EA013707B1 - Нетоксичные для нервной ткани плазминоген-активирующие факторы для лечения инсульта - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к применению и получению нетоксичных для нервной ткани активирующих плазминоген факторов, произведенных, например, из обыкновенного вампира Desmodus rotundus (DSPA), для терапевтического лечения инсульта у человека. Изобретение предоставляет новую терапевтическую базу для лечения инсульта у человека.

Description

Изобретение относится к терапевтическому применению нетоксичных для нервной ткани активаторов плазминогена, особенно из слюны Эекшобик тоЩпбик (Ό8ΡΆ), предпочтительно для лечения инсульта.

Под термином инсульт суммируются различные клинические состояния, которые коррелируют друг с другом по клиническим симптомам. Согласно соответствующему патогенезу существует первое различие между указанными клиническими проявлениями при так называемом ишемическом инсульте и геморрагическом инсульте.

Ишемические инсульты (ишемия) характеризуются ослаблением или прекращением кровообращения в головном мозге из-за отсутствия артериального кровоснабжения. Часто такое явление вызывается тромбозом артериосклеротического суженого сосуда или артерио-артериальной эмболией, соответственно кардиальной эмболией.

Геморрагические инсульты обусловлены разрывом снабжающих головной мозг артерий, повреждённых в результате артериальной гипертонии. Однако только приблизительно 20% всех случаев мозговых инсультов приходится на геморрагические инсульты. Таким образом, наиболее важным является инсульт вследствие тромбоза сосудов.

По сравнению с ишемией других тканей, ишемия нервной ткани в значительной степени сопровождается некрозом поражённых клеток. Более высокая распространённость некроза в нервной ткани может быть объяснена благодаря новому пониманию явления «эксцитотоксичность», которая представляет собой сложный каскад из множества реакционных стадий. Каскад инициируется ишемическими нейронами вследствие отсутствия кислорода, которые затем мгновенно лишаются АТФ и деполяризуются. В результате повышается постсинаптическое высвобождение нейромедиатора глутамата, который активирует мембранносвязанные рецепторы глутамата, регулирующие функцию катионных каналов. Однако вследствие повышенного высвобождения глутамата рецепторы глутамата становятся сверхактивированными.

Рецепторы глутамата регулируют функцию потенциалзависимых катионных каналов, которые открываются при связывании глутамата с рецептором. Это приводит к притоку Να' и Са⁺ в клетку, нарушая в значительной степени Са⁺-зависимый клеточный метаболизм. Особенно активация Са⁺-зависимых ферментов катаболизма может быть причиной смерти (Ьее, Лп-Мо с1 а1., ТЛе сЛаидшд 1ап6ксаре οί ίκсЛаетэс Ьташ шщту тесЛашктк; Иепшк XV. Ζΐιοί С1н1ата1е пеигоЮхюйу апб Фкеакек οί 1Ле петуоик кук1ет).

Хотя механизм нейротоксичности, опосредованный глутаматом, всё ещё полностью не исследован, полагают, что глутамат в значительной степени способствует гибели нервной клетки после ишемии мозга (Лп-Мо Ьее, е1 а1.).

Кроме защиты жизненно важных функций и стабилизации физиологического параметра, в терапии острой ишемии мозга приоритет принадлежит открытию просвета в закрытом сосуде. Открытие сосуда можно осуществлять различными способами. Простое механическое открытие, как, например, РТСА после сердечного приступа, не привело до сих пор к удовлетворительным результатам. Только с успехами в области фибринолиза можно достичь приемлемого улучшения физического состояния больных. Улучшения можно достичь путём местной аппликации с помощью катетера (РКОСАТ, изучение с проурокиназой). Однако несмотря на первые положительные результаты, указанный способ всё ещё официально не признан в качестве фармацевтического лечения.

Природный фибринолиз основан на протеолитической активности сериновой протеазы плазмина, который образуется из его неактивного предшественника посредством катализа (активации). Природная активация плазминогена катализируется активаторами плазминогена и-РА (активатор плазминогена урокиназного типа) и ΐ-РА (тканевой активатор плазминогена), которые имеются в организме. В отличие от и-РА, ΐ-РА образует так называемый активаторный комплекс вместе с фибрином и плазминогеном. Таким образом, каталитическая активность 1-РА зависит от фибрина и повышается в его присутствии приблизительно в 550 раз. Кроме фибрина, фибриноген также может стимулировать 1-РА-опосредованный катализ плазминогена до плазмина, хотя и в меньшей степени. В присутствии фибриногена активность 1РА увеличивается только в 25 раз. Также продукты расщепления фибрина (продукты деградации фибрина (ΕΌΡ)) стимулируют активность 1-РА.

Ранние попытки лечения острого инсульта тромболитическими средствами приходятся на 1950-ые годы. Первые обширные клинические испытания со стрептокиназой, фибринолитическим агентом из бета-гемолитического стрептококка, начались только в 1995 г. Вместе с плазминогеном стрептокиназа образует комплекс, который посредством катализа превращает другие молекулы плазминогена в плазмин.

Терапия стрептокиназой имеет серьёзные недостатки, так как стрептокиназа является бактериальной протеазой и поэтому она может вызывать аллергические реакции в организме. Кроме того, вследствие стрептококковой инфекции, вызывающей продукцию антител, у больного может развиваться так называемая стрептокиназная устойчивость, затрудняющая лечение. Кроме того, клинические испытания, проводимые в Европе (МиИсеШет Асн1е §1токе Тпа1 οί Еигоре (МА8Т-Е), МиИсеШет Асн1е §1токе Тпа1 οί Ла1у (МА8Т-1)) и Австралии (Аи81таЛап БЛерЮкшаке Тпа1 (А8Т)), указывают на повышение риска смертности и риска внутримозгового кровотечения (внутримозговое кровоизлияние, 1СН) после лечения больных стрептокиназой. Указанные испытания следовало закончить заблаговременно.

- 1 013707

В качестве альтернативы может быть применена урокиназа, также классический фибринолитический агент. В противоположность стрептокиназе, урокиназа не проявляет антигенных характеристик, поскольку она присутствует в различных тканях организма. Она является активатором плазминогена и не зависит от кофактора. Урокиназа продуцируется в культуре клеток почек.

Большой опыт по терапии тромболитическими средствами накоплен в отношении активатора плазминогена тканевого типа, так называемого й-РА (см. европейский патент ЕР 0093619, патент США 4766075), который продуцируется в рекомбинантных клетках хомячка. В 90-ые годы по всему миру были проведены клинические испытания по применению ΐ-РА на остром инфаркте миокарда в качестве главного показателя, которые привели к отчасти непонятным и противоречивым результатам. В ходе так называемого Европейского исследования острого инсульта (ЕСА88) больных лечили внутривенно посредством й-РА с интервалом времени 6 ч после появления симптомов инсульта. По истечении 90 дней уровень смертности, а также индекс Вай11с1 проверяли в качестве показателя инвалидизации или независимой жизнеспособности больных. Значительного улучшения жизнеспособности не наблюдали, но наблюдали, хотя и незначительное, увеличение случаев смертности. Таким образом, можно заключить, что лечение больных, которое подбирается индивидуально в соответствии с их историей болезни, тромболитическим средством, й-РА, немедленно после возникновения инсульта может быть целесообразным. Однако обычное применение й-РА с интервалом времени 6 ч после возникновения удара не рекомендуется, поскольку использование в течение указанного интервала времени повышает риск внутримозгового кровоизлияния (1СН) (С. Б-с\\'апбо\\ък| С апб ^Шаш Вагааи, 2001: ТгеаЦпеШ οί Аси1е 81гоке; ίη: АппаЕ οί Ететдеису Мебкше 37:2; 8. 202 ίί.).

Лечение инсульта тромболитиками также было предметом клинического испытания, проводимого Национальным Институтом по исследованию неврологических нарушений и удара (Иа1юиа1 ИъШШе οί №иго1ощс ЭЕогбег аиб 81гоке) (так называемое испытание инсульта, проводимое ΝΙΝΌ8 посредством йРА) в США. Указанное испытание было направлено на изучение эффекта лечения посредством й-РА, вводимого внутривенным путём, в пределах только 3 ч после появления симптомов. Больных проверяли три месяца после лечения. Благодаря наблюдаемому положительному эффекту от указанного лечения в отношении жизнеспособности больных, лечение посредством й-РА в пределах ограниченного времени из 3 ч было рекомендовано, хотя авторы обнаружили высокий риск возникновения 1СН.

