KR970008485B1

KR970008485B1 - 조직형 플라스미노겐 활성화제의 유도체

Info

Publication number: KR970008485B1
Application number: KR1019900702203A
Authority: KR
Inventors: 안네 슈테른; 울리히 쾬네르트; 라이너 루돌프; 슈테판 피셔; 울리히 마르틴
Original assignee: 뵈링거 만하임 게엠베하; 독트르. 다움 · 독트르. 포우쿠에트
Priority date: 1989-02-07
Filing date: 1990-02-06
Publication date: 1997-05-24
Also published as: SK279029B6; CZ55890A3; LU90025I2; JP2559538B2; LV10302B; CA2025900C; NO2000002I1; ATE126270T1; NO306563B1; CA2025900A1; NL970008I2; HK153396A; AU623228B2; GR3017099T3; GR900300140T1; FI100244B; NL970008I1; CZ281836B6; US5223256A; EP0382174B1

Abstract

없음

Description

조직형 플라스미노겐 활성화제의 유도체

제1도는 플라즈미드 pA 27.3의 구성을 도식으로 표시한 것이다.

제2도는 본 발명에 따른 t-PA 유도체(커브 1)의 섬유소 결합을 CHO 세포에서 발현된 천연 t-PA(생리학적 절단부위 Arg 275-Ile 276에서 전달된, CHO 세포 유래의 이본쇄 t-PA, 커브 2) 및 CHO 세포 유래의 일본쇄 t-PA(커브 3)의 섬유소 결합과 비교한 것을 표시한다.

제3도 및 제4도는 본 발명 t-PA 유도체의 t-PA 활성 약물동태학을 통상적으로 입수가능한 t-PA 제조물(Acti-lyse^R)과 비교하여 그래프로 표시한 것이다.(커브 1 : K2P, 투여량 200000U/㎏=0.25㎎/㎏ 30분간 정맥내 inf. : 검사한 동물(토끼)의 수 : 4; 커브 2 : Act-ilyse^R; 투여량 200000U/㎏; 30분간 정맥내 inf., 검사한 동물(토끼)의 수 : 6)

제5도는 본 발명 t-PA 유도체의 혈전용해 투여량 감응 커브(토끼의)를 Actilyse^R과 비교하여 표시한 것이다(평균값+SEM, 1KU=1000IU로 표시; 커브 1 : K2P; 커브 2 : Actilyse^R)

제6도는 마취된 개(dog)에다 위약 또는 증가하는 투여량의 Actilyse^R를 정맥내 볼러스(bolus) 주사하기 전 및 주사한 후에 Simplate 출혈시간(BT)에 대한 시간 경과를 표시한 것이다.

제7도는 마취된 개에다 위약 또는 증가하는 투여량의 K2P를 정맥내 볼럭스 주사하기 전 및 주사한 후에 Simplate 출혈시간(BT)에 대한 시간 경과를 표시한 것이다.

본 발명은 신규의 t-PA 유도체, 신규의 t-PA 유도체를 암호화한 DNA 서열, t-PA 유도체를 암호화한 DNA 서열을 함유한 발현 플라즈미드, 이러한 플라즈미드의 제조방법, t-PA 유도체의 생산방법 및 t-PA 유도체를 함유한 혈괴(blood clot)를 용해시키는 시약에 관한 것이다.

응고된 혈액은 단백질 매트릭스의 주성분인 중합 섬유소를 함유한다. 섬유소는 생리학적 조건하에서 혈액응고의 반응단계와 유사한 단계적인 반응의 섬유소 용해 시스템에 의해 용해된다. 여기서의 중심반응은 예컨대 조직형 플라스미노겐 활성화제(tissue-type plasminogn activator)인 t-PA에 의해 매개되는 플라스미노겐의 플라스민으로의 활성화이다. 다음에 플라스민은 응고된 혈액의 단백질 매트릭스 주성분인 섬유소를 용해시킨다. 천연 t-PA나 또는 유전 공학에 의해 진핵생물로부터 얻은 t-PA의 효소적 활성(즉 플라스미노겐을 플라스민으로 촉매적 활성화하는)은 섬유소나 섬유소원 분해 생성물의 부재에서 매우 낮지만, 이들 단백질의 존재에서 실질적으로 10배 이상으로 증가할 수 있다.

t-PA는 혈액에 존재하는 프로테아제에 의해 A-사슬과 B-사슬로 절단된다. 이들 두 부분의 사슬은 시스테인 결합을 통해 결합관계를 유지한다.

t-PA의 활성을 자극하는 능력은 우로키나제 또는 스트렙토키나제 같은 기타 공지된 플라스미노겐 활성화제와 비교하여 중요한 이점을 지닌다(예를 들어 M. Hoylaerts)와 그의 동료, J. Biol. Chem. d257(1982), 2912-2919; W. Nieuwenhuizen과 그의 동료, Biochem. Biophys. Acta, 755(1983) 531-533 참조).

생체내 t-PA의 작용 메카니즘이 예를 들어 Korniger and Collen, Thromb. Hamostasis 46(1981), 561-565에 기재되어 있다. 섬유소 표면상의 효소 활성집중은 t-PA를 병리학적 혈관 폐쇄(예를 들어 심근경색증)의 치료에 적당한 시약이 되도록 해주는 바, 이러한 것은 임상실험에 의해서도 상당한 정도까지 확인되었다(Collen과 그의 동료, Circulation 70(1984), 1012; Circulation 73(1986), 511).

그러나, t-PA는 혈장내 농도에 있어서 빠른 감소(제거)를 보여주는 단점을 지닌다. 그 결과. 비교적 당량의 t-PA가 혈전의 효과적인 분해를 위해 필요로 된다. 다른 한편으로, 치료적 투여량이 많아지면 예를 들어 출혈같은 부작용이 생긴다.

단지 프로테아제 영역과 크링글(kringle) II 영역만을 함유하며, N-말단이 알라닌 160으로 시작하는 t-PA의 천연분해 산물이 EP 제0 196 920호에 기재되어 있다. (Pennica와 그의 동료에 의해 Nature 301(1983), 214-221에 기술된 아미노산 서열에 따른 열거시스템).

