KR100311883B1 - 원구류의타액으로부터제조된트롬빈억제제 - Google Patents

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KR100311883B1
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베르나트 핸들러
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Abstract

본 발명은 트롬빈 억제제이고 포유동물의 혈액을 빨아먹는 곤충의 타액으로부터 분리된 천연 또는 합성에 의해 제조된 단백질에 관한 것이다. 곤충은 트라이아토마 팔리디페니스(Triatoma pallidipennis)가 바람직하다. 본 단백질은 혈전증 또는 불안전한 협심증 또는 동맥경화증을 치료하기 위하거나 PTCA/PTA후 다른 혈관은 재폐식을 예방하기 위하거나 혈액 투석시 응혈을 방지하기 위하여 사용된다.

Description

원구류의 타액으로부터 제조된 트롬빈 억제제
본 발명은 원구류(Protostomia)의 타액으로부터 제조된 트롬빈 억제제 단백질에 관한 것이다.
선행 기술
트롬빈은 혈관내의 혈전 형성에 있어서 중요한 기능을 한다. 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 전환시킨다. 이는 혈전을 형성하도록 한다. 따라서 혈전판을 응고시킨다. 이 효소는 예를 들면 동맥 및 정맥 혈전증 또는 동맥경화증과 같은 다양한 질병의 병인과 관련 있다.
따라서, 혈전증의 치료를 위해 트롬빈 억제제의 투여는 성공적인 효과가 있다. 현재까지 공지된 중요 트롬빈 억제제로는 항트롬빈 III-헤파린 및 히루딘(Hirudin)이 있다. 항트롬빈 III는 분자량이 58 kDa인 혈장에 존재하는 단백질이다. 항트롬빈 III는 먼저 다당체인 헤파린과 결합한다. 그후 항트롬빈 III-헤파린-복합체는 트롬빈에 결합하여 트롬빈을 억제한다. 트롬빈과 항트롬빈 III로 구성된 매우 안정한 복합체가 생기고 항트롬빈 III는 트롬빈으로부터 단리된다. 트롬빈 외에 항트롬빈 III는 예를 들어 응고인자 Xa와 같은 다른 세린 프로테아제(Serin protease)와도 결합한다[참조: Pratt, C. W. 및 Church, F. C.(1991) "Antithrombin: Structure and Function", Seminar in Hematology 28: 3-9 ].
거머리(Hirudo medicinallis)로 부터 단백질 히루딘을 단리하였다. 분자량은 약 7 KDa이며, 트롬빈과 이온성 상호작용에 의해 결합한다. 이것은 트롬빈에 대해 특이적이다 [참조: Johnson, P. H. et al. (1989) "Biochemistry and Genetic engineering of hirudin", Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15: 302-315].
본 발명의 설명
상기 선행 기술에서 언급한 현재까지 공지된 트롬빈 억제제 외에도 상이한 작용기전이나 향상된 활성도를 갖는 추가의 억제제가 필요하다.
본 발명은 트롬빈 억제제이고 포유동물의 혈액을 빨아먹는 곤충의 타액으로부터 단리된 천연 또는 합성된 단백질을 제시하는 것이다.
흡혈 빈대(Triatoma pallidipennis)에서 단리된 본발명에 따른 단백질이 바람직하다.
본 발명에 따른 단백질은 천연적으로 존재할 수 있다. 단백질은 타액을 정제하면 수득된다. 또한, 단백질을 타액선에서 얻거나 단백질 합성 세포를 타액선으로 부터 얻고 이를 배양하여 얻는다. 이 세포 배양에서 생산된 부유물을 수득하고 후처리한다. 세포 부유물을 정제하고 본 발명에 따른 단백질을 단리하고 순화한다. 모든 단리 및 정제의 순화과정은 본 발명의 일부이다. 바람직하게는, 단리 및 정제의 순화과정 중의 본 발명에 따른 단백질은 약제학적인 용도로 사용될 수 있다. 따라서 정제도는 총단백질량에 대해 트롬빈 억제제 50%이고, 총단백질량에 대해 바람직하게는 트롬빈 억제제 85%, 더욱 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 99%이다.
본 발명은 단지 트라이아토마 팔리디페니스로부터 단리되는 단백질 뿐만 아니라 다른 곤충에서 합성되는 단백질까지도 포함할 수 있다. 가장 바람직하게 여겨지는 트라이아토마 팔리디페니스 그룹으로부터 단리되는 단백질 외에 추가의 단백질도 바람직하다 [예: Triatoma infestans, Triatoma dimidiata, Triatoma maculata, Rhodnius prolixus, Panstrongylus megistus 및 Panstrongylus infestans에서 생산된 단백질].
또한, 본 발명에 따른 단백질을 합성하여 생산할 수 있다. 그 목적으로 문헌[예: J.M. SEWART and J.D. YOUNG, San Francisco, 1969 and J. MEIENHOFER, Hormonal Proteins and Peptides Vol. 2 p 46, Academic Press (New York), 1973 및 E. SCHODER and K. LUBKE, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York) 1965]에 따른 단백질 합성이 이용된다. 합성된 단백질에는 공지된 방법으로 제조되는 재조합 단백질도 포함된다. 작용 생물에 따라 본 발명에 따른 단백질은 글리코실화되어 있거나, 원핵 세포에서 합성될 때 비글리코실화되어 있다.
본 억제제의 기능은 다양한 시험 시스템으로 조사한다. 실시예 2 내지 4 및 9에서 통용되는 시험 방법을 기술하였다.
본 발명에 따른 단백질은 포유동물의 혈액을 빨아먹는 곤충으로부터 얻어진다. 본 단백질은 통상적인 방법으로 타액선의 세포에서 합성된다. 따라서 타액으로부터 제조된 단백질을 단리할 수 있다. 본 발명에 따른 단백질은 단지 이와 같은 제조방법 및 단리에 의해 한정되지 않는다. 오히려 타액에 존재하고 거기에서 단리되는 모든 합성 제조된 본 발명에 따른 트롬빈 억제제를 포함한다.
성숙 단백질의 N-말단 서열
본 발명은, 추가로,
a) 활성 단백질로서 하기의 일반식(1)의 N-말단 서열, 즉
을 갖거나,
b) 활성 단백질로서, 활성 단백질의 활성도에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 N-말단 아미노산 서열의 1 또는 2개의 아미노산이 치환되거나 결실되거나 삽입되는 a)에서 언급한 N-말단 아미노산 서열의 대립 형질성 변이를 갖거나,
c) 활성 단백질로서, 활성 단백질의 활성도에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 a) 및 b)에서 언급한 N-말단 서열의 후번역 변이를 갖는 것을 특징으로 하는, 트롬빈 억제제이고 포유동물의 혈액을 빨아먹는 곤충의 타액, 바람직하게는 트라이아토마 팔리디페니스로부터 단리되는 것을 특징으로 하는, 천연 또는 합성된 단백질에 관한 것이다.
성숙 단백질의 서열
본 발명은, 또한, 트롬빈 억제제이고,
d) 활성을 갖는 성숙 단백질로서, i) 서열 동정 번호 1 (Sequence Identification No. 1), ii) 서열 동정 번호 2 (Sequence Identification No. 2), iii) 서열 동정 번호 3 (Sequence Identification No. 3) 및 iv) 서열 동정 번호 4 (Sequence Identification No. 4) 중 어느 하나의 서열을 갖거나,
e) 활성을 갖는 성숙 단백질로서, 활성 단백질의 활성도에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 아미노산 서열중 1개 이상의 아미노산이 치환되거나 결실되거나 삽입된 d)에서 언급한 아미노산 서열의 대립 형질성 변이를 갖거나,
f) 활성을 갖는 성숙 단백질로서, 활성 단백질의 활성도에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 d) 및 e)에서 언급한 서열의 후번역 변이를 가짐을 특징으로 하는 단백질에 관한 것이다.