С помощью двух следующих исследований (ЕСА88 II Тпа1: АИер1а§е ТйтотЬо1у818 ίοτ Аси1е Νοηίη1егуеи1юиа1 Тйегару ίη Псйаетю 81гоке (АТЕА№Т18)) проверяли, может ли положительный эффект лечения посредством й-РА в пределах 3 ч после появления инсульта быть повторен при лечении в пределах 6 ч времени. Однако на этот вопрос нельзя ответить утвердительно, поскольку не наблюдали улучшения клинических симптомов или какого-либо уменьшения случаев смертности. Высокий риск развития 1СН оставался.

Полученные, отчасти, противоречивые результаты привели к тому, что й-РА можно применять с большой осторожностью. Уже в 1996 г. публикация Американской кардиологической ассоциации (Атепсаи Неай А88οс^аΐ^οи) продемонстрировала скептическое отношение докторов относительно лечения инсульта тромболитическими средствами; в то же время такого скептицизма относитально применения фибринолитика в терапии инфаркта миокарда не существует (уаи Оуи 1, ΜΌ, БК.СР, 1996, Сйси1а1юи 1996, 93:1616-1617).

Рациональное объяснение скептическому отношению к указанной проблеме впервые было дано в кратком описании всех испытаний, проводимых в отношении инсульта, которое было опубликовано в 1997 г. (обновлено в марте 2001 г.). Согласно данному обзору, лечение тромболитиками (урокиназа, стрептокиназа, й-РА или рекомбинантная урокиназа) в течение первых 10 дней после появления инсульта привело к высокому уровню смертности, в то время как общее количество умерших людей или инвалидизированных больных было снижено в случаях, когда тромболитики применяли в пределах 6 ч после возникновения удара. Указанный эффект был следствием, главным образом, 1СН. Поэтому широкое применение тромболитика для лечения инсульта не рекомендовалось.

Ранее такие результаты послужили поводом для саркастического утверждения некоторыми другими авторами, что больные после инсульта имеют выбор либо умереть, либо остаться инвалидами (8СКТР 1997:2265, 26).

Однако до сих пор терапия посредством й-РА представляет собой единственное лечение острой ишемии мозга, утверждённое Департаментом по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (БОА) в США. Однако имеется органичение применения γΙ-РА в течение 3 ч после возникновения инсульта.

Одобрение применения й-РА было достигнуто в 1996 г. До этого, в 1995 г. появились первые сообщения об отрицательном побочном эффекте, обусловленном применением й-РА, которые предоставили объяснение его драматического действия в случаях применения указанного тромболитика в лечении инсульта за пределами 3-часового интервала. Таким образом, глиальные макрофаги и нервные клетки гиппокампа продуцируют ΐ-РА, который принимает участие в глутамат-опосредованной эксцитотоксичности. Такое заключение было сделано на основании сравнительного изучения, проводимого на мышах с дефицитом ΐ-РА и мышах дикого типа, которым в гиппокамп вводили агонисты глутамата соответствен

- 2 013707 но. Мыши с недостаточностью 1-РЛ проявили высокую устойчивость к внешнему (интратекальному) глутамату (Татка 8Е с1 а1., Иа1иге, Уо1. 377, 1995, Ехсйохш-шбисеб пеигопа1 бедепетабоп апб зе1/иге апб шеб1а1еб Ьу бззие р1азшшодеп асбуа1от). Данные результаты были подтверждены в 1998 г., когда исследователю ^апд е1 а1. удалось доказать увеличение количества некротической нервной ткани в два раза у мышей с дефицитом 1-РЛ, которым вводили 1-РЛ внутривенно. Указанное отрицательное воздействие внешнего 1-РА на мышей дикого типа составляло только приблизительно 33% (^апд е1 а1., 1998, Иа1иге, Пззие р1азшшодеп асбуа1от (1-РА) шстеазез пеигопа1 батаде айет Тоса1 сегеЬга1 1зсЬаеш1а ш \\Иб 1уре апб 1-РА бейс1еп1 шке).

Дальнейшие результаты, касающиеся стимуляции эксцитотоксичности посредством 1-РА, были опубликованы авторами №со1е е1 а1. в начале 2001 г. (№со1е О., Иосадпе Р АН С; МатдаШ I; Сатте11е1 Р; МасКеп/1е ЕТ, У1у1еп Ό апб Вшззоп А, 2001: ТЬе рто1ео1убс асйуйу ой бззие-р1азшшодеп асбуа1от епЬапсез ΝΜΌΛ гесер1ог-теб1а1еб з1дпа1шд; ш: №11 Меб 7, 59-64). Им удалось доказать, что 1-РА, высвобождаемый деполяризованными кортикальными нейронами, может взаимодействовать с так называемой ΝΚ1 субъединицей рецептора глутамата типа ИМЭА, что приводит к расщеплению ΝΚ1. Расщепление ΝΚ1 приводит к увеличению активности рецептора, что способствует большему повреждению ткани после применения агониста рецептора глутамата ИМИА. Агонист ИМЭА вызывает эксцитотоксичность. Таким образом, 1-РА проявляет нейротоксичное действие путём активации рецептора глутамата ИМИА типа.

Согласно следующей концепции, нейротоксичность 1-РА является непрямым результатом превращения плазминогена в плазмин. Согласно данной модели, плазмин является эффектором нейротоксичности (СЬеп ΖΕ апб 81пск1апб 8, 1997: Иеигопа1 Иеа1Ь ш 1Ье Ырросашрцз 18 ргошо1еб Ьу р1азшш-са1а1узеб бедтабабоп ой 1ашшш. Се11: 91, 917-925).

Итоговые данные зависящего от времени нейротоксичного действия 1-РА представлены на фиг. 9. Полученные данные свидетельствуют о повышенной токсичности рекомбинантного 1-РА по сравнению с токсичностью эндогенного 1-РА. Вероятно, повышенная токсичность рекомбинантного 1-РА является следствием того, что й-РА способен проникать в ткань в высоких концентрациях.

Несмотря на нейротоксичный побочный эффект и увеличение смертных случаев, 1-РА был утверждён РИА. Такое решение можно только объяснить отсутствием безопасных и эффективных альтернатив, таким образом, это решение является результатом весьма практичного анализа стоимости и эффективности. Поэтому потребность в безопасных терапевтических методах всё ещё существует. Однако если такие методы были всё же основаны на применении тромболитиков, в случае, если невозможно найти альтернативы тромболизу, проблему нейротоксичности следует учитывать (см., например, ^апд е1 а1. а.а.О.; Ре\\ш1бо\\'зк1 апб Вагзоп 2001 а.а.О.).

Поэтому дальнейшая проверка известных тромболитических средств, включая И8РА (Иезшобиз го1ипбиз Р1азшшодеп Асйуа1от), с целью разработки новых лекарственных препаратов для лечения инсульта была остановлена, хотя в принципе все тромболитические средства являются потенциально применимыми. Особенно для И8РА, ранее была отмечена его пригодность в случае данного медицинского показания (Мебап Р; ТаШзишак Т; Такапо К; Сагапо КАП; Наб1еу 81; Избег М: ТЬтошЬо1уз1з \ν61ι тесошЬшаШ Иезшобиз забуа р1азшшодеп асбуа1от (тИ8РА) ш га1 ешЬобс шобе1; ш СетеЬтоуазс И1з 1996:6; 175-194 (4'¹' 1п1егпабопа1 8ушрозшш оп ТЬтошЬобс ТЬегару ш Аси1е 1зсЬаеш1с 81гоке). И8РА является активатором плазминогена с высокой гомологией (сходство) по отношению к 1-РА. Поэтому и вдобавок к разочарованию в связи с нейротоксичным побочным действием 1-РА дальнейших ожидаемых результатов от И8РА, как подходящего лекарственного средства для лечения инсульта, не было получено.

Вместо этого, современные стратегии, нацеленные на улучшение методов лечения тромболитическими средствами, основываются на применении тромболитического вещества не внутривенно, а внутриартериально через катетер, расположенный в прямой близости к тромбу. Первый опыт имеется с рекомбинантной урокиназой. Таким образом, вероятно, можно снизить необходимую дозу для тромболиза и к тому же отрицательные побочные эффекты. Однако такое применение требует больших технических расходов и не везде доступно. Кроме того, больной должен быть подготовлен ко времени для введения препарата. Время, однако, часто ограничено. Таким образом, подготовка предусматривает дополнительный риск.

