DE4123845A1 - Pharmazeutische verpackungseinheit enthaltend plasminogenaktivatoren zur mehrfachbolusgabe - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Verpackungseinheit enthaltend Plasminogenaktivatoren zur Mehrfach­ bolusgabe.

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Verpackungseinheit zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen, wobei die Ver­ packungseinheit im wesentlichen zwei Bestandteile umfaßt, und der erste Bestandteil eine pharmazeutisch übliche Darreichungsform eines Proteins mit plasminogenaktivator-ähnlicher Wirkung mit einer gegenüber t-PA verlängerten Halbwertszeit ist, wobei die Darreichungsform in einem oder mehreren Behältnissen vorliegen kann, und der zweite Bestandteil aus einem Hinweis zur Applikation dieses Proteins in Form einer fraktionierten Gabe von zwei oder mehreren Bolusinjektionen besteht.

Die thrombolytische Therapie des Herzinfarktes ist eine effektive, medizinisch gut erprobte und belegte Therapie zur Beseitigung von Verschlußthromben in den Koronararterien des Herzens. Das gen­ technologisch hergestellte t-PA (tissue-type plasminogen activator) ist zur Therapie dieser Erkrankung weltweit im Einsatz und hat sich als effektiv zur Auflösung koronarer Thromben erwie­ sen (Verstraete et al., Lancet II 1985; 965-969). Durch früh­ zeitige Lysetherapie des Herzinfarktes kann die residuale Herzfunktion nach Herzinfarkt im Vergleich zu anderen Therapien verbessert werden (Armstrong et al., J. Am. Coll. Cardiol. 1989; 13: 1469-1476) und eine höhere Überlebensrate gegenüber anderen Therapien erzielt werden (Wilcox et al., Lancet 11, 1988; 525-539).

Große Thrombolysestudien mit insgesamt mehreren tausend Patienten zeigen, daß eine rasche Einleitung der Thrombolyse mit früh­ zeitiger Reperfusion des Myokardgewebes zu einer Rettung von Myokardgewebe und damit zu einem Anstieg der Überlebensrate führt (GISSI-study-group, Lancet I, 1986; 397-401). Aus diesem Grunde ist es notwendig, die thrombolytische Therapie zu einem Zeitpunkt einzuleiten, zu dem das hinter dem Koronarverschluß gelegene Gewebe noch nicht irreversibel geschädigt ist.

Prinzipiell besteht bei der Behandlung eines Koronarverschlusses das Problem, einen möglicherweise auftretenden Wiederverschluß des Infarktgefäßes nach erfolgreicher initialer Thrombolyse zu vermei­ den. Für t-PA (Alteplase) konnte dieser nachteilige Effekt be­ obachtet werden (Chesebro et al., Circulation 1987; 76: 142-154). Der Wiederverschluß des Infarktgefäßes führt zu erhöhter Morbidität und Mortalität (Ohman et al., Circulation 1990; 82: 781-791). Zur Verhinderung von Wiederverschlüssen werden Sub­ stanzen verschiedener pharmakologischer Wirkprinzipien, wie Heparin (Bleich et al., Am. J. Cardiol. 1990; 66: 1412-1417) und Acetylsalicylsäure (Hsia et al., H. Engl. J. Med. 1990; 323: 1433- 1437) eingesetzt. Auch die zeitlich verlängerte Infusion von t-PA (Alteplase) soll durch eine längere Thrombolysedauer den Wieder­ verschluß des Infarktgefäßes verhindern (Gold et al., Circulation 1986; 73: 347-352; Verstraete et al., Am. J. Cardiol. 1987; 60: 231-237; Johns et al., Circulation 1988; 78: 546-556).