30개 이하의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 모든 대립형질성 변이체는 본 발명에 따른 단백질의 그룹에 속한다. 바람직하게는 20개 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 10개 이하의 아미노산, 가장 바람직하게는 1 내지 9개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 삽입된다.
신호서열(Signal-sequence)을 갖고 있는 성숙 단백질의 서열
본 발명에 따른 단백질의 추가의 양태는,
g) 단백질이 i) 서열 동정 번호 5 (Sequence Identification No. 5), ii) 서열 동정 번호 6 (Sequence Identification No. 6), iii) 서열 동정 번호 7 (Sequence Identification No. 7) 및 iv) 서열 동정 번호 8 (Sequence Identification No. 8) 중 어느 하나의 서열을 갖거나,
h) 활성을 갖는 성숙 단백질로서, 활성 단백질의 활성도에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 아미노산 서열 중 1개 이상의 아미노산이 치환되거나 결실되거나 삽입되는 g)에서 언급한 것 중 어느 하나의 아미노산 서열의 대립 형질성 변이를 갖거나,
i) 단백질이 활성 단백질의 활성도에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 g) 및 h)에서 언급한 것 중 어느 하나의 서열의 번역 후 변이를 가짐을 특징으로 하는, 신호 서열 및 본 발명에 따른 성숙 단백질로 구성된 단백질이다.
32개 이하의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 모든 대립형질 성 변이체는 본 발명에 따른 단백질의 그룹에 속한다. 바람직하게는 21개 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 11개 이하의 아미노산, 가장 바람직하게는 1 내지 9개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 삽입된다.
재조합 단백질인 본 발명에 따른 단백질이 가장 바람직하다. 이때 단백질은 글리코실화될 수 있다.
본 발명에 따른 단백질은 "신호 서열" 및 성숙 단백질의 서열로 부터 성립되는 성숙 단백질에 상응하는 전구 단백질를 포함한다. 이때 "신호 서열"이 성숙 단백질보다 먼저 실행된다. 성숙 단백질은 상기 a)에 언급된 N-말단 서열로부터 시작된다. "신호 서열"은 소포체(endoplasmic reticulum) 내부로 들어가는데 필요하다.
본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 cDNA 또는 DNA
본 발명은,
aa) cDNA 또는 DNA가 i) 서열 동정 번호 1 (Sequence Identification No.1), ii) 서열 동정 번호 2 (Sequence Identification No. 2), iii) 서열 동정 번호 3(Sequence Identification No. 3) 및 iv) 서열 동정 번호 4 (Sequence Identification No. 4)중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하거나,
bb) cDNA 또는 DNA가, 활성 단백질의 활성도에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 아미노산 서열중 1개 이상의 아미노산이 치환되거나 결실되거나 삽입되는 aa)에서 언급한 것중 어느 하나의 아미노산 서열의 대립 형질성 변이를 갖는 아미노산을 암호화함을 특징으로 하는, 성숙 트롬빈 억제제를 암호화하는 cDNA 또는 DNA를 추가로 포함한다.
대립 형질성 변이체는 상기 "성숙 단백질"에서 정의한 바와 같다.
추가로 본 발명은,
cc) cDNA 또는 DNA가 i) 서열 동정 번호 9 (Sequence Identification No.9), ii) 서열 동정 번호 10 (Sequence Identification No. 10), iii) 서열 동정 번호 11(Sequence Identification No. 11) 및 iv) 서열 동정 번호 12 (Sequence Identification No. 12)중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖거나,
dd) cDNA 또는 DNA가, cc)에서 언급한 뉴클레오티드 서열의 대립형질성 변이체에 의해 암호화되는 단백질의 활성도에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 1개 이상의 뉴클레오티드가 치환되거나 결실되거나 삽입된 cc)에서 언급한 것 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열의 대립 형질성 변이를 갖는 것을 특징으로 하는, 트롬빈 억제제를 암호화하는 cDNA또는 DNA을 포함한다.
모든 DNA 구조는 또한 동의성(degeneracy) 유전암호를 기본으로 하여 그 자신의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드가 교환될 때, 본 발명에 따른 열거된 서열에 속한다. 이러한 뉴클레오티드의 교환은 명백하고 이에 상응하는 아미노산은 모든 생화학책에 공공연하게 명시되어있다 (참조: R. KNIPPERS, 1982, 3. Auflage, Molekulare Genetik, Georg Thieme Verlag).
30개 이하의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 모든 대립형질성 변이체는 본 발명에 따른 단백질의 그룹에 속한다. 바람직하게는 20개 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 10개 이하의 아미노산, 가장 바람직하게는 1 내지 9개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 삽입된다.
추가로, 본 발명은, 성숙 단백질을 암호화는 서열외에 신호서열을 함유하는 유전물질도 포함한다. 이 신호서열은 cDNA 은행(bank)에서 발견되며, 다른 신호서열은 단백질의 발현 및 분비를 가능케 하는 것으로 추정된다.
따라서, 본발명은,
ee) cDNA 또는 DNA가 i) 서열 동정 번호 13 (Sequence Identification No.13), ii) 서열 동정 번호 14 (Sequence Identification No. 14), iii) 서열 동정 번호 15(Sequence Identification No. 15) 및 iv) 서열 동정 번호 16 (Sequence Identification No. 16) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖거나,
ff) cDNA 또는 DNA가, ec)에서 언급한 뉴클레오티드 서열의 대립 형질성 변이체에 의해 암호화되는 자신의 신호 서열을 포함하는 성숙 단백질의 활성도에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 1개 이상의 뉴클레오티드가 치환되거나 결실되거나 삽입된, ee)에서 언급한 것 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열의 대립형질성 변이를 갖는 것을 특징으로 하는, 신호 서열을 포함하는 성숙 트롬빈 억제제를 암호화하는 cDNA 또는 DNA에 관한 것이다.
대립형질성 변이체는 상기 dd)에서 정의한 바와 같다.
대립형질성 변이체가 본 발명에 따른 단백질의 그룹에 속할 수 있는지 확인하기 위하여 단백질이 활성을 나타내면, 신호 서열이 운반되는 경우에도 항상 성숙단백질의 기능을 측정한다. 신호 서열이 생성되어야 신호 서열의 제거후 얻어지는 단백질의 기능을 항상 측정할 수 있다.
추가로, 본 발명은 본 발명에 따른 성숙 단백질의 영역을 특징적으로 인지하는 결합물질 (예: 펩티드 및 이의 유도체), 단일쇄-단백질(Single Chain Proteins), 항체 또는 항체의 단편을 포함한다. 본 발명에 따른 단백질이 정제된다면, 단일클론성 항체를 제조하는 것은 전문가에게는 간단한 일이다. 여기서는 공지된 방법(Koehler 및 Milstein 법 및 추가 실행 방법)을 사용한다. 여기서 각각 통상의 방법에 의해 생쥐를 정제된 단백질로 여러번 면역시키고, 비장세포를 취하여 적당한 암세포와 융합시킨다. 이 잡종이 최종적으로 선택된다.
본 발명의 단백질은 흡혈 빈대 트라이아토마 팔리디페니스의 타액으로부터 단리될 수 있다. 겔 여과법 및 최종 트롬빈-세파로즈상의 친화성 크로마토그래피 법에 의해 정제된다(실시예 1 참조). 단백질은 전술한 아미노산 서열을 갖는다. 분자량은 약 l8OOO ± 3000 Da이다 (실시예 2 참조). 등전점은 실시예 8에서 기술한 방법을 사용하면 pH 4.5 내지 5.2의 영역이다.