Теперь новые идеи связаны с антикоагулянтами, такими как гепарин, аспирин или анкрод, который является активным веществом яда малайской гремучей змеи. Однако результаты двух дальнейших клинических испытаний, проводимых с целью проверки действия гепарина (1п1егпабопа1 81гоке Тпа1 (18Т) апб Тпа1 ой ОКО 10172 ш Аси1е 81гоке ТгеаОпеЩ (ТОА8Т), не показали значительного уменьшения уровня смертности или профилактики инсульта.

Далее, новые методы лечения не концентрируют внимание ни на тромбе, ни на разжижении крови или противосвёртывающей терапии, но направлены на повышение жизнеспособности клеток, повреждённых приостановкой кровоснабжения (международные публикации XVО 01/51613 А1 и XVО 01/51614 А1). Для достижения этого применяют антибиотики из группы хинонов, аминогликозиды или хлорамфеникол. С целью лечения инсульта полагают начать с применения цитихолина прямо после возникновения удара. В организме цитихолин расщепляется до цитидина и холина. Продукты расщепления образу

- 3 013707 ют часть нейронной клеточной мембраны и, таким образом, поддерживают регенерацию повреждённой ткани (патент США 5827832).

Недавнее исследование, посвященное безопасным методам лечения, основывается на новых данных о том, что часть фатальных последствий инсульта только косвенно обусловлена остановкой кровоснабжения, но прямо связана с эксцитотоксичностью или нейротоксичностью, включающей сверхактивированные рецепторы глутамата. Данный эффект увеличивается посредством ί-ΡΑ (см. выше). Поэтому идея заключается в том, чтобы снизить эксцитотоксичность путём применения так называемых нейропротекторов. Их можно использовать отдельно или в комбинации с фибринолитическими средствами, чтобы снизить до минимума нейротоксичные эффекты. Они могут привести к снижению эксцитотоксичности прямо, например, как в случае с антагонистом рецептора глутамата, или косвенно путём ингибирования потенциалзависимых натриевых или кальциевых каналов (Ли-Мо Лее с1 а1. а.а.О.).

Конкурентное ингибирование (антагонистическое действие) рецептора глутамата типа ΝΜΌΑ является возможным, например, 2-амино-5-фосфоновалератом (АРУ) или 2-амино-5-фосфоногептаноатом (АРН). Неконкурентное ингибирование может быть достигнуто, например, веществами, связывающимися с фенилциклидиновой стороной каналов. Такими веществами могут быть фенилциклидин, МК-801, декстрорфан или кетамин.

До сих пор лечение нейропротекторами не имело ожидаемого успеха, возможно, из-за того, что нейропротекторы должны быть комбинированы с тромболитическими агентами для проявления защитного действия. Это применимо к другим веществам (см. также фиг. 10).

Комбинация ί-ΡΑ и нейропротективных агентов приводит только к ограниченному повреждению. Тем не менее, нейротоксичности фибринолитического агента, как такового, не избежать.

Поэтому целью настоящего изобретения является разработка новой терапевтической концепции для лечения инсульта у человека.

Согласно изобретению применение нетоксичных плазминогенактивирующих факторов предполагается, как обозначено в п.1 формулы изобретения, для терапевтического лечения инсульта. Другие благоприятные примеры использования являются предметом независимых пунктов формулы изобретения соответственно, а также других зависимых пунктов формулы изобретения.

Основной идеей изобретения является использование активатора плазминогена при лечении инсульта, где зрелый фермент проявляет активность, которая избирательно повышается фибрином во много раз, а именно более чем в 650 раз.

Применение активаторов плазминогена согласно изобретению основывается на следующих данных: вследствие тканевого повреждения в мозге, вызванного мозговым ударом, гематоэнцефалический барьер повреждается или разрушается. Таким образом, циркулирующий в крови фибриноген может проникнуть в нейронную ткань головного мозга. Здесь он активирует ί-ΡΑ, который косвенно путём активации рецептора глутамата или плазминогена приводит к дальнейшему повреждению ткани. Для того чтобы избежать подобного действия, изобретение предлагает использовать активатор плазминогена, который является высокоизбирательным по отношению к фибрину и - как инверсия аргумента - проявляет сниженную способность к активации фибриногеном. Таким образом, активатор плазминогена не, или по сравнению с ί-ΡΑ, по крайней мере, в значительно меньшей степени, активируется фибриногеном, проникающим из крови в нейронную ткань в результате повреждения гематоэнцефалического барьера, поскольку активатор ί-ΡΑ фибрин не может проникнуть в нейронную ткань из-за его размера. Поэтому активаторы плазминогена, согласно изобретению, не являются токсичными для нервной ткани.

Согласно предпочтительному аспекту изобретения используют нетоксичные активаторы плазминогена, которые содержат по крайней мере один элемент из так называемой триады зимогена. Сопоставимая триада, как известно, составляет каталитический центр сериновых протеаз семейства химотрипсина, состоящий из трёх взаимодействующих аминокислот аспартата 194, гистидина 40 и серина 32. Однако эта триада не существует в ί-ΡΑ, который также принадлежит к семейству химотрипсиноподобных сериновых протеаз. Однако известно, что направленный мутагенез нативного ί-ΡΑ с целью введения по крайней мере одной из вышеуказанных аминокислот в подходящее положение приводит к снижению активности профермента (одна цепь ί-ΡΑ) и повышению активности зрелого фермента (двойная цепь ί-ΡΑ) в присутствии фибрина. Поэтому введение по крайней мере одной аминокислоты триады или аминокислоты с соответствующей функцией в триаде может повысить зимогенность ί-ΡΑ (т.е. отношение между активностью зрелого фермента и активностью профермента). В результате специфичность фибрина повышается в значительной степени. Такой эффект имеет место вследствие конформационного взаимодействия между введённым аминокислотным остатком и/или аминокислотными остатками последовательности дикого типа.

Известно, что мутагенез нативного ί-ΡΑ, направленный на замещение Ρ1κ305 остатком Ηίδ (Р305Н) и замещение Αία 292 остатком §ег (Α2928), приводит к 20-кратному увеличению зимогенности, в то время как вариант Р305Н только уже приводит к 5-кратному повышению зимогенности (ЕЬ МаЛеои, КоЬе Α, СеЙипд М-Ι; ЗашЬгоок ДЕ, ОоИетйЛ Εί 1993: СоиуегЛид Т155ие Ρ1а5т^ηодеη ΑοΙίνηΙΟΓ ίο а 2утодеи: Α гещ.11а1огу Тпаб ок Αδρ-Ηίδ^τ; §с1еисе: 262, 419-421). В присутствии фибрина указанные мутанты ί-ΡΑ проявляют активность в 30000 раз выше (Е305Н) и 130000 раз выше (Е305Н, Α2928) соответственно.

- 4 013707

Кроме того, указанные мутанты включают в себя замещение Агд275 на В275Е с целью предотвращения расщепления связи плазмином на участке расщепления Агд275-11е276, тем самым, препятствуя превращению одноцепочечный 1-РА в двухцепочечную форму. Введение мутантного сайта В275Е только приводит к 6900-кратному увеличению специфичности ΐ-РА к фибрину (К. Тасйак, Маб1коп ЕЬ 1995: Уапаи1к о! Т1ккие-1уре Р1акттодеп АсЬуЩог \У1нс11 Э1кр1ау 8иЬк1ап11а11у ЕпЬапсеб 8бти1абоп Ьу Р1Ьгш, ίη: 1оита1 о! Вю1одюа1 СйетШгу 270, 31: 18319-18322).

Положения 305 и 292 в молекуле ΐ-РА гомологичны положениям Н1к40 и 8ег32 известной триады химотрипсиновых сериновых протеаз. Путём соответствующих замещений, вводя гистидин или соответственно серин, указанные аминокислоты могут взаимодействовать с аспартатом 477 молекулы ί-РА, что приводит к образованию функциональной триады в мутантах ί-РА (Майкоп е1 а1., 1993).

