FI101475B

FI101475B - Menetelmä kudosplasminogeeniaktivaattorijohdannaisen valmistamiseksi

Info

Publication number: FI101475B
Application number: FI902700A
Authority: FI
Inventors: Rainer Rudolph; Ulrich Kohnert; Anne Stern; Stephan Fischer; Ulrich Martin
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1989-05-31
Filing date: 1990-05-30
Publication date: 1998-06-30
Also published as: FI902700A0; ES2070210T3; IL94539A0; PT94227B; EP0400545A1; EP0400545B1; HUT54734A; AU623781B2; CA2017636A1; DE59008693D1; NO902405L; CZ282035B6; NZ233796A; IL94539A; HU903267D0; DE3923339A1; CA2017636C; IE901848L; IE66006B1; ZA904089B

Description

101475

Menetelmä kudosplasminogeeniaktivaattorijohdannaisen valmistamiseksi -Förfarande for framställning av ett vävnadsplasminogenaktivatorderivat 5 Keksintö koskee uutta t-PA-johdannaista, DNA-sekvenssiä, joka koodittaa uutta t-PA-johdannaista, ekspressioplasmideja, joilla on t-PA-johdannaista koodittava DNA-sekvenssi, samoin kuin menetelmää sellaisten plasmidien valmistamiseksi ja menetelmää t-PA-johdannaisen valmistamiseksi. t-PA-johdannaista sisältävää ainetta voidaan käyttää verihyytymän liuottamiseen.

10

Hyytynyt veri sisältää pääkomponenttina polymeerisen fibriinin proteiinimatriisin. Fibriini liukenee fysiologisissa olosuhteissa fibrinolyyttisellä järjestelmällä reaktio-sarjassa, joka muistuttaa veren hyytymistä. Tällöin keskeinen reaktio on plasmino-geenin aktivointi plasmiiniksi, johon vaikuttaa esimerkiksi kudosplasminogeeniakti-15 vaattori t-PA (tissue type plasminogen activator). Plasmiini puolestaan liuottaa fib-riiniä, joka on hyytyneestä verestä koostuvan proteiinimatriisin pääkomponentti. Luonnollisen tai eukariooteista geeniteknologisesti saadun t-PA:n entsymaattinen aktiivisuus, nimittäin plasminogeenin katalyyttinen aktivointi plasmiiniksi, on hyvin vähäistä fibriinin tai fibrinogeenin hajoamistuotteiden puuttuessa, mutta se voi kui-20 tenkin nousta huomattavasti näiden proteiinien läsnäollessa, nimittäin enemmän kuin 10-kertaiseksi.

t-PA hajoaa veressä A- ja B-ketjuksi esiintyvien proteaasien johdosta. Molemmat osaketjut ovat liittyneet yhteen kysteiinisillalla. t-PA:n aktiivisuuden stimuloitavuus 25 on ratkaiseva etu muihin tunnettuihin plasminogeeniaktivaattoreihin, kuten esimerkiksi urokinaasiin tai streptokinaasiin verrattuna (vertaa esimerkiksi M. Hoylaerts et ai., J. Biol. Chem. 257 (1982) 2912-2919; W. Nieuwenhuizen et ai., Biochem. Biophys. Acta, 755 (1983) 531-533).

30 t-PA:n vaikutusmekanismi in vivo on kuvattu esimerkiksi julkaisussa: Komiger ja : Collen; Thromb. Hämostasis 46 (1981) 561-565. Entsyymin fibriininpintaan kohdis tuvasta aktiivisuudesta johtuen se on sopiva aine patologisten suonentukkeumien vastustamiseen (esimerkiksi sydäninfarktissa), mikä voitiin todistaa suurimmaksi osaksi kliinisillä kokeilla (Cohen et. ai., Circulation 70 (1984) 1012; Circulation 73 35 (1986)511).

t-PA:n haitaksi on kuitenkin katsottava sen plasmakonsentraation nopea aleneminen (puhdistumanopeus, Clearance-Rate). Seuraus tästä on, että vaaditaan suhteellisen 2 101475 suurta t-PA-määrää, jotta saavutettaisiin veritukosten tehokas liukeneminen in vivo. Korkeista käsittelyannoksista puolestaan seuraa sivuvaikutuksia, kuten esimerkiksi verenvuotoja.

5 EP-patenttijulkaisussa 0196920 on kuvattu t-PA:n luonnollinen hajoamistuote, joka sisältää enää vain t-PA:n Kringel 2-ja proteaasialueet ja sen N-terminaalisen aminohapon alaniini 160:n, ja joka on aminohapposekvenssi, jonka on kuvannut: Pennica et ai.; Nature 301 (1983) 214-221. Tämän t-PA-hajoamistuotteen puhdistumanopeus ei kuitenkaan poikkea olennaisesti luonnollisen t-PA:n puhdistumanopeudesta. 10 Tässä voidaan saada aikaan parannus vasta katalyyttisen alueen kemiallisella modifioinnilla salpausryhmän lisäyksellä.

Siten keksintö koskee t-PA:n muuttamista niin, että muodostuneella johdannaisella on voimakkaasti muuttunut puhdistumanopeus, ja siten pidentynyt puoliintumisaika 15 veriplasmassa. Tällöin olisi säilytettävä veritukoksia liuottava vaikutus samoin kuin stimuloitavuus fibriinillä.

Siten keksinnön kohteena on kudosplasminogeeniaktivaattori (t-PA-johdannainen, jota esimerkeissä kutsutaan myös nimellä K1K2P), jolle on luonteenomaista, että se 20 on glykosyloimaton ja koostuu seuraavasta aminohapposekvenssistä: (M)

Ser Tyr Gin Vai Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gin 5 10 15 .. 25 Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala 20 25 30

Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr 35 40 45

Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His 30 50 55 60 *, Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr 65 70 75

Vai Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro 80 85 90 35 Ala Cys Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser 95 100 105

Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys 110 115 120 3 101475

Leu Pro Trp Asn Ser Met lie Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala 125 130 135

Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr 140 145 150 5 Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu 155 160 165

Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys 170 175 180

Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg lie 10 185 190 195

Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp lie Ala Ser His Pro Trp Gin Ala 200 205 210

Ala lie Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu 215 220 225 15 Cys Gly Gly lie Leu lie Ser Ser Cys Trp lie Leu Ser Ala Ala 230 235 240

His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val lie 245 250 255

Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys 20 260 265 270

Phe Glu Val Glu Lys Tyr lie Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp 275 280 285

Thr Tyr Asp Asn Asp lie Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser 290 295 300 25 Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu 305 310 315

Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu 320 325 330

Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu 30 335 340 345

Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys 350 355 360

Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu 365 370 375 35 Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His 380 385 390

Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn 395 400 405 4 101475

Asp Gly Arg Met Thr Leu Vai Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly 410 415 420

Cys Gly Gin Lys Asp Vai Pro Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn 425 430 435 5 Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 440 445

Yllättäen osoitettiin, ettei muiden, natiivissa t-PA:ssa esiintyvien alueiden deleetiol-la ole lainkaan vaikutusta proteiinin trombolyyttiseen vaikutukseen ja että muteiinin 10 fibriinistä riippuva stimuloitavuus on sama kuin natiivilla t-PA:lla.

