JPH08507200A - 昆虫類の唾液からのトロンビン阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、トロンビン阻害剤でありかつ哺乳動物の血液を吸う昆虫類の唾液から単離可能である、天然からかまたは合成により得ることができる蛋白質に関する。好ましくは、昆虫のサシガメTriatoma pallidipennisである。この蛋白質は、血栓症または不安定なアンギナまたは動脈硬化症の治療に使用されるか、またはＰＴＣＡ／ＰＴＡによる血管の再閉塞の予防、または血液透析の際の血液凝固の阻止に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 昆虫類の唾液からのトロンビン阻害剤 本発明は、昆虫類の唾液からのトロンビン阻害剤である蛋白質に関する。従来の技術： トロンビンは、血管中での血栓形成の際に１つの重要な機能を有する。このト ロンビンは、フィブリノーゲンからのフィブリンの分解を触媒する。更に、この トロンビンは、血小板の凝固を誘発する。酵素は、例えば動脈および静脈の血栓 症または動脈硬化のような種々の疾患の病因に包含されている。 そのために、血栓症の治療のためのトロンビン阻害剤の使用は、有望である。 これまでに知られた最も重要なトロンビン阻害剤は、抗トロンビンＩＩＩ−ヘパ リンおよびヒルジンである。抗トロンビンＩＩＩは、血漿中に存在する５８ｋＤ ａの分子量を有する蛋白質である。抗トロンビンＩＩＩは、まず多糖類であるヘ パリンに結合する。次に、抗トロンビンＩＩＩ−ヘパリン複合体は、トロンビン に結合し、かつこのトロンビンを阻害する。１つの極めて安定な複合体は、トロ ンビンおよび抗トロンビンＩＩＩから生成され、抗トロンビンＩＩＩはトロンビ ンと分離される。抗トロンビンＩＩＩは、トロンビンとともに例えば因子Ｘａの ような別のセリンプロテアーゼをも阻害する（Pratt，C．w．およびChurch，F． C．（１９９１）“Antithrombin：Structure and Function”，Seminaris in He matology ２８：３〜９）。 血液ゲルのヒルド メディシナリス（Hirudo medicinalis）から、蛋白質のヒ ルジンは単離される。このヒルジンは、約７ｋＤａの分子量を有し、かつイオン 交換作用によりトロンビンに結合する。このヒルジンは、トロンビンに対して特 異性を有している（Ｊohnson，P．H．他（１９８９）“Biochemistry and Genet ic engineering of hirudin”，Seminars in Thrombosis and Hemostasis １５ ：３０２〜３１５）。 発明の詳細： 従来の技術に挙げられている前記のトロンビン阻害剤とともに、別の作用機構 または増大された活性を有する他の阻害剤が必要とされる。 本発明は、天然からかまたは合成により得ることができる蛋白質を供給し、こ の場合この蛋白質は、トロンビン阻害剤でありかつ哺乳動物の血液を吸う昆虫類 の唾液から単離可能である。 好ましいのは、本発明によれば、サシガメTriatoma pallidipennisから単離可 能である蛋白質である。 本発明による蛋白質は、天然に由来することができる。同様に、蛋白質を唾液 腺から単離するかまたは蛋白質を合成する細胞を唾液腺から取りかつ培養に維持 することは、可能である。この細胞培養によって生産される上澄み液は、収穫さ れかつ後処理される。細胞の上澄み液は精製され、本発明による蛋白質は、単離 されかつ含量が増大される。単離および精製の全ての含量増大工程は、本発明の 一部である。好ましいのは、単離および精製の含量増大工程であり、この場合本 発明による蛋白質は、製薬学的目的に使用することができる。即ち、全蛋白質に 対するトロンビン阻害剤の５０％の精製は達成され、好ましいのは、全蛋白質に 対するトロンビン阻害剤の８５％であり、よりいっそう好ましいのは、９５％で あり、最も好ましいのは、９９％である。 本発明は、サシガメTriatoma pallidipennisから単離可能である蛋白質を包含 するだけでなく、別の昆虫種によって合成させることができる蛋白質をも包含す る。即ち、最も好ましい群に数えられるサシガメTriatoma pallidipennisから単 離可能である蛋白質とともにトリアトマ・インフェスタンスTriatoma infestans 、トリアトマ・ジミジアタTriatoma dimidiata、トリアトマ・マクラタTriatoma maculata、ロドニウス・プロリクサスRhodnius prolixus、パンストロンギラス ・メギストゥスPanstrongylus megistusおよびパンストロンギラス・インフェス タンスPanstrongylus infestansに由来する他の蛋白質も有利である。 同様に、本発明による蛋白質を合成により得ることもできる。そのために、セ ワート（J．M．SEWART）およびヤング（J．D．YOUNG）、サンフランシスコ、１ ９６９およびマイエンホッファー（J．MEIENHOFER）、ホーモナル・プロテイン ズ・アンド・ペプタイズ（Hormonal Proteins and Peptides）、第２巻、第４６ 頁、アカデミック・プレス社（Academic Press，ニューヨーク在）、１９７３年 およびショーダー（E．SCHODER）およびラブケ（K．LUBKE）、ザ・ペプタイズ（ The Peptides）、第１巻、アカデミック・プレス社（Academic Press，ニューヨ ーク在）、１９６５年による合成法が挙げられる。また、合成により得られる蛋 白質には、公知方法により得られる組換え蛋白質も挙げられる。宿主微生物に応 じて、本発明による蛋白質は、グリコシル化されていてもよいか、または原核生 物中で合成される場合には、グリコシル化されていなくともよい。 阻害剤の機能は、種々の試験系で測定することができる。例２〜４および例９ には、通常の試験方法が記載されている。 本発明による蛋白質は、哺乳動物の血液を吸う昆虫類の吻中に確認することが できる。この蛋白質は、通常、唾液腺の細胞によって合成される。従って、蛋白 質は、吻から単離され得る。本発明による蛋白質は、この製造方法および単離に 限定されるものではない。 むしろ、合成により得られた本発明による全てのトロンビン阻害剤が一緒に包含 されており、この場合このトロンビン阻害剤は、吻中で検出することができかつ これから単離することができる。成熟蛋白質のＮ−末端配列 更に、本発明は、トロンビン阻害剤でありかつ哺乳動物の血液を吸う昆虫類の 吻、有利にサシガメTriatoma pallidipennisから単離可能である天然でかまたは 合成的に得ることができる蛋白質を包含し、 ａ）この場合蛋白質は、活性蛋白質として次のようなＮ末端配列： を有するかまたは ｂ）この場合蛋白質は、活性蛋白質として先にａ）で記載されたＮ−末端アミノ 酸配列の対立遺伝子の修飾を有し、この場合Ｎ−末端アミノ酸配列の１つまたは ２つのアミノ酸は、置換されているか、欠失されているか、または挿入されてお り、この場合には、活性蛋白質の活性は、本質的に影響を及ぼされない かまたは ｃ）この場合蛋白質は、活性蛋白質としてａ）およびｂ）でのＮ末端配列の翻訳 後修飾を有し、この場合には、本質的に活性蛋白質は影響を及ぼされない。成熟蛋白質の配列 更に、本発明は、トロンビン阻害剤でありかつ ｄ）活性成熟蛋白質として次の配列： ｉ） 配列アイデンティファイアーNo.1 （配列プロトコールNo.1） ii） 配列アイデンティファイアーNo.2 （配列プロトコールNo.2） iii） 配列アイデンテイファイアーNo.3 （配列プロトコールNo.3）および iv） 配列アイデンティファイアーNo.4 （配列プロトコールNo.4） の１つを有するかまたは ｅ）活性の成熟蛋白質として先にｄ）で記載されたアミノ酸配列の１つを有し、 この場合アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸は、置換されているか、欠失 されているか、または挿入されており、この場台活性蛋白質の活性は、本質的に 影響を及ぼされないかまたは ｆ）活性の成熟蛋白質としてｄ）およびｅ）での配列の１つの翻訳後修飾を有し 、この場合本質的に活性蛋白質の活性は影響を及ぼされないような蛋白質を包含 する。 ３０個までのアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を包含する全ての対立 遺伝子の修飾は、本発明による蛋白質の群に属する。好ましいのは、２０個まで のアミノ酸の欠失、置換および／または挿入にあり、よりいっそう好ましいのは 、１０個までのアミノ酸の欠失、置換および／または挿入にあり、最も好ましい のは、１、２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸の欠失、置換およ び／または挿入にある。