본 발명의 단백질은 응혈반응, 혈소판 활성화반응 및 아미도 분해성 시험에서 트롬빈의 작용을 억제한다. 시험 시스템은 실시예 2, 3, 4 및 9에서 설명되어 있다. 단백질은 8 nmol/l의 농도로 1.27 nmol/l의 트롬빈 농도에서 응혈을 억제시킨다. 트롬빈-유도 혈소판-응집반응은 15 ng/ml의 농도에서 100%까지 억제된다. 이 농도는 첨가된 0.06 IU/ml=0.812 pmol/ml (IU=국제단위)의 트롬빈 농도에서, 본 발명에 따른 단백질 대 트롬빈의 비는 약 1:1에 상응한다. 반대로 본 발명의 단백질은 본 발명에 따른 단백질 대 트롬빈의 비가 1:87인 경우 아미도 분해성 시험에서 트롬빈의 활성도를 약 50%까지만 억제한다. 본 발명의 단백질은 35 nmol/l의 농도에서 트롬빈-시간(1 IU/ml)을 약 5배정도 연장시켰다.
본 발명의 단백질은 트롬빈에 특징적이다. 다른 세린 프로테아제(예: 인자 Xa 또는 트립신)를 40배의 과량에서도 불충분하게 억제한다 (실시예 7 참조).
본 발명에 따른 DNA를 갖는 벡터
발명의 일부는 부가적으로 본 발명에 따른 cDNA 또는 DNA, 추가로 적당한 프로모터 및 경우에 따라 적당한 인핸서를 함유하는 벡터이다. 또한 "개시 서열"을 포함한다. 벡터는 유럽 특허 공보(예: EP 0 480 651, EP 0 462 632, 및 EP 0 173 177)에 자세히 기록되어 있다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명에 따른 벡터로 형질 전환시킨 진핵 또는 원핵 세포이다.
대립 형질성(allelic) 변이체
대부분의 결실, 삽입 및 치환은 본 발명의 단백질의 특성에 있어서 결정적인 변화를 일으키지 않는다. 치환, 결실 또는 삽입의 정확한 효과를 미리 예상하기는 어렵기 때문에 변화된 단백질의 기능을 본 발명에 따른 단백질의 기능과 비교하여야 한다. 이를 위하여 사용한 방법은, 예를 들면, 실시예 2 내지 4및 9에서 제공된다. 표준으로서 서열 동정 번호 1 내지 4에 따른 단백질, 또한 실시예 1에 따라 정제된 단백질 및 비교 단백질을 위한 실시예 1의 정제 방법이 제공된다.
유전 암호는 동의성이 있는데, 이는 다시 말하면 대부분의 아미노산은 3개의 뉴클레오티드로 된 코돈으로부터 암호화 된다는 것을 의미한다. 따라서, 뉴클레오티드 영역에서의 어떤 대립 형질성 변이는 아미노산 서열의 변화를 일으키지 않는다. 따라서 주로 DNA 영역에서의 대립형질성 변이는 일어나고 아미노산 서열에 2차적으로 작용할 수 있다.
본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 cDNA 또는 DNA 서열은, 본 발명에서 기술된 특징적인 단백질과 같은 활성도를 실질적으로 갖는, 본 발명에 따른 여러 종류의 단백질을 제조하기 위해 통상적인 기술에 따라 변이될 수 있다. 활성도는 실시예 2 내지 4 및 9에서와 같이 측정된다.
아미노산은 단백질의 기능에 실질적 영향을 미치지 않으면서 도표 1에서 기술한 바와 같이 치환될 수 있다. 각각의 경우에 단백질의 기능이 변화하는지를 활성도 시험으로 결정한다.
표 1: 단백질에서의 아미노산의 통상적인 치환
본래의 아미노산 예를 들어 제시한 치환
기능 또는 면역학적 성질은 치환시 도표 1에서 언급한 아미노산 보다 덜 보존적인 치환체를 선택할 경우에 실질적으로 변화된다. 이러한 실질적 변화는 이의 구조 및 기능적 기에 있어서 보다 더 상이한 아미노산을 갖는 치환을 통해 유발된다. 실질적 변화는 3차구조를 변화시키고(변화시키거나), 예를 들어 접힘-주름(folding-platte) 구조 또는 나선구조에 영향을 미친다. 또한 하전 및 소수성 연쇄의 전환이 변화 중에 관찰될 수 있다.
변이는 기술한 단백질의 상동성(유사성)에 의해 정의된다. 상동성의 표현은 유사 아미노산(예: 표 1) 및 아미노산의 서열에서의 결실을 포함한다(상동성=유사성). 본 발명에 따른 단백질은, d) 또는 g)에서 언급한 서열(서열 동정 번호 1 내지 8)을 통해 정의되고, 추가로 실시예 1에 따른 정제에 의해 제조되는 바와 같이 본 발명에 따른 구조의 80%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 및 가장 바람직하게는 98%이상의 상동성을 갖는다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 DNA 또는 cDNA의 변이체를 포함한다. 변이된 서열을 본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 DNA 서열과 제한된 조건하에 교잡한다( aa); cc) 및 ce)에서 언급한 서열 참조). cDNA 또는 DNA 서열은, 본 발명에 따른 cDNA 또는 DNA 서열에 대해 70%, 바람직하게는 82%, 더욱 바람직하게는 90% 및 가장 바람직하게는 95%이상의 동일성을 나타내는 짧은 (15개 이하의 뉴클레오티드) 결실 및 삽입을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다( aa), cc) 및 ec) 참조), 짧은(15개 이하의 뉴클레오티드) 결실 및 삽입을 포함하는 동일성은 교잡법에 의해 측정된다(참조 : R. KNIPPERS, Molekulare Genetik, 1982, dritteAuflage, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York).
번역 후(posttranslational) 변이
전술한 번역후 변이는 번역 중 또는 후에 나타나는 변화를 말한다. 여기에는 글리코실화, 디설피드-결합의 형성, 예를 들어 히루딘과 관련하여 설명된 황산염화와 같은 아미노산의 화학적 변이등이 있다(참조 : J.W. FENTON (1989) "Thrombin Interactions with Hirudin", Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15: 265-268).
글리코실화는 소포체 및(또는) 골지체의 실질적 기능이다. 올리고당류의 서열 및 분지는 소포체에서 형성되고 골지체에서 변화된다. 올리고당류는 N-결합된 올리고당류(예: 아스파라긴-결합된) 또는 0-결합된 올리고당류(예: 세린-, 트레오닌- 또는 히드록실 리신-결합된) 일 수 있다. 글리코실화의 형태는 형성되는 세포 종류 및 상응하는 세포 종류의 형태에 따라 다르다. 글리코실화의 범위 및 형태는 유럽특허 제 EP 0 222 313호에서 기록된 바와 같이 물질에 의해 달라진다. 다양한글 리코실화는 단백질의 기능을 변화시킨다.
단백질은 자주 사슬 내에 공유결합을 형성한다. 이 디설피드-결합을 두개의 시스테인 사이에서 형성된다. 여기서 단백질은 특징적으로 접힌다. 디설피드-결합은 단백질의 3차구조를 안정화시킨다.
추가로 국제특허 제 WO 9l/1O684호 에서와 같이 아미노산을 변화시킬 수 있다. 또한 단백질은 황산염화될 수 있다. 이 변화를 히루딘과 관련하여 설명한다.
본 발명에 따른 단백질의 단리 및 제조
본 발명은, 추가로 본 발명에 따른 cDNA 또는 DNA를 함유하는 벡터로 형질 전환된 세포의 배양 및 단백질의 단리 및 정제를 포함하는 본 발명에 따른 단백질의 제조방법도 포함한다.
단백질은 바람직하게는 실시예 1에 따라 정제된다. 하지만 다른 단리 및 정제방법도 가능하다(참조 : Methods of Enzymology, Volume 182: Guide to Protein Purification, ed. Murray P. DEUTSCHER, Academic Press, 1990; Protein Purification Application - A Practical Approach, ed. E,L.V. HARRIS and S. ANGEL, IRL-Press 1990; Protein Purification, Principles and Practice, Ropert SCOPES, Springer-Verlag 1982; Protein Furification, Principles, High Resolution Methods and Applications, ed. H.C.JANSON and L.RYDEN, VCH publishers 1989).
