PT1308166E - Factores activadores do plasminogénio não neurotóxicos para o tratamento de acidentes vasculares cerebrais - Google Patents

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DESCRIÇÃO "FACTORES ACTIVADORES DO PLASMINOGÉNIO NÃO NEUROTÓXICOS PARA O TRATAMENTO DE ACIDENTES VASCULARES CEREBRAIS" A invenção refere-se a uma utilização terapêutica de activadores do plasminogénio não neurotóxicos, em particular da saliva de Desmodus rotundus (DSPA), para o tratamento de acidente vascular cerebral.

Sob a designação "acidente vascular cerebral" reúnem-se diferentes quadros de doença, que se assemelham na sua sintometologia clinica. A partir da respectiva patogénese é possivel uma primeira diferenciação destes quadros de doença nos assim designados ataques isquémicos e ataques hemorrágicos.

No caso dos ataques isquémicos (isquémia) trata-se de uma redução ou interrupção da circulação sanguínea do cérebro em consequência de falta de fornecimento de sangue arterial. Esta é frequentemente provocada por uma trombose de um vaso arteriosclerótico estenosado, mas também por embolias arterioarteriais ou cardiais.

Pelo contrário, os ataques hemorrágicos derivam, entre outros, de uma perfuração das artérias que abastecem o cérebro, danificadas por hipertonia arterial. De todos os ataques cerebrais apenas somente cerca de 20% são provocados por esta forma de hemorragia, de modo que cabe aos acidentes vasculares cerebrais provocados por trombose muito maior importância. 1 A isquemia de tecidos neuronais está particularmente acompanhada - em comparação com isquemias de outros tecidos - de necrose das células afectadas. A elevada incidência de necrose pode ser explicada, de acordo com novos entendimentos, pelo fenómeno da assim desiqnada excitotoxicidade, em que se trata de uma cascata complexa de uma multiplicidade de passos reaccionais. De acordo com isso, esta é desencadeada por os neurónios isquémicos, afectados por uma deficiência de oxigénio, perderem ATP rapidamente e despolarizarem. Isto conduz a uma libertação pós-sináptica reforçada do transmissor neuronal glutamato, que por seu lado activa receptores do glutamato ligados à membrana, que regulam canais de catiões. No entanto, como consequência da distribuição aumentada de glutamato, os receptores de glutamato são sobre-activados.

Os receptores de glutamato regulam por seu lado canais de catiões dependentes da voltagem que - no caso da ligação de glutamato ao seu receptor - são abertos. Com isso estabelece-se uma afluência de Na+ e de Ca2+ na célula que conduz a um distúrbio massivo do metabolismo celular dependente de Ca2+ -incluindo o metabolismo energético. Neste caso, a activação das enzimas catabólicas dependentes de Ca2+, em particular, pode ser responsável pela morte celular que ocorre subsequentemente (Lee, Jin-Mo et al., "The changing landscape of ischaemic brain injury mechanisms"; Dennis W. Zhol "Glutamat neurotoxicity and diseases of the nervous System").

Mesmo que o mecanismo do glutamato que medeia a neurotoxicidade não seja à data ainda percebido em detalhe, parece persistir porém a concordância de que este fenómeno contribui numa grande extensão para a morte celular neuronal após uma isquémia cerebral (Jin-Mo Lee, et al.). 2

No caso da terapia da isquémia cerebral aguda está antes de tudo em primeiro plano, a par da salvaguarda de funções vitais e da estabilização de parâmetros fisiológicos, o esforço de uma reabertura do vaso fechado. Este objectivo é prosseguido com diferentes meios. A reabertura puramente mecânica não alcançou até agora quaisquer resultados satisfatórios, como por exemplo o PTCA no caso de enfarte cardíaco. Apenas com uma fibrinólise bem sucedida pôde até agora ser mostrada uma melhoria suficiente do estado para os doentes. Isto pode suceder por aplicação local por meio de catéter (PROCAT, um estudo com pró-urocinase), no entanto, apesar dos primeiros resultados positivos, este processo não conduziu até agora ao licenciamento de uma substância farmacêutica. A fibrinólise própria do corpo baseia-se na actividade proteolítica da protease de serina plasmina, que provém de uma catálise (activação) a partir do precursor inactivo plasminogénio. A activação natural do plasminogénio efectua-se pelos activadores do plasminogénio próprios do corpo u-PA (activador do plasminogénio do tipo urocinase) e t-PA (Activador do Plasminogénio do Tecido) . 0 último - em oposição a u-PA -forma em conjunto com fibrina e plasminogénio um assim designado complexo activador. A actividade catalítica do t-PA é por conseguinte dependente da fibrina e chega a um aumento de cerca de 550 vezes na presença de fibrina. A par da fibrina, também o fibrinogénio pode estimular a catálise mediada por t-PA de plasmina a plasminogénio - no entanto numa extensão muito mais pequena. Assim, a actividade t-PA na presença de fibrinogénio chega apenas a um aumento de 25 vezes. Os produtos de cisão da fibrina (produtos de degradação da fibrina (FDP)) estimulam por seu lado igualmente a actividade t-PA. 3

As primeiras tentativas do tratamento trombolitico do acidente vascular cerebral agudo remontam já aos anos de 1950. No entanto, apenas a partir de 1995 é que se realizaram as primeiras pesquisas clinicas extensas com estreptocinase, um fibrinolitico de estreptococos beta-hemolisantes. A estreptocinase forma um complexo com o plasminogénio que está em condições de converter outras moléculas de plasminogénio em plasmina. A terapia com estreptocinase está no entanto associada com desvantagens substanciais, uma vez que a estreptocinase como protease bacteriana pode desencadear reacções alérgicas no corpo. Também pode haver uma assim designada resistência à estreptocinase no caso de uma infecção anterior de estreptococos com formação correspondente de anticorpos, que dificultam uma terapia. Além disso, estudos clínicos na Europa (Multicenter Acute Stroke Trial of Europe (MAST-E), Multicenter Acute Stroke Trial of Italy (MAST-I)) e Austrália (Australian Streptokinase Trial (AST)) apontaram para um risco de mortalidade de tal forma aumentado e o perigo considerável de hemorragias intracerebrais (intracerebral hemorrhage, ICH) após o tratamento dos doentes com estreptocinase, que estes estudos tiveram mesmo que ser interrompidos precocemente.

Numa indicação terapêutica alternativa, é aplicada a urocinase - igualmente um fibrinolitico "clássico" - que, ao contrário da estreptocinase, não apresenta quaisquer propriedades antigénicas, uma vez que neste caso se trata de uma enzima própria do corpo que está presente em inúmeros tecidos. Ela representa um activador do plasminogénio independente de cofactor. A urocinase é produzida em culturas de células renais. 4

Existe extenso conhecimento na área da trombólise terapêutica do activador do plasminogénio do tipo tecidular - o assim designado rt-PA - (ver documento EP 0093619, patente US 4766075) que é produzido em células recombinantes de hamster. Nos anos 1990 foram realizados em todo o mundo uma série de estudos clínicos com t-PA - a par da indicação principal de enfarte agudo do miocárdio - com resultados em parte ainda incompreendidos e discrepantes. Assim, no assim designado European Acute Stroke Trial (ECASS), foram em primeiro lugar tratados doentes com rt-PA por via intravenosa no intervalo de tempo de seis horas após o estabelecimento dos sintomas do acidente vascular cerebral, e após 90 dias foram pesquisadas as taxas de mortalidade bem como o índice de Barthel, como medida de invalidez ou de viabilidade autónoma dos doentes. Neste caso não resultou qualquer melhoria significativa da viabilidade, mas porém um aumento da mortalidade - embora não significativo. Isto permitiu a conclusão de que possivelmente poderia ser vantajoso um tratamento trombolítico com rt-PA de doentes individuais pesquisados de acordo com a sua respectiva história de doença específica, imediatamente após o início do acidente vascular cerebral. Uma utilização geral de rt-PA no intervalo de tempo estudado de seis horas após o início do acidente vascular cerebral foi no entanto desaconselhada devido ao risco aumentado observado de uma hemorragia intracerebral (ICH) apenas após poucas horas depois do estabelecimento do acidente vascular cerebral (de acordo com C. Lewandowski C e William Barsan, 2001: Treatment of Acute Stroke; em: Annals of Emergency Medicine 37: 2; pág.202 e seguintes). O tratamento trombolítico do acidente vascular cerebral foi mais tarde igualmente objecto de um estudo clínico do National Institute of Neurologic Disorder and Stroke (assim designado 5 NINDS rtPA Stroke Trial) nos EUA. No entanto, neste caso estava em primeiro plano o estudo do efeito de um tratamento intravenoso de rt-PA no intervalo de tempo de apenas três horas após o inicio dos sintomas sobre o estado de saúde dos doentes após três meses. Apesar dos autores também aqui terem comprovado um risco aumentado para ICH, o tratamento com rt-PA dentro deste periodo limitado de tempo de três horas é recomendado devido aos efeitos positivos deste tratamento reconhecidos igualmente pelo estudo sobre a viabilidade dos doentes.

Em dois estudos adicionais (ECASS II Trial; Alteplase Thrombolysis for Acute Noninterventional Therapy in Ischemic Stroke (ATLANTIS)) foi estudado se estes testemunhos positivos sobre o efeito do tratamento com rt-PA no intervalo de três horas após o inicio do acidente vascular cerebral se deixavam comprovar também para um tratamento num periodo de tempo de seis horas. Esta pergunta não pôde no entanto ser respondida de forma positiva, uma vez que com um tratamento neste periodo de tempo, a par do risco elevado para ICH, não pôde ser observada qualquer melhoria dos sintomas clínicos ou uma diminuição da mortalidade.