그러나 이러한 t-PA 분해산물의 제거율은 천연 t-PA의 제거율과 상당한 차이가 나지 않고, 따라서, 블록킹(blocking) 그룹을 부착시켜 촉매영역을 화학적으로 변형시키는 방법만이 향상된 결과를 가져올 것으로 사료된다.

그러므로 본 발명의 목적은 t-PA를 변형시켜 결과의 유도체가 더 감소된 제거율을 가지므로서 혈장내에서 더 긴 반감기를 갖도록 하는데 있다.

이런 방법에서 t-PA의 혈전 용해 능력과 섬유소에 의한 자극 능력은 유지되어야 한다.

그러므로 본 발명의 구체예는 하기 아미노산 서열 또는 부가적인 N-말단 메티오닌을 갖는 아미노산 서열로 구성된 혈전용해활성을 갖는, 비글리코실화된 조직형 플라스미노겐 활성화제(t-PA) 유도체를 제공한다.

놀랍게도, 천연의 t-PA에 존재하는 기타 영역이 결실되었을때도 t-PA의 혈전용해 효력은 영향을 받지않았으며, 이러한 돌연변이 t-PA의 섬유소-의존성 자극능력은 원래의 t-PA의 그것에 필적하였다. 본 발명 t-PA 유도체는 섬유소에 결합특성을 결하긴 했어도, 놀랍게도 천연 t-PA의 혈전용해 효력에 비해 매우 향상된 생체내 혈전용해 효력을 나타내었다. 또한 놀랍게도 효가적인 혈전용해에 충분한 투여량을 투여할때도 전신계의 섬유소 용해에는 거의 영향을 미치지 아니하였다. 그러므로 생리학적 조건하에서 본 발명에 따른 t-PA 유도체가 섬유소 특이성의 대표적인 t-PA 특성을 나타냄이 입증되었다. 이러한 결과들을 본 발명에 따른 t-PA 유도체의 약리학적 검사로 얻었다(실시예 6 및 7 참조). 부가하여, 본 발명에 따른 단백질은 매우 높은 비활성을 갖는다. 기술되어 있는 복원방법을 이용하여 이미 500-800KU/㎎의 활성을 측정한 바 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명의 t-PA 유도체를 암호화한 다음과 같은 서열의 DNA 서열을 제공하는 것이다.

본 발명 DNA 서열은 발현 플라즈미드에 존재시 본 발명 t-PA 유도체를 발현시킨다. 이러한 종류의 발현 플라즈미드 뿐 아니라 본 발명의 t-PA 유도체를 암호화하지만 다른 DNA 서열을 갖는 발현 플라즈미드 또한 본 발명의 구체예가 된다. 상술한 DNA 암호서열과는 다른 암호서열도 본원 목적에 적합할 수 있는데, 이는 유전 암호서열의 변형(degeneracy)에 기인한다.

t-PA 유도체를 암호화한 서열 이외에 발현 플라즈미드는 또한 조절될 수 있는 프로모터(pormotor) 구조(예를 들어 tac), 효율적인 터미네이터(terminator)(예를 들어 fd), 선택마커(marker)(예를 들어 β-락타마제 유전자) 및 복제기원(origin)을 바람직하게 함유한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 플라즈미도 pA 27.3이다. 이 플라즈미드를 만드는 것이 실시예 1에 기술되어 있으며 이것은 본 발명의 t-PA 유도체를 암호화한 DNA 서열을 갖는다.

본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명의 t-PA 단백질 또는 크링글 II 및 프로테아제 영역 이외에 t-PA 단백질의 또 다른 부분을 함유한 t-PA 단백질의 유도체를 암호화한 DNA 서열을 플라즈미드에 삽입시킨뒤, 본 발명의 t-PA 유도체에 존재하지 않는 아미노산을 암호화한 기타 영역을 위치특이적 돌연변이유발법에 의해 삭제시키는 것으로 구성되는, 본 발명의 발현 플라즈미드중의 하나 만드는 방법을 제공한다.

본 발명의 t-PA 유도체를 암호화한 DNA 서열을 삽입시킬 플라즈미드의 선택은 이러한 유도체를 발현시키기 위해 나중에 사용되는 숙주세포에 따라 달라진다.

적당한 플라즈미드 뿐 아니라 이러한 플라즈미드에 대한 최소의 필요조건(예를 들어 복제기원, 제한부위)이 당 업계의 숙련자에게 공지되었다. 본 발명의 범위내에서 코즈미드[파아지(入,M13)의 이본쇄(doublestranded) 복제형태] 및 기타 당 업계의 숙련자에게 공지된 벡터가 플라즈미드 대신에 사용될 수 있다. 위치특이적 돌연변이유발법은 Morinaga 등의, Biotechnology 21, (1984), 634에 기재되어 있으며 이러한 방법은 기본적으로 기술되어 있는 바와 같이 행해진다.