Edelleen keksinnön kohteena on DNA-sekvenssi, joka koodittaa keksinnön mukaista t-PA-johdannaista ja sisältää seuraavan sekvenssin:

15 ATGTCTT ACCAAGTGATCGAT ACCAGGGCCACGTGCT ACGAGGACCAGG GCATCAGCTACAGGGGCACGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGCCGAGT GCACCAACTGGAACAGCAGCGCGTTGGCCCAGAAGCCCTACAGCGGGCG GAGGCCAGACGCCATCAGGCTGGGCCTGGGGAACCACAACTACTGCAGA ; AACCCAGATCGAGACTCAAAGCCCTGGTGCTACGTCTTTAAGGCGGGGA

20 AGT AC AGCTC AGAGTTCTGC AGC ACCCCT GCCTGCT CT GAGGG AAAC AG TGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCA CCG AGTCGGGT GCCTCCT GCCTCCCGT GGAATTCC AT G ATCCTG AT AGGC AAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCA AACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCA 25 CGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCC TGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAA AGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCT TTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCAT ACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGA 30 GGTTTCCGCCCC ACC ACCTGACGGTGAT CTT GGGC AGAACATACCGGGT , GGTCCCTGGCG AGGAGGAGC AGAAATTTGAAGTCGAAAAAT AC ATTGT C

CATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCA GCTGAAATCGGATT CGTCCCGCT GT GCCC AGG AGAGC AGCGT GGTCCGC ACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGT 35 GTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCG GAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCA CATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCT GGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCC

5 101475 AGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGAC TTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTC CCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACA ACATGCGACCG 1341 5

Keksinnön mukainen DNA-sekvenssi toimii keksinnön mukaisen t-PA-johdannaisen ekspressiossa sen esiintyessä ekspressioplasmidissa. Edelleen keksinnön kohteena on sellainen ekspressioplasmidi, samoin kuin ekspressioplasmidi, jolla on tästä poikkeava DNA-sekvenssi ja joka kuitenkin samoin koodittaa keksinnön mukaista t-10 PA-johdannaista. Geneettisen koodin degeneraatiosta johtuen tähän soveltuvat sekvenssit, jotka poikkeavat näytetystä DNA-sekvenssistä.

Ekspressioplasmidi sisältää paitsi replikaation alkamiskohdan (origin of replication) edullisesti t-PA-johdannaista koodittavan sekvenssin ohella lisäksi vielä säädettävis-15 sä olevan promoottorirakenteen (esimerkiksi tac-promoottori), tehokkaan terminaat-torin (esimerkiksi fd), valintamarkkerin (esimerkiksi β-laktamaasigeeni).

Edelleen keksintö koskee plasmidia pA33. Tämän plasmidin valmistus on kuvattu esimerkissä 1, se sisältää DNA-sekvenssin, joka koodittaa keksinnön mukaista t-PA-20 johdannaista.

Edelleen keksintö koskee menetelmää keksinnön mukaisten ekspressioplasmidien valmistamiseksi, jolle on luonteenomaista, että DNA-sekvenssi, joka koodittaa t-PA-proteiinia tai sen johdannaista, joka sisältää Kringel I-, Kringel II- ja proteaasialuei-.. 25 den lisäksi vielä muita t-PA-proteiinin alueita, lisätään plasmidiin, ja poistetaan suunnatulla mutageneesillä ne alueet, jotka koodittavat aminohappoja, jotka eivät esiinny keksinnön mukaisessa t-PA-johdannaisessa.

Plasmidin valinta, johon keksinnön mukaista t-PA-johdannaista koodittava DNA-30 sekvenssi lisätään, riippuu johdannaisen ekspressioon käytetyistä isäntäsoluista. Sopivat plasmidit samoin kuin minimivaatimukset, jotka sellaiselle plasmidille on asetettava (esimerkiksi replikaation alkamiskohta ja restriktiokatkaisukohta) ovat ammattimiesten tuntemia. Keksinnön puitteissa voidaan kuitenkin plasmidin sijasta käyttää myös kosmidia, faagien replikoitavaa, kaksoissäikeistä muotoa (λ, M13), ja 35 muita ammattimiesten tuntemia vektoreita. Suunnatun mutageneesin (site-directed mutagenesis) menetelmän on kuvannut: Morinaga et ai.; Biotechnology 2\ (1984) 634, ja se suoritetaan oleellisesti julkaisussa kuvatulla tavalla.

6 101475

Edelleen keksinnön kohteena on menetelmä keksinnön mukaisen t-PA-johdannaisen valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että yksi keksinnön mukaisista plasmideista ekspressoidaan sopivissa isäntäsoluissa ja tuote kerätään talteen kas-vatusväliaineesta tai isäntäsolujen avaamisen jälkeen nesteestä, jossa avaus suoritet-5 tiin (esimerkiksi puskuri tai myös kasvatus väliaine). Keksinnön mukaisen t-PA-johdannaisen valmistukseen käytetään isäntäsoluina edullisesti prokarioottisoluja. Tällöin on vuorostaan erityisen edullista, että tällöin muodostuvat niin kutsutut "inclusion bodies" (ei-liukoiset proteiiniaggregaatit) poistetaan ensin liukoisista so-luhiukkasista, t-PA:ta sisältävät inclusion bodies liuotetaan guanidiinihydrokloridilla 10 käsittelemällä, ne derivatisoidaan seuraavaksi hapetetulla glutationilla, ja viimeiseksi t-PA-johdannainen naturoidaan uudelleen L-arginiinia ja guanidiinihydrokloridia lisäämällä. Tarkkoja ohjeita t-PA:n aktivoimiseen "inclusion bodies"-proteiineista ilmenee esimerkiksi EP-patenttihakemuksista A-0219874 ja A-0241022. Samoin aktiivisen proteiinin talteen keräämiseen "inclusion bodies"-proteiinista voidaan kui-15 tenkin käyttää mitä hyvänsä muuta menetelmää.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan edullisesti L-arginiinin läsnäollessa, 20 erityisesti konsentraation 25-1000 mmol/1.