Rekombinant hergestelltes t-PA (rt-PA) wurde bereits in präliminä­ ren Studien an wenigen Patienten als Doppel- oder Mehrfachbolus verabreicht. Zwar wurden kurzfristig, d. h. bis 90 Minuten nach der ersten Bolusgabe hohe Auflösungsraten der Thromben gefunden; aufgrund der hohen Dosen wurde jedoch eine extensive, systemische Plasminogen-Aktivierung mit nachfolgender, fast völliger Re­ duzierung des Fibrinogens (nur noch 15.5 bis 5.2% des Ausgangs­ wertes) beobachtet (3. Am. Coll. Cardiol. 1991, 17(2), 152A). Diese an sich unerwünschte Reduzierung des Fibrinogenspiegels stellt insofern einen Nachteil dar, als bei Notoperationen eine hohe Blutungsneigung besteht, und eine intensive Überwachung des Patienten notwendig ist. Ferner wurde bei Doppel- oder Dreifach­ bolusgabe von rt-PA nachteilig eine Reokklusionsneigung, d. h. ein Wiederverschluß des Gefäßes, beobachtet (Circulation 1990, 82(4), Suppl. III 538, abstract 2137; Br. J. Haematol., 1991, 77, Suppl. 1, 47, abstract P080). Diese nachteiligen Eigenschaften sind aller Voraussicht nach auf die sehr kurze Halbwertszeit von rt-PA zurückzuführen. Für Alteplase wurde ebenfalls eine Studie durchge­ führt, in der die Mehrfachbolusgabe näher untersucht wurde (Coronary Artery Desease, 1990, 1(1), 83-88).

Das bisher zur koronaren Thrombolyse genutzte t-PA hat eine Halb­ wertszeit von etwa 3-6 Minuten (Garabedian et al., J. Am. Coll. Cardiol. 1987; 9: 599-607), was zur Sicherstellung des Throm­ bolyseerfolgs eine relativ langdauernde Infusion zur Aufrechter­ haltung effektiver Plasmaspiegel voraussetzt. Ein Nachteil der kurzen Halbwertszeit von t-PA liegt in der Notwendigkeit zur längerdauernden Infusion der Substanz (30 Minuten bis 6 Stunden) mit der Folge von Handling-Nachteilen in der Notfallsituation und der Möglichkeit zur Auflösung haemostatischer Plaques und den damit verbundenen Blutungsrisiken (Marder and Sherry, N. Engl. J. Med. 1988; 318: 1512-1520).

Das pharmakokinetische Profil von rt-PA (Alteplase) ist typischer­ weise durch ein Zwei- oder sogar Dreikompartimentmodell charakte­ risiert (Thromb. Haemost. 1989, 61, 497-501). Am wichtigsten ist dabei die initiale Halbwertszeit, da sie mit 66% zur Gesamtfläche unter der Kurve (area under the curve = AUC) beiträgt. Daher wird diese Halbwertszeit als die dominante Halbwertszeit bezeichnet. Bei von t-PA abgeleiteten Plasminogen-Aktivatoren mit verlängerter Halbwertszeit ist naturgemäß auch das pharmkokinetische Profil verändert. Die Bezeichnung "verlängerte Halbwertszeit" bezieht sich dabei auf die dominante Halbwertszeit, die charakteristisch für das pharmakokinetische Profil ist, weil sie quantitativ am meisten zur Gesamt-AUC beiträgt. Die Bestimmung der Halbwertszeit erfolgt nach dem aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren (Pharmoco­ kinetics, Ch. 2, Marcel Dekker, New York 1982).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine neue Applikations­ form für Proteine mit plasminogenaktivator-ähnlicher Wirkung zu finden, die die oben geschilderten Nachteile aus dem Stand der Technik nicht aufweist. Insbesondere sollte eine pharmazeutische Darreichungsform zur Verfügung gestellt werden, die eine möglichst einfache und schnelle Verabreichung von Plasminogenaktivatoren zur effektiven Behandlung von thromboembolischen Krankheiten ermöglicht.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß Proteine mit plasminogenaktivator-ähnlicher Wirkung dann erfolgreich bei der Behandlung von Koronarverschlüssen eingesetzt werden können, wenn die eingesetzten Proteine eine gegenüber t-PA verlängerte Halb­ wertszeit besitzen und die Applikation in Form einer fraktionier­ ten Gabe von zwei oder mehreren Bolusinjektionen erfolgt. Die Bolusgabe ist eine intravenöse Schnellinjektion und insbesondere deshalb vorteilhaft, weil einerseits die Zeit vom Beginn der klinischen Symptomatik bis zur Behandlung, und andererseits auch die Zeit vom Behandlungsbeginn bis zur Auflösung des Koronar­ thrombus verkürzt wird und damit mehr Myokardgewebe vor einer irreversiblen Zerstörung gerettet werden kann.