본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명의 플라즈미드 중 하나를 적당한 숙주세포에 발현시키고 필요하다면 숙주세포의 용해후에 생성물을 배양배지로부터 분리시키는 것으로 특징되는, 본 발명의 t-PA 유도체 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 t-PA 유도체 생산에는 원핵 세포를 숙주세포로서 사용하는 것이 바람직하다. 이와 관련하여, 우선 상기 과정동안에 형성된 소위 "봉입체(inclusion body)"를 가요성 세포입자로부터 분리하고, t-PA를 함유하는 봉입체를 환원조건하에서 구아니딘 하이드로 클로라이드로 처리하여 가용화시킨 다음, 이것을 GSSG로 유도체화 하고 마지막으로 L-아르기닌과 GSH를 부가하여 t-PA 유도체를 복원시키는 것이 특히 바람직하다. "봉입체"로부터 t-PA를 활성화시키는 것에 대한 정확한 사항이 예를 들어 EP-A 제0 219 874호 및 EP-A 제0 241 022호에 기재되어 있다. 그러나, 본 발명에 따라 봉입체로부터 활성 단백질을 분리하는 기타 방법이 또한 이용될 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 K2P 정제는 L-아르기닌 존재에서, 특히, L-아르기닌 농도 10-1000mmol/l에서 행해지는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 친화성 크로마토그래피에 의한 본 발명 외래 단백질 분리는 ETI(에리트리나 트립신 억제제) 흡착 컬럼에서 행해진다. 이와 관련하여, ETI는 예를 들어 세파로스(Sepharose) 같은 담체물질(흡착제)에 고정된다. FTI 흡착컬럼으로 정제시키는 것은 ETI 흡착 컬럼 물질이 0.8mol/l 아르기닌과 같은 고농도의 아르기닌 존재에서도 농축된 복원제조물로 직접 충전될 수 있다는 이점을 갖기 때문이다. 이같은 방법으로, 10mmol/l 이하의 낮은 아르기닌 농도에서 일어날 수 있는 K2P의 응집이 피해진다. 그러므로, 0.6-0.8mol/l 아르기닌 존재하의 ETI 흡착 컬럼에서 K2P를 정제시키는 것이 특히 바람직하다.

이러한 방법에서 K2P를 함유하는 용액은 바람직하게 7 이상의 pH(특히 바람직하게 7.5-8.6의 pH)를 갖는다.

ETI 컬럼으로부터 용리시키는 것은 K2P의 가용성이 양호하도록 하는 조건하의 아르기닌 존재 또는 부재에서 pH를 낮추므로써 행해진다. 용리하는 동안 pH 값은 바람직하게 산성 범위이며 특히 바람직하게 3-5.5의 범위이다.

본 발명에 따른 만들어진 K2P는 95% 이상, 바람직하게 99% 이상의 순도와 함께 550000±200000IU/㎎의 t-PA 비(比) 활성을 갖는다.

그러므로, 본 발명에 따라, 감소된 제거율에 기인하여 상당히 긴 혈장내 반감기를 갖는 t-PA 유도체가 제공된다. 그러나, 본 발명에 따른 유도체는 자신을 동맥 및 정맥 혈전의 혈전용해용 치료제로서 적당하도록 하는 혹종의 여하한 특성도 잃지 않음과 동시에 K2P 이용 혈전용해 치료에 필요로 되는 투여량을 천연 t-PA에 대한 일반적인 투여량의 최소한 1/4로 감소시켜 준다. K2P와 천연 t-PA의 동등한 효능을 나타내는 투여량을 썼을 때, K2P는 천연 t-PA 보다 응고 시스템에 미치는 영향이 한층 적어, 천연 t-PA와는 대조적으로 K2P 이용치료시 발생하는 출혈합병증을 감소시켜 줄 수 있는 정도로 출혈시간을 상당히 연장시켜줌을 볼 수 있었다.

그러므로 본 발명의 t-PA 유도체는 약제용으로 특히 적당하며, 이것은 또한 본 발명의 또 다른 구체예가 된다. 본 발명의 t-PA가 약제로서 사용되는 경우에는 CHO에서 만들어진 천연 t-PA에 보다 상당히 더 적은 투여량만을 투여하면 된다.

본 발명은 도면과 함께 다음 실시예로 설명된다.

플라즈미드 pA 27.3의 구성

EP-A-O 242 836에 기재되어 있는 출발 플라즈미드 pREM 7685는 tac-프로모터, ATG-출발코돈(codon)을 갖는 lac-오퍼레이터 부분, t-Pa 유도체 FK2P를 암호화한 부분, PKK 223-3으로부터의 전사터미네이터, β-락타마제 유전자, 카나마이신 저항성의 유전자 및 플라즈미드 pACYC 177(세포내에 적은 복사수로 존재하는)의 기원을 함유한다. t-PA 유도체 FK2P의 서열은 누클레오타이드 190-336(F-영역), 715-1809(K2-영역, 프로테아제, 3'UT의 작은 부분) 및 ATG-출발코돈으로 구성된다. 누클레오타이드 위치는 Pennica와 그의 동료, Nature 301(1983) 214-221에 의해 기술된 서열을 인용하였다.

플라즈미드 pREM 7685 내 FK2P 구조로부터 F-영역을 삭제하는데는 Morinaga와 그의 동료, Biotechnology 21(1984), 634의 방법을 기본적으로 사용하였다.

헤테로이본체(heteroduplex)를 만들기 위해 두개의 단편을 pREM 7685로부터 분리하였다. 단편 A는 pREM 7685를 제한 효소 EcoR I 로 절단한 후, 절단 생성물을 겔 전기영동법으로 분리하여 가장 큰 EcoR I 단편을 겔로부터 용리시켜 A로 취하였다.

단편 B는 플라즈미드 pREM 7685를 제한 효소 Xho I로 선형이 되게 한 후, 상술한 바와 같은 겔 전기영동법으로 정제해 얻은 선형 플라즈미드를 B로 취하였다. 돌연변이유발용의 다음 올리고누클레오타이드를 합성적으로 제조했다.

5'TG TCT TAC CAA GGA, AAC AGT GA 3'

헤테로이본체를 형성시키기 위해, 단편 A, 단편 B(각각 450fmol) 및 올리고누클레오타이드(75pmol)를 혼합하고, 50mmol/l NaCl, pH 7.5의 10mmol/l 트리스(Tris)-HCL 및 10mmol/l MaSO₄의 존재내 100℃에서 3분간 초기에 인큐베이팅한 다음 즉시 얼음에 옮겼다. 60℃에서 30분간 DNA를 복원시켰다. 복원합성을 위해 헤테로이본체에다 데옥시누클레오타이드 트리포스페이트(0.25mmol/l), ATP(1lmmol/l), NaCl(100mmol/l), pH 7.5의 트리스-HCl(6.5mmol/l), MaCl₂(8mmol/l), β-머캅토에탄올(1mmol/l), E. Coli 유래의 DNA-폴리머 라제의 Klenow 단편(0.125U/μl 반응 혼합물) 및 T4-리가제(0.1U/μl 반응 혼합물)를 부가했다. 복원 합성을 16℃에서 4시간 동안 행하였다. 연속해서, 이 제조물을 lac Iq-플라즈미드를 사용해 E. Coli 세포(RM 82, DSM 3689)에 도입시키고 25㎍/μl의 카나마이신을 배양배지에 부가함에 의해 형질전환된 세포를 선별하였다.