Estes resultados parcialmente discrepantes conduziram a um grande cuidado na utilização de rt-PA. Assim, já em 1996, uma publicação da American Heart Association constatava que entre os médicos dominava um acentuado cepticismo relativamente ao tratamento trombolítico do acidente vascular cerebral, que não subsistia em relação à terapia do enfarte do miocárdio com fibrinolíticos (van Gijn J, MD, FRCP, 1996-Circulation 1996, 93: 1616-1617) .

Uma razão deste cepticismo encontra-se numa síntese publicada pela primeira vez em 1997 e actualizada em Março de 6 2001 de todos os "Stroke Trials". De acordo com essa síntese, todos os tratamentos com tromboliticos (urocinase, estreptocinase, rt-PA ou urocinase recombinante) conduziam, em particular devido à ICH, a uma mortalidade significativamente aumentada no intervalo dos primeiros dez dias após o acidente vascular cerebral, enquanto no caso de um tratamento no intervalo de tempo de 6 horas o número total de doentes mortos ou incapacitados ficou reduzido. Por conseguinte, é desaconselhada uma utilização alargada de tromboliticos para um tratamento de acidente vascular cerebral.

Estes resultados já tinham anteriormente levado outros autores à afirmação antes sarcástica de que doentes de acidente vascular cerebral tinham a escolha de, dai em diante, morrer ou sobreviver incapacitados (SCRIP 1997: 2265, 26). Não obstante, a terapia com rt-PA representa à data o único método de tratamento da isquémia cerebral aguda aprovado nos EUA pela Food and Drug Administration (FDA) . Esta está, no entanto, limitada a uma aplicação do rt-PA no intervalo de três horas após o inicio do acidente vascular cerebral. A aprovação do rt-PA efectuou-se em 1996. Imediatamente antes, nomeadamente no ano de 1995, foram conhecidas as primeiras indicações sobre efeitos secundários prejudiciais do t-PA, que fornecem uma base de explicação para os efeitos dramáticos do t-PA no caso do tratamento de acidente vascular cerebral fora do período de tempo de tratamento de 3 horas. De acordo com isso, células microgliais e células neuronais do hipocampo produzem t-PA próprio do corpo, que participa na excitotoxicidade mediada pelo glutamato. Esta conclusão teve origem numa comparação de ratinhos deficientes em t-PA e 7 ratinhos de tipo selvagem, aos quais foram injectados respectivamente agonistas de glutamato no hipocampo. Neste caso, os ratinhos deficientes em t-PA mostraram uma resistência claramente aumentada contra glutamato aplicado externamente (intratecalmente) (Tsirka SE et al., Nature, vol. 377, 1995, "Exzitoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator") . Estes resultados foram confirmados no ano de 1998, quando Wang et al. puderam observar quase uma duplicação do tecido neuronal necrótico em ratinhos deficientes em t-PA, pela injecção intravenosa de t-PA. Em oposição, este efeito negativo do t-PA externo encontrava-se em ratinhos selvagens em apenas cerca de 33% (Wang et al., 1998, Nature, "Tissue plasminogen activator (t-PA) increases neuronal damage after focal cerebral ischemia in wild type and t-PA deficient mice".)

Nicole et al. publicaram no início de 2001 resultados adicionais sobre a estimulação da excitotoxicidade por t-PA (Nicole O; Docagne F Ali C; Margaill I; Carmeliet P; MacKenzie ET;, Vivien D e Buisson A, 2001: The proteolytic activity of tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptor-mediated signaling; em: Nat Med 7, 59-64) . Eles puderam comprovar que t-PA libertado de neurónios corticais despolarizados interage com a assim designada sub unidade NRl do receptor do glutamato do tipo NMDA e a cliva. Esta modificação conduz a um aumento da actividade do receptor, que por seu lado é responsável por uma lesão aumentada dos tecidos após a aplicação do agonista de glutamato NMDA, através de uma excitoxicidade induzida. Com isso, o t-PA actua por via neurotóxica através da activação do receptor de glutamato do tipo NMDA.

De acordo com uma tentativa de explicação adicional, a neurotoxicidade do t-PA é devida indirectamente à activação da plasmina a partir do plasminogénio. 0 próprio efector da neurotoxicidade é por conseguinte, de acordo com este modelo, a plasmina (Chen ZL e Strickland S, 1997: Neuronal Death in the hippocampus is promoted by plasmin-catalysed degradation of laminin. Cell: 91, 917-925). A fig.9 mostra uma representação resumida dos efeitos neurotóxicos do t-PA dependentes do tempo. Ai, é além disso clara a toxicidade aumentada do t-PA recombinante em comparação com o t-PA endógeno, que presumivelmente é devida ao rt-PA entrar no tecido em concentrações mais elevadas.

Que, apesar destas indicações para os efeitos secundários neurotóxicos do t-PA e apesar do aumento de mortalidade comprovado por t-PA, se tenha efectuado todavia um licenciamento do medicamento pela FDA, apenas pode ser explicado pela falta de alternativas não perigosas e efectivas - e uma análise de custo benefício muito pragmática . Persiste no entanto como antes a necessidade de terapias mais seguras, em que no caso do desenvolvimento de novos trombolíticos - desde que não se prescinda completamente da trombólise o problema da neurotoxicidade tenha que ser tomado em consideração (segundo por ex. Wang et al. citado no local indicado; Lewandowski e Barson 2001 citado no local indicado).

Por este motivo não se realizaram pesquisas adicionais de trombolíticos conhecidos incluindo o dspa (activador do plasminogénio de Desmodus rotundus) para o desenvolvimento de um novo agente terapêutico para o acidente vascular cerebral, apesar de em princípio a totalidade dos trombolíticos puderem 9 ser adequados e, por exemplo, no caso do DSPA já ter sido indicada numa primeira publicação a sua possível adequabilidade para este domínio de indicação (Medan P; Tatlisumak T; Takano K; Carano RAD; Hadley SJ; Fisher M: Thrombolysis with recombinant Desmodus saliva plasminogen activator (rDSPA) in a rat embolic stroke model; em: Cerebrovasc Dis 1996: 6; 175-194 (4th International Symposium on Thrombolic Therapy in Acute Ischemic Stroke) . Exactamente no caso de DSPA trata-se no entanto de um activador do plasminogénio com elevada homologia (semelhança) a t-PA, de modo que - simultaneamente com a desilusão sobre os efeitos secundários neurotóxicos do t-PA - também no caso do DSPA não foram colocadas expectativas adicionais.

Em vez disso, recentemente foi seguida a estratégia, entre outras, de melhorar o tratamento trombolítico actual de acidente vascular cerebral com os trombolíticos conhecidos, que introduzem as substâncias não mais por via intravenosa, mas antes por via intra-arterial através de um catéter directamente no trombo intravascular. Existem experiências iniciais relativas a isso com a urocinase produzida por via recombinante. Com isso pode possivelmente ser diminuída a dose necessária para a trombólise e com isso serem reduzidos uma parte dos efeitos secundários. Esta forma de aplicação requer no entanto um esforço técnico elevado e, por conseguinte, não está disponível de forma generalizada. Além disso, ela necessita de um determinado tempo para a preparação minuciosa do doente, que nem sempre se encontra disponível e representa um risco adicional.

Além disso, os esforços actuais são direccionados para anticoagulantes como heparina, aspirina ou ancord, a substância activa do veneno da víbora da Malásia. Dois estudos clínicos, entre outros, também direccionados para a pesquisa dos efeitos 10 de heparina (International Stroke Trial (IST) e Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Treatment (TOAST)) não apontam no entanto para uma melhoria significativa da mortalidade e para um impedimento de um novo acidente vascular cerebral.

Um método de tratamento novo adicional não assenta nem no trombo, nem na liquefacção do sangue ou na anticoagulação, mas antes examina o aumento da vitalidade das células lesadas pela interrupção do fornecimento de sangue (documentos WO 01/51613 Al e WO 01/51614 Al). Para isso são aplicados antibióticos do grupo das quinonas, aminoglicósidos ou cloranfenicol. Por uma razão semelhante é, além disso, proposto iniciar com a administração de citicolina imediatamente após o acidente vascular cerebral, que no corpo é clivado a citidina e colina. Estes produtos de cisão são componentes da membrana de células neuronais e podem assim apoiar a regeneração do tecido lesado (patente US 5827832) .

Esforços mais recentes na pesquisa de acordo com métodos de tratamento seguros baseiam-se nos novos conhecimentos sobre o assunto, de que uma parte das consequências fatais do acidente vascular cerebral apenas se deve indirectamente à interrupção do fornecimento sanguíneo, no entanto deve-se directamente à excitotoxicidade ou neurotoxicidade com participação do receptor de glutamato sobre-estimulado, que por outro lado é reforçada em particular também pelo t-PA (ver acima). Uma indicação para a redução desta excitotoxicidade é por conseguinte a aplicação dos assim designados neuroprotectores. Estes podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com fibrinolíticos, para assim minimizarem o seu efeito neurotóxico. Eles podem neste caso conduzir a um enfraquecimento da excitotoxicidade, quer directamente por exemplo como antagonistas do receptor de 11 glutamato, ou indirectamente através do bloqueamento de canais de sódio ou cálcio dependentes de voltagem (Jin-Mo Lee et al. citado no local indicado).