Указанные мутанты ί-РА могут быть использованы для лечения инсульта согласно изобретению, поскольку они не проявляют или, по сравнению с ί-РА дикого типа, проявляют нейротоксичность в значительно меньшей степени благодаря повышенной специфичности указанных мутантов к фибрину. С целью раскрытия упомянутых выше мутантов ί-РА Р305Н; Р305Н, А2928 только или в комбинации с В275Е, авторы включили в описание публикации Майкоп еί а1., (1993) и ТасЫак апб Маб1коп (1995) посредством ссылки.

Увеличение специфичности активаторов плазминогена по отношению к фибрину может быть достигнуто иначе путём точечной мутации Акр194 (или аспартата в гомологичном положении). Активаторы плазминогена принадлежат к группе сериновых протеаз семейства химотрипсина и поэтому содержат консервативную аминокислоту Акр194, которая ответственна за стабильность каталитической активной конформации зрелых протеаз. Известно, что Акр194 взаимодействует с Н1к40 в зимогенной форме сериновых протеаз. После того как зимоген активируется путём расщепления, данное специфическое взаимодействие нарушается, и боковая цепь Акр194 претерпевает вращение приблизительно на 170° с образованием нового солевого мостика с 11е16. Указанный солевой мостик вносит существенный вклад в поддержание стабильности оксианионного «кармана» каталитического центра зрелых сериновых протеаз. Он также присутствует в ί-РА.

Введение точечной мутации, заменяющей Акр194, на первый взгляд, препятствует образованию или соответственно стабильности каталитической конформации сериновых протеаз. Несмотря на это, мутированные активаторы плазминогена проявляют повышенную активность в присутствии их кофактора, фибрина, особенно по сравнению со зрелой формой дикого типа, что можно объяснить до некоторой степени тем, что взаимодействие с фибрином приводит к изменению конформации, стимулирующей каталитическую активность (Ь. 8йапбЬегд, Маб1коп ЕЬ, 1995: УапаШк о! Т1ккие-1уре Р1акттодеп Асбуайг ^ίί! 8иЬк1апиа11у ЕпЬапсеб Векропке апб 8е1ес11мНу 1о\гагбк Р1Ьпп со-ГасЮгк, т: 1оита1 о! Вю1ощса1 С1ет1йгу 270, 40: 2344-2349).

В заключение, мутанты активаторов плазминогена с заменой Акр194 проявляют повышенную активность в присутствии фибрина, что делает возможным их использование согласно изобретению.

В предпочтительном аспекте согласно изобретению используют мутант ί-РА, у которого Акр194 заменяют глутаматом (Э194Е) или соответственно аспарагином (Ό194Ν). У таких мутантов ί-РА активность снижается от 1 до 2000 раз в отсутствие фибрина, в то время как в присутствии фибрина активность повышается от 498000 до 1050000 раз. Указанные мутанты также могут включать в себя замещение Агд15 на В15Е, которое предотвращает расщепление плазмином одноцепочечного ί-РА у пептидной связи Агд15-11е16, приводящее к двухцепочечной молекуле ί-РА. Эта единственная мутация повышает активацию ί-РА фибрином в 12000 раз. С целью раскрытия мутаций ί-РА у положений 194 и 15, публикации 8ВапбЬегд апб Маб1коп (1995) включены полностью в описание посредством ссылки.

Повышения зависимости активаторов плазминогена от фибрина также можно достичь путём введения точечных мутаций в так называемую «петлю, подвергаемую автолизу». Этот элемент имеется в трипсине; он также может быть обнаружен как гомологичная часть в сериновых протеазах и характеризуется тремя гидрофобными аминокислотами (Ьеи, Рго и Р1е). Петля, подвергаемая автолизу, в молекулах активаторов плазминогена ответственна за взаимодействие с плазминогеном. Точечные мутации в данной области могут привести к тому, что белок-белковое взаимодействие между плазминогеном и активаторами плазминогена не может эффективно образовываться. Указанные мутации являются функционально значимыми только в отсутствие фибрина. Напротив, в присутствии фибрина обусловливают повышенную активность активаторов плазминогена (К. 8опд-Ниа, ТасЫак К., ЬатЬа Ό, Вобе ^, Маб1коп ЕЬ, 1997: 1беп(1Пса11оп о! а НубгорйоЫс ехосйе оп Т1ккие Туре Р1акттодеп АсЬсаЮг ТЬа1 Моби1а1ек 8рес1ПсНу !ог Р1актшодеп, ш: 1оита1 о! Вю1ощса1 СНетЩгу 272; 3, 1811-1816).

В предпочтительном аспекте точечные мутации ί-РА находятся в положениях от 420 до 423. Если указанные остатки замещаются путём направленного мутагенеза, то зависимость ί-РА от фибрина повышается вплоть до 61000 раз (К. 8опд-Ниа еί а1.). 8опд-Ниа еί а1. проверили точечные мутации Ь420А, Ь420Е, 84210, 8421Е, Р422А, Р422О, Р422Е, Р423А и Р423Е. Данные публикации полностью включены посредством ссылки для раскрытия применения согласно изобретению.

Согласно следующему благоприятному аспекту используют модифицированный тканевой активатор плазминогена с аминокислотной последовательностью, соответствующей 8ЕО Ш №. 1 (фиг. 13).

- 5 013707

Данный модифицированный 1-РЛ отличается от 1-РЛ дикого типа заменой гидрофобных аминокислот в положении от 420 до 423 в петле автолиза, которые являются следующими: Н15420. А§р421. А1а422 и Су§423. Данный ΐ-РА предпочтительно содержит фенилаланин в положении 194. Кроме того. положение 275 может быть занято глутаматом. Предпочтительно. когда положение 194 занято фенилаланином.

Кроме того. модифицированную урокиназу можно применять согласно изобретению. Урокиназа согласно изобретению может содержать аминокислотную последовательность. соответствующую 8ЕО Ш Νο. 2 (фиг. 14). в которой гидрофобные аминокислоты автолитической петли заменены на Уа1420. Т111421. А5р422 и 8ет423. Предпочтительно урокиназа имеет остатки 11е275 и С1и194. Данный мутант проявляет в сравнении с урокиназой дикого типа 500-кратное увеличение специфичности к фибрину.

Оба мутанта - урокиназу. а также ί-РА - анализировали посредством полуколичественного анализа и проявили повышенную специфичность к фибрину по сравнению с ΐ-РА дикого типа.

Активатор плазминогена (И8РА) из слюны обыкновенного вампира (Эе5тоби5 го1нпбн5) также проявляет повышенную активность в присутствии фибрина. особенно 100000-кратное повышение. Таким образом. эти данные предпочтительно использовать согласно изобретению. Термин И8РА включает в себя четыре разные протеазы. которые выполняют важную для обыкновенного вампира функцию. а именно. увеличивают продолжительность кровотечения из ран (Саг1\упд111. 1974).

Указанные четыре протеазы (И8РАа1. И8РАа2. И8РАв. 08РАу) проявляют высокое сходство (гомология) друг с другом и с ί-РА человека. Они также проявляют подобные физиологические активности. что подводит их под общепринятую классификацию под общим обозначением И8РА. Э8РА раскрывают в европейском патенте ЕР 0352119 А1 и патентах США 6008019 и 5830849. которые включены в текст полностью в виде ссылки с целью раскрытия.

До сих пор И8РАа являлась наиболее проанализированной из данной группы протеазой. Она имеет аминокислотную последовательность с гомологией выше 72% в сравнении с известной аминокислотной последовательностью ί-РА человека (Кга18сйтаг е1 а1.. 1991). Однако имеется два существенных различия между ί-РА и Э8РА. Во-первых. все Э8РА имеют полную протеазную активность. проявляемую одноцепочечной молекулой. поскольку она. в противоположность ί-РА. не превращается в двухцепочечную молекулу (Сатбе11 еί а1.. 1989; 1<га1/5с1ипаг еί а1.. 1991). Во-вторых. каталитическая активность 08РА почти абсолютно зависит от фибрина (Сатбе11 еί а1.. 1989; Вппдтапп еί а1.. 1995; То5с1не еί а1.. 1998). Например. активность И8РАа увеличивается в 100000 раз в присутствии фибрина. в то время как активность ί-РА увеличивается только в 550 раз. В противоположность. активность И8РА в меньшей степени индуцируется фибриногеном. так как она увеличивается только в 7-9 раз (Вппдтапн еί а1.. 1995). В заключение. И8РА в большей степени зависит от фибрина и является намного более специфичным по отношению к фибрину. чем ί-РА дикого типа. который активируется фибрином только в 550 раз.