Als Proteine mit plasminogenaktivator-ähnlicher Wirkung können solche Plasminogenaktivatoren eingesetzt werden, die gegenüber t-PA eine verlängerte Halbwertszeit besitzen. Wie oben bereits erwähnt beträgt die Halbwertszeit von t-PA im menschlichen Plasma ungefähr 3-6 Minuten. Bevorzugt im Sinne der vorliegenden Er­ findung werden solche Plasminogenaktivatoren eingesetzt, die eine gegenüber dem t-PA mindestens um den Faktor 2, vorzugsweise 3-7 und insbesondere 3-5 verlängerte Halbwertszeit besitzen. Insbeson­ dere sollte die Halbwertszeit mindestens etwa 10 Minuten, insbe­ sondere 10-40, 10-25 oder 10-15 Minuten betragen. Bevorzugt werden solche Proteine verwendet, deren Halbwertszeit um den Faktor 3-30, insbesondere 5-20 länger ist als die Halbwertszeit von t-PA.

Als Proteine mit plaminogenaktivator-ähnlicher Wirkung seien beispielhaft die folgenden Plasminogen-Aktivatoren genannt: LY 210825 (K2P aus "syrian hamster cell line", circ. 1990, 82, 930-940); DeltaFE3x und DeltaFE1x (K1K2P aus "chinese hamster ovary cells", Blood 1988, 71, 216-219); DeltaFEK1 (K2P aus "mouse C127 cells", J. Cardiovasc. Pharmacol. 1990, 16, 197-203); E-6010 (Jap. Circ. J. 1989, 53, p. 918); t-PA-Varianten (Thromb. Haemost. 1989, 62, p. 542); K2P und D-K2P (Thromb. Haemost. 1989, 62, p. 393); MB-1018 (FK2K2P, Thromb. Haemost. 1989, 62, p. 543); FK2P (FASEB J. 1989, 3, A1031, abstract 4791); Deltalx (Circulation 1988, 4, II-15); KlK2P (Thromb. Res. 1988, 50, 33-41); FK1K2P (J. Biol. Chem. 1988, 263, 1599-1602). Insbesondere werden rekombinante Plasminogen-Aktivatoren vom Typ K2P, wie z. B. BM 06.022 (bekannt aus EP-A-03 82 174) eingesetzt. Weitere t-PA-Muteine dieser Art sind in den folgenden Patentanmeldungen beschrieben: EP-A-01 96 920, EP-A-02 07 589; AU 61 804/86; EP-A-0,231,624; EP-A-02 89 508; JP 6 31 33 988; EP-A-02 34 051; EP-A-02 63 172; EP-A-02 41 208; EP-A-02 92 009; EP-A-02 97 066; EP-A-03 02 456; EP-A-03 79 890.

Als Plasminogenaktivatoren kommen prinzipiell solche, insbesondere rekombinant hergestellte Derivate des t-PA in Frage, die im wesentlichen diejenigen Proteinbereiche des natürlichen Proteins umfassen, die für die Fibrinolyse der Thromben zuständig sind. Dabei können auch solche Derivate des t-PA verwendet werden, die Deletionen oder Substitutionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren in der Sequenz des t-PA aufweisen, solange die Halbwertszeit solcher Derivate gegenüber t-PA im obigen Sinne verlängert ist. Insbesondere sind dies t-PA-Derivate vom Typ K2P.

Beispielhaft für die im Sinne der vorliegenden Erfindung in Frage kommenden Plasminogenaktivatoren wurde der in der Europäischen Patentanmeldung EP-A-03 82 174 näher beschriebene Plasminogen­ aktivator K2P (BM 06.002) verwendet. Er besteht aus den Kringel 2 und Protease-Domänen des humanen t-PA und liegt wegen seiner Expression in Escherichia-Coli-Zellen in unglycosilierter Form vor. Die spezifische Aktivität von K2P beträgt 5 50 000 +/- IU/mg (= 550 +/-200 KU/mg). K2P wird zur thrombolytischen Therapie thrombembolischer Krankheiten (Herzinfarkt, Lungenembolie, Hirn­ schlag und andere gefäßverschließende Erkrankungen) eingesetzt.