Uma inibição competitiva (antagonização) do receptor de glutamato do tipo NMDA é neste caso por exemplo possivel com 2-amino-5-fosfonovalerato (APV) ou 2-amino-5-fosfono-heptanoato (APH). Uma inibição não competitiva pode ser alcançada por exemplo por substâncias que se ligam ao lado fenciclidina dos canais, como fenciclidina, MK-801, dextrorfano ou cetamina.

Até ao presente, os tratamentos com neuroprotectores não trouxeram ainda no entanto o êxito desejado, possivelmente porque eles têm que ser combinados com tromboliticos para exibirem o seu efeito protector. Isto serve na mesma escala para as outras substâncias activas (ver fig. 10).

Mesmo com uma combinação de t-PA e um neuroprotector possibilita-se no entanto quanto muito apenas um êxito no sentido de uma limitação dos danos. As próprias desvantagens da neurotoxicidade do fibrinolitico utilizado não são com isso no entanto evitadas. A presente invenção tem assim por base o objectivo de disponibilizar uma nova preparação terapêutica para o tratamento do acidente vascular cerebral em humanos.

Este objectivo é solucionado pela utilização de mutantes de um factor activador do plasminogénio, de acordo com a reivindicação principal, para o tratamento terapêutico de acidente vascular cerebral. Utilizações vantajosas adicionais 12 são respectivamente objecto das subsequentes reivindicações dependentes. 0 cerne da invenção é o de empregar um activador do plasminogénio após o decurso de 3 horas desde o início do acidente vascular cerebral para o tratamento do acidente vascular cerebral, cuja especificidade para a fibrina em comparação com o tipo selvagem de t-PA é aumentada, sem ser utilizado um agente terapêutico adicional. A utilização de acordo com a invenção deste activador do plasminogénio baseia-se no conhecimento de que a neurotoxicidade do activador do plasminogénio tecidular (t-PA) se deve a que, devido à destruição do tecido no cérebro provocada pelo acidente vascular cerebral, a barreira de sangue - cérebro é danificada ou destruída, e com isso o fibrinogénio que circula no sangue pode entrar no tecido neuronal do cérebro. No cérebro, ele activa o t-PA que - indirectamente pela activação do receptor de glutamato ou pela activação do plasminogénio - conduz a danos adicionais no tecido. Para evitar este efeito é então empregue um activador do plasminogénio de acordo com a invenção, que mostra uma selectividade aumentada para a fibrina e - em argumento inverso - uma capacidade de activação diminuída pelo fibrinogénio. Daí resulta que o activador do plasminogénio de acordo com a invenção, no caso da passagem de fibrinogénio do sangue para o tecido neuronal como consequência da barreira sangue - cérebro danificada, não é activado - ou é activado numa escala claramente diminuída em comparação com o t-PA uma vez que o seu activador fibrina, devido ao seu tamanho, não pode entrar no tecido neuronal. Os activadores do plasminogénio de acordo com a invenção são com isso não neurotóxicos. 13

Numa forma de realização preferida são empregues activadores do plasminogénio não neurotóxicos, que apresentam pelo menos um elemento de uma assim designada tríade de zimogénio. É conhecida uma tríade comparável do centro catalítico de proteases de serina da família da quimotripsina, que se compõe dos três aminoácidos que interagem, aspartato 194, histidina 40 e serina 32. No entanto, esta tríade não existe no caso do t-PA pertencente à família das proteases de serina do género de quimotripsina. No entanto é conhecido que a mutagénese dirigida do t-PA nativo conduz à introdução de pelo menos um destes aminoácidos em posições adequadas para uma diminuição da actividade da proenzima (t-PA de uma cadeia) e um aumento da actividade da enzima madura (t-PA de duas cadeias) na presença de fibrina. Com isso, a introdução de pelo menos um aminoácido da tríade - ou de aminoácidos que assumam a função correspondente na tríade - conduz a um aumento da zimogenicidade do t-PA (razão da actividade da enzima madura para a actividade da proenzima) no caso de aumento claro da especificidade para a fibrina por interacção conformacional entre os resíduos de aminoácidos introduzidos e/ou resíduos de aminoácidos da sequência de tipo selvagem.

Assim é conhecido que a mutagénese do t-PA nativo para a substituição da Phe305 por His (F305H), bem como da Ala 292 por Ser (A292S) conduz a um aumento de 20 vezes da zimogenicidade, enquanto no entanto já no caso da variante F305H sozinha é produzido um acréscimo de 5 vezes (EL Madison, Kobe A, Gething M-J; Sambrook JF, Goldsmith EJ 1993: Converting Tissue Plasminogen Activator to a Zymogen: A regulatory Triad of Asp-His-Ser, Science: 262, 419-421). Na presença de fibrina, estes mutantes do t-PA mostram um acréscimo de actividade em 30.000 vezes (F305H) ou em 130.000 vezes (F305H, A292S). Ambos os 14 mutantes apresentam adicionalmente uma substituição da Arg275 por R275E para evitar a cisão por plasmina do t-PA de uma cadeia para a forma de duas cadeias no local de cisão Aug275-Ile276. Sozinho, este mutante R275E aumenta a especificidade para a fibrina do t-PA em 6.900 vezes (K Tachias, Madison EL 1995: Variants of Tissue-type Plasminogen Activator which Display Substantially Enhanced Stimulation by Fibrin, em: Journal of Bíological Chemistry 270, 31: 18319-18322).

As posições 305 e 292 do t-PA são homólogas às posições His40 e Ser32 da triade conhecida das proteases de serina. Pela substituição correspondente com histidina ou serina, estes aminoácidos podem interagir com o aspartato477 do t-PA, de modo a que a tríade conhecida possa ser formada de forma funcional nos mutantes do t-PA (Madison et al. 1993).

De acordo com a invenção, estes mutantes do t-PA podem ser empregues para o tratamento do acidente vascular cerebral, uma vez que devido à sua elevada especificidade para a fibrina não apresentam qualquer neurotoxicidade, ou apenas neurotoxicidade claramente diminuída - em comparação com o tipo selvagem de t-PA. Para finalidades da publicação dos mutantes t-PA referidos F305H; F305H, A292S sozinhos ou em combinação com R275E, são tomadas integralmente como referência as publicações de Madison et al. 1993, bem como de Tachias e Madison 1995. O aumento da especificidade para a fibrina de activadores do plasminogénio é em alternativa igualmente possível através de uma mutação pontual do Aspl94 (ou de um aspartato em posição homóloga). Os activadores do plasminogénio pertencem ao grupo das proteases de serina da família da quimotripsina e apresentam consentaneamente o aminoácido conservado Aspl94, que é 15 responsável pela estabilidade da conformação cataliticamente activa das proteases maduras. É conhecido que o Aspl94 nos zimogénios das proteases de serina interage com His40. Pela cisão activadora do zimogénio, estas interacções tornam-se impossíveis, e a cadeia lateral do Aspl94 roda em cerca de 170°, para em seguida formar uma nova ponte salina com a Ilel6. Esta ponte salina participa na estabilidade do bolso oxianiónico da triade catalítica da protease de serina madura. Ela também se apresenta em t-PA.

Uma mutação pontual do Aspl94 torna em primeiro lugar impossível a formação ou estabilidade da conformação catalítica das proteases de serina. Não obstante, os activadores do plasminogénio mutados mostram, na presença do seu cofactor fibrina - exactamente também em comparação com a forma madura do tipo selvagem - um claro aumento de actividade que só pode ser explicado por as interacções com fibrina permitirem uma alteração conformacional que possibilite uma actividade catalítica (L Strandberg, Madison EL, 1995: Variants of Tissue-type Plasminogen Activator with Substantially Enhanced Response and Selectivity towards Fibrin Co-factors, em: Journal of Biological Chemistry 270, 40: 2344-2349). Com isso, os mutantes Aspl94 dos activadores do plasminogénio mostram um elevado aumento de actividade na presença de fibrina, o que possibilita a sua utilização de acordo com a invenção.

Numa forma de realização preferida é empregue t-PA de acordo com a invenção cujo Aspl94 é substituído por glutamato (D194E) ou asparagina (D194N). Com isso reduz-se a actividade de t-PA na ausência de fibrina no factor de 1 - 2000, enquanto, pelo contrário, na presença de fibrina pode ser alcançado um aumento de actividade no factor de 498.000 até 1.050.000. Estes 16 mutantes podem além disso conter uma substituição da Argl5 para R15E, que impede a cisão por plasmina do t-PA de uma cadeia para o t-PA de duas cadeias na ligação peptidica Argl5 - Ilel6. Através desta mutação sozinha, a activação do t-PA por fibrina aumenta já no factor 12.000. Para finalidades da revelação das mutações nas posições 194, bem como 15 do t-PA, toma-se como referência na integra a publicação de Strandberg e Madison 1995.

Um aumento da dependência da fibrina dos activadores do plasminogénio pode além disso ser alcançado pela introdução de mutações pontuais na assim designada "curva de autólise". Esta secção de aminoácidos é conhecida da tripsina; ela apresenta-se no entanto como secção homóloga também em proteases de serina e é caracterizada em particular por três aminoácidos hidrofóbicos (Leu, Pro e Phe). A curva de autólise em activadores do plasminogénio é responsável pela interacção com plasminogénio. Mutações pontuais nesta área podem conduzir a que as interacções proteina/proteina entre plasminogénio e activador do plasminogénio não possam mais ser formadas de modo funcional. No entanto, estas mutações apenas são funcionalmente relevantes na ausência de fibrina. Na presença de fibrina elas são pelo contrário responsáveis por um aumento da actividade dos activadores do plasminogénio (K Song-Hua, Tachias K, Lamba D, Bode W, Madison EL, 1997: Identification of a Hydrophobic exocite on Tissue Type Plasminogen Activator That Modulates Specificity for Plasminogen, em: Journal of Biological Chemistry 272; 3, 1811-1816) .