Keksinnön mukainen vierasproteiinin erotus suoritetaan keksinnön edullisessa suoritusmuodossa affiniteettikromatografialla ETI (Erythrina-trypsiini-inhibiittori)-adsorberikolonnilla. Tällöin ETI on kiinnitetty kantajamateriaalille (adsorberille), 25 kuten esimerkiksi BrCN-sefaroosi. ETI-adsorberikolonnilla puhdistuksen etuna on, että ETI-adsorberikolonnimateriaali voidaan ajaa suoraan konsentroidusta pelkis-tyspanoksesta jopa niin korkeiden arginiinikonsentraatioden, kuin 0,8 mol/1 arginii-nia läsnäollessa. Tällöin estetään p-t-PA:n aggregoituminen, jota voi esiintyä alhaisilla arginiinikonsentraatioilla alle 25 mmol/1. Tämän vuoksi p-t-PA-valmisteen puh-30 distus tapahtuu erityisen edullisesti ETI-adsorberikolonnilla 0,2-1,0 M, edullisesti : 0,5-1,0 M arginiinin läsnäollessa. KlK2P/Pro:ta sisältävällä liuoksella on tällöin edullisesti pH-arvo yli 6,5, erityisen edullisesti yli 7.

Eluointi ETI-kolonnista tapahtuu pH:n alentamisella arginiinin läsnäollessa olosuh-35 teissä, jotka mahdollistavat prokariooteissa ekspressoidun t-PA:n hyvän liukoisuuden. pH-arvo on eluoinnissa edullisesti happamalla alueella, erityisen edullisesti pH-alueella 4-6.

7 101475

Keksinnön mukaisesti valmistetulla KlK2P/Pro-valmisteella on spesifinen t-PA-aktiivisuus >0,4· 10^ IU/mg, edullisesti >0,6· 10^ IU/mg, sen stimuloitavuus fibrino-geenihajoamistuotteilla (fibrinogeenipeptidiaktiivisuuden läsnäollessa/aktiivisuuden ilman fibrmogeenipeptidien läsnäolo) on suurempi kuin 10-kertainen, edullisesti 5 suurempi kuin 20-kertainen. Keksinnön mukaisen valmisteen puhtaus on yli 90 % ja edullisesti yli 95 %, erityisesti yli 98 %.

Sen vuoksi keksinnön mukainen t-PA-johdannainen soveltuu erityisesti käytettäväksi lääkkeessä veritukkeuman liuotukseen, joka jälleen on keksinnön eräs kohde.

10

Seuraava esimerkki valaisee keksintöä piirrosten yhteydessä edelleen.

Kuvassa 1 esitetään kaavamaisesti plasmidin pA33 valmistus.

15 Kuvassa 2 esitetään t-PA-aktiivisuusplasmakonsentraatio ajan funktiona laskimon-sisäisen bolusinjektion jälkeen kaupallisesti saatavasta t-PA:sta (ACTILYSE®) verrattuna keksinnön mukaiseen t-PA-johdannaiseen lineaarisena esityksenä.

. Kuvassa 3 esitetään konsentraatio ajan funktiona logaritmisena esityksenä.

20

Esimerkki 1

Plasmidin pA33 muodostaminen v 25 Lähtömateriaaliplasmidina toimi plasmidi pePa 133, joka on kuvattu EP-patentti-hakemuksessa A-0242836. Kaikki kokeelliset vaiheet spesifiseen mutageneesiin, ts. pePa 133:n alueiden F ja E deleetioon (katso kuva 1), suoritettiin oleellisesti käyttämällä menetelmiä, jotka on kuvannut: Morinaga et ai.; Biotechnologie 2! (1984) 634. Tätä varten pePa 133:sta valmistettiin 2 katkaisuerää. Erä A katkaistiin 30 EcoRl :llä, ja eristettiin suurempi fragmentti. Erä B katkaistiin XhoI:llä, ja niin tuote *. linearisoitiin. Heterodupleksin muodostamiseen käytettiin seuraavaa oligonukleoti- diä: 5’ TAC CAA GTG ATC GAT ACC AGG GCC 3’ 35

Kolonian hybridisoinnilla edellä mainitulla mutageneesioligonukleotidilla saatiin selville ne kloonit, jotka sisälsivät etsityn plasmidin pA33. Tämä plasmidi karakterisoitiin restriktiosanalyysillä, ja testattiin Sspl-restriktiokatkaisukohdan puuttuminen, 8 101475 joka katkaisukohta sijaitsee t-PA-ekspressiokasetin sormenjälkialuetta koodittavassa osassa.

Esimerkki 2 5

Aktiivisen KlK2P/Pro:n valmistus E. colista a) solujen lyysi ja inclusion bodies (IB)-proteiinin valmistaminen 10 1,6 kg kosteaa solumassaa (E. coli, DSM 3689), joka oli transformoitu plasmidilla pA33, suspendoitiin 10 l:aan 0,1 mol/1 Tris-HCL, 20 mmol/1 EDTA, pH 6,5, 4°C. Siihen lisättiin 2,5 g lysotsyymiä, ja inkuboitiin 30 min 4 °C:ssa; seuraavaksi suoritettiin solujen täydellinen aukaisu korkeapainedispersiolla. Avausliuokseen sekoitettiin 5 1 0,1 mol/1 Tris-HCl, 20 mmol/1 EDTA, 6 % Triton Xl00 ja 1,5 mol/1 NaCl, 15 pH 6,5, ja inkuboitiin edelleen 30 min 4 °C:ssa. Tämän jälkeen seurasi seuraavaksi liukenemattomien ainesosasten (IB) erotus sentrifiigoimalla.

Pellettiä suspendoitiin 10 l:aan 0,1 mol/1 Tris-HCl, 20 mmol/1 EDTA, pH 6,5, inku-, boitiin 30 min 4 °C:ssa, ja IB-valmiste eristettiin seuraavaksi sentriiugoimalla.

20 b) IB:n liuotus 8,7 g IB:ä (märkäpaino) suspendoitiin 100 ml:aan 0,1 M Tris, 6 M guanidiini, 0,1 M DTE, pH 7,5, ja sekoitettiin 30 min 25 °C:ssa.

25 pH-arvon säätämisen jälkeen pH 3:een HClillä (25-%) suoritettiin dialyysi 4 mol/1 guanidiini-HCliää vastaan, pH 2,5 (3x31, 24 h, 4 °C).

c) Derivatisointi 30 : Edellä kuvattu dialysaatti säädettiin hapetetulla glutationilla (GSSG) 50 mmol/l:aan ja Trisillä 100 mmol/liaan ja tiirattiin 5 mol/1 NaOH.lla pH-arvoon 7,5. Erää inku-boitiin 90 min 25 °C:ssa. pH-arvon säätämisen jälkeen pH-arvoon 3 HClillä (25-%) suoritettiin dialysointi 10 mmol/1 HCliää (3 x 100 1, 48 h, 4 °C) vastaan.

35 9 101475 d) Naturointi

10-1 reaktori täytettiin liuoksella, jossa oli 0,8 mol/1 Arg/HCl, pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 GSH (glutationi). Naturointi suoritettiin 20 °C:ssa lisäämällä kol-5 mesti 100 ml johdannaista, jota oli dialysoitu ennalta 6 mol/1 guanidiini-HCl, pH

2,5 :ta vastaan 24 tunnin ajan.