Учитывая фибринолитические свойства и значительное сходство с ί-РА. И8РА рассматривают в качестве интересного кандидата для разработки тромболитического средства. Несмотря на это. терапевтическое применение Э8РА в качестве тромболитического средства ранее было ограничено лечением инфаркта миокарда. потому что вследствие вклада ί-РА в индуцированную глутаматом нейротоксичность необоснованных надежд не существует. что активатор плазминогена. который является родственным ίРА. с достаточным основанием может быть использован для лечения острого инсульта.

Неожиданно было обнаружено. что Э8РА не проявляет нейротоксичного действия. даже хотя он и обладает высоким сходством (гомология) с ί-РА и даже хотя физиологические эффекты молекул сравнимы в большей степени. Представленное выше заключение приводит к мысли. что после всего сказанного И8РА можно успешно использовать в качестве тромболитического агента для терапии инсульта. не вызывая риска повреждения нервной ткани. Особенно заслуживающим внимания является тот факт. что И8РА можно применять позже 3 ч после возникновения симптомов инсульта.

Следующий вариант настоящего изобретения. который вытекает из представленных выше данных. заключается в выборе направления модифицировать или продуцировать активаторы плазминогена такими. чтобы они имели существенные характеристики И8РА. особенно отсутствие нейротоксичности. свойственной ί-РА. Основанием для такого варианта является исследованная взаимосвязь между структурой и биохимическими эффектами. которая позволяет трансформировать нейротоксичные активаторы плазминогена в нетоксичные для нервной ткани активаторы плазминогена и. тем самым. продуцировать нетоксичные для нервной ткани активаторы плазминогена на основе известных или недавно выявленных нейротоксичных активаторов плазминогена.

Новый вариант основан на сравнительных проверках ίη νίνο нейродегенеративного действия ί-РА. с одной стороны. и И8РА. с другой стороны. которые осуществляют с помощью так называемой модели каиновой кислоты и модели для проверки поражения полосатого тела. индуцированного NΜ^А.

Модель каиновой кислоты (также модель повреждения каиновой кислотой) основана на стимуляции нейротоксичного глутаматного каскада путём внешнего применения каиновой кислоты (КА) в качестве агониста рецептора глутамата типа каиновой кислоты (тип КА) и NΜ^А и АМРА глутаматных рецепторов. Используя в качестве экспериментальной модели ί-РА-дефицитных мышей. можно показать. что чувствительность лабораторных животных к каиновой кислоте только достигает уровня мышей ди

- 6 013707 кого типа после дополнительного применения внешнего ΐ-ΡΑ. В противоположность этому, инфузия эквимолярной концентрации Ό8ΡΑ при таких же экспериментальных условиях не восстанавливает чувствительность к каиновой кислоте (ΚΑ). На основании полученных результатов заключили, что нейротоксичное действие ΐ-ΡΑ не вызывается посредством Ό8ΡΑ. Сводные данные представлены в табл. 2.

_______Таблица 2

Участок интактного гиппокампа (мм)

Обрабатывав-	Количество	Контралате-	Ипсилатераль-	Остаток в
мая группа	животных	ральная	ная сторона	процентах
		сторона	Среднее
		Среднее	Значение
		значение	(ЗЕМ)
		(ЗЕМ)
Ь-РА инфузия	12	15,99 (0,208)	3,63 (0,458)	22,7*
(1,85 мкМ) +
КА
Ό3ΡΑ инфузия	11	16,07 (0,124)	13,8 (0,579)	85,87
(1,85 мкМ) +
КА
С-РА инфузия	3	16,75 (0,381)	17,08 (0,363)	101.97
(1,85 мкМ) +
РВЗ
Ό3ΡΑ инфузия	3	15,75 (0,629)	15,83 (0,363)	100,50
(1,85 мкМ) +
РВЗ
С-РА инфузия	3	15,60 (0,702)	5,07 (1,09)	32,5
(0,185 мкМ)
+ КА
Ώ3ΡΑ инфузия	3	16,06 (0,176)	13,80 (1,22)	85,93
(18,5 мкМ) +
КА
* Р<0,0001

Количественные проверки, основанные на данной модели, обнаружили, что даже 10-кратное увеличение концентрации Ό8ΡΑ не может восстановить чувствительности ΐ-РА-дефицитных мышей к обработке посредством ΚΑ, в то время как концентрация ΐ-ΡΑ уже в 10 раз ниже приводит к повреждениям ткани, индуцированным ΚΑ. Полученные результаты приводят к заключению, что Ό8ΡΑ обладает по крайней мере в 100 раз меньшим нейротоксичным потенциалом по сравнению с ΐ-ΡΑ в отношении стимуляции дегенерации нервной ткани после обработки ΚΑ (см. также фиг. 11 и 12).

Во второй модели дегенерации нервной ткани возможное действие ΐ-ΡΑ, а также Ό8ΡΑ на стимуляцию зависимой от ΝΜΌΑ дегенерации нервной ткани сравнивали с действием указанных протеаз на модели мышей дикого типа. С этой целью ΝΜΌΑ (как агонист рецептора глутамата типа ΝΜΌΑ) вводили посредством инъекции мышам дикого типа отдельно или в комбинации с ΐ-ΡΑ или Ό8ΡΑ. Данная модель позволяет сравнить действие указанных протеаз в условиях, которые всегда приводят к дегенерации нервной ткани и к притоку белков плазмы вследствие разрушения гематоэнцефалического барьера (Сйеп е! а1., 1999).

Во время работы на указанной модели инъекция ΝΜΌΑ приводит к воспроизводимым повреждениям в полосатом теле мышей. Объём повреждений увеличивается при инъецировании комбинированного препарата ΐ-ΡΑ и ΝΜΌΑ по крайней мере на 50%. В противоположность этому коинъекция Ό8ΡΑα1 не приводит к увеличению или распространению повреждений, вызванных ΝΜΌΑ. Даже в присутствии белков плазмы, которые могут свободно диффундировать в область повреждения, индуцированного ΝΜΌΑ, Ό8ΡΑ не приводит к увеличению дегенерации нервной ткани (см. также табл. 3).

- 7 013707

Таблица 3

Обраб атываемая группа	Количество мышей дикого типа	Объём повреждения, среднее значение (мм3) (ЗЕМ)
ΝΜϋΑ только	8	1,85 (0,246)
ΝΜΌΑ + Ъ-РА	8	3,987 (0,293)*
ΝΜΌΑ + Ό3ΡΑ	8	1,656 (0,094)**
ύ-ΡΑ только	3	0,20 (0,011)
Ό3ΡΑ только	3	0,185 (0,016)

** Незначимый

Указанные результаты показывают, что свободный от фибрина Ώ8ΡΑ, в противоположность ΐ-ΡΑ, ведёт себя подобно почти инертной протеазе в центральной нервной системе млекопитающего и также человека и поэтому не вносит вклад в нейротоксический эффект, обусловленный действием ΚΑ или ΝΜΏΑ. Несмотря на сомнения относительно терапевтического применения ΐ-ΡΑ-подобных белков при мозговом ударе, продемонстрированное отсутствие нейротоксичности делает Ώ8ΡΑ подходящим тромболитическим средством для лечения острого инсульта.

Первые результаты клинических испытаний показывают, что ими можно воспользоваться с целью лечения инсульта у человека. Было обнаружено, что значительных улучшений у больных можно добиться после успешной перфузии (улучшение 8 точек МП 188 или ΝΙΗ88 шкалы от 0 до 1). Табл. 1 представляет данные.

________________________________________ Таблица 1

Больной		ΝΙΗ33
	Базисная линия	После обработки	День 7	День 30	День 90	зАЕз
1001	12	7	4	4	*	Повторный инфаркт
1002	8	9	2	0	0
1003	8	10	12	10	*
1004	8	4	2	0	0
1005	11	11	4	5	*
1006	9	7	1	*	*
1007	14	6	*	*	*
2001	19	20	-	-	-	1СН, смерть
2002	15	21	-	-	-	1СН, смерть
3001	8	7	6	5	*
3002	15	16	9	8	*
3003	10	19	21	*		Смерть на 39 день

Отсутствие нейротоксичности у Ο8ΡΛ и других нетоксичных для нервной ткани активаторов плазминогена (см. выше) представляет особое преимущество в лечении инсульта, которое заключается в том, что применение указанных активаторов плазминогена, в противоположность ΐ-ΡΑ дикого типа, не ограничивается коротким максимальным периодом, составляющем 3 ч после возникновения удара. И наоборот, лечение можно начинать позже, например после 6 ч или даже позже, поскольку не существует риска стимулирования эксцитотоксических реакций. Первые клинические испытания с Ώ8ΡΑ создали возможность безопасного лечения больных даже в течение диапазона времени от 6 до 9 ч после возникновения симптомов инсульта.

