HU218092B

HU218092B - Eljárás szöveti-plazminogénaktivátor-származék előállítására

Info

Publication number: HU218092B
Application number: HU644/90A
Authority: HU
Inventors: Stephan Fischer; Ulrich Konhert; Ulrich Martin; Rainer Rudolph; Anne Stern
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1989-02-07
Filing date: 1990-02-06
Publication date: 2000-05-28
Also published as: KR910700336A; SK55890A3; NZ232337A; RU2107094C1; KR970008485B1; CA2025900C; CZ281836B6; DD291779A5; HUT58813A; NL970008I2; DK0382174T3; IL93280A; JPH03500724A; FI100244B; GR3017099T3; DE59009487D1; JP2559538B2; NL970008I1; ES2031804T3; NO2000002I1

Abstract

A találmány tárgya eljárás szövetplazminogénaktivátor- (t-PA)származékot kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós plazmidelőállítására. A találmány szerint a teljes t-PA-fehérjét vagy annakvalamely, a Kringle II- és a proteázdoméneken kívül a t-PA-- fehérjetovábbi területeit is tartalmazó valamely származékát kódoló DNS-szekvenciát egy plazmidba viszik, és irányított mutagenezissel a t-PA-származék felesleges aminosavait eltávolítják. A találmány tárgyatovábbá eljárás szövetplazminogénaktivátor- (t-PA) származékelőállítására a fenti plazmiddal transzformált sejtekkel. A találmánytovábbi tárgya a t-PA-származékot tartalmazó gyógyszerkészítmény éselőállítása. ŕ

Description

A találmány egy új t-PA-származékra, egy, az új t-PAszármazékot kódoló DNS-szekvenciára, a t-PA-származékot kódoló DNS-szekvenciát kifejező expressziós plazmidra, valamint az említett plazmidok előállítására, a t-PA-származék előállításának eljárására és a t-PAszármazékot tartalmazó véralvadék feloldásának módszerére vonatkozik.

Az alvadt vérben a fehérjemátrix-polimer főkomponense a fibrin. A fibrint a véralvadáshoz hasonló reakciókaszkádban, megfelelő fiziológiai körülmények között egy fibrinolitikus rendszerben feloldjuk. A meghatározó reakció a plazminogénnek a plazminhoz való aktiválása, mely például a szövetplazminogén-aktivátoron (t-PA) (tissue type plasminogen activator) keresztül működik. A plazmin ismét feloldja a fibrint, mely az alvadt vér fehérjemátrixának főkomponense. A természetes, illetve az eukariótákból géntechnológiai úton nyert t-PA enzimatikus aktivitása ugyanaz, mint a plazminogénnek a plazminhoz történő katalitikus aktiválása, ami a fibrin, illetve a fibrinogénhasított termékek távollétében rendkívül csekély, ám az említett fehérjék jelenlétében több mint tízszeresére növekszik.

A vérben található t-PA a megfelelő proteázok hatására egy A és egy B láncra hasad. A láncokat ciszteinhíd kapcsolja össze. A t-PA-aktivitás stimulálhatósága határozottan előnyös a többi ismert plazminogénaktívátorral, mint például az urokinázzal vagy sztreptokinázzal szemben [vesd össze például M. Hoylaerts és társai, J. Bioi. Chem. 257. (1982) 2912-2919.; W. Nieuwenhuizen és társai, Biochem. Biophys. Acta, 755. (1983), 531-533.]

A t-PA in vivő hatásmechanizmusát ismerteti Korniger és Collen, Thromb. Haemostasis 46. (1981), 561-565. A fibrin felületén fókuszált enzimaktivitás megfelelő módszernek tűnik a patológiás véredény-elzáródás leküzdésére (például szívinfarktus esetén), amint ezt a klinikai kísérletek nagy többsége is megerősíti [Collen és társai, Circulation 70. (1984), 1012.; Circulation 73 (1986), 511.]

A t-PA hátránya, amint ezt a plazmakoncentráció értékei alapján láthatjuk, hogy mennyisége gyorsan csökken (Clearance). Ebből arra következtethetünk, hogy egy vérrög hatásos in vivő líziséhez viszonylag nagy mennyiségű t-PA szükséges. A kezelések során alkalmazott nagy dózisok mellékhatásokat okozhatnak, például vérzést.

Az EP 0 196 920 a t-PA egyik természetes bomlástermékét írja le, amely csak a Kringle II- és a proteázdomént tartalmazza, és amelynek az N-terminális vége Alá 160-nal kezdődik [Pennica és társai, Natúré 301. (1983) 214-221.]; megadott aminosavszekvencia.

Az említett t-PA-bomlástermékek kiürülési rátája nem különbözik lényegesen a természetes t-PA-étól. A katalitikus hatás területén csak kémiai modifikálással érhetünk el javulást, blokkolócsoport alkalmazásával.

Ennélfogva a találmány feladata a t-PA olyan módon történő megváltoztatása, hogy a keletkező származék a vérplazmában erősen csökkent kiürülési rátát és ezzel együtt meghosszabbított felezési időt mutasson. A vérrög lízisét okozó hatást a fibrin stimulálhatóságán keresztül kapjuk meg.

A találmány tárgya eljárás szövetplazminogén-aktivátor (t-PA-származék) előállítására, azzal jellemezve, hogy az nincs glikozilezve, és aminosavszekvenciája megfelel az I általános képletnek, ahol az 1. számú aminosavnál (S) egy metioninnal (M) még meghosszabbítható.

Meglepő módon megállapítható, hogy a többi, a natív t-PA-ban meglevő tartomány deléciója semmilyen hatást nem fejt ki a fehérjék trombolitikus hatékonyságára, és a muteinek fibrinfuggő stimulálhatósága összevethető a natív t-PA-éval. Bár megállapítottuk, hogy a találmány szerinti t-PA-származéknál hiányzik a fibrin kötőképessége, ennek ellenére, meglepő módon, kimutatható a trombolízis hatékonysága, sőt, ellentétben a natív t-PA-nál tapasztaltakkal, annál lényegesen jobb. Hasonlóan meglepő az a tény is, mely szerint a származék trombolitikusan hatékony adagjánál a fibrinolízis mértéke az egész szervezetre kiterjedően szinte befolyásol atlan marad. Ezzel megmutattuk, hogy a találmány szerinti t-PA-származékok megfelelő fiziológiai körülmények között fibrinspecifikusságban a natív t-PA-ra jellemző tulajdonságokkal rendelkeznek. Az eredményeket a találmány szerinti t-PA-származékok farmakológiái vizsgálatai alapján kaptuk (6. és 7. példa). Ezenkívül a találmány szerinti fehérje rendkívül erős specifikus aktivitást mutat. A leírt renaturálás alkalmazása esetén 500—800 kU/mg közötti aktivitásértékeket határoztunk meg.