Naturoinnin jälkeen saadaan materiaali, jonka spesifinen aktiivisuus on 50 - 75 KU/mg (testausmenetelmä: H. Lill; Z. gesamte inn. Med. ihre Grenzgeb. 42 (1987) 10 478-486).

e) Uudelleennaturoidun erän konsentrointi

Uudelleen naturoitu erä voidaan konsentroida tarvittaessa hemodialysaattorilla.

15

Esimerkki 3

KlK2P/Pro:n puhdistus E. colista 20 KlK2P/Pro:n puhdistus E. Colista tapahtuu affiniteettikromatografialla Erythrina-trypsiini-inhibiittori (ETI)-sefaroosilla.

Naturointierä konsentroitiin hemodialysaattorilla (Asahi AM 300) 1:5, yön aikana 0,8 mol/1 Arg/HCl, pH 7,5 :tä vastaan, ja sentrifugoitiin. ETI-sefaroosikolonniin (120 .. 25 ml), joka oli tasapainotettu liuoksella, jossa oli 0,8 mol/1 Arg/HCl, pH 7,5, lisättiin 1,8 1 dialysaattia (4 kolonnintilavuutta (SV)/h), ja pestiin puskurilla (0,8 mol/1 Arg/-HC1, pH 7,5, 0,5 mol/1 NaCl), kunnes eluaatin absorptio saavutti 280 nm:llä puskurin 0-arvon. Toisen pesun jälkeen 5 SV:llä 0,3 mol/1 Arg/HCl, pH 7,0 eluoitiin 0,3 mol/1 Arg/HCl, pH 4,5:llä.

30 * tilavuudet aktiivisuus Cprot SA F1 ml KU/ml mg/ml KU/mg dialysaatti 1800 74 1,05 70 15 35 K1K2P yhdistetyt 200 610 0,82 744 28 F = stimulointi fibriinillä = aktiivisuus fibriinin läsnäollessa/aktiivisuus ilman fibriiniä.

10 101475

Esimerkki 4 E. colista saadun puhdistetun KlK2P/Pro:n karakterisointi

5 a) proteiinikemiallinen karakterisointi - SDS-PAGE ja käänteisfaasi-HPLC

AfFiniteettikromatografialla ETI-sefaroosilla puhdistetun materiaalin puhtaus osoitettiin SDS-PAGE.lla ja käänteisfaasi-HPLC.llä (RP-HPLC). Puhdistetun materiaalin elektroforeettisesta analyysistä arvioitiin E. colista saadun KlK2P:n kulkemasta 10 matkasta näennäinen molekyylipaino 50800 ± 2000 Da. Densitometrisellä analyysillä saatiin tulokseksi puhtaus > 90 %.

RP-HPLC riippuu proteiinien eriävästä vuorovaikutuksesta hydrofobisten matriisien kanssa. Tätä ominaisuutta käytettiin analyyttisenä menetelmänä puhtausasteen kvan-15 tisoimiseksi.

E. colista saadun puhdistetun KlK2P/Pro:n analyysi tapahtui Nucleosil 300-erotus-kolonnilla (Knauer) trifluorietikkahappo/asetonitriili-gradienttien avulla (puskuri A: 1,2 ml trifluorietikkahappoa 1000 ml:ssa H2O; puskuri B: 300 ml H2O, 700 ml 20 asetonitriiliä, 1 ml trifluorietikkahappoa; 0-100 %). Kromatografisen analyysin integroinnilla saatiin tulokseksi puhtaus > 95 %.

- N-terminaalinen sekvenssi 25 N-terminaalinen aminohapposekvenssi määritettiin ABI 470 Sequenator-laitteella vakio-ohjelmalla ja on-line PTH-detektiolla. Tulokseksi saatu sekvenssi S1-Y2-Q3-V4-I5-D6-T7-R8-A9-T10-C11-Y12-E13-D14 on yhtäpitävä DNA-sekvenssistä johdetun, odotetun sekvenssin kanssa.

30 b) Aktiviteettimääritys a a E. colista saadun KlK2P/Pro:n in vitro -aktiivisuus määritettiin tavalla, jonka on kuvannut: H. Lill; Z. gesamte inn. Med. ihre Grenzgeb. 42 (1987) 478-486. Spesifinen aktiivisuus (SA) oli 650000 ± 200000 IU/mg. E. colista saadun KlK2P/Pro:n 35 stimuloitavuus fibrinogeenin BrCN-fragmentina (fibrinogeenifragmenttien aktiivisuus jaettuna aktiivisuudella ilman fibrinogeenifragmentteja) oli tässä testijärjes-telmässä 25 - 30.

11 101475 c) In vitro -sitoutuminen fibriiniin

KlK2P/Pro:n in vitro-sitoutuminen fibriiniin määritettiin menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Higgins ja Vehar (Higgins, D.L. und Vehar, G.A. Biochem. 26 (1987) 5 7786-7791).

Tällöin kävi ilmi, ettei KlK2P/Pro:lla ollut mainittavaa fibriiniin sitoutumista CHO-soluista peräisin olevan t-PA:n läsnäollessa.

10 Esimerkki S

Kaniinista peräisin olevan KlK2P/Pro:n farmakokinetiikka

KlK2P/Pro:n farmakokineettisiä ominaisuuksia verrattiin valkoisilla Uuden-Seelan-15 nin kaneilla Actilyse®:llä (Alteplase, Thomae GmbH, Biberach, Saksan Liittotasavalta). Molempia fibrinolyyttisiä aineita injisoitiin laskimonsisäisesti annos 200000 IU/kg kehonpainoa (KG) 1 min aikana. Otettiin plasmanäytteitä ennen injektiota ja määritellyillä ajanhetkillä injektion jälkeen. t-PA-aktiivisuus plasmassa mitattiin spektrofotometrisellä testillä, jonka on kuvannut: J.H. Verheijen et ai.; Thromb. 20 Haemostas. 48 (1982) 266, modifioituna tavalla, jonka on kuvannut: H. Lill; Z. Ges. inn. Med. 42 (1987) 478.

Farmakokineettisten parametrien laskemiseksi käytettiin hyväksi ei-lineaarisen regression tietokoneohjelmaa, modifioituna H.Y. Huangin mukaan (Aero-• 25 Astronautics Report 64 Rice University 1-30, 1969). Käyrän sovituksessa käytettiin yksilöllisesti erilailla 1- tai 2-osaista mallia. Ennen laskemista vähennettiin kulloinkin kehon oman perustason arvo ennen seuraavia arvoja.