본 발명은, 또한 단백질을 단리하고 하나 이상의 컬럼상에서 정제하며 최종적으로 농축시킴을 특징으로 하는 본 발명에 따른 단백질의 정제 방법을 포함한다. 컬럼 크로마토그래피 또는 컬럼 흡착크로마토그래피가 바람직하다.
본 발명은, 따라서 컬럼(Superose 12 HR-컬럼)상에 타액을 놓고 용출시키며, 미리 트롬빈을 결합시킨 컬럼(CH-활성인 세파로즈 컬럼)상에 다시 놓고 용출시킴을 특징으로 하는 본 발명에 따른 단백질의 정제 방법을 포함한다. 정제법은 실시예 1에 자세히 설명되어 있다.
치료제로서의 용도
본 발명에 따른 단백질은 약물학적 효과를 갖고 있어서 약제학적 활성물질로서 사용가능하다. 본 발명은, 또한 본 발명에 따른 단백질 및 이의 혼합물을 함유하는 약제를 포함한다. 추가로, 본 발명은 약제학적으로 허용되고 사용되는 화합물 및 담체의 존재하에 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 혼합물을 함유하는 약제학적 혼합제제를 포함한다. 또한 본 발명은 본 발명에 따른 약제학적으로 활성인 단백질 또는 이의 혼합물 및 약제학적으로 허용되는 염 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 혼합제제를 포함한다.
특히 서열 동정 번호 1내지 4의 본 발명에 따른 단백질은 트롬빈의 활성을 억제한다.
트롬빈 활성의 억제도는, 응혈 시험(실시예 2 참조), 혈소판-응집 시험(실시예 3 참조), 아미도 분해성 시험(실시예 4 참조)에서 및 트롬빈-시간(실시예 9 참조)에 의해 결정된다. 트롬빈-시간의 측정은 바람직한 시험 시스템이다.
본 발명에 따른 단백질은 10 내지 60 nmol/l(트롬빈 농도 1 IU/ml)의 농도에서 트롬빈-시간을 연장시킨다. 58 nmol/l의 농도에서 9배 연장된다. 고 농도는 시험 시스템을 방해하지 않으면서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 단백질은 10 내지 200의 농도로 사용된다.
시험관내 실험의 결과, 본 발명에 따른 단백질을 약제로서 또는 투약처리를 위해 사용한다. 이 실험 결과는, 응혈 시험에서 확정된 실험조건에 해당하기 때문에 시험관내 시험으로부터 시험관내 시스템에 전송되도록 한다 (M. TALBOT(1989) "Biology of Recombinant Hirudin, A mew Prospect in the Treatment of Thrombosis" Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15: 293-301). 본 발명의 단백질은, 따라서 혈전증 또는 불안전한 협심증 또는 동맥경화증을 치료하기 위하여, PTCA/PTA(풍선-카테터(catheter)에 의한 혈관성형술)후 따른 혈관의 재폐색을 예방하기 위하여 또는 혈액 투석시 응혈을 방지하기 위해 사용된다. 본 발명의 단백질을 혈전성 및/또는 동맥경화성 질환의 치료를 위해 포유동물, 특히 사람에게 항혈전성 및/또는 항동맥경화성 약제로서 투여할 수 있다. 동맥경화성 응고물(혈소판)의 제거, 내피조직의 파괴(예:패혈증), 장기이식 또는 불안전한 협심증에 투여할 수 있다. 또한 심근 경색의 치료후 및/또는 섬유소 용해 또는 혈관성형에서 다시 폐색되는 것을 막기 위해 사용할 수 있다. 여기서 본 발명의 단백질을 카테터의 삽입 전, 중 및/또는 후에 투여할 수 있다.
본 발명은, 추가로 (I) 혈전증 또는 불안전한 협심증 또는 동맥경화증을 치료하기 위하거나 PTCA/PTA후 따른 혈관의 재폐색을 예방하기 위하거나 혈액 투석시 응혈을 방지하기 위한 약제의 제조를 위한 단백질 또는 이의 혼합물의 용도; (II) 이러한 약제를 필요로 하는 환자에게 질병을 억제할 수 있는 본 발명의 단백질 함량을 투여함을 포함하는 것을 특징으로 하여, 혈전증 또는 불안전한 협심증 또는 동맥경화증을 치료하기 위하거나 PTCA/PTA후 따른 혈관의 재폐색을 예방하기 위하거나 혈액 투석시 응혈을 방지하기 위한 방법; (III) 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 혼합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및 첨가물의 처치를 포함함을 특징으로 하는, 혈전증 또는 불안전한 협심증 또는 동맥경화증을 치료하기 위하거나 PTCA/PTA후 다른 혈관의 재폐색을 예방하기 위하거나 혈액 투석시 응혈을 방지하기 위한 약제학적 혼합제제에 관한 것이다.
이 치료 작용을 위하여 각각 상이한 함량이 적당하다. 이는 예를 들어 사용되는 단백질, 환자, 투여방법 및 치료 상태에 따른 방법과 난이도에 따라 다르다. 하지만 일반적으로 일일 용량이 체중 kg당 2 ㎍ 내지 2000 ㎍에 해당할 때 동물에서 만족할만한 결과를 얻을 수 있다. 큰 동물, 예를 들어 사람에서는 권장되는 일일 용량은 실시예 1에 따른 정제 단백질을 사용시 체중 kg당 2 ㎍ 내지 2000 ㎍이다. 예를 들어, 이 용량은 목적에 따라 1일 4번까지 나누어 복용할 수 있다. 급성 혈전증의 단기 치료에 사용되는 일일 용량은 체중 kg당 20 ㎍ 내지 2000 ㎍으로 만성치료에 사용되는 일일용량인 체중 kg당 2 ㎍ 내지 2000 ㎍보다 높다. 또한 본 발명의 단백질을 피하에 투여할 때 만족할만한 결과를 얻을 수 있다. 바람직하게는 혈전이 형성된 체내 부위에 직접 주사하는 것이다.
본 발명에 따른 단백질은 통상의 방법, 특히 바람직하게는 주사액 또는 현탁액으로 투여할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 혼합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및 첨가물의 처치를 포함하는 약제학적 혼합제제를 제시한다. 이러한 혼합제제는 공지된 방법으로 제조될 수 있다 ( 참조: Remington's Phamaceutical Science, l5th ed Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980)).
제 1도는 트라이아토마 팔리디페니스(Triatoma pallidipennis)로부터 제조된 본 발명에 따른 단백질 첨가시 트롬빈-시간의 연장을 나타내고,
제 2도는 아미도 분해성 시험에서의 트롬빈 활성도의 억제
(트라이아토마 = 트라이아토마 팔리디페니스로부터 제조된 트롬빈 억제제)를 나타내며,
제 3도는 응혈 시험에서의 트롬빈 활성도의 억제를 나타낸다.
실시예
실시예 1 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액 채취 및 본 발명의 단백질의 정제
흡혈 빈대를 그의 프로브시스(Probszis)의 기계적 자극을 통해 그의 타액을 단리하기 위하여 자극하였다. 타액을 유리판에 놓고 실리콘화되고 탈복된 파스테르피펫으로 모았다.