Die fehlende Glycosilierung führt zu einer herabgesetzten Clearance und resultiert in einer gegenüber dem t-PA um mindestens den Faktor 3-4 verlängerten Halbwertszeit. Die verlängerte Halbwertszeit macht die Anwendung der Substanz als klinisch wünschenswerte Mehrfach-Bolusapplikation möglich. Der thrombolyti­ sche Effekt der Bolusgabe der Substanz wurde in verschiedenen Tiermodellen untersucht. Dabei zeigte sich eine ungefähr um den Faktor 5 erhöhte thrombolytische Wirksamkeit verglichen mit Alte­ plase. Besonders beeindruckend war dabei die im Vergleich zu Alteplase und anderen Thrombolytika rasche Eröffnung von thrombo­ tisch verschlossenen Gefäßen, was eine gegenüber anderen Thrombo­ lytika verminderte Zeit zur Gefäßeröffnung und damit eine raschere Wiederdurchblutung des infarzierten Myocardgewebes bedeutet.

Aufgrund der verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften von K2P kann die effektive zu applizierende Dosis verringert und K2P kann als i. v. Mehrfachbolusinjektion verabreicht werden. Damit wird eine sehr schnelle maximale Reperfusionsrate erreicht. Weiterhin kann durch die Verabreichung eines Doppel- oder Mehr­ fachbolus die Durchblutungsverschlechterung in der Koronararterie nach Reperfusion (Reokklusionsneigung) signifikant verringert oder verhindert werden. Zusätzlich ist nach Doppel- oder Mehrfachboli der Abfall des Plasmafibrinogens geringer als nach der Einmal­ bolusinjektion der gleichen Gesamtdosis.

Neben der raschen Eröffnung von thrombotisch verschlossenen Ge­ fäßen ist die Verhinderung des Wiederverschlusses der eröffneten Gefäße von großer klinischer Bedeutung, da ein erneuter Verschluß des Infarktgefäßes zu einem klinisch bedeutsamen Reinfarkt mit den daraus resultierenden klinischen Komplikationen führen kann.

Die Applikation von K2P als Bolus in äquieffektiver Dosis im Vergleich zur Infusion von Alteplase führt im Tiermodell zu einer überraschend schnellen Eröffnung der Infarktgefäße und ermöglicht damit eine schnelle Durchblutung des infarzierten Myocardgewebes. Im Lichte der gegenwärtigen Kenntnisse über die Thrombolyse ist dieser beobachtete Effekt aus klinischer Sicht als sehr positiv zu werten.

Das Problem des Wiederverschlusses von thrombolysierten Infarkt­ gefäßen tritt nach den tierexperimentellen Daten auch unter dem Einmal-Bolus von K2P in einem Maße auf, das mit anderen Thrombo­ lytika vergleichbar ist. Überraschenderweise zeigt sich, daß eine Aufteilung der Gesamtdosis an K2P in zwei oder mehrere zeitlich versetzt injizierte Boli das Auftreten von Durchblutungsver­ schlechterungen in der Koronararterie nach Reperfusion zu ver­ ringern oder sogar zu verhindern mag.

Der zeitliche Abstand zwischen einer ersten und einer darauf­ folgenden Bolusinjektion ist indikationsabhängig und kann zwischen 20 Minuten und 2 Stunden, vorzugsweise 30-90 Minuten betragen. Die Injektionsdauer an sich ist relativ kurz und beträgt in Ab­ hängigkeit von dem zu applizierenden Volumen etwa 0,5-3 Minuten, wobei eine Infusionsrate von etwa 5-10 ml/min. vorteilhaft ist.

Zur Herstellung der pharmazeutischen Darreichungsform bezüglich des Proteins mit plasminogenaktivator-ähnlicher Wirkung werden die üblichen pharmazeutischen Hilfs- oder Zusatzstoffe verwendet. Ferner können Stabilisierung- oder die bekannten Solubilisierungs­ mittel, wie z. B. basische Aminosäuren (Arginin, Lysin oder Ornithin) zugesetzt werden. Die Darreichungsform kann in lyophili­ sierter Form oder als gebrauchsfertige Injektionslösung vorliegen. Die Bolusinjektion kann intravenös, intramuskulär oder auch sub­ cutan erfolgen, wobei die i.v. -Injektion bevorzugt ist.

