HU218092B - Eljárás szöveti-plazminogénaktivátor-származék előállítására - Google Patents
Eljárás szöveti-plazminogénaktivátor-származék előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU218092B HU218092B HU644/90A HU164490A HU218092B HU 218092 B HU218092 B HU 218092B HU 644/90 A HU644/90 A HU 644/90A HU 164490 A HU164490 A HU 164490A HU 218092 B HU218092 B HU 218092B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- derivative
- plasmid
- amino acid
- formula
- dna sequence
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás szövetplazminogénaktivátor- (t-PA)származékot kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós plazmidelőállítására. A találmány szerint a teljes t-PA-fehérjét vagy annakvalamely, a Kringle II- és a proteázdoméneken kívül a t-PA-- fehérjetovábbi területeit is tartalmazó valamely származékát kódoló DNS-szekvenciát egy plazmidba viszik, és irányított mutagenezissel a t-PA-származék felesleges aminosavait eltávolítják. A találmány tárgyatovábbá eljárás szövetplazminogénaktivátor- (t-PA) származékelőállítására a fenti plazmiddal transzformált sejtekkel. A találmánytovábbi tárgya a t-PA-származékot tartalmazó gyógyszerkészítmény éselőállítása. ŕ
Description
A találmány egy új t-PA-származékra, egy, az új t-PAszármazékot kódoló DNS-szekvenciára, a t-PA-származékot kódoló DNS-szekvenciát kifejező expressziós plazmidra, valamint az említett plazmidok előállítására, a t-PA-származék előállításának eljárására és a t-PAszármazékot tartalmazó véralvadék feloldásának módszerére vonatkozik.
Az alvadt vérben a fehérjemátrix-polimer főkomponense a fibrin. A fibrint a véralvadáshoz hasonló reakciókaszkádban, megfelelő fiziológiai körülmények között egy fibrinolitikus rendszerben feloldjuk. A meghatározó reakció a plazminogénnek a plazminhoz való aktiválása, mely például a szövetplazminogén-aktivátoron (t-PA) (tissue type plasminogen activator) keresztül működik. A plazmin ismét feloldja a fibrint, mely az alvadt vér fehérjemátrixának főkomponense. A természetes, illetve az eukariótákból géntechnológiai úton nyert t-PA enzimatikus aktivitása ugyanaz, mint a plazminogénnek a plazminhoz történő katalitikus aktiválása, ami a fibrin, illetve a fibrinogénhasított termékek távollétében rendkívül csekély, ám az említett fehérjék jelenlétében több mint tízszeresére növekszik.
A vérben található t-PA a megfelelő proteázok hatására egy A és egy B láncra hasad. A láncokat ciszteinhíd kapcsolja össze. A t-PA-aktivitás stimulálhatósága határozottan előnyös a többi ismert plazminogénaktívátorral, mint például az urokinázzal vagy sztreptokinázzal szemben [vesd össze például M. Hoylaerts és társai, J. Bioi. Chem. 257. (1982) 2912-2919.; W. Nieuwenhuizen és társai, Biochem. Biophys. Acta, 755. (1983), 531-533.]
A t-PA in vivő hatásmechanizmusát ismerteti Korniger és Collen, Thromb. Haemostasis 46. (1981), 561-565. A fibrin felületén fókuszált enzimaktivitás megfelelő módszernek tűnik a patológiás véredény-elzáródás leküzdésére (például szívinfarktus esetén), amint ezt a klinikai kísérletek nagy többsége is megerősíti [Collen és társai, Circulation 70. (1984), 1012.; Circulation 73 (1986), 511.]
A t-PA hátránya, amint ezt a plazmakoncentráció értékei alapján láthatjuk, hogy mennyisége gyorsan csökken (Clearance). Ebből arra következtethetünk, hogy egy vérrög hatásos in vivő líziséhez viszonylag nagy mennyiségű t-PA szükséges. A kezelések során alkalmazott nagy dózisok mellékhatásokat okozhatnak, például vérzést.
Az EP 0 196 920 a t-PA egyik természetes bomlástermékét írja le, amely csak a Kringle II- és a proteázdomént tartalmazza, és amelynek az N-terminális vége Alá 160-nal kezdődik [Pennica és társai, Natúré 301. (1983) 214-221.]; megadott aminosavszekvencia.
Az említett t-PA-bomlástermékek kiürülési rátája nem különbözik lényegesen a természetes t-PA-étól. A katalitikus hatás területén csak kémiai modifikálással érhetünk el javulást, blokkolócsoport alkalmazásával.
Ennélfogva a találmány feladata a t-PA olyan módon történő megváltoztatása, hogy a keletkező származék a vérplazmában erősen csökkent kiürülési rátát és ezzel együtt meghosszabbított felezési időt mutasson. A vérrög lízisét okozó hatást a fibrin stimulálhatóságán keresztül kapjuk meg.
A találmány tárgya eljárás szövetplazminogén-aktivátor (t-PA-származék) előállítására, azzal jellemezve, hogy az nincs glikozilezve, és aminosavszekvenciája megfelel az I általános képletnek, ahol az 1. számú aminosavnál (S) egy metioninnal (M) még meghosszabbítható.
Meglepő módon megállapítható, hogy a többi, a natív t-PA-ban meglevő tartomány deléciója semmilyen hatást nem fejt ki a fehérjék trombolitikus hatékonyságára, és a muteinek fibrinfuggő stimulálhatósága összevethető a natív t-PA-éval. Bár megállapítottuk, hogy a találmány szerinti t-PA-származéknál hiányzik a fibrin kötőképessége, ennek ellenére, meglepő módon, kimutatható a trombolízis hatékonysága, sőt, ellentétben a natív t-PA-nál tapasztaltakkal, annál lényegesen jobb. Hasonlóan meglepő az a tény is, mely szerint a származék trombolitikusan hatékony adagjánál a fibrinolízis mértéke az egész szervezetre kiterjedően szinte befolyásol atlan marad. Ezzel megmutattuk, hogy a találmány szerinti t-PA-származékok megfelelő fiziológiai körülmények között fibrinspecifikusságban a natív t-PA-ra jellemző tulajdonságokkal rendelkeznek. Az eredményeket a találmány szerinti t-PA-származékok farmakológiái vizsgálatai alapján kaptuk (6. és 7. példa). Ezenkívül a találmány szerinti fehérje rendkívül erős specifikus aktivitást mutat. A leírt renaturálás alkalmazása esetén 500—800 kU/mg közötti aktivitásértékeket határoztunk meg.
A találmány tárgya továbbá egy, a találmány szerinti t-PA-származékot kódoló DNS-szekvencia, melynek aminosavszekvenciája a II általános képletnek felel meg.
Amennyiben a megfelelő expressziós plazmid rendelkezésünkre áll, a találmány szerinti DNS-szekvencia a találmány szerinti t-PA-származék expresszálásához használható. A találmány további tárgya az említett expressziós plazmid, illetve egy, innen eltérő DNSszekvenciát felismerő expressziós plazmid, mely szintén a találmány szerinti t-PA-származékot kódolja. A genetikai kód degenerációjának alapján a bemutatott DNS-szekvenciától eltérő szekvenciák is alkalmasak.
Előnyös esetben az expressziós plazmid a t-PA-származékot kódoló szekvencia mellett egy szabályozható promotorszerkezettel (például tac), egy hatásos terminátorral (például fd), egy szelekciós markerrel (például béta-laktamázgénnel), illetve egy replikációs origóval egeszül ki.
A találmány tárgya továbbá a pA27.3 plazmid. Az említett plazmid előállítását az 1. példában mutattuk be, ez egy, a plazmidot kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.
A találmány tárgya továbbá egy eljárás a találmány szerinti expressziós plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy az összes t-PA-fehérjét, illetve annak valamely származékát - mely a Kringle II- és a proteázdoinéneken keresztül a t-PA-fehérjék további hatásait is felmutatja - kódoló DNS-szekvenciát egy plazmidba visszük, és irányított mutagenezissel eltávolítjuk az említett hatásokat okozó, a találmány szerinti t-PAszármazékokban elő nem forduló aminosavakat.