- 8 013707

Данный вариант неограниченного временем лечения не токсичными для нервной ткани активаторами представляет особую важность, поскольку он позволяет в течение первого времени лечить больных с симптомами острого инсульта безопасно даже в тех случаях, когда установление диагноза задерживается или начальный момент удара трудно определить с достаточной уверенностью. На предыдущем уровне техники указанная группа больных была не допущена до тромболитической терапии активаторами плазминогена из-за риска неблагоприятной оценки. Следовательно, существенное противопоказание для надёжного применения тромболитического средства в случаях инсульта устраняется.

Ό8ΡΑ, а также другие нетоксичные для нервной ткани активаторы плазминогена не проявляют побочных эффектов, выраженных в повреждении ткани. Однако их целесообразно применять в комбинации с нейропротективным агентом для лечения инсульта с целью ограничения тканевых повреждений, индуцированных имеющимся в организме человека глутаматом. Для этого могут быть применены нейропротективные агенты, ингибирующие рецептор глутамата конкурентно или неконкурентно. Применимыми для этого комбинациями являются, например, комбинации с известными ингибиторами рецепторов глутамата типа ΝΜΌΑ, типа каиновой кислоты или типа хисквалата, например, ΑΡν, ΑΡΗ, фенциклидин, ΜΚ-801, декстрорфан или кетамин.

Другая комбинация с катионами может быть благоприятной, так как катионы, особенно Ζη-ионы, блокируют катионный канал, регулируемый рецептором глутамата, и поэтому могут снижать нейротоксичные эффекты.

В следующем благоприятном аспекте, не токсичные для нервной ткани активаторы плазминогена могут быть комбинированы по крайней мере с одним другим терапевтическим агентом или с фармацевтически приемлемым носителем. Комбинация с терапевтическим агентом, который способствует уменьшению тканевого повреждения путём оживления клеток, является особенно предпочтительной, поскольку она вносит вклад в регенерацию уже повреждённой ткани или служит для предотвращения дальнейших случаев удара. Благоприятными примерами являются комбинации с антибиотиками, такими как хиноны, противосвёртывающими средствами, такими как гепарин или гирудин, а также с цитихолином или ацетилсалициловой кислотой.

Комбинация по крайней мере с одним ингибитором тромбина также может быть благоприятной. Предпочтительно тромбомодулин и аналоги тромбомодулина, аналогичные, например, солулину, триабину или паллидипину, могут быть использованы. Следующие комбинации с противовоспалительными веществами являются благоприятными, поскольку они влияют на инфильтрацию лейкоцитами.

Методы сравнительной проверки ΐ-ΡΑ и Ό8ΡΑ.

1. Животные.

Мыши дикого типа (с57/В1аск 6) и ΐ-ΡΑ-дефицитные мыши (!-РА-/-мыши) (с57/В1аск 6) (СаттеНе! с1 а1., 1994) предоставлены Ότ. Ρеΐе^ СаттеНе!, Ьеиуеп, Ве1дшт.

2. Экстракция белка из ткани головного мозга.

Оценку протеолитической активности в ткани мозга после инфузии либо ΐ-ΡΑ, либо ΌδΡΑαΙ осуществляли посредством зимографического анализа (6^аηе11^-Ρ^ρетο апб РеЫт 1974). После проведения инфузии в гиппокамп мышей в течение периода времени семь дней мышей анестезировали, затем перфузией транскардиально вводили ΡΒδ и мозги удаляли. Область гиппокампа удаляли, переносили в пробирки Эппендорфа и инкубировали в равном объёме (мас./об.) (приблизительно 30-50 мкм) 0,5% ΝΡ-40 буфера для лизиса, не содержащего протеазные ингибиторы (0,5% ΝΡ-40, 10 мМ трис-НС1 рН 7,4, 10 мМ №С1, 3 мМ МдС1₂, 1 мМ ΕΌΤΑ). Экстракты мозга гомогенизировали с помощью ручного стеклянного гомогенизатора и оставляли на льду в течение 30 мин. Затем образцы центрифугировали и супернатант удаляли. Количество имеющихся белков определяли (Вю-К.аб-геадеп!).

3. Зимографический анализ протеаз.

Протеолитическую активность в образцах и экстрактах ткани мозга определяли посредством зимографического анализа согласно методу СтапеШ, Ρ^ρе^ηο апб К.еюй (1974). Образцы с рекомбинантными белками (вплоть до 100 нМ) или экстрактами ткани мозга (20 мкг) подвергали электрофорезу в (10%) ПААГ (8Ό8-ΡΑ6Ε) при невосстанавливающих условиях. Гели удаляли с пластин, промывали 1% тритоном X 100 в течение 2 ч и накладывали на агарозный гель, содержащий полимеризованный фибриноген и плазминоген (СтапеШ, Ρ^ρе^ηο апб К.еюй, 1974). Гели инкубировали при 37°С в увлажнённой камере до появления зон протеолиза.

4. Инфузия ΐ-ΡΑ, Ό8ΡΑ внутрь гиппокампа и последующая инъекция каиновой кислоты.

Модель повреждения каиновой кислотой была основана на исследованиях Татка е! а1. (1995). Животных инъецировали внутрибрюшинно (ί.ρ.) атропином (4 мг/кг) и затем анестезировали посредством ί.ρ. инъекции пентобарбитола натрия (70 мг/кг). Потом мышей помещали в стереотаксическую рамку и между лопатками мышам подкожно имплантировали микроосмотический насос (Л1хе1 тобе1 1007Ό, Α1хе1 СΑ. υδΑ), содержащий 100 мкл либо ΡΒδ, либо рекомбинантный ΐ-ΡΑ человека (0,12 мг/мл, 1,85 мкМ) или ΌδΡΑα1 (1,85 мкМ). Насосы соединяли посредством стерильных трубок с канюлей в мозге и вставляли сквозь отверстие, сделанное в черепе трепанационным сверлом, в месте, координаты которого были: брегма - 2,5 мм, медиолатеральная - 0,5 мм и направленная вперёд - 1,6 мм, чтобы ввести жидкость

- 9 013707 близко к середине. Канюлю фиксировали в желаемом положении и с помощью насосов вливали соответствующие растворы со скоростью 0,5 мкл/ч в течение всего 7 дней.

Через два дня после инфузии протеаз мышей вновь анестезировали и их вновь помещали в стереотаксическую рамку. Потом 1,5 нмоль каиновой кислоты (КА) в 0,3 мкл РВЗ вводили посредством инъекции с одной стороны гиппокампа. Координаты были: брегма - 2,5 мм, медиолатеральная - 1,7 мм и направленная вперёд - 1,6 мм. Эксайтотоксин (КА) был доставлен в течение 30 с. После обработки каиновой кислотой инъекционную иглу оставляли при тех же координатах в течение других 2 мин для предотвращения оттока жидкости.

5. Процедура обработки головного мозга.

Через пять дней после инъекции КА, животных анестезировали и посредством перфузии вводили 30 мл РВЗ, затем 70 мл 4% раствора параформальдегида, фиксировали в том же фиксаже, инкубировали в 30% сахарозе в течение 24 ч. Венечные срезы (40 мкм) мозга приготавливали на охлаждающем микротоме и либо прокрашивали контрастным красителем тионином (ВПН, Аи81та11а) , либо обрабатывали для иммуногистохимической проверки, как описано ниже.

6. Количественная оценка потери нервной ткани в гиппокампе.