Numa forma de realização preferida é empregue um t-PA com mutações pontuais nas posições 420 - 423. Caso estes resíduos sejam substituídos por mutações pontuais específicas, aumenta a dependência da fibrina do t-PA num factor de até 61.000 (K Song- 17

Hua et al.). Song-Hua et al. pesquisaram as mutações pontuais L420A, L420E, S421G, S421E, P422A, P422G, P422E, F423A e F423E. A publicação é com isso aqui tomada como referência na integra para a utilização de acordo com a invenção.

Numa forma de realização vantajosa adicional é utilizado um activador do plasminogénio tecidular modificado com uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ. ID N°. 1 (fig.13). Este t-PA modificado distingue-se do t-PA de tipo selvagem pela troca do aminoácido hidrofóbico nas posições 420 - 423 na curva de autólise, que são ocupadas como se segue: His420, Asp421, Ala422 e Cys423. Este t-PA apresenta, de um modo preferido, uma fenilalanina na posição 194. Além disso, a posição 275 pode estar ocupada por um glutamato. De um modo vantajoso, a posição 194 está ocupada por fenilalanina.

Além disso pode ser empregue uma urocinase modificada de acordo com a invenção. Esta urocinase de acordo com a invenção pode apresentar o aminoácido de acordo com SEQ. ID N°.2 (fig.14), em que os aminoácidos hidrofóbicos da curva de autólise estão substituídos por Val420, Thr421, Asp422 e Ser 423. De um modo vantajoso, esta urocinase transporta uma Ile275, bem como um Glul94. Em comparação com a urocinase de tipo selvagem, este mutante mostra uma especificidade para a fibrina aumentada em 500 vezes.

Ambos os mutantes - tanto urocinase como também t-PA -foram pesquisados em testes semi-quantitativos e tiveram como resultado uma especificidade aumentada para a fibrina, em comparação com o t-PA de tipo selvagem. 18

Além disso, também o activador do plasminogénio (DSPA) da saliva do morcego vampiro (Desmodus rotundus) mostra um elevado aumento da actividade na presença de fibrina - nomeadamente um aumento em 100.000 vezes - que por conseguinte pode ser utilizado de um modo preferido de acordo com a invenção. Sob a designação DSPA estão reunidas quatro proteases diferentes que desempenham uma função essencial do morcego vampiro, nomeadamente de prolongar o tempo de hemorragia das feridas provocadas por estes animais nas presas (Cartwright, 1974). Estas quatro proteases (DSPAal, DSPAa2, dspab, dspay) apresentam consentaneamente uma elevada semelhança (homologia) a t-PA humano. Elas apresentam igualmente actividades fisiológicas semelhantes ou consentâneas, que justificam a sua concentração sob o conceito genérico DSPA. DSPA é objecto do documento EP 0352119 Al, bem como das patentes US 6008019 e 5830849.

No caso de DSPAal trata-se da protease deste grupo melhor pesquisada até à data. Ela apresenta na sua sequência de aminoácidos uma homologia de mais de 72% face à sequência de aminoácidos do t-PA humano conhecida (Krátzschmar et al., 1991). Todavia persistem duas diferenças essenciais entre t-PA e DSPA. Em primeiro lugar, como cadeia única, a DSPA representa nomeadamente uma molécula completamente activa em relação a substratos peptidicos, que não é convertida - como o t-PA - numa forma de duas cadeias (Gardell et al., 1989; Krátzschmar et al., 1991). Em segundo lugar, a actividade catalítica da DSPA mostra uma dependência quase absoluta de fibrina (Gardell et al., 1989; Bringmann et al., 1995; Toschie et al., 1998). Assim, por exemplo, a actividade da DSPAal aumenta em 100.000 vezes na presença de fibrina, enquanto a actividade do t-PA aumenta apenas cerca de 550 vezes. A actividade da DSPA é, pelo contrário, no essencial menos fortemente induzida por 19 fibrinogénio; chega apenas a um aumento de 7 até 9 vezes (Bringmann et al., 1995). A DSPA é assim muito mais dependente de fibrina e mais especifica para a fibrina do que o t-PA de tipo selvagem, que apenas é activado cerca de 550 vezes por fibrina.

Devido às suas propriedades fibrinoliticas e à grande semelhança relativamente a t-PA, a DSPA representa sem dúvida um candidato interessante para o desenvolvimento de um trombolitico. Não obstante, no passado, o desenvolvimento de DSPA como trombolitico foi limitado ao tratamento do enfarte do miocárdio uma vez que - devido à participação do t-PA na neurotoxicidade dependente do glutamato - não persistiam quaisquer esperanças legitimas de empregar com sucesso um activador do plasminogénio análogo ao t-PA para o tratamento do acidente vascular cerebral agudo.

Agora mostrou-se no entanto de forma surpreendente que apesar da elevada semelhança (homologia) da DSPA relativamente a t-PA e apesar da considerável consonância do seu efeito fisiológico relativamente a t-PA, a DSPA não apresenta, em oposição àquele, quaisquer efeitos neurotóxicos. Com esta comprovação, o entendimento está directamente associado a que DSPA pode pois ser utilizada como trombolitico para a terapia do acidente vascular cerebral sem que com isso esteja associado um risco adicional da lesão do tecido neuronal. Isto significa, em particular, que a DSPA também pode ser empregue mais tarde do que três horas após o estabelecimento dos sintomas no caso de acidente vascular cerebral.

Outro ensinamento da presente invenção que resulta do conhecimento anteriormente descrito é a possibilidade de 20 modificar ou produzir também outros activadores do plasminogénio de tal modo que apresentem esta propriedade da DPSA ou não apresentem a neurotoxicidade do t-PA. A base para isso é o contexto de actividade reconhecido, que permite no futuro converter activadores do plasminogénio neurotóxicos em activadores do plasminogénio não neurotóxicos, ou com base em activadores do plasminogénio neurotóxicos conhecidos ou descobertos de novo preparar activadores do plasminogénio não neurotóxicos. 0 novo ensinamento baseia-se em experiências de comparação in vivo do efeito neurodegenerativo do t-PA por um lado e da DSPA por outro lado, que foram realizadas com o auxilio do assim designado "modelo do ácido caínico", bem como um modelo para a pesquisa das lesões do estriato induzidas por NMDA. 0 modelo do ácido cainico (também modelo de lesão do ácido caínico) baseia-se no facto de a cascata neurotóxica do glutamato ser estimulada pela aplicação de ácido caínico (KA) externo como agonista do receptor do glutamato do tipo do ácido cainico (tipo KA), bem como dos receptores NMDA e AMPA do glutamato. Pela utilização de uma linhagem de ratinhos deficientes em t-PA como modelo de pesquisa pôde, com isso, ser mostrado que a sensibilidade dos animais da experiência contra o ácido caínico apenas alcançou o nível dos ratinhos de tipo selvagem no caso de uma toma adicional de t-PA esterno. Em oposição a isso, uma infusão de uma concentração equimolar em DSPA sob as mesmas condições experimentais não pôde restabelecer a sensibilidade contra o ácido caínico (KA). De acordo com isso, os efeitos do t-PA não puderam ser substituídos por DSPA. Na tabela 2 está representado um resumo destes resultados. 21

Tabela 2

Comprimento do Hipocampo intacto (mm) Grupo de tratamento Número de animais Média do lado contralateral (SEM) Média do lado ipsilateral (SEM) Restante percentagem Infusão t-PA (1,85 μΜ) + KA 12 15,99 (0,208) 3,63 (0,458) 22, 7* Infusão DSPA (1,85 μΜ) + KA 11 16,07 (0,124) 13,8 (0,579) 85, 87 Infusão t-PA (1,85 μΜ) + PBS 3 16,75 (0,381) 17,08 (0,363) 101,97 Infusão DSPA (1,85 μΜ) + PBS 3 15,75 (0,629) 15,83 (0,363) 100,50 Infusão t-PA (0,185 μΜ) + KA 3 15,60 (0,702) 5,07 (1,09) 32, 5 Infusão DSPA (18,5 μΜ) + KA 3 16,06 (0,176) 13,80 (1,22) 85, 93 *P < 0,0001

Pesquisas quantitativas neste modelo mostraram que mesmo um aumento de 10 vezes da concentração de DSPA não restabelece a sensibilidade dos ratinhos deficientes em t-PA contra o tratamento de KA, enquanto no entanto uma concentração 10 vezes mais baixa de t-PA já conduziu a danos nos tecidos induzidos por KA. Dai resulta que a DSPA apresenta uma actividade pelo menos 100 vezes mais baixa do que t-PA no estimulo da neurodegeneração após tratamento com KA (ver também figuras 11 e 12).

No segundo modelo da neurodegeneração foram comparados os efeitos possíveis do t-PA bem como da DSPA sobre o estimulo da neurodegeneração dependente de NMDA em ratinhos de tipo selvagem. Para isso foi injectado NMDA (como agonista do 22 receptor do glutamato do tipo NMDA) sozinho ou em combinação com t-PA ou DSPA a ratinhos de tipo selvagem. Este modelo permite a pesquisa do efeito destas proteases em condições sob as quais ocorre mesmo assim uma neurodegeneração e produz uma afluência de proteínas do plasma devido à interrupção da barreira sangue -cérebro (Chen et al., 1999).