KlK2P/Pro eliminoituu vain 2 eläimellä 6:sta nopealla a- ja hitaalla β-faasilla. 30 Näillä 2 eläimellä α-faasiosuus oli 53 % kokonaiseliminoitumisesta. Sitä vastoin on kaikilla eläimillä Actilyse®-iyhmässä nopea α-faasi, jonka osuus muodostaa koko-naispoistumisesta yli 70 %. KlK2P/Pro eliminoituu pääosin vain puoliintumisajalla 15,1 ± 3,1 min. Actilyse®:llä sitä vastoin on nopea puoliintumisaika 1,63 min, ja hidas puoliintumisaika 10,1 min (taulukko 1). KlK2P/Pro:n kokonaisplasmapuh-35 distuma on 6,3 ± 1,5 ml/kg/min, ja siten olennaisesti alhaisempi, kuin Actilyse®:llä (Otot= 22,9 ±9,1 ml/kg/min).

12 101475

Kaiken kaikkiaan KlK2P/Pro edustaa t-PA-mutanttia, jolla on tekniikan tason edustavaan Actilyse®: ään verrattuna selvästi parempi farmakokineettinen profiili (kuvat 2 ja 3).

5 Esimerkki 6

KlK2P/Pro:n farmakodynamiikka kaneilla

Trombolyyttisen tehon testaamiseksi käytettiin kanin kaulalaskimotukosmallia, 10 jonka on luonut: D. Collen et ai.; J. Clin. Invest. 71 (1983) 368. Fibrinolyyttiset aineet tai liuotinaine injisoitiin laskimonsisäisesti 1 min aikana boluksena. Seuraa-vaksi mitattiin veritulpanhajoamisnopeus, ja määritettiin hyytymisjäijestelmän valittuja parametrejä, kuten verihiutaleiden lukumäärä (taulukko 2).

15 KlK2P/Pro saavutti samalla annoksella (200000 IU/kg KG) laskimonsisäisen bolus-injektion jälkeen tilastollisesti merkittävästi korkeamman veritulpanhajoamisnopeu-den 50,7 ± 6,5 %, kuin Actilyse® (24,1 ± 3,7 %). KlK2P/Pro:n kanssa veritulpan-hajotuksessa verrattavissa oleva Actilyse®-annos on 800000 IU/kg KG (taulukko 2).

20 Samantehoisella KlK2P/Pro-annoksella Actilyse®:een verrattuna ilmenee liuotti-meen verrattuna vähäisiä vaikutuksia verenhyytymisparametreihin fibrinogeeni, plasminogeeni ja a2-antiplasmiini, jotka eivät kuitenkaan poikkea samantehoisen Actilyse®-annoksen vaikutuksista.

25 Siten KlK2P/Pro on t-PA-mutantti, jolla ilmeni kanin kaulalaskimotukosmallilla bolusinjektion jälkeen veritulpanhajotusnopeus, joka on Actilyse®:ään verrattuna olennaisesti kohonnut. KlK2P/Pro on tällöin säilyttänyt fibriinispesifisyytensä Actilyse® :n kanssa samassa mittakaavassa.

13 101475

Taulukko I

Farmakokineettiset parametrit, jotka on johdettu plasmakonsentraatio/aika-tietojen 5 tietokonelaskelmista t-PA-aktiivisuuden perusteella nukutetuissa kaniineissa i.v. bolusinjektion jälkeen annoksella 200000 IU/kg KG KlK2/Pro:ta tai Actinolyse® :ää.

Fibrinolyyttinen tyaa ty£ Cmj Vc* Cltot* AUCekstrapol * aine__(min) (min) (IU/ml) (ml/kg) (ml x kg'^ x min'^)__

Actilyse® (n=6) 1,63 10,1 3051,9 63,2 22,9 161,1 ___(n=5) ±1318,8 ±29,3__±9J__±49,8

KlK2P/Pro 8,9 15,1 1695,9 119,1 6,3 556,4 (n=6)_ (n=2) ±3,1 ±345,4 ±26,6 _±y_ ±118,8 10 Keskiarvo ± keskihajonta *VC = keskeisen osaston jakaantumistilavuudet Cltot = kokonaisplasmapuhdistuma AUC = käyrän alainen pinta-ala; fibrinolyyttisen aineen käytössä bolusinjektioon käyrän alainen alue erityisen kiinnostava, koska se antaa selvityksen plas-15 massa vallitsevista konsentraatioista ajan funktiona.

Taulukko II

Verenhyytymisjärjestelmän trombolyseraatit, verihiutaleiden lukumäärä ja valitut 20 parametrit Actilyse®:n, KlK2P/Pro:n tai liuottimen i.v.-bolusinjektion jälkeen (1 min aikana) kaulavaltimoveritulpilla kaniinimallilla.

Uuotin I Actilyse® I K1K?^ro ^00001 Actilyse® __ 200000 IU/kg KG 1U/Rg KCj 800000 IU/kg

Trombolyseraatti (%) 12,9 ± 0,9 24,1 ± 3,7__50,7 ± 6,4__44,6 ± 4,8 ,· Fibrinogeeni(%) 89,5 ±2,1 90,5 ±2,6__81,1 ±5,1__81,4±3,4

Plasmmogeeni (%) 90,5 ± 2,7 83,8 ± 4,4__60,1 ±4,3__69,6 ± 3,3 a 7-antiplasmnni (%) 90,9 ± 4,4__100,8 ± 5,3__67,6 ± 6,7__74,2 ± 5,9 PPT (%)__113,8 ±4,9 112,9 ±4,3__113,1 ±3,0 115,1 ±5,5

Verihiutaleita (%) 86,1 ±12,1 | 91,4 ±4,9 84,4 ±8,3 86,3 ±2,8

Verenhyytymisparametrit ja verihiutaleiden lukumäärä %:na lähtöarvosta ennen 25 injektiota PTT = partiaalinen tromboplastiiniaika keskiarvo ± SEM jokaisessa tyhmässä n = 6 eläintä 14 101475

Esimerkki 7

Optimoitu ekspressio E. colissa 5 Ekspressiosaannon nostamiseksi KlK2P-geeniä koodittava sekvenssi kloonattiin uudelleen plasmidiin, jolla on suuri kopiointiluku. Tätä varten käytettiin hyväksi DE-patenttihakemuksessa 3931933.4 kuvattua plasmidia pePa 126.1. Tämä plasmidi koostuu olennaisesti vektorista pKK223-3 ja t-PA:ta koodittavasta sekvenssistä, kuten se on kuvattu EP-patenttihakemuksessa A-0242835.