타액을 냉동건조하고 증류수 중에 2.5 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 이 용액 2ml를 여과하였다("Superose 12 HR l6/5O"-컬럼(Pharmacia)상에서, Tris/HCl 10 mmol/l, pH7.4, 0.0001% "Pluronic F68"중에). 응혈 시험 (실시예2)에서 활성인 분획을 정제하고, 제조자의 지시에 따라 트롬빈이 미리 결합되어있는 CH-활성화된 세파로즈(Sepharose, Pharmacia)상에 걸었다. 본 발명의 단백질은 트롬빈이 존재하는 컬럼에 결합하였다. 그 후, 타이로드(Tyrode)-완충액(혈청 알부민이 없는)으로 세척한 후 일차적으로 초산 나트륨 10 mmol/l, pH 4.5로, 이차적으로 글리신 1Ommol/l, pH2.5로 용출시켰다. 용출물을 pH7로 조절하였다. 10 mmol/l 글리신 용출물은 정제된 본 발명의 단백질을 함유하였다. 이것은 응혈 시험(실시예 2 참조), 혈소판-응집 시험(실시예 3 참조), 아미도 분해성 시험(실시예 4 참조)에서 활성을 나타내었고 트롬빈-시간(실시예 9 참조)이 연장되었다. 이 제제는 SDS-겔 전기영동에서 측정되는 오염은 함유하지 않았다.
실시예 2 : 응혈 시험에서 트롬빈 활성도의 억제
소혈청 알부민(0.1 mol/l NaHCo3, pH9.5중 0.1%)으로 덧칠한 마이크로측정판(microtiterplate)에 20 mmol/l HEPES, pH7.4 80 μl; 0.l5mmol/l NaCl; 20 mmol/l CaCl2 20 μl; 본 발명의 단백질 희석액 100 μl(5-5Ong) 및 트롬빈 20 μl(0.03 IU=0.03 국제단위)를 피펫팅하였다. 37℃에서 2분간 배양한 후 피브리노겐(5mg/1) 1OOμl를 추가하고 37℃에서 40분간 배양하였다. 최종적으로 4O5nm에서 흡수도를 측정하였다. 본 발명의 정제된 단백질 45 ng(=8 nmol/l)은 피브리노겐 분해를 완벽하게 억제하였다. 동일한 시험조건 하에 히루딘은 동일한 작용(8 nmol/l로 완벽하게 억제)을 하였다(제 3도 참조).
실시예 3 : 혈소판-응고 시험에서 트롬빈 활성도의 억제
여과된 혈소판(3OOOOO/ml) 5OOμl을 본 발명의 단백질(5-1OOng)과 함께 37℃에서 1분간 배양하였다. 그후 트롬빈(0.06 IU/ml)으로 응집을 유도하고 응집측정기로 응집을 기록하였다. 본 발명의 정제된 단백질에 의한 측정치는 15 ng/ml의 농도에서 응집을 100%까지 억제함을 나타내었다.
실시예 4 : 아미도 분해성 시험에서 트롬빈 활성도의 억제
마이크로측정판에서 100 mmol/l Tris/HCl, pH7.4 80 μl 150 mmol/l NaCl 및 0.03 IU (1.35 nmol/l) 트롬빈 및 본 발명의 단백질 희석액 100 μl을 37℃에서 10분간 배양한 후 기질 S2238 100 μl(50 nmol) (Kabi Vitrum)과 반응시켰다. 37℃에서 30분간 배양한 후 405 nm에서 흡수도출 측정하였다. 630 ng(117 nmol/l)는 트롬빈 활성도를 약 50%까지 억제하였다. 히루딘은 6 nmol/l의 농도로 트롬빈 활성도를 85%까지 억제하였다(제 2도 참조).
실시예 5 : N-말단 아미노산 서열의 결정
본 발명의 정제된 단백질은 제조자의 지시에 따라 자동 아미노산 분석기(Applied Biosystems, Inc.)를 사용하여 서열을 결정하였다. 1 내지 21개의 아미노산 서열(N-말단으로부터)은 하기와 같다: Ala-Glu-Gly-Asp-Asp-Cys-Ser-Leu-Glu-Lys-Ala-Met-Cly-Asp-Phe-?-Pro-Glu-Glu-Phe-Phe("?"는 불완전하게 동정됨을 의미한다. 이 아미노산은 어느 정도의 확률로서 리신으로 추정된다.)
실시예 6 : SDS-겔 전기영동 및 분자량의 결정
본 발명의 단백질을 환원 상태(Dithiothreit로 환원) 및 비환원 상태로서 분자량 표식(Electrophoresis Calibration Kit of Pharmacia), 포스포릴라제 b (94 kDa), 알부민 (67 kDa), 오브알부민 (43 kDa), 카본산 무수물 (30 kDa), 트립신 억제제(20.1 kDa) 및 락트알부민 (14.4 kDa)과 함께 12.5%의 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에 적재한 후 라에밀(Laemil)에 따른 전기영동(1970, Nature 227, 680- 685)에 따라 색소(Coomassie briliant blue)로 염색하였다. 환원 상태에서 본 발명의 단백질은 전기영동 동안에 트립신 억제제의 조금 위까지 이동한다. 이는 분자량 약 21OOO Da에 해당한다. 비환원 상태에서 본 발명의 단백질은 트립신 억제제와 락트알부민의 중간까지 이동하는데 이는 분자량 약 l8OOO Da에 해당한다.
실시예 7 : 본 발명의 단백질은 세린 프로테아제 인자 Xa 및 트립신을 억제하지 않는다.
인자 Xa 및 트립신의 활성도는 하기의 시험으로 측정되었다. 80 μl의 50 mmol/l Tris/HCl pH8.0, 227 mmol/l NaCl에, 인자 Xa를 결정하기 위하여 인자 Xa(American Diagnostica) 0.004 IU (0.653 pmol) 및 본 발명의 단백질 0.5 ㎍ (28 pmol)을 그리고 트립신 결정을 위하여 트립신 (Sigma) 0.004 IU (0.019 pmol) 및 본 발명의 단백질 0.0016 ㎍ (0.817 pmol)을 가하고, 37℃에서 2분간 배양하였다. 기질 S2222 (Kabi Vitrum) 0.05 μmol의 첨가후 37℃에서 20분간 배양하고 최종적으로 흡수도를 405 nm에서 측정하였다. 이 부가물의 흡수도는 단백질을 포함하지 않는 부가물의 것과 똑같이 높았다. 즉, 단백질은 인자 Xa 및 트립신 둘다 억제하지 않았다.
실시예 8 : 등전성으로 맞춤
본 발명의 단백질을 pH 3 내지 9의 영역 (Pharmacia)에 등전성으로 맞추기 위한 겔위에 적재하고 표준 단백질 (Calibration Kit PH 3- 10 of Pharmacia)로 맞추었다. 본 발명의 단백질의 초점을 맞춘 위치는 콩 트립신 억제제 (I.P.=4.55) 및 β-락토알부민 (L.P.=5.2)의 중간에 존재하였다.
실시예 9 : 트롬빈-시간의 연장
시험 혈장으로부터 얻은 외인성 트롬빈의 활성을 측정하였다. 혈장 0.1 nil 에, 다양한 희석액(6 내지 58 nmol/l)중의 본 발명의 단백질 용액 50 μl 및 pH 7.6인 디에틸발비투레이트 (Diethylbarbiturate)-아세테이트-완충액 50 μl을 가하고, 37℃에서 1분간 배양하였다. 트롬빈 용액 (3 IU/ml) 0.1ml의 첨가후 응혈이 일어나기 까지의 시간을 측정하였다(Biomatic 2000 Coagulometer of Sarstedt). 35nmol/l의 농도로 존재하는 본 발명의 단백질의 응혈시간은 표준물질에 비교하여 5배 더 연장되었다(제 1도 참조).