Ao trabalhar neste modelo, a injecção de NMDA conduziu a lesões reprodutíveis no estriato dos ratinhos. 0 volume destas lesões foi ampliado em no mínimo 50% por uma injecção conjunta de t-PA e NMDA. Em oposição a isso, uma co-injecção de DSPAal não conduziu a qualquer aumento da ampliação das lesões provocadas pela injecção de NMDA. Mesmo na presença de proteínas do plasma, que se puderam difundir na região da lesão em consequência da neurodegeneração dependente de NMDA, a DSPA não conduziu a qualquer aumento da neurodegeneração (ver também a tabela 3).

Tabela 3

Grupo de tratamento Número de ratinhos do tipo selvagem Volume médio de lesão (mm3) (SEM) NMDA alone 8 1,85 (0,246) NMDA + t-PA 8 3,987 (0,293)* NMDa + DSPA 8 1,656 (0,094)** t-PA alone 3 0,20 (0,011) DSPA alone 3 0,185 (0,016) *p < 0,0001 ** Não significativo >

Estes resultados mostram que a DSPA representa uma protease essencialmente inerte no sistema nervoso central de um mamífero - portanto também no do homem - e - em oposição a t-PA - não provoca qualquer aumento da neurotoxicidade induzida por KA ou 23 NMDA. Esta neurotoxicidade em falta torna a DSPA, ao contrário do esperado num trombolítico adequado para o tratamento do acidente vascular cerebral agudo.

Os primeiros resultados de estudos clínicos mostram a transmissibilidade destes resultados também para o tratamento do acidente vascular cerebral em humanos. Assim comprovaram-se claras melhoras em doentes após perfusão bem sucedida (melhoria em 8 pontos NIHSS ou NIHSS resultado 0 - 1) . A tabela 1 torna isto claro.

Tabela 1

Doente NIHSS Linha de base Pós Tmt Dia 7 Dia 30 Dia 90 sAEs 1001 12 7 4 4 k Re-enfarte 1002 8 9 2 0 0 1003 8 10 12 10 * 1004 8 4 2 0 0 1005 11 11 4 5 * 1006 9 7 1 * * 1007 14 6 * * * 2001 19 20 — — — ICH, morte 2002 15 21 — — — ICH, morte 3001 8 7 6 5 k 3002 15 16 9 8 k 3003 10 19 21 * — Morte no dia 39

Devido à neurotoxicidade em falta da DSPA, bem como dos outros activadores do plasminogénio do mesmo modo não neurotóxicos (ver acima), resulta como vantagem particular para o tratamento de acidente vascular cerebral o facto de a utilização destes activadores do plasminogénio - diferentes do 24 t-PA de tipo selvagem - não estar limitada à estreita janela temporal de até três horas após o início do acidente vascular cerebral. Pelo contrário, o tratamento pode realizar-se também num ponto temporal mais tardio - portanto, sem mais, também após seis horas ou ainda mais tarde - sem que - como no caso de t-PA - o risco de um estímulo da excitotoxicidade se lhe oponha. Primeiras pesquisas clínicas com a DSPA atestaram até o tratamento inofensivo de doentes num período de tempo de mais do que seis horas ou nove horas após o estabelecimento dos sintomas.

Esta opção de tratamento ilimitada em termos temporais com activadores do plasminogénio não neurotóxicos é exactamente por isso tão significativa, uma vez que com isso, pela primeira vez, é possível um tratamento de doentes de acidente vascular cerebral agudo sem hesitações, nos quais o início do acidente vascular cerebral não pode ser determinado com certeza suficiente em termos temporais. Este grupo de doentes era excluído até à data da trombólise com activadores do plasminogénio por motivos de cautela e da avaliação do risco. Com isso suprimiu-se uma contra-indicação essencial para a utilização aprovada de um trombolítico no caso de acidente vascular cerebral.

Numa forma de realização vantajosa adicional, os activadores do plasminogénio não neurotóxicos podem ser combinados com um suporte farmaceuticamente aceitável. 25

ESTUDOS COMPARATIVOS DE T-PA E DSPA A. Métodos 1. Animais

Foram disponibilizados pelo Dr. Peter Carmeliet, Leuven, Bélgica, ratinhos de tipo selvagem (c57/Black 6) e ratinhos deficientes em t-PA (t-PA/- ratinhos) (C57/Black 6) (Carmeliet et al., 1994) . 2. Extracção de proteína do tecido cerebral A determinação da actividade proteolítica no tecido cerebral após infusão de t-PA ou DSPAal efectuou-se por meio de análise zimográfica (Granelli-Piperno e Reich, 1974) . Após o tempo de 7 dias de infusão no hipocampo, os ratinhos foram anestesiados, em seguida perfundidos por via transcardial com PBS e os cérebros foram removidos. A região do hipocampo foi removida, transferida para recipientes eppendorf e incubada em volumes iguais (p/v) (cerca de 30 - 50 pL) com 0,5% de tampão de lise NP-40 sem inibidores de protease (0,5% NP-40, Tris-HCl 10 mM pH 7,4, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, EDTA 1 mM). Os extractos cerebrais foram homogeneizados por meio de um homogeneizador de vidro operado manualmente e deixados durante 30 minutos em gelo. As amostras foram depois centrifugadas e o sobrenadante foi recolhido. Foi determinada a quantidade de proteína presente (reagente Bio-Rad). 26 3. Análise zimográfica das proteases A actividade proteolítica nas amostras ou nos extractos do tecido cerebral foi determinada por análise zimográfica de acordo com o método de Granelli-Piperno e Reich (1974). Neste caso, as amostras da proteína recombinante (até 100 nmole) ou do extracto do tecido cerebral (20 pg) foram submetidas a SDS-PAGE a 10% em condições não redutoras. Os géis foram retirados das placas, lavados durante duas horas em 1% de Triton X100 e em seguida colocados sobre um gel de agarose com fibrinogénio e plasminogénio polimerizados (Granelli-Piperno e Reich, 1974) . Os géis foram incubados a 37 °C numa câmara húmida até poderem ser reconhecidas zonas de proteólise. 4. Infusão intra-hipocampo de t-PA, DSPA e subsequente injecção de ácido caínico O modelo de lesão do ácido caínico baseia-se na indicação de Tsirka et al. (1995). Os animais foram injectados por via intraperitoneal (i.p.) com atropina (4 mg/kg), depois foram anestesiados com uma injecção i.p. de pentobarbital de sódio (70 mg/kg). Em seguida eles foram colocados numa armação estereotáctica de modo a que pudesse ser implantada subcutaneamente, entre as omoplatas, uma bomba micro-osmótica (modelo Alzet 1007D, Alzet CA. EUA) com 100 pL de PBS ou t-PA humano recombinante (0,12 mg/mL; 1,85 pM) ou DSPAal (1,85 pM) . As bombas foram ligadas com uma cânula cerebral através de tubinhos estéreis e foram inseridas através de uma abertura no crânio nas coordenadas bregma - 2,5 mm, médio-lateral 0,5 mm e dorso-ventral 1,6 mm, para introduzir o líquido próximo da linha média. A cânula foi em seguida colada na posição desejada e as 27 bombas foram abertas para infundirem as soluções respectivas a uma taxa de fluxo de 0,5 pL por hora durante sete dias.

Dois dias após a infusão das proteases, os ratinhos foram novamente anestesiados e colocados na armação estereotáctica. Injectaram-se em seguida unilateralmente no hipocampo 1,5 nmole de ácido cainico em 0,3 pL de PBS. As coordenadas foram: bregma 2,5 mm, médio-lateral 1,7 mm e dorso-ventral 1,6 mm. A excitotoxina (KA) foi introduzida durante uma duração de 30 segundos. Após o tratamento de ácido cainico, a agulha permaneceu durante 2 minutos adicionais nestas coordenadas para evitar um refluxo do liquido. 5. Pesquisa cerebral

Cinco dias após a injecção de KA, os animais foram anestesiados e perfundidos por via transcardial com 30 mL de PBS, seguidos de 70 mL de uma solução de paraformaldeido a 4%, depois fixados durante 24 horas no mesmo fixador, seguida de uma incubação em sacarose a 30% durante 24 horas adicionais. Em seguida foram cortadas secções coronais (40 pm) do cérebro num micrótomo com capacidade de congelação, contra-coradas ou com tionina (BDH, Austrália) ou foram processadas para pesquisa imuno-histoquimica. 6. Quantificação da taxa de perda neuronal no interior do hipocampo A quantificação da perda neuronal nos subcampos CA1-CA3 do hipocampo foi realizada como descrito anteriormente (Tsirka et 28 al., 1995; Tsirka et al., 1996). Foram processadas cinco secções consecutivas do hipocampo dorsal de todos os grupos tratados, em que as secções compreendiam efectivamente o local da injecção de KA e a área da lesão. Os subcampos do hipocampo (CA1-CA3) destas secções foram observados por meio de desenhos de câmara lúcida do hipocampo. A totalidade do comprimento destes subcampos foi medida em comparação com padrões de 1 mm, que foram observados em igual ampliação. Foi determinado o comprimento das secções de tecido com neurónios piramidais vitais (com morfologia normal) e o comprimento das secções de tecido sem neurónios (nenhumas células presentes, nenhuma coloração de tionina). Os comprimentos, que representavam neurónios intactos e perdas neuronais na área de cada subcampo do hipocampo, foram utilizados para calcular a média entre as secções e foi determinado o desvio padrão.