A találmány szerinti t-PA-származékot kódoló DNSszekvenciát tartalmazó plazmid kiválasztása a származék későbbi, az alkalmazott gazdasejtben történő exp2
HU 218 092 Β resszálódásától függ. A megfelelő plazmidokkal szemben támasztott alapvető követelményeket (például a replikáció eredete, a restrikciós hasítási helyek stb.) a szakértők jól ismerik. A találmány keretében azonban egy plazmid kozmidját is alkalmazhatjuk, mely a fág (lamdba, Ml3) replikatív, kettős láncú formája, vagy más, a szakértők által jól ismert vektorokat alkalmazhatunk. Az irányított mutagenezis eljárását (site-directed mutagenesis) Morinaga és társai ismertetik [Biotechnology 21., (1984), 634.], lényegében az ott leírt eljárást hajtottuk végre.
A találmány tárgya továbbá egy eljárás a találmány szerinti t-PA-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy egy találmány szerinti plazmid a megfelelő gazdasejtben alkalmazva expresszálódik, és a terméket, adott esetben a gazdasejtek feltárása után, a tápközegből kinyerjük. Előnyös esetben a találmány szerinti t-PAszármazék előállítására prokarióta-gazdasejteket alkalmazunk. Itt egy újabb, az eddigiektől eltérő előny jelentkezik, mely szerint az így kialakított, úgynevezett inklúziós testeket („inclusion bodies”) (oldhatatlan fehérjeaggregátumok) mindenekelőtt elválasztjuk a sejtrészecskéktől, a t-PA-t tartalmazó inklúziós testeket redukálókörülmények között, guanidin-hidrokloriddal való kezelés során szolubilizáljuk, GSSG-t adunk hozzá, és végül L-argininnel és GSH-val renaturáljuk. A t-PA inklúziós testekből történő aktiválásának pontos leírását az EP-A 0 219 874 és az EP-A 0 241 022 tartalmazza. Az aktív fehérjék inklúziós testekből való kinyerésére alkalmas további eljárásokat a találmány tartalmazza.
A K2P találmány szerinti tisztítása során előnyös az L-arginin jelenléte, különösen előnyös a 10-1000 mmol/1 közötti mennyiség alkalmazása.
Az idegen fehérjéktől való elválasztás a találmány szerint affinitáskromatográfiával történik, előnyben részesítve egy ÉTI (Eritrina Tripszin Inhibitor) adszorberoszlop alkalmazását. Az ETI-t egy hordozóanyagon (például Sepharose) fixáljuk. Az ETI-adszorberoszlopon történő tisztításnak az az előnye, hogy az ETI-adszorberoszlop anyaga közvetlenül a koncentrált renaturálóréteggel lehet megtöltve, különösen az ilyen magas argininkoncentráció jelenlétében (például 0,8 mol/1). Ezáltal elkerülhető a K.2P alacsony argininkoncentráció jelenlétében végbemenő aggregációja. Ezért különösen előnyös az ETI-adszorberoszlopon a K2P-től való tisztítás kivitelezése során 0,6-0,8 mol/1 arginin jelenlétében dolgozni. A K2P-t tartalmazó oldódás során előnyösek a 7-nél magasabb pH-értékek, különösen előnyös a 7,5-8,6 közötti tartomány.
Az ETI-oszlop elúciója a pH-értékek csökkenése során megy végbe, mind a K.2P jó oldhatóságát lehetővé tevő arginin jelenlétében, mind annak hiányában. Az elúció során a pH-értékek a savas tartományba esnek, előnyös esetben 3-5,5 közé.
A találmány szerint előállított, 95% feletti, előnyös esetben 99% tisztaságú K.2P specifikus t-PA-aktivitása 550 000±200 000 IU/mg közötti érték.
A találmány szerint tehát egy t-PA-származékot állítunk elő, mely a csökkentett kiürülési ráta alapján meghosszabbodott plazmafélérték-időt mutat. A találmány szerinti származék tulajdonságai alapján alkalmasnak tűnik az artériás és vénás al vadék trombolízise során a gyógyszerként történő felhasználásra. A K2P-vel történő trombolitikus terápia során a szükséges dózis a natív t-P A-nál megszokott értéknek legalább negyedére csökken. A K2P és a natív t-PA azonos hatékonyságú dózisánál az alvadási rendszert a K2P a t-PA-nál kevésbé befolyásolja, és a vérzési idő sem hosszabbodik meg jelentősen a natív t-PA-hoz képest, így a K2P-vel történő terápia során fellépő vérzéses komplikációk csökkentésére megvan a lehetőség.
így a találmány szerinti t-PA-származék kiváltképpen alkalmas a gyógyszerként történő felhasználásra, ami a találmány további tárgya. A találmány szerinti tPA-származék gyógyszerként történő felhasználása során az a célunk, hogy a natív, CHO-ban termelt t-PA esetében alkalmazottnál kisebb dózismennyiségekkel azonos hatékonyságot érjünk el.
Az alábbi példák az ábrák segítségével a találmány részletes kifejtésében nyújtanak segítséget:
1. ábra
A pA27.3 plazmid sematikus előállítása.
2. abra
A találmány szerinti t-PA-származékot (1. görbe), a CHO-sejtekkel kifejezett natív t-PA-származékot (a CHO-sejtekből származó, kettős láncú t-PA, a fiziológiai hasítási helyeken Arg275-Ile276 alkalmazásával felhasítva, 2. görbe), és egy, a CHO-sejtekből származó, kettős láncú t-PA-t (3. görbe) hasonlítja össze.
3. és 4. ábra
A találmány szerinti t-PA-származék t-PA-aktivitásának farmakokinetikai diagramja, összehasonlítva egy általánosan előállítható t-PA-származékkal (Actilyse®); [1. görbe: K2P, dózis 200 000 U/kg=0,25 mg/kg; iv. inf. 30 perc felett; a megvizsgált állatok mennyisége (házinyul): 4; 2. görbe: Actilyse®, dózis 200 000 U/kg; iv. inf 30 perc felett; a megvizsgált állatok mennyisége (házinyúl): 6],
5. ábra
A lalálmány szerinti t-PA-származék alkalmazott dózisainak hatását bemutató görbék (házinyulakra), Actilyse®-szel összehasonlítva (bemutatva: a középérték + SEM, 1 KU=1000 IU; 1. görbe: K2P; 2. görbe: Actilyse®).
6. ábra
A szimplát vérzési idő (BT) időbeli lefolyását mutatja be. a placebóval történő iv. boluszinjekció előtt és után, illetve emelkedő mennyiségű Actilyse® alkalmazása esetén, narkotizált kutyákon.
7. ábra
A szimplát vérzési idő (BT) időbeli lefolyását mutatja be, a placebóval történő iv. boluszinjekció előtt és után, illetve emelkedő mennyiségű K2P alkalmazása esetén, narkotizált kutyákon.
1. példa
A pA 27.3 plazmid szerkezete
A kiindulási plazmid az EP-A 0 242 836-ban leírt pREM7685, mely az alábbi alkotórészeket tartalmazza: tac-promotert, lac operátorszakaszt ATG startkodonnal,
HU 218 092 Β az FK2P t-PA-származékot kódoló szakaszt, a pKK2233 transzkripciós terminátorát, egy béta-laktamázgént, egy kanamicinrezisztencia-gént, és a sejtben alacsony kópiaszámban előforduló pACYC177 plazmid origóját. Az FK2P t-PA-származék szekvenciája a 190-336 között (F-domén) és a 715-1809 között (K2-domén, proteáz, kis része 3’UT) nukleotidokból, valamint egy startkodonból áll. A nukleotidok pozícióját Pennica és társai határozták meg [Natúré 301. (1983) 214-221.].
A pREM7685 plazmid FK2P szerkezete F-doménjének deléciójához Morinaga és társai eljárását alkalmaztuk [Biotechnology 21. (1984), 634.] A heteroduplex képzéséhez a pREM7685-öt két fragmentumra izoláltuk. A fragmentum: a pREM7685-öt EcoRI restrikciós enzimmel hasítottuk. A hasított termékeket gélelektroforézissel vizsgáltuk, és a legnagyobb EcoRI fragmentumot eluáltuk a gélről. B fragmentum: a pREM7685 plazmidot Xhol restrikciós enzimmel linearizáltuk. A linearizált plazmidot szintén gélelektroforézis után kaptuk meg. A mutagenezishez az alábbi oligonukleotidot állítottuk elő szintetikus úton:
‘5 TG TCT TAC CAA GGA AAC AGT GA 3’.