信号配列を有する成熟蛋白質の配列 本発明による蛋白質のもう１つの実施態様は、１つの信号配列および１つの本 発明による成熟蛋白質からなる１つの蛋白質にあり、 ｇ）この場合この蛋白質は、次の配列： ｉ） 配列アイデンティファイアーNo.5 （配列プロトコールNo.5） ii） 配列アイデンティファイアーNo.6 （配列プロトコールNo.6） iii） 配列アイデンティファイアーNo.7 （配列プロトコールNo.7）および iv） 配列アイデンティファイアーNo.8 （配列プロトコールNo.8） の１つを有するかまたは ｈ）この場合この蛋白質は、先にｇ）で記載されたアミノ酸配列の対立遺伝子の 修飾を有し、この場合アミ ノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸は、置換されているか、欠失されているか 、または挿入されており、この場合成熟の活性蛋白質の活性は、本質的に影響を 及ぼされない、 かまたは ｉ）この場合この蛋白質は、ｇ）およびｈ）での配列の１つの翻訳後修飾を有し 、この場合には、活性の成熟蛋白質の活性は、本質的に影響を及ぼされないよう な１つの蛋白質にある。 ３２個までのアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を包含する全ての対立 遺伝子の修飾は、本発明による蛋白質の群に属する。好ましいのは、２１個まで のアミノ酸の欠失、置換および／または挿入にあり、よりいっそう好ましいのは 、１１個までのアミノ酸の欠失、置換および／または挿入にあり、最も好ましい のは、１、２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸の欠失、置換およ び／または挿入にある。 最も好ましいのは、組換え蛋白質である本発明による蛋白質である。この場合 、この蛋白質は、グリコシル化されていてもよい。 本発明による蛋白質は、“信号配列”および成熟蛋白質の配列から構成されて いる成熟蛋白質および相応する前駆体蛋白質を包含する。この場合、“信号配列 ”は、成熟蛋白質の配列から出発する。成熟蛋白質は、前記ａ）で先に記載され たＮ−末端配列を用いて開始 される。“信号配列”は、小胞体への浸透に必要とされる。本発明による蛋白質をコーディングするｃＤＮＡまたはＤＮＡ 更に、本発明は、成熟トロンビン阻害剤をコーディングするｃＤＮＡまたはＤ ＮＡをも包含し、 ａａ）この場合、ｃＤＮＡまたはＤＮＡは、次のアミノ酸配列をコーディングす る： ｉ） 配列アイデンティファイアーNo.1 （配列プロトコールNo.1） ii） 配列アイデンティファイアーNo.2 （配列プロトコールNo.2） iii） 配列アイデンティファイアーNo.3 （配列プロトコールNo.3）および iv） 配列アイデンティファイアーNo.4 （配列プロトコールNo.4） かまたは ｂｂ）この、場合ｃＤＮＡまたはＤＮＡは、ａａ）でのアミノ酸配列の１つの対 立遺伝子の修飾をコーディングし、 この場合アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸は、置換されているか 、欠失されているか、または挿入されており、この場合には、この活性蛋白質の 活性は、本質的に影響を及ぼされない。 対立遺伝子の修飾は、先の“成熟蛋白質の配列”の 項目に定義されている。 更に、本発明は、トロンビン阻害剤をコーディングするｃＤＡまたはＤＮＡを 包含し、 ｃｃ）この場合ｃＤＮＡまたはＤＮＡは、次のヌクレオチド配列の１つを有する ： ｉ） 配列アイデンティファイアーNo.9 （配列プロトコールNo.9） ii） 配列アイデンティファイアーNo.10 （配列プロトコールNo.10） iii） 配列アイデンティファイアーNo.11 （配列プロトコールNo.11）および iv） 配列アイデンティファイアーNo.12 （配列プロトコールNo.12） かまたは ｄｄ）この場合ｃＤＮＡまたはＤＮＡは、ｃｃ）でのヌクレオチド配列の１つの 対立遺伝子の修飾を有し、この場合少なくとも１つのヌクレオチドは、置換され ているか、欠失されているか、または挿入されており、この場合には、ｃｃ）で のヌクレオチド配列の対立遺伝子の修飾によってコーディングされる蛋白質の活 性は、本質的に影響を及ぼされない。 全てのＤＮＡ構成は、同じアミノ酸の縮重されたコードのためにコーディング するようなヌクレオチドを交換する場合にも枚挙された本発明による配列に数え られる。この種のヌクレオチドの交換は、明らかなこ とであり、相応するアミノ酸は、全ての生化学の教科書に開示されている。（R ．KNIPPERS，1982，第３版、Molekulare Genetik，Georg Thieme Verlag） アミノ酸配列の変化を生じる全ての対立遺伝子の修飾は、この修飾が３０個ま でのアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を包含する限り、本発明に属する 。好ましいのは、２０個までのアミノ酸の欠失、置換および／または挿入であり 、よりいっそう好ましいのは、１０個までのアミノ酸の欠失、置換および／また は挿入であり、最も好ましいのは、１、２、３、４、５、６、７、８または９個 のアミノ酸の欠失、置換および／または挿入である。 更に、本発明は、成熟蛋白質をコーディングする配列とともに同様に信号配列 をも含有する遺伝物質をも包含する。この信号配列は、ｃＤＮＡバンク中に見い 出されたものであり、また、蛋白質の発現および分泌を可能にする別の信号配列 も考えられる。 従って、本発明は、信号配列を有するトロンビン阻害剤をコーディングするｃ ＤＮＡまたはＤＮＡを包含し、 ｅｅ）この場合ｃＤＮＡまたはＤＮＡは、次のヌクレオチド配列： ｉ） 配列アイデンティファイアーNo.13 （配列プロトコールNo.13） ii） 配列アイデンティファイアーNo.14 （配列プロトコールNo.14） iii） 配列アイデンティファイアーNo.15 （配列プロトコールNo.15）および iv） 配列アイデンティファイアーNo.16 （配列プロトコールNo.16） を有するかまたは ｆｆ）この場合ｃＤＮＡまたはＤＮＡは、ｅｅ）でのヌクレオチド配列の１つの 対立遺伝子の修飾を有し、この場合少なくとも１つのヌクレオチドは、置換され ているか、欠失されているか、または挿入されており、この場合には、成熟蛋白 質の信号配列を含めてｅｅ）でのヌクレオチド配列の対立遺伝子の修飾によって コーディングされる成熟蛋白質の活性は、本質的に影響を及ぼされない。 対立遺伝子の修飾は、先にｄｄ）に定義されている。 対立遺伝子の修飾が本発明による蛋白質の群に数えられるか否かを確認するた めに、蛋白質の活性を記載する場合には、信号配列が同様に記載される場合であ っても常に成熟蛋白質を測定することができる。信号配列が記載される場合には 、信号配列の除去後に得られる蛋白質についての機能を常に測定することができ る。 更に、本発明は、本発明の成熟蛋白質上のドメインが認められる結合分子（例 えば、ペプチドまたはその誘導体）、一本鎖蛋白質、抗体または抗体の断片を包 含する。精製された本発明による蛋白質が存在する場合には、当業者にとってモ ノクロナール抗体を得ることは、容易に可能である。この場合には、ケーラー（ Koehler）およびミルシュタイン（Milstein）の公知方法およびその後の継続法 が使用される。この場合、詳細には、常法で１匹のマウスは、精製された蛋白質 で数回免疫化され、脾臓細胞が取り出され、かつ適当な腫瘍細胞と融合される。 引続き、ハイブリッドは選択される。 本発明の蛋白質は、サシガメTriatoma pallidipennisの唾液から単離すること ができる。精製は、ゲル濾過およびトロンビン−セファロースを用いての引き続 くアフィニティークロマトグラフィー処理によって行なわれる（例１参照）。こ の蛋白質は、先に記載されたアミノ酸配列を有する。この蛋白質は、約１８００ ０±３０００Ｄａの分子量を有する（例６参照）。等電点は、例８に記載の方法 を使用する場合には、ｐＨ４．５〜５．２の範囲内にある。 本発明の蛋白質は、血液凝固の場合および血小板の活性化の場合ならびにアミ ド分解においてトロンビンの効果を抑制する。これらの試験系は、例２、３、４ および９に記載されている。蛋白質は、１．２７ナノモル／１のトロンビン濃度 の際に８ナノモル／１の濃度で凝固を抑制する。この蛋白質は、１５ｎｇ／ｍｌ の濃度でトロンビン誘発された血小板凝集を１００％ 抑制する。この濃度は、０．０６ＩＵ／ｍｌ＝０．８１２ピコモル／ｍｌ（ＩＵ ＝国際単位）の使用されるトロンビン濃度の際にトロンビン対本発明による蛋白 質のモル比薬１：１に相当する。これとは異なり、本発明の蛋白質は、アミド分 解試験においてトロンビン対本発明による蛋白質の比１：８７の際にトロンビン の活性を約５０％だけ抑制する。