본 발명의 t-PA 유도체 K2P를 암호화하는 플라즈미드 pA 27.3을 함유한 클론들을 상기 기술된 돌연변이유발 올리고누클레오타이드를 탐침으로서 사용하여 콜로니 교잡형성(hybridisation) 방법으로 선별하였다. 이러한 플라즈미드는 특히 출발 플라즈미드 pREM 7685와는 달리 Pat I 또는 Ssp I 분해 부위를 지니지 않는다.

이들 두 분해부위는 출발 플라즈미드의 F-영역을 암호화한 부분에 함유되어 있다. 플라즈미드 pA27.3의 구성을 제1도에 도식으로 표시하였다.

[실시예 2]

E. Coli 유래 활성 t-PA 유도체 K2P의 제조

세포 용해 및 봉입체(IB's)의 제조

플라즈미드 pA 27.3으로 형질전환시킨 습윤 중량이 1.6㎏인 세포(E. Cooi, DSM 3689)를 0.1mml/l 트리스-HCl, 20mmol/l EDTA(pH 6.5) 10l에 4℃에서 현탁시키고 2.5g의 리소짐(lysozyme)을 이것에 부가하여 4℃에서 30분간 인큐베이팅시킨 후 고압분산으로 완전한 세포용해를 행하였다. 0.1mol/l 트리스-HCL, 20mmol/l EDTA, 6% Triton X100 및 1.5mol/l NaCl(pH 6.5) 5l를 용해물 용액과 혼합하고 4℃에서 30분간 또 인큐베이팅시켰다. 다음에 봉입체(IB's)를 Padberg 원심분리로 분리시켰다.

펠릿(pellet)을 0.1mol/l 트리스-HCL, 20mmol/l EDTA(pH 6.5) 10ℓ에 현탁시키고 4℃에서 30분간 인큐베이팅시킨, 뒤, IB-제조물을 원심분리로 분리시켰다.

IB's의 가용화

100g(습윤 중량)의 IB's를 0.1mol/l 트리스-HCl, 6mol/l 구아니딘. HCl, 0.2mol/l(1,4-디티오에리트피톨), 1mmol/l EDTA(pH 8.6) 450ml에 현탁시키고 25℃시간 동안 교반하였다.

pH를 HCl(25%)로 pH 3으로 조절한 후에, 용액을 10mmol/l HCl(3X 50ℓl, 24시간, 4℃)에 대해 투석시켰다.

유도체화

상기 투석물을 10mmol/l HCl로 최종 희석시킨 후에 구아니딘-HCl 농도가 6mol/l가 되도록 구아니딘. HCl(고체)를 부가했다.

제조물을 25℃에서 1.5시간 동안 미리 인큐베이팅시키고, 산화형 글루타티온(GSSG) 농도를 0.1mol/l로, 트리스-HCl 농도를 0.05mol/l로 조절한 후에 5mol/l NaOH로 pH를 pH 9.3으로 적정하였다. 제조물을 25℃에서 3.5시간 동안 교반했다.

HCl(25%)로 pH 값을 pH 3으로 조절한 후에 용액을 10mmol/l HCl(3X 100 1, 48기간, 4℃)에 대해 투석시켰다. 투석후에 제조물을 원심분리시켜, 투명한 상등액을 취하였다.

복원

0.1mol/l 트리스-HCl, 0.8mol/l L-아르기닌, 2mmol/l GSH(글루타티온, 환원형), 1mmol/l EDTA를 (pH 8.5)를 10ℓ의 반응용기에 채웠다. 100ml의 유도체(디설파이드를 혼합한, 상기 참조)를 20℃에서 24시간 간격으로 3번 부가함에 의해 복원을 행하였다.

복원시킨 후에 1500-10000IU/㎎의 비(比) 활성을 지닌 제조물을 얻었다(정량은 실시예 4b 참조). IU 단위는 생물학적 표준과 조절에 대한 국제 기관인 WHO의 정의에 따른 활성 단위이다.

복원 제조물의 농축

필요하다면, 복원된 제조물을 혈액투석기로 농축시킨다.

[실시예 3]

E. Coli 유래 K2P의 정제

1. 사전 농축후 ETI-세파로스상의 친화성 크로마토그래피에 의한 E. Coli 유래 K2P의 정제.

a) 시트르산을 사용한 용리

복원 제조물을 혈액투석기(Asahi AM 300)에서 1 : 23으로 농축시키고 0.5mol/l NaCl을 보충하였다. 550ml의 재산화 제조물의 농축물을 pH 7.5의 0.1mol/l 트리스-HCl, 0.8mol/l 아르기닌, 0.5mol/l NaCl로 평형시킨 ETI(에르트리나-트립신-억제제) 세파로스 컬럼(V=50ml)에 주입하고(시간당 10컬럼 부피, 10CV/시간), 280nm에서 용리액의 흡광도가 완충액의 블랭크 값에 이를때까지 평형 완충액으로 세척하였다. 결합된 물질을 pH 3.2의 20mmol/l 시트르산으로 용리시켰다.

1) 비(比) 활성(specific activity) ; 샘플의 단백질 함량으로 나눈 색원체 테스트(실시예 4b 비교 참조)에 있어서의 활성

b) pH 4.5의 0.3mol/l 아르기닌을 사용한 용리

복원된 제조물을 실시예 3, 1, a)에 기술된 바와 같이 농축시켰다. pH 7.5의 0.1mol/l 트리스-HCl, 0.8mol/l 아르기닌, 0.5mol/l NaCl로 평형시킨 ETI-세파로스 컬럼(25ml; 12CV/시간)에다 800ml의 상기 농축물을 주입하고 280nm에서 용리액의 흡광도가 완충액의 블랭크 값에 이를때까지 평형 완충액으로 세척했다. 결합된 물질을 pH 4.5의 0.3mol/l 아르기닌으로 용리시켰다.