10 Tähän plasmidiin yhdistettiin ensin fd-terminaattorin sekvenssi. Sitä varten plasmidi pePa 126.1 linearisoitiin restriktioentsyymillä Hind III. Niin katkaistu plasmidi erotettiin geelielektroforeettisesti ja otettiin talteen preparatiivisesti. Plasmidi pLBUl (Gentz et ai. (1981) PNAS 78(8):4963) katkaistiin Hind 111:11a, ja valmistet-15 tiin preparatiivisesti geelielektroforeettisesti ja geelieluoinnilla noin 360 bp kokoinen Hind III-fragmentti, joka sisälsi fd-terminaattorin. Linearisoitu plasmidi pePa 126.1 ja 360-bp Hind III-fragmentti pLBUl:stä liitettiin yhteen. Yhteenliitetty erä kotransformoitiin DE-patenttihakemuksessa P 3931933.4 kuvatulla tavalla plasmidiin pUBS 500 E. colissa, DSM 2102. Klooneista valittiin ne, jotka sisälsivät toivo-20 tun plasmidin pePa 126 fd, joka poikkesi lähtömateriaaliplasmidista pePa 126.1 siten, että siinä oli toinen Hind III-katkaisukohta.

Plasmidista pePa 126 fd saatiin 2 fragmenttia: 3,4 kb kokoinen BamHI/PvuI-Fragment, ja noin 1,3 kb kokoinen PvuI/Xmal-fragmentti. Molemmat mainituista 25 fragmenteista liitettiin plasmidista pA33 saatuun noin 1,6 kb kokoiseen BamHI/Xmal-fragmenttiin, ja transformoitiin plasmidilla pUBS 500 E. coliin. Tulokseksi saatu plasmidi on pA33 fd, ja voidaan erottaa pePa 126 fd:stä siten, että restriktiokäsittelyllä EcoRI toiseksi pienin EcoRI-fragmentti pePa 126 fd.stä, joka on noin 610 bp pitkä, on pA33 idissä noin 250 bp lyhyempänä.

:

Claims

101475

1. Förfarande för framställning av vävnadsplasminogenaktivator (t-PA)-derivat 25 som är oglykosylerat och har följande aminosyrasekvens: (M) Ser Tyr Gin Vai Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gin 5 10 15

30 Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala 20 25 30 Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr 35 40 45 Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His 35 50 55 60 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr 65 70 75 101475 Vai Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro 80 85 90 Ala Cys Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser 95 100 105

1. Menetelmä kudosplasminogeeniaktivaattori (t-PA)-johdannaisen valmistamiseksi, joka on glykosyloimaton ja sillä on seuraava aminohapposekvenssi: 5 (M) Ser Tyr Gin Vai Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gin 5 10 15 Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala 10 20 25 30 Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr 35 40 45 Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His 50 55 60

15 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr 65 70 75 Vai Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro 80 85 90 . Ala Cys Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser 20 95 100 105 Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys 110 115 120 Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Vai Tyr Thr Ala 125 130 135 : 25 Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr 140 145 150 Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Vai Leu 155 160 165 Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Vai Pro Ser Cys 30 170 175 180 ! Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile 185 190 195 Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gin Ala 200 205 210

35 Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu 215 220 225 Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala 230 235 240 101475 His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val lie 245 250 255 Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys 260 265 270

2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att plasmid pA33 enligt figur 1 används. 15 3. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat av att som värdceller an vänds prokariotceller, särskilt E. coli.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 35 kuvan 1 mukaista plasmidiapA33.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäso-luina käytetään prokarioottisoluja, erityisesti E. colia. 101475

4. Förfarande enligt patentkrav 1, 2 eller 3, kännetecknat av att för att forbättra utvinningen av aktivt protein avskiljs de "inclusion bodies"-proteiner som uppkom- 20 mit, upplöses de genom behandling med guanidinhydroklorid, derivatiseras sedan med oxiderad glutation, och t-PA-derivatet naturaliseras till slut pä nytt genom tillsats av L-arginin och GSH.

4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aktiivisen proteiinin saannon kohottamiseksi erotetaan muodostuneet "inclusion bodies"-proteiinit, nämä liuotetaan guanidiinihydrokloridilla käsittelemällä, derivatisoidaan seuraavaksi hapetetulla glutationilla, ja t-PA-johdannainen naturoidaan lopuksi 5 uudelleen L-arginiinia ja GSH:ta lisäämällä.

5. Förfarande enligt nägot av patentkrav 1-4, kännetecknat av att ätgärdema sker : 25 i närvaro av 25-1000 mmol/1 L-arginin.

5 Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn 395 400 405 Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly lie lie Ser Trp Gly Leu Gly 410 415 420 Cys Gly Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn 10 425 430 435 Tyr Leu Asp Trp lie Arg Asp Asn Met Arg Pro 440 445 kännetecknat av att en expressionsplasmid omfattande följande DNA-sekvens: 15 ATGTCTTACCAAGTGATCGATACCAGGGCCACGTGCTACGAGGACCAGG GCATCAGCTACAGGGGCACGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGCCGAGT GCACCAACTGGAACAGCAGCGCGTTGGCCCAGAAGCCCTACAGCGGGCG GAGGCCAGACGCCATCAGGCTGGGCCTGGGGAACCACAACTACTGCAGA 20 AACCCAGATCGAGACTCAAAGCCCTGGTGCTACGTCTTTAAGGCGGGGA AGTACAGCTCAGAGTTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTCTGAGGGAAACAG T G ACT GCT ACTTT GGG AAT GGGT C AGCCTACCGT GGC ACGC AC AGCCTC A CCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGC AAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCA 25 AACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCA CGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCC TGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAA AGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCT TTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCAT 30 ACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGA 1 GGTTTCCGCCCC ACC ACCT GACGGTGAT CTT GGGC AGAAC AT ACCGGGT GGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTC CATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCA GCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGC 35 ACTGT GTGCCTTCCCCCGGCGGACCT GC AGCT GCCGGACTGGACGG AGT GTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCG GAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCA CAT C AC AAC ATTT ACTT AAC AGAAC AGTCACCGACAAC AT GCTGT GT GCT 101475 GGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCC AGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGT CT GAACG ATGGCCGC AT G AC TTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTC CCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACA 5 ACATGCGACCG 1341 eller en annorlunda DNA-sekvens inom ramen för degenereringen av dess genetiska kod, varvid DNA-sekvensen kodar motsvarande t-PA-derivat, förs till en lämplig värdcell och expressionsprodukten tas tillvara fran odlingssubstratet eller efter ned-10 brytningen av värdcellema.

5 Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys 110 115 120 Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Vai Tyr Thr Ala 125 130 135 Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr 10 140 145 150 Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Vai Leu 155 160 165 Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Vai Pro Ser Cys 170 175 180

15 Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile 185 190 195 Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gin Ala 200 205 210 Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu 20 215 220 225 Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala 230 235 240 His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Vai Ile 245 250 255

25 Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys 260 265 270 Phe Glu Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe Asp Asp Asp 275 280 285 Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser 30 290 295 300 Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Vai Vai Arg Thr Vai Cys Leu 305 310 315 Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu 320 325 330

35 Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu 335 340 345 Arg Leu Lys Glu Ala His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys 350 355 360 101475 Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu 365 370 375 Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His 380 385 390

5 Cys Gly Gin Lys Asp Vai Pro Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn 425 430 435 Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 440 445 10 tai kuvan 1 mukaisen plasmidin pA33 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi, joka koodittaa koko t-PA-proteiinia tai sen johdannaista, joka sisältää Kringel I-, Kringel II- ja proteaasialueiden lisäksi vielä muita t-PA-proteiinin alueita, lisätään plasmidiin, ja poistetaan suunnatulla mutageneesillä ne alueet, jotka koodittavat aminohappoja, jotka eivät esiinny patenttivaatimuksessa 1 esitetyssä t-15 PA-johdannaisessa.