7. Lesões de excitotoxicidade intra-estriatais de NMDA com ou sem t-PA ou DSPA

Ratinhos de tipo selvagem (c57/Black 6) foram anestesiados e colocados numa armação estereotáctica (ver acima). Os ratinhos receberam em seguida uma injecção unilateral no estrato esquerdo com 50 nmole de NMDA, sozinha ou em combinação com 46 μΜ de rt-PA ou 46 μΜ de DSPAal. Como controlo foram além disso injectados t-PA e DSPAal, sozinhos ou em combinação, numa concentração de 46 μΜ como controlos. As coordenadas da injecção foram: bregma -0,4 mm, médio-lateral 2,0 mm e dorso-ventral 2,5 mm. As soluções (1 μμ de volume total para todos os tratamentos) foram transferidas durante um lapso de tempo de 5 minutos a 0,2 pL/min, em que a agulha permaneceu durante 2 minutos adicionais após a injecção, para minimizar um refluxo de 29 líquido. Após 24 horas, os ratinhos foram anestesiados e perfundidos por via transcardial com 30 mL de PBS, seguidos de 70 mL de uma solução de paraformaldeído a 4%, uma pós-fixação de 24 horas no mesmo fixador, seguida de uma incubação em sacarose a 30% durante 24 horas adicionais. Depois foram cortadas secções coronais (40 pm) num micrótomo com capacidade de congelação e foram colocadas sobre um suporte de vidro revestido com gelatina.

8. Quantificação do volume da lesão após a injecção de NMDA A quantificação do volume de lesão estriatal foi realizada com base no método descrito por Callaway et al. (2000) . Neste caso foram processadas 10 secções coronais consecutivas que compreendiam a área da lesão. A região lesada foi visualizada com base no método de Callaway e o volume da lesão foi quantificado por utilização de um Micro Computer Imaging Device (MCID, Imaging Research Inc., Universidade de Brock., Ontário, Canadá). 9. Imuno-histoquímica A imuno-histoquímica foi realizada de acordo com métodos padronizados. As secções coronais foram sujeitas a uma imersão numa solução de H202 a 3% / metanol a 10% durante 5 minutos, seguida de uma incubação com soro de cabra normal a 5% durante 60 minutos. As secções foram depois incubadas durante a noite, ou com um anticorpo anti-GFAP (1:1000; Dako, Carpinteria, Ca, EUA) para a detecção de astrócitos, com um anticorpo anti-MAC-1 (1:1000; Serotec, Raleigh, NC, EUA) para a detecção de microglia 30 ou anticorpos policlonais anti-DSPA (Schering AG, Berlim). Após a lavagem, as secções foram incubadas com os anticorpos secundários biotinilados apropriados (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). Seguiu-se uma incubação final num complexo de avidina/biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) durante 60 minutos antes da coloração definitiva com 3,3'-diaminobenzidina / 0,03% de H2O2. As secções foram depois colocadas sobre suportes revestidos com gelatina, secos, desidratados e cobertos com permount.

B. RESULTADOS 1. infusão de t-PA ou dspa é distribuída pelo hipocampo de ratinhos t-PA - e mantém a sua actividade proteolítica

As primeiras pesquisas foram concebidas para confirmar que tanto DSPA como também t-PA mantinham a sua actividade proteolítica durante a duração de 7 dias da infusão. Para este fim foram incubadas alíquotas de t-PA e DSPA (100 nmole) tanto a 37 °C como também a 30 °C, durante sete dias num banho-maria. Para determinar a actividade proteolítica, foram submetidas diluições seriadas de 5 vezes das amostras a uma SDS-PAGE com condições não redutoras e a actividade proteolítica foi medida por análises zimográficas. Foi empregue como controlo, respectivamente, uma alíquota de t-PA e DSPA que durante estes sete dias foi deixada congelada. Como se pode ver da figura 1, apenas resultou uma perda diminuta da actividade da DSPA ou t-PA, tanto na incubação a 25 °C, como também na incubação a 37 °C, durante este período de tempo. 31 2. Actividade de t-PA e DSPA também é reconhecida em extractos de hipocampo de ratinhos t-PA - após a infusão

Em primeiro lugar teve que ser comprovado que no caso da infusão as proteases administradas estavam presentes em geral no cérebro dos animais tratados e que também ai mantinham a sua actividade proteolitica. Para isso, ratinhos t-PA-/- receberam durante sete dias infusões com t-PA ou DSPA (ver acima) . Os ratinhos foram em seguida mortos por perfusão transcardial com PBS e os cérebros foram removidos. As regiões do hipocampo ipsilaterais e contralaterais foram isoladas, do mesmo modo uma região do cerebrelo (como controlo negativo). Amostras de tecido (20 pg) foram submetidas a uma SDS-PAGE e análise zimográfica de acordo com a descrição na parte dos métodos. Como se pode ver da figura 2, foram medidas tanto actividades de t-PA como também de DSPA na área ipsilateral do hipocampo, em que além disso foi medida alguma actividade no lado contra lateral. Isto mostrou que as proteases infundidas não mantinham apenas a sua actividade no cérebro, mas que além disso se tinham espalhado na região do hipocampo. No caso do controlo, não foi comprovada qualquer actividade no extracto preparado do cerebrelo.

3. Comprovativo imuno-histoquímico de DSPA

Para comprovar que a DSPA se tinha efectivamente espalhado sobre a região do hipocampo foram analisadas imuno-histoquimicamente secções coronais do cérebro de ratinhos t-PA-/- após infusão de DSPA. Neste caso foi comprovado antigénio de DSPA na região do hipocampo, em que a imediação do local de infusão apresentou a coloração mais forte. Este resultado 32 confirma que a DSPA infundida é solúvel e está efectivamente presente no hipocampo. 4. Ά infusão de DSPA não restabelece a sensibilidade em relação à neurodegeneração dependente de ácido caínico in vivo

Os ratinhos t-PA-/- são resistentes em relação à neurodegeneração dependente de ácido cainico. Em oposição a isso, uma infusão de rt-PA no hipocampo conduz a um restabelecimento completo da sensibilidade em relação a uma lesão dependente do ácido cainico. Para responder à pergunta de se a DSPA pode substituir o t-PA neste efeito, ratinhos t-PA-/-receberam infusões com t-PA ou DSPA no hipocampo, por meio de uma bomba mini-osmótica. Para ambos os grupos foram utilizados 12 ratinhos. Dois dias mais tarde os animais receberam injecções de ácido cainico numa fase de repouso subsequente. Cinco dias depois os animais foram mortos. Os cérebros foram retirados e processados (ver acima). Como controlo foram além disso infundidos ratinhos t-PA-/- com PBS antes do tratamento com KA (n = 3) .

Prepararam-se secções coronais de cérebro e os neurónios foram detectados por coloração de acordo com Nissl. Foi claro que os ratinhos t-PA-/- após a infusão de PBS eram resistentes em relação à KA. Em oposição, as infusões com t-PA recombinante conduziam ao restabelecimento da sensibilidade em relação ao tratamento com KA. Em oposição a isto, a infusão da mesma concentração em DSPA na região do hipocampo não alterou a sensibilidade destes animais em relação à KA (ver figura 4a e 4b) . 33

Efectuou-se uma quantificação destes resultados por utilização de 12 ratinhos em cada grupo. Em 2 dos 12 ratinhos infundidos com DSPA observámos algumas neurodegenerações sem importância. A razão para isso ainda não é clara e possivelmente é independente da presença de DSPA. Os dados combinados tomam em consideração o efeito sem importância que foi observado em ambos estes animais. Todos os 12 ratinhos tratados com t-PA foram sensíveis em relação ao tratamento de KA. Estes resultados mostram que, no caso de uma infusão de t-PA ou DSPAal em concentrações equimolares, apenas a administração de t-PA conduz a um restabelecimento da sensibilidade em relação à neurodegeneração induzida por KA. 5. Infusão de DSPA não provoca qualquer activação da microglia 0 restabelecimento da sensibilidade à KA de ratinhos t-PA-/- após infusão de t-PA resultou comprovadamente numa activação da microglia (Rogove et al., 1999). Para determinar a dimensão da activação da microglia após infusão de t-PA ou DSPA e subsequente tratamento com KA, secções coronais dos ratinhos foram sujeitas a uma coloração imuno-histoquímica para células da microglia activadas por utilização do anticorpo Mac-1. 0 restabelecimento da sensibilidade à KA após infusão de t-PA resultou num claro aumento das células Mac-1 positivas. Isto não foi observado nos ratinhos que tinham recebido as infusões com DSPA. Com isso, a presença de DSPA não conduz a uma activação das células da microglia após tratamento com KA. 34 6. Titulação de DSPA e t-PA na região do hipocampo dos ratinhos A concentração de t-PA que foi utilizada para a infusão baseou-se na concentração descrita por Tsirka et al. (1995) (100 pL de 0,12 mg/mL [1,85 μΜ]). Nós repetimos as experiências de carga de KA por utilização de uma quantidade de t-PA 10 vezes mais baixa (0,185 μΜ) e uma quantidade mais elevada em DSPA (18,5 μΜ) . A concentração mais baixa de t-PA ainda estava em condições de restabelecer a sensibilidade em relação ao tratamento com KA (n = 3). Foi de especial interesse o facto da infusão de concentração 10 vezes aumentada de DSPA apenas ter provocado perda neuronal diminuta após tratamento com KA. Estes dados apontam fortemente para que a DSPA não aumenta a sensibilidade em relação à KA. 7. Efeito de t-PA e DSPA sobre a neurodegeneração dependente de NMDA em ratinhos de tipo selvagem

Os efeitos de t-PA e DSPA foram pesquisados além disso num modelo da neurodegeneração em ratinhos de tipo selvagem. A injecção de t-PA no estrato destes ratinhos conduz comprovadamente a um reforço dos efeitos neurodegenerativos provocados pelo NMDA análogo ao glutamato (Nicole et al., 2001).