本発明の蛋白質は、３５ナノモル／１の濃度で トロンビン時間（１ＩＵ／ｍｌ）を５倍だけ延長する。 本発明の蛋白質は、 トロンビンに対して特異性を有する。別のセリンプロテ アーゼ（例えば、因子Ｘａまたはトリプシン）は、４０倍の過剰量の場合であっ ても検出により抑制されない（例７参照）。本発明によるＤＮＡを有するベクター 本発明の他の部分は、本発明によるｃＤＮＡまたはＤＮＡ、さらに適当なプロ モーターおよび場合によっては適当なエンハンサーを含有するベクターである。 同様に、なお“信号配列”を包含することもできる。ベクターは、欧州特許第０ ４８０６５１号明細書、欧州特許第０４６２６３２号明細書および欧州特許第０ １７３１７７号明細書に詳細に記載されている。 本発明のもう１つの実施態様は、本発明によるベクターで形質転換されている 真核または原核宿主細胞にある。対立遺伝子の修飾 多くの場合の欠失、挿入および置換は、本発明の蛋白質の特性において徹底し た変化を結果として生じないように思われる。置換、欠失または挿入の正確な効 果を予め記載することは困難であるので、変化された蛋白質の機能は、本発明に よる蛋白質の機能と比較されなければならない。このために使用すべき方法は、 例示的に例２〜４および９に記載されている。標準として、Seq．Id．No.1〜4に 記載された蛋白質が使用され、同様に例１により精製される蛋白質も使用され、 ならびに比較蛋白質のために例１の精製法が使用される。 遺伝コードは、縮重されており、このことは、多くの場合のアミノ酸が３個の ヌクレオチドからなる１つ以上のコドンによってコーディングされていることを 意味する。従って、ヌクレオチドの平面上での若干の対立遺伝子の修飾は、アミ ノ酸配列の変化を生じない。従って、対立遺伝子の修飾は、主にＤＮＡの平面上 で生じ、かつアミノ酸配列に二次的に影響を及ぼしうる。 本発明による蛋白質をコーディングするｃＤＮＡ−またはＤＮＡ配列は、本発 明の記載されかつ特性を有する蛋白質と同じ活性を本質的に有する本発明による 蛋白質の変形を得るために、常用の技術により修飾させることができる。この場 合、活性は、例２〜４および９の記載と同様に測定される。 アミノ酸は、第１表に表わされたように置換されていてもよく、しかし、この 場合には、蛋白質の機能は、 本質的に影響を及ぼされることがない。全ての個々の場合には、蛋白質の機能に 対する変化に、如何なる影響が及ぼされるのかについては、活性度試験によって 決定することができる。 置換の際に第１表に示したアミノ酸よりもあまり保守的でない置換基を選択す る場合には、機能または免疫学的同一性は、本質的に変化される。この種の本質 的な変化は、多くの場合に構造および官能基の点で区別されるアミノ酸で置換す ることによって達成することができる。本質的な変化により、三次元的構造を変 化させることおよび／または例えば折り畳まれた本のような構造または螺旋構造 に影響を及ぼすことが生じる。また、負荷の相互作用および疎水性鎖は、変化の 際に注目することができる。 突然変異は、比較のために問題となっている２つの蛋白質の相同性によって定 義することができる。相同性の発現は、アミノ酸の配列において類縁のアミノ酸 （例えば、第１表）および脱落個所を包含する。本発明による蛋白質は、本発明 による構造少なくとも８０％、有利に９０％、よりいっそう有利に９５％、最も 有利に９８％の相同性を有するアミノ酸配列を有しており、例えばこの構造は、 ｄ）またはｇ）の配列（Seq．1d No.1〜8）によって定義されており、かつさら に精製後に例１の記載により得ることができる。 前記の述べたように、本発明は、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの改質をも包含する。 この改質された配列は、本発明による蛋白質をコーディングするＤＮＡ配列を用 いて苛酷な条件下でハイブリッド化される（ａａ）;ｃｃ）およびｅｅ）に記載 の配列参照）。ｃＤＮＡ−またはＤＮＡ配列は、ヌクレオチド配列を有し、この ヌクレオチド配列は、少なくとも７０％、有利に８２％、よりいっそう有利に９ ０％、最も有利に９５％の短い（１５個までのヌクレオチド）欠失および挿入を 含めて本発明によるｃＤＮＡ−またはＤＮＡ配列との同一性を有している（ａａ ）、ｃｃ）およびｅｅ）参照）。短い（１５個までのヌクレオチド）欠失および 挿入を含む同一性は、例えばクニッパーズ（R．KNIPPERS）、モレクラーレ・ゲ ネティーク（Molekulare Genetik）、１９８２、第３版、Georg Thieme Verlag 社（Stuttgart，New York）刊に記載されているようにハイブリッド化によって 測定することができる。翻訳後修飾 先に述べた翻訳後修飾とは、翻訳中または翻訳後に生じる変化のことである。 これには、グリコシル化、ジスルフィド橋の形成、アミノ酸の化学的変性、例え ばヒルジンと関連して記載されている硫酸化が挙げられる。（J．W．FENTON（19 89）”Thrombin Interaction with Hirudin”，Seminars in Thrombosis and He mos tasis 15：265-268） グリコシル化は、内質細網および／またはゴルジ体の１つの本質的な機能であ る。オリゴ糖の配列および分枝は、内質細網中に形成され、かつゴルジ体中で変 化される。オリゴ糖は、Ｎ−結合したオリゴ糖（アスパラギン結合した）または Ｏ−結合したオリゴ糖（セリン−、トレオニン−またはヒドロキシリシン結合し た）であることができる。グリコシル化の形は、生産する細胞型および種類に依 存し、この場合相応する細胞型は、この種類に由来する。グリコシル化の程度お よび種類は、欧州特許第０２２２３１３号明細書に記載されているような物質に よって影響を及ぼされることができる。グリコシル化の変動により、蛋白質の機 能を変化させることができる。 蛋白質は、しばしば共有結合を鎖内に形成する。このジスルフィド橋は、２つ のシステイン間に得られる。この場合、蛋白質は特異的に倍加される。ジスルフ ィド橋は、蛋白質の三次元構造を安定する。 更に、アミノ酸は、国際公開番号ＷＯ９１／１０６８４に記載されているよう に変化させることができる。同様に、蛋白質は硫酸化されていてもよい。この変 化は、ヒルジンと関連して記載されている。本発明による蛋白質の単離および製造 更に、本発明は、次の工程を有する本発明による蛋白質の製造法を包含する： 本発明によるｃＤＮＡまたはＤＮＡを含有する、ベクトルで形質転換されている 宿主細胞の培養、ならびに蛋白質の単離および精製。 蛋白質は、有利に例１の記載により精製される。しかし、別の単離方法および 精製方法も可能である： メソッズ・オブ・エンザイモロジー（Methods of Enzymology）、第１８２巻： ガイド・トウ・プロテイン・ピューリフィケーション（Guide to Protein Purif ication）、ドイチャー（Murray P．DEUTSCHER）編、アカデミック・プレス（Ac ademic Press）社刊、１９９０； プロテイン・ピューリフィケーション・アプリケーション（Protein Purificati on Application）、ア・プラクティカル・アプローチ（A Practical Approach） 、ハリス（E．L．V．HARRIS）およびエンジェル（S．ANGEL）、アイアールエル −プレス（IRL-Press）社刊１９９０； プロテイン・ピューリフィケーション、プリンスプルス・アンド・プラクティス （Protein Purification，Principles and Practice）、スコープス（Ropert SC OPES）、スプリンガー （Springer-Verlag）社刊１９８２；および プロテイン・ピューリフィケーション、プリンスプルス、ハイ・レゾルーション ・メソッズ・アンド・アプリケーションズ（Protein Purification，Principles ， High Resolution Methods and Applications）、ジャンソン（H．-C．JANSON） およびライデン（L．RYDEN）編、ブイ・シー・エイッチ（VCH）社刊１９８９。 本発明は、同様に本発明による蛋白質を精製するための方法を包含し、この場 合蛋白質は、単離され、少なくとも１つのカラムを介して精製され、かつ引続き 濃縮される。好ましいのは、クロマトグラフィーカラムまたは吸着クロマトグラ フィーカラムである。 更に、本発明は、本発明による蛋白質を精製する方法を包含し、この場合この 方法は、次の工程からなる： “スペロース（SUPEROSE）１２ＨＲ−カラム”上への唾液の塗布および溶離なら びに 先にトロンビンがカップリングされたＣＨ活性化されたセファロース（Sepharos e）−カラム上への再度の塗布および溶離。 この精製については、例１に詳細に記載されている。医薬品としての使用 本発明による蛋白質は、薬理効果を有し、かつしたがって製薬学的作用物質と して使用可能である。