5 Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr 140 145 150 Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Vai Leu 155 160 165 Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Vai Pro Ser Cys 10 170 175 180 Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile 185 190 195 Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gin Ala 200 205 210

15 Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu 215 220 225 Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala 230 235 240 His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Vai Ile 20 245 250 255 Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys 260 265 270 Phe Glu Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe Asp Asp Asp 275 280 285 ; 25 Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser 290 295 300 Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Vai Vai Arg Thr Vai Cys Leu 305 310 315 Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu 30 320 325 330 ? Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu 335 340 345 Arg Leu Lys Glu Ala His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys 350 355 360

35 Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg Thr Vai Thr Asp Asn Met Leu 365 370 375 Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His 380 385 390 101475 Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Leu Asn 395 400 405 Asp Gly Arg Met Thr Leu Vai Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly 410 415 420

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että työskennellään 25-1000 mmol/1 L-arginiinin läsnäollessa.

5 Phe Glu Val Glu Lys Tyr lie Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp 275 280 285 Thr Tyr Asp Asn Asp lie Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser 290 295 300 Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu 10 305 310 315 Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu 320 325 330 Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu 335 340 345

15 Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys 350 355 360 Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu 365 370 375 . Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His 20 380 385 390 Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn 395 400 405 Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly lie lie Ser Trp Gly Leu Gly 410 415 420

25 Cys Gly Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn 425 430 435 Tyr Leu Asp Trp lie Arg Asp Asn Met Arg Pro 440 445 30 tunnettu siitä, että ekspressioplasmidi, joka käsittää seuraavan DNA-sekvenssin: ! 101475 AT GT CTT ACC AAGT GAT CGAT ACC AGGGCC ACGT GCT ACGAGGACC AGG GCATCAGCTACAGGGGCACGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGCCGAGT GCACCAACTGGAACAGCAGCGCGTTGGCCCAGAAGCCCTACAGCGGGCG GAGGCCAGACGCCATCAGGCTGGGCCTGGGGAACCACAACTACTGCAGA 5 AACCC AG AT CG AG ACT C AAAGCCCT GGT GCT ACGT CTTT AAGGCGGGG A AGTACAGCTCAGAGTTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTCTGAGGGAAACAG T GACTGCT ACTTT GGGAAT GGGTC AGCCTACCGT GGC ACGC AC AGCCTC A CCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCT CCCGT GGAATTCC AT G ATCCTGAT AGGC AAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCA 10 AAC AT AATT ACT GCCGGAATCCT GAT GGGGAT GCC AAGCCCTGGT GCC A CGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCC TGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAA AGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCT TT GCC AAGC AC AGG AGGTCGCCCGG AG AGCGGTTCCTGT GCGGGGGC AT 15 ACTC ATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCC ACTGCTTCC AGGAGA GGTTT CCGCCCC ACC ACCTGACGGT G ATCTT GGGC AG AAC AT ACCGGGT GGTCCCTGGCGAGGAGGAGC AG AAATTT GAAGTCGAAAAAT AC ATT GT C CAT AAGGAATTCGAT GAT GAC ACTT ACGAC AAT GAC ATT GCGCT GCT GCA GCTGAAAT CGGATTCGTCCCGCTGT GCCC AGG AGAGC AGCGT GGT CCGC 20 ACTGT GTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGC AGCTGCCGGACTGG ACGG AGT GT G AGCTCTCCGGCT ACGGC AAGC AT GAGGCCTT GTCTCCTTTCT ATTCG G AGC GGCT G AAGG AGGCT CAT GT C AG ACT GT ACCC AT CC AGCCGCT GCA CAT C AC AAC ATTT ACTT AAC AG AAC AGT C ACCGAC AAC AT GCT GT GT GCT GGAGAC ACTCGG AGCGGCGGGCCCC AGGC AAACTT GC ACGACGCCTGCC : 25 AGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGT GT GTCTG AACG AT GGCCGC AT GAC TTT GGT GGGC AT CAT C AGCT GGGGCC T GGGCTGT GG AC AGAAGGAT GT C CCGGGT GT GT AC AC AAAGGTT ACC AACT ACCT AG ACTGGATTCGT GAC A ACATGCGACCG 1341 30 tai sen geneettisen koodin degeneraation puitteissa erilaisen DNA-sekvenssin, joka ! koodittaa vastaavaa t-PA-johdannaista, viedään sopivaan isäntäsoluun ja otetaan ekspressiotuote talteen viljelyalustasta tai isäntäsolujen hajottamisen jälkeen.

6. Förfarande enligt nägot av patentkrav 1-5, kännetecknat av att efter renaturalisering av t-PA-derivatet koncentreras den renaturaliserade satsen och där-efter utförs kromatografisk rengöring med hjälp av affinitetskromatografi i en ETI- 30 adsorptionskolonn. *

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t- PA-johdannaisen renaturoinnin jälkeen renaturoitu erä konsentroidaan ja sen jälkeen suoritetaan kromatografinen puhdistus affiniteettikromatografian avulla ETI-adsorberikolonnissa.

7. Förfarande enligt patentkrav 6, kännetecknat av att kromatografisk rengöring utförs med ett koncentrat av en reaktiveringssats innehällande 25-1000 mmol/1, fö-reträdesvis 200-1000 mmol/1 L-arginin. 35

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suoritetaan kromatografinen puhdistus 25-1000 mmol/1, edullisesti 200-1000 mmol/1, L-arginii-nia sisältävän uudelleenaktivointierän konsentraatilla.

8. Förfarande enligt patentkrav 7, kännetecknat av att pH hos det koncentrat som används för kromatografisk rengöring regleras till ett pH-värde over 7,0. 101475

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatogra-20 fiseen puhdistukseen käytetyn konsentraatin pH säädetään pH-arvoon yli 7,0.