Количественную оценку потери нервной ткани в СА1-СА3 подполях гиппокампа осуществляли, как описано ранее (Татка е! а1., 1995; Татка е! а1., 1996). Пять последовательных частей дорсального гиппокампа от всех обрабатываемых групп приготавливали, заботясь о том, что части действительно содержали зону СА-инъекции и повреждённую область. Подполя гиппокампа (СА1-СА3) у этих срезов отслеживали по рисункам гиппокампа, сделанным посредством аппарата камера-люцида. Все участки подполей измеряли путём сравнения с 1 мм нормами, локализированными при таком же увеличении. Участки ткани с жизнеспособными пирамидальными нейронами (имеющие нормальную морфологию) и участки ткани, лишённые нейронов (клетки не присутствуют, тионином не прокрашиваются) определяли. Размеры участков, представляющих интактные нейроны, и участков с потерянными нейронами в пределах каждого подполя гиппокампа усредняли на протяжении срезов, и стандартные отклонения определяли.

7. Интрастриарные эксцитотоксичные повреждения, обусловленные введением ΝΜΌΑ с !-РА или ПЗРА или без активатора плазминогена.

Мышей дикого типа (с57/В1аск 6) анестезировали и помещали в стереотаксическую рамку (см. выше). Затем мышей инъецировали с одной стороны посредством 50 нмоль NΜ^Α в левый слой, инъецировали отдельно или в комбинации либо с 46 мкМ τί-РА, либо 46 мкМ ПЗРАа 1. В качестве контроля также вводили отдельно ί-РА и ПЗРА (оба при концентрации 46 мкМ). Координаты инъекции были: брегма - 0,4 мм, медиолатеральная - 2,0 мм и направленная вперёд - 2,5 мм. Растворы (1 мкл общего объёма для всех обработок) подавали в течение периода 5 мин со скоростью 0,2 мкл/мин, и иглу оставляли в том же месте в течение ещё 2 мин после инъецирования, чтобы снизить до минимума отток жидкости. Через 24 ч мышей анестезировали и посредством перфузии вводили 30 мл РВЗ, далее 70 мл 4% раствора формальдегида, фиксировали в том же фиксаже в течение 24 ч с последующей инкубацией в 30% сахарозе в течение 24 ч. Затем мозги разрезали (40 мкм) на охлаждающем микротоме и помещали на покрытые желатином стеклянные предметные стёкла.

8. Количественная оценка объёма повреждения после инъекции NΜ^Α.

Количественную оценку объёма повреждения полосатого тела осуществляли методом, описанным Сайагау е! а1. (2000). Последовательные венечные срезы, перекрывающие повреждённые области, приготовляли. Повреждённые области делали видимыми с помощью метода Сайагау и объём повреждения оценивали количественно путём использования миниатюрного вычислительного устройства с формирователем изображения (МС1Э. 1шадшд Векеатсй 1пс., Вгоск Ишуегайу, Оп!апо. Саиаба).

9. Иммуногистохимия.

Иммуногистохимические исследования проводили обычными способами. Венечные срезы погружали в раствор 3% Н₂О₂ и 10% метанола в течение 5 мин с последующей инкубацией в 5% нормальной козьей сыворотке в течение 60 мин. Срезы инкубировали в течение ночи либо с анти-СРРА антителом (1:1000; Пако, Сатрш!епа, СА, ИЗА) для обнаружения астроцитов, с анти-МАС-1 антителом (1:1000; Зего!ес, Яа1е1дк Ν^ ИЗА) для обнаружения микроглии, либо с поликлональными анти-ЛЗРА антителами (Зсйетшд АС, Ветки). После отмывки срезы инкубировали с соответствующими биотинилированными вторичными антителами (Уес!от ЬаЬотаЮпек, ВшИидаше, СА, ИЗА). Затем следовала конечная инкубация с комплексом авидин/биотин (Уес!от ЬаЬогаФпек, ВшИидаше, СА, ИЗА) в течение 60 мин до визуализации с 3,3'-диаминбебсидином/0,03% Н₂О₂. Затем срезы накладывали на покрытые желатином предметные стёкла, сушили, обезвоживали и покрывали покровными стёклами с раствором полимера нафталина в толуоле.

В. Результаты.

1. Введённый посредством инфузии ί-РА или ПЗРА диспергирует в гиппокампе !-РА-/-мышей и сохраняет протеолитическую активность.

Первоначальные эксперименты были предприняты для того, чтобы подтвердить, что как ПЗРА, так и ί-РА сохраняют их протеолитическую активность в течение периода инфузии 7 дней. К концу этого

- 10 013707 периода аликвоты ΐ-ΡΑ и Ό8ΡΑ (100 нмоль) инкубировали при 37°С и при 30°С в течение 7 дней на водяной бане. Для того чтобы определить протеолитическую активность, 5-кратно последовательно разведённые пробы подвергали электрофорезу 8Ρ8-ΡΑΟΕ при невосстанавливающих условиях и протеолитическую активность оценивали посредством зимографического анализа. Аликвоту 1-ΡΛ и Ό8ΡΑ, которые держали замороженными в течение периода 7 дней, использовали в качестве контроля. Как видно из фиг. 1, существует только минорная потеря активности Ό8ΡΑ или ΐ-ΡΑ при инкубации либо при 30°С, либо при 37°С в течение указанного периода времени.

2. Активность 1-ΡΑ и Ό8ΡΑ восстанавливается в экстрактах гиппокампа, приготовленных из мозга ΐΡΑ-Ζ-мышей после инфузии.

Вначале следовало подтвердить, что введённые посредством инфузии протеазы присутствовали в мозге животных, подвергаемых инфузии, и также сохраняли их протеолитическую активность, находясь в указанном отделе. Для того чтобы адресоваться к этой точке, ΐ-ΡΑ-Ζ-мышам вводили посредством инфузии либо ΐ-ΡΑ, либо Ό8ΡΑ в течение семи дней (см. выше). Затем мышам посредством инфузии вводили ΡΒ8 и мозг удаляли. Ипсилатеральную и контралатеральную области гиппокампа изолировали, а также область мозжечка (взятая как отрицательный контроль). Образцы тканей (20 мкг) подвергали электрофорезу 8Ό8-ΡΑΟΕ и зимографическому анализу согласно описанию в разделе «методы». Как можно видеть из фиг. 2, активности ΐ-ΡΑ и Ό8ΡΑ определялись в ипсилатеральной области гиппокампа, в то время как некоторое количество активности определялось на контралатеральной стороне гиппокампа. Полученные данные указывают на то, что введённые инфузией протеазы не только сохраняют их активность в мозге, но также проникают в область гиппокампа. В качестве контроля, никакой активности не обнаружили в экстракте, приготовленном из мозжечка.

3. Оценка Ό8ΡΑ иммуногистохимическим анализом.

Для того чтобы подтвердить, что Ό8ΡΑ действительно проникает в область гиппокампа, венечные срезы мозга у ΐ-ΡΑ-Ζ-мышей анализировали иммуногистохимически после инфузии Ό8ΡΑ. ΌδΡΑ-антиген обнаруживали в области гиппокампа с наиболее заметным окрашиванием в области участка инфузии. Полученные данные подтверждают, что введённый посредством инфузии Ό8ΡΑ является растворимым и действительно присутствует в гиппокампе.

4. Инфузия Ό8ΡΑ не восстанавливает опосредованную каиновой кислотой дегенерацию нервной ткани ίη νίνο.

ΐ-ΡΑ-Ζ-мыши характеризуются устойчивостью к каиновой кислоте (ΚΑ), опосредующей дегенерацию нервной ткани. Однако инфузия Γί-ΡΑ в гиппокамп полностью восстанавливает чувствительность к ΚΑ-опосредованному повреждению. Для того чтобы определить, можно ли заменить Ό8ΡΑ на ΐ-ΡΑ в данной модели, ΐ-ΡΑ-Ζ-мышам вводили посредством инфузии в гиппокамп либо ΐ-ΡΑ, либо Ό8ΡΑ, используя миниосмотический насос. Для обеих групп 12 мышей тестировали. Через 2 дня животных инъецировали каиновой кислотой и оставляли восстанавливаться. Через 5 дней животных убивали и мозг удаляли и обрабатывали (см. выше). В качестве контроля ΐ-ΡΑ-Ζ-мышам также вводили посредством инфузии ΡΒ8 до обработки ΚΑ (N=3).

Венечные срезы мозга приготавливали и нейроны обнаруживали окрашиванием N1881. Как показано на фиг. 4, 1-РА-/-мыши. которым посредством инфузии вводили ΡΒ8, оказались устойчивыми к последующему введению ΚΑ. Однако инфузия рекомбинантным ΐ-ΡΑ восстановила чувствительность к обработке посредством ΚΑ. В противоположность этому, инфузия такой же концентрации Ό8ΡΑ в область гиппокампа не изменила чувствительность животных к ΚΑ.