A találmány tárgya továbbá egy, a találmány szerinti t-PA-származékot kódoló DNS-szekvencia, melynek aminosavszekvenciája a II általános képletnek felel meg.

Amennyiben a megfelelő expressziós plazmid rendelkezésünkre áll, a találmány szerinti DNS-szekvencia a találmány szerinti t-PA-származék expresszálásához használható. A találmány további tárgya az említett expressziós plazmid, illetve egy, innen eltérő DNSszekvenciát felismerő expressziós plazmid, mely szintén a találmány szerinti t-PA-származékot kódolja. A genetikai kód degenerációjának alapján a bemutatott DNS-szekvenciától eltérő szekvenciák is alkalmasak.

Előnyös esetben az expressziós plazmid a t-PA-származékot kódoló szekvencia mellett egy szabályozható promotorszerkezettel (például tac), egy hatásos terminátorral (például fd), egy szelekciós markerrel (például béta-laktamázgénnel), illetve egy replikációs origóval egeszül ki.

A találmány tárgya továbbá a pA27.3 plazmid. Az említett plazmid előállítását az 1. példában mutattuk be, ez egy, a plazmidot kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.

A találmány tárgya továbbá egy eljárás a találmány szerinti expressziós plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy az összes t-PA-fehérjét, illetve annak valamely származékát - mely a Kringle II- és a proteázdoinéneken keresztül a t-PA-fehérjék további hatásait is felmutatja - kódoló DNS-szekvenciát egy plazmidba visszük, és irányított mutagenezissel eltávolítjuk az említett hatásokat okozó, a találmány szerinti t-PAszármazékokban elő nem forduló aminosavakat.

A találmány szerinti t-PA-származékot kódoló DNSszekvenciát tartalmazó plazmid kiválasztása a származék későbbi, az alkalmazott gazdasejtben történő exp2

HU 218 092 Β resszálódásától függ. A megfelelő plazmidokkal szemben támasztott alapvető követelményeket (például a replikáció eredete, a restrikciós hasítási helyek stb.) a szakértők jól ismerik. A találmány keretében azonban egy plazmid kozmidját is alkalmazhatjuk, mely a fág (lamdba, Ml3) replikatív, kettős láncú formája, vagy más, a szakértők által jól ismert vektorokat alkalmazhatunk. Az irányított mutagenezis eljárását (site-directed mutagenesis) Morinaga és társai ismertetik [Biotechnology 21., (1984), 634.], lényegében az ott leírt eljárást hajtottuk végre.

A találmány tárgya továbbá egy eljárás a találmány szerinti t-PA-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy egy találmány szerinti plazmid a megfelelő gazdasejtben alkalmazva expresszálódik, és a terméket, adott esetben a gazdasejtek feltárása után, a tápközegből kinyerjük. Előnyös esetben a találmány szerinti t-PAszármazék előállítására prokarióta-gazdasejteket alkalmazunk. Itt egy újabb, az eddigiektől eltérő előny jelentkezik, mely szerint az így kialakított, úgynevezett inklúziós testeket („inclusion bodies”) (oldhatatlan fehérjeaggregátumok) mindenekelőtt elválasztjuk a sejtrészecskéktől, a t-PA-t tartalmazó inklúziós testeket redukálókörülmények között, guanidin-hidrokloriddal való kezelés során szolubilizáljuk, GSSG-t adunk hozzá, és végül L-argininnel és GSH-val renaturáljuk. A t-PA inklúziós testekből történő aktiválásának pontos leírását az EP-A 0 219 874 és az EP-A 0 241 022 tartalmazza. Az aktív fehérjék inklúziós testekből való kinyerésére alkalmas további eljárásokat a találmány tartalmazza.

A K2P találmány szerinti tisztítása során előnyös az L-arginin jelenléte, különösen előnyös a 10-1000 mmol/1 közötti mennyiség alkalmazása.

Az idegen fehérjéktől való elválasztás a találmány szerint affinitáskromatográfiával történik, előnyben részesítve egy ÉTI (Eritrina Tripszin Inhibitor) adszorberoszlop alkalmazását. Az ETI-t egy hordozóanyagon (például Sepharose) fixáljuk. Az ETI-adszorberoszlopon történő tisztításnak az az előnye, hogy az ETI-adszorberoszlop anyaga közvetlenül a koncentrált renaturálóréteggel lehet megtöltve, különösen az ilyen magas argininkoncentráció jelenlétében (például 0,8 mol/1). Ezáltal elkerülhető a K.2P alacsony argininkoncentráció jelenlétében végbemenő aggregációja. Ezért különösen előnyös az ETI-adszorberoszlopon a K2P-től való tisztítás kivitelezése során 0,6-0,8 mol/1 arginin jelenlétében dolgozni. A K2P-t tartalmazó oldódás során előnyösek a 7-nél magasabb pH-értékek, különösen előnyös a 7,5-8,6 közötti tartomány.

Az ETI-oszlop elúciója a pH-értékek csökkenése során megy végbe, mind a K.2P jó oldhatóságát lehetővé tevő arginin jelenlétében, mind annak hiányában. Az elúció során a pH-értékek a savas tartományba esnek, előnyös esetben 3-5,5 közé.

A találmány szerint előállított, 95% feletti, előnyös esetben 99% tisztaságú K.2P specifikus t-PA-aktivitása 550 000±200 000 IU/mg közötti érték.

A találmány szerint tehát egy t-PA-származékot állítunk elő, mely a csökkentett kiürülési ráta alapján meghosszabbodott plazmafélérték-időt mutat. A találmány szerinti származék tulajdonságai alapján alkalmasnak tűnik az artériás és vénás al vadék trombolízise során a gyógyszerként történő felhasználásra. A K2P-vel történő trombolitikus terápia során a szükséges dózis a natív t-P A-nál megszokott értéknek legalább negyedére csökken. A K2P és a natív t-PA azonos hatékonyságú dózisánál az alvadási rendszert a K2P a t-PA-nál kevésbé befolyásolja, és a vérzési idő sem hosszabbodik meg jelentősen a natív t-PA-hoz képest, így a K2P-vel történő terápia során fellépő vérzéses komplikációk csökkentésére megvan a lehetőség.

így a találmány szerinti t-PA-származék kiváltképpen alkalmas a gyógyszerként történő felhasználásra, ami a találmány további tárgya. A találmány szerinti tPA-származék gyógyszerként történő felhasználása során az a célunk, hogy a natív, CHO-ban termelt t-PA esetében alkalmazottnál kisebb dózismennyiségekkel azonos hatékonyságot érjünk el.

Az alábbi példák az ábrák segítségével a találmány részletes kifejtésében nyújtanak segítséget:

1. ábra

A pA27.3 plazmid sematikus előállítása.