실시예 10 : Lys C로 분해후 내부 아미노산 서열의 결정
본 발명의 정제된 단백질(59 ㎍)을 10%의 머캅토에탄올로 환원(N2하에 실온에서 2시간)시킨 후 4-비닐피리딘으로 전환시켰다(N2하에 실온에서 2시간). 25 mmol/l Tris/HCl, pH 8.5; 1 mmol/l EDTA에 대한 투석후 샘플을 Lys C (Boehringer Mannheim) 1 ㎍과 반응시키고 37℃에서 6시간 배양하였다. 이 분해물을 컬럼(Supersper RP-18, 4 ㎛ (250 × 4 mm, MZ-Analysentechnik, Mainz)상에 표시하고 구배(H2O중 0.1% TFA-70% 아세토니트릴중 0.08% TFA)로 용출시켰다(Waters의 HPLC- 장치). 280 nm 및 214 nm에서의 흡수도가 나타나고 이 용출물이 단리되었다. 흡수 극대에 상응하는 분획을 건조하고 H2O 30 μl에 첨가하였다. 각각의 분획을 제조자의 지시에 따라 자동 아미노산 서열 분석기(Applied Biosystems Inc.)중에서 분석하였다. 따라서 하기의 서열이 얻어졌다(N- 말단으로부터 시작, "?"은 불확실하게 동정됨을 뜻함):
1. Ala-Met-Gly-Asp-Phe-Lys-Pro-Glu-Glu-Phe-Phe-?-Gly-Thr-Arg(?)-Tyr-Leu-Ala ( 아미노산 Arg의 결정은 불확실함 )
2. Gly-Phe-Thr-Gln-Ile-Val-Glu-Ile-Gly-Tyr-Asn-Lys-
3. Asn-Gly-Glu-Gln-Tyr-Ser-Phe-Lys-
실시예 11 : 본 발명에 따른 cDNA 분자의 클로닝
본 발명에 따른 단백질의 N-말단의 서열이 밝혀진후 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 조사하였다(WO 9O/O786l 참조).
aa) PCR로 특정 샘플의 제조
본 발명에 따른 cDNA를 조사하기 위하여, 상기에서 에드만(Edman)-분해법에서 조사된 아미노산 서열로부터 유도된 프라이머(primer)를 먼저 합성하였다. 합성된 프라이머의 올리고뉴클레오티드 서열은, PCR (Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 본 발명에 따른 cDNA의 단편을 증폭시키는데 사용되었다(참조 : 미국특허 제4,800,159호).
두개의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 제조되었다. 이들은 상기에서 부분적으로 결정된, 본 발명에 따른 완전한 단백질 및 이의 단편중 하나의 N-말단 영역의 아미노산 서열로부터 유도되었다. 여기서 하기의 아미노산 서열이 사용되었다:
완전한 단백질의 N-말단 서열:
단편의 N-말단 서열:
주형(template)은 폴리-A+(poly-A+) RNA로부터 제조되고 상기에서 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선으로부터 단리된 cDNA로 구성되어 있다 (SAMBROCK et al,: Molecular Cloning ( Chapter7, pp 18-22, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)).
주형-개시 단편 (센스(Sense) 프라이머):
비주형-개시 단편 (안티센스(Antisense) 프라이머) :
(여기서, A는 디옥시아데노신, C는 디옥시시티딘, G는 디옥시구아노신, T는 디옥시티미딘, I는 디옥시이노신이다.)
PCR은 40번의 순환(cycle)으로 되어있다. 한 순환은 a) 94℃에서 2분간 변성, b) 52℃에서 90초간 혼성화(Hybridization) 및 c) 72℃에서 2분간 신장과정으로 되어 있다.
전술한 방법으로 얻어진 PCR-증폭 제조물은 아가로즈(Agarose)-겔 상에 하나의 띠로 나타났다. 이것을 융점이 낮은 아가로즈-겔로부터 단리하고 직접 PCR 플라스미드(Stratagene)에 도입시키고 클론하였다. 이 방법은 제조자의 기록에 관한 설명에 상응하였다(PCR-Script TM SK(+) Cloning Kit of Stratagen). 삽입물질의 DNA 서열은 PCR-제조물의 서열에 상응하며 이는 문헌 (SANGER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1977) 74; 5463-5467)에서 기술한 바와 같이 결정되었다.
bb) cDNA-은행의 선택 방법 및 본 발명에 따른 cDNA-클론의 단리
트라이아토마 팔리디페니스 (cDNA library)의 타액선-cDNA-은행으로부터 얻어진 약 400,000개의 초기 클론을 나일론막(Pall Biosupport East Hills, NY, USA)에 옮겨서 제조자가 기록한 바와 같이 스크리닝하였다. 상기에 언급한 PCR-증폭법을 이용하여 얻어진 표지된 샘플을 여기서 사용하였다. 선택법은 두번씩 행해지고 플라스미드-DNA중 파아지-DNA의 변이 및 이 플라스미드-DNA의 삽입물(내재된 DNA)의 서열분석이 뒤따랐다. 따라서 서열 동정 번호 13 내지 l6에 있는 4개의 cDNA 서열이 분석되었는데 이때 단지 Ti 28 및 Ti 45에서는 아미노산 -17 내지 -9의 코돈(triplet)이 그리고 Ti 12에서는 아미노산 -18의 코돈이 존재하지 않았다.
단리된 DNA의 두 나선을 서열 분석하였다. 상기에서 에드만-분해법을 이용하여, 암호화된 DNA로부터 유도된 아미노산 서열을 본 발명에 따른 정제된 단백질로부터 제조된 아미노산 서열로서 완벽하게 결정하였다.
가장 긴 cDNA 클론(Ti 12)은 메티오닌에 관한 불완전 개시코돈에 상응하는 뉴클레오티드로 시작되었다. 이는, 선택 방법에서 똑같은 cDNA-은행의 600,000 파아지와 함께 발견되어 추가 단리된 클론(Ti5)을 고려할때 분명해지며 Til2, Ti28 및 Ti45의 선택에 사용되었다.
표 2 : 본 발명에 따른 단백질에 있어서 상이한 위치
클론(clone)
본 발명에 따른 단백질의 4개의 cDNA 서열은 상기에 언급한 방법으로 선택되고 동정되며 서열 분석되었다. 유도된 아미노산 서열 중에서 단지 9 개의 위치만이 상이하였다. 이 차이는 표 2에 나타나있다.
본 발명에 따른 4개의 성숙 단백질의 통일성(Identity) 및 유사성(Similarity)은 상대를 어느 것으로 선택하느냐에 따라 약 95 또는 98％였다.
실시예 12 : 본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 플라스미드의 제조 및 대장균(E. coli)에서 제조된 단백질의 발현 및 정제
DNA 서열이 공지되었다면, 적당한 프로모터 및 경우에 따라 적당한 인핸서를 이 서열과 결합하도록 하여 유효한 벡터를 제조하였다(M. WIRTH, L. SCHUHACHER 및 H. HAUSER, in H.S. CONRADT(ed) Protein Glycosylation, Cellular Biochemical and Analytical Aspects Vol 15, 49-52, VCH publishers, Weinheim, 1991; 또한 J. KRATZCHMAR et al. (1992) Gene 116: 281-284). 이러한 벡터의 발현은 진핵 세포( 예: 어린 햄스터의 신장 세포)에서 가능하다. 추가로, 적당한 원핵 벡터 중 DNA 서열을 대장균 균주에서 발현시키기 위해서 삽입하였다.
a) 플라스미드의 제조
(I) 전 고찰
원핵 세포에서 본 발명에 따른 재조합 단백질의 발현 구축물을 제조하고 이 안에 IPTG-유도가능한 trc 프로모터를 함유하는 시판되는 플라스미드pKK233-2를 삽입하였다. 발현을 위한 적당한 벡터는, 본 발명에 따른 단백질의 암호 서열 및 신호 서열을 삽입시킨 것으로 플라스미드 pKK233-2가 포함된다. 신호 서열은 분비된 대장균 단백질 사이클로필린 a로 환원된 변형된 신호 서열이다. 신호 서열 및 pKK/cph를 암호화하는 DNA를 프로모터의 하류에 삽입시켰다(T. HAYANO (1991) Biochemistry 30: 3041-3048).