2. 사전 농축시킴 없이 행한 ETI-세파로스상의 친화성 크로마토그래피에 의한 E. Coli 유래 K2P의 정제 0.1mol/l 트리스-HCl, 0.8mol/l 아르기닌, 0.5mol/l NaCl pH 7.5로 평형시킨 ETI-세파로스 컬럼(V=10ml)에다 12l의 재산호 제조물을 주입하고 용리액의 흡광도가 완충액의 흡광도에 이를 때까지 평형 완충액으로 세척하였다. 결합된 물질을 pH 5의 0.8mol/l 아르기닌으로 용리시켰다.

1) F : 섬유소에 의한 자극=섬유소 부재에서의 활성으로 나눈 섬유소 존재에서의 활성

[실시예 4]

E. Coli 유래 정제된 K2P의 특성화

a) 단백질의 특성화

-SDS-PAGE 및 역상(reversed-phase) HPLC

ETI-세파로스상의 친화성 크로마토그래피로 정제한 제조물의 균질성을 SDS-PAGE 및 역상 HPLC(RP-HPLC)로 입증했다. 원핵생물 유래 K2P의 분자량은 상대적인 이동도를 토대로 계산한 결과 2000Da이었다. 농도계로 분석한 결과 제조물의 순도는 >95%이었다.

RP-HPLC는 소수성 매트릭스와 단백질의 상이한 상호작용에 기초한다. 이러한 특성을 순도를 정량화하는 분석 방법으로서 사용했다.

E. Coli 유래 정제된 K2P를 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 구배액(gradient)(완충액 A : 1000ml, H₂O 내 1.2ml 트리플루오로아세트산 ; 완충액 B : 300ml H₂O, 700ml 아세토니트릴, 1ml 트리플루오로아세트산; 0-100%)를 이용해 Nucleosil 300분리 컬럼(Knauer)에서 분석하였다. 크로마토그래피 분석으로 순도가 >95%임을 알았다.

-N-말단의 아미노산 서열

표준 프로그램 및 온라인(on-line) PTH 검출기를 지는 ABI 470 시퀀서(sequencer)를 이용해 N-말단의 아미노산 서열을 결정했다. 결정된 서열 SI-Y2-Q3-G4-N5-S6-D7-C8-Y9는 DNA-서열로부터 추론되어 예기됐던 서열과 일치하였다.

b) 활성 결정

E. Coli 유래 K2P의 시험관내 활성을 "Zeitschrift fur die gesamte innere Medizin"(ZGIMAL) 42(17) 478-487(1987)의 테스트에 따라 측정하였다. 특이적인 활성은 550000 IU/㎎±200000IU/㎎이었다. 본 테스트 시스템에서 BrCN-섬유소원 단편에 의한 E. Coli 유래 K2P의 자극능력(섬유소원 단편 부재에서의 활성으로 나눈 섬유소원 단편 존재에서의 활성)은 >25이었다.

c) 시험관에 섬유소에 대한 결합.

시험관내 섬유소에 대한 E. Coli 유래 K2P의 결합을 Higgins and Vehar가 기술한 방법(D. L. Higgins, G. A. Vehar, Biochem. 26, (1987)7786-7791)에 따라 검사했다.

제2도는 E. Coli 유래 K2P가 CHO 유래 t-PA 또는 E. Coli 유래 t-PA와는 달리 섬유소와 상당한 정도의 결합에 이르지 않는다는 사실을 보여준다.

[실시예 5]

발현 생성물의 수율을 증가시키기 위해 K2P-유전자를 암호화한 서열을 많은 복사수를 지니는 플라즈미드에 서브클로닝시켰다. DE 특허출원 제38 38 378.0호에 기재되어 있는 플라즈미드 pePa 126.1을 상기 경우에 사용했다. 이 플라즈미드는 주로 EP-A-O 242 835에 기재된 t-PA 암호 서열 및 벡터 pKK 233-3으로 구성된다.

fd-터미네이터 서열을 우선 이 플라즈미드에 삽입시켰는바, 이를 위해 플라즈미드 pePa 126.1를 제한 효소 Hind III로 선형으로 만들었다. 이런 방법으로 절단한 플라즈미드를 겔 전기영동법으로 분리시켜 정제 분리하였다. 플라즈미드 PLBU 1(Beck와 그의 동료(1978), Nucl. Acids. Res., 5, 4495-4503 ; Gent 8와 그의 동료(1981) PNAS 78(8) : 4963)을 Hind III로 절단하고, fd-터미네이터를 함유한 약 360bp의 Hind III 단편을 겔 전기영동과 겔 용리에 의해 정제 분리하였다.

선형으로 된 플라즈미드 pePA 126.1과 PLB1 유래 360bp Hind III 단편을 결찰(ligation)시켰다. 이러한 결찰 제조물을 플라즈미드 pUBS 500을 사용해, DE 특허출원 제38 38 378.0호에 기재되어 있는 E. Coli, DSM 2102내로 도입시켰다. 클론 가운데서 목적 플라즈미드 PePA 126fd를 함유한 클론(제2의 Hind III 절단부위를 함유한 점에서 출발 플라즈미드 PePA 12.61과는 다른)을 선별하였다.

두개의 단편, 즉, 3.4kb 크기의 BamH I/Pvu L-단편과 1.3kb 크기의 Pvu I/Xma I 단편을 플라즈미드 pePA 126fd로부터 분리했다. 이 두개의 단편을 플라즈미드 pA 27.31.3 유래 약 1.3kb 크기의 BamH I/Xma I 단편에 결찰시킨 뒤 플라즈미드 pUSB 500을 사용해 E. Coli내로 도입시켰다. 결과의 플라즈미드를 pA 27이라고 칭하였는바, 이것은 EcoR I 사용제한 소화시, 두번째 가장 작은 EcoR I 단편이 약 610bp 길이인 pePA 126fd와는 달리 이보다 약 515bp가 더 짧은 길이의 EcoR I 단편을 지닌다.