2. abra

A találmány szerinti t-PA-származékot (1. görbe), a CHO-sejtekkel kifejezett natív t-PA-származékot (a CHO-sejtekből származó, kettős láncú t-PA, a fiziológiai hasítási helyeken Arg275-Ile276 alkalmazásával felhasítva, 2. görbe), és egy, a CHO-sejtekből származó, kettős láncú t-PA-t (3. görbe) hasonlítja össze.

3. és 4. ábra

A találmány szerinti t-PA-származék t-PA-aktivitásának farmakokinetikai diagramja, összehasonlítva egy általánosan előállítható t-PA-származékkal (Actilyse®); [1. görbe: K2P, dózis 200 000 U/kg=0,25 mg/kg; iv. inf. 30 perc felett; a megvizsgált állatok mennyisége (házinyul): 4; 2. görbe: Actilyse®, dózis 200 000 U/kg; iv. inf 30 perc felett; a megvizsgált állatok mennyisége (házinyúl): 6],

5. ábra

A lalálmány szerinti t-PA-származék alkalmazott dózisainak hatását bemutató görbék (házinyulakra), Actilyse®-szel összehasonlítva (bemutatva: a középérték + SEM, 1 KU=1000 IU; 1. görbe: K2P; 2. görbe: Actilyse®).

6. ábra

A szimplát vérzési idő (BT) időbeli lefolyását mutatja be. a placebóval történő iv. boluszinjekció előtt és után, illetve emelkedő mennyiségű Actilyse® alkalmazása esetén, narkotizált kutyákon.

7. ábra

A szimplát vérzési idő (BT) időbeli lefolyását mutatja be, a placebóval történő iv. boluszinjekció előtt és után, illetve emelkedő mennyiségű K2P alkalmazása esetén, narkotizált kutyákon.

1. példa

A pA 27.3 plazmid szerkezete

A kiindulási plazmid az EP-A 0 242 836-ban leírt pREM7685, mely az alábbi alkotórészeket tartalmazza: tac-promotert, lac operátorszakaszt ATG startkodonnal,

HU 218 092 Β az FK2P t-PA-származékot kódoló szakaszt, a pKK2233 transzkripciós terminátorát, egy béta-laktamázgént, egy kanamicinrezisztencia-gént, és a sejtben alacsony kópiaszámban előforduló pACYC177 plazmid origóját. Az FK2P t-PA-származék szekvenciája a 190-336 között (F-domén) és a 715-1809 között (K2-domén, proteáz, kis része 3’UT) nukleotidokból, valamint egy startkodonból áll. A nukleotidok pozícióját Pennica és társai határozták meg [Natúré 301. (1983) 214-221.].

A pREM7685 plazmid FK2P szerkezete F-doménjének deléciójához Morinaga és társai eljárását alkalmaztuk [Biotechnology 21. (1984), 634.] A heteroduplex képzéséhez a pREM7685-öt két fragmentumra izoláltuk. A fragmentum: a pREM7685-öt EcoRI restrikciós enzimmel hasítottuk. A hasított termékeket gélelektroforézissel vizsgáltuk, és a legnagyobb EcoRI fragmentumot eluáltuk a gélről. B fragmentum: a pREM7685 plazmidot Xhol restrikciós enzimmel linearizáltuk. A linearizált plazmidot szintén gélelektroforézis után kaptuk meg. A mutagenezishez az alábbi oligonukleotidot állítottuk elő szintetikus úton:

‘5 TG TCT TAC CAA GGA AAC AGT GA 3’.

A heteroduplex képzéséhez az A fragmentumot, a B fragmentumot (mindegyik 450 fmol) és az oligonukleotidot (75 pmol) 50 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 TriszHC1 pH=7,5 és 10 mmol/1 MgSO₄ jelenlétében elegyítettük, 3 percig 100 °C-on inkubáltuk, majd jégre vittük. A DNS renaturálása 60 °C-on 30 perc alatt következett be. A javítószintézishez az alábbiakat adtuk a heteroduplexhez:

dezoxi-nukleotid-trifoszfát (0,25 mmol/1), ATP (1 mmol/1), NaCl (100 mmol/1), Trisz-HCl pH=7,5 (6,5 mmol/1), MgCl₂ (8 mmol/1) béta-merkapto-etanol (1 mmol/1), E. coli DNS-polimeráz Klenow-fragmentuma (0,125 U/μΙ mennyiségben), és T4-ligáz (0,1 U/μΙ mennyiségben). A javítószintézis 16 °C-on 4 óra alatt következett be. Végül a kapott anyagot lac Ii- plazmid segítségével E. coli sejtekbe (RM82, DSM 3689) transzformáltuk, majd a transzformátumot 25 pg/ml Kanamycin hozzáadásával szelektáltuk a tápközegből.

A kolóniahibridizációs technika segítségével a fent bemutatott mutagén-oligonukleotidok mint szonda alkalmazásával kiválogattuk azokat a pA27.3 plazmidot hordozó kiónokat, melyek a találmány szerinti t-PAszármazékot kódolják. Ezek a plazmidok többek között abban különböznek a pREM7685 kiindulási plazmidtól, hogy hiányzik belőlük egy PstI, illetve egy Sspl hasítási hely. Ezeket a hasítási helyeket a kiindulási plazmidnak az a területe tartalmazza, mely az F-doméneket kódolja. A pA27.3 plazmid sematikus szerkezetét az

1. ábrán mutatjuk be.

2. példa

Az E. coliból származó aktív K2P t-PA-származék előállítása

A sejtek lízise és az inklúziós testek (IB’s) előállítása

1,6 kg nedves sejttömeget (E. coli, DSM 3689, pA27.3 plazmiddal transzformálva) 10 10,1 mol/1 TriszHCl és 20 mmol/1 EDTA elegyében 4 °C-on felszuszpendáltuk, pH=6,5. Az elegyhez 2,5 g lizozimot adtunk, és 4 °C-on 30 percig inkubáltuk; a teljes sejtfeltárást nagynyomású diszperzió segítségével végeztük el. A feltárás során kapott anyaghoz 5 1 0,1 mol/1 TriszHCl, 20 mmol/1 EDTA, 6% Triton X100 és 1,5 mol/1 NaCl elegyét adtuk, pH=6,5, és 4 °C-on 30 percig inkubáltuk. Végül az oldhatatlan alkotórészeket (IB’s) Padberg-centrifügával távolítottuk el.

A pelleteket 10 1 0,1 mol/1 Trisz-HCl és 20 mmol/1 EDTA elegyében 4 °C-on felszuszpendáltuk, pH=6,5. Az elegyhez 2,5 g lizozimot adtunk, és 4 °C-on 30 percig inkubáltuk, majd a kapott IB-preparátumot centrifügálással izoláltuk.