本発明は、同様に本発明による蛋白質の１つまたはその混 合物を含有する医薬品を包含する。更に、本発明には、製薬学的に認容性で受容 可能な化合物および担持剤の存在下で、本発明による蛋白質の１つまたは本発明 による蛋白質の混合物を含有する製薬学的組成物が属す る。同様に、本発明は、製薬学的に活性の本発明による蛋白質の１つまたはその 混合物および製薬学的に認容性の塩または製薬学的に認容性の担持剤を含有する 製薬学的組成物を包含する。 殊に、本発明による蛋白質は、配列実験記録Ｎｏ．１〜４によれば、トロンビ ン活性の阻害を示す。 トロンビン活性の阻害は、凝固試験（例２参照）、血小板凝集試験（例３参照 ）、アミド分解試験（amidolytischer Test）（例４参照）およびトロンビン時 間の測定（例９参照）によって検出することができる。トロンビン時間の測定は 、好ましい試験系である。 本発明による蛋白質は、 トロンビン時間の延長を１０〜６０ナノモル／ｌの 濃度で示す（トロンビン濃度１ＩＵ／ｍｌ）。５８ナノモル／ｌの濃度で、９倍 の延長が生じる。よりいっそう高い濃度は、試験系を損なうことなしに使用する ことができる。従って、本発明による蛋白質は、１０〜２００ナノモル／ｌの濃 度で使用可能である。 この試験管内試験の試験結果は、本発明による蛋白質が医薬品として使用され ることができるかまたは医学的処置に使用されることができることを示す。この 試験結果は、試験管内試験系から生体内系へ転用することができる。それという のも、凝固試験の場合には、確立された試験装置が重要であるからである（M．T ALBOT（1989）”Biology of Recombinant Hirudin，A New Prospect in the Treatment of Thrombosis”seminars in Thrombosis and Hemo stasis 15：293-301）。従って、本発明の蛋白質は、血栓症、不安定なアンギナ または動脈硬化症の治療および予防、またはＰＴＣＡ／ＰＴＡ（バルーンカテー テルを用いての血管形成術）による血管の再閉塞の予防または血液透析の際の血 液凝固の阻止に使用することができる。本発明の蛋白質は、哺乳動物、殊にヒト の場合に血栓症および／または動脈硬化症の後遺症の治療のために抗血栓症薬お よび／または抗動脈硬化症薬として使用することができる。このことは、動脈硬 化症の凝集による激痛（斑）、内皮細胞組織の破壊、例えば敗血症、移植または 不安定なアンギナの際に起こりうる。本発明による蛋白質は、心筋梗塞の治療後 および／または繊維素溶解または血管形成術の際の再度の閉塞を阻止するために 、同様に使用することができる。この場合、本発明による蛋白質は、カテーテル の導入前、導入時および／または導入後に投与することができる。 更に、本発明は、 （i）血栓症、不安定なアンギナまたは動脈硬化症を治療するか、ＰＴＣＡ／Ｐ ＴＡ後の血管の再閉塞を予防するか、または血液透析の際に血管凝固を阻止する ための薬剤の製造への本発明による蛋白質またはその混合物の使用； （ii）本発明による蛋白質量の投与を包含し、この場合 この量は、疾患を緩和させ、かつこの蛋白質量は、かかる薬物を必要とする患者 に与えられる、血栓症、不安定なアンギナまたは動脈硬化症を治療するか、ＰＴ ＣＡ／ＰＴＡ後もしくは血栓崩壊後の血管の再閉塞を予防するか、または血液透 析の際に血管凝固を阻止する方法； （iii）本発明による蛋白質の１つまたはその混合物および少なくとも１つの製 薬学的に認容性の担持剤および添加剤を治療の際に包含する、血栓症、不安定な アンギナまたは動脈硬化症を治療するか、ＰＴＣＡ／ＰＴＡ後もしくは血栓崩壊 後の血管の再閉塞を予防するか、または血液透析の際に血液凝固を阻止するため の製薬学的組成物 を供給する。 この治療の効果のためには、種々の投与量が適当である。投与量は、例えば使 用される蛋白質、宿主、投与の種類ならびに治療すべき状態の種類および重さに 依存する。 しかし、一般に日用量が体重１ｋｇ当たり２μｇ〜２０００μｇの範囲を包含 する場合には、動物において満足な結果を予想することができる。大型の哺乳動 物、例えばヒトにおいて、例１により精製された蛋白質を使用する場合には、望 ましい日用量は、体重１ｋｇ当たり２〜２０００μｇの範囲内にある。例えば、 この投与量は、有利に４回までの部分的投与量で毎日 投与される。急性の血栓症を短時間で治療する場合の日用量は、体重１ｋｇ当た り２０〜２０００μｇであり、体重１ｋｇ当たり２〜２００μｇでの慢性的治療 の際の投与量の場合よりも高い結果となる。同様に、本発明の蛋白質を皮下投与 する場合には、満足な結果を予想することができる。好ましくは、血栓が形成さ れた身体の部分に意図的に注射される。 本発明による蛋白質は、全ての常法で、殊に注射溶液または懸濁液の形で投与 することができる。 本発明は、本発明による蛋白質の１つまたはその混合物および少なくとも１つ の製薬学的に認容性の担持剤または添加剤を包含する製薬学的組成物を提供する 。このような組成物は、公知方法により得ることができる。この場合には、レミ ントンズ・ファーマシューティカル・サイエンス（Remington's Pharmaceutical Science）１５th マック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publishing Co mpany）、イーストペンシルバニア（East Pennsylvania）（１９８０）が指摘さ れる。 試験結果は、図面に明示されており、詳細には、次のことを示す： 図１：サシガメTriatoma pallidipennisからの本発明による蛋白質を添加した際 のトロンビン時間の延長。 図２：アミド分解試験におけるトロンビン活性の阻害（トリアトマ（Triatoma） =サシガメTriatoma pall idipennisからのトロンビン阻害剤） 図３：凝固試験におけるトロンビン活性の阻害実施例 例１ サシガメTriatoma pallidipennisからの唾液の取得および本発明による蛋白質の 精製 唾液を分泌させるためにサシガメの吻に機械的刺激を与える。この唾液をガラ ス板上に捕捉し、かつシリコーン処理された引き出されたパスツールピペットを 用いて捕集する。 この唾液を凍結乾燥し、かつ２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留水中に溶解する。 この溶液２ｍｌを“Superose 12 HR 16/50”カラム（Pharmacial）上でトリス／ ＨＣｌ １０ミリモル／ｌ、ｐＨ７．４、“Pｌuronic F68”中で濾過する。凝 固試験（例２参照）で活性の画分を合わせ、かつ製造業者の記載によれば先にト ロンビンをカップリングさせたＣＨ活性されたセファロース（Pharmacia）上に 塗布する。本発明の蛋白質は、トロンビンを備えた前記カラムに結合する。まず 、このカラムをタイロード緩衝液（血漿アルブミンなし）で洗浄し、次に初めて Ｎａ酢酸塩１０ミリモル／ｌ、ｐＨ４．５と一緒に溶離し、次いでグリセリン１ ０ミリモル／ｌ、ｐＨ２．５と一緒に溶離する。溶離液のｐＨを７に調節する。 グリシン溶離液１０ミリモル／ｌは、本発明の精製された蛋白質を含有する。こ の溶 離液は、凝固試験（例２参照）、血小板凝集試験（例３参照）、アミド分解試験 （例４参照）において活性であり、かつトロンビン時間（例９参照）を延長する 。調製液は、ＳＤＳゲル電気泳動で検出可能な不純物を含有していない。例２ 凝固試験におけるトロンビン活性の阻害 ウシ血清アルブミンで被覆されている（ＮａＨＣＯ₃ ０．１モル／ｌ中０． １％、ｐＨ９．５）微量滴定板中にＨＥＰＥＳ ８０μｌ ２０ミリモル／ｌ、 ｐＨ７．４；ＮａＣｌ ０．１５ミリモル／ｌ；ＣａＣｌ₂ ２０μｌ ２０ミ リモル；本発明の蛋白質の希釈した溶液１００μｌ（５〜５０ｎｇ）およびトロ ンビン２０μｌ（０．０３ ＩＵ＝０．０３国際単位）をピペットで注入する。 ３７℃で２分間の恒温保持後、フィブリノーゲン１００μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）を 添加し、かつ３７℃で４０分間恒温保持する。引続き、吸収を４０５ｎｍで測定 する。本発明の精製された蛋白質４５ｎｇ（＝８ナノモル／ｌ）は、フィブリノ ーゲン分解を完全に阻害する。同じ試験条件下で、ヒルジンは、同じ作用を示す （８ナノモル／ｌでの完全な阻害）。（図３参照）例３ 血小板凝集試験におけるトロンビン活性の阻害 濾過された血小板５００μｌ（３０００００／ｍｌ） を本発明の蛋白質（５〜１００ｎｇ／ｍｌ）と一緒に３７℃で１分間恒温保持す る。次に、凝集をトロンビン（０．０６ＩＵ／ｍｌ）で誘発させ、凝集を凝集測 定器（Aggregometer）中で記録する。本発明の精製された蛋白質を用いての測定 は、１５ｎｇ／ｍｌの濃度で凝集を１００％阻害することを示す。