[실시예 6]

원핵생물내에서 발현된 t-PA 유도체 K2P의 약리학적 결과

1. 토끼내 K2P의 약물동태학

K2P와 Actilyse^R의 약물동태학적 특성을 뉴질랜드산 흰색 토끼에서 비교했다. 상기 두가지의 섬유소 용해제를 체중 ㎏당 200000IU의 투여량으로 30분간 주입했다. 주입하기전, 주입하는 동안, 주입한 후 정해진 시간에 혈장 샘플을 취하였다. t-PA 활성을 H. Lill(Z. gas. Inn. Med. 42, 478, 1987)이 변형시킨 J. H. Verheijen과 그의 동료, (Thromb. Haemostas, 48, 266, 1982)에 따른 분광 광도계 테스트로 측정하였다.

H. Y. Huang(Aero-Astronautics-Report 64, Rice Univers-ity, 1-30, 1969)에 따라 변형된 비선형 희귀에 대한 계산 프로그램을 약물동태학적 파라미터(parameter)를 계산하는데 사용했다. 두개의 지수적 약물동태학적 모델을 이용하여 상기 파라미터를 각각 계산했다.

K2P는 Actilyse^R(Thomae company의 t-PA 제조물)보다 5배 더 긴 반감기(t1/2α=10.3분, 혈장내 농도감소)를 나타내었다(표 1, 제5도 및 제6도). K2P-P20 주입종료시(30분 후) Actilyse^R로 얻었던 것보다 6배 더 높은 19861U/ml인 t-PA 활성의 혈장내 농도(Cinf)를 측정했다. 중앙에 분포하는 부분의 부피(Vc)는 Actilyse^R에 대해 73.7ml/㎏인 것에 비해 K2P에 대해 46.8ml/㎏이었다. K2P-Pro의 총혈장 제거율(Cltot)은 Actilyse^R(Cltot=22.2ml/분/㎏)에 비교하여 1/7(Cltot=3.2ml/분/㎏)로 감소했다. 섬유소 용해제를 볼러스 주사로 투여했을때 "커브 아래쪽의 면적"(AUC)는 이것이 보통 혈장농도의 시간경과를 비교할 수 있도록 하므로 특히 중요하다. K2P는 Actilyse^R(133.3IU/ml X시간)보다 8배 더 큰 AUC(1064IU/ml X 시간)을 갖는다.

K2P는 현재 통상적으로 입수할 수 있는 제조합 t-PA-단백질인 Actilyse^R와 비교하여 동일한 투여량에서 5배 내지 8배 더 양호한 약물동태학적 특성을 전반적으로 나타내었다.

2. 토끼내 K2P의 약리학

D. Collen과 그의 동료(J. Clin. Invest. 71, 368, 1983)에 의해 설정된 경정맥 모델을 혈전붕괴 효력을 검사하는데 사용했다. K2P와 Actilyse^R을 3가지의 투여량 수준에서 각각 검사했다. 섬유소 용해제를 4시간 동안 주입한 후 혈전붕괴율을 측정했다.(표 2, 제5도).

선형의 회구선을 이용하여 50% 혈전붕괴율에 대한 투여량(ED 50)을 측정했더니 K2P에 대해서는 체중 ㎏당 124000IU이고 Actilyse에 대해서는 체중 ㎏당 520000IU였다. 그러므로 K2P는 Actilyse보다 4배 더 큰 혈전붕괴활성을 나타낸다.

K2P는 4배 더 낮은 투여량에서 Actilyse^R와 비교됐던 투여량에 의존하는 t-PA 활성의 혈장농도를 얻었다. 체중 ㎏당 800KU Actilyse^R에 필적하는 혈전붕괴활성을 갖는 체중 ㎏당 200KU K2P의 투여량은 체중 ㎏당 800KU Actilyse^R의 투여량 효과와 다르지 않은 약간의 효과를 응고 파라미터들인 섬유소원, 플라스미노겐 및 α²-앤티플라스민에 미치게 했다.

K2P는 투여량이 Actilyse^R투여량이 1/4로 감소되었을때 혈정붕괴제를 주입한지 4시간 내에 혈전증의 토끼모델에서 Actilyse^R와 동일한 혈정붕괴활성을 지닌 t-PA 돌연변이체이다. 상기 감소된 투여량의 K2P는 응고 시스템에 미치는 그것의 효과와 t-PA 활성의 혈장 농도에 있어 Actilyse^R과 다르지 않다.

[표 1]

t-PA 활성에 기초하는 t-PA 혈장농도-시간 데이타의 컴퓨터 계산으로 얻은 약물동태학적 파라미터

[표 2]

K2P, Actilyse 및 용매의 혈전붕괴, t-PA 혈장 활성의 수준(4시간 주입한 후) 및 지혈 파라미터(주입한 후 30분)

평균±SEM ; kU=1000IU ; 지혈 파라미터(기본선에 대한 %)

[실시예 7]

관상동맥 혈전증에 대한 개 모델에서 E. coli 유래 K2P의 약리학적 특성 동물의 급성 심근경색증에 대한 실험용 모델을 동매의 혈전에 미치는 E. coli 유래 K2P의 혈전붕괴효과를 검사하기 위한 예로서 선택했다. 동물종으로서 개를 선택했다. 관상동맥 혈전의 형성에 대한 방법은 Romson과 그의 동료, (Thromb. Res. 17, 841, 1980)의 방법의 변형 방법이다. 인공 호흡하는 마취된 개의 열린 홍곽에서, 좌측 회선 관상동맥지(LCX)의 동맥내막 표면을 전기적으로 자극하며(150μA), 이러한 방법에 의해 혈전을 생성시켰다. 협착증에 의한 반응적 충혈을 제거하기 위해 미리 스크류를 혈전의 말단부에 끼웠다. 관상 동맥혈전에 인접한 부위에서 제관류(reperfusion)를 측정할 수 있도록 하기 위해 전자기적 유동 측정 헤드를 LCX에 설치했다.