A heteroduplex képzéséhez az A fragmentumot, a B fragmentumot (mindegyik 450 fmol) és az oligonukleotidot (75 pmol) 50 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 TriszHC1 pH=7,5 és 10 mmol/1 MgSO4 jelenlétében elegyítettük, 3 percig 100 °C-on inkubáltuk, majd jégre vittük. A DNS renaturálása 60 °C-on 30 perc alatt következett be. A javítószintézishez az alábbiakat adtuk a heteroduplexhez:
dezoxi-nukleotid-trifoszfát (0,25 mmol/1), ATP (1 mmol/1), NaCl (100 mmol/1), Trisz-HCl pH=7,5 (6,5 mmol/1), MgCl2 (8 mmol/1) béta-merkapto-etanol (1 mmol/1), E. coli DNS-polimeráz Klenow-fragmentuma (0,125 U/μΙ mennyiségben), és T4-ligáz (0,1 U/μΙ mennyiségben). A javítószintézis 16 °C-on 4 óra alatt következett be. Végül a kapott anyagot lac Ii- plazmid segítségével E. coli sejtekbe (RM82, DSM 3689) transzformáltuk, majd a transzformátumot 25 pg/ml Kanamycin hozzáadásával szelektáltuk a tápközegből.
A kolóniahibridizációs technika segítségével a fent bemutatott mutagén-oligonukleotidok mint szonda alkalmazásával kiválogattuk azokat a pA27.3 plazmidot hordozó kiónokat, melyek a találmány szerinti t-PAszármazékot kódolják. Ezek a plazmidok többek között abban különböznek a pREM7685 kiindulási plazmidtól, hogy hiányzik belőlük egy PstI, illetve egy Sspl hasítási hely. Ezeket a hasítási helyeket a kiindulási plazmidnak az a területe tartalmazza, mely az F-doméneket kódolja. A pA27.3 plazmid sematikus szerkezetét az
1. ábrán mutatjuk be.
2. példa
Az E. coliból származó aktív K2P t-PA-származék előállítása
A sejtek lízise és az inklúziós testek (IB’s) előállítása
1,6 kg nedves sejttömeget (E. coli, DSM 3689, pA27.3 plazmiddal transzformálva) 10 10,1 mol/1 TriszHCl és 20 mmol/1 EDTA elegyében 4 °C-on felszuszpendáltuk, pH=6,5. Az elegyhez 2,5 g lizozimot adtunk, és 4 °C-on 30 percig inkubáltuk; a teljes sejtfeltárást nagynyomású diszperzió segítségével végeztük el. A feltárás során kapott anyaghoz 5 1 0,1 mol/1 TriszHCl, 20 mmol/1 EDTA, 6% Triton X100 és 1,5 mol/1 NaCl elegyét adtuk, pH=6,5, és 4 °C-on 30 percig inkubáltuk. Végül az oldhatatlan alkotórészeket (IB’s) Padberg-centrifügával távolítottuk el.
A pelleteket 10 1 0,1 mol/1 Trisz-HCl és 20 mmol/1 EDTA elegyében 4 °C-on felszuszpendáltuk, pH=6,5. Az elegyhez 2,5 g lizozimot adtunk, és 4 °C-on 30 percig inkubáltuk, majd a kapott IB-preparátumot centrifügálással izoláltuk.
Az inklúziós testek (IB’s) szolubilizálása
100 g inklúziós testet (IB’s) 450 ml 0,1 mol/1 TriszHCl, 6 mol/1 guanidin.HCl, 0,2 mohi DTE (1,4-ditioeritritol) és 1 mmol/1 EDTA elegyében felszuszpendáltuk, pH = 8,6, majd 2,5 órán keresztül 25 °C-on kevertük.
Miután a pH-értéket HCl-dal (25%) 3-ra állítottuk, a mintát 10 mmol/1 HC1 segítségével dializáltuk (3x501, 24 óra, 4 °C).
Derivatizálás
A guanidin.HCl (szilárd) előkészítése során a fenti dializátum végső koncentrációját 10 mmol/1 HCl-dal állítjuk be, 6 mol/1 guanidin.HCl értékre.
Az anyagot 25 °C-on 1,5 órán keresztül előinkubáljuk, majd 0,1 mol/1 glutation (GSSG) és 0,05 mol/1 Trisz-HCl mellett oxidáljuk, és 5 mol/1 NaOH segítségével pH = 9,3-ra titráljuk. Ezután az anyagot 25 °C-on 1,5 órán keresztül keverjük.
A pH-értéket HCl-dal (25%) 3-ra állítjuk, majd az anyagot 10 mmol/1 HCl-dal dializáljuk (3x100 1, 48 óra, 4 °C). A dialízis után a megmaradt tiszta anyagot dolgozzuk fel.
Naturálás
Egy 10 1-es reakcióedényt 0,1 mol/1 Trisz-HCl-dal, 0,8 mohi L-argininnal, 2 mmol/1 GSH-val (gentation glutation, redukált alak) és 1 mmol/1 EDTA-val megtöltjük, pH=8,5. A renaturálást 20 °C-on végezzük, háromszor, esetenként 100-100 ml származék (elegyített diszulfid, lásd fent) adagolása mellett, a reakció időtartama 24 óra.
A renaturálás után 1500-10 000 IU/mg specifikus aktivitással rendelkező anyagot kapunk [a meghatározás összevethető a 4b.) példával]. Az IU a WHO, National Institute fór Biological Standards and Control definíciója szerint az aktivitás egysége.
A renaturált anyag betöményítése
A renaturált anyag igény esetén hemodializátorban töményíthető be.
3. példa
Az E. coliból származó K2P tisztítása
1. Az E. coliból származó K2P tisztítása a fenti koncentrációban ETI-Sepharose oszlopon történik, affinitáskromatográfiás eljárás alkalmazásával.
a.) Citromsavas elúció
A renaturált anyagot hemodializátorban (Asahi AM 300) 1:23 arányban betöményítjük, és 0,5 mol/1 NaClot adunk hozzá. Egy 0,1 mol/1 Trisz-HCl-dal, pH=7,5, 0,8 mol/1 argininnel és 0,5 mol/1 NaCl-dal ekvilibrált ÉTI (Eritrina Tripszin Inhibitor) Sepharose oszlopot
HU 218 092 Β (V=50 ml) 550 ml koncentrált, reoxidált anyaggal feltöltünk (10 oszloptérfogat/h, 10 OT/h), és az ekvilibráló pufferrel addig mossuk, amíg az eluátum abszorpciója 280 nm-en eléri a puffemek megfelelő háttérértéket. A megkötött anyag elúciója 20 mmol/1 citromsavval történik, pH=3,2.
Térfogat (ml) | Aktivitás (IU/ml) | Cprot (mg/ml) | SA1·) (IU/mg) | |
Koncentrátum | 550 | 57 162 | 14 | 4 083 |
ETI-eluátum | 90 | .130 000 | 0,71 | 465 000 |
'> Specifikus aktivitás; a kromogén vizsgálatok alapján mért aktivitás [vesd össze 4b.) példa] osztva a minta proteintartalmával.
b.) 0,3 mol/1 argininnel (pH=4,5) végzett elúció A renaturált anyagot a 3.1.a pont alapján betöményítjük. Egy 0,1 mol/1 Trisz-HCl-dal, pH = 7,5, 15 0,8 mol/1 argininnel és 0,5 mol/1 NaCl-dal ekvilibrált ETI-Sepharose oszlopot (V=25 ml) 800 ml koncentrátummal feltöltünk (12 oszloptérfogat/h), és az ekvilibrálópufferrel addig mossuk, amíg az eluátum abszorpciója 280 nm-en eléri a puffemek megfelelő háttérértéket A megkötött anyag elúciója 0,3 mol/1 argininnel (pH=4,5) történik.
Térfogat (ml) | Aktivitás (IU/ml) | c '-'proi (mg/ml) | SA (IU/mg) | |
Koncentrátum | 800 | 20 000 | 11,3 | 1 770 |
ETI-eluátum | 55 | 280 000 | 0,6 | 550 000 |
2. Az E. coliból származó K2P affinitáskromatográfiás eljárás alkalmazásával, ETI-Sepharose oszlopon történő tisztítása, előzetes betöményítés nélkül
Egy 0,1 mol/1 Trisz-HCl-dal, pH=7,5, 0,8 mol/1 argininnel és 0,5 mol/1 NaCl-dal ekvilibrált ETI-Sepharose oszlopot (V = 10 ml) 12 1 reoxidált anyaggal feltöltjük, és az ekvilibrálópufferrel addig mossuk, amíg az eluátum abszorpciója 280 nm-en eléri a puffemek megfelelő háttérértéket. A megkötött anyag elúciója
0,8 mol/1 argininnel történik, pH = 5.