본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 서열을 발현-플라스미드에 삽입하고 이렇게 얻어진 상보적 구조(pKK/cph-단백질)를 대장균 JM 105-세포의 형질 전환을 위해 사용하였다.
(II) 플라스미드 pKK/cph의 구축
사이클로필린 a의 신호 서열을 암호화하는 DNA를 제조하기 위하여 부분적으로 중복되고 보충되는, 하기 기술한 두개의 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하였다. 세균성 신호-펩티다제를 위한 적당한 제한 부위를 형성하기 위하여 상응하는 사이클로필린 서열의 C-말단을 변형시켰다. 변형은 C-말단의 마지막 7개의 코돈이 하기의 아미노산 서열을 암호화하는 코돈으로 교환시키는 것을 말한다:Phe-ser-Ala- Ser-Ala-Leu-Ala(R.E. DALBEY G. von HEIJNE(1992) TIBS 17: 474-478).
의미를 갖는 올리고뉴클레오티드 서열(센스 올리고):
의미를 갖지 않는 올리고뉴클레오티드 서열(안티센스 올리고):
개시 서열을 설치하고 Taq 폴리머라제를 사용하여 최종적으로 딸(daughter)조각을 완벽하게 합성한 후 AflIII 및 hindIII로 DNA 단편을 절단하였다. 이 절단위치에 밑줄을 그었다. 이어서 플라스미드 pKK233-2의 Ncol- 및 HindIII-위치 사이에 DNA 단편을 클론하였다. HindIII-위치와 함께 cDNA조각을 추가로 클론하는 것을 완화하는 Nhel-위치를 굵은 활자로 잘 보이도록 인쇄하였다.
(III) 본 발명에 따른 단백질을 함유하는 플라스미드의 구축
본 발명에 따른 성숙 단백질(Ti 28 = 서열 동정 번호 2)을 암호화하는 서열을 증폭시키기 위하여 하기 기술한 프라이머(Primer)을 사용하였다. 밑줄이 그어진Nhel 및 HindIII 분해 위치는 플라스미드 pKK/cph내로의 삽입을 위하여 사용되었다.
의미를 갖는 올리고뉴클레오티드 서열(센스 올리고):
의미를 갖지 않는 올리고뉴클레오티드 서열(안티센스 올리고):
94℃에서 2분간, 30℃에서 2분간, 72℃에서 2.5분간으로 이루어진 10번의 순환을, PCR(Polymerase Chain Reaktion)을 위하여 주형 나선(template) 2 ㎍을 첨가하여 실행하였다. 여러 개의 DNA를 저 융점의 아가로즈-겔상에서 단리하고, Nhel 및 HindIII로 분해하고, 동일한 제한 뉴클레아제로 미리 분해시킨 플라스미드 pKK/cph중에 도입하였다. 이렇게 얻어진 구조를 암호화하는 DNA는 그 DNA의 양 측면에 있는 DNA의 도움으로 재검사하였다.
(IV) 대장균의 형질 전환
대장균 JM 105-세포를 CaCl2-방법을 사용하여 형질 전환시켰다. 여기서 본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 pKK/cph DNA 1 ㎍을 사용하였다.
b) 대장균을 이용하여 제조된 본 발명에 따른 단백질의 정제 및 특성
형질 전환된 대장균 세포를 IPTG(1 mmol/l)와 반응시키고 37℃에서 6분간 배양하였다(IPTG = Isopropyl-β-D-Thiogalactoside), 세포를 원심단리하고 삼투압적 충격(사카로즈- 및 최종적으로 H2O-처리)을 가하였다. 이렇게 얻은 원형질 분획은 응혈 시험(실시예 2 비교)에서 트롬빈의 활성을 억제하였다. 억제 활성물질을 DE-52 셀룰로즈상의 이온교환크로마토그래피 및 트롬빈-친화성 크로마토그래피를 통해 정제하였다(실시예 1 비교).
정제된 분획은 타액 단백질과 같은 억제 활성을 가졌다. 이는 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동에서 같은 특성을 나타내었다(실시예 6 비교). 추가로 성숙 단백질의 N-말단 아미노산 서열이 결정되었다.
서열 동정 번호 : 1
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 142 아미노산
분자의 종류 : 성숙 단백질 Ti 12
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : 성숙 단백질로서 트롬빈 억제제
서열 동정 번호 : 2
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 142 아미노산
분자의 종류 : 성숙 단백질 Ti 28
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : 성숙 단백질로서 트롬빈 억제제
서열 동정 번호 : 3
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 142 아미노산
분자의 종류 : 성숙 단백질 Ti 45
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : 성숙 단백질로서 트롬빈 억제제
서열 동정 번호 : 4
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 142 아미노산
분자의 종류 : 성숙 단백질 Ti 5
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : 성숙 단백질로서 트롬빈 억제제
서열 동정 번호 : 5
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 160 아미노산
분자의 종류 : 신호 서열을 갖고 있는 성숙 단백질 Ti 12
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : 성숙 단백질로서 트롬빈 억제제
서열 동정 번호 : 6
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 160 아미노산
분자의 종류 : 신호 서열을 갖고 있는 성숙 단백질 Ti 28
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : 성숙 단백질로서 트롬빈 억제제
서열 동정 번호 : 7
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 160 아미노산
분자의 종류 : 신호 서열을 갖고 있는 성숙 단백질 Ti 45
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : 성숙 단백질로서 트롬빈 억제제
서열 동정 번호 : 8
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 160 아미노산
분자의 종류 : 신호 서열을 갖고 있는 성숙 단백질 Ti 5
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : 성숙 단백질로서 트롬빈 억제제
서열 동정 번호 : 9
서열의 종류 : 뉴클레오티드 서열
서열의 길이 : 429 뉴클레오티드
분자의 종류 : 성숙 단백질을 암호화하는 cDNA Ti 12
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : cDNA 코돈
서열 동정 번호 : 10
서열의 종류 : 뉴클레오티드 서열
서열의 길이 : 429 뉴클레오티드
분자의 종류 : 성숙 단백질을 암호화하는 cDNA Ti 28
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : cDNA 코돈
서열 동정 번호 : 11
서열의 종류 : 뉴클레오티드 서열
서열의 길이 : 429 뉴클레오티드
분자의 종류 : 성숙 단백질을 암호화하는 cDNA Ti 45
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : cDNA 코돈
서열 동정 번호 : 12
서열의 종류 : 뉴클레오티드 서열
서열의 길이 : 429 뉴클레오티드
분자의 종류 : 성숙 단백질을 암호화하는 cDNA Ti 5
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : cDNA 코돈
서열 동정 번호 : 13
서열의 종류 : 뉴클레오티드 서열
서열의 길이 : 483 뉴클레오티드
분자의 종류 : 신호 서열을 갖고 있는 성숙 단백질을 암호화하는 cDNA Ti 12
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : cDNA 코돈
서열 동정 번호 : 14
서열의 종류 : 뉴클레오티드 서열
서열의 길이 : 483 뉴클레오티드
분자의 종류 : 신호 서열을 갖고 있는 성숙 단백질을 암호화하는 cDNA Ti 28
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : cDNA 코돈
서열 동정 번호 : 15
서열의 종류 : 뉴클레오티드 서열
서열의 길이 : 483 뉴클레오티드
분자의 종류 : 신호 서열을 갖고 있는 성숙 단백질을 암호화하는 cDNA Ti 45
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : cDNA 코돈
서열 동정 번호 : 16
서열의 종류 : 뉴클레오티드 서열
서열의 길이 : 483 뉴클레오티드
분자의 종류 : 신호 서열을 갖고 있는 성숙 단백질을 암호화하는 cDNA Ti 5
기원 : 트라이아토마, 팔리디페니스의 타액선
특징 : cDNA 코돈
서열 동정 번호 : 17
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 15 아미노산