例４ アミド分解試験におけるトロンビン活性の阻害 微量滴定板中でトリス／ＨＣｌ ８０μｌ １００ミリモル／ｌ、ｐＨ７．４ ；ＮａＣｌ １５０ミリモル／ｌおよびトロンビン０．０３ＩＵ（１．３５ナノ モル／ｌ）ならびに本発明の蛋白質の希釈した溶液１００μｌ（３２〜６３０ｎ ｇ）を３７℃で１０分間恒温保持し、次いで基質Ｓ２２３８（Kabi Vitrum）１ ００μｌ（５０ナノモル）を添加する。３７℃で３０分間の恒温保持後、吸収を ４０５ｎｍで測定する。６３０ｎｇ（１１７ナノモル／ｌ）は、 トロンビン活 性をほぼ５０％に阻害する。ヒルジンは、６ナノモル／ｌの濃度でトロンビンの 活性を８５％に阻害する。 （例２参照）例５ Ｎ−末端アミノ酸配列の測定 本発明の精製された蛋白質を自動アミノ酸シークエネーター （Applied Biosy stems，Inc．）中で製造業者の使用説明書に従い配列決定した。アミノ酸１〜２ １ の配列（Ｎ末端から）は次の通りである：Ala-Glu-Gly-Asp-Asp-Cys-Ser-Leu-Gl u-Lys-Ala-Met-Gly-Asp-Phe-?-Pro-Glu-Glu-Phe-Phe。“？”は、完全な確実さ をもって同定することができないものを表わす。このアミノ酸は、恐らくリシン である。例６ ＳＤＳ−電気泳動および分子量の測定 本発明の蛋白質を還元状態（ジチオトレイトを用いての還元）および非還元状 態で分子量標識（Pharmacia社の電気泳動較正キット）ホスポリラーゼｂ（９４ ｋＤａ）、アルブミン（６７ｋＤａ）、卵アルブミン（４３ｋＤａ）、カルボニ ックアンヒドラーゼ（３０ｋＤａ）、トリプシン阻害剤（２０．１ｋＤａ）およ びラクトアルブミン（１４．４ｋＤａ）と一緒に１２．５％のＳＤＳポリアクリ ルアミドゲル上に塗布し、かつラエッムリ（Laemmli）（1970、Nature 227，680 -685）による電気泳動後にクーマシーブリリアントブルーで着色した。還元状態 の場合には、本発明の蛋白質は、電気泳動の間に僅かにのみトリプシン阻害剤の 上方で移動する。これは、約２１０００Ｄａの分子量に相当する。非還元状態の 場合には、本発明の蛋白質は、トリプシン阻害剤とラクトアルブミンとの間で移 動し、このことは、約１８０００Ｄａの分子量に相当する。例７ 本発明の蛋白質は、セリンプロテアーゼ因子Ｘａおよびトリプシンを阻害しない 。 因子Ｘａおよびトリプシンの活性を次の試験で測定する。トリス／ＨＣｌ ８ ０μｌ ５０ミリモル／ｌ、ｐＨ８．０、ＮａＣｌ ２２７ミリモル／ｌに、因 子Ｘａ測定のために因子Ｘａ０．００４ＩＵ（０．６５３ピコモル）（American Diagnostica）および本発明の蛋白質０．５μｇ（２８ピコモル）を添加し、か つトリプシン測定のためにトリプシン（σ）０．００４ＩＵ（０．０１９ピコモ ル）および本発明の蛋白質０．０１６μｇ（０．８１７ピコモル）を添加し、３ ７℃で２分間恒温保持する。基質Ｓ２２２２（Kabi Vitrum）０．０５マイクロ モルの添加後、３７℃で２０分間恒温保持し、引続き吸収を４０５ｎｍで測定す る。この配合物の吸収は、本発明の蛋白質なしの配合物とまさに同様の高さであ り、即ち蛋白質は、因子Ｘａの活性を阻害しないし、トリプシンの活性も阻害し ない。例８ 等電点電気泳動 本発明の蛋白質を等電点電気泳動のためのゲル上にｐＨ３〜９の範囲内（Phar macia）で塗布し、かつ標準蛋白質（Pharmaciaの較正キットｐＨ３〜１０）と一 緒に焦点的に濃縮されて分離される。本発明の蛋白質の焦点位置は、ダイズトリ プシン阻害剤の焦点位置（I．P．＝4.55）とβ−ラクトグロブリンＡの焦点位置 （I．P．＝5.2）との間にあった。例９ トロンビン時間の延長 トロンビン時間により、外因性トロンビンの活性を測定し、この外因性トロン ビンを試験血漿に添加する。血漿０．１ｍｌに本発明の蛋白質の溶液５０μｌを 種々に希釈（６〜５８ナノモル／ｌ）して添加し、かつｐＨ７．６を有するバル ビツール酸ジエチル−酢酸塩緩衝液５０μｌを添加し、かつ３７℃で１分間恒温 保持する。トロンビン溶液０．１ｍｌ（３ＩＵ／ｍｌ）の添加後、凝固が発生す るまでの時間を測定する（SarstedtのBiomatic 2000 Coagulometer）。３５ナノ モル／ｌの濃度で存在する本発明の蛋白質は、対照の配合物と比較して凝固時間 を５倍延長する（図１参照）。例１０ Ｌｙｓ Ｃでの分解による内部アミノ酸配列の測定 本発明の精製された蛋白質（５９μｇ）を２−メルカプトエタノール１０％で 還元し（Ｎ₂雰囲気下で室温で２時間）、かつ次いで４−ビニルピリジンと反応 させる（Ｎ₂雰囲気下で室温で２時間）。トリス／ＨＣｌ ２５ミリモル／ｌ、 ｐＨ８．５；ＥＤＴＡ １ミリモル／ｌに対する透析後、試料にＬｙｓ Ｃ １ μｇ（Boehringer Mannheim）を添加し、かつ３７℃で６時間恒温保持する。こ の分解配合物をスーパースペル（Supersper）ＲＰ−１８，４μｍ（250×4mm、M Z -Analysen-technik，Hainz）カラム上に塗布し、かつＨ₂Ｏ中のＴＦＡ ０．１ ％〜アセトニトリル７０％中のＴＦＡ０．０８％の勾配で溶離する（WatersのHP LC装置）。２８０ｎｍおよび２１４ｎｍでの吸収を記録し、溶離液を分画する。 吸収ピークに相当する画分を乾燥し、かつＨ₂Ｏ ３０μｌ中に入れる。個々の 画分を自動アミノ酸シークエネーター（Applied Biosystems，Inc．）中で製造 業者の使用説明書に従い配列決定する。この場合には、次の配列が明らかになる （それぞれＮ末端からの出発、“？”は、明らかに同定されないものを表わす） ： １． Ala-Het-Gly-Asp-Phe-Lys-Pro-Glu-Glu-Phe-Phe-?-Gly-Thr-Arg（?）-Tyr -Leu-Ala（アミノ酸Ａｒｇの測定は、不確実性を有している。） ２． Gly-Phe-Thr-Gln-Ile-Val-Glu-Ile-Gly-Tyr-Asn-Lys- ３． Asn-Gly-Glu-Gln-Tyr-Ser-Phe-Lys-例１１ 本発明によるｃＤＮＡｓの分子クローン化 本発明による蛋白質のＮ末端の配列が公知である場合には、相応するヌクレオ チド配列を測定することができる。（国際公開番号ＷＯ９０／０７８６１参照） ａａ）ＰＣＲの場合の特異的試料の製造 本発明によるｃＤＮＡを測定するために、先にエドマン分解で測定されたアミ ノ酸配列によって導出されるプライマー（オリジナル、出発片）をまず合成させ る。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）で本発明によるｃＤＮＡの断片を増幅させ るために、プライマーの合成されたオリゴヌクレオチド配列を利用する。（米国 特許第４８００１５９号明細書参照） ２つのオリゴヌクレオチド−プライマーを、完全な本発明による蛋白質のＮ末 端範囲およびその断片の先に部分的に測定されたアミノ酸配列からヌクレオチド 配列を誘導することにより製造する。この場合には、次のアミノ酸配列を使用す る： 完全な蛋白質のＮ末端配列： および断片のＮ末端配列： マトリックス（鋳型）は、先にサシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺から 単離されているポリ−Ａ⁺ −ＲＮＡに由来するｃＤＮＡからなる。（SAMBROCK他：Molekular Cloning（Ch apter 7，第１８〜２２頁），Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）マ トリックス−出発片（センスプライマー（Sense primer））： 5´-GCI GA（A/G）GGI GA（C/T）GA（C/T）TG（C/T）TCI CTI GA（A/G）AA（A/G ）GCI ATG GGI GA（C/T）TT-3´ 非マトリックス−出発片（アンチセンスプライマー（Antisense primer））： 5´-TT（G/A）TT（G/A）TA ICC（G/A）AT（T/C）TC IAC（G/A）AT（T/C）TG IGT （G/A）AA-3 Ａ＝デスオキシアデノシン；Ｃ＝デスオキシシチジン；Ｇ＝デスオキシグアノシ ン；Ｔ＝デスオキシチミジンおよびＩ＝デスオキシイノシン ＰＣＲは、４０の作業周期から構成されている。１つの作業周期は、次のもの からなる： ａ）９４℃で２分間の変性 ｂ）５２℃で９０秒間のハイブリッド化および ｃ）７２℃で２分間の延長。 先に記載された方法によって得られたＰＣＲ増殖生 産物は、アガロースゲル上で１つのバンドを有する。このバンドは、低い融点を 有するアガロースゲルによって分離され、直接にＰＣＲプラスミド（Stratagene ）中に移され、かつサブクローン化される。この方法は、製造業者の実験記録か らの記載に相当する（StratageneのpCR-Script^TM SK（+）クローン化キット）。 