Az inklúziós testek (IB’s) szolubilizálása

100 g inklúziós testet (IB’s) 450 ml 0,1 mol/1 TriszHCl, 6 mol/1 guanidin.HCl, 0,2 mohi DTE (1,4-ditioeritritol) és 1 mmol/1 EDTA elegyében felszuszpendáltuk, pH = 8,6, majd 2,5 órán keresztül 25 °C-on kevertük.

Miután a pH-értéket HCl-dal (25%) 3-ra állítottuk, a mintát 10 mmol/1 HC1 segítségével dializáltuk (3x501, 24 óra, 4 °C).

Derivatizálás

A guanidin.HCl (szilárd) előkészítése során a fenti dializátum végső koncentrációját 10 mmol/1 HCl-dal állítjuk be, 6 mol/1 guanidin.HCl értékre.

Az anyagot 25 °C-on 1,5 órán keresztül előinkubáljuk, majd 0,1 mol/1 glutation (GSSG) és 0,05 mol/1 Trisz-HCl mellett oxidáljuk, és 5 mol/1 NaOH segítségével pH = 9,3-ra titráljuk. Ezután az anyagot 25 °C-on 1,5 órán keresztül keverjük.

A pH-értéket HCl-dal (25%) 3-ra állítjuk, majd az anyagot 10 mmol/1 HCl-dal dializáljuk (3x100 1, 48 óra, 4 °C). A dialízis után a megmaradt tiszta anyagot dolgozzuk fel.

Naturálás

Egy 10 1-es reakcióedényt 0,1 mol/1 Trisz-HCl-dal, 0,8 mohi L-argininnal, 2 mmol/1 GSH-val (gentation glutation, redukált alak) és 1 mmol/1 EDTA-val megtöltjük, pH=8,5. A renaturálást 20 °C-on végezzük, háromszor, esetenként 100-100 ml származék (elegyített diszulfid, lásd fent) adagolása mellett, a reakció időtartama 24 óra.

A renaturálás után 1500-10 000 IU/mg specifikus aktivitással rendelkező anyagot kapunk [a meghatározás összevethető a 4b.) példával]. Az IU a WHO, National Institute fór Biological Standards and Control definíciója szerint az aktivitás egysége.

A renaturált anyag betöményítése

A renaturált anyag igény esetén hemodializátorban töményíthető be.

3. példa

Az E. coliból származó K2P tisztítása

1. Az E. coliból származó K2P tisztítása a fenti koncentrációban ETI-Sepharose oszlopon történik, affinitáskromatográfiás eljárás alkalmazásával.

a.) Citromsavas elúció

A renaturált anyagot hemodializátorban (Asahi AM 300) 1:23 arányban betöményítjük, és 0,5 mol/1 NaClot adunk hozzá. Egy 0,1 mol/1 Trisz-HCl-dal, pH=7,5, 0,8 mol/1 argininnel és 0,5 mol/1 NaCl-dal ekvilibrált ÉTI (Eritrina Tripszin Inhibitor) Sepharose oszlopot

HU 218 092 Β (V=50 ml) 550 ml koncentrált, reoxidált anyaggal feltöltünk (10 oszloptérfogat/h, 10 OT/h), és az ekvilibráló pufferrel addig mossuk, amíg az eluátum abszorpciója 280 nm-en eléri a puffemek megfelelő háttérértéket. A megkötött anyag elúciója 20 mmol/1 citromsavval történik, pH=3,2.

	Térfogat (ml)	Aktivitás (IU/ml)	Cprot (mg/ml)	SA¹·) (IU/mg)
Koncentrátum	550	57 162	14	4 083
ETI-eluátum	90	.130 000	0,71	465 000

'> Specifikus aktivitás; a kromogén vizsgálatok alapján mért aktivitás [vesd össze 4b.) példa] osztva a minta proteintartalmával.

b.) 0,3 mol/1 argininnel (pH=4,5) végzett elúció A renaturált anyagot a 3.1.a pont alapján betöményítjük. Egy 0,1 mol/1 Trisz-HCl-dal, pH = 7,5, 15 0,8 mol/1 argininnel és 0,5 mol/1 NaCl-dal ekvilibrált ETI-Sepharose oszlopot (V=25 ml) 800 ml koncentrátummal feltöltünk (12 oszloptérfogat/h), és az ekvilibrálópufferrel addig mossuk, amíg az eluátum abszorpciója 280 nm-en eléri a puffemek megfelelő háttérértéket A megkötött anyag elúciója 0,3 mol/1 argininnel (pH=4,5) történik.

	Térfogat (ml)	Aktivitás (IU/ml)	c '-'proi (mg/ml)	SA (IU/mg)
Koncentrátum	800	20 000	11,3	1 770
ETI-eluátum	55	280 000	0,6	550 000

2. Az E. coliból származó K2P affinitáskromatográfiás eljárás alkalmazásával, ETI-Sepharose oszlopon történő tisztítása, előzetes betöményítés nélkül

Egy 0,1 mol/1 Trisz-HCl-dal, pH=7,5, 0,8 mol/1 argininnel és 0,5 mol/1 NaCl-dal ekvilibrált ETI-Sepharose oszlopot (V = 10 ml) 12 1 reoxidált anyaggal feltöltjük, és az ekvilibrálópufferrel addig mossuk, amíg az eluátum abszorpciója 280 nm-en eléri a puffemek megfelelő háttérértéket. A megkötött anyag elúciója

0,8 mol/1 argininnel történik, pH = 5.

	Térfogat (ml)	Aktivitás (IU/ml)	c ^prot (mg/ml)	SA (IU/mg)	Fi.)
Reoxidált anyag	12 000	615	0,135	4556	25
ETI-eluátum	42	105 300	0,185	568 000	35

¹ Ά fibrinnel történő stimulálás=fibrin jelenlétében mért aktivitás osztva a fibrinntentes minta aktivitásával.

4. példa

Az E. coliból származó megtisztított K2P jellemzése a.) Proteinkémiai jellemzés

- SDS-PAGE és reverz fázisú HPLC

Az ETI-Sepharose oszlopon affinitáskromatográfiás eljárással kapott anyag homogenitását SDS-PAGE és reverz fázisú HPLC (RP-HPLC) segítségével vizsgáltuk. A megtett relatív út alapján a prokarióta K2P-kre 38 500+2 000 molekulatömeg-értéket határoztunk meg. A kiértékelés szerint a preparátum tisztasága >95%.

Az RP-HPLC a fehérjék és a hidrofób mátrixok közötti különféle kölcsönhatásokon alapul. Ez a sajátság a tisztasági fok kvantitatívvá tételéhez szolgál alapul.

Az E. coliból származó megtisztított K2P analízise Nucleosil 300 elválasztóoszlopon történik (Knauer), trifluor-ecetsav/acetonitril gradiens segítségével (A puffer: 1,2 ml trifluorecetsav 1000 ml vízben; B puffer; 300 ml H₂O, 700 ml acetonitril, 1 ml trifluor-ecetsav; 0-100%). A kromatográfiás analízis integrációja szerint a tisztaság >95%.