분자의 종류 : 단백질의 N-말단 단편
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : 성숙 단백질로서 트롬빈 억제제
서열 동정 번호 : 18
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 21 아미노산
분자의 종류 : 단백질의 N-말단 단편
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : 성숙 단백질로서 트롬빈 억제제
서열 동정 번호 : 19
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 21 아미노산
분자의 종류 : 단백질의 N-말단 단편
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : 성숙 단백질로서 트롬빈 억제제
서열 동정 번호 : 20
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 18 아미노산
분자의 종류 : Lys C로 분해된 후의 단백질의 N-말단 분절
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : 성숙 단백질로서 트롬빈 억제제
서열 동정 번호 : 21
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 12 아미노산
분자의 종류 : Lys C로 분해된 후의 단백질의 N-말단 분절
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : 성숙 단백질로서 트롬빈 억제제
서열 동정 번호 : 22
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 8 아미노산
분자의 종류 : Lys C로 분해된 후의 단백질의 N-말단 분절
기원 : 트라이아토마 팔리디페니스의 타액선
특징 : 성숙 단백질로서 트롬빈 억제제
서열 동정 번호 : 23
서열의 종류 : 뉴클레오티드 서열
서열의 길이 : 44 뉴클레오티드
분자의 종류 : 주형-개시 단편 [센스 프라이머(sense primer)]
기원 : 아미노산 서열로부터 유도됨
특징 : 시발체
기호 : N = 이노신
서열 동정 번호 : 24
서열의 종류 : 뉴클레오티드 서열
서열의 길이 : 32 뉴클레오티드
분자의 종류 : 비주형-개시 단편 [안티센스 프라이머(antisense primer)]
기원 : 아미노산 서열로부터 유도됨
특징 : 비전사 시발체
기호 : N = 이노신
서열 동정 번호 : 25
서열의 종류 : 아미노산 서열
서열의 길이 : 7 아미노산
분자의 종류 : 펩티드 단편
특징 : 변형된 사이클로필린 a의 C-말단
서열 동정 번호 : 26
서열의 종류 : 뉴클레오티드 서열
서열의 길이 : 57 뉴클레오티드
분자의 종류 : 주형-개시 단편 (센스 프라이머)
기원 : 변형된 사이클로필린 a의 아미노산 서열로부터 유도됨
특징 : 센스 프라이머
서열 동정 번호 : 27
서열의 종류 : 뉴클레오티드 서열
서열의 길이 : 58 뉴클레오티드
분자의 종류 : 비주형-개시 단편(안티센스 프라이머)
기원 : 변형된 사이클로필린 a의 아미노산 서열로부터 유도됨
특징 : 안티센스 프라이머
서열 동정 번호 : 28
서열의 종류 : 뉴클레오티드 서열
서열의 길이 : 28 뉴클레오티드
분자의 종류 : 주형-개시 단편 (센스 프라이머)
기원 : 본 발명에 따른 단백질의 아미노산 서열로부터 유도됨
특징 : 센스 프라이머
서열 동정 번호 : 29
서열의 종류 : 뉴클레오티드 서열
서열의 길이 : 43 뉴클레오티드
분자의 종류 : 비주형-개시 단편 (안티센스 프라이머)
기원 : 본 발명에 따른 단백질의 아미노산 서열로부터 유도됨
특징 : 안티센스 프라이머

Claims (13)

  1. d) 성숙한 활성 단백질로서,
    i) 서열 동정 번호 1 (Sequence Identification No. 1),
    ii) 서열 동정 번호 2 (Sequence Identification No. 2),
    iii) 서열 동정 번호 3 (Sequence Identification No. 3) 및
    iV) 서열 동정 번호 4 (Sequence Identification No. 4) 중 어느 하나의 서열을 갖거나,
    f) 성숙한 활성 단백질로서, 활성 단백질의 활성도에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 d)에서 언급한 서열의 후번역 변이를 갖고, 트롬빈 억제제이며 포유동물의 혈액을 빨아먹는 곤충의 타액으로부터 단리되는 것을 특징으로 하는 천연 또는 합성된 단백질.
  2. g) 단백질이
    i) 서열 동정 번호 5 (Sequence Identification No. 5),
    ii) 서열 동정 번호 6 (Sequence Identification No. 6),
    iii) 서열 동정 번호 7 (Sequence Identification No. 7) 및
    iv) 서열 동정 번호 8 (Sequence Identification No. 8) 중 어느 하나의 서열을 갖거나,
    i) 단백질이 활성 단백질의 활성도에 실질적인 영향을 미치지 않으면서, g)에서 언급한 것 중 어느 하나의 서열의 후번역 변이를 갖고, 트롬빈 억제제이며 포유동물의 혈액을 빨아먹는 곤충의 타액으로부터 단리되는 것을 특징으로 하는, 신호 서열 및 성숙 단백질로 이루어진 천연 또는 합성된 단백질.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, 단백질이 재조합 단백질임을 특징으로 하는 단백질.
  4. 제1 또는 2항에 있어서, 단백질이 글리코실화됨을 특징으로 하는 단백질.
  5. aa) cDNA 또는 DNA가
    i) 서열 동정 번호 1 (Sequence Identification No. 1),
    ii) 서열 동정 번호 2 (Sequence Identification No. 2),
    iii) 서열 동정 번호 3 (Sequence Identification No. 3) 및
    iv) 서열 동정 번호 4 (Sequence Identification No. 4) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화함을 특징으로 하는, 성숙 트롬빈 억제제를 암호화하는 cDNA 또는 DNA.
  6. cc) cDNA 또는 DNA가
    i) 서열 동정 번호 9 (Sequence Identification No. 9),
    ii) 서열 동정 번호 10 (Sequence Identification No. 10),
    iii) 서열 동정 번호 11 (Sequence Identification No. 11) 및
    iV) 서열 동정 번호 12 (Sequence Identification No. 12) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 깆는 것을 특징으로 하는, 트롬빈 억제제를 암호화하는 cDNA 또는 DNA.
  7. ee) cDNA 또는 DNA가
    i) 서열 동정 번호 13 (Sequence Identification No. 13),
    ii) 서열 동정 번호 14 (Sequence Identification No. 14),
    iii) 서열 동정 번호 15 (Sequence Identification No. 15) 및
    iv) 서열 동정 번호 16 (Sequence Identification No. 16) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 신호 서열을 포함하는 성숙 트롬빈 억제제를 암호화하는 cDNA 또는 DNA.
  8. 제5 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 cDNA 또는 DNA를 함유하는 벡터.
  9. 제9항에 따른 벡터로 형질 전환된 진핵 세포 또는 원핵 세포.
  10. 제5 내지 7항중 어느 한 항에 따른 cDNA 또는 DNA를 함유하는 벡터로 형질 전환된 숙주 세포의 배양 및 단백질의 단리 및 정제를 특징으로 하는 과정을 포함하는 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 단백질의 제조 방법.
  11. 단백질을 단리하고 하나 이상의 칼럼 상에서 정제하며 최종적으로 농축시킴을 특징으로 하는 제1 내지 4항중 어느 한 항에 따른 단백질의 정제 방법.
  12. 컬럼(Superose l2 HR-컬럼) 상에 타액을 넣고 용출시키며, 미리 트롬빈을 결합시킨 컬럼(CH-활성화 세파로즈 칼럼) 상에 다시 넣고 용출시킴을 특징으로 하는 제 1 내지 4 및 제 10 내지 11항 중 어느 한 항에 따른 단백질의 정제 방법.
  13. 혈전증, 불안전한 협심증 또는 동맥경화증의 치료, PTCA/PTA후 혈관의 재폐색의 예방 또는 혈액 투석시 응혈의 방지를 위한, 제 1 내지 4항 중 어느 한 항의 단백질 및 제 10 내지 12항 중 어느 한 항에 따라 얻어진 단백질 또는 이의 혼합물을 함유하는 약제.
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