Para isso foram administradas injecções de NMDA com um volume total de 1 pL na região do estrato de ratinhos de tipo selvagem, na presença de t-PA ou DSPA (respectivamente 46 μΜ) . Após 24 horas, os cérebros foram retirados e o tamanho das lesões foi quantificado de acordo com o método de Callaway (Callaway et al., 2000) (ver acima). Como é visível da figura 7, 35 a injecção de NMDA sozinha provocou uma lesão reprodutível em todos os ratinhos tratados (n = 4). No entanto, caso t-PA e NMDA tenham sido injectados conjuntamente, o tamanho das lesões aumentou em cerca de 50% (P < 0,01, n = 4) . Em clara oposição a isso, a co-injecção de NMDA e da mesma concentração de DSPA não provocou qualquer aumento do tamanho da lesão em comparação a NMDA sozinho.

Injecções de t-PA ou DSPA sozinhas não conduziram a uma neurodegeneração comprovável. O efeito em falta de t-PA no caso de administração isolada é consistente com os resultados de Nicole et ai. (2001). Estes dados mostram que a presença de DSPA não aumenta adicionalmente a neurodegeneração mesmo durante um processo neurodegenerativo.

Para confirmar que a injecção de DSPA efectivamente se tinha espalhado na região do hipocampo, foram conduzidas pesquisas imuno-histoquímicas em cortes coronais por utilização do anticorpo de DSPA. As pesquisas mostram que a DSPA efectivamente entrou na região estriatal.

Análise cinética da activação do plasminonénio por teste cromogénico indirecto

Foram realizados testes cromogénicos indirectos da actividade de t-PA utilizando os substratos Lys-plasminogénio (American Diagnostica) e Spectrozyme PL (American Diagnostica) de acordo com Madison E.L., Goldsmith E.J., Gerard R.D., Gething M.-J., Sambrook J.F. (1989) Nature 339 721 - 724; Madison E.L., Goldsmith E.J., Gerard R.D., Gething M.J., Sambrook J.F. e Bassel-Duby R.S. (1990) Proc. Nat. Acad. Scí. U.S.A 87, 3530 - 36 3533, bem como Madison E.L., Goldsmith E.J., Gething M.J., Sambrook J.F. e Gerard R.D. (1990) J. Biol. Chem. 265, 21423 -21426. Os testes foram realizados tanto na presença como também na ausência do cofactor DESAFIB (American Diagnostica) . DESAFIB, uma preparação solúvel de monómeros de fibrina foi obtida por cisão de fibrinogénio humano altamente purificado pela protease batroxobina. A batroxobina cinde neste caso a ligação Argl6 -Glyl7 na cadeia Aa do fibrinogénio e liberta neste caso fibrinopéptido A. O resultante des-AA-fibrinogénio na forma de monómeros de fibrina I é solúvel na presença do péptido Gly-Pro-Arg-Pro. A concentração do Lys-plasminogénio foi variada na presença de DESAFIB de 0, 00125 até 0,2 μΜ, na ausência do cofactor de 0,9 até 16 μΜ.

Testes cromogénicos indirectos na presença de diferentes estimuladores

Realizaram-se testes cromogénicos indirectos padronizados de acordo com as publicações citadas acima. Neste caso utilizaram-se preparações de 100 pL de volume total com 0,25 -1 ng de enzima, 0,2 μΜ de Lys-plasminogénio e 0,62 mM de Spectrozym PL. Os testes foram realizados na presença quer de tampão, 25 pg/mL de DESAFIB, 100 pg/mL de brometo de cianogénio fragmentos de fibrinogénio (American Diagnostica) ou 100 pg/mL do péptido P368 de 13 aminoácidos estimulador. As análises foram realizadas em placas de microtitulação e a densidade óptica foi medida a um comprimento de onda de 405 nm durante 1 h todos os 30 seg, num "Molecular Devices Thermomax". A temperatura da reacção perfez 37 °C. 37

Referências:

Baranes D, Lederfein D, Huang YY, Chen M, Bailey CH, Kandel ER. 1998 Tissue plasminogen activator contributes to the late phase of LTP and to synaptic growth in the hippocampal mossy fiber pathway. Neuron 21: 813 - 25.

Bringmann P, Gruber D, Liese A, Toschi L, Kratzchmar J,

Schleuning WD Donner P. 1995. Structural features mediating fibrin selectivity of vampire bat plasminogen activators. J Biol Chem 270: 25596 - 25603.

Callaway JK, Knight Mj, Watkins dj, Beart PM, Jarrott B,

Delaney PM. 2000. A novel, rapid, computerized method for quantitation of neuronal damage in a rat model of stroke. J Neurosci Methods 102: 53 - 60.

Carmeliet P, Schoonjans L, Kieckens L, Ream B, Degen J,

Bronson R, De Vos R, van den Oord JJ, Collen D, Mulligan RC. 1994. Physiological consequences of loss of plasminogen activator gene function in mice. Nature 368: 419 - 424.

Cartwright T. 1974. The plasminogen activator of vampire bat saliva. Blood 43: 317 - 326.

Chen ZL Strickland S. 1997. Neuronal death in the hippocampus is promoted by plasmin-catalysed degradation of laminin. Cell 91: 917 - 925.

Chen, Z-L, Indyk, J.A., Bugge, T.H., Kombrinck, K.W., e Strickland S. 1999. Neuronal Death and blood-brain barrier 38 breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J.

Neuroscience 19: 9813 - 9820.

Frey U, Muller M, Kuhl D. 1996. A different form of long-lasting potentiation revealed in tissue plasminogen activator mutant mice. J Neurosci 16: 2057 - 2063.

Gardell SJ, Duong LT, Diehl RE, York JD, Hare TR, Register RB, Jacobs JW, Dixon RA, Friedman PA. 1989. Isolation, characterization, and cDNA cloning of a vampire bat salivary plasminogen activator. j Biol Chem 264: 17947 - 17952.

Gardell SJ, Ramjit DR, Stabilito II, Fujita T, Lynch JJ, Cuca GC, Jain D, Wang SP, Tung JS, Mark GE, et al. 1991. Effective thrombolysis without marked plasminemia after bolus intravenous administration of vampire bat salivary plasminogen activator in rabbits. Circulation 84: 244 - 253.

Granelli-Piperno, A e Reich, E. 1974. A study of proteases and protease inhibitor complexes in biological fluids. J. Exp. Med. 148: 223 - 234.

Huang YY, Bach ME, Lipp HP, Zhuo M, Wolfer DP, Hawkins RD, Schoonjans L, Kandel ER, Godfraind JM, Mulligan R, Collen D, Carmeliet P. 1996. Mice lacking the gene encoding tissue-type plasminogen activator show a selective interference with late-phase long-term potentiation in both Schaffer collateral and mossy fiber pathways. Proc Natl Acad Scí USA. 93: 8699 - 86704.

Kratzschmar J, Haendler B, Langer G, Boidol W, Bringmann P, Alagon A, Donner P, Schleuning WD. 1991. The plasminogen 39 activator family from the salivary gland of the vampire bat Desmodus rotundus: cloning and expression. Gene 105: 229 - 237.

Madani R, Hulo S, Toni N, Madani H, Steimer T, Muller D, Vassalli JD. (1999) Enhanced hippocampal long-term potentiation and learning by increased neuronal expression of tissue-type plasminogen activator in transgenic mice. EMBO J. 18: 3007 - 3012.

Mellott Mj, Stabilito II, Holahan MA, Cuca GC, Wang S, Li P, Barrett JS, Lynch JJ, Gardell SJ. 1992. Vampire bat salivary plasminogen activator promotes rapid and sustained reperfusion concomitant systemic plasminogen activation in a canine model of arterial thrombosis. Arterioscler. Thromb. 12: 212 - 221.

Muschick, P., Zeggert D., Donner, P., Witt, W. 1993. Thrombolytic properties of Desmodus (vampire bat) plasminogen activator DSPAal, Alteplase and streptokinase following intravenous bolus injection in a rabbit model of carotid artery thrombolysis. Fibrinolysis 7: 284 - 290.

Muller, C.M., Griesinger, C.B. 1998. Tissue plasminogen activator mediates reverse occlusion plasticity in visual córtex. Nature Neuroscience. 1: 47 - 53.

National Institute of Neurological Disorders and stroke rt-PA study group. 1995. New. Engl. J. Med. 333: 1581 - 1587.

Nicole, O., Docagne, F., Ali, C., Margaill, I., Carmeliet, P., MacKenzie, E.T. Vivien, D. & Buisson, A. (2001) The proteolytic activity of tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptor-mediated signaling. Nat Med 7, 59 - 64. 40

Rogove AD, Siao C, Keyt B, Strickland S, Tsirka SE. 1999. Activation of microglia reveals a non-proteolytic cytokine function for tissue plasminogen activator in the central nervous System. J Cell Sei 112: 4007 - 4016.

Schleuning WD, Alagon A, Boidol W, Bringmann P, Petri T, Kratzschmar J, Haendler B, Langer G, Baldus B, Witt W, et al. 1992. Plasminogen activators from the saliva of Desmodus rotundus (common vampire bat): unique fibrin specificity. Ann N Y Acad Sei 667: 395 - 403.

Seeds, N.W., Williams, B.L., Bickford, P.C. 1995. Tissue plasminogen activator induction in purkinje neurons after cerebellar motor learning. Science 270: 1992 - 1994.

Stewart RJ, Fredenburgh JC, Weitz Jl. 1998. Characterization of the interactions of plasminogen and tissue and vampire bat plasminogen activators with fibrinogen, fibrin, and the complex of D-dimer noncovalently linked to fragment E. J Biol Chem 273: 18292 - 18299.