투여량을 측정하기 위한 연구에서, 4가지 다른 투여량의 진행생물 t-PA(Alteplase, Actilyse^R, Dr. Karl Thomae GmbH, Biberach, FRG) 및 위약과 함께 BM 06.022를 초기의 단일 정맥내 볼러스로서 1분에 걸쳐 헤파린화한 개에다 주사했으며 각각의 투여량을 6마리의 동물에다 주사했다. 완전혈액내 혈소판의 수뿐 아니라 섬유소원, 플라스미노겐 및 α₂-앤티플라스민의 혈장농도 및 t-PA 활성의 혈장농도를 측정하기 위해, 주사하기 전 및 주사한 후 일정한 시간에 샘플을 취하였다.

섬유소원 Clauss(Acta haemat. 17, 237, 1957)에 따라 응고계로 측정하여, 플라스미노겐 및 α₂-앤티플라스민을 Collen과 그의 동료(J. Clin. Invest. 71, 378, 1983)에 의해 기술된 바와 같이 분광 광도계로 측정했다. 또한, "Simplate 출혈시간"을 40mmHg의 정맥혈울체(venostasis) 동안에 란셋(lancet)(Simplate^RI, Organon Teknika, Eppelheim, FRG)을 이용해 개의 뒷다리에서 측정했다. 주사한 후의 측정값과 주사하기 전의 대조값을 두개의 차이를 알아보기 위한 Wilcoxon Test에 의해 통계학적으로 비교하였다.

혈전붕괴 효과를 기술하기 위해, 재관류까지의 시간(=재관류 시간) 뿐 아니라 투여량 그룹당 재관류된 동물의 수(=재관류율)를 인용하였다. 또한, 주사후 2시간에 여전히 존재하는 잔류 혈전의 젖은 중량을 측정하고 재관류후 재교합된 동물의 수(=재교합율)을 측정하였다. 투여량 효과(재관류율)의 관계에 대한 반대수적(semi-logarithmic) 희귀 분석으로써, 50% 재관류율(ED₅₀)에 대한 효과적인 투여량을 각각의 물질에 대해 측정했다. 관계없는 임의의 샘플에 대한 Wilcoxon-Mann-Whitney 테스트를 이용하여 잔류 혈전의 중량을 통계학적으로 비교했다.

t-PA 활성의 혈장농도를 Lill(Z. gasamte Inn. Med. 42, 478, 1987)에 따라 변형된 Verheijen과 그의 동료의(Thromb. Haemost. 48, 266. 1982)에 따른 분광 광도계 테스트로 측정했다. H. Y. Huang(Aero-Astronautice-Report 64, Rice University, USA, 1-30, 1969)에 따라 변형된 비선형 회귀에 대한 계산 프로그램을 약물동태학적 파라미터를 계산하는데 사용했다. 연속적으로 측정된 값에서 t-PA 활성의 내부적 원인에 의한 기본 수준을 뺀 후에 두개의 지수적 약물동태학적 모델을 이용해 파라미터들을 각각 계산했다.

1. 개에서의 약리학

정맥내 주사후에 K2P는 투여량에 따른 재관류율을 나타내었다. 체중 ㎏당 200kU를 주사한 후에 최대 효과(100%의 재관류율)을 얻었다. 재관류에 있어 100% 성공을 이루는 Actilyse^R의 투여량은 체중 ㎏당 1600kU이다. ED₅₀값을 비교했더니 Actilyse^R에 대한 것(ED₅₀=961kU/체중 ㎏)보다 K2P에 대한 것(ED₅₀=83kU/체중 ㎏)이 11.5배 더 작았다. 위약을 투여했을때 재관류가 결과되지 않았다. 위약을 투여한 동물내 잔류혈전의 중량은 9.6±1.6㎎(평균±SEM) 이었으며, 위약을 투여한 대조 동물과 비교하여 Actilyse^R뿐 아니라 K2P의 증가하는 투여량으로써 잔류혈전의 중량이 상당히 감소하였다. K2P에 대해 25.9±3.5분 후에 또는 Actilyse^R에 대해 24.2±6.2분후에 모든 동물에 대해 평균으로서 재관류가 두개의 섬유소 용해제로써 일어났다. K2P 또는 Actilyse^R로 처리한 대부분의 개들은 재관류후 재고합했다(표 3).

2. 개에서의 약물동태학

200kU/㎏의 K2P나 Actilyse^R를 정맥내 주사한 후에,^t1/2α로서 표시된 혈장농도 증가의 빠른 페이즈(phase)는 1.6±2분에서 Actilyse^R에 대한 것보다 7.2±1.1분에서 K2P에 대한 것이 4.5 더 긴 펙터(factor)였다(표 4).

주사를 끝낸 후 즉시 측정한 K2P의 혈장농도는 Actilyse^R의 혈장농도만큼 높은 약 2배였다. 혈장으로부터 K2P의 제거율(혈장제거율=C1tot)은 Actilyse^R의 그것보다 9배 더 작았다. 상응해서, K2P의 혈장농도-시간 커브 아랫쪽의 면적은 Actilyse^R의 의한 것보다 약 9.5배 더 컸다.