Bei der Herstellung der pharmazeutischen Verpackungseinheit können die zu verabreichenden Mengen des Proteins für die Zwei- oder Mehrfachbolusinjektion vorzugsweise in zwei oder mehreren ge­ trennten Behältnissen, wie z. B. in Ampullen, zur Verfügung ge­ stellt werden. Prinzipiell ist es auch möglich, eine Multidose-Dar­ reichungsform zur Verfügung zu stellen, aus der die jeweils gewünschte Menge des Proteins durch Abziehen auf eine geeignete Spritze entnommen werden kann. Die Ampullen können die bereits injektionsfertige Lösung oder alternativ ein Lyophilisat des Proteins, und gegebenenfalls weitere pharmazeutisch übliche Hilfs- oder Trägerstoffe enthalten. Die Lyophilisate werden mit üblichen Injektionslösungen kurz vor der Applikation versetzt, so daß eine Lösung entsteht, die direkt appliziert werden kann.

Die Menge des Proteins mit plasminogenaktivator-ähnlicher Wirkung kann in dem ersten und zweiten Behältnis in Abhängigkeit der jeweiligen Bedürfnisse gleich oder auch verschieden sein. In der Regel werden Mengen von je 3-20 MU verwendet. Bevorzugt wird für die erste Bolusinjektion eine größere Menge des Proteins verab­ reicht als für die zweite Bolusinjektion. Insbesondere werden Mengen von 5-20 MU, insbesondere 5-15 MU für die erste und 3-15 MU, insbesondere 3-10 MU für die zweite Bolusinjektion verwendet. Besonders bevorzugt verwendet man etwa 10 MU für die erste und etwa 5 MU für die zweite Injektion. Die kumulative Dosis liegt bevorzugt im Bereich von 15-40 MU.

Beispiel 1

Für die Versuche wurde ein Hundemodell zur Simulation des Herz­ infarktes benutzt. Erwachsene Beaglehunde beiderlei Geschlechts wurden mit Barbiturat narkotisiert, intubiert und künstlich be­ atmet. Es wurden arterielle und venöse Katheter gelegt, um den Blutdruck zu kontrollieren, Substanzen zu verabreichen oder Blut­ proben zu entnehmen. Der Brustkorb wurde eröffnet und das Herz wurde dargestellt. Ein kurzer Abschnitt des Ramus circumflexus der Arteria coronaria sinistra wurde isoliert und präpariert. An­ schließend wurde die Koronararterie mit folgenden Instrumenten von proximal nach distal versehen: Einem elektromagnetischen Kopf zur Messung des Blutflusses in der Herzkranzarterie, eine Stimulations­ elektrode, eine einstellbare Schraube und einen Faden. Die Spitze der Stimulationselektrode wurde durch die Wand der Herzkranz­ arterie durchgeführt und innerhalb des Gefäßes so gelegt, daß die Nadelspitze mit der Innenfläche des Gefäßes in Berührung kam. Die Schraube wurde so eingestellt, daß 90% der reaktiven Hyperämie in Folge einer kurzfristigen Durchblutungsunterbrechung der Koronar­ arterie ausgeschaltet wurden.

Der Thrombus in der Koronararterie zur Auslösung des Herzinfarktes wurde nach der ursprünglich von Romson et al. (Thromb. Res. 1980; 17: 841-853) beschriebenen Methode gebildet. Die Methode wurde in der modifizierten Fassung von Shebuski et al. (J. Pharmacol. Exp. Ther. 1988; 246: 790-796) angewendet. Über die Stimulationselek­ trode wurde ein 150 mikro Ampere Gleichstrom an die Koronararterie angelegt und so lange aufrechterhalten bis der Blutfluß in der Koronararterie auf 0 ml/min abfiel und mindestens 3 Minuten dort blieb. Anschließend durfte der Thrombus noch 30 Minuten altern. In dieser Zeit wurden die Tiere heparinisiert in einer Dosis von 1000 units/Tier/Stunde. 30 Minuten nach Thrombusbildung wurde das Fibrinolytikum oder das Lösungsmittel als eine 1-minütige i. v. Bolusinjektion sechs Tieren pro Gruppe verabreicht. BM 06.022 wurde in vier Dosen verabreicht: 50, 100, 140 und 200 KU/kg. Alteplase wurde ebenfalls in vier Dosen gegeben: 200, 800, 1130 und 1600 KU/kg (= 2 mg/kg). Die spezifische Aktivität von Alteplase betrug 8 00 000 IU/mg (= 800 kU/mg). Plasmaproben wurden vor und wiederholt nach Injektion der Fibrinolytika gewonnen, um die Konzentration der Aktivität von BM 06.022 oder Alteplase nach der Methode von Verheÿen et al. (Thromb. Haemostas. 1982; 48: 266-269) zu bestimmen. Eine Reperfusion wurde angenommen, falls mindestens 33% des Ausgangsblutflusses in der Koronararterie wiedererreicht wurden. Entsprechend wurde die Zeit bis zur Reper­ fusion vom Beginn der Injektion bis zum Erreichen dieses Blut­ flusses definiert. In je einer weiteren Versuchsgruppe wurde BM 06.022 in einer Dosis von 140 KU/kg und Alteplase in einer Dosis von 800 KU/kg (= 1 mg/kg) intravenös über 90 Minuten als Dauer­ infusion verabreicht (10% der Gesamtdosis als initialer i. v. Bolus).