Traynelis, SF, Lipton, SA. 2001. Is tissue plasminogen activator a threat to neurons? Nature Medicine, 7: 17 - 18.

Toschi L, Bringmann P, Petri T, Donner P, Schleuning WD. 1998. Fibrin selectivity of the isolated protease domains of tissue-type and vampire bat salivary gland plasminogen activators. Eur J Biochem 252: 108 - 112.

Tsirka SE, Gualandris A, Amaral DG, Strickland S. 1995. Excitotoxin-induced neuronal degeneration and seizure are 41 mediated by tissue plasminogen activator. Nature. 377: 340 344 .

Tsirka, S., Rogove, A. D., and Strickland, S. 1996. Neuronal cell death and tPA. Nature 384: 123 - 124.

Tsirka SE, Rogove AD, Bugge TH, Degen JL, Strickland S. 1997. An extracellular proteolytic Cascade promotes neuronal degeneration in the mouse hippocampus. J Neurosci 17: 543 - 552.

Tsirka SE, Bugge TH, Degen JL, Strickland S. 1997. Neuronal death in the central nervous system demonstrates a non-fibrin substrate for plasmin. Proc Natl Acad Sei USA 94: 9779 - 9781.

Wang YF, Tsirka SE, Strickland S, Stieg PE, Soriano SG, Lipton SA. 1998. Tissue plasminogen activator (tPA) increases neuronal damage after focal cerebral ischemia in wild-type and tPA-deficient mice. Nat Med. 4: 228 - 231.

Walker JB, Nesheim ME. 2001. A kinetic analysis of the tissue plasminogen activator and DSPAalphal cofactor activities of untreated and TAFIa treated soluble fibrin degradation produets of varying size. J Biol Chem 276: 3138 - 3148. witt W, Maass B, Baldus B , Hildebrand M, Donner P, Schleuning WD. 1994 . Coronary thrombolysis with Desmodus salivary plasminogen activator in dogs. Fast and persistent recanalization by intravenous bolus administration. Circulation. 90: 421 - 426.

Lisboa, 20 de Novembro de 2009 42

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um mutante de um factor activador do plasminogénio cuja especificidade para a fibrina é aumentada em comparação ao t-PA de tipo selvagem, para a preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico do acidente vascular cerebral em humanos após o decurso de três horas desde o inicio do acidente vascular cerebral, sem a combinação com um agente terapêutico adicional.
2. 2. Utilização de um factor activador do plasminogénio de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por 0 tratamento terapêutico do acidente vascular cerebral em humanos após o decurso de seis horas desde o início do acidente vascular cerebral.
3. 3. Utilização de um factor activador do plasminogénio de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada por o tratamento terapêutico do acidente vascular cerebral em humanos após o decurso de nove horas desde o início do acidente vascular cerebral.
4. 4. Utilização de um factor activador do plasminogénio de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o factor activador do plasminogénio compreender no mínimo um resíduo de histidina ou serina, que em conjunto com um resíduo de aspartato forma no mínimo uma parte de uma tríade de zimogénio.
5. 5. Utilização de um factor activador do plasminogénio de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por o factor 1 activador do plasminogénio ser seleccionado do grupo dos seguintes mutantes t-PA: t-PA/R275E; t-PA/R275E, F305H; t-PA/R275E, F305H, A292S.
6. 6. Utilização de um factor activador do plasminogénio de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o factor activador do plasminogénio apresentar uma mutação pontual do Aspl94, que reduz a estabilização da conformação cataliticamente activa do factor activador do plasminogénio na ausência de fibrina.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por Aspl94 ser substituído por glutamato ou asparagina.
8. 8. Utilização de um factor activador do plasminogénio de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o factor activador do plasminogénio apresentar, pelo menos, uma mutação na sua curva de autólise que reduz a formação de interacções funcionais entre plasminogénio e factor activador do plasminogénio na ausência de fibrina.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por no mínimo uma mutação na curva de autólise nas posições de aminoácidos 420 até 423 do t-PA de tipo selvagem ou em posições homólogas a essas.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por uma mutação seleccionada do grupo dos seguintes mutantes: L420A, L420E, S421G, S421E, P422A, P422G, P422E, F423A e F423E. 2 11. Utilização de um factor activador do plasminogénio de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o factor activador do plasminogénio como zimogénio apresentar no minimo uma mutação pontual, que impede a catálise por plasmina.
11. 12. Utilização de um factor activador do plasminogénio de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por a mutação pontual estar localizada nas posições 15 ou 275 do t-PA ou em posições homólogas a essas.
12. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por glutamato na posição 15 ou 275.
13. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o factor activador do plasminogénio apresentar uma mutação pontual na posição 194, que reduz a estabilização da conformação cataliticamente activa do factor activador do plasminogénio na ausência de fibrina.
14. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por uma Phel94.
15. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por um factor activador do plasminogénio com uma sequência de aminoácidos com SEQ. ID N° 1.
16. 17. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por um factor activador do plasminogénio com uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ. ID N° 2. Lisboa, 20 de Novembro de 2009 3 1/10 tPA DSPA Fig. 1

    tPA DSPA 701

    601

    2/10 Fig. 2 tPA: Imuno-histoquímica tPA: Zimografia in situ

    3/10 Fig. 4a tPA-/- (+) tPA (+)KA

    g Wt (+) ácido caínico (n=2) H tPA -/- (+) ácido cainico (n=3) pi tPA -/- (+) tPA (+) ácido cainico (n=8) IH tPA -/- (+) DSPA (+) ácido cainico (n=8) CA1-3 Neurónios intactos nos cairpos do hipocampo

    (%) 100 60 40 20 Grupo de estudo 0 4/10 Fig. 4b tPa-/ Cortes em série do hipocampo ratinhos: Infusão de tPa seguido de injecção de ácido cainico (|) Ratinho #5 Ratinho #6

    Cortes em série do hipocampo Ratinho #7

    Ratinho #8

    5/10

    t-PA isoladamente DSPA isoladamente

    6/10 Fig- 9 Efeito terapêutico da reperfusâo diminui ao longo do tempo devido ao crescimento da lesão

    Aplicabilidade de rt-PA 7/10 Tecido resgatável como requisito Fig. 10 para um tratamento bem sucedido

    φ Tecido cerebral morto Tecido cerebral vulnerável 8/10 Fig. 1 Proporção de hipocampo intacto (%)

    1,85 μΜ DSPA 1,85 μΜ t-PA + ácido caínico + ácido cainico 1,85 μΜ DSPA + PBS 1,85 μΜ t-PA + PBS 9/10 Fig. 12 20 Troço do hipocampo intacto depois da injecção do ácido cainico (mm)

    Contralateral Ipsilateral * P<0.0001 1,85 M DSPA 1,85 M t-PA 1,85 M DSPA 1,85 M t-PA (+ ácido caínico)(+ ácido cainico) (+ pbs) (+ PBS) η=11 n=12 n=3 10/10 Fig- 13 SEQ. ID N° 2 1 MVNTMKTKLL CVXLLCGAVF SÍPRQETYRQ LARGSRAYGV ACKDEITQMT 51 YRRQESWL.RP EVRSRRVEHC QCDRGSNELH QVPSNSCDEP RCLNGGTCVS 101 NKYFSIHWCN CPKKFGGQHC EIDKSKTCYE GNGHFYRGKA STDTMGRPCL· 151 PWN9ATVLQQ TYHAHRSDAli QLGLGKHNYC RNPDNRRRPW CYVQVGLKPL 201 VQBCMVHDCA DFQCGQKTLR BPRFHSTGGE PTTIENQPWF AAXYRRHRGG 251 SGVTYVCGGS XJíSPCWVXSA THCFIDYPKK EDYXVYLGRS RLNSNTQGEM 301 KFEVENLILH KQYSADTHHN ΟΙΑΙΛ,ΚΧΗΒΚ BGRCAQPSRT IQTICIíPSMY 351 NDPQFGTSCE XTGFGKENST DYLYPEQLÍCM TWKLISHRE CQQPHYYGSE 401 VTTKMLCAAD PQWKEXYPNV TDSCQODSGG PLVCSL.QGRM TXTGXVSWGR 451 GCALKDKPGV YTRVSHFLFWIRSHTKL Fig. 14 SEQ. ID N° 3 1 MVNTMKTKLL CVLX,LCGÃVF SXfRQBTYRQ I^ARGSRAYGV ACKDEITQMT 51 YRRQSSWLRP SVRSKHVEHC QCÍ5RGQARCH TVPVKSCSEP RCFNGGT.CQQ 101 AliYFSDFVCQ CPEGFAGKCC KXDTRATCYE OQGXSYRGTW STAESGAECT 151 NWNGSALAQK PYSGÇRRPDAI RLGLGMHCTYC RNPDRDSKPW CYVFKAQKYS 201 SEFCSTPACS STGGI.RQYSQ PQFHSTGGLF ADIASHPWQA AIFAXHRRSP 251 GERFliCGGXL XSSCWXLSAA HCFQERFPPH HLTVTLGRTY RWPGEEEQK 3 01 FEVEKYXVHK EFDDDTYDND XALLQLKSDS SRCAQESSW RTVCLPPADL 3 51 QLPDWTECEL SGYGKHEALS PFYSBRIíKEA HVRLYPSSRC TSQHLLNRTV 401 TDNML.CAGDT RSGQPQANLH DACQGDSGQP' LVCIUDGRMT LVGXISWGI/G 451 CGQKDVPGVY TKVTNYIjDWI RDNMRP