- N-terminális aminosavszekvencia

Az N-terminális aminosavszekvencia meghatározása ABI 470 szekvenátor segítségével, egy standard programmal, on-line detektálással történt. A meghatározott szekvencia,

S1-Y2-Q3-G4-N5-S6-D7-C8-Y9, összhangban van az eredeti DNS-szekvenciával, és megfelel a várakozásnak.

b. ) Az aktivitás meghatározása

Az E. coliból származó K2P in vitro aktivitását a „Zeitschrift für die gesamte innere Medizin”, (2GIMAL) 42. (17), 478-486. vizsgálati leírása alapján határoztuk meg. A specifikus aktivitás értéke 550 000 IU/mg±200 000 IU/mg között található. Ebben a vizsgálati rendszerben az E. coliból származó K2P stimulálhatósága a fibrinogén BrCN-fragmentumán keresztül >25 volt (fibrin jelenlétében mért aktivitás osztva a fibrinmentes mintában mért aktivitással).

c. ) In vitro megkötődés a fibrinen

Az E. coliból származó K2P in vitro fibrinhez kapcsolódását Higgins és Vehar eljárása szerint határoztuk

HU 218 092 Β meg [Higgins, D. L. és Vehar, G. A. (1987), Biochem. 26., 7786-7791.].

A 2. ábra szerint az E. coliból származó K2P a CHO-ból származó t-PA-val, illetve az E. coliból származó t-PA-val szemben a fibrinhez nem mutat említésre méltó kapcsolódást.

5. példa

A stimulálhatóság fokozására a K2P gént kódoló szekvenciát magasabb kópiaszámban egy plazmidba klónoztuk. Ehhez a DE 38 38 378.0 szabadalmi bejelentés szerinti pePa 126.1 plazmidot alkalmaztuk. Ezen a plazmidon lényegében a pKK223-3 vektor és a t-PA kódolandó szekvenciája foglal helyet, amint ezt az EP-A 0 242 835 leírja.

Az említett plazmidba először egy fd-terminátor-szekvenciát integráltunk. Ehhez a pePa 126.1 plazmidot Hind III restrikciós enzimmel linearizáltuk. Az így elhasított plazmidot gélelektroforézissel vizsgáltuk és tettük preparatívvá. A pLBUl plazmidot [Beck és társai (1978), Nucl. Acids Rés., 5., 4495-4503.; Gentz és társai (1981), PNAS 78. (8): 4963.] Hind III-mal hasítottuk, és egy 360 bp nagyságú, az fd-terminátort tartalmazó Hind III fragmentumot gélelektroforézissel és gélelúcióval tettünk preparatívvá. A linearizált pePa 126.1 plazmidot és a pLBUl-ből származó, 360 bp nagyságú Hind III fragmentumot ligáltuk. A ligáit anyagot a DE 38 38 378.0 szabadalmi bejelentésben leírt pUBS 500 plazmid segítségével E. coli DSM 2102-be kotranszformáltuk. A kiónok közül kiválasztottuk azokat, melyek a kívánt pePa 126 fd-t tartalmazták, ezek a kiindulási pePa 126.1 plazmidtól abban különböztek, hogy az egy második Hind III hasítási helyet tartalmazott.

A pePa 126 plazmidból két fragmentumot kaptunk: egy 3,4 kb nagyságú BamHI/Pvul fragmentumot és egy 1,3 kb nagyságú Pvul/Xmal fragmentumot. A fenti fragmentumokat egy, a pA27.3 plazmidból származó, 1,3 kb nagyságú BamHI/Xmal fragmentummal ligáltuk, és a pUBS 500 plazmid segítségével E. coliba transzformáltuk. Az így kapott plazmid a pA27 fd nevet kapta, és a pePa 126-tól annyiban különbözik, hogy az EcoRI-vel végzett restrikciós hasítás során a pePa 126 fd második legkisebb fragmentuma körülbelül 610 bp hosszúsággal, míg a pA27-é körülbelül 515 bp hosszúsággal megrövidítve található.

6. példa

A prokariótákban expresszált K2P t-PA-származékának farmakológiai vizsgálata

1. A K2P házinyulakon végzett farmakokinetikai vizsgálata

Az általánosan ismert Neuseeland-házinyulakon hasonlítottuk össze a K2P és az Actilyse® farmakokinetikai tulajdonságait. Mindkét fibrinolitikus anyagot 200 000 IU/kg (a testtömegre vonatkoztatva) adagban infundáltuk, 30 percen keresztül. A plazmavizsgálatokat meghatározott időpontokban, az infúzió előtt, alatt és után végeztük el. A t-PA-aktivitást J. H. Verheijen és társai módszerével (Thromb. Haemostas. 48., 266.,

1982) , H. Lili (Z. ges. Inn. Med. 42., 478., 1987) módosítása szerint mértük.

A farmakokinetikai paramétereket nemlineáris regressziós programmal határoztuk meg, melyet Η. Y. Huang (Aero-Astronautics-Reports 64., Rice University, 1-30., 1969) módosított. A paramétereket egy biexponenciális farmakokinetikai modell segítségével határoztuk meg egyénileg.

A K.2P ötször hosszabb felezési időt mutatott (t^alfa=10,3 perc, koncentrációcsökkenés a plazmában), mint az Actilyse® (a Thomae cég t-PA-készítménye) (1. táblázat, 5. és 6. ábra). Az infúzió befejezésekor (30 perc után) megmértük a K2P-Pro egyik plazmakoncentrációjának t-PA-aktivitását (C_inf), ennek értéke 1986 IU/ml volt, ez hatszorosa az Actilyse®-nál mért értéknek. A központi részecskék térfogateloszlása (V,) a K2P esetében 46,8 ml/kg, míg az Actilyse® esetében 73,7 ml/kg volt. Az összes plazma kiürülési értéke (Cl_tot) az Actilyse® esetében meghatározott értékkel szemben (Cl_tot=22,2 ml/min/kg) a t-PA-Pro-nál %-ére csökkent (Cl_tot=3,2 ml/min/kg). A fibrinolitikus anyagok boluszinjekció céljára történő alkalmazása esetén különösen érdekes a görbe alatti terület [„Area under the curve” (AUC)], mivel általa lehetővé válik a plazmában uralkodó koncentráció időbeli változásának követése. A K2P esetében nyolcszor magasabb AUC-értékeket mértünk (1064 IU/ml xh), mint az Actilyse®nál (133,3 IU/ml xh).

Az Actilyse®-el összehasonlítva csak a K2P, a jelenleg egyedüli rekombináns t-PA-fehérje mutatott 5-8szoros javulást a farmakokinetikai profil vizsgálata során, azonos dózisok alkalmazása esetén.