挿入生産物のＤＮＡ配列は、ＰＣＲ生産物の配列に相当し、かつサンジャー（SA NGER）他、Proc Natl Acad Sci USA（1977）74：5463-5467の記載と同様に測定 される。 ｂｂ）ｃＤＮＡ−バンクの選択方法および本発明によるｃＤＮＡ−クローンの単 離 サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺−ｃＤＮＡ−バンクからの約４００ ０００個の一次クローン（ｃＤＮＡライブラリー）を、製造業者の使用説明書の 記載のようにナイロン膜（Pall Blosupport East Hills，NY，USA）上に移し、 かつスクリーニングする。この場合には、先に記載されたＰＣＲ増殖法により得 られた標識化された試料を使用する。選択方法を２回実施し、プラスミド−ＤＮ Ａへのファージ−ＤＮＡの変換およびこのプラスミドの挿入断片（導入されたＤ ＮＡ）の配列分析を行なう。それによって、配列中でアイデンティファイアー１ ３〜１６を形成している４個のｃＤＮＡ配列を測定し、この場合には、専らアミ ノ酸−１７〜−９の三重項（Triplika）をＴｉ２８お よびＴｉ４５で欠き、かつアミノ酸−１８の三重項をＴｉ１２で欠いている。 単離されたＤＮＡのそれぞれ２本の鎖を配列決定する。コーディングするＤＮ Ａによって導出されたアミノ酸配列は、先にエドマン分解により本発明による精 製された蛋白質から見い出されたアミノ酸配列と完全に一致する。 最も長いｃＤＮＡクローン（Ｔｉ１２）は、メチオニンのための不完全な出発 コドンに相当するヌクレオチドＴＧを用いて開始する。このことは、他の単離さ れたクローン（Ｔｉ５）を考慮する場合に明らかとなり、このクローンは、Ｔｉ １２、Ｔｉ２８およびＴｉ４５の選択の際に使用されたのと同じｃＤＮＡバンク の６０００００個のファージを用いての選択方法の場合に見い出された。 本発明による蛋白質の４つのｃＤＮＡ配列を先に記載した方法により選択し、 同定し、かつ配列決定する。専ら９個の位置が導出されたアミノ酸配列の区別を 有する。この区別は、第２表に記載されている。 ４個の本発明による円熟蛋白質の同定および類似性は、如何なる比較成分が選 択されるかに応じて約９５または９８％である。例１２ 本発明による蛋白質をコーディングするプラスミドの製造ならびに大腸菌中で得 られる蛋白質の発現および精製 ＤＮＡ配列が公知である場合には、適当なプロモーターおよび場合によっては 適当なエンハンサーは、それぞれのＤＮＡ配列と結合することができ、したがっ てさらに使用可能なベクターが存在する。（M．WIRTH，L．SCHUMACHERおよびH． HAUSER著、H．S．CONRADT編Protein Glycosylation，Cellular Biotechnical an d AAnalytical Aspects第１５巻、49-52，VCH社（Weinheim在）刊、１９９１） ；同様にJ．KRAETZSCHMAR 他（１９９２）Gene 116：281-284。このようなベク ターの発現は、真核生物（例えば、幼児のハムスターの腎臓細胞）の場合に可能 である。更に、適当な原核ベクター中のＤＮＡ配列は、大腸菌の菌株において発 現するために導入することができる。 ａ）プラスミドの製造 （ｉ）予備計画 原核生物において本発明による組換え蛋白質を発現させるための構成を、ＩＰ ＴＧ誘発可能なｔｒｃプロモーターを含有する商業的に入手可能なプラスミドｐ ＫＫ２３３−２を使用することにより得る。発現に適当なベクターは、このプラ スミドｐＫＫ２３３−２を包含し、この場合には、本発明による蛋白質のコーデ ィング配列ならびに信号配列が挿入されている。信号配列は、分泌された大腸菌 の蛋白質シクロフィリンａに帰因する修飾された信号配列である。信号配列およ びコーディングＤＮＡは、下流に向かってプロモーターによって使用され、それ によってｐＫＫ／ｃｐｈが生じる（T．HAYAN0（1991）Biochemistry 30：3041-3 048）。 本発明による蛋白質のコーディング配列は、発現プラスミド中に挿入され、こ うして得られた構成体（ｐＫＫ／ｃｐｈ蛋白質）は、能力細胞の大腸菌ＪＭ１０ ５細胞の形質転換に利用される。 （ii）プラスミドｐＫＫ／ｃｐｈの構成 次の１対の部分的に重なりかつ相補的オリゴデスオキシヌクレオチドは、シク ロフィリンａの信号配列のためのコーディングＤＮＡを後形成させるために使用 される。この場合、シクロフィリン配列の相応するＣ末端は、細菌性信号ペプチ ダーゼに最適な分解位置を形成するために修飾される。この修飾は、Ｃ末端の最 後の７個のトリプレット（Triplika）を次のアミノ酸配列をコーディングするト リプレット（Triplika）と交換することにある：Phe-Ser-Ala-Ser-Ala-Leu-Ala （R．E．DALBEYおよびG．von HEIJNE（1992）TIBS 17：474-478）。 センスを有するオリゴヌクレオチド配列：（センスオリゴ） 5´-GCGATAACAT GTTCAAAAGC ACCCTGGCGG CGATGGCTGCTGTTTTCGCT CTGTCTG-3´； センスを有しないオリゴヌクレオチド配列：（アンチセンスオリゴ） 5´-CGCTATAAGC TTCTGCAGGC TAGCGCGCTC GCGCTGAAAGCAGACACAGT CGAAACAG-3´ 出発配列の付着およびＴａｑポリメラーゼの使用下での姉妹部分の引き続く完 全化の後、ＤＮＡ断片は、Af/IIIおよびHindIIIで切断される。切断位置は、下 線が引かれている。その後に、ＤＮＡは、プラスミドpKK233-2のNcol位置とHind III位置との間でサブクローニングされる。HindIII位置と一緒にｃＤＮＡ部分の 他のサブクローニングを簡易化するNhel位置は、脂肪圧力（Fettdruck）によっ て認められる。 （ii）本発明による蛋白質を用いてのプラスミドの構成 本発明による成熟蛋白質（Ti28=Seq．Id．No.2）のためにコーディング配列を 増殖させるために、次の１対の出発配列（プライマー）を使用する。この場合に は、下線が引かれているNhelおよびHindIII切断位置は、プラスミドｐＫＫ／ｃ ｐｈ中への挿入に必要とされる。 センスを有するオリゴヌクレオチド配列：（センスオリゴ） 5´-GCGATAGCTA GCAGCAGAAG GTGACGAC-3´； センスを有しないオリゴヌクレオチド配列：（アンチセンスオリゴ） 5´-GCGATAGGAT CCAAGCTTAC TAACAAATTT CATTAGCATC AGG-3´ ９４℃で２分間、３０℃で２分間および７２℃で２．５分間からなる１０回の 作業周期をＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）のために実施し、この場合には、マト リックス鎖２μｇ（鋳型）が使用される。増殖されたＤＮＡを低融点アガロース ゲル上に単離し、NhelおよびHindIIIで切断され、かつ先に同じ制限エンドヌク レアーゼで切断されたプラスミドpKK/cph中に移す。こうして得られた構成体を コーディングＤＮＡの全配列化およびコーディングＤＮＡをフランキングするＤ ＮＡを用いて試験する。 （iii）大腸菌の形質転換 大腸菌ＪＭ１０５細胞をＣａＣｌ₂法を使用しながら形質転換する。この場合 には、本発明による蛋白質をコーディングするｐＫＫ／ｃｐｈ １μｇを使用す る。 ｂ）大腸菌を用いて得られた本発明による蛋白質の精製および特性決定 形質転換された大腸菌細胞の培養基にＩＰＴＧ（１ミリモル／ｌ）を添加し、 かつ３７℃で６時間恒温保持する。（ＩＰＴＧ＝イソプロピル−β−Ｄ−チオガ ラクトシド）この細胞を遠心分離し、かつ浸透圧ショック（サッカロース処理お よび引き続くＨ₂Ｏ処理）を受けさせる。こうして得られたペリプラズマ画分は 、凝固試験（比較例２）においてトロンビンの活性を阻害する。阻害活性をＤＥ −５２セルロースを用いてのイオン交換クロマトグラフィーおよびトロンビンア フィニティークロマトグラフィーによって精製する。（比較例１） 精製された画分は、唾液蛋白質と同じ阻害活性を有する。この画分は、ＳＤＳ ポリアクリルアミド電気泳動法の場合と同一の挙動を示す（比較例６）。更に、 この画分は、Ｎ末端アミノ酸配列において成熟唾液蛋白質と一致する。 ５０８１１ＡＷＯＭ１ＸＸ００＋Ｐ １９９３年１１月２５日 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：１４２個のアミノ酸 分子の種類：成熟蛋白質Ｔｉ１２ 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：１４２個のアミノ酸 分子の種類：成熟蛋白質Ｔｉ２８ 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：１４２個のアミノ酸 分子の種類：成熟蛋白質Ｔｉ４５ 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：１４２個のアミノ酸 分子の種類：成熟蛋白質Ｔｉ５ 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：１６０個のアミノ酸 分子の種類：信号配列Ｔｉ１２を有する成熟蛋白質 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：１６０個のアミノ酸 分子の種類：信号配列Ｔｉ２８を有する成熟蛋白質 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：１６０個のアミノ酸 分子の種類：信号配列Ｔｉ４５を有する成熟蛋白質 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：１６０個のアミノ酸 分子の種類：信号配列Ｔｉ５を有する成熟蛋白質 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：４２９個のヌクレオチド 分子の種類：成熟蛋白質をコーディングするｃＤＮＡ Ｔｉ１２ 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：コーディングするｃＤＮＡ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：４２９個のヌクレオチド 分子の種類：成熟蛋白質をコーディングするｃＤＮＡ Ｔｉ２８ 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：コーディングするｃＤＮＡ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：４２９個のヌクレオチド 分子の種類：成熟蛋白質をコーディングするｃＤＮＡ Ｔｉ４５ 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：コーディングするｃＤＮＡ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：４２９個のヌクレオチド 分子の種類：成熟蛋白質をコーディングするｃＤＮＡ Ｔｉ５ 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：コーディングするｃＤＮＡ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：４８３個のヌクレオチド 分子の種類：信号配列をコーディングするｃＤＮＡ Ｔｉ１２を有する成熟蛋白 質 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：コーディングするｃＤＮＡ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：４８３個のヌクレオチド 分子の種類：信号配列をコーディングするｃＤＮＡ Ｔｉ２８を有する成熟蛋白 質 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：コーディングするｃＤＮＡ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：４８３個のヌクレオチド 分子の種類：信号配列をコーディングするｃＤＮＡ Ｔｉ４５を有する成熟蛋白 質 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：コーディング配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：４８３個のヌクレオチド 分子の種類：信号配列をコーディングするｃＤＮＡ Ｔｉ５を有する成熟蛋白質 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：コーディングｃＤＮＡ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：１５個のアミノ酸 分子の種類：Ｎ末端蛋白質断片 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：２１個のアミノ酸 分子の種類：Ｎ末端蛋白質断片 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：２１個のアミノ酸 分子の種類：Ｎ末端蛋白質断片 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：１８個のアミノ酸 分子の種類：Ｌｙｓ Ｃを有する切断後のＮ末端蛋白質断片 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 ”?”不定；Arg（?）＝不確実さを有する ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：１２個のアミノ酸 分子の種類：Ｌｙｓ Ｃを有する切断後のＮ末端蛋白質断片 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：８個のアミノ酸 分子の種類：Ｌｙｓ Ｃを有する切断後のＮ末端蛋白質断片 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺 性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：４４個のヌクレオチド 分子の種類：マトリックス−出発部分／センスプライマー 出所：アミノ酸配列から導出された 性質：プライマー ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：３２個のヌクレオチド 分子の種類：非マトリックス−出発部分（アンチセンスプライマー） 出所：アミノ酸配列から導出された 性質：アンチセンスプライマー ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５ 配列の種類：アミノ酸配列 配列の長さ：７個のアミノ酸 分子の種類：ペプチド断片 性質：修飾されたシクロフィリンａのＣ末端 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：５７個のヌクレオチド 分子の種類：マトリックス−出発部分（センスプライマー） 出所：修飾されたシクロフィリンのアミノ酸配列から導出された 性質：センスプライマー ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：５８個のヌクレオチド 分子の種類：非マトリックス−出発部分（アンチセンスプライマー） 出所：修飾されたシクロフィリンのアミノ酸配列から導出された 性質：アンチセンスプライマー ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：２８個のヌクレオチド 分子の種類：マトリックス−出発部分（センスプライマー） 出所：本発明による蛋白質のアミノ酸配列から導出された 性質：センスプライマー ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：４３個のヌクレオチド 分子の種類：非マトリックス−出発部分（アンチセンスプライマー） 出所：本発明による蛋白質のアミノ酸配列から導出された 性質：アンチセンスプライマー 51062ADEM1XX00-P 発現 １９９３年１１月２５日１３：５２

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/55 ＡＢＸ ＡＣＢ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/435 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 9/99 9152−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＸ (31)優先権主張番号 Ｐ４３２８３３６．５ (32)優先日 1993年８月17日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 Ｐ４３４０７９８．６ (32)優先日 1993年11月25日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＦＩ，ＨＵ，Ｊ Ｐ，ＫＲ，ＮＯ，ＲＵ，ＵＳ (72)発明者 アラゴン，アレハンドロ メキシコ国 モレロス 62271 クエルナ ヴァカ （番地なし）ウニバーシダッド ナショナル アウトノマ デ メキシコ 内 (72)発明者 ポッサニ，ロウリヴァル メキシコ国 モレロス 62271 クエルナ ヴァカ （番地なし）ウニバーシダッド ナショナル アウトノマ デ メキシコ 内 (72)発明者 クウェヴァス−アグイエレ，デリア メキシコ国 モレロス 62271 クエルナ ヴァカ （番地なし）ウニバーシダッド ナショナル アウトノマ デ メキシコ 内 (72)発明者 ドナー，ペーター ドイツ連邦共和国 Ｄ―12169 ベルリン シュテークリッツァー ダム ７アー (72)発明者 ヘンドラー，ベルナルト ドイツ連邦共和国 Ｄ―10627 ベルリン シラーシュトラーセ 11ベー (72)発明者 ヘヒラー，ウルリケ ドイツ連邦共和国 Ｄ―10627 ベルリン カントシュトラーセ 63