Térfogat (ml) | Aktivitás (IU/ml) | c ^prot (mg/ml) | SA (IU/mg) | Fi.) | |
Reoxidált anyag | 12 000 | 615 | 0,135 | 4556 | 25 |
ETI-eluátum | 42 | 105 300 | 0,185 | 568 000 | 35 |
1 Ά fibrinnel történő stimulálás=fibrin jelenlétében mért aktivitás osztva a fibrinntentes minta aktivitásával.
4. példa
Az E. coliból származó megtisztított K2P jellemzése a.) Proteinkémiai jellemzés
- SDS-PAGE és reverz fázisú HPLC
Az ETI-Sepharose oszlopon affinitáskromatográfiás eljárással kapott anyag homogenitását SDS-PAGE és reverz fázisú HPLC (RP-HPLC) segítségével vizsgáltuk. A megtett relatív út alapján a prokarióta K2P-kre 38 500+2 000 molekulatömeg-értéket határoztunk meg. A kiértékelés szerint a preparátum tisztasága >95%.
Az RP-HPLC a fehérjék és a hidrofób mátrixok közötti különféle kölcsönhatásokon alapul. Ez a sajátság a tisztasági fok kvantitatívvá tételéhez szolgál alapul.
Az E. coliból származó megtisztított K2P analízise Nucleosil 300 elválasztóoszlopon történik (Knauer), trifluor-ecetsav/acetonitril gradiens segítségével (A puffer: 1,2 ml trifluorecetsav 1000 ml vízben; B puffer; 300 ml H2O, 700 ml acetonitril, 1 ml trifluor-ecetsav; 0-100%). A kromatográfiás analízis integrációja szerint a tisztaság >95%.
- N-terminális aminosavszekvencia
Az N-terminális aminosavszekvencia meghatározása ABI 470 szekvenátor segítségével, egy standard programmal, on-line detektálással történt. A meghatározott szekvencia,
S1-Y2-Q3-G4-N5-S6-D7-C8-Y9, összhangban van az eredeti DNS-szekvenciával, és megfelel a várakozásnak.
b. ) Az aktivitás meghatározása
Az E. coliból származó K2P in vitro aktivitását a „Zeitschrift für die gesamte innere Medizin”, (2GIMAL) 42. (17), 478-486. vizsgálati leírása alapján határoztuk meg. A specifikus aktivitás értéke 550 000 IU/mg±200 000 IU/mg között található. Ebben a vizsgálati rendszerben az E. coliból származó K2P stimulálhatósága a fibrinogén BrCN-fragmentumán keresztül >25 volt (fibrin jelenlétében mért aktivitás osztva a fibrinmentes mintában mért aktivitással).
c. ) In vitro megkötődés a fibrinen
Az E. coliból származó K2P in vitro fibrinhez kapcsolódását Higgins és Vehar eljárása szerint határoztuk
HU 218 092 Β meg [Higgins, D. L. és Vehar, G. A. (1987), Biochem. 26., 7786-7791.].
A 2. ábra szerint az E. coliból származó K2P a CHO-ból származó t-PA-val, illetve az E. coliból származó t-PA-val szemben a fibrinhez nem mutat említésre méltó kapcsolódást.
5. példa
A stimulálhatóság fokozására a K2P gént kódoló szekvenciát magasabb kópiaszámban egy plazmidba klónoztuk. Ehhez a DE 38 38 378.0 szabadalmi bejelentés szerinti pePa 126.1 plazmidot alkalmaztuk. Ezen a plazmidon lényegében a pKK223-3 vektor és a t-PA kódolandó szekvenciája foglal helyet, amint ezt az EP-A 0 242 835 leírja.
Az említett plazmidba először egy fd-terminátor-szekvenciát integráltunk. Ehhez a pePa 126.1 plazmidot Hind III restrikciós enzimmel linearizáltuk. Az így elhasított plazmidot gélelektroforézissel vizsgáltuk és tettük preparatívvá. A pLBUl plazmidot [Beck és társai (1978), Nucl. Acids Rés., 5., 4495-4503.; Gentz és társai (1981), PNAS 78. (8): 4963.] Hind III-mal hasítottuk, és egy 360 bp nagyságú, az fd-terminátort tartalmazó Hind III fragmentumot gélelektroforézissel és gélelúcióval tettünk preparatívvá. A linearizált pePa 126.1 plazmidot és a pLBUl-ből származó, 360 bp nagyságú Hind III fragmentumot ligáltuk. A ligáit anyagot a DE 38 38 378.0 szabadalmi bejelentésben leírt pUBS 500 plazmid segítségével E. coli DSM 2102-be kotranszformáltuk. A kiónok közül kiválasztottuk azokat, melyek a kívánt pePa 126 fd-t tartalmazták, ezek a kiindulási pePa 126.1 plazmidtól abban különböztek, hogy az egy második Hind III hasítási helyet tartalmazott.
A pePa 126 plazmidból két fragmentumot kaptunk: egy 3,4 kb nagyságú BamHI/Pvul fragmentumot és egy 1,3 kb nagyságú Pvul/Xmal fragmentumot. A fenti fragmentumokat egy, a pA27.3 plazmidból származó, 1,3 kb nagyságú BamHI/Xmal fragmentummal ligáltuk, és a pUBS 500 plazmid segítségével E. coliba transzformáltuk. Az így kapott plazmid a pA27 fd nevet kapta, és a pePa 126-tól annyiban különbözik, hogy az EcoRI-vel végzett restrikciós hasítás során a pePa 126 fd második legkisebb fragmentuma körülbelül 610 bp hosszúsággal, míg a pA27-é körülbelül 515 bp hosszúsággal megrövidítve található.
6. példa
A prokariótákban expresszált K2P t-PA-származékának farmakológiai vizsgálata
1. A K2P házinyulakon végzett farmakokinetikai vizsgálata
Az általánosan ismert Neuseeland-házinyulakon hasonlítottuk össze a K2P és az Actilyse® farmakokinetikai tulajdonságait. Mindkét fibrinolitikus anyagot 200 000 IU/kg (a testtömegre vonatkoztatva) adagban infundáltuk, 30 percen keresztül. A plazmavizsgálatokat meghatározott időpontokban, az infúzió előtt, alatt és után végeztük el. A t-PA-aktivitást J. H. Verheijen és társai módszerével (Thromb. Haemostas. 48., 266.,
1982) , H. Lili (Z. ges. Inn. Med. 42., 478., 1987) módosítása szerint mértük.
A farmakokinetikai paramétereket nemlineáris regressziós programmal határoztuk meg, melyet Η. Y. Huang (Aero-Astronautics-Reports 64., Rice University, 1-30., 1969) módosított. A paramétereket egy biexponenciális farmakokinetikai modell segítségével határoztuk meg egyénileg.
A K.2P ötször hosszabb felezési időt mutatott (t^alfa=10,3 perc, koncentrációcsökkenés a plazmában), mint az Actilyse® (a Thomae cég t-PA-készítménye) (1. táblázat, 5. és 6. ábra). Az infúzió befejezésekor (30 perc után) megmértük a K2P-Pro egyik plazmakoncentrációjának t-PA-aktivitását (Cinf), ennek értéke 1986 IU/ml volt, ez hatszorosa az Actilyse®-nál mért értéknek. A központi részecskék térfogateloszlása (V,) a K2P esetében 46,8 ml/kg, míg az Actilyse® esetében 73,7 ml/kg volt. Az összes plazma kiürülési értéke (Cltot) az Actilyse® esetében meghatározott értékkel szemben (Cltot=22,2 ml/min/kg) a t-PA-Pro-nál %-ére csökkent (Cltot=3,2 ml/min/kg). A fibrinolitikus anyagok boluszinjekció céljára történő alkalmazása esetén különösen érdekes a görbe alatti terület [„Area under the curve” (AUC)], mivel általa lehetővé válik a plazmában uralkodó koncentráció időbeli változásának követése. A K2P esetében nyolcszor magasabb AUC-értékeket mértünk (1064 IU/ml xh), mint az Actilyse®nál (133,3 IU/ml xh).
Az Actilyse®-el összehasonlítva csak a K2P, a jelenleg egyedüli rekombináns t-PA-fehérje mutatott 5-8szoros javulást a farmakokinetikai profil vizsgálata során, azonos dózisok alkalmazása esetén.