2. A K2P házinyulakon végzett farmakodinamikai vizsgálata

A trombolitikus hatások vizsgálatára a Collen és társai által házinyulakra létrehozott jugulárisvénatrombózis-modellt alkalmaztuk (J. Clin. Invest. 71., 368.,

1983) . A K2P-t és az Actilyse®-t mindig 3 dózisban vizsgáltuk. A fibrinolitikumot 4 órán keresztül infundáltuk, majd meghatároztuk a trombolízis mértékét (2. táblázat, 5. ábra).

Lineáris regressziós egyenes segítségével kiszámítottuk az 50%-os (ED₅₀) trombolizerátumok dózisát, mely K2P esetében 124 000 IU/kg (a testtömegre vonatkoztatva), míg Actilyse® esetében 520 000 IU/kg (a testtömegre vonatkoztatva). Eszerint a K.2P trombolitikus hatása négyszer erősebb, mint az Actilyse® esetében.

A K2P-nél a plazmakoncentrációtól függő t-PA-aktivitást értünk el, az Actilyse®-szel összehasonlítva négyszer alacsonyabb dózisok alkalmazása esetén. A trombolitikus hatás szempontjából összehasonlítható mennyiségű hatóanyag, 800 kU Actilyse®/kg (a testtömegre vonatkoztatva), illetve 200 kU K2P/kg (a testtömegre vonatkoztatva) jelentéktelen mértékben befolyásolta a fibrinogén, a plazminogén és az alfa₂-antiplazmin alvadási paramétereit, valamint a 800 kU Actilyse®/kg (a testtömegre vonatkoztatva) hatását nem tudtuk megkülönböztetni a 200 kU K2P/kg (a testtömegre vonatkoztatva) hatásától.

HU 218 092 Β

A K2P egy t-PA-mutein, mely a házinyulakra létrehozott jugulárisvénatrombózis-modellen a fibrinolitika négyórás infúziója során az Actilyse®-szel összehasonlítva a dózisok χ értékre való csökkenését eredményezte, mégpedig az Actilyse®-szel azonos trombolitikus hatás kifejtése mellett. A csökkentett mennyiségű K2Pnek az alvadási rendszerre és a plazmakoncentráció t-P A-akti vitására gyakorolt hatása nem különbözik az Actilyse® hatásaitól.

1. táblázat

Farmakokinetikai paraméterek, a t-PA-plazmakoncentráció-idő adatok alapján a t-PA-aktivitás meghatározása számítógéppel

Átlag [dózis: 200 000 IU/kg (a testtömegre vonatkoztatva)]	tX (min)	tX (min)	⁽ inf (IU/ml)	Ve (ml/kg)	ci_tot (ml/min/kg)	AUC_cxtrap_Oi (IU*h/ml)
	10,3	14,9	1986,6	46,8	3,2	1064,4
K2P (n=4)	±1,7	±4,6	±762,6	±14,7	±1,1	±443,2
	2,3	10,9	326,6	73,7	22,2	133,3
Actilyse® (n=6)	±0,6	±2,4	±118,1	±18,7	±7,6	±44,1

2. táblázat

A K2P, az Actilyse® és az oldószer trombolízis t-PA-plazmaaktivitás- (4 órás infúzió után), és hemosztázisparaméterei (az infúzió befejezése után 30 perccel)

	K2P (200 kU/kg)	K2P (100 kU/kg)	K2P (50 kU/kg)	Oldószer (NaCl/Twcen)	Actilyse® (800 kU/kg)	Actilyse® (400 kU/kg)
Trombolízis (%)	79±9	32±6	29 ±1	Ilii	64±6	46±3
(n = 3)	(n=5)	(n = 2)	(n=6)	(n=7)	(n=6)
Plazma-t-PA-aktivitás (IU/ml)	93,7±18,2	44±3	7±0	-	107±27	47±9
Fibrinogen (%)	74±2	90±6	86.5±6	92±3	77±6	90±3
Plazminogén (%)	79±7	75±6	87 ± 11	98±10	77±4	88±4
Alfaj-antiplazmin (%)	70±l	70±4	93 ±4	98±8	74±6	87±3

ÉrtckiSD; kU=1000IU;

hemosztázisparamétcrek (% az alapvonalra vonatkoztatva)

7. példa

Az E. coli által termelt K2P farmakológiai tulajdonságai koszorúér-trombózis esetén, kutyamodellen

Az E. coli által termelt K2P-nek az artériás trombózisra kifejtett trombolitikus hatása vizsgálatára akut miokardiális infarktusban szenvedő állatok alkalmazásával állítottunk fel egy kísérleti modellt. A kísérlethez kiválasztott állatfaj a kutya volt. A koszorúértrombus létrehozásához Romson és társai módosított eljárását választottuk ki (Thromb. Rés. 17., 841., 1980). Narkotizált és mesterségesen lélegeztetett kutyák nyitott mellkasán keresztül elektromosan ingereltük (150 μΑ) az A. coronaria sinistra Ramus circumflexusának intimafelületét ( = left circumflex coronary artery=LCX), ezáltal trombust hoztunk létre. A trombózistól disztálisan egy csavart rögzítettünk, így egy kísérleti szűkületet alakítottunk ki, melyen keresztül a reaktív hiperémiát elimináltuk. A koronáriatrombózistól proximálisan helyezkedett el az LCX, egy elektromágneses áramlásmérő fejjel felszerelve, mellyel a reperfúziót mértük.

Az adagolás tanulmányozására a BM 06.022-t az eukariótákból származó t-PA-val (Alteplase, Actilyse®,

Dr. Kari Thomas GmbH, Biberach, FRG) négy különböző adagban, valamint placebót alkalmaztuk, minden esetben 6 állat/adag került megvizsgálásra, kiindulásként a heparinnal kezelt kutyákba intravénásán, 1 percen keresztül injektáltuk az anyagot. Az injektálás előtt, valamint közben, meghatározott időpontokban mintát vettünk a plazmából, és meghatároztuk a teljes vér t-PAaktivitásának plazmakoncentrációját, valamint a fibrinogén, a plazminogén és az alfa₂-antiplazmin trombocitaszámát. A fibrinogént koagulometriásan, Clauss eljárásával (Acta Haemat. 17., 237., 1957), a plazminogént, és az alfa₂-antiplazmint spektrofotometriásán, Collen és társai eljárásával (J. Clin. Invest. 71., 368., 1983) mértük. Megmértük továbbá a „szimplát vérzési időt”, ez a kutyák hátsó lábán történt, egy ércsappantó segítségével (Simplate® I, Organon Teknika, Eppelheim, FRG), miközben 40 Hgmm-es vénás pangást mértünk (J. Surg. Rés. 27., 244., 1979). Az injektálás után mért értékek és az injektálás előtti kontrollértékek statisztikai összehasonlítása a Wilcoxon-teszt segítségével történt.