Abb. 1 zeigt die Dosis-Wirkungsbeziehung für die Reperfusion­ srate nach Bolusinjektion von BM 06.022 oder Alteplase. Eine 100%ige Reperfusionsrate (6 von 6 Tieren) wurde mit i. v. Bolusin­ jektion von 200 KU/kg bei BM 06.022 erreicht. Bei der gleichen Dosis reperfundierte keines der mit Alteplase injizierten Tiere. Zur Erzielung des gleichen, maximalen Effektes war eine Injektion von 1600 KU/kg (= 2 mg/kg) Alteplase notwendig. Diese Injektions­ dosis ist ungefähr doppelt so hoch wie die gegenwärtig in der Klinik als Infusion eingesetzte Dosis von Alteplase (ca. 1 mg/kg). Die höhere thrombolytische Potenz von BM 06.022, wie sie durch die Linksverschiebung der Dosiswirkungskurve veranschaulicht wird, kann durch die verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften von BM 06.022 (siehe Abb. 2) erklärt werden. Die Gesamtplasma-Clearance von BM 06.022 beträgt 4.4 ± 0.4 und die von Alteplase 20.4 ± 2.0 ml/min^-1·kg^-1. Damit ist die Gesamtplasma-Clearance (ein Maß für die Entfernung einer Substanz aus dem Plasma) von BM 06.022 ca. 4,6fach langsamer als die von Alteplase. Weiterhin wurde gefunden, daß Alteplase nach Infusion eine zwei mal höhere Reperfusionsrate als nach Einmal-Bolusinjektion der gleichen Dosis (800 KU/kg) erreichte. BM 06.022 in einer Dosis von 140 KU/kg zeigt die gleiche Reperfusionsrate (4 von 6 Tieren) nach Injektion und nach Infusion, aber die Zeit bis zur Reperfusion war nach Injektion signifikant kürzer (Tabelle 1).

Die Ergebnisse zeigen, daß Alteplase günstigere thrombolytische Erfolge nach Infusion als nach Injektion aufweist. Dieser Befund deckt sich mit der klinischen Praxis, in der Alteplase üblicher­ weise als Infusion verabreicht wird (Chesebro et al., Circulation 1987; 76: 142-254). Die langsamere Elimination von BM 06.022 im Vergleich mit Alteplase aus dem Plasma führte zu einer höheren thrombolytischen Potenz von BM 06.022. Dadurch ist nicht nur eine Dosisverringerung möglich, sondern es findet sich nach einmaliger i. v. Bolusinjektion überraschenderweise eine schnellere Reperfu­ sion als nach Infusion.

Beispiel 2

Für die Versuche in Beispiel 2 wurde das gleiche Hundemodell der Koronararterien-Thrombose wie in Beispiel 1 beschrieben benutzt. Im Gegensatz zu den Versuchen in Beispiel 1 war jedoch das Throm­ busalter bei Verabreichung der Substanzen eine Stunde anstatt nur 30 Minuten. BM 06.022 wurde entweder als eine einmalige i. v. Bolusinjektion oder als eine Doppel-Bolus-Injektion jeweils über 1 Minute verabreicht. Die Einmal-Bolus-Dosis betrug 140 oder 280 KU/kg. In den beiden Gruppen mit der Doppel-Bolus-Verabreichung betrug die erste Bolus-Dosis 140 KU/kg jeweils, gefolgt von dem zweiten Bolus in einer Dosis von 140 oder 50 KU/kg BM 06.022 44 Minuten später. Jede der vier Versuchsgruppen bestand aus sechs Hunden. Zusätzliche Parameter für die Auswertung waren das Maximum des koronaren Blutflusses, das nach Reperfusion gemessen wurde, und der koronare Blutfluß bei Beendigung des Versuches drei Stunden nach Injektion. Weiterhin wurde die kumulative Patencyzeit berech­ net; darunter versteht man die Summe der Zeitintervalle nach Reperfusion, in denen ein koronarer Blutfluß vorhanden war. Das Tiermodell ist so angelegt, daß typischerweise nach Reperfusion zyklische Flowvariationen mit Reokklusion auftreten. Bei Versuchs­ ende wurde der Restthrombus entnommen und sein Feuchtgewicht gemessen.