2. A K2P házinyulakon végzett farmakodinamikai vizsgálata
A trombolitikus hatások vizsgálatára a Collen és társai által házinyulakra létrehozott jugulárisvénatrombózis-modellt alkalmaztuk (J. Clin. Invest. 71., 368.,
1983) . A K2P-t és az Actilyse®-t mindig 3 dózisban vizsgáltuk. A fibrinolitikumot 4 órán keresztül infundáltuk, majd meghatároztuk a trombolízis mértékét (2. táblázat, 5. ábra).
Lineáris regressziós egyenes segítségével kiszámítottuk az 50%-os (ED50) trombolizerátumok dózisát, mely K2P esetében 124 000 IU/kg (a testtömegre vonatkoztatva), míg Actilyse® esetében 520 000 IU/kg (a testtömegre vonatkoztatva). Eszerint a K.2P trombolitikus hatása négyszer erősebb, mint az Actilyse® esetében.
A K2P-nél a plazmakoncentrációtól függő t-PA-aktivitást értünk el, az Actilyse®-szel összehasonlítva négyszer alacsonyabb dózisok alkalmazása esetén. A trombolitikus hatás szempontjából összehasonlítható mennyiségű hatóanyag, 800 kU Actilyse®/kg (a testtömegre vonatkoztatva), illetve 200 kU K2P/kg (a testtömegre vonatkoztatva) jelentéktelen mértékben befolyásolta a fibrinogén, a plazminogén és az alfa2-antiplazmin alvadási paramétereit, valamint a 800 kU Actilyse®/kg (a testtömegre vonatkoztatva) hatását nem tudtuk megkülönböztetni a 200 kU K2P/kg (a testtömegre vonatkoztatva) hatásától.
HU 218 092 Β
A K2P egy t-PA-mutein, mely a házinyulakra létrehozott jugulárisvénatrombózis-modellen a fibrinolitika négyórás infúziója során az Actilyse®-szel összehasonlítva a dózisok χ értékre való csökkenését eredményezte, mégpedig az Actilyse®-szel azonos trombolitikus hatás kifejtése mellett. A csökkentett mennyiségű K2Pnek az alvadási rendszerre és a plazmakoncentráció t-P A-akti vitására gyakorolt hatása nem különbözik az Actilyse® hatásaitól.
1. táblázat
Farmakokinetikai paraméterek, a t-PA-plazmakoncentráció-idő adatok alapján a t-PA-aktivitás meghatározása számítógéppel
Átlag [dózis: 200 000 IU/kg (a testtömegre vonatkoztatva)] | tX (min) | tX (min) | ( inf (IU/ml) | Ve (ml/kg) | citot (ml/min/kg) | AUCcxtrapOi (IU*h/ml) |
10,3 | 14,9 | 1986,6 | 46,8 | 3,2 | 1064,4 | |
K2P (n=4) | ±1,7 | ±4,6 | ±762,6 | ±14,7 | ±1,1 | ±443,2 |
2,3 | 10,9 | 326,6 | 73,7 | 22,2 | 133,3 | |
Actilyse® (n=6) | ±0,6 | ±2,4 | ±118,1 | ±18,7 | ±7,6 | ±44,1 |
2. táblázat
A K2P, az Actilyse® és az oldószer trombolízis t-PA-plazmaaktivitás- (4 órás infúzió után), és hemosztázisparaméterei (az infúzió befejezése után 30 perccel)
K2P (200 kU/kg) | K2P (100 kU/kg) | K2P (50 kU/kg) | Oldószer (NaCl/Twcen) | Actilyse® (800 kU/kg) | Actilyse® (400 kU/kg) | |
Trombolízis (%) | 79±9 | 32±6 | 29 ±1 | Ilii | 64±6 | 46±3 |
(n = 3) | (n=5) | (n = 2) | (n=6) | (n=7) | (n=6) | |
Plazma-t-PA-aktivitás (IU/ml) | 93,7±18,2 | 44±3 | 7±0 | - | 107±27 | 47±9 |
Fibrinogen (%) | 74±2 | 90±6 | 86.5±6 | 92±3 | 77±6 | 90±3 |
Plazminogén (%) | 79±7 | 75±6 | 87 ± 11 | 98±10 | 77±4 | 88±4 |
Alfaj-antiplazmin (%) | 70±l | 70±4 | 93 ±4 | 98±8 | 74±6 | 87±3 |
ÉrtckiSD; kU=1000IU;
hemosztázisparamétcrek (% az alapvonalra vonatkoztatva)
7. példa
Az E. coli által termelt K2P farmakológiai tulajdonságai koszorúér-trombózis esetén, kutyamodellen
Az E. coli által termelt K2P-nek az artériás trombózisra kifejtett trombolitikus hatása vizsgálatára akut miokardiális infarktusban szenvedő állatok alkalmazásával állítottunk fel egy kísérleti modellt. A kísérlethez kiválasztott állatfaj a kutya volt. A koszorúértrombus létrehozásához Romson és társai módosított eljárását választottuk ki (Thromb. Rés. 17., 841., 1980). Narkotizált és mesterségesen lélegeztetett kutyák nyitott mellkasán keresztül elektromosan ingereltük (150 μΑ) az A. coronaria sinistra Ramus circumflexusának intimafelületét ( = left circumflex coronary artery=LCX), ezáltal trombust hoztunk létre. A trombózistól disztálisan egy csavart rögzítettünk, így egy kísérleti szűkületet alakítottunk ki, melyen keresztül a reaktív hiperémiát elimináltuk. A koronáriatrombózistól proximálisan helyezkedett el az LCX, egy elektromágneses áramlásmérő fejjel felszerelve, mellyel a reperfúziót mértük.
Az adagolás tanulmányozására a BM 06.022-t az eukariótákból származó t-PA-val (Alteplase, Actilyse®,
Dr. Kari Thomas GmbH, Biberach, FRG) négy különböző adagban, valamint placebót alkalmaztuk, minden esetben 6 állat/adag került megvizsgálásra, kiindulásként a heparinnal kezelt kutyákba intravénásán, 1 percen keresztül injektáltuk az anyagot. Az injektálás előtt, valamint közben, meghatározott időpontokban mintát vettünk a plazmából, és meghatároztuk a teljes vér t-PAaktivitásának plazmakoncentrációját, valamint a fibrinogén, a plazminogén és az alfa2-antiplazmin trombocitaszámát. A fibrinogént koagulometriásan, Clauss eljárásával (Acta Haemat. 17., 237., 1957), a plazminogént, és az alfa2-antiplazmint spektrofotometriásán, Collen és társai eljárásával (J. Clin. Invest. 71., 368., 1983) mértük. Megmértük továbbá a „szimplát vérzési időt”, ez a kutyák hátsó lábán történt, egy ércsappantó segítségével (Simplate® I, Organon Teknika, Eppelheim, FRG), miközben 40 Hgmm-es vénás pangást mértünk (J. Surg. Rés. 27., 244., 1979). Az injektálás után mért értékek és az injektálás előtti kontrollértékek statisztikai összehasonlítása a Wilcoxon-teszt segítségével történt.
A trombolitikus eredmények leírásához a reperfúndáltatott állatok dóziscsoportonkénti számát (=reperfú7
HU 218 092 Β ziós ráta) és a reperfüzióig eltelt időt (=reperfúziós idő) adtuk meg. Továbbá megmértük a kétórás injektálás után még rendelkezésre álló trombusmaradék tömegét, illetve meghatároztuk azoknak az állatoknak a számát, melyeknél a reperfúzió után újabb elzáródást találtunk (reokklúziós ráta). A dózishatások féllogaritmusos regresszióanalízisének segítségével a reperfúziós rátára vonatkozólag minden egyes anyagra kiszámítottuk az 50%-os reperfúziós ráta ( = ED50) hatásos dózisát. A trombusmaradékok tömegének statisztikus összehasonlítása független szúrópróbákból, a WilcoxonMann-Whitney-teszt segítségével történt.
A t-PA-aktivitás plazmakoncentrációját Verheijen és társai spektrofotometriás eljárásával mértük meg (Thromb. Haemost. 48., 266., 1982), melyet Lili módosított (összegyűjtve lásd Inn. Med. 42., 478., 1987). A farmakokinetikai paraméterek kiszámítása nemlineáris regresszióra írt számítógépes programmal történt, melyet Η. Y. Huang módosított (Aero-Astronautics Report 64., Rice University, USA, 1-30., 1969). Az egyedi paramétereket a t-PA-aktivitás testre jellemző alapszintjének a következő mérési értékből való levonása után biexponenciális farmakokinetikai modell segítségével számítottuk ki.