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． トロンビン阻害剤でありかつ哺乳動物の血液を吸う昆虫類の唾液から単離 可能である天然からかまたは合成により得ることができる蛋白質。 ２． サシガメTriatoma pallidipennisから単離可能である、請求項１記載の蛋 白質。 ３． ａ）活性蛋白質として次のようなＮ末端配列： を有するかまたは ｂ）活性蛋白質として先にａ）で記載されたＮ−末端アミノ酸配列の対立遺 伝子の修飾を有し、この場合Ｎ−末端アミノ酸配列の１つまたは２つのアミノ酸 は、置換されているか、欠失されているか、または挿入されており、この場合に は、活性蛋白質の活性は、本質的に影響を及ぼされない かまたは ｃ）活性蛋白質としてａ）およびｂ）でのＮ末端配列の翻訳後修飾を有し、 この場合には、本質的に活 性蛋白質は影響を及ぼされない、請求項１または２に記載の蛋白質。 ４． トロンビン阻害剤でありかつ ｄ）活性成熟蛋白質として次の配列： ｉ） 配列アイデンティファイアーNo.1 （配列プロトコールNo.1） ii） 配列アイデンティファイアーNo.2 （配列プロトコールNo.2） iii） 配列アイデンテイファイアーNo.3 （配列プロトコールNo.3）および iv） 配列アイデンティファイアーNo.4 （配列プロトコールNo.4） の１つを有するかまたは ｅ）活性の成熟蛋白質として先にｄ）で記載されたアミノ酸配列の１つを有 し、この場合アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸は、置換されているか、 欠失されているか、または挿入されており、この場合活性蛋白質の活性は、本質 的に影響を及ぼされない かまたは ｆ）活性の成熟蛋白質としてｄ）およびｅ）での配列の１つの翻訳後修飾を 有し、この場合本質的に活性蛋白質の活性は影響を及ぼされないような蛋白質。 ５． 請求項１または２に記載の１つの信号配列および成熟蛋白質からなる１つ の蛋白質において、 ｇ）この場合この蛋白質は、次の配列： ｉ） 配列アイデンティファイアーNo.5 （配列プロトコールNo.5） ii） 配列アイデンティファイアーNo.6 （配列プロトコールNo.6） iii） 配列アイデンティファイアーNo.7 （配列プロトコールNo.7）および iv） 配列アイデンティファイアーNo.8 （配列プロトコールNo.8） の１つを有するかまたは ｈ）この場合この蛋白質は、先にｇ）で記載されたアミノ酸配列の対立遺伝 子の修飾を有し、この場合アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸は、置換さ れているか、欠失されているか、または挿入されており、この場合成熟の活性蛋 白質の活性は、本質的に影響を及ぼされない、 かまたは ｉ）この場合この蛋白質は、ｇ）およびｈ）での配列の１つの翻訳後修飾を 有し、この場合には、活性の成熟蛋白質の活性は、本質的に影響を及ぼされない 、請求項１または２に記載の１つの信号配列および成熟蛋白質からなる１つの蛋 白質。 ６． 蛋白質が組換え蛋白質である、請求項１から５までのいずれか１項に記載 の蛋白質。 ７． 蛋白質がグリコシル化されている、請求項１から ６までのいずれか１項に記載の蛋白質。 ８． 成熟トロンビン阻害剤をコーディングし、 ａａ）この場合、ｃＤＮＡまたはＤＮＡは、次のアミノ酸配列： ｉ） 配列アイデンティファイアーNo.1 （配列プロトコールNo.1） ii） 配列アイデンティファイアーNo.2 （配列プロトコールNo.2） iii） 配列アイデンティファイアーNo.3 （配列プロトコールNo.3）および iv） 配列アイデンティファイアーNo.4 （配列プロトコールNo.4） をコーディングするかまたは ｂｂ）この場合ｃＤＮＡまたはＤＮＡは、ａａ）でのアミノ酸配列の１つの 対立遺伝子の修飾をコーディングし、 この場合アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸は、置換されている か、欠失されているか、または挿入されており、この場合には、この活性蛋白質 の活性は、本質的に影響を及ぼされないｃＤＮＡまたはＤＮＡ。 ９． トロンビン阻害剤をコーディングし、 ｃｃ）この場合ｃＤＮＡまたはＤＮＡは、次のヌクレオチド配列： ｉ） 配列アイデンティファイアーNo.9 （配列プロトコールNo.9） ii） 配列アイデンティファイアーNo.10 （配列プロトコールNo.10） iii） 配列アイデンティファイアーNo.11 （配列プロトコールNo.11）および iv） 配列アイデンティファイアーNo.12 （配列プロトコールNo.12） の１つを有するかまたは ｄｄ）この場合ｃＤＮＡまたはＤＮＡは、ｃｃ）でのヌクレオチド配列の１ つの対立遺伝子の修飾を有し、この場合少なくとも１つのヌクレオチドは、置換 されているか、欠失されているか、または挿入されており、この場合には、ｃｃ ）でのヌクレオチド配列の対立遺伝子の修飾によってコーディングされる蛋白質 の活性は、本質的に影響を及ぼされないｃＤＡまたはＤＮＡ。 １０． 信号配列を有するトロンビン阻害剤をコーディングし、 ｅｅ）この場合ｃＤＮＡまたはＤＮＡは、次のヌクレオチド配列： ｉ） 配列アイデンティファイアーNo.13 （配列プロトコールNo.13） ii） 配列アイデンティファイアーNo.14 （配列プロトコールNo.14） iii） 配列アイデンティファイアーNo.15 （配列プロトコールNo.15）および iv） 配列アイデンティファイアーNo.16 （配列プロトコールNo.16） を有するかまたは ｆｆ）この場合ｃＤＮＡまたはＤＮＡは、ｅｅ）でのヌクレオチド配列の１ つの対立遺伝子の修飾を有し、この場合少なくとも１つのヌクレオチドは、置換 されているか、欠失されているか、または挿入されており、この場合には、成熟 蛋白質の信号配列を含めてｅｅ）でのヌクレオチド配列の対立遺伝子の修飾によ ってコーディングされる成熟蛋白質の活性は、本質的に影響を及ぼされないｃＤ ＮＡまたはＤＮＡ。 １１． 請求項８から１０までのいずれか１項に記載のｃＤＮＡまたはＤＮＡ、 さらに適当なプロモーターおよび場合によっては適当なエンハンサーを含有する ベクター。 １２． 請求項１１記載のベクターで形質転換されている真核または原核宿主細 胞。 １３． 請求項１から７までのいずれか１項に記載の蛋白質を製造する方法にお いて、次の工程： 請求項８から１０までのいずれか１項に記載のｃＤＮＡまたはＤＮＡを含有す る、ベクトルで形質転換されている宿主細胞の培養、 ならびに 蛋白質の単離および精製を有する請求項１から７までのいずれか１項に記載の蛋 白質の製造法。 １４． 請求項１から７までのいずれか１項に記載の蛋白質を精製する方法にお いて、蛋白質を単離し、少なくとも１つのカラム上で精製し、かつ引続き濃縮す る、請求項１から７までのいずれか１項に記載の蛋白質の精製法。 １５． 請求項１から７までのいずれか１項および請求項１３または１４に記載 の蛋白質を精製する方法において、この方法が次の工程： “スペロース（SUPEROSE）１２ＨＲ−カラム”上への唾液の塗布および溶離な らびに 先にトロンビンがカップリングされたＣＨ活性化されたセファロース（Sephar ose）−カラム上への再度の塗布および溶離からなる、請求項１から７までのい ずれか１項および請求項１３または１４に記載の蛋白質の精製方法。 １６． 製薬学的作用物質としての請求項１から７までのいずれか１項および請 求項１３から１５までのいずれか１項に記載の蛋白質の１つまたはその混合物。 １７． 請求項１から７までのいずれか１項および請求項１３から１５までのい ずれか１項に記載の蛋白質の１つまたはその湿合物を含有する医薬品。 １８． 請求項１から７までのいずれか１項および請求項１３から１５までのい ずれか１項に記載の蛋白質 の１つまたはその混合物を、製薬学的に認容性で相容性の化合物および担持剤の 存在下で含有する医薬品。 １９． 血栓症または不安定なアンギナまたは動脈硬化症を治療するか、または ＰＴＣＡ／ＰＴＡによる血管の再閉塞を予防するか、または血液透析の際の血液 凝固を阻止する医薬品を製造するための請求項１から７までのいずれか１項およ び請求項１３から１５までのいずれか１項に記載の蛋白質の１つまたはその混合 物の使用。