌ■ｕ　Ｇｌｙ　　　　　　５０　　　
   　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　
   　　　　　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　
   Ａｒｇ 　　　　　６０ Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌ
   ｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　　６５　　　　　　　
   　　　　　　　　　　　７０　　　　　　　　　　　　
   　　　　　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｐｈ■　Ｌｙｓ　Ａｌａ　
   Ｇｌｙ 　７５　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０ Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｃ
   ｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　８５　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　９０　Ａｌａ　Ｃｙ■　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　
   Ａｓｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　９５ Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａ
   ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　　　　　　　　　　　
   　　１００　　　　　　　　　　　　　　　　　１０５
   　　　　　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　
   Ｓｅｒ 　　　　　　　　　　　　１１０ Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＧＩｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓ
   ｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　　　　　　　　　１１
   ５　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０　　　　
   　　　　　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　
   Ｌｅｕ 　　　　　　　　１２５　　　　　　　　　　　　 Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａ
   ｌａ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　　　　　１３０　　　
   　　　　　　　　　　　　　　１３５ Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ 　　　　１４０ Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃ
   ｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　１４５　　　　　　　
   　　　　　　　　　　１５０　　　　　　　　　　　　
   　　　　　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　
   Ｐｒｏ １５５　　　　　　　　　　　　　　　　　１６０　Ｔ
   ｒｐ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓ
   ｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　
   　　　　　１６５　　　　　　　　　　　　　　　　　
   １７０ Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　　
   　　　　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　
   　　　　　　１７５　　　　 Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃ
   ｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　　　　　　　　　　　
   　　１８０　　　　　　　　　　　　　　　　　１８５
   　　　　　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　
   Ｇｌｎ 　　　　　　　　　　　　１９０　　　　　　　　 Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌ
   ｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　　　　　　　　　１９
   ５　　　　　　　　　　　　　　　　　２００　　　　
   　　　　　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　
   Ｔｒｐ 　　　　　　　　２０５　　　　　　　　　　　　 Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌ
   ｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　　　　　２１０　　　
   　　　　　　　　　　　　　　２１５　　　　　　　　
   　　　　　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　
   Ｐｈｅ 　　　　２２０　　　　　　　　　　　　　　　　 Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｉ
   ｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ ２２５　　　　　　　　　　　　　　　　　２３０ Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ ２３５　　　　　　　　　　　　　　　　　２４０ Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｐ
   ｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　
   　　　　　　２４５　　　　　　　　　　　　　　　　
   　２５０　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　
   Ｌｅｕ 　　　　　　　　　　　　　　　　２５５　　　　 Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｖ
   ａｌ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｙ　Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　
   　　２６０　　　　　　　　　　　　　　　　　２６５
   　　　　　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　
   Ｇｌｕ 　　　　　　　　　　　　２７０　　　　　　　　 Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｈ
   ｉｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　　　　　　　　　２７
   ５　　　　　　　　　　　　　　　　　２８０　　　　
   　　　　　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　
   Ａｓｐ 　　　　　　　　２８５　　　　　　　　　　　　 Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇ
   ｌｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　　　　　２９０　　　
   　　　　　　　　　　　　　　２９５　　　　　　　　
   　　　　　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　
   Ａｌａ 　　　　３００　　　　　　　　　　　　　　　　 Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａ
   ｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｎ　Ｃｙｓ　３０５　　　　　　　
   　　　　　　　　　　３１０　　　　　　　　　　　　
   　　　　　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　
   Ｌｅｕ ３１５　　　　　　　　　　　　　　　　　３２０ Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｇ
   ｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ 　　　　　　　　　　　　　　　　３２５　　　　　　
   　　　　　　　３３０　　　　　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙ
   ｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ 　　　　　　　　　　　　　　　　３３５　　　　 Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔ
   ｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　　　　　　　　　　　
   　　３４０　　　　　　　　　　　　　　　　　３４５
   　　　　　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　
   Ｖａｌ 　　　　　　　　　　　　３５０　　　　　　　　 Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａ
   ｒｇ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　３５
   ５　　　　　　　　　　　　　　　　　３６０　　　　
   　　　　　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　
   Ａｒｇ 　　　　　　　　３６５　　　　　　　　　　　　 Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｌ
   ｅｕ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　　　　　３７０　　　
   　　　　　　　　　　　　　　３７５　　　　　　　　
   　　　　　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　
   Ｇｌｙ 　　　　３８０　　　　　　　　　　　　　　　　 Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａ
   ｓｐ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　３８５　　　　　　　
   　　　　　　　　　　３９０　　　　　　　　　　　　
   　　　　　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　
   Ｐｒｏ ３９５　　　　　　　　　　　　　　　　　４００ Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇ
   ｌｙ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　
   　　　　　　４０５　　　　　　　　　　　　　　　　
   　４１０　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　
   Ｓｅｒ 　　　　　　　　　　　　　　　　４１５　　　　 Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇ
   ｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　　　　　　　　　　　
   　　４２０　　　　　　　　　　　　　　　　　４２５
   　　　　　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　
   Ｌｙｓ 　　　　　　　　　　　　４３０　　　　　　　　 Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔ
   ｒｐ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　　　　　　　　　４３
   ５　　　　　　　　　　　　　　　　　４４０　　　　
   　　　　　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ 　　　　　　　　４４５ を含有することを特徴とする組織プラスミノーゲン活性
   化因子（ｔ−ＰＡ）の誘導体。
2. （２）請求項（１）記載のｔ−ＰＡ誘導体をコードする
   。下記配列： ▲数式、化学式、表等があります▼ を含むことを特徴とするＤＮＡ配列。
3. （３）請求項（２）記載のＤＮＡ配列または請求項（１
   ）記載のタンパクをコードするに足りる遺伝暗号の変形
   の範囲内で異なるＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはプ
   ラスミドｐＡ３３を適切な宿主細胞に導入し、その培養
   培地から、所望により宿主細胞を溶解した後、発現産生
   物を単離することを特徴とする請求項（１）記載のｔ−
   ＰＡ誘導体の産生方法。
4. （４）請求項（１）記載のｔ−ＰＡ誘導体を含有する血
   餅溶解用薬物。