Az alábbi eredményeket kaptuk.
1. Kutyákon vizsgált farmakodinamika
A K2P az intravénás injekció után dózisfuggő reperfúziós rátát mutatott. Maximális hatást (reperfúzió 100%) 200 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva) esetében értünk el. Actilyse®-nél 1600 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva) esetében értük el a 100%-os reperfúziót. Az ED50-értékek összehasonlítása során a K2P [ED5O=83 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva)] esetében 11,5-ször alacsonyabb értéket kaptunk, mint az Actilyse® [ED50=961 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva)] esetében. A placebo beadásakor nem észleltünk reperfúziót. A placeboállatoknál a trombus maradékok tömege 9,6±1,6 közötti értéket mutatott (középérték±SEM); vagyis emelt dózisok esetén, összehasonlítva a placebokontrollal, a K2P az Actilyse®-hoz hasonlóan jelentős csökkenést eredményezett a trombusmaradékok tömegében. A reperfúzió mindkét fibrinolitikum esetében hasonló átlagokat eredményezett, a K2Pnél 25,9±3,5, és az Actilyse®-nél 9,6±1,6 értékeket. A reperfúzió után mind a K2P-vel, mind az Actilyse®szel kezelt kutyáknál újabb elzáródásokat észleltünk.
2. Kutyákon vizsgált farmakokinetika
200 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva) K2P, illetve Actilyse® intravénás injekciója után megállapítottuk, hogy a plazmakoncentráció fogyásának gyors szakasza a K2P esetében (7,2± 1,1) 4,5-szer hosszabb, mint az Actilyse® esetében (1,6 ±0,2) (4. táblázat). Közvetlenül az injektálás után a K2P esetében kétszer olyan magas volt a plazmakoncentráció, mint az Actilyse esetében. A K2P a plazmából (Plazma-clearance=Cltot) kilencszer lassabban távozott el, mint az Actilyse®. A plazmakoncentráció-görbe alatti terület a K2P-nél 9,5-szer nagyobb volt, mint az Actilyse®-nál.
3. Kutyákon vizsgált fibrinspecifitás
A K2P injektálása után két órával a legmagasabb dózisnál [200 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva)] a maradék fibrinogénkoncentráció csak kissé, 81 ±10% értékre csökkent le. Ezzel szemben a legmagasabb Actilyse® dózisnál [1600 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva)] a beadás után azonnal 3±0%-ra csökkent a fibrinogénkoncentráció (5. táblázat). A dózisok mellékhatásának a fibrinogéncsökkenésre vonatkozó féllogaritmusos regresszióanalízise, melynek kiértékelése az ED50 trombolitikus hatásának és a hozzá tartozó maradék fibrinogénkoncentrációnak a segítségével történt, ekvipotenciális K2P-adagok esetében 92,5% fibrinogén maradékot eredményezett, míg Actilyse® esetében 38,6%-ot. A plazminogén és az alfa2-antiplazmin mennyisége az injektálás után két órával a maradékban szintén dózisfüggő csökkenést mutatott, ez a csökkenés az Actilyse® esetében jellegzetesebb volt, mint a K2P esetében. Sajnos egyik anyagnál sem sikerült a vérlemezkék koncentrációját befolyásolni.
4. A vérzést idő befolyásolása kutyáknál
A K2P intravénás injektálása során a vérzést idő a kontrollértékekkel összehasonlítva a négy vizsgált dózis egyikénél sem hosszabbodott meg szignifikáns mértékben. Ezzel szemben 1130 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva) és 1600 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva) Actilyse® esetében a vérzési idő statisztikusan szignifikáns meghosszabbodását tapasztaltuk (6. és 7. ábra).
5. Összefoglalás
A bemutatott koszorúér-trombózisos kutyamodelleknél a K2P fibrinolitikus hatása bebizonyosodott, és, amint ezt a 100%-os reperfúziós rátájú boluszinjekcióval eléltük, sem a fibrinogénkoncentrációt nem befolyásoltuk erősen, sem a vérzési idő nem növekedett meg jelentős mértékben. Az Actilyse®-szel összehasonlítva az eljárások során az intravénás boluszinjekció után a K2P hatásosabb tombolitikumnak bizonyult (11,5-ször). A K2P farmakokinetikai profiljának a vizsgálata során, az Actilyse®-szel összehasonlítva, a kiürülési értékek alapján a K2P a plazmából kilencszer lassabban távozott el.
3. táblázat
Trombolitikus paraméterek koszorúér-trombózis esetén, kutyamodellen, 1 perces intravénás placebo, növekvő mennyiségű Actilyse®, illetve K2P boluszinjekciója után
Anyag | Dózis (IU/kg*) | n | Reperfúziós ráta | Reperfúziós idő (min) | T rombusmaradék nedvestömeg (mg) | Reokklúziós ráta |
Placebo | - | 6 | 0/6 | / | 9,6±1,2 | / |
HU 218 092 Β
3. táblázat (folytatás)
Anyag | Dózis (IU/kg*) | n | Rcpcrfúziós ráta | Rcpcrfúziós idő (min) | Trombusmaradék ncdvcstömeg (mg) | Reokklúziós ráta |
1 600 000 | 6 | 6/6 | 28± 11 | 2,2±0,7 | 4/6 | |
Actilyse® | 1 130 000 | 6 | 4/6 | 14±3 | 4,4±0,5 | 4/4 |
800 00 | 6 | 2/6 | 35±38 | 5,5±0,4 | 1/2 | |
200 00 | 6 | 0/6 | / | 8,8±1,3 | / | |
200 00 | 6 | 6/6 | 29±6 | 2,5±0,3 | 6/6 | |
K2P | 140 00 | 6 | 4/6 | 15±6 | 4,4±1,4 | 4/4 |
100 00 | 6 | 3/6 | 30± 14 | 7,4±1,1 | 2/3 | |
50 00 | 6 | 2/6 | 31 ±4 | 5,5±0,8 | 2/2 |
Középcrték±SD *a testtömegre vonatkoztatva
4. táblázat
A t-PA-aktivitás alapján kapott plazmakoncentráció-idő adatok számítógépes kiértékelése során meghatározott farmakokinetikai paraméterek [narkotizált kutyák 200 000 IU/kg (a testtömegre vonatkoztatva) Actilyse®, illetve K2P intravénás boluszinjekciója után]
Anyag | t/2 alfa (min) | ί)ζ béta (min) | Cinf(IU/ml) | Vc (ml/kg) | ci,01 (ml/min/kg) | AUCcxtrapol (IU*h/ml) |
1,6 | 14,6 | 1674 | 106,1 | 41,6 | 84,1 | |
Actilyse® (n=6) | 0,2 | 6,6 | ±504 | ±37 | ±11,4 | ±23,8 |
7,2 | 15,0 | 3177 | 64,7 | 4,6 | 803 | |
K2P (n = 6) | ±1,1 (n=4) | ±4,3 | ±817 | ±19,7 | ±1,3 | 250 |
Közcpcrtckia standard értéke
Vc=a központi részecskék eloszlása
ClI01=összcs kiürülés
AUC^rapo^,,3 görbe alatti terület”; a plazmakoncentráció-idő alatti terület extrapolálása
5. táblázat
Alvadási paraméterei és a trombocitaszám koszorúér-trombózis esetén, kutyamodellen, 1 perces intravénás placebo, növekvő mennyiségű Actilyse®, illetve K2P boluszinjekciója után
Anyag | Dózis (IU/kg) | n | Fibrinogén (%) | Plaztninogén (%) | Alfa2-antiplazmin (%) | (%) |
Placebo | - | 6 | 106±2 | 103 (n=4) | 92±11 (n=4) | 101±3 |
1 600 000 | 6 | 3±0 | 46±2 | 19±11 | 119±10 | |
Actilyse® | 1 130 000 800 000 | 6 6 | 16±13 86±4 | 59±6 87±3 | 45±6 64±5 | 110± 10 104±6 |
200 000 | 6 | 97±3 | 90±3 | 86±4 | 109±4 | |
200 000 | 6 | 81± 10 | 74±8 | 40±6 | 106±8 | |
K2P | 140 000 | 6 | 93±1 | 81± 1 | 50±7 | 104±5 |
100 000 | 6 | 92±3 | 88±3 | 77±7 | 101 ±3 | |
50 000 | 6 | 95±3 | 90±2 | 84± 12 | 118± 11 |
KözépcrtékiSD
Az alvadási értékeket és a trombocitaszámot az injekció kiindulási értékének a százalékában jelöltük.