In beiden Gruppen mit Einmal-Bolus-Injektion betrug die Reper­ fusionsrate vier von sechs Tieren. In den Doppel-Bolus-Gruppen war sie höher und betrug sechs von sechs oder fünf von sechs Tieren (Tabelle 2). Die in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse für die kumulative Patencyzeit, den koronaren Blutfluß und das Restthrom­ busgewicht zeigen, daß eine Doppel-Bolus-Verabreichung von BM 06.022 signifikant die kumulative Patencyzeit verlängert, signifi­ kant den koronaren Blutfluß erhöht, dieser auch bei Versuchsende signifikant erhöht geblieben ist und das Rest-Thrombusgewicht signifikant im Vergleich mit der Einmal-Bolus-Injektion von 140 KU/kg erniedrigt hat. Abb. 3 zeigt, daß eine Erhöhung der Einmal-Bolus-Injektion von 140 auf 280 KU/kg den koronaren Blut­ fluß nicht deutlich verbessern kann. Es werden immer noch starke zyklische Flowvariationen beobachtet. In Abb. 4 ist dagegen zu erkennen, daß die Doppel-Bolus-Verabreichung von 140 und 140 KU/kg BM 06.022 den koronaren Blutfluß deutlich im Vergleich mit der Einmal-Bolus-Injektion von 140 KU/kg BM 06.022 verbessert. Der gleiche Effekt auf den koronaren Blutfluß kann auch durch die Doppel-Bolus-Verabreichung von 140 und 50 KU/kg BM 06.022 erzielt werden (Abb. 5). Wie Tabelle 4 zeigt, verhindert die Auf­ teilung einer Gesamtdosis von 280 KU/kg auf 140 und 140 KU/kg anstatt der Einmal-Bolus-Injektion der gleichen Gesamtdosis an BM 06.022 den signifikanten Abfall des Plasmafibrinogens.

Die Ergebnisse zeigen, daß die Verschlechterung des koronaren Blutflusses nach Reperfusion, die an diesem Modell in Simulation von Patienten mit Reokklusionsneigung intrinsisch auftritt, durch die Einmal-Bolus-Injektion selbst in der höheren Dosis nicht verhindert werden kann. Dagegen ist die Verabreichung eines Doppel-Bolus überraschenderweise in der Lage, sowohl die kumula­ tive Patencyzeit zu verlängern als auch den Flow quantitativ zu erhöhen und bis zum Versuchsende erhöht aufrechtzuerhalten. Zusätzlich hat die Doppel-Bolus-Injektion den überraschenden Vorteil eines geringeren Abfalls des Plasmafibrinogens im Gegen­ satz zur Einmal-Bolus-Injektion derselben Gesamtdosis. Die Höhe des Zweitbolus in der Doppel-Bolus-Verabreichung kann dabei variabel gestaltet werden, ohne den Erfolg einzuschränken.

Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 stellt den thrombolytischen Dosiswirkungsbereich von BM 06.022 und Alteplase nach 1minütiger i. v. Injektion an Hunden mit Koronarthrombose dar. Die Reperfusionsrate (%) bedeutet den Prozentsatz reperfundierter Hunde innerhalb einer Dosisgruppe (n=6 pro Dosis). Die Dosiswirkungskurven wurden mit Hilfe einer halblogarithmischen Regressionsanalyse erstellt. Die Alteplase­ gruppe ohne Reperfusion (bei 200 KU/kg) wurde von der Regression­ sanalyse ausgeschlossen.

Abb. 2 zeigt den pharmakokinetischen Vergleich der Plasma­ konzentrations-Zeitkurven für die Aktivität von BM 06.022 und Alteplase an anästhesierten Hunden. Eine 1-minütige i. v. In­ jektion von 140 KU/kg BM 06.022 oder 800 KU/kg (= 1 mg/kg) Alte­ plase wurde sechs Hunden pro Substanz verabreicht. Die Daten stellen den arithmetischen Mittelwert dar. Die Ausgangskonzentra­ tion wurde von den nachfolgend gemessenen Konzentrationen abgezo­ gen.