9. Förfarande enligt nagot av patentkrav 6-8, kännetecknat av att eluering utförs vid ett pH-värde pä 4-6.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 6-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eluointi suoritetaan pH-arvossa 4-6. : 25 10. Menetelmä ekspressioplasmidin valmistamiseksi, joka käsittää seuraavan DNA-sekvenssin: ATGTCTTACCAAGTGATCGATACCAGGGCCACGTGCTACGAGGACCAGG GC ATC AGCT ACAGGGGCACGT GGAGCAC AGCGGAG AGT GGCGCCGAGT 30 GC ACC AACT GGAAC AGC AGCGCGTTGGCCCAGAAGCCCT AC AGCGGGCG :! G AGGCC AGACGCC ATC AGGCTGGGCCTGGGGAACC AC AACTACTGC AGA AACCC AGATCGAGACTC AAAGCCCT GGT GCT ACGTCTTT AAGGCGGGG A AGTACAGCTCAGAGTTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTCTGAGGGAAACAG TGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCA 35 CCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGC AAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCA AACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCA CGTGCTG AAG AACCGC AGGCTG ACGTGGGAGT ACT GT GATGT GCCCTCC 101475 TGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAA AGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCT TT GCC AAGC AC AGGAGGT CGCCCGGAGAGCGGTTCCTGT GCGGGGGC AT ACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGA 5 GGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGT GGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTC CATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCA GCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGC ACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGT 10 GTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGC ATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCG GAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCA CAT C AC AAC ATTT ACTT AAC AGAAC AGTC ACCGAC AAC AT GCTGT GTGCT GGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCC AGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGAC 15 TTT GGT GGGC ATC AT C AGCT GGGGCCTGGGCT GT GG AC AG AAGGAT GT C CCGGGTGT GT AC AC AAAGGTT ACC AACT ACCT AGACTGGATTCGT G AC A ACATGCGACCG 1341 tai sen geneettisen koodin degeneraation puitteissa erilaisen DNA-sekvenssin, joka 20 koodittaa proteiinia, joka on glykosyloimaton ja jolla on seuraava aminohappo-sekvenssi: (M) Ser Tyr Gin Vai Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gin ' 25 5 10 15 Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala 20 25 30 Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr 35 40 45

30 Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His V 50 55 60 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr 65 70 75 Vai Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro 35 80 85 90 Ala Cys Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser 95 100 105 101475 Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys 110 115 120 Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Vai Tyr Thr Ala 125 130 135

10 Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys 350 355 360 Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu 365 370 375 Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His 15 380 385 390 Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn 395 400 405 Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly lie lie Ser Trp Gly Leu Gly 410 415 420

20 Cys Gly Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn 425 430 435 Tyr Leu Asp Trp lie Arg Asp Asn Met Arg Pro 440 445 ; 25 eller plasmid pA33 enligt figur 1, kännetecknat av att DNA-sekvensen som kodar hela t-PA-proteinet eller dess derivat, vilket förutom Kringel I-, Kringel II- och proteasomrädena innehäller ytterligare andra omräden av t-PA-protein, tillsätts till plasmiden, och med riktad mutagenes elimineras de omräden som kodar aminosyror och inte ännu förekommer i t-PA-derivatet i patentkrav 1. 30

10 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr 65 70 75 Vai Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro 80 85 90 Ala Cys Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser 15 95 100 105 Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys 110 115 120 Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Vai Tyr Thr Ala 125 130 135

20 Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr 140 145 150 Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Vai Leu 155 160 165 Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Vai Pro Ser Cys 25 170 175 180 Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile 185 190 195 Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gin Ala 200 205 210

30 Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu ♦ 215 220 225 Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala 230 235 240 His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Vai Ile 35 245 250 255 Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys 260 265 270 Phe Glu Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe Asp Asp Asp 101475 275 280 285 Thr Tyr Asp Asn Asp lie Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser 290 295 300 Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Vai Vai Arg Thr Val Cys Leu 5 305 310 315 Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu 320 325 330 Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu 335 340 345

10. Förfarande för framställning av expressionsplasmid omfattande följande DNA-5 sekvens: ATGTCTTACCAAGTGATCGATACCAGGGCCACGTGCTACGAGGACCAGG GC ATC AGCTAC AGGGGC ACGT GGAGC AC AGCGGAGAGT GGCGCCG AGT GCACCAACTGGAACAGCAGCGCGTTGGCCCAGAAGCCCTACAGCGGGCG 10 GAGGCCAGACGCCATCAGGCTGGGCCTGGGGAACCACAACTACTGCAGA AACCCAGATCGAGACTCAAAGCCCTGGTGCTACGTCTTTAAGGCGGGGA AGT AC AGCTC AGAGTTCTGC AGC ACCCCTGCCTGCTCT GAGGGAAAC AG T GACT GCT ACTTT GGGAAT GGGTC AGCCT ACCGT GGC ACGC AC AGCCTC A CCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGC 15 AAGGTTTAC AC AGCAC AGAACCCC AGTGCCC AGGC ACTGGGCCTGGGC A AACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCA CGT GCTGAAG AACCGC AGGCTGACGT GGGAGT ACT GT GAT GTGCCCTCC T GCTCC ACCTGCGGCCTGAGAC AGT AC AGCC AGCCT C AGTTTCGC AT C AA AGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCT 20 TTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCAT ACTC AT C AGCTCCTGCTGGATT CTCTCTGCCGCCC ACT GCTT CC AGGAGA GGTTTCCGCCCC ACC ACCT GACGGT G ATCTT GGGC AGAAC AT ACCGGGT GGTCCCTGGCGAGGAGGAGC AGAAATTT GAAGTCG AAAAAT AC ATT GT C CAT AAGG AATTCG AT G ATGAC ACTT ACGAC AAT GAC ATT GCGCTGCTGC A 25 GCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGC ACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGT GT GAGCTCTCCGGCTACGGC AAGC AT G AGGCCTT GTCTCCTTTCT ATTCG GAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCA CAT C AC AAC ATTT ACTT AAC AGAAC AGTC ACCG AC AAC AT GCTGT GT GCT 3 0 GG AG AC ACTCGGAGCGGCGGGCCCC AGGC AAACTTGC ACGACGCCTGCC AGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGT GT GT CT GAACG AT GGCCGC AT GAC TTT GGT GGGC AT CAT C AGCT GGGGCCTGGGCT GT GGAC AGAAGG AT GT C CCGGGT GTGT AC AC AAAGGTT ACC AACT ACCT AG ACT GG ATTCGT G AC A AC AT GCGACCG 1341 35 eller en annordlunda DNA-sekvens inom ramen för degenereringen av dess gene-tiska kod, varvid DNA-sekvensen kodar protein som är oglykosylerat och har följande aminosyrasekvens: 101475 (M) Ser Tyr Gin Vai Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gin 5 10 15 Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala 5 20 25 30 Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr 35 40 45 Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His 50 55 60

11. Förfarande enligt patentkrav 10, kännetecknat av att som DNA-sekvens för t-PA-proteinet eller dess derivat används motsvarande cDNA.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA-proteiinin tai sen johdannaisen DNA-sekvenssinä käytetään vastaavaa cDNA.ta.

12. Plasmidi pA33, tunnettu siitä, että se on kuvassa 1 esitetyn mukainen.

12. Plasmid pA33, kännetecknat av att den motsvarar figur 1. 35