Claims (21)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK.1. Eljárás expressziós plazmid előállítására, mely egy, (II) általános képletnek megfelelő DNS-szekvenciát tartalmaz, vagy a genetikai kód degenerációja eredményeként attól eltérő, szövetplazminogénaktivátor- (t-PA) származékot, mely nincs glikozilezve, és aminosavszekvenciája az (I) általános képletnek felel meg, ahol az aminosavlánc vége az 1-helyzetben metioninnal (M) még meghosszabbítható, kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a teljes t-PA-fehérjét vagy annak valamely, a Kringle II- és a proteázdoméneken kívül a t-PA-fehérje további területeit is tartalmazó valamely származékát kódoló DNS-szekvenciát egy plazmidba visszük, és irányított mutagenezissel az (I) általános képletű t-PA-származék felesleges aminosavait eltávolítjuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy szövetplazminogénaktivátor- (t-PA) származékot, mely nincs glikozilezve, és aminosavszekvenciája az (I) általános képletnek felel meg, ahol az aminosavlánc vége az 1-helyzetben metioninnal (M) még meghosszabbítható, kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmidot állítunk elő.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (II) általános képletnek megfelelő szekvenciájú DNS-t tartalmazó plazmidot állítunk elő.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pA27.3 plazmidot állítjuk elő.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pA27 fd plazmidot állítjuk elő.
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-szekvenciaként a megfelelő cDNS-t alkalmazzuk.
- 7. Eljárás szövetplazminogénaktivátor- (t-PA) származék előállítására, mely nincs glikozilezve, és aminosavszekvenciája megfelel az (I) általános képletnek, ahol az aminosavlánc vége az 1-helyzetben metioninnal (M) még meghosszabbítható, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerint előállított plazmidot megfelelő gazdasejtbe transzformáljuk, és az expresszálódott terméket a tápközegből és/vagy a gazdasejtekből feltárással kinyerjük.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként prokariótákat, előnyösen E. colit alkalmazunk.
- 9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kinyerés során a t-PA-származékot tartalmazó inklúziós testeket elválasztjuk, guanidin-hidroklorid alkalmazásával szolubilizáljuk, oxidált glutationnal derivatizáljuk, végül a t-PA-származékot L-arginin és GSH hozzáadásával renaturáljuk.
- 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy renaturálás után a t-PA-származékot a renaturálóanvagban betöményítjük, majd affinitáskromatográfiával tisztítjuk.
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatografálást 10-1000 mmól/1 L-arginin jelenlétében végezzük.
- 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatográfiás tisztítás után kapott koncentrátumot, mely 10-1000, előnyösen 800 mmól/1 L-arginint tartalmaz, egy ETI-oszlopon vezetjük át, és a t-PAszármazékot az oszlopról eluáljuk.
- 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ETI-oszlopra 7,5-8,6 pH-értékű koncentrátumot viszünk fel.
- 14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eluálást 3-5,5 közötti pH-értéken végezzük.
- 15. Eljárás t-PA-származékot tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 7-14. igénypontok bármelyike szerint előállított t-PA-származékot a gyógyszerkészítésnél általánosan elfogadott segédanyagokkal szokásos dózisformává alakítunk.
- 16. Szövetplazminogénaktivátor- (t-PA) származék, azzal jellemezve, hogy nincs glikozilezve, és aminosavszekvenciája megfelel az (I) általános képletnek, ahol az aminosavlánc vége az 1-helyzetben metioninnal (M) még meghosszabbítható.
- 17. DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy valamely 1. igénypont szerinti t-PA-származékot kódol, és szekvenciája megfelel a (II) általános képletnek.
- 18. Expressziós plazmid, azzal jellemezve, hogy egy (II) általános képletnek megfelelő DNS-szekvenciát vagy a genetikai kód degenerációja eredményeként attól eltérő, a 17. igénypontnak megfelelő fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.
- 19. A 18. igénypont szerinti expressziós plazmid, azzal jellemezve, hogy az a pA27.3 plazmid.
- 20. A 18. igénypont szerinti expressziós plazmid, azzal jellemezve, hogy az a pA27 fd plazmid.
- 21. Fibrinolitikus kezelésre alkalmas gyógyászati készítmény, mely hatóanyagként a 17. igénypont szerinti t PA-származékot tartalmazza.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3903581A DE3903581A1 (de) | 1989-02-07 | 1989-02-07 | Gewebs-plasminogenaktivator-derivat |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU901644D0 HU901644D0 (en) | 1991-04-29 |
HUT58813A HUT58813A (en) | 1992-03-30 |
HU218092B true HU218092B (hu) | 2000-05-28 |
Family
ID=6373566
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU644/90A HU218092B (hu) | 1989-02-07 | 1990-02-06 | Eljárás szöveti-plazminogénaktivátor-származék előállítására |
Country Status (29)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5223256A (hu) |
EP (1) | EP0382174B1 (hu) |
JP (1) | JP2559538B2 (hu) |
KR (1) | KR970008485B1 (hu) |
AT (1) | ATE126270T1 (hu) |
AU (1) | AU623228B2 (hu) |
CA (1) | CA2025900C (hu) |
CZ (1) | CZ281836B6 (hu) |
DD (1) | DD291779A5 (hu) |
DE (2) | DE3903581A1 (hu) |
DK (1) | DK0382174T3 (hu) |
ES (1) | ES2031804T3 (hu) |
FI (1) | FI100244B (hu) |
GR (2) | GR900300140T1 (hu) |
HK (1) | HK153396A (hu) |
HU (1) | HU218092B (hu) |
IE (1) | IE61077B1 (hu) |
IL (1) | IL93280A (hu) |
LU (1) | LU90025I2 (hu) |
LV (1) | LV10302B (hu) |
NL (1) | NL970008I2 (hu) |
NO (2) | NO306563B1 (hu) |
NZ (1) | NZ232337A (hu) |
PT (1) | PT93082B (hu) |
RU (1) | RU2107094C1 (hu) |
SK (1) | SK55890A3 (hu) |
UA (1) | UA27111A1 (hu) |
WO (1) | WO1990009437A1 (hu) |
ZA (1) | ZA90861B (hu) |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4634007A (en) * | 1985-12-02 | 1987-01-06 | Adolph Coors Company | Carton blank with perforated tear line |
US5676947A (en) * | 1989-02-07 | 1997-10-14 | Boehringer Manneheim Gmbh | Method for treating thromboembolic conditions using thrombolytically active proteins |
DE3923339A1 (de) * | 1989-05-31 | 1990-12-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Gewebs-plasminogen-aktivator-derivat |
GB9019120D0 (en) * | 1990-09-01 | 1990-10-17 | Beecham Group Plc | Novel compounds |
DE4037196A1 (de) * | 1990-11-22 | 1992-05-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur reaktivierung von denaturiertem protein |
DE4123845A1 (de) * | 1991-07-18 | 1993-01-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Pharmazeutische verpackungseinheit enthaltend plasminogenaktivatoren zur mehrfachbolusgabe |
WO1992018157A1 (de) * | 1991-04-16 | 1992-10-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Pharmazeutische verpackungseinheit enthaltend plasminogenaktivatoren zur mehrfachbolusgabe |
US5510330A (en) * | 1994-03-25 | 1996-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Combinations of thrombolytically active proteins and non-heparin anticoagulants, and uses thereof. |
DE4423574A1 (de) * | 1994-07-05 | 1996-01-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nicht-glykosylierte Plasminogenaktivator-Derivate und ihre Verwendung bei erhöhtem Blutungsrisiko |
AU4259496A (en) * | 1994-12-06 | 1996-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Use of the protease domain of human plasminogen activator for the treatment of thromboembolic diseases |
US5723122A (en) * | 1995-06-01 | 1998-03-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Use of the protease domain of human plasminogen activator for the treatment of thromboembolic diseases |
WO1997038123A1 (en) * | 1996-04-05 | 1997-10-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells |
US6083715A (en) * | 1997-06-09 | 2000-07-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells |
CN101348789B (zh) | 1997-07-23 | 2016-08-17 | 罗切诊断学有限公司 | 通过同源重组在人细胞中生产人突变蛋白 |
AU9162198A (en) * | 1997-08-13 | 1999-03-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Plasminogen activator with improved zymogenity |
WO1999009184A1 (de) * | 1997-08-13 | 1999-02-25 | Roche Diagnostics Gmbh | Plasminogenaktivator mit verbesserter zymogenität und verminderter fibrinbindung |