A trombolitikus eredmények leírásához a reperfúndáltatott állatok dóziscsoportonkénti számát (=reperfú7

HU 218 092 Β ziós ráta) és a reperfüzióig eltelt időt (=reperfúziós idő) adtuk meg. Továbbá megmértük a kétórás injektálás után még rendelkezésre álló trombusmaradék tömegét, illetve meghatároztuk azoknak az állatoknak a számát, melyeknél a reperfúzió után újabb elzáródást találtunk (reokklúziós ráta). A dózishatások féllogaritmusos regresszióanalízisének segítségével a reperfúziós rátára vonatkozólag minden egyes anyagra kiszámítottuk az 50%-os reperfúziós ráta ( = ED₅₀) hatásos dózisát. A trombusmaradékok tömegének statisztikus összehasonlítása független szúrópróbákból, a WilcoxonMann-Whitney-teszt segítségével történt.

A t-PA-aktivitás plazmakoncentrációját Verheijen és társai spektrofotometriás eljárásával mértük meg (Thromb. Haemost. 48., 266., 1982), melyet Lili módosított (összegyűjtve lásd Inn. Med. 42., 478., 1987). A farmakokinetikai paraméterek kiszámítása nemlineáris regresszióra írt számítógépes programmal történt, melyet Η. Y. Huang módosított (Aero-Astronautics Report 64., Rice University, USA, 1-30., 1969). Az egyedi paramétereket a t-PA-aktivitás testre jellemző alapszintjének a következő mérési értékből való levonása után biexponenciális farmakokinetikai modell segítségével számítottuk ki.

Az alábbi eredményeket kaptuk.

1. Kutyákon vizsgált farmakodinamika

A K2P az intravénás injekció után dózisfuggő reperfúziós rátát mutatott. Maximális hatást (reperfúzió 100%) 200 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva) esetében értünk el. Actilyse®-nél 1600 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva) esetében értük el a 100%-os reperfúziót. Az ED₅₀-értékek összehasonlítása során a K2P [ED_5O=83 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva)] esetében 11,5-ször alacsonyabb értéket kaptunk, mint az Actilyse® [ED₅₀=961 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva)] esetében. A placebo beadásakor nem észleltünk reperfúziót. A placeboállatoknál a trombus maradékok tömege 9,6±1,6 közötti értéket mutatott (középérték±SEM); vagyis emelt dózisok esetén, összehasonlítva a placebokontrollal, a K2P az Actilyse®-hoz hasonlóan jelentős csökkenést eredményezett a trombusmaradékok tömegében. A reperfúzió mindkét fibrinolitikum esetében hasonló átlagokat eredményezett, a K2Pnél 25,9±3,5, és az Actilyse®-nél 9,6±1,6 értékeket. A reperfúzió után mind a K2P-vel, mind az Actilyse®szel kezelt kutyáknál újabb elzáródásokat észleltünk.

2. Kutyákon vizsgált farmakokinetika

200 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva) K2P, illetve Actilyse® intravénás injekciója után megállapítottuk, hogy a plazmakoncentráció fogyásának gyors szakasza a K2P esetében (7,2± 1,1) 4,5-szer hosszabb, mint az Actilyse® esetében (1,6 ±0,2) (4. táblázat). Közvetlenül az injektálás után a K2P esetében kétszer olyan magas volt a plazmakoncentráció, mint az Actilyse esetében. A K2P a plazmából (Plazma-clearance=Cl_tot) kilencszer lassabban távozott el, mint az Actilyse®. A plazmakoncentráció-görbe alatti terület a K2P-nél 9,5-szer nagyobb volt, mint az Actilyse®-nál.

3. Kutyákon vizsgált fibrinspecifitás

A K2P injektálása után két órával a legmagasabb dózisnál [200 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva)] a maradék fibrinogénkoncentráció csak kissé, 81 ±10% értékre csökkent le. Ezzel szemben a legmagasabb Actilyse® dózisnál [1600 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva)] a beadás után azonnal 3±0%-ra csökkent a fibrinogénkoncentráció (5. táblázat). A dózisok mellékhatásának a fibrinogéncsökkenésre vonatkozó féllogaritmusos regresszióanalízise, melynek kiértékelése az ED₅₀ trombolitikus hatásának és a hozzá tartozó maradék fibrinogénkoncentrációnak a segítségével történt, ekvipotenciális K2P-adagok esetében 92,5% fibrinogén maradékot eredményezett, míg Actilyse® esetében 38,6%-ot. A plazminogén és az alfa₂-antiplazmin mennyisége az injektálás után két órával a maradékban szintén dózisfüggő csökkenést mutatott, ez a csökkenés az Actilyse® esetében jellegzetesebb volt, mint a K2P esetében. Sajnos egyik anyagnál sem sikerült a vérlemezkék koncentrációját befolyásolni.

4. A vérzést idő befolyásolása kutyáknál

A K2P intravénás injektálása során a vérzést idő a kontrollértékekkel összehasonlítva a négy vizsgált dózis egyikénél sem hosszabbodott meg szignifikáns mértékben. Ezzel szemben 1130 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva) és 1600 kU/kg (a testtömegre vonatkoztatva) Actilyse® esetében a vérzési idő statisztikusan szignifikáns meghosszabbodását tapasztaltuk (6. és 7. ábra).

5. Összefoglalás

A bemutatott koszorúér-trombózisos kutyamodelleknél a K2P fibrinolitikus hatása bebizonyosodott, és, amint ezt a 100%-os reperfúziós rátájú boluszinjekcióval eléltük, sem a fibrinogénkoncentrációt nem befolyásoltuk erősen, sem a vérzési idő nem növekedett meg jelentős mértékben. Az Actilyse®-szel összehasonlítva az eljárások során az intravénás boluszinjekció után a K2P hatásosabb tombolitikumnak bizonyult (11,5-ször). A K2P farmakokinetikai profiljának a vizsgálata során, az Actilyse®-szel összehasonlítva, a kiürülési értékek alapján a K2P a plazmából kilencszer lassabban távozott el.