3. 개에서의 섬유소 특이성

K2P를 주사한 후 2시간에 섬유소원의 잔류 농도는 투여량에 따라 감소하는데 가장 많은 투여량(200kU/체중 ㎏)에서 81±10%까지 감소했다. 비교하여, Actilyse^R의 최고 투여량(1600kU/체중 ㎏)을 투여한 후에 섬유소원 농도는 거의 완전히 3±0%까지 감소하였다(표 5). 투여량에 따른 부작용(섬유소원 감소) 관계의 반 대소적 희귀 분석을 행하고 혈전붕괴 효과에 대한 ED₅₀에 상응하는 섬유소원의 잔류 농도를 측정하게 되면, 동등한 효능을 나타내는 투여량에 대해 섬유소원의 잔류 함량은 Actilyse^R의 경우 38.6%인 것에 비해 K2P의 경우 92.5%였다. 주사후 2시간에 플라스미노겐과 α₂-앤티플라스민의 잔류 함량은 또한 투여량에 따라 낮아지며 이것은 K2P의 경우보다 Actilyse^R경우에 더욱 현저하였다. 혈소판의 농도는 실질적으로 상기 두 물질에 의해 영향받지 않는다.

4. 개에서 출혈 시간에 미치는 영향

K2P 정맥내 주사했을 때 검사한 4개의 모든 투여량에서 주사전의 대조값과 비교하여 출혈시간이 통계학상 상당히 증가하지 않았다. 대조하여, Actilyse^R경우 체중 ㎏당 1130 및 1600kU의 투여량에서 통계학상 주요한 출혈시간이 증가하였다(제6도 및 제7도).

5. 전체 평가

개의 관상동맥 혈전중에 대해 상기 기술된 모델에서, K2P는 출혈시간의 상당한 증가없이 그리고 섬유소원 농도에 주된 영향을 미침없이 100%의 재관류율을 얻을 수 있는 혈전붕괴제임이 입증되었다. K2P는 당업계의 Actilyse^R와 비교하여 정맥내 볼러스 주사한 후 이것의 혈정붕괴 효능에 있어 분명히 더 우수하였다(11.5의 펙터). 또한, K2P의 약물동태학적 특징을 검사하므로써 Actilyse^R과 비교하여 K2P의 제거율이 혈장으로부터의 더 느린 제거율 표시로 9배 더 느렸음을 알았다.

[표 3]

위약 또는 증가하는 투여량의 Actilyse^R나 K2P를 정맥내 볼러스 주사(1분간)한 후 개의 관상동맥 혈전증에 대한 모델의 혈전붕괴 파라미터

평균±SEM

[표 4]

체중 ㎏당 200000IU의 Actilyse또는 K2P를 정맥내 블러스 주사한 후 마취된 개에서 t-PA 활성에 기초한 혈자 농도-시간 데이타의 컴퓨터 계산으로 얻은 약물동태학적 파라미터

평균±표준 편차

V_c=중앙에 분포하는 부분의 부피

Cl_tot=총 혈장 제거율

AUC 외삽="커브 아래쪽의 면적" : 혈장 농도-시간 커브 아랫쪽의 외삽된 면적

[표 5]

개의 관상동맥 혈전증에 대한 모델에서 위약 또는 증가하는 투여량의 Actilyse나 K2P를 정맥내 볼러스주사(1분간)한 후 2시간에 응고 파라미터 및 혈소판의 수

평균±SEM

혈소판의 수 및 응고에 대한 값을 주사전의 초기값 %로서 표시함.

Claims

하기 아미노산 서열 또는 부가적인 N-말단 메티오닌을 갖는 아미노산 서열로 구성된 혈전용해 활성을 갖는, 비글리코실화된 조직형 플라스미노겐 활성화제(t-PA) 유도체.
제1항의 t-PA 유도체의 암호화한 하기 DNA 서열.
제2항의 DNA 서열이나 또는 제1항의 단백질을 암호화한 유전 암호의 변형 범위내에 있는 다른 DNA 서열을 함유하는 발현 플라즈미드.
플라즈미드 pA 27.3.
플라즈미드 pA 27fd.
완전한 t-PA 단백질 또는 크링글 II 및 프로테이제 영역이외에 t-PA 단백질의 또다른 부분을 함유하는 t-PA 단백질의 유도체를 암호화한 DNA 서열을 플라즈미드에 삽입시키고 제1항의 t-PA 유도체에 존재하지 않는 아미노산을 암호화한 영역들을 위치특이적 돌연변이로 삭제시키는 것으로 구성되는, 제3항 내지 제5항의 어느 한 항에 플라즈미드를 제조하는 방법.
제6항에 있어서, 당해 cDNA를 t-PA 단백질 또는 t-PA 단백질 유도체를 암호화한 DNA 서열로 사용하는 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 플라즈미드 pA 27.3 및 플라즈미드 pA 27fd를 사용하는 방법.
제3항 내지 제5항의 어느 한 항의 플라즈미드를 적당한 숙주 세포에 도입시킨, 뒤, 발현 생성물을 배양 배지로부터 분리하거나 또는 숙주 세포를 용해시킨 후에 분리하는 것으로 구성되는 제1항의 t-PA 유도체를 생산하는 방법.
제9항에 있어서, 원핵 세포, 특히 E. coli를 숙주 세포로서 사용하는 방법.
제10항에 있어서, 형성된 "봉입체"를 분리한 뒤에 이것을 구아니딘 하이드로클로라이드로 처리하여 가용화시키고, 산화형 글루타티온으로 유도체화한 다음, 마지막으로 L-아르기닌과 GSH의 부가로 t-PA 유도체를 복원시킴으로써 활성 단백질의 수율을 증가시키는 방법
제11항에 있어서, 복원후에 K2P를 복원 제조물로 농축시킨 뒤, 친화성 크로마토그래피법을 사용해 크로마토그래피 정제하는 방법.
제12항에 있어서, 10-1000mmol/l, L-아르기닌 존재에서 행하는 방법.
제13항에 있어서, 10-1000mmol/l, 바람직하게 600-800mmol/l L-아르기닌을 함유하는 복원 제조물의 농축물을 이용한 크로마토그래피 정제를 ETI 흡착컬럼에서 행하는 방법.
제14항에 있어서, 크로마토그래피 정제에 사용된 농축물을 7.5-8.6의 pH값으로 조절하는 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 용리를 pH 3-5.5 행하는 방법.
제1항의 t-PA 유도체를 함유하는 섬유소 용해용 제약학적 시약.