DE10105912A1 (de) * | 2001-02-09 | 2002-08-14 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante Proteinase K |
DE10153601A1 (de) * | 2001-11-02 | 2003-05-22 | Paion Gmbh | DSPA zur Behandlung von Schlaganfall |
AR068914A1 (es) * | 2007-10-18 | 2009-12-16 | Paion Deutschland Gmbh | Uso de un activador de plasminogeno para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de apoplejia |
EP2289542A1 (en) | 2009-08-31 | 2011-03-02 | PAION Deutschland GmbH | Treatment of neurological or neurodegenerative disorders |
EP2289541A1 (en) | 2009-08-31 | 2011-03-02 | PAION Deutschland GmbH | Treatment of neurological or neurodegenerative disorders |
US11692033B2 (en) | 2017-02-03 | 2023-07-04 | Acticor Biotech | Inhibition of platelet aggregation using anti-human GPVI antibodies |
EP3624832A1 (en) | 2017-05-16 | 2020-03-25 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of acute ischemic stroke |
US20210238605A1 (en) | 2018-06-15 | 2021-08-05 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Use of pi3kc2b inhibitors for the preservation of vascular endothelial cell barrier integrity |
WO2021148439A1 (en) | 2020-01-21 | 2021-07-29 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for stimulating cerebrovascular function |
EP4161579A1 (en) | 2020-06-09 | 2023-04-12 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | Fucoidan-functionalized polysaccharide particles with t-pa for targeted thrombolytic therapy |
WO2023156683A1 (en) | 2022-02-21 | 2023-08-24 | Acticor Biotech | Treatment of cardiovascular diseases using anti-human gpvi antibodies |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4766075A (en) * | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
DE3382389D1 (de) * | 1982-12-14 | 1991-10-02 | South African Inventions | Plasminogenaktivator. |
US4620948A (en) * | 1982-12-22 | 1986-11-04 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4511502A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4753879A (en) * | 1984-08-27 | 1988-06-28 | Biogen N.V. | Modified tissue plasminogen activators |
US5073494A (en) * | 1985-04-22 | 1991-12-17 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator substituted at position 275 or at positions 275 and 277 |
JPH0672105B2 (ja) * | 1985-10-02 | 1994-09-14 | 持田製薬株式会社 | 血栓溶解剤及びその製法 |
DE3537708A1 (de) * | 1985-10-23 | 1987-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten |
US4777043A (en) * | 1985-12-17 | 1988-10-11 | Genentech, Inc. | Stabilized human tissue plasminogen activator compositions |
US5034225A (en) * | 1985-12-17 | 1991-07-23 | Genentech Inc. | Stabilized human tissue plasminogen activator compositions |
DE3611817A1 (de) * | 1986-04-08 | 1987-10-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur renaturierung von proteinen |
DE3643158A1 (de) * | 1986-04-21 | 1987-11-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Gewebs-plasminogen-aktivator(tpa) - derivat und seine herstellung |
US4898825A (en) * | 1986-05-07 | 1990-02-06 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Methods for purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator |
JPH0779692B2 (ja) * | 1986-05-07 | 1995-08-30 | 三井東圧化学株式会社 | 一本鎖t−PAと二本鎖t−PAを分離する方法 |
JPS6463378A (en) * | 1986-08-11 | 1989-03-09 | Mitsui Toatsu Chemicals | Separation of single stranded tpa and double standard tpa |
SE8702562L (sv) * | 1987-06-18 | 1988-12-19 | Kabigen Ab | Nya fibrinolytiska enzymer |
US4935237A (en) * | 1988-03-21 | 1990-06-19 | Genentech, Inc. | Processes for the preparation of t-PA mutants |
IL87276A (en) * | 1987-08-03 | 1995-07-31 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Analog of a tissue plasminogen activator containing the Pringle 2 and protease regions only, DNA encoding it, processes for its preparation, and pharmaceutical preparations containing it |
US5037752A (en) * | 1987-10-09 | 1991-08-06 | Monsanto Company | Modified tissue plasminogen activator substituted at cysteine-73 and lysine-277 |
US4963357A (en) * | 1987-10-09 | 1990-10-16 | Monsanto Company | Tissue plasminogen activator modified by the substitution of Arg for Cys at position 73, methods and pharmaceutical compositions therefor |
-
1989
- 1989-02-07 DE DE3903581A patent/DE3903581A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-01-30 IE IE34390A patent/IE61077B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-02-01 NZ NZ232337A patent/NZ232337A/xx unknown
- 1990-02-02 DD DD90337557A patent/DD291779A5/de not_active IP Right Cessation
- 1990-02-05 IL IL9328090A patent/IL93280A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-02-06 RU SU4831496A patent/RU2107094C1/ru active
- 1990-02-06 DK DK90102329.1T patent/DK0382174T3/da active
- 1990-02-06 AU AU50470/90A patent/AU623228B2/en not_active Expired
- 1990-02-06 EP EP90102329A patent/EP0382174B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-06 CZ CS90558A patent/CZ281836B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-02-06 CA CA002025900A patent/CA2025900C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-06 KR KR1019900702203A patent/KR970008485B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-02-06 LU LU90025C patent/LU90025I2/fr unknown
- 1990-02-06 SK SK558-90A patent/SK55890A3/sk not_active IP Right Cessation
- 1990-02-06 HU HU644/90A patent/HU218092B/hu unknown
- 1990-02-06 ZA ZA90861A patent/ZA90861B/xx unknown
- 1990-02-06 DE DE59009487T patent/DE59009487D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-06 AT AT90102329T patent/ATE126270T1/de active
- 1990-02-06 ES ES90102329T patent/ES2031804T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-06 US US07/585,129 patent/US5223256A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-06 UA UA4831496A patent/UA27111A1/uk unknown
- 1990-02-06 WO PCT/EP1990/000194 patent/WO1990009437A1/de active IP Right Grant
- 1990-02-06 JP JP2502957A patent/JP2559538B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-07 PT PT93082A patent/PT93082B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 NO NO904211A patent/NO306563B1/no not_active IP Right Cessation
- 1990-10-08 FI FI904951A patent/FI100244B/fi active IP Right Grant
-
1991
- 1991-09-27 GR GR90300140T patent/GR900300140T1/el unknown
-
1993
- 1993-06-01 LV LVP-93-448A patent/LV10302B/xx unknown
-
1995
- 1995-08-10 GR GR950402065T patent/GR3017099T3/el unknown
-
1996
- 1996-08-08 HK HK153396A patent/HK153396A/xx not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-02-17 NL NL970008C patent/NL970008I2/nl unknown
-
2000
- 2000-05-19 NO NO2000002C patent/NO2000002I1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU218092B (hu) | Eljárás szöveti-plazminogénaktivátor-származék előállítására | |
JP2631645B2 (ja) | 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 | |
Orsini et al. | Efficient renaturation and fibrinolytic properties of prourokinase and a deletion mutant expressed in Escherichia coli as inclusion bodies | |
RU2143490C1 (ru) | Бифункциональный вариант урокиназы, плазмида, содержащая синтетический структурный ген, кодирующий бифункциональную урокиназу, плазмида (варианты), способ получения плазмиды, способ получения бифункционального варианта урокиназы, тромболитическое средство | |
JP3329340B2 (ja) | トロンビン活性化プラスミノーゲン誘導体 | |
CA2163925A1 (en) | Chimeric proteins having fibrinolytic and thrombin-inhibiting properties | |
US5854048A (en) | Method for treating thromboembolic conditions using thrombolytically active proteins | |
CA2017636C (en) | Derivative of tissue-type plasminogen activator | |
CA2162986A1 (en) | Proteins having fibrinolytic and coagulation-inhibiting properties | |
HUT52558A (en) | Process for production of derivatives of prouroquinase with small molecule mass and medical compositions containing them as active substance | |
US5908625A (en) | Use of the protease domain of human plasminogen activator for the treatment of thromboembolic diseases | |
JP2000504941A (ja) | トロンビンによって活性化され得るプラスミノーゲンアクチベーター | |
EP0796323A1 (en) | Use of the protease domain of human plasminogen activator for the treatment of thromboembolic diseases |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
GB9A | Succession in title |
Owner name: ACTAVIS GROUP PTC EHF., IS Free format text: FORMER OWNER(S): BOEHRINGER MANNHEIM GMBH., DE; ROCHE DIAGNOSTICS GMBH, DE |