Количественный анализ результатов был основан на данных, полученных от 12 мышей в каждой группе. У 2 из 12 мышей, которым вводили посредством инфузии Ό8ΡΑ, наблюдали незначительную степень дегенерации нервной ткани. Причина такого результата неясна и, возможно, не связана с присутствием Ό8ΡΑ. Объединённые данные учитывают указанный минорный эффект, который наблюдали в случае этих 2 животных. Все 12 мышей, обработанных ΐ-ΡΑ, оказались чувствительными к обработке ΚΑ. Полученные результаты показывают, что в случае инфузии ΐ-ΡΑ или Ό8ΡΑα1 в эквимолярных концентрациях только введение ΐ-ΡΑ привело к восстановлению восприимчивости к дегенерации нервной ткани, вызванной ΚΑ.

5. Инфузия Ό8ΡΑ не приводит к активации микроглии.

Восстановление у ΐ-ΡΑ-Ζ-мышей восприимчивости к ΚΑ, вызванное инфузией ΐ-ΡΑ, также приводит к активации микроглии (Ρο§ονο с1 а1., 1999). Для того чтобы оценить степень активации микроглии после инфузии ΐ-ΡΑ или Ό8ΡΑ и последующей обработки посредством ΚΑ, венечные срезы мозга мышей подвергали иммуногистохимическому окрашиванию для активированных клеток микроглии, используя Мас-1 антитело. Восстановление восприимчивости к ΚΑ после инфузии ΐ-ΡΑ привело к чёткому увеличению Мас-1 положительных клеток. Такой результат не наблюдали у мышей, которым вводили Ό8ΡΑ посредством инфузии. Следовательно, присутствие Ό8ΡΑ не приводит к активации клеток микроглии после обработки ΚΑ.

6. Титрование Ό8ΡΑ и ΐ-ΡΑ в области гиппокампа мышей.

Концентрация ΐ-ΡΑ, применяемая для инфузии, основана на концентрации, описанной Т81гка с1 а1. (1995) (100 мкл 0,12 мг/мл [1,85 мкМ]). Эксперименты, в которых повреждение ткани было вызвано об

- 11 013707 работкой КА, повторяли с использованием концентрации 1-РЛ в 10 раз ниже (0,185 мкМ) и концентрации Ю8РА в 10 раз выше (18,5 мкМ). Низкая концентрация 1-РЛ была способна восстановить чувствительность к обработке КА (п=3). Интерес привлекли данные, что инфузия Ю8РЛ при повышенной в 10 раз концентрации вызвала незначительную потерю нейронов после обработки КА. Полученные данные показывают, что Ю8РА не приводит к повышению чувствительности к КА.

7. Действие ί-РА и Ю8РА на ИМЮА-зависимую дегенерацию нервной ткани у мышей дикого типа.

Действие ί-РА и Ю8РА также проверяли на модели дегенерации нервной ткани у мышей дикого типа. Инъекция ί-РА в полосатое тело данных мышей, вероятно, привела к усилению нейродегенеративных эффектов, вызванных аналогом глутамата ИМЮА (№со1е с1 а1., 2001).

ИМЮА вводили в стриарную область мозга мышей дикого типа в присутствии ί-РА или Ю8РА (каждый 46 мкМ) в общем объёме 1 мкл. После 24 ч мозг удаляли и размер повреждений оценивали количественно согласно методу Са11а\\'ау (Са11а\\'ау с1 а1., 2000) (см. выше). Как видно из фиг. 7, инъекция NМ^А только вызвала воспроизводимое повреждение у всех обработанных мышей (N=4). В случаях, когда ί-РА и Ю8РА применяли вместе, размер повреждений увеличивался приблизительно на 50% (Р<0,01, п=4). В противоположность этому, коинъекция NМ^А и такой же концентрации Ю8РА не привела к увеличению размера повреждения по сравнению с NМ^А только.

Инъекция ί-РА или Ю8РА только не привела к определяемой дегенерации нервной ткани. Отсутствие эффекта при введении ί-РА только находится в соответствии с результатами, полученными Νίοοίο с1 а1. (2001). Полученные данные показывают, что присутствие Ю8РА не повышает дегенерацию нервной ткани даже во время нейродегенеративного события.

Для того чтобы подтвердить, что инъекция Ю8РА действительно распространяется в область гиппокампа, иммуногистохимический анализ осуществляли на венечных срезах путём использования антитела к Ю8РА. Проверка показала, что Ю8РА действительно проникает в стриарную область.

Кинетический анализ активации плазминогена с помощью непрямого хромогенного теста.

Непрямые хромогенные тесты активности ί-РА осуществляли с помощью субстрата Ьу§плазминогена (Атепсап Ю1адпо5Йса) и спектроцима РЬ (Атепсап Ю1адпо5Йса) согласно Ма615оп Е.Ь., Со1б5тЦ11 Е.Ь, Оегатб Β.Ό., Ое1Ыпд М.-Ь, ЗатЬгоок ЕЕ. (1989) №1Шге 339 721-724; Ма615оп Е.Ь.О., Оо1бδΐηίΐΐι Е.Ь, Ое1Ыпд М.Е, ЗатЬгоок ЕЕ. апб ВаккеЬЮиЬу В.8. (1990) Ргос. №И. Асаб. 8сЕ И.8.А 87, 35303533, а также Мабщоп Е.Ь., Со1б5тЦ11 Е.Ь, ОеШтд М.-Е, ЗатЬгоок ЕЕ. и Оегатб ΚΌ. (1990) 1. Вю1. Сйет. 265, 21423-21426. Тесты выполняли как в присутствии, так и в отсутствие кофактора ЮЕ8АЕ1В (Атепсап Ю1адпо8бса). ЮЕЗАЕЕВ представляет собой препарат растворимых мономеров фибрина, полученных путём расщепления высокоочищенного фибриногена человека протеазой батроксобин. Батроксобин расщепляет связь Атд¹⁶-О1у¹⁷ в Аа-цепи фибриногена и, тем самым, высвобождает фибринопептид А. Полученный дес-АА-фибриноген, представляющий собой мономеры фибрина 1, является растворимым в отсутствие пептида О1у-Рго-Агд-Рто. Концентрация Ьук-плазминогена варьировала от 0,0125 до 0,2 мкМ в присутствии ЮЕЗАИВ и от 0,9 до 16 мкМ в отсутствие кофактора.

Непрямые хромогенные тесты в присутствии различных стимулов.

Непрямые хромогенные стандартные тесты выполняли согласно публикациям, цитированным выше. Пробы общего объёма 100 мкл, содержащие 0,25-1 нг фермента, 0,2 мкМ Ьук-плазминогена и 0,62 мМ спектроцима РЬ, использовали. Тесты выполняли либо в присутствии буфера, 25 мкг/мл ЮЕ8АЕ1В, 100 мкг/мл бромциановых фрагментов фибриногена (Атепсап Ю1адпо8бса) или 100 мкг/мл стимулятора пептида Р368, состоящего из 13 аминокислот. Анализы проводили в титрационных микропланшетах и оптическую плотность определяли при длине волны 405 нм каждые 30 с в течение 1 ч в Мо1еси1аг Юеуюе5 Тйегтотах. Температура реакции была 37°С.

Claims (3)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение активирующего плазминоген фактора для производства лекарственного средства для лечения инсульта в течение по меньшей мере 3 ч после его начала, где указанный активирующий плазминоген фактор не оказывает нейродегенеративного эффекта ί-РА немутантного типа по данным сравнительных экспериментов на модели повреждения каиновой кислотой и модели для проверки поражения полосатого тела, индуцированного NМ^А.
2. 2. Применение по п.1, где нейродегенеративный эффект активирующего плазминоген фактора по меньшей мере в 100 раз ниже эффекта ί-РА дикого типа.
3. 3. Фармацевтическая композиция для лечения инсульта в течение по меньшей мере 3 ч после его начала, содержащая активирующий плазминоген фактор, где активирующий плазминоген фактор не оказывает нейродегенеративного эффекта ί-РА немутантного типа по данным сравнительных экспериментов на модели повреждения каиновой кислотой и модели для проверки поражения полосатого тела, индуцированного NМ^Л.

   - 12 013707