Abb. 3 zeigt den Zeitverlauf des koronaren Blutflusses vor und nach einer einmaligen i. v. Bolusinjektion mit 140 oder 280 KU/kg BM 06.022 zum Zeitpunkt t = 0 Minuten. Die Daten sind Mittel­ werte + SEM; n = 4 reperfundierte Hunde pro Gruppe. Pre stellt den Ausgangsblutfluß dar.

Abb. 4 zeigt den Zeitverlauf des koronaren Blutflusses vor und nach einer Einmal i. v. Bolusinjektion von 140 KU/kg BM 06.022 n-4) zum Zeitpunkt t = 0 Minuten oder einer Doppel-Bolus-Injektion von 140 und 140 KU/kg BM 06.022 (n = 6) zum Zeitpunkt t = 0 und t-44 Minuten. Die Daten sind Mittelwerte + SEM; Pre ist der Aus­ gangsblutfluß.

Abb. 5 stellt den Zeitverlauf des konoaren Blutflusses vor und nach Doppel-Bolus-Verabreichung von 140 und 140 KU/kg (n = 6) oder 140 und 50 KU/kg BM 06.022 (n = 5) zum Zeitpunkt t = 0 und t-44 Minuten. Die Daten stellen den Mittelwert + SEM dar; Pre ist der Ausgangsblutfluß.

Tabelle 1

Koronarthrombolytische Eigenschaften von Alteplase und BM 06.022

Tabelle 2

Reperfusionscharakteristika an BM 06.022-behandelten Hunden

Tabelle 3

Charakteristika des koronaren Blutflusses nach Reperfusion und Thrombusgewicht an BM 06.022-behandelten Hunden

Tabelle 4

Gerinnungsvariablen an BM 06.022-behandelten Hunden

Claims (11)

1. Pharmazeutische Verpackungseinheit zur Behandlung von throm­ boembolischen Erkrankungen, umfassend im wesentlichen zwei Bestandteile, wobei der erste Bestandteil eine pharmazeutisch übliche Darreichungsform eines Proteins mit plasminogen­ aktivator-ähnlicher Wirkung mit einer gegenüber t-PA ver­ längerten Halbwertszeit in einem oder mehreren Behältnissen ist, und der zweite Bestandteil aus einem Hinweis zur Applikation dieses Proteins in Form einer fraktionierten Gabe von zwei oder mehreren Bolusinjektionen besteht.

2. Verpackungseinheit gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein mit plasminogenaktivator-ähnlicher Wirkung eine um den Faktor 2-30 verlängerte Halbwertszeit gegenüber t-PA aufweist.

3. Verpackungseinheit gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Halbwertszeit 10-30 Minuten beträgt.

4. Verpackungseinheit gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein K2P ist.

5. Verwendung eines Proteins mit plasminogenaktivator-ähnlicher Wirkung und einer gegenüber von t-PA verlängerten Halbwerts­ zeit zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Applikation des Proteins in Form einer fraktionierten Gabe von zwei oder mehreren Bolusinjektionen erfolgt.

6. Verwendung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die fraktionierte Gabe zwischen einer ersten und einer zweiten Bolusinjektion innerhalb eines Zeitabstandes von 10 Minuten bis zu 3 Stunden erfolgt.

7. Verwendung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Zeitabstandes 30 Minuten bis zu 2 Stunden beträgt.

8. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 5-7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Protein mit plasminogenaktivator-ähnlicher Wirkung vom Typ K2P ist.

9. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 5-8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß pro Einzelbolusinjektion eine Menge von 3-30 MU appliziert wird.

10. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 5-9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Herzinfarkts, der Lungenembolie, des Hirnschlags oder zur Behandlung von akuten oder chronischen, arteriellen, venösen oder peripheren Ver­ schlußkrankheiten.

11. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels enthaltend ein Protein mit plasminogenaktivator-ähnlicher Wirkung und einer gegenüber von t-PA verlängerten Halbwertszeit zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß eine das Protein enthaltende übliche pharmazeutische Darreichungsform zusammen mit dem Hinweis zur Applikation in Form einer fraktionierten Gabe von zwei oder mehreren Bolus­ injektionen zur Verfügung gestellt wird.