3. táblázat

Trombolitikus paraméterek koszorúér-trombózis esetén, kutyamodellen, 1 perces intravénás placebo, növekvő mennyiségű Actilyse®, illetve K2P boluszinjekciója után

Anyag	Dózis (IU/kg*)	n	Reperfúziós ráta	Reperfúziós idő (min)	T rombusmaradék nedvestömeg (mg)	Reokklúziós ráta
Placebo	-	6	0/6	/	9,6±1,2	/

HU 218 092 Β

3. táblázat (folytatás)

Anyag	Dózis (IU/kg*)	n	Rcpcrfúziós ráta	Rcpcrfúziós idő (min)	Trombusmaradék ncdvcstömeg (mg)	Reokklúziós ráta
	1 600 000	6	6/6	28± 11	2,2±0,7	4/6
Actilyse®	1 130 000	6	4/6	14±3	4,4±0,5	4/4
800 00	6	2/6	35±38	5,5±0,4	1/2
	200 00	6	0/6	/	8,8±1,3	/
	200 00	6	6/6	29±6	2,5±0,3	6/6
K2P	140 00	6	4/6	15±6	4,4±1,4	4/4
100 00	6	3/6	30± 14	7,4±1,1	2/3
	50 00	6	2/6	31 ±4	5,5±0,8	2/2

Középcrték±SD *a testtömegre vonatkoztatva

4. táblázat

A t-PA-aktivitás alapján kapott plazmakoncentráció-idő adatok számítógépes kiértékelése során meghatározott farmakokinetikai paraméterek [narkotizált kutyák 200 000 IU/kg (a testtömegre vonatkoztatva) Actilyse®, illetve K2P intravénás boluszinjekciója után]

Anyag	t/₂ alfa (min)	ί)ζ béta (min)	C_inf(IU/ml)	V_c (ml/kg)	ci,₀₁ (ml/min/kg)	AUC_cxtrapol (IU*h/ml)
	1,6	14,6	1674	106,1	41,6	84,1
Actilyse® (n=6)	0,2	6,6	±504	±37	±11,4	±23,8
	7,2	15,0	3177	64,7	4,6	803
K2P (n = 6)	±1,1 (n=4)	±4,3	±817	±19,7	±1,3	250

Közcpcrtckia standard értéke

V_c=a központi részecskék eloszlása

Cl_I01=összcs kiürülés

AUC^rapo^,,³ görbe alatti terület”; a plazmakoncentráció-idő alatti terület extrapolálása

5. táblázat

Alvadási paraméterei és a trombocitaszám koszorúér-trombózis esetén, kutyamodellen, 1 perces intravénás placebo, növekvő mennyiségű Actilyse®, illetve K2P boluszinjekciója után

Anyag	Dózis (IU/kg)	n	Fibrinogén (%)	Plaztninogén (%)	Alfa₂-antiplazmin (%)	(%)
Placebo	-	6	106±2	103 (n=4)	92±11 (n=4)	101±3
	1 600 000	6	3±0	46±2	19±11	119±10
Actilyse®	1 130 000 800 000	6 6	16±13 86±4	59±6 87±3	45±6 64±5	110± 10 104±6
	200 000	6	97±3	90±3	86±4	109±4
	200 000	6	81± 10	74±8	40±6	106±8
K2P	140 000	6	93±1	81± 1	50±7	104±5
100 000	6	92±3	88±3	77±7	101 ±3
	50 000	6	95±3	90±2	84± 12	118± 11

KözépcrtékiSD

Az alvadási értékeket és a trombocitaszámot az injekció kiindulási értékének a százalékában jelöltük.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK.

1. Eljárás expressziós plazmid előállítására, mely egy, (II) általános képletnek megfelelő DNS-szekvenciát tartalmaz, vagy a genetikai kód degenerációja eredményeként attól eltérő, szövetplazminogénaktivátor- (t-PA) származékot, mely nincs glikozilezve, és aminosavszekvenciája az (I) általános képletnek felel meg, ahol az aminosavlánc vége az 1-helyzetben metioninnal (M) még meghosszabbítható, kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a teljes t-PA-fehérjét vagy annak valamely, a Kringle II- és a proteázdoméneken kívül a t-PA-fehérje további területeit is tartalmazó valamely származékát kódoló DNS-szekvenciát egy plazmidba visszük, és irányított mutagenezissel az (I) általános képletű t-PA-származék felesleges aminosavait eltávolítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy szövetplazminogénaktivátor- (t-PA) származékot, mely nincs glikozilezve, és aminosavszekvenciája az (I) általános képletnek felel meg, ahol az aminosavlánc vége az 1-helyzetben metioninnal (M) még meghosszabbítható, kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmidot állítunk elő.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (II) általános képletnek megfelelő szekvenciájú DNS-t tartalmazó plazmidot állítunk elő.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pA27.3 plazmidot állítjuk elő.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pA27 fd plazmidot állítjuk elő.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-szekvenciaként a megfelelő cDNS-t alkalmazzuk.
7. Eljárás szövetplazminogénaktivátor- (t-PA) származék előállítására, mely nincs glikozilezve, és aminosavszekvenciája megfelel az (I) általános képletnek, ahol az aminosavlánc vége az 1-helyzetben metioninnal (M) még meghosszabbítható, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerint előállított plazmidot megfelelő gazdasejtbe transzformáljuk, és az expresszálódott terméket a tápközegből és/vagy a gazdasejtekből feltárással kinyerjük.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként prokariótákat, előnyösen E. colit alkalmazunk.
9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kinyerés során a t-PA-származékot tartalmazó inklúziós testeket elválasztjuk, guanidin-hidroklorid alkalmazásával szolubilizáljuk, oxidált glutationnal derivatizáljuk, végül a t-PA-származékot L-arginin és GSH hozzáadásával renaturáljuk.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy renaturálás után a t-PA-származékot a renaturálóanvagban betöményítjük, majd affinitáskromatográfiával tisztítjuk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatografálást 10-1000 mmól/1 L-arginin jelenlétében végezzük.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatográfiás tisztítás után kapott koncentrátumot, mely 10-1000, előnyösen 800 mmól/1 L-arginint tartalmaz, egy ETI-oszlopon vezetjük át, és a t-PAszármazékot az oszlopról eluáljuk.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ETI-oszlopra 7,5-8,6 pH-értékű koncentrátumot viszünk fel.
14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eluálást 3-5,5 közötti pH-értéken végezzük.
15. Eljárás t-PA-származékot tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 7-14. igénypontok bármelyike szerint előállított t-PA-származékot a gyógyszerkészítésnél általánosan elfogadott segédanyagokkal szokásos dózisformává alakítunk.
16. Szövetplazminogénaktivátor- (t-PA) származék, azzal jellemezve, hogy nincs glikozilezve, és aminosavszekvenciája megfelel az (I) általános képletnek, ahol az aminosavlánc vége az 1-helyzetben metioninnal (M) még meghosszabbítható.
17. DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy valamely 1. igénypont szerinti t-PA-származékot kódol, és szekvenciája megfelel a (II) általános képletnek.
18. Expressziós plazmid, azzal jellemezve, hogy egy (II) általános képletnek megfelelő DNS-szekvenciát vagy a genetikai kód degenerációja eredményeként attól eltérő, a 17. igénypontnak megfelelő fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.
19. A 18. igénypont szerinti expressziós plazmid, azzal jellemezve, hogy az a pA27.3 plazmid.
20. A 18. igénypont szerinti expressziós plazmid, azzal jellemezve, hogy az a pA27 fd plazmid.
21. Fibrinolitikus kezelésre alkalmas gyógyászati készítmény, mely hatóanyagként a 17. igénypont szerinti t PA-származékot tartalmazza.